CZ115698A3

CZ115698A3 - Způsob přípravy rekombinantního faktoru VIII v prostředí prostém proteinu

Info

Publication number: CZ115698A3
Application number: CZ981156A
Authority: CZ
Inventors: Sham-Yuen Chan; Kathleen Harris
Original assignee: Bayer Corporation
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 1998-11-11
Also published as: HUP9800901A3; AR012451A1; KR19980081531A; EP0872487A3; DE69836164D1; CN1210866A; CO4790112A1; CA2234215C; PL325862A1; IL124123A; ES2273380T3; AU748731B2; DK0872487T3; BRPI9801092A; BRPI9801092B1; ID20193A; KR100496111B1; EP0872487A2; DE69836164T2; TR199800493A1

Description

Způsob přípravy rekombinantního faktoru VIII v prostředí prostém proteinu

Oblast techniky

Tento vynález se obecně týká způsobu přípravy rekombinantního faktoru VIII a zejména způsobu přípravy rekombinantního faktoru VIII v prostředí prostém sera nebo proteinu.

Dosavadní stav techniky

Hemofilie A je X-vázaná recesivní genetická porucha, která je důsledkem vadných nebo nedostatečných molekul faktoru VIII, co způsobuje sklon ke krvácení. K potlačení příhod krvácení se hemofilici ošetřují faktorem VIII. V minulosti byl faktor VIII izolován z lidské krevní plazmy. Avšak léčení faktorem VIII získaným z plazmy je spojeno s přenosem různých virů napadajících člověka, jako je virů způsobujících hepatitidu a virů lidské imunitní nedostatečnosti .

S nástupem rekombinantní DNA technologie byla objasněna struktura faktoru VIII a jeho genu. Transkripční produkt genu, který je odvozen od 26 exonů, je mesengerem RNA molekuly o délce přibližně 9000 bází, kódující pro veliký protein z 2351 aminokyselin. Studie struktury faktoru VIII ukazují, že jde o glykoprotein obsahující signifikantní počet karbohydrátových zbytků.

cDNA kódující pro faktor VIII byla klonována a stabilně exprimována v ledvinách nedospělého křečka (BHK-21) ♦ · · 9 ·· • •4 · · ·····

999 9 9 9 · · 999

9 9 9 9 ·····» ·····

9 9 9 9 9 9 99

9 99 9 9 9 9 99 9

- 2 a buňkách vaječníku čínského křečka (CHO). K produkci rekombinantního faktoru VIII pro ošetřování hemofilie A byly vyvinuty průmyslové procesy. Rekombinantní faktor VIII se v současné době vyrábí z buněk savců zpracovaných genetickou konstrukcí a tak se zbaví spoléhání se na plazmu a minimalizují se jakákoli možná rizika přenosu virů.

Genová amplifikace je volitelnou metodou k získání vysoce produkčních buněčných linií pro terapeuticky účinné proteiny. Amplifikační strategie zahrnuje vázání transkripční jednotky kódující požadovaný protein k amplifikovatelnému markéru, jako je dihydrofolát reduktáza. Potom se aplikují transfekační techniky k přenosu vektoru DNA do příjemcových buněk. Buněčné populace se volí ke zvýšení resistence k vybranému léčivu, jako je methotrexat. Dosažení stabilního buněčného klonu je uskutečňováno klonováním za limitního zředění. Tyto buněčné klony se potom upravují na produkční prostředí zbavené sera a sledují na produkci požadovaného proteinu.

Pro labilní proteiny, jako je faktor VIII, se lidský albumin přidává jako stabilizátor během procesů přípravy a čištění. Třebaže se albumin podrobuje stupni virové inaktivace pasterací, bylo by ideální, pokud by se faktor VIII připravoval v naprosté nepřítomnosti lidských nebo zvířecích krevních proteinů. Původci tohoto vynálezu nyní zjistili, že je možné používat nové kultivační prostředí pro buňky. Podrobnosti jsou popsány dále.

Podstata vynálezu

Způsob kontinuální přípravy relativně velkých množství rekombinantního faktoru VIII (rFVIII) ze savčích buněk

- 3 v nepřítomnosti libovolného plazmového proteinu získaného od člověka nebo zvířete zahrnuje kultivaci savčích hostitelských buněk v prostředí prostém proteinu, které je doplněno polyolovým polymerem, jako je Pluronic F-68. Výhodné prostředí zahrnuje síran mědi, komplex síranu železnatého a EDTA a dále soli stopových prvků, jako je mangan, molybden, křemík, lithium a chrom.

Dále se uvádí podrobný popis tohoto vynálezu.

Současný pokrok v technologii exprese rekombinantního proteinu umožňuje produkci proteinu ve velikých množstvích v savčích buňkách. Mezi hostitelské buňky vhodné pro produkci faktoru VIII se zahrnují buněčné linie, jakými jsou buňky ledvin nedospělého křečka (BHK), buňky vaječníků čínského křečka (CHO) a buňky ledvin lidského embrya (HEK). Obzvláště výhodné jsou buňky ledvin nedospělého křečka, zejména pokud jsou transfekovány genem schopným přímě exprese faktoru VIII, jak popsal Wood a kol. (1984), včetně derivátů, jako jsou klonované varianty a jejich progeny. Taková buněčná linie je uložena v Americké sbírce typových kultur (Američan Type Culture Collection) a jsou opatřeny sbírkovým číslem ATCC CRL-8544.

Požadovaná buněčná linie hostitele nesoucí gen faktoru VIII je obvykle uzpůsobena k růstu jako kultura pěstovaná v suspenzi v prostředí prostém proteinu, který je doplněno lipoproteinem. Bazální prostředí zvolené pro kultivaci buněčné linie hostitele není rozhodující pro tento vynález a může být libovolné z těch, které jsou známy v oboru nebo může být tvořeno takovou kombinací, která je vhodná pro kultivaci buněk savců. Prostředí, jako je Eagleovo prostředí modifikované podle Dulbeccoa, Hamovo prostředí F-12, Eagleovo • · · · * · ·· · · ··· ··· · · · · • · · · · ··· · · · · • « ·♦· ······ · · · · · ··· ··· · · · ····· · · · ·· ·· minimální základní prostředí, prostředí RPMI-1640 a podobně, je komerčně dostupné. Přídavek růstového faktoru, jako rekombinantního inzulínu, je obvyklý v oboru.

V důsledku labilní povahy faktoru VIII, produktivita konstruovaných hostitelových buněk je vážně snížena za podmínek prostých proteinu. Lidský sérový albumin se běžně používá jako doplněk kultury prosté proteinu pro produkci rekombinantních proteinů. Lidský sérový albumin slouží k řadě funkcí, mezi které se zahrnuje, že slouží

1) jako nosič pro mastné kyseliny, cholesterol, lipofilní vitamíny, steroidní hormony a růstové faktory,

2) jako ochranný prostředek proti poškození v důsledku střihových sil,

3) jako pufr pro změny hodnoty pH a

4) jako regulátor osmotického tlaku.

Jiná rozhodující úloha albuminu spočívá snad v ochraně labilních proteinů, jako je faktor VIII, před proteolýzou tím, že slouží jako substrát pro proteázy.

Nečistoty přítomné v albumínových přípravcích mohou také přispívat ke stabilizujícímu účinku albuminu. Faktory, jako je lipoprotein (Chán, 1996), byly identifikovány jako náhrada lidského sérového albuminu pro přípravu rekombinantního faktoru VIII za podmínek prostých sera.

Pokus původců pokusy vyvinout produkční prostředí zbavené albuminu získaného z plazmy vedl k nalezení tohoto vynálezu, základního prostředí prostého proteinu pro produkci rekombinantního faktoru VIII. Výhodné prostředí sestává z Dubleccova minimálního základního prostředí a Hamova F-12 prostředí (v hmotnostním poměru 50:50), doplněném rekombinantním inzulínem (Nucellin, Eli Lilly) v množství 10 pg/ml ···· · · · · · · ·· • · · * · · ···· · ··· · · • · · ·«· ··· ····· · * · ·· ··

- 5 a FeSO^.EDTA v množství 50 μΜ. S výjimkou produkce faktoru VIII, buňky konstruované z BHK rostou dobře v tomto prostředí prostém proteinu.

S překvapením bylo zjištěno, že přídavek polyolu, jako je Pluronic F-68, nemá účinek na růst, ale zvyšuje specifickou produktivitu BHK buněk pro faktor VIII. Naštěstí přidání síranu mědi dále zvyšuje produkci faktoru VIII. Také zahrnutí řady stopových prvků, jako je mangan, molybden, křemík, lithium a chrom, vede k dalšímu zvýšení produkce faktoru VIII. Kontinuální proces byl potom vyvinut pro produkci faktoru VIII za podmínek prostých proteinu získaného z lidské plazmy. Další informace s ohledem na použití polyolů Pluronic se dají zjistit v Papoutsakis (1991) a Schmolka (1977).

Pluronic F-68, polyglykol (BASF, Wyandot) se obecně používá k zabránění pěnění, které nastává v míchané kultuře, a k ochraně buněk před střihovým napětím a poškozením probubláváním v kulturách podrobených střihovým podmínkám. Pluronic F-68 je neionový blokový kopolymer se střední molekulovou hmotností 8400, který sestává z centrálního bloku póly(oxypropylénu) (20 % hmotnostních) a bloků poly(oxyethylenu) na obou koncích. Rozsáhlý výzkum úlohy Pluronic F-68 ukazuje, že Pluronic F-68 působí jako smáčedlo a zabraňuje poškození buněk tím, že dovoluje odvodnění buněk opouštějících bubliny tvořící se v biologických reaktorech během míchání nebo za střihových podmínek. Několik vynálezců však uvedlo příznivé účinky Pluronic F-68 na růst za kultivačních podmínek, při kterých se minimalizuje střih (Mizrahi, 1975, Murhammer a Goochee, 1990). Společné čištění lipidů s Pluronic F-68 během produkčního čištění působí zřejmě směšně, protože polymer Pluronic může nahradit albumin nejen jako smáčedlo, ale může také působit jako nosič pro • ·

- 6 lipidy. Pluronic F-68 může také zabránit poškození membrány z odumřelých buněk před tím, než se mohou účinně odstranit, možná přímou interkalací do membrány. Úloha Pluronic F-68 v působení jako pufr na bázi kovových ionů je zcela neznámá.

Třebaže původci uvádějí, že Pluronic F-68 v prostředí může zvýšit produktivitu na jednotku objemu, mechanismus účinku se zdá být udržován životaschopností buněk (Schneider, 1989, Qi, 1996). Podle znalostí původců, tomu je především proto, že se zdá, že Pluronic F-68 zvyšuje specifickou produkci zvláštního proteinového produktu. Protože životaschopnost a rychlost růstu jsou srovnatelné v systému podle tohoto vynálezu s Pluronic F-68 a bez této látky, udržování životaschopnosti buněk nemůže být mechanismem účinku Pluronic F-68 v systému původců. Účinek přidání Pluronic F-68 však je bezprostřední a prudký při jakémkoli mechanismu.

Předpokládá se, že výskyt jiných polyolů může mít podobné účinky. Mezi takové jiné polyoly se zahrnují neionové blokové kopolymery poly(oxyethylenu) a póly(oxypropylénu), které mají molekulovou hmotnost v rozmezí od přibližně 1000 do zhruba 16 000.

Kromě obvyklé technicky kultivace v suspenzi, jako v třepaných baňkách, rotujících baňkách a válcových láhvích, způsob podle tohoto vynálezu je také aplikovatelný na použití s perfuzí a v násadových biologických reaktorech. Po kultivaci hostitelských buněk se faktor VIII může získat z vyčerpaného prostředí normalizovanou metodou, jako je ultrafiltrace nebo odstředování. Pokud je to žádoucí, získaný faktor VIII se může čistit například ionoměničovou chromatografií nebo chromatografií na bázi rozměrového vylučování • · · · · · • · · · · · · ···· · ··· · · ·· • · · · · ······ ··· · · ······ ··· ····· ·· · · · · ·

- 7 (size exclusion chromatography), imunoafinitní chromatografií nebo chromatografií na kovovém chelatu a podobně.

Pokud se zde používá výrazu prostředí prosté lidského nebo zvířecího proteinu, jde o prostředí ke kultivaci buněk, které je zbaveno libovolného proteinu, který je získán z lidského nebo zvířecího zdroje. Proteiny, které jsou izolovány z lidských nebo zvířecích zdrojů, přinášejí podstatné riziko zavedení kontaminace viry. Cílem prostředí prostého lidského nebo zvířecího proteinu je vyloučit nebo alespoň výrazně snížit riziko přenesení virů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Ledvinové buňky nedospělého křečka (BHK-21), transfekované genem schopným řídit expresi faktoru VIII, byly získány z Genetech, lne., South San Francisco, Kalifornie, USA. Buněčná linie je připravena, jak podrobně popsal Wood a kol. (1984), a je uložena v Americké sbírce typových kultur (Američan Type Culture Collection), s přiřazeným sbírkovým číslem ATCC CRL-8544. Klonová varianta této buněčné linie se také dostane od Genetech, lne., a použije ve všech příkladech.

Buňky BHK-21 obsahující gen kódující faktor VIII se kultivují jako suspenzní kultura v třepaných baňkách za použití základního prostředí prostého sera, které sestává z Hamova F-12 prostředí a Dubleccova minimálního základního prostředí (v hmotnostním poměru 50:50), rekombinantního inzulínu (Nucellin) v množství 5 až 10 úg/ml, FeSO^.EDTA v množství 50 μΜ a chloridu hořečnatého v množství 15 mM.

• ·

- 8 Buňky se udržují a pasážují během období 48 hodin. Buňky se oddělují při přetížení 800 x g po dobu 5 minut, určí se jejich četnost a znovu se naočkují při hustotě 1 x 10 buněk na ml. Každá baňka obsahuje 50 až 100 ml čerstvého prostředí. Třepané baňky se umístí na rotor, inkubují za teploty 37 °C a udržují jako buněčná suspenze opatrným vířením při frekvenci otáček 90 až 110 za minutu. Účinek polyolu, jako je Pluronic F-68 (0,1 %), uváděného dále též jako F-68, a síranu mědi (50 nM) na faktor VIII se zkouší v třepaných baňkách. Faktor VIII se kvantitativně stanoví chromogenní zkušební soupravou. Zkušební souprava se prodává na trhu jako testovací souprava, známá jako Coatest VIII:C/4, která je dostupná od společnosti Baxter Health Care Products. Buňky se udržují při tomto postupu po dobu 24 dní. Aktivita faktoru VIII v každém prostředí, jak je stanovena pomocí soupravy Coatest VIII:C/4, je uvedena v tabulce 1.

Tabulka 1

		Specifická	% zvýšení
Podmínky	Titr (U/ml)	produktivita	nad základní
		(μυ/buňka/den)	úroveň
Základní prostředí	0,15±0,07*	0,026±0,013	0
Základní + F-68	0,24±0,04	0,052±0,013	200
(0,1 %)**
Základní + F-68	0,42±0,09	0,091±0,013	350

(0,1 %) + Cu (50

Střední hodnota ze 36 vzorků ± standardní odchylka.

Buňky se sledují na produkci faktoru VIII během • · ··· · · · ···· ···· · ··· · ··· • · * · · · ···· · ··· · · ······ ··· ····· ·· · ·· ··

- 9 časového období 24 dní, jak je popsáno výše.

Titračni experimenty ukazuji, že 0,1 % je optimální dávka pro Pluronic F-68. Zvýšení koncentrace na 0,3 % nemá signifikantní účinek na produkci faktoru VIII. Experimenty odezvy na dávku ukazují, že 50 až 800 nM síranu mědi je optimální obsah pro produkci faktoru VIII.

Jak je uvedeno v tabulce 1, přídavek samotného Pluronic F-68 nebo výhodně v kombinaci se síranem mědi významně zvyšuje titr a specifickou produktivitu buněk BHK obsahujících gen kódující pro faktor VIII za podmínek prostých proteinu.

Příklad 2

K další optimalizaci produkce faktoru VIII za podmínek prostých proteinu se přidají k produkčnímu prostředí prostému proteinu stopy kovů. Příprava faktoru VIII se potom zkouší po dobu 16 dnů v kontinuálním kultivačním systému třepaných baněk, jak je popsáno v příkladu 1. Hodnoty jsou uvedeny v tabulce 2. V nepřítomnosti síranu mědi stopy kovů nemají žádný účinek na produktivitu faktoru VIII. Viz tabulka 2.

• ·

Tabulka 2

Podmínky	Titr (U/ml)	Specifická produktivita (μϋ/buňka/den)	% zvýšení nad základní úroveň + F-68
Základní + F-68	0,46±0,ll	0,065±0,013	0
Základní + F-68	0,53±0,15	0,078±0,026	120
+ Cu
Základní + F-68	0,73±0,16	0,104±0,026	160
«Uf + Cu + kovy
Pod kovy	se zahrnuje CuSO₄	.5H₂O (50 nM),	MnSO₄ (3

nM), Na₂SÍO₃.9H₂O (1,5 μΜ) , [NH₄]₆Mo_?0₂₄.4H₂O (3 nM), CrK(SO₄)₂.4H₂O (1,5 nM) a LÍCI (236 nM).

Příklad 3

Účinek stop kovů a mědi na produkci faktoru VIII se dále hodnotí v promývacím fermentoru. Dva fermentory o objemu

1,5 litru se naočkují BHK klonovou variantou při hustotě 2 x 10⁶ buněk na ml za použití základního prostředí, které je popsáno v tabulce 1. Fermentory se proplachuj í rychlostí 0,5 litru za den. Jeden fermentor se udržuje jako kontrolní a druhý fermentor se doplní mědí a stopami kovů, jak je popsáno v příkladu 2. Fermentory se udržují po dobu 15 dnů s průměrnou hustotou buněk přibližně 2 až 3 x 10⁶ buněk na ml. Jak je uvedeno v tabulce 3, přidání Pluronic F-68, mědi a stop kovů signifikantně zvýší specifickou produktivitu BHK buněk zachycujících gen kódující pro faktor VIII za podmínek prostých proteinu a za podmínek nepřetržité perfuze. Tato produkční metoda se může snadno upravit pro větší fermentor (200 až 500 litrů), který je vybaven zařízením pro zadržování buněk, jako je usazovací nádoba.

Tabulka 3

Den	Specifická produktivita Základní prostředí	(μυ/buňka/den) Cu + kovy
1	0,02	0,04
2	0,02	0,05
3	0,02	0,045
4	0,018	0,05
5	0,02	0,05
6	0,035	0,060
7	0,025	0,055
8	0,02	0,04
9	0,025	0,06
10	0,02	0,065
11	0,025	0,070
12	0,025	0,065
13	0,02	0,060
14	0,03	0,06
15	0,02	0,05

Výše uvedené příklady jsou určeny jako prostředek pro ilustrování tohoto vynálezu a nemají být vykládány jako omezení tohoto vynálezu, který je definován toliko patentovými nároky.

Literární odkazy

Bihoreau, N., a kol., Eur. J. Biochem., 222, 41-48 (1994), Chán, S. Y. , US patent Č. 5 576 194 (1996),

Eis-Hubinger, A. M., a kol., Thromb. Haemost., 76, 1120 (1996),

Mizrahi, A., J. Clin. Microbiol., 11-13 (1975),

Murhammer, D. W. , a kol., Biotechnol. Prog., 6, 142-148 (1990),

Papoutsakis, E. T., Trends in Biotechnology (Tibtech), 9, 316-324 (1991),

Qi, Y-M. a kol., Cytotechnology, 21, 95-109 (1996), Schmolka, I. R., J. Am. Oil Chemists' Soc. 54, 110-116, Schneider, Y-J., J. Immunol. Meth., 116, 65-77 (1989), Wood, W., a kol., Nátuře, 312, 330-337 (1984),

Xu, D., a kol., China J. Biotech., 11, 101-107 (1995), Zhang, J., a kol., Biotechnol., 33 . 249 - 258 (1994).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy rekombinantního faktoru VIII ze savčích buněk obsahujících k tomu gen, vyznačuj ící se t í m, že se kultivují savčí hostitelské buňky v prostředí prostém lidského nebo zvířecího proteinu, které je doplněno polyoly.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že prostředí obsahuje iony mědi.
3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že polyolem je Pluronic F-68 a je přítomen v prostředí v koncentračním rozmezí od přibližně 0,025 do zhruba 0,2 % hmotnostních.
4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že prostředí obsahuje síran mědi v množství, které je v rozmezí od přibližně 50 do zhruba 800 nM.
5. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že iony manganu jsou přítomny v množství, které je v rozmezí od přibližně 1,5 do zhruba 4,5 nM.
6. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že iony molybdenu jsou přítomny v množství, které je v rozmezí od přibližně 1,5 do zhruba 4,5 nM.
7. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že křemík je přítomen v množství, které je v rozmezí od přibližně 75 do zhruba 300 nM.
8. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že iony chrómu jsou přítomny v množství, které je v rozmezí od přibližně 1,0 do zhruba 4,0 nM.
9. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že iony lithia jsou přítomny v množství, které je v rozmezí od přibližně 120 do zhruba 480 nM.
10. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že savčí hostitelská buňka je vybrána ze souboru zahrnujícího buňky ledvin nedospělého křečka, buňky ledvin lidského embrya a buňky vaječníků čínského křečka.
11. Rekombinantní faktor VIII jako produkt připravený způsobem podle nároku 1,vyznačující se tím, že tento produkt je prostý lidského nebo zvířecího proteinu.
12. Kultivační prostředí prosté lidského nebo zvířecího proteinu pro přípravu rekombinantniho faktoru VIII, vyznačující se tím, že zahrnuje základní prostředí, které obsahuje polyol.
13. Prostředí podle nároku 12,vyznačuj ící se t í m, že obsahuje iony mědi.
14. Prostředí podle nároku 13, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje alespoň jeden stopový prvek, zvolený ze souboru zahrnujícího mangan, molybden, křemík, lithium a chrom.
15. Prostředí podle nároku 14,vyznačuj ící se t í m, že obsahuje inzulín.