CZ117998A3 - Způsob stabilizace biologických materiálů a přípravky k provádění tohoto způsobu - Google Patents

Způsob stabilizace biologických materiálů a přípravky k provádění tohoto způsobu Download PDF

Info

Publication number
CZ117998A3
CZ117998A3 CZ981179A CZ117998A CZ117998A3 CZ 117998 A3 CZ117998 A3 CZ 117998A3 CZ 981179 A CZ981179 A CZ 981179A CZ 117998 A CZ117998 A CZ 117998A CZ 117998 A3 CZ117998 A3 CZ 117998A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
drying
substances
mixtures
derivatives
glass transition
Prior art date
Application number
CZ981179A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ293456B6 (cs
Inventor
Markus Mattern
Gerhard Winter
Original Assignee
Roche Diagnostics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7775640&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ117998(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Roche Diagnostics Gmbh filed Critical Roche Diagnostics Gmbh
Publication of CZ117998A3 publication Critical patent/CZ117998A3/cs
Publication of CZ293456B6 publication Critical patent/CZ293456B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A61K38/443—Oxidoreductases (1) acting on CH-OH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F26—DRYING
    • F26B—DRYING SOLID MATERIALS OR OBJECTS BY REMOVING LIQUID THEREFROM
    • F26B5/00—Drying solid materials or objects by processes not involving the application of heat
    • F26B5/04—Drying solid materials or objects by processes not involving the application of heat by evaporation or sublimation of moisture under reduced pressure, e.g. in a vacuum

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Drying Of Solid Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medical Preparation Storing Or Oral Administration Devices (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Storage Of Fruits Or Vegetables (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

(57) Anotace:
Způsob výroby suchých, částečně amorfních produktů, obsahujících biologicky, zejména terapeuticky aktivní materiál, které představují makroskopicky homogenní směsi substancí, přičemž tyto směsi substancí jsou zvoleny tak, že obsahují alespoň po jedné substanci ze skupiny /1/ sacharid nebo amfoterní iont s polárním zbytkem a jejich deriváty t a /11/ amfoterní lont s nepolárním zbytkem a jeho deriváty, vyznačující se tím, že še vyrobí roztok biologického nebo terapeuticky . aktivního materiálu a substanci /1/ a /ii/ a tento roztok se při teplotě produktu vyšší než teplota mrazu tohoto roztoku suší. Nové směsi substancí, které se získají pomocí uvedeného způsobu, jakož i jejich použití při diagnostických a terapeutických metodách.
Způsob stabilizace biologických materiálů a přípravky k provádění tohoto způsobu
Oblast techniky
Předložený vynález se týká způsobu stabilizace biologických materiálů pomoci sušeni bez zmrazování a přípravků k provádění tohoto způsobu. Přitom se cíleně popisují zvolené í směsi cukrů a aminokyselin a jejich deriváty, jakož i růz* ných aminokyselin a jejich deriváty, pomocí kterých je možno dosáhnout po výrobě suchých, částečně amorfních produktů pomocí sušení bez zmrazování, obzvláště výhodné stabilizace peptidu, proteinů, glykoproteinů, protilátek a podobných substancí.
Dosavadní stav techniky
Výroba přípravků biologicky aktivních a terapeutických látek, jako jsou peptidy, proteiny, glykoproteiny, nukleotidy, plazmidy, buněčné fragmenty, .viry, atd., které jsou stabilní při skladování (zejména při pokojové teplotě), pro diagnostické a terapeutické účely má dnes velký, stále rostoucí význam.
I F
Popsány jsou rozličné formulace a způsoby výroby suché‘ ho biologicky nebo terapeuticky aktivního materiálu. Pod suchým materiálem se rozumějí látky a směsi látek, které mají zbytkovou vlhkost nanejvýš 8 % hmot., přednostně nanejvýš 4 % hmot., obzvláště přednostně nanejvýš 2 %. Lyofilizačni postupy jsou velmi rozšířeny [F. Franks, Cryo Lett. 11, 93 110, (1990); M. J. Pikal, Biopharm. 3 (9), 26 - 30 (1990);
M. Hora, Pharm. Research 8 (3), 285 - 291 (1992); F. Franks,
999 9 99
Jap. J. Freezing Drying 38, 15 - 16, (1992)], mají však nevýhody. Spotřebují velká množství energie, vyžadují použití částečně škodlivých chladiv (Frigene), trvají dlouhou dobu. Pro velký počet substanci, zejména pro proteiny, je krok zmrazování, nutný pro lyofilizaci, škodlivý, tj. destabilizující. Proto je tento způsob pro mnoho biologických materiálů zcela nepoužitelný.
Alternativami pro lyofilizaci při výrobě suchých proteinových přípravků jsou způsoby, při kterých se materiál suší pomocí využití tepla nebo vakua [F. Franks, R. Μ. H. Hatley: Stability and Stabilization of Enzýmes; Eds. W.. J. J. van den Teel, A. Harder, R. M. Butlaar, Elsevier Sci, Publ. 1993, str. 45 - 54; B. Roser, Biopharm, 4(9), 47 - 53 (1991); J. F. Carpenter, J. H. Crowe, Cryobiol. 25, 459 470 (1988)]. Zde je možno uvést například vakuové sušeni s použitím nebo bez použití zvýšené, teploty, sušení rozprašováním v nejrůznějších modifikacích včetně kombinovaného využití vakua a techniky rozprašování, jakož i sušení na válcích a jiné způsoby sušení v tenké vrstvě.
V J. F. Carpenter, J. H. Crowe, Biochemistry 2J3, 3916 3922 (1989); K. Tanaka, T. Taluda, K., Miyajima, Chem. Pharm. Bull. 39 (5), 1091 - 94 (1991), DE-C-3520228, EP-B-0229810, WO 91/18091, EP-B-0383569, US 5,290,765 jsou popsány přípravky, které obsahují cukry nebo cukernaté látky. Při výrobě suchých přípravků obsahujících cukry je možno při způsobech popsaných v dosavadním stavu techniky stanovit následující nevýhody·, popřípadě problémy: Výroba skutečně dostatečně suchých přípravků obsahujících cukry není možná bez signifikantního energetického nároku. To. platí obzvláště pro přípravky v konečném balení. Přitom se počítá s využitím
Φ · · tepla/horka, které se však musí vzhledem ke stabilitě použitých biologických materiálů hodnotit velmi kriticky. Aby se dosáhlo dostatečného vysušení při malém dodávání tepla, je možno alternativně využít drasticky prodloužených dob procesů nebo extrémně tenkých tlouštěk vrstev. Oba postupy však nevedou k cíli. Dlouhé doby procesů jsou ekonomicky velmi nevýhodné, kromě toho je dlouhé setrvání biologické účinné látky v matrici, která jen pomalu ztrácí vodu, destabilizuj icí, a tím rovněž kritické. Sušení tenkých tlouštěk vrstev nevede v mnoha případech k ekonomicky významnému výtěžku produktu, tj. za časovou jednotku a/nebo na sušicí plochu se získají jen minimální množství produktu. Kromě to^ ho je zpracování biologických materiálů na velmi velkých otevřených sušicích plochách těžko realizovatelné na častokrát žádoucí sterilitu při farmaceutické a diagnostické aplikaci.
Sušení, která probíhají pomocí vakua při nízké teplotě nebo při teplotě nepatrně zvýšené ve srovnání s pokojovou teplotou, jsou šetrná. Výroba suchých přípravků, obsahujících cukry, stabilních při skladování je však v mnoha případech prakticky stěží proveditelná. Při vysoušení roztoků cukrů vznikají přibývajíc viskózní, houževnaté látky. Množství zbytkové vody zůstávající v těchto látkách nebo zbytkovou vlhkost nelze odstranit za ekonomicky výhodnou dobu, v mnoha případech se sušení, na vysoké úrovni, nevhodné ke stabilizaci, zastaví. Degradace se projevuje například ztrátou aktivity uskladněného materiálu, tvorbou agregačních produktů nebo výskytem produktů degradace s nízkou molekulovou hmotností. Nízký obsah zbytkové vody vhodný ke stabilizaci proteinů atd. je možno rozeznat na základě fyzikálních měřených veličin. Ze shora citované literatury vyplývá, že • · · · · ·
přípravky vhodné ke stabilizaci proteinů atd. mají vykazovat sklovitou, tj. amorfní strukturu, jejichž teplota skelného přechodu je vyšší než požadovaná teplota uskladnění. Teplota skelného přechodu je teplota, při které amorfní tuhá látka přechází ze sklovitého stavu do houževnatého viskózního stavu a naopak. Přitom se vyskytují prudké změny viskozity a s tím spojené změny koeficientu difúze a kinetické mobility proteinů a jiných molekul. Fyzikální parametry, jako tvrdost a modul, se mění právě tak jako termodynamické stavové veličiny objem, entalpie a entropie. Teplota skelného přechodu například látky obsahující cukry a její obsah zbytkové vody jsou fyzikálně navzájem spojeny tak, že stoupající množství zbytkové vody vedou ke klesajícím teplotám skelného přechodu a naopak. Tím je možno z měření teploty skelného přechodu vyvozovat například pomocí „Differential Scanning Calorimetrie (DSC)), zda přípravek vykazuje obsah zbytkové vody vhodný ke stabilizaci, popřípadě jak se výše rozvádí, zda je postup sušení úspěšný nebo nikoli. Kromě stanovení teploty skelného přechodu pomocí DSC je možno doložit existenci amorfních struktur také pomocí zkoumání rentgenové difrakce, optických pozorování a pozorování elektronovým mikroskopem.
Žádoucí je proto dát k dispozici stabilizační matrici pro biologicky nebo farmaceuticky aktivní materiály s teplo-, tou skelného přechodu vyšší, než je teplota uskladnění, která obsahuje malou zbytkovou, vlhkost, a způsob nepříliš nákladné výroby takových stabilizačních matric.
Podstata vynálezu
Překvapivě se zjistilo, že pomocí přidání amfoternich iontů s nepolárními zbytky k látkám obsahujícím sacharidy lze jejich chování při sušeni pozitivně změnit tak, aby předtím špatně schnoucí materiály, které podle toho nevykazovaly žádné dostatečně stabilizující vlastnosti, bylo možno nyní velmi rychle sušit a aby způsobovaly vynikající stabilitu biologicky, zejména terapeuticky aktivních materiálů, v nich obsažených.
Dále se zjistilo, že překvapivě také formulace bez sacharidů sestávající ze směsí určitých amfoternich iontů je možno velmi rychle sušit a že vykazují velmi dobré stabilizující vlastnosti. Přitom se musí použít amfoterního iontu s polárním zbytkem společně s amfoterním iontem s nepolárním zbytkem. Takovými amfoterními ionty jsou přednostně aminokyseliny a jejich deriváty, obzvláště přednostně farmaceuticky snesitelné aminokyseliny. Pod amfoterními ionty se rozumějí nízkomolekulové sloučeniny, jejichž molekulová hmotnost je menší než 10 kDa, přednostně menší než 5 kDa (1 Da (dalton) = 1, 660.10-27 kg). Popisují se způsoby, které bez použiti zvýšené teploty, tj. při pokojové teplotě umožňuji sušit přípravky podle vynálezu tak, aby se pro přípravky k stabilizaci biologicky aktivních, zejména terapeuticky aktivních substancí dosáhlo vhodných teplot skelného přechodu. Biologicky aktivními substancemi jsou kromě terapeuticky účinných substancí i takové, kterých se používá v biolotechnologických procesech, jako je například fermentace. Rovněž takové substance, kterých se užívá.například na ochranu rostlin nebo jako insekticidů. Takovými biologicky, zejména terapeuticky aktivními materiály může být jedna nebo více substancí zvolených ze souboru zahrnujícího proteiny,, peptidy/ glykoproteiny, lipoproteiny, enzymy, koenzymy, biolo • ·· gické membrány, protilátky, fragmenty protilátek, buňky, složky buněk, viry, složky virů, vakciny, DNA, RNA, PNA, plazmidy, vektory, feromony, biologická terapeutika a diagnostika a jejich deriváty. Biologicky aktivními substancemi nejsou míněny žádné potraviny jako takové.
Zvláštní výhody tu popsaných přípravků a způsobů spočívají v tom, že se upouští od zmrazování v průběhu sušeni, provádění sušení je možné pomocí lyofilizačnich zařízeni již existujících v chemicko-farmaceutickém průmyslu bez jakéhokoli přestavování, plnění, obzvláště výhodné k aseptické výrobě, se může beze změny uchovávat v nádobáchobvyklých v obchodě, například ve skleněných lahvičkách, provozní doby jsou řádově jako u lyofilizačnich postupů a mnohem menši, může se použít toxikologicky nezávadných pomocných látek, mohou se ušetřit všechna množství energie potřebná ke zmrazování a použití chladiv zhoršujících životni prostředí se může prudce snížit, získané produkty představují dobře viditelný, rychle se znovu rozpouštějící „koláč, pomocí rychlého dosaženi částečně amorfního stavu biologický materiál· méně degraduje než pomocí způsobů popsaných v dosavadním stavu techniky.
Zjistilo se, že zvláštní výhody tu popsaných receptur z určitých směsí cukrů a aminokyselin, jakož i určitých směsí alespoň 2 aminokyselin působí také, když se použijí v rámci jiných postupů sušení, které se vyhýbají zmrazování. Také při sušení rozprašováním, sušení na válcích atd. se úplně projevuje působení přísad urychlující sušení, jakož i vlastnost přípravků vytvářet amorfní nebo částečně amorfní systémy.
Podstatné je, že jsou k dispozici pomocí DSC a/nebo rentgenové strukturní analýzy nebo jiných vhodných způsobů dokazatelně signifikatní amorfní podíly a přípravek nemá úplně krystalický charakter. Krystalické přípravky nejsou vhodné k tomu, aby se dosáhlo dostatečné stability u citlivých biologických látek. Úplně amorfní přípravky jsou vhodné ke stabilizaci, a tím jsou principiálně přípravky podle vynálezu, obzvláště však částečně amorfní přípravky.
Přehled obrázků na výkresu
Obr. 1 a: Teploty skelného přechodu jednotlivých směsí maltózy a L-fenylalaninu;
Obr. 1 b: Obsah zbytkové vody v jednotlivých směsích maltózy a L-fenylalanínu
Obr. 2: Difraktogramy prášků ve vakuu sušených (a) fenylalaninu (obsah vody 1,2 %/krystalický), » · 4 · ·· « · »· , · * · ·· · · *·· · * • · * · · · ♦ · · · .«*· ·· ·· ·· ·* *· (b) maltózy (obsah vody 4,0 %, Tg = 50 °C) a (c) fenylalaninu a. maltózy připravených způsobem podle vynálezu (obsah vody 0,7 %, Tg = 88 °C).
Difraktogramy se snímaly pomocí konvenčního přístroje (Phillips 1730 X-ray) a příslušného software. Teplota měření: 25 °C, úhel rozlišení (2Θ) 0,05 podmínky měření: 1 s na úhel při napětí elektronky 40 kV a proudu 40 mA.
Obr. 3: Časový průběh (a) obsahu zbytkové vody a (b) teploty skelného přechodu přípravku z maltózy a fenylalaninu podle vynálezu.
Podrobný popis vynálezu
Ve 13 příkladech a 10 srovnávacích příkladech je vynález exemplárně vylíčen a objasněn. Přitom se se objevily formulace a způsoby, které prudce zlepšuji a urychlují sušeni látek obsahujících cukry pomocí vakuového sušení a jsou vhodné ke stabilizaci relevantních terapeutických a diagnostických biologických materiálů. Dále se objevují úplně nová složení, která splňují účel stabilizace za zachování optimalizovaných charakteristik sušení.
Tato složení obsahují přednostně buď alespoň jeden amfoterní iont s nepolárním zbytkem (například aminokyselinu, jako fenylalanin) a cukr, přičemž teplota skelného přechodu cukru je pomocí přísady tohoto amfoterního iontu zřetelně zvýšena. Alternativně se mohou použit také směsi různých speciálně zvolených aminokyselin nebo jejich deriváty. Tyto směsi se skládají z jednoho amfoterního iontu s nepolárním • ·· • φ · ♦ zbytkem a z jednoho amfoterního iontu s polárním zbytkem. K těmto směsím se mohou přidávat také ještě cukry.
Jako pracovní hypotéza se objevilo, že výsledky žádané podle vynálezu poskytují obzvláště směsi cukru nebo polární amfoterní substance (například argininu, kyseliny asparagové, kyseliny glutamové, histidinu, citrulinu, lysinu) a nepolární amfoterní substance (například fenylalaninu, isoleucinu, methioninu, valinu, alaninu, glycinu, tryptofanu, cysteinu) nebo jejich deriváty (například acetylfenylalaninethylester). Je možno snadno jak obměňovat způsob, tak i rozšiřovat seznamy látek popsané na základě příkladů.
Obzvláště přednostními biologicky nebo terapeuticky aktivními materiály jsou protilátky (monoklonální nebo polyklonální), enzymy a lidské .proteiny, popřípadě lidské peptidy, jako například rekombinantní lidský erytropoetin (rhEPO), rekombinantní lidský faktor stimulující kolonie granulocytů (granulocyten colony stimulating factor (rh-G-CSF)) nebo rekombinantní aktivátor plazminogenu (rPA), nGF, PTH, ularitidy, plazmidy, viry, GUP, BP-5.
Na přípravcích bez účinné látky se dopracovalo toho, jakým způsobem přísada aminokyselin změní sušení matric obsahujících.cukry. V příkladu 1 je znázorněno, že přísada fenylalaninu a argininu k maltóze zlepšuje její chování při sušení v závislosti na přidaném množství těchto příměsi. Teplota skelného· přechodu se dá pomocí cílené přísady těchto pomocných látek zvýšit o více než 65 K za stejných podmínek sušení, korespondující obsah zbytkové vody se dá snížit snadno na méně než 1 %. Z příkladu 1 vyplývá, že přitom použitý způsob vede po dobu 48 h bez jakéhokoli působeni tepla φ «· · · » · ·» • · ·*· · · · · ♦· · · · · · · · · · · *··· ·· ·· ·· ·· ♦· k žádoucímu výsledku. Maltóza bez pomocných látek přidaných podle vynálezu vykazuje za těchto podmínek obsah zbytkové vody 7 - 8 %, teplota skelného přechodu (Tg) je nižší než pokojová teplota, a tedy tento systém není vhodný ke stabilizaci proteinů atd..
Výrobou přípravků podle vynálezu ze sacharózy a jedné aminokyseliny ze skupiny aminokyselin vhodných podle vynálezu k výrobě stabilizujících, částečně amorfních produktů se dosáhne zabránění určitých nevýhod u formulace se sacharózou, zatím co se výhody vlastní sacharóze mohou zcela projevit. Sacharóza má ve srovnání s jinými, v literatuře zmíněnými cukry relativně nízkou teplotu skelného přechodu při přiměřeně normovaných obsazích vody. Proto· je při výrobě suchých.přípravků obsahujících sacharózu obzláště obtížné dosáhnout vysokých Tg, které jsou zřetelně-vyšší než požadovaná teplota uskladnění. Dále je obtížné převést sacharózu pomocí sušení odpařováním zcela na amorfní formu, cukr snadno vykrystalizuje, a tím snadno vytváří krystalickou strukturu nevýhodnou pro stabilizaci biologických účinných látek. Kromě toho se pozorovalo, že amorfní sacharóza v průběhu skladování'srovnatelně rychle tvoří ve velké míře krystaly a po uplynutí určitých dob uskladnění může úplně krystalizovat. Také při tomto procesu ztrácí takový přípravek své stabilizující -vlastnosti. Všechny tyto problémy, rizika a nedostatky spojené s použitím sacharózy se mohou odstranit podle vynálezu pomocí přísady aminokyselin z vhodné skupiny. Obzvláště přednostní je přitom použití fenylalaninu a argininu (příklad 2). Ve srovnávacím příkladu Ά se ukázalo, že rovněž za použití delších dob sušení a zvýšené teploty nelze čisté cukry účinně sušit. Účinku aminokyselin a cukru zlepšujícího sušení se dá dosáhnout jak pomocí jednotlivých ' I 'η · ··· · ♦ · · · · · · · * · * ·· · · * -.-. ······» · ♦ · 11 »M1 ·♦ ·· ·· ·· ♦· aminokyselin, tak pomocí směsí aminokyselin. Příklady 3 a 4 k tomu poskytují příslušné výsledky na maltózových a sacharózových směsích. Byly nalezeny rovněž aminokyseliny, které nemají žádné účinky zlepšující sušení, například histidin (srovnávací příklad B). V příkladu 5 se ukazuje, že kromě aminokyselin mohou také jejich strukturně příbuzné deriváty mít účinky zlepšující sušení. Výběr určitých aminokyselin se podrobně, i když ne omezujíc nebo zcela obsáhle popisuje v příkladu 6. Je možno zachytit,.že při dalším nezpůsobuje každá aminokyselina požadovaný účinek, nýbrž jen určité aminokyseliny. Rovněž míra účinků je rozdílná, takže se mohou jmenovat obvzláště přednostní kombinace nebo přípravky. Těmito jsou především fenylalanin, tryptofan, leucin a isoleucin. Z příkladu 1 a 6 se dá dále odvodit, že.je možná směs aminokyselin za zachování účinku zlepšujícího sušení. Arginin samotný neprojevuje žádný pozitivní účinek, ale sice vesměs! s fenylalaninem.
Chováni,aminokyselin při vakuovém sušení se zkoumalo za účelem zjištění, zda také bez matrice obsahující cukry pomocí aminokyselin je možno obdržet přípravky, které mají teplotu skelného přechodu vyšší než teplota místnosti. Překvapivě se zjistilo, že čistá aminokyselina samotná vytváří jen krystalické struktury, zatímco určité soli aminokyselin a směsi aminokyselin vytvářejí sklovité matrice (srovnávací příklad C a příklad 7). Pro výrobu amorfních struktur je třeba volit aminokyseliny cílevědomě různě. Překvapivě se zjistilo, že aminokyseliny lze rozdělit do 2 skupin, které vykazují zjevně rozdílné vlastnosti. Z každé skupiny je potřebné vybrat alespoň jednu aminokyselinu a připravit vhodnou směs a tuto sušit. Tak jako u formulace směsí cukrů a aminokyselin je rovněž zde potřebný určitý poměr míšení k tomu, aby se obdržely přípravky podle vynálezu (příklad 7). Potom se obdrží matrice s amorfními podíly, která je vhodná ke stabilizaci biologických účinných látek.
Účinnost zlepšeného sušení vzhledem k vlastnímu cíli, stabilizaci biologicky aktivního materiálu, exemplárně znázorněný na proteinech, se podrobně dokládá v příkladech 8 12 a ve srovnávacích příkladech D - J. Příklady 8 a 9 se srovnávacími příklady D - G popisují stabilizaci rh-G-CSF, příklad 10 a srovnávací příklad H stabilizaci erytropoetinu a příklady 11 a 12, jakož i srovnávací příklady I a J stabilizaci laktátdehydrogenázy. Na základě dob uskladnění proteinu (rh-G-CSF, příklady 8 a 9, popřípadě srovnávací příklady D, E a F, G), glykoproteinu (rh-EPO, příklad 10· a srovnávací příklad H) a enzymu (LDH, příklady 11, 12 a srovnávací příklad I a J) se příkladně ukazuje překvapivě velmi zlepšená stabilita při skladování přípravků podle vynálezu v porovnání s přípravky sušenými.ve vakuu bez pomocných látek a s dalšími přípravky. Změny rozličných přípravků rh-G-CSF za skladovacích podmínek při rozličných teplotách se znázorňují v příkladech. Pouze přípravky podle vynálezu, tj. částečně amorfní, sklovité přípravky neprojevují po 6 měsících žádnou pozoruhodnou degradaci v rozsahu teplot uskladnění od několika °C (chladnička) až do 40 °C (příklady 8 a 9). Vhodné přípravky sušené za vakua bez pomocných látek (srovnávací příklad D) projevují při pokojové teplotě a zvýšené teplotě (40 °C) zřejmý úbytek monomeru až do 20 %. Přípravky, které nejsou amorfní, nýbrž houževnaté, viskózní, které jsou skladovány při teplotě vyšší než teplota skelného přechodu, projevují již při pokojové teplotě po 5 týdnech signifikantní úbytky .koncentrace monomeru (srovnávací příklady D a E). Krystalické přípravky (srovnávací příklad G á J) ukazují • ·· • · · • · · ··♦· ♦· • · ·· ’ · t » · 9 9 ··· * · · · · · · * ·» ·· ·· *♦ právě tak signifikantně zkrácené doby uskladnění. Z porovnáni příkladu 8 a srovnávacího přikladu E se ukazuje,, že při zvýšené teplotě uskladněni (40 °C) přísada aminokyselin k maltóze jako stabilizátor více než zdesateronásobí dobu uskladnění, při které méně než 10 % monomerů G-CSF agreguje. Porovnáni příkladu 9 se srovnávacím příkladem G ukazuje, že také volba aminokyselin je rozhodující pro velmi prodlouženou dobu uskladnění. Porovnání podílu monomeru u glykoproteinu EPO (příklad 10, srovnávací příklad H) ukazuje, že přípravky podle vynálezu při -pokojové teplotě a zvýšené teplotě uskladnění jsou ve srovnání s EPO sušeným ve vakuu bez pomocných látek zřetelně výhodnější. Při 5-týdenním skladování citlivého enzymu LDH jako přípravků podle vynálezu (příklady 11 a 12) ve srovnání s LDH sušeným ve vakuu bez pomocných látek (srovnávací příklad I) a krystalickým přípravkem (srovnávací příklad J) se ukazuje, že pouze přípravky podle vynálezu se mohou skladovat při pokojové teplotě nebo při vyšších teplotách uskladnění (30 ’C) bez drastické ztráty aktivity. Pozoruhodná přitom je také přídavná stabilizace enzymu pomocí přípravku podle vynálezu přímo po přípravě vzorků (aktivita při 0 týdnů > 80 % oproti 65 %. při přípravku bez pomocných látek, popřípadě 10 % při krystalickém přípravku). Typický časový průběh procesu sušení jedné směsi podle vynálezu je exemplárně znázorněn v příkladu 13.
K výrobě směsí alespoň dvou aminokyselin podle vynálezu k dosažení rychloschnoucích, sklovitých přípravků je třeba zvolit alespoň po jedné aminokyselině a jejích derivátů z těchto uvedených 2 skupin:
Skupina 1: arginin, kyselina asparagová, kyselina glutámová, histidin, citrulin, lysin, ornithin;
. . : ·: : · ···. . ........ ..·
Skupina 2: fenylalanin, isoleucin, leucin, methioninn, valin, alanin, glycin, tryptofan, acetylfenylalaninethylester, cystein, sarkosin.
Výhradní použití jenom jedné aminokyseliny nebo několika aminokyselin jenom z jedné z obou skupin nevede k výhodným přípravkům podle vynálezu. Směsi látek podle vynálezu mohou, jak se exemplárně znázorňuje, nalézt tak, že se k roztoku stabilizátoru biologicky nebo terapeuticky aktivních látek přimíchá v rozličných množstvích amfoterní iont s nepolárním zbytkem, například fenylalanin nebo jeho deriváty. Směsi sušené při pokojové teplotě se.hned potom přezkoumají pomocí D.SC, zda' vykazují zvýšenou teplotu skelného přechodu pomocí přísady amfoterniho iontu. Teplota skelného přechodu se přitom zvýšila ve srovnání s přípravky bez přísad podle vynálezu o 10 K, přednostně o 20 K, obzvláště přednostně o 40' K. Výhodné přípravky podle vynálezu jsou částečně amorfní, mají teplotu skelného přechodu vyšší než 4 °C, přednostně než 20 °C, obzvláště přednostně vyšší než 40 °C a mají vhodné zbytkové vlhkosti menši než 6 %, přednostně menší než 4 %. Jejich zdánlivá hustota odpovídajíc sypné hustotě je alespoň o 10 %, přednostně o 50 % vyšší než hustota příslušných lyofilizátů. Zachovávají si svou křehkou, sklovitou, kompaktní, částečně amorfní strukturu po dobu alespoň 2 týdnů, přednostně 2 měsíce, obzvláště přednostně 1 rok.
Kromě toho je jejich doba sušení (tj. okamžik, ve kterém se dosáhne stejné zbytkové vlhkosti) ve srovnání se směsmi látek, které obsahují jen jeden sacharid nebo amfoterní iont s nepolárním zbytkem, menší zejména o 25 %, obzvláště přednostně menši o 50 % nebo dokonce o 75.%. Tyto směsi látek se mohou také mlít nebo dále zpracovávat jiným způsobem, například používat v terapeutických prostředcích nebo diagnosti15 kách v kombinaci s obvyklými pomocnými látkami a nosiči. Terapeutické prostředky jsou terapeutické přípravky, které obsahuji jedno nebo několik terapeuticky účinných agens kromě obvyklých pomocných látek a přísad. Mohou být ve formě tablet, kapsulí nebo tuhých látek, ze.kterých se pomocí přídavku kapaliny (například sterilní vody nebo pufru) vyrábějí terapeuticky účinné roztoky (například infúzní roztoky). Dále jsou obzvláště vhodné k aplikaci jako tuhé substance pomocí rozličných způsobů, například jako nosní sprej, inhalační prostředek nebo transdermální prášek atd.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Vakuové sušení směsí maltózy, L-argininu a L-fenylalaninu
Připravil se roztok s obsahem 50 mg monohydrátu maltózy a 0,1 mg Polysorbátu 80 v 1 ml. K němu se potom přidávaly stoupající množství L-argininu a L-fenylalaninu k stejným podílům (g/g). Takto připravené roztoky se sterilně filtrovaly (0,22 pm nitrocelulózový filtr) a potom po 1 ml roztoku se plnilo do 2ml lahviček a nasadily se lyofilizační zátky. Takto připravené vzorky se stejným způsobem ve vakuu sušily při 20 °C a za sníženého tlaku 48 h. Po vysušení se stanovil obsah vody vzorků podle Karla Fischera a teplota skelného přechodu se zjistila pomocí diferenční termické analýzy (Perkin Elmer DSC7 - rychlost nahřívání vzorků = 10 K/min). Výsledky měření ukazují, že chování maltózy při sušeni se pomocí přídavku určitých množství aminokyselin zřetelně mění. Od 7,5 mg každé aminokyseliny obsah vody ve vzorcích zřetelně klesá a teplota skelného přechodu příměre ně stoupá. Při 10 mg L-argininu a L-fenylalaninu se dosáhne hodnot, které už nelze zvyšovat dalším zvyšováním podílů aminokyselin v suchém produktu. K roztoku cukru s 50 mg monohydrátu maltózy a 0,1 mg Polysorbátu 80 v 1 ml se přidávala stoupající množství aminokyselin. Výsledné produkty po vysušení vykazovaly zde uvedené obsahy vody a teploty skelného přechodu.
Tabulka 1:
L-Arginin [mg/ml] L-Fenylanilin [mg/ml] Obsah zbytkové vody m Teplota skelného přechodu [°C]
0 0 7,68 12,86
1 1 7,95 .12,47
2,5 2,5 7,71 12,91
5 5 7,75 13,67
7,5 7,5 3,55 52,04
10 10 0,54 80,57
12,5 12,5 0,76 73,14
Příklad 2
Vakuové sušení směsí sacharózy, L-argininu a L-fenylalaninu
K roztoku sacharózy, který obsahoval 50 mg sacharózy a 0,1 mg Polysorbátu 80 v 1 ml, se přidávala stoupající množství L-argininu a L-fenylalaninu ve stejných podílech. Vzorky se připravily jako v příkladu 1, sušily a analyzovaly. Při množstvích do 10 mg aminokyselin se získaly dokonale krystalické produkty. Až od 10 mg L-argininu a 10 mg L-fenylalaninu na 1 ml bylo možno identifikovat částečně amorfní produkty se skelným přechodem. V tomto přikladu se pomoci přídavku aminokyselin nejen zlepšuje chováni roztoku při sušeni, nýbrž i systém se pomocí tohoto přídavku převádí do částečně amorfního stavu. K roztoku cukru s 50 mg sacharózy a 0,1 mg Polysorbátu 80 v 1 ml se přidávala stoupající množství aminokyselin. Výsledné produkty po vysušení vykazovaly zde uvedené obsahy vody a teploty skelného přechodu.
Tabulka 2:
L-Arginín [mg/ml] L-Fenylanilin [mg/ml] Obsah zbytkové vody [%] Teplota skelného přechodu [°C]
0 0 2,97 krystalický
1 1 1,11 krystalický
2,5 2,5 3,46 krystalický
5 5 6,11 krystalický
10 10 3,43 18,56
15 15 1, 53 53,70
20 20 1, 60 58,78
Srovnávací příklad A
Vakuové sušení čistých roztoků cukrů
Připravil se roztok monohydrátu maltózy a roztok sacharózy o koncentraci 50 mg/ml. Tyto roztoky cukrů se potom filtrovaly, plnily a analyzovaly, jak je popsáno v příkladu 1. Mohlo se ukázat, že ani při 72-hodínovém sušení při 50 °C za sníženého tlaku není možno vysušit 50 mg cukru v 2ml lahvičce na uspokojivou zbytkovou vlhkost tak, aby skelný přechod byl nad 25 °C. Produkt maltózy vykazoval houževnatou konzistenci a obsah zbytkové vody 6,4 %. Teplota skelného přechodu byla 20 °C. Při sacharóze bylo ještě 6,0 % zbytkové vody, skelný přechod při 14 °C. Pro srovnáni se čisté roztoky cukrů také 48 h sušily při 20 °C za sníženého tlaku. Výsledné produkty byly ještě více vlhké a skelný přechod byl proto ještě níž než u vzorků sušených při 50 °C. Tento pokus zřetelně ukazuje, že jen pomocí přísady určitých aminokyselin je možno vrstvy cukrů sušit v injekčních lahvičkách nebo v podobných baleních pomocí vakuového sušení na malé zbytkové vlhkosti. Zlepšené chování při sušení pomocí přídavku aminokyselin se tak stává zřejmým.
Tabulka 3:
Sušení Maltóza Obsah zbytkové vody Maltóza Teplota skelného přechodu Sacharóza Obsah zbytkové vody Sacharóza Teplota skelného přechodu
72 h při 50 °C 6,4 % 20,0 °C 6,0 % 14,0 °C
48 h při 20 °C 8,9 % 6,1 °C 9,3 % -1,8 °C
Příklad 3
Vakuové sušení směsí maltózy a L-fenylalaninu a směsí maltózy a L-isoleucinu
V tomto pokusu se nyní připravily binární směsi aminokyselin a monohydrátu maltózy. Má přezkoumat, zda tu použité aminokyseliny' maji vlastnosti zlepšující sušení a jaká je • 4 • ·· závislost efektu zlepšujícího sušení na množství při jednotlivých aminokyselinách. K roztoku, který obsahoval v 1 ml 50 mg monohydrátu maltózy, se přidávala stoupající množství L-fenylalaninu nebo L-isoleucinu. Takto připravené roztoky se sterilně filtrovaly (0,22 pm nitrocelulózový filtr) a potom po 1 ml roztoku se plnilo do 2ml lahviček a nasadily se lyofilizační zátky. Takto připravené vzorky se za vakua sušily při 20 °C za sníženého tlaku 48 h. Po vysušení še stanovil obsah vody ve vzorcích podle Karla Fischera vždy 4krát a teplota skelného přechodu se zjistila pomocí diferenční termické analýzy u dvou vzorků z každé směsi (Perkin ElmerDSC7 - rychlost zahřívání vzorků = 10 K/min).
a. Výsledek maltóza-L-fenylalanin
Výsledky měření jasně ukazují pozitivní, vliv L-fenylalaninu na chování maltózy při sušení. Už malá množství Lfenylalaninu postačují na to, aby se teplota skelného přechodu skla cukru při neměnících se podmínkách sušení zvýšila o přibližně 50 °C (obr. 1 a a 1 b) . Při 10 mg/ml L-fenylalaninu dosahuje efekt zlepšující sušení maxima. Pomocí přídavku větších množství L-fenylalaninu už není možné žádné zlepšení. Teplota skelného přechodu se tak zvýšila pomocí přísady L-fenylalaninu ve srovnání s čistou maltózou o přibližně 80 °C. Při velkých množstvích L-fenylalaninu (10 - 20 mg/ml) není možno v tomto pokusu poznat žádné rozdíly, co se týče chování při sušení. Toto se však mění při zkrácených dobách sušení. Tu je možno vidět se stoupajícími množstvími L-fenylalaninu stoupání skelných přechodů také v rozsahu 10 - 20 mg L-fenylalaninu na 1 ml. Tabulka 4 ukazuje množství L-fenylalaninu v roztoku cukru a z toho výplývající obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu Tg.
Tabulka 4:.
L-Fenylalanin [mg/ml] Obsah zbytkové vody [%] Teplotaskelného přechodu [°C] , .
0 8,91 6,1
5 3,21 62,8
7,5 0, 95 77,7
10 1, 12 86, 0
15 0,99 85,2
20 0, 99 88,2
Kromě toho se zaznamenaly difraktogramy prášků za vakua sušeného fenylalaninu a maltózy a směsi fenylalaninu a maltózy podle vynálezu (obr. 2a, 2b, 2c). Čistý fenylalanin ukazuje typický difraktogram krystalické substance (obr. 2a), zatímco maltóza ukazuje difraktogram amorfní substance (obr. 2b). Jen u směsi podle vynálezu dochází k tvorbě částečně amorfních struktur, patrno na diskrétních difrakčních maximech na širokém signálu pozadí (obr. 2c) .
b. Výsledek maltóza a L-isoleucin
K zásobnímu roztoku s 50 mg monohydrátu maltózy v 1 ml se přidávala různá množství L-isoleucinu.a jednotlivé směsi se sušily při 20 °C. Se stoupajícím množstvím aminokyseliny se efekt zlepšující sušení stává zřetelným. Pomocí přídavku 20 mg/ml L-isoleucinu (poměr míšení 5.: 2 hmot.dílů) lze zvýšit Tg maltózového produktu o přibližně 20 °C. Tabulka 5 znázorňuje množství L-isoleucinu v roztoku cukru a z toho plynoucí obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu Tg.
Tabulka 5
Isoleucin [mg/ml] Obsah zbytkové vody [%] Teplota skel- ného přechodu [°Cj
0 8,91 6,1
5 7,84 13,7
10 7,52 17,7
15 6,77 19,4
20 5,34 24,7
Přiklad 4
Vakuové sušení sacharózy a L-leucinu
V následujících pokusech se připravily binární směsi sacharózy s' různými aminokyselinami. Mělo se prozkoumat, zda použité aminokyseliny mají na sacharózu účinek zlepšující sušení. K roztoku, který obsahoval 50 mg sacharózy v 1 ml, se. přidávala zvyšující se množství L-leucinu. Roztoky se zpracovaly tak, jak je popsáno v příkladu 3.
Výsledek: sacharóza - L-leucin
Sacharóza vytváří s menšími množstvími L-leucinu krystalický produkt. Tato tvorba krystalů mohla být pozorována již v příkladu 2 s L-argininem a L-fenylalaninem. Sacharóza tvoří tedy při smíchání ,s určitými aminokyselinami krystalické produkty. Čistý cukr a směsi s většími podíly L-leucinu tvoří systémy se skelným přechodem. To znamená, že existuje částečně amorfní struktura. Tak se stává jasným to, že až koncentrace od 15 mg/ml L-leucinu zlepšují vlastnosti čisté sacharózy při sušení a skelný přechod se může zvýšit pomocí přídavku této aminokyseliny o přibližně 18 ’C. L-Leucin je tedy aminokyselinou s účinkem zlepšujícím sušení. Tabulka 6 znázorňuje množství L-leucinu v roztoku cukru a z toho plynoucí obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu Tg konečných produktů.
Tabulka 6
L-Leucin [mg/ml] Obsah zbytkové vody [%] Teplota skelného přechodu [°C]
0 9,34 -1,8
5 6,23 krystalický
10 6,50: krystalický
15 5,81 1-6,4
20 5,02 16,1
Srovnávací příklad B
Vakuové sušení směsi sacharózy a L-histidinu
Pokusy se prováděly jako v příkladu '4. Místo L-leucinu se použilL-histidin. Směs sacharózy a L-histidinu vytváří při.vakuovém sušení amorfní produkty, u kterých není možno pozorovat žádný účinek zlepšující sušení. Nezávisle na poměru míšení se suší Struktury špatně a obsahy zbytkové vody a skelné přechody směsí jsou řádově stejné jako výsledky čisté sacharózy. Tedy L-histidin nemá žádný účinek zlepšující sušení. Tabulka 7 znázorňuje množství L-histidinu v roztoku cukru a z toho vyplývající obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu Tg konečných produktů.
Tabulka 7:
L-Histidin [mg/ml] Obsah zbytkové vody [%] Teplota skelného přechodu [°C]
0 9,34 -1,8
5 11,23 -1,4
20 9,78 -2, 6
Příklad 5 '
Vakuové sušení směsí sacharózy a L-tryptofanu a směsí sacharózy a N-ačetyl-L-fenylálaninethylesteru (APE)
V tomto pokusu se připravil jeden roztok s 10 mg Ltryptofanu v 1 ml a jeden roztok s 3 mg ΑΡΕ v 1 ml (APE má jen omezenou rozpustnost ve vodě). K oběma roztokům se přidávala stoupající množství sacharózy. Takto získané roztoky se jako v příkladu 3 zpracovaly a sušily. Pro srovnání se při tomto pokusu sušil také roztok sacharózy (50 mg/ml) za stejných podmínek sušení. Tento vykazoval v konečném produktu obsah zbytkové vody 9,98' % a teplotu skelného přechodu -6,25 °C.
a. Tabulka 8 znázorňuje množství sacharózy v roztoku L-tryptofanu (10 mg/ml) a z toho vyplývající obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu konečných produktů.
Tabulka 8:
Sacharóza [mg/ml] Obsah zbytkové vody [%] Teplota skelného přechodu [°C]
20 3,09 37,30
40 4,19 22,51
60 5,37 14,44
b. Tabulka 9 znázorňuje množství sacharózy v roztoku ΆΡΕ (3 mg/ml) a z toho vyplývající obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu konečných produktů.
Tabulka 9:
Sacharóza [mg/ml] Obsah zbytkové vody [%] Teplota skelného přechodu [°C]
10 6,15 13,3
40 8,33 1,4
Výsledky ukazuji, že obě zkoumané substance, L-tryptófan a ΆΡΕ, vykazují účinek zlepšující sušeni. Pomocí L-tryptofanu lze zvýšit teplotu skelného přechodu částečně amorfního produktu při neměnících se podmínkách sušení o přibližně 45 °C. Pomoci APE je možné zvýšení teploty skelného přechodu při neměnících se podmínkách o 20 °C.
Příklad 6
Vakuové sušení dalších směsí cukrů a aminokyselin
V tomto pokusu se připravily binární směsi monohydrátu maltózy nebo sacharózy s L-aminokyselinou. Přitom se k roztoku cukrů přidávaly aminokyseliny v poměru míšeni 5 : 2 až 1:1. Mělo se prozkoumat, zda daná aminokyselina vykazuje u odpovídajících cukrů účinek zlepšující sušení. Příprava,, zpracování a sušení roztoků'se provádělo jako v příkladu 4. Jednotlivě se jednalo o následující směsi:
a. Směsi s monohydrátem maltózy
Tabulka 10
Použitá Množství Množství Obsah zbyt- Teplota
aminokyse- AMK cukru kové vody skelného
lina [mg/ml] [mg/ml] [·%] přechodu [°C]
- - 50 8,91 . '6,1
L-Arginin 10 50 8,10 10,3
L-Arginin 20 50 8,63 7,1
L-Leucin 20 50 5,42 20,9
L-Leucin 20 20 1,87 56,05
L-Histidin 20 50 9,78 5,3
L-Isoleucin 20 20 3,12 37,9
L-Methionin 15 30 7,45 9,7
L-Methionin 20 20 2,70 34,4
L-Valin 20 20 4,93 18,8
b. Směsi se sacharózou
Tabulka 11 * ·
Použitá aminokyselina Množství AMK [mg/ml] Množství cukru [mg/ml] Obsah zbytkové vody [%] Teplota skelného přechodu [°C]
- - 50 9,34 -1,8
L-Alanin 15 30 6,04 2,8
L-Alanin 20 20 4,46 11,7
L-Glycin 20 20 4,47 5, 3
L-Fenylala- nin 20 50 1,12 62,7
L-Serin 15 30 11,77 -15,1
L-Serin 20 20 10, 61 -14,4
Výsledky sušeni ukazuji, že L-histidin nemá žádný pozitivní vliv na chování cukrů při sušení (tabulka 10). L-Serin dokonce ještě více zhoršuje sušení cukrů (tabulka 11). L-Leucin, L-isoleucin a L^methionin mají účinek zlepšující sušení (tabulka 10). Tento se stává zřejmým, když se k roztoku cukrů přidávají stoupající množství těchto aminokyselin. Při L-valinu a L-alaninu je možno zjistit zlepšení sušení jen při velkých množstvích aminokyseliny v produktu; L-arginin a L-glycin mají slabý pozitivní vliv. Velmi dobrý účinek L-fenylalaninu na chování při sušení se stává jasným také při binární směsi se sacharózou (tabulka 11). Produkt se suší dobře a vykazuje velmi vysokou teplotu skelného přechodu.
Srovnávací příklad C
Vakuové sušeni roztoků aminokyselin nebo roztoků solí aminokyselin
Z jednotlivých aminokyselin nebo solí jednotlivých aminokyselin se připravily roztoky a sterilně se filtrovaly (0,22 pm nitrocelulózový filtr). Po 1 ml roztoku se plnilo do 2ml lahviček a nasadily se lyofilizační zátky. Takto připravené vzorky se za vakua sušily při 20 °C . ža sníženého tlaku 48 h. Po vysušení se stanovil obsah vody ve vzorcích podle Karla Fischera a teplota skelného přechodu se zjistila pomocí diferenční termické analýzy (Perkin Elmer DSC7 rychlost zahřívání' vzorků = 10 K/min)'. Následující roztoky se jednotlivě sušily a výsledkem byly zde uvedené obsahy zbytkové vody a výsledky měření DSC:
a. Aminokyseliny
Tabulka 12
Aminokyse- lina Koncentrace Obsah zbyt- kové vody [%] Výsledek měřeni DSC [°C]
[mol/1] [mg/ml]
L-Alanin 0,24 21,38 0,81 krystalický
L-Arginin 0,24 41,80 0,52 krystalický
L-Citrulin 0,24 42,05 4,9 krystalický
L-Cystein 0,24 29,08 2,61 krystalický
Glycin 0,24 18,02 0,76 krystalický
L-Histidin 0,12 18,62 0,77 krystalický
L-Isoleucin 0,12 15,74 1,10 krystalický
L-Leucin 0,12 15, 74 1,62 krystalický
L-Lysin 0,24 35,09 0,79 krystalický
L-Methionin 0,12 17,91 1,57 krystalický
L- Fenylalanin 0,12 19,82 1,53 krystalický
L-Prolin 0,24 27,63 19, 93 krystalický
L-Serin 0,24 25,22 0,44. krystalický
L-Threonin 0,24 28,59 0,45 krystalický
L-Valin 0,24 28,12 0,57 krystalický
b. Soli aminokyselin
Tabulka 13
Aminokyselina Koncentrace Hodnota pH Obsah zbytkové vody [%] Výsledek měření DSC [ °C]
[mol/1] [mg/ml]
L-Arginin HC1 0,25 0-,30 43,55 10,93 2,70 6, 46 3,51
L-Arginin h3po4 0,25 0,15 43, 55 14,70 6,81 3,3 5,17
L-Arginin H2SO4 0,25 0,15 43,55 14,71 2,89 3,24 6, 67
L-Arginin HNO3 0,25 0, 30 43,55 18,90 2,58 2,66 krystalický
L-Arginin Kyselina octová 0,25 0,30 43, 55 18,0 5,24 11,04 krystalický
Kyselina L-asparagová NaOH 0,12 0,12 15, 97 4,8 9, 65 9,78 27,7
Kyselina L-glu- tamová NaOH 0,12 0,12 17, 66 4,8 5,14 14,69 5,5
L-Ornithin HC1 0,24 40,47 5, 39 0,4 krysta- lický
f Výsledek ukazuje, že aminokyseliny jsou po vakuovém sušení krystalické. Jen soli zásaditých a kyselých aminokyselin vytvářejí během těchto podmínek sušení amorfní struktury, které se ovšem velmi špatně'suší a jejich teplota skelného přechodu za zvolených podmínek je nižší než pokojová teplota.
e * · · • · v ·*·♦ * · ♦ * 4 ♦ · · * ··44
Příklad 7
Vakuové sušeni směsí L-argininu a L-fenylalaninu a jedné směsi L-argininu a L-izoleucinu
V tomto pokusu se připravily, zpracovaly a sušily rozličné směsi L-argininu a L-fenylalaninu a zkoumaly se jako ve srovnávacím příkladu C. Jednotlivě se připravily a sušily následující binární směsi:
Tabulka 14
Molárni poměr míšení L-Arginin L-Fenylalanin Obsah zbytkové vody [%] Teplota skelného přechodu [°C]
[mol/1] [mg/ml]
[mol/1] [mg/ml]·
1:1 0,12 . 20,90 0,12 19, 82 2,27 59,5
2:1 0,16 27,87 0,08 13,21 9, 32 1,7
3:1 0,18 31,35 0, 06 9, 91 9, 40 2,8
4:1 0,192 33,44 0,048 7,928 9, 96 1,3
5:1 0,20 34,83 0,04 6, 61 10,73 0,0 ,
6:1 ' 0,206 35,88 0, 034 5,61 10,03 1,3
7:1 0,21 36, 58 0,03 4,96 11, 38 1,0
1:2 0,06 10,45 0,12 19, 82 2,85 47,2
1:3 0,04 6,97 0,12 19,82 3,43 46,2
1:4 0,03 5,23 0,12 19,82 3, 66 43,45
Tento pokus ukazuje, že pomocí smíchání dvou aminokyselin, které samotné sušené poskytují krystalické produkty, je možno připravit částečně amorfní struktury. Tyto se suší při zvolených poměrech míšení tak dobře, že výsledkem jsou částečně amorfní struktury s vysokou teplotou skelného přechodu a malým obsahem zbytkové vody.
«··· · ·
Je zajímavé, že existuje optimální poměr míšeni s nejvyšší teplotou skelného přechodu. V tomto pokusu se připravil ještě jeden roztok, který obsahoval,L-arginin a L-isoleucin po 0,15M'.
Tabulka 15
Molární poměr míšení L-Arginin L-Isoleucin Obsah zbytkové vody Teplota skelného přechodu
[mol/1] [mg/ml] [mol/1] [mg/ml]
1:1 0,15 26,13 0,15 19, 68 1,05 53,27
Zde je výsledkem produkt s teplotu skelného přechodu 53,27 °C a obsahem zbytkové vody 1,05 %. Smícháním dvou aminokyselin se mohla vytvořit tak dobře schnoucí částečně amorfní struktura; teplota skelného přechodu se zvýšila přibližně o 50 °C ve srovnání se solemi argininu s minerálními kyselinami (srovnávací příklad C).
Příklad 8 rh-G-CSF sušený za vakua v receptuře maltózy obsahující Larginin a L-feriylalanin
Připravil se roztok s 50 mg maltózy, 10 mg L-fenylalaninu a 10 mg L-argininu v 1 ml. Kromě toho obsahoval tento roztok 0,1 mg Polysorbátu 80 a 0,35 mg rh-G-CSF v 1 ml. Hodnota pH receptury se nastavila pomocí kyseliny chlorovodíkové na 7,4. Za aseptických podmínek se připravil roztok obsahující protein a sterilně se filtroval (polyvinyliden• · · · · · € · difluoridový filtr 0,22 pm) . Potom se po 1 ml roztoku plnilo do 2ml lahviček. Naplněné lahvičky s lyofilizačnimi zátkami se potom izotermicky sušily 48 h při 20 °C a za sníženého tlaku. Vznikl suchý produkt s obsahem zbytkové vody 1,16 % a teplotou skelného přechodu 75 °C. Takto připravené vzorky se skladovaly při různých teplotách a po různých dobách uskladnění se posoudila stabilita proteinu.
Při rh-G-CSF je podíl vzniklého dimeru v připraveném produktu dobrým kritériem pro posuzování stability produktu. Proto jsou množství monomeru a dimeru zjištěná pomocí gelové permeační chromatografie (na podmínku 4 jednoduchá měření) měrou pro stabilizující účinek našich přípravků připravených sušením. Při gelové permeační chromatografii se molekuly proteinu oddělí na základě velikosti jejich částic v rozpuštěném stavu, tj. vysokomolekulární složky (dimery) se separují ód monomerů rh-G-CSF. Zkoumání (ΗΡ-SEC) se provádělo v aparatuře HPLC od Shimadzu za použití ochlazovatelného automatického vzorkovače (Waters TM 717). Jako dělicí kolona se použila kolona TSK-Gel G2000 SW (7,5x300 mm) od firmy TosoHaas. Detekce oddělených složek probíhala fotometricky při 214 nm (Fotometr Shimadzu LC-GA). Jako elučního prostředku se použilo O,1M sodno-draselného fosfátového pufru, pH 6,2, pomoci kterého se nastavil průtok 0,6 ml/min při pokojové teplotě. Zkoumané vzorky se rozpustily ve dvakrát destilované vodě tak, aby se znovu připravila výchozí koncentrace (přídavek 1 ml). Tyto rozpuštěné vzorky se potom uschovávaly v automatickém vzorkovači ochlazeném ná 6 °C až do zkoumání. Vstřikované množství jednoho vzorku bylo 20 μΐ (= 7 μg GCSF), doba průtoku jednoho vzorku 32 min. Vyhodnocení výsledků probíhalo za použití pracovního standardu G-CSF. Aby bylo možno produkty přídavně kvalitativně posuzovat, prová • ··♦ · · děla se kromě toho při každém stanoveni obsahu SDS-gelová eletroforéza s vybarvením pomocí „silver stain. Výsledky k SDS-gelové elektroforéze jsou znázorněny v příkladu 8 b, obr. 9. Ve vodných roztocích se denaturuje protein při teplotě mezi 45 a 47 QC v průběhu několika hodin. Pomocí této receptury se podařilo po dobu týdnů stabilizovat protein dokonce při teplotě uskladněni 50 ĎC.
a. Stabilita rh-G-CSF v maltózové receptuře sušené ve vakuu s L-argininem a L-fenylalaninem
Tabulka 16
Obsahy monomeru uvedené v %, získané v HP-SEC
Doba Teplota uskladnění
uskladnění
[týdny] TCH PT 30 °C 40 °C 50 °C
0 - 99,83 % - - -
5 99, 94 % 99,93 % 99,86 % 99, 89 % 99,87 %
13 99,83 % 99,86 % 99,88 % 99, 83 % 99,83 %
26 99,76 % 99,75 % 99,55 % 99, 36 % 99,21 %
39 99,68 % 96,73 % 96,40 % 93,81 % 89, 27 %
52 98,34 % 94,81 % 94,70 % 91,27 % 86, 27 %
TCH = teplota chladničky
PT = pokojová teplota =20-22 °C
Výsledky gelové permeační chromatografie jasně ukazují, že pomocí této receptury je možno protein rh-G-CSF v takovém přípravku sušeném za vakua stabilizovat po delší dobu. Pokus ukazuje, že je možno delší dobu stabilizovat rh-G-CSF v čás tečně amorfní, za vakua sušené receptuře maltózy, obsahující L-arginin a L-fenylalnin pod teplotou skelného přechodu.
b. Přehled výsledků SDS-gelové eletroforézy všech receptur, které obsahovaly účinnou látku rh-G-CSF
Nejdříve se připravily polyakrylamidové gely obsahující SDS, jejichž dělicí gel obsahoval 15 % akrylamidu a jejichž sběrný gel obsahoval 3 % akrylamidu a 1 % dodecylsulfátu sodného (SDS). Příprava vzorků' probíhala tak, že ze 3 injekčních lahviček se připravil 1 směsný vzorek. Hned potom se tento zkušební roztok zředil zkušebním pufrem obsahujícím dithiothreit (DTT) a bromfenolovou modř tak, že vznikla koncentrace 150 pg/ml rh-G-CSF. Vzorky se denaturovaly 5 minut při 95 °C v předehřátém vytápěcím bloku. Jako srovnávací proteiny se použily proteiny „Combithek Eichproteine fur die Chormatographie MG 18000-300000 od Boehringer Mannheim.' Tyto se připravily a zpracovaly přesně tak jako vzorky rh-GSCF. Kromě toho se připravil pracovní standard rh-G-CSF, který se použil ke srovnání. Gelová elektroforéza se prováděla pomocí miniaturní jednotky pro gelovou elektroforézu (Midget Gelektrophoresis Unit, Pharmacia - LKB 2050) a pomocí příslušné jednotky napětí. Když se naplnil elektroforetický pufr, do každého gelového zásobníku se naplnilo 20 μΐ vzorku (tj. 3 μς rh-G-CSF). Po uzavření elektroforetické komory a nastavení vodního chlazení se vložilo napětí 80 V, které se zvýšilo na 130 V, když protekl sběrný gel. Krátce předtím než pás bromfenolové modři dosáhl konce gelu, elektroforéza se ukončila. Gely se odstranily z komory a promyly dvakrát destilovanou vodou. Potom se provádělo barvení „silver stain pomocí Daiichi 2D-silver-stain II Kit podle tam obsaženého návodu. Po ukončeni barvení se provádělo optické posuzování gelů.
Tabulka 17: Výsledek gelové elektroforézy
Stopa Přípravek Vizuální výsledek
1 Srovnávací proteiny
2 Příklad 8: Maltózová receptura obsahující L-arginin a L-fenylalanin jen monomery
3 Srovnávací příklad D: Sušení bez pomocných látek monomery a dimery
4 Srovnávací příklad E: Čistá maltózová receptura monomery, dimery a trimery
5 Srovnávací proteiny
6 Příklad 9: Receptura bez cukrů, obsahující L-arginin a L-fenylalnin jen monomery
7 Srovnávací příklad F: L-Argininová receptura s kyselinou fosforečnou monomery a dimery
8 Srovnávací příklad G: Krystalická receptura L-valinu a L-glycinu monomery, dimery a produkty odbourání
Receptury příkladů 8 a 9 ukazují při této zkoušce jen monomery. Při srovnávacím příkladu D a F je možno kromě monomeru rozeznat ještě dimery, v příkladu E kromě toho přídavně trimery. V krystalickém přípravku L-valinu a Lglycinu srovnávacího příkladu G se pozorují kromě toho ještě 2 produkty degradace, jejichž molekulová hmotnost je menší než molekulová hmotnost monomeru, a 2 slabé pásy produktů degradace, jejichž molekulová hmotnost leží mezi molekulovou hmotností monomeru a dimeru.
Na základě této citlivé metody se mohly stát velmi dobře viditelnými produkty degradace a agregace monomeru, které se nacházely v množstvích > 1 %.
Srovnávací příklad D
Vakuové sušeni rh-G-CSF bez přídavku pomocných látek
Při tomto pokusu se připravil roztok, který obsahoval jen protein rh-G-CSF v koncentraci 0,35 mg/ml ve zředěném fosfátovém pufru (přibližně 0,01m). Tento proteinový roztok se připravil, zpracoval a analyzoval,' jak je popsáno v příkladu 8. Při tomto přípravku nebylo z technických důvodů možno u konečných produktů stanovit obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu. Údaje o stabilitě rh-G-CSF sušeného ve vakuu bez pomocných látek
Tabulka 18:
Doba uskladnění [týdny] Teplota uskladnění CHT PT 40 °C
0 - 97,84 % -
5 94,90 % 94,53 % 93, 96. %
13 91,31 % 89, 66 % 78,23 %
26 80,06 % 73, 60 % 52,22 %
TCH = teplota chladničky =4-6 °C,
PT = pokojová teplota =20-22 °C • · 4 · · *4 ·· ··· · 4 · · 4 « 4 · 444 • 444 44 «4 «4 44 4«
Údaje o stabilitě čistého proteinu jasně ukazuji stabilizující účinek pomocných látek receptury popsané v příkladu 8. Také u této receptury se při každé zkoušce prováděla SDSgelová elektroforéza s vybarvením pomoci „siver stain. Výsledky viz v příkladu 8 b.
Srovnávací příklad E rhG-CSF v čisté maltózové receptuře sušené ve vakuu
Připravil se roztok, který obsahoval v 1 ml 50 mg monohydrátu maltózy, 0,1 mg Polysorbátu 80 a 0,35 mg rhG-CSF. Hodnota pH receptury se nastavila pomocí sodného louhu na 7,4. Výchozí roztok a konečné produkty se připravily, zpracovaly a analyzovaly tak, jak je popsáno v příkladu 8. Jak ukazuje již příklad .1, je obtížné vysušit maltózu bez přísady aminokyselin za .48 h na malé zbytkové vlhkosti. Proto vznikají produkty s obsahem zbytkové vody 10,43 % a teplotou skelného přechodu -2 °C. Při teplotách uskladnění, tedy nad skelným přechodem, neexistuje žádné amorfní, křehké sklo, nýbrž vysoce viskózní, houževnatá elastická hmota. Stabilita rhG-CSF v maltózovém přípravku sušeném ve vakkuu bez aminokyselin
Tabulka 19:
Uvedeny jsou obsahy monomeru v %, které se získaly v HP-SEC
Doba uskladnění [týdny] Teploty uskladnění
TCH PT 30 °C 40 °C 50 °C
0 - 97,99 % - - -
5 98,26 % 96,82 % 93,91 % 67,45 % 42,63 .%
13 97,15 % 90,49 % 73,70 % . 30,05 % 18,52 %
26 97,05 % 88,23 % 71,32 % 22,30 % 15,27 %
K výsledkům SDS-gelové eletroforézy viz příklad 8 b. Výsledek ukazuje,, že není výhodné uschovávat rhG-CSF v cukrové směsi bez aminokyselin. Stabilita je jasně nižší než u sypkého materiálu sušeného ve vakuu (srovnávací příklad D) a u. optimalizované receptury sušené ve vakuu (příklad 8).
Tento pokus ukazuje jasně nutnost přísady aminokyselin k cukrům při vakuovém sušení k tomu, aby se získaly produkty s vysokými skelnými přechody, ve kterých se potom protein stabilizuje pomocí amorfní struktury pomocné látky. Skladování produktů pod teplotou skelného přechodu se ukazuje jako nutnost pro stabilizaci účinné látky. Je třeba ještě poznamenat, .že ve vzorcích, které byly uskladněny při 40 a 50 °C, se zcela vykrystalizovala maltóza již po 4 týdnech. Takovým fyzikálním změnám ve vzorcích v průběhu skladováni je třeba zabránit; urychlují úbytek obsahu monomeru.
Příklad 9:
rh-G-CSF v receptuře L-argininu a L-fenylalaninu bez cukrů, sušené ve vakuu
Připravil se roztok, který obsahoval v'1 ml 20 mg Largininu a 20 mg L-fenylalaninu, 0,1 mg Polysorbátu 80 a 0,35 mg rh-G-CSF. Po nastavení hodnoty pH na 7,4 pomocí kyseliny chlorovodíkové se roztok zpracoval, sušil a analyzoval tak, jak je popsáno v příkladu 8. Po ukončení sušení byl k dispozici homogenní produkt s teplotou skelného přechodu 77,0 °C a obsahem zbytkové vody 1,30 %.
Stabilita rh-G-CSF v receptuře argininu' a fenylalaninu, sušené ve vakuu.
Tabulka 20: Uvedeny jsou podíly monomeru získané v HP-SEC
Doba uskladnění [týdny] Teploty uskladnění
TCH' PT 30 °C 40 °C 60 °C 80 °C
0 - 99, 57 % - - - -
4 99,36 % 99,36 % 99,50 % 99,81 % 95,56 % 1,44 %
13 99,17 % 99,31 % 99,40 % 99, 64 % - -
26 98,64 % 98,62 % 96,52 % · 1 91,06 % - -
39 99,64 % 94,18 % 88,99 % 79,05 % - -
TCH = teplota chladničky =4-6 °C,
PT = pokojová teplota = 20 - 22 °C
Výsledky zkoumání trvanlivosti ukazují jasně, že je možno s touto recepturou po delší dobu protein rh-G-CSF stabilizovat v částečně amorfním, ve vakuu sušeném aminokyselinovém přípravku, pokud teploty uskladnění jsou zřetelně nižší než teploty skelného přechodu (srovnej také srovnávací příklad C). Uskladnění při 80 °C ve srovnání s uskladněním • φ· « při 60 °C ukazuje tento fenomén vztahující se ke skelnému přechodu při 77 °C.
Aby bylo možno doplňkově posuzovat produkty kvalitativně, provázela se kromě toho s každým stanovením obsahu SDSgelová eletroforéza s vybarvením „silver stain. Výsledky této SDS-gélové elektroforézy jsou znázorněny v příkladu 8 b. Stejná receptura se uskladňovala také při různých teplotách po dobu 1 roku. Výsledek je znázorněn v tabulce 20a.
Obsah vody. [%] Tg [°č]. Obsah monomeru G-CSF [%]
Start 0,77 82,1 99,82
po 52 týdnech:
TCH 1,20 79,52 98,34
PT 2,08 69,47 94,81
30 °C 2,21 67,91 94,70
40 °C 2,32 67,36 91,27
50 °C 2,40 68,63 86,26
TCH = teplota chladničky =4-6 °C,
PT = pokojová teplota = 20 - 22 °C
Pokus ukazuje, že je možno rh-G-CSF stabilizovat v částečně amorfní, ve vakuu sušené receptuře L-argininu a L-fenylalaninu pod teplotou skelného přechodu.
Srovnávací příklad F rh-G-CSF v L-argininové receptuře sušené ve vakuu s kyselinou fosforečnou
Připravil se roztok, který obsahoval v 1 ml 40 mg L-argininu, 0,1 mg polysorbátu 80 a 0,35 mg rh-G-CSF. Po nastavení hodnoty pH pomocí kyseliny fosforečné na 7,4,'se roztok zpracoval, sušil a analyzoval, jak je popsáno v příkladu 8. Vysušený konečný produkt vykazoval obsah zbytkové vody 3,59 % a teplotu skelného přechodu 8,6 °C. Tento produkt byl tedy po ukončení sušení při pokojové teplotě k dispozici nikoli jako křehké, amorfní sklo, nýbrž jako vysokoviskózní, houževnatá plastické hmota. Stabilita rh-G-CSF v L-argininové receptuře, sušené ve vakuu.
Tabulka 21: Podíly monomeru v % získané v HP-SEC
Doba uskladnění [týdny] Teploty uskladnění
-20 °C TCH PT 30 °C 40 °C 60 °C 80 °C
0 99, 60 %
4 99, 57% 99,60% 99,37 % 99,34% 99,20% 89,46% 31,81%
13 99,75% 98,17% 98,06 % 97,31% 93,41%
33 99,28% 99,30% 99,21 O o 97,86% 93,02%
Nedosahuje se stabilizujícícho. efektu,. kterého se dosahuje v suchém, částečně amorfním skle (příklad 8 a 17). Toto • ·· · * ·· ♦ · ·· • · · · ·ι: ·« * · ··· · · • · · ♦- ·· · · ·«· • t»« «· ·ί Μ ·'·' »· ukazuje význam vhodné směsi pomocných látek, aby se jejich chování při sušení v průběhu vakuového sušení zlepšilo a tak se získala při pokojové teplotě částečně amorfní skla. Především při vyšších teplotách (30 a 40 ĎC) se toto stává zřetelným. Stabilita je ve srovnání s účinnou látkou sušenou ve vakuu bez pomocných látek v této směsi zvýšena (srovnej srovnávací příklad D). Aby bylo možno přídavně kvalitativně posuzovat produkty, prováděla se kromě toho při . každém stanovení obsahu SDS-gelová elektroforéza s vybarvením pomocí „silver stain. Výsledky této SDS-gelové elektroforézy jsou znázorněny v příkladu 3.
Srovnávací příklad G rh-G-CSF v krystalické receptuře L-valinu a glycinu, sušené ve vakuu
K roztoku, který obsahoval v 1 ml po 20 mg L-valinu a glycinu a 0,1 mg polysorbátu 80, se přidalo 0,35 mg rh-G-CSF na 1 ml a hodnota pH roztoku se nastavila pomocí sodného louhu na 7,4. Hotový smíšený roztok se zpracoval, sušil a analyzoval, jak je popsáno v příkladu 8. Zkouška po ukončení sušení ukazovala, že se při hotových vzorcích jednalo o krystalický produkt s obsahem zbytkové vody 0,82 %. Stabilita rh-G-CSF v krystalické, ve vakuu sušené receptuře Lvalinu a glycinu.
Tabulka 22: Podíly monomeru jsou uvedeny v %, jak se získaly v HP-SEC i ’ · · « ΦΦ ··' φ φ φ φφφφ φ φ φ
Φφφφ φφ φφ ·· ·· ·Φ
Doba uskladnění [týdny] Teploty uskladnění
TCH PT 30 °C 40 °C 60 °C 80 °C
0 - 94,3 6 % - - - -
4 89, 93 % 89,66 % 84,26 % 72,47 % 44,54 % 27,44 %
13 74,14 % 73,91 % 64]90 % 46,82 % - -
33 73,75 % 70,04 % 54,93 % 40,40 % - -
TCH = teplota chladničky = 4 - 6 °C,
ΡΤ = pokojová teplota = 20 - 22 °C
Tento výsledek zřetelně ukazuje, že krystalická aminokyselinová receptura ani při nízkých obsazích zbytkové vody není schopna stabilizovat rh-G-CSF. Ve srovnání s rh-G-CSF sušeným ve vakuu bez pomocných látek se zřetelně ukazuje destabilizující účinek takového přípravku (viz srovnávací příklad D) .
Aby bylo možno produkty přídavně kvalitativně posuzovat, prováděla se kromě toho při každém stanovení obsahu SDS gelová elektroforéza s vybarvenín pomocí „silver stain. Výsledky této SDS-gelové elektroforézy jsou znázorněny v příkladu 8 b.
Příklad 10 · «· * · ·· · ♦·· • ♦ · · · · · ♦ · ··♦ 9 · • *· ♦ · · · · · · *·»« ·· ·· ·» ·· ··
Vakuové sušení erytropoetinu v sacharózové receptuře obsahující L-arginin a L-fenylalanin
Připravil se roztok obsahující v 1 ml 50 mg sacharózy, po 10 mg L-argininu a L-fenylalaninu a 0,1 mg Polysorbátu 80. Do tohoto roztoku se přidalo 5000 U erytropoetinu (EPO) na 1 ml a hodnota pH se pomocí kyseliny fosforečné nastavila na 7,2. Roztok se zpracoval a sušil,jako je popsáno v příkladu 8. Vznikl .suchý, částečně amorfní produkt s obsahem zbytkové vody 0,56 % a teplotou skelného přechodu 86,6 %. U EPO je podíl vzniklého dimeru v připraveném produktu dobrým kritériem pro posuzování stability produktu. Proto jsou množství monomeru a dimeru zjištěné pomocí gelové permeačni chromatografie (na podmínku 3 jednoduchá měření) mírou pro stabilizující účinek našich přípravků připravených pomocí sušení.
Při gelové permeačni chromatografii se molekuly proteinu oddělí na základě velikosti jejich částic v rozpuštěném stavu, tj. vysokomolekulární složky (dimery) se separují od monomerů EPO. Zkouška (HP-SEC) se prováděla v aparatuře HPLC od Shimadzu za použití automatického vzorkovače (Gilson Abimed 231). Jako dělicí kolona se použila kolona TSK-Gel G3000 SWXL (7,8x300 mm) od firmy TosoHaas. Detekce oddělených složek probíhala fotometricky při 280 nm (Měrek Fluorescence Spectrophotometer 820 FP). Jako elučního prostředku se použilo 0,41M sodno-draselného fosfátového pufru s chloridem sodným, pH 7,3, pomocí kterého se nastavil průtok 0,6 ml/min při pokojové teplotě. Vzorky určené ke zkoumání se rozpustily ve dvakrát destilované vodě tak, aby se znovu připravila výchozí koncentrace (přídavek 1 ml). Tyto rozpuštěné vzorky se potom uschovávaly do automatickém vzorkovači až do *·«· · * » · · » í · • ·· ♦ · ·· · · ·· • · · · · · · · · ··· « · »··«··· · · · ···· ·· ·· ♦· ·· ·· zkoumání. Vstřikované množství jednoho vzorku bylo 100 μΐ (= 2 μ9 EPO), doba průtoku jednoho vzorku 25 min. Vyhodnocení výsledků se provádělo sa využití pracovního standardu EPO.
Stabilita EPO v sacharózové receptuře obsahující L-arginin a L-fenylalanin, sušené ve vakuu
Tabulka 23: Uvedeny jsou obsahy monomeru v % získané v HPSEC
Doba uskladnění [týdny] Teploty uskladnění
TCH PT 40 °C
0 - 100 % -
4 100 % 100 % 100 % -
9 100 % 100 % 100 %
13 100 % 100 % 100 %
26 100 % 100 % 99,9 %
TCH = teplota chladničky =4-6 °C,
PT = pokojová teplota =20-22 °C
Výsledek ukazuje, že je možno stabilizovat EPO pomocí vakuového sušení se zde zvolenými kombinacemi pomocných látek. Aby bylo možno produkty přídavně kvalitativně posuzovat, prováděla se kromě toho při každém stanovení obsahu SDS gelová elektroforéza s vybarvením „silver stain. Příprava gelů, provádění elektroforézy a vybarvení gelů probíhalo tak, jak se popisuje v příkladu 8 b. Příprava vzorků probíhala tak, že ze 3 injekčních lahviček se připravil 1 směsný vzorek. Hned potom se tento zkušební roztok zředil zkušebním * ·« » · ♦· · · ·♦ φ · φ·« · φ ·Φ é φ Φ φ φ Φ φ φ Φ Φ Φ · Φφφ • ΦΦΦ ·· Φ· ΦΦ ·* ΦΦ pufrem obsahujícím bromfenolovou modř, takže vznikla koncentrace EPO 20 pg/ml. Vzorky se denaturovaly 5 minut při 95 °C v předehřátém vytápěcím bloku. Jako srovnávací proteiny se použily proteiny „Bio-Rad Standard Low. Tyto se připravily a zpracovaly přesně tak jako vzorky EPO, Kromě toho se připravil pracovní standard EPO, který se použil pro srovnáni. Gelová elektroforéza se prováděla pomocí miniaturní jednotky pro gelovou elektroforézu (Midget Gelektrophoresis Unit, Pharmacia - LKB 2050), a pomocí příslušné jednotky napětí. Když se naplnil elektroforetický pufr, do každého gelového zásobníku se naplnilo 20 μΐ vzorku (tj. 400 ng EPO). Po ukončení barvení se provádělo optické posuzováni gelů a gely se fotografovaly. Na základě této citlivé metody se mohly stát velmi dobře viditelnými produkty degradace a agregace monomomeru, které byly v množství > 1 %.
Výsledkek elektroforézy
U zde popsané receptury bylo možno u všech vzorků po 9 týdnech rozeznat v gelu jen jeden pás monomeru odpovídající pracovnímu standardu. Toto zdůrazňuje stabilitu proteinu v tomto přípravku.
Srovnávací příklad H
Vakuové sušení erytropoetinu bez přídavku pomocných látek
V tomto pokusu se připravil výchozí roztok, který obsahoval jen účinnou látku EPO (50000 U/ml) ve zředěném fosfátovém pufru (přibližně 5 mM). Roztok se připravil, zpracoval a sušil jako v příkladu 8.
♦ φ* • · *· • ·· • · ·*. · ·· * » »· « · • · » · · · · · · · Φ··· ·· ·· ♦· ♦* ··
U tohoto přípravku nebylo z technických důvodů možno stanovit u konečných produktů obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu, protože existující množství v jedné lahvičce byla příliš malá (přibližně 0,2 mg). Stabilita proteinu se posuzovala pomocí gelové permeační chromatografie jako v příkladu 10.
Stabilita EPO sušeného ve vakuu bez pomocných látek.
Tabulka 24: Uvedeny jsou obsahy monomeru v % získané v HPSEC
Doba uskladnění [týdny] Teplota uskladnění
TCH PT 40 °C
0 - 99,5 % -
4 98,6 % 94,4 % 88,0 %
9 96,0 % ' 89,0 % 75,0. %
13 95,7 % 87,0 % 76,3 %
26 94,7 % 88,2 % 66,6 %
TCH = teplota chladničky =4-6 °C, PT = pokojová teplota =20-22 °C
Při každém stanovení obsahu se rovněž prováděla SDS-gelová elektroforéza s vybarvením „silver stain. Příprava gelů, příprava vzorků, provádění elektroforézy a vybarvení gelů se uskutečňovalo jako v příkladu 10. Po vybarvení gelů bylo možno u vzorků každé skladovací teploty kromě pásů monomeru odpovídajících pásu pracovního standardu zřetelně rozeznat pás dimeru. Tímto pokusem se stává jasným stabilizující účinek kombinace pomocných látek použité v přikladu • 44 4 4 44 • 44«
44« «« • 4 4 4 · 4 4044 • 444 04 ·· 40 *· ··
10. Stabilita čisté účinné látky v tomto přikladu je zřetelně snížena ve srovnání se stabilitou účinné látky v receptuře příkladu 10; je možno pozorovat tvorbu dimeru. Čím vyšší je. teplota uskladnění, tím zřetelnějším se stává ochranný účinek zvolené kombinace pomocných látek v pokusu 10.
Příklad 11:
Laktátdehydrogenáza v receptuře L-maltózy, L-argininu a Lfenylalaninu, sušené ve vakuu
Připravil se roztok obsahující v 1 ml 50 mg monohydrátu maltózy, 10 mg L-argininu a 10 mg L-fenylalaninu. K tomuto roztoku se přidala laktátdehydrogenáza (LDH) tak, že výsledná aktivita proteinu byla 165 U/ml. Hodnota pH roztoku se nastavila pomocí kyseliny fosforečné na 7,0. Roztok se připravil, zpracoval a sušil jako v příkladu 8. Po vysušení vznikl homogenní produkt s teplotou skelného přechodu 96 °C a obsahem zbytkové vody 0,82 %. Hotové vzorky se uskladnily při různých teplotách a aktivita proteinu se posuzovala po různých dobách uskladnění. U LDH se určila enzymatická aktivita jako míra pro stabilitu proteinu. Toto určení se provádělo fotometricky. Ve zkušebním roztoku se pyruvát redukoval pomocí NADH za katalytického působení LDH na laktáta NAD. Úbytek obsahu NADH v roztoku bylo možno sledovat fotometricky (λ = 365 nm; ε = 3,4 cm2/pmol) . Aktivita se měřila (spektrofotometr Perkin-Elmer 552 UV/VIS) v 100 nebo 200-krát zředěných výchozích roztocích v kyvetě z umělé hmoty (tloušťka absorpční vrstvy = 1 cm). Z úbytku za .časovou jednotku se může vypočítat proteinová aktivita LDH.
• ·· · · φφ · · φφ • <* · ♦ · ·· Φ Φ ··· Φ * • Φ · · Φ · Φ Φ · ·
ΦΦ«* φφ ·· ·· ·· ΦΦ
Stabilita LDH v maltózové receptuře obsahující arginin a fenylalanin, sušené ve vakuu. Aktivita výchozího roztoku odpovídala hodnotě 100 %.
Tabulka 25: Uvedena je aktivita v % získaná ve zkoušce
Doba uskladnění [týdny] Teploty uskladněni
TCH PT 30 °C 40 °C 60 ’C
0 - 85,3 % - - -
5 87,81 % 87., 45 % ' 81,15 % 80,'42 % 64,42 %
13 83,28 % 79,41 % 78,79 % 61,74 % -
TCH = teplota chladničky =4-6 °C,
PT = pokojová teplota =20-22 °C
Pokus zřetelně ukazuje stabilizující účinek receptury pro velmi citlivý protein LDH.
Srovnávací příklad I
Vakuové sušení laktátdehydrogenázy bez přídavku pomocných látek
V tomto pokusu se připravil roztok čisté účinné látky laktátdehydrogenázy (LDH) s aktivitou 136 U/ml ve zředěném
4*4 · · · · * ·»1 • 4 * · · · · · Λ · · 4 ·4
44 · · 4 4 4 44
4444 *« ·· ·· · ··« fosfátovém pufru (8 mM). Roztok se připravil, zpracoval a sušil jako v příkladu 8. Při tomto přípravku nebylo z technických důvodů možno u konečných produktů stanovit obsah zbytkové vody a teplotu skelného přechodu, protože existující množství v jedné lahvičce byla příliš malá (přibližně 0,2 mg). Stabilita proteinu se posuzovala jako v příkladu 11. Stabilita LDH bez pomocných látek, sušené ve vakuu. Aktivita výchozího roztoku odpovídala hodnotě 100 %.
Tabulka 26: Uvádí se aktivita v %, získaná ve zkoušce
Doba uskladnění [týdny] Teplota uskladnění
TCH PT 40 °C
0 - 64,52 % -
5 66,54 % 23,03 % 1,57 %
13 50, 63 % 6,81 % 0 %
TCH = teplota chladničky =4-6 °C, PT = pokojová teplota =20-22 °C
Tímto pokusem se stává zřetelným stabilizující účinek kombinace pomocných látek použitých v příkladu 11. Stabilita čisté účinné látky v tomto příkladu je ve srovnání se stabilitou účinné látky v receptuře příkladu 11 zřetelně snížena. Čím vyšší je teplota uskladnění, tím zřetelnějším se stává ochranný účinek zvolené kombinace pomocných látek v pokusu
11. Rozdíl mezi stabilitou čistého proteinu a stabilitou proteinu sušeného v kombinaci pomocných látek je nej zřetelnější u LDH.
Příklad 12:
«·*· 4«
Laktátdehydrogenáza v receptuře L-argininu a L-fenylalaninu bez cukrů, sušené ve vakuu
Připravil se zásobní roztok s 20 mg L-argininu a 20 mg L-fenylalaninu v 1 ml. K němu se po nastavení hodnoty pH na 7,0 pomocí kyseliny fosforečné přidala laktátdehydrogenáza (LDH) tak, že vznikl výchozí roztok s proteinovou aktivitou 168 U/ml. Roztok se připravil, zpracoval a sušil jako v příkladu 8. Po vysušení vznikl homogenní produkt s teplotou skelného přechodu 103,9 °C a obsahem zbytkové vody 1,18 %. Hotové vzorky se uskladnily při různých teplotách a proteinová aktivita se posuzovala po různých dobách uskladnění. Proteinová analýza se prováděla jako v příkladu 11. Stabilita LDH v přípravku L-argininu a L-fenylalaninu bez cukrů, sušené ve vakuu. Aktivita výchozího roztoku před sušením odpovídala hodnotě 100 %.
Tabulka 27: Uvádí se enzymová aktivita v % získaná v testu aktivity
Doba uskladnění [týdny] Teploty uskladnění
TCH PT 30 °C 40 °C 60 °C
0 - 80,36 % - - -
4 79,70. % 82,08 % 79,-34 % 77,62 % 70,54 %
13 82,25 % 76,11 % 75,21 % 73,06 % -
Pokus zřetelně ukazuje stabilizující účinek tohoto aminokyselinového přípravku v celém zkušebním teplotním rozsahu. Stabilita LDH je ve srovnání se sušením čisté účinné látky (srovnávací příklad I) zřetelně zvýšena.
Srovnávací příklad J:
Laktátdehydrogenáza sušená ve vakuu v krystalické receptuře L-valinu a glycinu
Připravil se zásobní roztok s 20 mg L-valinu a 20 mg glycinu v 1 ml. K němu se po nastavení hodnoty pH na 7,0 pomocí roztoku NaOH přidala laktátdehydrogenáza (LDH) tak, že vznikl výchozí roztok s proteinovou aktivitou 147 U/ml. Roztok se připravil, zpracoval a sušil jako v příkladu 8. Po vysušení vznikl homogenní, dokonale krystalický produkt s obsahem zbytkové vody 1,12 %. Hotové vzorky se uskladnily při různých teplotách a proteinová aktivita se posuzovala po určených dobách uskladnění jako.v.příkladu 11. Stabilita LDH v dokonale krystalickém přípravku L-valinu a glycinu, sušeném ve vakuu. Aktivita výchozího roztoku před sušením odpovídala hodnotě 100 %.
Tabulka 28: Uvádí se enzymová aktivita v % získaná v testu aktivity
Doba Teploty uskladnění
uskladnění
[týdny] TCH PT 30 °C 40 °C 60 °C
0 - 9,26 % - - -
5 3,69 % 2,11 % 1,09 % 0,80 % 0,0 % '
13 0,08 % 0,01 % 0 % 0 %' 0 %
Tento pokus zřetelně ukazuje, že krystalická aminokyselinová receptura má v průběhu vakuového sušení velmi negativní účinek na enzym. Již v průběhu sušení, to znamená během tvorby krystalické struktury, se ztrácí již 90 % akti ·
vity. Také při uskladnění při různých teplotách se nemůže ještě existující aktivita zachovat. Po 5 týdnech se počáteční hodnoty vzorků ještě více zhoršily. Dokonale krystalická aminokyselinová receptura je tedy pro stabilizaci LDH úplně nevhodná.
Příklad 13
V tomto pokusu se sušil ve vakuu roztok čisté maltózy (50 mg/ml) a roztok maltózy a fenylalaninu (40 mg/ml maltózy a 10.mg/ml fenylalaninu). Zároveň s tím se připravily podobné přípravky s přísadou 10 μς/ml rh-ngf nebo 100 pg/ml PTH (1-37) nebo 500 μς/ml ularitidů. Roztoky se po přípravě sterilně filtrovaly a plnily do 2ml lahviček. Vzorky se sušily ve vakuu při 20 °C a po předem zadaných dobách se z obou receptur odebraly vzorky. Ú odebraných vzorků se určilo množství zbytkového plnění, obsah vody podle Karla Fischera a Tg. Během celé doby sušení se udržovala teplota plotny 20 °C. Tlak v komoře se snižoval postupně až na přibližně 103 mbar (1 bar = 105 Pa). Hmotnost náplně lahviček u obou receptur se 7 h zmenšovala na přibližně 6 % výchozí hodnoty, tj. roztoky se velmi rychle zkoncentrovaly. U receptury čisté maltózy vzniká nejdříve přesycený roztok, který potom přechází do kauČukovitého stavu. V dalším průběhu sušení je možno rozeznat malou výhodu při úbytku hmotnosti v přípravku obsahujícím fenylalanin ve srovnání s čistým roztokem cukru. Po ukončení sušení je u vzorků maltózy ještě přibližně 5,5 % původní, hmotnosti náplně v lahvičkách, zatím co u směsi maltózy a fenylalaninu ještě přibližně 4,9 % množství náplně.
Tento výsledek se stává ještě zřetelnější, když se místo změny hmotnosti náplně posuzuje změna obsahu vody ve vzorcích. Na začátku sušení se roztok skládá z 95,08 % vody, tj. jedna lahvička obsahuje přibližně 965 mg vody. Cílem je suchý produkt se zbytkovou vlhkostí 1 - 2 %. Při množství pevné fáze 50 mg odpovídá 1 - 2 % potom 0,5 - 1 mg vody na 1 lahvičku. Podle toho se musí během sušení asi 99,95 % vyskytující se vody sublimovat ze vzorku, aby se získal suchý produkt. V pokročilém stadiu sušení se určil obsah vody vzorků podle Karla Fischera. Toto se provádělo u vzorků obsahujících fenylalanin pomocí přímého vnesení vzorků do roztoku methanolu. Velmi lepivý cukr se nedá přímo převést do roztoku methanolu. Tento se rozpustil najdříve v bezvodém DMF. Potom se určil obsah vody tohoto roztoku. Obr. 3a znázorňuje výsledky takto uskutečněného stanovení zbytkové vody. Velmi zřetelně se rozeznává převaha přípravku obsahujícícho aminokyseliny. Již po 17 hodinách sušení se tu obsah zbytkové vody snížil na 2,7 %, zatím co u maltózové receptury byl ještě 13,59 %. Tento výsledek ukazuje výhodu roztoku obsahujícího fenylalanin. Maltózu není možno za těchto podmínek způsobu vysušit za 48 h. Po· ukončení sušení existuje při pokojové teplotě stále ještě „rubber („pryž) s velkým obsahem zbytkové vody. Kromě obsahů zbytkové vody se určily také teploty skelného přechodu jednotlivých vzorků pomocí DSC. Protože teploty skelného přechodu koresponduji přímo s obsahem vody vzorků, vykazuje směs maltózy a fenylalaninu zřetelně vyšší hodnoty. Výsledek ukazuje., že Tg směsí aminokyselin a cukrů je již po přibližně 10 hodinách v roz-sahu teploty plotny. Příslušné naměřené hodnoty jsou znázor-něny na obr. 3b. Protože v tomto stadiu sušení se odpaří ještě jen velmi málo vody, je teplota produktu v rozsahu teploty plotny. Tak existuje již po 10 hodinách procesu su-šení v lahvičkách při pokojové teplotě sklo. V případě sta-biliza.ce proteinů pomocí takové receptury to znamená, že protein je již po 10 hodinách zalitý ve stabilizujícím skle. Doba, v průběhu které zůstává protein ve zkoncentrovaném roztoku nebo v „rubber, je tedy velmi krátká, co představu-je pro stabilitu účinné látky velkou výhodu. Čistý cukr existuje sám oproti tomu po ukončení sušení při pokojové teplotě ještě jako „rubber a nemá tak v případě produktu obsahujícího proteiny žádný stabilizující účinek na účinnou látku.
Rozličné přípravky obsahující proteiny se neodlišují fyzikálními zbytkovými veličinami od základních receptur bez účinné látky.

Claims (27)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob výroby suchých, částečně amorfních produktů, které kromě jedné nebo více substancí ze skupin, zahrnujících proteiny, humánní peptidy, glykoproteiny, lipoproteiny, enzymy, koenzymy, protilátky, fragmenty protilátek, viry, složky virů, buňky, složky buněk, vakcíny, DNA, RNA, PNA a > jejich deriváty, obsahují směsi substancí, přičemž tyto směsi substancí jsou zvoleny tak, že obsahují alespoň po jedné substanci ze skupiny (i) sacharid nebo amfoterní iont s polárním zbytkem a jejich deriváty, a (ii) amfoterní iont s nepolárním zbytkem a jeho.deriváty, vyznačující se tím, že se vyrobí roztok jedné nebo více substancí ze skupin zahrnujících proteiny, humánní peptidy, glykoproteiny, lipoproteiny, enzymy, koenzymy, protilátky, fragmenty protilátek, viry, složky virů, buňky, složky buněk, vakcíny, DNA, RNA, PNA a jejich deriváty, a substancí (i) a (ii) a tento roztok se suší bez zmrazování tohoto roztoku.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, přičemž amfoterním iontem s nepolárním zbytkem je aminokyselina nebo její derivát.
  3. 3. Způsob podle jednoho z nároků 1 nebo 2, přičemž amfoterním iontem s polárním zbytkem je aminokyselina nebo její derivát.
    • · ·· • · ·.' · · φφφφ ♦· ·· ♦ · * «to·.
    φφ· ·, «
  4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že směsi substanci jsou zvoleny z jedné nebo více látek ze skupiny zahrnující monosacharidy, disacharidy, arginin, kyselinu asparagovou, citrulin, kyselinu glutamovou, ornithin, histidin, lysin a jejich deriváty a a ze skupiny zahrnující acetylfenylalaninethylester, alanin, cystein, glycin, isoleucin, leucin, methionin, fenylalanin, tryptofan, valin, sarkosin a jejich deriváty.
  5. 5. Způsob podle jednoho z nároků 1-5, vyznačující se tím, že roztok doplňkově obsahuje obvyklé pomocné látky zvolené ze skupin zahrnujících pufry, tenzidy, antioxidanty, izotonizační' prostředky, konzervační prostředky.
  6. 6. Způsob podle jednoho z nároků 1-5, vyznačující se t i m , že sušení se provádí prostřednictvím vakuového sušení.
  7. 7. Způsob podle jednoho z nároků 1-6, vyznačující se tím, že vakuové sušení nastává kontinuálním způsobem sušení.
  8. 8. Způsob podle jednoho z nároků 1-5, vyznaču jící se tím, že sušení nastává prostřednictvím sušení rozprašováním.
  9. 9. Způsob podle jednoho z nároků 1-5, vyznačující se tím, že sušeni nastává prostřednictvím sušení na válcích.
    ····»·· · · · Β··ι« ,·· ·♦ ·'· **’ * *’
  10. 10. Způsob podle jednoho z nároků 1-5, vyznačující se tím, že sušení nastává prostřednictvím infračerveného záření, mikrovln nebo jiných způsobů sálavého sušení.
  11. 11. Způsob podle jednoho z nároků 1 - 10, vyznačující se tím, že amfoterní iont s nepolárním zbytkem je zvolen tak, aby vysušená směs substancí vykazovala zvýšenou teplotu skelného přechodu ve srovnání se směsi substancí bez odpovídající přísady.
  12. 12. Způsob podle jednoho z nároků 1-7, vyznačující se tím, že sušení nastává v lyofilizačním zařízení bez předchozího zmrazování.
  13. 13. · Způsob podle jednoho z nároků 1-7, 11 nebo 12, vyznačující se tím, že sušení směsi substancí se provádí v jednorázových dávkovačích baleních.
  14. 14. Způsob podle jednoho z nároků 1 - 12, vyznačující se tím, že získaná směs látek se hned potom mele na prášek.
  15. 15. Směsi substancí obsahující kromě jedné nebo více substancí ze skupin zahrnujících proteiny, humánní peptidy, glykoproteiny, lipoproteiny, enzymy, koenzymy, protilátky, fragmenty protilátek, viry, složky virů, buňky, složky buněk, vakcíny, DNA, RNA, PNA a jejich deriváty, látky zvolené po jedné nebo více substancí z následujících skupin (i) sacharid nebo amfoterní iont s polárním zbytkem a jejich deriváty r · ·
    4«·· ·♦
    4. 4 · · «4 44 a jejich deriváty, směsi substanci (ii) amfoterní ionty s nepolárním zbytkem vyznačující- se tím, že vykazují pomocí přísady jedné nebo více substancí ze skupiny (ii) zvýšenou teplotu skelného přechodu ve srovnání se substancemi ze skupiny (i) bez příslušné přísady, přičemž lyofilizáty jsou vyloučeny.
  16. 16. Směsi substancí, které je možno získat způsobem . podle jednoho z nároků 1-14.
  17. 17. Směsi substancí podle nároku 15 nebo 16, vyznačující se t i m , že jsou částečně amorfní.
  18. 18. Směsi substancí podle jednoho z nároků 15 - 17, vyznačující se tím, že teplota skelného přechodu je vyšší než 4 °C, přednostně vyšší než 20 °C, a zbytková vlhkost je nižší než 6 % (hmot.), především nižší než 4 % (hmot.).
  19. 19. Směsi substancí podle jednoho z nároků 15 - 18, vyznačující se tím, že vykazují alespoň o 10 % vyšší zdánlivou hustotu než lyofilizáty.
  20. 20. Směsi substancí podle jednoho z nároků 15 - 19, vyznačující se tím, že vykazují křehkou, částečně amorfní, sklovitou, kompaktní strukturu.
  21. 21. Směsi substancí podle jednoho z nároků 15 - 20, vyznačující se t í m , že si zachovávají částečně amorfní strukturu v průběhu dob-uskladnění alespoň 2 týdnů.
    * *φ φ φ · φ φ · · «««« φφ » ·'··! φ οι β • ·« · φ· ·· φφφφ φφφφ φ φ φ φ φφ ··
  22. 22. Směsi substancí podle jednoho z nároků 15 - 21, vyznačující se tím, že jejich doby sušení jsou ve srovnání se substancemi ze skupiny (i) alespoň o polovinu kratší.
  23. 23. Diagnostické prostředky, vyznačující se tím, že obsahuji směsi substancí podle jednoho z nároků 15 - 22.
    1» $
  24. 24. Použiti směsí substancí podle jednoho z nároků 15 22 k výrobě diagnostik.
  25. 25. Terapeutické přípravky, vyznačující se tím, že obsahují směsi látek podle jednoho z nároků 15 22.
  26. 26. Použití směsí substancí podle jednoho z nároků 15 22 k výrobě terapeutických prostředků vedle obvyklých pomocných látek a přísad.
  27. 27. Použití alespoň po jedné substanci zvolené ze skupin (i) sacharid nebo amfoterní iont s polárním zbytkem a jejich deriváty a * (ii) amfoterní iont s nepolárním zbytkem a jeho deriváty, ke stabilizaci jedné nebo více substancí ze skupin zahrnujících proteiny, humánní peptidy, glykoproteiny, lipoproteiny, enzymy, koenzymy, protilátky, fragmenty protilátek, viry, složky virů, buňky, složky buněk, vakcíny, DNA, RNA, PNA a
CZ19981179A 1995-10-25 1996-10-24 Způsob výroby suchýchŹ částečně amorfních produktůŹ směsi substancí získané tímto způsobemŹ jejich použití a diagnostické prostředky a terapeutické přípravky obsahující tyto směsi CZ293456B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19539574A DE19539574A1 (de) 1995-10-25 1995-10-25 Zubereitungen und Verfahren zur Stabilisierung biologischer Materialien mittels Trocknungsverfahren ohne Einfrieren

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ117998A3 true CZ117998A3 (cs) 1998-11-11
CZ293456B6 CZ293456B6 (cs) 2004-05-12

Family

ID=7775640

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19981179A CZ293456B6 (cs) 1995-10-25 1996-10-24 Způsob výroby suchýchŹ částečně amorfních produktůŹ směsi substancí získané tímto způsobemŹ jejich použití a diagnostické prostředky a terapeutické přípravky obsahující tyto směsi

Country Status (25)

Country Link
US (3) US7172999B2 (cs)
EP (1) EP0857060B1 (cs)
JP (2) JPH11513700A (cs)
KR (1) KR100466670B1 (cs)
CN (1) CN1130196C (cs)
AT (1) ATE212541T1 (cs)
AU (1) AU712489B2 (cs)
BR (1) BR9611265A (cs)
CA (1) CA2235243C (cs)
CZ (1) CZ293456B6 (cs)
DE (2) DE19539574A1 (cs)
DK (1) DK0857060T3 (cs)
ES (1) ES2170274T3 (cs)
HU (1) HU222601B1 (cs)
IL (1) IL124204A (cs)
MX (1) MX9803264A (cs)
NO (1) NO324728B1 (cs)
NZ (1) NZ320276A (cs)
PL (1) PL190657B1 (cs)
PT (1) PT857060E (cs)
RU (1) RU2191003C2 (cs)
SK (1) SK283664B6 (cs)
TR (1) TR199800715T2 (cs)
WO (1) WO1997015288A2 (cs)
ZA (1) ZA968930B (cs)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6582728B1 (en) 1992-07-08 2003-06-24 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Spray drying of macromolecules to produce inhaleable dry powders
DE19539574A1 (de) * 1995-10-25 1997-04-30 Boehringer Mannheim Gmbh Zubereitungen und Verfahren zur Stabilisierung biologischer Materialien mittels Trocknungsverfahren ohne Einfrieren
EP0852951A1 (de) * 1996-11-19 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von mono- oder polyklonalen Antikörpern
EP0913178A1 (en) * 1997-11-03 1999-05-06 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the manufacture of dry, amorphous products comprising biologically active material by means of convection drying and products obtainable by the process
EP0913177A1 (de) * 1997-11-03 1999-05-06 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur Herstellung trockener, amorpher Produkte enthaltend biologisch aktive Materialien mittels Konvektionstrocknung, insbesondere Sprühtrocknung
BR9905867A (pt) * 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Linhagem celular produtora de eritropoietina humana recombinante e a eritropoietina humana recombinante produzida por esta célula
PT1181036E (pt) * 1999-04-09 2008-10-03 Ortho Mcneil Pharm Inc Composições farmacêuticas de eritropoietina
DE10026698A1 (de) 2000-05-30 2001-12-06 Basf Ag Selbstemulgierende Wirkstoffformulierung und Verwendung dieser Formulierung
AU2000264912A1 (en) * 2000-06-07 2001-12-17 Universal Preservation Technologies, Inc. Industrial scale barrier technology for preservation of sensitive biological materials
GB0017999D0 (en) * 2000-07-21 2000-09-13 Smithkline Beecham Biolog Novel device
CN101352421A (zh) * 2002-01-16 2009-01-28 贝林格尔英格海姆法玛两合公司 一种制备基本上非结晶形式的替米沙坦的方法
KR100556503B1 (ko) * 2002-11-26 2006-03-03 엘지전자 주식회사 건조기의 건조 시간제어 방법
US8377952B2 (en) * 2003-08-28 2013-02-19 Abbott Laboratories Solid pharmaceutical dosage formulation
US8025899B2 (en) 2003-08-28 2011-09-27 Abbott Laboratories Solid pharmaceutical dosage form
US20060099567A1 (en) * 2004-04-08 2006-05-11 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
CA2560513A1 (en) 2004-04-08 2005-12-01 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
US20080176209A1 (en) * 2004-04-08 2008-07-24 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
GB0517688D0 (en) * 2005-08-31 2005-10-05 Cambridge Biostability Ltd Improvements in the stabilisation of biological materials
GB2430880A (en) * 2005-10-04 2007-04-11 Cambridge Biostability Ltd Pharmaceutical compositions stabilized in glassy particles
GB0523638D0 (en) * 2005-11-21 2005-12-28 Cambridge Biostability Ltd Pharmaceutical device for the administration of substances to patients
US8968721B2 (en) 2005-12-28 2015-03-03 Advanced Bionutrition Corporation Delivery vehicle for probiotic bacteria comprising a dry matrix of polysaccharides, saccharides and polyols in a glass form and methods of making same
US8097245B2 (en) 2005-12-28 2012-01-17 Advanced Bionutrition Corporation Delivery vehicle for probiotic bacteria comprising a dry matrix of polysaccharides, saccharides and polyols in a glass form and methods of making same
US8460726B2 (en) 2006-12-18 2013-06-11 Advanced Bionutrition Corporation Dry food product containing live probiotic
US8466187B2 (en) 2007-09-18 2013-06-18 Thermolife International, Llc Amino acid compositions
WO2010111565A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 Advanced Bionutrition Corporation Microparticulated vaccines for the oral or nasal vaccination and boostering of animals including fish
EP2236520A1 (en) * 2009-03-31 2010-10-06 Leukocare Ag Stabilizing composition for immobilized biomolecules
WO2010138522A2 (en) * 2009-05-26 2010-12-02 Advanced Bionutrition Corporation Stable dry powder composition comprising biologically active microorganisms and/or bioactive materials and methods of making
AR080428A1 (es) 2010-01-20 2012-04-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulaciones liquidas estabilizadas contentivas de anticuerpos
US9504750B2 (en) 2010-01-28 2016-11-29 Advanced Bionutrition Corporation Stabilizing composition for biological materials
US8834951B2 (en) 2010-01-28 2014-09-16 Advanced Bionutrition Corporation Dry glassy composition comprising a bioactive material
US9845489B2 (en) 2010-07-26 2017-12-19 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing DNA, RNA and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
CA2806670A1 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
WO2012021783A2 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Advanced Bionutrition Corporation Dry storage stabilizing composition for biological materials
CN102408467B (zh) * 2010-09-26 2014-03-05 海口维瑅瑷生物研究院 真空干燥蛋白的方法、制得的蛋白产品和试剂盒
AU2012242565B2 (en) 2011-04-13 2017-05-11 Thermolife International, Llc N-Acetyl Beta Alanine methods of use
US9725703B2 (en) 2012-12-20 2017-08-08 Biomatrica, Inc. Formulations and methods for stabilizing PCR reagents
FI3834824T3 (fi) 2014-03-28 2025-12-05 Univ Duke Estrogeenireseptoripositiivisen rintasyövän hoito selektiivisellä estrogeenireseptorin modulaattorilla
CN106572650B (zh) 2014-06-10 2021-08-31 生物马特里卡公司 在环境温度下稳定凝血细胞
US9868944B2 (en) * 2014-12-19 2018-01-16 Roche Molecular Systems, Inc. Reaction mixtures
AR103173A1 (es) 2014-12-22 2017-04-19 Novarits Ag Productos farmacéuticos y composiciones líquidas estables de anticuerpos il-17
KR102567744B1 (ko) * 2015-02-11 2023-08-18 에바 뉴트리션 인크 생존 가능한 대장균을 삽입하기 위한 향상된 건조 기질, 이의 제조 방법 및 용도
JP7019422B2 (ja) 2015-04-29 2022-02-15 ラジウス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 癌を治療するための方法
US12558395B2 (en) 2015-07-29 2026-02-24 Advanced Bionutrition Corp. Stable dry probiotic compositions for special dietary uses
JP6889699B2 (ja) 2015-07-29 2021-06-18 アドバンスド バイオニュートリション コープ． 特定栄養用途のための安定乾燥プロバイオティクス組成物
SG11201804776SA (en) 2015-12-08 2018-07-30 Biomatrica Inc Reduction of erythrocyte sedimentation rate
CN106831466B (zh) * 2016-12-28 2018-05-22 安徽省虹升生物股份有限公司 一种β-丙氨酸的常规储存方法
KR102707399B1 (ko) 2017-01-05 2024-09-13 래디어스 파마슈티컬스, 인코포레이티드 Rad1901-2hcl의 다형 형태
EP3781192A1 (en) * 2018-04-16 2021-02-24 Merck Patent GmbH Additives for protein formulations to improve thermal stability
IL279853B2 (en) 2018-07-04 2025-01-01 Radius Pharmaceuticals Inc Polymorphic forms of RAD 1901-2HCL
CN113348163B (zh) 2019-02-12 2024-10-08 雷迪厄斯制药公司 方法和化合物
AU2021278562A1 (en) 2020-05-29 2022-12-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody-containing formulation
MX2023000557A (es) * 2020-07-13 2023-02-13 Merck Patent Gmbh Excipientes reductores de la viscosidad y combinaciones de los mismos para formulaciones proteicas altamente concentradas.
US12156886B2 (en) 2020-11-12 2024-12-03 Thermolife International, Llc Methods of increasing blood oxygen saturation
US11865139B2 (en) 2020-11-12 2024-01-09 Thermolife International, Llc Method of treating migraines and headaches
MX2023009015A (es) 2021-02-11 2023-08-08 Thermolife Int Llc Un metodo para administrar gas de oxido nitrico.
CN114480129A (zh) * 2022-01-13 2022-05-13 力因精准医疗产品（上海）有限公司 一种人粪便保存液及使用方法
KR102913374B1 (ko) * 2022-12-28 2026-01-15 씨제이제일제당 주식회사 발효 제품 제조 방법

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3714353A (en) * 1959-08-11 1973-01-30 Upjohn Co THERAPEUTIC COMPOSITIONS COMPRISING A 6 alpha ; 9 alpha -DIFLUORO-11 beta ,17 alpha ,21-TRIHYDROXY-16 alpha -METHYL-1,4-PREGNADIENE-3,20-DIONE AND 21-ACYLATES
US3852461A (en) * 1971-08-04 1974-12-03 Upjohn Co Benzodiapines used as minor tranquilizers
JPS5836954B2 (ja) * 1980-03-31 1983-08-12 栄研化学株式会社 酵素の安定化剤
JPS5967228A (ja) 1982-10-07 1984-04-16 Green Cross Corp:The 寒冷不溶性グロブリンの凍結乾燥方法
JPS6197229A (ja) * 1984-10-18 1986-05-15 Chugai Pharmaceut Co Ltd 安定なエリトロポエチン製剤
US4732889A (en) * 1985-02-06 1988-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for the treatment of the anemia of rheumatoid arthritis
US4788072A (en) * 1985-08-15 1988-11-29 Toshimitsu Kawamura Method of dehydrating foods
US4808617A (en) 1985-12-18 1989-02-28 Bristol-Myers Company Lyophilized or precipitated cephalosporin zwitterion and salt combination
WO1988006457A1 (fr) * 1987-03-04 1988-09-07 Nippon Hypox Laboratories Incorporated Composition medicinale contenant de l'albumine en tant que support et procede de preparation
DE3729863A1 (de) * 1987-09-05 1989-03-16 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilisierte erythropoietin-lyophilisate
US4886742A (en) * 1987-06-15 1989-12-12 Coulter Corporation Enzyme immunoassay for detecting HIV antigens in human sera
DE3801179A1 (de) 1988-01-18 1989-07-27 Hoechst Ag Stabilisierung von cephalosporinderivaten durch trocknung mit einem stabilisator sowie stabile zubereitungsformen mit cephalosporinderivaten
JPH0761955B2 (ja) 1988-04-28 1995-07-05 国立予防衛生研究所長 凍結乾燥ａ型肝炎ワクチン
CA1339071C (en) 1988-08-24 1997-07-29 Koichiro Tsuji Thrombus control agent
JPH0296536A (ja) 1988-09-29 1990-04-09 Green Cross Corp:The プラスミノゲン乾燥製剤
JP2739584B2 (ja) 1989-01-06 1998-04-15 株式会社ミドリ十字 ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター乾燥製剤
US5186944A (en) * 1989-02-15 1993-02-16 Eimei Company Ltd. Therapeutic medicament for thrombosis
JPH03505334A (ja) 1989-04-11 1991-11-21 イミユノバイオロジー・リサーチ・インスチチユート・インコーポレーテツド 凍結乾燥されたペプチド製剤
JPH0775519B2 (ja) 1989-10-06 1995-08-16 東洋製罐株式会社 ドライパック包装食品の製造方法
GB9001987D0 (en) * 1990-01-29 1990-03-28 Janssen Pharmaceutica Nv Improved cyclodextrin based erythropietin formulation
JPH0813750B2 (ja) 1990-03-01 1996-02-14 持田製薬株式会社 経口用トロンビン製剤
US5200399A (en) * 1990-09-14 1993-04-06 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Method of protecting biological materials from destructive reactions in the dry state
US5217741A (en) 1991-01-25 1993-06-08 Snow Brand Milk Products Co., Ltd. Solution containing whey protein, whey protein gel, whey protein powder and processed food product produced by using the same
AU659645B2 (en) 1991-06-26 1995-05-25 Inhale Therapeutic Systems Storage of materials
JP2818834B2 (ja) * 1991-08-12 1998-10-30 大塚製薬株式会社 ＩＬ−１α安定化医薬製剤
DE4141351A1 (de) 1991-12-14 1993-06-17 Basf Ag Stabile pulverfoermige vitamin- und/oder carotinoid-praeparate und verfahren zu deren herstellung
SE9201073D0 (sv) 1992-04-03 1992-04-03 Kabi Pharmacia Ab Protein formulation
IL105553A (en) 1992-05-06 1998-01-04 Janssen Pharmaceutica Inc Solid dosage form comprising a porous network of matrix forming material which disperses rapidly in water
IT1254359B (it) 1992-05-11 1995-09-14 Serono Cesare Ist Ricerca Composizioni farmaceutiche contenenti il-6
US6582728B1 (en) 1992-07-08 2003-06-24 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Spray drying of macromolecules to produce inhaleable dry powders
JP3168550B2 (ja) * 1992-12-02 2001-05-21 株式会社林原生物化学研究所 脱水剤およびそれを用いる含水物の脱水方法並びにその方法で得られる脱水物品
DE4242863A1 (de) 1992-12-18 1994-06-23 Boehringer Mannheim Gmbh Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von G-CSF
US5354934A (en) * 1993-02-04 1994-10-11 Amgen Inc. Pulmonary administration of erythropoietin
NZ281112A (en) 1994-03-07 1998-04-27 Inhale Therapeutic Syst Powdered insulin delivered as an aerosol
US5955448A (en) * 1994-08-19 1999-09-21 Quadrant Holdings Cambridge Limited Method for stabilization of biological substances during drying and subsequent storage and compositions thereof
FR2719479B1 (fr) * 1994-05-04 1996-07-26 Sanofi Elf Formulation stable lyophilisée comprenant une protéine: kit de dosage.
ES2245780T3 (es) 1994-05-18 2006-01-16 Nektar Therapeutics Metodos y composiciones para la formulacion de interferones como un polvo seco.
IL116085A (en) * 1994-12-16 1999-12-31 Ortho Pharma Corp Spray dried erythropoietin
ES2237767T3 (es) 1995-04-14 2005-08-01 Nektar Therapeutics Composiciones farmaceuticas en polvo que tienen una dispersabilidad mejorada.
US5728678A (en) 1995-06-06 1998-03-17 Nestec Ltd. Method and composition for providing nutrition to a renal failure patient
DE19538687A1 (de) 1995-10-17 1997-04-24 Boehringer Mannheim Gmbh Stabile pharmazeutische Darreichungsformen enthaltend Parathormon
DE19539574A1 (de) * 1995-10-25 1997-04-30 Boehringer Mannheim Gmbh Zubereitungen und Verfahren zur Stabilisierung biologischer Materialien mittels Trocknungsverfahren ohne Einfrieren

Also Published As

Publication number Publication date
RU2191003C2 (ru) 2002-10-20
DE19539574A1 (de) 1997-04-30
DK0857060T3 (da) 2002-05-13
US20070020289A1 (en) 2007-01-25
KR19990067082A (ko) 1999-08-16
AU7298496A (en) 1997-05-15
PT857060E (pt) 2002-07-31
NO981868L (no) 1998-06-25
SK283664B6 (sk) 2003-11-04
WO1997015288A3 (de) 1997-05-29
ZA968930B (en) 1998-04-24
HU222601B1 (hu) 2003-08-28
HUP9901314A3 (en) 2000-02-28
MX9803264A (es) 1998-09-30
CN1205628A (zh) 1999-01-20
NO981868D0 (no) 1998-04-24
US7172999B2 (en) 2007-02-06
BR9611265A (pt) 1999-05-04
ES2170274T3 (es) 2002-08-01
PL326358A1 (en) 1998-09-14
TR199800715T2 (xx) 1998-08-21
JP2007236975A (ja) 2007-09-20
EP0857060B1 (de) 2002-01-30
KR100466670B1 (ko) 2005-09-07
EP0857060A2 (de) 1998-08-12
JPH11513700A (ja) 1999-11-24
CN1130196C (zh) 2003-12-10
US20030059468A1 (en) 2003-03-27
NO324728B1 (no) 2007-12-03
CA2235243A1 (en) 1997-05-01
CA2235243C (en) 2003-04-22
AU712489B2 (en) 1999-11-11
NZ320276A (en) 1999-11-29
DE59608684D1 (de) 2002-03-14
CZ293456B6 (cs) 2004-05-12
PL190657B1 (pl) 2005-12-30
SK50998A3 (en) 1998-12-02
WO1997015288A2 (de) 1997-05-01
HUP9901314A2 (hu) 1999-07-28
IL124204A (en) 2001-10-31
US20010055617A1 (en) 2001-12-27
ATE212541T1 (de) 2002-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ117998A3 (cs) Způsob stabilizace biologických materiálů a přípravky k provádění tohoto způsobu
JP2007236975A6 (ja) 凍結しない乾燥過程により生物材料を安定化するための調製物及び方法
AU2010324839B2 (en) Lyophilization methods, compositions, and kits
CZ292183B6 (cs) Stabilizovaný lyofilizovaný přípravek s rekombinantním faktorem VIII prostý albuminu
CN101039660B (zh) 稳定的聚乙二醇化干扰素制剂
Lam et al. Replacing succinate with glycolate buffer improves the stability of lyophilized interferon-γ
CA2288649A1 (en) Stable pharmaceutical administration forms of peptides, proteins and nucleic acids
US5714458A (en) Stable pharmaceutical compositions containing a fibroblast growth factor
JP3100058B2 (ja) 線維芽細胞成長因子を含む安定な医薬組成物
Lu et al. Thermal and FTIR investigation of freeze-dried protein-excipient mixtures
US20020103126A1 (en) Stable pharmaceutical form of administration for peptides, proteins and nucleic acids
TW387988B (en) Preparations and processes for stablizing biological materials by means of drying processes without freezing
MXPA99009550A (en) Stable pharmaceutical administration forms of peptides, proteins and nucleic acids

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20111024