ES2220933T3

ES2220933T3 - Conjugados constituidos por complejos metalicos y oligonucleotidos.

Info

Publication number: ES2220933T3
Application number: ES95925792T
Authority: ES
Inventors: Ludger Dinkelborg; Christoph-Stephan Hilger; Ulrich Niedballa; Johannes Platzek; Bernd Raduchel; Ulrich Speck; Larry Gold; Wolfgang Pieken
Original assignee: Schering AG; Nexstar Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Bayer Pharma AG; Nexstar Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1995-06-30
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2015-06-30
Also published as: EP0777498A1; NO970141D0; SK2897A3; NO970141L; CN1152879A; MX9606443A; NZ289831A; IL114237A; RU2165771C2; IL114237A0; ATE265229T1; PT777498E; JPH10503182A; DE69532958D1; DK0777498T3; CZ11497A3; HU220859B1; CZ295930B6; SK284598B6; HU9700100D0

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A CONJUGADOS DE OLIGONUCLEOTIDOS MODIFICADOS QUIMICAMENTE QUE CONTIENEN UN AGENTE DE COMPLEJO O UN COMPLEJO QUE SE UNE POR UN ELEMENTO DE CONEXION A LOS OLIGONUCLEOTIDOS. EN ESTE CASO, LOS OLIGONUCLEOTIDOS SE MODIFICAN EN UNA FORMA QUE EVITA O AL MENOS INHIBE DE FORMA SIGNIFICATIVA LA DEGRADACION POR LAS NUCLEASAS QUE SE PRODUCEN NATURALMENTE. EL RADICAL OLIGONUCLEOTIDO PUEDE UNIRSE ESPECIFICAMENTE Y CON ALTA AFINIDAD DE ENLACE A ESTRUCTURAS DE DESTINO Y POR TANTO PUEDE PRODUCIR UN EFECTO DIAGNOSTICO O TERAPEUTICO ESPECIFICO MEDIANTE EL AGENTE DE COMPLEJO DE UNION O COMPLEJO DE UNION.

Description

Conjugados constituidos por complejos metálicos y oligonucleótidos.

Esta invención se refiere al objeto descrito en las reivindicaciones, es decir, conjugados oligonucleotídicos, que contienen un agente complejante o un complejo. Estos conjugados se utilizan en los campos de diagnóstico y tratamiento.

El diagnóstico por imagen ha alcanzado gran progreso en las últimas décadas, y está desarrollándose más continuamente. Actualmente es posible visualizar el sistema vascular, la mayoría de los órganos y muchos tejidos en el cuerpo vivo sin intervención de mayor importancia. Las enfermedades se diagnostican en muchos casos, debido a que conducen a cambios evidentes de forma, tamaño y posición de las estructuras anatómicas en el cuerpo. Tales datos anatómicos procedentes del interior del cuerpo pueden obtenerse por tecnología de rayos X, diagnóstico por ultrasonidos y tomografía de resonancia magnética. La eficiencia de cada una de las tecnologías mencionadas puede mejorarse por el uso de agentes farmacéuticos para mejora de los contrastes naturales de los tejidos y fluidos corporales en la imagen resultante. Los agentes farmacéuticos en cuestión se introducen en las cavidades del cuerpo o se inyectan en los vasos sanguíneos, con el propósito de cambiar el contraste de las cavidades o vasos. Adicionalmente, aquéllos se extienden por el torrente sanguíneo en el organismo y pueden cambiar la visibilidad de órganos y tejidos. En caos excepcionales, tales sustancias se fijan a ciertas estructuras en el cuerpo y/o son transportadas y/o excretadas activamente por el último. De este modo, pueden hacer visibles también funciones en casos individuales y utilizarse para diagnosticar enfermedades.

En contraste con ello, el diagnóstico nuclear está basado en sustancias que pueden hacerse visibles en sí mismas. En este caso, se introduce en el cuerpo isótopos radiactivos que emiten radiación de largo alcance. La extensión de estas sustancias en el organismo puede rastrearse por medio de detectores adecuados. La ventaja del proceso médico nuclear es la alta eficacia a dosis baja de las sustancias radiactivas transmisoras de las señales designadas como agentes radiofarmacéuticos.

Si se utilizan isótopos, que liberan radiación \alpha o \beta u otros productos tóxicos de descomposición eficaces en el tejido, pueden utilizarse también agentes radiofarmacéuticos para propósitos terapéuticos, v.g., para la destrucción de tumores. La misma finalidad puede conseguirse también, introduciendo en el cuerpo isótopos o sustancias no nocivos que se convierten solamente en el mismo mediante, v.g., radiación de neutrones o rayos X, ultrasonidos o radioondas, en una forma terapéuticamente eficaz.

Un problema general es el diagnóstico y la localización de cambios patológicos en un momento en el que no está disponible cambio alguno de forma, estructura y circulación de los órganos y tejidos en cuestión. Un diagnóstico y seguimiento de este tipo tiene importancia decisiva, v.g., en el caso de enfermedades tumorales, con inclusión de la búsqueda de metástasis, evaluación de un suministro deficiente de oxígeno a los tejidos, y en el caso de ciertas infecciones y enfermedades metabólicas.

Los métodos terapéuticos y de diagnóstico por imagen ahora disponibles dependen considerablemente de la disponibilidad de preparaciones farmacéuticas, que se acumulan en sitios de cambios patológicos indetectables por otros medios.

Los medios de contraste disponibles comercialmente en este momento son, muy predominantemente, las denominadas preparaciones inespecíficas. Las mismas se extienden pasivamente en los espacios en los que se introducen, v.g., por inyección.

En el pasado, se han identificado muchas sustancias y clases de sustancias que pueden detectarse o puede esperarse que tengan especificidad con respecto a su extensión en el organismo vivo. Ejemplos a este respecto son, además de los anticuerpos, lectinas, todos los tipos de sustancias fijadas a receptores, células, membranas y componentes de membrana, ácidos nucleicos, metabolitos naturales y sus derivados, así como incontables sustancias farmacéuticas. Se han estudiado y están estudiándose también péptidos con atención especial.

La patente U.S. No. 4.707.352 se refiere a un proceso especial para marcar moléculas formadoras de complejos con isótopos radiactivos, pero no se describe ningún agente complejante adecuado para la fijación de iones metálicos.

El documento EP-A-0 285 057 describe conjugados nucleótido-agente complejante, que no son adecuados, entre otras cosas, debido a la inestabilidad in vivo de los nucleótidos utilizados, para uso como agentes de diagnóstico o agentes terapéuticos in vivo y cumplen apenas también los otros requisitos de compatibilidad y farmacocinética.

Muchas patentes de los Estados Unidos, tales como, por ejemplo, la patente U.S. No. 4.707.440, se refieren a polímeros modificados, que contienen un grupo químico detectable. Los polímeros pueden ser polinucleótidos y oligonucleótidos, pero no están estabilizados contra la degradación por las nucleasas existentes naturalmente ni seleccionados por un proceso especial, de tal modo que se fijen específicamente con afinidad de fijación alta a estructuras diana. Realizaciones especiales de estas moléculas detectables se mencionan en las patentes U.S. No. 4.843.122 y 4.943.523. Un nucleótido individual, modificado de este modo, se reivindica en la patente U.S. No. 4.952.685. El uso de estos agentes en procesos de formación de imagen se describe en la patente U.S. No. 4.849.208.

El objeto de esta invención es la preparación de agentes de diagnóstico que se fijan específicamente para la detección de estructuras diana, por los cuales, por ejemplo, se hace posible la visualización de órganos, tejidos y sus cambios patológicos in vitro e in vivo.

Se ha encontrado ahora que este objeto es alcanzado por conjugados oligonucleotídicos que, además de un radical oligonucleotídico, exhiben un agente complejante, fijado por un enlace directo o un componente de conexión, y cuyo radical oligonucleotídico está modificado de tal modo que se previene la degradación por las nucleasas existentes naturalmente o se inhibe al menos significativamente.

El objeto de esta invención está constituido por:

Conjugados oligonucleotídicos constituidos por un radical oligonucleotídico N y n sustituyentes (B-K), en los cuales el compuesto exhibe la fórmula general (I)

(I)N-(B-K)_{n}

en la cual N es un oligonucleótido con 15 a 100 nucleótidos, que se fija específicamente con afinidad de fijación alta a otras estructuras diana y exhibe modificaciones que impiden o al menos reducen significativamente la degradación por las nucleasas existentes naturalmente,

B es un enlace químico o un componente de conexión al radical oligonucleotídico, que produce la conexión entre N y K, y K significa un agente complejante o complejo de isótopos de metales radiactivos, o isótopos estables, que

- se convierten en isótopos radiactivos por radiación procedente del exterior,

- convierten la radiación procedente del exterior en radiación de calidad diferente, contenido de energía diferente, y/o diferente longitud de onda, de los elementos de números atómicos 5, 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 u 85,

n es un número entre 1 y 10,

en los cuales

a) la posición 2' de la unidad azúcar, independientemente unas de otras, está ocupada por los grupos siguientes:

un grupo OR, en el cual

R es un radical alquilo con 1 a 20 átomos de carbono, que contiene opcionalmente hasta 2 grupos hidroxilo y que está interrumpido opcionalmente por 1-5 átomos de oxígeno,

un átomo de hidrógeno,

un grupo hidroxilo,

un átomo de flúor,

un radical amina,

un grupo amino,

y los grupos hidroxilo presentes en las posiciones terminales 3' y 5', independientemente unos de otros, están eterificados opcionalmente con el radical R y/o

b) los fosfodiésteres, que se utilizan opcionalmente como el enlace internucleotídico, independientemente unos de otros, están reemplazados por fosforotioatos, fosforoditioatos o alquilfosfonatos, preferiblemente metil-fosfonato, y/o

c) los radicales terminales en las posiciones 3' y 5' están enlazados de una manera intramolecular unos con otros por un enlace internucleotídico como se describe en b) y/o

d) contiene un enlace internucleotídico como se describe en b), que enlaza las posiciones 3'-3' o 5'-5', y/o

e) contiene un enlace fosfodiéster como se describe en b), que conecta, de modo análogo a un éster, dos timidinas por un radical hidroxialquilo C_{2}-C_{10} respectivamente en posición 3 o conecta un radical timidina sustituido análogamente, de modo análogo a un éster, con un grupo hidroxilo de otro azúcar en posición 2' o 3' o 5' y/o

f) los radicales terminales en las posiciones 3' y 5' contienen enlaces internucleotídicos modificados opcionalmente como se describe en b).

Se prefieren aquellos compuestos de la invención en los cuales N es un oligonucleótido, que se fija específicamente con afinidad de fijación alta a otras estructuras diana y que puede obtenerse de tal manera que una mezcla de oligonucleótidos que contienen secuencias aleatorias se pone en contacto con la estructura diana, y ciertos oligonucleótidos exhiben una afinidad incrementada para la estructura diana con relación a la mezcla de los oligonucleótidos, se separan los últimos del resto de la mezcla de oligonucleótidos, y se multiplican luego los oligonucleótidos que tienen afinidad incrementada para la estructura diana a fin de obtener una mezcla de oligonucleótidos que exhibe una porción incrementada de oligonucleótidos que se fijan a las estructuras diana.

Son especialmente preferidos los compuestos de la invención en los cuales N es un oligonucleótido, que se fija específicamente con afinidad de fijación alta a otras estructuras diana, y que puede obtenerse, de tal modo que

a) en primer lugar, se produce una cadena de DNA por síntesis química, de tal modo que en el extremo 3', esta cadena de DNA exhibe una secuencia definida, que es complementaria a un promotor para una RNA-polimerasa y al mismo tiempo complementaria para un iniciador de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y de tal modo que esta cadena de DNA exhibe una secuencia definida en el extremo 5', que es complementaria para una secuencia iniciadora para la reacción en cadena de la polimerasa, y la secuencia entre las secuencias definidas contiene una secuencia aleatoria, y de tal manera que

b) esta cadena de DNA se transcribe en una cadena de RNA complementario con ayuda de una RNA-polimerasa, y se ofrecen a la polimerasa nucleótidos que están modificados en la posición 2' de la unidad ribosa, y de tal manera que

c) los nucleótidos de RNA, producidos de este modo, se ponen en contacto con la estructura diana a la cual debe fijarse específicamente el oligonucleótido, y de tal manera que

d) aquellos oligonucleótidos que se han fijado a la estructura diana se separan primeramente junto con la estructura diana de los oligonucleótidos que no se fijan, y después de ello los oligonucleótidos fijados se separan de nuevo de la estructura diana, y de tal manera que

e) estos oligonucleótidos de RNA específicos de la estructura diana se transcriben con ayuda de transcriptasa inversa en una cadena de DNA complementario, y de tal manera que

f) estas cadenas de DNA se multiplican por la reacción en cadena de la polimerasa con el uso de las secuencias iniciadoras definidas, y de tal manera que

g) los oligonucleótidos de DNA multiplicados de esta manera se transcriben luego nuevamente con ayuda de la RNA-polimerasa y con nucleótidos modificados en oligonucleótidos de RNA, y de tal manera que

h) los pasos de selección c) a g) arriba mencionados se repiten opcionalmente muchas veces hasta que los oligonucleótidos, que se caracterizan por una afinidad de fijación alta a la estructura diana, se seleccionan suficientemente, y después de ello las secuencias del oligonucleótido así obtenido pueden ser determinadas opcionalmente.

Son especialmente preferidos los compuestos de la invención en los cuales la estructura de diana se selecciona entre macromoléculas, estructuras tisulares de organismos superiores, tales como animales o humanos, órganos o partes de órganos de un animal o humano, células, células tumorales o tumores.

En esta Solicitud se consideran especialmente aquellas sustancias en las cuales el o los componentes de conexión B se fija(n)

*a) al extremo 4' del radical oligonucleotídico N reducido en posición 4' por el grupo CH_{2}-OH y/o

*b) al extremo 3' del radical oligonucleotídico N reducido en posición 3' por un átomo de hidrógeno y/o

*c) al puente o puentes fosfodiéster, reducido(s) por el o los grupos OH, entre dos nucleótidos cada uno y/o

*d) a 1 a 10 nucleobases, que está(n) reducida(s) por un átomo de hidrógeno respectivamente en la o las posiciones 5, 8 y/o el o los grupos amino en la o las posiciones 2, 4 y 6.

Son especialmente preferidos los compuestos de la invención, descritos anteriormente en *a) o *b) en los cuales B tiene la fórmula general X-Y-Z^{1}, que está conectada al lado X con el agente complejante o complejo y en el lado Z con el oligonucleótido, en la cual

X representa un enlace directo, un grupo -NH o -S,

Y representa una cadena de alquileno C_{1}-C_{20} de cadena lineal, de cadena ramificada, saturada o insaturada, que contiene opcionalmente

1-2 grupos ciclohexileno, 1-5 grupos imino, 1-3 grupos fenileno, 1-3 grupos fenilenimino, 1-3 grupos fenil-enoxi, 1-3 grupos hidroxifenileno, 1-5 grupos amido, 1-2 grupos hidrazido, 1-5 grupos carbonilo, 1-5 grupos etil-enoxi, 1 grupo ureido, 1 grupo tioureido, 1-2 grupos carboxialquilimino, 1-2 grupos éster, 1-3 grupos Ar, en los cuales Ar representa un anillo de 5 ó 6 miembros saturado o insaturado, que contiene opcionalmente 1-2 heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre y/o 1-2 grupos carbonilo; 1-10 átomos de oxígeno, 1-5 átomos de nitrógeno y/o 1-5 átomos de azufre, y/o está sustituida opcionalmente con 1-5 grupos hidroxi, 1-2 grupos mercapto, 1-5 grupos oxo, 1-5 grupos tioxo, 1-3 grupos carboxi, 1-5 grupos carboxi-alquilo C_{1}-C_{4}, 1-5 grupos éster, 1-3 grupos amino, 1-3 grupos hidroxi-alquilo C_{1}-C_{4}, 1-3 grupos alcoxi C_{1}-C_{7}, y

Z^{1} representa -CONH-CH_{2}-4', -NH-CO-4', -O-P(O)R^{1}-NH-CH_{2}-4', -O-P(O)R^{1}-O-CH_{2}-4', -O-P(S)R^{1}-O-3' o -O-P(O)R^{1}-O-3', en cuyas fórmulas 4' o 3' indica el enlace a la o las unidades azúcar terminales y R^{1} representa O^{-}, S^{-}, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o NR^{2}R^{3}, significando R^{2} y R^{3} hidrógeno y radicales alquilo C_{1}-C_{4}.

Como estructuras cíclicas (Ar), son adecuadas especialmente alquilenos cíclicos saturados o insaturados con 3 a 6, especialmente 5 ó 6 átomos C, que contienen opcionalmente heteroátomos, tales como N, S u O. Como ejemplos, se pueden mencionar: grupos ciclopentileno, pirrolileno, furanileno, tiofenileno, imidazolileno, oxazolilideno, tiazolileno, pirazolileno, pirrolidileno, piridileno, pirimidileno, maleinimidileno y ftalimidileno.

Adicionalmente deben considerarse los compuestos arriba descritos en *c) en los cuales B tiene la fórmula general X-Y-Z^{2}, que está conectado en el sitio X con el agente complejante o complejo y en el sitio Z con el oligonucleótido. En este caso

Z^{2}, en el puente que enlaza dos unidades azúcar adyacentes,

Z^{2}---

\melm{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{3'}}}}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

---O---5'

\hskip1cm

y/o

\hskip1cm

Z^{2}---

\melm{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{3'}}}}{P}{\uelm{\dpara}{S}}

---O---5'

representa el grupo -NR^{2}-, -O- o -S-, y X representa un enlace directo, un grupo -NH o grupo -S,

Y representa una cadena alquileno C_{1}-C_{20} de cadena lineal, cadena ramificada, saturada o insaturada, que contiene opcionalmente

R^{2} significa hidrógeno o radicales alquilo C_{1}-C_{4}.

Como radicales Y del componente de conexión Z^{1}-Y-X (de acuerdo con el punto 6) o Z^{2}-Y-X (de acuerdo con el punto 7), se pueden mencionar como ejemplos los radicales

1

10

Son especialmente preferidos los compuestos de la invención descritos anteriormente en *d) en los cuales B tiene la fórmula general X-Y-Z^{3}, en la cual Z^{3} representa un grupo -NH o un enlace directo a la nucleobase y X representa un enlace directo, un grupo -NH o -S,

Y representa una cadena de alquileno C_{1}-C_{20} de cadena lineal, cadena ramificada, saturada o insaturada, que contiene opcionalmente

1-2 grupos ciclohexileno, 1-5 grupos imino, 1-3 grupos fenileno, 1-3 grupos fenilenimino, 1-3 grupos fenil-enoxi, 1-3 grupos hidroxifenileno, 1-5 grupos amido, 1-2 grupos hidrazido, 1-5 grupos carbonilo, 1-5 grupos etil-enoxi, 1 grupo ureido, 1 grupo tioureido, 1-2 grupos carboxialquilimino, 1-2 grupos éster, 1-3 grupos Ar, en los cuales Ar representa un anillo de 5 ó 6 miembros saturado o insaturado, que contiene opcionalmente 1-2 heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre y/o 1-2 grupos carbonilo; 1-10 átomos de oxígeno, 1-5 átomos de nitrógeno y/o 1-5 átomos de azufre, y/o está sustituida opcionalmente con 1-5 grupos hidroxi, 1-2 grupos mercapto, 1-5 grupos oxo, 1-5 grupos tioxo, 1-3 grupos carboxi, 1-5 grupos carboxi-alquilo C_{1}-C_{4}, 1-5 grupos éster, 1-3 grupos amino, 1-3 grupos hidroxi-alquilo C_{1}-C_{4}, 1-3 grupos alcoxi C_{1}-C_{7}.

Como ejemplos se pueden mencionar los radicales

-CH_{2}-CO-NH-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2}-,

NH-CO-CH_{2}-CO-NH-CH_{2}-CH(OH)-CH_{2},

-CO-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-, -CH_{2}-S-CH_{2}-CH_{2}-NH-, -CH_{2}-S-CH_{2}-CH_{2}-,

-(CH_{2})_{4}-S-CH_{2}-CH_{2}-NH-, -CO-CH_{2}-S-CH_{2}-CH_{2}-NH-, -CO-CH_{2}-S-(CH_{2})_{6}-NH-,

-CH=CH-CO-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-, -CH=CH-CH_{2}-NH-,

-C\equivC-CH_{2}-NH- ó -CO-CH_{2}-CH_{2}-NH-CH_{2}-CH_{2}-NH-.

Como sitios de fijación en el caso de las bases púricas, es especialmente adecuada la posición 8, y en el caso de las bases pirimidínicas, es adecuada la posición 5. De modo exclusivamente formal, en este caso, un átomo de hidrógeno de la base respectiva se sustituye por el radical B-K. No obstante, puede tener lugar también un enlace por grupos amino contenidos opcionalmente en posición 2, 4 ó 6, así, v.g., por el grupo 2-amino en la guanina, por el grupo 6-amino en la adenina o por el grupo 4-amino en la citosina. En este caso, un átomo de hidrógeno del grupo amino respectivo está sustituido respectivamente por el radical B-K.

Los compuestos de acuerdo con uno de los puntos anteriores, en los cuales el complejo metálico, como elemento formador de imagen, contiene un isótopo radiactivo, seleccionado de los elementos cobre, bismuto, tecnecio, renio o indio están considerados en esta Solicitud.

La invención comprende también un proceso para detectar una estructura diana, en el cual uno o más de los compuestos de acuerdo con uno de los puntos anteriores se ponen en contacto in vivo o in vitro con la muestra a estudiar y, basándose en la señal, se detecta si la estructura diana, a la cual se fija específicamente y con afinidad de fijación alta el oligonucleótido N, está presente en la muestra.

Un proceso para diagnóstico no invasivo de enfermedades forma parte de la invención, en el cual uno o más de los compuestos de la invención mencionados se ponen en contacto con la estructura diana a estudiar in vivo y, basándose en la señal, se detecta si la estructura diana, a la cual se fija específicamente el oligonucleótido N, está presente en el organismo a estudiar.

El objeto de la invención es también el uso de un compuesto arriba descrito para la producción de un medicamento útil en radiodiagnóstico y/o en radioterapia.

Adicionalmente, es objeto de la invención el uso de un estuche de diagnóstico para detección in vivo y/o in vitro de estructuras diana, en el cual el estuche de diagnóstico contiene al menos un compuesto de acuerdo con la descripción.

Son especialmente preferidos compuestos, en los cuales N es un ligando oligonucleotídico no existente naturalmente que tiene una afinidad de fijación específica para una molécula diana, siendo dicha molécula diana una estructura química tridimensional distinta de un polinucleótido que está unido a dicho ligando oligonucleotídico a través de un mecanismo que depende predominantemente del apareamiento de bases de Watson/Crick o fijación de la triple hélice, en los cuales dicho ligando oligonucleotídico no es un ácido nucleico que tenga la función fisiológica conocida de fijarse a la molécula diana.

Si los conjugados de acuerdo con la invención deben utilizarse como agentes de diagnóstico, el o los agentes complejantes contiene(n) un isótopo radiactivo formador de imagen de los elementos de números atómicos 21, 26-27, 29, 31, 43 ó 49, preferiblemente 43 ó 49. Si los conjugados de acuerdo con la invención deben utilizarse como agente terapéutico, además de los arriba mencionados, son también adecuados isótopos de los elementos de números atómicos 5, 22-25, 28, 42, 44, 57-83 y 85. Más allá de los isótopos radiactivos de los elementos arriba mencionados, especialmente también isótopos estables, que

a) se convierten por radiación procedente del exterior en isótopos radiactivos,

b) convierten la radiación del exterior en radiación de calidad diferente, contenido de energía diferente y/o longitud de onda diferente,

son adecuados en el intervalo de tratamiento.

El número de sustituyentes de formación de imagen o terapéuticamente eficaces B-K enlazados con el radical oligonucleotídico está, por una parte, limitado por el valor del oligonucleótido, pero nunca es mayor que 10. De acuerdo con la invención, se prefieren uno o dos sustituyentes B-K.

El valor del radical oligonucleotídico N en esta invención está limitado a 15 hasta 100 nucleótidos.

Los oligonucleótidos utilizables de acuerdo con la invención están estabilizados contra la degradación por las nucleasas que tiene lugar in vivo.

Los oligonucleótidos o polinucleótidos no modificados son escindidos in vivo por endonucleasas y exonucleasas. La reacción de degradación en la serie del RNA comienza con una activación del grupo 2'-hidroxi. Otras enzimas catabólicas son, v.g. ribozimas, que escinden el enlace fosfodiéster RNS (véase Science 261, 709 (1993)). La estabilidad in vivo de los derivados de RNS puede aumentarse por sustitución parcial o completa del grupo 2'-hidroxilo por otros sustituyentes. Tales sustituyentes son, v.g., grupos alcoxi, especialmente el grupo metoxi (véase, v.g., Chem. Pharm. Bull. 13, 1273 (1965), Biochemistry 10, 2581, (1971)), un átomo de hidrógeno, un átomo de flúor (véase, v.g., Can. J. Chem. 46, 1131 (1968)) o un grupo amino (véase, v.g., J. Org. Chem. 42, 714 (1977)). Varios de estos sustituyentes, así como otros, pueden introducirse también en la posición 2' utilizando los métodos descritos en la Solicitud U.S. No. Ser. 08/264.029, presentada el 22 de junio de 1994. Otras posibilidades para estabilizar el enlace internucleotídico son el reemplazamiento de uno o dos átomos de oxígeno en el puente fosfodiéster al mismo tiempo que se forman fosforotioatos (Trends Biochem. Sci. 14, 97 (1989)) o fosforoditioatos (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 591 (1983) y Nucleic Acids Res. 12, 9095 (1984)) y el uso de alquilfosfonatos en lugar de fosfodiésteres (Ann. Rep. N.Y. Acad. Sci. 507, 220 (1988)).

La estabilización puede realizarse de tal modo que los grupos hidroxilo en la posición 2' de las unidades ribosa, independientemente unos de otros, se modifiquen. Una modificación de este tipo puede realizarse por reemplazamiento de este grupo hidroxilo por un grupo OR, un átomo de halógeno, especialmente un átomo de flúor, un átomo de hidrógeno o un radical amina, especialmente por un grupo amino. El radical R del grupo alcoxi representa, en este caso, un radical alquilo de cadena lineal o cadena ramificada con 1 a 20 átomos C, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, terc-butilo, pentilo o hexilo o un radical alquilo cíclico insustituido o sustituido con 4 a 20 átomos C, tal como ciclopentilo o ciclohexilo, que contiene opcionalmente 1-2 grupos hidroxi, y que está interrumpido opcionalmente por 1-5 átomos de oxígeno. La estabilización se incrementa también debido a que los presentes grupos hidroxilo en posiciones 3' y 5' están opcionalmente eterificados.

Otra estabilización del polinucleótido tiene lugar en el sentido de que los fosfodiésteres que se utilizan como enlace internucleotídico están reemplazados parcial o completamente, y con independencia unos de otros, por fosforotioatos, fosforoditioatos o alquilfosfonatos, de modo especialmente preferible por alquilfosfonatos inferiores, tales como, v.g., metil-fosfonato. Estos enlaces internucleotídicos pueden unirse también a los radicales terminales en las posiciones 3' y 5' o bien conectar también las posiciones 3'-3' o 5'-5'. El enlace fosfodiéster hace posible uniones ulteriores por radicales hidroxialquilo, que están presentes en los átomos de nitrógeno o carbono de las nucleobases; así, por ejemplo, dos timidinas pueden unirse por las cadenas hidroxialquilo presentes en posición 3, o dos bases púricas por los radicales presentes en posiciones 8. Puede tener lugar también la unión a los grupos hidroxilo en posición 2', 3' o 5'.

Los enlaces internucleotídicos modificados pueden tener lugar opcionalmente de modo preferible en los extremos del polinucleótido, y estar unidos de modo especialmente preferible a la timidina.

De acuerdo con la invención, los radicales oligonucleotídicos utilizados N no están limitados a secuencias oligonucleotídicas específicas. No obstante, se prefieren aquellos oligonucleótidos que están enlazados específicamente con afinidad de fijación alta a estructuras diana con la excepción del ácido nucleico.

Un proceso para identificar oligonucleótidos adecuados, que se requieren como sustancias de partida para los conjugados de acuerdo con la invención, se describe en la patente U.S. 5.270.163. Este proceso, denominado SELEX, puede utilizarse para producir un ligando de ácido nucleico para cualquier molécula diana deseada.

El método SELEX significa la selección de una mezcla de oligonucleótidos candidato e iteraciones escalonadas de fijación, partición y multiplicación, utilizando el mismo esquema de selección general, para cumplir virtualmente cualquier criterio descrito de afinidad de fijación y selectividad. Partiendo de una mezcla de ácidos nucleicos, que comprende preferiblemente un segmento de secuencia aleatorizada, el método SELEX incluye pasos de poner en contacto la mezcla con la diana en condiciones favorables para la fijación, separación de los ácidos nucleicos no fijados de aquellos ácidos nucleicos que se han fijado específicamente a moléculas diana, disociación de los complejos ácido nucleico-diana, multiplicación de los ácidos nucleicos disociados de los complejos ácidos nucleico-diana para proporcionar una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligandos, seguido por reiteración de los pasos de fijación, partición, disociación y multiplicación a lo largo de tantos ciclos como se desee para obtener ligandos de ácido nucleico altamente específicos, y de afinidad alta para la molécula diana.

El método SELEX básico se ha modificado para conseguir varios objetivos específicos. Por ejemplo, la Solicitud de Patente U.S. No. Ser. 07/960.093, presentada el 14 de octubre de 1992, describe el uso de SELEX en asociación con electroforesis en gel para seleccionar moléculas de ácido nucleico con características estructurales específicas, tales como DNA plegado. La Solicitud de Patente U.S. No. Ser. 08/123.935, presentada el 17 de septiembre de 1993, describe un método basado en SELEX para seleccionar ligandos de ácido nucleico que contienen grupos fotorreactivos capaces de fijación y/o fotorreticulación y/o fotodesactivación de una molécula diana. La Solicitud de Patente U.S. No. Ser. 08/134.028, presentada el 7 de octubre de 1993, describe un método para identificar ligandos de ácido nucleico altamente específicos capaces de discriminar entre moléculas estrechamente relacionadas, denominado Counter-SELEX. La Solicitud de Patente U.S. No. Ser. 08/143.564, presentada el 25 de octubre de 1993, describe un método basado en SELEX que consigue una partición altamente eficiente entre oligonucleótidos que tienen afinidad alta y baja para una molécula diana. La Solicitud de Patente U.S. No. Ser. 07/964.624, presentada el 21 de octubre de 1992, describe métodos para la obtención de ligandos de ácido nucleico mejorados después que se ha realizado el método SELEX. La Solicitud de Patente U.S. No. Ser. 08/400.440, presentada el 8 de marzo de 1995, describe métodos para unir covalentemente un ligando a su diana.

El método SELEX abarca la identificación de ligandos de ácido nucleico de afinidad alta que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al ligando, tales como estabilidad in vivo mejorada o características de suministro mejoradas. Ejemplos de tales modificaciones incluyen sustituciones químicas en la ribosa y/o el fosfato y/o sustituciones de bases. Ligandos de ácido nucleico identificados por SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la Solicitud de Patente U.S. No. Ser. 08/117.991, presentada el 8 de septiembre de 1993, que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las posiciones 5 y 2' de las pirimidinas. La Solicitud de Patente U.S. No. Ser. 08/134.028, citada anteriormente, describe ligandos de ácido nucleico altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino-(2'-NH_{2}), 2'-fluoro(2'-F), y/o 2'-O-metil(2'-OMe). La Solicitud de Patente U.S. No. Ser. 08/264.029, presentada el 22 de junio de 1994, describe oligonucleótidos que contienen varias pirimidinas modificadas en la posición 2.

El método SELEX abarca la combinación de oligonucleótidos seleccionados con otros oligonucleótidos seleccionados y unidades funcionales que no son oligonucleótidos como se describe en las Solicitudes de Patente U.S. No. Ser. 08/284.063, presentada el 2 de agosto de 1994, y No. Ser. 08/234.997, presentada el 28 de abril de 1994, respectivamente. Estas Solicitudes permiten la combinación de la extensa serie de formas y otras propiedades, y las propiedades de multiplicación y replicación eficientes, de oligonucleótidos con las propiedades deseables de otras moléculas.

En su forma más básica, el proceso SELEX puede definirse por la serie de pasos siguiente:

1) Se prepara una mezcla candidato de ácidos nucleicos de secuencia diferente. La mezcla candidato incluye generalmente regiones de secuencias fijas (es decir, cada uno de los miembros de la mezcla candidato contiene las mismas secuencias en la misma localización) y regiones de secuencias aleatorizadas. Las regiones de secuencias fijas se seleccionan para: (a) colaborar en los pasos de multiplicación descritos más adelante, o (b) mimetizar una secuencia conocida que se fija a la diana, o (c) mejorar la concentración de una configuración estructural dada de los ácidos nucleicos en la mezcla candidato. Las secuencias aleatorizadas pueden estar aleatorizadas totalmente (es decir, tales que la probabilidad de encontrar una base en cualquier posición es de uno en cuatro) o sólo parcialmente aleatorizadas (v.g., tales que la probabilidad de encontrar una base en una localización dada puede seleccionarse en cualquier nivel comprendido entre 0 y 100 por ciento).

2) La mezcla candidato se pone en contacto con la diana seleccionada en condiciones favorables para fijación entre la diana y los miembros de la mezcla candidato. En estas circunstancias, puede considerarse que la interacción entre la diana y los ácidos nucleicos de la mezcla candidato forma pares ácido nucleico-diana entre la diana y aquellos ácidos nucleicos que tengan la afinidad más fuerte para la diana.

3) Los ácidos nucleicos con afinidad máxima para la diana se separan por partición de aquellos ácidos nucleicos que tienen menor afinidad para la diana. Dado que sólo un número extremadamente pequeño de secuencias (y posiblemente una sola molécula de ácido nucleico) correspondiente(s) a los ácidos nucleicos de afinidad máxima existe(n) en la mezcla candidato, generalmente es deseable establecer los criterios de partición de tal manera que una cantidad significativa de los ácidos nucleicos en la mezcla candidato (aproximadamente 5-50%) queden retenidos durante la partición.

4) Aquellos ácidos nucleicos seleccionados durante la partición por tener la afinidad relativamente más alta para la diana se multiplican luego para crear una nueva mezcla candidato que está enriquecida en ácidos nucleicos que tienen una afinidad relativamente mayor para la diana.

5) Por repetición de los pasos de partición y multiplicación anteriores, la mezcla candidato nuevamente formada contiene cada vez menos secuencias singulares, y el grado medio de afinidad de los ácidos nucleicos para la diana aumentará por regla general. Llegado a este extremo, el proceso SELEX producirá una mezcla candidato que contiene solamente uno o un pequeño número de ácidos nucleicos singulares que representan aquellos ácidos nucleicos de la mezcla candidato original que tienen la afinidad máxima para la molécula diana.

Las patentes y solicitudes SELEX se describen y elaboran en este proceso con gran detalle. Se incluyen dianas que pueden utilizarse en el proceso; métodos para la partición de los ácidos nucleicos dentro de una mezcla candidato; y métodos para multiplicar los ácidos nucleicos obtenidos por partición a fin de generar una mezcla candidato enriquecida. Las patentes y solicitudes SELEX describen también los ligandos obtenidos para cierto número de especies diana, que incluyen tanto dianas proteínicas en las cuales la proteína es y no es una proteína de fijación de ácido nucleico. Por esta razón, el proceso SELEX puede utilizarse para proporcionar ligandos de afinidad alta de una molécula diana.

Las moléculas diana son preferiblemente proteínas, pero pueden incluir también, entre otros, carbohidratos, peptidoglicanos y una diversidad de pequeñas moléculas. Como en el caso de los anticuerpos proteináceos convencionales, los anticuerpos de ácido nucleico (ligandos oligonucleotídicos) pueden emplearse para direccionamiento a estructuras biológicas, tales como superficies celulares o virus, por interacción específica con una molécula que es una parte integral de dicha estructura biológica. Los ligandos oligonucleotídicos son ventajosos en el sentido de que no están limitados por auto-tolerancia, como ocurre con los anticuerpos convencionales. Asimismo, los anticuerpos de ácido nucleico no requieren animales o cultivos de células para síntesis o producción, dado que SELEX es un proceso totalmente in vitro. Como es bien conocido, los ácidos nucleicos pueden fijarse a secuencias de ácido nucleico complementarias. Esta propiedad de los ácidos nucleicos ha sido extensamente utilizada para la detección, cuantificación y aislamiento de ácidos nucleicos. Así pues, los métodos de la presente invención no tienen por objeto abarcar estas capacidades de fijación bien conocidas entre los ácidos nucleicos. Específicamente, los métodos de la presente invención relacionados con el uso de anticuerpos de ácido nucleico no tienen por objeto abarcar afinidades de fijación conocidas entre moléculas de ácido nucleico. Se conocen cierto número de proteínas que funcionan por fijación a secuencias nucleicas, tales como proteínas reguladoras que se fijan a secuencias operadoras de ácido nucleico. La capacidad conocida de ciertas proteínas de fijación de ácido nucleico para fijarse a sus sitios naturales, por ejemplo, se ha empleado en la detección, cuantificación, aislamiento y purificación de tales proteínas. Los métodos de la presente invención relacionados con el uso de ligandos oligonucleotídicos no tienen por objeto abarcar la afinidad de fijación conocida entre moléculas de fijación de ácido nucleico y secuencias de ácido nucleico a las cuales se sabe que se fijan aquéllas. Sin embargo, utilizando SELEX pueden desarrollarse nuevas secuencias, no existentes naturalmente, que se fijan a las mismas proteínas de fijación de ácido nucleico. En particular, los ligandos oligonucleotídicos de la presente invención se fijan a tales moléculas diana que comprenden una estructura química tridimensional, distinta de un polinucleótido que se fija a dicho ligando oligonucleotídico a través de un mecanismo que depende predominantemente del apareamiento de bases Watson/Crick o fijación de la triple hélice, en el cual dicho ligando oligonucleotídico no es un ácido nucleico que tenga la función fisiológica conocida de ser fijado por la molécula diana.

Debe indicarse que SELEX permite una determinación muy rápida de las secuencias de ácido nucleico que se fijarán a alguna proteína y, por tanto, puede emplearse fácilmente para determinar la estructura de secuencias operadoras y sitios de fijación desconocidos, secuencias que pueden emplearse luego para aplicaciones como las descritas en esta memoria. SELEX es por consiguiente un método general para uso de moléculas de ácido nucleico para la detección, cuantificación, aislamiento y purificación de proteínas que no son conocidas por su fijación a ácidos nucleicos. Adicionalmente, ciertos anticuerpos de ácido nucleico que pueden ser aislados por SELEX pueden emplearse también para afectar a la función, por ejemplo, inhibir, mejorar o activar la función de moléculas o estructuras diana específicas. Específicamente, pueden emplearse anticuerpos de ácido nucleico para inhibir, mejorar o activar la función de proteínas.

Los oligonucleótidos utilizados en los conjugados de acuerdo con la invención se obtienen en una realización preferida de acuerdo con el proceso descrito a continuación.

Así, pueden obtenerse oligonucleótidos adecuados de tal manera que una mezcla de oligonucleótidos que contiene secuencias aleatorias se pone en contacto con la estructura diana, y ciertos oligonucleótidos exhiben una afinidad incrementada para la estructura diana con relación a la mezcla de los oligonucleótidos, se separan los últimos del resto de la mezcla de oligonucleótidos, y los oligonucleótidos con afinidad incrementada para la estructura diana se multiplican luego a fin de obtener una mezcla de oligonucleótidos que exhibe una porción incrementada de oligonucleótidos que se fijan a las estructuras diana.

En el proceso, primeramente se produce una cadena de DNA de un modo preferido por síntesis química. En el extremo 3', esta cadena de DNA tiene una secuencia conocida, que se utiliza como promotor para una RNA-polimerasa y al mismo tiempo es complementaria para una secuencia iniciadora para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En una realización especialmente preferida, en este caso, está implicado el promotor para la RNA-polimerasa T7. A continuación, se sintetiza una secuencia aleatoria en el promotor. La secuencia aleatoria puede obtenerse de tal manera que las cuatro bases adecuadas se alimentan en la misma relación a la máquina de síntesis. Así, resultan secuencias de DNA completamente aleatorias. En una realización preferida, la longitud de la secuencia aleatoria es aproximadamente 15 a 100 nucleótidos. Otra secuencia de DNA, que puede utilizarse para la realización en cadena de la polimerasa (PCR), se sintetiza sobre esta pieza de DNA con la secuencia aleatoria.

Después de la síntesis de esta cadena de DNA, se transcribe la última en una cadena de RNA complementaria con ayuda de una RNA-polimerasa. En una realización preferida, se utiliza en este caso la RNA-polimerasa T7. En la transcripción, se ofrecen a la RNA-polimerasa los nucleótidos que están modificados. En una realización especialmente preferida, la ribosa se modifica en la posición 2'. En este caso, puede estar implicada una sustitución del átomo de hidrógeno o el grupo hidroxilo por un grupo alcoxi, preferiblemente metoxi, amino o flúor. Los oligonucleótidos de RNA producidos de esta manera se introducen luego en el proceso de selección.

En el proceso de selección, los oligonucleótidos de RNA se ponen en contacto con la estructura diana. Debe entenderse que la estructura diana significa una estructura a la cual el oligonucleótido debe unirse específicamente y con afinidad alta.

Tales estructuras son, v.g., macromoléculas, estructuras tisulares de organismos superiores, tales como animales o humanos, órganos o partes de órganos, células, especialmente células tumorales o tumores.

En este contexto, la estructura diana no tiene que encontrarse absolutamente en forma pura, sino que puede estar presente también en un órgano existente naturalmente o en una superficie celular. Puede aplicarse severidad al proceso de selección por la adición de poliamino (tRNA, heparina), plasma o sangre entera a la reacción de SELEX.

Si está involucrada en este caso una proteína aislada, la última puede estar fijada a una fase sólida, por ejemplo, un filtro. En la selección, se utiliza un exceso de la estructura diana con relación a la mezcla de RNA. En la incubación, las moléculas oligonucleotídicas específicas se unen a las estructuras diana, mientras que los oligonucleótidos no fijados se separan de la mezcla, por ejemplo por lavado.

A continuación, las moléculas oligonucleotídicas se separan de las moléculas diana o se eliminan por lavado con tampones o disolventes adecuados.

Con ayuda de la transcriptasa inversa, el oligonucleótido de RNA encontrado se transcribe en la cadena de DNA complementario.

Dado que la cadena de DNA obtenida exhibe secuencias iniciadoras (o secuencias promotoras) en ambos extremos, una multiplicación de las secuencias de DNA encontradas puede realizarse simplemente con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa.

Los oligonucleótidos de DNA multiplicados de este modo se transcriben luego nuevamente con ayuda de la RNA-polimerasa en oligonucleótidos de RNA, y los oligonucleótidos de RNA así obtenidos pueden utilizarse en un paso de selección ulterior (como se ha descrito arriba).

Después de separar los oligonucleótidos de RNA que se fijan, obtenidos en el segundo paso de selección, de las moléculas diana, las últimas se transcriben nuevamente en DNA con ayuda de la transcriptasa inversa, los oligonucleótidos de DNA complementarios así obtenidos se multiplican con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa y se transcriben luego nuevamente con ayuda de la RNA-polimerasa a los oligonucleótidos de RNA, que están disponibles para un paso de selección ulterior.

Se ha encontrado que las altas especificidades deseadas y las altas afinidades de fijación pueden obtenerse si los pasos de selección se repiten varias veces. En raras ocasiones se obtendrá la secuencia oligonucleotídica deseada tan pronto como después de uno o dos pasos de selección. Tan pronto como se obtiene la especificidad y afinidad de fijación deseada entre la estructura diana y el oligonucleótido, el o los oligonucleótidos pueden secuenciarse y, como resultado, se puede determinar la secuencia de los oligonucleótidos que se fijan específicamente.

Es especialmente ventajoso en este proceso el hecho de que el mismo puede utilizarse no sólo con proteínas adecuadas, sino también in vivo. No obstante, el proceso de selección arriba mencionado puede realizarse también sobre estructuras diana purificadas. Sin embargo, es esencial, especialmente para el diagnóstico in vivo, que la especificidad de los oligonucleótidos se proporcione para la estructura diana in vivo. Por esta razón, los procesos de selección pueden realizarse también sobre células o cultivos celulares, sobre tejidos o secciones de tejidos, sobre órganos sometidos a perfusión e incluso sobre organismos vivos.

En este caso, es ventajoso que los oligonucleótidos modificados puedan resistir la degradación por los RNAs prácticamente omnipresentes. Como resultado, las secuencias oligonucleotídicas deseadas se acumulan por sí mismas en los procesos de selección en organismos vivos, dado que los oligonucleótidos correspondientes existentes naturalmente serían degradados por los RNAs.

El radical oligonucleotídico N puede exhibir uno o más componentes de conexión B, o sustituyentes B-K, que pueden seleccionarse independientemente unos de otros. Se reivindican conjugados oligonucleotídicos, que contienen 1 a 10 componentes de conexión B idénticos o 2 a 10 componentes de conexión B diferentes. Son especialmente preferidos los conjugados oligonucleotídicos con 1 ó 2 componentes de conexión B.

El componente de conexión B conecta el radical oligonucleotídico N con un agente complejante o complejo K.

Ventajosamente, pueden utilizarse como átomos donantes ligandos polidentados complejantes de cadena abierta o cíclicos con O, S y N.

Como ejemplos para radicales de agentes complejantes K, se pueden mencionar los ácidos poliaminopolicarboxílicos reducidos por un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi y/o un grupo ácido acético, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminapentaacético, ácido trans-1,2-ciclohexanodiaminatetraacético, ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecanotetraacético, ácido 1,4,7-triazaciclo-nonanotriacético, ácido 1,4,8,11-tetraazatetradecano-tetraacético, ácido 1,5,9-triazaciclododecanodiacético, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecanotriacético y ácido 3,6,9,15-tetraazabiciclo-[9,3,1]-pentadeca-1(15),11,13-trienotriacético.

Agentes complejantes adecuados se describen, v.g., en los documentos EP 0 485 045, EP 0 071 564 y EP 0 588 229, en DE 43 10 999 y DE 43 11 023, así como US 4.965.392.

Para ilustrar las diversas posibilidades para los agentes complejantes K de acuerdo con esta invención, se hace referencia a las figuras 1 a 3, en las cuales se recogen algunas estructuras ventajosas. Estas figuras deben entenderse como una selección y no limitan esta invención en modo alguno a los agentes complejantes representados.

El agente complejante K puede contener todos los isótopos radiactivos, utilizados habitualmente en medicina nuclear para propósitos diagnósticos y terapéuticos, en la forma de sus iones metálicos. Pueden utilizarse también isótopos estables, que son excitados por radiación externa para emitir radiación diagnóstica o terapéutica, o isótopos que se convierten por radiación procedente del exterior en isótopos radiactivos.

Isótopos adecuados de acuerdo con la invención se seleccionan de los elementos de los números atómicos 5, 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 u 85.

Para uso del compuesto de acuerdo con la invención como agente radiofarmacéutico, el agente complejante contiene un elemento radiactivo. Dos elementos radiactivos que son capaces de producir un efecto terapéutico o diag-nóstico in vivo o in vitro son adecuados para este propósito. Se prefieren isótopos radiactivos de los elementos cobre, bismuto, tecnecio, renio o indio. Son especialmente preferidos los complejos de ^{99m}Tc.

Si los compuestos de fórmula general I de acuerdo con la invención contienen isótopos emisores de positrones, tales como, v.g., Sc-43, Sc-44, Fe-52, Co-55, Ga-68 o Cu-61, los últimos pueden utilizarse en tomografía de emisión de positrones (PET).

Si los compuestos de fórmula general I de acuerdo con la invención contienen isótopos emisores de radiación gamma, tales como, v.g., Tc-99m o In-111, los mismos pueden utilizarse en tomografía de emisión de fotones simple (SPECT).

Los compuestos de acuerdo con la invención pueden utilizarse también en radioterapia en forma de sus complejos con radioisótopos, tales como, v.g., Ir-192.

Los compuestos de acuerdo con la invención pueden utilizarse también en radioinmunoterapia o terapia de radiación. Los últimos se distinguen del diagnóstico correspondiente solamente por la cantidad y tipo de isótopo utilizado. En este caso, el propósito es la destrucción de células tumorales por radiación de onda corta de alta energía con una gama lo más pequeña posible. Iones emisores \beta adecuados son, por ejemplo, Sc-46, Sc-47, Sc-48, Ga-72, Ga-73, Y-90, Re-186 o Re-188. Iones emisores \alpha adecuados que exhiben semi-vidas breves son, por ejemplo, At-209, At-211, Bi-211, Bi-212, Bi-213 y Bi-214, prefiriéndose Bi-212. Un ion emisor de fotones y electrones adecuado es ^{158}Gd, que puede obtenerse a partir de ^{157}Gd por captura de neutrones.

Si el agente de acuerdo con la invención tiene por objeto ser utilizado en la variante de terapia de radiación propuesta por R.L. Mills et al. (Nature 336, 787 (1988)), el ion central tiene que derivarse de un isótopo de Mössbauer, tal como, por ejemplo, ^{57}Fe o ^{151}Eu.

Aquellos grupos de ácido carboxílico que no se requieren para la formación de complejos con los iones metálicos de los elementos de números atómicos 21 a 29, 31, 39, 42 a 44, 49, 57 a 83 u 85 pueden estar presentes opcionalmente como sales de una base inorgánica u orgánica, tal como hidróxidos y carbonatos de metal alcalino o alcalinotérreo, especialmente hidróxido de sodio y potasio, o amoníaco y alquilaminas, o aminoácido o como un éster o amida.

Adicionalmente, pueden utilizarse compuestos que son excitados por neutrones para emitir partículas y/o radiación. Es especialmente efectivo en este caso el gadolinio. Ventajosamente, pueden utilizarse aquellos compuestos que contienen el isótopo boro-10. En tales casos, K puede tener la estructura

2

en la cual x representa un número entero de 1 a 10.

La invención se refiere adicionalmente a procesos para la producción de los conjugados de acuerdo con la invención.

Así, conjugados en los cuales el componente de conexión B está fijado en el extremo 5' del oligonucleótido pueden obtenerse por reacción del oligonucleótido con un derivado de fosforamidito (Tetrahedron 49, 1925-1963 (1993)). A este fin, el grupo 5' hidroxi del oligonucleótido se hace reaccionar con un fosforamidito de fórmula general PR'(NR_{2}'')OR'''. En este caso, R' representa un grupo alquilo, alcoxi o arilalcoxi, que contiene opcionalmente N, NO_{2}, Si, o SO_{2}, con 1 a 20 átomos C, tal como metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, metoxi, etoxi, propiloxi, butiloxi, benciloxi o feniletiloxi, que puede estar sustituido opcionalmente. Como sustituyentes se utilizan especialmente grupos ciano y nitro. Ventajosamente, por ejemplo, pueden utilizarse grupos metoxi, \beta-cianoetoxi o nitrofeniletoxi. Son especialmente preferidos los grupos \beta-cianoetoxi. R'' es un radical C_{1}-C_{4} alquilo, y son especialmente adecuados etilo y propilo. Se prefieren radicales isopropilo. R''' es un grupo alquilo o arilalquilo, que contiene opcionalmente S, O, N, CN, NO_{2} o halógeno, con 1 a 20 átomos C. Preferiblemente, se utilizan radicales amino y tioalquilo protegidos, así como radicales amino y tiooxaalquilo protegidos. Son especialmente preferidos 6-amino-hexilo, 6-tiohexilo, 3,6,9-trioxa-11-amino-undecilo y 3,6-dioxa-8-amino-octanilo. Como grupos protectores se pueden utilizar grupos protectores de N o S habituales. Por ejemplo, son adecuados grupos trifluoroacetilo, ftalimido y monometoxitritilo.

En una realización especialmente preferida de esta invención, se utiliza como derivado de fosforamidito \beta-cianoetil-N,N-diisopropil-6-(trifluoroacetamido)-1-hexil-fosforamidito.

En otra realización preferida de esta invención, se utiliza como derivado de fosforamidito \beta-cianoetil-N,N-diisopropilamino-(3,6,9-trioxa-11-ftalimido-1-undecil)-fosforamidito.

En otra realización de la invención, el componente de conexión B está fijado en el extremo 3' del oligonucleótido N de una manera análoga a la descrita arriba por un grupo que contiene fósforo.

La reacción arriba descrita entre oligonucleótido y fosforamidito puede tener lugar como reacción en fase sólida, encontrándose el oligonucleótido todavía en la columna de un sintetizador automático. Después que se ha obtenido un oligonucleótido de la secuencia deseada y ha tenido lugar la exposición del grupo 5'-hidroxi del oligonucleótido, v.g., con ácido tricloroacético, se hace reaccionar el mismo con el fosforamidito y el producto de reacción se oxida y se desprende. A continuación, el derivado de oligonucleótido así obtenido se acopla en el grupo amino o tiol terminal con el agente complejante o complejo K opcionalmente por otro grupo enlazador. El radical fijado en el primer paso por el grupo que contiene fósforo en el oligonucleótido forma luego, junto con el grupo enlazador adicional opcionalmente presente, el componente de conexión B.

El enlace entre el oligonucleótido y el agente complejante puede tener lugar también de tal manera que el grupo 5'-hidroxilo libre del oligonucleótido se hace reaccionar con un agente complejante o complejo, que lleva en posición terminal un radical fósforo susceptible de fijación. Un compuesto de este tipo puede describirse por la fórmula

a)

3

\newpage

en la cual

R^{a} representa un radical alquilo C_{1}-C_{6}, que lleva opcionalmente un grupo ciano en posición \beta,

R^{b} representa un grupo amino secundario y

K y B tienen el significado indicado

o la fórmula

b)

K---B---

\melm{\delm{\para}{H}}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

---O---R^{c}

en la cual

R^{c} representa un catión trialquilamonio y K y B tienen el significado mencionado,

O la fórmula

c)

K---B---

\melm{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R ^{d} }}}}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

---O---R^{c}

\hskip1cm

o

\hskip1cm

K---B---

\melm{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R ^{d} }}}}{P}{\uelm{\dpara}{S}}

---O---R^{c}

en la cual

R^{d} representa un radical arilo, sustituido opcionalmente con uno o más átomos de halógeno y/o uno o más grupos nitro, o un radical alquilo C_{1}-C_{6}, que está sustituido opcionalmente en posición \beta con un grupo ciano, y K, B y R^{c} tienen el significado mencionado, y cuando se utiliza un radical de fórmula a), tiene lugar un paso de oxidación a fosfato después que se ha completado la reacción de acoplamiento. En ambos casos, el radical -OR^{a} o -OR^{c} puede escindirse opcionalmente por hidrólisis.

El enlace del derivado oligonucleótido por el enlazador con el agente complejante o complejo K puede tener lugar también como una reacción en fase sólida en la columna de un sintetizador automático. El compuesto de acuerdo con la invención puede aislarse luego del vehículo sólido por desprendimiento.

El enlace del oligonucleótido con el enlazador puede tener lugar no sólo por el grupo 5'-OH del azúcar del nucleótido terminal, sino también por otros grupos funcionales, que pueden generarse a partir del grupo 5'-OH, tales como, v.g., un grupo amino o carboxi. Tales nucleótidos que llevan grupos amino o carboxi son conocidos y pueden producirse fácilmente. La síntesis de una 5'-desoxi-5'-aminouridina se describe en J. Med. Chem. 22, 1273 (1979) y en Chem. Lett. 6, 601 (1976). La 4'-carboxi-5'-desoxiuridina está disponible como se describe en J. Med. Chem. 21, 1141 (1978) o Nucleic Acids Symp. Ser. 9, 95 (1981).

El enlace con el agente complejante tiene lugar luego por medio de un enlazador que lleva un grupo ácido carboxílico o amino de una manera conocida por los expertos en la técnica. El enlazador forma luego el componente B de conexión junto con el grupo-NH-CH_{2}-4' o el grupo -CO-4'.

Puede subrayarse que la distribución de los conjugados de acuerdo con la invención en un radical nucleotídico, un componente de conexión y un agente complejante o complejo tiene lugar de modo puramente formal, y por tanto independientemente de la estructura de síntesis actual. Así, v.g., en el caso arriba mencionado, se considera el grupo -NH-CH_{2}-4' o -CO-4' como perteneciente al componente de conexión B, mientras que el oligonucleótido reducido en la posición 4' por un grupo CH_{2}-OH se designa como radical oligonucleotídico N.

Un proceso para la producción de conjugados, en el cual tiene lugar el componente de conexión a los puentes fosfodiéster o fosforotioato reducidos por los grupos OH, consiste en que primeramente se unen dos unidades azúcar a un dinucleótido (véase, v.g., Chem. Lett. 1305 (1993)). En este caso, resulta primeramente un triéster de fórmula

3'---O---

\melm{\delm{\para}{O---U---V}}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

---O---5'

en la cual U representa un radical alquileno correspondiente y V representa un grupo amino o azufre protegido. Después de la escisión, v.g., del grupo protector de amino, el agente complejante puede enlazarse opcionalmente, de una manera conocida por los expertos en la técnica, por medio de un enlazador con el grupo amino - v.g., en la forma de un enlace amida. El enlazador forma luego el componente de conexión B junto con el grupo O-U-V' (en el cual V' representa un grupo -NH).

Un proceso alternativo consiste en que el fosfodiéster que se forma y pasa durante el mismo (v.g., por reacción con 1,5-diaminopentano) se somete a una aminólisis (véase Biochemistry 27, 7237 (1988) o J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988)).

Los compuestos así obtenidos de fórmula

3'---O---

\melm{\delm{\para}{NH---U---NH _{2} }}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

---O---5'

pueden enlazarse como se describe arriba con el agente complejante, opcionalmente por medio de un enlazador.

Para propósitos de acoplamiento, son también adecuados los dinucleósido-fosfato-monotiotriésteres (véase J. Am. Chem. Soc. 111, 9117 (1983) y Nucl. Acids Res. 20, 5205 (1992)).

Las nucleobases ofrecen una variedad especialmente grande para enlazar los agentes complejantes con los nucleótidos. Un eslabonamiento por grupos amino en posición 2 en las purinas y en posición 4 en las pirimidinas puede tener lugar directamente. Pero, en muchos casos, es más ventajoso modificar primeramente las purinas o pirimidinas y enlazar estas bases derivatizadas con los agentes complejantes (opcionalmente por medio de enlazadores adicionales). Nucleobases derivatizadas convenientes se describen, v.g., en Biochemie [Biochemistry] 71, 319 (1989), Nucl. Acids Res. 16, 4937 (1988) o Nucleosides Nucleotides 10, 633 (1991).

Un proceso alternativo para enlace por las nucleobases consiste en el acoplamiento catalizado por paladio de nucleobases de bromo o yodo con radicales funcionalizados (Biogenic and Medical Chemistry Letter V, 361 (1994)). Por estos radicales funcionalizados, el agente complejante puede enlazarse luego opcionalmente con la nucleobase por otro enlazador de acuerdo con métodos conocidos. Como radicales funcionalizados en posición 5 de la pirimidina y en posición 8 de la purina, pueden mencionarse como ejemplos un éster acrílico o una alquilamina (véase Nucl. Acids Res. 14, 6115 (1986) y Nucl. Acids Res. 16, 4077 (1988)). Otro proceso alternativo para preparar pirimidinas modificadas en posición 5, especialmente para introducir grupos funcionales tales como carbonilo, alquenilo o arilo en la posición 5, y un catalizador de paladio mejorado capaz de acoplar grupos modificadores en la posición 5 de las pirimidinas se describe en la Solicitud de Patente U.S. No. Ser. 08/076.735, presentada el 14 de junio de 1993. Los derivados de halógenos utilizados como precursor pueden obtenerse como se describe, v.g., en Biophys. J. 44, 201 (1983), J. Am. Chem. Soc. 86, 1242 (1964) o Chem. Commun. 17 (1967).

La producción de los complejos metálicos de acuerdo con la invención a partir de los conjugados oligonucleotídicos exentos de metales tiene lugar como se describe en el documento DE 34 01 052, por el óxido metálico o una sal metálica (por ejemplo, el nitrato, acetato, carbonato, cloruro o sulfato) del isótopo metálico deseado que se disuelve o se suspende en agua y/o un alcohol inferior (tal como metanol, etanol o isopropanol) y se hace reaccionar con la solución o suspensión de la cantidad equivalente del conjugado oligonucleotídico que contiene el agente complejante y posteriormente, en caso deseado, los átomos de hidrógeno ácido presentes se sustituyen por cationes de bases inorgánicas y/u orgánicas o aminoácidos o grupos de ácido carboxílico libres que se convierten en aminas de aminoácidos.

La neutralización de los grupos ácido libres todavía posiblemente presentes tiene lugar con ayuda de bases inorgánicas (por ejemplo, hidróxidos, carbonatos o bicarbonatos) de, por ejemplo, sodio, potasio, litio, magnesio o calcio y/o bases orgánicas tales como, entre otras, aminas primarias, secundarias y terciarias, tales como, por ejemplo, etanolamina, morfolina, glucamina, N-metil- y N,N-dimetil-glucamina, así como aminoácidos básicos, tales como, por ejemplo, lisina, arginina y ornitina, o de amidas de aminoácidos originalmente neutros o ácidos.

La producción de los agentes farmacéuticos de acuerdo con la invención tiene lugar también de una manera conocida en la técnica, suspendiendo o disolviendo los conjugados oligonucleotídicos de acuerdo con la invención
-opcionalmente por adición de los aditivos habituales en preparaciones galénicas- en medio acuoso y esterilizándose luego opcionalmente la suspensión o solución, o esterilizándose por filtración. Aditivos adecuados son, por ejemplo, tampones fisiológicamente inocuos (tales como, por ejemplo, trometamina), aditivos de agentes complejantes (tales como, por ejemplo, ácido dietilenotriaminapentaacético) o -en caso necesario- electrólitos, tales como, por ejemplo, cloruro de sodio o -en caso necesario- antioxidantes, tales como, por ejemplo, ácido ascórbico, o especialmente para formas de administración oral, manitol u otras sustancias osmóticamente activas.

Si se desean suspensiones o soluciones de los agentes de acuerdo con la invención en agua o solución salina fisiológica para administración enteral o para otros propósitos, las mismas pueden mezclarse con uno o más adyuvantes usuales en la preparación de formulaciones galénicas (por ejemplo, metil-celulosa, lactosa, manitol) y/o agentes tensioactivos (por ejemplo, lecitinas, Tween^{TR}, Myrj^{TR}).

Los agentes farmacéuticos de acuerdo con la invención contienen preferiblemente 0,1 \mumol/l a 3 mmol/l de los conjugados oligonucleotídicos de acuerdo con la invención y generalmente se dosifican en cantidades de 0,01 nmol/kg-60 \mumol/kg. Aquéllos están destinados a administración enteral o parenteral.

En el uso médico-nuclear in vivo, los compuestos marcados se dosifican generalmente en cantidades menores que 10^{-10} mol/kg de peso corporal, y la dosis exacta puede variar notablemente en función de la región corporal estudiada, pero especialmente también en función del método de estudio seleccionado respectivamente. Partiendo de un peso corporal medio de 70 kg, la cantidad de radiactividad para usos de diagnóstico está comprendida entre 40 y 1100 MBq, preferiblemente 200-800 MBq, para usos terapéuticos 1-500 MBq, preferiblemente 10-100 MBq por administración. La administración tiene lugar normalmente por vía intravenosa, intra-arterial, intersticial, peritoneal o intratumoral, y se prefiere la administración intravenosa. En general, se administran 0,1 a 20 ml del agente en cuestión por estudio.

Esta invención se refiere adicionalmente a un proceso para detectar estructuras diana. En este caso, uno o más de los compuestos arriba descritos se ponen en contacto con la muestra a estudiar in vivo o in vitro. En este caso, el radical oligonucleotídico N se fija específicamente y con afinidad de fijación alta a la estructura diana a detectar.

Si la estructura diana está presente en la muestra, puede detectarse en ella basándose en la señal. El proceso es especialmente adecuado para un diagnóstico de enfermedades no invasivo. En este caso, se administra in vivo uno o más de los compuestos arriba descritos y puede detectarse por la señal si la estructura diana, a la cual se fija específicamente y con afinidad alta el radical oligonucleotídico N, está presente en el organismo a estudiar.

No obstante, además de la mera detección de estructuras diana en las muestras a estudiar, las últimas pueden destruirse también específicamente. A este respecto, los compuestos de la presente invención son especialmente adecuados en radioterapia, v.g., en terapia del cáncer.

Otra realización de esta invención comprende un estuche (kit) de diagnóstico para detección in vivo de estructuras diana, que contiene uno o más de los compuestos arriba mencionados.

Los conjugados y agentes de acuerdo con la invención satisfacen los muchos requerimientos que deben ser cumplidos por un agente farmacéutico para radioterapia y diagnóstico. Aquéllos se distinguen especialmente por una alta especificidad o afinidad con relación a la estructura diana en cuestión. Con relación a los conjugados oligonucleotídicos conocidos, los conjugados de acuerdo con la invención exhiben una estabilidad in vivo especialmente alta. Esto se ha conseguido por una sustitución del grupo 2'-hidroxilo y la incorporación de secuencias de timidina modificadas en los grupos hidroxilo terminales de los nucleótidos. Sorprendentemente, la especificidad del oligonucleótido no se deteriora significativamente por esta modificación ni por el acoplamiento con el agente complejante. Otras ventajas son la farmacocinética controlable así como la necesaria compatibilidad.

Breve descripción de los dibujos

Diversos otros objetos, características y ventajas concomitantes de la presente invención se apreciarán más plenamente a medida que la misma llegue a comprenderse mejor cuando se considera en asociación con los dibujos que se adjuntan, en los cuales:

La Figura 1 muestra una selección de agentes complejantes cíclicos K, que pueden ser utilizados ventajosamente para esta invención. "b" marca el sitio de fijación en el componente de conexión B.

Las Figuras 2 y 3 muestran una selección de agentes complejantes K de cadena abierta, que pueden ser utilizados ventajosamente para esta invención.

Los ejemplos siguientes tienen por objeto ilustrar esta invención con mayor detalle.

Los polinucleótidos descritos en los ejemplos contienen compuestos modificados.

Los mismos significan:

A, U, C, G los nucleótidos contienen un grupo 2'-OCH_{3}

*: el enlace internucleotídico es un metil-fosfonato

**: el enlace internucleotídico es un tiofosfonato

***: el enlace internucleotídico es un ditiofosfonato.

Sin mayor elaboración, se cree que un experto en la técnica puede, utilizando la descripción que antecede, emplear la presente invención en su máxima extensión. Las realizaciones específicas preferidas siguientes deben interpretarse, por consiguiente, como meramente ilustrativas y no limitantes del resto de la descripción en modo alguno, cualquiera que sea.

En lo que antecede y en los ejemplos siguientes, todas las temperaturas se exponen en grados Celsius sin corregir; y, a no ser que se indique otra cosa, todas las partes y porcentajes se expresan en peso.

Ejemplo 1 a) 5'-(6-Amino-hexil-éster del ácido fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAG CUACAUAT*T*T*T*T-3'

El oligonucleótido 30mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3', identificado de acuerdo con el proceso SELEX, con la modificación de una secuencia T*T*T*T*T-3' situada aguas arriba se produce de la manera usual en un sintetizador automático de la compañía Pharmacia (véase Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, compilador F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nueva York, Tokyo, 1991), y el oligonucleótido está presente también en la columna del vehículo sólido. Por reacción con solución de ácido tricloroacético en diclorometano, se abre el grupo 5'-hidroxi. La carga de la columna es aproximadamente 10 mg de oligonucleótido 35mero. Para unir el enlazador, la columna se hace reaccionar con una solución en acetonitrilo de 50 \mumol de \beta-cianoetil-N,N-diisopropilamino-6-(trifluoroacetamido)-1-hexil-fosforamidito (producido de acuerdo con Nucl. Acids Res. 16, 2659-2669 (1988)) en presencia de tetrazol. La oxidación del fosfito formado al fosfotriéster completamente protegido tiene lugar con yodo en tetrahidrofurano. A continuación, la columna se lava sucesivamente con metanol y agua. Para separar el oligonucleótido modificado del vehículo sólido, el contenido de la columna se transporta en un multivial, se mezcla con 5 ml de solución de amoníaco al 30%, se cierra herméticamente el recipiente y se agita durante una noche mediante sacudidas a 55ºC. Se enfría luego a 0ºC, se centrifuga, se lava el vehículo con 5 ml de agua y las fases acuosas reunidas se someten a liofilización.

Para purificación, el material sólido se recoge en 2 ml de agua, se mezcla con 2 ml de solución de acetato de amonio 0,5 M y se mezcla con 10 ml de etanol, se deja en reposo durante una noche a -20ºC, se centrifuga, se lava el residuo con 1 ml de etanol (-20ºC) y finalmente se seca a vacío a la temperatura ambiente. Se obtienen 8 mg del compuesto del título como polvo incoloro.

b) 10-[5-(2-Carboxifenil)-2-hidroxi-5-oxo-4-aza-pentil]-1,4,7-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

Se disuelven 50 g (144,3 mmol) de 1,4,7-tris(carboxi-metil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano (D03A) en 250 ml de agua y se ajusta el pH a 13 con solución 5N de hidróxido de sodio. A continuación, se añade gota a gota en el transcurso de una hora una solución de 38,12 g (187,6 mmol) de N-(2,3-epoxipropil)-ftalimida en 100 ml de dioxano, se agita durante 24 horas a 50ºC y el pH se mantiene en 13 por adición de solución 5N de hidróxido de sodio. La solución se ajusta a pH 2 con ácido clorhídrico al 10% y se evapora a sequedad a vacío. El residuo se disuelve en algo de agua y se purifica en una columna de intercambio iónico (Reillex® = poli-(4-vinil)-piridina, se eluye con agua). Las fracciones principales se concentran por evaporación a vacío, y se somete el residuo a una purificación final por cromatografía sobre RP-18 (LiChroPrep®/disolvente móvil: gradiente de tetrahidrofurano/metanol/agua). Después de concentración por evaporación de las fracciones principales, se obtienen 63,57 g (71% de la teoría)) de un sólido amorfo.

Contenido de agua: 8,5%

Análisis elemental (referido a la sustancia anhidra):

Calc.:	C 52,90	H 6,57	N 12,34
Enc.:	C 52,65	H 6,68	N 12,15

c) 10-(3-Amino-2-hidroxi-propil)-1,4,7-tris(carboxi-metil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

50 g (88,1 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 1b se calientan a reflujo en 300 ml de ácido clorhídrico concentrado durante 24 horas. Se evapora a sequedad, se disuelve el residuo en algo de agua y se purifica en una columna de intercambio iónico (Reillex® = poli-(4-vinil)-piridina (se eluye con agua)). Las fracciones principales se evaporan a sequedad.

Rendimiento: 39 g (95% de la teoría) de un sólido vítreo.

Contenido de agua: 10,3%

Análisis elemental (referido a la sustancia anhidra):

Calc.:	C 48,68	H 7,93	N 16,70
Enc.:	C 48,47	H 8,09	N 16,55

d) 10-[7-(4-Nitrofenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboxi-metil)-4-aza-heptil]-1,4,7-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

9,84 g (41,8 mmol) de anhídrido 3-(4-nitrofenil)-glutárico (J. Org. Chem. 26, 3856 (1961)) se añaden a 14,62 g (34,86 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 1c) en 200 ml de dimetilformamida/20 ml de trietilamina y se agita durante una noche a la temperatura ambiente. Se evapora a sequedad a vacío. El residuo se recristaliza en isopropanol/ácido acético 95:5.

Rendimiento: 21,68 g (95% de la teoría) de un sólido amarillento)

Contenido de agua: 0,9%

Análisis elemental (referido a la sustancia anhidra):

Calc.:	C 51,37	H 6,47	N 12,84
Enc.:	C 51,18	H 6,58	N 12,67

e) 10-[7-(4-Aminofenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboxi-metil)-4-aza-heptil]-1,4,7-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

21,0 g (32,07 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 1d) se disuelven en 250 ml de metanol y se añaden 5 g de catalizador de paladio (10% Pd sobre C). Se hidrogena durante una noche a la temperatura ambiente. El catalizador se separa por filtración y el filtrado se evapora a sequedad a vacío.

Rendimiento: 19,63 g (98% de la teoría) de un sólido de color crema)

Contenido de agua: 0,8%

Análisis elemental (referido a la sustancia anhidra):

Calc.:	C 53,84	H 6,35	N 12,60
Enc.:	C 53,73	H 6,45	N 12,51

f) 10-[7-(4-Isotiocianatofenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboximetil)-4-aza-heptil]-1,4,7-tris(carboxi-metil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

Se disuelven 12,4 g (19,27 mmol) del compuesto del título del Ejemplo 1e) en 200 ml de agua y se añaden 6,64 g (57,8 mmol) de tiofosgeno en 50 ml de cloroformo. Se agita durante 1 hora a 50ºC. Se enfría a la temperatura ambiente, se separa la fase orgánica y se agita dos veces la fase acuosa mediante sacudidas con 100 ml de cloroformo. La fase acuosa se evapora a sequedad y el residuo se precipita absortivamente en 100 ml de isopropanol a la temperatura ambiente. Se separa el sólido por filtración y se lava con éter. Después de secado durante una noche a vacío (40ºC), se obtienen 12,74 g (97% de la teoría) de un sólido de color crema.

Contenido de agua: 3,1%

Análisis elemental (referido a sustancia anhidra):

Calc.:	C 52,24	H 6,35	N 12,60	S 4,81
Enc.:	C 52,37	H 6,44	N 12,48	S 4,83

g) Conjugado de 5-(6-amino-hexil-éster de ácido fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCGCAA GACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' y 10-[7-(4-isotiocianato-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboximetil)-4-azaheptil]-1,4,7-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetraaza-ciclododecano

8 mg del oligonucleótido obtenido en el Ejemplo 1a) se disuelven en 2,5 ml de un tampón NaHCO_{3}/Na_{2}CO_{3} (pH 8,0) y se mezclan con 1 mg de 10-[7-(4-isotiocianatofenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboximetil)-4-aza-heptil]-1,4,7-tris-(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano (compuesto del título del Ejemplo 1f). Se agita durante 5 horas a la temperatura ambiente, se ajusta el pH a 7,2 por adición de ácido clorhídrico 0,01 M y la solución se somete a ultrafiltración a través de una membrana con límite de exclusión 3.000 (Amicon YM3) seguido por liofilización. Se obtienen 7 mg del conjugado deseado.

h) Complejo con ^{111}indio del conjugado con tiourea de 5-éster del ácido 6-amino-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' y 10-[7-(4-isotiocianato-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboximetil)-4-azaheptil]-1,4,7-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetraaza-ciclododecano

15 \mul de una solución de acetato de ^{111}indio(III) (350 \muCi), (producido a partir de cloruro de ^{111}indio(III) en solución 2 M de acetato de sodio y ajuste del pH a 4,0 con ácido clorhídrico 0,1 M) se añaden a 135 \mul de una solución de 1 mg del compuesto del título del Ejemplo 1g) en tampón MES, pH 6,2 (MES = ácido 2-(N-morfolino)etilsulfónico). Se lleva el pH a 4,2 por adición de ácido clorhídrico 0,01 M. Se agita durante una hora a 37ºC a pH 4,2. Se lleva a pH 6 con solución 2 M de acetato de sodio y se añaden 10 \mul de una solución 0,1 M de Na_{2}EDTA = sal disódica del ácido etilenodiamina-tetraacético, para complejar el exceso de ^{111}indio. La purificación final del conjugado marcado así obtenido (1 h) tiene lugar por HPLC (cromatografía de exclusión: TSK-400/tampón MES). Las fracciones que contienen el conjugado marcado se diluyen con solución fisiológica de sal común, se ajustan a pH 7,2 con solución 0,01 M de hidróxido de sodio y se filtran. La solución así producida representa entonces una preparación adecuada para radiodiagnóstico.

Ejemplo 2 a) Conjugado de 5'-(éster del ácido (6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCG CAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' y ácido N-[2-amino-3-(4-isotiocianatofenil)-propil]-trans-ciclohexano-1,2-diamina-N,N'-N',N'',N''-pentaacético

8 mg del oligonucleótido obtenido en el Ejemplo 1a) se disuelven en 2,5 ml de un tampón NaHCO_{3}/Na_{2}CO_{3} (pH 8,0) y se añade 1 mg de ácido N-(2-amino-3-(p-isotiocianato-fenil)propil]-trans-ciclohexano-1,2-diamina-N,N',N',N'',N''-pentaacético (producido de acuerdo con Bioconjugate Chem. 1, 59 (1990)). Se agita durante 5 horas a la temperatura ambiente, se ajusta luego a pH 7,2 con ácido clorhídrico 0,1 M y la solución se somete a ultrafiltración a través de una membrana con el límite de exclusión 3.000 (Amicon YM3). Después de liofilización, se obtienen 6 mg del conjugado de tiourea 2a).

b) Complejo con bismuto-212 del conjugado de 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' y ácido N-[2-amino-3-(4-isotiocianatofenil)-propil]-trans-ciclohexano-1,2-diamina-N,N'-N',N'',N''-pentaacético

Una solución de tetrayoduro de ^{212}bismuto en ácido yodhídrico 0,1 M se lleva a pH 4 con ácido acético 2 M. Una parte alícuota de esta solución con actividad de aproximadamente 3 mCi se añade a 1 mg del compuesto del título del Ejemplo 2a), disuelto en 0,5 ml de tampón MES 0,02 M y se añaden 0,5 ml de solución 0,15 M de cloruro de sodio. Se agita durante 20 minutos a la temperatura ambiente. Se lleva a pH 6 con solución 2M de acetato de sodio y se añaden 20 \mul de una solución 0,01 M de Na_{2}EDTA. Se agita durante 20 minutos. La purificación del complejo tiene lugar por HPLC (cromatografía de exclusión: TSK-400/tampón MES). Las fracciones de conjugado radiactivo se reúnen, se diluyen con solución fisiológica de sal común, y se ajustan a pH 7,2 con solución 0,01 M de hidróxido de sodio. Después de filtración, se obtiene una preparación adecuada para radioterapia.

Ejemplo 3 a) Complejo de indio-111 del conjugado de 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' y ácido N-[2-amino-3-(4-isotiocianatofenil)-propil]-trans-ciclohexano-1,2-diamina-N,N'-N',N'',N''-pentaacético

15 ml de una solución de 15 \mul de acetato de ^{111}indio(III) (350 \muCi) (producido a partir de cloruro de ^{111}indio(III) en solución 2 M de acetato de sodio y ajuste del pH a 4,0 con ácido clorhídrico 0,1 M) se añaden a 0,5 ml de una solución de 1 mg del compuesto del título del Ejemplo 2a) en tampón MES, pH 6,2 (MES = ácido 2-(N-morfolino)etilsulfónico). El pH se lleva a 5,0 por adición de ácido clorhídrico 0,01 M. Se agita durante 1 hora a 37ºC a pH 5,0. Se lleva a pH 6 con solución 2M de acetato de sodio y se añaden 10 \mul de una solución 0,1 M de Na_{2}EDTA =
sal disódica del ácido etilenodiamina-tetraacético, para complejar el exceso de ^{111}indio. La purificación final del conjugado marcado así obtenido (1 h) tiene lugar por HPLC (cromatografía de exclusión: TSK-400/tampón MES). Las fracciones que contienen el conjugado marcado se diluyen con solución fisiológica de sal común, se ajustan a pH 7,2 con solución 0,01 M de hidróxido de sodio y se filtran. La solución así producida representa entonces una preparación adecuada para radiodiagnóstico.

Ejemplo 4 a) Conjugado de 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGCAGCGCAA GACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' y ácido 2-(4-isotiocianato-bencil)-dietilenotriamina-N,N,N',N'',N''-pentaacético

8 mg del oligonucleótido obtenido en el Ejemplo 1a) se disuelven en 2,5 ml de un tampón NaHCO_{3}/Na_{2}CO_{3} (pH 8,0) y se añade 1 mg de ácido 2-(4-isotiocianato-bencil)-dietilenotriamina-N,N',N',N'',N''-pentaacético (producido de acuerdo con: Bioconjugate Chem. 2, 187 (1991)). Se agita durante 5 horas a la temperatura ambiente, se ajusta luego a pH 7,2 con ácido clorhídrico 0,01 M y la solución se somete a ultrafiltración a través de una membrana con el límite de exclusión 3.000 (Amicon YM3). Después de liofilización, se obtienen 6 mg del conjugado de tiourea.

b) Complejo con itrio-90 del conjugado de 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligómero 35mero 5'-CUCAUGCAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' y ácido 2-(4-isotiocianato-bencil)-dietilenotriamina-N,N,N',N'',N''-pentaacético

Una solución de ^{90}itrio, disuelto en solución 0,05 M de acetato de amonio (aproximadamente 380 mCi), se añade a 1 mg del derivado de tiourea del Ejemplo 4a) en 0,5 ml de solución 0,05 M de acetato de amonio de pH 6, se ajusta a pH 5,2 con ácido acético 3 M y se agita durante una hora a la temperatura ambiente. Se ajusta a pH 7,0 con solución 0,01 M de hidróxido de sodio y el conjugado se purifica por HPLC (TSK-400/tampón MES). Se reúnen las fracciones principales, se diluyen con solución fisiológica de sal común y se llevan a pH 7,2 con solución 0,01 M de hidróxido de sodio. Después de filtración, se obtiene una preparación adecuada para la radioterapia.

Ejemplo 5 a) 5'-(Éster del ácido 6-mercapto-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGG AGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' (ligando modificado para serina-proteasa)

El oligonucleótido 30mero 5'-AGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' (seq.no. 13 de la Patente U.S. No. 5.270.163) identificado de acuerdo con el proceso SELEX, modificado en las unidades azúcar y por una secuencia enlazada en 5' de 5 timidinas, se produce de la manera usual en un sintetizador automático de la compañía Pharmacia (véase Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, compilador F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nueva York, Tokyo, 1991), y el oligonucleótido está presente también en la columna del vehículo sólido. Por reacción con solución de ácido tricloroacético en diclorometano, se abre el grupo 5'-hidroxi. La carga de la columna es aproximadamente 10 mg de oligonucleótido 35mero. Para unir el enlazador, se hace reaccionar la columna con una solución de 50 \mumol de \beta-cianoetil-N,N-diisopropilamino-S-tritil-6-mercapto)-fosforamidito en acetonitrilo en presencia de tetrazol. La oxidación del fosfito formado para dar el fosfotriéster completamente protegido tiene lugar con yodo en tetrahidrofurano. A continuación, se lava la columna sucesivamente con metanol y agua. Para separar el oligonucleótido modificado del vehículo sólido, el contenido de la columna se transfiere a un multivial, se mezcla con 5 ml de solución de amoníaco al 30%, se cierra herméticamente el recipiente y se agita mediante sacudidas durante una noche a 55ºC. Se enfría luego a 0ºC, se centrifuga, se lava el vehículo con 5 ml de agua y las fases acuosas reunidas se someten a liofilización.

Para la purificación, el material sólido se recoge en 2 ml de agua, se mezcla con 2 ml de solución 0,5 M de acetato de amonio y se mezcla con 10 ml de etanol, se deja en reposo durante una noche a -20ºC, se centrifuga, se lava el residuo con 1 ml de etanol (-20ºC) y se seca finalmente a vacío a la temperatura ambiente.

Se obtienen 9 mg del compuesto del título tritilado en S. Para escindir el grupo protector tritilo, se disuelve el producto en 0,5 ml de agua, se seca con 0,1 ml de solución 1 M de nitrato de plata y se agita durante 1 hora a la temperatura ambiente. A continuación, se mezcla con 0,1 ml de solución 1 M de ditiotreitol. Después de 15 minutos, se centrifuga, y la solución sobrenadante se extrae varias veces con acetato de etilo. Después de la liofilización, se obtienen 8 mg del compuesto del título deseado a partir de la solución acuosa.

b) Éster metílico de 4-benciloxi-N-metanosulfonil-fenilalanina

Se añaden gota a gota 19,58 g de cloruro del ácido metanosulfónico en 50 g de hidrocloruro del éster metílico de 4-benciloxi-fenilalanina en 300 ml de piridina a 0ºC y se agita durante 3 horas a 0ºC. Se evapora a sequedad a vacío y el residuo se disuelve en 500 ml de diclorometano. Se agita 2 veces mediante sacudidas con 300 ml de ácido clorhídrico 5 N cada vez, se seca sobre sulfato de magnesio y se concentra por evaporación a vacío. El residuo se recristaliza en 150 ml de metanol.

Rendimiento: 53,64 g de un polvo cristalino incoloro.

c) 2-(4-Benciloxibencil)-1-metanosulfonil-1,4,7-triaza-heptan-3-ona

37,2 g de éster metílico de 4-benciloxi-N-metano-sulfonil)fenilalanina y 1,2 l de 1,2-diaminoetano se agitan durante 3 horas a 80ºC. El residuo se evapora a sequedad y se precipita absortivamente con 200 ml de agua; el precipitado se filtra con succión, se lava hasta neutralidad con agua y se seca durante una noche a 60ºC.

Rendimiento: 37,68 g de un polvo amorfo de color crema.

d) 2-(4-Benciloxibencil)-1-metanosulfonil-7-(terc-butil-oxicarbonil)-1,4,7-triazaheptan-3-ona

Una solución de 16,23 g de 2-(4-benciloxibencil)-1-metanosulfonil-1,4,7-triazaheptan-3-ona y 4,76 g de tri-etilamina en 200 ml de cloroformo se mezcla a 0ºC con una solución de 10,27 g de dicarbonato de di-terc-butilo en 50 ml de cloroformo. Se agita durante 5 horas a la temperatura ambiente, se agita mediante sacudidas con solución de carbonato de sodio al 5% y agua, se seca sobre sulfato de magnesio y se concentra por evaporación a vacío. El residuo se recristaliza en 100 ml de metanol.

Rendimiento: 20,19 g de un sólido alveolar.

e) 2-(4-Hidroxibencil)-1-metanosulfonil-7-(terc-butiloxi-carbonil)-1,4,7-triazaheptan-3-ona

20 g de 2-(4-benciloxibencil)-1-metanosulfonil-7-(terc-butiloxicarbonil)-1,4,7-triazaheptan-3-ona, disueltos en 300 ml de diclorometano, se agitan con 4 g de paladio-carbono (al 10%) durante una noche en atmósfera de hidrógeno. Se filtra y la solución se concentra por evaporación a vacío.

Rendimiento: 16,17 g de una espuma vítrea, que solidifica después de unos cuantos minutos.

f) 2-[4-(Benciléster del ácido 3-oxapropiónico)-bencil]-1-metanosulfonil-7-(terc-butiloxicarbonil)-1,4,7-triaza-heptan-3-ona

15 g de 2-(4-hidroxibencil)-1-metanosulfonil-7-(terc-butiloxicarbonil)-1,4,7-triazaheptan-3-ona, 8,56 g de éster bencílico del ácido bromoacético y 13,18 g de carbonato de potasio se calientan a reflujo en 300 ml de acetonitrilo durante 24 horas. Se filtra y se evapora a sequedad a vacío. El residuo se disuelve en 200 ml de diclorometano, y se agita 2 veces mediante sacudidas con 50 ml de agua cada vez. La fase orgánica se seca sobre sulfato de magnesio y se concentra por evaporación a vacío. El residuo se cromatografía con diclorometano-hexano-acetona (20/10/1) como eluyente.

Rendimiento: 10,06 g de un sólido alveolar.

g) 2-[4-(Éster bencílico del ácido 3-oxapropiónico)-bencil]-1-metanosulfonil-1,4,7-triazaheptan-3-ona

10 g de 2-[4-(éster bencílico del ácido 3-oxapropiónico)-bencil]-1-metanosulfonil-7-(terc-butiloxi-carbonil)-1,4,7-triazaheptan-3-ona se agitan durante una hora a la temperatura ambiente con 100 ml de ácido trifluoroacético. Se evapora a sequedad a vacío.

Rendimiento: 9,2 g de una espuma vítrea, que solidifica al dejarla en reposo.

h) 9-Cloro-1-metanosulfonil-2-[4-(éster bencílico del ácido 3-oxapropiónico)-bencil]-1,4,7-triaza-3,8-diona

9 g de 2-[4-(éster bencílico del ácido 3-oxa-propiónico)-bencil]-1-metanosulfonil-1,4,7-triazaheptan-3-ona y 1,78 g de trietilamina se disuelven en 200 ml de cloroformo. A 0ºC, se añaden gota a gota 1,98 g de cloruro de cloroacetilo, disueltos en 20 ml de cloroformo, en el transcurso de 30 minutos y se agita luego durante 2 horas a 0ºC. Se lava con 100 ml de ácido clorhídrico al 5%, 2 veces con 50 ml de agua cada vez, se seca sobre sulfato de magnesio y se evapora a sequedad a vacío. El residuo se cromatografía sobre gel de sílice con diclorometano-acetato de etilo (20/1) como diluyente.

Rendimiento: 6,97 g de un sólido céreo.

i) 9-Cloro-1-metanosulfonil-2-[4-(éster bencílico del ácido 3-oxapropiónico)-bencil]-1,4,7-triaza-3,8-diona

6,5 g de 9-cloro-1-metanosulfonil-2-[4-(éster bencílico del ácido 3-oxapropiónico)-bencil]-1,4,7-triaza-3,8-diona, disueltos en 150 ml de diclorometano, se agitan con 2 g de paladio-carbono (al 10%) durante una noche en atmósfera de hidrógeno. Se filtra y la solución se concentra por evaporación a vacío.

Rendimiento: 5,33 g de un sólido vítreo.

j) 10-Acetil-2-[4-(ácido 3-oxapropiónico)-bencil]-1-(metanosulfonil)-10-tia-1,4,7-triazadecano-3,8-diona

5 g de 9-cloro-1-metanosulfonil-2-[4-(éster bencílico del ácido 3-oxapropiónico)-bencil]-1,4,7-triaza-3,8-diona, disueltos en 80 ml de cloroformo, se calientan a reflujo con 1,98 g de trietilamina y 0,74 g de ácido tioacético durante 10 minutos. La solución se vierte en 200 ml de ácido clorhídrico al 5% enfriado en hielo, se separa la fase orgánica, se seca sobre sulfato de magnesio y se concentra por evaporación a vacío. Después de cromatografía sobre gel de sílice con hexano-acetato de etilo (3/1), se obtienen 4,64 g del compuesto deseado como un sólido ví-
treo.

k) 10-Acetil-2-[4-(ácido 3-oxapropiónico-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-il)-éster)-bencil]-1-(metanosulfonil)-10-tia-1,4,7-triazadecano-3,8-diona

4 g de 10-acetil-2-[4-ácido 3-oxapropiónico)-bencil]-1-(metanosulfonil)-10-tia-1,4,7-triazadecano-3,8-diona, 1,91 g de diciclohexilcarbodiimida, 4 g de N-hidroxi-succinimida y 30 mg de 4-dimetilaminopiridina se agitan durante 24 horas en 20 ml de cloroformo a la temperatura ambiente. Se mezcla luego con 20 ml de dietil-éter, se filtra, y el residuo se concentra por evaporación a vacío. El residuo se cromatografía sobre gel de sílice con diclorometano-dioxano (10/1) como eluyente.

Rendimiento: 3,47 g de un sólido de color crema.

Análisis elemental:

Calc.:	C 46,15	H 4,93	N 9,78	S 11,20
Enc.:	C 46,03	H 4,83	N 9,64	S 11,05

l) 10-Acetil-2-{4-[ácido 3-oxapropiónico-(6-maleimido-hexanoil)-hidrazida]-bencil}-1-metanosulfonil-10-tia-1,4,7-triazadecano-3,8-diona

3 g de 10-acetil-2-[4-(ácido 3-oxapropiónico-(2,5-dioxo-pirrolidin-1-il)-éster)-bencil]-1-(metanosulfonil)-10-tia-1,4,7-triazadecano-3,8-diona y 1,17 g de hidrazida del ácido 6-maleimidocaproico (Science 261, 212 (1993)) se agitan en 40 ml de dimetilformamida durante 5 horas a 60ºC. Con agitación enérgica, se añaden gota a gota 100 ml de agua y se separan por filtración del precipitado producido. Se seca a vacío y el residuo se purifica por cromatografía súbita en una columna de gel de sílice con diclorometano/dioxano (10/1) como eluyente. Se obtienen 2,8 g del compuesto del título como un sólido blanco.

Análisis elemental (referido a sustancia anhidra):

Calc.:	C 49,25	H 5,61	N 12,30	S 9,39
Enc.:	C 49,33	H 5,95	N 12,43	S 1,11

m) Conjugado de 5'-(éster del ácido 6-mercapto-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T* TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y 10-acetil-2-{4-[ácido 3-oxapropiónico-(6-maleimido)-hexanoil)-hidrazida]-bencil}-1-metanosulfonil-10-tia-1,4,7-triaza-decano-3,8-diona

5 mg del oligonucleótido que contiene tiol producido de acuerdo con el Ejemplo 5a) se mezclan en 2 ml de tampón de fosfato (pH 7,4) con 1 mg del derivado de maleimida, producido de acuerdo con el Ejemplo 5l), disuelto en 0,2 ml de dimetilformamida. Se deja en reposo durante 2 horas a la temperatura ambiente, y la solución se somete a ultrafiltración a través de una membrana con el límite de exclusión 3.000 (Amicon YM3) seguido por liofilización. Se obtienen 5 mg del conjugado deseado.

n) Complejo con tecnecio-99m del conjugado de 5'-(éster del ácido 6-mercapto-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y 10-acetil-2-{4-[ácido 3-oxapropiónico-(6-maleimido)-hexanoil)hidrazida]-bencil}-1-metanosulfonil-10-tia-1,4,7-triazadecano-3,8-diona

1 ml de una solución de D-glucarato de potasio (12 mg/ml) y cloruro de estaño(II) (100 \mug/ml) en NaHCO_{3} 0,2 M se liofilizan en un vial y se mezclan luego con solución de [Tc-99m]pertecnetato de sodio (1 ml, 1 mCi) procedente de un generador de Mo-99/Tc-99m. Después de dejar en reposo a la temperatura ambiente durante 15 minutos, se retira una parte alícuota y se mezcla con el mismo volumen del conjugado del Ejemplo 5m) (1 mg/ml) disuelto en solución 0,2 M de NaHCO_{3}. Después de 15 minutos, tanto la cromatografía en capa fina como la HPLC demostraron que más del 98% de la radiactividad había sido retenida por el conjugado.

Ejemplo 6 a) Conjugado de 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCG CAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' y S-benzoil MAG_{3}-2,3,5,6-tetrafluorofeniléster

3 mg de S-benzoil-MAG_{3}-2,3,5,6-tetrafluorofeniléster (producido de acuerdo con el documento US 4.965.392), disueltos en 0,2 ml de dimetilformamida, se añaden a 8 mg del compuesto del título del Ejemplo 1a), disueltos en 0,5 ml de tampón de fosfato 0,1 M (pH 7), y se agita durante 3 horas a la temperatura ambiente. Se diluye con agua y la solución se somete a ultrafiltración (Amicon YM3, límite de exclusión 3.000). Después de liofilización, se obtienen 5 mg del conjugado 6a).

b) Complejo con ^{99m}tecnecio del conjugado de 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' y S-benzoil MAG_{3}-2,3,5,6-tetrafluorofeniléster

1 mg del compuesto del título del Ejemplo 6a) se disuelve en 200 \mul de agua y se mezcla con 1 ml de tampón de fosfato 0,1 M de pH 8,5. Se añaden a esta mezcla 200 \mul de solución de gluconato de ^{99m}tecnecio-(V) (aproximadamente 15 mCi) y se deja en reposo durante 15 minutos a la temperatura ambiente. El rendimiento de trazador (determinado por HPLC) es aproximadamente 95%.

Ejemplo 7 a) Conjugado del 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCG CAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' y el complejo con ^{99m}tecnecio del éster del ácido 2,3,5,6-tetrafluorofenil-4,5-bis(mercaptoacetamido)-pentanoico

Se añaden 3 mg del compuesto del título del Ejemplo 1a), disueltos en 0,6 ml de tampón de fosfato, al complejo con ^{99m}tecnecio del éster del ácido 2,3,5,6-tetrafluorofenil-4,5-bis(mercaptoacetamido)-pentanoico (producido de acuerdo con: J. Nucl. Med. 32, 1445 (1991)) aproximadamente 100 mCi, disueltos en 2 ml de tampón de fosfato, pH 7,2. Se ajusta a pH 10 con tampón 1,0 M de carbonato de potasio y se agita durante 20 minutos a la temperatura ambiente. Para la purificación final, se añade la solución a una columna Sephadex (Pharmacia) y se eluye con 75 mmol de solución de cloruro de sodio. Se reúnen las fracciones principales, se diluyen con solución fisiológica de sal común y se filtran. La solución así obtenida puede utilizarse para estudios de radiodiagnóstico.

Ejemplo 8 a) Conjugado de 5'-(éster del ácido 6-mercapto-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T* TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y 5'(N-maleimido)-3-oxapentil-{2-[3-carboxibenzoil)-tio]-acetil}glicilglicilglicinato

5 mg del oligonucleótido que contiene el grupo tio producido de acuerdo con el Ejemplo 5a) se mezclan bajo N_{2} en 2 ml de tampón de fosfato (pH 7,4) con 1 mg de 5-(N-maleimido)-3-oxapentil-{2-[3-carboxi-benzoil)-tio]-acetil}-glicilglicilglicinato (producido de acuerdo con Bioconj. Chem. 1, 431 (1990)), disuelto en 0,2 ml de dimetilformamida. Se deja en agitación durante 2 horas a la temperatura ambiente y la solución se somete a ultrafiltración a través de una membrana (Amicon YM3) seguido por liofilización. Se obtienen 5,5 mg del conjugado deseado.

b) Complejo con tecnecio-99m del conjugado 5'-(éster del ácido 6-mercapto-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y 5'(N-maleimido)-3-oxapentil-{2-[3-carboxibenzoil)-tio]-acetil}glicilglicilglicinato

1 ml de una solución de D-glucarato de potasio (12 mg/ml) y cloruro de estaño(II) (100 \mug/ml) en NaHCO_{3} 0,2 M se liofiliza en un vial y se mezcla luego con solución de [Tc-99m]-pertecnetato de sodio (1 ml, 1 mCi) procedente de un generador de Mo-99/Tc-99m. Después de permanecer en reposo a la temperatura ambiente durante 15 minutos, se retira una parte alícuota y se mezcla con el mismo volumen del conjugado del Ejemplo 8a) (1 mg/ml) disuelto en solución 0,2 M de NaHCO_{3}. La sustancia puede aislarse por liofilización. El rendimiento de trazador determinado por HPLC es mayor que 96%.

Ejemplo 9 a) Conjugado 5'-(éster del ácido 6-mercapto-1-hexil-fosfónico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T* TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y 1-[6-(2-vinil-6-hexiloximetil)-piridina]-1,4,8,11-tetraazaciclo-tetradecano

Una solución de 4 mg del oligonucleótido que contiene el grupo tio, producido de acuerdo con el Ejemplo 5a), en 2 ml de tampón de fosfato (pH 7,4) se mezcla bajo N_{2} con 1 mg de 1-[6-(2-vinil-6-hexil-oximetil)-piridina]-1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (producido de acuerdo con el documento EP 0 588 229), disuelto en 0,5 ml de dimetilformamida. Se deja en agitación durante 4 horas a 35ºC, se mezcla con 10 ml de etanol y el producto se aisla por centrifugación. La purificación tiene lugar por cromatografía en fase inversa en una columna de 1 x 25 cm con un gradiente de 50 mmol de acetato de trietilamonio (pH 7)/acetonitrilo. Las fracciones reunidas se liofilizan, se disuelven en 1 ml de agua y se desalan en una columna Sephadex G-10. El compuesto del título (aproximadamente 4 mg) se aisla por liofilización.

b) Complejo con Tc-99m del conjugado de 5'-(éster del ácido 6-mercapto-1-hexil-fosfónico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y 1-[6-(2-vinil-6-hexiloximetil)-piridina]-1,4,8,11-tetra-azaciclotetradecano

El procedimiento se lleva a cabo como se describe en el Ejemplo 8b). El rendimiento de trazador, determinado por HPLC, es 92%.

Ejemplo 10 a) Conjugado de 5'-(éster del ácido 6-mercapto-1-hexil-fosfónico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T* TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y N-[4-hidroxi-3-(1,4,8,11-tetraaza-ciclotetradec-5-il)-bencil]-2-(6-vinil-piridin-2-ilmetoxi)-acetamida

Una solución de 6,5 mg del oligonucleótido que contiene el grupo tiol, producido de acuerdo con el Ejemplo 5a), en 2 ml de tampón de fosfato (pH 8,0) se mezcla con 1,2 mg de N-[4-hidroxi-3-(1,4,8,11-tetraaza-ciclotetra-dec-5-il)-bencil-2-(6-vinil-piridin-2-ilmetoxi)-acetamida (producida de acuerdo con J. Chem. Soc., Chem. Commun. 156 (1988)), disuelta en 0,1 ml de dimetilformamida. Se agita durante 4 horas bajo N_{2} a 35ºC, se mezcla con 10 ml de etanol y el producto se aisla por centrifugación. La purificación tiene lugar por cromatografía en fase inversa en una columna de 1 x 25 cm con un gradiente de 50 mmol acetato de trietilamonio (pH 7)/acetonitrilo). Las fracciones reunidas se desalan en una columna Sephadex G-10. Por liofilización, se obtienen 5 mg del compuesto del título como un polvo blanco.

b) Complejo con cobre-64 del conjugado de 5'-(éster del ácido 6-mercapto-1-hexilfosfónico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y N-[4-hidroxi-3-(1,4,8,11-tetraaza-ciclotetradec-5-il)-bencil]-2-(6-vinil-piridin-2-ilmetoxi)-acetamida

1 mg del conjugado obtenido de acuerdo con 10a) se incuba en un 1 ml de tampón de fosfato (pH 8) con ^{64}CuCl_{2} (0,2 mCi). El rendimiento de trazador, determinado después de 1 hora por HPLC, es > 98%. El producto se aisla por liofilización.

Ejemplo 11 a) Conjugado de 5'-(éster del ácido 6-mercapto-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T* TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octano]-1,4,7,10-tetraacético

1 mg de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octano]-1,4,7,10-tetraacético (producido de acuerdo con J. Chem. Soc., Chem. Commun. 796, (1989)) se añade a una solución de 5 mg del oligonucleótido que contiene grupo tiol, producido de acuerdo con el Ejemplo 5a), en 2 ml de tampón de fosfato (pH 8) bajo N_{2}. Se agita durante 3 horas a 35ºC, se mezcla con 10 ml de alcohol isopropílico y el producto se aisla por centrifugación. La purificación tiene lugar por cromatografía en fase inversa en una columna de 1 x 25 cm con un gradiente de 25 mmol de acetato de trietilamonio (pH 7)/acetonitrilo). Las fracciones reunidas se concentran cuidadosamente por evaporación a vacío, se disuelven en un poco de agua y se desalan con ayuda de una columna Sephadex G-10. Por liofilización, se obtienen 4 mg del compuesto del título en forma de un polvo blanco.

b) Complejo con itrio-90 del conjugado de 5'-(éster del ácido 6-mercapto-1-hexil-fosfónico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-2-[(5-aza-8-male-imido-6-oxo)-octano]-1,4,7,10-tetraacético

Se mezcla acetato de ^{90}Y (1 mCi), disuelto en 1 ml de solución 0,05 M de acetato de amonio, con 1 mg del conjugado producido de acuerdo con el Ejemplo 11a) y se calienta durante 1 hora a 85ºC. El rendimiento de trazador, determinado por HPLC, es > 95%. El producto se aisla por liofilización.

Ejemplo 12 a) Conjugado de 5'-(éster del ácido 6-mercapto-1-hexil-fosfónico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T* TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y ácido 1,4,7-triazaciclononano-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octano]-1,4,7-triacético

1 mg de ácido 1,4,7,10-triazaciclononano-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octano]-1,4,7-triacético (producido de acuerdo con J. Chem. Soc., Chem. Commun. 794, (1989)) se añade a una solución de 5 mg del oligonucleótido que contiene grupo tiol, producido de acuerdo con el Ejemplo 5a), en 2 ml de tampón de fosfato (pH 8) bajo N_{2}. Se agita durante 6 horas a 35ºC, se mezcla con 10 ml de isopropanol y el producto se aisla por centrifugación. La purificación tiene lugar por cromatografía en fase inversa en una columna de 1 x 25 cm con un gradiente de 25 mmol de acetato de trietilamonio (pH 7)/acetonitrilo. Las fracciones reunidas se concentran cuidadosamente por evaporación a vacío, se disuelven en un poco de agua y se desalan con ayuda de una columna Sephadex G-10. Por liofilización, se obtienen 3 mg del compuesto del título como un polvo blanco.

b) Complejo con galio-67 del conjugado de 5'-(éster del ácido 6-mercapto-1-hexil-fosfónico) del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T*TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y ácido 1,4,7-triazaciclononano-2-[(5-aza-8-maleimido-6-oxo)-octano]-1,4,7-triacético

20 mg del conjugado producido de acuerdo con el Ejemplo 12a) se disuelven en 0,5 ml de tampón de citrato 0,1 M de pH 4,5 y se mezclan con 0,1 ml de una solución de citrato de galio-67 (0,2 mCi). Se deja en reposo durante 2 horas a la temperatura ambiente y el producto se desala en una columna Sephadex G-10. Después de liofilización, se obtienen 17 mg del compuesto del título como un polvo blanco.

Ejemplo 13 a) Fosfitilación de 5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)-5-(prop-2-en-1-ona)-2'-desoxiuridina

50 mg de 4-dimetilaminopiridina, 3 ml de diisopropil-etilamina y 962 \mul (4,31 mmol) de 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamidito se añaden sucesivamente a una solución agitada de 2,1 g (3,59 mmol) de 5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)-5-(prop-2-en-1-ona)-2'-desoxiuridina (producida de acuerdo con Nucleosides & Nucleotides 13, 939-944, (1994)) en 50 ml de tetrahidrofurano. Después de aproximadamente 30 min, se forma un precipitado blanco. Se filtra, se concentra la solución por evaporación a vacío y el residuo se reparte entre diclorometano y solución de bicarbonato de sodio al 5%. La fase de diclorometano se seca sobre sulfato de magnesio y se concentra por evaporación a vacío. El residuo se purifica por cromatografía rápida en gel de sílice, y se eluye con diclorometano/hexano/diisopropiletilamina (80:18:2). Se obtienen 1,8 g del compuesto deseado como una espuma blanca.

Análisis elemental:

Calc.:	C 64,28	H 6,29	N 7,14	P 3,95
Enc.:	C 64,02	H 6,60	N 7,21	P 4,09

b) Conjugado del oligonucleótido 36mero U^{*}T*T*T*T*TCUCAUGGAGCCAAGACGAAUAGCUACAUA-3' y 10-(4-aza-2-hidroxi-5-imino-8-mercapto-octano-1,4,7-tris(carboxi-metil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

U^{*}: 5-(prop-2-en-1-ona)-2'-desoxiuridina

Se produce el oligonucleótido 30mero identificado de acuerdo con el proceso SELEX con la modificación de una secuencia enlazada en 5' 5'-T*T*T*T*T de la manera usual en un sintetizador automático de la compañía Pharmacia (véase Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, compilador F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nueva York, Tokyo, 1991), y el oligonucleótido está presente también en la columna del vehículo sólido. Por reacción con solución de ácido tricloroacético en diclorometano, se abre el grupo 5'-hidroxi. La carga en la columna es aproximadamente 10 mg del oligonucleótido 35mero. El grupo 5'-hidroxi se hace reaccionar en presencia de tetrazol con el fosforamidito obtenido de acuerdo con el Ejemplo 13a). A continuación, el fosfito se convierte en el fosfotriéster por tratamiento con solución de yodo, y el radical DMT terminal se escinde por reacción con solución de ácido tricloroacético en diclorometano. Para la adición de un grupo tiol al sistema de carbonilo \alpha,\beta-insaturado presente en la 2'-desoxiuridina terminal, se hace reaccionar la misma con una solución de 10-(4-aza-2-hidroxi-5-imino-8-mercapto-octano)-1,4,7-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano*) en tetrahidrofurano y se lava sucesivamente con metanol y agua. Para separar el oligonucleótido modificado del vehículo sólido, se transfiere el contenido de la columna a un multivial, se mezcla con 5 ml de solución de amoníaco al 30%, se cierra herméticamente el recipiente y se agita mediante sacudidas durante una noche a 55ºC. Se enfría luego a 0ºC, se centrifuga, se lava el vehículo con 5 ml de agua y las fases acuosas reunidas se someten a liofilización.

Para purificación, el material sólido se recoge en 2 ml de agua, se mezcla con 2 ml de solución 0,5 M de acetato de amonio y se mezcla con 10 ml de etanol, se deja en reposo durante una noche a -20ºC, se centrifuga, se lava el residuo con 1 ml de etanol (-20ºC) y se seca finalmente a vacío a la temperatura ambiente.

Se obtienen 6 mg del compuesto del título como un polvo incoloro.

*) El 10-(4-aza-2-hidroxi-5-imino-8-mercapto-octano)-1,4,7-tris-(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano se obtiene como se describe a continuación:

Se añaden 15,7 ml de solución 1 N de hidróxido de sodio y 480 mg (3,49 mmol) de hidrocloruro de 2-iminotetrahidrotiofeno a una solución de 1,46 g (3,49 mmol) de 10-(3-amino-2-hidroxi-propil)-1,4,7-tris-(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano (véase Ejemplo 1c) en una mezcla de 50 ml de agua y 50 ml de metanol y se agita durante 3 horas a la temperatura ambiente, se concentra por evaporación a vacío hasta aproximadamente 1/4 del volumen inicial y se mezcla por agitación con un cambiador de aniones (IRA 410) hasta que se alcanza un pH de 11. Se filtra la solución y se mezcla con agitación en pequeñas porciones con cantidad suficiente del cambiador de cationes IRC 50 hasta que se alcanza un pH de 3,5. Después de filtrar, se liofiliza la solución. Se obtienen 1,39 g de la sustancia deseada como un polvo blanco que tiene un contenido de agua de 4,9%.

Análisis elemental (referido a la sustancia anhidra):

Calc.:	C 48,45	H 7,74	N 16,14	S 6,16
Enc.:	C 48,30	H 7,98	N 16,05	S 6,44

c) Complejo con itrio-90 del conjugado del oligonucleótido 36mero U^{*}T*T*T*T*TCUCAUGGAGCCAAGACGAAUA GCUACAUA-3' y 10-(4-aza-2-hidroxi-5-imino-8-mercapto-octano)-1,4,7-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

U^{*}: 5-(prop-2-en-1-ona)-2'-desoxiuridina

Se añade una solución de ^{90}itrio, disuelto en solución 0,05 M de acetato de amonio (aproximadamente 380 mCi), a 1 mg del tio-derivado del Ejemplo 13b) en 0,5 ml de solución 0,05 M de acetato de amonio de pH 6, se ajusta a pH 5,2 con ácido acético 3 M y se agita durante 1 hora a la temperatura ambiente. Se ajusta a pH 7,0 con solución 0,01 M de hidróxido de sodio y el conjugado se purifica por HPLC (TSK-400/tampón MES). Las fracciones principales se reúnen, se diluyen con solución fisiológica de sal común y se llevan a pH 7,2 con solución 0,01 M de hidróxido de sodio. Después de filtración, se obtiene una preparación adecuada para radioterapia.

Ejemplo 14 a) Éster metílico de S-(trifenilmetil-mercaptoacetil)-glicil-glicina

3,34 g (10 mmol) de ácido S-trifenilmetil-mercaptoacético y 1,83 g (10 mmol) de hidrocloruro del éster metílico de glicilglicina se suspenden en 250 ml de diclorometano absoluto. Después de añadir 1,01 g (10 mmol) de trietilamina, se añaden gota a gota 2,06 g (10 mmol) de diciclohexilcarbodiimida, disueltos en 50 ml de diclorometano absoluto enfriando con hielo. Se agita durante 1 hora a 0ºC y durante 18 horas a la temperatura ambiente. Se filtra, se concentra por evaporación y se cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: CH_{2}Cl_{2}/MeOH: 10%-30%).

Rendimiento: 3,56 g (77,0% de la teoría)), polvo blanco

Análisis elemental:

Calc.:	C 67,51	H 5,67	N 6,06	O 13,84	S 11,20
Enc.:	C 67,37	H 6,02	N 5,91		S 6,73

b) [S-(trifenilmetil-mercaptoacetil)-glicil-glicinamid-il]-6-hexanol

4,63 g (10 mmol) de éster metílico de S-(trifenil-metil-mercaptoacetil)-glicil-glicina, producido de acuerdo con el Ejemplo 14a), se calientan a 100ºC en 11,72 g (100 mmol) de 6-aminohexanol/50 ml de 1,4-dioxano en atmósfera de argón durante 2 horas. A continuación, la carga de reacción se vierte sobre una mezcla de 100 ml de diclorometano y 100 ml de agua. Con agitación y enfriamiento con hielo, se ajusta un pH de 6 con ácido clorhídrico 10 M, se separa la fase orgánica y se seca sobre sulfato de sodio. Después de evaporación del disolvente, el producto bruto se purifica sobre gel de sílice (eluyente: CH_{2}Cl_{2}/MeOH: 10%-50%).

Rendimiento: 2,97 g (54,2% de la teoría)), polvo blanco

Análisis elemental:

Calc.:	C 67,98	H 6,81	N 7,67	O 11,68	S 5,85
Enc.:	C 67,72	H 6,93	N 7,93		S 5,64

c) Diéster del ácido O-{[S-(trifenilmetil-mercapto-acetil)-glicil-glicinamidil]-6-hex-1-il}-diisopropil-amida-O'-metil-fosforoso

5,48 g (10 mmol) del [S-(trifenilmetil-mercapto-acetil)-glicil-glicinamidil]-6-hexanol producido de acuerdo con el Ejemplo 14b) se disuelven en 100 ml de diclorometano absoluto. Se añaden 5,17 g (40 mmol) de diisopropiletilamina en atmósfera de argón y se añaden gota a gota a 0ºC 3,95 g (20 mmol) de cloruro de diisopropilamida de éster monometílico de ácido fosforoso, disueltos en 50 ml de diclorometano absoluto. Se agita durante 0,5 horas a 0ºC y luego durante 2 horas a la temperatura ambiente. Para el tratamiento de acabado, se mezcla bajo enfriamiento en hielo con 320 mg (10 mmol) de metanol absoluto, y después de concentración, se cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: CH_{2}Cl_{2}/MeOH: 95%:5/5% trietilamina).

Rendimiento: 1,98 g (27,9% de la teoría)), aceite incoloro.

d) Éster del ácido 5'-[(mercaptoacetil-glicil-glicil-amidil)-6-hex-1-il]-fosfórico del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3'

Se produce un oligonucleótido 30mero, identificado de acuerdo con el proceso SELEX, con la modificación de una secuencia enlazada en 5'-T*T*T*T*T con ayuda de un sintetizador automático de la compañía Pharmacia (véase Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, compilador F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nueva York, Tokyo, (1991)), y el oligonucleótido está presente también en forma protegida en la columna del vehículo sólido. La carga en la columna es aproximadamente 15 mg de oligonucleótido 35mero. Después de escisión del grupo protector 5'-DMT (ácido tricloroacético/diclorometano), se acopla de acuerdo con los métodos estándar con el fosforamidito descrito en el Ejemplo 14c). Después de oxidación con yodo en tetrahidrofurano, el conjugado se escinde del vehículo. En este caso, el material se mezcla con 10 ml de solución de amoniaco al 30%, se cierra herméticamente el recipiente y se agita mediante sacudidas durante una noche a 55ºC. Se enfría a 0ºC, se centrifuga, se lava el vehículo con 10 ml de agua y las fases acuosas reunidas se someten a liofilización.

Para purificación, el material se recoge en 5 ml de agua, se mezcla con 4 ml de solución 0,5 M de acetato de amonio y se mezcla con 20 ml de etanol. Para completar la precipitación, se enfría durante una noche (-20ºC), se centrifuga, se lava el residuo con 1 ml de etanol (-20ºC) y se seca a vacío. Se obtienen 9 mg de un polvo blanco.

Para escisión de grupo protector S-tritilo, el material se recoge en 5 ml de solución 50 milimolar de acetato de trietilamonio (pH 7,0) y se incuba con 500 \mul de solución 0,1 M de nitrato de plata durante 30 minutos. A continuación, se añaden 500 \mul de solución 0,14 M de ditiotreitol y se incuba durante otros 30 minutos. Después de centrifugar, el sobrenadante claro se desala sobre Sephadex G-10. Las fracciones que contienen el producto se liofilizan. Se obtienen 4 mg del conjugado como un polvo blanco.

e) Complejo con tecnecio-99m del conjugado éster del ácido 5'-[(mercaptoacetil-glicil-glicil-amidil)-6-hex-1-il]-fosfórico del oligonucleótido 35 mero 5'-T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3'

1 mg del conjugado 14d) se disuelve en 1 ml de tampón 0,1 M de hidrogenofosfato disódico (pH = 9,5). Después de añadir 10 mg de tartrato disódico, se mezcla con solución de pertecnetato de sodio (1 mCi) y luego con 10 ml de solución de cloruro de estaño(II) (5 mg de SnCl_{2}/1 ml de HCl 0,01 M). El rendimiento de trazador (aproximadamente 93%) se determina por HPLC.

Ejemplo 15 a) O-Éster del ácido {[S-(trifenilmetil-mercaptoacetil)-glicil-glicinamidil]-6-hex-1-il}-toluenosulfónico

Se disuelven 5,48 g (10 mmol) del [S-(trifenilmetil-mercaptoacetil)-glicil-glicinamidil]-6-hexanol producido de acuerdo con el Ejemplo 14b) en 100 ml de diclorometano absoluto. Se añaden 1,01 g (10 mmol) de trietilamina y 1,91 g (10 mmol) de cloruro del ácido p-toluenosulfónico y se agita durante 24 horas a la temperatura ambiente. A continuación, se concentra y se cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: CH_{2}Cl_{2}/MeOH: 95:5).

Rendimiento: 4,32 g (61,5% de la teoría)), aceite incoloro.

Análisis elemental:

Calc.:	C 65,03	H 6,18	N 5,99	O 13,68	S 9,14
Enc.:	C 64,93	H 6,32	N 5,78		S 8,87

b) Éster del ácido 5'-[(mercaptoacetil-glicil-glicinamidil)-6-hex-1-il]-fosfórico del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3'

Se produce un oligonucleótido 30mero, identificado de acuerdo con el proceso SELEX, con la modificación de una secuencia en 5'-T*T*T*T*T con ayuda de un sintetizador automático de la compañía Pharmacia (véase Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, compilador F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nueva York, Tokyo, (1991)), y el oligonucleótido está presente también en forma protegida en la columna del vehículo sólido. La carga de la columna es aproximadamente 15 mg de oligonucleótido 35mero. Después de escisión del grupo protector 5'-DMT (ácido tricloroacético/diclorometano), se acopla de acuerdo con los métodos estándar con S-tritil-6-mercapto-hexil-fosforamidito. Después de oxidación con yodo en tetrahidrofurano, el compuesto protegido con tritilo se escinde del vehículo, se aisla y se purifica (véase Ejemplo 14d).

La escisión del grupo protector S-tritilo, el aislamiento del oligonucleótido que lleva el grupo SH y la purificación tienen lugar como se describe en el Ejemplo 14d) (6 mg).

Para el acoplamiento, el oligonucleótido 35mero que lleva el grupo SH (6 mg) en 500 \mul de solución 0,1 M de carbonato de sodio se mezcla en atmósfera de argón con 100 mg de éster del ácido toluenosulfónico 15a), disuelto en 500 \mul de dimetilformamida. Después de 30 minutos, se neutraliza y se diluye con agua hasta un volumen de 5 ml. Después de la centrifugación, el sobrenadante claro se liofiliza.

Para escisión de los grupos S-tritilo, el procedimiento se realiza como se ha descrito en 14d). Después de purificación, se obtienen 4 mg del conjugado.

c) Complejo con tecnecio-99m del conjugado éster del ácido 5'-[(mercaptoacetil-glicil-glicinamidil)-6-hex-1-il]-fosfórico del oligonucleótido 35mero 5'-T*T*T*T*TCUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3'

1 mg del conjugado descrito en el Ejemplo 15b) se disuelve en 1 ml de tampón 0,1 M de hidrogenofosfato disódico (pH = 9,5). Después de añadir 10 mg de tartrato disódico, se mezcla con solución de pertecnetato de sodio (1 mCi) y luego con 10 \mul de solución de cloruro de estaño(II) (5 mg de SnCl_{2}/1 ml de HCl 0,01 M). El rendimiento de trazador (aproximadamente 95%) se determina por HPLC.

Ejemplo 16 a) Éster metílico de N-[3-tia-5-(trifenilmetilmercapto)-1-oxo-pent-1-il]-S-trifenilmetil-cisteína

2,69 g (10 mmol) de éster metílico de N-[3-tia-5-(trifenilmetilmercapto)-1-oxo-pent-1-il]-S-trifenilmetil-cisteína (producción de acuerdo con el documento DE 43 10 999) se disuelven junto con 5,58 g (20 mmol) de cloruro de trifenilmetilo en 100 ml de diclorometano absoluto. Después de añadir 2,02 g (20 mmol) de trietilamina, se deja en agitación durante una noche en atmósfera de argón a la temperatura ambiente. Para el tratamiento de acabado, la fase orgánica se lava tres veces en cada caso con solución de ácido cítrico al 1%, solución saturada de bicarbonato de sodio y con agua. Después de secar sobre sulfato de sodio, se concentra por evaporación y se purifica sobre gel de sílice (eluyente: CH_{2}Cl_{2}/MeOH: 95:5).

Rendimiento: 4,53 g (60,1% de la teoría)) de aceite incoloro.

Análisis elemental:

Calc.:	C 73,27	H 5,75	N 1,86	O 6,37	S 12,76
Enc.:	C 73,31	H 5,48	N 1,63		S 12,49

b) N-[3-Tia-5-(trifenilmetilmercapto)-1-oxo-pent-1-il]-S-trifenilmetil-N'-(6-hidroxi-hex-1-il)cisteinamida

7,54 g (10 mmol) del éster metílico de N-[3-tia-5-(trifenilmetilmercapto)-1-oxo-pent-1-il]-S-cisteína descrito en el Ejemplo 16a) se calientan a 100ºC en 11,72 g (100 mmol) de 6-aminohexanol/50 ml de 1,4-dioxano en atmósfera de argón durante 2 horas. A continuación, la carga de reacción se vierte sobre una mezcla de 100 ml de diclorometano y 100 ml de agua. Con agitación y enfriamiento en hielo, se ajusta a un pH de 6 con ácido clorhídrico 10 M, se separa la fase orgánica y se seca sobre sulfato de sodio. Después de evaporación del disolvente, el producto bruto se purifica sobre gel de sílice (eluyente: CH_{2}Cl_{2}/MeOH: 5%-50%).

Análisis elemental:

Calc.:	C 72,99	H 6,49	N 3,34	O 5,72	S 11,46
Enc.:	C 72,73	H 6,62	N 3,11		S 11,17

c) Diéster del ácido O-{{[N-[3-tia-5-(trifenilmercapto)-1-oxo-pent-1-il]-S-trifenilmetilcisteinil}-2-amino-et-1-il}-diisopropilamida-O'-metilfosforoso

8,39 g (10 mmol) de la N-[3-tia-5-(trifenilmetil-mercapto)-1-oxo-pent-1-il]-S-trifenilmetil-N'-(6-hidroxi-hex-1-il)cisteinamida producida según el Ejemplo 16b), se disuelven en 200 ml de diclorometano absoluto. Se añaden 5,17 g (40 mmol) de diisopropiletilamina en atmósfera de argón y se añaden gota a gota a 0ºC 3,95 g (20 mmol) de cloruro de éster monometílico del ácido fosforoso-diisopropilamida, disueltos en 50 ml de diclorometano absoluto. Se agita durante 0,5 horas a 0ºC y luego durante 1,5 horas a la temperatura ambiente. Para el tratamiento de acabado, se mezcla, enfriando con hielo, con 320 mg (10 mmol) de metanol absoluto y, después de concentración, se somete a cromatografía sobre gel de sílice (eluyente: CH_{2}Cl_{2}/MeOH: 95:5/5% (trietilamina)).

Rendimiento: 5,37 g (53,7% de la teoría)) de aceite amarillento.

d) Éster del ácido 5'-[N-(3-tia-5-mercapto-1-oxo-pent-1-il]-cisteína-N'-(6-hidroxi-hex-1-il)-amida]-fosfórico del oligonucleótido 35 mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3'

Se produce un oligonucleótido 30mero, identificado de acuerdo con el proceso SELEX, con la modificación de una secuencia T*T*T*T*T-3' situada aguas arriba con ayuda de un sintetizador automático de la compañía Pharmacia (véase Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, compilador F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nueva York, Tokyo, (1991)), y el oligonucleótido está presente también en forma protegida en la columna del vehículo sólido. La carga en la columna es aproximadamente 15 mg de oligonucleótido 35mero. Después de escisión del grupo protector 5'-DMT (ácido tricloroacético/diclorometano), se acopla de acuerdo con los métodos estándar con fosforamidito (16c) y se oxida luego.

La escisión del vehículo de los grupos protectores básicos y la purificación del conjugado protegido con bis-S-tritilo tienen lugar como se describe en 14d) (aproximadamente 12 mg).

Para escisión de los grupos protectores S-tritilo, el material se recoge en 5 ml de solución 50 milimolar de acetato de trietilamonio (pH = 7,0) y se incuba con 500 \mul de solución 0,1 M de nitrato de plata durante 30 minutos. A continuación, se añaden 500 \mul de solución 0,14 M de ditiotreitol y se incuba durante otros 30 minutos. Después de centrifugar, el sobrenadante claro se desala sobre Sephadex G10. Las fracciones que contienen el producto se liofilizan. Se obtienen 5 mg de un polvo blanco.

e) Complejo con tecnecio-99M del conjugado éster del ácido 5'-[N-(3-tia-5-mercapto-1-oxo-pent-1-il]-cisteína-N'-(6-hidroxi-hex-1-il)-amida]-fosfórico del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUA CAUAT*T*T*T*T-3'

1 mg del conjugado descrito en el Ejemplo 16d) se disuelve en 1 ml de tampón 0,1 M de hidrogenofosfato disódico (pH = 9,5). Después de añadir 10 mg de tartrato disódico, se mezcla con solución de pertecnetato de sodio (1 mCi) y luego con 10 ml de solución de cloruro de estaño(II) (5 mg de SnCl_{2}/1 ml de HCl 0,01 M). El rendimiento de trazador (aproximadamente 96%) se determina por HPLC.

Ejemplo 17 a) Éster del ácido O-{N-[3-tia-5-(trifenilmetilmercapto)-1-oxo-pent-1-il]-S-trifenilmetil-N'-(6-hidroxi-hex-1-il)-cistein-imidil}-p-toluenosulfónico

8,39 g (10 mmol) de la N-[3-tia-5-(trifenilmetil-mercapto)-1-oxo-pent-1-il]-S-trifenilmetil-N'-(6-hidroxi-hex-1-il)cisteinamida, producida en el Ejemplo 16b, se disuelven en 200 ml de diclorometano absoluto. Se añaden 1,01 g (10 mmol) de trietilamina y 1,91 g (10 mmol) de cloruro del ácido p-toluenosulfónico, y se agita durante 20 horas a la temperatura ambiente. A continuación, se concentra y se somete a cromatografía sobre gel de sílice. (Eluyente: CH_{2}Cl_{2}/MeOH: 97:3).

Rendimiento: 6,44 g (67,0% de la teoría)) de un aceite amarillento.

Análisis elemental:

Calc.:	C 72,47	H 6,29	N 2,91	O 8,32	S 10,01
Enc.:	C 72,19	H 6,47	N 2,68		S 9,83

b) Éster del ácido 5'-[(mercaptoacetil-glicil-glicinamidil)-13-tridec-7-tio-1-il]-fosfórico del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3'

Se produce un oligonucleótido 30mero, identificado de acuerdo con el proceso SELEX, con la modificación de una secuencia T*T*T*T*T-3' situada aguas arriba con ayuda de un sintetizador automático de la compañía Pharmacia (véase Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, compilador F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nueva York, Tokyo, (1991)), y el oligonucleótido está presente también en forma protegida en la columna del vehículo sólido. La carga en la columna es aproximadamente 15 mg de oligonucleótido 35mero. Después de escisión del grupo protector 5'-DMT (ácido tricloroacético/diclorometano) se acopla de acuerdo con los métodos estándar con S-tritil-6-mercaptohexil-fosforamidito.

Después de oxidación con yodo en tetrahidrofurano, el compuesto protegido con tritilo se escinde del vehículo, se aisla y se purifica (véase Ejemplo 14d).

La escisión del grupo protector S-tritilo, el aislamiento del oligonucleótido que lleva el grupo SH y la purificación tienen lugar como se describe en el Ejemplo 14d) (7,5 mg).

Para el acoplamiento, se mezcla el oligonucleótido 30mero que lleva el grupo SH (7 mg) en 550 \mul de solución 0,1 M de carbonato de sodio en atmósfera de argón con 180 mg de éster del ácido toluenosulfónico 17a), disuelto en 500 \mul de dimetilformamida. Después de 30 minutos, se neutraliza y se diluye con agua hasta un volumen de 5 ml. Después de la centrifugación, se liofiliza el sobrenadante claro. Para escisión de los grupos S-tritilo, el procedimiento se realiza como se describe en 14d). Después de purificación, se obtienen 4,3 mg de conjugado.

c) Complejo con tecnecio-99m del conjugado éster del ácido 5'-[(mercaptoacetil-glicil-glicinamidil)-13-trideca-7-tio-1-il]-fosfórico del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3'

1 mg del conjugado descrito en el Ejemplo 17b) se disuelve en 1 ml de tampón 0,1 M de hidrogenofosfato disódico (pH = 9,5). Después de añadir 10 mg de tartrato disódico, se mezcla con solución de tecnetato de sodio (1 mCi) y luego con 10 \mul de solución de cloruro de estaño(II) (5 mg de SnCl_{2}/1 ml de HCl 0,01 M). El rendimiento de trazador (aproximadamente 93%) se determina por HPLC.

Ejemplo 18 a) Conjugado de 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCG CAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' y monoamida del ácido N-(tetrahidro-2-oxo-tiofen-3-il)-tiodiglicólico

Se produce un oligonucleótido 30mero, identificado de acuerdo con el proceso SELEX, con la modificación de una secuencia T*T*T*T*T-3' situada aguas arriba con ayuda de un sintetizador automático de la compañía Pharmacia (véase Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, compilador F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nueva York, Tokyo, (1991)), y el oligonucleótido está presente también en forma protegida en la columna del vehículo sólido. La carga en la columna es aproximadamente 15 mg de oligonucleótido 35mero. Después de escisión del grupo protector 5'-DMT (ácido tricloroacético/diclorometano), se acopla de acuerdo con los métodos estándar con N-trifluoroacetilaminohexilfosforamidito.

Después de oxidación con yodo en tetrahidrofurano, el oligonucleótido que lleva el grupo amino se escinde del vehículo y se aisla y purifica como se describe en 1b) (9,3 mg).

Para acoplamiento con la monoamida del ácido N-(tetrahidro-2-oxo-tiofen-3-il)-tiodiglicólico (documento DE 43 11 023), se disuelven 5 mg del oligonucleótido que lleva el grupo amino en 1 ml de solución 2 M de carbonato de sodio. Después de añadir 100 mg del derivado tiolactona, se incuba durante 4 horas a la temperatura ambiente. A continuación, se neutraliza y se realiza el desalado por ultrafiltración a través de una membrana con un límite de exclusión de 3.000 (Amicon YM3). Después de liofilización, se liofiliza una vez más. Se obtienen 6,3 mg del conjugado deseado.

b) Complejo con tecnecio-99m del conjugado 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' y monoamida del ácido N-(tetrahidro-2-oxo-tiofen-3-il)-tiodiglicólico

1 mg del conjugado que lleva el grupo SH descrito en el Ejemplo 18a) se disuelve en 1 ml de tampón 0,1 M de hidrogenofosfato disódico (pH = 9,5). Después de añadir 10 mg de tartrato disódico, se mezcla con solución de pertecnetato de sodio (1 mCi) y luego con 10 \mul de solución de cloruro de estaño(II) (5 mg de SnCl_{2}/1 ml de HCl 0,01 M). El rendimiento de trazador (94%) se determina por HPLC.

Ejemplo 19 a) 5'-(Éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 32mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGAC GAAUAGCUACAUAT-^{3'-3'}T-5'

El oligonucleótido 30mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3', identificado de acuerdo con el proceso SELEX, con la modificación de una secuencia de timidina-T^{3'-3'}T-5', situada aguas arriba, que está unida por la posición 5' al vehículo, se produce de la manera usual en un sintetizador automático de la compañía Pharmacia (véase Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, compilador F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nueva York, Tokyo, (1991)), y el oligonucleótido está presente también en la columna del vehículo sólido. Por reacción con solución de ácido tricloroacético en diclorometano, se abre el grupo 5'-hidroxi. La carga en la columna es aproximadamente 10 mg del oligonucleótido 32mero. Para unir el enlazador, la columna se hace reaccionar con una solución en acetonitrilo de 50 \mumol de \beta-cianoetil-N,N-diisopropilamino-6-(trifluoroacetamido)-1-hexil-fosforamidito (producido de acuerdo con Nucl. Acids Res. 16, 2659-2669 (1988)) en presencia de tetrazol. La oxidación del fosfito formado al fosfotriéster completamente protegido tiene lugar con yodo en tetrahidrofurano. A continuación, la columna se lava sucesivamente con metanol y agua. Para separar el oligonucleótido modificado del vehículo sólido, el contenido de la columna se transfiere a un multivial, se mezcla con 5 ml de solución de amoniaco al 30%, se cierra herméticamente el recipiente y se agita mediante sacudidas durante una noche a 55ºC. Se enfría luego a 0ºC, se centrifuga, se lava el vehículo con 5 ml de agua y las fases acuosas reunidas se someten a liofilización.

Para la purificación, el material sólido se recoge en 2 ml de agua, se mezcla con 2 ml de solución 0,5 M de acetato de amonio y se mezcla con 10 ml de etanol, se deja en reposo durante una noche a -20ºC, se centrifuga, se lava el residuo con 1 ml de etanol (-20ºC) y finalmente se seca a vacío a la temperatura ambiente.

Se obtienen 8 mg del compuesto del título como un polvo incoloro.

b) Conjugado de 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 32mero 5'-CUCAUGGAGCG CAAGACGAAUAGCUACAUAT-^{3'-3'}T-5' y 10-[7-(4-isotiocianatofenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboximetil)-4-azaheptil]-1,4,7-tris-(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

8 mg del oligonucleótido obtenido en el Ejemplo 19a) se disuelven en 2,5 ml de un tampón NaHCO_{3}/Na_{2}CO_{3} (pH =
8,0) y se mezclan con 1 mg de 10-[7-(4-isotiocianatofenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboximetil)-4-aza-heptil]-1,4,7-tris-(carboximetil)-1,4,7,10-tetraaza-ciclododecano (compuesto del título del Ejemplo 1f). Se agita durante 5 horas a la temperatura ambiente, se ajusta el pH a 7,2 por adición de ácido clorhídrico 0,01 M y la solución se somete a ultrafiltración a través de una membrana con el límite de exclusión 3.000 (Amicon YM3) seguido por liofilización. Se obtienen 7 mg del conjugado deseado.

c) Complejo con ^{111}indio del conjugado de 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 32mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT-^{3'-3'}T-5' y 10-[7-(4-isotiocianatofenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboxi-metil)-4-azaheptil]-1,4,7-tris-(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

Se añaden 15 \mul de una solución de acetato de ^{111}indio(III) (350 \muCi), (producida a partir de cloruro de ^{111}indio(III) en solución 2 M de acetato de sodio y ajuste del pH a 4,0 con ácido clorhídrico 0,1 M) a 135 \mul de una solución de 1 mg del compuesto del título del Ejemplo 19b) en tampón MES, pH 6,2 (MES = ácido 2-(N-morfolino)etilsulfónico). El pH se lleva a 4,2 por adición de ácido clorhídrico 0,01 M. Se agita durante 1 hora a 37ºC a pH 4,2. Se lleva a pH 6 con solución 2 M de acetato de sodio y se añaden 10 \mul de una solución 0,1 M de Na_{2}EDTA (Na_{2}EDTA = sal disódica del ácido etilenodiaminatetraacético) para complejar el exceso de ^{111}indio. La purificación final del conjugado marcado así obtenido (1 h) tiene lugar por HPLC (cromatografía de exclusión: TSK-400/tampón MES). Las fracciones que contienen el conjugado marcado se diluyen con solución fisiológica de sal común, se ajusta a pH 7,2 con solución 0,01 M de hidróxido de sodio y se filtra. Una solución así preparada representa entonces una preparación adecuada para radiodiagnóstico.

Ejemplo 20 a) 5'-(Éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-T***T***T***T***TAGG AGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3'

Se produce el oligonucleótido 30mero 5'-TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' (seq.no. 13 de la Patente U.S. No. 5.270.163), identificado de acuerdo con el proceso SELEX, de la manera usual en un sintetizador automático de la compañía Pharmacia (véase Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, compilador F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nueva York, Tokyo, (1991)), y el oligonucleótido está presente también en la columna del vehículo sólido. Las cuatro timidinas finales se fijan por fosforoditioatos a la timidina presente en el extremo 5' de acuerdo con la técnica descrita por G. Blaton et al. en "Oligonucleotides and Analogues", pp. 109-135. Para este propósito, se abre primeramente el grupo 5'-hidroxi por tratamiento con ácido tricloroacético. A continuación, el grupo 3'-hidroxi de una 5'-DMTO-tiridina se convierte con tris-pirrolidinofosfina y tetrazol en el diamidito, que se convierte en el fosforotioamidito por adición de 2,4-diclorobencil-mercaptano. Este compuesto se activa con tetrazol y se hace reaccionar con el grupo 5'-hidroxi del oligonucleótido a tiofosfatotriéster. La oxidación a fosforoditioato tiene lugar con azufre elemental en una solución de disulfuro de carbono, piridina y trietilamina 95:95:10. Los grupos bencilo no se eliminan todavía. De manera análoga, se fijan también 3 timidinas adicionales. La carga en la columna es aproximadamente 10 mg del oligonucleótido 35mero. A continuación, se abre de nuevo un grupo 5'-hidroxi.

Para unir el enlazador, la columna se hace reaccionar con una solución en acetonitrilo de 50 \mumol de 2-cianoetil-N,N'-diisopropilamino-6-(trifluoroacetamido)-1-hexil-fosforamidito (lit. en el ejemplo en presencia de tetrazol. La oxidación del fosfito formado al fosfotriéster tiene lugar con yodo en tetrahidrofurano. A continuación, la columna se lava sucesivamente con metanol y agua. Después de ello, los grupos protectores de los enlaces ditionato se eliminan por una solución de tiofenol/trietilamina/dioxano 1:2:2, lo que tiene lugar en 2 horas. Después de ello, la columna se lava en cada caso con 3 veces su volumen de metanol, se lava luego con éter y se seca. Para separar el oligonucleótido modificado del vehículo sólido, el contenido de la columna se transfiere a un multivial, se mezcla con 5 ml de solución de amoniaco al 30%, se cierra herméticamente el recipiente y se agita mediante sacudidas durante una noche a 55ºC. Se enfría luego a 0ºC, se centrifuga, se lava luego el vehículo con 5 ml de agua y las fases acuosas reunidas se someten a liofilización.

Para la purificación, el material sólido se recoge en 2 ml de agua, se mezcla con 2 ml de solución 0,5 M de acetato de amonio y se mezcla con 10 ml de etanol, se deja en reposo durante una noche a -20ºC, se centrifuga, se lava el residuo con 1 ml de etanol (-20ºC), y finalmente se seca a vacío a la temperatura ambiente.

Se obtienen 8 mg del compuesto del título como un polvo incoloro.

b) Conjugado de 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-T***T*** T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y 10-[7-(4-isotiocianato-fenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboxi-metil)-4-aza-heptil]-1,4,7-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

Se disuelven 8 mg del oligonucleótido obtenido en el Ejemplo 20a) en 2,5 ml de un tampón NaHCO_{3}/Na_{2}CO_{3} (pH 8,0) y se mezclan con 1 mg de 10-[7-(4-isotiocianatofenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboximetil)-4-aza-heptil]-1,4,7-tris-(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano (compuesto del título del Ejemplo 1f). Se agita durante 5 horas a la temperatura ambiente, se ajusta el pH a 7,2 por adición de ácido clorhídrico 0,01 M y la solución se somete a ultrafiltración a través de una membrana con el límite de exclusión 3.000 (Amicon YM3) seguido por liofilización.

Se obtienen 7 mg del conjugado deseado.

c) Complejo con indio^{111} del conjugado 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-T***T***T***T***TAGGAGGAGGAGGGAGAGCGCAAAUGAGAUU-3' y 10-[7-(4-isotiocianatofenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboxi-metil)-4-aza-heptil]-1,4,7-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

Se añaden 15 \mul de una solución de acetato de ^{111}indio(III) (350 \muCi), (producida a partir de cloruro de ^{111}indio(III) en solución 2 M de acetato de sodio y ajuste del pH a 4,0 con ácido clorhídrico 0,1 M) a 135 \mul de una solución de 1 mg del compuesto del título del Ejemplo 20b) en tampón MES, pH 6,2 (MES = ácido 2-(N-morfolino)etilsulfónico). El pH se lleva a 4,2 por adición de ácido clorhídrico 0,01 M. Se agita durante 1 hora a 37ºC a pH 4,2. Se lleva a pH 6 con solución 2M de acetato de sodio y se añaden 10 \mul de una solución 0,1 M de Na_{2}EDTA = sal disódica del ácido etilenodiamina-tetraacético, para complejar el exceso de ^{111}indio. La purificación final del conjugado así obtenido (1 h) tiene lugar por HPLC (cromatografía de exclusión: TSK-400/tampón MES). Las fracciones que contienen el conjugado marcado se diluyen con solución fisiológica de sal común, se ajustan a pH 7,2 con solución 0,01 M de hidróxido de sodio y se filtran. Una solución así producida representa entonces una preparación adecuada para radiodiagnóstico.

Ejemplo 21 a) 5'(Éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAG CUACAUAT**T**T**T**T-3'

Se obtiene el oligonucleótido 30mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3', identificado de acuerdo con el proceso SELEX, con la modificación de una secuencia T**T**T**T**T-3' situada aguas arriba, primeramente por una secuencia de 5 timidinas conectada por grupos cianoetilfosfato que se producen en el vehículo por 3'. Por reacción de este compuesto con una solución 0,5 M de disulfuro de tetraetiltiuram en acetonitrilo, la sulfonación al fosfonotioato tiene lugar en el transcurso de 15 minutos que, posteriormente, con el grupo 5'-hidroxilo libre es el material de partida para el oligonucleótido 35mero. La síntesis total tiene lugar de la manera usual en un sintetizador automático de la compañía Pharmacia (véase Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, compilador F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nueva York, Tokyo, (1991)), y el oligonucleótido está presente todavía en la columna del vehículo sólido. Por reacción con solución de ácido tricloroacético en diclorometano, se abre el grupo 5'-hidroxi. La carga en la columna es aproximadamente 10 mg del oligonucleótido 35mero. Para unir el enlazador, la columna se hace reaccionar con una solución en acetonitrilo de 50 \mumol de \beta-cianoetil-N,N-diisopropilamino-6-(trifluoroacetamido)-1-hexilfosforamidito (producido de acuerdo con Nucl. Acids Res. 16, 2659-2669 (1988)) en presencia de tetrazol. La oxidación del fosfito formado de este modo para dar el fosfotriéster totalmente protegido tiene lugar con yodo en tetrahidrofurano. A continuación, la columna se lava sucesivamente con metanol y agua. Para separar el oligonucleótido modificado del vehículo sólido y escindir los grupos cianoetilo, el contenido de la columna se transfiere a un multivial, se mezcla con 5 ml de solución de amoniaco al 30%, se cierra herméticamente el recipiente y se agita mediante sacudidas durante una noche a 55ºC. Se enfría luego a 0ºC, se centrifuga, se lava el vehículo con 5 ml de agua y las fases acuosas reunidas se someten a liofilización.

Se obtienen 8 mg del compuesto del título como polvo incoloro.

b) Conjugado de 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCG CAAGACGAAUAGCUACAUAT**T**T**T**T-3' y 10-[7-(4-isotiocianatofenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboxi-metil)-4-aza-heptil]-1,4,7-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

8 mg del oligonucleótido obtenido en el ejemplo 20a) se disuelven en 2,5 ml de un tampón NaHCO_{3}/Na_{2}CO_{3} (pH 8,0) y se mezclan con 1 mg de 10-[7-(4-isotiocianatofenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboximetil)-4-aza-heptil]-1,4,7-tris-(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano (compuesto del título del Ejemplo 1f). Se agita durante 5 horas a la temperatura ambiente, se ajusta el pH a 7,2 por adición de ácido clorhídrico 0,01 M y la solución se somete a ultrafiltración a través de una membrana con el límite de exclusión 3.000 (Amicon YM3) seguido por liofilización.

Se obtienen 7 mg del conjugado deseado.

c) Complejo con ^{111}indio del conjugado 5'-(éster del ácido 6-amino-1-hexil-fosfórico) del oligonucleótido 35mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT**T**T**T**T-3' y 10-[7-(4-isotiocianatofenil)-2-hidroxi-5-oxo-7-(carboxi-metil)-4-aza-heptil]-1,4,7-tris(carboximetil)-1,4,7,10-tetraazaciclododecano

15 \mul de una solución de acetato de ^{111}indio(III) (350 \muCi), (producida a partir de cloruro de ^{111}indio(III) en solución 2 M de acetato de sodio y ajuste del pH a 4,0 con ácido clorhídrico 0,1 M) se añaden a 135 \mul de una solución de 1 mg del compuesto del título del Ejemplo 21b) en tampón MES, pH 6,2 (MES = ácido 2-(N-morfolino)etilsulfónico). El pH se lleva a 4,2 por adición de ácido clorhídrico 0,01 M. Se agita durante 1 hora a 37ºC a pH 4,2. Se lleva a pH 6 con solución 2 M de acetato de sodio y se añaden 10 \mul de una solución 0,1 M de Na_{2}EDTA = sal disódica del ácido etilenodiamina-tetraacético para complejar el exceso de ^{111}indio. La purificación final del conjugado así obtenido (1 h) tiene lugar por HPLC (cromatografía de exclusión: TSK-400/tampón MES). Las fracciones que contienen el conjugado marcado se diluyen con solución fisiológica de sal común, se ajustan a pH 7,2 con solución 0,01 M de hidróxido de sodio y se filtran. Una solución así producida representa entonces una preparación adecuada para radiodiagnóstico.

Ejemplo 22 a) Éster metílico de N-(5-mercapto-3-tia-1-oxo-pent-1-il)-glicina

12,56 g (0,1 mol) de hidrocloruro del éster metílico de glicina, 13,42 g (0,1 mol) de 2,5-ditia-ciclohexanona y 10,12 g (0,1 mol) de trietilamina se disuelven en atmósfera de argón en 500 ml de diclorometano absoluto. Se agita durante 24 horas a la temperatura ambiente, y la carga se vierte luego sobre 250 ml de ácido cítrico acuoso al 5%. Se agita bien, se separa la fase orgánica y se seca sobre sulfato de sodio. Después de evaporación del disolvente a vacío, el residuo aceitoso se cromatografía sobre gel de sílice (disolvente móvil: diclorometano/metanol, metanol 0-10%).

Rendimiento: 18,9 g (84,6%), aceite incoloro.

Análisis elemental:

Calc.:	C 37,65	H 5,87	N 6,27	O 21,49	S 28,71
Enc.:	C 37,43	H 6,02	N 6,12		S 28,48

b) Éster metílico de N-[5-(trifenilmetilmercapto)-3-tia-1-oxo-pent-1-il]-glicina

11,17 g (50 mmol) de éster metílico de N-(5-mercapto-3-tia-1-oxo-pent-1-il)-glicina (Ejemplo 22a), 13,94 g (50 mmol) de cloruro de trifenilmetilo y 5,06 g (50 mmol) de trietilamina se disuelven en atmósfera de argón en 500 ml de diclorometano absoluto. Se agita durante 16 horas a la temperatura ambiente y la carga se vierte luego sobre 150 ml de ácido cítrico acuoso al 5%. Se agita bien, se separa la fase orgánica y se seca sobre sulfato de sodio. Después de evaporación del disolvente a vacío, el residuo aceitoso se somete a cromatografía sobre gel de sílice (disolvente móvil: diclorometano/metanol, 95:5).

Rendimiento: 15,7 g (67,4%), aceite incoloro.

Análisis elemental:

Calc.:	C 67,07	H 5,85	N 3,01	O 10,31	S 13,77
Enc.:	C 67,01	H 6,11	N 2,93		S 13,49

c) N-[5-(Trifenilmetilmercapto)-3-tia-1-oxo-pent-1-il]-glicina-N'-(6-hidroxihexil)-amina

11,64 g (25 mmol) de éster metílico de N-[5-(trifenilmetilmercapto)-3-tia-1-oxo-pent-1-il]-glicina (Ejemplo 22b) y 29,3 g (250 mmol) de 6-aminohexanol se funden juntos en atmósfera de argón durante 16 horas a 100ºC. Después de enfriar la carga de reacción, se recoge la misma en 500 ml de diclorometano y se vierte sobre 250 ml de ácido cítrico acuoso al 5%. Bajo enfriamiento con hielo y agitación, se ajusta a un pH de 6,5 con ácido clorhídrico concentrado. La fase orgánica se separa y se seca sobre sulfato de sodio. Después de evaporación del disolvente a vacío, el residuo aceitoso se somete a cromatografía sobre gel de sílice (disolvente móvil: diclorometano/metanol, 0-10% metanol).

Rendimiento: 7,7 g (56,0%), aceite incoloro.

Análisis elemental:

Calc.:	C 67,60	H 6,96	N 5,09	O 8,72	S 11,64
Enc.:	C 67,48	H 7,03	N 4,92		S 11,43

d) Amida del ácido N-diisopropil-O-cianoetil-0'-[7,10-diaza-8,11-dioxo-13-tia-15-(trifenilmetilmercapto)-pentadec-1-il]-fosforoso

5,51 g (10 mmol) de N-[5-(trifenilmetilmercapto)-3-tia-1-oxo-pent-1-il]-glicina-N'-(6-hidroxihexil)-amida (Ejemplo 22c) se disuelven en 50 ml de diclorometano absoluto y 50 ml de piridina absoluta. Se añaden gota a gota a la carga 4,73 g (20 mmol) de cloruro del ácido diisopropilamino-O-cianoetil-fosforoso, disueltos en 50 ml de diclorometano absoluto, a la temperatura ambiente. Después de 4 horas, se vierte sobre 250 ml de solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio, se agita y la fase orgánica se seca sobre sulfato de magnesio. Después de evaporación del disolvente, el residuo aceitoso se cromatografía sobre gel de sílice (diclorometano/etanol/trietilamina 98:1:1).

Rendimiento: 4,32 g (57,5%), aceite espumoso incoloro.

Análisis elemental:

Calc.:	C 63,97	H 7,38	N 7,46	O 8,52	P 4,12	S 8,54
Enc.:	C 63,81	H 7,41	N 7,22		P 3,97	S 8,31

e) 5'-[Éster del ácido N-(3'-aza-8'-mercapto-1',4'-dioxo-6'-tia-oct-1'-il)-6-aminohexil-fosfórico] de 5'-CUCAU GGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'

Se produce un oligonucleótido 30mero 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUA-3', identificado de acuerdo con el proceso SELEX, con la modificación de una secuencia T*T*T*T*T*-3' situada aguas arriba, con ayuda de un sintetizador automático de la compañía Pharmacia (véase Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, compilador F. Eckstein, Oxford University Press, Oxford, Nueva York, Tokyo, 1931), y el oligonucleótido en forma protegida está presente todavía en la columna del vehículo sólido. La carga en la columna es aproximadamente 15 mg del oligonucleótido 35mero. Después de escisión del grupo protector 5'-DMT, se acopla de acuerdo con los métodos estándar con el fosforamidito descrito en el ejemplo 22d. Después de oxidación con yodo en tetrahidrofurano, el conjugado se escinde del vehículo. Para este propósito, el material se mezcla con 10 ml de solución de amoniaco al 30% y se agita luego mediante sacudidas durante una noche a 55ºC. Se enfría a 0ºC, se centrifuga, se lava el vehículo con 10 ml de agua y las fases acuosas reunidas se someten a liofilización. Para la purificación, el material se recoge en 5 ml de agua, se añaden 4 ml de acetato de amonio 0,5 mol y se mezcla con 20 ml de etanol. Para completar la precipitación, se enfría durante una noche (-20ºC), se centrifuga, se lava el residuo con 1 ml de etanol (-20ºC) y se seca a vacío. Se obtienen 9,5 mg de un polvo blanco. Para escisión del grupo protector S-tritilo, el material se recoge en 5 ml de solución 50 milimolar de acetato de trietilamonio (pH = 7) y se incuba con 500 \mul de solución 0,1 M de nitrato de plata durante 30 minutos. A continuación, se añaden 500 \mul de solución 0,14 M de ditiotreitol y se incuba durante otros 30 minutos. Después de centrifugar, el sobrenadante claro se desala sobre Sephadex G10. Las fracciones que contienen el producto se liofilizan. Se obtienen 3,5 mg de un polvo blanco.

f) Complejo con Tc-99m de 5'-[éster del ácido N-(3'aza-8'-mercapto-1',4'-dioxo-6'-tia-oct-1'-il)-6-aminohexil-fosfórico] de 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'

1 mg del conjugado descrito en el Ejemplo 22e) se disuelve en 1 ml de tampón 0,1 M de hidrogenofosfato disódico (pH = 8,5). Después de añadir 10 mg de tartrato disódico, se mezcla con solución de pertecnetato de sodio (1 mCi) y luego con 10 \mul de solución de cloruro de estaño(II) (5 mg/1 ml de HCl 0,01 M). El rendimiento de trazador (aproximadamente 95%) se determina por HPLC.

Ejemplo 23 a) 5'-[Éster del ácido N-[6'-aza-7'-hidroxicarboxi-9'-mercapto-1',5'-dioxo-3'-tia-non-1'-il)-6-aminohexilfosfórico] de 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'

Se produce primeramente una solución del éster de N-hidroxisuccinimida de la monoamida del ácido N-(2-oxo-tetrahidrotiofen-3-il)-tiodiglicólico (documento DE 43 11 023) en 500 \mul de DMF absoluta. Para este propósito, 24,9 mg (0,1 mmol) de monoamida del ácido N-(2-oxo-tetrahidrotiofen-3-il)-tiodiglicólico y 11,5 mg (0,1 mmol) de N-hidroxisuccinimida se disuelven en 500 \mul de DMF absoluta. A 0ºC, se añaden a la carga 19,2 mg (0,1 mmol) de EDC. Se agita durante 30 minutos a 0ºC.

10 mg del 5'-(éster del ácido 6-amino-hexilfosfórico) de 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*
T*T*T*T*-3' producido en el Ejemplo 1 se disuelven en 1 ml de un tampón bicarbonato de sodio/carbonato de sodio (pH = 8,0). Se añade la solución en DMF del éster de NHS preparado previamente y se incuba durante 16 horas a la temperatura ambiente en atmósfera de argón. A continuación, se centrifuga, se concentra a un volumen de 500 \mul y se somete a cromatografía sobre Sephadex G-25. Después de liofilización, se obtienen 2 mg del conjugado como un polvo blanco.

b) Complejo con Tc-99m de 5'-[éster del ácido N-(6'-aza-7'-hidroxi-9'-mercapto-1',5'-dioxo-3'-tia-non-1'-il)-6-aminohexil-fosfórico] de 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'

1 mg del conjugado descrito en el Ejemplo 23a) se disuelve en 1 ml de tampón de hidrogenofosfato disódico 0,1 M. Después de añadir 10 mg de tartrato disódico, se mezcla con solución de pertecnetato de sodio (1 mCi) y luego con 10 \mul de solución de cloruro de estaño(II) (5 mg/1 ml de HCl 0,01 M). El rendimiento de trazador se determina por HPLC (aproximadamente 92%).

Ejemplo 24 a) 5'-[Éster del ácido N-(mercaptoacetil)-6-aminohexilfosfórico] de 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACA UAT*T*T*T*T*-3'

10 mg del 5'-(éster del ácido 6-amino-hexil-fosfórico) de 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T-3' producido de acuerdo con el Ejemplo 1 se disuelven en 1 ml de un tampón de bicarbonato de sodio/carbonato de sodio (pH = 8,0). A continuación, se añaden a la carga 23,1 mg (0,1 mmol) de éster de NHS del ácido S-acetilmercaptoacético, disueltos en 500 \mul de DMF absoluta, y se incuba durante 17 horas a la temperatura ambiente en atmósfera de argón. A continuación, se centrifuga, se concentra a un volumen de 500 \mul y se somete a cromatografía sobre Sephadex G-25. Después de liofilización, se obtienen 3 mg del conjugado como un polvo blanco.

b) Complejo con Tc-99m de 5'-[éster del ácido N-(mercaptoacetil)-6-aminohexil-fosfórico] de 5'-CUCAU GGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'

1 mg del conjugado descrito en el Ejemplo 24a) se disuelve en 1 ml de tampón 0,1 M de hidrogenofosfato disódico (pH = 8,5). Después de añadir 10 mg de tartrato disódico, se mezcla con solución de pertecnetato de sodio (1 mCi) y luego con 10 \mul de solución de cloruro de estaño(II) (5 mg/1 ml de HCl 0,01 M). El rendimiento de trazador (aproximadamente 97%) se determina por HPLC.

Ejemplo 25 a) Monoamida del ácido N-[2-(trifenilmetilmercapto)-et-1-il]-tiodiglicólico

31,9 g (0,1 mol) de 2-(trifenilmetilmercapto)-etilamina y 10,1 g (0,1 mol) de trietilamina se introducen en 500 ml de diclorometano absoluto. A 0ºC, se añade gota a gota una solución de 13,2 g (0,1 mol) de anhídrido del ácido tiodiglicólico, se agita durante 1 hora a 0ºC y durante 16 horas a la temperatura ambiente. A continuación, se vierte sobre 250 ml de ácido cítrico acuoso al 5%, se agita bien, se separa la fase orgánica y se seca sobre sulfato de sodio. Después de evaporación del disolvente a vacío, el residuo se somete a cromatografía sobre gel de sílice (disolvente móvil: diclorometano/metanol, 0-20% metanol).

Rendimiento: 20,32 g (45,0%), aceite incoloro.

Análisis elemental:

Calc.:	C 66,49	H 5,58	N 3,10	O 10,63	S 14,20
Enc.:	C 66,21	H 5,73	N 2,98		S 14,02

b) 5'-[Éster del ácido N-(1',5'-dioxo-6'-aza-3'-tia-8'-mercapto-oct-1-il)-aminohexilfosfórico] de 5'-CUCAUGG AGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'

Primeramente, se produce el éster de NHS de la monoamida del ácido N-[2-(trifenilmetilmercapto)-et-1-il]-tiodiglicólico (Ejemplo 25a). Para este propósito, se disuelven 45,2 mg (0,1 mmol) del ácido mencionado previamente en 500 \mul de DMF absoluta (0,1 mmol) y se mezcla con 11,5 mg (0,1 mmol) de NHS. Después de enfriar a 0ºC, se añaden 19,2 mg (0,1 mmol) de EDC y se incuba durante 30 minutos a 0ºC.

Una solución de 10 mg del 5-(éster del ácido 6-aminohexil-fosfórico) de 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACG
AAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3' en 1 ml de un tampón de bicarbonato de sodio/carbonato de sodio (pH = 8,0), descrito en el Ejemplo 1, se mezcla con 500 \mul de la solución del éster de NHS producida previamente. Se incuba durante 16 horas a la temperatura ambiente. A continuación, se concentra por evaporación en 500 \mul y se somete a cromatografía sobre Sephadex G-25. Se obtienen 6 mg del compuesto protegido con S-tritilo. La escisión del grupo protector S-tritilo, el aislamiento del oligonucleótido que lleva grupos SH y la purificación tienen lugar como se describe en el ejemplo 22e. Se obtienen 4 mg de liofilizado blanco.

c) Complejo con Tc-99m de 5'-[éster del ácido N-(1',5'-dioxo-6'-aza-3'-tia-8'-mercapto-oct-1-il)-aminohexil-fosfórico de 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'

1 mg del conjugado producido en el Ejemplo 25b se disuelve en 1 ml de tampón 0,1 M de hidrogenofosfato disódico (pH = 8,5). Después de añadir 10 mg de tartrato disódico, se mezcla con solución de pertecnetato de sodio (1 mCi) y luego con 10 \mul de solución de cloruro de estaño(II) (5 mg/1 ml de HCl 0,01 M). El rendimiento de trazador se determina por HPLC (91%).

Ejemplo 26 a) Éster metílico del ácido N,N'-bis-[2-(trifenilmetilmercapto)-1-oxo-et-1-il)-3,4-diaminobenzoico

Se disuelven 3,32 g (20 mmol) de éster metílico del ácido 3,4-diaminobenzoico y 13,38 g (40 mmol) de ácido S-trifenilmetil-mercaptoacético en 200 ml de diclorometano absoluto. A 0ºC, se añaden gota a gota a la carga 8,25 g (40 mmol) de diciclohexilcarbodiimida, disuelta en 100 ml de diclorometano absoluto. Se agita durante 1 hora más a 0ºC y finalmente durante 16 horas más a la temperatura ambiente. Se filtra, se agita mediante sacudidas contra ácido cítrico acuoso al 1%, se seca la fase orgánica sobre sulfato de sodio y se evapora el disolvente a vacío. El residuo se somete a cromatografía sobre gel de sílice (disolvente móvil: diclorometano/metanol, 0-10% metanol).

Rendimiento: 10,2 g (63,8%), aceite incoloro.

Análisis elemental:

Calc.:	C 75,16	H 5,30	N 3,51	O 8,01	S 8,02
Enc.:	C 75,01	H 5,58	N 3,30		S 7,89

b) Ácido N,N'-bis-[2-(trifenilmetilmercapto)-1-oxo-et-1-il]-3,4-diaminobenzoico

7,99 g (10 mmol) de éster metílico del ácido N,N'-bis-[2-(trifenilmetilmercapto)-1-oxo-et-1-il]-3,4-diaminobenzoico (Ejemplo 26a) se mezclan en 200 ml de dioxano, 20 ml de agua y 20 ml de metanol con 4 g (100 mmol) de hidróxido de sodio. Se agita durante 5 horas a la temperatura ambiente y la carga se vierte sobre 300 ml de ácido acético acuoso al 5%. Se extrae exhaustivamente con diclorometano, y se seca la fase orgánica sobre sulfato de sodio. Después de evaporación del disolvente, el residuo se somete a cromatografía sobre gel de sílice (disolvente móvil: diclorometano/metanol, metanol 0-40%).

Rendimiento: 3,56 g (45,4%), aceite incoloro.

Análisis elemental:

Calc.:	C 74,97	H 5,14	N 3,57	O 8,15	S 8,17
Enc.:	C 74,71	H 5,32	N 3,31		S 7,88

c) 5'-{Éster del ácido N-[3',4'-bis-(2''-mercaptoacetilamino)-benzoil]-6-aminohexilfosfórico de 5'-CUCAUGG AGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'

Primeramente, se produce el éster de NHS del ácido N,N'-bis-[2-(trifenilmetilmercapto)-1-oxo-et-1-il]-3,4-diaminobenzoico (Ejemplo 26b). Para este propósito, se disuelven 78,5 mg (0,1 mmol) del ácido en 500 \mul de DMF absoluta y se mezclan con 11,5 mg (0,1 mmol) de NHS. Después de enfriar a 0ºC, se añaden 19,2 mg (0,1 mmol) de EDC y se incuba durante 30 minutos a 0ºC. Una solución de 10 mg del 5'-(éster del ácido 6-aminohexil-fosfórico) de 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3' en 1 ml de tampón de bicarbonato de sodio/carbonato de sodio (pH = 8,0), descrito en el Ejemplo 1, se mezcla con 500 \mul de la solución del éster de NHS producida previamente. Se incuba durante 17 horas a la temperatura ambiente. A continuación, se concentra por evaporación a 500 \mul y se somete a cromatografía sobre Sephadex G-25. Se obtienen 7 mg del compuesto protegido con S-tritilo.

La escisión del grupo protector S-tritilo, el aislamiento del oligonucleótido que lleva grupos SH y la purificación tienen lugar como se describe en el Ejemplo 22e. Se obtienen 3 mg de liofilizado blanco.

d) Complejo con Tc-99m de 5'-{éster del ácido N-[3',4'-bis-(2''-mercaptoacetilamino)-benzoil]-6-aminohexilfosforoso] de 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'

1 mg del conjugado descrito en el Ejemplo 26c) se disuelve en 1 ml de tampón 0,1 M de hidrogenofosfato disódico (pH = 9,5). Después de añadir 10 mg de tartrato disódico, se mezcla con solución de pertecnetato de sodio (1 mCi) y luego con 10 \mul de solución de cloruro de estaño(II) (5 mg/1 ml de HCl 0,01 M). El rendimiento de trazador (aproximadamente 91%) se determinó por HPLC.

Ejemplo 27 a) Éster terc-butílico de N-[O-acetil-hidroxiacetil]-glicil-glicil-glicina

24,5 g (0,1 mol) de éster terc-butílico de glicil-glicil-glicina y 11,8 g (0,1 mol) de ácido O-acetil-glicólico se añaden juntos a 0ºC a 500 ml de dimetilformamida absoluta. Se añade gota a gota a la carga una solución de 20,6 g (0,1 mol) de diciclohexilcarbodiimida en 500 ml de dimetilformamida absoluta, se agita durante 1 hora a 0ºC y finalmente durante una noche a la temperatura ambiente. Se filtra, y el filtrado se concentra por evaporación en la bomba de aceite. Se cristaliza repetidamente en acetato de etilo/n-pentano.

Rendimiento: 12,5 g (36,2%), polvo blanco.

Análisis elemental:

Calc.:	C 48,69	H 6,71	N 12,17	O 32,43
Enc.:	C 48,43	H 7,01	N 11,93

b) N-[O-Acetil-hidroxiacetil]-glicil-glicina

3,45 g (10 mmol) de éster terc-butílico de N-[O-acetil-hidroxiacetil]-glicil-glicil-glicina se agitan en 50 ml de ácido trifluoroacético durante 15 minutos. A continuación, se vierte sobre 500 ml de dietil-éster absoluto y el producto se separa por filtración, y se recristaliza repetidamente en acetato de etilo/n-pentano.

Rendimiento: 1,23 g (42,5%), polvo blanco.

Análisis elemental:

Calc.:	C 41,53	H 5,23	N 14,53	O 38,72
Enc.:	C 41,31	H 5,51	N 14,32

c) 5-{Éster del ácido N-[N'-(hidroxiacetil)-glicil-glicil-glicil]-6-aminohexilfosfórico de 5'-CUCAUGGAGCCA AGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'

Primeramente, se produce el éster de NHS de N-[O-acetilhidroxiacetil]-glicil-glicil-glicina (ejemplo 27b). Para este propósito, se disuelven 28,9 mg (0,1 mmol) del ácido en 500 \mul de DMF absoluta y se mezcla con 11,5 mg (0,1 mmol) de NHS. Después de enfriar a 0ºC, se añaden 19,2 mg (0,1 mmol) de EDC y se incuba durante 30 minutos a 0ºC. Una solución de 10 mg del (éster del ácido 6-aminohexilfosfórico) de 5'-CUCAUGGAGCGCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3' en 1 ml de solución 1M de carbonato de sodio, descrita en el Ejemplo 1, se mezcla con 500 \mul de la solución del éster de NHS producida previamente. Se incuba durante 18 horas a la temperatura ambiente. A continuación, se concentra por evaporación a 500 \mul y se somete a cromatografía sobre Sephadex G-25. Después de liofilización, se obtienen 3 mg del compuesto del título.

d) Complejo con Tc-99m de 5-{éster del ácido N-[N'-(hidroxiacetil)-glicil-glicil-glicil]-6-aminohexilfosfórico} de 5'-CUCAUGGAGCCAAGACGAAUAGCUACAUAT*T*T*T*T*-3'

1 mg del conjugado descrito en el Ejemplo 27c se disuelve en 1 ml de tampón 0,1 M de hidrogenofosfato disódico (pH = 10,5). Después de añadir 10 mg de tartrato disódico, se mezcla con solución de pertecnetato de sodio (1 mCi) y luego con 10 \mul de solución de cloruro de estaño(II) (5 mg/1 ml de HCl 0,01 M). El rendimiento de trazador se determina por HPLC (95%).

Los ejemplos que anteceden pueden repetirse con éxito similar empleando las sustancias reaccionantes y/o las condiciones de operación de esta invención descritas genérica o específicamente en sustitución de las utilizadas en los ejemplos que anteceden.

Claims

1. Conjugados oligonucleotídicos constituidos por un radical oligonucleotídico N y n sustituyentes (B-K), en los cuales el compuesto exhibe la fórmula general I)

(I)N-(B-K)_{n}

en la cual N es un oligonucleótido con 15 a 100 nucleótidos, que se fija específicamente con afinidad de fijación alta a estructuras diana y exhibe modificaciones que impiden o al menos reducen significativamente la degradación por las nucleasas existentes naturalmente,

B es un enlace químico o un componente de conexión, que produce la conexión entre N y K, y K significa un agente complejante o complejo de isótopos de metales radiactivos, o isótopos estables, que

n es un número entre 1 y 10,

en los cuales

un grupo -OR, en el cual

un átomo de hidrógeno,

un grupo hidroxilo,

un átomo de flúor,

un radical amina,

un grupo amino,

b) los fosfodiésteres, que se utilizan opcionalmente como enlace internucleotídico, independientemente unos de otros, están reemplazados por fosforotioatos, fosforoditioatos o alquilfosfonatos, preferiblemente metil-fosfonato, y/o

e) contiene un enlace fosfodiéster como se describe en b), que conecta, de modo análogo a un éster, dos timidinas respectivamente por un radical hidroxialquilo C_{2}-C_{10} en posición 3 o conecta un radical timidina sustituido análogamente, de modo análogo a un éster, con un grupo hidroxilo de otro azúcar en posición 2' o 3' o 5' y/o

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual N es un oligonucleótido, que se fija específicamente con afinidad de fijación alta a otras estructuras diana y que puede obtenerse de tal manera que una mezcla de oligonucleótidos que contienen secuencias aleatorias se pone en contacto con la estructura diana, y en la que ciertos oligonucleótidos exhiben una afinidad incrementada para la estructura diana con relación a la mezcla de los oligonucleótidos, se separan los últimos del resto de la mezcla de oligonucleótidos, y se multiplican luego los oligonucleótidos que tienen afinidad incrementada para la estructura diana a fin de obtener una mezcla de oligonucleótidos que exhibe una porción incrementada de oligonucleótidos que se fijan a las estructuras diana.

3. Un compuesto de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 2, en el cual N es un oligonucleótido, que se fija específicamente con afinidad de fijación alta a otras estructuras diana, y que puede obtenerse de tal manera que

a) en primer lugar, se produce una cadena de DNA por síntesis química, de tal modo que esta cadena de DNA exhibe una secuencia definida en el extremo 3', que es complementaria a un promotor para una RNA-polimerasa y al mismo tiempo complementaria para un iniciador de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y de tal modo que esta cadena de DNA exhibe una secuencia definida en el extremo 5', que es complementaria para una secuencia iniciadora para la reacción en cadena de la polimerasa, y la secuencia entre las secuencias definidas contiene una secuencia aleatoria, y de tal manera que

f) estas cadenas de DNA se multiplican utilizando las secuencias iniciadoras definidas por la reacción en cadena de la polimerasa, y de tal manera que

h) los pasos de selección c) a g) arriba mencionados se repiten opcionalmente muchas veces hasta que los oligonucleótidos, que se caracterizan por una afinidad de fijación alta a la estructura diana, se seleccionan suficientemente, y después de ello las secuencias del oligonucleótido así obtenido pueden ser determinadas opcionalmente.

4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual la estructura diana se selecciona de entre macromoléculas, estructuras tisulares de organismos superiores, tales como animales o humanos, órganos o partes de órganos de un animal o humano, células, células tumorales o tumores.

5. Un compuesto de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual el o los componentes de conexión B se fija(n)

a) al extremo 4' del radical oligonucleotídico N reducido en posición 4' por el grupo CH_{2}-OH y/o

b) al extremo 3' del radical oligonucleotídico N reducido en posición 3' por un átomo de hidrógeno y/o

c) al puente o puentes fosfodiéster, reducido(s) por el grupo o grupos OH, entre dos nucleótidos cada uno y/o

d) a 1 a 10 nucleobases, que está(n) reducida(s) por un átomo de hidrógeno respectivamente en las posiciones 5, 8 y/o el o los grupos amino en la o las posiciones 2, 4 y 6.

6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, párrafo a) o b), en el cual B tiene la fórmula general X-Y-Z^{1}, que está conectada en el lado X con el agente complejante o complejo y en el lado Z con el oligonucleótido, en el cual

X es un enlace directo, un grupo -NH o -S,

Y representa una cadena de alquileno C_{1}-C_{20} de cadena lineal, de cadena ramificada, saturada o insaturada, que contiene opcionalmente 1-2 grupos ciclohexileno, 1-5 grupos imino, 1-3 grupos fenileno, 1-3 grupos fenilenimino, 1-3 grupos fenilenoxi, 1-3 grupos hidroxifenileno, 1-5 grupos amido, 1-2 grupos hidrazido, 1-5 grupos carbonilo, 1-5 grupos etilenoxi, 1 grupo ureido, 1 grupo tioureido, 1-2 grupos carboxialquilimino, 1-2 grupos éster, 1-3 grupos Ar, en los cuales Ar representa un anillo de 5 ó 6 miembros saturado o insaturado, que contiene opcionalmente 1-2 heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre y/o 1-2 grupos carbonilo; 1-10 átomos de oxígeno, 1-5 átomos de nitrógeno y/o 1-5 átomos de azufre, y/o está sustituida opcionalmente con 1-5 grupos hidroxi, 1-2 grupos mercapto, 1-5 grupos oxo, 1-5 grupos tioxo, 1-3 grupos carboxi, 1-5 grupos carboxi-alquilo C_{1}-C_{4}, 1-5 grupos éster, 1-3 grupos amino, 1-3 grupos hidroxi-alquilo C_{1}-C_{4}, 1-3 grupos alcoxi C_{1}-C_{7}, y

Z^{1} es -CONH-CH_{2}-4', -NH-CO-4', -O-P(O)R^{1}-NH-CH_{2}-4', -O-P(O)R^{1}-O-CH_{2}-4', -O-P(S)R^{1}-O-3' o -O-P(O)R^{1}-O-3', en cuyas fórmulas 4' o 3' indica el enlace a la o las unidades azúcar terminales y R^{1} es O^{-}, S^{-}, un grupo alquilo C_{1}-C_{4} o NR^{2}R^{3}, significando R^{2} y R^{3} hidrógeno o radicales alquilo C_{1}-C_{4}.

7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, párrafo c), en el cual B tiene la fórmula general X-Y-Z^{2}, que está conectada en el lado X con el agente complejante o complejo y en el lado Z con el oligonucleótido, en el cual

Z^{2}, en el puente que enlaza dos unidades azúcar adyacentes,

Z^{2}---

\melm{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{3'}}}}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

---O---5'

\hskip1cm

y/o

\hskip1cm

Z^{2}---

\melm{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{3'}}}}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

---O---5'

es el grupo -NR^{2}-, -O- o -S-,

X es un enlace directo, un grupo -NH o grupo -S,

Y es una cadena alquileno C_{1}-C_{20} de cadena lineal, cadena ramificada, saturada o insaturada, que contiene opcionalmente 1-2 grupos ciclohexileno, 1-5 grupos imino, 1-3 grupos fenileno, 1-3 grupos fenilenimino, 1-3 grupos fenilenoxi, 1-3 grupos hidroxifenileno, 1-5 grupos amido, 1-2 grupos hidrazido, 1-5 grupos carbonilo, 1-5 grupos etilenoxi, 1 grupo ureido, 1 grupo tioureido, 1-2 grupos carboxialquilimino, 1-2 grupos éster, 1-3 grupos Ar, en los cuales Ar representa un anillo de 5 ó 6 miembros saturado o insaturado, que contiene opcionalmente 1-2 heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre y/o 1-2 grupos carbonilo; 1-10 átomos de oxígeno, 1-5 átomos de nitrógeno y/o 1-5 átomos de azufre, y/o está sustituida opcionalmente con 1-5 grupos hidroxi, 1-2 grupos mercapto, 1-5 grupos oxo, 1-5 grupos tioxo, 1-3 grupos carboxi, 1-5 grupos carboxi-alquilo C_{1}-C_{4}, 1-5 grupos éster, 1-3 grupos amino, 1-3 grupos hidroxi-alquilo C_{1}-C_{4}, 1-3 grupos alcoxi C_{1}-C_{7}, y

R^{2} es hidrógeno o radicales alquilo C_{1}-C_{4}.

8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 5d, en el cual B tiene la fórmula general X-Y-Z^{3}, en la cual Z^{3} representa un grupo -NH o un enlace directo a la nucleobase,

X es un enlace directo, un grupo -NH o grupo -S, e

Y es una cadena de alquileno C_{1}-C_{20} de cadena lineal, cadena ramificada, saturada o insaturada, que contiene opcionalmente 1-2 grupos ciclohexileno, 1-5 grupos imino, 1-3 grupos fenileno, 1-3 grupos fenilenimino, 1-3 grupos fenilenoxi, 1-3 grupos hidroxifenileno, 1-5 grupos amido, 1-2 grupos hidrazido, 1-5 grupos carbonilo, 1-5 grupos etilenoxi, 1 grupo ureido, 1 grupo tioureido, 1-2 grupos carboxialquilimino, 1-2 grupos éster, 1-3 grupos Ar, en los cuales Ar representa un anillo de 5 ó 6 miembros saturado o insaturado, que contiene opcionalmente 1-2 heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre y/o 1-2 grupos carbonilo; 1-10 átomos de oxígeno, 1-5 átomos de nitrógeno y/o 1-5 átomos de azufre, y/o está sustituida opcionalmente con 1-5 grupos hidroxi, 1-2 grupos mercapto, 1-5 grupos oxo, 1-5 grupos tioxo, 1-3 grupos carboxi, 1-5 grupos carboxi-alquilo C_{1}-C_{4}, 1-5 grupos éster, 1-3 grupos amino, 1-3 grupos hidroxi-alquilo C_{1}-C_{4}, y 1-3 grupos alcoxi C_{1}-C_{7}.

9. Compuestos de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en los cuales el complejo metálico, como elemento formador de imagen, contiene un isótopo radiactivo, seleccionado de los elementos cobre, bismuto, tecnecio, renio o indio.

10. Un proceso para detectar una estructura diana, en el cual uno o más de los compuestos de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores se ponen en contacto con la muestra a estudiar in vivo o in vitro y, basándose en la señal, se detecta si la estructura diana, a la cual se fija específicamente y con afinidad de fijación alta el oligonucleótido N, está presente en la muestra.

11. Compuestos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-9 para diagnóstico no invasivo de enfermedades.

12. Uso de un compuesto de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 para la producción de un medicamento útil en radiodiagnóstico y/o en radioterapia.

13. Estuche de diagnóstico para detección in vivo y/o in vitro de estructuras diana, en el cual el estuche de diagnóstico contiene al menos un compuesto de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9.

14. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual N es un ligando oligonucleotídico no existente naturalmente, que tiene una afinidad de fijación específica para una molécula diana, siendo dicha molécula diana una estructura química tridimensional distinta de un polinucleótido que se fija a dicho ligando oligonucleotídico por un mecanismo que depende predominantemente del apareamiento de bases de Watson/Crick o fijación de la triple hélice, en el cual dicho ligando oligonucleotídico no es un ácido nucleico que tiene la función fisiológica conocida de ser fijado por la molécula diana.