PL183284B1

PL183284B1 - Kompleks analog insuliny-protamina, preparat farmaceutyczny, sposób wytwarzania kryształów Lys Pro-insuliny ludzkiej z protaminą i sposób wytwarzania kryształów Asp-insuliny ludzkiej z protaminą

Info

Publication number: PL183284B1
Application number: PL95309100A
Authority: PL
Inventors: Felippis Michael R. De
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 2002-06-28
Also published as: GB9512105D0; DK67695A; PT101723B; FR2721215A1; SE509295C2; FI118208B; JPH083064A; LU88627A1; NL1000565A1; CO4410204A1; NO952356D0; FI952932A0; SI9500199A; PE34496A1; KR960000923A; CA2151564A1; KR100386038B1; GR1002494B; JP3812962B2; AT408611B

Abstract

1. Kompleks analog insuliny - protamina, znamienny tym, ze zawiera ludzka insuline, w której Pro w pozycji B28 jest ewentualnie podstawiona Asp lub Lys, oraz Lys w pozycji B29 jest ewentualnie podstawiona Pro, od okolo 0,2 do kolo 1,5 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny, od okolo 0,35 do okolo 0,9% wagowych cynku na analog insuliny i co najmniej jedna czasteczke pochodnej fenolowej na czasteczke analogu insuliny; z zastrzezeniem, ze gdy insulina jest AspB28-insulina ludzka, stezenie protaminy jest nizsze niz 10% wagowych analogu insuliny. 5 Preparat farmaceutyczny do podawania pozajelitowego, znamienny tym, ze zawiera kom pleks analog insuliny - prota- mina, w którym analog insuliny stanowi ludzka insuline, w której Pro w pozycji B28 jest podstawiona Asp lub Lys, oraz Lys w pozycji B29 jest ewentualnie podstawiona Pro, od okolo 0,2 do okolo 1,5 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny, od okolo 0,35 do okolo 0,9% wagowych cynku na analog insuliny, od okolo 1,0 mg/ml do okolo 6,0 mg/ml pochodnej fenolowej; z zastrzezeniem, ze gdy analogiem insuliny jest AspB 28-insulina ludzka, stezenie protaminy jest nizsze niz 10% wagowych analogu insuliny. 9. Preparat farmaceutyczny do podawania pozajelitowego, znamienny tym, ze zawiera mieszanine rozpuszczalnego ana- logu insuliny i krysztalów analog insuliny-protamina, przy czym stosunek wagowy ilosci obu skladników wynosi okolo 2575 do 75.25 rozpuszczalnego analogu insuliny do krysztalów analogu insuliny z protamina, a analogiem insuliny jest ludzka insulina, w której Pro w pozycji B28 jest odstawiona Asp lub Lys, oraz Lys w pozycji B29 jest ewentualnie podstaw iona Pro, od okolo 0,2 do okolo 1,5 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny, od okolo 0,35 do okolo 0,9% wagowych cynku na ana- log insuliny od okolo 1,0 mg/ml do okolo 6,0 mg/ml pochodnej fenolowej; z zastrzezeniem, ze gdy insulina jest AspB 28-insu- lina ludzka, stezenie protaminy jest nizsze niz 10% wagowych analogu insuliny. 12. Sposób wytwarzania krysztalów LysB 28-ProB 29-insuliny ludzkiej z protam ina znam ienny tym, ze laczy sie wodny roztwór LysB 28-ProB 29-insuliny ludzkiej w stanie heksamerycznym oraz roztwór protaminy, w temperaturze od okolo 8°C do okolo 22°C, przy czym wodny roztwór zawiera LysB 2 8 -ProB 2 9 -insuline ludzka, od okolo 0,35 do okolo 0,9% wagowych cynku na analog insuliny oraz pochodna fenolow a przy pH od okolo 7,1 do okolo 7,6, a roztwór protaminowy zawiera protamine przy pH od okolo 7,1 do okolo 7,6, tak ze koncowe stezenie protaminy wynosi od okolo 0,27 do okolo 0,32 mg na 100 IU analogu insuliny. 14 Sposób wytwarzania krysztalów AspB 2 8 -insuliny ludzkiej z rpotamina, znamienny tym, ze laczy sie wodny roztwór AspB 28-insuliny ludzkiej w stanie heksamerycznym oraz roztwór protaminy, w temperaturze od okolo 13°C do okolo 17°C, przy czym wodny roztwór zawiera AspB 28-insuline ludzka od okolo 0,35 do okolo 0,9% wagowych cynku na analog insuliny oraz pochodna fenolowa przy pH od okolo 7,1 do okolo 7,6, a roztwór protaminowy zawiera protamine, ma odczyn pH od okolo 7,1 do okolo 7,6, tak ze koncowe stezenie protaminy wynosi od okolo 0,27 do okolo 0,32 mg na 100 IU analogu insuliny. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompleks analog insuliny - protamina, preparat farmaceutyczny zawierający ten kompleks, sposób wytwarzania kryształów Lys^B28-Pro^B29-insuliny ludzkiej z protaminą i sposób wytwarzania kryształów Asp^B28-insuliny ludzkiej z protaminą.

Od chwili wprowadzenia insuliny w latach dwudziestych dokonano znacznego postępu wleczeniu diabeters mellitus. Główny postęp w czystości insuliny i jej dostępności dokonał się z wynalezieniem techniki rekombinacji DNA. Opracowano także wiele kompozycji z różną charakterystyką działania czasowego. Obecnie istnieje siedem dostępnych w handlu kompozycji insulinowych: insulina zwykłą insulina „semilente”, insulina globinowa, insulina izofanowa, insulina cynkowa w zawiesinie, insulina protaminowo-cynkowa i insulina „ultralente”.

Pomimo licznych dostępnych kompozycji terapia oparta na zastrzykach podskórnych nie dysponuje nadal dogodnym dla pacjenta sposobem regulacji i normalizacji stanu glukozy we krwi. Częste odchylenia od normalnego poziomu glukozy prowadzą do hiper- lub hipoglikemii, a długookresowe komplikacje obejmują retinopatię, neuropatię, nefropatię oraz mikroi makroangiopatię.

Aby uniknąć ekstremalnych poziomów glukozy we krwi, diabetycy dokonują częstych zastrzyków insuliny, zwykle przy każdym posiłku. Jednak dotychczas nie zoptymalizowano takiej terapii. Najszybciej działająca insulina dostępna w handlu wykazuje maksymalne działanie zbyt późno od zastrzyku, i trwa ono zbyt długo, aby optymalnie sterować poziomem glukozy. Poczyniono wiele wysiłków, aby wytworzyć kompozycje insulinowe i analogi insuliny, które zmieniałyby kinetykę procesu absorpcji podskórnej.

Wszystkie handlowe kompozycje insulinowe zawierają insulinę w stanie samozaasocjowanym, głównie w formie heksameru. Przypuszcza się więc, że etapem decydującym o szybkości absorpcji insuliny z miejsca zastrzyku podskórnego do krwioobiegu jest dysocjacja samozagregowanego heksanu insuliny. Ostatnio opracowano monomeryczne analogi insuliny, mniej podatne na asocjację niż insulina ludzka. Brak takiej samoasocjacji jest związany

183 284 z modyfikacją sekwencji aminokwasowej ludzkiej insuliny, wpływającą na zrywanie powstających dimerów. Patrz np. Brems i in., Protein Engineering, 5:6, 527-533 (1992) oraz Brange i in., Naturę, 333:679-682 (1988). Odpowiednio więc monomeryczne analogi insuliny wykazują znacznie szybciej aktywność, zachowując zarazem biologiczną aktywność ludzkiej insuliny. Analogi pozwalają na szybką absorpcję z miejsca wstrzyknięcia i osiągnięcie szczytu aktywności w okolicach szczytu obecności glukozy poposiłkowej związanej z reakcją na posiłek.

Właściwości fizyczne i charakterystyka monomerycznych analogów nie jest zgodna z cechami insuliny. Np. Brems i in. opisują różne monomeryczne analogi, które wcale nie wykazują, lub w niewielkim stopniu wykazują asocjację indukowaną cynkiem. Jedyna obserwowana asocjacja jest związana z wielokrotnością masy cząsteczkowej monomeru. Różni to analogi od insuliny, która występuje w obecności cynku prawie wyłącznie w heksamerycznej konformacji. Patrz np. Brange in. w Diabetes Case 13: 923-954 (11). Brak asocjacji jest związany z szybkim działaniem analogu. Ze względu na małą skłonność do asocjacji jest zaskakujące, że analog monomeryczny insuliny można umieścić w kompozycji pozwalającej na osiągnięcie pośredniego czasu trwania aktywności.

W opisie US 4,764,592 ujawnione jest wytwarzanie kryształów ludzkiej proinsuliny, cząsteczki prekursora pojedynczego łańcucha 86-aminokwasu ludzkiej insuliny. Właściwości krystalizacyjne ludzkiej proinsuliny różnią się znacznie od właściwości krystalizacyjnych dwułańcuchowej cząsteczki insuliny ludzkiej, która sama w sobie różni się znacznie od analogów monomerycznej insuliny. W opisie US 3,758,683 opisano połączenie protaminy i soli insuliny zasadniczo wolnej od cynku z wytworzeniem kompleksu w postaci amorficznych wytrąceń. W europejskim opisie patentowym nr 383472 ujawniono analogi monomerycznej insuliny. Opis ten nie ujawnia sposobu wytarzania kompleksu analogów z protaminą, czy też preparatów zawierających protaminę. W publikacji Naturę, Vol. 338, (1989), str. 594-596 opisano fakt wiązania i stabilizacji przez fenol postaci helikalnych B1-B8 w R6 (monocyklicznej) postaci krystalicznej insuliny. Kompleksy insuliny opisane w tym artykule nie zawierają protaminy, tak więc nie można było przewidzieć jaki byłby wpływ fenolu w wytwarzaniu kompleksów analog monomerycznej insuliny-protamina.

Celem wynalazku było otrzymanie nowej krystalicznej postaci kompleksu protaminowego monomerycznego analogu insuliny nazwanej analogiem insuliny-NPD oraz preparatu farmaceutycznego zawierającego taki kompleks wykazującego przy stosowaniu pośredni czas trwania aktywności. Ponadto było nim także otrzymanie preparatu zawierającego mieszaninę analogu insuliny-NPD i rozpuszczalnego mieszaninę analogu insuliny-NPD i ropuszczalnego monomerycznego analogu insuliny. Mieszanina taka pozwala na szybkie rozpoczęcie działania i pośredni czas trwania aktywności. Tak więc mieszanina taka daje korzyści w porównaniu z insuliną i analogiem monomerycznym. Celem wynalazku był także sposób wytwarzania jednorodnych kryształów analogu insuliny-NPD.

Zgodnie z wynalazkiem kompleks analog insuliny - protamina zawiera ludzką insulinę, w której Pro w pozycji B28 jest podstawiona Asp lub Lys, oraz Lys w pozycji B29 -jest ewentualnie podstawiona Pro, od około 0,2 do około 1,5 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny, od około 0,35 do około 0,9% wagowych cynku na analog insuliny i co najmniej jedną cząsteczkę pochodnej fenolowej na cząsteczkę analogu insuliny; z zastrzeżeniem, że gdy insuliną jest Asp^B28-insulina ludzka, stężenie protaminy jest niższe niż 10% wagowych analogu insuliny.

Korzystnie kompleks zawiera Lys^B28-Pro^B29-insulinę ludzką lub Asp^B28-insulinę ludzką, a stężenie protaminy wynosi od około 0,27 do około 0,32 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny.

Korzystnie kompleks ma postać krystaliczną.

Termin „monomeryczny analog insuliny” lub „analog insuliny” stosowany tutaj oznacza szybko działający analog insuliny mniej skłonny do imeryzacji lub samoasocjacji. Analog monomeryczny insuliny powstaje z ludzkiej insuliny przez odstawienie Pro w pozycji B28 Asp lub Lys, a Lys w pozycji B29 jest ewentualnie podstawiona proliną.

183 284

Monomeryczne analogi insuliny opisuje Chance i in., publikacja EPO nr 383472 oraz Brange i in., publikacja EPO nr 214826.

Specjalista z tej dziedziny zauważy, że możliwe są inne modyfikacje monomerycznych analogów insuliny. Modyfikacje te są szeroko znane wśród fachowców i obejmują zastąpienie reszty histydynowej w pozycji B10 kwasem aspartowym, reszty fenyloalaninowej w pozycji BI kwasem aspartowym, reszty treoninowej w pozycji B30 alaniną reszty serynowej w pozycji B9 kwasem aspartowym, usunięcie aminokwasów z pozycji BI lub także z pozycji B2, usunięcie treoniny z pozycji B30.

Termin „pochodna fenolowa” oznacza m-krezol, fenol lub korzystnie ich mieszaninę.

Dzięki wynalazkowi podano specyficzne warunki, w jakich analogi insuliny z protaminą istnieją jako trwałe kryształy. Preparaty z takimi kryształami są definiowane jako analog insuliny NPD. Analog insuliny-NPD oznacza preparat zawierający kryształy analogu insuliny NPD, która wykazuje pośredni czas trwania aktywności. Profil, aktywności analogu insuliny NPD jest dość zaskakujący, ze względu na brak skłonności do samoasocjacji monomerycznego analogu.

Analogi insuliny według wynalazku można wytwarzać w dowolny znany sposób metodą syntezy peptydowej, w tym klasycznej (metoda w roztworze), w fazie stałej, półsyntetyczną i bardziej nowoczesnymi metodami rekombinacyjnymi. Np. Chance i in., publikacja EPO r 393472 oraz Brange i in., publikacja EPO nr 214826, opisują wytwarzanie różnych monomerycznych analogów.

Termin „monomeryczny analog insuliny-NPD” lub „analog insuliny-NPD” oznacza także zawiesinę krystalicznego analogu insuliny i protaminy w preparacie. NPD jest obojętną kompozycją protaminy według DeFelippisa. Preparat wytwarza się zgodnie z niniejszym opisem. Pokrewny termin „kryształy analogu insuliny-NPD”, „krystaliczny analog insuliny-NPD” lub „kryształy Lys^B28-Pro^B29-insuliny ludzkiej z protaminą odnoszą się do kryształów analogu insuiny z protainą w preparacie NPD.

Preparat farmaceutyczny według wynalazku jest preparatem do podawania pozajelitowego do leczenia cukrzycy i zawiera kompleks analog insuliny-protamina, w którym analog insuliny stanowi ludzką insulinę, w której Pro w pozycji B28 jest podstawiona Asp lub Lys, oraz Lys w pozycji B29 jest ewentualnie podstawiona Pro, od około 0,2 do około 1,5 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny, od około 0,35 do około 0,9% wagowych cynku na analog insuliny, od około 1,0 mg/ml do około 6,0 mg/ml pochodnej fenolowej; z zastrzeżeniem, że gdy analogiem insuliny jest Asp^B28-insulina ludzką stężenie protaminy jest niższe niż 10% wagowych analogu insuliny.

Korzystnie preparat zawiera analog insuliny, który stanowi Lys^B28-Pro^B29-insulina ludzka lub Asp^B28-insulina ludzka a stężenie protaminy wynosi od około 0,27 do około 0,32 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny.

Korzystnie preparat zawiera około 0,3 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny, około 0,7% wagowych cynku w przeliczeniu na analog insuliny, około 1,7 mg/ml m-krezolu, około 0,7 mg/ml fenolu, około 16 mg/ml gliceryny i około 3,78 mg/ml dwuzasadowego fosforanu sodu.

W preparacie stosuje się środek izotoniczny, to jest środek, który jest tolerowany fizjologicznie i nadaj e odpowiednią toniczność preparatowi w celu zapobiegania wynikowemu przepływowi jednokierunkowemu wody przez ściankę komórki. Zwykle stosuje się takie związki, jak glicerynę, w znanych stężeniach. Stężenie środka izotonicznego mieści się w zakresie znanym specjalistom wytwarzającym kompozycje insulinowe. Na ogół, stężenie środka izotonicznego wynosi np. 14 mg/ml do 18 mg/ml, korzystnie około 16 mg/ml.

Ilość protaminy w preparacie przelicza się na wolną zasadę wprowadzając poprawkę na zawartość soli i wody w solach protaminy dostępnych w handlu i zwykle stosowanych w kompozycjach pozajelitowych. Korzystny rodzaj protaminy, siarczan protaminy, zawiera w przybliżeniu 80% protaminy.

183 284

Termin „IU” lub „U” oznacza jednostkę międzynarodową. „Stosunek izofanowy” oznacza równowagową ilość protaminy niezbędną do skompleksowania analogu, według Krayenbuhla i Rosenberga, Steno Memoriał Hospital Report (Copenhagen), 1:60 (1946). Stosunek izofanowy określany jest przez miareczkowanie w sposób dobrze znany i opisany przez Kreyenbuhla i in.

Pochodną fenol ową jest m-krezol, fenol lub ich mieszanina. Korzystnie pochodną fenolową jest m-krezol i fenol. Stężenie pochodnej fenolowej jest znane specjalistom. Musi być ono dostateczne do tego, aby wywołać działanie konserwujące, tj. powstrzymać rozwój mikroorganizmów. Zwykle stężenie związku fenolowego wynosi np. od 1,0 do 6,0 mg/ml, korzystnie ponad około 2,5 mg/ml. Najkorzystniejsze stężenie wynosi około 3 mg/ml. Obecność pochodnej fenolowej jest niezwykle istotna, ponieważ służy ona dodatkowo do kompleksowania analogu, protaminy i cynku. Jednak sądzi się, że tylko jedna cząsteczka fenolu na cząsteczkę insuliny jest związana ze strukturą krystaliczną.

Odczyn pH preparatu można ustalać środkiem buforowym tolerowanym fizjologicznie, najlepiej buforem fosforanowym takim jak dwuzasadowy fosforan sodu. Inne fizjologicznie tolerowane bufory obejmują TRIS, octan sodu lub cytrynian sodu. Dobór i stężenie bufora są znane specjalistom. Zwykle stężenie wynosi np. około 1,5 mg/ml do 5,0 mg/ml, korzystnie 3,8 mg/ml.

Jak opisano powyżej, do preparatu według wynalazku można dodawać środek izotoniczny. Środek można dodawać do roztworu analogu, do roztworu protaminy lub do końcowego preparatu. Podobnie tolerowany fizjologicznie bufor można dodawać do roztworu analogu, do roztworu protaminy lub do końcowego preparatu. Jednak korzystne jest dodawanie bufora i środka izotonicznego do roztworu analogu i protaminy przed ich połączeniem. Ze względu na działanie NaCl w procesie wytwarzania krystalicznego analogu insuliny-NPD gliceryna jest zalecanym środkiem izotonicznym.

Przedmiotem wynalazku jest także preparat farmaceutyczny do podawania pozajelitowego, który zawiera mieszaninę rozpuszczalnego analogu insuliny i kryształów analog insuliny-protamina, przy czym stosunek wagowy ilości obu składników wynosi około 25:75 do 75:25 rozpuszczalnego analogu insuliny do kryształów analogu insuliny z protaminą, a analogiem insuliny jest ludzka insulina, w której Pro w pozycji B28 jest podstawiona Asp lub Lys, oraz Lys w pozycji B29 jest ewentualnie podstawiona Pro, od około 0,2 do około 1,5 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny, od około 0,35 do około 0,9% wagowych cynku na analog insuliny i od około 1,0 mg/ml do około 6,0 mg/ml pochodnej fenolowej; z zastrzeżeniem, że gdy insuliną jest Asp^B28-insulina ludzka, stężenie protaminy jest niższe niż 10% wagowych analogu insuliny.

Korzystnie preparat zawiera rozpuszczalną Lys^B28-Pro^B29-insulinę ludzką i kryształy Lys^B28-Pro^B29-insulina ludzka - protamina.

Stosunek wagowy ilości obu powyższych składników korzystnie wynosi 50:50, 75:25 lub 25:75.

Rozpuszczalny analog insuliny jest monomerycznym analogiem insuliny rozpuszczonym w wodnym rozcieńczalniku zawierającym cynk, fenolową pochodną środek izotoniczny i bufor. Stężenia składników w rozcieńczalniku są takie, jak opisano powyżej.

Preparat z łatwością wytwarza się mieszając indywidualne składniki.

Preparaty według wynalazku nadają się szczególnie do leczenia cukrzycy, ze względu na szybkie rozpoczynanie działania i przedłużone działanie. Mieszaniny takie pozwalają na „precyzyjną kontrolę” dzięki zmianom ilości każdego składnika w zależności od potrzeb, diety i fizycznej aktywności pacjenta. Mieszaniny analogu insuliny-NPD i rozpuszczalnego analogu insuliny są także korzystne, ponieważ są jednorodne, to jest możliwa jest każda wymiana równowagowa pomiędzy kryształami w zawiesinie a rozpuszczalnym analogiem insuliny.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania kryształów Lys^B28-Pro^B29-insuliny ludzkiej z protaminą który polega na tym, że łączy się wodny roztwór Lys^B28-Pro^B29-insuliny ludzkiej w stanie heksamerycznym oraz roztwór protaminy, w temperaturze od około

183 284

8°C do około 22°C, przy czym wodny roztwór zawiera Lys^B28-Pro^B29-insulinę ludzką, od około 0,35 do około 0,9% wagowych cynku na analog insuliny oraz pochodną fenolową przy pH od około 7,1 do około 7,6, a roztwór protaminowy zawiera protaminę przy pH od około 7,1 do około 7,6, tak że końcowe stężenie protaminy wynosi od około 0,27 do około 0,32 mg na 100IU analogu insuliny.

Korzystnie stosuje się temperaturę 15°C, stężenie cynku od około 0,7 do około 0,9% wagowych na analog insuliny, a stężenie protaminy wynosi 0,3 mg na 100 IU analogu insuliny.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania kryształów Asp^B28-insuliny ludzkiej z protaminą, który polega na tym, że łączy się wodny roztwór Asp^B28-insuliny ludzkiej w stanie heksamerycznym oraz roztwór protaminy, w temperaturze od około 13°C do około 17°C, przy czym wodny roztwór zawiera Asp^B28-insulinę ludzką, od około 0,35 do około 0,9% wagowych cynku na analog insuliny oraz pochodną fenolową przy pH od około 7,1 do około 7,6, a roztwór protaminowy zawiera protaminę, ma odczyn pH od około 7,1 do około 7,6, tak że końcowe stężenie protaminy wynosi od około 0,27 do około 0,32 mg na 100 IU analogu insuliny.

Wiadomo było, że monomeryczne analogi insuliny mają mniejszą tendencję do asocjacji i tworzenia heksamerów. Warunki konieczne do spowodowania ich asocjacji z protaminą w celu utworzenia kryształów były dotychczas nieznane. Poprzednie badania dotyczyły insuliny. Opis wytwarzania insuliny-NPH (obojętna protamina według Hagedoma) lub izofanowej kompozycji insuliny według Krayenbuhla i Rosenberga, Steno Memoriał Hospital Report (Copenhagen), 1:60 (1946), nie jest w tym przypadku przydatny ze względu na odmienne właściwości monomerycznych analogów insuliny. W rzeczywistości handlowy proces wytwarzania środka Humulin-N™ (insulina-NPH), proces kwasowo-obojętny, nie pozwala na otrzymanie krystalicznego analogu insuliny-NPD.

Co ważniejsze, znaleziono, że parametry niniejszego procesu - konkretnie temperatura krystalizacji i tworzenia kompleksu heksamerowego analogu insuliny, cynku i pochodnej fenolowej są krytycznymi ograniczeniami tworzenia trwałych kryształów Lys^B28-Pro^B29-insuliny ludzkiej-NPD.

Temperatura krystalizacji musi wynosić od około 8°C do około 22°C. Jeśli temperatura jest wyższa, powstaje głównie bezpostaciowa kompozycja analogu insuliny z protaminą.

Ważne jest także, aby analog insuliny został przetworzony w heksamer przed krystalizacją. W wyniku krystalizacji powstaje bezpostaciowy produkt, jeśli proces prowadzono z monomerem. Kryształy tworzą się bez mieszania w czasie od 5 do 36 godzin. Kryształy dobrej jakości powstają zwykle w ciągu 24 godzin.

Rozpuszczalny monomeryczny analog insuliny przetwarza się w kompleks heksameryczny umieszczając go w zawiesinie w rozcieńczalniku zawierającym pochodną fenolową i dodając cynk aż do osiągnięcia stężenia od około 0,35 do około 0,9% wagowych. Cynk korzystnie dodaje się w postaci soli. Przykłady soli cynku obejmują octan cynku, bromek cynku, chlorek cynku, fluorek cynku, jodek cynku i siarczan cynku. Specjalista zrozumie, że istnieje wiele innych soli cynku, które także można stosować w procesie. Korzystny jest octan cynku lub chlorek cynku.

Rozpuszczanie analogu insuliny w rozcieńczalniku może być wspomagane przez zjawisko zwane rozpuszczaniem kwasowym. W procesie tym pH obniża się do około 3,0 do 3,5 przy pomocy fizjologicznie tolerowanego kwasu, korzystnie HC1, w celu zwiększenia rozpuszczalności analogu. Inne fizjologicznie tolerowane kwasy obejmują kwas octowy, cytrynowy i fosforowy. Odczyn pH podwyższa się fizjologicznie tolerowaną zasadą, korzystnie NaOH, do około 7,1 do 7,6 w celu wykrystalizowania. Inne fizjologicznie tolerowane zasady obejmują KOH i wodorotlenek amonu.

Najważniejsze jest, że proces wytwarzania kompleksu Lys^B28-Pro^B29-insulina ludzka-NPD jest wrażliwy na stężenie NaCl. Jeśli stężenie to przekroczy około 4 mg/ml, kryształy analogu insuliny-NPD mieszają się z bezpostaciowym produktem. Tak więc korzystne jest, aby monomeryczny analog rozpuszczać przy odczynie pH obojętnym, aby nie powstawały

183 284 jony soli. Alternatywnie analog można rozpuścić w rozcieńczalniku w warunkach kwasowych przed dodaniem bufora. Obniża to stężenie soli powstającej przy zmianie pH.

Jednak kolejność dodawania składników nie jest istotna dla tworzenia heksameru lub kompozycji bezpostaciowej.

Figura 1 przedstawia graficznie profil działania Lys^B28-Pro^B29-insułiny ludzkiej-NPD i ludzkiej insuliny NPH. Wykres jest wyskalowany w pU względem czasu wstrzyknięcia. Figura przedstawia korzyści płynące z wynalazku, to jest zdolność do tworzenia preparatu o pośrednim czasie trwania aktywności przez monomeryczny analog. Profil NPD jest podobny do profilu insuliny-NPH. Czasy trwania działania kompozycji NPD i kompozycji insulina-NPH są w przybliżeniu równe. Jednak przede wszystkim preparat według wynalazku zaczyna działać szybciej i pozostaje stabilny przez dłuższy czas w porównaniu z insuliną-NPH. Różnica ta jest nieoczekiwana ze względu na szybkie, zgodne z profilem, działanie analogu monomerycznego.

Figura 2 przedstawia obraz kryształów protaminy z Asp^B28-insuliną ludzką według wynalazku. Powiększenie 1000-krotne z kontrastem fazowym.

Figura 3 przedstawia obraz kryształów protaminy z Lys^B28-Pro^B29-hI według wynalazku. Powiększenie 1000 z kontrastem fazowym.

Leczenie pacjenta preparatem według wynalazku oznacza opiekę nad pacjentem w celu zwalczenia choroby, stanu lub zaburzenia, i obejmuje podawanie preparatu według wynalazku w celu zwalczania ataku choroby lub komplikacji, złagodzenia objawów lub komplikacji, lub też wyleczenia choroby, stanu lub zaburzenia.

Poniższe przykłady mają tylko zilustrować wytwarzanie analogów insuliny według wynalazku. Zakres wynalazku nie składa się wyłącznie z poniższych przykładów.

Przykład I

Wytwarzanie Lys^B28-Pro^B29-insuliny ludzkiej-NPD

Roztwór Lys^B28-Pro^B29-insuliny ludzkiej (Lys^B28-Pro^B29-hI) o stężeniu 200 lU/ml (U200) otrzymano rozpuszczając zawierające cynk kryształy Lys^B28-Pro^B29-hI w układzie bufora ze środkiem konserwującym zawierającym 1,6 mg/ml m-krezolu, 0,73 mg/ml fenolu (równoważne 0,65 mg/ml fenolu jako 89%), 16 mg/ml gliceryny i 3,78 mg/ml bufora dwuzasadowego fosforanu sodu. Endogenną zawartość cynku w kryształach uzupełniono dodając właściwą ilość kwasowego roztworu ZnO (10 mg/ml) do końcowego stężenia 0,025 mg/100 IU (0,7%). Rozpuszczanie Lys^B28-Pro^B29-hI przeprowadzono w temperaturze pokojowej obniżając pH do około 3 przy pomocy mikrolitrowych ilości 5M HC1. Po sklarowaniu roztworu pH podwyższono do 7,5 przy pomocy mikrolitrowych ilości 5M NaOH.

Roztwór protaminy przygotowano rozpuszczając dostateczną ilość stałego siarczanu protaminy w roztworze środka konserwuj cąego/bufora do końcowego stężenia 0,6 mg/100 IU w przeliczeniu na wolną zasadę. Odczyn pH tego roztworu ustawiono na 7,5 i całość ochłodzono do 15°C.

Oba roztwory rozcieńczono do końcowego stężenia wodą do iniekcji i przesączono. Próbki 5 ml Lys^B28-Pro^B29-hI umieszczono w oddzielnych czystych szklanych fiolkach i próbki inkubowano na łaźni wodnej w temperaturze 15°C. Po czasie wystarczającym do osiągnięcia równowagi (15 minut) wywołano strącenie dodając szybko 5 ml roztworu protaminy do próbek Lys^B28-Pro^B29-hI. Krystalizacja przebiegała przez około 24 godziny w temperaturze 15°C.

Przykład II

Wytwarzanie Lys^B28-Pro^B29-insuliny ludzkiej-NPD

Sposób jest identyczny jak w przykładzie I, ale rozpuszczanie Lys^B28-Pro^B29-hI zachodzi przy obojętnym odczynie pH. Proces prowadzono tak, że końcowe pH wynosiło 7,4.

Przykład III

Wytwarzanie Lys^B28-Pro^B29-insuliny ludzkiej-NPD

Analog insuliny-NPD wytworzono w sposób analogiczny, jak w przykładzie I, ale kwasowe rozpuszczanie Lys^B28-Pro^B29-hI prowadzono w obecności wszystkich zarobek poza

183 284 buforem z dwuzasadowego fosforanu sodu. Dodano go po dojściu roztworu analogu insuliny do pH 7,4. Dodanie dwuzasadowego fosforanu sodu sklarowało roztwór.

Przykład IV

Wytwarzanie kompozycji z analogiem insuliny-NPD

Mieszaniny Lys^B28-Pro^B29-hI o dużej i średniej szybkości działania wytwarza się w następujący sposób. Zawiesinę o pośredniej szybkości działania wytwarza się jak w przykładzie III, i stanowi ona część o pośredniej szybkości działania mieszaniny. Oddzielny roztwór Lys^B28-Pro^B29-hI (100 IU) wytwarza się rozpuszczając zawierające cynk kryształy Lys^B28-Pro^B29-hI w temperaturze pokojowej w rozcieńczalniku opisanym w przykładzie I. Endogenny poziom cynku z Lys^B28-Pro^B29-hI uzupełnia się dodając kwasowy roztwór ZnO aż do osiągnięcia poziomu części zawiesinowej (to jest 0,025 mg/100 IU (0,7%)). Całość rozcieńczono wodą do iniekcji do końcowego stężenia po ustawieniu pH na 7,4 przy pomocy 10% roztworu HC1 lub NaOH. Roztwór stanowi część o szybkim działaniu mieszanin. Końcową mieszaninę otrzymuje się łącząc odpowiednie ilości obu części w żądanym stosunku. Mieszaninę 50/50 otrzymuje się łącząc 1 część objętościową zawiesiny o pośredniej szybkości działania i 1 część objętościową roztworu o dużej szybkości działania.

Przykład V

Wpływ siły jonowej na krystalizację Lys^B28-Pro^B29-hI z protaminą

Wpływ siły jonowej oceniono dodając NaCl do części zawierającej Lys^B28-Pro^B29-hI przed zmieszaniem z protaminą. NaCl dodano do końcowego stężenia 20, 30 i 40 mM (1,2, 1,8 i 2,3 mg/ml). Rozkład objętości cząstek wykazywał multimodalność (dodatkowe piki przy małych rozmiarach) ze wzrostem stężenia NaCl. Średnie rozmiary cząstek malały ze wzrostem stężenia NaCl, wskazując na wzrost ilości substancji bezpostaciowej. Wyniki pomiarów były następujące:

[NaCl] Średni objętościowo rozmiar cząstek (pm) mM3,9 mM3,5 mM3,3 mM3,2

Analiza mikroskopowa pokazała, że wszystkie próbki zawierały mieszaninę substancji krystalicznych i bezpostaciowych. Próbka z 40 mM NaCl zawierała głównie substancję bezpostaciową i niewiele kryształów.

Przykład VI

Porównawcza dynamika Lys^B28-Pro^B29-hI-NPD i ludzkiej insuliny-NPH

Studium przeprowadzono na psach w stanie przytomności. Przed jego rozpoczęciem pobrano trzy podstawowe próbki. Następnie rozpoczęto infuzję samotostatyny (0,3 pg/kg na minutę). Po 10 minutach przerwy wykonano podskórny zastrzyk NPD lub NPH. Rozpoczęto częste obserwacje poziomu glukozy w osoczu oraz dokonano infuzji zmienną ilością glukozy (20%) dla zachowania w przybliżeniu stałego poziomu w osoczu. Próbki pobierano przez cały czas i analizowano na immunoreaktywną insulinę (przeciwciało Linco) i glukozę. Wyniki podaje fig. 1.

Przykład VII

Wytarzanie kryształów analogu Asp(B28) z protaminą

Część zawierającą Asp(B28)-ludzkiej insuliny w stężeniu 200 lU/ml przygotowano rozpuszczając liofilizowaną substancję (czystość 95%) w układzie środka konserwującego/bufora zawierającym 1,6 mg/ml m-krezolu, 0,73 mg/ml fenolu (równoważne 0,65 mg/ml fenolu jako 89%), 16 mg/ml gliceryny i 3,78 mg/ml bufora dwuzasadowego fosforanu sodu. Do układu dodano cynk w postaci kwasowego roztworu ZnO (10 mg/ml) do końcowego stężenia 0,025 mg/100 IU. Rozpuszczanie Asp(B28) przeprowadzono w temperaturze pokojowej przy obojętnym odczynie pH. Końcowe pH wynosiło 7,4.

183 284

Krystalizację prowadzono w sposób opisany w przykładzie II. Badano końcowe stężenia protaminy 0,3 mg/100 U, 0,35 mg/100 U i 0,4 mg/100 U. Stężenia te odpowiadają 2,9%, 9,3% i 10,5% wagowych. Temperatury inkubacji wynosiły 5°C (tylko 0,3 mg/100 U), 15°C i 22°C. Po 24 godzinach w tych temperaturach, próbki zanalizowano na powstawanie kryształów. Wyniki badania mikroskopowego wskazują na mieszaninę produktu bezpostaciowego i niewielu kryształów.

Przykład VIII

Wytwarzanie kryształów analogu Asp(B28) z protaminą

Krystalizację Asp(B28) z protaminą prowadzono jak w przykładzie VII, jednak białko rozpuszczono najpierw w rozcieńczalniku bez bufora. Cynk w postaci kwasowego roztworu ZnO dodano do osiągnięcia pH 2,0-2,5. Po składowaniu roztworu pH podwyższono ponownie do wartości 7 mikrolitrowymi ilościami 5N NaOH. Dodano dwuzasadowy fosforan sodu o stężeniu 47,25 mg/ml do końcowego stężenia 3,78 mg/ml. Część tę zakwaszono do pH 7,4 mikrolitrowymi ilościami 5N HC1.

Krystalizację rozpoczęto łącząc część Asp(B28) i protaminową w sposób opisany w poprzednich przykładach. Badano końcowe stężenia protaminy 0,3 mg/100 U, 0,35 mg/100 U i 0,4 mg/100 U. Temperatury inkubacji wynosiły 15°C i 22°C. Po 24 godzinach w tych temperaturach próbki zanalizowano na powstawanie kryształów. Wyniki badania mikroskopowego wskazują na mieszaninę produktu bezpostaciowego i kryształów.

Przykład IX

Wytwarzanie kryształów analogu Leu(B28)Pro(B29) z protaminą

Część zawierającą Leu(B28)Pro(B29) (czystość 93%) o stężeniu 200 lU/ml (U200) wytworzono jak w przykładzie VIII, stosując rozpuszczanie kwasowe substratu, a następnie ustawiając pH 7,4 przy pomocy 5N NaOH. Krystalizacja przebiegała jak powyżej. Badano końcowe stężenia protaminy 0,3 mg/100 U, 0,35 mg/100 U i 0,4 mg/100 U. Temperatury inkubacji wynosiły 5°C, 15°C i 22°C. Po 24 godzinach w tych temperaturach próbki zawierały pewne ilości kryształów, ale głównie były bezpostaciowe.

Przykład X

Kryształy des(B27)-hI z protaminą

Część zawierającą desThr(B27) (czystość 97,37%) o stężeniu 200 lU/ml (U200) wytworzono jak w przykładzie VIII, stosując rozpuszczanie kwasowe substratu, a następnie ustawiając pH 7,4 przy pomocy 5N NaOH. Krystalizacja przebiegała jak powyżej. Badano końcowe stężenia protaminy 0,3 mg/100 U, 0,35 mg/100 U i 0,4 mg/100 U. Temperatury inkubacji wynosiły 15°C i 22°C. Po 24 godzinach w tych temperaturach próbki były pod mikroskopem głównie bezpostaciowe. Zaobserwowano jakościowe ilości kryształów.

Przykład XI

Kryształy des(B28-B30)-hI z protaminą

Część zawierającą des(B28-B30) (czystość 96,3%) o stężeniu 200 lU/ml (U200) wytworzono jak w przykładzie VIII, stosując rozpuszczanie kwasowe substratu, a następnie ustawiając pH 7,4 przy pomocy 5N NaOH. Krystalizację rozpoczęto łącząc obojętne części białkową i protaminową w sposób opisany powyżej. Badano końcowe stężenia protaminy 0,3 mg/100 U, 0,35 mg/100 U i 0,4 mg/100 U. Temperatury inkubacji wynosiły 15°C i 22°C. Po 24 godzinach w tych temperaturach próbki były pod mikroskopem głównie bezpostaciowe, zaobserwowano jakościowe ilości kryształów, dobrze zdefiniowanych.

Przykład XII

Analog Asp(B28) z protaminą

Roztwór analogu Asp(B28)-insuliny ludzkiej otrzymano rozpuszczając 16,6 mg białka w 1 ml roztworu zawierającego 3,2 mg/ml m-krezolu, 1,3 mg/ml fenolu i 32 mg/ml gliceryny. Dodano 14,4 μ! kwasowego roztworu cynkowego (10 mg/ml Zn²⁺, otrzymany przez rozpuszczenie 0,311 g ZnO w 5 ml 10% HC1 i rozcieńczony do 25 ml wodą). Roztwór miał pH 2,3, dzięki czemu białko uległo rozpuszczeniu. Dodano 10 μΐ 10% NaOH dla podwyższenia pH do 7,06. Do roztworu dodano 100 μΐ 0,28 M dwuzasadowego fosforanu sodu o pH 7,0, co podnosiło

183 284 pH roztworu do wartości 7,27. Następnie dodano 870 μΐ wody do iniekcji. W końcu dodano 10% roztwór HC1 (1 μΐ) i NaOH (0,7 pl), a końcową objętość roztworu zwiększono do 2 ml wodą do iniekcji uzyskując końcowe pH 7,26. Roztwór przed użyciem przesączono przez 0,2 pm filtra Supor® Acrodisc®13, (Gelman Sciences).

Roztwory protaminy przygotowano rozpuszczając siarczan protaminy w roztworze zawierającym 1,6 mg/ml m-krezolu, 0,65 mg/ml fenolu, 16 mg/ml gliceryny i 14 mM dwuzasadowego fosforanu sodu. Końcowe pH roztworu ustawiono na 7,3. Końcowe stężenie protaminy wynosiło 0,60 mg/100 U w przeliczeniu na wolną zasadę. Oba roztwory przesączono przez 0,22 pm jednostki filtrujące (Millipore Sterivex™-GV) przed użyciem.

Krystalizacji dokonano mieszając roztwór Asp(B28)-insuliny ludzkiej w stosunku 1:1 i w kontrolowanej temperaturze, jak podaje tabela 1. Ostatecznie mieszanina zawierała 3,94 mg/ml Asp(B28)-insuliny ludzkiej, 0,0359 mg/ml (0,9% jonów cynku), 1,6 mg/ml m-krezolu, 0,65 mg/ml fenolu, 16 mg/ml gliceryny, 14 mM dwuzasadowego fosforanu sodu i 0,30 mg/100 U protaminy przy pH 7,3. Dokładniej, porcje 50-200 μΐ roztworu Asp(B28)-insuliny ludzkiej przeniesiono do szklanych fiolek i próbki doprowadzono do równowagi w temperaturach 4, 8, 15 lub 23°C (otoczenia). Podobnie potraktowano porcje obu roztworów protaminy. Po 15-20 minutach równoważną objętość jednego z roztworów protaminy przeniesiono pipetą do próbek insuliny. Mieszaninę łagodnie wytrząśnięto, zamknięto naczynie i pozostawiono w kontrolowanej temperaturze na okres krystalizacji. Po 24 godzinach próbki zbadano pod mikroskopem i stwierdzono głównie obecność produktu bezpostaciowego. Po 48 godzinach próbka zawierająca 0,30 mg/100 U protaminy inkubowana w temperaturze 15°C wykazała obecność znacznej ilości igłowatych kryształów i pewnej ilości produktu bezpostaciowego.

Przykład XIII

Roztwór analogu Asp(B28)-insuliny ludzkiej otrzymano rozpuszczając 10,62 mg białka w 0,71 ml roztworu zawierającego 3,2 mg/ml m-krezolu, 1,3 mg/ml fenolu i 32 mg/ml gliceryny. Dodano 10,2 pl kwasowego roztworu cynkowego (10 mg/ml ZN²⁺, otrzymany przez rozpuszczenie 0,311 g ZnO w 5 ml 10% HC1 i rozcieńczony do 25 ml wodą). Roztwór miał pH 2,3, dzięki czemu białko uległo rozpuszczeniu. Dodano 6,5 pl 10% NaOH dla podwyższenia pH do 7,00. Do roztworu dodano 71 pl 0,28 M dwuzasadowego fosforanu sodu o pH 7,0, co podniosło pH roztworu do wartości 7,26. Następnie dodano 620 μΐ wody do iniekcji. W końcu dodano 10% roztwór HC1 (0,2 μΐ) i NaOH (0,6 pl), a końcową objętość roztworu zwiększono do 1,42 ml wodą do iniekcji uzyskując końcowe pH 7,42. Roztwór przed użyciem przesączono przez 0,2 pm filtr Supor® Acrodisc®13, (Gelman Sciences).

Roztwory protaminy przygotowano rozpuszczając siarczan protaminy w roztworze zawierającym 1,6 mg/ml m-krezolu, 0,65 mg/ml fenolu, 16 mg/ml gliceryny i 14 mM dwuzasadowego fosforanu sodu. Końcowe pH roztworu pozostawiono na 7,3. Końcowe stężenie protaminy wynosiło 0,60 mg/100 U w przeliczeniu na wolną zasadę. Oba roztwory przed użyciem przesączono przez 0,22 pm jednostki filtrujące (Millipore Sterivex™-GV).

Krystalizacji dokonano mieszając roztwór Asp(B28)-insuliny ludzkiej w stosunku 1:1 z roztworem protaminy, jak opisano w przykładzie XII, w kontrolowanej temperaturze 13, 15, 17 i 23°C. Wyniki podano w tabeli 1. Ostatecznie mieszanina zawierała 3,74 mg/ml Asp(B28)-insuliny ludzkiej, 0,0359 mg/ml (0,9% jonów cynku), 1,6 mg/ml m-krezolu, 0,65 mg/ml fenolu, 16 mg/ml gliceryny, 14 mM dwuzasadowego fosforanu sodu i 0,30 mg/100 U protaminy przy pH 7,4. Zbadano krystalizację w czterech różnych temperaturach. Próbkę 1 ml Asp(B28)-insuliny ludzkiej doprowadzono do równowagi w temperaturze 15°C i zmieszano z 1 ml roztworu protaminy o tej samej temperaturze. Mieszaninę łagodnie wytrząśnięto i pozostawiono w temperaturze 15°C. Inną próbkę przygotowano doprowadzając do równowagi w temperaturze 13°C 100 pl roztworu Asp(B28)-insuliny ludzkiej, łącząc z 100 pl roztworu protaminy o tej samej temperaturze. Mieszaniną inkubowano w temperaturze 13°C. Trzecią próbkę przygotowano w podobny sposób z dwu porcji po 100 pl połączonych i inkubowanych w temperaturze 17°C. Końcowy roztwór wytworzono mieszając w temperaturze

183 284 otoczenia zrównoważone próbki 80 μΐ roztworów Asp(B28)-insuliny ludzkiej i protaminy i inkubując w temperaturze otoczenia (23°C). Wszystkie próbki po 24 godzinach i później, jak podaje tabela 1, zbadano pod mikroskopem.

Tabela 1

Warunki krystalizacji i wyniki mikroskopowe

r a B28-. [Asp ] (mg/ml)	[Protamina] (mg/100 U)	Temepratura (°C)	Czas (godziny)	Wyniki⁶mikroskopowe
3,94	0,30	15	24	bezpostaciowe
			48	krystaliczne
			72	krystaliczne
			96	krystaliczne
			120	krystaliczne
3,94	0,30	23	24	bezpostaciowe
			48	bezpostaciowe
			72	bezpostaciowe
3,74	0,30	13	24	bezpostaciowe
			40	kryst./bezpost.
			48	kryst./bezpost.
			69	kryst./bezpost.
3,74	0,30	15	24	bezpost./kryst.
			40	krystaliczne
			48	krystaliczne
			69	krystaliczne
3,74	0,30	17	24	bezpost./mało kryst.
			40	kryst./bezpost.
			48	kryst./bezpost.
			69	kryst./bezpost.
3,74	0,30	23	24	bezpostaciowe
			40	bezpost./mało kryst.
			48	bezpost./mało kryst.
			69	bezpost./mało kryst.

^a Wszystkie roztwory zawierały 0,9% jonów cynkowych, 1,6 mg/mlm-krezolu, 0,65 mg/ml fenolu, 16mg/ml gliceryny i 14 mM dwuzasadowego fosforanu sodu, pH 7,4.

^b Wynik krystalizacji określono pod mikroskopem przy powiększeniu 600 razy (mikroskop Nikon Optiphot 66) lub 1000 razy (mikroskop Zeiss Axioplan z różnicowym kontrastem). Oba mikroskopy były wyposażone w akcesoria do fotografii.

Kryształy wytworzone zgodnie z powyższymi przykładami przedstawiono na fig. 2 i 3.

183 284

FIG. 2

FIG. 3

183 284

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompleks analog insuliny - protamina, znamienny tym, że zawiera ludzką insulinę, w której Pro w pozycji B28 jest ewentualnie podstawiona Asp lub Lys, oraz Lys w pozycji B29 jest ewentualnie podstawiona Pro, od około 0,2 do koło 1,5 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny, od około 0,35 do około 0,9% wagowych cynku na analog insuliny i co najmniej jedną cząsteczkę pochodnej fenolowej na cząsteczkę analogu insuliny; z zastrzeżeniem, że gdy insuliną jest Asp^B28-insulina ludzka, stężenie protaminy jest niższe niż 10% wagowych analogu insuliny.
2. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera Lys^B28-Pro^B29-insulinę ludzką, a stężenie protaminy wynosi od około 0,27 do około 0,32 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny.
3. Kompleks według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera Asp^B28-insulinę ludzką, a stężenie protaminy wynosi od około 0,27 do około 0,32 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny.
4. Kompleks według zastrz. 1 albo 2, albo 2, znamienny tym, że ma postać krystaliczną.
5. Preparat farmaceutyczny do podawania pozajelitowego, znamienny tym, że zawiera kompleks analog insuliny - protamina, w którym analog insuliny stanowi ludzką insulinę, w której Pro w pozycji B28 jest podstawiona Asp lub Lys, oraz Lys w pozycji B29 jest ewentualnie podstawiona Pro, od około 0,2 do około 1,5 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny, od około 0,35 do około 0,9% wagowych cynku na analog insuliny, od około 1,0 mg/ml do około 6,0 mg/ml pochodnej fenolowej; z zastrzeżeniem, że gdy analogiem insuliny jest Asp^B28-insulina ludzka, stężenie protaminy jest niższe niż 10% wagowych analogu insuliny.
6. Preparat według zastrz. 5, znamienny tym, że analog insuliny stanowi Lys^B28-Pro^B29-insulina ludzka, a stężenie protaminy wynosi od około 0,27 do około 0,32 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny.
7. Preparat według zastrz. 5, znamienny tym, że analog insuliny stanowi Asp^B28-insulina ludzka, a stężenie protaminy wynosi od około 0,27 do około 0,32 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny.
8. Preparat według zastrz. 6, znamienny tym, że zawiera około 0,3 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny, około 0,7% wagowych cynku w przeliczeniu na analog insuliny, około 1,7 mg/ml m-krezolu, około 0,7 mg/ml fenolu, około 16 mg/ml gliceryny i około 3,78 mg/ml dwuzasadowego fosforanu sodu.
9. Preparat farmaceutyczny do podawania pozajelitowego, znamienny tym, że zawiera mieszaninę rozpuszczalnego analogu insuliny i kryształów analog insuliny-protamina, przy czym stosunek wagowy ilości obu składników wynosi około 25:75 do 75:25 rozpuszczalnego analogu insuliny do kryształów analogu insuliny z protaminą, a analogiem insuliny jest ludzka insulina, w której Pro w pozycji B28 jest odstawiona Asp lub Lys, oraz Lys w pozycji B29 jest ewentualnie podstawiona Pro, od około 0,2 do około 1,5 mg protaminy na 100 IU analogu insuliny, od około 0,35 do około 0,9% wagowych cynku na analog insuliny od około

183 284

1,0 mg/ml do około 6,0 mg/ml pochodnej fenolowej; z zastrzeżeniem, że gdy insuliną jest Asp^B28-insulina ludzka, stężenie protaminy jest niższe niż 10% wagowych analogu insuliny.
10. Preparat według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera rozpuszczalną Lys^B28-Pro^B29-insulinę ludzką i kryształy Lys^B28-Pro^B29 - insulna ludzka - protamina.
11. Preparat według zastrz. 10, znamienny tym, że stosunek wagowy ilości obu składników wynosi 50:50, 75:25 lub 25:75.
12. Sposób wytwarzania kryształów Lys^B28-Pro^B29-insuliny ludzkiej z protaminą znamienny tym, że łączy się wodny roztwór Lys^B28-Pro^B29-insuliny ludzkiej w stanie heksamerycznym oraz roztwór protaminy, w temperaturze od około 8°C do około 22°C, przy czym wodny roztwór zawiera Lys^B28-Pro^B29-insulinę ludzką od około 0,35 do około 0,9% wagowych cynku na analog insuliny oraz pochodną fenolową przy pH od około 7,1 do około 7,6, a roztwór protamino wy zawiera protaminę przy pH od około 7,1 do około 7,6, tak że końcowe stężenie protaminy wynosi od około 0,27 do około 0,32 mg na 100 IU analogu insuliny.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stosuje się temperaturę 15°Ć, stężenie cynku od około 0,7 do około 0,9% wagowych na analog insuliny, a stężenie protaminy wynosi 0,3 mg na 100 IU analogu insuliny.
14. Sposób wytwarzania kryształów Asp^B28-insuliny ludzkiej z rpotaminą znamienny tym, że łączy się wodny roztwór Asp^B28-insuliny ludzkiej w stanie heksamerycznym oraz roztwór protaminy, w temperaturze od około 13°C do około 17°C, przy czym wodny roztwór zawiera Asp^B28-insulinę ludzką od około 0,35 do około 0,9% wagowych cynku na analog insuliny oraz pochodną fenolową przy pH od około 7,1 do około 7,6, a roztwór protaminowy zawiera protaminę, ma odczyn pH od około 7,1 do około 7,6, tak że końcowe stężenie protaminy wynosi od około 0,27 do około 0,32 mg na 100 IU analogu insuliny.

* * *