JPH01163130A

JPH01163130A - 腫瘍抗原およびアジュバントを含有するワクチン

Info

Publication number: JPH01163130A
Application number: JP63244691A
Authority: JP
Inventors: John L Cantrell; ジョン　レオナード　カントレル
Original assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Current assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Priority date: 1987-09-30
Filing date: 1988-09-30
Publication date: 1989-06-27
Also published as: GB8822749D0; FR2620941B1; GB2210557B; IT8822145A0; GB2210557A; NL8802393A; DE3833319A1; DE3833319C2; FR2620941A1; JPH0575731B2; US4877611A; CH678492A5; CA1333152C; IT1226861B; BE1001634A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、概括的にはワクチンに関する。−の態様とし
ての本発明は、微生物療に由来する無毒性かつ高い有効
性のアジュバントおよび腫瘍会合性抗原からなるワクチ
ンに向けられたものである。

またさらに本発明は、腫瘍ワクチンの製造方法および免
疫原性腫瘍抗原の有効性を高めることによる治療および
予防にそれらを使用する方法に向けられる。

［従来の技術］最近の９０年間に、エンドトキシンが有効な免疫促進剤
として認識された。Ｗ、Ｂ、Ｃｏ１ｅｙは癌の処置にお
いて「細菌毒素」の使用を公表している（Ａｎｎ、Ｓｕ
ｒｇ、　１４，１９９（１８９１））　、また、かかる
混合微生物ワクチンを用いた手術不可能な患者の治癒率
が４〜７％であることも公表されている（ＪＡＭＡ。

５４．２５０（１９１９）　）。引き続きエンドトキシ
ンは、数種の動物モデルにおいて研究された。Ｇｒａｔ
ｉａおよびＬｉｎｚは、モルモットの移植脂肪肉腫モデ
ルにおける出血性の壊死および合併型腫瘍の退縮を公表
している〔い」丘勤工しジら＋し肌が一■胆：４２７（
１９３１）　）。他のゲラ歯頚の腫瘍モデルについては
次のとおりである。マウスの肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）　
１８０（Ｓｈｗａｒｔｚｍａｎ、　Ｇ、およびＭｉｃｈ
ａｉｌｏｖｓｋｙ、Ｎ、　、Ｐｒｏｃ。

Ｓｏｃ、Ｅｘ　、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、　２９ニア３７（
１９３２））　、マウスのエーリッヒ癌（Ｂｅｒｅｎｄ
ｔ、　Ｍ、Ｊ、およびＮｏｒｔｈ、　Ｒ，Ｊ、　＋　Ｅ
ｘｐ。

Ｍｅｄ、、１５１：６９（１９８０）　〕、ならびにラ
ットの移植性腫瘍（Ｂｅｒｅｎｄｔ、Ｍ、Ｊ、およびＮ
ｏｒｔｈ＋Ｒ１Ｊ−＋個人的情報〕。

エンドトキシン処置動物における腫瘍の壊死の観察に係
る最近の研究は、内毒性画分それ自体は壊死について直
接的に応答し得ない可能性があることを指摘している（
Ｃａｒｓｗｅｌｌ、Ｅ、Ａ、、Ｏｌｄ、Ｌ、Ｊ、。

Ｋａｓｓｅｌ、　Ｒ，Ｌ、　、　Ｇｒｅｅｎ、　Ｓ、　
、　Ｌｉｏｒｅ、　Ｎ、　、およびＷ　ｉ　ｌ　ｌ　ｉ
ａｍｓｏｎ　。

Ｂ、、　Ｐｒｏｃ、ＮａＬ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ　７２：３６６６（１９７５）　　）。

逆に、ＢＣＧ、Ｃ・バルバム（Ｃ，且■憇）またはザイ
モサンのようなマクロファージ賦活剤により予め刺激さ
れたマウスから単離された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と称
される因子によって壊死形成が促進される可能性がある
。さらに、ＴＮＦはイン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）
である種の腫瘍系に対して細胞毒であり、イン・ビボ（
ｉｎ　ｖｉｖｏ）での抗腫瘍活性はこれらの物質に帰因
することが示されている。

本発明前の抗腫瘍活性を有する微生物成分につイテノ研
究では、エンドトキシンがトレハロース・ジミコール酸
（ＴＤＭ）および油滴と組み合わせられたある製剤を株
（Ｓｔｒａｉｎ）　２のモルモットにおける樹立悪性腫
瘍系−１０の腫瘍に注入した場合には、高い治癒率およ
び全身系腫瘍免疫を生ずることが見い出されている。こ
のことが免疫療法剤としてエンドトキシンの価値の再評
価をもたらした。最も有力なエンドトキシンアジュバン
トは、ダラム陰性細菌の新たな（ヘプトース欠失）変異
株からのフェノール−水（ＰＷ）またはクロロホルム−
メタノール（ＣＭ）抽出物であった。これらの抽出物に
は、野生型の細菌由来のフェノール−水抽出物から調製
される内毒素性リポ多糖類（１、ＰＳ）を含有している
。ＲｅＧ１とリボ多糖ともＴＤＭおよび油滴と組み合わ
せて注入した場合、腫瘍においてシュワルツマン（Ｓｈ
ｗａｒｔｚｍａｎ）様壊死反応の迅速な発生を惹起した
。この反応の後、ＬＰＳ組み合わせ体は注入腫瘍の部分
的な退縮のみを誘発し、約２週間後にこれらの増殖が始
まった。他方、ＲｅＧ１−　ＴＤＭ組み合わせ体の注入
は、系統−１０の腫瘍による攻撃に対して高率の永続的
な退縮および全身系免疫の獲得を惹起した。ＲｅＧ１＋
ＴＯ−またはＣＷＳ　＋　ＴＤＨによる腫瘍の退縮は、
さらにより進行したｌｌ！！瘍をかなりの成功裏に処置
することができた。

カントレル博士（Ｄｒ、Ｊ、Ｌ、Ｃａｎｔｒｅｌｌ）等
の論文では、化学療法剤と免疫療法剤の組み合わせ体は
、たとえそれらのいずれかの単独処置が効果を示さない
としても、マウスの樹立腫瘍の退縮をもたらす上で高い
効果を有することを公表している（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ、　３９．１１５９〜１１６７＋４月（１
９７９）　）。

この研究で使用される抗原としては、トレハロース・ジ
ミコール酸を含むかまたは含まない水中油形の乳濁液と
してのＫＣｆ−抽出腫瘍抗原が挙げられている。

また、米国特許筒４．４３６，７２７号および同４．５
０５．９０３号明細書には、精製不活化エンドトキシン
または精製した微生物のピリジン可溶性抽出物と細胞壁
骨格および／またはトレハロース・ジミコール酸との多
様な組み合わせ体が癌性腫瘍の処置にとって有用である
ことが記載されている。

しかしながら、本発明前の免疫療法は、非特異的な免疫
療法であるか、または腫瘍抗原を単独で用いるような生
物学的な応答調節剤を用いて実施されていた。また、非
特異的な免疫療法は腫瘍に対して短期の効果を有するに
すぎず、ｌ１ｉｉ抗原は免疫原性が低いものであった。

さらに、ヒトワクチンとして使用するには従前の入手可
能なアジュバントは低い活性を存するにすぎず、そのた
めその免疫療法は完全に満足すべきものではなかった。

従って、アジュバントや腫瘍抗原についてかなりの数の
先行技術文献があるからと言っても、腫瘍抗原と一緒に
使用した場合に保護された免疫を促進せしめる無毒性の
生物学的なアジュバントの使用に関する先行技術文献は
まったく存在しない。

それ故に、保存性があり、かつ永続する腫瘍免疫を提供
するためにはＩＩ！ｉｌ会合性抗原と共に利用し得る無
毒性免疫促進剤のほかに必要なのは効能である。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明の実施により次の１以上の目的が達成さ
れるであろう。本発明の目的は、腫瘍の治療および予防
に有効なワクチンを提供することである。本発明の他の
目的は、微生物に由来する無毒性でかつ高い効能のアジ
ュバントおよび腫瘍抗原を含んでなるワクチンを提供す
ることである。

さらに本発明の目的は、免疫原性腫瘍抗原の抗腫瘍活性
を促進せしめるための方法を提供することである。本発
明のさらに別の目的は、腫瘍ワクチンの製造方法を提供
することである。さらなる目的は、アジュバントとｌ！
１ｍ抗原を含んでなる１１１３ワクチンの製造方法であ
る。また他の目的は、精製しそして不活化したエンドト
キシンおよび１１１瘍抗原を含んでなるワクチンの製造
方法を提供するにある。

さらなる目的は、腫瘍の治療および予防における前記ワ
クチンを使用するための方法を提供するにある。これら
および他の目的は、本明細書に含まれる教示に照らし、
当業者にとうて容易に理解されるだろう。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、微生物に由来する無毒性かつ高活性アジュバ
ントと腫瘍抗原を含んでなるワクチンに向けられたもの
である。また、本発明は前記ワクチンの製造方法および
腫瘍の治療および予防におけるそれらの使用に関する。

より詳細には、本発明のワクチンは、（ａ）少なくとも１種の腫瘍会合性抗原、（ｂ）精製し
た不活化エンドトキシン免疫刺激因子、（ｃ）（１）ミコバクテリア細胞壁骨格、（２））レバ
ロース・シミコール酸、および（３）微生物のピリジン
可溶性抽出物、を含んでなる群から選ばれる少くとも１
種の生物学的免疫刺激因子、ならびに（ｄ）医薬として許容され得る担体、を含んでなるもの
である。

本発明のワクチンは、腫瘍会合性抗原（以下ｒＴＡＡ、
とも称する）、精製不活化エンドトキシン免疫促進剤（
以下ｒＭＰＬ、と称する）および少なくとも１種の他の
細菌性免疫促進剤を含んでなるものである。本発明のワ
クチンにおいて用いられる腫瘍会合性抗原とは、細胞全
体、細胞の画分または既知の手段で調製される腫瘍細胞
の抽出物であることができる。ある場合には、同一のワ
クチンの中に２種以上の抗原を用いることが望ましいか
も知れない。

具体的な腫瘍会合性抗原としては、限定されるものでな
いが、温血動物腫瘍、例えば眼の癌腫、類肉腫、卵巣癌
、乳癌、腺癌、膵臓癌、腎臓癌および肺癌等に由来する
抗原が挙げられる。

本発明で用いられる精製不活化エンドトキシン免疫促進
剤は、モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）と同定されており
、引用することにより本明細書の内容となる米国特許第
４，４３６，７２７号および同４．４３６，７２８号明
細書に記載される方法で調製される。ＭＰＬを生産する
ために出発原料として使用される種類のエンドトキシン
抽出物は、親菌株および変異菌株を含むいずれかのエン
テロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃ
ｅａｅ）から得ることことができる。前述の特許明細書
に記載される種類の微生物を使用して出発原料を得るこ
ともできるし、出発原料を調製するために各種の方法を
使用することもできる。また、不活化エンドトキシンは
合成的に調製することもできるし、さらに遺伝子工学技
術によっても調製することができる。本発明の内毒素様
抽出物を得るのに好ましい方法は、Ｃｈｅｎ等により公
表されている（Ｊ、１ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ。

」冊、５４３（１９７３）　）。

モノリン酸リピドＡ（ＭＰＬ）は、リン１■当たり約３
５０〜４７５ｎｍｏｌおよび脂肪酸１■当たり約１７０
０〜２０００ｎｍｏ６で検出できる２−ケト−デオキシ
オクトン酸をまったく含まないものとしての特徴を有す
る組成物である。サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ　　ｍ１ｎｎｅｓ牡蛙Ｒ５９５のリポ多糖類に
由来するモノリン酸リピドＡの完全構造は、次式によっ
て示される。

」（モノリン酸リピドＡ）ＭＰＬは不活化されて、しかも療法的使用に不適当な内
毒素抽出物を提供する高い毒性成分を含有しないので、
エンテロバクテリアセエに由来する内毒素抽出物から大
幅な改良がなされている〔エンドトキシンによるモルモ
ットの系統−１０腫瘍の免疫療法に必要とされるペプチ
ド；　Ｒｉｂｉ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、ｖｏｌ、Ｌ４３〜５８：（１９７
９）、参照；この文献も引用することにより本明細書の
内容となる。例えば、米国特許第４，４３６，７２７号
および同４，４３６，７２８号；ならびにＲｉｔ）ｉ、
　Ｅ、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒ
ｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ、ｖｏｌ、３．１
〜９９゜（１９８４）に記載される他の内毒素抽出物に
由来するＭ’Ｐ　Ｌの有用な効果も、これらの文献を引
用することにより本明細書の内容となる］。

前記に示すように、本発明のワクチンに用いられるエン
ドトキシン免疫促進剤は、米国特許第４．４３６，７２
７号および同４，４３６，７２８号明細書に示される方
法により不活化した。「不活化」とは、ニワトリ胚の致
死アッセイに基づくエンドトキシンの毒性（ＬＤＳ。値
）であるＬＤ、。が約０．００１μｇである毒性エンド
トキシンに比較した場合に２０硝以下であることを意味
する。

さらに、本発明のワクチンに用いられるモノリン酸リピ
ドＡ免疫促進剤は、少なくとも１種の追加の細菌性アジ
ュバントをも表わす。前述したように、かかるアジュバ
ントは、（ａ）ミコバクテリア細胞壁骨格、（ｂ）トレ
ハロース・ジミコール酸および（ｃ）微生物のピリジン
可溶性抽出物を含む。

抗原およびＭＰＬと共に用いることができる第１の細菌
性アジュバントは、採取される細胞壁中に通常見られる
多くのタンパクおよび脂質を有する細胞壁の本質となる
細胞壁骨格である。このものは、トレハロース・ミコー
ル酸の残遺物（’Ｐ３Ｊ）および未消化ラベルクロタン
パクを含有する高分子状のミコール酸アラビノガラクク
ンムコペプチドである。限定されるものでないが、細胞
壁骨格は、Ｍ・スメグマチス（肚Ｙ旺鯨旦旦、Ｍ・フレ
イ　（ム匝胆ｕ、ノカルジア・ルブラ（Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ　ｒｕｂｒａ）　、ノカルジア・アステロイデス（Ｎ
ｏｃａｒｄｉａ　ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、コリネバク
テリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｄｉ　ｈｔｈｅｒｉａ）　、コリネバクテリウム・
バルプム（Ｃｏｒυｅｂａｃｔμｍ叩−…旦憇）、Ｍ・
カンサイ　（几上邸ｌ口謙−１Ｍ・ラベルクローシス（
Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）　　［Ｈ３７およびＲ
Ｖおよびアヨマ（Ａｙｏａ＋ａ）　Ｂ株〕およびＭ・ボ
ビス（几上い佳Ω−ＢＣＧ株を含むいずれかの微生物か
ら得られる。さらに、細胞壁骨格は前記以外の生物体、
例えばＥ・コリー（Ｒ，ｃｏｌｉ）　、Ｂ・アポルタス
（］およびコクシェラ・バーネッティイ　（Ｃｏｘｉｅ
ｌｌａ　ｂｕｒｎｅｔｔｉｉ）から得られる可能性もあ
る。細胞壁骨格は、Ｍ・ボビスＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）株をまず増殖し
次いで採取することにより調製することができる。得ら
れた全細胞残渣は、破砕細胞を原形質の不純物から外層
膜または細胞壁を分離する細胞分画装置（Ｒｉｂｉ　Ｃ
ｅ１ｌ　Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ（Ｓｏｒｖａｌｌ　
Ｍｏｄｅｌ　ＲＦ−１））を用いて処理される。次に、
得られた細胞壁を一連の溶媒抽出および酵素処理（例え
ば、トリプシンおよび／またはキモトリプシン）に付し
、精製した細胞壁骨格が得られる。

本発明のワクチンに用いることのできる第２の細菌性ア
ジュバントは、例えばＭ・アビアム（Ｌａｖｉｕｍ）、
Ｍ・フレイ、Ｍ・ラベルクローシス（Ｈ３７Ｒνおよび
Ａｙｏｍａ　８株）、Ｍ・ボビスＢＣＧ、Ｍ・スメグマ
チス、Ｍ・カンサイ、ノカルジア・ルブラ、Ｍ・ボビニ
ス（Ｍ、ｂｏｖｉｎｉｓ）およびコリネバクテリウム・
ジフセリエのような生物体から得ることができるトレハ
ロース・ジミコール酸（ＴＤＭ）である。

Ｍ・マビアムのような細菌が増殖、採取次いで熱殺菌さ
れる。次に細胞塊は、数種の溶媒で抽出され、次いで活
性物の溶解した溶媒画分が抽出される。さらに、この抽
出物は一連の溶媒抽出により精製されて粗ＴＤＭを与え
る（「ミコバクテリア細胞壁に由来する生理活性成分−
１，細胞壁骨格および成分の単離および組成、Ｐ、　３
　」；　Ａｚｕｍａ等、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ
　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ
ｅ。

Ｖｏ　１　、５２．９５〜１０１．１９７４、参照：な
おこの文献は引用することにより本明細書の内容となる
）。

Ａｚｕｍａ等が記載するように、粗ＴＤＭはさらに沈降
微粒子状シリカゲルクロマトグラフィーにより精製して
精製ＴＤＭを与える。また、ＴＤＭは、１９８５年３月
１９日付で登録された米国特許第４．５０５．９００号
明細書に記載の方法に従って調製してもよい。

本発明のワクチンに含ませ得る第３の細菌性アジュバン
トは、約３〜２０重量％のタンパク、約１０〜４０重量
％の糖および約３５〜６０重量％の脂肪酸を含有する微
生物のピリジン可溶性抽出物である。

この抽出物は、約５重量％の各種のタンパク、約３５重
世％の糖および約５重量％の脂肪酸を含むものが好旧い
。

このタンパクは、例えばアスパラギン　　　　　　　　　０．２７３スレオニン
　　　　　　　　　　０．１０８セリン　　　　　　　
　　　　０．５８５ムラミン酸　　　　　　　　　　　
０．２１９グルタミン酸　　　　　　　　　　０．２６
７グリシン　　　　　　　　　　　０．３９アラニン　
　　　　　　　　　　０．１７３のようなアミノ酸を含
む、アミノ酸およびアンモニアを含んでなる。

なお、前記の量は、重量％を意味しそして総タンパクは
６．３４重量％である。

本発明の方法により調製されるピリジン可溶性抽出物は
、次に示すような元素分析値を有することが見い出され
ている。

元素　　　　　重量％炭素　　　　　６０．３５水素　　　　　９．４７酸素　　　　　２３．９１さらに、この抽出物は、次の表に示すような抽出物の同
定に有用な主要ピークを有する赤外線スペクトラムによ
り特徴付けられる。

以下余白 ■ ピーク周波数（ｃｍ−’）　　　　　　同　　定３４０
０（ｂ）　　　　　　　　Ｎｌ＋伸縮３２００〜２５０
０　（ｂ）　　　　分子間水素結合ＯＨピーク２９２０
　（ｓ）　　　　　　　　ＣＨ伸縮１７１０（ｓ）　　
　　　　　　エステルカルボニル伸縮１５４１　（ｍ）
　　　　　　　アミド■吸収帯■（ｂ）−幅広い吸収、
　　（ｓ）−強い吸収、（ｎ＋）＝中程度の吸収ピリジン可溶性抽出物を得るのに使用できる微生物には
、例えばＭ・ボビスＢＣＧ、Ｍ・フレイ、Ｍ・スメグマ
チス、Ｍ・カンサイ、ノカルジア・ルブラ、コリネバク
テリウム・ジフセリエおよびコリネバクテリウム・パル
ブムが挙げられる。特に、コリネバクテリウム・パルブ
ムが好ましい。

微生物の細胞全体が、好ましくはペースト状でピリジン
と混合される。得られた混合物を分離してピリジン可溶
性抽出物を含む上澄とピリジン残渣を得る。場合により
、ピリジン残渣はピリジンを用いる前記の分離方法を繰
り返して、さらに所期の抽出物を採取するために用いて
もよい。

次に、抽出物からピリジンを除去し、乾燥抽出物を齋留
水のような適当な溶媒に対して透析する。

細胞そのものおよび細胞断片の汚染物が存在しないこと
を電子顕微鏡で確認する。次に、得られる精製抽出物を
既知の方法で凍結乾燥して安定な製品とする。

腫瘍会合性抗原を含む混合物である本発明の免疫学的な
アジュバントは、該当する抗原に対する免疫応答を高め
るので、動物およびヒト宿主用の多様な腫瘍ワクチンと
して有用である。事実、精製不活化エンドトキシン（Ｍ
ＰＬ）は、特に投与蛍光たり約１０〜約５０Ｉｔｇの濃
度で上昇した免疫応答を誘発するので、投与蛍光たり約
１０〜約５００ｊＩｇの濃度で使用できることが判明し
た。細胞壁骨格は、好ましくは、投与蛍光たり約２７５
〜約３２５７／ｇの濃度で使用される。トレハロース・
ジミコール酸は、好ましくは、投与蛍光たり約５０〜約
３００ｕｇの濃度で、より好ましくは投与蛍光たり約１
２５〜約１７５μｇの濃度で使用される。ピリジン可溶
性抽出物は、投与蛍光たり約５００〜２４００μｇの濃
度で、より好ましくは投与蛍光たり約７５０〜１２００
ｘの濃度で使用することができる。場合により他の成分
または添加剤を本発明のアジュバントと共に使用しても
よい。

３種類のアジュバントの１種または２種だけが抗原およ
びＭＰＬとして使用される場合には、かカルアジュバン
トの濃度をさらに高いレベルに調整してもよい。しかし
ながら、すべては１Ｉｆｆｉｌ’Ｒ会合性抗原に対する
ワクチンの免疫応答を高めるアジュバントの免疫応答を
高める量が要求される。

本発明のワクチンに用いられる抗原の最適計は、無論、
各個々の腫瘍について多様であり得る。しかしながら、
実際には、投与蛍光たり約１〜約１００■、より好まし
くは約２〜約１１０１ｎの濃度でワクチン中に抗原が一
般に存在することが見い出されている。

腫瘍会合性抗原およびアジュバントは、医薬として許容
され得る担体を使用して本発明のワクチンを調製するこ
とができる。使用し得る前記担体としては、生理食塩水
または油滴乳濁液が挙げられる。使用される油の量は、
組成物の総重量に基づき約０．５〜約３．０容量％であ
る。

本発明のワクチン製剤は、許容され得る方法によりＴＡ
Ａ　、　ＭＰＬおよび生物学的アジュバントを混ぜ合わ
せることにより調製することができる。

前述した如く、温血動物およびヒトの処置用の組成物は
、油滴乳濁液の剤形で使用してもよい。

使用される油の量は、組成物の総重量に基づき約０．５
〜約３．０容量％である。好ましくは約０．７５〜１．
５容量％の油が使用される。かかる油の例としては、軽
質鉱油、スクアラン、７−ｎ−へキシルオクタデカン、
コノコスーパーオイル（Ｃｏｎｏｃ。

５ｕｐｅｒｏｉｌ）およびドラケオール（Ｄｒａｋｅｏ
ｌ）　６　ＶＲ鉱油（Ｐｅｎｎｒｅｃｏ社、Ｂｕｔｌｅ
ｒ、Ｐａ製）が挙げられる。

次に、均一化した油含有混合物を、場合により混合前に
生理食塩水で熔解していてもよい分散剤と一緒にする。

分散剤の量は、具体的には組成物の総量に基づき約０．
０２〜０．２０容量％であり、好ましくは約０．１０〜
０．２０容量％である。分散剤としては、ツイーン（Ｔ
ｗｅｅｎ）−８０およびアラセル（Ａｒｌａｃｅｌ）（
Ａｔｌａｓ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社製）を包含するものを
使用することができる。

分散剤の添加に由来する混合物は、顕微鏡下の観察によ
り測定した場合に、ＭＰＬおよびＣＷＳによって高いパ
ーセンテージの油滴が被覆される懸濁液を形成するよう
に均一化される。

別法としては、生物学的アジュバントを含有する親油性
の乳濁液にＴＡＡの水性懸濁液を添加し、はとんどミル
ク状の懸濁液が得られるまで撹拌により混合または乳化
してもよい。親油性乳濁液は、既知の方法で調製される
（米国特許第４，５２０，０１９号参照）。

本発明のワクチンは、通常、前述の投与量で合計１５回
注入まで週１回、筋肉内、腹腔内または皮下注射により
温血動物に投与される。

本発明のワクチンは、広範な各種の自然および合成のい
ずれの抗原とも会合する自発性腫瘍、ウィルス、細菌、
カビ、またはプロトシア抗原に対する免疫応答を非常に
高める。本発明のワクチンに使用される抗原の要件は、
宿主における免疫応答を誘発することが可能であり、そ
して組み合わされた本発明のアジュバントによりその応
答が高められ得ることだけである。従って、本発明のワ
クチンは、抗腫瘍活性作用を有し、動物およびヒトのい
ずれの多様な腫瘍の治療および予防にを用である。本発
明のワクチンにより処置され得る腫瘍（癌を含む）には
、動物腫瘍、例えばウシ扁平細胞癌、ウシ線維肉腫、ウ
マ類肉腫、ウマ黒色腫、ウマ扁平細胞癌、イヌ乳癌、イ
ヌ腺腫およびイヌ黒色腫、ならびにヒトのｌ１ｊｌ瘍、
例えば卵巣癌、黒色腫、結腸癌、膵臓癌および腎臓癌等
が挙げられる。

本発明のワクチンが腫瘍の退縮をもたらす機構と関連付
けられないとしても、腫瘍会合性抗原およびアジュバン
トの組み合わせ体が非特異的および特異的ないずれかの
免疫応答をも促進することは信じられる。

本発明のワクチンは腫瘍の処置に有効であるにもかかわ
らず、実際的には、これらの抗腫瘍ワクチンを別の療法
様式の処置に対する一方として臨床的に組み込んで使用
することができる。なぜならば、有する腫瘍が患者の免
疫系により処理することができる程十分小さい場合には
、免疫療法が最も有効であり得るからである。従って、
進行した疾患を有する患者は、できるならば何等かの処
置を受けて有している腫瘍を減少せしめ、次いで残存す
る腫瘍細胞を除去するために本発明の抗腫瘍性ワクチン
を受けるであろう。対となる処置としては、手術、化学
療法もしくは放射線療法、または有する腫瘍を効果的に
減少せしめるその他のすべての方法が挙げられる。また
対となる処置は、他の方法が免疫療法、例えばインター
ロインキン−２の投与のようなものであってもよい。

例として、以下に当該技術分野で既知の手段を用いる細
菌成分、腫瘍および腫瘍細胞、ならびに腫瘍細胞ワクチ
ンの調製および評価を示す。

１、　　　　＼の言、′ 粗エンドトキシンを有機溶媒抽出によりサルモネラ・ミ
ネソタ　（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍ１ｎｎｅｓｏｔａ
）（Ｒ５９５株）の多糖欠失、ヘプトース欠失Ｒｅ変異
菌株から単離した。この菌株は、Ｎ　Ｉ　Ｈ（ＮＩＡＩ
Ｄ、Ｒｏｃｋｙ　Ｍｏｕｎ−ｔａｉｎ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ＋Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔａｎａ）から入手
した。単にＫＤＯおよびリピドＡだけからなるこのエン
ドトキシンは、典型的な内毒素リボ多糖というよりはむ
しろ糖脂質であり、適当な極性の有機溶媒を用いる分別
沈殿により精製した。次に、このものを０．ＩＮの沸騰
塩酸で処理して遊離脂肪酸および構造類似の無毒性モノ
リン酸リピドＡ（ＭＰＬ）からなる複合混合物を得た。

これらの成分を加圧溶出カラムクロマトグラフィーによ
り分離した。薄層クロマトグラフィーでＭＰＬの構造類
似物に相当する溶離画分を集め、毒性について試験した
。ニワトリの胚への静脈内接種に対するそれらの５０％
が死亡するｆｆ１（ＣＥＬＤ、。）が１０ｎ以上である
場合にそれらを動物実験に適するものとした（原料エン
ドトキシンに対する致死量は０．００１河以下である）
。

２、　ミコバクテリア　　辞ｘ　　　ｃｗｓ　　のｉム
！！１１１ミコバクテリア・ボビス（Ｍ　ｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ株（ＮＩＨ（前記）か
ら得た〕の細胞壁を、５ｏｒｖａｌｌ−Ｒｉｂｉの細胞
分画装置（Ｍｏｄｅｌ　ＲＦ−１）を用いて調製した。

１０〜１５°Ｃの温度で３５，０００ｐｓｉ　の圧をか
けて、このミコバクテリア細胞壁を「破砕」し、次いで
原形質を可溶性状態として押し出した。

次に、遠心により細胞壁膜を採取し、遠心および水中へ
の懸濁を繰り返すことにより精製した。

その後、細胞壁をＲＮＡ分解酵素およびＤＮＡ分解酵素
で処理して核酸を除去し、次いで一連のタンパク分解酵
素および洗浄剤で処理して、それぞれタンパクおよびペ
プチドを除去した。最後に、調製品は有機溶媒で徹底的
に抽出して１遊離の脂質」を除去した。この得られたＣ
ＷＳは、高分子状ミコール酸−アラビノガラクタンムコ
ペプチド複合体から成っていた。

３、トレハロース・ジミコール　　ＴＤＭ　　のミコバ
クテリアの細胞全体を、最初にエタノールで、次いでア
セトンで、そして最後にクロロホルムとメタノールの混
合液（ＣＨ２：１）で抽出した。ＣＭ抽出物は、ＴＤＭ
より低いかまたは高い極性を有する汚染脂質が混ざった
ＴＤＭを含んでいた。これらの脂質を、ＴＤＭは溶解相
に残こすがそれらは溶解しない有機溶媒の組成物を用い
て、該脂質を沈殿させることにより選択的に分離した。

得られた「粗ＴＤＭ、を加圧溶出クロマトグラフィーで
精製した。Ｔ’Ｌ　Ｃによる測定でＴＤＭの単一成分を
含有する溶離画分を集めて試験に使用した。

Ｃ，ＣｕＣｕｍｍ１ｎ博士（Ｖｉｒｇｉｎｉａ　Ｐｏ１
ｙｔｅｃｈｎｉｃ　Ｉｎ５ｔｉ−ｔｕ　ｔｅ）から入手
したＣ・パルブム（シ皿ユ」）の熱殺菌細菌の全体を、
３７°Ｃのピリジンで３度抽出し、合わせたピリジン可
溶性抽出物をフラッシュ・エバポレーターで濃縮し、透
析しそして凍結乾燥した。高い抗腫瘍活性と非常に低減
した毒性を有する物質を得た。

２、ｉ′　　に　いるマウス　３ｊｊラド房几暫１、分
立すべてのＩｌｌ瘍試験は、６〜８週令のＣ３ｔｌＢ／Ｆ
ｅＪ雌のマウスまたはいずれか一方の性のＣ５７ＢＬ／
１０およびＤＢＡ／２マウスについて実施した。マウス
は、Ｒｉｂｉ　Ｉｌｎｍｕｎｏ　Ｃｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ社（Ｈａｍｉｌｔｏｎ。

Ｍｏｎｔａｎａ）の生産群体から人手した。ＤＢＡ／　
２およびＣ２ｆｔＢ／ＦｅＪマウスの親株は、Ｊａｃｋ
ｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ　ｌ１ａｒｂｏ
ｒ、Ｍａｉｎｅ）から購入した。

同系交配株−２のシーウェル・ライト（Ｓｅｗｅｌｌ−
Ｗｒｉｇｈｔ）モルモットは、前記Ｒｉｂｊ　Ｉｍｍｕ
ｎｏ　ＣｈｅｍＲｅｓｅａｒｃｈの生産群体から入手し
た。いずれか一方の性のモルモットは、３５０〜５００
ｇの体重のものを実験に用いた。

２、　　ＭｉＪＩｔ白血病ＥＬ−４細胞（Ｂｒｕｃｅ　Ｃｈｅｓｅｂｒｏ博
士（ＮＴＤＩＤ。

Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｍｉｌ
ｔｏｎ、Ｍｏｎｔａｎａ）から入手］、卵巣癌ＭＯＴ細
胞（Ｊ、Ｂｅｒｅｋ博士（ＩＪＣＬＡ、　ＬｏｓＡｎｇ
ｅｌｅｓ、Ｃａ）から入手〕、およびリンパ腫Ｐ３８８
細胞（ＡＴＣＣから入手）を、それぞれＣ５７ＢＬ／１
０　。

Ｃ３ＨＢ／ＦｅＪおよびＤＢＡ／　２マウスに連続して
接種することにより腹水の形で維持した。腫瘍細胞を腹
腔から採取し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）２０ｄで洗浄
した。赤血球（ＲＢＣ）を１％のシュウ酸アンモニウム
１０滅に溶解した。３０秒後、ＰＲＳ　４０ｍを添加す
ることにより生理学的な浸透性を回復させた。細胞を遠
心によりペレットとし、２〜５×１０４個の細胞の接種
物がＰＢＳ０．１ｄ中で投与されるように細胞量を調整
した。

系統−１０の肝癌細胞を連続的な腹腔内接種により同質
遺伝子性株２のモルモットに腹水の形で維持した。１Ｉ
ｆｆｌｌｌＪ！細胞を腹水症にかかっている供給体から
採取し、滅菌生理食塩水で３度洗浄し、次いで２０Ｘ１
０’個の腫瘍細胞／ｄに調整した。

３、　　　　・ｉ　のＵ前記と同一の供給源から入手したＥＬ−４、ＭＯＴまた
はＰ３８８腫瘍細胞を前述のごとく調製し、腫瘍細胞懸
濁液０．２　ｄを０日令のマウスの適当な同質遺伝子性
株の腹腔内に接種した。腫瘍対照はそれ以上の処置をな
にも行わなかった。腫瘍を移植した後、種々の時期（１
日〜６日目）にて、前記免疫療法剤の単独腹腔内注射を
した。それぞれの群の動物を連日観察して生存率および
／または腫瘍塊の減少率を測定した。系統−１０の腫瘍
は、１０ｂ個の腹水の増殖腫瘍細胞の皮肉注射によりモ
ルモットにおいて樹立した。免疫療法剤を、６日後（！
１ｍ瘍の直径が９〜１１１ＩＩＩ１１になったとき）に
病巣内に０．４　ｍｆｌＯ量で投与した。

腫瘍抗原は、３ＭのＫＣＩ！、抽出を用いる変法により
調製した。具体的には、ＰＢＳ中の３ＭのＫＣｌを５ｄ
当たり３Ｘ１０”個細胞濃度における生きた腫瘍細胞の
細胞ペレットに添加した。この懸濁液を４℃で１８〜２
４時間撹拌し、４°Ｃにおいて２時間１００，０ＯＯＸ
　ｇで遠心した後、ペレットを廃棄し、上澄液を蒸留水
に対して４°Ｃで２４時間透析した。透析物をさらに４
°Ｃにおいて２時間１００．０ＯＯＸ　ｇで遠心し、透
析後に形成する精製したゼラチン状沈殿を採取した。次
に、この物質を凍結乾燥した。

腫瘍を有する宿主から得られる系統−１０のモルモット
腫瘍；マウスＥｌ−４、？ＩＯＴおよびＰ２Ｓ５　；な
らびにウシの眼の扁平細胞癌（ＢＯ３ＣＣ）およびウマ
類肉腫（ＥＳ）を前記の方法で抽出した。さらに、均質
化したＢＯ５ＣＣおよびＥＳの生理食塩水懸濁液を、変
性フェノール法で抽出した。

２、迫摘１屓彼辺■製１１ｆｆｌ瘍の可溶性抽出物を含有する油滴乳濁液を、
既に公表されている（米国特許第４，５２帆叫９号明細
書）ようなＣＷＳ　、　ＴＤＭおよびＭＰＬを各種の組
み合わせにより調製した。

３、馴１刀ｊ」づり「Ｈ１戊訣木質的には、治療方法は既に公表されているようなもの
である。元来、２〜５Ｘ１０’個の腹水の増殖腫瘍細胞
を用いるマウスまたはモルモットのＳ、Ｃ，注射により
樹立される。接種後７日目（腫瘍が約４ＩｎＩＩ＋の直
径となったとき）にマイトマイシンＣの２５■または１
００鱈を病巣に投与した。２日後に、ワクチンを種々の
経路で注入した。治癒率を未処理動物の生存率と比較し
た。治癒した動物は、同類の腫瘍細胞を用いる連続的な
攻撃への抵抗性について試験した。

４、　ウシおよびウマの　　　　　の　　・　　２、広ウシの眼の扁平細胞癌（ＢＯ３ＣＣ）は、ヘルツオード
（）ｉｅｒｆｏｒｄ）牛の母集団の約４．７％および一
般牛の母集団の０．８％〜１．６％に自然に発生する潜
在的な転移性を有する自発性の癌である。ウマ類肉腫（
ＥＳ）は、局所的な攻撃性の皮膚腫瘍であり、馬にもっ
とも普通に自発する腫瘍である。これらの腫瘍は容易に
転移しないが、局所的な侵入力を有し、そして非攻撃性
である。

計１４０重Δ八−のへ験腫瘍モデル、（ａ）直系交配株２のモルモットにお
ける系統−１０の肝癌細胞および（ｂ）文系交配Ｃ３Ｈ
Ｂ／ＦｅＪマウスにおけるマウス卵巣癌（ＭＯＴ）は、
Ｒ４ｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｃｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
社（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔａｎａ）におけるこれ
らの宿主の既存する繁殖群体から入手した。

さらに次の３種マウス腫瘍の細胞株を得た。Ｌ−１２１
０白血病細胞は、Ｊｅｒｒｙ　Ｋ１１ｌｉｏｎ博士（Ｏ
ｒａｌＲｏｂｅｒｔｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｔｕｌ
ｓａ、ＯＫ）入手し；ＥＬ−４リンパ腫細胞は、Ｂｒｕ
ｃＢ　（：ｈｅｓｅｂｒｏ博士（前述）から入手し；そ
してＰ−３８８リンパ腫細胞はＡＴＣＣより購入した。

これらのｌｌｌ瘍細胞株を維持させそして腫瘍の退縮を
試験するためのＢＪｚＦ＋およびＣ３ＨＲ／ＦｅＪマウ
スは、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ
　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｍａｉｎｅ、）から購入した。

本発明のＭＰＬおよび他の細菌性抗腫瘍成分を組み合わ
せて使用するための腫瘍会合性抗原（ＴＡＡ）は、３Ｍ
のＫＣｆ抽出法によりＭＯＴ卵巣癌細胞、ＥＬ−４リン
パ腫細胞、Ｐ−３８８リンパ腫細胞およびＬ−１２１０
白血病細胞から単離した。

具体的には、マウスの適当な株の群に０．５〜１×１０
５個の生きた腫瘍細胞を腹腔内注入した。８〜１０日後
に腹水を集め、遠心により細胞を採取した。目標の腫瘍
細胞を３ＭのＫＣＩ！、で−夜抽出した。遠心により水
可溶性抽出物を得て、透析次いで凍結乾燥した。さらに
、前述の方法を用いて株２のモルモットの腹水で増殖し
た系統−１０の腫瘍細胞からＴＡＡも入手した。

また、ＴＡＡ抽出物を馬における２種の自然発生した類
肉腫から入手した。固形類肉腫腫瘍を３ＭのＫＣｌ中で
均質化し、４°Ｃで一夜抽出した。

水抽出物を遠心で集め、透析次いで凍結乾燥した。

試験は、ＭＰＬと組み合わせた場合に、細胞壁骨格（Ｃ
ＷＳ）と同様にＰＡ　−ＰＥおよびミコバクテリアのト
レハロース・ジミコール酸（ＴＤＭ）が、株２のモルモ
ットにおける系統−１０の腫瘍に効果を有することを確
認する目的で実施した。得られた結果を次の第１表に示
す。

以下余白第ユ」−一表ン：２′°のゞＰＥ　Ｃ，ル猛易＋ｍ　＋ＭＰＬ　＋ＴＤ門　　５００
＋５０＋１００　１７／１９　　８９．５ＰＥ　Ｃ，ル
ドと徂＋にＰＬ十ＴＤＭ　　１００＋５０＋５０　５／
１０　　５ＯＰＥ　Ｃ，匹■憇＋ＴＤＭ　　　　　５０
０　＋　１００　　　３／９　　３３ＰＥ　Ｃ，ル匹μ
徂十？ＩＰＬ　　　　　　５００＋５０　　　　１／９
　　　１１ＰＥζ巨■憇　単独　　　５００　　　　　
０／７　　０ＭＰＬ　　＋　ＴＤＭ　　　　　　　　　
　５００＋１００　　　０／６　　　０ａ）株２のモル
モットに２Ｘ１０’個の系統−１０の腫瘍細胞を０日目
に１．Ｄ、接種した。免疫促進剤を６日目（腫瘍が８〜
１０閣の直径になったとき）に病巣内に投与した（０．
４ｍｌ／動’４ｋ）、　　　　　　　　　　　　　　　
　　以下余白側」４次の試験は、Ｃ３ＨＢ／ＦｅＪマウスにおけるＭ　ＯＴ
卵巣癌細胞の退縮に対するＭＰＬ単独またはＰＡ−ＰＥ
との組み合わせ体として含有する水溶液の有効性が確認
できることを示す。雌のマウスに０日目に２Ｘ１０’個
のＭＯＴ細胞を接種し、２４時間後に免疫療法剤を投与
した。第２表かられかるように、ＰＡ−ＰＥ１２００μ
ｇかまたはＭＰＬ　２４０■のいずれのマウスへの投与
も、活性が小さいかまたはまったく抗腫瘍活性がないこ
とが観察された。しかしながら、ＰＡ　−ＰＥ　十ＭＰ
Ｌの組み合わせ体で処置したマウスでは、顕著な抗腫瘍
活性（８８％腫瘍フリー）を示した。さらに、免疫促進
剤の投与量が減少するにつれて腫瘍フリーの動物がより
少くなる如く、応答が投与量に左右された。この結果を
、次の第２表に示す。

以下余白】ユ」Ｌ−表ＰＡ−ＰＥ＋ＭＰＬ　　　１２００＋２４０　　　　　
４３／４９　　　　　　　　　　　　８８Ｐ八−ＰＥ＋
ＭＰＬ　　　６００＋１２０　　　　　　　４／８　　
　　　　　　　　　　　　　　５０ＰＡ−ＰＥ＋ＭＰＬ
　　３５０＋７５　　　　　　０１５　　　　　　　　
　　　０ＭＰＬ　　　　　　　　２４０　　　　　　　
　　２／８　　　　　　　　　　　２５ＰＡ−ＰＥ　　
　　　　１２００　　　　　　　　０／８　　　　　　
　　　　　０なし　、　　　　　　　　　　０１５４　
　　　　　　０ａ）雌Ｃ３ＨＢ　／　ＦｅＪマウスに１
〜２Ｘ１０’個のＭＯＴｌｌｉ瘍細胞を０日目にｔ、ｐ
、接種し、移植後２４時間して免疫促進剤をｉ、ｐ、投
与した（　０．５　ｍｌ　／　７ウス）、ｂ）腫瘍移植
後の６００日目確認された腫瘍フリー動物の数。

、例ｊユ可溶化腫瘍抗原（ＴＡＡ）が、ＭＯＴを接種してＭＯＴ
腫瘍を維持いるマウスに対し、ＴＡＡ単独で抗腫瘍活性
を促進するか否か、または効能を示さない濃度のＰＡ　
−ＰＨ十ＭＰＬにＴＡＡを添加した組み合わせ体が前記
活性を促進するか否かを確認することを目的とする（第
３表）。

５００カまたは３５０犀のＴＡＡ単独で処置したマウス
においては、まったく抗腫瘍活性は観察されなかった。

しかしながら、ＴＡＡ　５００硝をＰＡ　−ＰＥ　＋Ｍ
ＰＬと組み合わせた場合、腫瘍移植後６００日目マウス
の１００％が腫瘍フリーとなった。なお、何等の処置も
行わなかった腫瘍対照群に対する生存期間は２１日であ
った。結果を次の第３表に示す。

［〕丁、下二ｉ。

第一」Ｌ−表ＴＡＡ　　　　　　　　　　　　５００　　　　　　　
　０／８　　　　　　　　　０ＴＡＡ　　　　　　　　
　　　　３５０　　　　　　　　０１５　　　　　　　
　　０Ｐ八−ＰＥ十ＭＰＬ　　　　　　　　３５０＋７
５　　　　　　　０１５　　　　　　　　　　　　０Ｔ
ＡＡ＋ＰＡ−ＰＥ＋ＭＰＬ　　３５０＋３５０＋７５　
２１５　　　　　　　　　４０ＴＡＡ＋ＰＡ−ＰＥ＋Ｍ
Ｐｌ；　　５００＋３００＋６０　８／８　　　　　　
　　　１００ａ）雌Ｃ３ＨＢ／ＦｅＪマウスに１〜２×
１０４個のＭＯＴ腫瘍細胞を０日目にｉ、ｐ、接種した
。免疫促進剤を腫瘍移植後２４時間してｉ、ｐ、投与（
０，５ｄ／マウス）した。ｂ）腫瘍移植後６００日目腫
瘍フリー動物の数を測定した。

以下余片 ±１ＴＡＡをＰＡ　−ＰＲ＋　ＭＰＬと組み合わせることに
より顕著な抗腫瘍活性が観察されるとはいえ、Ｉｔ！１
瘍移植経過後の投与時間を延長した場合に、その抗腫瘍
効果を確認することは興味深いことである。

０日目に２Ｘ１０’個のＭＯＴ細胞をマウスに接種し、
その後１，２．３または４日目に治療した（ＰＡ−ＰＥ
＋ＭＰＬまたはＴＡＡ　＋　ＰＡ　−ＰＲ＋　ＭＰＬ）
。ｌ１１瘍細胞を移植した後１日目または２日目に投与
を行う場合には、ＰＡ　−ＰＲ＋　ＭＰＬ単独またはＴ
ＡＡとの組み合わせ体による療法効果が観察された。し
かしながら、３日目および４日目では腫瘍フリーの動物
により測定する場合、抗腫瘍活性の量は著く減少した。

抗腫瘍活性のこの減少は、腫瘍の負荷が増大することに
帰因するようである。そこで、マイトマイシンＣを用い
る化学療法によりＩ！＊ｉの負荷を減少せしめる試験を
計画した。結果を次の第４表にまとめた。　　　　　　
　　　以下余白迅−」し−表Ｐ＾−Ｐε＋ＭＰＬ　　　　　　　１　　　　　　　　
５／６　　　　　　　　　　８３（１２００ｐｇ＋　　
２４０μｇ）　　　　２　　　　　　　　４／６　　　
　　　　　　　６７ＴＡＡ＋ＰＡ−ＰＥ＋ＭＰＬ　　　
　１　　　　　　　　５／６　　　　　　　　　　８３
（５００＋３００　　＋６０）　　　　２　　　　　　
　　４／６　　　　　　　　　　６７ＴＡＡ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　
　　　０／６　　　　　　　　　　　　　　　０なし　
　　　　　　　　　　　　０７６０ａ）雌Ｃ３）１８／
ＦｅＪマウスに１〜２×１０４個のＭ○Ｔｌｉ瘍細胞０
日目にｉ、ｐ、接種した。免疫促進剤を腫瘍移植後１，
２．３または４日日ｉ、ｐ。

投与（０，５ｄ／マウス）した。ｂ）腫瘍移植後６００
日目腫瘍フリー動物の数を測定した。

■１組み合わせ化学免疫療法の効果試験の目的で、０日目に
ＭＯＴＩＩＩ！細胞をマウスに与え、２〜６日目にマイ
トマイシンＣを腹腔内投与した。免疫療法剤を医薬投与
後３０〜３６時間目に投与した。使用されるマイトマイ
シンＣの投与量は、腫瘍を有するマウスを６日目にいろ
いろな量の医薬の■π腔投与により処置することによっ
て予め決定した。

毒性がないことおよび最小の療法効果（退縮率２０％）
に基づき投与１ｉ　１００！！ｇが選ばれた。

腫瘍を有するマウスを６日目にマイトマイシンＣで処置
し、次いで３１時間後に免疫療法剤で処置した場合の試
験結果を第５表に示す。予め化学療法を施すことなく免
疫療法剤で処置したすべてのマウスは、進行性の腫瘍増
殖により死亡した（データは示していない）、シかしな
がら、低い投与量では最小の活性が見られる医薬および
ＴＡＡ＋　ＰＡ　−ＰＥ　＋　ＭＰＬの高い量を投与さ
れた群では、５０％の応答率が観察された。

Ｔへへ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０
０　　　　　　　　０／６　　　　　　　　　　　　　
０　　　　　　０Ｔ八八＋ＰＡ−ＰＲ＋ＭＰＬ　　　５
００＋３００＋６０　　　　　３／６　　　　　１／６
　　　　　５０　　　　　　１７ＴＡ八十Ｐ八−ＰＨ＋
ＭＰＬ　　　５００＋１２００＋２４０　　　３／６　
　　　　３／６　　　　　５０　　　　　　５０ＰＡ−
ＰＥ＋ＭＰＬ　　　　３００＋６０　　　０／６　　　
　　０　　　０ＰＡ−Ｐｉ！＋ＭＰＬ　　　　１２００
＋２４０　　　２／６　　１／６　　３３　　１７Ｍ０
Ｔ細胞単独　　　　　　　　　　　　０／６．　　　　
　００ａ）雌Ｃ３ＨＢ／ＦｅＪマウスに１〜２×１０４
個のＭＯＴ腫瘍細胞を０日目にｉ、ｐ、接種した。化学
療法剤を６日目に投与し、次いで３１時間後に免疫療法
剤を投与した。

梱。

腫瘍の移植と化学療法の間の時間を変更した以外は例９
の方法を繰り返した。免疫療法剤をマイトマイシン剤の
投与後３３時間目に与えた。結果を次の第６表に示す。

ふ゛Ｚ７全７余第−」Ｌ−表堕１ニュ伏ＪＪ【以肱果Ａ　　　　ＰＡ−ＰＥ＋ＭＰＬ　　　　　３００＋６０
　　　　　　４／６　　　　６７　　　＞５４ＢＰ八−
ＰＥ＋ＭＰＬ　　　　　　　　　１２００＋２４０　　
　　　　　　　　５／６　　　　　　　　　８３　　　
　　　　　〃ＣＴＡＡ十ＰＡ−ＰＥ＋ＭＰＬ　　５００
＋３００＋６０　　　５／６　　　　　８３　　　　Ｎ
Ｄ　　　　／／　　　〃〃５００＋１２００＋２４０　
　６／６　　　　１００　　　　／／Ｅ　　　　／／　
　　〃／／　　　１０００＋３００＋６０　　　４／６
　　　　　６７　　　　ＮＦ〃〃〃１０００＋１２００
＋２４０５７６８３〃ＨＰＡ−ＰＥ＋ＭＰＬ　　　　１
２００＋２４０　　　　５／６　　　　８３　　　＞５
４１　　　　　ＴＡＡ＋ＰＡ−ＰＥ　＋ＭＰＬ　　　５
００＋３００＋６０　　　　５／６　　　　　　８３　
　　　　ノｌＪ　　　　〃〃／／　　　５００＋１２０
０＋２４０　　６／６　　　　１００　　　　／／Ｋ　
　　　〃〃”　　１０００＋３００＋６０　　４／６　
　　　６７　　　　’／Ｌ　　　　Ｎ　　　〃／／　　
１０００＋１２００＋２４０　　５／６　　　　８３　
　　　／／Ｎ　　　　　　　ＴＡ八　　　　　　　　　
　　　　　　　１０００　　　　　　　　　　　　　　
　１／６　　　　　　　　　１７　　　　　　３５０　
　　　ＴＡＡ＋ＰＡ−ＰＥ＋ＭＰＬ　　５００＋１２０
０＋２４０　　３／６　　　　５０　　　３７Ｐ〃〃〃
１０００＋３００＋６０３／６５０４３Ｑ　　　　〃〃
〃１０００＋１２００＋２４０　　４／６　　　　６７
　　　＞５４Ｒ対照、　ＭＯＴ細胞のみ　　　−０／６
　　　　　０　　　２４Ｓ　　　ＭＯＴ！ＩＩ胞のみの
（可なし）−０／６　　　　　　　　　２２ａ）グルー
プループプ２日目にマイトマイシンＣが投与された場合には、化学
免疫療法または化学療法のみを受けたこれらのグループ
間で著しい相違は見られなかった。

従って、早期に行われた場合には、化学療法はめざまし
い効果を有する。一方、４日または６日目にマイトマイ
シンＣだけを投与した動物では化学療法効果かまった（
見られないが、免疫療法と組み合わせた場合には、著し
い抗腫瘍効果が観察された。この抗腫瘍活性は、ＰＡ　
−　ＰＥ　＋　ＭＰＬだけを投与するか、ＴＡＡと組み
合わせて投与したマウスに見られた。

今までの試験は、ＭＰＬおよび細胞壁骨格が、株２のモ
ルモットにおける樹立系統一１０の腫瘍の退縮で測定し
た場合に著しい抗腫瘍活性を有することを示した。次の
試験は、ＭＰＬ　＋　ＣＷＳへの可溶性ＴＡＡの添加が
、その抗腫瘍活性を促進するか否かについて示す。同系
交配株２のモルモットに２Ｘ１０’個の生きた系統−１
９Ｉｌ！１瘍を０日接種した。免疫療法剤を、６日目（
腫瘍が直径８〜１０世になったとき）に水中油性の乳濁
液として腫瘍内に直接投与した。結果を第７表に示す。

以下余白男−ニし一表一　〇″′　六３種混合（ＣＷＳ　＋　ＭＰＬ　＋　ＴＤＭ）　　５０　＋　５
０　＋　５０　　　３／７　　　　　　４３ＬＩＯ−Ｔ
ＡＡ＋　　　　　　　　　　　１０００　　　　　　　
　　　５／７　　　　　　　　　　　　　７１３種混合
　　　　　５０　＋　５０　＋　５０ＤＥＴＯＸ　　　
　　　　２００　＋　２０　　　　１／７　　　　　　
１４（ＣＩ十ＭＰＬ）ＬＩＯ　−　ＴＡＡ　＋　　　　　１０００　　　　　
２／７　　　　　　２９ＤＥＴＯＸ　　　　　　　２０
０　＋　２０ＬＩＯ　−　ＴＡＡのみ　　　１０００　
　　　　０／７　　　　　　　０！示された結果は、腫
瘍内注入に対するものである。これらの組み合わせ体を
対側の脇腹に投与した場合には、まったく抗腫瘍活性は
観察されなかった（’Ｏ／７）。

Claims

【特許請求の範囲】１、宿主の腫瘍の治療および予防のために有用なワクチ
ンであって、（ａ）少なくとも１種の腫瘍会合性抗原、（ｂ）精製不活化エンドトキシン免疫促進因子、（ｃ）
（１）ミコバクテリア細胞壁骨格、（２）トレハロース・ジミコール酸、および（３）微生
物のピリジン可溶性抽出物、を含んでなる群から選ばれ
る少くとも１種の生物学的免疫促進因子、ならびに（ｄ）医薬として許容され得る担体、を含んでなる前記
ワクチン。２、精製不活化エンドトキシンが、リン１ｍｇ当たり約
３５０〜４７５ｎｍｏｌおよび脂肪酸１ｍｇ当たり約１
７００〜２０００ｎｍｏｌで検出できる２−ケト−３−
デオキシオクトン酸をまったく含んでおらず、かつ前記
微生物に由来するピリジン可溶性抽出物が、約７〜２０
重量％のタンパク、約１０〜１６重量％の糖および約３
５〜５５重量％の脂肪酸を含む請求項１記載のワクチン
。３、精製不活化エンドトキシンがモノリン酸リピドＡで
ある請求項１または２記載のワクチン。４、成分（ｃ）が、ミコバクテリア細胞壁骨格、トレハ
ロース・ジミコール酸、微生物のピリジン可溶性抽出物
、ミコバクテリア細胞壁骨格およびトレハロース・ジミ
コール酸の組み合わせ体、ミコバクテリア細胞壁骨格お
よび微生物のピリジン可溶性抽出物の組み合わせ体、ト
レハロース・ジミコール酸および微生物のピリジン可溶
性抽出物の組み合わせ体またはミコバクテリウム細胞壁
骨格、トレハロース・ジミコール酸および微生物のピリ
ジン可溶性抽出物の組み合わせ体である請求項１〜３の
いずれかに記載のワクチン。５、（ａ）少なくとも１種の腫瘍会合性抗原、（ｂ）精
製不活化エンドトキシン、（ｃ）（１）ミコバクテリア細胞壁骨格、（２）トレハロース・ジミコール酸、および（３）微生物のピリジン可溶性抽出物、を含んでなる群から選ばれる少くとも１種の生物学的免疫
促進因子、ならびに（ｄ）医薬として許容され得る担体、の混合物を形成す
ることを含んでなる宿主の腫瘍の治療および予防のため
に有用なワクチンの製造方法。６、精製不活化エンドトキシンが、リン１ｍｇ当たり約
３５０〜４７５ｎｍｏｌおよび脂肪酸１ｍｇ当たり約１
７００〜２０００ｎｍｏｌで検出できる２−ケト−３−
デオキシオクトン酸をまったく含んでおらず、この精製
不活化エンドトキシンがモノリン酸リピドＡであり、前
記成分（ｃ）がミコバクテリア細胞壁骨格、またはトレ
ハロース・ジミコール酸、または微生物のピリジン可溶
性抽出物、またはミコバクテリア細胞壁骨格およびトレ
ハロース・ジミコール酸の組み合わせ体、またはミコバ
クテリア細胞壁骨格および微生物のピリジン可溶性抽出
物の組み合わせ体、またはトレハロース・ジミコール酸
および微生物のピリジン可溶性抽出物の組み合わせ体、
またはミコバクテリア細胞壁骨格、トレハロース・ジミ
コール酸および微生物のピリジン可溶性抽出物である請
求項５記載の方法。