JPH10295397A - タンパク質を含まない培地中での組み換え因子ｖｉｉｉの製造 - Google Patents

タンパク質を含まない培地中での組み換え因子ｖｉｉｉの製造

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JPH10295397A
JPH10295397A JP10115903A JP11590398A JPH10295397A JP H10295397 A JPH10295397 A JP H10295397A JP 10115903 A JP10115903 A JP 10115903A JP 11590398 A JP11590398 A JP 11590398A JP H10295397 A JPH10295397 A JP H10295397A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 動物の血液タンパク質の完全な不在下におけ
る因子ＶＩＩＩの生産方法を提供すること。 【解決手段】 好ましくは銅などの微量金属の存在下
で、ポリオールコポリマーが補充されたタンパク質を含
まない培地中で細胞を培養することにより、組み換え因
子ＶＩＩＩをアルブミンなどの動物−由来タンパク質の
不在下で連続的に、哺乳類細胞から比較的大量に生産す
ることができる。非常に好ましい実施態様の場合、培地
はプルロニックＦ−６８として既知のポリグリコール、
硫酸銅、硫酸第１鉄／ＥＤＴＡ錯体ならびにマンガン、
モリブデン、ケイ素、リチウム及びクロムなどの微量金
属の塩を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】分野 ：本発明は一般的に組み換え因子ＶＩＩＩの製造に
ならびに特定的に血清又はタンパク質を含まない培地中
における組み換え因子ＶＩＩＩの製造に関する。
【０００２】先行技術：血友病Ａは欠陥又は欠失因子Ｖ
ＩＩＩ分子に基因するＸ−連鎖劣性遺伝病（Ｘ−ｌｉｎ
ｋｅｄ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓ
ｏｒｄｅｒ）であり、出血傾向を生ずる。出血場面（ｂ
ｌｅｅｄｉｎｇ ｅｐｉｓｏｄｅｓ）を抑制するため
に、血友病者は因子ＶＩＩＩで処置される。歴史的に
は、因子ＶＩＩＩはヒト血漿から単離された。しかしな
がら、血漿−由来因子ＶＩＩＩを用いる治療は肝炎及び
ヒト免疫不全ウィルスなどの数種のヒトのウィルスの伝
染を伴ってきた。
【０００３】組み換えＤＮＡ技術が出現し、ヒト因子Ｖ
ＩＩＩ及びその遺伝子の構造が明らかになった。２６個
のエキソンから誘導される遺伝子の転写産物は長さが約
９０００塩基のメッセンジャーＲＮＡであり、２３５１
個のアミノ酸の大きなタンパク質をコードする。因子Ｖ
ＩＩＩの構造的研究は、それがかなりの数の炭水化物残
基を含有する糖タンパク質であることを示している。
【０００４】因子ＶＩＩＩをコードするｃＤＮＡがクロ
ーニングされ、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）
及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で安
定して発現された。血友病Ａの処置のために組み換え因
子ＶＩＩＩを生産する商業的プロセスが開発された。現
在組み換え因子ＶＩＩＩは遺伝子工学的に操作された哺
乳類細胞により製造され、かくして血漿への信頼を取り
除き（ｏｂｖｉａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌｉａｎｃ
ｅ）、考えられるウィルス伝染の危険を最小にしてい
る。
【０００５】遺伝子増幅は治療的タンパク質のための高
生産性細胞系を誘導するために選ばれる方法であった。
増幅戦略は、所望のタンパク質をコードする転写単位を
ジヒドロ葉酸レダクターゼなどの増幅可能なマーカーに
連鎖させること（ｌｉｎｋｉｎｇ）を含む。次いでトラ
ンスフェクション法が適用され、ベクターＤＮＡを受容
細胞に転移させる。メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒ
ｅｘａｔｅ）などの選ばれた薬剤への耐性の向上に関し
て細胞集団を選択する。限界希釈クローニングにより安
定な細胞クローンの確立を行う。次いでこれらの細胞ク
ローンを無血清生産培地に適応させ、所望のタンパク質
の生産に関して監視する。
【０００６】因子ＶＩＩＩのような不安定なタンパク質
の場合、製造及び精製手順の間、安定剤としてヒトアル
ブミンが加えられてきた。アルブミンは低温殺菌により
ウィルス不活化段階に供されるが、ヒト及び動物の血液
タンパク質の完全な不在下で組み換え因子ＶＩＩＩを製
造することができたら理想的である。今回、私は、新規
な細胞培養培地を用いることによりこれが可能であるこ
とを見いだした。詳細を下記に記載する。
【０００７】
【発明の概略】ヒト又は動物−由来血漿タンパク質の不
在下で哺乳類細胞から比較的大量の組み換え因子ＶＩＩ
Ｉ（ｒＦＶＩＩＩ）を連続的に生産するための方法は、
プルロニックＦ−６８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８）
などのポリオールポリマーが補充されたタンパク質を含
まない培地中で哺乳類宿主細胞を培養することを含む。
好ましい培地は硫酸銅、硫酸第１鉄／ＥＤＴＡ錯体なら
びにマンガン、モリブデン、ケイ素、リチウム及びクロ
ムなどの微量金属の塩を含む。
【０００８】
【発明の詳細な記述】組み換えタンパク質発現法におけ
る近年の発達は、哺乳類細胞中で大量にタンパク質を生
産することを可能にしてきた。因子ＶＩＩＩ生産に適し
た宿主細胞には、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細
胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びヒ
ト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞などの細胞系が含まれる。特に
好ましいのはベビーハムスター腎臓細胞であり、Ｗｏｏ
ｄ ｅｔ ａｌ．（１９８４）に記載されているような
因子ＶＩＩＩの発現を方向付けることができる遺伝子で
トランスフェクションされたものが特別に好ましい（ク
ローン変異株及びその子孫などの誘導体を含む）。その
ような細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されており、受理
番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８５４４が指定されている。
【０００９】因子ＶＩＩＩ遺伝子を保有している所望の
宿主細胞系は、典型的に、リポタンパク質が補充された
タンパク質を含まない生産培地中の懸濁培養として生育
するように適応させられる。宿主細胞系の培養のために
選ばれる基礎培地は、本発明にとって重要ではなく、哺
乳類細胞の培養のために適した当該技術分野で既知の培
地のいずれかの１つ又は組み合わせであることもでき
る。Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修正Ｅａｇｌｅ培地（Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＥａｇｌｅＭｅｄｉ
ｕｍ）、Ｈａｍの培地Ｆ−１２（Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉ
ｕｍ Ｆ−１２）、Ｅａｇｌｅの最少必須培地（Ｅａｇ
ｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅ
ｄｉｕｍ）及びＲＰＭＩ−１６４０培地などの培地が商
業的に入手可能である。組み換えインスリンなどの成長
因子の添加は当該技術分野において通常である。
【００１０】因子ＶＩＩＩの不安定性の故に、操作され
た宿主細胞の生産性はタンパク質を含まない条件下で非
常に低下する。組み換えタンパク質の生産のための無血
清培養補充物としてヒト血清アルブミンが通常用いられ
る。ヒト血清アルブミンは： （１）脂肪酸、コレステロール及び親油性ビタミン類、
ステロイドホルモンならびに成長因子のための担体とし
て；（２）剪断力による損傷に対する保護剤として；
（３）ｐＨ変化のための緩衝剤として；ならびに（４）
浸透圧調整剤としてを含む多くの機能を提供する。アル
ブミンの他の重要な役割はおそらく、プロテアーゼのた
めの基質として働くこにより因子ＶＩＩＩなどの不安定
なタンパク質をタンパク質分解から保護することであ
る。
【００１１】アルブミン調剤中に存在する不純物もアル
ブミンの安定化効果に寄与しうる。リポタンパク質（Ｃ
ｈａｎ，１９９６）などの因子は、無血清条件下におけ
る組み換え因子ＶＩＩＩの生産のためのヒト血清アルブ
ミンのための代替物として同定された。
【００１２】ヒト血漿−由来アルブミンを含有しない生
産培地を開発する我々の試みは、本開示の発明、組み換
え因子ＶＩＩＩ生産のための基礎無タンパク質培地に導
いた。好ましい培地は、１０μｇ／ｍｌにおける組み換
えインスリン（Ｎｕｃｅｌｌｉｎ，Ｅｌｉ Ｌｉｌｌ
ｙ）及びＦｅＳＯ4・ＥＤＴＡ（５０μＭ）が補充され
た修正Ｄｕｌｂｅｃｃｏの最少必須培地及びＨａｍのＦ
−１２培地（重量で５０：５０）から成る。因子ＶＩＩ
Ｉ生産を除き、操作されたＢＨＫ細胞はこのタンパク質
を含まない基礎培地中で十分に生育する。
【００１３】驚くべきことに、プルロニックＦ−６８な
どのポリオールの添加は生育に効果を有していなかった
が、因子ＶＩＩＩに関するＢＨＫ細胞の特異的生産性を
増強した。予期しないことに、硫酸銅の添加はさらに因
子ＶＩＩＩの生産を増強する。マンガン、モリブデン、
ケイ素、リチウム及びクロムなどの微量金属の一団の含
有も因子ＶＩＩＩ生産をさらに増加させた。次いでヒト
血漿−由来タンパク質を含有しない条件下における因子
ＶＩＩＩ生産のための連続プロセスが開発された。プル
ロニックポリオールの使用に関するさらなる情報は、Ｐ
ａｐｏｕｔｓａｋｉｓ（１９９１）及びＳｃｈｍｏｌｋ
ａ（１９７７）に見いだすことができる。
【００１４】ポリグリコールであるプルロニックＦ−６
８（ＢＡＳＦ、Ｗｙａｎｄｏｔ）は、通常、撹拌された
培地において起こる発泡を防ぐためならびに散布された
培養（ｓｐａｒｇｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）における剪断
応力及び泡損傷から細胞を保護するために用いられる。
プルロニックＦ−６８は、ポリ（オキシプロピレン）
（２０重量％）の中心ブロック及び両端のポリ（オキシ
エチレン）のブロックから成る平均分子量が８４００の
非イオン性ブロックコポリマーである。プルロニックＦ
−６８の役割に関する広範囲の研究は、プルロニックＦ
−６８が界面活性剤として作用し、撹拌又は散布の間に
バイオリアクター中に生成する泡から細胞のドレナージ
（ｄｒａｉｎａｇｅ）を遠ざけることにより細胞への損
傷を防ぐことを示している。しかし数人の研究者は、剪
断が最小である培養条件下における生育へのプルロニッ
クＦ−６８の有益な効果に気付いた（Ｍｉｚｒａｈｉ，
１９７５；Ｍｕｒｈａｍｍｅｒ ａｎｄ Ｇｏｏｃｈｅ
ｅ，１９９０）。生成物精製の間のプルロニックＦ−６
８との脂質の共−精製は、プルロニックポリマーが界面
活性剤としてアルブミンの代替となるのみでなく、脂質
のための担体としても作用することができるという話題
となる証拠を与える。プルロニックＦ−６８は、おそら
く膜内への直接の挿入により、修復を行うことができる
前に細胞を死亡させないように膜の損傷を防ぐこともで
きる。金属イオン緩衝体として作用する時のプルロニッ
クＦ−６８の役割は完全に未知である。
【００１５】培地中におけるプルロニックＦ−６８は容
量測定的生産性を増加させることができるという報告が
あるが、作用の機構は細胞生存率の維持であると思われ
る（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，１９８９；Ｑｉ，１９９
６）。我々の知識では、これがプルロニックＦ−６８が
特定のタンパク質生成物の特異的生産を増加させること
が観察された最初である。プルロニックＦ−６８を用い
るか又は用いない我々の系において生存率及び生育速度
は比例するので、細胞生存率の維持は我々の系における
プルロニックＦ−６８の作用の機構ではあり得ない。し
かしながら、機構が何であろうと、プルロニックＦ−６
８添加の効果は直接的であり且つ劇的である。
【００１６】ある範囲の他のポリオールが類似の効果を
有するであろうことは予想される。そのような他のポリ
オールには、約１０００〜約１６，０００の範囲の分子
量を有するポリ（オキシエチレン）とポリ（オキシプロ
ピレン）の非イオン性ブロックコポリマーが含まれる。
【００１７】震盪フラスコ、スピナーフラスコ（ｓｐｉ
ｎｎｅｒ ｆｌａｓｋｓ）及びローラーボトル（ｒｏｌ
ｌｅｒ ｂｏｔｔｌｅｓ）などの通常の懸濁培養法の他
に、本発明の方法は潅流及びバッチバイオリアクターと
一緒の使用にも適用できる。宿主細胞の培養に続き、限
外濾過又は遠心分離などの標準的方法により、因子ＶＩ
ＩＩを使用された培地から回収することができる。所望
により、回収された因子ＶＩＩＩを例えばイオン交換又
は寸法排除クロマトグラフィー、イムノアフィニティー
あるいは金属キレートクロマトグラフィーなどにより精
製することができる。
【００１８】本明細書で用いる場合の「ヒト又は動物タ
ンパク質を含まない培地」は、ヒト供給源又は動物供給
源に由来するいずれのタンパク質も含有しない細胞培養
培地である。ヒト又は動物供給源から単離されるタンパ
ク質は、本来、ウィルス汚染を導入する危険を有する。
ヒト又は動物タンパク質を含まない培地の目的は、かく
してウィルス伝染の危険を排除するか又は少なくとも大
きく減少させることである。
【００１９】
【実施例】実施例１ ：因子ＶＩＩＩの発現を方向付けることができ
る遺伝子を用いてトランスフェクションされたベビーハ
ムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞はＧｅｎｅｔｅｃ
ｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃ
ｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から得た。細
胞系をＷｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９８４）に詳細に記
載されている通りに調製し、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、受
理番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８５４４が与えられた。この
細胞系のクローン変異株もＧｅｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎ
ｃ．，から得、すべての実施例において用いた。
【００２０】因子ＶＩＩＩをコードする遺伝子を含有す
るＢＨＫ−２１細胞を、以下：ＨａｍのＦ−１２培地及
びＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培地（重量で５０：５
０）、Ｎｕｃｅｌｌｉｎ（組み換えインスリン、５〜１
０μｇ／ｍｌ）、ＦｅＳＯ4・ＥＤＴＡ（５０μＭ）及
びＭｇＣｌ2（１５ｍＭ）を含有する無血清基礎培地を
用い、震盪フラスコ中の懸濁培養として培養した。細胞
を保持し、４８時間の間隔で継代させた。細胞を８００
×ｇにおいて５分間回転させ、計数し、１ｍｌ当たり１
×１０6個の細胞という密度で再播種した。各フラスコ
は５０〜１００ｍｌの新しい培地を含有する。震盪フラ
スコを回転機上に置き、３７℃でインキュベーション
し、９０〜１１０ｒ．ｐ．ｍ．で穏やかに渦動させるこ
とにより懸濁培養として保持した。下記においてＦ−６
８として示されるプルロニックＦ−６８（０．１％）な
どのポリオール及び硫酸銅（５０ｎＭ）の因子ＶＩＩＩ
生産への効果を震盪フラスコにおいて調べた。因子ＶＩ
ＩＩは色原体アッセイ（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｓ
ｓａｙ）により定量した。アッセイはＣｏａｔｅｓｔＶ
ＩＩＩ：Ｃ／４として既知の試験キットとして市販さ
れ、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓから入手可能である。細胞はこの手順により２４
日間保持された。Ｃｏａｔｅｓｔ ＶＩＩＩ：Ｃ／４キ
ットを用いて決定された各培地における因子ＶＩＩＩ活
性を表１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】＊３６個の試料の平均±標準偏差。細胞は
上記の通り２４日間に及んで因子ＶＩＩＩ生産に関して
監視された。
【００２３】＊＊滴定実験が、０．１％がプルロニック
Ｆ−６８の最適用量であることを示した。０．３％に濃
度を増加させることは因子ＶＩＩＩ生産に有意な影響を
有していなかった。用量−応答実験が、５０〜８００ｎ
Ｍの硫酸銅が因子ＶＩＩＩ生産に最適であることを明ら
かにした。
【００２４】表１に示される通り、単独の又は好ましく
は硫酸銅と組み合わされたプルロニックＦ−６８の添加
は、タンパク質を含まない条件下で、因子ＶＩＩＩをコ
ードする遺伝子を含有するＢＨＫ細胞の力価及び特異的
生産性を有意に増強した。
【００２５】実施例２：タンパク質を含まない条件下に
おける因子ＶＩＩＩの生産をさらに最適化するために、
微量の金属を無タンパク質培地に加えた。次いで実施例
１で記載された連続震盪フラスコ培養系により因子ＶＩ
ＩＩ生産を１６日間評価した。データを表２に示す。硫
酸銅の不在下では、微量金属は因子ＶＩＩＩ生産性に効
果を有していなかった。表２を参照されたい。
【００２６】
【表２】
【００２７】＊金属はＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（５０ｎ
Ｍ）、ＭｎＳＯ4（３ｎＭ）、Ｎａ2ＳｉＯ3・９Ｈ２Ｏ
（１．５μＭ）、［ＮＨ4］6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ２Ｏ（３
ｎＭ）、ＣｒＫ（ＳＯ4）2・４Ｈ2Ｏ（１．５ｎＭ）及
びＬｉＣｌ（２３６ｎＭ）を含む。
【００２８】実施例３：因子ＶＩＩＩ生産への微量金属
及び銅の効果を潅流発酵器においてさらに評価した。２
つの１．５−リットル発酵器に表１に記載の基礎培地を
用い、１ｍｌ当たり２ｘ１０6個という細胞の密度でＢ
ＨＫクローン変異株を播種した。発酵器を０．５リット
ル／日の速度で潅流した。１つの発酵器を標準として保
持し、他の発酵器に表２に記載されている通り、銅及び
微量金属を補充した。発酵器を１ｍｌ当たり約２〜３ｘ
１０6個の細胞という平均細胞密度で１５日間保持し
た。表３に示される通り、プルロニックＦ−６８、銅及
び微量金属の添加は、連続潅流条件下における無タンパ
ク質条件下で、因子ＶＩＩＩをコードする遺伝子を内在
させているＢＨＫ細胞の特異的生産性を有意に増強し
た。この生産法は、沈降タンクなどの細胞保持装置が備
えられた比較的大きな発酵器（２００〜５００リット
ル）に容易に適応させることができる。
【００２９】
【表３】
【００３０】上記の実施例は本発明を例示する手段とし
て示されており、本発明を制限するとみなされるべきで
はなく、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定され
る。
【００３１】本発明の主たる特徴及び態様は以下の通り
である。
【００３２】１．因子ＶＩＩＩのための遺伝子を保有し
ている哺乳類宿主細胞を、ポリオールが補充されたヒト
又は動物タンパク質を含まない培地中で培養することを
含む、因子ＶＩＩＩのための遺伝子を保有している哺乳
類細胞からの組み換え因子ＶＩＩＩの生産方法。
【００３３】２．培地が銅イオンを含む上記１項の方
法。
【００３４】３．ポリオールがプルロニックＦ−６８
（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８）であり、約０．０２５
〜約０．２重量％の範囲の濃度で培地中に存在する上記
１項の方法。
【００３５】４．培地が硫酸銅を約５０〜約８００ｎＭ
の範囲の量で含む上記１項の方法。
【００３６】５．マンガンイオンが約１．５〜約４．５
ｎＭの範囲の量で存在する上記２項の方法。
【００３７】６．モリブデンを含有するイオンが約１．
５〜約４．５ｎＭの範囲の量で存在する上記２項の方
法。
【００３８】７．ケイ素を含有するイオンが約７５〜約
３００ｎＭの範囲の量で存在する上記２項の方法。
【００３９】８．クロムイオンが約１．０〜約４．０ｎ
Ｍの範囲の量で存在する上記２項の方法。
【００４０】９．リチウムイオンが約１２０〜約４８０
ｎＭの範囲の量で存在する上記２項の方法。
【００４１】１０．該哺乳類宿主細胞がベビーハムスタ
ー腎臓細胞、ヒト胚腎臓細胞及びチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞からなる群より選ばれる上記１項の方法。
【００４２】１１．ヒト又は動物タンパク質を含有しな
い、上記１項の方法に従って作られた組み換え因子ＶＩ
ＩＩ生成物。
【００４３】１２．ポリオールを含む基礎培地を含む組
み換え因子ＶＩＩＩの生産のためのヒト又は動物タンパ
ク質を含まない細胞培養培地。
【００４４】１３．銅イオンを含む上記１２項の培地。
【００４５】１４．マンガン、モリブデン、ケイ素、ク
ロム及びリチウムからなる群より選ばれる少なくとも１
種の微量金属を含む上記１３項の培地。
【００４６】１５．インスリンを含む上記１４項の培
地。
【００４７】
【表４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 因子ＶＩＩＩのための遺伝子を保有して
    いる哺乳類宿主細胞を、ポリオールが補充されたヒト又
    は動物タンパク質を含まない培地中で培養することを特
    徴とする、因子ＶＩＩＩのための遺伝子を保有している
    哺乳類細胞からの組み換え因子ＶＩＩＩの生産方法。
  2. 【請求項２】 ヒト又は動物タンパク質を含有しない、
    請求項１の方法に従って作られた組み換え因子ＶＩＩＩ
    生成物。
  3. 【請求項３】 ポリオールを含む基礎培地を含む組み換
    え因子ＶＩＩＩの生産のためのヒト又は動物タンパク質
    を含まない細胞培養培地。
  4. 【請求項４】 銅イオンを含む請求項３の培地。
  5. 【請求項５】 マンガン、モリブデン、ケイ素、クロム
    及びリチウムからなる群より選ばれる少なくとも１種の
    微量金属を含む請求項４の培地。
  6. 【請求項６】 インスリンを含む請求項５の培地。
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