CN100347301C - 无选择标志重组基因的菌株,得到这些菌株的方法及应用 - Google Patents

无选择标志重组基因的菌株,得到这些菌株的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了无选择标志系统，其可用于将遗传修饰导入细菌、酵母和真菌中。该系统可被应用于在所指定之宿主的基因组中导入或删除所需基因而没有留下不需要的DNA，即如于选择转化株的选择标志或用于克隆的其他DNA。以这种方式已发展了只含有已在预期的染色体位点被导入之所需基因的菌株。相类似的，所需DNA片段已被删除或在预期位点被置换。

Description

无选择标志重组基因的菌株，得到这些菌株的方法及应用
本发明公开了无选择标志基因的重组体菌株，其制得这些菌株的方法及它们的应用。另外，还涉及使用本发明的方法进行菌株改良。
重组DNA技术的应用引起了越来越多的社会关注。重组DNA技术的有前途的应用领域之一是菌株改良。从发酵生产过程的早期开始就已要求改善用于生产之菌株的生产能力。
有关工业上使用的微生物的传统菌株改良程序主要是基于随机诱变然后进行选择。已对诱变方法作过广泛的描述；其中包括使用紫外光、NTG或EMS作诱变剂。例如在“Biotechnology：a comprehensive treatise in 8 Vol，”VolumeI，Microbialfundamentals，Chapt，5b，Verlag Chemie GmbH，Weinheim，Ger-many中就已深入描述过这些方法。
选择方法一般是围绕着适当的检测法而建立的，并且在区别野生型和突变型菌株中是很重要的。
已经很清楚，这些传统方法改良菌株的潜力很有限。一般说来，连续几次改良只能很小量地增加所需产物的产率。这种情况至少一部分原因是由于所用诱变方法的随机特性。与预定的突变不同，这些方法也可引起并不期望的以及对菌株的其它特性产生消极影响的突变。
鉴于传统方法的这些缺点，使用可造成明显改善的重组DNA方法应是受到欢迎的。一般说来，在菌株改良程序中使用的重组DNA方法旨在提高所需基因产物的表达水平。
基因产物可以是其本身有价值的蛋白质；另一方面，所编码的基因产物也可能作为合成其他产物的调节蛋白质。
可将所需的蛋白质编码基因的多个拷贝导入特定宿主生物体中而改善菌株。但也可能经导入调节基因来提高表达水平。
使用载体材料导入所需的基因。这些载体可以是质粒、柯氏质粒或噬菌体。载体可以是能够表达基因的，这种情况下一般载体可以自身复制。但载体也可以只是能够整合的。载体的另一种特征是，当不能很容易基于已改变的表型特征选择表达产物时，可以在载体中装配易于进行选择的标志。
尚没有从所有已知的微生物中分离出载体，这是因为有的生物体中未发现有载体，或者是得自其他生物体的可利用的载体经很小或未加修饰即可使用。这种情况同样适用于选择标志基因。
目前已对广泛使用和继而传播特定标志基因产生了争论。这主要是由于发现使用抗生素选择标志可造成不期望的已形成抗生素抗性之菌株的扩散。这就要求继续开发新的以致更强有力的抗生素。
因此，在大批量生产中使用不含抗生素抗性基因和尽可能少的外来DNA的重组体微生物这一总的趋势是不足为奇的。
理想的是，被转化的微生物将只含有所需基因、其片段或修饰形式，以及尽可能少的或完全没有用于克隆之DNA剩余部分。
本发明公开了可以容易地从重组体宿主生物体中再次被删除的选择标志基因。所说标志基因的删除是基于优势选择。
该标志可被用于如细菌、丝状真菌和酵母等多种生物体中。
本文所用选择标志的有利活性是基于下列两步骤原理：
a)将基因整合到宿主生物体的基因组中并选择重组体细胞，
b)在底物上培养被转化的细胞，由标志基因编码的活性将底物转化成对细胞有致死性的产物。
所选择的细胞将是重组的并且缺失了选择标志基因。
总的说来，本发明公开了具有基因组修饰的动物或植物细胞以及微生物，特征在于使用amdS基因或由之衍生的cDNA导入改变。
可按这种方式使用的选择标志的一个例子是乙酰胺酶基因。该基因较好是可得自丝状真菌，更好是得自曲霉属真菌，最好是得自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。
本发明进一步显示使用乙酰胺酶(amdS)基因作为标志，在选择的宿主生物体中导入、缺失或修饰所需的异源或同源基因或DNA片段。然后删除amdS基因。较好的是位点特异性地导入amdS和所需的基因。
本发明公开了包含下列组分的载体：
a)预定导入宿主基因组中的所需DNA片段，
b)有或没有一个能使载体整合(位点特异性地)到宿主菌株基因组中的DNA序列，
c)在DNA重复序列间的编码乙酰胺酶的基因(如得自构巢曲霉的amdS基因)。
本发明进一步公开了用所说的载体转化的宿主生物体。
本发明进一步公开了无选择标志基因的重组体微生物。
具体地说，本发明公开了含有位点特异性地导入之基因的不存在任何进一步的外来DNA的生物体。因此，此方法也适于重复修饰宿主基因组，如在预定的座位相继导入多个基因拷贝。
本发明提供了得到无选择标志基因之重组体菌株的方法，该方法包括下列步骤：
a)将所需DNA片段和选择标志导入菌株的基因组中，
b)选择所得转化体，
c)较好使用选择标志侧翼重复序列间的内部重组缺失选择标志，
d)基于没有选择标志进行反选择。
虽然这是得到无选择标志基因之重组体菌株的优选方法，但本发明还提供了该方法的改进方法，例如所需的DNA片段和选择标志可存在于共转化的两个不同的DNA分子上。选择标志不一定整合到菌株的基因组中，但可以存在于可被加工处理的附加基因DNA分子。
本发明进一步举例说明了可从被转化生物体的基因组中缺失该标志基因而没有留下克隆所使用的DNA。
本发明公开了来自曲霉属微生物的amdS基因在细菌和酵母中作为标志的应用。
本发明还公开了使用amdS基因从“宿主”生物体的染色体中缺失所需的基因。这些改进技术可应用于丝状真菌、酵母和细菌。在特定实施方案中，使用了下列种属的菌株：曲霉属、木霉属、青霉属、芽孢杆菌属、大肠杆菌、克鲁维酵母属和酵母属。
本发明的方法提供了用同一或其他载体重复进行此过程而得到的具有基因组修饰的重组体菌株。
附图说明
附图中使用下列缩写符号：
限制性酶和限制位点：
A＝ApaI；Ba＝BamHI；B＝BglII，Bs＝BssHII；E＝EcoRI；H＝HindIII；K＝KpnI；N＝NdeI；N＝NotI；Ps＝PstI；P＝PvuII；Sa＝SalI，Sc＝ScaI；S＝SmaI；Sn＝SnaBI；Spe＝SpeI；Sp＝SphI；Ss＝SstII；Xb＝XbaI；X＝XhoI。
其他：T·＝LAC4终止子序列。
图1：显示质粒pamdS-1的限制图。该质粒含有来自构巢曲霉之amdS基因的cDNA。
图2：图解显示使用置换载体pGBDEL4L从来自黑曲霉的glaA座位缺失标志基因。基因置换载体pGBDEL4L的基本部分含有处于重复序列(glaA基因的3′非编码区域)间之gpdA启动子控制下的amdS基因。
图3-9图解显示如实施例1中进一步描述的pGBDEL4L的构建途径。
图10：
A.用32P标记的glaA启动子片段和木聚糖酶探针探查的pGBDEL4L转化体#41(泳道1)、#42(泳道2)、#43(泳道3)和#19(泳道4)及宿主菌株黑曲霉CBS513.88(泳道5)的KpnI消化产物，以及pGBDEL4L转化体#41(泳道6)、#24(泳道7)、#23(泳道8)、#19(泳道9)和宿主菌株黑曲霉CBS513.88(泳道10)的BamHI消化产物。
B.用32P标记的glaA启动子片段和木聚糖酶探针探查的GBA-102(泳道1)和氟乙酰胺选择后的GBA-102菌株：GBA-107(泳道2)与GBA-108(泳道3)的KpnI消化产物，以及GBA-102(泳道4)和氟乙酰胺选择后的GBA-102菌株：GBA-107(泳道5)与GBA-108(泳道6)的BamHI消化产物。
图11：
A.图解表示黑曲霉CBS 513.88中野生型glaA座位之BamHI和KpnI片段长度。
B.图解表示转化体#19(＝GBA-102)中截短之glaA座位的BamHI和KpnI片段长度。
C.图解表示除去amdS基因后的GBA-102转化体(＝GBA-107和GBA-108)中截短之glaA座位的BamHI和KpnI片段长度。
图12：
A.图解显示glaA基因整合到黑曲霉GBA-107的截短之glaA座位的3′非编码区中。
B.显示侧接amdS基因之3′glaA重复序列间内部重组的结果。
图13-24：图解显示如实施例2中进一步描述的整合载体pGBGLA30的构建途径。
图25：用32P标记的glaA启动子片段探测的pGBGLA30转化体#107-9(泳道1)、#107-7(泳道2)和107-5(泳道3)、宿主菌株黑曲霉GBA-107(泳道4)和亲代菌株黑曲霉CBS 513.88(泳道5)的BglII消化产物，以及pGBGLA30转化体#107-9(泳道6)、#107-7(泳道7)和#107-5(泳道8)、宿主菌株黑曲霉GBA-107(泳道9)和亲代菌株黑曲霉CBS 513.88(泳道10)的KpnI消化产物。
图26：
A.图解表示黑曲霉CBS 513.88中野生型glaA座位的KpnI和BglII片段长度。
B.图解表示黑曲霉GBA-107中截短之glaA座位的KpnI和BglII片段长度。
C.图解表示如在转化体#107-5(＝GBA-119)和#107-9(＝GBA-122)中具有整合到glaA3′非编码区内之单一拷贝pGBGLA30的截短之glaA座位的KpnI和BglII片段长度。
D.图解表示除去amdS基因后之GBA-119和GBA-122转化体(＝GBA-120、GBA-121、GBA-123和GBA-124)中截短之glaA座位的KpnI和BglII片段长度。
图27：
A.用32P标记的3″glaA非编码片段探测的黑曲霉CBS 513.88(泳道10)、GBA-107(泳道9)、GBA-119(泳道8)和氟乙酰胺选择后之GBA-119菌株：#AG5-7(＝GBA-120)(泳道5)、#AG5-5(GBA-121)(泳道6)及#AG5-6(泳道7)；GBA-122(泳道4)和氟乙酰胺选择后之GBA-122菌株：#AG9-1(＝GBA-123)(泳道3)、#AG9-2(泳道2)及#AG9-4(＝GBA-124)(泳道1)的BglII消化产物。
B.用32P标记的3″glaA非编码片段探测的黑曲霉CBS513.88(泳道10)、GBA107(泳道9)、GBA-119(泳道8)和氟乙酰胺选择后的GBA-119菌株：#AG5-7(＝GBA-120)(泳道5)、#AG5-5(＝GBA-121)(泳道6)及#AG5-6(泳道7)；GBA-122(泳道4)和氟乙酰胺选择后的GBA-122菌株：#AG9-1(＝GBA-123)(泳道3)、#AG9-2(泳道2)及#AG9-4(＝GBA-124)(泳道1)的KpnI消化产物。
图28：图解显示pGBGLA53的构建途径。
图34：图解显示pGBamdS1的构建。
图35：图解显示pGBamdS2的构建。
图36：图解显示pGBamdS3的构建。
图37：图解显示pGBamdS5的构建。
图38：图解显示pGBamdS6的构建。
图39：图解显示pPTLAC4的构建，该质粒用于构建pGBamdS6。
图40：图解显示pGBamdS7的构建。
图41：用32P标记的LAC4启动子片段探查的乳酸克鲁维酵母(K.lactis)CBS 683(泳道1)、乳酸克鲁维酵母CBS2360(泳道2)、乳酸克鲁维酵母CBS 683/pGBamdS1转化体KAM-1(泳道3)、乳酸克鲁维酵母CBS 2360/pGBamS1转化体KAM-2(泳道4)以及氟乙酰胺选择后之KAM-1菌株(泳道5、6)的HindIII消化产物。
图42：
A.用32P标记的LAC4终止子片段探查的乳酸克鲁维酵母CBS683/pGBamdS3转化体(泳道1-3)的BamHI消化产物。
B.用32P标记的LAC4终止子片段探查的乳酸克鲁维酵母CBS683/pGBamdS5转化体(泳道1-5)和宿主菌株乳酸克鲁维酵母CBS683(泳道6)的BamHI消化产物。
图43：用32P标记的amdS片段探查的酿酒酵母(S.cerevi-siae)D273-10B(泳道1)和酿酒酵母D273-10B/pGBamdS5转化体(泳道2-8)的BamHI消化产物。
图44：用32P标记的LAC4终止子片段探查的乳酸克鲁维酵母CBS2360(泳道1)、乳酸克鲁维酵母CBS2360/pGBamdS6转化体(泳道6)和氟乙酰胺选择后之乳酸克鲁维酵母CBS2360/pGBamdS6转化体菌株(泳道2-5)的HindIII消化产物。
图45：芽孢杆菌质粒pBHA1的限制图。
图46：芽孢杆菌质粒pLNF的限制图。
图47：图解显示pGBamdS21的构建。
图48：图解显示pGBamdS22的构建。
图49：图解显示pGBamdS23的构建。
图50：图解显示pGBamdS25的构建。
图51：图解显示pGBamdS41的构建。
本发明公开了选择被转化宿主菌株之标记的应用。可在附加基因DNA载体上使用选择标志基因。但在本发明中，最好将标志基因整合到宿主菌株的基因组中。本发明选择标志的优点在于它是非抗生素优势选择标志。本发明选择标志的另一个优点是它能够很容易地从被转化之宿主生物体中缺失。因此本发明的选择标志是显性的，并且是双向选择标志。就我们所知，它是双向的并且在两个方向呈显性的仅有的选择标志。
在本说明书中，我们使用了术语“选择标志基因”，不管它是否为真正的基因还是由之衍生的cDNA，都是指编码呈功能形式之标志蛋白质的DNA。可根据宿主生物体和预期的拼接问题来使用该基因或cDNA。
在本发明说明书中我们使用术语“载体”是指可以导入选择的宿主内的任何DNA分子，而不管该载体是整合到宿主细胞的基因组中还是保留附加基因。载体含有在选择的宿主中有功能的可选择标志基因，或者可与含有这样一个选择标志基因的另一DNA分子共转染。
本说明书中使用的术语“所需的异源或同源基因或DNA片段”是指可得自宿主菌株或其他种属生物或菌株的DNA片段。所需的DNA片段可含有任何遗传元件、其部分或其组合，如基因(编码部分或全部座位)、cDNA、启动子、终止子、内含子、信号序列、DNA结合蛋白质的任何调节DNA序列或识别序列。该片段也可以是已经过修饰的DNA序列，即含有一个或多个核苷酸改变(如插入、缺失、取代)。
本说明书中还使用了所需基因或DNA片段的“导入”这一术语。该术语是指在选择的宿主细胞中插入、缺失或取代所需的DNA序列。
用于本发明的术语“遗传修饰”是指在所选择的宿主细胞中对DN A序列的任何修饰，它是较好借助转化或共转化将上述所需DNA片段之一导入宿主细胞内的结果。
一般说来，所有这些遗传修饰都可以使用本发明的继后缺失选择标志基因的方法来实现。由于包括这样一种遗传修饰的重组体菌株不含选择标志基因这一事实，所以可以重复本发明的方法，从而可将上文提示的修饰结合在重组体菌株中。最后，可以重复使用本发明的方法，以致可通过缺失或失活相应的遗传元件而从所得到的重组体菌株除去了所有不需要的活性，并通过继后在所需的和限定的座位上以所需的拷贝数导入相应的所需DNA片段而使之含有所需的活性。
构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因允许构巢曲霉在作为单一氮源的乙酰胺上生长。对于没有可能性或只有很有限的利用乙酰胺作为单一氮源之能力的微生物，原则上可使用乙酰胺酶基因作为选择标志，条件是细胞摄入乙酰胺。amdS基因已在曲霉属(Kelly and Hynes(1985)EMBOJ.4，475-479；Christensen etal.(1988)Bio/technology 6，1419-1422)、青霉属(BeriandTurner(1987)Curr，Genet.11，639-641)和木霉属(Pentillaet al.(1987)Gene 61，155-164)中用作标志基因。
本发明第一次公开了构巢曲霉的amdS基因在丝状真菌以外的生物体中作为选择标志的应用。公开了该选择标志在细菌和酵母中的应用。具体地说，已证明其可用于酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、枯草芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌及大肠杆菌中。从所公开的该选择标志在选自如真菌、酵母和细菌等各类生物体之种中的可应用性角度看，预期该标志也可应用于这些生物体的其他种属。因此该标志的应用不只限于已公开的这些种。
得自构巢曲霉的amdS基因能够将乙酰胺转化成氨和乙酸。这一性质使构巢曲霉能在含有作为单一N源或C源之乙酰胺的培养基上生长。
amdS基因的另一个性质是它也可将氟乙酰胺转化成氨和氟乙酸。但氟乙酸是对细胞有毒性的。这一性质形成了本发明之另一个方面即生产无标志基因重组体菌株的基础。转化氟乙酰胺的性质得以反向选择被转化的细胞。将amdS基因导入宿主菌株中并通过同源重组整合到基因组中。在含有作为唯一N源之乙酰胺的培养基上选择被转化的菌株。然后使被选择的菌株生长在含有氟乙酰胺和作为唯一N源之尿素(或其他较好限定的N源)的培养基上。存活菌株将是缺失了amdS基因的。
本发明使用构巢曲霉amdS基因作为乙酰胺标志基因。可由得自其他来源的乙酰胺酶提供由构巢曲霉amdS基因编码之乙酰胺酶的相关性质，即将乙酰胺水解成氨和乙酸盐的能力以及从氟乙酰胺释放氟乙酸的能力。因此乙酰胺酶标志基因的使用不只限于构巢曲霉amdS基因，而可包括编码功能性乙酰胺酶的任何DNA序列。
标志缺失的频率随着基因进行染色体内同源重组的能力增加而显著增加。为此最好将amdS基因置于DNA重复序列之间。这些重复不一定存在于载体中，而也可能由单股交换整合产生。另外，可以删去侧接重复序列并依靠其他机制除去或失活标志基因。但在此种情况下，其结果不易预见，并可能不会除去而只是失活标志基因。
可按这种方式构建载体，即在缺失标志基因后，在宿主菌株的染色体中不保留外部的外来DNA(除有用DNA外)。本发明公开了包括下列组分的载体：
a)预定整合到宿主基因组中的所需DNA片段，
b)可能存在的能使载体整合(位点特异地)到宿主菌株之基因组中的DNA序列，
C)在DNA重复序列间的编码乙酰胺酶的基因(如来自构巢曲霉的amdS基因)。
当预定整合到宿主基因组中的DNA片段和可选择的标志基因(如乙酰胺酶基因)存在于两个不同的被共转化的DNA分子上时-这种情况下含有可选择标志的DNA分子并不一定整合到宿主基因组中而可能存在于可被纠正的附加基因DNA分子上——可获得同样的结果。
如果期望发生位点特异性(或更好是座位特异性)整合，则使用上面b)中提到的用于整合的序列。然而，如果这一序列不存在于载体中则可整合到基因组内。这种情况并不影响删除选择标志基因的能力。
可按各种方式将上述显性反选择用于开发工业生产菌株。由于改良的生产菌株常常是二倍体或多倍体，所以在开发这些菌株中使用显性选择标志是特别有利的。
用于整合amdS基因的载体较好含有另一个有用基因。因此本发明能够利用amdS基因作为标志使所需的外来或同源基因或DNA元件整合到选择的宿主生物体中。继后删除amdS基因。最好位点特异性地导入amdS和所需的基因或DNA元件，然后删除amdS基因。
具体地说，本发明公开了含有位点特异性地导入的基因而不存在任何其他外来DNA的生物体。本发明用于在预定的基因组座位整合所需基因或DNA元件的多个拷贝。
本发明提供了得到无选择标志基因之重组体菌株的方法，该方法包括下列步骤：
—通过掺入到表达暗盒中的序列与宿主染色体上的序列间的同源重组整合所需的基因或DNA元件及选择标志，
—使用显性的选择标志基因进行选择，
—使用选择标志基因侧接区域缺失选择标志基因，
—基于没有选择标志基因进行选择(反选择)。
本发明进一步显示，可从被转化生物体的染色体中删除该标志基因而没有留痕迹即用于克隆的DNA。此外，本发明还显示，当所需基因或DNA元件和选择标志存在于两个被共转化的不同DNA分子上时，可得到相同或相似的结果。
最后，本发明公开了使用amdS基因从“宿主”生物体的染色体中删除所需的基因。
从上文的描述可以看出，本发明特别适合于，但又不只限于克隆和表达编码食品、饲料或医药上应用之蛋白质的基因，或参与生物合成抗生素及其他生物学活性化合物，即受到严格登记限制之重组蛋白质和/或宿主生物体的基因。
这类蛋白质的例子是本领域中已知的，并包括凝乳酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、纤维素酶以及半纤维素、细胞素和其他药物蛋白质等。
利用同样方法删除编码影响所需蛋白质之生产水平的基因，而同样没有在基因组中留下标志基因。这些蛋白质包括有消化所需产物之活性的蛋白酶，所说的产物可在宿主菌株得以高表达并因此减小了产生和/或筛选所需蛋白质的可能性。删除特定基因的优选方法应使用含有下列元件(以5′至3′次序)的DNA构建体：被删除之基因的5′端序列、与被删除基因的3′序列直接融合的序列、之后是下游的功能性选择标志基因(特别是乙酰胺酶基因)、再后是下游被删除之基因的3′侧序列。在这种情况下，选择待删除之基因的两3′序列，以使它们形成侧接选择标志基因的重复序列。转化该DNA构建体并继而用在待删除基因的5′和3′序列中有交换点的DNA构建体置换待删除基因的染色体拷贝，而导致给定基因的缺失。然后在侧接选择标志基因之重复区间进行染色体内重组并反选择这些重组体，最后产生特定基因被删除的无选择标志的菌株。可以构建用来进行这一缺失的DNA构建体，以致使在带有该缺失的菌株中没有留下外来DNA或其他遗传修饰的痕迹。
本发明公开了无选择标志基因的重组体微生物。这样的微生物可以是在使用所公开技术后含有所需基因之额外拷贝的(同源的或异源的)生物体。可相继应用同一技术一次又一次地再转化该微生物，以插入或删除相同或其他有用基因的附加拷贝。
该微生物的特征还在于它们具有以任何所需方式被删除或改变的预确定的基因。
使用本发明的方法有可能精细调节所需蛋白质的产生。这种可能性是基于可以容易地反复进行插入或删除。该方法有可能插入或删除预定数目的基因拷贝。因此能够以预定的量和所需的比例产生蛋白质。这一优点特别适用于生产蛋白质或酶的混合物。
鉴于已知乙酰胺酶基因能够在曲霉中转化作为唯一N源的乙酰胺，故表明乙酰胺酶基因很容易从被转化之曲霉的基因组中缺失。为此而将amdS基因克隆到直接重复区之间。原则上可利用任何允许内部重复的直接重复序列。在本发明实例中，这一点已通过在3′淀粉转葡糖苷酶(glaA)非编码DNA序列间克隆amdS基因得以证实。
已表明可在含氟乙酰胺和尿素(作为N源)的培养基上接种后整合并缺失amdS基因。
还进一步证明可从曲霉的基因组中删除淀粉转葡糖苷酶基因。构建一置换载体，其含有glaA启动子的一部分、在所有三个读码内包括终止密码子的合成DNA序列、在构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子控制下的来自构巢曲霉的amdS基因，且其中amdS基因侧接有3′glaA非编码序列。转化黑曲霉后，载体通过双股交换被整合从而有效地取代淀粉转葡糖苷酶基因。在选择amdS活性之后，将被转化的菌株铺敷在含氟乙酰胺和尿素的平皿上。经选择而得到其中amdS基因被删除的菌株。
该实例进一步说明使用amdS基因从曲霉属菌株之基因组中删除所需基因的可能性。可以按相似方法除去或修饰其他基因。
在进一步的实例中证明可将某基因在没有标志的预定位点插入基因组中。构建一含有黑曲霉glaA座位和侧接有两个3′glaA非编码重复序列之amdS基因的整合载体。，
表明该构建体整合于淀粉转葡糖苷酶座位处。在氟乙酰胺上选择后删除amdS基因。以这种方式在没有留下标志DNA的情况下将基因拷贝整合在特定座位。
上述实例证明本文所述方法可使本领域技术人员能够在预确定的座位整合或删除预定基因而没有留下选择标志DNA。
该方法可用于基因扩增和基因置换。
一个特别重要的应用是整合所需的基因。在传统的菌株改良之后，可在不丧失表达水平的情况下用新的有用基因的未受晕响的拷贝置换可能因传统菌株改良技术而受到不利影响的基因。
当使用已知不能在乙酰胺(作为唯一N源)上生长的其他真菌菌株时，可望用上述适用于曲霉属的系统获得同样的结果。就其他微生物来说，已描述了将amdS基因作为选择标志用于青霉属和木霉属真菌。此外，amdS基因甚至可用于虽然较差但仍可使用乙酰胺作为唯一N源的丝状真菌。在这种情况下，可选择培养基中由CsCl的包含物阻抑生长很差之被转化细胞的本底(Tilburn，J.et al.(1993)Gene，26，205-221)。因此预期该系统可总地适用于丝状真菌。
在本申请的一个实例中，令人惊奇地证明构巢曲霉amdS基因可作为选择标志被用于乳酸克鲁维酵母。在该实施例中，显示两个不同的乳酸克鲁维酵母菌株不能生长于作为单一N源的乙酰胺上。将此两个乳酸克鲁维酵母菌株铺敷在YCB培养基上，该培养基是
a)完全的但没有N源，
b)同a)但有乙酰胺，
c)同a)但有硫酸铵。
已表明菌株不能生长在上述b)培养基上但可生长在c)培养基上。因此只要乙酰胺被酵母细胞摄入并且amdS基因可在乳酸克鲁维酵母中受到阻遏，则该系统也可至少作为选择标志应用于酵母中。使用氟乙酰胺进行反选择必须符合某些其他要求。当被乙酰-CoA合成酶激活时，氟乙酸盐是有毒性的。因此进行也对amdS+酵母有效的氟乙酰胺反选择时，其先决条件是
1)氟乙酰胺应对amds-酵母没有毒性，
2)酵母细胞壁和胞质膜应能透过氟乙酰胺，且
3)乙酰CoA合成酶应是有活性的。
将amdS基因克隆到乳酸克鲁维酵母中以对此要求进行检验。
为避免构巢曲霉amdS基因在乳酸克鲁维酵母中的潜在拼接问题，按实验部分所述方法克隆来自构巢曲霉的amdS cDNA。
然后在含有另一标志(磷酸转移酶-G418)的载体中将amdS克隆到酵母启动子(LAC4、ADHI、KIEF)的下游。实施例8中描述了这一克隆方法。使用G418标志选择含有G418标志和amdS基因的载体，然后用于完善对amdS+表型进行选择的最佳选择条件。
在本发明的另一实例中显示了对乳酸克鲁维酵母的直接选择，并在实施例11中显示了对酿酒酵母的直接选择。
继后证明可将反选择用于被转化的酵母菌株以除去amdS基因。
该amdS基因系统适用于酵母中基因的无标志基因插入和无标志基因缺失。
在进一步的具体实例中，从乳酸克鲁维酵母中删除乳糖酶基因，而在实施例14中则描述了将凝乳酶基因的拷贝插入乳酸克鲁维酵母基因组中。
本文所述用来插入或删除的基因只是作为实例给出的。可使用其他基因或DNA元件实施这一技术。如前所述，可对用于插入或删除的DNA片段，即基因、启动子序列、调节序列等进行突变。在所有情况下，均可能在预定的基因组位点并以所要求的数目插入或删除这些序列，而没有留下标志基因。
有证据表明在其他酵母菌株中使用该系统的可行性。
作为在细菌中使用本发明之系统的第一个步骤，实施例15中显示枯草芽孢杆菌和大肠杆菌不能在作为唯一N源的乙酰胺上生长。
实施例16描述了已构建的用于芽孢杆菌和大肠杆菌的载体。
实施例17和18中证明amdS基因可作为选择标志有效地用于芽孢杆菌和大肠杆菌，而实施例19则证明细菌amdS+转化体的氟乙酰胺反选择。
本发明之系统的优点是多方面的。最显著的优点是：-证明amdS系统是普遍适用的(用于植物细胞、动物细胞、酵母、细菌和丝状真菌等)，而只要求所研究的宿主不能在作为唯一C源或N源的乙酰胺上生长或生长很差，但能够分别利用乙酸盐和氨作为唯一C源或N源。
—amd S系统代表了仅有的双向和显性选择系统。这一特性对于在多倍体或非整倍体菌株(天然分离物和/或工业菌株常常是这样的菌株)中应用是极其方便的。
—由于所需基因已被整合到明确限定的座位，所以在经过传统的菌株改良后，可以通过基因置换很容易地用未突变的拷贝取代所需基因的已突变拷贝。因此可在不影响表达水平的情况下用未突变基因取代这些基因。
—由于可在明确限定的和非随机的位点导入多重整合这一能力，所以可以推测在基因扩增后不会产生不期望的特性。
—可由本系统克服逐步引起关注的各种选择标志在环境中释放的问题。在导入所需基因或遗传修饰后的菌株的生产中，不需存在选择标志基因或其他不必要的或不期望的DNA序列。
                        实验
通用分子克隆技术
在本文所述的实施例中，按已有文献(Sambrook et al.(1989)“Molecular Cloning：a Laboratory manual”，ColdSpring Harbour Laboratories，Cold Spring Harbour，NewYork；Innis et al.(eds.)(1990)“PCR protocols，a guideto methods and applications”Academic Press，San Diego)中所述完成核酸的分离和纯化、核酸电泳、核酸的酶促修饰、裂解和/或扩增、大肠杆菌的转化等标准分子克隆技术。按照制造商提供的使用手册分别在Applied Biosystems 380B DNA合成仪和373A DNA测序仪上进行寡脱氧核苷酸的合成和DNA序列分析。
黑曲霉的转化
按照Tilburn，J等人(1983，Gene 26，206-221)和Kelly，J.&Hynes，M.(1985，EMBO J.，4，475-479)所述方法进行对黑曲霉的转化，所作改动是：
—在曲霉属基本培养基中，于30℃用300rpm的旋转振荡器将孢子培养16小时。曲霉基本培养基由下列成分组成：每升含69NaNO3、0.52gKCl、1.52gKH2PO4、1.12ml.4MKOH、0.52gMgSO4·7H2O、10g葡萄糖、1g酪蛋白氨基酸、22mgZnSO4·7H2O、11mgH3BO3、5mgFeSO4·7H2O、1.7mgCoCl2·6H2O、1.6mgCuSO4·5H2O、5mgMnCl2·4H2O、1.5mgNa2MoO4·2H2O、50mg EDTA、22mg核黄素、2mg盐酸硫胺素、2mg烟酰胺、1mg盐酸吡哆醇、0.2mg泛酸、4μg生物素、10ml青霉素(5000IU/ml)/链霉素(5000UG/ml)溶液(Gibco)。
—只使用Novozym 234(Novo Industri)(无解螺旋酶)形成原生质体；
—原生质体形成(60-90分钟)后，加入KC缓冲液(0.8MKCl、9.5mM柠檬酸，pH6.2)至45ml体积，并在摆动桶式转子中，以2500g在4℃下将原生质体悬浮液离心10分钟。将原生质体重新悬浮在20ml KC缓冲液中。然后加入25ml STC缓冲液(1.2M山梨醇、10mM Tris-HCl pH 7.5、50mM CaCl2)并在摆动桶式转子中以2500g在4℃下将原生质体悬浮液离心10分钟，
在STC缓冲液中洗涤并以108个原生质体/ml的浓度重新悬浮在STC缓冲液中；
—向200μl原生质体悬浮液中加入在TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5，0.1mM EDTA)中体积为10μl的DNA片段，然后再加入100μl PEG溶液(20％PEG4000(Merck)、0.8M山梨醇、10mM Tris-HCl pH 7.5、50mM CaCl2)；
—在室温下将DNA-原生质体悬浮液保温10分钟后，缓慢加入1.5ml PEG溶液(60％PEG 4000(Merck)、10mM Tris-HClpH 7.5、50mM CaCl2)，并反复混合试管内容物。室温下保温10分钟后，用5ml STC缓冲液稀释该悬浮液，颠倒混合并在室温下以2000g离心10分钟。将原生质体轻轻悬浮在1ml1.2M山梨醇中并铺敷在由不含核黄素、盐酸硫胺素、烟酰胺、盐酸吡哆醇、泛酸、生物素、酪蛋白氨基酸和葡萄糖但含有10mM乙酰胺(作为唯一氮源)、1M蔗糖的曲霉基本培养基组成的，用2％细菌学琼脂#1(Oxoid，England)固化的选择性再生培养基上。于30℃下生长6-10天后，复制平板培养在其中含有以2％葡萄糖代替蔗糖并以1.5％琼脂糖代替琼脂之曲霉选择性再生培养基的选择性乙酰胺平皿上。于30℃生长5-10天后分离单个转化体。
米曲霉(A.oryzae)的转化
按照Christensen，T.等人在欧洲专利申请0238023A2中描述的方法进行米曲霉的转化。
reesei木霉(T.reesei)的转化
按照Penttilla M.，Knowles，J.(1987，Gene 61，155-164)描述的方法进行reesei木霉的转化。
产黄青霉(P.chrysogenum)的转化
使用Ca-PEG介导的原生质体转化方法。按照Gouka等人(J.of Biotechnology 20(1991)，189-200)所述方法进行原生质体的制备和产黄青霉的转化，所作改动包括：
—转化后，将原生质体铺敷在由曲霉基本培养基组成的，用1.2M蔗糖渗压稳定的，含0.1％乙酰胺作为唯一氮源并用1.5％细菌学琼脂#1(Oxoid，England)固化的选择性再生培养基平皿上。
—于25℃保温5-8天后出现转化体。
乳酸克鲁维酵母(K.lactis)的转化
使用Ito，H.等人(1983，J.Bacteriol.153，163-168)所述的乙酸锂方法转化乳酸克鲁维酵母，其中作了如下改动：
—取OD610在0.5和1.0之间的乳酸克鲁维酵母培养物进行转化。
—对被转化细胞悬液进行5分钟热休克处理后，加入1mlYEPD/YNB(1％酵母浸膏、2％细菌蛋白胨、2％葡萄糖和0.17％YeastNitrogen Base w/o氨基酸(YNB；Difco))，并将细胞悬液在振荡保温器中30℃保温150-180分钟。
—经上述保温(30℃下进行150-180分钟)后，在室温下将细胞悬液以2000g离心5分钟并铺敷在用2％细菌琼脂(Difco)固化的YEPD/G418双层培养基上。按下述方法制备YEPD/G418双层平皿：在铺敷细胞悬液前10分钟，将没有G418的15ml YEPD琼脂(1％酵母浸膏、2％细菌蛋白胨、2％葡萄糖，用2％细菌琼脂(Difco)固化)倒在含50μg G418/ml的15ml YEPD琼脂上。如此得到在抗生素散布后含25μg G418/ml的YEPD/G418双层平皿。在使用菌株乳酸克鲁维酵母CBS683或CBS 2360的情况下，YEPD/G418双层平皿分别含有25μg G418/ml或100μg G418/ml。
从曲霉、木霉、青霉及酵母中分离DNA
按照Yelton等人(1984，Proc，Natl.Acad，Sci.81，1470-1474)所述方法从曲霉和木霉中分离DNA。
按照Kolar等人(Gene 62(1988)，127-134)所述方法从青霉中分离DNA。
按照Fujimura和Sakuma(1983，Biotechnology 14，538)所述方法从乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母中分离DNA。
芽孢杆菌转化和DNA分离
按照Brom((1990)“Plasmid”，Molecular Biological Me-thods for Bacillus，Harwood，CR and Cutting，SM，eds.，series Modern Microbiological Methods，John Wiley & Sons，Chichester，UK)所述方法转化不同种的芽孢杆菌并从这些菌种中分离质粒或染色体DNA。
使用感受态细胞进行枯草芽孢杆菌BS-154(CBS 363.94)的转化并使用原生质体进行地衣形芽孢杆菌T5(CBS 470.83)的转化。新霉素选择时所用浓度为20μg/ml。对枯草芽孢杆菌进行乙酰胺选择时使用其中酪蛋白氨基酸和酵母浸膏被20mM乙酰胺取代的基本琼脂培养基。对地衣形芽孢杆菌转化体进行乙酰胺选择时，使用其以20mM乙酰胺取代硫酸铵的原生质体再生培养基。
amdS选择标志的去除
在涉及曲霉属、木霉属和青霉属的大多数实施例中，将amdS标志基因克隆在由淀粉转葡糖苷酶基因之3′非编码区的一部分组成的重复序列之间。经侧接amdS选择标志之3′glaA非编码重复序列间的内部同源重组，或通过单股交换过程进行整合而产生的重复序列间的同源重组除去amdS选择标志。使细胞生长在含氟乙酰胺的平皿上，借以选择已失去了amdS选择标志的细胞。包藏amdS基因的细胞可代谢氟乙酰胺而产生铵和对细胞有毒性的氟乙酸盐。
在从曲霉属转化体中除去amdS标志时，将这些转化体的孢子铺敷在其中以32mM氟乙酰胺和5mM尿素代替10mM乙酰胺，以1.1％葡萄糖代替蔗糖并将细菌学琼脂#1(Oxoid，England)浓度由2％改为1.1％的上述选择性再生培养基上。35℃下生长7-10天后收获单个菌落并铺敷在0.4％马铃薯右旋糖琼脂(Oxoid，England)上。在从木霉属转化株中除去amdS标志的情况下，将这些转化体的孢子铺敷在添加了10mM氟乙酰胺的非选择性基本培养基上(每升培养基含20g葡萄糖、5g(NH4)2SO4、15g KH2PO4、0.6gMgSO4、0.6gCaCl2、0.005g FeSO4·7H2O、0.0016gMnSO4·H2O、0.0014g ZnSO4·7H2O、0.002g CoCl2；pH5.5)。30℃生长5-10天后，收获菌落并铺敷在0.4％马铃薯右旋糖琼脂(Oxoid，England)上。
在从青霉属转化体中除去amdS标志的情况下，将这些转化体的孢子铺敷在由含10mM氟乙酰胺和5％葡萄糖之曲霉菌基本培养基组成的，用1.5％细菌学琼脂#1(Oxoid，England)固化的选择性培养基平皿上。25℃下生长5-10天后出现抗性菌落。
检测黑曲霉转化体的葡糖淀粉酶产生能力
将孢子或菌丝体铺敷在按照提供者的说明制备的PDA(马铃薯右旋糖琼脂)平皿(Oxoid)上，以收集转化体和对照黑曲霉菌株的孢子。在30℃下生长3-7天后，向平皿中加入0.01％Triton X-100以收集孢子。用无菌水洗涤后，将大约107个所选择之转化体及对照菌株的孢子接种在含有20ml液体预培养基(每升培养基含30g麦芽糖·H2O、5g酵母浸膏、10g水解酪蛋白、1gKH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、3g Tween 80、10ml青霉素(5000IU/ml)/链霉素(5000UG/ml)溶液；pH5.5)的摇瓶内。使这些培养物在34℃下生长10-24小时。将5-10ml该培养物接种在100ml发酵培养基中，每升发酵培养基含有70g麦芽糊精(maltodextrines)、25g水解酪蛋白、12.5g酵母浸膏、1g KH2PO4、2gK2SO4、0.5gMgSO4·7H2O、0.03g ZnCl2、0.02g CaCl2、0.01g MnSO4·4H2O、0.3gFeSO4·7H2O、10ml青霉素(5000IU/ml)/链霉素(5000UG/ml)，并用4NH2SO4调到pH5.6。使这些培养物在34℃下生长5-10天。在培养期间的不同时间取样分析葡糖淀粉酶产生量。离心发酵液样品(10分钟，10,000g)并收集上清液。
将10μl在0.032M NaAc/HAC(pH4.05)中6倍稀释的培养物上清液样品与115μl加入0.032M NaAc/HAc(pH4.05)中的0.2％(W/V)对位硝基苯基α-D-吡喃葡糖苷(Sigma)一起保温以检测葡糖淀粉酶活性。室温下保温30分钟后加入50μl 0.3M Na2CO3并检测405nm波长的吸光率。以A405nm作为AG产生量的量度。
amdS cDNA的克隆
构巢曲霉amdS基因含有三个小的内含子(Corrick et al.(1987)Gene 53，63-71)。为了避免因这三个内含子在酵母中的不正确拼接和在细菌中拼接不足而引起的问题，我们使用了用于在酵母和细菌中表达的amdS cDNA。Corrick等人((1987)，Gene53，63-71)已描述了从构巢曲霉poly A+RNA制剂克隆amdS cDNA的方法。在此实施例中我们使用了用含有构巢曲霉amdS基因之质粒pAF2-2S(Van Hartingsveld et al.(1983)Gene 127，87-94)的多个拷贝转化的黑曲霉NRRL 3135转化株#4。按照Auffray等人((1980)Eur.J.Biochem.107，303-314)改进的直接LiCl沉淀法分离总RNA。使黑曲霉孢子发芽并使之在添加了葡萄糖(作为碳源)和乙酰胺(作为唯一氮源)的基本培养基(Cove(1966)Biochem，Biophys.Acta 113，51-56)中37℃生长过夜。得到菌丝体后过滤干燥，然后用液氮冷冻并研碎。0℃下将所得粉末分散于3M LiCl、6M尿素中并于4℃保留过夜。以16,000g离心30分钟并用苯酚/氯仿/异戊醇(50∶48∶2)进行两次连续提取后得到总细胞RNA。用乙醇沉淀RNA并溶解在1ml 10mMTris-HCl(pH7.4)和0.5％SDS中。为进行polyA+选择，将总RNA样品于65℃加热5分钟，然后上Oligo(dT)纤维素柱。用含有10mM Tris-HCl(pH7.4)、0.5％SDS和0.5M NaCl的溶液洗几次后，经用10mMTris-HCl(pH7.4)和0.5％SDS洗脱收集polyA+RNA，并用乙醇沉淀。使用约5μgpolyA+mRNA作为模板，进行由Oligo(dT)引物引发的反转录。将反应混合物(50mM Tris-HCl pH7.6、10mMDTT、6mM MgCl2、80mM KCl、各0.2mM各种dNTP和0.1mg BSA/ml)与500单位小鼠MLV反转录酶(BRL)和75单位RNase抑制物(Promega)(终体积100μl)在37℃下保温30分钟。再加入200单位反转录酶并使反应继续进行30分钟。用氯仿提取混合物并在0.25M乙酸铵存在下用乙醇沉淀。在继后的聚合酶链反应(PCR)中使用第一股cDNA的该混合物作模板以扩增amdS cDNA。用基因组amdS序列设计在该PCR中用作引物的合成的寡核苷酸：
AB3100(SEQ ID NO：1)：
5′-CTAA TCTAGAATGCCTCAATCCTGAA-3′(从核苷酸-3到+16的amdS特异性序列，前面接有一个XbaI位点和4个附加核苷酸)。
AB3101(SEQ ID NO：2)：
5′-GACA GTCGACAGCTATGGAAGTCACCACA-3′(位于amdS终止密码子下游，从侧接有附加SalI位点之核苷酸1911至1884的amdS特异性序列)。
使用10％的cDNA混合物作模板和各0.1μg Oligo AB3100(SEQ ID NO：1)与Oligo AB3101(SEQ ID NO：2)作引物进行PCR反应。变性(100℃，7分钟)后加入1.3单位Taq-聚合酶，对反应混合物进行25次扩增循环(各次循环：94℃下2分钟，55℃下2分钟和72℃下3分钟)。在最后一次循环中延伸步骤较长(7分钟)以便合成全长片段。用XbaI和SalI消化所得的DNA片段并再克隆到pUC18的XbaI/SalI位点中。用pamdS-1消化所得质粒(参见图1)。对质粒pamdS-1的限制性酶切分析证实不存在内含子，而且外显子正确融合在amdS cDNA中。
                     实施例1
使用amdS基因删除无标志基因的黑曲霉基因
本实施例中，用通过双股交换同源重组整合到黑曲霉基因组中的置换载体转化黑曲霉，以取代黑曲霉中的基因组靶基因。置换载体包括与被侧接DNA重复序列之可选择标志基因破坏之靶座位同源的DNA区域。
本实施例中，使用质粒pGBDEL4L缺失glaA编码区和glaA启动子区的(远端)部分。该载体包含黑曲霉glaA基因组座位的一部分，其中glaA编码序列及glaA启动子序列的一部分被处于侧接有3′未转译之glaA序列(作为直接重复序列)的构巢曲霉glaA序列(作为选择标志)控制下的构巢曲霉amdS基因所取代。用该载体转化黑曲霉而由amdS标志基因直接置换glaA基因。对实验部分中所述的这些转化体进行氟乙酰胺反选择，将通过3′glaADNA重复序列间的内部重组过程适当地删除amdS标志基因，产生无标志基因ΔglaA重组体菌株，最后完全没有外来DNA序列(参见图2)。
对glaA基因置换载体pGBDEL4L的简要描述
基因置换载体pGBDEL4L含有黑曲霉淀粉转葡糖苷酶(glaA)启动子区的5′部分、在所有三个读码中提供终止密码子的16bp合成DNA序列、在3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpdA)启动子控制下，两侧接有3′glaA非编码序列的构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)基因。
pGBDEL4L的构建途径
为了获得最终缺失载体pGBDEL4L，首先衍生glaA座位的几个亚克隆。图3中给出了图解说明。黑曲霉的glaA座位是以前曾克隆并描述过的分子(EP 0463 706A1)。质粒pAB6-1在克隆到pUC19之HindIII位点中的15.5KbHindIII片段上含有来自黑曲霉的完整glaA座位(Yanisch-Perron et al.Gene 33(1985)，103-119，并可得自例如Boehringer Mannheim，Germany)。用EcoRI消化pHB6-1并经琼脂糖凝胶电泳分离恰在glaA基因上游的1.8KbEcoRI DNA片段，将其连接到用EcoRI消化的pUC19中，然后转移到大肠杆菌内并克隆该分子。所得质粒称为pAB6-3(图3A)。为了构建pAB6-1的另一个亚克隆即质粒pAB6-4，用HindIII和BglII消化pAB6-1。经琼脂糖凝胶电泳分离含有glaA启动子和glaA编码序列之一部分的4.6Kb大小的DNA片段，并连接到先已用HindIII和BamHI消化的pUC19中(图3B)。结果，经此克隆步骤而适当地破坏了pAB6-4中的BamHI及BglII位点。
接着，在用HindIII和EcoRI消化质粒pAB6-4并使用大肠杆菌DNA聚合酶充填5′粘性末端后，经琼脂糖凝胶电泳分离1.8KbglaA启动子DNA片段，并连接到用EcoRI部分消化的pAB6-3中，并用大肠杆菌DNA聚合酶处理产生平头，将连接混合物转移到大肠杆菌中进行分子克隆。所衍生的质粒(称为pAB6-31)含有3.6KbglaA启动子片段，其中部为被破坏的EcoRI位点，但在glaA ATG起始位点的直接上海仍具有EcoRI位点(现在该片段中是唯一酶切位点)(图4)。
本发明中使用的构巢曲霉amdS基因位于质粒pGW325(Wer-nars et al.，thesis(1986)Agricultural University，Wa-geningen，The Netherlands)中的约4Kb大小的EcoRI-KpnI片段上。将该含有amdS基因，侧接有其自身调节序列的EcoRI-KpnIDNA片段分子克隆到如Verdoes等人(Transgenic Res.2，84-92，1993)所述的pUC19的适当位点中，得到pAN4-1。用EcoRI和KpnI消化pAN4-1，经琼脂糖凝胶电泳分离含有amdS基因的4Kb大小的DNA片段，连接到用EcoRI和KpnI消化的pAB6-31中并将连接混合物转移到大肠杆菌内进行分子克隆。所得质粒称pAB6S(图5)并含有3.8Kb glaA启动子DNA片段和4KbamdS片段。
首先用SalI部分消化质粒pAB6S并连接到具有如下序列的合成得到的寡核苷酸TN0001(SEQ ID NO：3)上：
TN0001(SEQ ID No：3)：5′TCGATTAACTAGTTAA3′，然后再次用EcoRI消化。经琼脂糖凝胶电泳纯化并分离含有pUC19，glaA启动子和amdS基因序列的DNA片段。同样经琼脂糖凝胶电泳从用SalI消化的质粒pAB6-1中分离2.2Kb3′侧翼glaA DNA片段并连接到上述合成的寡核苷酸上，用T4多核苷酸激酶处理，然后用EcoRI消化并连接到上述从pAB6S中分离的DNA片段上。将此DNA连接混合物转入大肠杆菌进行分子克隆。所得质粒称为pGBDEL1并示于图6中。用这种方法同时破坏SalI限制位点并在所有读码中导入终止密码子。
为了得到含有正好位于glaA基因终止密码子下游并侧接有适当的限制性位点之3′glaA非编码DNA序列的约1Kb大DNA片段，进行PCR扩增。在该PCR扩增中，使用质粒pAB6-1作为模板，并使用下列两个合成的寡核苷酸作为引物：
Oligo AB 2154(SEQ ID No：4)：
5′AACCATAGGGTCGACTAGACAATCAATCCATTTCG 3′
(恰在终止密码子下游的3′glaA非编码序列)和
Oligo AB 2155(SEQ ID No：5)：
5′GCTATTCGAAAGCTTATTCATCCGGAGATCCTGAT 3′
(位在终止密码子约1Kb下游EcoRI位点附近的3′glaA非编码序列)。
按Saiki等人(Science 239，487-491，1988)所述并按TAQ聚合酶供应商(Cetus)推荐的方法进行PCR反应。在DNA扩增仪(Perkin-Elmer/Cetus)中进行25次扩增循环(各次55℃下2分钟，72℃下3分钟和94℃下2分钟)。经琼脂糖凝胶电泳纯化用HindIII和SalI消化的1Kb经过扩增的DNA片段，再用乙醇沉淀，然后克隆到pGBDEL1的HindIII和SalI限制性位点中。如此得到的质粒称为pGBDEL2(图7A，B)。
为了得到最终的glaA基因置换载体pGBDEL4L，用较强的构巢曲霉gpdA启动子交换pGBDEL2的amdS启动子区域。用聚合酶链反应(PCR)方法使gpdA启动子序列融合到amdS基因的编码序列上。为进行这一PCR融合，使用两个不同的模板：含有在构巢曲霉gpdA启动子和构巢曲霉trpC终止子控制下之大肠杆菌hph基因的质粒pAN7-1(Punt et al.，Gene 56，117-124，1987)，以及含有在其自身调节序列控制下之构巢曲霉amdS基因的质粒pAN4-1。使用具有下示序列的四个合成的寡核苷酸作为引物：
Oligo AB 2977(SEQ ID NO：6)：
5′TATCAGGAATTCGAGCTCTGTACAGTGACC 3′
(5′gpdA启动子特异性寡核苷酸，位于大肠杆菌hph基因之ATG起始密码子的约880bP上游)
Oligo AB2992(SEQ ID NO：7)：
5′GCTTGAGCAGACATCACCATGCCTCAATCCTGGGAA 3′
Oligo AB2993(SEQ ID NO：8)：
5′TTCCCAGGATTGAGGCATGGTGATGTCTGCTCAAGC 3′
(两序列彼此互补，并含有gpdA启动子之3′末端的18bp和amdS编码区之5′部分的18bp)
Oligo AB2994(SEQ ID NO：9)：
5′CTGATAGAATTCAGATCTGCAGCGGAGGCCTCTGTG 3′
(位于ATG起始密码子约175bp下游BglII位点附近的amdS特异性序列)
为了将880bp gpdA启动子区域融合到amdS编码序列上，进行两个不同的PCR反应：第一个PCR用pAN7-1作模板并用寡核苷酸AB2977(SEQ ID No：6)和AB2993(SEQ ID No：8)作引物，扩增含有通过与amdS基因之5′末端互补的18个核苷酸侧接在3′边缘上的gpdA启动子的880bpDNA片段，第二个PCR反应用pAN4-1作模板并用寡核苷酸AB2992(SEQ ID No：7)和AB2994(SEQ ID No：9)作引物扩增含有通过与gpdA启动子之3′末端互补的18个核苷酸侧接在5′边缘上之amdS基因的5′部分的200bp DNA片段。图8A中图解显示了这些扩增程序。经琼脂糖凝胶电泳基本上纯化所产生的两个片段，用乙醇沉淀后作为模板用于以寡核苷酸AB2977(SEQ ID NO：6)和AB2994(SEQ ID No：9)为引物的第三个PCR反应中。用EcoRI消化所得DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳纯化和乙醇沉淀后克隆到pTZ 18R(UnitedStates Biochemicals)的EcoRI位点中。所得质粒称为pGBGLA24(图8B)。
为了用gpdA启动子序列交换amdS启动子序列，在用适当的限制酶消化后经琼脂糖凝胶电泳分离pGBGLA 24的约1Kb大小的EcoRI/BglII DNA片段，并连接到pGBDEL2的EcoRI和BglII位点中。所得glaA基因置换载体称为pGBDEL4L(图9)。
删除黑曲霉中的glaA启动子和编码序列
在用pGBDEL4L转化黑曲霉之前，经HindIII和XhoI消化和琼脂糖凝胶电泳除去大肠杆菌序列。按实验部分中所述方法用2.5、5或10μg DNA片段转化黑曲霉菌株CBS 513.88(已于1988年10月10日寄存)，其中在选择平皿中使用乙酰胺作为唯一氮源。在含有选择性乙酰胺的基本培养基平皿上将单个黑曲霉转化体纯化几次。在含0.4％马铃薯-右旋糖(Oxoid，England)的琼脂平皿上于30℃培养约5天，以收集个别转化体的孢子。进行Southern分析借以证实剪短的glaA座位的存在。分离几个转化体的高分子量DNA，用BamHI和KpnI消化后在0.7％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。转移到硝化纤维素滤膜上之后，使用两个32P标记的探针按标准方法进行杂交：分离自质粒pAB6-4(参见上文和图3A)的XhoI/SalI glaA启动子和识别内源性木聚糖酶序列的探针(欧洲专利申请0463706A)。图10A中只作为实例显示了4个转化株(#19、#23、#24、#41)和对照菌株黑曲霉CBS 531.88的结果。为了更好地了解该放射性自显影图谱，图11中图解显示了完整的和截短的glaA座位中杂交片段的大小。
完整的glaA座位的特征是BamHI消化产物中的3.5Kb杂交片段和KpnI消化产物中的4.5Kb杂交片段(参见图11A)。在截短的glaA座位中，没有此3.5KbBamHI杂交片段和4.5Kb KpnI杂交片段并被5.5Kb BamHI杂交片段和6.3Kb KpnI杂交片段所取代。本实施例中，如图10A所示，转体株#19显示出被截短之glaA座位的预期特征(图11B)。该转化被称为GBA-102。
在其他转化株中没有发生glaA基因的置换。差的杂交带：KpnI消化产物中的4.8和15Kb片段和BamHI消化产物中的7和12Kb片段涉及作为内部对照的木聚糖酶序列。
在含氟乙酰胺平皿上反选择以从黑曲霉GBA-102中除去amdS基因
按实验部分中所述方法再次除去黑曲霉GBA-120转化株中的amdS基因。经对染色体DNA所作Southern分析证实，仅在2个存活的重组体菌株中除去了amdS选择标志基因。分离高分子量DNA，用BamHI和KpnI消化后在0.7％琼脂糖凝胶上电泳分离之。转移到硝化纤维素滤膜上之后，使用前部分所述的探针按标准程序进行杂交。图11C中图解显示了各杂交片段。Southern分析的结果如图10B中所示。5.2Kb杂交BamHI片段和3.4Kb杂交KpnI片段的存在，同时并有5.5Kb BamHI和6.3Kb杂交KpnI的丢失对于不存在amdS选择标志来说是特异性的。BamHI消化产物中较弱杂交的7和12Kb片段和4.8及15Kb KpnI片段再次涉及内源性木聚糖酶座位。两菌株均显示了预期的特征。在这些称为GBA107和GBA-108的重组体菌株中，都正确地除去了优选的glaA序列并且最后都完全没有选择标志基因。两菌株都可以使用同一类型载体而再次用于删除或插入其他基因或DNA元件。
                     实施例2
在黑曲霉GBA-107之截短glaA座位的3′glaA非编码区定位无标志基因导入glaA基因
本实施例中描述使用前面实施例中已述的同样方法和程序将基因导入黑曲霉的基因组中。除所需基因或DNA元件外，载体还含有为通过单股交换将载体导向宿主的预定基因组座位所需之与宿主基因组同源的DNA序列。这种类型的载体还包含侧接有DNA重复序列的选择标志基因。可用反选择方法再次适当地除去用该载体衍生之转化体中的选择标志基因。作为一个例子而描述了glaA基因拷贝的导入，后者被逐步整合在实施例1中得到的重组体ΔglaA黑曲霉GBA-107菌株中截短的glaA座位上(参见图12)。
对glaA整合载体：pGBGLA30的描述
整合载体pGBGLA30由在天然启动子控制下的黑曲霉淀粉转葡糖苷酶(glaA)基因和在侧接有3′glaA非编码序列之构巢曲霉gpdA启动子控制下的构巢曲霉amdS基因组成，以指导在3′glaA非编码区的整合及通过反选择除去amdS选择标志基因。
整合载体的构建
将来自pAB6-1的1.8Kb XhoI/EcoRI glaA启动子片段亚克隆到pTZ19R(Uuited States Biochemicals)的SmaI和EcoRI位点中。在克隆到pTZ19R中之前，使用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段充填glaA启动子片段之XhoI位点的突出的5′末端。用这一克隆程序破坏SmaI位点并恢复XhoI位点。将如此制得的质粒称为pGBGLA5(图13)。
为导入适当的限制性位点(AatII、SnaBI、AsnI和NotI)并破坏glaA启动子中的XhoI位点，在pGBGLA5的HindIII和XhoI位点中整合由下列两个寡核苷酸AB3657(SEQ ID NO：10)和AB3658(SEQ ID NO：11)组成的合成片段：
5′AGCTTGACGTCTACGTATTAATGCGGCCGCT        3′AB3657
       |||||||||||||||||||||||||||
       |||||||||||||||||||||||||||
3′    ACTGCAGATGCATAATTACGCCGGCGAAGCT    5′AB3658
如此得到的质粒定命为pGBGLA26(图14)。
然后，将来自pAB6-1含glaA启动子之其余3′部分、glaA编码序列和3′glaA非编码序列之一部分的3.4Kb EcoRI片段克隆到pGBGLA26的EcoRI位点中。该新的质粒被称为pGBGLA27(图15)。用EcoRI消化该质粒，并将由下列寡核苷酸AB3779(SEQ ID NO：12)和AB3780(SEQ ID NO：13)组成的合成片段插入到glaA基因之3′glaA非编码序列末端处的EcoRI位点：
5′AATTGGGGCCCATTAACTCGAGC        3′AB3779
       |||||||||||||||||||
       |||||||||||||||||||
3′    CCCCGGGTAATTGAGCTCGTTAA    5′AB3780
借助这一克隆步骤，破坏EcoRI位点并导入ApaI和XhoI限制性位点。所得质粒被称为pGBGLA42(图16)。
用聚合酶链反应(PCR)方法扩增2.2Kb3′glaA非编码序列，同时调整适当的限制性位点。
在这些PCR反应中，使用含整个glaA座位的质粒pAB6-1作为模板并设计具有下示序列的四个合成寡核苷酸作为引物：Oligo AB3448(SEQ ID NO：14)：
5′GTGCGAGGTACCACAATCAATCCATTTCGC 3′
(恰在glaA基因终止密码子之下游的3′glaA非编码特异性序列)
Oligo AB3449(SEQ ID NO：15)：
5′ATGGTTCAAGAACTCGGTAGCCTTTTCCTTGATTCT 3′
(在终止密码子之约1Kb下游KpnI位点附近的3′glaA非编码特异性序列)
Oligo AB3450(SEQ ID NO：16)：
5′AGAATCAAGGAAAAGGCTACCGAGTTCTTGAACCAT 3′
(在终止密码子之约1Kb下游KpnI位点附近的3′glaA非编码特异性序列)
Oligo AB3520(SEQ ID NO：17)：
5′ATCAATCAGAAGCTTTCTCTCGAGACGGGCATCGGAGTCCCG 3′
(在终止密码子之约2.2Kb下游处的3′glaA非编码特异性序列)
进行两个分立的聚合酶链反应以破坏离glaA基因约1Kb下游的KpnI位点并将离glaA基因终止密码子约2.2Kb下游的SalI位点改变成XhoI位点：第一个反应用寡核苷酸AB3448(SEQ ID NO：14)和AB3449(SEQ ID NO：15)作为引物以扩增恰在glaA基因终止密码子下游的约1Kb DNA片段，第二个反应用寡核苷酸AB3450(SEQID NO：16)和AB3520(SEQ ID NO：17)作为引物扩增3′glaA非编码区中KpnI位点下游的约1.2Kb DNA片段。两个PCR反应均用pAB6-1作为模板。图17A是对这些扩增的图解说明。按实施例1中所述程序完成PCR反应。共进行25次扩增循环(每次于55℃进行1分钟，72℃下1.5分钟和94℃下1分钟)。
经琼脂糖凝胶电泳纯化两个PCR反应所产生的DNA片段，用乙醇沉淀后在使用寡核苷酸AB3448(SEQ ID NO：14)和AB3520(SEQ ID NO：17)作为引物的第三个PCR反应中用作模板，以产生融合片段。在DNA扩增仪(Perkin-Elmer/Cetus)中共进行25次扩增循环(每次循环于55℃下进行2分钟、于72℃进行3分钟、于94℃进行2分钟)。经琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA片段，用乙醇沉淀后亚克隆到pTZ18R的SmaI位点中。所得质粒被定名为pGBGLA17(图17B)。
为了将该经过调整的3′glaA非编码区融合剂amdS基因上，将来自pGBDEL44的amdS基因的一部分亚克隆到pSp73(Promega)中。为进行这个构建，用BglI和HindIII消化pGBDEL4L，经琼脂糖凝胶电泳分离3.4Kb amdS/3′glaA非编码片段并亚克隆到pSp73(Promega)的适当位点中。所得质粒被定名为pGBGLA21(图18)。
该质粒中的约1Kb大小的3′glaA非编码区被换成pGBGLA17的2.2Kb 3′glaA非编码区。用KpnI和HindIII消化pGBGLA17和pGBGLA21。经琼脂糖凝胶电泳分离pGBGLA17的2.2Kb3′glaA非编码区DNA片段和pGBGLA21的4.9Kb DNA片段，连接后将其连接混合物转入大肠杆菌进行分子克隆。将如此得到的质粒称为pGBG-LA22(图19)。
用gpdA启动子完善带延伸之3′glaA非编码区的amdS基因并融合到amdS基因的其余部分上。用BglII和HindIII消化pGBGLA22，经琼脂糖凝胶电泳分离4.4Kb amdS/3′glaA非编码区DNA片段，然后与用BglII和HindIII消化的质粒pGBGLA24连接并转入大肠杆菌中。所得质粒被定名为pGBGLA25(图20)。
用EcoRI部分消化pGBGLA25并在gpdA启动子的EcoRI位点中插入由寡核苷酸AB 3781(SEQ ID NO：18)和AB 3782(SEQ ID NO：19)：
5′AATTGGGGCCCAGCGTCC        3′AB3781
       ||||||||||||||
       ||||||||||||||
3′    CCCCGGGTCGCAGGTTAA    5′AB3782
组成的合成片段。该新的质粒被称为pGBGLA43(图21)。由于这一克隆步骤，因导入ApaI限制性位点而破坏了gpdA启动子前面的EcoRI限制位点。
用ApaI和XhoI消化质粒pGBGLA43并经琼脂糖凝胶电泳分离含有gpdA启动子/amdS基因/3′glaA非编码区的5.3Kb DNA片段，然后与用ApaI和XhoI消化的pGBGLA42连接并转移到大肠杆菌中。所得质粒被定名为pGBGLA28(图22)。
在克隆之前，用PCR方法扩增3′glaA非编码区DNA片段(位于glaA基因之终止密码子的约2.2Kb下游，称3″glaA非编码区)并提供适当的限制性位点。
为进行该PCR反应，使用质粒pAB6-1作模板并设计具有下示序列：
Oligo AB3746(SEQ ID NO：20)：
5′TGACCAATAAAGCTTCTCGAGTAGCAAGAAGACCCAGTCAATC 3′
(位于glaA基因终止密码子之约2.2Kb下游处的SalI位点附近的部分3″glaA非编码特异性序列)
Oligo AB3747(SEQ ID NO：21)：
5′CTACAAACGGCCACGCTGGAGATCCGCCGGCGTTCGAAATAACCAGT3′
(位于glaA基因终止密码子之约4.4Kb下游处的XhoI位点附近的部分3″glaA非编码特异性序列)
在DNA扩增仪(Perkin-Elmer/Cetus)中共进行25次扩增循环
(每次于55℃进行1分钟，于72℃进行1.5分钟，于94℃进行1分钟)。该扩增的图解说明如图23A中所示。用HindIII消化如此得到的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳纯化和乙醇沉淀后以两个方向亚克隆到pTZ 19R的HindIII位点中。将所得质粒称为pGBGLA29A和pGBGLA29B(图23)。
最后步骤包括将pGBGLA29A的3″glaA非编码序列插入质粒pGBGLA28中。为此目的，用HindIII和NotI消化pGBGLA29A。经琼脂糖凝胶电泳分离2.2Kb大小的3′glaA非编码区片段，然后与用HindIII和NotI消化的pGBGLA28连接并转入大肠杆菌。所得整合载体被定名为pGBGLA30(图24)。
用整合载体pGBGLA30转化黑曲霉GBA-107
转化前，经XhoI消化和琼脂糖凝胶电泳从整合载体pGBGLA30中除去大肠杆菌序列。按实验部分中所述的程序用5或10μgDNA片段转化黑曲霉菌株GBA-107。在含有选择性乙酰胺的平皿上将单个黑曲霉转化株纯化几次。在0.4％马铃薯右旋糖琼脂(Oxoid，England)上30℃生长约5天后收集个别转化株的孢子。进行Southern分析以证实是否已整合到内源性截短之glaA座位的3′glaA非编码区中。分离几个转化株的高分子量DNA，用KpnI或BglII消化，然后在0.7％琼脂糖凝胶上电泳分离之。转移到硝化纤维素滤膜上之后，按标准方法进行杂交。使用从质粒pAB6-4(参见实施例1中所述)中分离的32P标记的约0.7Kb XhoI/SalIglaA启动子片段作为探针。图25中作例子只显示了三个转化株(#107-5、#107-9和#107-7)及参考株黑曲霉GBA107和其祖细胞黑曲霉CBS 531.88的检测实验结果。为更好地了解放射自显影图谱，图26A、B、C中图解显示了完整glaA座位、截短的glaA座位和带有整合到预定3′glaA非编码区中之单个pGBGLA30拷贝的截短的glaA座位的杂交片段大小。
完整glaA座位的特征是KpnI消化产物中的4.5Kb杂交片段和BglII消化产物中的10Kb杂交片段。黑曲霉GBA-107截短之glaA座位的特征是KpnI消化产物中的3.4Kb杂交片段和BglII消化产物中的13Kb杂交片段。在pGBGLA30载体整合到截短之glaA座位的3′区中的情况下，预期除3.4Kb杂交片段外在KpnI消化产物中有一附加的6.7Kb杂交片段，并且在BglII消化产物中没有13Kb杂交片段而被14.5Kb杂交片段取代。如从表25中可以看出的，转化株#107-5和#107-9显示了整合到截短的glaA座位中之预定3′非编码区中的单一pGBGLA30拷贝的预期杂交图形。转化株#107-7的杂交图形表明pGBGLA30拷贝在另外的位置整合到黑曲霉GBA-107的基因组中。具有正确整合的pGBGLA30拷贝的转化株被定名为GBA-119和GBA-122，继后将其用于适当的amdS选择标志基因。
经在含氟乙酰胺平皿上的反选择从黑曲霉GBA-119和GBA-122中除去amdS选择标志基因
按实验部分中所述方法除去转化株黑曲霉GBA-119和GBA-122中的amdS选择标志基因。对染色体DNA进行Southern分析以证实在几个存活的重组菌株中除去了amdS选择标志基因。分离高分子量DNA，用KpnI或BglII消化，然后在0.7％琼脂糖凝胶上进行电泳分离。转移到硝化纤维素膜上之后，按标准程序进行杂交。使用32P标记的从质粒pGBGLA29A(如前所述，参见图24)中分离的2.2Kb HindIII/NotI 3″glaA非编码片段作为探针。
图26中图解说明各杂交片段。图27A和B中只显示了黑曲霉GBA-119的3个存活转化株(#AG5-5、#AG5-6、和#AG5-7)、以及黑曲霉GBA-122的3个存活重组菌株(#AG9-1、#AG9-2和#AG9-4)和参考菌株黑曲霉CBS 531.88与黑曲霉GBA-107的杂交结果。
在黑曲霉菌株CBS 531.88的KpnI消化产物中存在6.9Kb杂交片段，BglII消化产物中存在6.9Kb杂交片段。在黑曲霉菌株GBA-107的KpnI消化产物中存在6.9Kb杂交片段，BglII消化产物中存在13Kb杂交片段。在具有整合到3′glaA非编码区中之单一pGBGLA30拷贝的黑曲霉菌株GBA-119和GBA-122中，其KpnI消化产物内存在有8Kb和6.7Kb杂交带，而在其BglII消化产物内则存在有14.5Kb和7.6Kb杂交带。
在KpnI消化产物中存在6.7Kb和8.5Kb杂交片段同时丢失了8Kb杂交片段，对于amdS选择标志基因的正确除去是特异性的。在BglII消化产物中存在14.5Kb和6.9Kb杂交片段同时丢失了7.6Kb杂交片段，对于没有amdS选择标志基因来说是特异的。如可从图27中看出的，菌株#AG5-7、#AG5-5、#AG9-1和#AG9-4显示了正确去除之amdS选择标志基因的预期杂交图形。这些菌株分别被称为GBA-120、GBA-121、GBA-123和GBA-124。菌株#AG5-6和#AG9-2的杂交图形表明完整pGBGLA30拷贝的丢失产生只有截短之glaA座位的亲代黑曲霉GBA-107菌株。
在摇瓶发酵试验中，检测黑曲霉菌株GBA-120、GBA-121、GBA-123和GBA-124产生葡糖淀粉酶的能力。用黑曲霉菌株CBS531.88、GBA-107、GBA-119和GBA-122作为参考菌株。按照实验部分中所述方法进行摇瓶发酵和葡糖淀粉酶检测。在菌株GB A-119至GBA-124中，可测得酶产生量为150-200U/ml。这些葡糖淀粉酶产生水平是已预料到的，并且与用未被转化的野生型黑曲霉菌株CBS 531.88的生产水平差不多。
                     实施例3
在黑曲霉GBA-107中截短的glaA座位的3′glaA非编码区定位无标志基因导入肌醇六磷酸酶基因
本实施例描述使用前面的实施例中所用的同样方法和程序将基因导入黑曲霉的基因组中。主要不同在于目的基因和选择标志基因位于两个分立的载体上，并且这些载体被共转化到黑曲霉中。除目的基因或标志基因外，载体还含有与宿主基因组同源的DNA序列，借以通过单股交换过程使载体定位在宿主的预定基因组座位上。经对这些(共)转化株(如实验程序部分所述)进行氟乙酰胺反选择，amdS标志基因将由于通过单股交换进行整合而产生的DNA重复序列间的内部重组过程得以被适当地删除。
对用于共转化之载体的描述
携带目的基因的载体pGBGLA53含有处在黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)启动子控制下的无花果曲霉(A.ficuum)肌醇六磷酸酶基因，所说的启动子侧接有3′glaA非编码序列以指导在3′glaA非编码区的整合。携带选择标志基因的载体pGBGLA50含有处于构巢曲霉gpdA启动子控制下的构巢曲霉amdS基因，所说的启动子侧接有3′glaA非编码区的整合。
pGBGLA50的构建途径
pGBGLA50的构建包括一个克隆步骤。用HindIII消化质粒pGBGLA29A并使用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段填充粘性末端。然后，经琼脂糖凝胶电泳分离2.2Kb3″glaA非编码区片段，再连接到用ApaI消化的pGBGLA43中并用T4 DNA聚合酶处理以产生平头，继之转移到大肠杆菌中。所得到的带有呈正确方向之3″glaA非编码区DNA片段的质粒被定名为pGBGLA50(图28)。
pGBGLA53的构建途径
pGBGLA53的构建途径中第一个步骤是亚克隆两个片段，所说的片段包括融合到无花果曲霉肌醇六磷酸酶基因之几乎整个编码序列上的glaA启动子。为此目的，用HindIII和EcoRI消化质粒pGBGLA42并经琼脂糖凝胶电泳分离1.8Kb Hind III/EcoRI 5′glaA启动子片段。用EcoRI和BglII消化质粒pFYT3(欧洲专利申请0420358A1)并经琼脂糖凝胶电泳分离包括融合到肌醇六磷酸酶5′部分上之glaA启动子3′部分的1.6Kb EcoRI/BglII片段，然后与分离自pGBGLA42的1.8Kb HindIII/EcoRI 5′glaA启动子一起连接到pSp73(Promega)的HindIII和BglII位点中。所得质粒被称为pGBGLA49(图29)。
下一个步骤是将3′glaA非编码区DNA片段克隆到pGBGLA49中。克隆之前，使用PCR方法扩增位于glaA基因终止密码子约2.2Kb下游处的该3′glaA非编码区DNA片段，并提供适当的限制性位点。
为进行PCR反应，使用质粒pAB6-1作模板并设计两个具有下示序列的合成寡核苷酸作引物：
Oligo AB 4234(SEQ ID NO：22)：
5′GAAGACCCAGTCAAGCTTGCATGAGC 3′
(位于glaA基因终止密码子之大约2.2Kb下游的3′glaA非编码序列)
Oligo AB 4235(SEQ ID NO：23)：
5′TGACCAATTAAGCTTGCGGCCGCTCGAGGTCGCACCGGCAAAC 3′
(位于glaA基因之大约4.4Kb下游的3′glaA非编码序列)
在DNA扩增仪(Perkin-Elmer)中完成25个循环(每个循环：94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1.5分钟)。图30A图解显示了这一扩增结果。用Hind III消化如此得到的片段，经琼脂糖凝胶电泳纯化并亚克隆到pTZ19R的HindIII位点。所得质粒被称为pGBGLA47(图30)。
用HindIII和NotI消化质粒pGBGLA47，经琼脂糖凝胶电泳分离2.2Kb3″glaA非编码DNA片段并克隆到pGBGLA49的HindIII和NotI位点中。所得质粒被称为pGBGLA51(图31)。
pGBGLA53之构建途径中的最后一个步骤是克隆包括肌醇六磷酸酶编码序列之其余部分的DNA片段，所说的编码序列融合在正位于glaA基因终止密码子下游处的3′glaA非编码DNA片段上。克隆之前，使用PCR方法融合肌醇六磷酸酶基因的其余部分和正位于glaA终止密码子下游处的3′glaA非编码DNA片段，并提供适当的限制性位点。在PCR中使用质粒pAB6-1作模板并使用具有下示序列的两个合成寡核苷酸作引物：
Oligo AB4236(SEQ ID NO：24)：
5′TGACCAATAAAGCTTAGATCTGGGGGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCTTAGACAATCAATCCATTTCGC 3′
(36bp肌醇六磷酸酶编码序列，开始于BglII位点直到与3′glaA非编码区融合的终止密码子，所说的3′glaA非编码区正好开始于glaA基因之终止密码子的下游)
Oligo AB4233(SEQ ID NO：25)：
5′TGACCAATAGATCTAAGCTTGACTGGGTCTTCTTGC 3′
(位于glaA基因终止密码子大约2.2Kb下游处的3′glaA非编码序列)
在DNA扩增仪(Perkin-Elmer)中完成25个扩增循环(每个循环：94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1.5分钟)。图32A图解说明了这一扩增结果。用HindIII消化如此得到的片段，经琼脂糖凝胶电泳纯化并以两个方向亚克隆到pTZ19R的HindIII位点中。将所得质粒定名为pGBGLA48和pGBGLA52(图32B)。
用BglII消化并用BamHI部分消化质粒pGBGLA52，经琼脂糖凝胶电泳分离2.2Kb肌醇六磷酸酶/3′glaA非编码DNA片段并克隆到pGBGLA51的BglII位点中。将在正确方向上带有2.2Kb肌醇六磷酸酶/3′glaA非编码DNA片段的所得质粒称为pGBGLA53(图33)。
用载体pGBGLA50和pGBGLA53转化黑曲霉GBA-107
转化前，分别经XhoI或HindIII消化然后经琼脂糖凝胶电泳从DGBGLA50和pGBGLA53中除去大肠杆菌序列。分别用1μgpGBGLA50片段加1μg pGBGLA53片段、1μg pGBGLA50片段加5μgpGBGLA53、或1μg pGBGLA50片段加10μg pGBGLA53片段，按照实验部分中所述的转化程序转化黑曲霉GBA-107菌株。
分离单个转化株，纯化并使用实施例2中所述的同样消化产物和探针进行Southern分析，以证实pGBGLA50和pGBGLA53的整合。在大约10-20％被分析的转化体中pGBGLA50和pGBGLA53两者均整合到黑曲霉GBA-107宿主菌株的基因组中。然后使用显示有单拷贝pGBGLA50和单拷贝pGBGLA55的正确整合图形，且两者均在截短之glaA座位的预定3′glaA非编码区被整合的转化体除去amdS选择标志基因。
经在含氟乙酰胺的平皿上反选择除去amdS标志基因
进行氟乙酰胺反选择(如实验部分中所述)，在通过单股交换整合而产生的DNA重复序列(即3′glaA非编码序列)间进行内部重组而删除amdS标志基因。使用实施例2中所述的同样消化产物和探针进行Southern分析，证实只适当地除去了amdS标志基因。
                     实施例4
在米曲霉中无标志基因导入glaA基因和肌醇六磷酸酶基因
本实施例描述在米曲霉(A.oryzae)NRRL 3485无标志基因导入glaA基因或肌醇六磷酸酶基因。使用实施例2和3中所述的同样载体和手段，按实验部分所述方法转化米曲霉NRRL 3485。分离单个转化株，纯化并对几个转化株的染色体DNA进行Sou-thern分析，以分别证实pGBGLA30载体或pGBGLA50和pGBGLA53载体的整合。在Southern分析中，使用如实施例2中所述的同样消化产物和探针。
经在含氟乙酰胺平皿上反选择除去amdS基因
在整合pGBGLA30载体的情况下，使用具有已整合到宿主菌株米曲霉pGBGLA30之基因中的pGBGLA30单个拷贝的转化株适当地除去amdS基因。按实验部分中所述方法在含氟乙酰胺平皿上进行反选择。对几个氟乙酰胺抗性菌株的染色体DNA进行Sou-thern分析以证实amdS基因的正常去除。使用如实施例2中所述的同样消化产物和探针。
在pGBGLA50和pGBGLA53载体共转化的情况下，使用具有已整合到宿主基因组中之pGBGLA50和pGBGLA53的单个拷贝的转化株适当地除去amdS标志基因。按实验部分所述使用含氟乙酰胺平皿进行反选择。使用实施例2中所述的同样消化产物和探针对几个氟乙酰胺抗性菌株的染色体DNA进行Southern分析以证实amdS标志基因(如pGBGLA50载体)的正确去除。
                     实施例5
在T.reesei中无标志基因导入glaA基因和肌醇六磷酸酶基因
本实施例描述在木霉T.reesei菌株QM9414(ATCC 26921)中无标志基因导入glaA基因或肌醇六磷酸酶基因。按实验部分所述方法用实施例2和3中所述的载体和手段转化T.reesei QM9414。分离单个转化株，纯化并对几个转化株的染色体DNA进行Southern分析以证实是否分别整合了pGBGLA30载体或pGBGLA50和pGBGLA53载体。在Southern分析中，使用如实施例2中所述的同样消化产物和探针。
在含氟乙酰胺平皿上进行反选择以除去amdS基因
在pGBGLA30载体整合的情况下，使用带有整合到宿主菌株T.reesei QM 9414之基因组中的pGBGLA30之单个拷贝的转化株适当地除去amdS基因。按实验部分中所述方法在含氟乙酰胺平皿上进行反选择。对几个氟乙酰胺抗性菌株的染色体DNA进行Southern分析以证实amdS基因的正确去除。
在pGBGLA50和pGBGLA53共转化的情况下，使用带有已整合到宿主基因组中之pGBGLA50和pGBGLA53的单一拷贝的转化株适当地去除amdS标志基因。按实验部分中所述程序使用含氟乙酰胺平皿进行反选择。使用如实施例2中所述的同样消化产物和探针对几个氟乙酰胺抗性菌株的染色体DNA进行Southern分析以证实amdS标志基因(如pGBGLA50载体)的正确去除。
                       实施例6
使用amdS基因作选择标志经共转染将产黄青霉基因无标志基因导入产黄青霉中
本实施例中描述借助共转化将基因无标志基因导入产黄青霉的基因组中。
在共转化过程中，赋予原生质体两个不同的DNA片段，其中一个是amdS选择标志，如实验部分中所述，基于其存在而发生第一次转化株选择，第二个则是如编码特定的有用酶的另一DNA片段。在一定数目的转化体中，两DNA片段都将整合到染色体中，并将得以稳定地保留和表达。
然后可应用如实验部分中所述的反选择程序从纯化的转化株中选择性地除去amdS选择标志基因，而第二个DNA片段则仍将稳定地整合到转化株的染色体中。
作为举例说明该方法之普遍适用性的实施例，其描述了niaD基因的稳定地无标志基因导入，它可使niaD宿主在以硝酸盐为唯一氮源的培养基上生长。
共转化的宿主是产黄青霉niaD菌株，该菌株缺少硝酸盐还原酶，因此不能在以硝酸盐为唯一氮源的平皿上生长。可用已知方法很容易地得到这些菌株(Gouka et al.，J.of Biotechnology20(1991)，189-200及其中所引的参考文献)。
在共转化(实验部分中所述步骤)中，同时赋予原生质体两个DNA片段：得自含amdS选择标志基因之pGBGLA28的7.6Kb EcoRI限制性片段和得自含产黄青霉niaD基因之PGC1-1的6.5Kb EcoRI限制性片段。转化前，经琼脂糖凝胶电泳从大肠杆菌载体序列中分离出两片段，并用电洗脱法从琼脂糖凝胶中纯化之。
按实验部分所述方法在含乙酰胺作为唯一氮源的选择平皿上进行转化株的第一次选择。
将纯化之转化株的孢子复制铺敷到以乙酰胺为唯一氮源的平皿上，从转化株中找出共转化株。
一般约有20-60％的复制铺敷的转化株能够在该培养基上生长，表明这些转化株不仅有amdS选择标志基因而且还有niaD基因已整合到基因组中并得以表达。
经在含氟乙酰胺平皿上反选择除去amdS基因
然后在氟乙酰胺上反选择从共转化株中除去amdS选择标志基因。
用于直接对amdS-/niaD+表型进行选择的培养基含有10mM氟乙酰胺。以每个平皿104个孢子的密度接种孢子。于25℃保温5-7天后，可作为明显不同于微弱本底的实体菌落鉴定出氟乙酰胺抗性菌落。使它们生长在含有作为唯一氮源之硝酸盐的氟乙酰胺培养基上，借以证明转化株的niaD+表型。一般占原数目0.1-2％的接种的孢子表现出预期的表型。
对几个氟乙酰胺抗性菌株的染色体DNA进行Southern分析，进一步证实从产黄青霉基因组中除去了amdS选择标记基因。
                    实施例7
检验乳酸克鲁维酵母的amdS-表型
在乳酸克鲁维酵母中使用amdS选择系统的先决条件是该酵母不含任何乙酰胺酶活性。为进行这一试验，我们在下列不同的固体培养基上铺敷乳酸克鲁维酵母菌株CBS 683和CBS 2360：
I酵母碳基(YCB，Difco)，含有除氮源以外的所有基本营养素和维生素。
II添加了5mM乙酰胺的YCB。
III添加了0.1％(W/V)NH4(SO4)2的YCB。
所有3种培养基均含有1.2％(W/V)Oxoid琼脂(Agar No.1)和30mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)。所用DifcoYCB浓度为1.17％(W/V)。
在含有铵作为氮源的培养基III上只观察到充分生产的乳酸克鲁维酵母菌落。在没有氮源或有乙酰胺作为唯一氮源的平皿上不生长，或者有时观察到有微弱的本底生长，这种情况很可能是由于微量氮污染琼脂或其他培养基成分而引起的。我们的结论是，两乳酸克鲁维酵母菌株缺乏足以维持在以乙酰胺为唯一氮源的培养基上生长的乙酰胺酶活性。这一点应允许使用构巢曲霉amdS基因作为乳酸克鲁维酵母中的选择标志。
                  实施例8
便于在酵母中利用amdS基因之质粒的构建
pGBamdS1的构建
以前我们已使用pGBHSA20在乳酸克鲁维酵母中表达人血清白蛋白(HSA)(Swinkels et al.，1993，Antonis vanLeeuwenhoek 64，187-201)。在pGBHSA20中，HSA cDNA是由乳酸克鲁维酵母LAC4启动子驱动的(质粒pGBHSA20的物理图谱参见图34)。在3′末端，HSA cDNA侧接LAC4终止子序列。为选择转化体，pGBHSA20含有赋予抗生素G418抗性的Tn5磷酸转移酶基因(Geneticin，BRL)(Reisset al.(1984)EMBO J.3，3317-3322)。该基因是由酿酒酵母ADHI启动子(Bennetzenand Hall(1982)J.Biol.Chem，257，3018-3025)驱动的。在LAC4启动子的特有SstII位点中，pGBHSA20含有用于在大肠杆菌中扩增的大肠杆菌载体pTZ19R。在转化到乳酸克鲁维酵母中之前，经用SstII消化和琼脂糖凝胶电泳纯化从pGBHSA20中除去pTZ19R序列。将在LAC4启动子的SstII位点线性化的pGBHSA20转化到乳酸克鲁维酵母中，使之经同源重组整合到基因组LAC4启动子中。使用PCR，在amdS cDNA的5′和3′末端导入SalI位点。在该PCR中，用pamdS1作为模板，并使用下示Oligo AB3514(SEQ ID NO：26)和OligoAB3515(SEQ ID NO：27)作为引物：
Oligo AB3514(SEQ ID NO：26)：
5′-CTGCGAATTC GTCGACATGCCTCAATCCTGGG-3′
(带有已被导入之SalI位点的5′末端amdS特异性序列)
Oligo AB3515(SEQ ID NO：27)：
5′-GGCAGTCTAGA GTCGACCTATGGAGTCACCACATTTC-3′
(带有被导入之SalI位点的3′末端amdS特异性序列)
用SalI消化如此制得的PCR片段并克隆到pGBHSA20的SalI/XhoI位点中。经限制性分析判定，得到含有呈两个可能方向之amdS cDNA的几个克隆。其中一个有呈正确方向的amdS cDNA的克隆是pGBamdS1，其物理图谱如图24所示。
pGBamdS3的构建
使用衍生于酿酒酵母延伸因子1-α基因(EF1-α；Nagataet al.(1984)EMBO J.3，1825-1830)的探针进行异源杂交，我们已分离出含有EF1-α基因之乳酸克鲁维酵母同源区的基因组克隆并将其称为KlEF1。本实施例中我们使用含有KlEF1启动子的813bP片段在乳酸克鲁维酵母中表达amdS cDNA。在PCR中使用寡核苷酸AB 3701(SEQ ID NO：28)和AB 3700(SEQ ID NO：29)作引物，使用乳酸克鲁维酵母菌株CBS 683的基因组DNA作模板扩增该片段。其中设计的AB 3700(SEQ ID NO：29)含有KlEF启动子的21个核苷酸和amdS基因ATG起始密码子上游38个核苷酸。
AB 3701(SEQ ID NO：28)和AB 3700(SEQ ID NO：29)的序列如下所示：
Oligo AB3701(SEQ ID NO：28)：
5′-CTGC GAATTCGTCGAC ACTAGTGGTACCATTATAGCCATAGGACAGCAAG 3′
(在启动子5′末端带有附加限制性位点EcoRI、SalI、SpeI和KpnI的5′KlEF1特异性启动子序列)
Oligo AB3700(SEQ ID NO：29)：
5′-GCTCTAGA GCGCGCTTATCAGCTTCCAGTTCTTCCCAGGATT-GAGGCATTTTTAATGTTACTTCTCTTGC-3′
(融合到带有限制性位点BssH2和附加位点XbaI之amdScDNA 5′序列上的3′KlEF特异性启动子序列)。
使用标准条件进行PCR，用EcoRI与XbaI消化所得到的PCR片段并亚克隆到EcoRI/XbaI消化的pTZ19R中。所得质粒pTZKlEF1的物理图谱如图35所示。用BssH2和SphI消化从pGBamdS1中得到amdS cDNA的其余部分和LAC4终止子序列的一部分。将该BssH2-SphI片段克隆到BssH2和SphI消化的pTZKlEF1中并将所得质粒定名为pGBamdS2(图35)。对于构建pGBamdS3的最后一个步骤，用SphI和HindIII消化pGBamdS2和pTY75LAC4(Das andHollenberg(1982)Current Genetics 6，123-128)。分离后从琼脂糖凝胶中纯化含有其余LAC4终止子序列的pGBamdS2的5.7Kb DNA片段和pTY75LAC4的1.2KbDNA片段，然后连接并用于转化大肠杆菌。将所得到的其中amdS cDNA是由乳酸克鲁维酵母KlEFI启动子驱动的表达载体称为pGBamdS3(图36)。
pGBamdS5的构建
使用pGBHSA20作为模板，以PCR方法将酿酒酵母醇脱氢酶I(ADH1)启动子融合到amdS cDNA上。引物之一(AB3703；SEQ IDNO：31)含有与融合到amdS cDNA序列上之ADH1启动子序列的3′末端互补的序列。另一引物(AB3702；SEQ ID NO：30)含有ADHI启动子的5′末端：
Oligo AB3702(SEQ ID NO：30)：
5′-CTGC GAATTCGTCGAC ACTAGTGGTACCATCCTTTTGTTGTTTCCGGGTG-3′
(在启动子的5′端带有附加限制性位点EcoRI、SalI、SpeI和KpnI的5′ADH1特异性启动子序列)
Oligo AB3703(SEQ ID NO：31)：
5′-GCTCTAGA GCGCGCTTATCAGCGGCCAGTTCTTCCCAGGAT-TGAGGCATTGTATATGAGATAGTTGATTG-3′
(融合到5′amdS序列上带有附加限制性位点BssH2和XbaI的3′ADH 1特异性启动子序列)
使用“touchdown”程序(Don et al.，(1991)NucleicAcids Res.19，4008)进行PCR反应。对反应混合物进行30次扩增循环，同时每两次循环将退火温度降低1℃，从开始55℃降至在40℃“touchdown”，在此温度进行10次以上循环(循环：于94℃进行2分钟，退火2分钟，于72℃进行3分钟)。用EcoRI和XbaI消化所得PcR片段并亚克隆到pTZ19R中。所得质粒pTZs.c.ADH2如图37中所示。用KpnI和BssH2消化pTZs.c.ADH2和pGBamdS3。经凝胶电泳纯化得自pGBamdS3的6.8Kb片段和来自pTZs.c.ADH1的750bp片段，连接之并用于转化大肠杆菌JM109。所得表达载体被定名为pGBamdS5(图37)。
pGBamdS6的构建
质粒pGBamdS3含有在KlEF1启动子控制下并在3′末端侧接1.5Kb LAC4终止子序列的amdS cDNA(图36)。经克隆含有LAC4启动子和pGBamdS表达暗盒之终止子序列上游的融合体而构建pGB-amdS6(图38)。为使LAC4启动子与终止子序列融合，我们已首先构建了pPTLAC4(图39)。使用PCR方法，在600bp LAC4终止子片段的5′和3′末端导入附加限制性位点。在PCR反应中，使用乳酸克鲁维酵母CBS 683染色体DNA作模板，并使用寡核苷酸AB 3704(SEQ ID NO：32)和AB 3705(SEQ ID NO：33)作引物：
Oligo AB3704(SEQ ID NO：32)：
5′-GC TCTAGAAGTCGAC ACTAGTCTGCTACGTA CTCGAGAATTTATACTTAGA-TAAG-3′
(在LAC4终止密码子处开始的带有附加限制性位点XbaI、SalI、SpeI、SnaBI和XhoI的LAC4终止子特异性序列)Oligo AB3705(SEQ ID NO：33)：
5′-TGC TCTAGATCTCAAGCCACAATTC-3′
(带有附加限制性位点XbaI的3′LAC4终止子特异性序列)。
使用标准条件进行PCR，用XbaI消化所得DNA片段并亚克隆到pTZ19R的XbaI位点中得到PTLAC4(图39)。经用XbaI和SnaBI消化pKS105(Van den Berg et al.(1990)Bio/Technology 8，135-139)得到LAC4启动子序列。将XbaI-SnaBI LAC4启动子片段克隆到PTLAC4的SneI/SnaBI位点中并定名为PPTLAC4(图39)。在构建pGBamdS6的最后步骤中，用XbaI消化质粒pPTLAC4。经凝胶电泳纯化得自PPTLAC4的4.1Kb DNA片段并克隆到pGBamdS3的SpeI位点中。将所得基因置换载体称为pGBamdS6(图38)。
pGBamdS8的构建
在存在于pGBamdS6中的LAC4启动子和终止子序列之间克隆含有一部分的LAC4启动子及凝乳酶表达暗盒的片段，以构建pGBamdS7(图40)。质粒pKS105含有前凝乳酶cDNA，后者融合到处于LAC4启动子控制下的酿酒酵母α因子之前早区域上(VandenBerg et al.(1990)Bio/Technology 8，135-139)。经PCR在融合体LAC4启动子和凝乳酶表达暗盒的5′和3′末端导入附加的限制性位点。在PCR中，使用pKS105DNA作为模板并使用寡核苷酸AB3965(SEQ ID NO：34)和AB 3966(SEQ ID NO：35)作为引物：
Oligo AB3965(SEQ ID NO：34)：
5′-CTGCTACGTAATGTTTTCATTGCTGTTTTAC-3′
(开始于限制性位点SnaB1处的LAC4启动子特异性序列)Oligo AB3966(SEQ ID NO：35)：
5′-CCGCCCAGTCTCGAGTCAGATGGCTTTGGCCAGCCCC-3′
(带有附加限制性位点XhoI的凝乳酶特异性序列)。
使用标准条件进行PCR，并用SnaB1和XhoI消化所得到的PCR片段。用XhoI部分消化质粒pGBamdS6，然后再用SnaB1消化并经凝胶电泳分离和纯化10.9Kb DNA片段。将SnaB1-XhoI融合体片段LAC4启动子/凝乳酶表达暗盒克隆到pGBamdS6的SnaB1/XhoI位点中。将所得质粒称为pGBamdS7(图40)。
为了破坏离凝乳酶基因起始密码子上游约66bp处的HindIII位点，用HindIII部分消化pGBamdS7并用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段处理以产生平头，然后将它们连接在一起并转移到大肠杆菌中进行分子克隆。所衍生的质粒被称为pGBamdS8并含有其中HindIII位点已被破坏的LAC4启动子片段。
                     实施例9
在乳酸克鲁维酵母中从LACA4启动子开始表达amdS cDNA
表达载体pGBamdS1含有不同于amdS cDNA的可赋予对抗生素G418之抗性的第二个选择标志。该选择标志允许首先使用G418抗性作为一种已很完善的程序(Sreekrishna et al.(1984)Gene28，73-81)选择转化株。然后可用以这种方式得到的转化株证实amdS cDNA的表达并使得在乳酸克鲁维酵母中选择amdS+表型的条件达到最佳化。一旦建立了这些条件，即可如使用没有附加选择标志的表达暗盒直接选择amdS+转化株。
经SstII消化在LAC4启动子将pGBamdS1(图34)切成线形。使用琼脂糖凝胶电泳法分离并纯化除去pTZ19R序列。用15μg该DNA片段，按照实验部分中所述的改动的ItoH.等人的方法(1983，J.Bacteriol.153，163-168)转化乳酸克鲁维酵母菌株CBS 2360和CBS 683。将转化平皿在30℃保温3天。用两个菌株均得到G418抗性转化株。然后在含有不同固体培养基的平皿上划线接种两菌株及野生型菌株的几个独立的转化株(参见表1)。实验部分中已描述了YEPD和YEPD/G418。YCB、YCB/NH和YCB/乙酰胺分别作为培养基I、II和III已在实施例7中述及。YNB-lac/NH4和YNB-lac/乙酰胺含有分别添加了0.1％(W/V)NH4(SO4)2或5mM乙酰胺的0.17％(W/V)酵母氮基W/O氨基酸和硫酸铵(Difco)。
CBS 683/pGBamdS1转化株的amdS+表型在YCB/乙酰胺上是很明显的(参见表1)。然而，含有同一表达载体的CBS 2360转化株在YCB/乙酰胺上未表现出任何生长迹象。我们有理由认为，这种情况可能是由于在没有乳糖或半乳糖作为碳源时缺少对驱动amdS cDNA之LAC4启动子的诱导作用，已描述了不同乳酸克鲁维酵母菌株间对LACA启动子之调节作用的碳源依赖性差异(Breunig(1989)Mol.Gen.Genet.216，422-427)。表1显示确实是这样，在含有乳糖作为唯一碳源和以乙酰胺作为唯一氮源的培养基上，CBS 2360转化株能够生长。因此我们能得出结论，即根据所使用的碳源，这些转化株足可表达构巢曲霉amdS cDNA，以维持酵母乳酸克鲁维酵母在以乙酰胺为唯一氮源的培养基上生长。
进行Southern分析以进一步证实是否已在LAC4启动子中整合。分离几个CBS 2360和CBS 683转化株的高分子量DNA，用HindIII消化后在0.7％琼脂糖凝胶上电泳分离之。转移到硝化纤维素滤膜上之后，按标准方法进行杂交。使用32P标记的分离自质粒pGBHSA20(图34)的约1.5Kb SacII/HindIII LAC4启动子片段作为探针。我们鉴定了含有整合到LAC4座位中之单一pGBamdS1表达暗盒的CBS 683和CBS 2360转化株，图41中显示了各转化株的一个例子并分别称之为KAM-1和KAM-2。整合在LAC4启动子中的pGBamdS1的单一拷贝产生4.2Kb和8.6Kb的两个新的HindIII片段，两者均存在于KAM-1和KAM-2中。因为CBS 683含有两个LAC4座位，并且pGBamdS1已在KAM-1中整合到它们的仅一个之中，所以KAM-1的消化产物也显示有衍生于第二个未被扰乱之LAC4座位的5.6Kb Hind III片段。
表1：乳酸克鲁维酵母CBS 683和CBS 2360野生型及pGBamdS1转化株在含有不同氮源和/或碳源之固体培养基上的生长
  菌株   CBS 683   CBS 2360
  转化DNA   无   pGBamdS1   无   pGBamdS1
  YEPO   +   +   +   +
  YEP0-G418   -   +   -   +
  YCB   -   -   -   -
  YCB/HN4   +   +   +   +
  YCB/乙酰胺   -   +   -   -
  YNB-lac/NH4   +   +   +   +
YNB-lac/乙酰胺 - + - +
                      实施例10
使用乙酰胺作为唯一氮源直接选择CBS 683和CBS 2360转化株
使用Ito H.等人((1983)，J.Bact.153，163-168)所述的转化程序将用SstII切成线性的pGBamdS1(15μg)转化到乳酸克鲁维酵母CBS 683和CBS 2360中所作改动包括：
-在OD610＝0.5-1.0时收集用于转化的乳酸克鲁维酵母培养物。
-在对DNA-细胞悬液进行5分钟热休克后，以1ml体积于30℃进行150-180分钟的表型表达，然后铺板。两菌株使用不同的培养基。对于CBS 683，使用YEPD/YNB溶液(1*YNB(酵母氮基，Difco)、1％细菌蛋白胨、1％酵母浸膏和2％葡萄糖)或YNB-glu(添加1％(W/V)葡萄糖和30mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)的1*YNB(酵母氮基W/O氨基酸和硫酸铵，Difco))。对于CBS2360，使用YNB-lac(添加1％(W/V)乳糖和30mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)的1*YNB(酵母氮基W/O氨基酸和硫酸铵，Difco))。经此保温后，在室温下以2,000g将细胞离心5分钟，然后铺敷在YNB-lac/乙酰胺平皿上(参见实施例9)。30℃下生长3天。得到两菌株的amdS+转化体。发现转化频率与使用G418选择时差不多。然后将所得菌株接种在含G418的YEPD平皿上并经Southern分析进一步证实转化体的正确特性。
用XhoI消化将其中amdS cDNA是由KlEF1启动子驱动的pGBamdS3(图36)在LAC4终止子中切成线形，然后将15μg凝胶分离的片段转化到乳酸克鲁维酵母菌株CBS 683中，按上述转化pGBamdS1进入CBS683的同样方法在YCB/乙酰胺上直接选择。用Southern印迹法分析所得到的某些转化株。分离高分子量DNA，用BamHI消化然后在0.7％琼脂糖凝胶上电泳分离之。转移到硝化纤维素膜上之后按标准方法进行杂交。使用32P标记的从质粒pTY75LAC4中分离的1.2Kb SphI/HindIII LAC4终止子片段作为探针(见实施例8)。图42A和42B中分别显示了几个含pGBamdS3质粒的转化株和几个含pGBamdS5质粒的转化株的杂交结果。参考菌株CBS 683示于图42B中。在CBS 683转化株中，除完整LAC4终止子的3.7Kb杂交片段外，还存在一个另外的6.8Kb大小的杂交片段。这表明质粒正确整合到了LAC4终止子区域中。
在所有这些转化株中，pGBamdS3均以一个或多个拷贝整合到LAC 4终止子中(6.8Kb杂交片段的强度代表了该载体已整合之拷贝的数目)。我们的结论是，KlEF1启动子也可驱动amdS cDNA而将其用作选择标志。使用pGBamdS5(图37)—其中amdS cDNA是由酿酒酵母ADH1启动子驱动的—也获得了相似的结果。
                   实施例11
经在乙酰胺上直接选择用pGBamdS5转化酿酒酵母
本实施例中，我们试验了是否amdS cDNA也可在其他酵母如酿酒酵母中被用作选择标志。我们已首先使用涉及乳酸克鲁维酵母的培养基和方法(实施例7)确定了酿酒酵母菌株D237-10B的amdS-表型及其利用铵作为唯一氮源的能力。如在乳酸克鲁维酵母所观察到的，只在以铵作氮源的平皿上观察到充分生长的酿酒酵母菌落。在没有氮源或有乙酰胺作唯一氮源的平皿上没有生长，或有时只观察到微弱的本底生长。用SphI部分消化在ADH1启动子中将质粒pGBamdS5切成线形。使用实施例10中所述的用pGBamdS1转化乳酸克鲁维酵母CBS 683的转化程序，用15μg凝胶分离的线性化pGBamdS5片段转化酿酒酵母菌株D273-10B(ATCC 25657)。转化后将细胞铺敷在YCB/乙酰胺平皿上(参见实施例9)并使之在30℃下生长3天，在此转化中得到几个amdS+转化株。然后对几个amdS转化株进行Southern分析的证实amdS cDNA稳定地整合到了酿酒酵母基因组中。
分离高分子量DNA并用BamH1消化，然后经电泳(在0.7％琼脂糖凝胶上)分离并转印到硝化纤维素膜上。使用32P标记的从pGBamdS1中分离的750bp EcoRV amdS片段作为探针。图43中显示了几个D273-10B/pGBamdS5转化株以及参考菌株D273-10B(ATCC25657)的杂交结果。D273-10B中存在两个杂交片段，分别是一个代表多拷贝片段的6.6Kb片段，和一个代表侧翼序列的未知大小的杂交片段。如所预料到的，参考菌株未显示出任何杂交片段。
                    实施例12
使用氟乙酰  胺反选择法从乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母amdS+转化体中除去amdS标志
上述实施例中，含amdS表达的暗盒通过单一交换同源重组被整合在乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母基因组中。这意味着在这些amdS酵母转化株的基因组中amdS cDNA侧接有直接重复序列。因此，amdS cDNA将通过在直接重复侧翼cDNA间以低频率发生的染色体内有丝分裂重组体过程在重组群体的一小部分中被删除。有可能使用含氟乙酰胺——一种如Hynes和Pateman((1970)Mol.Gen.Genet.108，107-116)已就构巢曲霉所证明的对amdS+细胞有毒性但对amdS-细胞无毒性的化合物——的培养基对这些过程作出选择。在amdS+细胞中，氟乙酰胺被转化成铵和氟乙酸盐，当被乙酰CoA合成酶激活时后者是有毒性的。因此氟乙酰胺反选择也适用于amdS+酵母的先决条件是：1)氟乙酰胺对amdS-酵母应是无毒性的，2)酵母细胞壁和胞质膜应能透过氟乙酰胺，以及3)乙酰CoA合成酶应是有活性的。为进行这一试验，我们使用了含有已整合到LAC4启动子中之pGBamdS1单一拷贝的称为KAM-1的乳酸克鲁维酵母CBS683转化株，和含有已整合到ADH1启动子中之pGBamdS5单一拷贝的称为SAM-1的酿酒酵母D273-10B转化株。在选择性培养基上对KAM-1和SAM-1至少进行三次遗传纯化以排除amdS-亲代菌株的污染。将KAM-1和SAM-1分别以每平皿约103CFU的密度铺敷在添加10mM氟乙酰胺的YCB/NH4上。30℃下保温3-6天后，KAM-1和SAM-1均产生5至20个氟乙酰胺抗性菌落。对几个独立的KAM-1和SAM-1衍生的amdS-菌落的染色体DNA进行Southern分析，以进一步证实通过侧翼直接重复序列间的同源重组(图41)从乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母基因组中正确地除去amdS cDNA。事实上，在一个KAM-1amdS-重组体中，重组的交换点位于多态Hind III位点和amdScDNA之间。该多态HindIII位点存在于pGBamdS1之LAC4启动子中LAC4读码的92bp上游，但该位点不存在于CBS 683 LAC4启动子中。重组过程已在该特定KAM-1重组体的基因组中留下了HindIII位点，该转化体在其他方面则不能与亲本菌株CBS 683区别开(参见图41中泳道6的多余4.2Kb片段)。因此该KAM-1转化株排除了这种可能性，即我们将分离到CBS 683污染物而不是KAM-1 amdS-重组体。我们的结论是，当侧接直接重复序列时可使用氟乙酰胺反选择从酵母基因组中除去amdS cDNA。在本实施例中，以大约0.1％的频率出现amdS-乳酸克鲁维酵母和酿酒酵母重组株。
我们已注意到，对于某些酵母菌株，在氟乙酰胺上的有效反选择不能在YCB/NH4上进行，这可能是由于乙酰CoA合成酶的强的碳代谢产物阻遏作用所致。在这些例子中，我们成功地使用了添加10mM氟乙酰胺的YNB-半乳糖/NH4培养基(该培养基与实施例9中所述的YNB-lac/NH4相同，但以1％半乳糖代替1％乳糖)进行反选择。
                    实施例13
使用amdS标志无标志基因删除乳酸克鲁维酵母基因
为操纵酵母基因组而经常使用的技术是“一步骤基因破坏”，该方法允许以单一转化步骤破坏(或修饰)基因(Rothsteinetal.(1983)Methods Enzymol.101，202-211)。在该方法中，带有被酵母可选择标志破坏之靶基因拷贝的转化质粒通过双交换同源重组整合在酵母基因组中，导致野生型靶基因被已经破坏的拷贝取代。将“一步骤基因破坏”与我们在实施例12中描述的对amdS+酵母转化株的氟乙酰胺反选择方法合用，可在没有留下可选择标志的情况下从酵母基因组中删除基因。在本实施例中，我们已合用这些方法从乳酸克鲁维酵母CBS 2360基因组中删除LAC4基因。为进行乳酸克鲁维酵母LAC4基因的一步骤基因置换，我们构建了pGBamdS6(图38)，该质粒含有侧接LAC4启动子和终止子序列的amdS表达暗盒。在amdS表达暗盒的直接上游存在一个附加的LAC4终止子片段，使得amdS表达暗盒侧翼连有直接重复区，这将允许通过这些直接重复间的染色体内重组从乳酸克鲁维酵母基因组中切除amdS序列。用SpeI和HindIII消化质粒pGBamdS6，并在经过凝胶电泳后分离出一6.6Kb DNA片段。使用含有该Spel-HindIII片段的基因置换载体按实施例10中所述转化方法转化乳酸克鲁维酵母CBS2360菌株。将amdS+转化株铺敷在含有0.008％X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)的YEPO平皿上，以筛选带有被转位之LAC4基因的转化株。
对amdS+转化体进行Southern印迹分析。分离高分子量DNA，用HindIII消化，然后在0.7％琼脂糖凝胶上电泳分离并转印到硝化纤维素膜上。使用32P标记的分离自质粒pPTLAC4(如实施例8中所述)的600bpXhoI LAC4终止子片段作为探针。图44中显示了带有被转位之LAC4基因的amdS+CBS 2360转化株以及参考菌株CBS 2360的杂交结果。在amdSCBS 2360转化株中，存在一个暗指正确转位之LAC4基因的7.4Kb杂交片段。参考菌株CBS2360则显示一个代表完整LAC4座位的2.0Kb杂交片段。
然后按实施例12中所述对这些amdS+转化株进行氟乙酰胺反选择，得到带有amdS-表型的重组体。对amdS-重组体染色体DNA进行Southern分析。分离高分子量DNA，用HindIII消化，然后在0.7％琼脂糖凝胶上分离并印迹转移到硝化纤维素膜上。使用如上文所述的同样32P标记的探针。图44中显示了amdS-CBS2360转化株的杂交结果。在amdS-重组体的情况下，存在一个5.4Kb杂交片段，这进一步证明没有LAC4基因以及从酵母基因组中正确地除去了amdS标志。这些乳酸克鲁维酵母LAC4菌株没有了amdS标志便有可能重新利用amdS标志再次删除和/或修饰基因。
                 实施例14
使用amdS标志无标志基因在乳酸克鲁维酵母基因组中插入基因
为了向酵母基因组中无标志基因插入基因，我们使用了凝乳酶cDNA作为模式基因。在本实施例中，我们在乳酸克鲁维酵母座位上插入了凝乳酶cDNA，同时置换LAC4基因且没有留下选择标志。无标志基因插入的原理是与实施例13中所述的无标志基因缺失的原理相同的，不同的是在此情况下转位载体pGBamdS8含有目的基因，即凝乳酶cDNA(图40)。用SpeI和HindIII消化质粒pGBamdS8并经凝胶电泳分离8.0Kb DNA片段。按实施例10中所述用10μg该片段转化乳酸克鲁维酵母CBS 2360。得到带有被转位之LAC4基因和凝乳酶活性的amdS+转化株。按已述方法(Van denBerg et al.(1990)Bio/technology 8，135-139)检测凝乳酶活性。然后按实施例12中所述在氟乙酰胺上反选择这些转化株，分离到带有amdS-表型但仍产生了凝乳酶的重组体。对amdS-、凝乳酶+重组体的染色体DNA进行Southern分析，进一步证实LAC4基因被凝乳酶取代以及从乳酸克鲁维酵母基因组中正确地除去了amdS标志。这些重组体的amdS-/凝乳酶+表型也基于在YCB/乙酰胺平皿上不能生长以及存在凝乳酶活性(见上文)而得以证实。这些重组体的amdS-表型允许进一步使用amdS标志操纵这些菌株，如整合凝乳酶表达暗盒的附加拷贝和/或如实施例13中所述删除乳酸克鲁维酵母基因。
                   实施例15
检验芽孢杆菌和大肠杆菌的amdS-表型
在芽孢杆菌中使用amdS选择系统的先决条件是这些革兰氏阳性细菌不含任何乙酰胺酶活性。为了对此进行试验，我们将枯草芽孢杆菌菌株BS-154(CBS 363.94)铺敷在含有除氮源外的所有基本营养素和维生素的培养基(28.7mM K2HPO4、22mM KH2HPO4、1.7mM柠檬酸钠、0.4mM MgSO4、0.75μM MnSO4、0.5％(W/V)葡萄糖和1.5％琼脂)上。在该培养基上或者当添加20mM乙酰胺作为氮源时没有观察到生长。只有在基本培养基中添加20mM(NH4)2SO4或20mM KNO3作为氮源时才观察到细菌生长。我们的结论是，芽孢杆菌BS-154(CBS 363.94)缺乏足够的乙酰胺酶活性维持其在作为唯一氮源的乙酰胺上生长。这一现象应允许在革兰氏阳性细菌中使用构巢曲霉amdS基因作为选择标志。
同样，我们试验了缺乏乙酰胺酶活性的革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，以确定构巢曲霉amdS基因是否可以在这些微生物中被用作选择标志。在此情况下，我们使用了添加0.02μg(W/V)硫胺素的Mg基本培养基(Sambrook et al.(1989)“Molecular Cloning：a Laboratory Manual”，Cold Spring Harbour Laboratories，Cold Spring Harbour，New York)。当铺敷在Mg平皿上时，观察到大肠杆菌JM109的充分生长的菌落。但当从Mg平皿中去掉NH4Cl或用20mM乙酰胺代替时则没观察到生长或只有微弱的本底生长。我们的结论是，大肠杆菌JM109菌株缺乏足以维持其在作为唯一氮源的乙酰胺上生长的乙酰胺酶活性。这一事实也将允许在革兰氏阴性细菌中将构巢曲霉amdS基因用作选择标志。
                 实施例16
构建用于细菌中的amdS表达载体
pGBamdS22的构建
为了在不同种芽孢杆菌中表达构巢曲霉amdS基因，我们将来自pamdS-1的amdS cDNA克隆到基本芽孢杆菌表达载体pBHA-(欧洲专利申请89201173.5；其物理图谱参见其中的附图45)。使用具有下示序列的寡核苷酸AB3825(SEQ ID NO：36)和AB3826(SEQ ID NO：37)在pamdS-1中的amdScDNA基因之ATG起始密码子处导入NdeI位点：
Oligo AB3825(SEQ ID NO：36)：
5′-CGCGCTTATCAGCGGCCAGTTCTTCCCAGGATTGAGGCATATGT-3′Oligo AB3826(SEQ ID NO：37)：
5′-CTAGACATATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAG-3′
使用标准方法将这些寡核苷酸退火。将所得双股DNA片段连
接到BssHII/XbaI消化的pamdS-1中并转入大肠杆菌。从转化株之一分离pGBamdS21并经限制性酶切分析确定其特征(图47)。用KpnI和HindIII消化pGBamdS21并将含amdS cDNA的片段克隆到用KpnI及Hind III消化的pBHA-1中。将所得质粒称为pGBamdS22(图48)。
pGBamdS25的构建
为了证明使用amdS作为选择标志将所需DNA序列位点特异性地整合到地衣形芽孢杆菌基因组中，将amdScDNA克隆在表达/整合载体pLNF中(图46)。该载体含有地衣形芽孢杆菌淀粉酶基因的5′和3′非编码序列，其能够位点特异性地整合在相应的染色体淀粉酶座位。用NdeI和PvuII消化pGBamdS21(详见上文，图47)，并含amdS cDNA的片段与用NdeI和ScaI消化的PLNF相连接。将此连接混合物转化到枯草芽孢杆菌BS-154(CBS 363.94)中。在添加20μg/ml新霉素的基本培养基上选择转化株。从其中一个称为BAA-101的转化株中分离质粒pGBamdS25(图50)。
pGBamdS41的构建
为在大肠杆菌中表达构巢曲霉amdS cDNA，我们使用了pTZ18R/N——欧洲专利申请0340878A1中描述pTZ18R的衍生物。pTZ18R/N不同于pTZ21R，在于使用体外位点针对性诱变技术在pTZ19R中lacZ读码的ATG起始密码子处造成一个NdeI位点。
用NdeI和Hind III消化pGBamdS21并将凝胶分离的含amdScDNA的片段连接到用NdeI和HindIII消化的pTZ18R/N中。用该连接混合物转化大肠杆菌JM109并从其中一个转化株中分离pGBamdS41(图51)。
                    实施例17
使用amdS基因作为选择标志转化芽孢杆菌
为了从pGBamdS22中删除大肠杆菌序列并放置amdScDNA的“hpa2”启动子直接上游，用NdeI消化pGBamdS22，重新连接成环并用于转化枯草芽孢杆菌BS-154(CBS 363.94)。在乙酰胺基本平皿上选择转化株并检查新霉素抗性。从其中的一个转化株中分离表达载体pGBamdS23(图49)并经限制性酶切分析鉴定其特征。这些结果表明：1)在芽孢杆菌启动子序列控制下的构巢曲霉amdScDNA得以很好地表达，2)amdS基因可在转化芽孢杆菌中被用作选择标志。
用载体pGBamdS25转化地衣形芽孢杆菌T5(CBS 470.83)。按实验部分所述方法进行转化并在添加了20mM乙酰胺作为唯一氮源的改良的原生质体再生平皿(详见实验部分所述)上经直接选择得到amdS+转化株。根据其新霉素抗性表型以及可再次从转化株中分离到该质粒这一事实进一步证实转化株中存在pGBamdS25。
使用其中一个定名为BAA-109的转化株将质粒pGBamdS25在淀粉酶座位上定点整合到地衣形芽孢杆菌基因组中。使转化株在含有乙酰胺作为唯一氮源的基本培养基琼脂上于50℃生长，以完成质粒整合。将几个菌落重复转移到新鲜平皿上(2至3次)后于50℃下保温。检验所分离之菌落在以乙酰胺作为唯一氮源的培养基上生长的能力和对新霉素(1μg/ml)的抗性。经用从整合体分离的DNA再次转化宿主菌株后，确认没有自动复制的质粒DNA。未能得到新霉素抗性菌落。
这一结果清楚地证明amdS基因是选择含有单一amdS基因拷贝之芽孢杆菌菌种的适当标志。
                     实施例18
使用amdS基因作为选择标志转化大肠杆菌
按标准程序用载体pGBamdS41转化大肠杆菌JM109。在添加0.02μg/ml硫胺素和50μg/ml氨苄青霉素的M9平皿上或没有铵但添加了20mM乙酰胺、0.02μg/ml硫胺素及0.05mMIPTG的M9平皿上进行选择。得到amdS+/氨苄青霉素抗性转化株，从中可重新分离到pGBamdS41。使用在氨苄青霉素或乙酰胺上选择的方法，其转化频率差不多。该事实证明构巢曲霉amdS基因对于革兰氏阴性细菌的转化也具选择标志的功能。
                     实施例19
amdS+细菌转化株的氟乙酰胺反选择
使用氟乙酰胺对细胞amdS+转化株进行反选择要求乙酰CoA合成酶具有将氟乙酸转化成氟乙酰CoA的活性。为了避免如在大肠杆菌中观察到的(Broun et al.，1977)代谢产物对乙酰CoA合成酶的抑制作用，使细菌amdS+转化株或单拷贝整合体生长在含有NH4Cl为氮源和乙酸为碳源及能源的限定的培养基上。
包括枯草芽孢杆菌在内的许多生物体(Freese，E.andFortnagel，P.(1969)J.Bacteriol.90，745-756)均缺少功能性乙醛酸代谢旁路，因此只有当培养基中添加TCA循环中间产物如谷氨酸或琥珀酸时才能代谢乙酸。使芽孢杆菌amdS+菌株生长在Grundy，F.J.等人((1993)，Molecular Microbiology 10，259-271)所述的含0.01％谷氨酸盐和50mM乙酸盐的TSS培养基上。为此用琼脂固化培养基，以1-50mM的浓度加入氟乙酰胺。以每平皿102细胞的密度铺敷枯草芽孢杆菌BAA-101或地衣形芽孢杆菌BAA-103(单拷贝整合体)。只在某些氟乙酰胺浓度的平皿出现很少菌落。经质粒和染色体DNA分析证明这些菌落中没有pGBamdS25，对新霉素敏感，而且不能在以乙酰胺为唯一氮源的平皿上生长。如经活性检测和Southern印迹分析所表明的，反选择BAA-103在某些情况下导致淀粉酶基因的丢失。这显示可使用反选择法从含有大多数amdS+芽孢杆菌细胞的群体中选择出amdS-细胞并同时删除特异性靶基因。
同样，我们使用了添加有浓度为1-50mM的氟乙酰胺和0.5mMIPTB的Vanderwinkel E.和De Vlieghere M.(European J.Biochem.，5(1968)81-90)所述的基本培养基#132，从pGBamdS41转化株的群体中选择amdS-大肠杆菌JM109细胞。以每平皿102细胞的密度铺敷细胞。结果只有在某些氟乙酰胺下显现出少数菌落生长。分离DNA后证明氟乙酰胺选择的菌落中没有pGBamdS41，其对氨苄青霉素敏感，并且不能在以乙酰胺为唯一氮源的平皿上生长。这证明氟乙酰胺反选择可被用于从含大多数amdS+大肠杆菌细胞的群体中选择amdS-细胞。
                           序列表
(1)一般资料：
(略)
(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：26碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3100
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
CTAATCTAGA ATGCCTCAAT CCTGAA                        26
(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：28碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3101
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
CACAGTCGAC AGCTATGGAG TCACCACA                      28
(2)SEQ ID NO：3的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：16碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：TN0001
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
TCGATTAACT AGTTAA                                   16
(2)SEQ ID NO：4的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：35碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB2154
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
AACCATAGGG TCGACTAGAC AATCAATCCA TTTCG              35
(2)SEQ ID NO：5的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：35碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB2155
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
GCTATTCGAA AGCTTATTCA TCCGGAGATC CTGAT              35
(2)SEQ ID NO：6的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：30碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB2977
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
TATCAGGAAT TCGAGCTCTG TACAGTGACC                    30
(2)SEQ ID NO：7的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：36碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB2992
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
GCTTGAGCAG ACATCACCAT GCCTCAATCC TGGGAA             36
(2)SEQ ID NO：8的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：36碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB2993
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
TTCCCAGGAT TGAGGCATGG TGATGTCTGC TCAAGC             36
(2)SEQ ID NO：9的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：36碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB2994
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
CTGATAGAAT TCAGATCTGC AGCGGAGGCC TCTGTG             36
(2)SEQ ID NO：10的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：31碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3657
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
AGCTTGACGT CTACGTATTA ATGCGGCCGC T                  31
(2)SEQ ID NO：11的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：31碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3658
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
TCGAAGCGGC CGCATTAATA CGTAGACGTC A                  31
(2)SEQ ID NO：12的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3779
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
AATTGGGGCC CATTAACTCG AGC                           23
(2)SEQ ID NO：13的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：23碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3780
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
AATTGCTCGA GTTAATGGGC CCC                           23
(2)SEQ ID NO：14的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：30碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3448
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
GTGCGAGGTA CCACAATCAA TCCATTTCGC                    30
(2)SEQ ID NO：15的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：36碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3449
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
ATGGTTCAAG AACTCGGTAG CCTTTTCCTT GATTCT             36
(2)SEQ ID NO：16的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：36碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3450
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
AGAATCAAGG AAAAGGCTAC CGAGTTCTTG AACCAT             36
(2)SEQ ID NO：17的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：42碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3520
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
ATCAATCAGA AGCTTTCTCT CGAGACGGGC ATCGGAGTCC CG      42
(2)SEQ ID NO：18的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：18碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3781
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
AATTGGGGCC CAGCGTCC                                 18
(2)SEQ ID NO：19的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：18碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3782
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
AATTGGACGC TGGGCCCC
(2)SEQ ID NO：20的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：43碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
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(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3746
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
TGACCAATAA AGCTTCTCGA GTAGCAAGAA GACCCAGTCA ATC     43
(2)SEQ ID NO：21的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：47碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3747
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
CTACAAACGG CCACGCTGGA GATCCGCCGG CGTTCGAAAT AACCAGT 47
(2)SEQ ID NO：22的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：26碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB4234
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
GAAGACCCAG TCAAGCTTG CATGAGC                        26
(2)SEQ ID NO：23的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：43碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB4235
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
TGACCAATTA AGCTTGCGGC CGCTCGAGGT CGCACCGGCA AAC     43
(2)SEQ ID NO：24的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：69碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB 4236
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
TGACCAATAA AGCTTAGATC TGGGGGTGAT TGGGCGGAGT         40
GTTTTGCTTA GACAATCAAT CCATTTCGC                     69
(2)SEQ ID NO：25的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：36碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB4233
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：
TGACCAATAG ATCTAAGCTT GACTGGGTCT TCTTGC             36
(2)SEQ ID NO：26的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：32碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3514
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：
CTGCGAATTC GTCGACATGC CTCAATCCTG GG                 32
(2)SEQ ID NO：27的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：37碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3515
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：
GGCAGTCTAG AGTCGACCTA TGGAGTCACC ACATTTC            37
(2)SEQ ID NO：28的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：50碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3701
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：
CTGCGAATTC GTCGACACTA GTGGTACCAT TATAGCCATA         40
GGACAGCAAG                                          50
(2)SEQ ID NO：29的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：70碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3700
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：
GCTCTAGAGC GCGCTTATCA GCTTC CAGTT CTTCCCAGGA        40
TTGAGGCATT TTTAATGTTA CTTCTCTTGC                    70
(2)SEQ ID NO：30的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：50碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3702
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：
CTGCGAATTC GTCGACACTA GTGGTACCAT CCTTTTGTTG         40
TTTCCGGGTG                                          50
(2)SEQ ID NO：31的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：70碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3703
(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：
GCTCTAGAGC GCGCTTATCA GCGGCCAGTT CTTCCCAGGA         40
TTGAGGCATT GTATATGAGA TAGTTGATTG                    70
(2)SEQ ID NO：32的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：55碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3704
(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：
GCTCTAGAAG TCGACACTAG TCTGCTACGT ACTCGAGAAT         40
TTATACTTAG ATAAG                                    55
(2)SEQ ID NO：33的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：25碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3705
(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：
TGCTCTAGAT CTCAAGCCAC AATTC                         25
(2)SEQ ID NO：34的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：31碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3965
(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：
CTGCTACGTA ATGTTTTCAT TGCTGTTTTA C                  31
(2)SEQ ID NO：35的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：37碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3966
(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：
CCGCCCAGTC TCGAGTCAGA TGGCTTTGGC CAGCCCC            37
(2)SEQ ID NO：36的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：44碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：无
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3825
(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：
CGCGCTTATC AGCGGCCAGT TCTTCCCAGG ATTGAGGCAT ATGT    44
(2)SEQ ID NO：37的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：44碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单股
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假设：无
(iii)反意义：有
(vii)直接来源：
(B)克隆：AB3826
(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：
CTAGACATAT GCCTCAATCC TGGGAAGAAC TGGCCGCTGA TAAG    44

Claims (26)

1.获得无选择标志基因的重组菌株的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将所需的DNA片断和显性与乙酰胺酶双向选择标志基因整合到菌株的基因组中，所述标志基因侧翼连接有正向DNA重复，
(b)选择转化株，
(c)通过位于选择标志基因侧翼的正向DNA重复之间的重组缺失该乙酰胺酶选择标志基因，和
(d)基于没有乙酰胺酶选择标志基因进行反选择。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于在选择标志基因的5’或3’克隆一序列，该序列与一序列形成重复，后一序列是待从基因组中删除的序列的3’或5’。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所需DNA片断含有选自以下组的遗传元件：基因、cDNA、启动子、终止子、调节元件、内含子、DNA结合蛋白质的识别序列、翻译起始位点、限制性位点和其组合。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中使用相同或不同的所需DNA片断，对获得的重组菌株重复进行步骤(a)到(d)。
5.根据权利要求4的方法，其中选择标志基因是真菌来源的乙酰胺酶基因。
6.根据权利要求5的方法，其中选择标志基因是曲霉属真菌来源的乙酰胺酶基因。
7.制备生物活性化合物的方法，该方法包括培养根据权利要求1-6任一项的方法产生的重组菌株的步骤。
8.根据权利要求7的方法，其中生物活性化合物是蛋白质。
9.根据权利要求7的方法，其中生物活性化合物是抗生素。
10.根据权利要求1-6任一项的方法产生的重组菌株在制备生物活性化合物中的用途。
11.根据权利要求10的用途，其中生物活性化合物是蛋白质。
12.根据权利要求10的用途，其中生物活性化合物是抗生素。
13.根据权利要求1-6任一项的方法产生的无选择标志的重组菌株，含有包含所需DNA片断的重组载体。
14.根据权利要求13的无选择标志的重组菌株，其特征在于所需DNA片断通过位点特异性同源重组被整合到所述重组菌株的基因组中。
15.根据权利要求13-14任一项的无选择标志的重组菌株，其特征在于所需DNA片断含有选自以下组的遗传元件：基因、cDNA、启动子、终止子、调节元件、内含子、DNA结合蛋白质的识别序列、翻译起始位点、限制性位点和其组合。
16.根据权利要求13-14任一项的无选择标志的重组菌株，其特征在于所需DNA片断含有编码凝乳酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、脂酶、淀粉酶、蛋白酶、或β-半乳糖苷酶的序列。
17.根据权利要求13-14任一项的无选择标志的重组菌株，其特征在于所需DNA片断对于所述重组菌株是外源的。
18.根据权利要求13-14任一项的无选择标志的重组菌株，其特征在于它在其基因组中包含所需的缺失。
19.根据权利要求13-14任一项的无选择标志的重组菌株，其中重组菌株是丝状真菌、酵母或细菌。
20.根据权利要求19的重组菌株，其中丝状真菌是曲霉属、木霉属或青霉属真菌。
21.根据权利要求19的重组菌株，其中酵母是克鲁维酵母属或酵母属酵母。
22.根据权利要求19的重组菌株，其中细菌是革兰氏阳性细菌。
23.根据权利要求22的重组菌株，其中革兰氏阳性细菌是芽孢杆菌。
24.根据权利要求23的重组菌株，其中芽孢杆菌是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌菌株。
25.根据权利要求19的重组菌株，其中细菌是革兰氏阴性细菌。
26.根据权利要求25的重组菌株，其中革兰氏阴性细菌是大肠杆菌菌株。
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