CZ11497A3

CZ11497A3 - Konjugáty vyrobené z kovových komplexů a oligonukleotidů, činidla obsahující konjugáty, jejich použití v radiodiagnostice jakož i způsob jejich výroby

Info

Publication number: CZ11497A3
Application number: CZ97114A
Authority: CZ
Inventors: Ludger Dinkelborg; Christoph-Stephan Hilger; Ulrich Niedballa; Johannes Platzek; Bernd Radüchel; Ulrich Speck; Larry Gold; Wolfgang Pieken
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft; Nextstar Pharmaceuticals Inc.
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1995-06-30
Publication date: 1998-08-12
Also published as: EP0777498A1; NO970141D0; SK2897A3; NO970141L; CN1152879A; MX9606443A; NZ289831A; IL114237A; RU2165771C2; IL114237A0; ATE265229T1; PT777498E; JPH10503182A; DE69532958D1; DK0777498T3; HU220859B1; CZ295930B6; SK284598B6; HU9700100D0; KR100366525B1

Description

Oblast -techniky i (i 9 7· 1 «

Tento vynález se týká objektu charakterizovaného™·—''’ v patentových nárocích, tj . oligonukleotidových konjugátů, které obsahují komplexační činidlo nebo komplex. Tyto konjugáty se používají v oblastech diagnostiky a léčení.

Dosavadní stav techniky

Zobrazovací diagnostika dosáhla velkého pokroku v posledních desetiletích a je kontinuálně dále vyvíjena. Nyní je možné zviditelnit vaskulární systém, většinu orgánů a mnoho tkání v živém těle bez podstatné intervence. V mnoha případech jsou diagnostikovány choroby, protože vedou k jasné změně tvaru, velikosti a polohy anatomických struktur v těle. Takové anatomické údaje ze vnitřku těla mohou být získány rentgenovou technologií, ultrazvukovou diagnózou a magneticko-rezonanční tomografií. Účinnost každé z výše zmíněných technologii může být zlepšena použitím farmaceutických činidel pro zvýšení přirozeného kontrastu tkání a tělesných kapalin ve výsledném obraze. Příslušná farmaceutická činidla jsou zaváděna do tělesných dutin nebo injektována do krevních cév za účelem změny kontrastu dutin nebo cév. Navíc jsou rozšiřována v krevním proudu v organismu a mohou měnit viditelnost orgánů a tkání. Ve vyj íměčných případech se takové složky vážou k určitým strukturám v těle a/nebo aktivně transportují a/nebo vxlučují později. Tímto způsobem mohou také být zviditelněny v jednotlivých případech funkce a být použity pro diagnostiku choroby.

Na rozdíl od toho je nukleární diagnóza založena na substancích, které mohou být samy viditelné. V tomro případě se do těla zavádějí radioaktivní izotopy, které emitují radiaci s dlouhým doletem. Rozptýlení těchto substancí v organismu může být sledováno vhodnými detektory. Výhodou nukleárního medikálního procesu je vyšší účinnost při nízké dávce signál-přenášjících radioaktivních substancí označených jako radiofarmaceutická činidla.

Jestliže se použijí izotopy, které uvolňují a- nebo β-radiaci nebo jiné toxické produkty rozkladu účinné ve tkáni, mohou být také použita radiofarmaceutická činidla pro terapeutické účely, např. pro destrukci tumorů. Stejného výsledku je možno dosáhnout, jestliže se neškodné izotopy nebo substance zavádějí do těla a převádějí se pouze zde, např. neutronovým nebo rentgenovým zářením, ultrazvukovými nebo radiovými vlnami, na terapeuticky účinnou formu.

Obecným problémem je diagnostika a lokalizace patologických změn v době, kdy nejsou dostupné žádné jasné změny tvaru, struktury a cirkulace ve zkoumaných orgánech a tkáních. Taková diagnostika a sledování má rozhodující důležitost, např. v případě nádorových onemocnění, zahrnujících zjišfování metastáz, hodnocení nedostatečného zásobování tkání kyslíkem a v případě určitých infekcí i metabolických chorob.

Nyní dostupné terapeutické a zobrazovací diagnostické metody jsou závislé na dostupnosti farmaceutických přípravků, které se akumuluji na místech jinak netegovatelných patologických změn.

Kontrastní media komerčně v současnosti dostupná jsou převážně takzvané nespecifické přípravky. Rozšiřují se pasivně v prostorech, do kterých jsou zaváděny, např. inj ekcí.

V minulosti bylo identifikováno mnoho substancí a tříd substancí, které mohou být detegovány nebo mohou být očekávány jako mající specifitu vzhledem kjejich rozšíření v živém organismu. Příklady v tomto ohledu jsou, navíc k protilátkám, lektiny, všechny typy receptor-vázajících substanci, buňky, membrány a membránové složky, nuleové kyseliny, přírodní metabolity a jejich deriváty jakož i bezpočet farmaceutických substancí. Také byly a jsou studovány se zvláštní péčí peptidy.

US patent č. 4707352 pojednává o speciálním způsobu značení komplexačních molekul s radioaktivními isotopy, jsou ale popsána ne právě vhodná komplexační činidla pro vazbu kovových iontů.

EP-A-0285057 popisuje konjugáty nukleotid-komplexační činidlo, které nejsou vhodné, mezi jiným pro in vivo nestabilitu použitých nukleotidů, pro použití jako ín vivo diagnostická činidla nebo terapeutická činidla a také stěží splňují další požadavky kompatibility a farmakokinetiky.

Mnoho US patentů jako je např. US patent č. 4707440 se zabývá modifikovanými polymery, které obsahují detegovatelnou chemickou skupinu. Polymery mohou být polynukleotidy a oligonukleotidy, ale nejsou ani stabilizovány proti degradaci přirozeně se vyskytujícími nukleasami ani vybrány speciálním procesem, tak že se vázaly specificky s vysokou vazebnou afinitou k cílovým strukturám. Speciální provedení těchto detegovatelných molekul jsou uvedena v US patentech č. 4843122 a 4943523. Individuální nukleotid, modifikovaný tímto způsobem, je nárokován v US patentu č. 4952685. Použití těchto činidel ze zobrazovacích procesech je popsáno v US patentu č. 4849208.

Objektem tohoto vynálezu je příprava specifických vazebných diagnostických činidel pro detekci cílových struktur, kterými je, například možná vizualizace orgánů, tkání a jejich patologických změn in vitro a in vivo.

Podstata vynálezu

Nyní bylo nalezeno, že tohoto objektu se dosáhne oligonukleotidovými konjugáty, které navíc k oligonukleotidovému radikálu vykazují komplexační činidlo, navázané přímou vazbou nebo spojovací složkou, a jejichž oligonukleotidový radikál je modifikován tak, že je zabráněno degradaci přirozeně se vyskytuj ícími nukleasami nebo je tato alespoň významně inhibována.

Objektem tohoto vynálezu jsou:

1. Oligonukleotidové konjugáty, obsahující oligonukleotidový radikál N a n substituenty (B-K), kde B znamená přímou vazbu nebo spojovací složku k oligonukleotidovému radikálu a K znamená komplexační činidlo nebo komplex radioaktivních kovových izotopů, nebo stabilních izotopů, které

- jsou převedeny na radioaktivní izotopy vnější ozařováním,

- převádějí radiaci z vnějšku na radiaci jiné kvality, jiného energetického obsahu a/nebo jiné vlnové délky, prvků atomových čísel 5, 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 nebo 85, vyznačující se tím, že oligonukleotidový radikál

N vykazuje modifikaci, která brání nebo alespoň významně inhibuje degradaci přirozeně se vyskytujícími nukleasami.

2. Ve výhodném provedení mají oligonukleotidové konjugáty podle tohoto vynálezu obecný vzorec I

Ν-(Β-Κ)_η (I) kde N je oligonukleotid, který se váže specificky s vysokou vazebnou afinitou k jiným cílovým strukturám a vykazuje modifikace, které významně redukují degradaci přirozeně se vyskytuj ícími nukleasami,

B je chemická vazba nebo spojovací složka, které poskytuje spojení mezi N a K a

K je komplexační ligand, který může vykazovat signál-transmitující nebo terapeuticky aktivní prvek a n je číslo mezi 1 a 10.

3. Sloučenina podle 1 nebo 2, ve které N je oligonukleotid s 5 až 200 nukleotidy, kde (a) 2’-poloha cukrové jednotky, nezávisle na jakékoliv jiné, je obsazena následujícími skupinami: skupina OR, kde

R znamená alkylový radikál s 1 až 20 atomy uhlíku, který popřípadě obsahuje až 2 hydroxylové skupiny a který je popřípadě přerušen 1 až 5 atomy kyslíku, atom vodíku, hydroxylová skupina, atom fluoru, aminový radikál, aminoskupina, hydroxylové skupiny přítomná v terminálních polohách 3’ a 5’, nezávisle na jiných, jsou popřípadě etherifikovány radikálem R a/nebo (b) fosfodiestery, popřípadě použité jako internukleotidová vazba, nezávisle na jiných, jsou nahrazeny fosforothioáty, fosforodithioáty nebo alkylfosfonáty, výhodně methylfosfonátem a/nebo (c) koncové radikály ve 3’- a 5’-polohách jsou spojeny intramolekulárním způsobem vzájemně internukleotidovou vazbou jak je popsáno v b) a/nebo (d) obsahuje internukleotidovou vazbu jak je popsána v b) , která spojuje 3’-3’- nebo 5’-5’-polohu a/nebo (e) obsahuje fosforodiesterovou vazbu jak je popsána v b) , která spojuje, podobně jako ester, dva thymidiny C2-C2ohydro^xy^alkylovým radikálem v poloze 3 nebo spojuje analogicky substituovaný thymidinový radikál, podobně jako ester, s hydroxylovou skupinou jiného cukru ve 2’- nebo 3’nebo 5’-poloze a/nebo (f) terminální radikály v polohách 3’ a 5’ obsahují internukleotidové vazby modifikované jak je popsáno v b).

4. Sloučenina podle 3, kde oligonukleotid N obsahuje 15 až 100 nukleotidů.

5. Sloučenina podle bodů 1 až 4, kde N je oligonukleotid, který se specificky váže s vysokou vazebnou afinitou k jiným cílovým strukturám a který může být získán tak, že se směs oligonukleotidů, obsahujících náhodné sekvence uvede do styku s cílovou strukturou a určité oligonukleotidy vykazují zvýšenou afinitu k cílovým strukturám vzhledem ke směsi oligonukleotidů, posledně uvedené se oddělí od zbývající oligonukleotidové směsi, potom se oligonukleotidy se zvýšenou afinitou k cílové struktuře amplifikují za získání směsi oligonukleotidů, která vykazuje zvýšený podíl oligonukleotidů, které se vážou k cílovým strukturám.

6. Sloučeniny, jak jsou popsány v bodech 1 až 5, kde N je oligonukleotid, který se specificky váže s vysokou vazebnou afinitou k jiným cílovým strukturám a který může být získán tak, že (a) se nejprve vyrobí DNA řetězec chemickou syntézou tak, že na 3’-konci tento DNA řetězec vykazuje definovanou sekvenci která je komplementární k promotoru pro

RNA-polymerasu a současně komplementární k primerů polymerasové řetězové reakce (PCR) a že tak tento DNA řetězec vykazuje definovanou sekvenci na 5’-konci, která je komplementární k primerové sekvenci pro polymerasovou řetězovou reakci a sekvence mezi definovanými sekvencemi obsahuje náhodnou sekvenci a že (b) tento DNA řetězec je transkribován do komplementárního RNA řetězce za pomoci RNA-polymerasy a polymerase jsou poskytnuty nukleotidy, které jsou modifikovány ve 2’-poloze ribozové jednotky a že (c) RNA oligonukleotidy, produkované tímto způsobem, jsou uvedeny do styku s cílovou strukturou, na kterou se oligonukleotid specificky váže a že (d) tyto oligonukleotidy, které se navázaly na cílovou strukturu jsou odděleny nejprve spolu s cílovou strukturou od nenavázaných oligonukleotidů a pak jsou navázané oligonukleotidy opět odděleny od cílové struktury a že (e) tyto cílově strukturně specifické RNA oligonukleotidy jsou transkribovány za pomoci reverzní transkriptásy do komplementárního DNA žetězce a že (f) tyto DNA řetězce jsou amplifikovány s polymerasovou řetězovou reakcí za použití definovaných příměrových sekvencí a že (g) DNA oligonukleotidy aplifikované tímto způsobem jsou pak transkribovány opět za pomoci RNA-polymerasy a s modifikovanými nukleotidy do RNA-oligonukleotidů a že (h) výše uvedené selekční stupně c) až g) se popřípadě opakují tolikrát, až jsou dostatečně vybrány oligonukleotidy, které se vyznačují vysokou vazebnou afinitou k cílové struktuře a pak jsou sekvence takto získaných oligonukleotidů popřípadě schopny být stanoveny.

7. Sloučenina podle 6, kde je cílová struktura vybrána z makromolekul, tkáňových striktur vyšších organismů jako jsou zvířata nebo lidé, orgánů nebo částí orgánů zvířat nebo lidí, buněk, nádorových buněk nebo nádorů.

8. Sloučenina podle bodů 1 až 7, kde spojovací složka(y)

B je (jsou) navázána(y) (a) ke 4’-konci oligonukleotidového radikálu N redukovaného ve 4’-poloze Ci^-OH skupinou a/nebo (b) ke 3’-konci oligonukleotidového radikálu N redukovaného ve 3’-poloze atomem vodíku a/nebo (c) k fosfodiesterovému můstku(ům), redukovanému OH skupinou(amin), mezi každými dvěma nukleotidy a/nebo (d) k 1 až 10 nukleobázím,které jsou redukovány atomem vodíku v 5-, 8-poloze(polohách) a/nebo aminoskupině(nám) v poloze(polohách) 2-, 4- a 6-,

9. Sloučenina podle bodu 8a) nebo 8b), kde B má obecný vzorec Χ-Ύ-Ζ^, který je spojen na X straně s komplexačním činidlem nebo koplexem a na Z straně s oligonukleotidem, ve kterém

X znamená přímou vazbu, -NH nebo -S skupinu,

Y znamená přímý, rozvětvený, nasycený nebo nenasycený C1-C20 alkylenový řetězec, který popřípadě obsahuje 1-2 cyklohexyleny, 1-5 imino, 1-3 fenyleny, 1-3 fenylenimino,

1-3 fenylenoxy, 1-3 hydroxyfenyleny, 1-5 amido, 1-2 hydrazido, 1-5 karbonyl, 1-5 ethylenoxy, ureido, thioureido, 1-2 karboxyalkylimino, 1-2 esterové skupiny, 1-3 skupiny Ar, ve kterých Ar představuje nasycený nebo nenasycený 5- nebo

6-členný kruh, který popřípadě obsahuje 1 až 2 heteroatomy vybrané z dusíku, kyslíku a síry a/nebo 1-2 karbonylové skupiny; 1-10 kyslékových, 1-5 dusíkových a/nebo 1-5 sírových atomů a/nebo je popřípadě substituován 1-5 hydroxy, 1-2 merkapto, 1-5 oxo, 1-5 thioxo, 1-3 karboxy, 1-5 karboxy-C^-C^alkyl, 1-5 ester, 1-3 amino, 1-3 hydroxy-C^-C4 alkyl, 1-3 C-^-C-y alkoxyskupinami a

Z¹ znamená -CONH-CH2-4’, -NH-CO-4’, -0-P(0)R¹-NH-CH2-4’ ,

-0-P(0)R¹-NH-CH₂-4’, -O-P(S)R¹-O-3’ nebo -0-P(0)R’-0-3’, kde

4’ nebo 3’ znamená spojení k terminální cukrové jednotce (jednotkám) a R^ znamená 0, S, C-^-C₄alkyl nebo NR^R^ o 3 skuoinu, kde R a R znamená vodík a C^-C^alkylové radikály.

Jako cyklické struktury (Ar), jsou vhodné zejména cyklické nasycené nebo nenasycené alkyleny se 3 až 6, zejmén 5 nebo 6 C atomy, které popřípadě obsahují heteroatomy, jako je N, S nebo 0. Jako příklady je možno uvést: cyklopentylen, pyrrolylen, furanylen, thiofenylen, imidazolylen, oxazoliden, thiazolylen, pyrazolylen, pyrrolidylen, pyridylen, pyrimidylen, maleinimidylen a ftalimidylen skupiny.

v · 9

10. Sloučenina podle 8c), kde B má obecný vzorec X-Y-Z , který je spojen na X straně s komplexaěním činidlem nebo komplexem a na Z straně s oligonukleotidem, kde

Z v můstkovém spojení dvou sousedících cukrových jednotek o

II

Z² - P - 0-5’ a/nebo

I o

3’

Z²- P - 0 - 5’

3’

O představuje skupinu -NR -, -0- nebo-S- a X, Y a R mají význam uvedený v bodě 9.

Jako příklady radikálů Y spojovací složky Z^-Y-X (podle bodu 9) nebo Z²-Y-X (podle bodu 10), mohou být uvedeny následující

- (CH₂) ₆-NH-CS-NH-C_sH₄-CH(CH₂CO₂H) -CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH) -ch₂-,

- (CH₂) ₆-NH-CS-NH-C_sH₄-CH₂-, - (CH₂)_s-NH-C0-CH₂-,

- (CH₂)_s-NH-CO-CH₂-CH₂-, -(CHJ₂-, -(CH₂)_s-, -(CH₂)_s-S-(CH₂)₂- (CH₂)_s-S-(CH₂)_s-, - (CH₂)₂-NH-CO-, - (CH₂)_s-NH-C0-,

- (CH₂) s-S- (CH₂) -NH-CO, - (CH₂) _s-S- (CHj S-NH-CO-,

- (CHJ ₆-S-CH-CH₂-CO-N- (CHJ _s-NH-NH-CO-CH₂-O-C₆H₄-CH₂- , co (CHJ _s-S-CH-CH₂-C(>N- (chj₂-o- (chj₂-nh-co-ch₂-, ^cc

- (CHJ ₅-S-CH-CH₂-CO-N- (CH₂) 2-C0-NH- (CHJ 3-,

- (CHJ _s-S-CH-CH₂-C0-N- (CHJ ₂-C0-NH- (CHJ ₄- ,

- (CHJ s-S- (CHJ ₂-C=CH-CH=CH^.C-CH₂-0- (CHJ _s- nebo (CHJ s-S- (CH₂)₂-C^CH-CH=CH₇C-CH₂-0-CH₂-C0-NH-CH₂-C_SH₃OH’N^;

11. Sloučenina podle 8d) , kde B má obecný vzorec X-Y-Z^, kde 3 v

Z představuje -NH skupinu nebo přímou vazbu k nukleobázi a X a Y maj í významy uvedené v nároku 9.

Jako příklady radikálů je možno uvést -CH2-CONH-CH₂-CH(OH) -ch₂-, -nh-co-ch₂-co-nh-ch₂-ch(oh) -ch₂-, -co-nh-ch₂-ch₂-nh-, -ch₂-s-ch₂-ch₂-nh-, -ch₂-s-ch₂-ch₂-,

- (ch₂)₄-s-ch₂-ch₂-nh-, -co-ch₂-s-ch₂-ch₂-nh-, -co-ch₂-s(CH₂)₆-NH-_z -ch=ch-co-nh-ch₂-ch₂-nh-, -ch=ch-ch₂-nh-, -C=C-CH₂-NH- nebo -CO-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-.

Jako vazebné místo v případě purinových bází je zvláště vhodná 8-poloha a v případě pyrimidinových bází je vhodná 5-poloha. Čistě formálně v tomto případěě je atom vodíku odpovídající báze nahrazen radikálem B-K. Spojení ale může také být uskutečněno aminoskupinami popřípadě obsaženými v poloze 2-, 4- nebo 6-, např. 2-aminoskupinou ve guaninu, 6-aminoskupinou v adeninu nebo 4-aminoskupinou v cytosinu. V tomto případě je atom vodíku odpovídající aminoskupiny nahrazen radikálem B-K.

12. Sloučeniny podle některého z předcházejících bodů, kde kovový komplex, jako zobrazovací činidlo, obsahuje radioaktivní izotop, vybraný z prvků měď, vismut, technecium, rheníum nebo indium.

13. Vynález také zahrnuje způsob detekce cílové struktury, při kterém jedna nebo více ze sloučenin podle některého z předchozích bodů j sou uvedeny do styku in vivo nebo in vitro se vzorkem, který je studován a na základě signálu je detegováno, zda cílová strutura, na kterou se oligonukleotid

N váže specificky a s vysokou vazebnou afinitou, je přítomna ve vzorku jakož i

14. Způsob neinvazivní diagnózy chorob, při kterém se jedna nebo více ze sloučenin podle některého z nároků 1 až 12 uvedou do styku s cílovou strukturou, která je studována in vivo a na podle signálu je delegováno, zda cílová struktura, na kterou se oligonukleotid N specificky váže, je přítomna ve studovaném organismu.

15. Objektem vynálezu je také použití sloučeniny podle nároků 1 až 12 v radiodiagnoze a/nebo radioterapii, jakož i

16. Diagnostický kit pro in vivo a/nebo in vitro detekci cílových struktur, kde diagnostický kit obsahuje alespoň jednu sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12.

17. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde N je přirozeně se nevyskytující oligonukleotidový ligand, mající specifickou vazebnou afinitu pro cílovou molekulu, kde taková cílová molekula je trojrozměrná chemická struktura jiná než polynukleotid, který se váže k uvedenému oligonukleotidovému ligandu mechanismem, který převážně závisí na Vatson/Crickově párování bází nebo vazbě trojné šroubovice, kde uvedený oligonukleotidový ligand není nukleová kyselina, mající známou fyziologickou funkci navázanou k cílové molekule.

Jestliže se konjugáty podle vynálezu používají jako diagnostické činidlo, komplexační činidlo(a) obsahuje(í) zobrazovací radioaktivní izotop prvků atomovývh čísel 21, 26-27, 29, 31, 43 nebo 49, výhodně 43 nebo 49. Jestliže konjugáty podle vynálezu se používají jako terapeutické činidlo, mimo výše uvedených, jsou také vhodné izotopy prvků atomových čísel 5, 22-25, 28, 42, 44, 57-83 a 85. Mimo radioaktivních izotopů výše uvedených prvků jsou také vhodné stabilní izotopy, které (a) jsou převedeny vnějším ozařováním jiné kvality, jiného energetického obsahu a/nebo jiné vlnové délky, v rozsahu léčby.

Počet zobrazovacích nebo terapeuticky účinných substituentů B-K spojených s oligonukleotidovým radikálem je na jedné straně omezen hodnotou oligoukleotidu, ale nikdy není větší než 10. Podle vynálezu jsou preferovány jeden nebo dva substitenty B-K.

Hodnota oligonukleotidového radikálu N není v zásadě omezena. Pro tento vynález jsou používány oligonukleotidy s 5 až 200 nukleotidy, zejména preferovány jsou oligonukleotidy s 15 až 100 nukleotidy.

Oligonukleotidy použitelné podle vynálezu jsou stabilizovány proti degradaci nukleasami vyskytujícími se in vivo.

Nemodifikované oligonukleotidy nebo polynukleotidy j sou štěpeny in vivo endonukleasami a exonukleasami. Degradační reakce v RNA sériích začíná aktivaci 2 ’-hydroxyskupiny. Jiné katabolické enzymy jsou, např. ribozymy, které štěpí diesterovou vazbu RNS (viz Science 261, 709 (1993)). In vivo stabilita RNS derivátů může být zvýšena částečnou nebo úplnou náhradou 2’-hydroxylové skupiny jinými substituenty. Takovými substituenty jsou, například, alkoxyskupiny, zejména methoxyskupina (viz např. Chem.Pharm.Bull. 13, 1273 (1965), Biochemistry 10, 2581, (1971)), atom vodíku, atom fluoru (viz např. Can.J.Chem.

46, 1131 (1968)) nebo aminoskupina (viz např. J.Org.Chem.

42, 714 (197)). Některé z těchto substituentů, jako jiné, mohou být také zavedeny do 2’-polohy za použití metod popsaných v US přihlášce Ser.No. 08/264029, podané 22.června 1994. Další možnosti stabilizace internukleotidové vazby jsou nahrazení jednoho nebo dvou kyslíkových atomů ve fosfodiesterovém můstku za tvorby fosforothioátů (Trends Biochem. Sci. 14, 97 (1989)) nebo fosforodithioátů (J.Chem.SOc. , Chem. Commun. 591 (1983) a Nucleic Acids Res. 12, 9095 (1984)) a použití alkylfosfonátů místo fosfodiesterů (Ann.Rep. N.Y.Acad. Sci. 507, 220 (1988)).

Stabilizace může být dosaženo tím, že hydroxylové skupiny v poloze 2’ ribozových jednotek, jsou modifikovány. Takové modifikace lze dosáhnout nahrazením této hyxdroxylové skupiny OR skupinou, atomem halogenu, zejména atomem fluoru, atomem vodíku nebo aminovým radikálem, zejména aminoskupinou. Radikál R alkoxyskupiny představuje v tomto případě přímý nebo rozvětvený alkylový radikál s 1 až 20 C atomy jako je methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, terč.butyl, pentyl nebo hexyl nebo cyklický nesubstituovaný nebo substituovaný alkylový radikál s 4 až 20 C atomy jako je cyklopentyl nebo cyklohexyl, který popřípadě obsahuje 1 až 2 hydroxyskupiny a popřípadě je přerušen 1 až 5 atomy kyslíku. Stabilizace je také zvýšena protože hydroxylové skupiny popřípadě přítomné v polohách 3’ a 5’ j sou etherifikovány.

Jiná stabilizace polynukleotidů se provádí tak, že fosforodiestery použité jako internukleotidová vazba jsou nahrazeny částečně nebo úplně a nezávisle na sobě, fosforothioáty, fosforodithioáty nebo alkylfosfonáty, zvláště výhodně nižšími alkylfosfonáty jako je, např. meťhylfosfonát. Tyto internukleotidové vazby mohou být také připojeny k terminálním radikálům ve 3’- a 5’-polohách nebo jinak také spojovat 3’-3’- nebo 5’-5’-polohy.

Fosfodiesterová vazba umožňuje další spojení hydroxyalkylových radikálů, které jsou přítomny na dusíkových nebo kyslíkových atomech nukleobází, tak například mohou být dva thymidiny spojeny hydroxyalkylovými řetězci přítomnými ve 3-poloze nebo dvě purinové báze radikály přítomnými v 8-poloze. Spojení může být také uskutečněno k hydroxylovým skupinám ve 2’- nebo 3’- nebo 5’-poloze.

Modifikované internukleotidové vazby se výhodně mohou objevovat na koncích polynukleotidu a jsou zejména výhodně navázány ke thymidinu.

Podle vynálezu nejsou použité N oligonukleotidové radikály omezeny na specifické oligonukleotidové sekvence. Výhodné jsou ale ty oligonukleotidy, které se vážou specificky s vysokou vazebnou afinitou k cílovým strukturám s výjimkou nukleové kyseliny.

Způsob identifikace vhodných oligonukleotidů, které jsou vyžadovány jako počáteční substance pro konjugáty podle vynálezu, je popsán v US patentu 5270163. Tento proces nazvaný SELEX, může být použit pro přípravu nukleokyselinového ligandu k jakékoliv požadované cílové molekule.

SELEX metoda zahrnuje výběr ze směsi kandidátů oligonukleotidů a postupné opakování vazby, podílení se a amplifikace, za použití stejného obecného výběrového schématu, k dosažení potenciálně jakéhokoliv požadovaného kriteria vazebné afinity a selektivity. Vychází se ze směsi nukleových kyselin, výhodně obsahujících segment náhodné sekvence a SELEX metoda zahrnuje stupně kontaktování směsi s cílem za podmínek vodných pro vazbu, oddělí se nenavázané nukleové kyseliny od těch nukleových kyselin, které se specificky vážou k cílovým molekulám, disociují se komplexy nukleová kyselina-cíl, amplifikují se nukleové kyseliny disociované z komplexů nukleová kyselina-cíl za získání ligandem obohacené směsi nukleových kyselin, potom se opakují stupně navázání, rozdělení, disociace a amplifikace v tolika cyklech, kolik jich je potřebných pro získání vysoce specifických, vysoce afinitních nukleokyselinových ligandů k cílové molekule.

Základní SELEX metoda byla modifikována k dosažení mnoha specifických objektů. Například US patentová přihláška č. 07/960093, podaná 14.října 1992 popisuje použití SELEXu ve spojení s gelovou elektroforézou k vybrání molekul nukleové kyseliny se specifickými strukturními charakteristikami jako je ohyb DNA. US patentová přihláška č. 08/123935 podaná 12. září 1993 popisuje metodu na bázu SELEXu pro výběr nukleokyselinových ligandů, obsahujících fotoreaktivní skupiny schopné vazby a/nebo fotozesítění k a/nebo fotoinaktivace cílové molekuly. US patentová přihláška č. 08/134028, podaná 7.října 1993, popisuje způsob identifikace vysoce specifických nukleokyselinových ligandů schopných rozlišovat mezi blízce příbuznými molekulami, nazvanou Counter-SELEX. US patentová přihláška č.

08/143564, podaná 25. října 1993 popisuje metodu na bázi SELEXu, kterou se dosáhne vysoce účinného rozdělení mezi oligonukleotidy, majícími vysokou a nízkou afinitu k cílovým molekulám. US patentová přihláška č. 07/964624, podaná

21.října 1992 popisuje metody získání zlepšených nukleokyselinových ligandů po provedení SELEXu. US patentová přihláška č. 08/400440, podaná 8.března 1995 popisuje metody pro kovalentní navázání ligandu k jeho cíli.

SELEX metoda zahrnuje identifikaci vysoce afinitních nukleokyselinových ligandů, obsahujících modifikované nukleotidy poskytnutím zlepšených charakteristik ligandu, jako je zlepšená in vivo stabilita nebo zlepšené dodávací charakteristiky. Příklady takových modifikací zahrnují chemické substituce na riboze a/nebo fosfátu a/nebo bázi. SELEX-identifikované nukleokyselinové ligandy obsahující modifikované nukleotidy jsou popsány v US patentové přihlášce č. 08/117991, podané 8.září 1993, která popisuje oligonukleotidy, obsahující nukleotidové deriváty chemicky modifikované v 5- a 2’-polohách pyrimidinů. US patentová přihláška č. 08/134028 výše, popisuje vysoce specifické nukleokyselinové ligandy, obsahující jeden nebo více nukleotidů modifikovaných se 2’-amino (2’-NH2), 2’-fluor (2’-F) a/nebo 2’-0-methyl (2’-OMe). US patentová přihláška č. 08/264029, podaná 22.června 1994 popisuje oligonukleotidy, obsahující různě modifikované 2’ pyrimidiny.

SELEX metoda zahrnuje kombinování vybraných oligonukleotidů s jinými vybranými oligonukleotidy a neoligonukleotidovými funkčními jednotkami jak je popsáno v US patentových přihláškách č. 08/284063, podané 2.srpna 1994 a č. 08/234997, podané 28. dubna 1994. Přihlášky poskytuj i kombinaci velkého množství tvarů a j iných vlastností a účinných amplifikačnich a replikačních vlastností, oligonukleotidů se žádoucími vlastnostmi jiných molekul.

Ve své nejbázičtější formě může být SELEX způsob definován následujícími seriemi stupňů:

(1) Připraví se příslušná směs nukleových kyselin různých sekvencí. Příslušná směs obecně zahrnuje oblasti fixovaných sekvencí (tj. každý ze členů příslušné směsi obsahuje stejné sekvence ve stejném místě) a oblasti náhodných sekvencí. Fixované sekvenční regiony jsou vybrány z buď: (a) aby asistovaly v amplifikačních stupních popsaných dále, (b) aby napodobovaly sekvenci, o které je známo, že se váže k cíli, nebo (c) ke zvýšení koncentrace daného strukturního uspořádání nukleových kyselin v kandidátové směsi. Náhodné sekvence mohou být plně náhodné (tj. pravděpodobnost nalezení báze v jakékoliv poloze je jedna ke čtyřem) nebo pouze částečně náhodné (např. pravděpodobnost nalezení báze v jakémkoliv místě může být zvolena při jakékoliv hladině mezi 0 a 100 procent).

(2) Kandidátové směs se kontaktuje s vybraným cílem za podmínek výhodných pro vazbu mezi cílem a členy kandidátové směsi. Za těchto okolností mohou být interakce mezi cílem a nukléovými kyselinami kandidátové směsi považována za tvořící páry nukleová kyselina-cíl mezi cílem a těmi nukléovými kyselinami, majícími nej silnější afinitu pro cíl.

(3) Nukleové kyseliny s nejvyšší afinitou pro cíl se odliší od těch nukleových kyselin s menší afinitou k cíli. Protožev kandidátové směsi existuje pouze extrémně malý počet sekvencí (a možná pouze jedna molekula kyseliny), odpovídajících nejvýše afinitním nukleokyselinám, je obecně žádoucí vytvořit odlišovací kriteria tak, aby podstatné množství nukleokyselin v kandidátové směsi (přibližně 5 až 50 %) se během odlišování zachovalo.

(4) Ty nukleové kyseliny vybrané během odlišování jako mající relativně vyšší afinitu k cíli jsou pak aplifikovány pro vytvořenínové kandidátové směsi, která je obohacena o nukleové kyseliny, mající relativně vyšší afinitu pro cíl.

(5) Opakováním odlišovacích a amplifikačních stupňů výše, obsahuje nově vytvořená kandidátově směs méně a méně jedinečných sekvencí a průměrný stupeň afinity nukleových kyselin k cíli se obecně bude zvyšovat. Extrémně vzato bude SELEX proces poskytovat kandidátovou směs, obsahující jednu nebo malý počet jedinečných nukleových kyselin, představuj ících ty nukleové kyseliny z původní kandidátové směsi, mající nejvyšší afinitu k cílové molekule.

SELEX patenty a aplikace popisují a vypracovávají tento proces podrobněji. Zahrnuty jsou cíle, které mohou být použity v procesu; metody pro odlišení nukleových kyselin v kandidátové směsi; a metody pro amplifikaci odlišených nukleových kyselin pro generování obohacené kandidátové směsi. SELEX patenty a přihlášky také popisují ligandy získané ke mnoha cílovým druhům, zahrnujícím jak proteinové cíle, kde protein je a není nukleovou kyselinu vázající protein, proto může být SELEX proces použit pro poskytnutí vysoce afinitnich ligandů cílové molekuly.

Cílové molekuly jsou výhodně proteiny, ale mohou také zahrnovat mnoho jiných karbohydrátů, peptidoglykanů a různé malé molekuly. Jako s konvenčními proteinovými protilátkami, nukleokyselinové protilátky (oligonukleotidové ligandy) mohou být použity k cíli biologických struktur, jako jsou buněčné povrchy nebo viry, přes specifickou interakci s molekulou, která je integrální částí této biologické struktury. Oligonukleotidové ligandy jsou výhodné tím, že nejsou omezeny samotolerancí jako jsou konvenční protilátky. Také nukleokyselinové protilátky nevyžadují živočišné nebo buněčné kultury pro syntézu nebo produkci, protože SELEX je plně in vitro proces. Jak je dobře známo nukelové kyseliny se mohou vázat ke komplementárním nukleokyselinovým sekvencím. Tato vlastnost nukleových kyselin může být intenzivně využita pro detekci, kvantifikaci a izolaci nukleokyselinové molekuly. Metody podle předloženého vynálezu nejsou míněny jako zahrnující tyto dobře známé vazebné schopnosti mezi nukleovými kyselinami. Specificky se metody podle předloženého vynálezu týkají použití nukleokyselinových protilátek, které nejsou míněny jako zahrnující známé vazebné afinity mezi nukleokyselinovými molekulami. Mnoho proteinů je známých jako působících přes vazbu k nukleovým sekvencím, jako jsou regulátorové proteiny, které se vážou k nukleokyselinovým operátotovým sekvencím. Známá schopnost určité nukleové kyseliny vázající proteiny, vázat se ke svým přirozeným místům, například byla použita v detekci, kvantifikaci, izolaci a čištění takových proteinů. Metody podle předloženého vynálezu vztažené k použití oligonukleotidových ligandů nejsou míněny jako zahrnující známou vazebnou afinitu mezi nukleovou kyselinu vázaj ícími proteiny a nukleokyselinovými sekvencemi, o kterých je známo, že se k nim vážou. Nicméně nové, přirozeně se nevyskytující sekvence, které se vážou ke stejným nukleokyselinovým vazebným proteinům mohou být vyvinuty pro použití SELEXu. Konkrétně, oligonukleotidové ligandy podle předloženého vynálezu se vážou k takovým cílovým molekulám, které zahrnují trojrozměrnou chemickou strukturu, jinou než polynukleotid, který se váže k uvedenému oligonukleotidovému ligandu mechanismem, který převážně závisí na Vatson/Cricko vě párování bází nebo vazbě trojného helixu, přičemž uvedený oligonukleotidový ligand není nukleová kyselina, mající známou fyziologickou funkci být vázána cílovou molekulou.

Mělo by být uvedeno, že SELEX umožňuje velmi rychlé stanovení nukleokyselinových sekvencí, které se budou vázat k proteinu a proto mohou být snadněj i použity ke stanovení struktury sekvencí neznámých operátorových a vazebných míst, které pak mohou být použity pro amplifikace zde popsané. SELEX je tak obecnou metodou pro použití nukleokyselinových molekul pro detekci, kvantifikaci, izolaci a čištění proteinů, které nejsou známé pro vázání nukleových kyselin. Navíc určité nukleokyselinové protilátky izolovatelné SELEXem mohou být také použity k ovlivňování funkce, například inhibice, zvýšení nebo aktivace funkce, specifických cílových molekul nebo struktur. Specificky mohou být nukleokyselinové protilátky použity pro inhibici, zvýšení nebo aktivaci funkce proteinů.

Oligonukleotidy použité v konjugátech podle vynálezu se získají v preferovaném provedení způsobem popsaným dále.

Vhodné oligonukleotidy mohou být získány tak, že se směs oligonukleotidů, obsahující nahodilé sekvence uvede do styku s cílovou strukturou, a určité oligonukleotidy vykazují zvýšenou afinitu k cílové struktuře vzhledem ke směsi oligonukleotidů, kde posledně uvedené jsou odděleny od zbývající oligonukleotidové směsi, potom jsou oligonukleotidy se zvýšenou afinitou k cílové struktuře amplifikovány pro získání směsi oligonukleotidů, které vykazují zvýšený podíl oligonukleotidů, které se vážou k cílové struktuře.

V procesu j e nej prve produkován DNA řetězec výhodně chemickou syntézou. Na 3’-konci má tento DNA řetězec známou sekvenci, která je použita jako promotor pro RNA polymerasu a současně je komplementární k primerové sekvenci pro polymerasovou řetězovou reakci (PCR). Ve zvláště preferovaném provedení, v tomto případě, je obsažen promotor pro T7 RNA-polymerasu. Potom se syntetizuje na promotoru nahodilá sekvence. Nahodilá sekvence může být získána tak, že se vhodné čtyři báze zavádějí ve stejném poměru do přístroje pro syntézu. Takto vznikají plně nahodilé DNA sekvence. V preferovaném provedení je délka nahodilé sekvence asi 15 až 100 nukleotidů. Další DNA sekvence, která může být použita pro polymerasovou řetězovou reakci (PCR) se syntetizuje na tomto DNA kousku s nahodilou sekvencí.

Po syntéze tohoto DNA řetězce se posledně uvedený transkribuje do komplementárního RNA řetězce za pomoci RNA polymerasy. V preferovaném provedení se tomto případě použije T7 RNA polymerasa. V transkripci jsou nukleotidy, které jsou modifikovány poskytnuty pro RNA polymerasu. Ve zvláště specifickém provedení je ribosa modifikována v poloze 2’. V tomto případě může být zahrnuto nahrazení atomu vodíku nebo hydroxylové skupiny alkoxyskupinou, výhodně methoxy, amino nebo fluorem. RNA oligonukleotidy produkované tímto způsobem jsou pak zahrnuty v selekčním procesu.

V selekčním procesu jsou RNA oligonukleotidy uvedeny do styku s cílovou strukturou. Cílovou strukturou je míněna struktura, na kterou se oligonukleotid váže specificky a s vysokou afinitou.

Takové struktury jsou například makromolekuly, tkáňové struktury vyšších organismů, jako jsou zvířata nebo lidé, orgány nebo části orgánů, buňky, zejména nádorové buňky nebo nádory.

V této souvislosti nemusí být cílová struktura v absolutně čisté formě, může být také přítomny v přirozeně se vyskytujícím orgánu nebo na buněčném povrchu. Přesně vzato mohou být aplikovány k selekčnímu procesu přídavky polyamino(tRNA, heparin), plasmy nebo celé krve k SELEX reakci.

Jestliže je zde zahrnut izolovaný protein, může být posledně uvedený navázán k pevné fázi, například filtru.

V selkeci se používá přebytku cílové struktury vzhledem k RNA směsi. V inkubaci se specifické oligonukleotidové molekuly vážou k cílovým strukturám, zatímco nenavázané oligonukleotidy jsou oddělovány ze směsi například promýváním.

Pak jsou oligonukleotidové molekuly separovány od cílových molekul nebo odstraněny promýváním vhodnými pufry nebo rozpouštědly.

Za pomoci reverzní transkriptasy je nalezený RNA oligonukleotid transkribován do komplementárního DNA řetězce.

Protože získaný řetězec DNA vykazuje primerová sekvence (nebo promotorové sekvence) na obou koncích, byly jednoduše provedeny amplifikace nalezených DNA sekvencí za pomoci polymerasové řetězové reakce.

DNA oligonukleotidy aplifikované tímto způsobem jsou opět transkribovány za pomoci RNA polymerasy do RNA oligonukleotidů a takto získané RNA oligonukleotidy mohou být použity v dalším selekčním stupni (jak je popsán výše).

Po separaci navázaných RNA oligonukleotidů získaných ve druhém selekčním stuoni, od cílových molekul, jsou posledně uvedené opět transkribovány do DNA za pomoci reverzní transkriptasy, takto získané komplementární DNA oligonukleotidy jsou amplifikovány za pomoci polymerasové řetězové reakce a pak opět transkribovány za pomoci RNA polymerasy na RNA oligonukleotidy, které jsou dostupné pro další selekční stupeň.

Opačně je možno říci, že požadované vysoké specifity a vysoké vazebné afinity mohou být získány jsou-li selekční stupně několikrát opakovány. Vzácně bude požadovaná oligonukleotidová sekvence získána tak brzo jako po jednom nebo po dvou selekčních stupních. Jakmile se získá požadovaná specifita a vazebná afinita mezi cílovou strukturou a oligonukleotidem, může být oligonukleotid(y) sekvenován a výsledkem je že může být stanovena sekvence specificky navázaných oligonukleotidů.

Zvláštní výhodou tohoto procesu je, že tento proces může být použit nejen se vhodnými proteiny, ale také in vivo. Výše uvedený selekční proces může být také proveden na čištěných cílových strukturách. Je ale podstatné, zejména pro in vivo diagnózu, že specifita oligonukleotidů je poskytnuta pro cílovou strukturu v žijícím prostředí. Proto mohou být selekční procesy také provedeny na buňkách nebo buněčných kulturách, na tkáních nebo tkáňových řezech, na perfundovaných orgánech a i na žijících organismech.

V tomto případě je výhodné, že modifikované oligonukleotidy mohou odolávat degradaci všude přítomnými RNA. Výsledkem je, že jsou požadované oligonukleotidové sekvence samy akumulovány v selekčních procesech na žijících organismech, protože odpovídající přirozeně se vyskytující oligonukleotidy by mohly být degradovány RNA.

Olígonukleotidový radikál N může vykazovat jednu nebo více spojovacích složek B nebo substituentů B-K, které mohou být nezávisle na sobě selektovány. Nárokovány jsou oligonukleotidové konjugáty, které obsahují 1 až 10 shodných nebo 2 až 10 odlišných spojovacích složek B. Zvláště preferovány jsou oligonukleotidové konjugáty s jednou nebo dvěma spojovacími složkami B.

Spojovací složka B spojuje olígonukleotidový radikál N s komplexačním činidlem nebo komplexem K.

Výhodně může být jako donor atomů použit polydentát, komplexační ligandy s otevřeným řetězcem nebo cyklické, s 0, S a N.

Jako příklady radikálů K komplexačních činidel je možno uvést polyaminopolykarboxylové kyseliny redukované atomem vodíku, hydroxyskupinou a/nebo skupinou kyseliny octové, ethylendiamintetraoctovou kyselinu, diethylentriaminpentaoctovou kyselinu, trans-1,2-cyklohexandiamintetraoctovou kyselinu,

1.4.7.10- tetraazacyklododekantetraoctovou kyselinu,

1,4,7-tri-azacyklononantrioctovou kyselinu,

1.4.8.11- tetraazatetradekantetraoctovou kyselinu,

1,5,9-triazacyklododekantrioctovou kyselinu,

1,4,7,10-tetraazacyklododekantrioctovou kyselinu a 3,6,9,15-tetraazabicyklo-[9,3,1]-pentadeka1(15),11,13-trien-trioctovou kyselinu.

Vhodná komplexační činidla j sou popsána např. v EP 0485045, EP 0071564 a EP 058229, v DE 4310999 a DE 4311023 jakož i US 4965392.

Pro ilustraci různých možností pro komplexační činidla K podle tohoto vynálezu je třeba odkázat na obrázky 1 až 3, na kterých jsou uvedeny některé výhodné struktury. Tyto obrázky jsou míněny jako výběrové a neomezující tento vynález žádným způsobem na uvedená komplexační činidla.

Komplexační činidlo K může obsahovat všechny radioaktivní izotopy obvykle používané v nukleární medicíně pro diagnostické a terapeutické účely, ve formě jejich kovových iontů. Mohou bý také použity stabilní izotopy, které jsou excitovány vnější radiací pro emisi diagnostické nebo terapeutické radiace, nebo izotopy, které jsou konvertovány radiací z vnějšku na radioaktivní izotopy.

Izotopy vhodné podle vynálezu jsou vybrány z prvků atomových čísel 5, 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 nebo 85.

Pro použití sloučeniny podle vynálezu jako radiofarmaceutického činidla obsahuje komplexační činidlo radioaktivní prvek. Všechny radioaktivní prvky, které jsou schopny dosáhnout in vivo nebo in vitro diagnostického účinku jsou vhodné pro tento účel. Preferovány jsou radioaktivní izotopy prvků měď, vizmut, technecium, rhenium nebo indium. Zvláště jsou preferovány ^^^mTc-komplexy.

Jestliže sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu obsahují pozitron-emitující izotopy jako je např. Cs-43, Sc-44, Fe-52, Co-55, Ga-68 nebo Cu-61, podle uvedené mohou být použity v pozitronové emisní tomografii (PET).

Jestliže sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu obsahují gama-záření emitující izotopy jako je např. Tc-99m nebo In-111, mohou tyto být použity v jednorázové fotonové emisní tomografii (SPÉCT).

Sloučeniny podle vynálezu mohou být použity také v radioterapii ve formě jejich komplexů s radioisotopy jako je např. IR-192.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být také použity v radioiminoterapii nebo radiační terapii. Tyto jsou odlišovány od odpovídajících diagnóz pouze množstvím a typem použitého izotopu. V tomto případě je cílem destrukce tumorových buněk zářením o krátké vlnové délce s vysokou energií s nejmenším možným rozmezím. Vhodné β-emitující ionty jsou, například Sc-46, Sc-47, Sc-48, Ga-73, Y-90,

Re-186 nebo Re-188. Vhodné α-emitující ionty vykazující malý poločas životnosti jsou, například, At-209, At-211, Bi-211, Bi-212, Bi-213 a Bi-214 a preferován je Bi-212. Vhodným foton- a elektron emitujícím iontem je Gd, který může být získán ze Gd neutronovým záchytem.

Jestliže je činidlo podle vynálezu míněno pro použití ve variantě radiační terapie navržené R.L.Millsem a spol. (Nátuře 336, 787 (1988)), musí být centrální iont odvozen z Móssbauerova isotopu jako je například ^^Fe nebo ^^^Eu.

Ty skupiny karboxylových kyselin, které nejsou vyžadovány pro komplexaci kovových iontů prvků atomových čísel 21 až 29, 31, 39, 42 až 44, 49, 57 až 83 nebo 85 mohou být popřípadě přítomny jako soli anorganických nebo organických bází jako jsou hydroxidy alkylických kovů a kovů alkalických zemin a uhičitany, zejména hydroxid sodný a draselný nebo amoniak a alkylaminy nebo amonokyselina nebo ester nebo amid.

Dále mohou být použity sloučeniny, které jsou excitovány neutrony k emitování částic a/nebo záření.

Zejména účinné v tomto případě je gadolinium. Výhodně mohou být také použity ty sloučeniny, které obsahují isotop bor-10. V takových případech K může mít vzorec

-(CH₂)_x-C-B₁₀H₁₀,

W

CH kde x představuje celé číslo od 1 do 10.

Vynález se dále týká způsobů pro produkci konjugátů podle vynálezu.

Konjugátý, ve kterých spojovací složka B je vazba ba 5’-konec oligonukleotidů mohou být získány reakcí oligonukleotidů s fosforamiditovým derivátem (Tetrahedron 49, 1925-1963 (1993)). K tomuto zakončení 5’-hydroxyskupina oligonukleotidů reaguje s fosforamiditem obecného vzorce PR’(NR₂)0R’. V tomto případě R’ představuje alkyl, alkoxy nebo arylalkoxyskupinu, popřípadě obsahující N, N0₂, Si nebo S0₂ s 1 až 20 C atomy jako je methyl,ethyl,, propyl, butyl, pentyl, hexyl, methoxy, ethoxy, propyloxy, butyloxy, benzyloxy nebo fenylethoxy, která popřípadě může být substituována. Jako substituenty se zejména používají kyano a nitroskupiny. Výhodně například mohou být použity methoxy, β-kyanoethoxy nebo nitrofenylethoxyskupiny. Zvláště preferovány jsou β-kyanoethoxyskupiny. R je C^-C^ alkylový radikál a zvláště vhodné jsou ethylové a propylové radikály. Preferovány jsou isopropylové radikály. R” ’ je alkyl nebo arylalkylskupina, popřípadě obsahující S, 0, N, CN, NO2 nebo halogen, s 1 až 20 C atomy. Výhodně mohou být použity chráněné amino a thioalkylradukály jako i chráněné amino a thiooxaalkylradikály. Zvláště preferovány jsou 6-amino-hexyl, 6-thiohexyl, 3,6,9-trioxa-ll-amino-undecyl a 3,6-dioxa-8-amino-oktanyl skupiny. Jako chránící skupiny, obecně mohou být použity N- nebo S-chránící skupiny. Například jsou vhodné trifluoracetylové, ftalimidové a monomethoxytritylové skupiny.

Ve zvláště výhodném provedení tohoto vynálezu se jako fosforoamiditový derivát použije β-kyanoethyl-N,N-diisopropylamino-6-trifluoracetamido)1-hexyl-fosforamidit.

V dalším výhodném provedení tohoto vynálezu se jako fosforamiditový derivát použije β-kyanoethyl-N ,N-diisopropylamino-(3,6,9-trioxa-llftalimido-l-undecyl)-fosforamidit.

V dalším provedení vynálezu je spojovací složka B navázána na 3’-konec oligonukleotidů N způsobem analogickým způsobu popsanému výše u fosfor obsahující skupiny.

Výše popsaná reakce mezi oligonukleotidem a fosforamiditem se provádí jako reakce v pevné fázi a oligonukleotid je ještě na sloupci automatického syntetizátoru. Po té, co byl získán oligonukleotid požadované sekvence a vystavení 5’-skupiny oligonukleotidů provedeno, např. kyselině trichloroctové, reaguje s fosforamiditem a reakční produkt se oxiduje a uvolní.

Potom se takto získaný oligonukleotidový derivát kopuluje na terminálni amino nebo thiolové skupině s komplexačním činidlem nebo komplexem K popřípadě jinou spojovací skupinou. Radikálová vazba v prvním stupni fosfor obsahující skupiny na oligonukleotid pak tvoří, spolu s popřípadě přítomnou dalši linkerovou skupinou, spojovací složku B.

Spojení mezi olígonukleotidem a komplexačním činidlem může být také provedeno tak, že volná 5’-hydroxylová skupina oligonukleotidů reaguje s komplexačím činidlem nebo komplexem, který na konci nese vázatelný fosforečný radikál. Je možno je popsat vzorcem (a)

0R^a /

kde

R^a představuje C^-Cg alkylový radikál, který popřípadě nese kyanoskupinu v β-poloze,

R^ představuje sekundární aminoskupinu a K a B maj i uvedený význam nebo vzorcem (b)

O

II

K-B- P - O - R^c

I

H kde

R^c představuje trialkylamoniový kationt a K a B mají uvedený význam, nebo vzorce (c)

K-B- P - 0 - R^c nebo

S «

K-B- P-O-R^c

I o

kde

R^b představuje arylový radikál, popřípadě substituovaný jedním nebo více atomy halogenu a/nebo jednou nebo více nitroskupinami, nebo Cý-C^alkylový radikál, který je popřípadě substituován v β-poloze s kyanoskupinou a K,

B a R^c mají uvedený význam a je-li použit radikál vzorce a) oxidační stupeň na fosfát probíhá po ukončení kopulační reakce. V obou případech radikál -0R^a nebo -0R^c může být popřípadě odštěpen hydrolýzou.

Spojení oligonukleotidových derivátů linkerem s komplexačním činidlem nebo komplexem K může být provedeno také reakcí v pevné fázi na koloně automatického syntetizátoru. Sloučenina podle vynálezu může být pak izolována z pevného nosiče odejmutím.

Spojení oligonukleotidů s linkerem může probíhat nejen na 5’-OH skupině cukru terminálního nukleotidu, ale také na jinývh funkčních skupinách, které mohou být generovány z 5’-OH skupiny, jako je např. amino nebo karboxyskupina. Takové nukleotidy nesoucí amino nebo karboxyskupiny jsou známé a mohou být snadno připraveny. Syntéza

5’-deoxy-5’-aminouridinu je popsána v J.Med.Chem. 22, 1273 (1979) jakož i v Chem.Lett.6, 601 (1976).

4’-Karboxy-5’-deoxyuridin je dostupný jak je popsáno v J.Med.Chem. 21, 1141 (1978) nebo Nucleic Acids Symp.Ser.9, 95 (1981).

Spojení s komplexačním činidlem pak probíhá linkerem, nesoucím skupinu karboxylové kyseliny nebo aminoskupiny způsobem, který je odborníkům v oboru známý. Linker pak tvoří spojovací složku B spolu s -NH-CH2~4’ nebo -C0-4’ skupinou.

Třeba zdůraznit, že distribuce konjugátů podle vynálezu do nukleotidového radikálu, spojovací složky a komplexačního činidla nebo komplexu může probíhat pouze formálně a tak nezávisle na aktuální syntetické struktuře. Tak např. ve výše uvedeném případě skupina -NH-CH2~4’ nebo -CO-4’ je považován za patřící do spojovací složku B, zatímco oligonukleotid redukovaný ve 4’-poloze CH2OH skupinou je nazván jako oligonukleotidový radikál N.

Způsob výroby konjugátů, ve kterých spojovací složka k fosfodiesterovému nebo fosforothioátovému můstku se redukuje OH skupinami, probíhá tak, že jsou nejprve dvě cukrové jednotky připojeny k dinukleotidu (viz např. Chem. Lett. 1305 (1993)). V tomto případě toto nejprve vede ke triesteru vzorce

II

3’-0- P-0-5’

O-U-V kde U představuje odpovídající alkylenový radikál a V představuje chráněnou amino nebo sírovou skupinu. Po štěpení, např. aminochránící skupinou, může být komplexační činidlo popřípad připojeno způsobem, který je znám odborníkům v oboru, linkerem s aminoskupinou - např. ve formě amidové vazby. Linker pak tvoří spojovací složku B spolu se skupinou O-U-V’ (kde V’ představuje skupinu -NH)

Alternativní způsob spočívá v tom, že fosforotriester je ihned (např. po reakci s 1,5-diaminopentanem) podroben aminolýze (viz Biochemistry 27, 7237 (1988) nebo J.Am.Chem. Soc. 110, 4470 (1988)).

Takto získané sloučeniny vzorce

II

3’-0- P-0-5’

I nh-u-nh₂ mohou být spojeny jak je popsáno výše s komplexačnim činidlem popřípadě linkerem.

Pro kopulační účely jsou také vhodné dinukleosid-fosfát-monothiotriestery (viz J.Am.Chem.Soc.

111, 9117 (1983) a Nucl.Acids Res. 20, 5205 (1992)).

Nukleosidy poskytují zvláště velké množství variant pro spojeni komplexačních činidel s nukleotidy. Spojení amioskupinami ve 2-poloze v purinech a ve 4-poloze v pyrimidinech může být provedeno přímo. Často je ale výhodnější modifikovat puriny nebo pyrimidiny a spojit tyto derivatizované báze s komplexačními činidly (popřípadě dalšími linkery). Vhodné derivatizované nukleobáze jsou popsány např. v Biochemie (Biochemistry) 71, 319 (1989), Nucl.Acids Res. 16, 4937 (1988) nebo Nucleosides Nucleotides 10, 633 (1991) .

Alternativní způsob spojení nukleobází spočívá v palladiem katalyzované kopulaci bromových nebo jodových nukleobází s funkcionalizovanými radikály (Biogenic and Medical Cjemistry Letter V, 361 (1994)). Těmito funkcionalizovanými radikály mohou pak komplexační činidla být spojena s nukleobází dalším linkerem podle známých metod. Jak funkcionalizované radikály v 5-poloze pyrimidinu a v 8-poloze purinu, mohou být jako příklady uvedeny akrylester nebo allylamin (viz Nucl.Acids Res. 14, 6115 (1986) a Nucl.Acids Res. 16, 4077 (1988)). Další alternativní způsob pro přípravu v 5-poloze modifikovaných pyrimidinů, zejména pro zavedení funkčních skupin jako je karbonyl, alkenyl nebo arylskupiny do 5-polohy, a zlepšený palladiový katalyzátor schopný kopulace modifikujících skupin v 5-poloze pyrimidinů je popsán v US patentové přihlášce č. 08/076735, podané 14, června 1993. Halogenové deriváty použité jako prekurzory mohou být získány jak je popsáno např. v Biophys. J. 44, 201 (1983), J.Am.Chem.Soc.

86, 1242 (1964) nebo Chem.Commun. 17 (1967).

Produkce kovových komplexů podle vynálezu z kovů prostých oligonukleotidových konjugátů probíhá jak je popsáno v DE 3401052, kdy se oxid kovu nebo kovová sůl (například dusičnan, octan, uhličitan, chlorid nebo síran) požadovaného kovového izotopu rozpustí nebo suspenduje ve vodě a/nebo nižším alkoholu (jako je methanol, ethanol nebo isopropanol a reaguje s roztokem nebo suspenzí ekvivalentního množství oligonukleotidového konjugátu, obsahujícího komplexační činidlo a pak, je-li to žádoucí, jsou přítomné kyselé vodíkové atomy nahrazeny kationty anorganických nebo organických bází nebo aminokyselin nebo jsou volné skupiny karboxylových kyselin převedeny na amidy aminokyselin.

Neutralizace ještě možných přítomných volých kyselých skupin probíhá za pomoci anorganických bází (například hydroxidů, uhličitanů nebo hydrogenuhličitanů) například sodíku, draslíku, lithia, hořčíku nebo vápníku a/nebo organických bází jako jsou mezi jinými primární, sekundární a terciární aminy jako je například ethanolamin, morfolin, glukamin, N-methyl- a N,N-dimethyl-glukamin, jakož i bázické aminokyseliny jako je, například lysin, arginin a ornithin nebo amidy původně neutrálních aminokyselin.

Produkce farmaceutických činidel podle vynálezu probíhá také známým způsobemv oboru, kdy se oligonukleotidové konjugáty podle vynálezu -- popřípadě za přídavku aditiv obvyklých v galenikách -- suspendují nebo rozpustí ve vodném mediu a pak se suspenze nebo roztok popřípadě sterilizují nebo sterilizují filtrací. Vhodná aditiva jsou, například, fyziologicky neškodné pufry (jako je například tromethamin), aditiva komplexačních činidel (jako je například kyselina diethylentriaminpentaoctová) nebo - je-li to nezbytné - elektrolyty jako je, například chlorid sodný nebo - je-li to nezbytné - antioxidanty jako je, například, askorbová kyselina, nebo zejména pro orální formy podání, mannitol nebo jiné osmoticky aktivní substance.

Jestliže jsou suspenze nebo roztoky činidel podle vynálezu ve vodě nebo fyziologickém solném roztoku požadovány pro enterální podání nebo jiné účely, mohou být smíseny s jednou nebo více pomocnými látkami obvyklými v galenikách (například jako je methylceluloza, laktoza, mannitol) a/nebo povrchově aktivní látky (například lecitiny, Tween^TR, Myrj^^R).

Farmaceutická činidla podle vynálezu výhodně obsahují 0,1 pmol/l až 3 mmol/1 oligonukleotidových konjugátů podle vynálezu a jsou obecně dávkována v množstvích 0,01 nmol/kg až 60 pmol/kg. Jsou zamýšleny pro enterální a parenterální podání.

V in vivo použití v nukleární medicíně jsou obecně

0 značené sloučeniny dávkovány v množstvích menších než 10 mol/kg tělesné hmotnosti a přesná dávka se může měnit většinou jako funkce sledované oblasti těla ale zejména také jako funkce příslušné zvolené studijní metody. Jestliže se vychází z tělesné hmotnosti 70 kg, je množství radioaktivity pro diagnostické použití mezi 40 a 1100 MBq, býhodně 200 až 800 MBq, pro terapeutická použití 1 až 500 MBq, výhodně 10 až 100 MBq na podál. Podání se provádí normálně intravenozně, intraarteriálně, intersticiálně, peritoneálně nebo intratumorálně a preferováno je podání intravenozní. Obecně se podává 0,1 až 20 ml příslušného činidla na studii

Předložený vynález se dále týká způsobu detekce cílových struktur. V tomto případě se uvede do styku jedna nebo více výše popsaných sloučenin se vzorkem, který je studován in vivo nebo in vitro. V tomto případě se váže oligonukleotidový radikál N specificky a s vysokou vazebnou afinitou k cílové struktuře, která je detegována.

Jestliže je cílová struktura přítomna ve vzorku, může být zde detegována na bázi signálu. Způsob je specificky vhodný pro neinvazivní diagnózu chorob. V tomto případě se podává jedna nebo více výše popsaných sloučenin in vivo a může být detegováno signálem, zda cílová struktura, na kterou se oligonukleotidový radikál N váže specificky a s vysokou afinitou, je přítomen v organismu, který se studuj e.

Ale navíc ke spíše detekci cílových struktur ve studovaných vzorcích, může být posledně uvedený specificky rozložen. Z tohoto hlediska jsou sloučeniny podle vynálezu zvláště vhodné v radioterapii, např. rakovinové terapii.

Další provedení tohoto vynálezu zahrnuje diagnostický kit pro in vivo detekci cílových struktur, který obsahuje jednu nebo více z výše uvedených sloučenin.

Konjugáty a činidla podle vynálezu splňují mnoho požadavků, které jsou kladeny na farmaceutické činidlo pro radioterapii a diagnózu. Liší se zejména vysokou specifitou nebo afinitou vzhledem k zájmové cílové struktuře. Vzhledem ke známým oligonukleotidovým konjugátům, konjugáty podle vynálezu vykazují zvláště vysokou stabilitu in vivo. Této bylo dosaženo substitucí 2’-hydroxylové skupiny a zabudováním modifikovaných thymidinových sekvencí na terminálních hydroxylových skupinách nukleotidů. Překvapivě není specifičnost oligonukleotidu podstatně zhoršena ani touto modifikací nebo kopulací s komplexačním činidlem. Jiné výhody jsou kontrolovatelné farmakokinetiky jakož i nezbytná kompatibilita.

Popis obrázků na výkresech

Různé další objekty, rysy a související výhody předloženého vynálezu budou lépe srozumitelné ve spojení s připojenými obrázky, kde:

obr.l představuje selekci cyklických komplexačních činidel K, která mohou být použita výhodně podle tohoto vynálezu, b označuje vazebná místa připojení složky B.

obr.2 a 3 představují selekci komplexačních činidel K s otevřeným řetězcem, která mohou být použita výhodně podle tohoto vynálezu.

Následující přílady slouží k podrobnější ilustraci těchto vynálezů.

Polynukleotidy popsané v příkladech obsahují modifikované sloučeniny.

Znamená to, že:

A, U, C, G nukleotidy obsahují Ζ’-ΟΟΗ^ skupinu * internukleotidová vazba je methylfosfonát internukleotidová vazba je thiofosfonát *** internukleotidová vazba je dithiofosfonát

Bez dalšího zkoumání se předpokládá, že odborník v oboru, za použití předchozího postupu, bude schopen vynález v plném rozsahu využívat. Následující preferovaná specifická provedení jsou proto konstruována spíše jako ilustrativní a neomezující jakýmkoliv způsobem přítomný popis.

V předchozích a následuj ících příkladech j sou všechny teploty nekorigovány a uvedeny ve stupních Celsia a pokud není uvedeno jinak, jsou všechny díly a procenta hmotnostní

Celé popisy všech přihlášek, patentů a publikací, citovaných výše a dále, včetně DE 44 24 922.5, podané 14. července 1994, jsou zde zahrnuty jako odkaz.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

a) Ester 5’-(6-amin-hexyl-fosforečné kyseliny)

35mer-oligonukleotidu ’ - CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT * T * T * T * T - 3 ’

30merový oligonukleotid

5’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3’, identifikovaný podle SELEX procesu, s modifikací sekvence T*T*T*T*-3’ umístěnou proti směru je produkován obvyklým způsobem v automatickém syntetizátoru Pharmacia company (viz Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, vyd. F.Ecksteín, Oxford

University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991) a oligonukleotid je také přítomen na koloně pevného nosiče. Reakcí s roztokem kyseliny trichloroctové v dichlormethanu, se 5’-hydroxyskupina otevře. Zatížení kolony je asi 10 mg 35merového-oligonukleotidů. K připojení linkeru kolona reaguje s acetonitrilovým roztokem 50 gmol β-kyanoethyl-N,N-diisopropylamino-6-(Trifluoracetamido)1-hexyl-fosforamiditu (vyroben podle Nucl.Acids. Res. 16, 2659-2669 (1988)) za přítomnosti tetrazolu. Oxidace vytvořeného fosfitu na kopletně chráněný fosfortriester probíhá s jodem v tetrahydrofuranu. Potom se kolona promyje dostatečně methanolem a vodou. Pro odstranění modifikovaných oligonukleotidů z pevného nosiče se obsahy kolony umístí do více lahviček, smísí se s 5 ml 30% roztoku amoniaku, nádoba se uzavře a třepe se přes noc při 55 °C. Ochladí se pak na 0 °C, odstředí, vehikulum se promyje 5 ml vody a spojené vodné fáze se podrobí sušení vymražením.

Pro čištění se pevný materiál vyjme do 2 ml vody, smísí se se 2 ml 0,5M roztoku octanu amonného a smísí s 10 ml ethanolu, ponechá se stát přes noc při -20 ’C, odstředí, zbytek se promyje 1 ml ethanolu (-20 °C) a nakonec se suší za vakua při teplotě místnosti. Získá se 8 mg titulní sloučeniny jako bezbarvý prášek.

b) 10-[5-(2-Karboxyfenyl)-2-hydroxy-5-oxo-4-aza-pentyl]1.4.7.10- tetraazacyklododekan g (144,3 mmol) l,4,7-tris(karboxymethyl)1.4.7.10- tetraazacyklododekanu (D03A) se rozpustí ve 250 ml vody a pH se upraví na 13 5N roztokem hydroxidu sodného. Potom se během 1 hodiny zavede 38,12 g (187,6 mmol)

N-(2,3-epoxypropyl)-ftalimidu ve 100 ml dioxanu, míchá se hodin při 50 °C a pH se udržuje na 13 přídavkem 5N roztoku hydroxidu sodného. pH roztoku se upraví na 2 10% kyselinou chlorovodíkovou a odpaří se dosucha ve vakuu. Zbytek se rozpustí v malém množství vody a čistí iontově výměnnou chromatografii (Reillex = póly(4-vinyl)-pyridin, eluce vodou). Hlavní frakce se zahustí odpařením ve vakuu a zbytek se čistí konečnou chromatografii na RP-18 (LiCroPrep /mobilní rozpouštědlo: gradient tetrahydrofuran/methanol/voda) . Po zahuštění hlavních frakcí se získá 63,57 g (71 % teorie) amorfní pevné látky.

Obsah Vody 8,5 %

Elementární analýza (vztaženo na bezvodou substanci): vypočteno: 52,90 % C, 6,57 % H, 12,34 % N nalezeno: 52,65 % C, 6,68 % H, 12,15 % N.

c) 10-(3-Amino-2-hydroxypropyl)-1,4,7-tris(karboxymethyl)1,4,7,10-tetraazacyklododekan g (88,1 mmol) titulní sloučeniny z příkladu lb se refluxuje ve 300 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové po 24 h. Odpaří se dosucha, zbytek se rozpustí v malém množství vody a čistí se na iontovýměnné koloně (Reillex = póly-(4-vinyl)-pyridin (eluce vodou)). Hlavní frakce se odpaří dosucha.

Výtěžek: 39 g (95 % teorie) sklovité pevné látky.

Obsah vody: 10,3 %

Elementární analýza (vztaženo na bezvodou substanci): vypočteno: 48,68 % C, 7,93 % H, 16,70 % N nalezeno: 48,47 % C, 8,09 % H, 16,55 % N.

d) 10-[7-(4-Nitrofenyl)-2-hydroxy-5-oxo-742 (karboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(karboxymethyl)1,4,7,10-tetraazacyklododekan

9,84 g (41,8 mmol) 3-(4-nitrofenyl)-glutaranhydridu (J.Or.Chem.26, 3856 (1961)) se přidá ke 14,62 g (34,86 mmol) titulní sloučeniny z příkladu lc) ve 200 ml dimethylformamidu/20 ml triethylaminu a míchá se při teplotě místnosti přes noc. Odpaří se dosucha ve vakuu. Zbytek se rekrystaluje z isopropanolu/kyseliny octové 95:5.

Výtěžek 21,68 g (95 % teorie) žlutavé pevné látky

Obsah vody 0,9 %

Elementární analýza (vztaženo na bezvodou substanci): vypočteno: 51,37 % C, 6,47 % H, 12,84 % N nalezeno: 51,18 % C, 6,58 % H, 12,67 % N.

e) 10-[7-(4-Aminofenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7(karboxymethyl)-4-aza-heptyl]-l,4,7-tris(karboxymethyl)1,4,7,10-tetraazacyklododekan

21,0 g (32,07 mmol) titulní sloučeniny z příkladu ld) se rozpustí ve 250 ml methanolu a přidá se 5 g palladiového katalyzátoru (10% Pd na C). Hydrogenuje se přes noc při teplotě místnosti. Katalyzátor se odfiltruje a filtrát se odpaří dosucha ve vakuu.

Výtěžek 19,63 g (98 % teorie) krémově zabarvené pevné látky. Obsah vody 0,8 %

Elementární analýza (vztaženo na bezvodou substanci): vypočteno: 53,84 % C, 6,35 % H, 12,60 % N nalezeno: 53,73 % C, 6,45 % H, 12,51 % N.

f ) 10-[7-(4-Isothiokyanatofenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7(karboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(karboxymethyl)43

1.4.7.10- tetraazacyklododekan

12,4 g (19,27 mol) titulní sloučeniny z příkladu le) se rozpustí ve 200 ml vody a přidá se 6,64 g (57,8 mmol) thiofosgenu v 50 ml chloroformu. Míchá se 1 h při 50 °C. Ochladí se na teplotu místnosti, oddělí se organická fáze a vodná fáze se dvakrát vytřepe se 100 ml chloroformu. Vodná fáze se odpaří dosucha a zbytek se absorpčně vysráži ve 100 1 isopropanolu při teplotě místnosti. Pevná látka se odfiltruje a promyje se etherem. Po sušení přes noc ve vakuu (40 °C) se získá 12,74 g (97 % teorie) krémově zabarvené pevné látky.

Obsah vody 3,1 %

Elementární analýza (vztaženo na bezvodou substanci) : vypočteno: 52,24 % C, 6,35 % H, 12,60 % N, 4,81 % S nalezeno: 52,37 % C, 6,44 % H, 12,48 % N, 4,83 % S.

g) Konjugát esteru 5-(6-amino-hexyl-fosforečné kyseliny) 35merového oligonukleotidu ’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*-3 ’ a 10-[7(4-isothiokyanato-fenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(karboxymethyl) -4-azaheptyl]-1,4,7-tris(karboxymethyl)-1,4,7,10tetraazacyklododekanu mg oligonukleotidu získaného v příkladu la) se rozpustí ve 2,5 ml NaHCO3/Na2CO3 pufru (pH 8,0) a smísí se s 1 mg 10-[7-(4-isothiokyanatofenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7(karboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris-(karboxymethyl)1.4.7.10- tetraazacyklododekanu (titulní sloučenina z příkladu lf). Míchá se 5 hodin při teplotě místnosti, pH se upraví na 7,2 přídavkem 0,01 M kyseliny chlorovodíkové a roztok se podrobí ultrafiltraci přes membránu s mezí vylučování 3000 (Amicon YM3) a pak sušení vymražením. Získá se 7 mg požadovaného konjugátu.

h) mIndiový koplex thiomočovinového konjugátu esteru

5-(6-amino-hexyl-fosforečné kyseliny) 35merového oligonukleotidů ’ - CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT * T * T * T * T - 3 ’ a 10-[7-(4-isothiokyanatofenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7(karboxymethyl)-4-azaheptyl]-1,4,7-tris(karboxymethyl)1,4,7,10-tetraazacyklododekanu μΐ roztoku Hlindium(III)acetátu (350 pCi) , (vyrobeného z chloridu Hlinditého ve 2M roztoku octanu sodného a upravením pH na 4,0 0,1M kyselinou chlorovodíkovou) se přidá ke 135 μΐ roztoku 1 mg titulní sloučeniny z příkladu lg) v MES pufru, pH 6,2 (MES =

2-(N-morfolino)ethylsulfonová kyselina). pH se upraví na

4,2 přídavkem 0,01M kyseliny chlorovodíkové. Míchá se 1 hodinu při 37 °C při pH 4,2. Upraví se na pH 6 2M roztokem octanu sodného a 10 μΐ 0,1M Na2EDTA = dvoj sodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové se přidá ke komplexuaci přebytu H1india. Konečné čištění takto získaného značeného kojugátu (lh) se provede HPLC (vylučovací chromatografie: TSK-400/MES-pufr). Frakce, obsahující radioaktivně značený konjugát se zředí běžným fyziologickým solným roztokem, pH se upraví na 7,2 0,01M roztokem hydroxidu sodného a filtrují. Takto získaný roztok pak představuje vhodný přípravek pro radiodiagnozu.

Příklad 2

a) Konjugát esteru 5’(6-amino-l-hexyl-fosforečné kyseliny) 35mer oligonukleotidů ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3 ’ a N- [ 2amino-3- (4-isothiokyanatofenyl) -propyl] -trans-cyklohexan1,2-diamin-N,Ν’-Ν’,Ν,N-pentaoctové kyseliny mg oligonukleotidu získaného v příkladu la) se rozpustí ve 2,5 ml NaHCO₃/Na₂CO₃ pufru (pH 8,0) a přidá se 1 mg N-[2-amino-3-(p-isothiokyanatofenyl)propyl]-transcyklohexan-1,2-diamin-N,Ν’ ,Ν’ ,Ν ,Ν-pentaoctové kyseliny (vyrobena podle Bioconjugate Chem. i, 59 (1990)). Míchá se 5 hodin při teplotě místnosti, potom se upraví na pH 7,2 0, ÍM kyselinou chlorovodíkovou a roztok se podrobí ultrafiltraci přes membránu s vylučovací mezí 3000 (Amicon YM3) . Po sušení vymražením se získá 6 mg thiomočovinového konjugátu 2a).

b) Vismut-212 komplex konjugátu 5’-(esteru

6-amino-1-hexyl-fosforečné kyseliny) 35meru oligonukleotidu 5’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3 ’ a kyseliny N-[2-amino-3-(4-isothiokyanatofenyl)-propyl]-transcyklohexan-1,2-diamin-N,Ν’-N’,N,N-pentaoctové

2

Roztok jodidu vismutičitého v 0,ÍM kyselině jodovodíkové se upraví na pH 4 2M kyselinou octovou. Podíl tohoto roztoku o aktivitě asi 3 mCi se přidá k 1 mg titulní sloučeniny z příkladu 2a), rozpuštěné v 0,5 ml 0,02M MES pufru a přidá se 0,5 ml 0,15M roztoku chloridu sodného.

Míchá se 20 minut při teplotě místnosti. pH se upraví na hodnotu 6 2M roztokem octanu sodného a přidá se 20 μΐ 0,01M roztoku Na₂EDTA. Míchá se 20 minut. Čištění komplexu se provádí pomocí HPLC (vylučovací chromatografie:

TSK-400/MES-pufr). Frakce radioaktivního konjugátu se spojí, zředí se běžným roztokem fyziologické soli a pH se upraví na

7,2 pomocí 0,01M roztoku hydroxidu sodného. Po filtraci se získá přípravek vhodný pro radioterapii.

Příklad 3

a) Indium-111 komplex konjugátu 5(esteru 6-amino-lhexyl-fosforečné kyseliny) 35meru oligonukleotidů 5 ’ - CUCAUGGAGCGCAAGACGAAU AGCUACAU AT *T*T*T*T-3 ’ a N- [2-amino-3-(4-isothiokyanatofenyl)-propyl]-transcyklohexan-1,2-diamin-N,N’-N’,N”,N-pentaoctové kyseliny ml 15 μΐ roztoku octanu ^^^inditého (350 gCi) (vyrobený z chloridu m-inditého ve 2M roztoku octanu sodného a upravením pH na 4,0 0, ÍM kyselinou chlorovodíkovou) se přidá k 0,5 ml roztoku 1 mg titulní sloučeniny z příkladu 2a) v MES-pufru, pH 6,2 (MES =

2-(N-morfolino)ethylsulfonová kyselina). pH se uraví na 5,0 přídavkem 0,01M kyseliny chlorovodíkové. 1 hodinu se míchá při 37 °C při pH 5,0. Upraví se na pH 6 2M roztokem octanu sodného a přidá se 10 μΐ 0 , ÍM Na2EDTA = dvoj sodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové pro komplexaci přebytku m-india. Konečné čištění takto získaného značeného konjugátu (lh) se provede HPLC (vylučovací chromatografie: TSK-400/MES-pufr). Frakce, obsahující značený konjugát se zředí fyziologickým běžným roztokem soli, pH se upraví na

7,2 Ο,ΌΙΜ roztokem hydroxidu sodného a filtrují se. Takto získaný roztok pak představuje vhodný přípravek pro radiodiagnozu.

Příklad 4

a) Konjugát 5’-(esteru-6-amino-l-hexyl-fosforečné kyseliny) 35merového oligonukleotidů ’ - CUCAUGC AGCGCA AGACGA AU AGCUACAU AT *_τ*_ψ*_τ*_ψ_₃- _a 2-(447 isothiokyanato-benzyl)-diethylentriamin-Ν,Ν,Ν’ ,Ν ,Νpentaoctové kyseliny mg oligonukleotidů získaného v příkladu la) se rozpustí ve 2,5 ml NaHC02/Na2C0j pufru (pH 8,0) a přidá se 1 mg 2-(4-isothiokyanato-benzyl)-diethylentriaminΝ,Ν,Ν’ ,N,N-pentaoctové kyseliny (vyrobené podle

Bioconjugate Chem. 2, 187 (1991)). 5 hodin se míchá při teplotě místnosti, pak se pH upraví na 7,2 0,01M kyselinou chlorovodíkovou a roztok se podrobí ultrafiltraci přes membránu s vylučovací mezí 3000 (Amicon YM 3) . Po sušení vymraženim se získá 6 mg thiomočovinového konjugátu.

b) Yttrium-90 komplex konjugátu 5’-(esteru

6-amino-l-hexyl-fosforeěné kyseliny) 35 mer oligonukleotidů 5 ’ -CUCAUGCAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3’ a 2-(4-isothiokyanato-benzyl)-diethylentriamin-Ν,Ν,Ν’ ,N,Npentaoctové kyseliny

Roztok ^Oyttria, rozpuštěného v 0,05M roztoku octanu amoného (asi 380 mCi) se přidá k 1 mg thiomočovinového derivátu z příkladu 4a) v 0,5 ml 0,05M roztoku octanu sodného o pH 6, pH se upraví na 5,2 3M kyselinou octovou a míchá se 1 h při teplotě místnosti. pH se upraví na 7,0 0,01M roztokem hydroxidu sodného a konjugát se čistí pomocí HPLC (TSK-400/MES-pufr). Hlavní frakce se spojí, zředí se běžným fyziologickým roztokem soli a pH se upraví na 7,2 0,01M roztokem hydroxidu sodného. Po filtraci se získá přípravek vhodný k radioterapii.

Příklad 5

a) 5(Ester 6-merkapto-l-hexyl-fosforečné kyseliny)

35mer-oligonukleotidů , __t*_t*_t*_t*_{TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU}_₃ , (modifikovaný ligand pro serinovou protesu)

30mer-oligonukleotid 5 ’ -AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3 ’ (sekv. č. 13 US patentu č. 5270163) identifikovaný podle SELEX procesu, modifikovaný v cukrových jednotkách a 5’-napojenou sekvencí 5 tymidinu, se vyrobí obvyklým způsobem v automatickém syntetizátoru Pharmacia company (viz Oligonucleotide and Analogues, A Practical Approach, vyd. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991) , a oligonukleotid je také přítomen na koloně pevného vehikula. Reakcí s roztokem kyseliny trichloroctové v dichlormethanu se otevře 5’-hydroxyskupina. Zatížení kolony je asi 10 mg 35mer-oligonukleotidu. Ke připojení linkeru reaguje kolona s roztokem 50 μπιοί β-kyanoethyl-N,N-diisopropylamino-S-trityl-6-merkapto)fosforamiditu v acetonitrilu za přítomnosti tetrazolu. Oxidace vzniklého fosfitu na plně chráněný fosfotriester probíhá s jodem v tetrahydrofuranu. Potom se kolona promyje přebytkem methanolu a vody. Pro odstranění modifikovaného oligonukleotidů z pevného nosiče se obsahy kolony shromáždí ve více lahvičkách, smísí se s 5 ml 30% roztoku amoniaku, nádoba se uzavře a třepe při 55 °C přes noc. Potom se ochladí na 0 °C, odstředí, vehikulum se promyje 5 ml vody a spojené vodné fáze se podrobí sušení vymražením.

Pro čištění se pevný materiál vyjme do 2 ml vody, smísí se se 2 ml 0,5M roztoku octanu amonného, smísí se 2 ml 0,5M roztoku octanu amonného a smísí s 10 ml ethanolu, nechá se stát přes noc při -20 °C, odstředí, zbytek se promyje 1 ml ethanolu (-20 °C) a nakonec se suší ve vakuu při teplotě místnosti.

Získá se 9 mg S-tritylované titulní sloučeniny. Pro odštěpení tritylové chránící skupiny se produkt rozpustí v 0,5 ml vody, smísí se s 0,1 ml roztoku dusičnanu stříbrného a míchá se 1 hodinu při teplotě místnosti. Potom se smísí s 0,1 ml ÍM roztoku dithiothreitolu. Po 15 minutách se odstředí a roztok supernatantu se několikrát extrahuje ethylacetátem. Po vymražení dosucha se z vodného roztoku získá 8 mg požadované titulní sloučeniny.

b) Methylester 4-benzyloxy-N-methansulfonyl-fenylalaninu

19,58 g chloridu kyseliny methansulfonové se umístí do 50 g hydrochloridu methylesteru 4-benzyloxy-fenylalaninu ve 300 ml pyridinu při 0 °C a míchá se 3 hodiny při 0 °C.

Odpaří se dosucha ve vakuu a zbytek se rozpustí v 500 ml dichlormethanu. Vytřepe se dvakrát vždy 300 ml 5N kyseliny chlorovodíkové, suší se nad síranem hořečnatým a zahustí se odpařením ve vakuu. Zbytek se rekrystaluje ze 150 ml methanolu.

Výtěžek: 53,64 g bezbarvého krystalického prášku.

c) 2-(4-Benzyloxybenzyl)-l-methansulfonyl-l,4,7-triazaheptan-3-on

37,2 g methylesteru 4-benzyloxy-N-methansulfonylfenyl-alaninu a 1,2 1 1,2-diaminoethanu se míchají 3 hodiny při 80 °C. Zbytek se odpaří dosucha a absorpčně se vysráží 200 ml vody, sraženina se odsaje, promyje do neutrality vodou a suší se přes noc při 60 °C.

Výtěžek: 37,68 g krémově zbarveného, amorfního prášku.

d) 2-(4-benzyloxybenzyl)-l-methansulfonyl-7-(terč.butyl50 oxykarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on

Roztok 16,23 g 2-(4-benzyloxybenzyl)-1-methansulf onyl-1,4,7-triazaheptan-3-onu a 4,76 g triethylaminu ve 200 ml chloroformu se míchá při 0 °C s roztokem 10,27 g di-terc.butyldikarbonátu v 50 ml chloroformu. Míchá se 5 hodin při teplotě místnosti, vytřepe se 5% roztokem uhličitanu sodného a vodou, suší se nad síranem hořečnatým a zahustí odpařením ve vakuu. Zbytek se rekrystaluje ze 100 ml methanolu.

Výtěžek: 20,19 g pěnovité pevné látky.

e) 2-(4-Hydroxybenzyl)-l-methansulfonyl-7-(terč.butyloxykarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on g 2-(4-benzyloxybenzyl)-1-methansulfonyl7- (terč.butyloxykarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-onu, rozpuštěného ve 300 ml dichlormethanu, se míchá se 4 g palladia na uhlí (10%) přes noc pod atmosférou vodíku, odfiltruje se a roztok se zahustí odpařením ve vakuu. Výtěžek: 16,17 g skelné pěny, která po několika minutách tuhne.

f) 2-[4-(3-0xapropionová kyselina-benzylester)-benzyl]l-methansulfonyl-7-(terč.butyloxykarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-on g 2-(4-hydroxybenzyl-l-methansulfonyl-7(terc.butyl-oxykarbonyl)-1,4,7-triazaheptan-3-onu, 8,56 g benzylesteru kyseliny bromoctové a 13,18 g uhličitanu draselného se refluxuje ve 300 ml acetonitrilu 24 hodin. Filtruje se a odpaří se dosucha ve vakuu. Zbytek se rozpust ve 200 ml dichlormethanu, vytřepe se dvakrát vždy s 50 ml vody. Organická fáze se suší nad síranem hořečnatým a zahustí odpařením ve vakuu. Zbytek se chromatografuje s dichlormethanem-hexanem-acetonem (20/10/1) jako elučním činidlem.

Výtěžek: 10,06 g pěnovité pevné látky.

g) 2-[4-(Benzylester 3-oxapropionové kyseliny)-benzyl]-1methansulfonyl-1,4,7-triazaheptan-3-on g 2-[4-(benzylester 3-oxapropionové kyseliny)benzyl] -1-methansulfonyl-7-(terč.butyloxykarbonyl)1,4,7-triazaheptan-3-onu se 1 hodinu míchá při teplotě místnosti se 100 ml kyseliny trifluoroctové. Odpaří se ve vakuu dosucha.

Výtěžek: 9,2 g skelné pěny, která stáním tuhne.

h) 9-Chlor-l-methynsulfonyl-2-[4-(benzylester

3-oxapropionové kyseliny)-benzyl]-1,4,7-triaza-3,8-dion 9 g 2-[4-(benzylester 3-oxapropionové kyseliny)-benzyl]1-methansulfonyl-1,4,7-triazaheptan-3-onu a 1,78 g triethylaminu se rozpustí ve 200 ml chloroformu. Při 0 °C se během 30 minut přidá 1,98 g chloracetylchloridu, rozpuštěného ve 20 ml chloroformu a pak se 2 hodiny míchá při 0 °C. Promyje se 100 ml 5% kyseliny chlorovodíkové, dvakrát vždy 50 ml vody, suší se nad síranem hořečnatým a odpaří se dosucha ve vakuu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu dichlormethanem-ethylacetátem (20/1) jako elučním činidlem.

Výtěžek: 6,97 g voskovité pevné látky.

i) 9-Chlor-l-methansulfonyl-2-[4-(3-oxapropionová kyselina benzylester)-benzyl]-1,4,7-triaza-3,8-dion

6,5 g 9-chlor-l-methansulfonyl-2-[4-(3-oxapropionová kyselina-benzylester)-benzyl]-1,4,7-triaza-3,8-dionu, rozpuštěného ve 150 ml dichlormethanu, se míchá se 2 g palladia-uhlí (10%) přes noc pod atmosférou vodíku. Odfiltruje se a roztok se zahustí odpařením ve vakuu. Výtěžek: 5,33 g skelné pevné látky

j) 10-Acetyl-2-[4-(3-oxapropionová kyselina)-benzyl]-l(methansulfonyl)-10-thia-1,4,7-triazadekan-3,8-dion g 9-chlor-l-methansulfonyl-2-[4-(3-oxapropionová kyselina-benzyleter)-benzyl]-1,4,7-triaza-3,8-dionu, rozpuštěného v 80 ml chloroformu, se refluxuje s 1,98 g triethylaminu a 0,74 g kyseliny thiooctové po 10 minut. Roztok se nalije do 200 ml ledově studené 5% kyseliny chlorovodíkové, organická fáze se oddělí, suší se nád síranem hořečnatým a zahustí se odpařením ve vakuu. Po chromatografii na silikagelu s hexanem-ethylacetátem (3/1) se získá 4,4 g požadované sloučeniny jako skelné pevné látky.

k) 10-Acetyl-2-[4-(3-oxapropionová kyselina-(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)-ester)-benzyl]-1-(methansulfonyl)-10-thia

1,4,7-triazadekan-3,8-dion g 10-acetyl-2-[-(3-oxapropionová kyselina)-benzyl] 1-(methansulfonyl)-10-thia-l,4,7-triazadekan-3,8-dionu,

1,91 g dicyklohexylkarbodiimidu, 4 g N-hydroxysukcinimidu a 30 mg 4-dimethylaminopyridinu se míchá 24 hodin ve 20 ml chloroformu při teplotě místnosti. Potom se smísí se 20 ml diethyletheru, filtruje a zbytek se zahustí odpařením ve vakuu. Zbytek se chromátografuje na silikagelu s dichlormethanem-dioxanem (10/1) jako eluentem.

Výtěžek: 3,47 g krémovitě zbarvené pevné látky

Elementární analýza:

vypočteno: 46,15 % C, 4,93 % H, 9,78 % N, 11,20 % S nalezeno: 46,03 % C, 4,83 % H, 9,64 % N, 11,05 % S.

l) 10-Acetyl-2-{4-[3-oxapropionová kyselina-(6-maleimidohexanoyl) -hydrazid] -benzyl}-l-methansulfonyl-10-thia1.4.7- triazadekan-3,8-dion g 10-acetyl-2-[4-oxapropionová kyselina- (2,5-dioxo-pyrrolidin-l-yl)ester) -benzyl] -1(methansulfonyl)-10-thia-l, 4,7-triazadekan-3,8-dionu a 1,17 g hydrazidu kyseliny 6-maleimidokaproové (Science 261, 212 (1993)) se míchá ve 40 ml dimethylformamidu 5 hodin při 60 °C. Za intenzivního míchání se přidá 100 ml vody a odfiltruje se vzniklá sraženina. Suší se ve vakuu a zbytek se čistí rychlou chromatografií na sloupci silikagelu chloroformem/dioxanem (10/1) jako elučním činidlem. Získá se 2,8 g titulní sloučenina jako bílé pevné látky.

Elementární analýza (vztaženo na bezvodou substanci): vypočteno: 49,25 % C, 5,61 % H, 12,30 % N, 9,39 % S nalezeno: 49,33 % C, 5,95 % H, 12,43 % N, 9,11 % S.

m) Konjugát 5(esteru 6-merkapto-l-hexyl-fosforečné kyseliny) 35mer-olionukleotidu ’ - T * T * T * Τ * T AGGAGGAGGAGGGAGAGCGC AAAUGAGAUU - 3 ’ a

10-acetyl-2-{4-[3-oxapropionová kyselina-(6-maleimidohexanoyl)-hydrazid]-benzyl}-l-methansulfonyl-10-thia1.4.7- triazadekan-3,8-dionu mg thiol-obsahujícího oligonukleotidů vyrobeného podle příkladu 5a) se smísí ve 2 ml fosfátového pufru (pH

7,4) s 1 mg maleimidového derivátu vyrobeného podle příkladu 51), rozpuštěným v 0,2 ml dimethylformamidu. Nechá se stát 2 hodiny při teplotě místnosti a roztok se podrobí ultrafiltraci přes membránu s vylučovací mezí 3000 (Amicon YM 3) a pak sušení vymražením. Získá se 5 mg požadovaného konjugátu.

n) technecium-99m komplex konjugátu 5(esteru 6merkapto-l-hexyl-fosforečné kyseliny) 35mer-olionukleotidu ₅ , _ _T * _T * _T * _T * TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU- 3 ’ a

10-acetyl-2-{4-[3-oxapropionová kyselina-(6-maleimidohexanoyl)-hydrazid]-benzyl}-1-methansulfonyl-10-thia1,4,7-triazadekan-3,8-dionu ml roztoku D-glukarátu draselného (12 mg/ml) a chloridu cínatého (100 gg/ml) v 0,2M NaHCO^ se suší vymražením v lahvičce a pak se smísí s roztokem [Tc-99m]-pertechnetátu sodného (1 ml, 1 mCi) z Mo-99/Tc-99m generátoru. Po stání při teplotě místnosti 15 minut se odebere podíl a smísí se se stejným objemem konjugátu z příkladu 5m) (1 mg/ml) rozpuštěným v 0,2M NaHCO^ roztoku.

Po 15 minutách jak chromatograf ie na tenké vrstvě tak HPLC ukazují, že > 98 % radioaktivity bylo přijato konjugátem.

Příklad 6

a) Kónjugát 5’-(esteru 6-amino-l-hexyl-fosforečné kyseliny) 35mer-olionukleotidu ’ - CUC AUGGAGCGC AAGACGAAU AGCU ACAUAT *_ψ*_τ*_ψ*_τ_₃« _a

S-benzoyl MAG^-2,3,5,6-tetrafluorfenylesteru mg S-benzoyl MAG^-2,3,5,6-tetrafluorfenylesteru (vyrobeného podle US 4965392), rozpuštěné v 0,2 ml dimethylformamidu, se přidá k 8 mg titulní sloučeniny z příkladu la) , rozpuštěným v 0,5 ml 0, IM fosfátového pufru (pH 7) a míchá se 3 hodiny při teplotě místnosti. Zředí se vodou a roztok se podrobí ultrafiltraci (Amicon YM 3, vylučovací mez 3000). Po sušení vymražením se získá 5 mg konjugátu 6a) .

b) ^^^mTechnecium komplex konjugátu 5’-(esteru 6-aminol-hexyl-f osf orečné kyseliny) 35mer-olionukleotidu ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*_T*_T*_T*_T_₃> _a

S-benzoyl MAG^-2,3,5,6-tetrafluorfenylesteru mg titulní sloučeniny z příkladu 6a) se rozpustí ve 200 μΐ vody a smísí se s 1 ml 0,lM fosfátového pufru o pH 8,5. K této směsi se přidá 200 μΐ

99^mtechnecium- (V)-glukonátového roztoku (asi 15 mCi) a ponechá se stát 15 minut při teplotě místnosti. Výtěžek značení (stanoveno pomocí HPLC) je asi 95 %.

Příklad 7

a) Konjugát 5(esteru 6-amino-l-hexyl-fosforečné kyseliny) 35mer-olionukleotidu ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT* _T * _T * _T * _T _ ₃ ’ _a

99^mtechnecium komplexu esteru 2,3,5,6-tetrafluorfenyl-4,5bis(merkaptoacetamido)-pentanové mg titulní sloučeniny z příkladu la), rozpuštěné v 0,6 nil fosfátového pufru se přidá k ^^^mtechneciového komplexu 2,3,5,6-tetrafluorfenyl-4,5-bis (merkaptoacetamido)pentanové kyseliny (vyrobená podle; J.Nucl.Med. 32, 1445 (1991)) asi 100 mCi, rozpuštěného ve 2 ml fosfátového pufru, pH 7,2. Upraví se na pH 10 1,0M pufrem uhličitanu draselného a míchá se 20 minut při teplotě místnosti. Pro konečné čištění se roztok vloží na Sephadexovou kolonu (Pharmacia) a eluuje 75 mmol roztoku chloridu sodného. Hlavní frakce se spojí, zředí se běžným fyziologickým solným roztokem a filtrují. Získá se tak roztok, který může být použit pro radiodiagnostické studie.

Příklad 8

a) Konjugát 5’-(esteru 6-merkapto-l-hexyl-fosforečné kyseliny) 35mer-oligonukleotidu ’ - T * T * T * T * TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU - 3 ’ a

5’(N-maleimido)-3-oxapentyl-{2-[3-karboxybenzoyl)-thio]acetyl}-glycylglycylglycinátu mg thio-obsahujícího oligonukleotidu vyrobeného podle příkladu 5a) se smísí pod dusíkem ve 2 ml fosfátového pufru (pH 7,4) s 1 mg

5- (N-maleimido)-3-oxapentyl-{2-[3-karboxybenzoyl) -thio] -acetyl} -glycylglycylglycinátu (vyroben podle Bioconj. Chem. X, 431 (1990)), rozpuštěným v 0,2 ml dimethylformamidu. Míchá se 2 hodiny při teplotě místnosti a roztok se podrobí ultrafiltraci přes membránu (Amicon YM 3) a pak sušení vymražením. Získá se 5,5 mg požadovaného konj ugátu.

b) Technecium-99m komplex konjugátu 5’-(ester

6- merkapto-l-hexyl-fosforečné kyseliny)

35mer-oligonukleotidu ’ - T * T * T * T * T AGGAGGAGGAGGGAGAGCGC AAAUGAGAUU - 3 ’ a 5 ’ (N-maleimido)-3-oxapentyl-{2-[3-karboxybenzoyl)-thio]acetyl}-glycylglycylglycinátu ml roztoku draselného-D-glukarátu (12 mg/ml) a chloridu cínatého (100 pg/ml) v 0,M NaHCO^ se suší vymražením v lahvičce a pak se smísí s roztokem [Tc-99m]-pertechnetátu sodného (1 ml, 1 mCi) z Mo-99/Tc-99m generátoru. Po stání při teplotě místnosti po 15 minut se odebere podíl a smísí se se stejným objemem konjugátu z příkladu 8a) (1 mg/ml) rozpuštěného v 0,2M NaHCO^ roztoku. Substance může být izolována sušením vymražením. Výtěžek značení stanovený pomocí HPLC je > 96 %.

Příklad 9

a) Konjugát 5(ester 6-merkapto-l-hexyl-fosfonové kyseliny) 35mer-oligonukleotidů ’ - T * T * T * T * TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU - 3 ’ a

1-[6-(2-vinyl-6-hexyloxymethyl)-pyridin]-1,4,8,11-tetraazacyklotetradekanu

Roztok 4 mg thio-obsahujícího oligonukleotidů, vyrobeného podle příkladu 5a), ve 2 ml fosfátového pufru (pH 7,4) se smísí pod dusíkem s 1 mg

1- [6-(2-vinyl-6-hexyl-oxymethyl)-pyridin]-1,4,8,11tetraazacyklotetradekanu (vyrobený podle EP 0588229) , rozpuštěný v 0,5 ml dimethylformamidu. Míchá se 4 hodiny při 35 °C, smísí s 10 ml ethanolu a produkt se izoluje odstředěním. Čištění se provede chromatografií s reverzní fází na sloupci 1 x 25 cm s 50 mmol triethylamoniumacetát (pH 7) acetonitrilovým gradientem. Spojené frakce se suší vymražením, rozpustí v 1 ml vody a odsolí na koloně Sephadex G-10. Titulní sloučenina (asi 4 mg) se izoluje sušením vymražením.

b) Tc-99m komplex konjugátu 5’-(ester 6-merkapto-1-hexyl58 fosfonové kyseliny) 35mer-oligonukleotidu ’ - T * T * T * T * TAGGACGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU - 3 ’ a 1- [ 6- ((2-vinyl-6-hexyloxymethyl)-pyridin]-1,4,8,11tetraazacyklotetradekanu

Postupuje se jak je popsáno v příkladu 8b). Výtěžek značení stanovený pomocí HPLC je 92 %.

Příklad 10

a) Konjugát 5’-(esteru 6-merkapto-l-hexyl-fosfonové kyseliny) 35mer oligonukleotidů ₅ , _ _ψ * _T * _ψ * _T * T AGGAGGAGGAGGGAGAGCGC AAAUGAGAUU - 3 ’ a N- [4-hydroxy-3- (1,4,8,ll-tetraaza-cyklotetradec-5-yl)benzyl] -2-(6-vinylpyridin-2-ylmethoxy)-acetamidu

Roztok 6,5 mg thiol-obsahujícího oligonukleotidů vyrobeného podle příkladu 5a) , ve 2 ml fosfátového pufru (pH 8,0) se smísí s 1,2 mg N-[4-hydroxy-3-(1,4,8,ll-tetraazacyklotetradec-5-yl) -benzyl-2- (6-vinyl-pyridin2-ylmethoxy)-acetamidu (vyrobený podle J.Chem.Soc.,

Chem.Commun. 156 (1988)), rozpuštěným v 0,1 ml dimethylformamidu. Míchá se 4 hodiny pod dusíkem při 35 °C, smísí se s 10 ml ethanolu a produkt se izoluje odstředěním. Čištění se provede chromatografii s reverzní fází na koloně 1 x 25 cm s gradientem 50 mmol triethylamoniumacetát (pH

7)/acetonitril. Spojené frakce se odsolí na koloně

Sephadex-G-10. Sušením vymražením se získá 5 mg titulní sloučeniny jako bílého prášku.

b) Komplex měď-64 konjugátu 5’-(esteru 6-merkapto-l-hexylfosforečné kyseliny) 35mer-oligonukleotidu ’ - T * T * T * T *TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3’ a

Ν- [4-hydroxy-3- (1,4,8,ll-tetraaza-cyklotetradec-5-yl)benzyl] -2-(6-vinyl-pyridin-2-ylmethoxy)-acetamidu mg konjugátu získaného podle 10a) se inkubuje v 1 ml fosfátového pufru (pH 8) s ^^CuCl2 (0,2 mCi). Výtěžek značení, stanoveno po 1 hodině pomocí HPLC, je > 98 %. Produkt se izoluje sušením vymražením.

Příklad 11

a) Konjugát 5’-(esteru 6-merkapto-l-hexyl-fosfonové kyseliny) 35mer oligonukleotidu

5’-_T*_T*_T*_T*_TAGG_AGGAG_GAGGG_AG_AGCG_CAAAUGAGAUU-3, a kyseliny 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-2-[(5-aza-8-maleimido-6oxo)-oktan]-1,4,7,10-tetraoctové mg kyseliny l,4,7,10-tetraazacyklododekan-2-[(5aza-8-maleimido-6-oxo)-oktan]-1,4,7,10- tetraoctové (vyrobena podle J.Chem.Soc., Chem.Commun. 796, (1989)) se přidá k roztoku 5 mg thiol-obsahujícího oligonukleotidu, vyrobeného podle příkladu 5a) , ve 2 ml fosfátového pufru (pH

8) pod dusíkem. 3 hodiny se míchá při 35 C, smísí s 10 ml isopropylalkoholu a produkt se izoluje odstředěním. Čištění se provede chromatografií s reverzní fází na koloně 1 x 25 cm s gradientem 25 mmol triethylamoniumacetát (pH 7)/acetonitril. Spojené frakce se šetrně zahustí odpařením ve vakuu, rozpustí se v malém množství vody a odsolí pomocí kolony Sephadex-G-10. Sušením vymražením se získají 4 mg titulní sloučeniny jako bílý prášek.

b) Yttrium-90 komplex konjugátu 5(esteru 6-merkapto1-hexyl-fosfonové kyseliny) 35mer oligonukleotidu ’ -T’T^T^AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3 ’ a kyseliny

1,4,7,10-tetraazacyklododekan-2-[(5-aza-8-maleimido-6oxo)-oktan]-1,4,7,10-tetraoctové ^θΥ-acetát (1 mCi), rozpuštěný v 1 ml 0,05M roztoku octamu amonného, se smísí s 1 mg konjugátu vyrobeného podle příkladu 11a) a zahřívá se 1 hodinu na 85 °C. Výtěžek značení stanovený pomocí HPLC je > 95 %. Produkt se izoluje sušením vymraženim.

Příklad 12

a) Konjugát 5’-(esteru 6-merkapto-l-hexyl-fosfonové kyseliny) 35mer oligonukleotidů ₅.-_T*_T*_T*_T*_{TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU}_₃, _a kyseliny

1,4,7-triazacyklononan-2- [ (5-aza-8-maleimido-6oxo)-oktan]-1,4,7-trioctové mg kyseliny 1,4,7-triazacyklononan-2-[(5-aza-8maleimido-6-oxo)-oktan]-1,4,7-trioctové (vyrobené podle J. Chem. Soc., Chem. Commun. 794, (1989)) se přidá k roztoku 5 mg thiol-obsahujícího oligonukleotidů, vyrobeného podle příkladu 5a), ve 2 ml fosfátového pufru (pH 8) pod dusíkem. Míchá se 6 hodin při 35 °C, smísí s 10 ml isopropanolu a produkt se izoluje odstředěním. Čištění se provede chromatografií s reverzní fází na koloně 1 x 25 cm s gradientem 25 mmol triethylamoniumacetátu (pH

7)/acetonitril. Spojené frakce jsou šetrně zahuštěny odpařením ve vakuu, rozpuštěny v malém množství vody a odsoleny za pomoci kolony Sephadex G-10. Sušením vymraženim se získají 3 mg titulní sloučeniny jako bílého prášku.

b) Gallium-67 komplex konjugátu 5’-(esteru 6-merkapto61

1- hexylfosfonové kyseliny) 35mer oligonukleotidů ’ -T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU- 3’ a kyseliny

1,4,7-triazacyklononan-2- [ (5-aza-8-maleimido-6oxo)-oktan]-1,4,7-trioctové mg konjugátu produkovaného podle příkladu 12a) se rozpustí v 0,5 ml 0,ÍM citrátového pufru o pH 4,5 a smísí se s 0,1 ml roztoku gallium-67-citrátu (0,2 mCi) . Nechá se stát 2 hodiny při teplotě místnosti a produkt se odsolí na koloně Sephadex-G-10. Po sušení vymražením se získá 17 mg titulní sloučeniny jako bílého prášku.

Příklad 13

a) Fosfitylace 5’-0-(4,4’-dimethoxytrityl)-5-(prop2- en-1-on)-2’-deoxyuridinu mg 4-dimethylaminopyridinu, 3 ml diisopropylethylaminu a 962 μΐ (4,31 mmol)

2-kyanoethyl-N, N-diisopropylchlorf osf oramiditu se postupně přidá k míchanému roztoku 2,1 g (3,59 mmol) ’ -O- (4,4’-dimethoxytrityl)-5-(prop-2-en-l-on)-2’deoxyuridinu (vyroben podle Nucleosides & Nucleotídes 13. 939-944, (1994)) v 50 ml tetrahydrofuranu. Po asi 30 min se vytvoří bílá sraženina. Odfiltruje se, roztok se zahustí odpařením ve vakuu a zbytek se rozdělí mezi dichlormethan a 5% roztok hydřogenuhličitanu sodného. Dichlormethanová fáze se suší nad síranem hořečnatým a zahustí se odpařením ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou chromatografii na silikagelu a eluuje dichlormethanem/hexanem/diisopropylethylaminem (80:18:2). Získá se 1,8 g požadované sloučeniny jako bílé pěny. Elementární analýza:

vypočteno: 64,28 % C, 6,29 % H, 7,14 % N, 3,95 % P nalezeno: 64,02 % C, 6,60 % H, 7,21 % N, 4,09 % P.

b) Konjugát 36mer oligonukleotidů _u * _ _ψ * _T * _T * _T * TCUCAUGGAGCCAAGACGAAUAGCUACAUA - 3’ a 10-(4-aza2-hydroxy-5-imino-8-merkapto-oktan-l, 4,7-tris(karboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekanu

U* : 5-(prop-2-en-l-on)-2’-deoxyuridin

30mer-oligonukleotid identifikovaný procesem SELEX se produkuje s modifikací 5’-připojené sekvence 5 ’ _ψ*ψ*’τ*ψ*ψ obvyklým způsobem v automatickém syntetizátoru Pharmacia company (viz Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991) a oligonukleotid je také přítomen na sloupci· pevného vehikula. Při reakci s roztokem kyseliny trichloroctové v dichlormethanu se otevře ’-hydroxyskupina. Zatížení kolony je asi 10 mg

35mer-oligonukleotidu. 5’-Hydroxyskupina reaguje za přítomnosti tetrazolu s fosforamiditem získaným podle příkladu 13a). Potom se fosfit převede na fosfotriester zpracováním s roztokem jodu a koncový DMT radikál se rozštěpí reakcí s roztokem kyseliny trichloroctové v dichlormethanu. Pro adici thiolskupiny k a, β-nenasycenému karbonylovému systému přítomnému na konci 2’-deoxyuridinu, reaguje roztok

10-(4-aza-2-hydroxy-5-imino-8-merkapto-oktan)-1,4,7tris(karboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekanu*) v tetrahydrofuranu a postupně se promyje methanolem a vodou. Pro odstranění modifikovaného oligonukleotidů z pevného nosiče se obsahy kolony převedou do multinádobek, smísí se s 5 ml 30% roztoku amoniaku, nádoba se uzavře a třepe se přes noc při 55 °C. Potom se ochladí na 0 °C, odstředí, nosič se promyje 5 ml vody a spojené vodné fáze se podrobí sušení vymražením.

Pro čištění se pevný materiál vyjme do 2 ml vody, smísí se 2 ml 0,5M roztoku octanu amonného a smísí s 10 ml ethanolu, nechá se stát přes noc při -20 °C, odstředí, zbytek se promyje 1 ml ethanolu (-20 °C) a nakonec se suší ve vakuu při teplotě místnosti.

Získá se 6 mg titulní sloučeniny jako bezbarvého prášku * ) 10-(4-Aza-2-hydroxy-5-imino-8-merkapto-oktan)1,4,7-tris-(karboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan se získá jak je popsáno dále:

15,7 ml IN roztoku hydroxidu sodného a 480 mg (3,49 mmol) 2-iminotetrahydrothiofenhydrochloridu se přidá k roztoku 1,46 g (3,49 mmol) 10-(3-amino-2-hydroxypropyl) -1,4,7-tris-(karboxymethyl)-1,4,7,10tetraazacyklododekanu (viz příklad lc) ve směsi 50 ml vody a 50 ml methanolu a míchá se 3 hodiny při teplotě místnosti, zahustí se odpařením ve vakuu na asi 1/4 počátečního objemu a smísí za míchání s aniontovým měničem (IRA 410) až do dosažení hodnoty pH 11. Roztok se filtruje a smísí po malých podílech s kationtovým měničem IRC 50 do dosažení pH 3,5. Po filtraci se roztok suší vymražením. Získá se 1,39 g požadované substance jako bílého prášku s obsahem vody

4,9 %.

Elementární analýza (vztaženo na bezvodou substanci):

vypočteno: 48,45 % C, 7,74 % H, 16,14 % N, 6,16 % S nalezeno: 48,30 % C, 7,98 % H, 16,05 % N, 6,44 % S.

c) Yttrium-90 komplex konjugátu 36mer oligonukleotidů U * T * T * T * T * TCUC AUGGAGCC AAGACGAAU AGCU AC AU A - 3 ’ a 10- (4-aza-2-hydroxy-5-imino-8-merkapto-oktan)1,4,7-tris(karboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekan

U* : 5-(prop-2-en-l-on)-2’-deoxyuridin

Roztok ^Oyttria, rozpuštěného v 0,05M roztoku octanu amonného (asi 380 mCi) se přidá k 1 mg thioderivátu z příkladu 13b) v 0,5 ml 0,05M roztoku octanu amoného o pH 6, upraví se na pH 5,2 3M kyselinou octovou a míchá se 1 hodinu při teplotě místnosti. Upraví se na pH 7,0 0,01M roztokem hydroxidu sodného a konjugát se čistí pomocí HPLC (TSK-400/-MES-pufr). Hlavní frakce se spojí, zředí se běžným fyziologickým roztokem soli a upraví se na pH 7,2 0,0114 roztokem hydroxidu sodného. Po filtraci se získá přípravek vhodný pro radioterapii.

Příklad 14

a) Methylester S-(trifenylmethyl-merkaptoacetyl)-glycylglycinu

3,34 g (10 mmol) kyseliny S-trifenylmethylmerkaptooctové a 1,83 g (10 mmol) hydrochloridu methylesteru glycylglycinu se suspenduje ve 250 ml absolutního dichlormethanu. Po přídavku 1,01 g (10 mmol) triethylaminu se za chlazení ledem přidá 2,06 g (10 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu rozpuštěného v 50 ml absolutního dichlormethanu. Míchá se 1 hodinu při 0 °C a 18 hodin při teplotě místosti. Filtruje se, zahustí se odpařením a chromatografuje na silikagelu (eluent: CH₂Cl₂/MeOH: 10% až 30%).

Výtěžek: 3,56 g (77,0 % teorie), bílý prášek

Elementární analýza:

vypočteno:	67,51 % C,	5,67	%	H,	6,06	% N,
11,20	% S
nalezeno:	67,37 6,73	% c, % s.	6,02	%	H,	5,91	% N,

b) [ S-(Trifenylmethyl-merkaptoacetyl)-glycylglycinamidyl ] -6-hexanol

4,63 g (10 mmol) methylesteru S- (trifeny1-methyl-merkaptoacetyl)-glycyl-glycinu, vyrobeného podle příkladu 14a), se zahřívá na 100 “C v 11,72 g (100 mmol) 6-aminohexanolu/50 ml 1,4-dioxanu pod atmosférou argonu 2 hodiny. Potom se reakční vsádka nalije do směsi 100 ml dichlormethanu a 100 ml vody. Za míchání a chlazení ledem se pH upraví na 6 10M kyselinou chlorovodíkovou, organická fáze se oddělí a suší se nad síranem sodným. Po odpaření rozpouštědla se surový produkt čistí na silikagelu (eluent: CI^C^/MeOH: 10%-50%) . Výtěžek: 2,97 g (54,2 % teorie), bílý prášek Elementární analýza:

vypočteno:	67,98 %	c, s	6,81	% H,	7,67 % N, 11,68 % 0,
5,85	%
nalezeno:	67,72	%	c,	6,93	%	H,	7,93	%	N,
	5,64	%	s.

c) Diester kyseliny 0-{[S-(trifenylmethyl-merkaptoacetyl)glycyl-glycinamidyl]-6-hex-1-yl)-diisopropylamid0’ -methyl-fosforité

5,48 g (10 mmol) [S-(trifenylmethyl-merkaptoacetyl)glycyl-glycinamidyl]-6-hexanolu vyrobeného podle příkladu 14b) se rozpustí ve 100 ml absolutního dichlormethanu. Pod atmosférou argonu se přidá 5,17 g (40 mol) diisopropylethylaminu a 3,95 g (20 mmol) chloridu diisopropylamidu monomethylesteru kyseliny fosforité, rozpuštěného v 50 ml absolutního dichlormethanu, se přikape při 0 °C. Míchá se 0,5 hodiny při 0 °C a pak 2 hodiny při teplotě místnosti. Pro zpracováni se smísí za chlazení ledem se 320 mg (10 mmol) absolutního methanolu a po zahuštění se chromatograf uje na silikagelu (eluent: CE^C^/MeOH: 95% : 5/5% triethylamin).

Výtěžek: 1,98 g (27,9 % teorie), bezbarvý olej

d) Ester kyseliny 5’-[(merkaptoacetyl-glycyl-glycylamidyl)- 6-hex-l-yl]-fosforečné 35mer oligonukleotidu ₅ , __T *_T *_T * _T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3’

30mer-oligonukleotid, identifikovaný způsobem SELEX, s modifikací 5’-připojené sekvence 5 ’ _ψ*ψ*'ρ*'τ*ψ _se vyrobí za pomoci automatického syntetizátoru Pharmacia company (viz Oligonucleotides and Analogus, A Practical Approach, vyd. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991) a oligonukleotid ve chráněné formě je také přítomen na koloně pevného nosiče. Zatížení kolony je asi 15 mg

35mer-oligonukleotidu. Po odštěpení 5’-DMT-chránící skupiny (kyseliny trichloroctová/dichlormethan) se kopuluje podle standardních metod s fosforamiditem jak je popsáno v příkladu 14c). Po oxidaci jodem v tetrahydrofuranu se konjugát odštěpí od nosiče. V tomto případě se materiál smísí s 10 ml 30% roztoku amoiaku, nádoba se uzavře a přes noc se třepe při 55 °C. Ochladí se na 0 °C, odstředí, nosič se promyje 10 ml vody a spojené organické fáze se podrobí sušením vymražením.

Pro čištění se materiál vyjme do 5 ml vody, smísí se ml 0,5M roztoku octanu amonného a smísí se 20 ml ethanolu. Po ukončení srážení se přes noc chladí (-20 °C), odstředí, zbytek se promyje 1 ml ethanolu (-20 °C) a suší se ve vakuu. Získá se 9 mg bílého prášku.

Pro odštěpení S-tritylové chránící skupiny se materiál vyjme do 5 ml roztoku triethylamoniumacetátu (pH 7,0) a inkubuje se s 500 μΐ 0,IM roztoku dusičnanu stříbrného 30 minut. Potom se přidá 500 μΐ 0,14M roztoku dithiothreitolu a inkubuje se dalších 30 minut. Po odstředění se čirý supernatant odsolí na SEphadexu G 10. Frakce, obsahující produkt se suší vymražením. Získají se 4 mg konjugátu jako bílý prášek.

e) Technecium-99m komplex konjugátu esteru 5’-[(merkaptoacetyl-glycyl-glycyl-amidyl)-6-hex-l-yl]-fosforečné kyseliny 35mer oligonukleotidů ’ - T * T * T * T * TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA - 3 ’ mg kojugátu 14d) se rozpustí v 1 ml 0,IM pufru hydrogenfosforečnanu dvojsodného (pH 9,5). Po přídavku 10 mg vínanu dvojsodného, se smísí s roztokem pertechnetátu sodného (1 mCi) a pak s 10 ml roztoku chloridu cínatého (5 mg SnCl2/l ml 0,01M HC1). Výtěžek značení (asi 93 %) byl stanoven pomocí HPLC.

Přiklad 15

a) Ester 0-{[S-(trifenylmethyl-merkaptoacetyl)-glycyl-glycin amídyl]-6-hex-l-yl}-toluensulfonové kyseliny

5,48 g (10 mmol) [S-(trifenylmethyl-merkaptoacetyl) 68 glycyl-glycinamidyl]-6-hexanolu vyrobený podle příkladu 14b) se rozpustí ve 100 ml absolutního dichlormethanu. Přidá se 1,01 g (10 mmol) triethylamiu a 1,91 g (10 mmol) chloridu kyseliny p-toluensulfonové a míchá se 24 hodin při teplotě místnosti. Potom se zahustí a chromatografuje na silíkagelu (eluent: CH₂Cl₂/MeOH: 95:5).

Výtěžek: 4,32 g (61,5 % teorie), bezbarvý olej

Elementární analýza:

vypočteno: 65,03 % C, 6,18 % H, 5,99 % N, 13,68 % 0,

9,14 % S nalezeno: 64,93 % C, 6,32 % H, 5,78 % N,

8,88 % S.

b) Ester kyseliny 5’-[(merkaptoacety-glycyl-glycinamidyl)6-hex-l-yl]-fosforečné 35mer oligonukleotidů 5 ’ - T * T * T * T *TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3’

30mer-oligonukleotid, identifikovaný procesem SELEX, s modifikací 5’-připojené sekvence 5 ’ _ψ*-ρ*ψ*'ρ* j _se vyrobí za pomoci automatického syntetizátoru Pharmacia company (viz Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, vyd.

F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991) a oligonukleoid ve cgráněné formě je také přítomen na koloně pevného nosiče. Zatížení kolony je asi 15 mg 35mer-oligonukleotidu. Po odštěpení 5’-DMT-chránící skupiny (kyselina trichloroctová/dichlormethan), se kopuluje podle standardních metod s S-trityl-6-merkapto-hexylfosforamiditem. Po oxidaci jodem v tetrahydrofuranu se trityl-chráněná sloučenina odštěpí od nosiče, izoluje a čistí (viz příklad 14d).

Odštěpení S-tritylové chránící skupiny, izolace SH-skupinu nesoucího oligonukleotidů a čištění se provede jak je popsáno v příkladu 14d) (6 mg).

Pro kopulaci ae SH-skupinu nesoucí 35mer-oligonukleotid (6 mg) v 500 μΐ 0 , ÍM roztoku uhličitanu sodného smísí pod atmosférou argonu se 100 mg esteru kyseliny toluensulfonové 15a), rozpuštěných v 500 μΐ dimethylf ormamidu. Po 30 minutách se neutralizuje a zředí se vodou na objem 5 ml. Po odstředění se čirý supernatant vymrazí dosucha.

Odštěpení S-tritylových skupin se provede postupem popsaným jak je popsáno pod 14d) . Po čištění se získají 4 mg konjugátu.

c) Technecium-99m komplex konjugátu esteru 5’-[(merkaptoacetyl-glycyl-glycinamidyl) -6-hex-l-yl] -fosforečné kyseliny 35mer-oligonukleotidů ’ -T* T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA- 3 ’ mg konjugátu popsaného pod příkladem 15b) se rozpustí v 1 ml 0 , ÍM pufru hydrogenfosf orečnanu dvoj sodného (pH = 9,5). Po přídavku 10 mg vínanu dvojsodného, se smísí s roztokem pertechnetátu sodného (1 mCi) a pak s 10 μΐ roztoku chloridu cínatého (5 mg SnCl₂/l ml 0,01M HCl). Výtěžek značení (asi 95 %) se stanoví pomocí HPLC.

Příklad 16

a) Methylester N-[3-thia-5-(trifenylmethylmerkapto)-1-oxopent-1-yl]-S-trifenylmethyl-cysteinu

2,69 g (10 mmol) methylesteru N-[3-thia-5(trif enylmethylmerkapto) -l-oxo-pent-l-yl] -S-trif eny lmethyl70 cysteinu (vyrobený podle DE 4310999) se rozpustí spolu s 5,58 g (20 mmol) trifenylmethylchloridu ve 100 ml absolutního diehlormethanu. Po přídavku 2,02 g (20 mmol) triethylaminu se nechá míchat přes noc pod atmosférou argonu při teplotě místnosti. Pro zpracování se organická fáze promyje třikrát vždy 1% roztokem kyseliny citrónové, nasyceným roztokem hydřogenuhličitanu sodného a vodou. Po sušení síranem sodným se zahustí odpařením a čistí se na silikagelu (eluent: CH₂Cl₂/MeOH: 95:5).

Výtěžek: 4,53 g (60,1 % teorie) bezbarvého oleje

Elementární analýza:

vypočteno: 73,27 % C, 5,75 % H, 1,86 % N, 6,37 % 0,

12,76 % S nalezeno: 73,31 % C, 5,48 % H, 1,63 % N,

12,49 % S.

b) N-[3-Thia-5-(trifenylmethylmerkapto)-l-oxo-pent-l-yl]S-trifenylmethyl-N’-(6-hydroxy-hex-l-yl)cysteinamid

7,54 g (10 mmol) methylesteru N-[3-thia-5(trifenylmethylmerkapto)-l-oxo-pent-l-yl]-S-cysteinu popsaného pod příkladem 16a) se zahřívá na 100 °C v 11,72 g (100 mmol) 6-aminohexanolu/50 ml 1,4-dioxanu pod argonovou atmosférou 2 hodiny. Potom se reakční vsádka nalije do směsi 100 ml diehlormethanu a 100 ml vody. Za míchání a chlazení ledem se PH upraví 10M kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 6, organická fáze se oddělí a suší nad síranem sodným. Po odpaření rozpouštědla se surový produkt čistí na silikagelu (eluent: CH₂Cl₂/MeOH: 5%-50%)

Elementární analýza:

vypočteno: 72,99 % C, 6,49 % H, 3,34 % N, 5,72 % 0,

11,46 % S nalezeno: 72,73 % C, 6,62 % H, 3,11 % N, 11,17 % S.

c) Diester 0-{{[N-[3-thia-5-(trifenylmethylmerkapto)1-oxo-pent-l-yl]-S-trifenylmethyl-cysteinyl}-2-aminoeth-l-yl}-diisopropylamid-0’-methylfosforité kyseliny

8,39 g (10 mmol) N-[3-thia-5-(trifenylmethylmerkapto) -1-oxo-pent-l-yl] -S-trifenylmethyl-N’ - (6-hydroxyhex-l-yl)cysteinamidu, vyrobeného podle příkladu 16b), se rozpustí ve 200 ml absolutního diclormethanu. Pod atmosférou argonu se přidá 5,17 g (40 mmol) diisopropylethylaminu a 3,95 g (20 mmol) chloridu diisopropylamidu monomethylesteru kyseliny fosforité, rozpuštěného v 50 ml absolutního dichlormethanu, se přikape při 0 °C. Míchá se 0,5 hodiny při 0 °C a pak 1,5 hodiny při teplotě místnosti. Pro zpracování se smísí za chlazení ledem se 320 mg (10 mmol) absolutního methanolu a po zahuštění se chromatografuje na silikagelu (eluent: Cl^C^/MeOH: 95:5/5% (triethylamin)) .

Výtěžek: 5,37 g (53,7 % teorie) žlutavého oleje.

d) Ester 5’-[N-(3-thia-5-merkapto-l-oxo-pent-l-yl]cystein-N’-(6-hydroxy-hex-l-yl)amid]-fosforečné kyseliny 35mer oligonukleotidu ’ - CUC AUGGAGCGCAAGACGAAU AGCUACAUAT * T * T * T * - 3 ’

30mer-oligonukleotid identifikovaný SELEX procesem, se vyrobí s modifikací na sekvenci T*T*T*T*-3’ umístěné ve směru proti proudu za pomoci automatického syntetízátoru Pharmacia company (viz Oligonukleotides and Analogues,

A Practical Approach, Editor F.Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991). a oligonukleotid ve chráněné formě je také přítomen na pevném nosiči. Zatížení kolony je asi 15 mg 35mer-oligonukleotidu. Po odštěpení ’-DMT-chránící skupiny (kyselina trichloroctová/dichlormethan) se kopuluje standardními metodami s fosforamiditem (16c) a pak se oxiduje.

Odštěpení bázi chránících skupin z nosiče a čištěním bis.S-trityl-chráněného konjugátu se provádí jako pod 14d) (asi 12 mg).

Pro odštěpení S-tritylových chránících skupin se materiál vyjme do 5 ml 50 mol roztoku triethylamoniumacetátu (pH = 7,0) a inkubuje se s 500 μΐ 0,ÍM roztoku dusičnanu stříbrného 30 minut. Potom se přidá 500 μΐ 0,14M dithiothreitolového roztoku a inkubuje se dalších 30 minut. Po odstředění se čirý supernatant odsolí na Sephadexu G 10. Frakce, obsahující produkt se suší vymražením. Získá se 5 mg bílého prášku.

e) Technecium-99m komplex konjugátu esteru kyseliny ’ - [N-(3-thia-5-merkapto-l-oxo-pent-l-yl]-cystein-N’-(6hydroxy-hex-l-yl)-amid]fosforečné 35mer oligonukleotidu 5 ’ - CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUAC AU AT * T * T * T * - 3 ’ mg konjugátu popsaného pod příkladem 16d se rozpustí v 1 ml 0,ÍM pufru dvoj sodného hydrogenfosforečnanu (pH = 9,5). Po přídavku 10 mg vínanu dvoj sodného se smísí s roztokem pertechnetátu sodného (1 mCi) a pak s 10 ml roztoku chloridu cínatého (5 mg SnC^/l ml 0,01M HCI). Výtěžek značení (asi 96 %) je stanoven pomocí HPLC.

Příklad 17

a) Ester kyseliny 0-{N-[3-thia-5-(trifenyImethylmerkapto)1-oxo-pent-l-yl]-S-trifenylmethyl-N’-(6-hydroxy73 hex-1-yl)cysteinimidyl}-p-toluensulfonové

8,39 g (10 mmol) N-[3-thia-5-(trifenylmethylmerkapto)-1-oxo-pent-l-yl]-S-trifenylmethyl-N’-(6-hydroxyhex-l-yl)cystein-amidu, vyrobeného podle příkladu 16b, se rozpustí ve 200 ml absolutního dichlormethanu. Přidá se 1,01 g (10 mmol) triethylaminu, 1,91 g (10 mmol) chloridu kyseliny p-toluensulfonové a míchá se 20 hodin při teplotě místnosti. Potom se zahustí a chromatografuje se na silikagelu. (Eluent: CH₂Cl₂/MeOH: 97:3).

Výtěžek: 6,44 g (67,0 % teorie) žlutavého oleje

Elementární analýza:

vypočteno: 72,47 % C, 6,29 % H, 2,91 % N, 8,32 % 0,

10,01 % S nalezeno: 72,19 % C, 6,47 % H, 2,68 % N,

9,83 % S.

b) Ester kyseliny 5’-[(merkaptoacetyl-glycyl-glycinamidyl)13-trídec-7-thio-l-yl]fosforečné 35meru oligonukleotidu 5 ’ - CUCAUGGAGCGC AAGACGAAUAGCUACAUAT *_ψ*_τ*_τ*_τ*_₃·

30mer-oligonukleotid identifikovaný SELEX procesem se vyrobí modifikací sekvence ψ*'ρ*·ρ*'Γ*ψ* _₃ > umístěné proti směru za pomoci automatického syntetizátoru Pharmacia Company (viz Olinucleotides and Analogues, A Practical Approach, vyd. F.Ecksteín, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991) a oligonukleotid ve chráněné formě je také přítomen na koloně pevného nosiče. Zatížení kolony je asi 15 mg 35mer-oligonukleotidu. Po odštěpení

5’-DMT-chránící skupiny (kyselina trichloroctová/dichlormethan), se kopuluje podle standardních metod s S-trityl-6-merkaptohexylfosforamiditem.

Po oxidaci jodem v tetrahydofuranu se trityl-chráněná sloučenina odštěpí z nosiče, izoluje se a čistí (viz příklad 14d) .

Odštěpení S-tritylové chránící skupiny, izolace SH-skupinu nesoucího oligonukleotidů a čištění se provádí jak je popsáno v příkladu 14d) (7,5 mg).

Pro kopulaci se SH-skupinu nesoucí 30mer-oligonukleotid (7 mg) v 550 μΐ 0,1M roztoku uhličitanu sodného smísí pod atmosférou argonu se 180 mg esteru kyseliny toluensulfonové 17a), rozpuštěném v 500 μΐ dimethylformamidu. Po 30 minutách se neutralizuje a zředí vodou na objem 5 ml. Po odstředění se čirý supernatant suší vymražením. pro odštěpení S-tritylových skupin se provede postup jak je popsán pod 14d). Po čištění se získá 4,3 mg konj ugátu.

c) Technecium-99m komplex konjugátu esteru kyseliny ’ -[(merkaptoacetyl-glycyl-glycinamidyl)-13trideka-7-thio-1-yl]fosforečné 35meru oligonukleotidů 5 ’ - CUC AUGGAGCGCAAGACGAAU AGCU ACAUAT *_T*_T*_T*_T*_₃>

mg konjugátu popsaného pod příkladem 17b) se rozpustí v 1 ml 0,1M pufru dvoj sodného hydrogenfosforečnanu (pH 9,5). Po přídavku 10 mg vínanu dvoj sodného se smísí s roztokem pertechnetátu sodného (1 mCi) a pak s 10 μΐ roztoku chloridu cínatého (5 mg SnC^/l ml 0,01M HCl). Výtěžek značení (asi 93 %) byl stanoven pomocí HPLC.

Příklad 18

a) Konjugát esteru kyseliny 5(6-amino-l-hexyl-fosforečné) 35meru oligonukleotidů ’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3 ’ a monoamidu N- (tetrahydro-2-oxo-thiofen-3-yl) -thiodiglykolové kyseliny

30mer-oligonukleotid, identifikovaný podle procesu SELEX, se vyrobí s modifikací sekvence *7*7*7*7*_₃’ proti směru za pomoci automatického syntetizátoru Pharmacia company (viz Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, vyd. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford New York, Tokyo, 1991), a oligonukleotid ve chráněné formě je také přítomen na sloupci pevného nosiče. Zatížení kolony je asi 15 mg 35met-oligonukleotidů. Po odštěpení

5’-DMT-chránící skupiny (kyselina trichloroctová/dichlormethan), se kopuluje podle standardních metod s N-trifluoracetylaminohexylfosforamiditem.

Po oxidaci jodem v tetrahydrofuranu se oligonukleotid nesoucí aminoskupinu odštěpí z nosiče a izoluje se a čistí jak je popsáno pod lb) (9,3 mg).

Pro kopulaci s monoamidem kyseliny N-(tetrahydro-2-oxo-thiofen-3-yl)-thiodiglykolové (DE 4311023), 5 mg oligonukleotidů, nesoucího aminoskupinu se rozpustí v 1 ml 2M roztoku uhličitanu sodného. Po přídavku 100 mg thiolaktonového derivátu se inkubuje při teplotě místnosti 4 hodiny. Potom se neutralizuje a odsolí se ultrafiltrači přes membránu s vylučovací mezí 3000 (Amicon YM3) . Po lyofilizací se podrobí sušení vymražením. Získá se 6,3 mg požadovaného konjugátu.

b) Technecium-99m komplex konjugátu esteru kyseliny

5’-(6-amino-l-hexyl-fosforečné) 35meru oligonukleotidů 5 ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T* -3 ’ a monoamidu N- (tetrahydro-2-oxo-thiofen-3-yl)-thiodiglykolové kyseliny mg SH-skupinu nesoucího konjugátu popsaného pod příkladem 18a) se rozpustí v 1 ml pufru 0,ÍM dvoj sodného hydrogen fosforečnanu (pH =9,5). Po přídavku 10 mg vinanu dvoj sodného se smísí s roztokem pertechnetátu sodného (1 mCi) a pak s 10 μΐ roztoku chloridu cínatého (5 mg SnC^/l ml 0,01M HC1). Výtěžek značení (94 %) je stanoven pomocí HPLC.

Příklad 19

a) 5(Ester 6-amino-l-hexyl-fosforečné kyseliny) 32mer oligonukleotidů ’ - CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT - ³’³’T-5’

30mer oligonukleotidů ’ - CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCU ACAUA - 3’, identifik ováný SELEX procesem, s modifikací thymidinové sekvence -T ~ T-5’, umístěné proti směru, která je vázána 5’-polohou na vehikulm, se vyrobí obvyklým způsobem v automatickém syntetizátoru Pharmacia company (viz Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, vyd. F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991) a oligonukleotid je také přítomen na koloně pevného nosiče. Reakcí s roztokem kyseliny trichloroctové v dichlormethanu se otevře 5’-hydroxyskupina. Zatížení kolony je asi 10 mg 32mer-oligonukleotidu. Pro připojení linkeru reaguje kolona s acetonitrilovým roztokem 50 pmol

P-kyanoethyl-N,N-diisopropyl-amino-6- (trif luoracetamido) 1-hexyl-fosforamiditu (připravený podle Nucl.Acids. Res.

16, 2659-2669 (1988)) za přítomnosti tetrazolu. Oxidace vytvořeného fosfitu na plně chráněný fosfotriester se provede jodem v tetrahydrofuranu. Potom se kolona postupně promyje methanolem a vodou. Pro odstranění modifikovaného oligonukleotidů z pevného nosiče jsou obsahy kolony shromážděny ve více lahvičkách, smíseny s 5 ml 30% roztoku amoniaku, nádoba je utěsněna a třepána přes noc při 55 C. Potom se ochladí na 0 °C, odstředí, nosič se promyje 5 ml vody a spojené vodné fáze se podrobí sušení vymražením.

Pro čištění se pevný materiál vyjme do 2 ml vody, smísí se 2 ml 0,5M roztoku octanu amonného a smísí s 10 ml ethanolu, nechá se stát přes noc při -20 °C, odstředí se, zbytek se promyje 1 ml ethanolu (-20 °C) a nakonec se suší ve vakuu při teplotě místnosti.

Získá se 8 mg titulní sloučeniny jako bezbarvého prášku.

b) Konjugát 5’-(esteru 6-amino-l-hexyl-fosforečné) 32mer oligonukleotidů ’ - CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUAC AUAT - ³ ’ ’ ³ ’ T - 5 ’ a

10- [7-(4-isothiokyanatofenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(karboxymethyl) -4-azaheptyl]-1,4,7-tris-(karboxymethyl)-1,4,7,10tetraazacyklododekanu mg oligonukleotidů získaného v příkladu 19a) se rozpustí ve 2,5 ml pufru NaHC0j/Na2C03 (pH 8,0) a smísí s 1 mglO-[7-(4-isothiokyanatofenyl)-2-hydroxy-5-oxo7- (karboxy-methyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(karboxymethyl)-1,4,7,10-tetra-azacyklododekanu (titulní sloučenina z příkladu lf). Míchá se 5 hodin při teplotě místnosti, pH se upraví na 7,2 přídavkem 0,01M kyseliny chlorovodíkové a roztok se podrobí ultrafiltraci přes membránu s vylučovací mezí 3000 (Amicon YM3) a pak sušení vymražením). Získá se 7 mg požadovaného konjugátu.

c) ^xxxIndium komplex konjugátu 5’-(esteru

6-amino-1-hexyl-fosforečné) 32mer oligonukleotidů ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-³ ’’³ *T-5’ a

10- [7- (4-isothiokyanatofenyl) -2-hydroxy-5-oxo-7(karboxymethyl) -4-azaheptyl] -1,4,7-tris- (karboxymethyl) 1,4,7,10-tetraazacyklododekanu μΐ roztoku octanu ^^^inditého (350 μϋι) (vyrobený z chloridu inditého ve 2M roztoku octanu sodného a upravením pH na 4,0 s 0,IM kyselinou chlorovodíkovou) se přidá ke 135 μΐ roztoku 1 mg titulní sloučeniny z příkladu 19b) v MES pufru, pH 6,2 (MES = 2-(N-morfolino)ethylsulfonová kyselina). pH se upraví na 4,2 přídavkem 0,01M kyseliny chlorovodíkové. 1 hodinu se míchá při 37 °C při pH 4,2. pH se upraví na 6 2M roztokem octanu sodného a 10 μΐ 0,IM roztoku Na2EDTA (Na2EDTA = dvoj sodná sůl ethylendiamin-tetraoctová kyseliny) se přidá pro komplexaci přebytku india. Konečné čištění takto získaného značeného konjugátu (lh) se provede pomocí HPLC (vylučovací chromatografie): TSK-400 (MES-pufr). Frakce, obsahující značený konjugát se zředí běžným fyziologickým solným roztokem, pH se upraví na 7,2 0,01M roztokem hydroxidu sodného a filtrují. Takto připravený roztok pak představuje vhodný přípravek pro radiodiagnozu.

Příklad 20

a) 5’-(Ester 6-amino-l-hexyl-fosforečné kyseliny) 35mer oligonukleotidu ₅,__T***_T***_T»**_T***_{TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGGAAAUGAGAUU}_3,

30mer-oligonukleotidu ’-TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3 ’ (sekv.č. 13 US patentu č. 5270163), identifikovaný procesem SELEX, se vyrobí obvyklým způsobem v automatickém syntetizátoru Pharmacia company (viz Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, vyd. F.Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991), a oligonukleotid je také přítomen na koloně pevného nosiče. Čtyři konečné thymidiny jsou navázány fosforoditioáty ke thymidinu přítomnému na 5’-konci podle techniky popsané G. Blatonem a spol., v Oligonucleotides and Analogues, str. 109 až 135. pro tento účel je první 5 ’-hydroxyskupina otevřena zpracováním s kyselinou trichloroctovou. Potom se 3’-hydroxyskupina

5’-DMTO-thymidinu převede tris-pyrrolidinofosfinem a tetrazolem na diamidit, který se převede na fosforothioamidit přídavkem 2,4-dichlorbenzylmerkaptanu.

Tato sloučenina se aktivuje tetrazolema nechá reagovat s 5 ’-hydroxyskupinou oligonukleotidu na thiofosfáttriester. Oxidace na fosforodithioát probíhá s elementární sírou v roztoku sirouhlíku, pyridinu, triethylaminu 95:95:10. Benzylové skupiny ještě nejsou odstraněny. Analogickým způsobem jsou také naváány 3 další thymidiny. Zatížení kolony je asi 10 mg 35mer-oligonukleotidu. Potom se opět otevře 5’-hydroxyskupina.

Pro připojení linkeru reaguje kolona s roztokem 50 pmol acetonitrilového roztoku 2-kyanoethyl-N,N’diisopropylamino-6-(trifluoracetamido)-1-hexylfosforamiditu (lit. v příkladu za přítomnosti tetrazolu. Oxidace vytvořeného fosfitu na fosforotriester se provede jodem v tetrahydrofuranu. Potom se kolona postupně promyje methanolem a vodou. Pak se odstraní chránící skupiny dithionátových vazeb roztokem thiofenol/triethylamin/dioxan 1:2:2, který působí 2 hodiny. Pak se kolona promyje v každém případě 3krát svým objemem methanolu, potom se promyje etherem a suší se. Pro odstranění modifikovaného oligonukleotidů z pevného nosiče se obsahy kolony shromáždí, smísí s 5 ml 30% roztoku amoniaku, ochladí se na 0 °C, odstředí, nosič se promyje 5 ml vody a spojené vodné fáze se podrobí sušení vymražením.

Pro čištění se pevný materiál vyjme do 2 ml vody, smísí se se 2 ml 0,5M roztoku octanu amonného a míchá s 10 ml ehanolu, nechá se přes noc stát při -20 °C, odstředí se, zbytek se promyje 1 ml ethanolu (-20 °C) a nakonec se suší ve vakuu při teplotě místnosti.

Získá se 8 mg titulní sloučeniny jako bezbarvého prášku.

b) Konjugát 5’-(esteru 6-amino-l-hexyl-fosforeěné kyseliny) 35mer-oligonukleotidů ₅,__τ***_τ***_τ***_τ*,* τ AGGAGGAGGAGGGAGAGCGC AAAUGAGAUU - 3 ’ a 10- [7-(4-isothiokyanato-fenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(karboxymethyl) -4-aza-heptyl]-l,4,7-tris(karboxymethyl)1,4,7,10-tetraazacyklododekanu mg oligonukleotidů získaného v příkladu 20a) se ropustí ve 2,5 ml pufru NaHCO3/Na2CO-3 (pH 8,0) a smísí s 1 mg 10- [7-(4-isothiokyanátofenyl)-2-hydroxy-5-oxo7-(karboxymethyl)-4-aza-heptyl]-l,4,7-tris(karboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyklododekanu (titulní sloučenina z příkladu lf). Míchá se 5 hodin při teplotě místnosti, PH se upraví na 7,2 přídavkem 0,01M kyseliny chlorovodíkové a roztok se podrobí ultrafiltráci přes membránu s vylučovací mezí 3000 (Amicon ÝM3) a pak sušení vymražením.

Získá se 7 mg požadovaného konjugátu.

111

c) Indium komplex konjugátu 5’-(esteru 6-amino-l-hexylfosforečné kyseliny) 35mer-oligonukleotidů 5 , __T* * *_T* * *_T* * *_T* * *TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3 ’ a 10- [7-(4-isothiokyanato-fenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7-(karboxymethyl) -4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(karboxymethyl)1,4,7,10-tetraazacyklododekanu μΐ roztoku octanu ^^^inditého (350 pCi) (vyrobeného 111 z chloridu inditého ve 2M roztoku octanu sodného a upravením PH na 4,0 0,ÍM kyselinou chlorovodíkovou) se přidá ke 135 μΐ roztoku 1 mg titulní sloučeniny z příkladu 20b) v MES pufru, pH 6,2 (MES = kyselina

2-(N-morfolino)ethylsulfonová). pH se upraví na 4,2 přídavkem kyseliny 0,01M chlorovodíkové. 1 hodinu se míchá při 37 °C při pH 4,2. Upraví se na pH 6 2M roztokem octanu sodného a pro komplexaci mindia se přidá 10 μΐ 0,1M Na₂EDTA = dvoj sodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové. Konečné čištění takto získaného konjugátu (lh) se provede pomocí HPLC (vylučovací chromatografie: TSK-400/MES-pufr). Frakce, obsahující značený konjugát se zředí běžným fyziologickým solným roztokem, pH se upraví na 7,2 0,01M roztokem hydroxidu sodného a filtruje. Takto připravený roztok pak představuje vhodný přípravek pro radiodiagnozu.

Příklad 21

a) 5(Ester 6-amino-l-hexyl-fosforečné kyseliny) 35mer oligonukleotidů ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT* **_T**_T**_T**_T.₃>

30mer-oligonukleotidů ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT- 3 ’ , identifikovaný procesem SELEX, s modifikací sekvence T**T**T**T**T-3’ umístěné proti směru, se získá nejprve vyrobením sekvence 5 thymidinů spojených kyanoethylfosfonátovými skupinami vyrobenou na nosiči ke 3 ’ . Reakcí této sloučeniny s 0,5M roztokem tetraethylthiuramdisulfidu v acetonitrilu se provádí sulfonace na fosfonothioát během 15 minut a pak je materiál s volnou 5’-hydroxylovou skupinou výchozí materiál pro 35mer oligonukleotid. Celá syntéza probíhá obvyklým způsobem na automatickém syntetizátoru Pharmacia company (viz Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, vyd. F.Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York, Tokyo, 1991) a oligonukleotid je ještě přítomen na koloně pevného nosiče. Reakcí s roztokem kyseliny trichloroctové v diehlormethanu se otevře 5 ’-hydroxyskupina. Zatížení kolony je asi 10 mg 35mer-oligonukleotidu. Pro připojení linkeru kolonareaguje s acetonitrilovým roztokem β-kyanoethyl-N,N-diisopropylamino-6-(trifluoracetamido)1-hexyl-fosforamiditu (vyrobený podle Nucl.Acids.Res. 16. 2659-2669 (1988)) za přítomnosti tetrazaolu. Oxidace vytvořeného fosfitu tak, že se vytvoří plně chráněný fosforotriester proběhne s jodem v tetrahydrofuranu. Potom se kolona postupně promyje methanolem a vodou. Pro odstranění modifikovaného oligonukleotidů z pevného nosiče a odštěpení kyanoethylskupin se obsahy kolony shromáždí, smísí s 5 ml 30% roztoku amoniaku, nádoba se uzavře a třepe přes noc při 55 °C. Pak se ochladí na 0 °C, odstřeďuje, nosič se promyje 5 ml vody a spojené vodné fáze se podrobí sušení vymražením.

Pro čištění se pevný materiál vyjme do 2 ml vody, smísí se 2 ml 0,6M roztoku octanu amonného a smísí s 10 ml thanolu, nechá se stát přes noc při -20 °C, odstředí, zbytek se promyje 1 ml ethanolu (-20 °C) a nakonec se suší ve vakuu při teplotě místnosti.

Získá se 8 mg titulní sloučeniny jako bezbarvého prášku.

b) Konjugát 5’-(ester 6-amino-l-hexyl-fosforečné kyseliny) 35mer oligonukleotidu ’ - CUC AUGGAGCGC AAGACGAAUAGCUACAUAT ***_T**_T**_T**_T_₃’ _{a 10}_ [7- (4-isothiokyanatofenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7(karboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(karboxymethyl)1,4,7,10-tetraazacyklododekanu mg oligonukleotidu získaného v příkladu 20a) se rozpustí ve 2,5 ml pufru NaHCO-j/Na2CO3 (pH 8,0) a smísí s 1 mg 10-[7-(4-isothiokyanatofenyl)-2-hydroxy5-oxo-7-(karboxymethyl)-4-aza-heptyl]-l,4,7-tris(karboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyklo-dodekanu (titulní sloučenina z příkladu lf). Míchá se 5 hodin při teplotě místnosti, pH se upraví ma 7,2 přídavkem 0,01M kyseliny chlorovodíkové a roztok se podrobí ultrafiltraci přes membránu s vylučovací mezí 3000 (Amicon YM3) a pak sušení vymražením.

Získá se 7 mg požadovaného konjugátu.

c) *¹¹Indium komplex konjugátu 5’-(ester 6-amino-l-hexylfosforečné kyseliny) 35mer-oligonukleotidu 5 ’ - CUC AUGGAGCGC A AG ACGA AUAGCU AC AU AT ***_τ**_τ**_ψ**_ψ_₃> _{a 1θ}_ [7- (4-isothiokyanatofenyl)-2-hydroxy-5-oxo-7(karboxymethyl)-4-aza-heptyl]-1,4,7-tris(karboxymethyl)1,4,7,10-tetraazacyklododekanu μΐ roztoku octanu ^inditého (350 gCi) (vyrobeného z chloridu ^'^'inditého ve 2M roztoku octanu sodného a upravením pH na 4,0 0 , ÍM kyselinou chlorovodíkovou) se přidá ke 135 μΐ roztoku 1 mg titulní sloučeniny z příkladu 21b) v MES pufru, pH 6,2 (MES =

2-(N-morfolino)ethylsulfonová kyselina). pH se upraví na

4,2 přídavkem 0,01M kyseliny chlorovodíkové. 1 hodinu se míchá při 37 °C při pH 4,2. pH se upraví na 6 2M roztokem octanu sodného a pro komplexaci přebytku '^^índia se přidá 10 μΐ 0,1M Na^EDTA = dvoj sodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové. Konečné čištění takto získaného konjugátu (lh) se provede pomocí HPLC (vylučovací chromatografie: TSK-400/MES-pufr). Frakce, obsahující značený konjugát se zředí běžným fyziologickým solným roztokem, pH se upraví na 7,2 0,01M roztokem hydroxidu sodného a filtrují. Takto získaný roztok pak představuje vhodný přípravek pro radiodiagnozu.

Příklad 22

a) Methylester N-(5-merkapto-3-thia-l-oxo-pent-l-yl)-glycinu

12,56 g (0,1 mol) hydrochloridu methylesteru glycinu, 13,42 g (0,1 mol) 2,5-dithia-cyklohexanonu a 10,12 g (0,1 mol) triethylaminu se rozpustí pod atmosférou argonu v 500 *» ml absolutního dichlormethanu. Míchá se 24 hodin při teplotě místnosti a vsádka se pak nalije do 250 ml 5% vodné kyseliny citrónové. Dobře se rozmíchá, organická fáze se oddělí a suší se nad síranem sodným. Po odpaření rozpouštědla ve vakuu se olejový zbytek chromatografuje na silikagelu (mobilní rozpouštědlo: dichlormethan/-methanol, methanol 0 až 10 %) .

Výtěžek: 18,9 g (84,6 %), bezbarvý olej

Elementární analýza:

vypočteno: 37,65 % C, 5,87 % H, 6,27 % N, 21,49 % 0,

28,71 % S nalezeno: 37,43 % C, 6,02 % H, 6,12 % N,

28,48 % S.

b) Methylester N-[5-(trifenyImethylmerkapto)-3-thia-l-oxopent-l-yl]-glycinu

11,17 g (50 mmol) methylesteru N-(5-merkapto-3thia-l-oxo-pent-l-yl)-glycinu (příklad 22a), 13,94 g (50 mmol) trifenylmethylchloridu a 5,06 g (50 mmol) triethylaminu se rozpustí pod atmosférou argonu v 500 ml absolutního dichlormethanu. 16 hodin se míchá při teplotě místnosti a vsádka se pak nalije do 150 ml 5% kyseliny citrónové. Dobře se promíchá, organická fáze se oddělí a suší nad síranem sodným. Po odpaření rozpouštědla ve vakuu se olejový zbytek rechromatografuje na silikagelu (mobilní rozpouštědlo: dichlormethan/methanol, 95:5).

Výtěžek: 15,7 g (67,4 %), bezbarvý olej

Elementární analýza:

vypočteno:	67,07 13,77	% C, % s	5,85 % H,	3,01 %	N,
nalezeno:	67,01	% c,	6,11 % H,	2,93 %	N,
	13,49	% s.

c) Ν- [ 5-(trifenyImethylmerkapto)-3-thia-l-oxo-pent1-yl] -glycin-N’ - (6-hydroxyhexyl) -amid

11,64 g (25 mmol) methylesteru N-[5-(trifenylmethylmerkapto)-3-thia-l-oxo-pent-l-yl]-glycinu (příklad 22b) a 29,3 g (250 mmol) 6-aminohexanolu se taví společně pod atmosférou argonu 16 hodin při 100 °C. Po ochlazení reakční lázně se vyjme do 500 ml dichlormethanu a nalije se do 250 ml 5% vodné kyseliny citrónové. Za chlazení ledem a míchání se pH upraví na 6,5 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Organická fáze se oddělí a suší nad síranem sodným. Po odpaření rozpouštědla ve vakuu se olejovitý zbytek chromatografuje na silikagelu (mobilní rozpouštědlo: dichlormethan/methanol, 0 až 10 % methanolu) .

Výtěžek: 7,7 g (56,0 %), bezbarvý olej

Elementární analýza:

vypočteno:	67,60 %	c, s	6,96	%	H,	5,09	%	N,
11,64	%
nalezeno:	67,48	%	c,	7,03	%	H,	4,92	%	N,
	11,43	%	s.

d) Amid kyseliny N-diisopropyl-O-kyanoethyl-O’[7,10-diaza-8,ll-dioxo-13-thia-15-(trifenyImethy1merkapto)-pentadec-l-yl]-fosforité

5,51 g (10 mmol) amidu N-[5-(trifenyImethylmerkapto) 3-thia-l-oxo-pent-l-yl]-glycin-N’-(6-hydroxyhexyl)-amidu (příklad 22c) se rozpustí v 50 ml absolutního dichlormethanu a 50 ml absolutního pyridinu. Ke směsi se při teplotě místnosti přikape 4,73 g (20 mmol) chloridu kyseliny diisopropylamino-O-kyanoethyl-fosforité, rozpuštěného v 50 ml absolutního dichlormethanu. Po 4 hodinách se nalije do

250 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, míchá se a organická fáze se suší nad síranem horečnatým. Po odpaření rozpouštědla se olej ovitý zbytek chromatografuje na silikagelu (dichlormethan/methanol/triethylamin 98:1:1).

Výtěžek: 4,32 g (57,5 %) ,

Elementární analýza:
vypočteno:	63,97	%	c,	7,38
	4,12	%	P,	8,54
nalezeno:	63,81	%	c,	7,41
	3,97	%	P,	8,31

bezbarvý olej % H, 7,46 % N, 8,52 % O, % S % H, 7,22 % N, % S.

e) 5’-[ester N-(3’-Aza-8’-merkapto-l’-4’-dioxo~6’-thia-okt-l ’ yl)-6-amiohexyl-fosforečné kyseliny] ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*_T*_T*_T*_T*_₃’

30mer-oligonukleotid 5 ' -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3 ’ , identifikovaný procesem SELEX, s modifikací na sekvenci T*t*t*T*T*-3 ’ umístěné proti směru, se vyrobí za pomoci automatického syntetizátoru Pharmacia company (viz Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, vyd.

F.Eckstein, Oxford University Press, Oxford, New York,

Tokyo, 1991), a oligonukleotid ve chráněné formě je ještě přítomen na sloupci pevného nosiče. Zatížení sloupce je asi 15 mg 35mer-oligonukleotidu. Po odštěpení 5’-DMT-chránící skupiny, se kopuluje podle standardních metod s fosforamiditem popsaným pod příkladem 22d. Po oxidací jodem v tetrahydrofuranu se konjugát odštěpí od nosiče. Pro tento účel se materiál smísí s 10 ml 30% roztoku amoniaku a třepe se přes noc při 55 °C. Ochladí se na 0 °C, odstředí, nosič se promyje 10 ml vody a spojené organické fáze se podrobí sušení vymraženim. Pro čištění se materiál vyjme do 5 ml vody, přidají se 4 ml 0,Smol octanu amonného a smísí se se 20 ml ethanolu. Pro úplné vysrážení se chladí přes noc (-20 °C), odstředí, zbytek se promyje 1 ml ethanolu (-20 °C) a suší se ve vakuu. Získá se 9,5 mg bílého prášku. Pro odštěpení S-tritylové chránící skupiny se materiál vyjme do 5 ml roztoku triěthylamoniumacetátu (pH =7) a inkubuje se s 500 μΐ 0 , ÍM roztoku dusičnanu stříbrného 30 minut. Potom se přidá 500 μΐ roztoku dithiothreitolu a inkubuje se dalších 30 minut. Po odstředění se čirý supernatant odsolí na Sephadexu G 10. Frakce, obsahující produkt se suší vymažením. Získá se 3,5 mg bílého prášku.

f) Tc-99m komplex 5’-[ester N-(3’-aza-8’-merkapto-1’-4’dioxo-6’-thia-okt-1’-yl)-6-aminohexyl-fosforečné kyseliny] a 5 ’ - CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAG CUACAUAT *_T*_T*_T*_T*_₃>

mg konjugátu popsaného pod příkladem 22e( se rozpustí v 1 ml 0,lm pufru hydrogenfosforečnanu dvoj sodného (pH = 8,5). po přídavku 10 mg vínanu dvojsodného se smísí s roztokem pertechnetátu sodného (1 mCi) a pak s 10 μΐ roztoku chloridu cínatého (5 mg/ml Ο,ΟΙΜ HC1). Výtěžek značení (asi 95 %) se stanoví pomocí HPLC.

Příklad 23

a) 5’-[Ester N- (6’-aza-7’-hydroxykarboxy-9’-merkapto-1’,5’dioxo-3’-thia-non-1’-yl)-6-aminohexyl-fosforečné kyseliny] ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*_T*_T*_T*_T*_₃’

Nejprve se vyrobí roztok N-hydroxysukcinimidesteru monoamidu kyseliny N-(2-oxo-tetrahydrothiofen-3-yl)thio-diglykolové (DE 4311023) v 500 μΐ absolutního DMF. Pro tento účel se rozpustí 24,9 mg (0,1 mmol) monoamidu kyseliny N-(2-oxo-tetrahydrothiofen-3-yl)thiodiglykolové a 11,5 mg (0,1 mmol) N-hydroxysukcinimidu v 500 μΐ absolutního DMF.

Při 0 °C se ke vsádce přidá 19,2 mg (0,1 mmol) EDC. Míchá se 30 minut při 0 °C.

mg 5(esteru 6-aminohexyl-fosforečné kyseliny) a 5 ’-GUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3 ’ vyrobeného podle příkladu 1 se rozpustí v 1 ml pufru hydrogenuhličitan sodný/uhličitan sodný (pH = 8,0). Přidá se předem připravený DMF roztok NHS esteru a inkubuje se 16 hodin při teplotě místnosti pod atmosférou argonu. Potom se odstředí, zahustí se na objem 500 μΐ a chromatografuje se na Sephadexu G-25.

Po sušení vymražením se získají 2 mg konjugátu jako bílého prášku.

b) Tc-99m komplex 5’-[esteru N-(6’-aza-7’-hydroxykarboxy-9’merkapto-l’,5’-dioxo-3’-thia-non-1’-yl)-6-aminohexylfosforečné kyseliny] a 5 ’ - CUC AUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT *_T*_T*_T*_T*_₃>

mg konj ugátu popsaného pod příkladem 23a) se rozpustí v 1 ml 0, IM pufru hydrogenfosforečnanu dvoj sodného. Po přídavku 10 mg vínanu dvoj sodného se smísí s roztokem pertechnetátu sodného (1 mCi) a pak s 10 μΐ roztoku chloridu cínatého (5 mg/1 ml 0,01M HC1). Výtěžek značení se stanoví pomocí HPLC (asi 92 %).

Příklad 24

a) 5’-[Ester N-(merkaptoacetyl)-6-aminohexyl-fosforečné kyseliny] a 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*- 3 ’ mg 5(esteru 6-aminohexyl-fosforečné kyseliny) a 5 ’ - CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT *_τ*_ψ*_τ*_τ*_₃’ vyrobeného podle příkladu 1 se rozpustí v 1 ml pufru hydrogenuhličitan sodný/uhličitan sodný (pH = 8,0). Potom se ke vsázce přidá 23,1 mg (0,1 mmol) NHS-esteru kyseliny

S-acetylmerkaptooctové, rozpuštěné v 500 μΐ absolutního DMF a inkubuje se 17 hodin při teplotě místnosti pod atmosférou argonu. Potom se odstředí, zahustí se na objem 500 μΐ a chromatografuje se na Sephadexu G-25. Po sušení vymražením se získají 3 mg konjugátu jako bílého prášku.

b) Tc-99m komplex 5’-[esteru N-(merkaptoacetyl)-6-aminohexylfosforeěné kyseliny] a 5 ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT * T * T * T * T * -3’ mg konjugátu popsaného pod příkladem 24a) se rozpustí v 1 ml 0,ÍM pufru hydrogenfosforečnanu dvoj sodného (pH 8,5). Po přídavku 10 mg vínanu dvojsodného se smísí s roztokem pertechnetátu sodného (1 mCi) a pak s 10 μΐ roztoku chloridu cínatého (5 mg/1 ml 0,01M HCI). Výtěžek značení se stanoví pomocí HPLC (asi 97 %).

Příklad 25

a) Monoamid kyseliny N-[2-(trifenyImethylmerkapto)-eth-l-yl]thiodiglykolové

31,9 g (0,1 mol) 2-(trifenyImethylmerkapto)ethylaminu a 10,1 g (0,1 mol) triethylaminu se zavede do 500 ml absolutního diehiórmethanu. Při 0 °C se přikape roztok 13,2 g (0,1 mol) anhydridu kyseliny thiodiglykolové, míchá se 1 hodinu při 0 °C a 16 hodin při tplotě místnosti. Potom se nalije do 250 ml 5% vodné kyseliny citrónové, dobře se míchá, organická fáze se oddělí a suší se nad síranem sodným. Po odpařeni rozpouštědla ve vakuu se zbytek chromatografuje na silikagelu (mobilní rozpouštědlo: dichlormethan/methanol, 0 až 20 % methanolu). Výtěžek: 20,32 g (45,0 %) , bezbarvý olej Elementární analýza:

vypočteno:	66,49 % C,	5,58	%	H,	3,10 % N,
14,20	% S
nalezeno:	66,21	% C,	5,73	%	H,	2,98 % N,
	14,02	% S.

b) 5’-[Ester N-(1’,5’-dioxo-6’-aza-3’-thia-8’-merkaptookt- 1-yl)-aminohexyl-fosforečné kyseliny] a 5 ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3’

Nejprve se vyrobí roztok NHS-esteru monoamidu kyseliny N- [2-(trifenylmethylmerkapto)-eth-l-yl]-thiodiglykolové (příklad 25a). Pro tento účel se rozpustí 45,2 mg (0,1 mmol) výše uvedené kyseliny v 500 μΐ absolutního DMF (0,1 mmol) a smísí se s 11,5 mg (0,1 mmol) NHS. Po ochlazení na 0 °C se přidá 19,2 mg (0,1 mmol) EDC a inkubuje se 30 minut při 0 *C.

Roztok 10 mg 5’-(esteru 6-aminohexyl-fosforečné kyseliny) a 5 ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T* - 3 ’ popsaný podle příkladu 1 v 1 ml pufru hydrogenuhličitan sodný/uhličitan sodný (pH = 8,0) smísí s předem připraveným roztokem NHS esteru. Inkubuje se 16 hodin při teplotě místnosti. Potom zahustí odpařením na objem 500 μΐ a chromatografuje se na Sephadexu G-25. Po sušení vymražením se získá se 6 mg S-trityl-chráněné sloučeniny. Odštěpení S-trityl-chránící skupiny, izolace oligonukleotidu, nesoucího SH skupiny a čištění se provede jak je popsáno v příkladu 22e. Zíakají se 4 mg bílého lyofilizátu.

c) Tc-99m komplex 5[esteru Ν-(1’,5’-dioxo-6’-aza-3’-thia8 ’ -merkapto-okt-l-yl) -aminohexyl-fosforečné kyseliny] a 5 ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAG-CUACAUAT*_ψ*_ψ*_τ*_ψ*_₃>

mg konjugátu popsaného pod příkladem 25b se rozpustí v 1 ml 0 , IM pufru hydrogenfosforečnanu dvoj sodného. Po přídavku 10 mg vínanu dvoj sodného se smísí s roztokem pertechnetátu sodného (1 mCi) a pak s 10 μΐ roztoku chloridu cínatého (5 mg/1 ml 0,01M HCl). Výtěžek značení se stanoví pomocí HPLC (asi 91 %).

Příklad 26

a) Methylester kyseliny N,N’-bis-[2-(trifenyImethy1merkapto) -1-oxo-eth-l-yl] -3,4-diaminobenzoové.

3,32 g (20 mmol) methylesteru kyseliny 3,4-diaminobenzoové a 13,38 g (40 mmol) kyseliny S-trif eny Imethy l-merkaptooctové se rozpustí ve 200 ml absolutního dichlormethanu. Při 0 °C se ke vsádce přikape 8,25 g (40 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu rozpuštěného ve 100 ml absolutního dichlormethanu. Míchá se další 1 hodinu při 0 °C a nakonec 16 dalších hodin při teplotě místnosti. Odfiltruje se, vytřepe opět 1% vodnou kyselinou citrónovou, organická fáze se suší nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Zbytek se chromatografuje na silikagelu (mobilní rozpouštědlo: dičhlormethan/methanol, 0-10 % methanolu).

Výtěžek: 10,2 g (63,8 %), bezbarvý olej

Elementární analýza:

vypočteno: 75,16 % C, 5,30 % H, 3,51 % N, 8,01 % 0,

8,02 % S nalezeno: 75,01 % C, 5,58 % H, 3,30 % N,

7,89 % S.

b) Kyselina N,N’-bis-[2-(trifenylmethylmerkapto)-1-oxoeth-l-yl]-3,4-diaminobenzoová.

7,99 g (10 mmol) methyiesteru kyseliny N,N’ - bis-[2-trifenylmethylmerkapto)-l-oxo-eth-l-yl[3,4-diaminobenzoové (příklad 26a) se smísí ve 200 ml dioxanu, 20 ml vody a 20 ml methanolu se 4 g (100 mmol) hydroxidu sodného. Míchá se 5 hodin při teplotě místnosti a vsázka se nalije do 300 ml 5% vodné kyseliny citrónové. Intenzivně se extrahuje dichlormethanem, organická fáze se suší síranem sodným. Po odpaření rozpouštědla se zbytek chromatografuje na silikagelu (mobilní rozpouštědlo: dichlormethan/methanol, methanol 0-40 %) .

Výtěžek: 3,56 g (45,4 %), bezbarvý olej

Elementární analýza:

vypočteno: 74,97 % C, 5,14 % H, 3,57 % N, 8,15 % 0,

8,17 % S nalezeno: 74,71 % C, 5,32 % H, 3,31 % N, 7,88 % S.

c) 5'-{Esteru N-[3’,4’-bis-(2-merkaptoacetylamino)benzoyl]-6-aminohexylfosforečné kyseliny} a ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*_T*_T*_T*_T*_₃’

Nejprve se připraví NHS-ester kyseliny N,N’-bis-[2-)trifenylmethylmerkapto)-l-oxo-eth-l-yl]-3,4dlaminobenzoové kyseliny (příklad 26b). Pro tento účel se

78,5 mg (0,1 mmol) kyseliny rozpustí v 500 μΐ absolutního DMF a smísí se s 11,5 mg (0,1 mmol) NHS. Po ochlazení na 0 °C se přidá 19,2 mg (0,1 mmol) EDC a inkubuje se 30 minut při 0 °C. Roztok 10 mg 5(esteru 6-aminohexyl-fosforečné kyseliny) 5’-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3 ’ v 1 ml pufru hydrogenuhličitan sodný/uhličitan sodný (pH = 8,0), popsaný v příkladu 1, se smísí s 500 μΐ roztoku NHS-esteru popsaného výše. Inkubuje se 17 hodin při teplotě místnosti. Potom se zahustí odpařením na 500 μΐ a chromatografuje se na SEphadexu G-25. Získá se 7 mg S-trityl-chráněné sloučeniny.

Odštěpení S-trityl-chránící skupiny, izolace oligonukleotidů nesoucího SH skupiny a čištění se provádí jak je popsáno v příkladu 22e. Získají se 3 mg bílého lyofilízátu.

d) Tc-99m komplex 5’-{esteru N-[3’ ,4’-bis-(2-merkaptoacetylamino)-benzoyl]-6-aminohexylfosforečné kyseliny} a 5 ’ - CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT *_T*_T*_T*_T*_₃’ mg konjugátu popsaného v příkladu 26c) se rozpustí v 1 ml 0,lM pufru dvoj sodného hydrogenfosforečnanu (pH = 9,5). Po přídavku 10 mg vínanu dvoj sodného, se smísí s roztokem pertechnetátu sodného (1 mCi) a pak s 10 μΐ roztoku chloridu cínatého (5 mg/1 ml 0,01M HCI). Výtěžek značení (asi 91 %) byl stanoven pomocí HPLC.

Příklad 27

a) terč.Butylester kyseliny N-[O-acetyl-hydroxyacetyl]glycyl-glycinu.

24,5 g (0,1 mol) terč.butylesteru glycylglycyl-glycinu a 11,8 g (0,1 mol) kyseliny O-acetyl-glykolové se společně přidají při 0 °C do 500 ml absolutního dimethylformamidu. Do vsádky se přikape roztok

20,6 g (0,1 mol) dicyklohexylkarbodiimidu v 500 ml absolutního dimethylformamidu, 1 hodinu se míchá při 0 °C a nakonec při teplotě místnosti přes noc. Odfiltruje se a filtrát se zahustí odpařením na olejové pumpě. Opakovaně se krystaluje z ethylacetátu/n-pentanu.

Výtěžek: 12,5 g (36,2 %), bílý prášek

Elementární analýza:

vypočteno: 48,69 % C, 6,71 % H, 12,17 % N, 32,43 % O nalezeno: 48,43 % C, 7,01 % H, 11,93 % N

b) N-[O-Acetyl-hydroxyacetyl]-glycyl-glycyl-glycin

3,45 g (10 mmol) terč.butylesteru N-[0-acetylhydroxyacetyl]-glycyl-glycyl-glycinu se míchá v 50 ml kyseliny trifluoroctové 15 minut. Potom se nalije do 500 ml absolutního diethyletheru a produkt se odfltruje. Rekrystaluje se opakovaně z ethylacetátu/n-pentanu.

Výtěžek: 1,23 g (42,5 %), bílý prášek

Elementární analýza:

vypočteno: 41,53 % C, 5,23 % H, 14,53 % N, 38,72 % 0 nalezeno: 41,31 % C, 5,51 % H, 14,32 % N

c) 5-{Ester N-[Ν’ -(hydroxyacetyl]-glycyl-glycyl-glycyl]-6aminohexylfosforečné kyseliny} a ’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3 ’

Nejprve se vyrobí NHS-ester N-(O-acetylhydroxyacetyl)-glycyl-glycyl-glycinu (příklad 27b). Pro tento účel se 28,9 mg (0,1 mmol) kyseliny rozpustí v 500 μΐ absolutního DMF a smísí s 11,5 mg (0,1 mmol) NHS. Po ochlazení na 0 °C se přidá 19,2 mg (0,1 mmol) EDC a inkubuje se 30 minut při 0 °C. Roztok 10 mg (esteru 6-aminohexyl-fosforečné kyseliny) a 5’ -CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3 ’ v 1 ml 1M roztoku uhličitanu sodného, popsaného v příkladu 1, se smísí s 500 μ’1 NHS-esterového roztoku připraveného dříve. Inkubuje se 18 hodin při teplotě místnosti. Potom se zahustí odpařením na 500 μΐ a chromatografuje se na Sephadexu G-25. Po sušení vymražením se získají 3 mg titulní sloučeniny.

d) Tc-99m komplex 5-{ester N-[N’-(hydroxyacetyl]-glycylglycyl-glycyl]-6-aminohexylfosforečné kyseliny} a 5 ’ - CUC AUGGAGCGC AAGACGAAUAGCUACAUAT *_T*_T*_T*_T*_₃’ mg konjugátu popsaného v příkladu 27c se rozpustí v 1 ml 0,ÍM pufru hydrogenfosforečnanu dvoj sodného (pH = 10,5). Po přídavku vínanu dvojsodného se smísí s roztokem pertechnetátu sodného (1 mCi) a pak s 10 μΐ roztoku chloridu cínatého (5 mg/1 ml 0,01M HC1). Výtěžek značení se stanoví pomocí HPLC (95 %).

Předcházej ící příklady mohou být opakovány s podobným výsledkem za nahrazení genericky nebo specificky popsaných reaktantů a/nebo pracovních podmínek tohoto vynálezu za ty, které byly použity v předcházejících příkladech.

Z předcházejícího popisu může odborník v oboru snadno seznat podstatné charakteristiky tohoto vynálezu a aniž by porušil jeho myšlenku a rozsah, může provést různé změny a modifikace vynálezu pro upravení jeho různé využití a podmínky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

9 9999 99 9

9 9 9 9

1. Oligonukleotidové konjugáty, obsahující oligonukleotidový radikál N a n substituenty (B-K), kde B znamená přímou vazbu nebo spojovací složku k oligonukleotidovému radikálu a K znamená komplexační činidlo nebo komplex radioaktivních kovových izotopů, nebo stabilních izotopů, které

- jsou převedeny na radioaktivní izotopy vnější ozařováním,

- převádějí radiaci z vnějšku na radiaci jiné kvality, jiného energetického obsahu a/nebo jiné vlnové délky, prvků atomových čísel 5, 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 nebo 85, kde oligonukleotidový radikál N vykazuje modifikaci, která brání nebo alespoň významně inhibuje degradaci přirozeně se vyskytuj ícími nukleasami.
2. Sloučenina podle nároku 1, která má obecný vzorec I

N-(B-K)_n (I) kde N je oligonukleotid, který se váže specificky s vysokou vazebnou afinitou k jiným cílovým strukturám a vykazuje modifikace, které významně redukuji degradaci přirozeně se vyskytuj ícími nukleasami,

B je chemická vazba nebo spojovací složka, která poskytuje spojeni mezi N a K a

K je komplexační ligand, který může vykazovat signál-transmitující nebo terapeuticky aktivní prvek a n je číslo mezi 1 a 10.
3. Sloučenina podle nároku 1 nebo 2, ve které N je oligonukleotid s 5 až 200 nukleotidy, kde • · · · · · ··· · · ·· • ··«·· · · · * · » »·· · » • · · ···» ·«·

a) 2’-poloha cukrové jednotky, nezávisle na jakékoliv jiné, je obsazena následujícími skupinami:

skupina OR, kde

R znamená alkylový radikál s 1 až 20 atomy uhlíku, který popřípadě obsahuje až 2 hydroxylové skupiny a který je popřípadě přerušen 1 až 5 atomy kyslíku, atom vodíku, hydroxylová skupina, atom fluoru, aminový radikál, aminoskupina, hydroxylové skupiny přítomné v terminálních polohách 3’ a 5’, nezávisle na jiných, jsou popřípadě etherifikovány radikálem R a/nebo

b) fosfodiestery, popřípadě použité jako internukleotidová vazba, nezávisle na jiných, jsou nahrazeny fosforothioáty, fosforodithioáty nebo alkylfosfonáty, výhodně methylfosfonátem a/nebo

c) koncové radikály ve 3’- a 5’-polohách jsou spojeny intramolekulárnim způsobem vzájemně internukleotidovou vazbou jak je popsáno v b) a/nebo

d) obsahuje internukleotidovou vazbu jak je popsána v b), která spojuje 3’-3’- nebo 5'-5’-polohy a/nebo

e) obsahuje fosforodiesterovou vazbu jak je popsána v b), která spojuje, podobně jako ester, dva thymidiny C2-C2ohydroxyalkylovým radikálem v poloze 3 nebo spojuje analogicky substituovaný thymidinový radikál, podobně jako ester, s hydroxylovou skupinou jiného cukru ve 2’- nebo 3’nebo 5’-poloze a/nebo

f) terminální radikály v polohách 3’ a 5’ obsahují internukleotidové vazby modifikované jak je popsáno v b).

·· · ♦· ·♦ «· ·· ··· *·· ··«« • ··· « · ··· · · ·· • ····· * * · · · * ···· · ··· ···♦ ·*« ·· · ·· ·· ·· »·
4. Sloučenina podle nároku 3, kde oligonukleotid N obsahuje 15 až 100 nukleotidů.
5. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 4, kde N je oligonukleotid, který se specificky váže s vysokou vazebnou afinitou k jiným cílovým strukturám a který může být získán tak, že se směs oligonukleotidů, obsahujících náhodné sekvence uvede do styku s cílovou strukturou a určité oligonukleotidy vykazují zvýšenou afinitu k cílovým strukturám vzhledem ke směsi oligonukleotidů, posledně uvedené se oddělí od zbývající oligonukleotidové směsi, potom se oligonukleotidy se zvýšenou afinitou k cílové struktuře amplifikují za získání směsi oligonukleotidů, která vykazuje zvýšený pódii oligonukleotidů, které se vážou k cílovým strukturám.
6. Sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde N je oligonukleotid, který se specificky váže s vysokou vazebnou afinitou k jiným cílovým strukturám a který může být získán tak, že

a) se nej prve vyrobí DNA řetězec chemickou syntézou tak, že na 3’-konci tento DNA řetězec vykazuje definovanou sekvenci která je komplementární k promotoru pro RNA-polymerasu a současně komplementární k primeru polymerasové řetězové reakce (PCR) a že tak tento DNA řetězec vykazuje definovanou sekvenci na 5’-konci, která je komplementární k primerové sekvenci pro polymerasovou řetězovou reakci a sekvence mezi definovanými sekvencemi obsahuje náhodnou sekvenci a že

b) tento DNA řetězec je transkribován do komplementárního RNA řetězce za pomoci RNA-polymerasy a nukleotidy jsou poskynuty polymerase, které jsou modifikovány ve 2’-poloze ribozové jednotky a že

c) RNA oligonukleotidy, produkované tímto způsobem, jsou

100 • · · 9

9 9 9 9 9

9 9 9999 9 9

9 9 9 9

99 9 uvedeny do styku s cílovou strukturou, na kterou se oligonukleotid specificky váže a že

d) tyto oligonukleotidy, které se navázaly na cílovou strukturu jsou odděleny nejprve spolu s cílovou strukturou od nenavázaných oligonukleotidů a pak jsou navázané oligonukleotidy opět odděleny od cílové struktury a že

e) tyto cílově strukturně specifické RNA oligonukleotidy jsou transkribovány za pomoci reverzní transkriptásy do komplementárního DNA žetězce a že

f) tyto DNA řetězce jsou amplifikovány s polymerasovou řetězovou reakcí za použití definovaných příměrových sekvencí a že

g) DNA oligonukleotidy aplifikované tímto způsobem jsou pak transkribovány opět za pomoci RNA-polymerasy a s modifikovanými nukleotidy do RNA-oligonukleotidů a že

h) výše uvedené selekční stupně c) až g) se popřípadě opakují tolikrát, až jsou dostatečně vybrány oligonukleotidy, které se vyznačuji vysokou vazebnou afinitou k cílové struktuře a pak jsou sekvence takto získaných oligonukleotidů popřípadě schopny být stanoveny.
7. Sloučenina podle nároku 6, kde je cílová struktura vybrána z makromolekul, tkáňových striktur vyšších organismů jako jsou zvířata nebo lidé, orgánů nebo částí orgánů zvířat nebo lidí, buněk, nádorových buněk nebo nádorů.
8. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 7, kde spojovací složka(y) B je (jsou) navázána(y)

a) ke 4’-konci oligonukleotidového radikálu N redukovaného ve 4’-poloze CH2-OH skupinou a/nebo

b) ke 3’-konci oligonukleotidového radikálu N redukovaného ve 3’-poloze atomem vodíku a/nebo

c) k fosfodiesterovému můstku(ům), redukovanému OH

101 • · ·· · • · · • · · · • · · · · · φ · · φφ ·· φ* φφ • · φφφφ • φφφ · φφφ • · φ φ φφφφ φ • Φ · · Φ · • · · Φ · · φ Φ skupinou(amin), mezikaždými dvěma nukleotidy a/nebo

d) k 1 až 10 nukleobázím,které jsou redukovány atomem vodíku v 5-, 8-poloze(polohách) a/nebo amlnoskupině(nám) v poloze(polohách) 2-, 4- a 6-.
9. Sloučenina podle nároku 8a), kde B má obecný vzorec X-Y-Z^, který je spojen na X straně s komplexačním činidlem nebo komplexem a na Z straně s oligonukleotidem, ve kterém X znamená přímou vazbu, -NH nebo -S skupinu,

Y znamená přímý, rozvětvený, nasycený nebo nenasycený C1-C20 alkylenový řetězec, který popřípadě obsahuje 1-2 cyklohexyleny, 1-5 Imino, 1-3 fenyleny, 1-3 fenylenimino,

1-3 fenylenoxy, 1-3 hydroxyfenyleny, 1-5 amido, 1-2 hydrazido, 1-5 karbonyl, 1-5 ethylenoxy, ureido, thioureido, 1-2 karboxyalkylimlno, 1-2 esterové skupiny, 1-3 skupiny Ar, ve kterých Ar představuje nasycený nebo nenasycený 5- nebo 6-členný kruh, který popřípadě obsahuje 1 až 2 heteroatomy vybrané z dusíku, kyslíku a siry a/nebo 1-2 karbonylové skupiny; 1-10 kyslíkových, 1-5 dusíkových a/nebo 1-5 sírových atomů a/nebo je popřípadě substituován 1-5 hydroxy, 1-2 merkapto, 1-5 oxo, 1-5 thioxo, 1-3 karboxy, 1-5 karboxy-C-^-C^alkyl, 1-5 ester, 1-3 amino, 1-3 hydroxy-C-^-C^ alkyl, 1-3 C^-Cy alkoxyskupinami a

Z¹ znamená -CONH-CH2-4’, -NH-CO-4’, -0-P(0)R¹-NH-CH2-4’, -O-P(O)R¹-NH-CH₂-4’, -O-P(S)R¹-O-3’ nebo -O-P(O)R’-0-3’, kde 4’ nebo 3’ znamená spojení k terminální cukrové jednotce (jednotkám) a znamená 0, S“, C-^-C^alkyl nebo NR^R^ skupinu, kde R^ a R^ znamená vodík a C-^-C^alkylové radikály.
10. Sloučenina podle nároku 8c), kde B má obecný vzorec X-Y-Z^, který je spojen na X straně s komplexačním činidlem nebo komplexem a na Z straně s oligonukleotidem, • ·

102 • · ···· • · · 9 9 9 9 • · ··· · 9 99 • 9 9 9 9 99 9 9 · • · · · 9 9 9

9999 99 99 kde

Z² v můstkovém spojení dvou sousedících cukrových jednotek

0 S

Z² - P - 0-5’ a/nebo Z²- P - O - 5’

I I o o

I I

3’ 3’

O představuje skupinu -NR-, -0- nebo-S-,

X je přímá vazba, -NH nebo -S skupina,

Y znamená přímý, rozvětvený, nasycený nebo nenasycený C-£-C2q alkylenový řetězec, který popřípadě obsahuje 1-2 cyklohexyleny, 1-5 imino, 1-3 fenyleny, 1-3 fenylenimino,

1-3 fenylenoxy, 1-3 hydroxyfenyleny, 1-5 amido, 1-2 hydrazido, 1-5 karbonyl, 1-5 ethylenoxy, ureido, thioureido, 1-2 karboxyalkylimino, 1-2 esterové skupiny, 1-3 skupiny Ar, ve kterých Ar představuje nasycený nebo nenasycený 5- nebo 6-členný kruh, který popřípadě obsahuje 1 až 2 heteroatomy vybrané z dusíku, kyslíku a síry a/nebo 1-2 karbonylové skupiny; 1-10 kyslíkových, 1-5 dusíkových a/nebo 1-5 sirových atomů a/nebo je popřípadě substituován 1-5 hydroxy, 1-2 merkapto, 1-5 oxo, 1-5 thioxo, 1-3 karboxy, 1-5 karboxy-C^-C^alkyl, 1-5 ester, 1-3 amino, 1-3 hydroxy-C-_L-C₄alkyl, 1-3 C^-Cy alkoxyskupinami a

R² znamená vodík a C-^-C^alkylové radikály.
11. Sloučenina podle nároku 8d), kde B má obecný o o vzorec X-Y-Z , kde Z představuje -NH skupinu nebo přímou vazbu k nukleobázi,

X je přímá vazba, -NH nebo -S skupina a • · # • · «

103

9 9 9

9 9999 ·

Y znamená přímý, rozvětvený, nasycený nebo nenasycený C-£-C2o alkylenový řetězec, který popřípadě obsahuje 1-2 cyklohexylény, 1-5 imino, 1-3 fenyleny, 1-3 fenylenimino,

1-3 fenylenoxy, 1-3 hydroxyfenyleny, 1-5 amido, 1-2 hydrazido, 1-5 karbonyl, 1-5 ethylenoxy, ureido, thioureido, 1-2 karboxyalkylimino, 1-2 esterové skupiny, 1-3 skupiny Ar, ve kterých Ar představuje nasycený nebo nenasycený 5- nebo 6-členný kruh, který popřípadě obsahuje 1 až 2 heteroatomy vybrané z dusíku, kyslíku a síry a/nebo 1-2 karbonylové skupiny; 1-10 kyslíkových, 1-5 dusíkových a/nebo 1-5 sírových atomů a/nebo je popřípadě substituován 1-5 hydroxy, 1-2 merkapto, 1-5 oxo, 1-5 thioxo, 1-3 karboxy, 1-5 karboxy-C-^-C4alkyl, 1-5 ester, 1-3 amino, 1-3 hydroxy-C-^-C^ alkyl, 1-3 alkoxyskupinami a
12. Sloučeniny podle některého z předcházejících nároků, kde kovový komplex, jako zobrazovací činidlo, obsahuje radioaktivní izotop, vybraný z prvků měď, vismut, technecium, rhenium nebo indium.
13. Sloučenina podle nároků 1 až 12 pro přípravu prostředku pro použití v radiodiagnoze a/nebo radioterapii.
14. Diagnostický kit pro in vivo a/nebo in vitro detekci cílových struktur, kde diagnostický kit obsahuje alespoň jednu sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12.
15. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde N je přirozeně se nevyskytuj lei oligonukleotidový ligand, mající specifickou vazebnou afinitu pro cílovou molekulu, kde taková cílová molekula je trojrozměrná chemická struktura jiná než polynukleotid, který se váže k uvedenému • ♦ » • · · · ·« *· * · · · • · ·· ·»· · · > · β • e ·· r

104 oligonukleotidovému ligandu mechanismem, který převážně závisí na Vatson/Crickově párování bází nebo vazbě trojné šroubovice, kde uvedený oligonukleotidový ligand není nukleová kyselina, mající známou fyziologickou funkci navázanou k cílové molekule.