UA66340C2 - Спосіб одержання рекомбінантного фактора viii, рекомбінантний фактор viii, культуральне середовище - Google Patents

Abstract

Рекомбінантний фактор VІІІ може бути одержаний у відносно великих кількостях неперервним способом з клітин ссавців при відсутності білків ссавців, таких як альбумін, шляхом культивування клітин у середовищі, вільному від білка, з додаванням сополімеру поліолу Pluronic F-68 у присутності мікроелементів, таких як мідь. У варіантах реалізації винаходу, яким надається особлива перевага, середовище містить сульфат міді, комплекс сульфату заліза з етилендіамінтетраоцтовою кислотою і солі мікроелементів, таких як марганець, молібден, кремній, літій і хром.

Description

Опис винаходу

Даний винахід загалом стосується одержання рекомбінантного фактора МІ і, зокрема, одержання 2 рекомбінантного фактора МІ! у сироватці або вільному від білка середовищі.

Гемофілія А є зв'язаним з Х-хромосомами рецесивним генетичним захворюванням, яке виникає як наслідок неповноти або недостатності молекули фактора МІ, що зумовлює геморагічну тенденцію. Для контролю випадків кровотечі хворих на гемофілію лікують з використанням фактора МІ. Історично фактор МІ! був виділений з плазми крові людини. Проте, терапія з використанням одержаного з плазми фактора МІ була 70 пов'язана з перенесенням деяких людських вірусів, таких як вірус гепатиту та вірус імунодефіциту людини.

З появою технології рекомбінантної ДНК була з'ясована структура людського фактора МІ та його гену.

Транскриптом гена, що походить з 26 екзонів, є молекула МРНК завдовжки 9000 основ, яка кодує білок, до складу якого входить 2351 амінокислота. Дослідження структури фактора МІ свідчать про те, що він представляє собою глікопротеїн, який містить значну кількість вуглеводневих залишків. 12 КДНК, яка кодує фактор МІ, була клонована і стабільно експресована в клітинах нирки новонародженого хом'яка (ВНК-21) та клітинах яєчника китайського хом'яка (СНО). Для лікування гемофілії А були розроблені промислові способи одержання рекомбінантного фактора МІ. На даний момент рекомбінантний фактор МІЇ одержують з клітин ссавців, підданих обробці методами генної інженерії, таким чином уникаючи необхідності застосування плазми і зводячи до мінімуму будь-який можливий ризик перенесення вірусів.

Ампліфікація генів була способом, із застосуванням якого одержували високопродуктивні клітинні лінії для одержання білків терапевтичного призначення. Стратегія ампліфікації полягає в прив'язуванні транскрибованої ділянки, яка кодує цільовий білок, до ампліфікованого маркера, такого як дигідрофолатредуктаза. Потім для перенесення векторної ДНК до клітин-реципієнтів застосовують техніку трансфекції. Відбирають популяції клітин з підвищеною резистентністю до вибраного препарату, такого як метотрексат. Одержання стійкого клітинного с клону досягають шляхом клонування граничних розведень. Потім ці клітинні клони адаптують до вільного від Ге) сироватки продукційного середовища і контролюють для одержання цільового білка.

У процедурах одержання та очищення лабільних білків, таких як фактор МІЇЇ, в якості стабілізатора додають людський альбумін. Хоча альбумін піддають вірусній інактивації шляхом пастеризації, ідеальною була б можливість одержання рекомбінантного фактора МІ! при повній відсутності білків крові людини та тварин Було о виявлено, що це можливо при використанні нового культурального середовища. Деталі описані нижче. «І

Спосіб неперервного одержання відносно великих кількостей рекомбінантного фактора МІ (рФ МІ) з клітин ссавців при відсутності будь-яких людських або одержаних від тварин білків плазми полягає в культивуванні о клітин-хазяїв ссавця в середовищі, вільному від білка, з додаванням поліольного полімера, такого як Плюронік Ге)

Е-68. Середовище, якому надають перевагу, містить сульфат міді комплекс сульфату заліза з 3о етилендіамінтетраоцтовою кислотою (ЕДТА) та солі мікроелементів, таких як марганець, молібден, кремній, літій ее, і хром.

Останні досягнення в технології експресії рекомбінантного білка дали змогу одержувати білок у великих кількостях у клітинах ссавців. Клітини-хазяї, придатні для одержання фактора МІІЇ, включають такі клітинні « лінії, як клітини нирки новонародженого хом'яка (ВНК), клітини яєчника китайського хом'яка (СНО) та людські З 50 ембріональні клітини нирки (НЕК). Особлива перевага надається клітинам нирки новонародженого хом'яка, с особливо тим, які трансфіковані геном, здатним направляти експресію фактора МІ, як описано у Уоса та ін.

Із» (1984) (включно з похідними, такими як клональні варіанти та їх потомство). Така клітинна лінія була депонована в Американській колекції типових культур, їй було присвоєно вхідний номер АТСС СК -8544.

Необхідна лінія клітин-хазяїв, яка несе ген фактора МІЇЇ, звичайно адаптується до росту у вигляді суспензійних культур у вільному від білка середовищі продукування, до якого додають ліпопротеїн. Основне б середовище, вибране для культивування лінії клітин-хазяїв, не є суттєвим для даного винаходу і може бути

Ге»! одним із середовищ, відомих фахівцям, або поєднанням таких середовищ, що застосовуються для культивування клітин ссавців. Такі середовища, як модифіковане середовище Дюльбекко-Ігла, середовище Хема о Е-12, мінімальне основне середовище Ігла, середовище КРМІ-1640 та подібні є комерційно доступними. «їз» 20 Додавання факторів росту, таких як рекомбінантний інсулін, є відомим фахівцям в даній галузі.

За рахунок лабільної природи фактора МІ! продуктивність клітин-хазяїв, що були піддані генно-інженерній с обробці, в умовах відсутності білка значною мірою знижена. Для одержання рекомбінантних білків звичайно застосовують людський сироватковий альбумін в якості безсироваткової культуральної добавки. Людський сироватковий альбумін виконує ряд функцій включно з: (1) функцією носія жирних кислот, холестерину і 29 ліпофільних вітамінів, стероїдних гормонів та факторів росту; (2) функцією захисного агента від ушкодження

ГФ) клітин внаслідок сил зсуву; (3) функцією буфера при змінах значень рн; і (4) функцією регулятора осмотичного юю тиску. Інша важлива роль альбуміну полягає в захисті лабільних білків, таких як фактор МІ, від протеолізу, служачи при цьому субстратом для протеаз.

Домішки, присутні в препаратах альбуміну, також можуть сприяти стабілізуючому ефекту альбуміну. Для 60 одержання рекомбінантного фактора МІ в безсироваткових умовах в якості замінників людського сироваткового альбуміну були ідентифіковані такі фактори, як ліпопротеїн (Спап, 1996).

Спроба заявника створити середовище для продукування, яке не містить виділеного з людської плазми альбуміну, привела до відкриття об'єкта даного винаходу - основного середовища, вільного від білка, для одержання рекомбінантного фактора МІ. Середовище, якому надається перевага, складається з бо модифікованого Дюльбекко мінімального основного середовища і середовища Хема Е-12 (50:50 за вагою) з додаванням 1Омкг/мл рекомбінантного інсуліну (Нуцелін, фірма Еллі Ліллі), а також 5О0мкМ Резо /ПЕОТА (комплексу сульфату заліза з етилендіамінтетраоцтовою кислотою). У цьому основному середовищі, вільному від білка, клітини ВНК, які були піддані генно-інженерній обробці, росли добре, за винятком продукування фактора МІ.

Несподівано було виявлено, що додавання поліолу, такого як плюронік Е-68, не вплинуло на ріст клітин ВНК, але підвищило їх специфічну продуктивність відносно фактора МІЇїЇ. Також додавання сульфату міді далі посилює утворення фактора МІ. Також включення до середовища мікроелементів, таких як марганець, молібден, кремній, літій і хром, приводить до ще більшого посилення утворення фактора МІ. Потім було розроблено 70 неперервний спосіб продукування фактора МІ в умовах відсутності одержаного з людської плазми білка.

Подальшу інформацію стосовно використання поліолів типу плюроніка можна знайти в роботах Рароцізаків (1991) ії ЗсптоїКа (1997).

Плюронік Е-68, полігліколь (фірма БАСФ, Вйандот) звичайно використовують для запобігання спіненню при перемішуванні культур, для захисту клітин від руйнування та від ушкодження бульбашками барботованій 7/5 Культурі. Плюронік Р-68 є неійонним блоковим співполімером із середньою молекулярною масою 8400 і складається з центрального блоку поліоксипропілену (20ваг. 90) і блоків поліоксиетилену на обох кінцях.

Чисельні дослідження ролі плюроніка Е-68 свідчать, що він діє як поверхнево-активна речовина і запобігає пошкодженню клітин, шляхом відведення клітин від бульбашок, які утворюються у біореакторах при перемішуванні або барботуванні. Однак, деякі дослідники відзначили сприятливу дію плюроніка Е-68 на ріст

Культури в умовах мінімального пошкодження (Міггапйі, 1975; Мигпаттег і Сооспее, 1990). Співочищення ліпідів з плюроніком Е-68 під час очищення продукту підтверджує парадоксальний факт, що полімер Плюронік може не тільки замінювати альбумін в якості поверхнево-активної речовини, але й діяти в якості носія ліпідів.

Плюронік Е-68 може також запобігати пошкодженню мембрани вбиваючими клітинами ще до того, як відбудеться репарація, шляхом передбаченого безпосереднього інтеркалювання в мембрану. Роль плюроніка Е-68, який діє сч ов В 'яКОСТті метал-іонного буфера, є зовсім невивченою.

Незважаючи на повідомлення про те, що плюронік Е-68 при додаванні в середовище може підвищити об'ємну і) продуктивність, механізм його дії, очевидно, полягає у підтриманні життєздатності клітин (Зсппеїдег, 1989;

Оі, 1996). За наявними у заявника даними вперше показано, що плюронік Е-68 посилює специфічне продукування конкретного білкового продукту. Оскільки в заявленій системі життєздатність клітин і швидкості о зо їх росту при додаванні плюроніка Р-68 і без нього є співставлюваними, то у даному випадку механізм дії плюроніка Е-68 не полягає у підтриманні життєздатності клітин. Однак, яким би не був механізм його дії, ефект « додавання плюроніка Е-68 проявляється швидко і помітно. с

Передбачається, що ряд інших поліолів може виявляти подібну дію. Такі поліоли включають неїіонні блокові співполімери поліоксиетилену і поліоксипропілену, які мають молекулярну масу від приблизно 1000 до ісе) приблизно 16000. со

Окрім звичайного обладнання для суспензійного культивування, такого як струшувані посудини, обертальні посудини та перекочувані по роликовому настилу бутилі, спосіб згідно з даним винаходом може також застосовуватися для біореакторів неперервної та періодичної дії. Після культивування клітин-хазяїв фактор

МШП може бути виділений з відпрацьованого середовища з допомогою стандартних прийомів, таких як « ультрафільтрація або центрифугування. При необхідності регенерований фактор МІ може бути очищений з с хроматографією, наприклад іонообмінною, ексклюзійною, імуно-афінною або метал-хелатною і т. п. . Використовуваний тут термін "середовище, вільне від білка людини або тварини" означає культуральне и? клітинне середовище, в якому немає білків, одержаних від людини або тварини. Білки, виділені з людських джерел або від тварин, спадково супроводжуються ризиком вірусного інфікування. Ціллю створення середовища, вільного від білка людини або тварини є виключення або принаймні значне зниження небезпеки б передачі вірусу.

Приклад 1

Ме, Клітини нирки новонародженого хом'яка (ВНК-21), трансфіковані геном, здатним направляти експресію 2) фактора МІ, були одержані від фірми Дженентек, Інк., Південний Сан-Франциско, Каліфорнія, США (Сепепіесі, боро |пс.). Клітинна лінія була одержана, як детально описано у Уоса та ін. (1984), і депонована в Американській ве колекції типових культур під вхідним номером АТСС СКІ -8544. Клональний варіант цих клітин одержували також о від фірми Дженентек, Інк., і застосовували в усіх прикладах.

Клітини ВНК-21, які містять ген, що кодує фактор МІ, культивували у вигляді суспензійних культур У струшуваних посудинах із застосуванням безсироваткового основного середовища, яке містило: середовище дв Хема Б-12 І мінімальне основне середовище Дюльбекко (50:50 за вагою), нуцелін (рекомбінантний інсулін, 5-10мкг/мл), комплекс ЕДТА з РезО, (50мкМ) і МаСі» (15мММ). Клітини витримували і пасажували з 48-годинними

Ф, інтервалами. Клітини центрифугували при 800 х д протягом 5 хвилин, рахували і пересівали з густиною ко 1х10бклітин/мл. Кожна посудина містила 50-100мл свіжого середовища. Посудини для струшування розташовували на обертальному пристрої, інкубували при 37"С і підтримували у вигляді суспензійної культури бо шляхом обережного обертання із швидкістю 90-110 обертів/хвилину. Вплив поліолу, такого як плюронік Е-68 (0,195), позначеного нижче як Е-68, і сульфату міді (5ХОНМ) на продукування фактора МІІЇ досліджували у посудинах для струшування. Фактор МІЇЇ кількісно визначали хромогенним аналізом. Реагенти для аналізу комерційно доступні у вигляді тест-набору, відомого під назвою Коатест МІ:С/4 (Соаїеві МІП:С/4), який поставляється фірмою Бекстер Хелс Кеєр Продактс (Вахіег НеаїЇ(йсаге Ргодисів). Таким способом клітини 65 Підтримувались протягом 24 днів. Активність фактора МІ у кожному середовищі, визначена з допомогою

Коатест МІП:С/4, наведена у Таблиці 1.

во бяюве середовне олег 00000006 тки 1000000 твввюляюх 10000000 тім 1 " Середнє значення від 36 зразків - стандартне відхилення. Утворення фактора МІЇІ в клітинах контролювали протягом 24 днів, як описано вище. "я Титрувальні експерименти показали, що оптимальна доза плюроніка Е-68 становить 0,195. Збільшення 75 концентрації до 0,3 90 не виявило значного впливу на утворення фактора МІЇЇ. Залежні від дозування експерименти показали, що для утворення фактора МІІЇ оптимальною є концентрація сульфату міді 50-ВООНМ.

Як показано в Таблиці 1, в умовах відсутності білка додавання лише самого плюроніка Е-68 або, переважно, в поєднанні з сульфатом міді значно підвищує титр і специфічну продуктивність клітин ВНК, які містять ген, який кодує фактор МІ.

Приклад 2

З метою подальшої оптимізації способу одержання фактора МІ! в умовах відсутності білка, до вільного від білка продукційного середовища додавали мікроелементи. Утворення фактора МІ оцінювали з використанням культуральної системи неперервно струшуваних посудин, як описано у прикладі 1, протягом 16 днів. Дані наведені у Таблиці 2. При відсутності сульфату міді мікроелементи не виявляли впливу на продукування Га фактора МІІІ. Див. Таблицю 2. о

Основне середовище ояеолт 0 0000000ообюю 00000000

СДН Ес ННЯ ННЯ ПОН НН НА

ЗСУ ТИННННИ ПОН ПОН НО КК:

Фо зежвюсих метали (Се) " Метали включають Си5зО)05Н2О (50НМ), МизО) (ЗНМ), Ма»зіОзп9НьО (1,5мкМ), (МН.а)бМо705414Н50 (ЗНМ), Стк(504)274Н20 (1,5НМ) і ГІСІ (236нМ).

Приклад З «

Вплив мікроелементів і міді на продукування фактора МІ! далі оцінювали в перфузійному ферментері. Два ферментери по 1,5л кожен засівали клональним варіантом клітин ВНК з густиною 2х109 клітин/мл із ші с застосуванням основного середовища, описаного у Таблиці 1. Ферментер перфузували із швидкістю О,бл/день. "з Один ферментер служив контролем, у другий додавали мідь та мікроелементи, як описано у Таблиці 2. У " ферментерах підтримували середню густину клітин на рівні приблизно 2-3х105 клітин/мл протягом 15 днів. Як показано в Таблиці 3, при відсутності білка додавання плюроніка Е-68, міді і мікроелементів в умовах безперервної перфузії значно посилювало специфічну продуктивність клітин ВНК, які містять ген, що кодує

Ме фактор МІ. Цей спосіб одержання може бути легко адаптований до більших ферментерів (200-500л), оснащених б пристроєм, який утримує клітини, таким як сепаратор. о в» с о 81 вою т 810051ом во 80001106 бо 14 0,03 0,06

Наведені вище приклади є лише ілюстрацією і не носять обмежувального характеру для даного винаходу, об'єм охорони якого визначається формулою винаходу.

Claims (12)

Формула винаходу

1. Спосіб одержання рекомбінантного фактора МІЇЇ, що включає культивування клітин-хазяїв ссавців, які 70 містять ген, що кодує фактор МІ, у присутності поліолів, виділення рекомбінантного фактора МІЇЇ, і, У разі необхідності, його очистку, який відрізняється тим, що культивування здійснюють в присутності іонів міді в середовищі, вільному від білка, що походить від плазми, а як поліол використовують Рішгопіс Е-68 в концентрації від приблизно 0,025 до приблизно 0,3 95 від ваги середовища.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як поліол використовують Рішгопіс Е-68 в концентрації від приблизно 0,025 до приблизно 0,295 від ваги середовища.

3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що іони міді додають у формі сульфату міді, що використовується у кількості від приблизно 50 до приблизно 800 нмоль.

4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що культивування здійснюють у середовищі, яке додатково містить іони марганцю в кількості від приблизно 1,5 до приблизно 4,5 нмоль.

5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що культивування здійснюють у середовищі, яке додатково містить іони молібдену в кількості від приблизно 1,5 до приблизно 4,5 нмоль.

6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що культивування здійснюють у середовищі, яке додатково містить іони кремнію в кількості від приблизно 75 до приблизно 300 нмоль.

7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що культивування здійснюють у середовищі, яке додатково містить сч 29 іони хрому в кількості від приблизно 1,0 до приблизно 4,0 нмоль. Ге)

8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що культивування здійснюють у середовищі, яке додатково містить іони літію в кількості від приблизно 120 до приблизно 480 нмоль.

9. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як клітини-хазяї використовують клітини, вибирані з групи, що о складається з клітин нирки новонародженого хом'яка, людських ембріональних клітин нирки та клітин яєчника китайського хом'яка. чу

10. Рекомбінантний фактор МІ, одержаний згідно зі способом за п. 1, при цьому він вільний від білка, що со походить від плазми.

11. Культуральне середовище для одержання рекомбінантного фактора МІ, що містить основне (Се) середовище, яке включає поліол, і клітини ссавців, що містять ген, який кодує фактор МІ, яке відрізняється со Зо тим, що основне середовище містить іони міді в кількості від приблизно 50 до приблизно 800 нмоль, при цьому середовище вільне від білка, що походить від плазми, а поліол, що представляє собою Рішигопіс Е-68, міститься у концентрації від приблизно 0,025 до приблизно 0,295 від ваги середовища.

12. Культуральне середовище за п. 11, яке відрізняється тим, що додатково містить принаймні один « мікроелемент, вибраний з групи, яка складається з марганцю, молібдену, кремнію, хрому та літію. З7З с 70 13. Культуральне середовище за п. 11, яке відрізняється тим, що додатково містить рекомбінантний інсулін. з Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2004, М 5, 15.05.2004. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. (о) (о) (95) щ» (42) іме) бо б5