CH689934A5

CH689934A5 - Insulin-Analogon-Formulierungen.

Info

Publication number: CH689934A5
Application number: CH01764/95A
Authority: CH
Inventors: Filippis Michael Rosario De
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 2000-02-15
Also published as: GB9512105D0; DK67695A; PT101723B; FR2721215A1; SE509295C2; FI118208B; JPH083064A; LU88627A1; NL1000565A1; CO4410204A1; NO952356D0; FI952932A0; SI9500199A; PE34496A1; KR960000923A; CA2151564A1; KR100386038B1; GR1002494B; JP3812962B2; AT408611B

Description


  
 



  Die vorliegende Erfindung betrifft monomere Analoga von Humaninsulin. Insbesonders betrifft die vorliegende Erfindung verschiedene parenterale Formulierungen, welche ein monomeres Insulin-Analogon, Zink, Protamin und ein Phenol-Derivat umfassen. Die Formulierungen ergeben verlängerte Wirkungsdauer. Ein Verfahren für die Herstellung von Insulin-Analogon-Protamin-Formulierungen wird ebenfalls beschrieben. 



  Seit der Einführung von Insulin in den 1920ern wurden fortlaufende Anstrengungen unternommen, um die Behandlung von Diabetes mellitus zu verbessern. Bedeutende Fortschritte in Bezug auf die Reinheit und die Verfügbarkeit von Insulin wurden mit der Entwicklung der rekombinanten DNA-Technologie gemacht. Es wurden auch verschiedene Formulierungen mit unterschiedlichen Zeitwirkungen entwickelt. Gegenwärtig gibt es im Wesentlichen 7 kommerziell erhältliche Insulinformulierungen: Reguläres Insulin, Insulin Semilente (intermediär wirksames Insulin), Globin-Insulin, Isophan-Insulin, Insulin-Zink-Suspension, Protamin-Zink-Insulin und Insulin Ultralente (langwirksames Depotinsulin) 



  Trotz der Vielfalt erhältlicher Formulierungen misslingt es der subkutanen Injektionstherapie immer noch, einem Patienten passende Regulierung und normalisierte glykämische Kontrolle bereitzustellen. Häufige Abweichungen von den normalen glykämischen Gehalten während dem Leben eines Patienten führen zu Hyper- oder Hypoglykämie und Langzeitkomplikationen einschliesslich Retinopathie, Neuropathie, Nephropathie und Mikro- und Makroangiopathie. 



  Um extreme glykämische Gehalte vermeiden zu helfen, führen Diabetiker häufig die Mehrfachinjektionstherapie durch, bei der Insulin mit jeder Mahlzeit verabreicht wird. Diese Therapie wurde jedoch noch nicht  optimiert. Das am schnellsten wirkende Insulin, welches kommerziell erhältlich ist, erreicht seinen Spitzenwert zu spät nach der Injektion und bleibt zu lange wirksam, um die Glykosegehalte optimal zu kontrollieren. Deshalb wurden wesentliche Anstrengungen der Entwicklung von Insulinformulierungen und Insulin-Analogon-Formulierungen geweiht, welche die Kinetik des subkutanen Absorptionsprozesses verändern. 



  Da alle kommerziellen pharmazeutischen Insulin-Formulierungen Insulin im selbstassoziierten Zustand und überwiegend in der hexameren Form enthalten, wird angenommen, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Absorption von Insulin aus dem subkutanen Injektionsdepot in den Blutstrom die Dissoziation des selbst-aggregierten Insulin-Hexamers ist. Kürzlich wurden monomere Insulin-Analoga entwickelt, welche weniger dazu neigen, zu höheren Molekulargewichtsformen zu assoziieren, als Humaninsulin. Dieser Mangel an Selbstassoziation ist durch Modifikationen in der Aminosäuresequenz von Humaninsulin bedingt, welche die Assoziation erniedrigen, indem sie primär die Dimer-Formation zerstören. Vergleiche z.B. Brems et al., Protein Engineering, 5:6, 527-533 (1992) und Brange et al., Nature, 333: 679-682 (1988).

   Dementsprechend besitzen monomere Insulinanaloga einen vergleichsweise schnelleren Wirkungsbeginn, während sie die biologische Aktivität von natürlichem Humaninsulin beibehalten. Diese Insulin-Analoga ermöglichen rasche Absorption, um die Injektionszeit und den Spitzenwert von Insulin näher zum postprandialen Glukoseausschlag zu bringen, der im Zusammenhang mit der Antwort auf eine Mahlzeit steht. 



  Die physikalischen Eigenschaften und Charakteristika von monomeren Analoga sind nicht analog zu Insulin. Beispielsweise offenbaren Brems et al. dass verschiedene monomere Analoga geringe oder keine Zink-induzierte Assoziation aufweisen. Jegliche Assoziation, die beobachtet wird, umfasst eine Vielzahl höherer Molekular gewichtsformen. Dies unterscheidet sich wesentlich von Insulin, welches in der Gegenwart von Zink fast ausschliesslich in einer geordneten, hexameren Konformation vorliegt. Brange et al. Diabetes Care 13: 923-954 (1990). Die Ermangelung der Assoziation trägt zu den Eigenschaften der Analoga bei, die die rasche Wirkung betreffen. Da die Analoga geringere Tendenz haben zu assoziieren, ist es sehr überraschend, dass ein monomeres Insulin-Analogon derart formuliert werden kann, dass es mittlere Wirkungsdauer ergibt. 



  Die vorliegende Erfindung stellt eine monomere Insulin-Analogon-Formulierung bereit, welche bei der Verwendung eine mittlere Wirkungsdauer ergibt. Die Erfindung stellt ferner einen neuen Protaminkristall mit Namen Insulin-Analogon-NPD bereit. Die vorliegende Erfindung stellt zudem eine Mischung aus Insulin-Analogon-NPD und löslichem monomerem Insulin-Analogon bereit. Diese Mischung ergibt einen raschen Wirkungsbeginn und eine mittlere Wirkungsdauer. Entsprechend besitzt die Mischung Vorteile sowohl gegenüber Insulin als auch gegenüber dem monomeren Analogon. Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren für die Herstellung einheitlicher Kristalle von Insulin-Analogon-NPD bereit. 



  Diese Erfindung stellt eine Insulin-Analogon-Protamin-Formulierung bereit, welche umfasst: Ein monomeres Insulin-Analogon, Protamin, Zink und ein Phenol-Derivat. 



  Die Erfindung stellt ferner einen kristallinen Insulin-Analogon-Protamin-Komplex bereit. Dieser Komplex wurde als Insulin-Analogon-NPD bezeichnet. Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin-NPD umfasst: ein Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin, etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100 Einheiten (U) Insulin-Analogon, etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gew.-% Zink und ein Phenol-Derivat. 



  Diese Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren für die Herstellung von Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin-NPD bereit, welches umfasst: 



  Zusammengeben einer wässrigen Lösung von Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin in einem hexameren Assoziationszustand und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von etwa 8 DEG bis etwa 22 DEG C;
 wobei die wässrige Lösung von etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gew.-% Zink, Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin und ein Phenol-Derivat bei einem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 umfasst;
 und wobei die Protaminlösung Protamin bei einem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 enthält, derart, dass die Endkonzentration an Protamin etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100 U Insulin-Analogon beträgt. 



  Die Erfindung stellt zudem Formulierungen bereit, welche sowohl schnell- als auch mittelwirksam sind. Die Formulierungen sind Mischungen von monomerem Insulin-Analogon und kristallinem Insulin-Analogon-NPD, wobei das Gewichtsverhältnis der zwei Komponenten etwa 1-99:99-1 beträgt. 



  Schliesslich betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche Insulin-AnalogonProtamin-Kristalle enthält, zur Behandlung von Diabetes mellitus. 
 
   Fig. 1 ist eine graphische Darstellung des Wirkungsprofils von Lys<B28>Pro<B29>-hI-NPD und Humaninsulin-NPH. Der Graph stellt  mu U/ml versus die Infusionszeit dar. Die Figur zeigt die Vorteile der vorliegenden Erfindung. 
   Fig. 2 stellt ein Bild von Asp<B28>-Humaninsulin-Protamin-Kristallen der vorliegenden Erfindung dar. Das Bild wurde bei 1000facher Vergrösserung mit Differentialphasenkontrast aufgenommen. 
   Fig. 3 stellt ein Bild von Lys<B28>-Pro<B29>-HI-Protamin-Kristallen der vorliegenden Erfindung dar. Das Bild wurde bei 1000facher Vergrösserung mit Differentialphasenkontrast aufgenommen. 
 



  Wie oben festgehalten, stellt die Erfindung verschiedene Formulierungen eines monomeren Insulin-Analogon bereit. Die Bezeichnung "monomeres Insulin- Analogon" oder "Insulin-Analogon", wie sie hierin verwendet wird, ist ein schnellwirkendes Insulin-Analogon, welches weniger zur Dimerisierung oder Selbstassoziation neigt. Das monomere Insulin-Analogon ist Humaninsulin, in dem Pro an Position B28 mit Asp, Lys, Leu, Val oder Ala substituiert ist und Lys an Position B29 Lysin oder Prolin ist; des(B28-B30); oder des(B27). Monomere Insulin-Analoga sind in Chance et al., EP Veröffentlichungsnummer 383 472 und Brange et al., EP Veröffentlichungsnummer 214 826 beschrieben, welche hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind. 



  Der Fachmann erkennt, dass andere Modifikationen am monomeren Insulin-Analogon möglich sind. Solche Modifikationen werden von der Fachwelt breit akzeptiert und schliessen Ersetzen des Histidinrests an Position B10 durch Asparaginsäure; Ersetzen des Phenylalaninrests an Position B1 durch Asparaginsäure; Ersetzen des Threoninrest an Position B30 durch Alanin; Ersetzen des Serinrests an Position B9 durch Asparaginsäure; Deletion (Löschung) der Aminosäure an Position B1 alleine oder in Verbindung mit einer Deletion an Position B2; und Deletion von Threonin an Position B30 ein. 



  Alle Aminosäureabkürzungen, die in dieser Offenbarung verwendet werden, sind jene, die durch das United States Patent & Trademark Office, wie in 37 C.F.R.  1.822(b) (2) dargelegt wurden. Speziell bevorzugte monomere Insulin-Analoga sind Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin (B28 ist Lys; B29 ist Pro) und Asp<B28>-Humaninsulin (B28 ist Asp). 



  Der Ausdruck "monomeres Insulin-Analogon-NPD" oder "lnsulin-Analogon-NPD" ist eine Suspension von kristallinem Insulin-Analogon und Protamin in einer Formulierung. NPD ist eine neutrale Protamin-Formulierung gemäss DeFelippis. Die Zusammensetzung wird in Übereinstimmung mit dem hierin beanspruchten und beschriebenen Verfahren hergestellt. Ein verwandter Ausdruck "Insulin-Analogon-NPD-Kristalle", "kristallines Insulin-Analogon- NPD", oder "Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin-Protamin-Kristalle" beziehen sich auf die Insulin-Analogon-Protamin-Kristalle in der NPD-Formulierung. 



  Der Ausdruck "Behandeln", wie er hierin verwendet wird, beschreibt die Behandlung und Pflege eines Patienten zum Zweck der Bekämpfung der Krankheit, des Zustands oder der Unpässlichkeit und schliesst die Verabreichung einer Verbindung der vorliegenden Erfindung ein, um das Auftreten der Symptome oder Komplikationen zu verhindern, die Symptome oder Komplikationen zu mildern oder die Krankheit, den Zustand oder die Unpässlichkeit zu eliminieren. 



  Der Begriff "lsotonizitäts-Mittel" bezieht sich auf ein Mittel, welches physiologisch verträglich ist und der Formulierung eine geeignete Tonizität verleiht, um den Nettofluss von Wasser durch die Zellmembrane zu verhindern. Verbindungen wie Glycerin werden üblicherweise für solche Zwecke bei bekannten Konzentrationen verwendet. Die Konzentration des Isotonizitäts-Mittels ist im Bereich, der dem Fachmann für Insulin-Formulierungen bekannt ist. 



  Der Begriff "Phenol-Derivat" bedeutet m-Cresol, Phenol oder vorzugsweise eine Mischung von m-Cresol und Phenol. 



  Der Begriff "auf Basis freier Base" gibt die Menge Protamin in der Formulierung an. Auf Basis freier Base korrigiert hinsichtlich des Wasser- und Salzgehalts der Protaminsalze, die kommerziell erhältlich sind und in parenteralen Formulierungen üblicherweise verwendet werden. Das bevorzugte Protamin, Protaminsulfat, besteht zu etwa 80% aus Protamin. 



  Der Begriff "IU" oder "U" bedeutet internationale Einheit. 



  Der Begriff "Isophanverhältnis" bedeutet die Gleichgewichtsmenge an Protamin, die notwendig ist, um mit dem Analogon zu komplexieren, wie gelehrt von Krayenbühl und Rosenberg, STENO MEMORIAL HOSPITAL REPORT  (KOPENHAGEN), 1:60 (1946). Das Isophanverhältnis wird mittels Titration auf eine Art bestimmt, die im Fachgebiet gut bekannt und in Krayenbühl, et al. beschrieben ist. 



  Die vorliegende Erfindung stellt eine Insulin-Analogon-Protamin-Formulierung bereit, welche umfasst: Ein monomeres Insulin-Analogon, Protamin, Zink und ein Phenol-Derivat. Die Konzentration von Protamin ist vorzugsweise etwa 0,2 bis etwa 1,5 mg Protamin auf 100 U Insulin-Analogon auf Basis freier Base. Speziell bevorzugt ist der Bereich von Protamin etwa 0,27 mg/100 U bis etwa 0,35 mg/100 U. Die Konzentration von Zink beträgt von etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gew.-%. Vorzugsweise beträgt die Konzentration von Zink etwa 0,7%. 



  Das Phenol-Derivat ist m-Cresol, Phenol oder eine Mischung aus m-Cresol und Phenol. Vorzugsweise ist das Phenol-Derivat m-Cresol und Phenol. Die Konzentration des Phenol-Derivats ist dem Fachmann bekannt. Die Konzentrationen müssen ausreichend sein, um Wirksamkeit als Konservierungsmittel aufrecht zu erhalten, d.h. mikrobielles Wachstum zu verzögern. Im Allgemeinen ist die Konzentration des Phenol-Derivats beispielsweise im Bereich von 1,0 mg/ml bis 6,0 mg/ml; vorzugsweise grösser als etwa 2,5 mg/ml. Die am meisten bevorzugte Konzentration ist etwa 3 mg/ml. Die Anwesenheit eines Phenol-Derivats ist kritisch, weil es zusätzlich dazu, dass es als Konservierungsmittel dient, Komplexierung des Analogons, Protamins und Zinks bewirkt. Es wird jedoch angenommen, dass nur ein Molekül von Phenol pro Molekül-Insulin-Analogon zur Kristallstruktur gebunden wird. 



  Vorzugsweise wird ein Isotonizitätsmittel zur Formulierung zugegeben. Das bevorzugte Isotonizitätsmittel ist Glycerin. Die Konzentration des Isotonizitätsmittels ist beispielsweise 14 mg/ml bis 18 mg/ml, vorzugsweise etwa 16 mg/ml. 



  Der pH der Formulierung kann mit einem physiologisch annehmbaren Puffer gepuffert werden, vorzugs weise mit einem Phosphatpuffer, wie Dinatriumhydrogenphosphat. Andere physiologisch annehmbare Puffer schliessen TRIS, Natriumacetat oder Natriumcitrat ein. Die Auswahl und Konzentration des Puffers ist dem Fachmann bekannt. Allgemein ist die Konzentration beispielsweise 1,5 mg/ml bis      5,0 mg/ml, vorzugsweise 3,8 mg/ml. 



  Die vorliegende Erfindung stellt ferner spezifische Bedingungen bereit, unter welchen das Insulin-Analogon-Protamin als stabiler Kristall existiert. Formulierungen dieser Kristalle sind definiert als Insulin-Analogon-NPD. Insulin-Analogon-NPD ist eine formulierte Suspension von Insulin-Analogon-NPD-Kristallen und ergibt bei Verwendung eine mittlere Wirkungsdauer. Das Wirkungsprofil von Insulin-Analogon-NPD ist im Hinblick auf den Mangel an Selbstassoziation des monomeren Analogons sehr überraschend. 



  Die Fähigkeit, mit einem monomeren Analogon eine intermediär wirksame Formulierung zu bilden, wird in Fig. 1 dargestellt. Fig. 1 offenbart ein Wirkungsprofil für Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin-NPD und Humaninsulin-NPH. Das NPD-Profil ist ähnlich dem von Insulin-NPH. Die Wirkungsdauer für die NPD-Formulierung und die Insulin-NPH-Formulierung sind etwa gleich. Die vorliegende Formulierung, jedoch, was äusserst bemerkenswert ist, steigt rascher an und bleibt während einer längeren Zeitspanne stabil als Insulin-NPH. Dieser Unterschied war im Hinblick auf das rasche Wirkungsprofil des monomeren Analogon äusserst unerwartet. 



  Eine speziell bevorzugte Insulin-Analogon-Protamin-Formulierung, Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin-NPD, umfasst: Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin, etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100 U Insulin-Analogon, etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gew.-% Zink und ein Phenol-Derivat. Die Protaminkonzentration ist vorzugsweise 0,3 mg/100 U auf Basis freier Base. 



  Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren für die Herstellung von Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin-Protamin-Kristallen bereit, welches umfasst: 



  Zusammengeben einer wässrigen Lösung von Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin in einem Hexamer-assoziierten Zustand und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von etwa 8 DEG  bis etwa 22 DEG C;
 wobei die wässrige Lösung von etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gew.-% Zink, Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin und ein Phenol-Derivat bei einem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 um-fasst und
 wobei die Protaminlösung Protamin bei einem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 umfasst, derart, dass die Endkonzentration an Protamin etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100 U Insulin-Analogon beträgt. 



  Am Zeitpunkt der Erfindung war es bekannt, dass monomere Insulin-Analoga weniger dazu neigen zu assoziieren und Hexamere zu bilden. Die Bedingungen, die notwendig sind, um monomere Insulin-Analoga dazu zu bringen, mit Protamin zu assoziieren, um Kristalle zu bilden, waren der Fachwelt zwar unbekannt. Frühere Studien betreffen Insulin. Die Lehren betreffend die Herstellung von Insulin-NPH (neutrale Protaminformulierung gemäss Hagedorn) oder Isophaninsulinformulierungen von Krayenbühl und Rosenberg, STENO MEMORIAL HOSPITAL REPORT (KOPENHAGEN), 1:60 (1946) sind im Hinblick auf die unterschiedlichen Eigenschaften der monomeren Insulin-Analoga nicht relevant. Tatsächlich ergibt das kommerzielle Verfahren für die Herstellung von Humulin-N<TM> (Insulin-NPH), ein Sauer-Neutral-Verfahren, kein kristallines Insulin-Analogon-NPD. 



  Äusserst bemerkenswerterweise wurde gefunden, dass die Parameter des gegenwärtigen Verfahrens - nämlich die Temperatur der Kristallisation und die Bildung eines Hexamer-Komplexes des Insulin-Analogons, Zinks und des Phenol-Derivats - kritische Beschränkungen der Bildung stabiler Lys<B28>Pro<B29>-hI-NPD-Kristalle sind. 



  Die Kristallisationstemperatur muss von etwa 8 DEG C bis etwa 22 DEG C betragen, vorzugsweise von 13 DEG C bis 17 DEG C. Wenn die Temperatur ausserhalb dieses Bereichs liegt, entsteht eine weitgehend amorphe Insulin-Analogon-Protamin-Formulierung. 



  Es ist ebenfalls wichtig, dass das Insulin-Analogon vor der Kristallisation in einen hexameren Zustand transformiert wird. Die Kristallisation führt zu einem amorphen Produkt, wenn das Verfahren mit einem monomeren Assoziationszustand ausgeführt wird. Kristalle bilden sich ohne Rühren in 5-36 Stunden. Kristalle guter Qualität werden im Allgemeinen in 24 Stunden gebildet. 



  Lösliches monomeres Insulin-Analogon wird zu einem hexameren Assoziationszustand dadurch komplexiert, dass festes monomeres Analogon in einem Verdünnungsmittel, welches das Phenol-Derivat enthält, suspendiert wird und Zugabe von Zink bis die Konzentration von etwa 0,35 Gew.-% bis etwa 0,9 Gew.-% beträgt. Zink wird vorzugsweise als ein Salz zugegeben. Repräsentative Beispiele von Zinksalzen schliessen Zinkacetat, Zinkbromid, Zinkchlorid, Zinkfluorid, Zinkiodid und Zinksulfat ein. Der Fachmann erkennt, dass auch viele andere Zinksalze im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Vorzugsweise wird Zinkacetat oder Zinkchlorid verwendet. 



  Auflösen des Insulin-Analogons im Verdünnungsmittel kann unterstützt werden durch das, was allgemein bekannt ist als saures Auflösen. Beim sauren Auflösen wird der pH mit einer physiologisch annehmbaren Säure, vorzugsweise HCl, auf etwa 3,0 bis 3,5 abgesenkt, um die Löslichkeit des Analogons zu erhöhen. Andere physiologisch annehmbare Säuren schliessen Essigsäure, Zitronensäure und Phosphorsäure ein. Der pH wird dann mit einer physiologisch annehmbaren Base, vorzugsweise NaOH, für die Kristallisation auf etwa 7,1 bis 7,6 eingestellt. Andere physiologisch annehmbare Basen schliessen KOH und Ammoniumhydroxid ein. 



  Äusserst wesentlich ist, dass das Verfahren für die Herstellung von Lys<B28>Pro<B29>-hI-NPD-Komplex empfindlich gegenüber der NaCl-Konzentration ist. Wenn die Konzentration etwa 4 mg/ml überschreitet, werden die Insulin-Analogon-NPD-Kristalle mit amorphem Produkt gemischt. Dementsprechend ist es bevorzugt, dass das monomere Analogon bei neutralem pH gelöst wird, um die Bildung von Salzionen zu verhindern. Alternativ kann das Analogon im Verdünnungsmittel vor der Zugabe des Puffers bei saurem pH gelöst werden. Dies vermindert die Konzentration an Salzen, die durch die pH-Einstellung erzeugt werden. Die Reihenfolge, in der die Bestandteile zugegeben werden, ist jedoch für die Bildung des Hexameren oder der amorphen Formulierung nicht kritisch. 



  Wie zuvor offenbart, kann ein Isotonizitätsmittel zur Formulierung der vorliegenden Erfindung zugegeben werden. Die Zugabe des Isotonizitätsmittels kann zur Analogon-Lösung, zur Protamin-Lösung oder zur Insulin-Analogon-NPD-Endformulierung erfolgen. Auf ähnliche Art kann die Zugabe des physiologisch annehmbaren Puffers zur Analogon-Lösung, zur Protamin-Lösung oder zur Insulin-Analogon-NPD-Endformulierung erfolgen. Es wird jedoch bevorzugt, dass sowohl die Analogon-Lösung als auch die Protamin-Lösung das Isotonizitätsmittel und den Puffer enthalten, bevor die wässrige Lösung und das Protamin zusammengefügt werden. Wegen des NaCl-Effekts auf das Verfahren für die Herstellung kristallinen Insulin-Analogon-NPD's, ist Glycerin das bevorzugte Isotonizitätsmittel. 



  Die Erfindung stellt ferner Insulin-Analogon-Formulierungen bereit, welche Mischungen von Insulin-Analogon-NPD als kristallinen Feststoff und lösliches Insulin-Analogon umfassen. Diese Mischungen werden in einem Bereich von etwa 1:99 bis 99:1, bezogen auf das Volumen suspendierten Insulin-Analogon-NPD's zu löslichem Insulin-Analogon hergestellt. Das lösliche Insulin-Analogon ist ein monomeres Insulin-Analogon, gelöst in einem wässrigen Verdünnungsmittel, umfassend: Zink, ein Phenol- Derivat, ein Isotonizitäts-Mittel und Puffer. Die für das Verdünnungsmittel beschriebenen Konzentrationen sind die gleichen, die hier zuvor offenbart wurden. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis von Insulin-Analogon-NPD zu löslichem Insulin-Analogon 25:75 bis 75:25 und speziell bevorzugt 50:50. Die Mischungen können durch Mischen der einzelnen Bestandteile leicht hergestellt werden. 



  Die gemischten Formulierungen der vorliegenden Erfindung sind wegen der Kombination eines raschen Wirkungsbeginns und verlängerter Dauer für die Behandlung von Diabetes mellitus besonders geeignet. Diese Mischungen erlauben "Feinkontrolle" durch Variation der Menge jedes einzelnen Bestandteils, basierend auf dem Bedürfnis, der Ernährung und der körperlichen Aktivität des Patienten. Die Mischung von suspendiertem Insulin-Analogon-NPD und löslichem Insulin-Analogon sind auch vorteilhaft, weil sie homogen sind, d.h. jeder Gleichgewichtsaustausch zwischen den suspendierten Kristallen und löslichem Insulin-Analogon ist offenkundig. 



  Die Insulin-Analoga der vorliegenden Erfindung können mittels irgendeiner Vielzahl anerkannter Peptid-Synthesetechniken einschliesslich klassischer (Lösungs-)Verfahren, Festphasenverfahren, halbsynthetischer Verfahren und neuerer rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise offenbaren Chance et al, EP Veröffentlichungsnummer 383 472 und Brange et al., EP Veröffentlichungsnummer 214 826 die Herstellung verschiedener monomerer Analoga. 



  Die folgenden Beispiele werden nur angeführt, um die Herstellung der Insulin-Analoga und die Erfindung weiter zu veranschaulichen. Der Umfang der Erfindung soll nicht als bloss aus den folgenden Beispielen bestehend erachtet werden. 


 Beispiel 1
 Herstellung von Lys<B28>Pro<B29>-hI-NPD 
 



  Eine Lösung von Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin (Lys<B28>Pro<B29>-hI) mit einer Konzentration von 200 IU/ml (U 200) wurde durch Lösen von zinkhaltigen Kristallen von Lys<B28>Pro<B29>-hI in einem Konservierungsmittel/Puffer-System hergestellt, welches enthielt: 1,6 mg/ml m-Cresol, 0,73 mg/ml Phenol (entsprechend 0,65 mg/ml Phenol berechnet als 89%), 16 mg/ml Glycerin und 3,78 mg/ml Dinatriumhydrogenphosphatpuffer. Der endogene Zinkgehalt in den Kristallen wurde durch Zugabe eines angemessenen Volumens einer sauren ZnO-Lösung (10 mg/ml) ergänzt, um eine Endkonzentration von 0,025 mg/100 IU (0,7%) zu erzielen. Auflösen von Lys<B28>Pro<B29>-hI wurde bei Umgebungstemperatur erzielt, indem der pH mit   mu l-Volumina an 5 M HCl auf etwa 3 abgesenkt wurde. Nachdem die Lösung klar geworden war, wurde der pH mit  mu l-Volumina an 5 M NaOH wieder auf 7,5 eingestellt. 



  Eine Protaminlösung wurde durch Auflösen einer ausreichenden Menge festen Protaminsulfats in der Konservierungsmittel/Puffer-Lösung, um eine Endkonzentration von 0,6 mg/100 IU, berechnet auf Basis freier Base, zu erzielen, herstellt. Der pH der Lösung wurde auf 7,5 eingestellt und bei 15 DEG C equilibriert. 



  Beide Lösungen wurden mit Injektions-Wasser auf die Endkonzentration verdünnt und filtriert. 5 ml Teilmengen der Lys<B28>Pro<B29>-hI-Untereinheit wurden in getrennte saubere Glasviolen gefüllt und die Proben wurden in einem Wasserbad bei 15 DEG C inkubiert. Nach angemessener Equilibrierungszeit (15 Minuten) wurde durch die schnelle Zugabe von 5 ml der Protaminlösung zu den Lys<B28>Pro<B29>-hI-Proben die Fällung eingeleitet. Die Kristallisation erfolgte während etwa 24 Stunden bei 15 DEG C. 


 Beispiel 2
 Herstellung von Lys<B28>Pro<B29>-hI-NPD 
 



  Das Verfahren ist identisch mit demjenigen von Beispiel 1, ausser dass die Auflösung von Lys<B28>Pro<B29>-hI bei neutralem pH stattfindet. Das Verfahren wurde derart ausgeführt, dass der End-pH 7,4 war. 


 Beispiel 3
 Herstellung von Lys<B28>Pro<B29>-hI-NPD 
 



  Insulin-Analogon-NPD wurde auf eine Weise analog zu Beispiel 1 hergestellt, aber die saure Auflösung von Lys<B28>Pro<B29>-hI wurde in Anwesenheit aller Zusatzstoffe ausser dem Dinatriumhydrogenphosphatpuffer ausgeführt. Festes Dinatriumhydrogenphosphat wurde zugegeben, nachdem die Insulin-Analogon-Lösung wieder auf pH 7,4 gebracht worden war. Die Zugabe von Dinatriumhydrogenphosphat machte die Lösung klar. 


 Beispiel 4
 Herstellung von Insulin-Analogon-NPD-Mischungsformulierungen 
 



  Mischungen von mittel- und schnellwirkenden Lys<B28>Pro<B29>-hI-Formulierungen werden wie folgt hergestellt. Die mittelwirksame Suspensionszubereitung wird mittels der in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt und dient als mittelwirksamer Teil der Mischung. 



  Eine getrennte Lösung von Lys<B28>Pro<B29>-hI (100 IU) wird durch Auflösen zinkhaltiger Lys<B28>Pro<B29>-hI-Kristalle bei  Umgebungstemperatur im Verdünnungsmittel, welches in Beispiel 1 beschrieben ist, hergestellt. Der endogene Zinkgehalt von Lys<B28>Pro<B29>-hI in dieser Lösung wird durch Zugabe von saurer ZnO-Lösung ergänzt, bis er dem Gehalt im Suspensionsteil entspricht (d.h. 0,025 mg/100 IU (0,7%). Injektionswasser wird verwendet, um die Lösung auf die Endkonzentration zu verdünnen, nachdem der pH unter Verwendung 10%iger Lösungen von HCl und/oder NaOH auf 7,4 eingestellt worden ist. Diese Lösung ist der schnellwirkende Teil der Mischungen. Die Endmischung wird durch Zusammenbringen angemessener Volumina der mittel- und raschwirkenden Teile hergestellt, um das gewünschte Verhältnis zu erzielen.

   Eine 50:50-Mischung wird durch Zusammengeben eines Volumenteils des mittelwirksamen Teils und eines Volumenteils des schnellwirksamen Teils hergestellt. 


 Beispiel 5
 Wirkung der Ionenstärke auf die Kristallisation von Lys<B28> Pro<B29>-hI-Protamin 
 



  Die Wirkung der lonenstärke auf die Kristallisation wurde durch Zugabe von NaCl zum Lys<B28>Pro<B29>-hI-Teil vor dem Mischen mit Protamin ermittelt. Natriumchlorid wurde derart zugegeben, dass die Gesamtkonzentration 20, 30 und 40 mM (1,2; 1,8 und 2,3 mg/ml) betrug. Die Volumen-Teilchengrösse zeigte bei zunehmender NaCl-Konzentration multimodales Verhalten (zusätzliche Peaks bei kleinen Teilchengrössen). Die mittlere Volumen-Teilchengrösse nahm mit zunehmender Natriumchloridkonzentration ab, was eine Zunahme amorphen Materials anzeigt. Die Resultate der Teilchengrösse versus die NaCl-Konzentration sind wie folgt: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Head Col 1: [NaCl] 
<tb>Head Col 2: Mittlere Volumen-Teilchengrösse ( mu m)
<tb><SEP>13 mM<SEP>3,9
<tb><SEP>20 mM<CEL AL=L>3,5
<tb><CEL AL=L>30 mM<SEP>3,3
<tb><SEP>40 mM<SEP>3,2 
<tb></TABLE> 



  Die Mikroskopanalyse zeigte, dass alle Proben eine Mischung aus amorphem und kristallinem Material enthielten. Die Probe mit 40 mM NaCl enthält vor allem amorphes Material und sehr wenige Kristalle. 


 Beispiel 6
 Vergleichende Dynamikstudien für Lys<B28>Pro<B29>-hI-NPD und Humaninsulin-NPH 
 



  Diese Studie wurde an einem Hund ausgeführt, der bei Bewusstsein war. Vor Beginn der Studie wurden drei Grundproben genommen. Eine Somatostatin-Infusion (0,3  mu g/kg-Min. wurde eingeleitet. Nach einem 10 Minuten-Intervall wurde eine subkutane Injektion von entweder NPD oder NPH verabreicht. Häufiges Aufzeigen der Plasmaglukose wurde eingeleitet und eine variable Glukose (20%)-Infusion wurde derart gegeben, dass eine nahezu normale Glykämie beibehalten wurde. Fortlaufend wurden Proben genommen und auf immunreaktives Insulin (Linco-Antikörper) und Glykose analysiert. Die Resultate sind in Fig. 1 dargestellt. 


 Beispiel 7
 Herstellung von Asp(B28)-Analogon-Protamin-Kristallen 
 



  Eine Untereinheit von Asp(B28)-hI bei 200 IU/ml (U 200) Konzentration wurde durch Auflösen lyophilisierter Masse (95% Reinheit) in einem Konservierungsmittel/Puffer-System aufgelöst, welches enthielt: 1,6 mg/ml m-Cresol, 0,73 mg/ml Phenol (Äquivalent zu 0,65 mg/ml Phenol berechnet als 89%),         16 mg/ml Glycerin und 3,78 mg/ml Dinatriumhydrogenphosphat. Unter Verwendung eines angemessenen Volumens einer sauren ZnO-Lösung (10 mg/ml) wurde dem System Zink zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,025 mg/100 IU zu erhalten. Die Auflösung von Asp(B28) wurde bei Umgebungstemperatur und bei neutralem pH erzielt. Der End-pH dieses Teils war 7,4. 

 

  Eine Kristallisation wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, ausgeführt. Protamin-Endkonzentrationen von 0,3 mg/100 U; 0,35 mg/100 U und 0,4 mg/100 U wurden untersucht. Diese Protaminkonzentrationen entsprechen 2,9%, 9,3% resp. 10,5% auf einer Gewicht/Gewicht-Basis. Die Inkubationstemperaturen umfassten 5 DEG C (nur 0,3 mg/100 U), 15 DEG C und 22 DEG C. Nach 24 Stunden bei diesen Temperaturen wurden Proben auf Kristallbildung untersucht. Mittels Mikroskop ermittelte Resultate veranschaulichen eine Mischung von wenigen Kristallen und amorphem Produkt. 


 Beispiel 8
 Herstellung von Asp(B28)-Analogon-Protamin-Kristallen. 
 



  Die Kristallisation von Asp(B28)-Protamin wurde wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt, mit der  Ausnahme, dass das Protein zuerst in einem pufferfreien Verdünnungsmittel aufgelöst wurde. Die Zugabe des sauren Zinkoxid-Vorrats war ausreichend, um die Probe auf pH 2,0 bis 2,5 anzusäuern. Nachdem die Lösung klar geworden war, wurde der pH mit  mu l-Volumina 5 N NaOH wieder auf etwa pH 7 eingestellt. Natriumphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, wurde unter Verwendung einer konzentrierten Vorratslösung von 47,25 mg/ml zugegeben, um eine Endkonzentration von 3,78 mg/ml zu erzielen. Die Untereinheit wurde unter Verwendung von  mu l-Mengen HCl auf pH 7,4 eingestellt. 



  Kristallisation wurde durch Zusammengeben der Asp(B28)- und Protamin-Teile, wie in vorangehenden Beispielen beschrieben, eingeleitet. Protamin-Endkonzentrationen von 0,3 mg/100 U, 0,35 mg/100 U und 0,4 mg/100 U wurden untersucht. Die Inkubationstemperaturen umfassten 15 DEG C und 22 DEG C. Nach 24 Stunden bei diesen Temperaturen wurden Proben auf Kristallbildung untersucht. Die mittels Mikroskop ermittelten Resultate zeigen eine Mischung von Kristallen und amorphem Material. 


 Beispiel 9
 Herstellung von Leu(B28)Pro(B29)-Analogon-Protamin-Kristallen 
 



  Eine Leu(B28)Pro(B29)-Untereinheit (93% Reinheit) mit 200 IU/ml (U 200)-Konzentration wurde, wie in Beispiel 8 beschrieben, unter Verwendung von saurer Auflösung des Massematerials, gefolgt durch pH-Einstellung mit SN NaOH auf pH 7,4, hergestellt. Kristallisation erfolgte wie oben beschrieben. Protamin-Endkonzentrationen von 0,3mg/100 U; 0,35 mg/100 U und 0,4 mg/100 U wurden untersucht. Inkubationstemperaturen schlossen 5 DEG C, 15 DEG C und 22 DEG C ein. Nach 24 Stunden bei diesen Temperatu ren enthielten alle Proben einige Kristalle, waren aber primär amorph, wie mittels Mikroskopie ermittelt wurde. 


 Beispiel 10
 Des (B27)hI-Protamin-Kristalle 
 



  Eine Untereinheit DesThr(B27) (97,37% Reinheit) mit 200 IU/ml (U 200)-Konzentration wurde, wie in Beispiel 8 beschrieben, hergestellt, unter Verwendung von saurer Auflösung des Massematerials, gefolgt durch pH-Einstellung mit 5N NaOH auf pH 7,4. Eine Kristallisation wurde wie in Beispiel 8 beschrieben ausgeführt. Protamin-Endkonzentrationen von 0,3 mg/100 U; 0,35 mg/100 U und             0,4 mg/100 U wurden untersucht. Inkubationstemperaturen schlossen 15 DEG C und 22 DEG C ein. Nach 24 Stunden bei diesen Temperaturen waren alle Proben vorwiegend amorph, wie mittels Mikroskopie bestimmt wurde. Qualitativ wurden Kristalle beobachtet. 


 Beispiel 11
 Des (B28-B30)hI-Protamin 
 



  Eine Untereinheit Des(28-30) (96,3% Reinheit) mit 200 IU/ml (U 200)-Konzentration wurde, wie im Beispiel 8 beschrieben, hergestellt, unter Verwendung von saurer Auflösung des Massematerials, gefolgt durch pH-Einstellung mit SN NaOH auf pH 7,4. Eine Kristallisation wurde angestrebt unter Verwendung des Neutral/Neutral-Kombinations-Verfahrens der Protein- und Protamin-Teile, wie oben beschrieben. Protamin-Endkonzentrationen von 0,3 mg/100 U; 0,35 mg/100 U und 0,4 mg/100 U wurden untersucht. Inkubationstemperaturen schlossen 15 DEG C und 22 DEG C ein. Nach 24 Stunden bei diesen Temperaturen waren alle  Proben vorwiegend amorph, wie mittels Mikroskopie bestimmt wurde. Qualitativ wurden Kristalle beobachtet. Die Kristalle waren gut definiert. 


 Beispiel 12
 Asp(B28)-Analogon-Protamin 
 



  Eine Insulin-Asp(B28)-Humaninsulin-Analogon-Lösung wurde durch Auflösen von 16,6 mg des Proteins in 1 ml Lösung enthaltend 3,2 mg/ml m-Cresol 1,3 mg/ml Phenol und 32 mg/ml Glycerin hergestellt. Eine 14,4  mu l-Teilmenge einer sauren Zinkvorratslösung (10 mg/ml Zn<2><+>, hergestellt durch Auflösen von 0,311 g Zinkoxid in 5 ml 10%iger HCl und Verdünnen auf 25 ml mit Wasser) wurde zugegeben. Der pH der Lösung war 2,3, was die vollständige Auflösung des Proteins erlaubte. Eine 10  mu l-Teilmenge 10%iger NaOH wurde zugegeben, um den pH auf 7,06 einzustellen. Der Lösung wurden 100  mu l 0,28 M Dinatriumhydrogenphosphat, pH 7,0, zugegeben, was den Lösungs-pH auf 7,27 erhöhte. Eine 870  mu l-Teilmenge Injektionswasser wurde der Lösung zugegeben.

   Zusätzliche 10%ige HCl (1  mu l) und NaOH (0,7  mu l) wurden zugegeben und das Endvolumen der Lösung wurde mit Injektionswasser auf 2 ml gebracht, was einen End-pH von 7,26 ergab. Die Lösung wurde vor Verwendung durch ein 0,2  mu m Supor< TM > Acrodisc< TM > 13 (Gelman Sciences)-Filter filtriert. 



  Protamin-Vorratslösungen wurden durch Auflösen von Protaminsulfat in einer Lösung enthaltend    1,6 mg/ml m-Cresol, 0,65 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin und 14 mM Dinatriumhydrogenphosphat hergestellt. Der End-pH der Lösung wurde auf 7,3 eingestellt. Die Protamin-Endkonzentration war    0,60 mg/100 U auf Basis freier Base. Beide Lösungen wurden vor Verwendung durch 0,22  mu m (Millipore Sterivex<TM>-GV)-Filtereinheiten filtriert. 



  Kristallisation wurde erhalten durch Mischen der Asp(B28)-Humaninsulinlösung in einem 1:1-Verhältnis bei kontrollierter Temperatur, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Die Endmischungsbedingungen waren 3,94 mg/ml Asp(B28)-Humaninsulin, 0,0359 mg/ml (0,9%) Zinkionen, 1,6 mg/ml m-Cresol, 0,65 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin, 14 mM Dinatriumhydrogenphosphat und 0,30 mg/100 U Protamin bei pH 7,3. Insbesonders 50-200  mu l Portionen der Asp<B28>-Humaninsulinlösung wurden zu Glasviolen transferiert und die Proben wurden auf 4, 8, 15 oder 23 DEG C (Umgebungstemperatur) equilibriert. Anteile beider Protaminlösungen wurden ebenfalls bei diesen Temperaturen equilibriert. Nach 15-20 Minuten wurde ein äquivalentes Volumen jeder Protaminlösung in die Asp(B28)-Humaninsulin-Proben pipettiert.

   Die Mischung wurde leicht gewirbelt, bedeckt und dann bei kontrollierter Temperatur während der Kristallisationszeit ruhen gelassen. Alle Proben wurden mittels Mikroskopie nach 24 Stunden geprüft und als vorwiegend amorph befunden. Nach 48 Stunden zeigten die Proben, die 0,30 mg/100 U Protamin enthielten und bei 15 DEG C inkubiert worden waren, grosse Mengen nadelähnlicher Kristalle und etwas amorphes Material. 


 Beispiel 13 
 



  Eine Insulin Asp(B28)-Humaninsulin-Analogon-Lösung wurde durch Auflösen von 10,62 mg des Proteins in 0,71 ml einer Lösung, die 3,2 mg/ml m-Cresol, 1,3 mg/ml Phenol und 32 mg/ml Glycerin enthält, hergestellt. Eine 10,2  mu l Teilmenge einer sauren Zinkvorratslösung (10 mg/ml Zn<2><+>, hergestellt durch Auflösen von 0,311 g Zinkoxid in 5 ml 10%iger HCl und Verdünnen auf 25 ml mit Wasser) wurde zugegeben. Der Lösungs-pH war 2,3, was vollständige Auflösung des Proteins erlaubte. Eine 6,5  mu l Teilmenge 10%iger NaOH wurde zugegeben, um den pH auf 7,00 einzustellen. Der Lösung wurden   71  mu I 0,28 M Dinatriumhydro genphosphat, pH 7,0, zugegeben, was den pH der Lösung auf 7,26 erhöhte. Eine 620  mu l Teilmenge Injektionswasser wurde der Lösung zugegeben.

   Zusätzliche 10%ige HCl   (0,2  mu l) und NaCH (0,6  mu l) wurden zugegeben und das Endvolumen der Lösung wurde mit Injektionswasser auf 1,42 ml gebracht, was zu einem End-pH von 7,42 führte. Die Lösung wurde vor der Verwendung durch ein 0,2  mu m Supor< TM > Acrodisc< TM > 13 (Gelman Sciences)-Filter filtriert. 



  Eine Protamin-Vorratslösung wurde durch Auflösen von Protaminsulfat in einer Lösung enthaltend  1,6 mg/ml m-Cresol, 0,65 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin und 14 mM Dinatriumhydrogenphosphat hergestellt. Der End-pH der Lösung wurde auf 7,4 eingestellt und die Protamin-Endkonzentration war 0,60 mg/100 U auf Basis freier Base. Die Lösung wurde vor Verwendung durch eine 0,22  mu m (Millipore Sterivex<TM>-GV)-Filtereinheit filtriert. 



  Kristallisation wurde durch Mischen der Asp(B28)-Humaninsulin-Lösung in einem 1:1-Verhältnis mit der Protaminlösung, wie in Beispiel 12 beschrieben, bei kontrollierten Temperaturen von 13 DEG C, 15 DEG C, 17 DEG C und 23 DEG C erhalten. Die Resultate sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Endmischungs-Bedingungen waren 3,74 mg/ml Asp(B28)-Humaninsulin, 0,0359 mg/ml (0,9%) Zinkionen, 1,6 mg/ml m-Cresol,        0,65 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin, 14 mM Dinatriumhydrogenphosphat und 0,30 mg/100 U Protamin bei pH 7,4. Vier verschiedene Kristallisationstemperaturen wurden beurteilt. Eine 1 ml-Teilmenge des bei 15 DEG C equilibrierten Asp<B28>-Humaninsulins wurde mit 1 ml der Protaminlösung, die auf die gleiche Temperatur eingestellt war, gemischt. Nach leichtem Wirbeln wurde die Zubereitung bei 15 DEG C ruhen gelassen.

   Eine andere Probe wurde durch Equilibrieren von 100  mu l der Asp(B28)-Humaninsulin-Lösung auf 13 DEG C und anschliessendes Zusammengeben mit 100  mu l der Protaminlösung, die auf die gleiche Temperatur eingestellt war, hergestellt. Die Endmischung wurde bei 13 DEG C inkubiert. Die dritte Probe wurde auf ähnliche Weise hergestellt, mit der Ausnahme, dass die beiden 100  mu l Teilmengen equi libriert, zusammengegeben und dann bei 17 DEG C inkubiert wurden. Die Endlösung wurde durch Mischen von 80  mu l Teilmengen der Asp(B28)-Humaninsulin- und Protamin-Lösungen, die bei Umgebungstemperatur equilibriert worden waren, hergestellt und bei Umgebungstemperatur (23 DEG C) inkubiert.

   Alle Proben wurden mittels Mikroskopie nach 24 Stunden und anderen Zeitintervallen, die hier in der Folge in Tabelle 1 aufgelistet sind, untersucht. 
<tb><TABLE> Columns=5 Tabelle 1
 Kristallisationbedingungen<a> und Resultate der Mikroskopie 
<tb>Head Col 1: [Asp<B28>]
 (mg/ml) 
<tb>Head Col 2: [Protamin] 
 (mg/100 U) 
<tb>Head Col 3: Temperatur 
 ( DEG C) 
<tb>Head Col 4: Zeit 
 (Std.) 
<tb>Head Col 5:

   Mikroskopieresultat<b>
<tb><SEP>3,94<SEP>0,30<SEP>15<SEP>24<SEP>amorph
<tb><CEL CB=4 AL=L>48<SEP>kristallin
<tb><SEP>72<SEP>kristallin
<tb><SEP>96<SEP>kristallin
<tb><CEL CB=4 AL=L>120<SEP>kristallin
<tb><SEP>3,94<SEP>0,30<SEP>23<SEP>24<SEP>amorph
<tb><SEP>48<CEL AL=L>amorph
<tb><SEP>72<SEP>amorph
<tb><SEP>3,74<SEP>0,30<SEP>13<SEP>24<CEL AL=L>amorph
<tb><CEL CB=4 AL=L>40<SEP>kristallin/amorph
<tb><SEP>48<SEP>kristallin/amorph
<tb><SEP>69<CEL AL=L>kristallin/amorph
<tb><SEP>3,74<SEP>0,30<SEP>15<SEP>24<SEP>amorph/kristallin
<tb><CEL CB=4 AL=L>40<CEL AL=L>kristallin
<tb><SEP>48<SEP>kristallin
<tb><SEP>69<SEP>kristallin
<tb><SEP>3,74<CEL AL=L>0,30<SEP>17<SEP>24<SEP>amorph/wenige Kristalle
<tb><SEP>40<SEP>kristallin/amorph
<tb><CEL CB=4 AL=L>48<SEP>kristallin/amorph
<tb><SEP>69<SEP>kristallin/amorph
<tb><SEP>3,74<SEP>0,

  30<CEL AL=L>23<CEL AL=L>24<SEP>amorph
<tb><SEP>40<SEP>amorph/wenige Kristalle
<tb><SEP>48<SEP>amorph/wenige Kristalle
<tb><SEP>69<SEP>amorph/wenige Kristalle 
 <a> Alle Lösungen enthielten auch 0,9% Zinkionen, 1,6 mg/ml m-Cresol, 0,65 mg/ml Phenol, 16 mg/ml Glycerin und 14 mM Dinatriumhydrogenphosphat, pH 7,4.
 <b> Das Kristallisationsergebnis wurde mittels Mikroskopie bei 600facher (Nikon Optiphot 66 Mikroskop) oder 1000facher (Zeiss Axioplan-Mikroskop mit Differentialgrenzflächenkontrast)-Vergrösserung beurteilt. Beide Mikroskope waren mit Fotografiezubehör ausgerüstet.
  
<tb></TABLE> 



  Kristalle, die in Übereinstimmung mit den obigen Beispielen hergestellt wurden, sind in den Fig. 2 und 3 veranschaulicht.

Claims

1. Ein Insulin-Analogon-Protamin-Komplex, welcher umfasst: Humaninsulin worin Pro an Position B28 substituiert ist mit Asp, Lys, Leu, Val oder Ala und Lys an Position B29 Lys oder Pro ist, des(B28-B30)-Humaninsulin oder des(B27)-Humaninsulin; Protamin; Zink und ein Phenol-Derivat, vorausgesetzt, dass, wenn das Insulin Asp<B28>-Humaninsulin ist, die Konzentration von Protamin weniger als 10 Gew.-% beträgt.

2. Ein Insulin-Analogon-Protamin-Komplex gemäss Anspruch 1, welcher umfasst: Humaninsulin worin Pro an Position B28 substituiert ist mit Asp, Lys, Leu, Val oder Ala und Lys an Position B29 Lys oder Pro ist, des(B28-B30)-Humaninsulin oder des(B27)-Humaninsulin; Protamin; Zink und ein Phenol-Derivat, mit der Massgabe, dass das Insulin nicht Asp<B28>-Humaninsulin ist.

3.

Der Komplex gemäss einem der Ansprüche 1, oder 2, welcher umfasst: Humaninsulin worin Pro in Position B28 mit Lys substituiert ist und Lys in Position B29 mit Pro substituiert ist; Protamin; Zink und ein Phenol-Derivat.

4. Der Komplex gemäss Anspruch 3, welcher Lys<28B>Pro-<B29>Humaninsulin, etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100 IU Insulin-Analogon, etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gew.-% Zink und ein Phenol-Derivat ist.

5. Der Komplex gemäss Anspruch 1, welcher Asp<B28>-Humaninsulin, etwa 0,27 bis etwa 0,35 mg Protamin/100 IU Insulin-Analogon, etwa 0,35 bis 0,9 Gew.-% Zink und ein Phenol-Derivat ist.

6. Der Komplex gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, in welchem der Komplex kristallin ist.

7. Eine parenterale pharmazeutische Insulin-Analogon-Protamin-Formulierung, welche den Komplex gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält oder daraus besteht.

8.

Die Formulierung gemäss Anspruch 7, welche zudem etwa 0,2 bis 1,5 mg Protamin/100 IU Insulin-Analogon, etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gew.-% Zink und ein Phenol-Derivat enthält.

9. Die Formulierung gemäss Anspruch 8, welche umfasst: Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin, etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100 IU Insulin-Analogon, etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gew.-% Zink und ein Phenol-Derivat.

10. Die Formulierung gemäss Anspruch 8, welche umfasst: Asp<B28>-Humaninsulin, etwa 0,27 bis etwa 0,35 mg Protamin/100 IU Insulin-Analogon, etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gew.-% Zink und ein Phenol-Derivat.

11.

Eine parenterale pharmazeutische Formulierung gemäss einem der Ansprüche 7 bis 9, welche umfasst: Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin, etwa 0,3 mg Protamin/100 IU Insulin-Analogon, etwa 0,7 Gew.-% Zink, etwa 1,7 mg/ml m-Cresol, etwa 0,7 mg/ml Phenol, etwa 16 mg/ml Glycerin und etwa 3,78 mg/ml Dinatriumhydrogenphosphat.

12. Die Formulierung gemäss einem der Ansprüche 7 bis 11, welche zusätzlich lösliches Insulin-Analogon enthält.

13.

Eine parenterale pharmazeutische Formulierung gemäss Anspruch 12, welche umfasst: Eine Mischung von löslichem Insulin-Analogon und Insulin-Analogon-Protaminkristallen, wobei das Gewichtsverhältnis der beiden Komponenten etwa 1:99 bis 99:1 Insulin-Analogon zu Insulin-Analogon-Protamin-Kristallen beträgt, wobei das Insulin-Analogon Humaninsulin ist, in dem Pro an Position B28 durch Asp, Lys, Leu, Val oder Ala substituiert ist und Lys an Position B29 Lys oder Pro ist; des(B28-B30)-Humaninsulin oder des(B27)-Humaninsulin, vorausgesetzt, dass, wenn das Insulin Asp<B28>-Humaninsulin ist, die Konzentration des Protamins weniger als 10 Gew.-% beträgt.

14.

Eine parenterale pharmazeutische Formulierung gemäss Anspruch 13, welche umfasst: Eine Mischung von löslichem Insulin-Analogon und Insulin-Analogon-Protaminkristallen, wobei das Gewichtsverhältnis der beiden Komponenten etwa 1:99 bis 99:1 Insulin-Analogon zu Insulin-Analogon-Protamin-Kristallen beträgt, wobei das Insulin-Analogon Humaninsulin ist, in dem Pro an Position B28 mit Lys substituiert ist und Lys an Position B29 mit Pro substituiert ist.

15. Die Formulierung gemäss einem der Ansprüche 13 oder 14, in der das Gewichtsverhältnis der beiden Komponenten etwa 75:25 bis 25:75 beträgt.

16. Die Formulierung gemäss Anspruch 15, welche umfasst: Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin und Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin-Protamin-Kristalle.

17.

Die parenterale pharmazeutische Formulierung gemäss Anspruch 16, in der das Gewichtsverhältnis der beiden Komponenten 50:50, 75:25 oder 25:75 beträgt.

18. Die Formulierung gemäss einem der Ansprüche 7 bis 17 als Mittel zur Behandlung von Diabetes mellitus.

19. Ein Verfahren für die Herstellung des Komplexes gemäss einem der Ansprüche 1-6, welches umfasst: Zusammengeben von einem monomeren Insulin-Analogon, Protamin, Zink und einem Phenol-Derivat in einem wässrigen Lösungsmittel und Zulassen, dass sich der Komplex bildet.

20.

Ein Verfahren für die Herstellung von Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin-Protamin-Kristallen gemäss Anspruch 6, welches umfasst: Zusammengeben einer wässrigen Lösung von Lys<B28>ProB29-Humaninsulin in einem Hexamer-assoziierten Zustand und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von etwa 8 DEG C bis etwa 22 DEG C, wobei die wässrige Lösung von etwa 0,35 bis etwa 0,9 Gew.-% Zink, Lys<B28>Pro<B29>-Humaninsulin und ein Phenol-Derivat bei einem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 enthält und wobei die Protaminlösung Protamin bei einem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 enthält, derart, dass die Endkonzentration an Protamin etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100 IU Insulin-Analogon beträgt.

21. Das Verfahren gemäss Anspruch 20, in dem die Temperatur 15 DEG C beträgt, die Zinkkonzentration von 0,7% bis 0,9% und die Protaminkonzentration 0,3 mg/100 IU Insulin-Analogon ist.

22.

Ein Verfahren für die Herstellung von Asp<B28>-Humaninsulin-Protamin-Kristallen gemäss Anspruch 6, welches umfasst: Zusammengeben einer wässrigen Lösung von Asp<B28>-Humaninsulin in einem Hexamer-assoziierten Zustand und einer Protaminlösung bei einer Temperatur von etwa 13 DEG C bis 17 DEG C, wobei die wässrige Lösung von etwa 0,35 bis 0,9 Gew.-% Zink, Asp<B28>-Humaninsulin und ein Phenol- Derivat beieinem pH von etwa 7,1 bis etwa 7,6 enthält, und wobei die Protaminlösung Protamin bei einem pH von etwa7,1 bis etwa 7,6 enthält, derart, dass die Endkonzentration an Protamin etwa 0,27 bis etwa 0,32 mg Protamin/100 IU Insulin-Analogon beträgt.

23.

Ein Verfahren für die Herstellung einer parenteralen pharmazeutischen Formulierung gemäss einem der Ansprüche 7 bis 17, welches umfasst: Suspendieren von Insulin-Analogon-Protaminkristallen in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel.