CH683101A5 - T-Zellen-Epitope. - Google Patents

T-Zellen-Epitope. Download PDF

Info

Publication number
CH683101A5
CH683101A5 CH1608/92A CH160892A CH683101A5 CH 683101 A5 CH683101 A5 CH 683101A5 CH 1608/92 A CH1608/92 A CH 1608/92A CH 160892 A CH160892 A CH 160892A CH 683101 A5 CH683101 A5 CH 683101A5
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
sequence
cell epitope
trat
cell
molecule
Prior art date
Application number
CH1608/92A
Other languages
English (en)
Inventor
Gregory John-Jones Russell
Andrew Francis Geczy
Original Assignee
Biotech Australia Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotech Australia Pty Ltd filed Critical Biotech Australia Pty Ltd
Publication of CH683101A5 publication Critical patent/CH683101A5/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
Beschreibung
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte oder synthetische Sequenzen von oder abgeleitet von TraT (einem Proteinmolekül, welches aus der äusseren Membrane gewisser Stämme von Escherichia coli isoliert wird) welche als T-Zellen-Epitope wirken. Solche Sequenzen können verwendet werden für die Herstellung von Vakzinen, welche die Verwendung von Trägerpeptiden miteinbeziehen, um die Antikörperproduktion gegen ein Immunogen zu erhöhen und/oder starke zeilmediierte Immunität gegen das Immunogen zu stimulieren, währenddem sie die Verwendung langer Trägerproteinmoieküle vermeiden.
Stand der Technik
Die Erzeugung einer Immunantwort gegen ein Pathogen (bakteriell, viral oder parasitär) hängt in erster Hinsicht von der Freisetzung des entsprechenden Stimulans gegen das Immunsystem des Wirts ab. Das Pathogen oder infizierende Mittel versieht den Wirt mit einer Anzahl immunstimulierender Verbindungen oder Antigenen, welche gewöhnlich grosse Moleküle wie Proteine, Polysaccharide oder Gly-coproteine sind. Diese Antigene können einen oder mehrere verschiedene Reaktionstypen durch den Wirt hervorrufen in dem Bestreben, den eindringenden Organismus zu zerstören oder zu eliminieren. Dementsprechend kann das Antigen T-Zellen stimulieren, weiche zeilmediierte Immunität bereitstellen und/oder ein Antigen kann B-Zellen stimulieren, damit sie mit der Antikörper-Synthese und -Sekretion beginnen (humorale Immunität). Die Entwicklung und der Unterhalt der schützenden Immunantwort des Individums gegen ein fremdes Antigen ist gewöhnlich abhängig vom Erlangen eines kritischen Niveaus der Stimulation sowohl der zellmediierten als auch der humoralen Immunität.
Bei der Erzeugung einer schützenden Immunantwort ist häufig ein bestimmter Typ einer T-Zelle, eine Helfer-T-Zelle notwendig, um die B-Zelle bei der Bildung und Ausscheidung löslicher Antikörper zu unterstützen. Diese Helfer-T-Zellen treten auch mit Antigenen auf der Oberfläche von antigenpräsentieren-den Zellen, wie Makrophagen, in Wechselwirkung und erkennen diese Antigene und sie mediieren die Aktivierung und Differenzierung von B-Zellen, indem sie lösliche Faktoren (Cytokine) freisetzen.
Gewisse kleine Moleküle, die Haptene genannt werden, und für welche kurze Peptide ein Beispiel sind, sind gewöhnlich nur schwach immunogen, während grössere Moleküle, wie Proteine und einige Polysaccharide gewöhnlich immunogen sind, so dass sie eine zufriedenstellende schützende Antwort hervorrufen. Um die Probleme zu verhindern, dass Immunität bei schwach immunogenen Molekülen hervorgerufen wird, wurden Versuche gemacht, deren Immunogenität zu erhöhen, indem sie an «Trä-ger»-Moleküle gebunden wurden. Diese Träger, welche üblicherweise immunogene Proteine sind, wirken dadurch, dass sie den kooperativen Effekt der T-Zelle stimulieren, welcher bei natürlichen immunogenen Molekülen auftritt. Das heisst, dass ein schwach immunogenes Antigen, welches an einen Träger gebunden ist, Hilfe der T-Zelle bei der Antikörperproduktion hervorlocken wird. Indem die T-Zellen durch Träger-Determinanten in Anspruch genommen werden, werden die B-Zellen mit der Produktion von Antikörpern beginnen, nicht nur gegen den Träger selbst, sondern auch gegen die gebundene antigene Determinante.
Obschon allgemein akzeptiert wird, dass das Trägerprinzip eine wirksame Methode für die Verbesserung der Effizienz von Vakzinen ist, ist die Anzahl der Proteine, welche aus ethischen Gründen für die Verwendung als wirksame Trägerproteine für die Verwendung beim Menschen akzeptiert werden, ziemlich begrenzt. Diese schliessen Tetanustoxoid und Diphtherietoxoid ein. Die beschränkte Anzahl an zur Verfügung stehenden Trägerproteinen bedeutet, dass in einer grossen Anzahl an Vakzineprodukten eines dieser Proteine verwendet wird, und mehrfache Immunisierungen mit Produkten, welche zu diesen Trägern konjugiert sind, erhöhen die Möglichkeit, dass unerwünschte Reaktionen gegenüber diesen Trägern auftreten können. Ausserdem wurden diese Träger in der ersten Instanz nicht wegen ihrer immunostimulierenden Eigenschaften ausgewählt, sondern vielmehr weil sie bereits für die Verwendung beim Menschen registriert waren. Es ist deshalb klar, dass ein Bedürfnis für einen alternativen Träger zu jenen, welche gegenwärtig in konjugierten Vakzinen verwendet werden, besteht, welcher die immunologischen Probleme, die mit diesen Vakzinen verbunden sind, vermeidet und dennoch die gleiche Immunogenität wie die gegenwärtig verwendeten Vakzinen aufweist oder diese verbessert.
Während der letzten Dekade ist es klar geworden, dass eher gewisse Fragmente von Proteinen als das ganze Proteinmolekül durch T-Zellen in Verbindung mit einem entsprechenden Selbst-Antigen (Klasse I oder Klasse II), bevorzugt erkannt werden. Diese Fragmente sind als T-Zellen-Epitope bekannt und deren Co-Erkennung (d.h. in Verbindung mit gewissen Molekülen der Klasse I oder Klasse II) durch T-Zellen stellt die Freisetzunq von «T-Zellen-Hilfe» sicher, so dass eine B-Zelle aktiviert werden und Differenzierung durchmachen kann, um Antikörper auszuscheiden.
Es wird allgemein akzeptiert, dass die T-Zellen-Erkennung von Proteinen komplexer ist als das Binden von Antikörpern und, trotz kürzlicher Fortschritte bei unserem Verständnis der T-Zellen-Epitope, weniger klar verstanden wird. Mitte der 80er Jahre wurde jedoch vorgeschlagen, dass T-Zellen-Determi-nanten (Epitope) die Tendenz haben, stabile, helicale Strukturen zu bilden, in welchen sich die hydrophilen Gruppen auf einer Oberfläche der Helix ausrichten, während sich die hydrophoben Reste auf der
2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
gegenüberliegenden Oberfläche ausrichten. In diesem Modell wird vorgeschlagen, dass die hydrophobe Oberfläche gewöhnlich mit dem MHC-Antigen assoziiert gefunden werden wurde, während die hydrophilere Oberfläche dem T-Zellen-Rezeptor ausgesetzt würde. Entsprechend wurde ein Algorythmus für das Absuchen einer gegebenene Proteinsequenz nach Regionen mit einer Tendenz, helicale, amphipa-thische Strukturen zu bilden, entwickelt und auf verschiedene Proteinmodelle angewendet (De Lisi und Berzofsky, P N A S 82: 7048, 1985). Im Gegensatz dazu behaupten gewisse Forscher, dass T-Zellen-Determinaten mit beta-Drehungen innerhalb des Proteins verbunden sind. Diesen Algorythmen gelingt es jedoch häufig nicht, T-Zellen-Epitope zu detektieren und in umgekehrter Weise wählen sie oft Sequenzen aus, welche nicht als T-Zelien-Epitope wirken. Ausserdem können diese Algorythmen nicht verwendet werden, um die Stärke oder Funktionalität der Kreuzungsarten der ausgewählten Sequenzen zu definieren. Eine vereinheitlichende Hypothese, welche Faktoren für das Vorhersagen von T-Zellen-Epitopen wichtig sind, muss immer noch entwickelt werden und die Identifikation solcher Epitope sowie die Bestimmung deren Stärke ist immer noch sehr stark eine empirische Übung. Obschon es immer noch nicht klar ist, was eine T-Zelle wahrnimmt, herrscht Übereinstimmung zwischen verschiedenene Gruppen, welche eine Vielzahl von Modellen verwenden, dass ein Bereich einer Länge von 7-17 Aminosäureresten Länge für die Erkennung notwendig ist.
T-Zellen-Epitope von Diphtherietoxin, Tetanustoxin und kreuzreagierendem Material von Diphtherieto-xin wurden in PCT/US89/00388 beschrieben. Diese unterscheiden sich von den T-Zellen-Epitopen dieser Erfindung.
Eine frühere Arbeit (PCT/AU87/00107) hat eine Anzahl integraler Membranproteine auf deren Fähigkeit untersucht, Serum-Antikörper-Antworten in der Abwesenheit eines Hilfsstoffs hervorzurufen. Es wurde gezeigt, dass diese Proteine, welche TraT einschliessen, hohe Titer an Serumantikörper in Mäusen, Ratten, Meerschweinchen und Kaninchen stimulieren. Die Antikörper-Titer, welche durch das Injizieren von TraT in Salzlösung hervorgerufen werden, werden durch die Zugabe von Hilfsstoffen auf Ölbasis wie Freund's Incomplete Adjuvant (FIA) oder Montanide/Marcol nicht signifikant erhöht. Kovalentes Verknüpfen von Rinderserumalbumin oder der Dinitrophenylgruppe oder eines Peptidantigens zu TraT resultiert in einer signifikanten Steigerung der Immunantwort gegenüber dem konjugierten Material, im Vergleich zu der Antwort, welche beobachtet wird, wenn das Immunogen ohne Hilfsstoff oder nicht zu TraT konjugiert injiziert wird. Die Antikörperantwort gegenüber diesen Konjugaten wird durch die Zugabe von FIA nicht signifikant erhöht. TraT ist ein selbst hilfsstoffbildendes Trägermolekül, welches in der Lage ist, hohe Antikörpertiter gegenüber sich selbst zu erzeugen, sowie auch gegenüber Molekülen, die an es gebunden sind.
3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
Abkürzugen
AIOH
-
Aluminiumhydroxid
CPM
-
Zählungen pro Minute
DEAE
-
Diethylaminoethyl
DMF
-
Dimethylformamid
DT
-
Diphtherie-Toxoid
EDTA
-
Ethylendiamintetraessigsäure
FIA
-
Freund's incomplete adjuvant (Freund's unvollständiger Hilfsstoff)
HPLC
-
Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie
FCS
-
fötales Kälberserum
LAL-Test
-
Limulus-Amoebocyt-Lysat-Test
LH RH
-
Luteinisierungshormon freisetzendes Hormon
LIP
-
Liposom
LPS
-
Lipopolysaccharid
MBS
-
m-Benzoesäuremaleimid-n-hydroxysuccinimidester
PBS
-
phosphatgepufferte Salzlösung
PHA
-
Phyto-Hämagglutinin
PMSF
-
Phenylmethylsulphonylfluorid
QA
-
Qualitätsversicherung
QC
-
Qualitätskontrolle
RPMI
-
Gewebe-Kultur-Medium
RT
-
Raumtemperatur
SAP
-
Saponin
SDS
-
Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE
-
Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gelelektrophorese
TFA
-
Trifluoressigsäure
VYDAC
-
Handelsname einer Chromatographie-Säule
ZWIT
-
Zwittergent
Darstellung der Erfindung
Gemäss der vorliegenden Erfindung sind isolierte Peptidsequenzen von oder abgeleitet von TraT identifiziert und verwendet worden, welche durch sich selbst unerwartet hohe immunostimulierende Eigenschaften in einem Bereich von Arten haben. Die spezifischen Sequenzen T1, T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID Nrn. 1, 2, 4 resp. 6), welche hierin beschrieben sind, werden durch verschiedene pathogenetisch unterschiedliche Arten, einschliesslich Primaten, erkannt. Gemäss dem Wissen der Erfinder des vorliegenden Erfindungsgegenstandes sind T-Zelien stimulierende Peptidsequenzen, welche verschiedene Artenbarrieren überschreiten, zuvor nicht beschrieben worden.
Die Erkenntnis, dass TraT (SEQUENZ ID Nr. 16) ein stark selbst hilfsmittelbildendes Trägermolekül war, führte die Erfinder dazu in Betracht zu ziehen, dass dort spezielle Peptidsequenzen innerhalb dieses Proteins sein könnten, welche durch T-Zellen bevorzugt erkannt werden. Als ein Resultat des Abtastens des TraT-Moleküls und in Anbetracht der Faktoren, welche die Aktivität als ein T-Zellen-Epitop erhöhen könnten, wurden sieben Peptide, weiche vom TraT-Molekül abgeleitet worden waren, synthetisiert und dann in T-Zellen-Fortpflanzungstests getestet, wobei T-Zellen von einer Vielzahl von Tieren verwendet wurden, welche mit dem natürlichen TraT-Molekül in Salzlösung immunisiert worden waren. Ein hierarchisches Muster des Grads der Reaktion (responsiveness) gegenüber den Peptiden wurde bei den vier untersuchten Tierarten beobachtet, und im speziellen zeigten vier der Peptide (T1, T2, T4, T6: SEQUENZ ID Nrn. 1, 2, 4 resp. 6) sehr starke Antworten bei allen vier getesteten Arten. Weil diese Peptidsequenzen diverse Artbarrieren überschreiten ist es möglich, dass sie sowohl durch T-Zellen innerhalb von als auch quer durch Arten erkannt werden.
4
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
Die Aminosäuresequenzen der sieben Moleküle sind:
T1:
GlyAlaMetSerThrAlalleLysLysArgAsnLeuGluValLysThrGInNetSerGluThrlleTrpLeuGlu
(SEQUENZ ID Nr. 1)
T2:
GlyLeuGInGlyLyslleAlaAspAlaValLysAlaLysGly (SEQUENZ ID Nr. 2)
T3:
SerGInTrpLeuAsnArgGlyTyrGluGlyAlaAlaValGlyAlaAlaLeuGlyAlaGlylleThrGly
(SEQUENZ ID Nr. 3)
T4:
GlyLeuAlaAlaGlyLeuValGlyMetAlaAlaAspAlaMetValGluAspValAsn (SEQUENZ ID Nr. 4)
T5:
AspValGInlleAlaGluArgThrLysAlaThrValThrThrAspAsnValAlaAlaLeuArgGln
(SEQUENZ ID Nr. 5)
T6:
SerThrGluThrGlyAsnGlnHisHisTyrGInThrArgValValSerAsnAlaAsnLys
(SEQUENZ ID Nr. 6)
T7:
LysValAsnLeuLysThrGluGluAlaLysProValLeuGluAspGInLeuAlaLys
(SEQUENZ ID Nr. 7)
Die TraT-Sequenzen, welche zu diesen Molekülen korrespondieren, sind in Fig. 5 gezeigt
und sind die folgenden:
TraT(T1)
GlyAlaMetSerThrAlalleLysLysArgAsnLeuGluValLysThrGInMetSerGluThrlleTrpLeuGlu
(SEQUENZ ID Nr. 1)
TraT(T2)
GlyLeuGlnGlyLyslleAlAspAlaValLysAlaLysGly (SEQUENZ ID Nr. 2)
TraT(T3)
GluSerGlnGlyTrpLeuAsnArgGlyTyrGluGlyAlaAlaValGlyAiaAlaLeuGlyAlaGlylleThrGly
(SEQUENZ ID Nr. 23)
TraT(T4)
GlyLeuAlaAlaGlyLeuValGlyMetAlaAlaAspAlaMetValGluAspValAsn (SEQUENZ ID Nr. 4)
TraT(T5)
AspValGInlleAlaGluArgThrLysAlaThrValThrThrAspAsnValAlaAlaLeuArgGln
(SEQUENZ ID Nr. 5)
TraT(T6)
SerThrGluThrGlyAsnGlnHisLysTyrGInThrArgValValSerAsnAlaAsnLys
(SEQUENZ ID Nr. 24)
TraT(T7)
LysValAsnLeuLysPheGluGluAlaLysProValLeuGluAspGInLeuAlaLys
(SEQUENZ ID Nr. 25).
T1, T2, T4 und T5 sind identisch mit den Sequenzen, weiche in der natürlichen TraT-Sequenz erscheinen. T3, T6 und T7 sind im Vergleich mit TraT(T3), TraT(T6) und TraT(T7) modifiziert. In T3 sind die vier aminoterminalen Reste GiuSerGInGly von TraT(T3) ersetzt durch SerGln. In T6 ist der Lys-Rest von Position 9 von TraT(T6) ersetzt durch His. In T7 ist der Phe-Rest von Position 6 von TraT(T7) ersetzt durch Thr. Diese Veränderungen der natürlichen Sequenzen wurden gemacht, um die T-Zellen-Epitop-Aktivität dieser Peptide zu erhöhen.
Gemäss einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein T-Zellen-Epitop bereitgestellt, welches einen Teil der Aminosäuresequenz des Proteins TraT enthält oder daraus besteht.
Typischerweise sind die T-Zellen-Epitope quer durch Arten wirksam.
Spezifische T-Zellen-Epitope gemäss der vorliegenden Erfindung schliessen Teile von TraT ein, welche T-Zellen-Epitop-Aktivität haben, oder Derivate derselben wie T1, T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID Nrn. 1,2, 4 und 6), welche Sequenzen, wie oben beschrieben, haben. Jedes der T-Zellen-Epitope der Erfindung kann modifiziert werden. Modifikationen, die in Einklang mit der vorliegenden Erfindung sind, schliessen die Addition eines N-terminalen Pyroglutaminsäurerestes, die Substitution eines N-terminalen Glutaminsäurerestes durch einen Pyroglutaminsäurerest und/oder die Addition oder Substitution eines C-terminalen Cysteinamids sowie die spezifischen Modifikationen ein, welche in T3, T6 und T7, wie oben beschrieben, durchgeführt worden sind. Modifizierte T-Zellen-Epitope der Erfindung fallen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung und sind vom Ausdruck «T-Zellen-Epitop» mitumfasst, wenn dieser hier verwendet wird, und sie sind bei Bezugnahmen auf spezielle T-Zellen-Epitope dieser Erfindung ebenfalls eingeschlossen. Bei der Herstellung von Fusionsproteinen der Erfindung können nach der Translation oder in der codierenden Sequenz, falls gewünscht, Modifikationen am Epitop durchgeführt werden, um interne Aminosäuren oder terminale Reste zu verändern. Die Modifikationen sollten die T-Zellen-Epitopaktivität des Stammoleküls (parent molecule) beibehalten.
Die Erfindung stellt ausserdem einen Komplex bereit, welcher mindestens ein T-Zellen-Epitop der ersten Ausführungsart verbunden mit mindestens einem Immunogen enthält, worin das Immunogen und das Epitop auf solche Art verbunden sind, dass das mindestens eine T-Zellen-Epitop immer noch als T-Zellen-Epitop wirken kann und dass das mindestens eine Immunogen immer noch mindestens eine antigene Determinante aufweist, gegen welche eine Immunantwort angeregt werden kann.
5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
Die Erfindung stellt ausserdem eine Vakzine bereit, welche einen Komplex der Erfindung gemeinsam mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Füllstoff, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoff enthält.
Die Komplexe der Erfindung können durch eine Anzahl von Wegen hergestellt werden. Sie können direkt oder durch chemisches Koppeln unter Verwendung passender Verknüpfungs- oder Kopplungsmittel oder durch Modifikation von Resten um Stellen für die Verknüpfung bereitzustellen, hergestellt werden. Sie können auch durch rekombinante Mittel als Fusionsproteine hergestellt werden.
Das mindestens eine «Immunogen», welches einen Teil des erfindungsgemässen Komplexes bildet, ist irgendein Molekül, von welchem es wünschenswert ist, dass es verwendet wird, um eine Immunantwort hervorzurufen. Typischerweise wird dieses mindestens eine «Immunogen» ein Molekül sein, welches schwach immunogen ist, aber immunogene Moleküle sind nicht ausgeschlossen. Das mindestens eine «Immunogen» schliesst Peptide, Oligosaccharide, Polypeptide, Polysaccharide ein und spezifische Beispiele umfassen:
Zirkumsporozoit-Oberflächenprotein von Plasmodium falciparum (CSP); das synthetische Immunogen NH2 Cys (Asn Pro Asn Ala)4 (SEQUENZ ID Nr. 8) abgeleitet von CSP; das Ganze oder ein Teil des Luteinisierungshormons oder Somatostatins; und immunogene Proteine, welche das Ganze oder ein Teil sind von: dem S-Protein des Hepatitis B-Virus; dem Aids-Virus; Influenza-Virus; oder Maul- und Klauenseuche-Virus; Inhibin und FSH.
In bezug auf den Aufbau von Fusionsproteinen stellt die Erfindung ein erstes Hybrid-Polynucleotidmo-lekül bereit, welches besteht aus: einer Polynucleotidsequenz, welche als eine codierende Sequenz für mindestens ein T-Zellen-Epitop der Erfindung wirkt und die mit einer Polynucleotidsequenz verschmolzen ist, welche für die Aminosäuresequenz von mindestens einem Immunogen codiert.
Die Hybridpolynucleotidmoleküle können Sequenzen umfassen, welche folgendes codieren: mindestens ein isoliertes T-Zellen-Epitop der Erfindung, verschmolzen mit mindestens einem Immunogen; mindestens ein T-Zellen-Epitop der Erfindung, welches in ein Immunogen eingefügt worden ist; das Ganze oder ein Teil des TraT-Moleküls mit dem mindestens einen Immunogen, welches direkt neben einem T-Zellen-Epitop der Erfindung eingefügt worden ist.
Es ist bekannt, dass es dann, wenn eine Sequenz, die ein spezielles Fusionsprotein von Interesse codiert, bereitgestellt worden ist, innerhalb der Möglichkeiten eines erfahrenen Fachmanns sein würde, diese Sequenz zu verändern, so dass sie immer noch ein Fusionsprotein codiert, weiches die Aktivität der ursprünglichen Fusion aufweist. Ein Grund, dass solche veränderte Fusionen hergestellt werden können, liegt in der Degeneriertheit des genetischen Codes. Ausserdem ist es für einen erfahrenen Fachmann klar, dass es möglich ist, Codone für Aminosäuren, welche ähnlichen Eigenschaften aufweisen, an Stellen innerhalb eines Proteins zu substituieren, ohne die Aktivität des Moleküls gegenüber dem ursprünglichen Molekül zu beeinflussen. Wenn eine wünschbare Fusion oder ein Komplex identifiziert worden ist, dann können diese ausserdem durch Einschluss von Multimeren des T-Zellen-Epitops und/oder des Immunogens und/oder durch die Einfügung zusätzlicher T-Zellen-Epitope der Erfindung modifiziert werden. Solche veränderten Moleküle liegen ebenfalls im Rahmen dieser Erfindung.
Bevorzugte Hybridpolynucleotidsequenzen sind DNA-Sequenzen.
Speziell bevorzugt sind die Sequenzen der Erfindung, welche für mindestens ein T-Zellen-Epitop der Erfindung codieren, und die mit einer DNA-Sequenz verknüpft sind, welche für die Aminosäuresequenz des mindestens einen Immunogens codiert, so dass das resultierende TraT-Fusions-Protein zur Oberfläche der Wirtszelle transportiert und auf dieser ausgesetzt wird.
Die Erfindung stellt ausserdem ein fusioniertes Gen bereit, welches eine Hybrid-DNA-Sequenz der Erfindung, verschmolzen mit einem transportierbaren Promotor, enthält. Ein bevorzugter Promotor gemäss der Erfindung ist der pl-Promotor des Bakteriophagen Lambda.
Ausserdem stellt die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül bereit, welches eine DNA-Sequenz der Erfindung und eine Vektor-DNA enthält. Typischerweise ist der Vektor Plasmid-, Bakteriophagen-, virale oder Cosmid-DNA.
Ein bevorzugtes rekombinantes DNA-Molekül der Erfindung schliesst eine Expressionskontrollsequenz ein, welche wirksam mit der DNA-Sequenz der Erfindung verknüpft ist.
Innerhalb des Umfangs der Erfindung liegt ein Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, welches Verfahren den Schritt umfasst: Einfügen einer DNA-Sequenz der Erfindung in Vektor-DNA.
Bevorzugt schliesst das Verfahren ausserdem den Schritt ein, eine Expressionskontrollsequenz in den Vektor einzuführen.
Die Erfindung stellt ausserdem einen transformanten Wirt mit der genetischen Information für die Biosynthese eines Komplexes bereit, welcher mindestens ein Immunogen und mindestens ein T-Zellen-Epitop der Erfindung enthält, so dass das resultierende, zusammengeschmolzene Peptid auf der Oberfläche der Wirtszelle freiliegt.
Transformante Wirte, welche die Fusion nur intrazellulär exprimieren, können jedoch auch mit der Fusion verwendet werden, welche von den Zellen in Übereinstimmung mit Standard-Reinigungsverfahren gereinigt wird.
Geeignete Wirte schliessen prokaryotische und eukaryotische Zellen ein, einschliesslich: Bakterien, z.B. E. coli, Pseudomonas-Arten, Salmonella-Arten und Bazillus-Arten; Hefe und andere Pilze, z.B. Saccharomyces cerevisiae und Aspergillus-Arten; Insektenzellen, z.B. Zellinien, welche von Spodoptera
6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 AS
frugiperda und Bombyx mori abgeleitet sind; und Säugetierzellen, z.B. Eierstockzellen des chinesischen Hamsters und andere Zellinien.
Eingeschlossen innerhalb des Umfangs der Erfindung ist ausserdem ein Verfahren für das Transformieren eines Wirts, welches Verfahren den folgenden Schritt enthält: Einführen eines rekombinanten DNA-Moleküls gemäss der Erfindung in einen Wirt.
Die Erfindung stellt ausserdem ein Expressionsprodukt eines transformierten Wirts der Erfindung bereit, welches einen Komplex der Erfindung enthält.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Fig. 1 zeigt die T-Zellen-Antwort gegenüber T1-T7 (SEQUENZ ID Nrn. 9-15), PHA und TraT (SEQUENZ ID Nr. 16) in immunisierten Tieren.
Fig. 2 zeigt die Darstellung von T1-T7 (SEQUENZ ID Nrn. 9-15), PHA und TraT (SEQUENZ ID Nr. 16) durch fixierte und Kontrollmakrophagen.
Fig. 3 zeigt T-Zellen-Antworten gegenüber Träger und Peptid in Affen, welche mit Pre S2-TraT oder PreS2-DT in verschiedenen Formulierungen immunisiert worden sind.
Fig. 4 zeigt die Struktur von p TraT (c), einem TraT-Expressionsvektor. Pl = gegen Links (leftward)-Promotor von Lambda; TT = Transkriptionsterminator; Ampr = Ampicillin-Resistenz-Gen; Region 1302-3597 entspricht etwa der Region 2066 (alte Pvull-Stelle) bis 4367 (alte EcoRi-Stelle) von pBR322; Diagram nicht massstabgerecht.
Fig. 5 zeigt die codierende Sequenz von TraT und die Lage von TraT (T1-T7). (SEQUENZ ID Nrn. 1, 2, 23, 4, 5, 24 und 25).
Bester Weg zur Ausführung der Erfindung
Die rekombinanten DNA-Techniken, Techniken der chemischen Synthese, Formulierung und Impfung, welche in Übereinstimmung mit dieser Erfindung verwendet werden, sind Standardtechniken, welche jenen bekannt sind, die auf dem entsprechenden Fachgebiet erfahren sind. Für das Formulieren der Vakzinen der Erfindung wird eine wirksame Menge eines Komplexes der Erfindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel Arzneimittelträger und/oder Hilfsstoff formuliert, um eine Vakzine für die Verabreichung an einen Wirt bereitzustellen, welcher Immunisierung mit dem interessierenden Immunogen benötigt.
Feste Dosierungsformen, welche für die orale Verabreichung geeignet sind, können Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate einschliessen. In solchen festen Dosierungsformen kann mindestens ein Komplex mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel wie Saccharose, Lactose oder Stärke vermischt werden. Solche Dosierungsformen können, wie es normale Praxis ist, ausserdem zusätzliche Substanzen enthalten, welche keine inerten Verdünnungsstoffe sind, z.B. Schmiermittel wie Magnesium-stearat. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen ausserdem Puffermittel enthalten. Tabletten und Pillen können zusätzlich mit enterischen Beschichtungen hergestellt werden.
Flüssige Dosierungsformen für die orale Verabreichung können in der Form pharmazeutisch annehmbarer Emulsionen, Sirups, Lösungen, Suspensionen und Elixieren sein, welche inerte Verdünnungsmittel enthalten, die auf dem Fachgebiet allgemein verwendet werden, wie Wasser. Solche Zusammensetzungen können ausserdem Benetzungsmittel, emulgierende und suspendierende Mittel und süssende, geschmackgebende und geruchgebende Mittel enthalten, einschliesslich Zucker wie Saccharose, Sorbit, Fructose etc., Glykole wie Polyethylenglykol, Propylenglykol etc., Öle wie Sesamöl, Olivenöl, Soyaboh-nenöl etc., Antiseptica wie Alkylparahydroxybenzoat etc. und Geschmackstoffe wie Erdbeergeschmack, Pfefferminz etc.
Geeignete Arzneimittelträger, Träger und/oder Verdünnungsmittel für die Verwendung bei der Herstellung von injizierbaren Formen können ebenfalls bei der Herstellung injizierbarer Vakzinen verwendet werden.
Andere Alternativen würden Nasalsprays und andere über die Schleimhaut erfolgende Arten der Verabreichung wie Suppositorien einschliessen.
Der Begriff «pharmazeutische annehmbares Hilfsmittel» kann entweder die Standardzusammenset-zungen bedeuten, welche für die Verabreichung beim Menschen geeignet sind oder die typischen Hilfsmittel, welche bei der Impfung von Tieren verwendet werden.
Gegenwärtig ist Alaun das einzige registrierte Hilfsmittel für die Verwendung beim Menschen, es wird jedoch experimentelle Arbeit bezüglich anderer Hilfsmittel für die Verwendung beim Menschen durchgeführt und es ist vorhersehbar, dass diese anderen Hilfsmittel für die Verwendung bei der Herstellung von Zusammensetzungen für die Impfung des Menschen in Übereinstimmung mit dieser Erfindung geeignet sein würden.
Geeignete Hilfsmittel für die Impfung von Tieren schliessen die folgenden ein, aber sind nicht auf diese beschränkt: Saponin, Ölemulsionen wie Freund's vollständiges oder unvollständiges Hilfsmittel (nicht geeignet für die Verwendung bei lebendem Inventar), Marcol 52: Montanide 888 (Marcol ist eine Handelsmarke von Esso. Montanide ist eine Handelsmarke von SEPPIC, Paris), Squalan oder Squalen, Hilfsmittel 65 (welches Erdnussöl, Mannidmonooieat und Aluminiummonostearat enthält), Mineralgele
7
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
CH 683 101 A5
wie Aiuminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Kalziumphosphat und Alaun, oberflächenaktive Mittel wie Hexadecylamin, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-dioctadecyl-N',N'-bis(2~hydroxyethyl)propandiamin, Methoxyhexadecylgiycerin und Pluronic-Polyole, Polyanionen wie Pyran, Dextransulfat, Poiyacrylsäure und Carbopol, Peptide und Aminosäuren wie Muramyl-dipeptid, Di-methylglycin, Tuftsin und Trehalosedimycolat. Die Komplexe der vorliegenden Erfindung können auch nachfolgend auf die Einverleibung in Liposomen oder andere Mikroträger verabreicht werden, oder nach Konjugation mit Polysaccharid, Proteinen oder Polymeren oder in Kombination mit Quil-A, um immuno-stimulierende Komplexe zu bilden.
Es ist erkannt worden, dass eine Anzahl Faktoren die Bestimmung einer geeigneten Dosierung für einen speziellen Wirt beeinflussen wird. Solche Faktoren schliessen das Alter, Gewicht, Geschlecht, allgemeine Gesundheit und gleichzeitigen Krankheitsstatus des Wirts ein. Die Bestimmung des angemessenen Dosisniveaus für den speziellen Wirt wird mittels pharmazeutischer Standardtechniken durchgeführt.
Die Stärke der Wirkung der Peptidsequenz, welche von TraT abgeleitet worden war, wurde durch die Demonstration bewiesen, dass Konjugate von TraT und einem Peptid HepB-preS2 133-152: SEQUENZ ID Nr. 17 (worin PreS2 die Aminosäuren 120-145 der preS2 Region des Hepatitis B Oberflächenanti-gens repräsentiert) in Affen der Gruppe Saimiri (squirrel monkeys) eine viel stärkere T-Zellen-Antwort bewirken als Konjugate des Diphtherietoxoids (DT) und preS2. DT ist ein wirksames Trägerprotein mit einer Anzahl T-Zellen-Epitopen, welches für die Verwendung als Träger in menschlichen Vakzinen genehmigt worden ist.
BEISPIEL 1:
Die Synthese von Peptiden, welche von TraT abgeleitet sind.
Die sieben Peptide T1 bis T7 (SEQUENZ ID Nrn. 1-7) wurden auf einem «Applied Biosystems No. 430A»-Peptidsyntheseapparat mit N-terminalem pyroGlu und C-terminalem Gys-NH2 synthetisiert. Die Peptide wurden mittels Chromatographie an G-25 Sephadex (Pharmacia) in 10% Essigsäure gereinigt, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC auf einer VVDAC C-18-Säule unter Verwendung eines linearen Gradienten von 5-60% Acetonitril in 0,1 % TFA. Die Sequenzen der synthetisierten Peptide sind wie folgt:
T1 : PyroGluGlyAlaMetSerThrAlalleLysLysArgAsnLeuGluValLysThrGInMetSerGluThrlleTrpLeuGluCys-NH2 (SEQUENZ ID Nr. 9)
T2: PyroGluGlyLeuGlnGlyLyslleAlaAspAlaValLysAlaLysGlyCys-NH2 (SEQUENZ ID Nr. 10)
T3: PyroGluSerGlnTrpLeuAsnArgGlyTyrGluGlyAlaAlaValGlyAlaAlaLeuGlyAlaGlylleThrGlyCys-NH2 (SEQUENZ ID Nr. 11)
T4: PyroGluGlyLeuAlaAlaGlyLeuValGlyMetAlaAlaAspAlaMetValGluAspValAsnCys-NH2 (SEQUENZ ID Nr. 12)
T5: PyroGluAspValGlnlleAlaGluArgThrLysAlaThrValThrThrAspAsnValAlaAlaLeuArgGlnCys-NH2 (SEQUENZ ID Nr. 13)
T6: PyroGluSerThrGluThrGlyAsnGlnHisHisTyrGlnThrArgValValSerAsnAlaAsnLysCys-NH2 (SEQUENZ ID Nr. 14)
T7: PyroGluLysValAsnLeuLysThrGluGluAlaLysProValLeuGluAspGlnLeuAlaLysCys-NH2 (SEQUENZ ID Nr. 15)
Reinigung von TraT
E. coli Zellen (Stamm BTA 1349, welcher das Plasmid pBTA 439 enthält, ein Derivat des Plasmids pBR329, in welches ein 6.0 kb EcoRI Fragment des R100 Plasmids eingeführt worden ist, welches die DNA-Sequenz enthält, die für TraT codiert, exprimiert vom linken Lambda-Promotor Pl), wurden in einem Fermenter bei 30°C gezüchtet und bei 42°C während zwei Stunden induziert. Nach der Induktion wurden die Zellen in einem Amicon DC1 OLA Konzentrationsapparat (0.1 um Hohlfaserpatrone) konzentriert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Zellen wurden aus dem Konzentrationsapparat entfernt und die ganzen Membran-Proteine aus den Zellen durch die Zugabe einer Lösung, welche 0.2 M Natrimacetat-Puffer von pH 2.5, 2% Cetrimid (Sigma) in 20% Ethanol plus 0.2 M CaCb (Endkonzentration) enthielt, extrahiert. Es wurde zugelassen, dass die Extraktion über Nacht bei Raumtemperatur (RT) weiterlief, worauf die Bakterien mittels Zentrifugation tablettiert wurden (17 000 x g, 20 Min.).
TraT wurde aus der überstehenden Lösung durch die Zugabe von Ethanol bis 50% gefällt, worauf Zentrifugation (4000 x g 10 Min.) folgte. Es wurde dann in 1% Zwittergent, 20 mM Natriumacetat-Puffer, pH 6.5, 20 mM EDTA abermals suspendiert und mittels Chromalographie an DEAE-Sepharose (Pharmacia) in 20 mM Natriumacetat-Puffer pH 6.5, welcher 0,1% Zwittergent (Calbiochem) und 20 mM
8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
EDTA enthielt, weiter gereinigt. Proteine wurden eluiert, indem ein linearer Gradient von 0 bis 1 M Natriumchlorid im zur Beladung verwendeten Puffer verwendet wurde. Fraktionen, welche die ganzen Membranproteine enthielten, wurden zusammengegossen, mit Ethanol gefällt und in 10% SDS wieder suspendiert und mittels Grössenausschlusschromatographie (size exclusion chromatography) an S-300 Sephacryl (Pharmacia) in 10 mM Tris • HCl pH 8.8, welches 2% SDS, 20 mM EDTA enthielt, weiter gereinigt. TraT, welches durch dieses Verfahren gereinigt wurde, wanderte bei SDS-PAGE Analyse als eine einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von 28 000 und es wurde gefunden, dass es frei von LPS war, wenn es SDS-PAGE unterworfen und gemäss dem Verfahren von Tsai und Frasch (Anal. Biochem. 119: 115, 1982) mit Silber gefärbt wurde. Es wurde gefunden, dass das TraT-Protein mit weniger als 0.005 ng LPS/mg an Protein verunreinigt war, wenn dies mit dem LAL-Test bestimmt wurde (Webster, J Cline Microbio!. 12: 644, 1980).
Immunisierung von Tieren und die Schätzung der T-Zellen-Proliferation
Tiere wurden intramuskulär mit 50 ng (Mäuse), 200 ng (Hunde und Affen) oder 500 ng (Vieh) an TraT in Salzlösung immunisiert und 14 bis 28 Tage später mit einer ähnlichen Impfung unterstützt. Vierzehn Tage nach der letzten Injektion, wurden periphere Blutlymphocyten (Hunde, Affen und Vieh) oder Lymphknotenzellen (Mäuse) als Quelle von T-Lymphocyten verwendet, welche dann in vitro mit verschiedenen Konzentrationen der Peptide stimuliert wurden [die Antworten auf 50 ng TraT (SEQUENZ ID Nr. 16) bzw. 50 ng an T1 bis T7 (SEQUENZ ID Nrn. 9-15) sowie zu 2 ng PHA sind in Fig. 1 dargestellt]. T-Lymphocyten wurden aus den Lymphknoten gemäss dem Verfahren von Adorini et al. J. Exp. Med. 168: 2091, 1988 isoliert, während für das Isolieren von T-Zellen aus peripherem Blut nach dem Verfahren von Chouaib et al. (P.N.A.S., 85: 6875, 1988) vorgegangen wurde. Für die Schätzung der T-Zellen-Proliferation wurde nach der Methode von Adorini et al. vorgegangen. Resultate sind als Stimulations-Indices ausgedrückt, welche berechnet werden, indem die c.p.m. in der Gegenwart von Antigen durch die c.p.m. in der Abwesenheit von Antigen dividiert werden. Standardabweichungen der Mittelwerte von Kulturen in dreifacher Ausführung waren weniger als 10% des Mittelwerts.
Resultate
Wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, wurde signifikantes Ansprechvermögen (responsiveness) der T-Zellen auf 50 ng T1, T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID Nrn. 9, 10, 12 resp. 14) sowie auf TraT bei allen vier Arten beobachtet, wobei T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID Nrn. 10, 12 resp. 14) speziell starke Antworten zeigten. Die hohen Grade der Konservierung der Antworten auf diese Peptide in einer Anzahl an Arten legt den Schluss nahe, dass diese Peptide sowohl in einem Bereich von phylogenetisch diversen Spezien als auch in einem Bereich von genetisch diversen Individuen innerhalb einer Spezies starke Antikörperantworten primen können. T-Zellen stimulierende Peptidsequenzen, welche verschiedene Artgrenzen kreuzen, sind, unseres Wissens nach, in der Literatur nicht beschrieben worden.
Primäre und sekundäre proliferative T-Zellen-Antworten von peripheren Blutlvmphocvten des Menschen gegenüber TraT und gegenüber T-Zellen-Epitop-Peptiden
Die starken poliferativen in vitro-Antworten. welche gegenüber den T-Zellen-Peptiden (im speziellen gegenüber T2, T4 und T6: SEQUENZ ID Nrn. 10, 12 resp. 14) in den vier untersuchten Tierarten beobachtet wurden, legten den Schluss nahe, dass ein ähnliches hierarchisches Muster des Ansprechvermögens auch bei Menschen gesehen werden würde. T-Zellen-Epitop-Peptide, welche eine erlaubte Verbindung mit grösseren Histokompatibilität-Komplex-Molekülen (MHC) zeigen und deshalb durch T-Zellen bevorzugt erkannt werden, würden attraktive Kandidaten für die Herstellung von Vakzinen-Untereinhei-ten sein, weil man von ihnen erwarten würde, dass sie eine Immunantwort in der Mehrheit von Individuen in einer nicht blutsverwandten menschlichen Population (outbred human population) induzieren. Es wurde deshalb beschlossen T-Zellen-Antworten gegenüber von TraT abgeleiteten T-Zellen-Epitopen in Menschen zu untersuchen.
Wegen der logistischen Probleme, die beim Immunisieren von Menschen mit TraT gestellt werden (unseres Wissens wurde keiner der Blutspender vorsätzlich mit TraT immunisiert), wurde eine alternative Annäherung durchgeführt, welche in vitro-lmmunisieruno miteinbezog.
Um die «Universalität» der von TraT abgeleiteten T-Zellen stimulierenden Peptide in Menschen zu testen, wurden heparinisierte Blutproben von zwanzig zufällig ausgewählten Spendern bei einer Blutbank erhalten. Periphere Blutlymphozyten (PBL), welche eine angereicherte T-Zellen-Population sind, wurden in vitro mit TraT oder mit T1 bis T7 (SEQUENZ ID Nrn. 9-15) in Primärkulturen stimuliert, und ein Teil des PBL wurde ausserdem in sekundären Kulturen mit mit TraT gepulsten mononuklearen Zellen (TraT-pulsed mononuclear cells) restimuliert. Die Resultate in Tabelle I zeigen, dass PBL von acht aus zwanzig (40%) Spendern in einem drei Tage Primär-T-Zellen-Poliferationstest auf mindestens drei (T2, T4, T6: SEQUENZ ID Nrn. 10, 12 resp. 14) der T-Zellen-Peptide sowie auch auf TraT (SEQUENZ ID Nr. 16) antworteten (Stimulationsindex > 3). Nach einer zweiten in vitro-lmmunisieruno mit mit TraT gepulstem PBL jedoch wurde Ansprechvermögen in den Kulturen beobachtet, welche von allen zwanzig
9
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
CH 683 101 A5
Spendern (Tabelle 2) abgeleitet waren und zusätzlich wurde bei den Zellkulturen, welche auf die primäre Stimulation geantwortet hatten, ein signifikant verstärkender Effekt beobachtet. Die wichtige, selbstverständliche Folgerung aus dieser Arbeit ist, dass T-Zeilen stimulierende Peptide wie T2, T4, T6 (SEQUENZ; ID Nrn. 10, 12 und 14) und möglicherweise T1 (SEQUENZ ID Nr. 9) als Träger in Vakzinen-Untereinheiten verwendet werden könnten und dabei das Nichtansprechvermögen, welches in Menschen als Resultat der MHC-Restriktion beobachtet wird, überwinden könnten.
Tabelle 1
Primäre T-Zellen-poliferative Antworten von peripheren Blutlymphozyten des Menschen gegen TraT und die T-Zellen stimulierenden Peptide.
In vitro Stimulantien
Spender
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
TraT
PHA
R.E.
1.0
1.2
0.7
1.1
0.7
12.8
1.2
10.3
86
A.L.
15.8
22.9
1.2
15.8
2.8
31.0
0.9
42.5
56.2
N.M.
6.4
8.0
1.8
10.7
3.0
10.3
1.7
7.8
191
S.S.
0.8
0.8
0.7
0.8
3.8
0.6
0.6
3.9
133
C.O.
1.0
0.7
1.1
0.7
1.0
1.0
1.0
1.1
105
B.G.
0.9
0.9
0.8
0.8
0.7
0.8
0.8
1.0
90.6
A.W.
3.9
6.9
2.8
6.8
2.7
8.8
0.9
9.0
84.3
B.F.
0.7
1.0
1.1
1.2
1.0
4.7
1.1
4.6
141.0
G.F.
1.0
2.0
1.2
1.4
1.5
82.8
1.9
70.8
183.0
S.S.
29.1
51.1
15.7
48.3
23.1
73.0
0.8
68.2
84.9
D.H.
28.4
43.8
8.4
52.7
25.2
65.4
0.9
70.6
97.8
C.B.
1.1
1.1
1.3
2.1
2.5
22.2
1.1
49.2
139
G.L.
1.0
0.8
1.4
1.0
1.0
1.8
1.1
1.1
357
Z.L.
0.9
0.8
0.6
1.1
1.5
0.8
0.8
0.6
217
D.W.
69.7
10.8
30.4
100.0
39.0
184.5
1.9
155.0
223
F.W.
0.8
0.7
0.7
2.0
2.0
34.6
2.8
60.5
117
K.M.
0.8
31.0
17.0
37.5
18.0
47.0
0.8
41.4
51.3
S.M.
17.3
26.7
1.0
42.7
29.5
53.4
0.8
51.5
71.0
R.T.
2.0
0.9
1.0
0.9
0.8
1.0
0.9
1.3
57.2
J.L.
1.0
0.5
0.5
0.7
0.7
0.5
0.6
0.7
57.2
Periphere Blutlymphozyten (PBL) wurden aus heparinisiertem Blut mittels Ficoll-Paque (Pharmacia) Gradientzentrifugation abgetrennt. Kurz ausgedrückt wurden 10 ml Blut als Schicht auf 6 ml Ficoll-Paque aufgebracht und eine angereicherte T-Zellen-Population wurde durch Zentrifugation bei 400 g während 40 Minuten abgetrennt. PBL (105 in 0,2 ml RPMI Medium, welches 10% Human-AB-Serum enthält) wurde in Flachbodenplatten mit 50 ng TraT (SEQUENZ ID Nr. 16) oder einem der T-Zellen-sti-mulierenden Peptide (T1 bis T7; SEQUENZ ID Nrn. 9-15) 5 oder mit 2 ng PHA während 3 Tagen bei 37°C kultiviert. Sechzehn Stunden vor der Ernte wurden die Zellen mit 0,5 nCi an tritiertem Thymidin markiert, geerntet und in einem Flüssig-Scintillationszähler gezählt. Die Resultate werden als Stimulationsindizes ausgedrückt, welche berechnet werden, indem die Zählungen (counts) pro Minute (c.p.m.) in der Anwesenheit von Antigen durch die c.p.m. in der Abwesenheit von Antigen geteilt werden.
10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
Tabelle 2
Sekundäre T-Zellen-proliferative Antworten von peripheren Blutlymphozyten des Menschen gegen TraT und die T-Zellen-stimulierenden Peptide.
In vitro Stimulantien
Spender
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
Tra
TPHA
R.E.
6.1
10.6
4.1
12.3
3.8
17.0
1.6
15.9
227.0
A.L.
11.8
38.0
1.8
45.0
3.6
59.0
1.8
66.0
218.0
N.M.
7.8
24.2
3.8
36.0
4.5
55.2
3.3
72.0
274.0
S.S.
1.0
11.8
5.7
12.5
0.8
14.7
1.3
16.8
379.3
C.O.
9.2
15.8
5.9
18.3
5.3
23.2
0.6
49.2
110.5
B.G.
35.2
46.7
18.1
50.7
27.7
72.8
1.0
78.3
357.0
A.W.
2.6
25.0
5.3
42.3
6.2
55.9
2.4
66.2
317.0
B.F.
49.8
110.0
32.0
161.0
73.0
227.0
2.2
235.0
113.0
G.F.
1.3
32.0
20.0
56.0
24.5
71.5
1.5
89.4
160.0
S.S.
23.0
51.5
14.2
69.4
40.0
110.0
8.0
133.0
309.0
D.H.
32.3
49.0
7.7
86.0
20.8
133.0
2.5
166.6
335.0
C.B.
6.7
13.1
4.3
18.4
1.2
19.2
4.7
63.5
304.0
G.L.
2.6
41.5
1.0
28.3
2.3
22.0
5.4
17.9
206.0
Z.L.
0.8
119.0
90.0
135.0
102.0
150.0
0.5
125.0
104.3
D.W.
56.0
150.0
28.0
185.0
26.5
216.0
2.8
236.0
116.5
F.W.
3.2
27.5
1.9
43.0
3.8
72.0
3.9
186.0
180.2
K.M.
32.0
62.5
8.6
62.6
12.5
93.0
2.8
120.5
175.3
S.M.
8.2
32.5
2.9
66.5
15.4
92.5
2.2
146.0
218.0
R.T.
1.2
226.0
74.6
270.0
45.7
255.0
1.0
289.0
195.0
J.L.
1.0
251.0
53.0
205.0
1.2
202.0
1.8
289.0
226.0
PBL (6 bis 7 x 106) wurden mit 50 ng TraT (SEQUENZ ID Nr. 16) während 30 Minuten bei 37°C gepulst und dann dreimal mit RPMI-Medium gewaschen, welches 10% menschliches AB-Serum enthielt. Die mit Antigen gepulsten Zellen wurden in 3 ml Kulturmedium in 30 ml Kulturkolben (Costar) angesetzt und dann aufrecht während 8 Tagen bei 37°C inkubiert. Ein Teil des PBL wurde beiseitegestellt und in 10% Dimethylsulphoxid eingefroren und darauf verwendet, um Primärkulturen zu stimulieren. Am Ende der Primärinkubation wurden die Zellen bei 150 g während 10 Minuten zentrifugiert und dann mit mit
2 x 106 TraT-gepulstem, gefrorenem und aufgetautem PBL stimuliert und die abermals stimulierten Kulturen wurden in Kulturkolben während weiterer drei Tage bei 37°C inkubiert. Lebensfähige Zellen (3 bis 4 x 106), welche am Ende der Sekundärkultur gewonnen wurden, wurden zweimal gewaschen, bei einer Konzentration von 106 Zellen/ml an Kulturmedium und 10% menschlichem AB-Serum wieder su-spendie ;. Die wiederstimulierten PBL (105 in 0,2 ml Kulturmedium) wurden schliesslich in Flachbodenplatten mit TraT (SEQUENZ ID Nr. 16), T1 bis T7 (SEQUENZ ID Nrn. 9 bis 15) oder PHA während
3 Tagen wie zuvor beschrieben (vergi., Legende zu Tabelle 1) kultiviert.
T-Zellen stimulierende Peptide von TraT sind stärker als iene von Diphtherietoxoid (DT)
Die in vitro-Aktivitäten von Peptiden, welche von TraT abgeleitet worden sind (T1 bis T6: SEQUENZ ID Nrn. 9 bis 14), wurden mit jenen von vier Peptiden verglichen, von welchen andere berichteten (D1 und D2: SEQUENZ ID Nrn. 19 und 20; Bixler et al. PCT/US89/00388) oder vorhersagten (D3 und D4: SEQUENZ ID Nrn. 21 und 22), dass diese starke T-Zellen-stimulierende Aktivität aufwiesen, und welche mit N- und/oder C-terminaler Modifikation hergestellt worden waren. DT wird häufig als Trägermolekül verwendet, um T-Zellen-Hilfe für Immunogene, welche dazu konjugiert sind, bereitzustellen. Aus ethischen Gründen war es nicht möglich, Menschen mit TraT (SEQUENZ ID Nr. 16) zu immunisieren. Deshalb wurden normale Blutspender ausgewählt, deren Lymphozyten in vitro wohl auf DT als auch auf TraT ansprachen; etwa 60% von zufällig ausgewählten Blutspendern sprachen in vitro auf TraT an (vergi. Tabelle 1). Die Daten in der Tabelle 3 unten zeigen, dass bei vier aus fünf dieser Individuen die
11
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
CH 683 101 A5
Antworten auf das TraT-Molekül mindestens so hoch waren, wie jene auf DT. Ausserdem waren die po-liferativen Antworten, welche durch T4 (SEQUENZ ID Nr. 12) und T6 (SEQUENZ ID Nr. 14) in Primärkulturen induziert wurden, 2- bis 3mal höher als bei irgend einem der von DT abgeleiteten Peptide (D1 bis D4: SEQUENZ ID Nrn. 19 bis 22). Bemerkenswert ist, dass die Antworten auf T6 (SEQUENZ ID Nr. 14) nahezu so stark sind wie jene auf das TraT-Molekül selbst, was nahelegt, dass T6 eine extrem hohe Bindungsaffinität für das MHC hat. Im Gegensatz dazu sind die Antworten auf D1 und D4 (SEQUENZ ID Nrn. 19 und 22) viel geringer als auf das natürliche DT-Molekül.
Diese Resultate zeigen, dass mindestens zwei der von TraT abgeleiteten Peptide stärkere T-Zellen stimulierende Aktivität haben als irgend eine der vier ausgewählten von DT abgeleiteten Sequenzen und deshalb zeigen die Daten die überlegene Nützlichkeit dieser Moleküle bei der Formulierung menschlicher Vakzinen an.
Tabelle 3
T-Zellen stimulierende Aktivität von Peptiden von TraT und Diphtheritoxoid (DT).
Stimulans fin vitrai menschlicher Spender 1 2
3
4
5
T1
2.4*
1.8
2.3
6.2
20.4
T2
5.6
6.6
8.2
33.2
32.0
T3
1.2
2.0
1.8
13.0
12.7
T4
12.8
14.2
16.6
49.3
49.5
T5
3.4
2.8
3.2
7.7
26.2
T6
16.9
18.9
22.4
56.6
45.2
T7
2.8
2.1
3.8
14.5
18.6
TraT
20.6
24.2
28.7
64.5
48.5
DT
19.4
40.1
18.8
62.6
34.7
D1
4.2
3.8
5.9
23.1
20.7
D2
1.1
0.9
1.9
17.3
13.9
D3
5.8
4.2
6.6
20.8
18.5
D4
4.7
5.7
7.3
26.0
23.2
PHA
186.0
192.0
238.0
69.3
57.3
* Stimulierungs-Index
Vergleiche die Legende zu Tabelle 1 für Einzelheiten der Verfahren zum Abschätzen der T-Zellen-Proliferation. T-Zellen wurden mit 50 ng TraT, T1 bis 17, DT und D1 bis D4 oder mit 2 ng PHA während drei Tagen bei 37°C kultiviert.
BEISPIEL 2;
Das oder die immunogenen Fraomentfei. welche als ein Resultat der «natürlichen» Verarbeitung von TraT gebildet werden, scheinen mit Haupt-Histocompatibilitäts-Komplex fMHCVKIasse Il-Antioenen mindestens so wirkungsvoll wie die Peptide T1. T2. T4 und T6 in Wechselwirkung zu treten (SEQUENZ ID Nrn. 1. 2. 4 und 6i.
Immunisierung von Tieren und Antigen Präsentation durch Makrophagen.
Mäuse (CBA oder C57BL/6J) wurden subkutan mit 50 ng TraT (SEQUENZ ID Nr. 16) in Salzlösung immunisiert und 10 Tage nach dem Priming wurde den Tieren intraperitoneal 1 ml Marcol-Öl injiziert, um ein peritoneales Exsudat (PE) zu induzieren. Drei Tage später wurden die Mäuse getötet, das PE geerntet und die Makrophagen, wie bei Buus und Werdelin (J. Immunol. 136: 452, 1986) beschrieben, abgetrennt. Makrophagen wurden mit Paraformaldehyd fixiert, im wesentlichen wie durch Buus und Werdelin (vergi, oben) beschrieben. Zusammengefasst wurden die Makrophagen (5 x 106) mit 1 % Paraformaldehyd in 0,1 M PBS während 2 Minuten behandelt, und die Reaktion wurde durch die Zugabe von 0,15M Glycin-PBS-Puffer gestoppt. Die fixierten Makrophagen wurden dreimal in Puffer gewaschen, in RPMI (10% FCS) suspendiert und 105-Zellen wurden mit TraT (SEQUENZ ID Nr. 16) (50 ng). PHA (2 ng) oder mit den Peptiden T1 bis T7 (SEQUENZ ID Nrn. 9 bis 15) (50 ng) während 30 Minuten bei 37°C gepulst; nicht fixierte oder Kontrollmakrophagen wurden ebenfalls mit Antigen während 30 Minuten
12
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
bei 37°C gepulst. Nach drei Waschungen, um überschüssiges Antigen zu entfernen, wurden 105 mit Antigen gepulste, Paraformaldehyd-fixierte oder unbehandelte Makrophagen mit 105 TraT-immunen T-Lymphozyten (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben) kombiniert und die Zellen während 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Stimulierung wurde wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben, bestimmt.
Resultate
Wie in Fig. 2 gezeigt, waren fixierte Makrophagen beim Übergeben der vier Peptide T1, T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID Nrn. 9, 10, 12 und 14) an T-Lymphozyten nahezu so effizient wie unbehandelte Makrophagen, obschon T6 (SEQUENZ ID Nr. 14) mehr Aufbereitung zu benötigen scheint als die anderen drei Peptide. Im Gegensatz dazu waren fixierte Makrophagen nicht in der Lage das natürliche TraT-Molekül zu übergeben, vielleicht weil TraT durch lebensfähige Makrophagen aufbereitet werden muss, bevor es durch T-Zellen erkannt wird. Die Daten weisen deshalb darauf hin, dass die Fragmente, welche aus natürlicher Aufbereitung von TraT resultieren, in der Form ihrer Wechselwirkung mit Klasse Il-Mole-külen an der Oberfläche des Makrophagen sehr ähnlich zu den von TraT abgeleiteten Peptiden sein müssen. Wenn die Peptidfragmente, welche von TraT abgeleitet worden sind, von den natürlich aufbereiteten Fragmenten stark unterschiedlich wären, würden sie nicht ohne weitere Aufbereitung mit Makrophagen in Wechselwirkung treten, um T-Zellen zu stimulieren. Es ist von Interesse, dass diese Klasse Il-Moleküle trotz der Paraformaldehyd-Behandlung intakt zu bleiben scheinen. Diese Beobachtungen weisen ausserdem darauf hin, dass die vier Peptide, T1, T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID Nrn. 1, 2, 4 und 6) in der Tat eine wichtige Rolle bei der Erzeugung von Antikörperantworten in vivo spielen können.
BEISPIEL 3
Bei Affen der Gattung Saimiri (souirrel monkevs) induzieren PreS2-TraT-Koniuaate stärkere T-Zellen-Antworten als PreS2-Koniuaate von DiPhtherietoxoid (DTÌ
Synthese von Peptiden und deren Konjugation mit dem Träger.
Ein Peptid, welches einen Teil des hochimmunogenen preS2-Peptids (Aminosäuren 120-145 der preS2-Region von Hepatitis B) plus einen weiteren Sequenzteil, welcher aus den Aminosäuren 133-152 m-
Asp-Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser-Gly-Thr-Val-Cys: SEQUENZ ID Nr. 17) besteht, enthält, wurde auf einem Applied Biosystems No 430A-Peptid-Syntheseapparat synthetisiert. Die Peptide wurden mittels Chromatographie an G-25 Sephadex (Pharmacia) in 10% Essigsäure chromatographiert, worauf Umkehrphasen-HPLC an einer VYDAC C-18-Säule unter Verwendung eines linearen Gradienten von 5-60% Acetonitril in 0,1% TFA folgte.
DiPhtherietoxoid (DT) (Commonwealth Serum Laboratories, Melbourne, Australien, 1570 Lf Einheiten/ ml) wurde in 80% Ethanol gefällt und in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7.0, wieder suspendiert. Es wurde dann während 30 Minuten bei 22°C mit einem 60-fachen molaren Überschuss an m-Maleinimidbenzoe-säure-N-hydroxysuccinimidester (MBS, Sigma Chemical Co; verdünnt auf 10 mg/ml in DMF) aktiviert. Das aktivierte DT wurde mit 80% Ethanol gefällt, in 0.1 M Phosphatpuffer, pH 7.0, wieder suspendiert und mit einem 20-fachen molaren Überschuss an preS2-Peptid während 3 Stunden bei 22°C gemischt. Das Konjugat wurde über Nacht gegen PBS dialysiert.
TraT wurde in 50% Ethanol gefällt, in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7.0, welcher 1% Zwittergent enthielt, wieder suspendiert und mit 10-fach MBS während 30 Minuten bei 22cC aktiviert. Das aktivierte TraT wurde mit einem 14-fachen molaren Überschuss an preS2 (SEQUENZ ID Nr. 17)-Peptid während 3 Stunden bei 22°C gemischt. Das Konjugat wurde dann über Nacht gegen PBS, welches 0.1% Zwittergent enthielt, dialysiert. Die mittlere Anzahl an preS2-Gruppen (basierend auf Aminosäureanalyse) pro Molekül an Proteinträger betrug 2 (TraT) resp. 10 (DT).
Formulierungen
Alhvdrogel: PreS2-TraT oder PreS2-DT (2.5 mg in 0.5 ml) wurden zu 0.5 ml an Alhydrogel gegeben und mit PBS und Zwittergent (0.5%) auf 2.5 ml verdünnt.
Sapnnin: PreS2-TraT oder PreS2-DT (2.5 mg in 0.5 ml) wurde zu 2.5 mg Saponin hinzugefügt und dann mit PBS auf 2.5 ml verdünnt.
Zwitteroent: TraT- oder DT-Konjugate (2 mg in 0.5 ml) wurden mit PBS und Zwittergent (0.5%) auf 2 ml verdünnt.
Liposomen: (A) TraT- oder DT-Konjugate, wurden nachfolgend auf Fällung mit 80% Ethanol in 1 ml an 10% Octylglukosid in 10 mM Hepes wieder suspendiert. (B) 1 ml Chloroform, welcher Phosphatidy-lethanolamin (16 mg) und Phosphatidylcholin (4 mg) enthielt, wurde in einen Kolben gegeben und das Chloroform wurde unter Vakuum abgedampft.
1 ml der Octylglukosidlösung (A) wurde zu (B) hinzugegeben und die Formulierung wurde mittels Beschallung löslich gemacht, gefolgt von Übernacht-Dialyse gegen PBS.
13
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
Affen der Gattung Saimiri wurden an den Tagen 0 und 42 mit 200 ng von jedem der Konjugate (preS3-TraT oder preS2-DT) in den verschiedenene Formulierungen (zwit = Zwittergent; AlOH = Alhy-drogel; Sap = Saponin; Lip = Liposomen) intramuskulär immunisiert. Periphere Blutlymphozyten, welche am Tag 56 genommen worden waren, wurden als eine Quelle für T-Zellen verwendet, welche dann in vitro mit verschiedenen Konzentrationen an TraT, DT oder preS2 stimuliert wurden, wie in BEISPIEL 1 beschrieben. Die Resultate (proliferative Antworten auf 50 ng an TraT, DT oder preS2) sind als Stimulationsindizes ausgedrückt. Die Standardfehler der Mittelwerte von Dreifachkulturen waren weniger als 10% des Mittelwerts.
Resultate
Die Resultate in Fig. 3 zeigen, dass die proliferativen T-Zellenantworten gegen TraT 2- bis 3mal höher waren als gegenüber Diphtherietoxoid. Ausserdem waren die anti-PreS2-Antworten in PreS2-TraT-immunisierten Affen 3- bis 4mal höher als in PreS2-Diphtherietoxoid-immunisierten Tieren. Die besseren T-Zellen-Antworten, welche in Antwort auf TraT erzeugt wurden, legen den Schluss nahe, dass dieses Protein (oder eine seiner TZellen-stimulierenden Sequenzen) eine brauchbare Komponente von Vakzinen, im speziellen jener gegen virale und parasitäre Krankheiten, sein kann. Es gibt eindrückliche Beweise dafür, dass für viele virale und parasitäre Infektionen primär Effector-T-Zeilen verantwortlich für die Beseitigung der Infektion sind.
BEISPIEL 4
Peptidsequenzen IT2. T4. T6: SEQUENZ ID Nrn. 2. 4 und 6) welche von TraT abgeleitet sind.
primen starke Antikörperantworten gegen ein an diese gebundenes Peptid.
Nachdem wir die Existenz von starken, T-Zellen stimulierenden Peptidsequenzen innerhalb TraT identifiziert und dokumentiert hatten, war es notwendig zu bestimmen, ob die beschriebenen Regionen von TraT als wirksame Trägermoleküle wirken könnten. Das Peptid gp120 (Aminosäuren 254-274 des konservierten Gebietes der gp120-Region von HIV1) wurde verwendet um eine antigene Determinante bereitzustellen. Die Fähigkeit von T-Zellen-stimuiierenden Sequenzen T-Zellen-Hilfe freizusetzen und deshalb Antikörperantworten gegenüber Peptiden, welche an diese gebunden sind, zu primen, ist eine wichtige Eigenschaft von T-Zellen-Epitop-Peptiden. Entsprechend wurden Mäuse mit Glutaraldehyd-Kon-jugaten von jedem der sieben Peptide T1 bis T7 (SEQUENZ ID Nrn. 9 bis 15) und dem gp120-Peptid, welches in Montanide/Marcol (9:1 )-Hilfsmittel emulgiert war, immunisiert und 21 Tage nach der primären Immunisierung wurde die Impfung wiederholt. Die Antikörper-Antworten, welche in diesen Tieren ausgelöst wurden, sind in Tabelle 4 dargestellt. Diese Resultate zeigen, dass die Peptide (T2, T4 und T6: SEQUENZ ID Nrn. 10, 12 und 14), welche starke T-Zellen-Antworten auslösen, auch die höchsten Antikörper-Antworten gegenüber dem Peptid gp120 primen, was die Brauchbarkeit als Träger demonstriert. Weil diese Peptide starke T-Zellen-stimulierende Aktivität haben werden geringe bis vernachlässigbare Antikörperniveaus in Antwort auf die starken Peptide selbst (T2, T4 und T6: SEQUENZ ID Nrn. 10, 12 und 14) beobachtet.
Herstellung von Glutaraldehvdkoniuoaten des gp120-Peptids und der T-Zellen-Eoitop-Peptide
Es wurde nach dem Zwei-Stufen-Glutaraldehydverfahren von Avrameus et al. fScand. J. Immunol. 8:7, 1978) vorgegangen. Kurz gesagt wurde das gp120-Peptid (1 mg/ml) in 0,1 M PBS pH 6.8 mit 0.2% Glutaraldehyd während 2 Stunden bei 22°C umgesetzt. Nachfolgend auf Übernacht-Dialyse gegen 0.1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer pH 9.5 wurde das mit Glutaraldehyd aktivierte gp120 bei einem molaren Verhältnis von 1:1 zu den verschiedenen Peptiden (T1 bis T7: SEQUENZ ID Nrn. 9-15) gegeben und während 24 Stunden bei 22°C umgesetzt. Die Konjugate wurden in 1 ml PBS suspendiert und in Non-tanide/ Marcol (9:1) emulgiert.
Gruppen von fünf weiblichen C57BL/6J-Mäusen (20-25 g) wurden an den Tagen 0 und 21 mit 100 ng Glutaraldehydkonjugaten von jedem der Peptide (T1 bis T7: SEQUENZ ID Nrn. 9-15) und dem gp120-Peptid, welches in Montanide/Marcol (9:1) emulgiert war, oder mit dem gp120-Peptid in Salzlösung subcutan immunisiert. Von den Tieren wurde 14 Tage nach der zweiten Injektion Blut entnommen und Antiträger-(T1 bis T7: SEQUENZ ID Nrn. 9-15) und Antipeptid (gp120)-Antworten wurden mittels eines Standard ELISA, unter Verwendung von Platten, welche mit den T1 bis T7 (SEQUENZ ID Nrn. 9-15)-Peptiden oder mit gp120 beschichtet waren, beurteilt.
Resultate
Die Resultate in Tabelle 4 zeigen, dass die T-Zellen-stimulierenden Peptide T2, T4, T6 (SEQUENZ ID Nrn. 10, 12 und 14) und möglicherweise TI (SEQUENZ ID Nr. 9) die höchsten Antikörperantworten gegenüber dem an sie gebundenen Peptid (gp120) primen. Wie vorhergesehen wurden in Antwort auf diese Peptide (T1, T2, T4 und T6: SEQUENZ ID Nrn. 9, 10, 12 und 14) schwache bis vernachlässigba-
14
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
re Antikörpertiter beobachtet. Weil diese T-Zellen-Epitope sind, ist es unwahrscheinlich, dass sie B-Zellen gut stimulieren. Im Gegenteil, es wurde im wesentlichen keine Antwort in Tieren gesehen, weiche mit gp120 in Salzlösung immunisiert worden waren. Deshalb werden diese T-Zellen-stimulierenden Peptide brauchbar sein für das Primen von Antikörper-Antworten gegenüber Peptidantigenen. Solche Antigene von kommerzieller Brauchbarkeit können Luteinisierungshormon, Somatostatin, Inhibin, FSH, Maul- und Klauensäuchepeptid, Hepatitis B pre S2-Peptid, Malaria-Peptide, Herpes oder Influenza-Pep-tide einschliessen, aber sie sind nicht auf diese beschränkt.
Tabelle 4
Antiträger- und Antipeptidantworten in Mäusen, welche mit qp120-T-Zellen-stimulierenden Peptidkonjugaten immunisiert worden sind.
ANTIKÖRPERANTWORT Immunisierungsgruppe
Anti-Träger
Anti-gp120-Peptid
Salzlösung
1
1
gp 120-T1
2
838
gp 120-T2
1
2,612
gp 120-T3
1,234
52
gp 120-T4
1
3,110
gp 120-T5
2
158
gp 120-T6
3
3,431
gp 120-T7
400
13
gp 120
1
13
Antikörpertiter werden als das arithmetische Mittel des reziproken Werts der Antiserumverdünnung ausgedrückt, welche nach 45 Minuten bei 25°C einen ELISA-Stand von 0,5 gab.
Die starke T-Zellen-Stimulierung, welche mit diesen Peptiden, die B-Zellen-Antworten gegenüber dem gebundenen Immunogen primen, beobachtet wurden, konnten auch durch das Einverleiben der T-Zel-len-Epilopsequenzen in Fusionsproteine erzielt werden, welche speziell für die Präsentation von Peptid-Antigenen entworfen wurden.
Immunogene Fusionsproteine, welche die T-Zellen-Epitope und Protein- oder Peptid-Antigene enthalten, können von einem rekombinanten Gen, welches das Fusionsprotein codiert, produziert werden, wenn dieses in einem angemessenen Wirtsvektorsystem exprimiert wird. Diese Chimären Proteine können verschiedene Formen annehmen. Das Antigen kann benachbart zum T-Zellen-Epitop wie T2 (SEQUENZ ID Nr. 2) oder T6 (SEQUENZ ID Nr. 24) lokalisiert sein, wobei das TraT im wesentlichen intakt ist (z.B. Luteinisierungshormon freisetzendes Hormon [LHRH]/TraT-Fusionen); die T-Zellen-Epitope alleine können in das Proteinantigen eingesetzt werden. Zum Beispiel T2 (SEQUENZ ID Nr. 2) oder T6 (SEQUENZ ID Nr. 6 oder 24) kann in das Milben-Antigen BM86 (beschrieben als WGL+ in PCT/AU87/ 00401) eingefügt werden; oder Teile von TraT, welche T2 (SEQUENZ ID Nr. 2) und/oder T6 (SEQUENZ ID Nr. 24) tragen, können nahe bei den antigenen Teilen des Proteins lokalisiert sein (z.B. T2, T6/TraT und Luteinisierungshormon).
Eine geeignete Quelle für DNA, welche die T-Zellen-Epitope der Erfindung codiert, ist ATCC 67331.
BEISPIEL 5
Verbesseruno der Wirksamkeit einer Vakzine durch die Verwendung von starken, universellen T-Zellen-Epitopen.
Einer der hauptsächlichen Nachteile bei der Entwicklung von wirksamen Vakzinen gegen Krankheiten sowie AIDS war die Anwesenheit von «Unterdrückregionen» (suppressor régions), welche bei der Entwicklung von wirksamen Immunantworten gegenüber diesen Proteinen störend wirkten, in anderweitig immunogenen Molekülen wie gp120 (ein immunodominantes externes Hüllprotein von HIV). Um schützende Immunantworten gegen diese Proteine auszulösen wurde vorgeschlagen, diese Sequenzen zu entfernen und diese durch stärker immunogene Sequenzen zu ersetzen.
T-Zellen-Epitopsequenzen, welche von TraT abgeleitet worden sind, besitzen unerwartet hohe immu-nostimulierende Eigenschaften bei einer Reihe von phylogenetisch unterschiedlichen Arten. Von diesen verschiedenen T-Zellen-Epitop-Peptiden, welche eine erlaubbare Verbindung mit grösseren Histocompa-tibilitätskomplex (MHC)-Molekülen manifestieren und deshalb von T-Zellen bevorzugt erkannt werden, würde erwartet werden, dass diese starke T-Zellen-Immunität in der Mehrheit an Individuen in einer nicht blutsverwandten Population auslösen.
15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
CH 683 101 A5
Von zwei Unterdrückerregionen, welche zu den Aminosäuresequenzen 735-752 und 846-860 des transmembranen Glycoproteins von HIV korrespondieren, ist gezeigt worden, dass sie eine markante Inhibition der blastogenen Antworten des Menschen gegen Mitogene und Alloantigene ausüben (Chanh, T.C., Kennedy, R.C. und Kanda, K. Cell Immunol. 111: 77-86. 1988).
Unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie sind die «Unterdrückerregionen» in einer Anzahl voraussichtlicher Vakzine-Proteine einschliesslich gp120 entfernt und durch immunstimuiierende Peptiden, welche von TraT abgeleitet wurden, ersetzt worden. Dieser Weg (approach) resultiert in Vakzinen, weiche starke schützende Immunität in Wirten eines breiten Spektrums von MHC-Hintergründen auslösen. In erster Linie wird die Entfernung von Unterdrückerregionen die immunogenität des Moleküls verbessern und der Ersatz von Unterdrückerregionen mit immunostimulierenden Regionen wird die Immunogenität des modifizierten Moleküls weiter erhöhen. Der Ersatz von der oder den Unterdrückerregionen mit einer stark T-Zellen-stimulierenden Region wie T6 wird die Immunogenität des modifizierten rekombinanten Moleküls verstärken. Dieses Molekül würde das natürliche gp120-Molekül ersetzen, wo dieses modifizierte Molekül als eine Basis einer Vakzine verwendet wird, z.B. als Vakzinenuntereinheit oder als Teil inaktivierter viraler Partikel.
Zum Beispiel wird die Unterdrückerregion von HIV, welche zur Aminosäuresequenz (735-752) korrespondiert:
Tyr-Asp-Ar g-Pro-Glu-Gly-I Ie-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Glu-Arg-(735)
Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Gly-Cys (SEQUENZ ID Nr. 18)
(752)
durch das von TraT abgeleitete T6-Peptid ersetzt: Ser-Thr-Glu-Thr-Gly-Asn-Gln-His-His-Tyr-Gln-Thr-Arg-Val-Val-Ser-Asn-Ala-Asn-Lys (SEQUENZ ID Nr. 6).
Industrielle Anwendung
Die vorliegende Erfindung ist bei der Herstellung von Vakzinen für die Verwendung in Tieren und Menschen von Wert. Die Verwendung von T-Zellen-Epitop-Peptiden als Trägermoleküle wird sowohl die Antikörperproduktion erhöhen als auch die zeilmediierte Immunität stimulieren, währenddem viele der Nachteile vermieden werden, welche bei der Verwendung grösserer Trägerproteinmoleküle auftreten.
Hinterlegung von Stämnnen
BTA 1349 wurde gemäss den Bestimnnungen des Budapest-Vertrags bei der American Type Culture Collection an der 12301 Parklawn Drive, Rockville MD 20852 USA am 2. März 1987 unter der Hinterlegungsnummer ATCC 67331 hinterlegt.
Referenzen
Adsorini et al (1988) J Exp. Med. ISS 2091
Avraemeus et al (1978) Scand. J. Immunol. £ 7
Bolivar et al (1977) Gene 2 95
Chanh, et al (1988) Cell Imnnunol. 111: 77-86
Chouaib et al (1988) PNAS S5 6875
De Lisi and Berzofsky (1985) PNAS §2 7048
Ogata et al (1982) J. Bacteriol 151819
Perumal und Ninkley (1984) J. Biol. Chem. 259 5359
Tsai und Frasch (1982) Anal. Biochem. 119 115
Webster (1980) J. Clin. Microbiol. 12 644
Buus und Werdelin (1986) J. Immunol. 125 452
PCT/US89/00388
PCT/AU87/00107
16
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i)
ANMELDER:
RUSSELL-JONES, Gregory John (für USA) GRECZY, Andrew Francis (für US) Biotech Australia Pty Limited (für bezeichnete Staaten ausser USA)
(ii)
TITEL DER ERFINDUNG:
T-Zellen-Epitope
(Iii)
ANZAHL DER SEQUENZEN:
25
(iv)
KORRESPONDENZ-ADRESSE:
(A)
EMPFÄNGER:
Griffith Hack & Co
(B)
STRASSE:
71 York Street
(C)
ORT:
SYDNEY
(D)
STAAT:
New South Wales
(E)
LAND:
AUSTRALIEN
(F)
PLZ:
2000
(V)
COMPUTERLESBARE FORM:
(A)
MEDIUM TYP:
Diskette, 3.5 Inch, 720 Kb
(B)
COMPUTER:
I BM-PC-kompatibel
(C)
BETRIEBSSYSTEM:
MS DOS 3.3
(D)
SOFTWARE:
Wordperfect 5.1
(Vi)
DATEN DER FRÜHEREN ANMELDUNG:
(A)
ANMELDENUMMER:
PK2361
(B)
EINREICHUNGSDATUM:
18. September 1990
17
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FUR SEQ: ID Nr. 1:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
25 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
Eine auf T-Zellen-Epitop-Aktivität getestete Sequenz vom E. coli Protein TraT
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
Nein Nein Intern
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS:
E- coli
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON: BTA 1349 (viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 1:
Gly Ala Met Ser Thr Ala Ile Lys Lys Arg
Asn Leu Glu Val Lys Thr Gin Met Ser Glu
5
10
15
Thr Ile Trp Leu Glu
25
20
18
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 2:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNG IG KEIT:
(D) TOPOLOGIE:
14 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
Eine auf T-Zellen-Epitop-Aktivität getestete Sequenz vom TraT-Protein von E. coli
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
Nein Nein Intern
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS:
E. coli
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON: BTA 1349
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 2:
Gly Leu Gin Gly Lys Ile Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly
5
10
19
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 3:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
23 Aminosäuren
Aminosäure
Einzel
Linear
Peptid
Auf T-Zellen-Epitop-Aktivität getestete Sequenz mit N-terminaler Modifikation, welche vom TraT-Protein von E. coli abgeleitet worden ist.
Nein
Nein
Intern modifiziert
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS:
E. coli
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 3:
Ser Gin Trp Leu Asn Arg Gly Tyr Glu Gly Ala Ala Val Gly Ala
5
10
15
Ala Leu Gly Ala Gly Ile Thr Gly
20
20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 4: (ij SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS:
(B)
STAMM:
(C)
EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D)
ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E)
HAPLOTYP:
(F)
GEWEBETYP:
(G)
ZELLTYP:
(H)
ZELLINIE:
(I)
ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON: BTA 1349
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 4:
Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val
5 10 15
Glu Asp Val Asn
19 Aminosäuren
Aminosäure
Einzel
Linear
Peptid
Auf T-Zellen-Epitop-Aktivität getestete Sequenz vom TraT-Protein von E. coli
Nein
Nein
Intern
E. coli
21
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 5:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
22 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
Auf T-Zellen-Epitop-Aktivität getestete Sequenz vom TraT-Protein von E. coli
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
Nein Nein Intern
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS:
E. coli
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON: BTA 1349
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 5:
Asp Val Gin Ile Ala Glu Arg Thr Lys Ala Thr Val Thr Thr Asp
5
10
15
Asn Val Ala Ala Leu Arg Gin
20
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 6:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
20 Aminosäuren
Aminosäure
Einzel
Linear
Peptid
Auf T-Zellen-Epitop-Aktivität getestete Sequenz mit Modifikation, welche vom TraT-Protein von E. coli abgeleitet ist
Nein
Nein
Intern modifiziert
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS:
E. coli
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 6:
Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gin His His Tyr Gin Thr Arg Val Val
5
10
15
Ser Asn Ala Asn Lys
20
23
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FUR SEQ: ID Nr. 7:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
19 Aminosäuren
Aminosäure
Einzel
Linear
Peptid
Auf T-Zellen-Epitop-Aktivität getestete Sequenz mit Modifikation, welche vom TraT-Protein von E. coli abgeleitet ist
Nein
Nein
Intern modifiziert
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS:
E. coli
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLIN IE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSON/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 7:
Lys Val Asn Leu Lys Thr Glu Glu Ala Lys Pro Val Leu Glu Asp
5
10
15
Gin Leu Ala Lys
24
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 8:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
17 Aminosäuren
Aminosäure
Einzel
Linear
Peptid
Synthetisches Immunogen, welches vom Zirkumsporozoit-Oberflächen-Protein von Plasmodium falciparum abgeleitet worden ist
Nein
Nein
N/A
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
(iii) HYPOTHETISCH
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) RAGMENT TYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS:
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 8:
Cys Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
5
10
15
Asn Ala
25
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FUR SEQ: ID Nr. 9:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
27 Aminosäuren Aminosäure Einzel Linear
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
Peptid
Modifikation von Sequenz ID Nr. 1 mit hinzugefügten N-terminalen und C-terminalen Resten
Nein
Nein
Intern modifiziert
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS:
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(ix) KENNZEICHEN:
An Position 1, Xaa = Pyroglutaminsäure An Position 27, Xaa = Cysteinamid (xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 9:
Xaa Gly Ala Met Ser Thr Ala Ile Lys Lys Arg Asn Leu Glu Val
5
10
15
Lys Thr Gin Met Ser Glu Thr Ile Trp Leu Glu Xaa
20
25
26
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 10:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
16 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP:
(A) BESCHREIBUNG:
Modifikation von Sequenz ID Nr. 2 mit hinzugefügten N-terminalen und C-terminalen Resten
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
Nein Nein
Intern modifiziert
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS:
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINI E:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(ix) KENNZEICHEN:
An Position 1, Xaa = Pyrogiutaminsäure An Position 16, Xaa = Cysteinamid (xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 10:
Xaa Gly Leu Gin Gly Lys Ile Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly
5
10
15
Xaa
27
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 11:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
25 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
Modifikation von Sequenz ID Nr. 3 mit hinzugefügten N-terminalen und C-terminalen Resten
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
Nein Nein
Intern modifiziert
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS:
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(ix) KENNZEICHEN:
An Position 1, Xaa = Pyroglutaminsäure An Position 25, Xaa = Cysteinamid (xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 11:
Xaa Ser Gin Trp Leu Asn Arg Gly Tyr Glu Gly Ala Ala Val Gly
5
IO
15
Ala Ala Leu Gly Ala Gly Ile Thr Gly Xaa
20
25
28
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 12:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
21 Aminosäuren
Aminosäure
Einzel
Linear
Peptide
Modifikation von Sequenz ID Nr. 4 mit hinzugefügten N-terminalen und C-terminalen Resten.
Nein
Nein
Intern modifiziert
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP::
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS:
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(ix) KENNZEICHEN:
An Position 1, Xaa = Pyroglutaminsäure An Position 21, Xaa = Cysteinamid (xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 12:
Xaa Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met
5
10
15
Val Glu Asp Val Asn Xaa
20
29
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 13:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
24 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
Modifikation von Sequenz ID Nr. 5 mit hinzugefügten N-terminalen und C-terminalen Resten
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
Nein Nein
Intern modifiziert
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS:
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLIN IE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(ix) KENNZEICHEN:
An Position 1, Xaa = Pyroglutaminsäure An Position 24, Xaa = Cysteinamid (xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 13:
Xaa Asp Val Gin Ile Ala Glu Arg Thr Lys Ala Thr Val Thr Thr
5
10
15
Asp Asn Val Ala Ala Leu Arg Gin Xaa
20
30
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 14:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
22 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
Modifikation von Sequenz ID Nr. 6 mit hinzugefügten N-terminalen und C-terminalen Resten
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
Nein Nein
Intern modifiziert
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS:
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(ix) KENNZEICHEN:
An Position 1, Xaa = Pyroglutaminsäure An Position 22, Xaa = Cysteinamid (xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 14:
Xaa Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gin His His Tyr Gin Thr Arg Val
5
10
15
Val Ser Asn Ala Asn Lys Xaa
20
31
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FUR SEQ: ID Nr. 15:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
21 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
Modifikation von Sequenz ID Nr. 7 mit hinzugefügten N-terminalen und C-terminalen Resten
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
Nein Nein
Intern modifiziert
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS:
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHRONOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(ix) KENNZEICHEN:
An Position 1, Xaa = Pyroglutaminsäure An Position 21, Xaa = Cysteinamid (xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 15:
Xaa Lys Val Asn Leu Lys Thr Glu Glu Ala Lys Pro Val Leu Glu
5
10
15
Asp Gin Leu Ala Lys Xaa
20
32
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 16:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
729 Basenpaare Nukleinsäuren doppelsträngig Linear
Genomische DNA
Codiert für das TraT-Protein von E. coli
Nein
Nein
N/A
(D) TOPOLOGIE:
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS:
E, coli ein Stamm, welcher Plasmid R100 trägt
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON: BTA 1349 (ATCC 67331)
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
33
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
45
90
135
180
225
270
315
360
405
450
CH 683 101 A5
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 16
AAA ATG AAA AAA TTG ATG ATG GTT GCA CTG GTC AGT TCC ACT CTG Lys Met Lys Lys Leu Met Met Val Ala Leu Val Ser Ser Thr Leu
5 10 15
GCC CTT TCA GGG TGT GGT GCG ATG AGC ACA GCA ATC AAG AAG CGT Ala Leu Ser Gly Cys Gly Ala Met Ser Thr Ala Ile Lys Lys Arg
20 25 30
AAC CTT GAG GTG AAG ACT CA G ATG AGT GAG ACC ATC TGG CTT GAA Asn Leu Glu Val Lys Thr Gin Met Ser Glu Thr Ile Trp Leu Glu
35 40 45
CCC GCC AGC GAA CGC ACG GTA TTT CTG CAG ATC AAA AAC ACG TCT Pro Ala Ser Glu Arg Thr Val Phe Leu Gin Ile Lys Asn Thr Ser
50 55 60
GAT AAA GAC ATG AGT GGG CTG CAG GGC AAA ATT GCT GAT GCT GTG Asp Lys Asp Met Ser Gly Leu Gin Gly Lys Ile Ala Asp Ala Val
65 70 75
AAA GCA AAA GGA TAT CAG GTG GTG ACT TCT CCG GAT AAA GCC TAC Lys Ala Lys Gly Tyr Gin Val Val Thr Ser Pro Asp Lys Ala Tyr
80 85 90
TAC TGG ATT CAG GCG AAT GTG CTG AAG GCC GAT AAG ATG GAT CTG Tyr Trp Ile Gin Ala Asn Val Leu Lys Ala Asp Lys.Met Asp Leu
95 100 105
CGG GAG TCT CAG GGA TGG CTG AAC CGT GGT TAT GAA GGC GCA GCA Arg Glu Ser Gin Gly Trp Leu Asn Arg Gly Tyr Glu Gly Ala Ala 110 115 120
GTT GGT GCA GCG TTA GGT GCC GGT ATT ACC GGC TAT AAC TCA AAT Val Gly Ala Ala Leu Gly Ala Gly Ile Thr Gly Tyr Asn Ser Asn 125 130 135
TCT GCC GGT GCC ACA CTC GGT GTA GGC CTT GCT GCT GGT CTG GTG Ser Ala Gly Ala Thr Leu Gly Val Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val c 140 145 150
34
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
GGT ATG GCT GCA GAT GCG ATG GTG Gly Met. Ala Ala Asp Ala Met Val
155
ATC ACG GAT GTA CAG ATT GCA GAG Ile Thr Asp Val Gin Ile Ala Glu 170
ACG GAT AAT GTT GCC GCC CTG CGT Thr Asp Asn Val Ala Ala Leu Arg 185
ATT CAG ACC AGT ACT GAA ACA GGT Ile Gin Thr Ser Thr Glu Thr Gly 200
CGT GTG GTT TCA AAT GCG AAC AAG Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys 215
GCG AAG CCT GTT CTC GAA GAC CAA Ala Lys Pro Val Leu Glu Asp Gin 230
ATT CTC TGA Ile Leu CT
GAA GAT GTG AAC TAT ACC ATG 495 Glu Asp Val Asn Tyr Thr Met 160 165
CGT ACT AAG GCA ACG GTG ACA 540 Arg Thr Lys Ala Thr Val Thr 175 180
CAG GGC ACA TCA GGT GCG AAA 585 Gin Gly Thr Ser Gly Ala Lys 190 195
AAC CAG CAT AAA TAC CAG ACC 630 Asn Gin His Lys Tyr Gin Thr 205 210
GTT AAC CTG AAA TTT GAA GAG 675 Val Asn Leu Lys Phe Glu Glu 220 225
CTG GCC AAA TCA ATC GCA AAT 720 Leu Ala Lys Ser Ile Ala Asn 235 240
35
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 17:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
20 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
Aminosäuren 133-152 der preS2-Region des Hepatitis B-Virus
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
Nein Nein
Intern modifiziert
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS:
Hepatitis B-Virus
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 17:
Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser
5
10
15
Ser Gly Thr Val Cys
20
36
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 18: (îj SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS:
(B)
STAMM:
(C)
EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D)
ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E)
HAPLOTYP:
(F)
GEWEBETYP:
(G)
ZELLTYP:
(H)
ZELLINIE:
(I)
ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSON/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 18:
Tyr Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu
5 10
Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser Gly Cys
15 20
21 Aminosäuren
Aminosäure
Einzel
Linear
Peptid
Aminosäuren 734-754 des Transmembran-Glycoproteins von HIV
Nein
Nein
Intern
HIV
37
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 19:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
25 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
D1-T-Zellen-Epitop des Diphtherie-Toxoids mit N- und C-terminaler Modifikation
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
Nein Nein
Intern modifiziert
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS:
Corvnebacterium diphtheriae
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(ix) KENNZEICHEN:
An Position 1, Xaa = Acetylalanin An Position 25, Xaa = Cysteinamid (xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 19:
Xaa Thr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn
Leu Phe Gin Val Val His Asn Ser Tyr Asn
5
10
15
20
Arg Pro Ala Tyr Xaa
25
38
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 20:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
24 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
D2-T-Ze!len-Epitop von Diphtherie-Toxoid mit N- und C-terminaler Modifikation
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
Nein Nein
Intern modifiziert
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS:
Corvnebacterium diphtheriae
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(ix) KENNZEICHEN:
An Position 1, Xaa = Acetylthreonin An Position 24, Xaa = Cysteinamid (xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 20:
Xaa Glu Pro Asn Leu His Asp Gly Tyr Ala
Val Ser Trp Asn Thr Val Glu Asp Ser Ile
5
10
15
20
Ile Arg Thr Xaa
39
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 21:
Ô) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
(ii) MOLEKÜL TYP:
(A) BESCHREIBUNG:
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS:
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(ix) KENNZEICHEN:
An Position 1, Xaa = Acetylaspartat An Position 23, Xaa = Cysteinamid (xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 21:
Xaa Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys
5 10
Thr Val Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly 15 20
Ile Gly Xaa
23 Aminosäuren
Aminosäure
Einzel
Linear
Peptid
D3-T-Zellen-Epitop von Diphtherie-Toxoid mit N- und C-terminaier Modifikation
Nein
Nein
Intern modifiziert Corvnebacterium diphtheriae
40
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 22:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
(ii) MOLEKÜL TYP:
(A) BESCHREIBUNG:
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS:
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON:
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGNENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(ix) KENNZEICHEN:
An Position 39, Xaa = Cysteinamid (xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG:
39 Aminosäuren.
Aminosäure
Einzel
Linear
Peptid
D4-T-Zellen-Epitop von Diphtherie-Toxoid mit N- und C-terminaler Modifikation
Nein
Nein
Intern modifiziert Corvnebacterium diphtheriae
SEQ ID Nr. 22:
Glu Giù Ile Val Ala Gin Ser Ile Ala Leu Ser .Ser Leu Met Val
5 IO 15
Ala Gin Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe
20 25 30
Ala Ala Thr Asn Phe Val Glu Ser Xaa
35
41
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 23:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
25 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
Eine Sequenz cles TraT-Proteins von E. coli von welchem vorhergesagt wurde, dass es ein T-Zellen-Epitop ist: TraT (T3)
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG:
(v) FRAGMENT TYP:
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
Nein Nein Intern
(A) ORGANISMUS:
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
E. coli
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON: BTA 1349
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 23:
Glu Ser Gin Gly Trp Leu Asn Arg Gly Tyr Glu Gly Ala Ala Val
5
10
15
Gly Ala Ala Leu Gly Ala Gly Ile Thr Gly
20
25
42
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 24:
(i) SEQUENZ MERKMALE:
(A) LÄNGE:
(B) TYP:
(C) STRÄNGIGKEIT:
(D) TOPOLOGIE:
20 Aminosäuren Aminosäure
Einzel Linear Peptid
(ii) MOLEKÜL TYP: (A) BESCHREIBUNG:
Eine Sequenz des TraT-Proteins von E coli. von welchem vorhergesagt wurde, dass es ein T-Zellen-Epitop ist: TraT (T6)
(iii) HYPOTHETISCH:
(iv) GEGENRICHTUNG: (v) FRAGMENT TYP:
Nein Nein Intern
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE: (A) ORGANISMUS:
E. coli
(B) STAMM:
(C) EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E) HAPLOTYP:
(F) GEWEBETYP:
(G) ZELLTYP:
(H) ZELLINIE:
(I) ORGANELLE:
(vii) UNMITTELBARE QUELLE:
(A) BIBLIOTHEK:
(B) KLON: BTA 1349
(viii) POSITION IM GENOM:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT:
(B) KARTENPOSITION:
(C) EINHEITEN:
(xi) SEQUENZ BESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 24:
Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gin His Lys Tyr Gin Thr Arg Val Val
5
io
15
Ser Asn Ala Asn Lys
20
43
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
CH 683 101 A5
(2) INFORMATION FÜR SEQ: ID Nr. 25:
(i)
SEQUENZ MERKMALE:
(A)
LÄNGE:
19 Aminosäuren
(B)
TYP:
Aminosäure
(C)
STRÄNGIGKEIT:
Einzel
(D)
TOPOLOGIE:
Linear
(ii)
MOLERÜL TYP:
Peptid
(A)
BESCHREIBUNG:
Eine Sequenz des TraT-Proteins von E. coli, von welchem vorhergesagt wurde, das es ein T-Zellen-Epitop ist: TraT (T7)
(iii)
HYPOTHETISCH:
Nein
(iv)
GEGENRICHTUNG:
Nein
(v)
FRAGMENT TYP:
Intern
(vi)
URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A)
ORGANISMUS:
E. coli
(B)
STAMM:
(C)
EINZELNE ISOLIERTE PRODUKTE:
(D)
ENTWICKLUNGSSTADIUM:
(E)
HAPLOTYP:
(F)
GEWEBETYP:
(G)
ZELLTYP:
(H)
ZELLINIE:
(1)
ORGANELLE:
(vii)
UNMITTELBARE QUELLE:
(A)
BIBLIOTHEK:
(B)
KLON:
BTA 1349
(viii)
POSITION IM GENOM:
(A)
CHROMOSOM/SEGMENT:
(B)
KARTENPOSITION:
(C)
EINHEITEN:
(xi)
SEQUENZ BESCHREIBUNG:
SEQ ID Nr. 25:
Lys Val Asn Leu Lys Phe Glu Glu Ala Lys
5 io
Pro Val Leu Glu Asp Gin Leu Ala Lys
15
44
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 683 101 A5

Claims (24)

Patentansprüche
1. Ein T-Zellen-Epitop, welches einen Teil der Aminosäuresequenz des Proteins TraT darstellt.
2. Das T-Zellen-Epitop gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Sequenz hat:
GlyAlaMetSerThrAlalleLysLysArgAsnLeuGluValLysThrGInMetSerGIuThrlleTrpLeuGlu.
3. Das T-Zellen-Epitop gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Sequenz hat:
GlyLeuGInGlyLyslleAlaAspAlaValLysAlaLysGly.
4. Das T-Zellen-Epitop gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Sequenz hat:
GlyLeuAlaAlaGlyLeuValGlyMetAlaAlaAspAlaMetValGluAspValAsn.
5. Das T-Zellen-Epitop gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Sequenz hat:
SerThrGluThrGlyAsnGlnHisHisTyrGInThrArgValValSerAsnAlaAsnLys.
6. Das T-Zellen-Epitop gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgende Sequenz hat:
SerThrGluThrGlyAsnGlnHisLysTyrGInThrArgValValSerAsnAIaAsnLys.
7. Ein T-Zellen-Epitop, worin die Aminosäuresequenz eines T-Zellen-Epitops nach einem der Ansprüche 1 bis 6 mindestens einmal modifiziert ist, wobei die mindestens eine Modifikation die Addition eines N-terminalen Pyroglutaminsäure-Rests, die Substitution eines N-terminalen Glutaminsäure-Rests durch einen Pyroglutaminsäure-Rest, die Addition eines C-terminalen Cysteinamids, die Substitution eines C-terminalen Aminosäure-Rests mit einem Cysteinamid und/oder die Entfernung oder Substitution eines Aminosäure-Rests innerhalb der entsprechenden Sequenz ist.
8. Ein T-Zellen-Epitop gemäss Anspruch 7, welches einen N-terminalen Pyroglutaminsäurerest enthält.
9. Ein T-Zellen-Epitop gemäss Anspruch 7 oder Anspruch 8, welches einen C-terminalen Cystein-amid-Rest enthält.
10. Ein Komplex, welcher mindestens ein T-Zellen-Epitop gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9 enthält, welches mit mindestens einem Immunogen verbunden ist, so dass das mindestens eine T-Zellen-Epitop seine Wirkung als ein T-Zellen-Epitop beibehält und das mindestens eine Immunogen mindestens eine antigene Determinante präsentiert, gegen welche eine Immunantwort angeregt werden kann.
11. Ein Komplex gemäss Anspruch 10, worin das mindestens eine Immunogen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: dem Circumsporozoit-Oberflächenprotein von Plasmodium falciparum. dem synthetischen Immunogen NH2 Cys (Asn Pro Asn Ala)-», welches vom Circumsporozoit-Oberflächenpro-tein von Plasmodium falciparum abgeleitet worden ist, das Ganze oder ein Teil des Luteinisierungshor-mons oder Somatostatins und immunogene Proteine, welche ganz oder ein Teil sind von dem S-Protein vom Hepatitis B-Virus, dem AIDS-Virus, Influenza-Virus, Maul- und Klauenseuche-Virus, Inhibin oder FSH.
12. Eine Vakzine, welche einen Komplex gemäss Anspruch 10 oder 11 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Füllstoff, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsmittel enthält.
13. Ein Hybridpolynucleotidmoiekül für die Herstellung eines Komplexes nach Anspruch 10, welches besteht aus: einer Polynucleotidsequenz, welche als eine codierende Sequenz für mindestens ein T-Zellen-Epitop gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9 wirkt, welche mit einer Polynucleotidsequenz verschmolzen ist, die als eine codierende Sequenz für mindestens ein Immunogen wirkt.
14. Ein Hybridpolynucleotidmoiekül für die Herstellung eines Komplexes nach Anspruch 10, welches besteht aus einer Polynucleotidsequenz, welche als eine codierende Sequenz für mindestens ein Immunogen wirkt, in welche mindestens eine Polynucleotidsequenz eingefügt ist, welche als eine codierende Sequenz für ein T-Zellen-Epitop gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9 wirkt.
15. Ein Hybridpolynucleotidmoiekül für die Herstellung eines Komplexes nach Anspruch 10, welches besteht aus: einer ersten Polynucleotidsequenz, welche als eine codierende Sequenz für das ganze oder einen Teil des TraT-Moleküls wirkt, mit einer Polynucleotidsequenz, welche als eine codierende Sequenz für mindestens ein Immunogen wirkt, welche in die erste Polynucleotidsequenz eingefügt ist, benachbart zu mindestens einem T-Zellen-Epitop gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9.
16. Ein Hybridpolynucleotidmoiekül gemäss einem der Ansprüche 13 bis 15, weiches Molekül ein DNA-Molekül ist.
17. Ein Fusionsgen zur Herstellung eines Komplexes nach Anspruch 10, welches eine Hybrid-DNA-Sequenz gemäss Anspruch 16 enthält und mit einem portablen Promotor, wie dem Pi_-Promotor des Bakteriophagen-Lambda verschmolzen ist.
18. Ein rekombinantes DNA-Molekül zur Herstellung eines Komplexes nach Anspruch 10, welches eine DNA-Sequenz gemäss Anspruch 16 und Vektor-DNA enthält.
19. Ein rekombinantes DNA-Molekül gemäss Anspruch 18, welches eine Expressionskontroll-Se-quenz enthält, welche wirksam mit der DNA-Sequenz verknüpft ist.
20. Ein transformierter Wirt, welcher die genetische Information für die Biosynthese eines Komplexes gemäss Anspruch 10 oder 11 trägt.
45
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 683 101 A5
21. Ein Komplex gemäss Anspruch 10 oder 11 als Expressionsprodukt eines transformierten Wirts gemäss Anspruch 20.
22. Verfahren für die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls gemäss Anspruch 18, welches das Klonieren einer DNA-Sequenz gemäss Anspruch 16 oder 17 in Vektor-DNA einschliesst.
23. Verfahren gemäss Anspruch 22, welches zusätzlich das Klonieren einer Expressions-Kontrollse-quenz in den Vektor einschliesst.
24. Verfahren für die Herstellung eines transformierten Wirts, dadurch gekennzeichnet, dass ein rekombinantes DNA-Molekül gemäss Anspruch 18 oder 19 in einen Wirt eingeführt wird.
46
CH1608/92A 1990-09-18 1991-09-17 T-Zellen-Epitope. CH683101A5 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AUPK236190 1990-09-18
PCT/AU1991/000429 WO1992005192A1 (en) 1990-09-18 1991-09-17 T-cell epitopes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CH683101A5 true CH683101A5 (de) 1994-01-14

Family

ID=3774962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CH1608/92A CH683101A5 (de) 1990-09-18 1991-09-17 T-Zellen-Epitope.

Country Status (4)

Country Link
US (2) US5500366A (de)
CH (1) CH683101A5 (de)
DE (2) DE4192335C2 (de)
WO (1) WO1992005192A1 (de)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ28294A3 (en) * 1991-08-13 1994-05-18 Biotech Australia Pty Ltd Immunostimulation
US6169171B1 (en) * 1992-02-27 2001-01-02 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hybrid protein between CS from plasmodium and HBSAG
ES2180576T3 (es) * 1993-04-27 2003-02-16 United Biomedical Inc Construcciones peptidicas de lhrh inmunogenicas y estimuladores de inmunidad universales sinteticos para vacunas.
US5759551A (en) * 1993-04-27 1998-06-02 United Biomedical, Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
DK96493D0 (da) * 1993-08-26 1993-08-26 Mouritsen Og Elsner Aps Fremgangsmaade til at inducere antistofresponser mod selvproteiner og autovaccine fremstillet ved fremgangsmaaden
US6936249B1 (en) * 1998-04-15 2005-08-30 Genencor International, Inc. Proteins producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
US20030232055A1 (en) * 2000-07-31 2003-12-18 Ruslan Medzhitov Innate immune system-directed vaccines
US7608683B2 (en) * 2000-08-09 2009-10-27 The Regents Of The University Of California Stress proteins and peptides and methods of use thereof
US6989146B2 (en) * 2000-08-09 2006-01-24 The Regents Of The University Of California Stress proteins and peptides and methods of use thereof
US20030175287A1 (en) * 2001-01-03 2003-09-18 Yale University Innate immune system-directed vaccines
US20030007973A1 (en) * 2001-06-22 2003-01-09 Lynes Michael A. Methods and compositions for manipulation of the immune response using anti-metallothionein antibody
ES2555544T3 (es) 2006-03-07 2016-01-04 Vaxinnate Corporation Composiciones que incluyen hemaglutinina, métodos de preparación y métodos de uso de las mismas
SG190562A1 (en) 2008-04-18 2013-06-28 Vaxinnate Corp Deletion mutants of flagellin and methods of use
EP2391383B1 (de) 2009-02-02 2015-12-23 ChronTech Pharma AB Codon-optimiertes hepatitis b virus core antigen (hbcag)
WO2011119920A2 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
WO2012028524A2 (en) * 2010-08-30 2012-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing a lipid particle, the lipid particle itself and its use
ES2667425T3 (es) 2011-06-10 2018-05-10 Oregon Health & Science University Glucoproteínas y vectores recombinantes de CMV
CA2838070A1 (en) 2011-08-25 2013-02-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Shortened tetranectin-apolipoprotein a-i fusion protein, a lipid particle containing it, and uses thereof
AU2012216792A1 (en) 2011-09-12 2013-03-28 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2586461A1 (de) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Von einem eingehüllten Virus abgeleitete Virenpartikel
EP2679596B1 (de) 2012-06-27 2017-04-12 International Aids Vaccine Initiative HIV-1 Env-proteinvariante
WO2014186409A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Chrontech Pharma Ab Immunogenic compositions for inhibiting hepatitis d virus
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
EP2873423B1 (de) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Lösliche hiv-1-hüllglykoproteintrimere
US10174292B2 (en) 2015-03-20 2019-01-08 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (de) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Lösliche hiv-1-hüllglykoproteintrimere
WO2022067062A1 (en) * 2020-09-24 2022-03-31 Epivax, Inc. Rapid development of prophylactic broad spectrum vaccine for sars-cov-2 using phage mediated antigen delivery system

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU619443B2 (en) * 1986-04-21 1992-01-30 Bioenterprises Pty. Ltd. Immunopotentiation
CA1331355C (en) * 1986-04-21 1994-08-09 Bioenterprises Pty. Ltd Immunopotentation
JP2921574B2 (ja) * 1988-02-01 1999-07-19 アメリカン・サイアナミド・カンパニー 接合体ワクチンの担体分子としてのｔ細胞のエピトープ
GB8812214D0 (en) * 1988-05-24 1988-06-29 Hoffmann La Roche Use of peptide from circumsporozoite protein of p falciparum as universally recognized t-cell epitope
JPH03503054A (ja) * 1988-09-26 1991-07-11 バイオテクノロジー・オーストラリア・プロプライエタリー・リミテッド ワクチン
AU629249B2 (en) * 1988-09-26 1992-10-01 Biotechnology Australia Proprietary Limited Vaccine
ATE140972T1 (de) * 1989-08-25 1996-08-15 Biotech Australia Pty Ltd Fusionsproteine bestehend aus tratp und mindestens einem lhrh-analog

Also Published As

Publication number Publication date
DE4192335T1 (de) 1993-10-07
WO1992005192A1 (en) 1992-04-02
US5500366A (en) 1996-03-19
DE4192335C2 (de) 1996-02-08
US5928644A (en) 1999-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE4192335C2 (de) T-Zell-Epitope
DE69315993T2 (de) Konjugate aus hitzeshockproteinen und oligo- oder polysacchariden
DE69738329T2 (de) Zielrichten von antigenen auf den mhc-klasse i prozessierungsweg mit hilfe eines anthraxtoxin-fusionsproteins
DE69630033T2 (de) Immunologische kombinationsmittel und dazugehörige verfahren
DE69924392T2 (de) Verfahren zur hemmung der aktivität von osteoprotegerin-liganden
DE68921895T3 (de) Meningococcales klasse i-aussenmembranprotein-vakzin.
JP5566684B2 (ja) Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する、組換え毒素Ａ／毒素Ｂワクチン
DE69814177T2 (de) Impfstoffe mit einem ltb adjuvans
DE68907045T2 (de) Synthetische Peptide und deren Verwendung als allgemeine Träger für die Herstellung von immunogenischen Konjugaten, die für die Entwicklung von synthetischen Impfstoffen geeignet sind.
DE68928251T2 (de) Cs-Peptide von P. Falciparum als allgemeines t-Zellen-Epitop
DE69829668T2 (de) Herstellung und verwendung von rekombinanten influenza a virus m2 konstruktionen und impstoffe
DE69937571T2 (de) Mutiertes cholera holotoxin als hilfsmittel
DE60036552T2 (de) Fc-fusionsproteine zur erhöhung der immunogenität von protein- und peptid-antigenen
DE69333036T2 (de) DNA-Fragmente, die für die Untereinheiten von dem Neisseria Meningitidis Rezeptor kodieren
DE69534992T2 (de) Mutierendes enterotoxin als nichttoxisches orales adjuvans
DE68922394T2 (de) Rekombinante vakzine von flagellin.
DE69835031T2 (de) Neue anti-hiv immunogene (toxoide), herstellungsverfahren und verwendung zur behandlung und vorbeugung von aids
DE69636544T2 (de) Expression von lipoproteinen
DE69532588T2 (de) Verfahren zur verbesserung der immunogenität einer immunogenen zusammensetzung oder eines haptens und verwendung zur herstellung von impfstoffen
HU219673B (hu) Neisseria meningitidis elleni vakcina
EA002167B1 (ru) Вакцинная композиция против малярии
US6733760B1 (en) Recombinant toxin A/toxin B vaccine against Clostridium difficile
DE69533961T2 (de) Trägerprotein mit adjuvant aktivität, diese enthaltende immunogene komplexe, ihre herstellung, nukleotidsequenz und impfstoff
DE60038099T2 (de) Neisseria impfstoffzusammensetzungen und methoden
DE69101646T2 (de) Vakzine gegen Coccidiose.

Legal Events

Date Code Title Description
PL Patent ceased