CZ14699A3

CZ14699A3 - Rostlinný materiál cukrové řepy rezistentní proti herbicidům, způsob produkce herbicidní rezistence v tomto rostlinném materiálu, způsob udělení rezistence proti herbicidům tomuto rostlinnému materiálu a způsob kontroly růstu plevele v přítomnosti těchto rostlin

Info

Publication number: CZ14699A3
Application number: CZ99146A
Authority: CZ
Inventors: Donald Penner; Terry R. Wright
Original assignee: Michigan State University
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1997-07-08
Publication date: 1999-08-11
Also published as: UA72429C2; PL331176A1; BG64235B1; EP0944716B1; ATE362976T1; EP0944716A4; SK286017B6; EP0944716A1; CN1230218A; SK4499A3; US5773702A; DK0944716T3; PT944716E; HUP9903914A3; CN1109753C; DE69737751D1; CZ295393B6; EA199900122A1; EA003296B1; AU3596497A

Description

(57) Anotace:

Řešení se týká rostlin cukrové řepy, které jsou rezistentní proti imidazolinonovým herbicidům. Rostliny cukrové řepy jsou odvozeny z citlivých buněk selekcí imidazolinonově rezistentních buněk mutantů, která se provádí za použití herbicidu. Rezistentní rostliny, které jsou odvozeny z těchto buněk, mohou růst na polích, na kterých se ke kontrole plevele použily imidazolinony.

01-48-99 Če ýl/ ΙΚ-Ίγ • · · · · · · • · · · • · · · · · ·· ··· ··· • · · ·· ·· ··

7Λ-)

Rostlinný materiál cukrové řepy rezistentní proti herbicidům, způsob produkce herbicidní rezistence v tomto rostlinném materiálu, způsob, který udílí tomuto rostlinnému materiálu rezistenci proti herbicidům a způsob kontroly růstu plevele v přítomnosti těchto rostlin

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu produkce rostlin cukrové řepy (Beta vulgaris L.), které jsou rezistentní proti imidazolinonovým herbicidům, které se používají pro kontrolu plevele. Vynález se týká zejména rostlin cukrové řepy odvozených z citlivé cukrové řepy výběrem rostlin s mutovaným genem kódujícím acetolaktátsyntázu (ALS), která je rovněž známa jako syntáza acetohydroxykyseliny (AHAS), v kultivačním médiu za použití herbicidu a buněk.

Dosavadní stav techniky

Známý stav popisuje genetickou alteraci acetolaktátsyntázového genu rekombinantními prostředky, které jsou popsány v patentech US 5,013,659; US 5,141,870 a US 5,378,824 (Bedbrook a kol.). Tento typ modifikace v rostlinách cukrové řepy je popsán v příkladu IV patentu '824. Výsledky pokusů vyprodukovat rostliny s ideální herbicidní rezistencí nebyly doposud uspokojivé.

V minulosti již byly produkovány a kříženy různé rezistentní rostliny. Saunders a kol. v Crop Science

32:1357-1360 (1992) například popisuje produkci rostliny cukrové řepy (CR1-B) rezistentní proti sulfonylmočovinám z

01-48-99 Ce • · • · · · • · • · · *

citlivého samoplodícího klonu (REL-1), která spočívá v selekci buněk mutanta v kultivačním médiu obsahujícím herbicid a pomocí které se vyprodukovaly a křížily různé rezistentní rostliny. Hart a kol. (Weed Science 40:378-383 (1992); a Weed Sci. 41:317-324 (1993)) dále charakterizoval rezistentní linii a zjistil, že rezistence je důsledkem alterované ALS aktivity, že neexistuje křížová rezistence s dalšími herbicidy inhibujicími ALS a to, že rezistence je kódována jediným semidominantním genem.

V současnosti nejsou dostupné žádné publikace, které by popisovaly imidazolinonovou rezistenci získanou u rostlin cukrové řepy modifikací ALS neboli AHAS. Nicméně jak uvádí Newhouse a kol., Theoretical and Applied Genetics 83:65-70 (1991), byly již vyvinuty různé kukuřičné linie s imidazolinonovou rezistencí.

Komerčním způsobem používaným pro ochranu sklizně je použití klinických „ochranných prostředků, například prostředků popsaných v evropském patentu č. 375,875. Tento způsob zavádí do půdy další chemikálie. Z výše uvedeného tedy vyplývá, že bylo výhodné nalézt způsob, kterým by bylo možné vyprodukovat rostliny cukrové řepy, které by byly rezistentní proti imidazolinonovým herbicidům.

Podstata vynálezu

Jak již bylo uvedeno, cílem vynálezu je tedy poskytnout způsob, který udělí rostlinám cukrové řepy rezistenci proti imidazolinonovým herbicidům, přičemž tento způsob je založen na mutaci acetolaktátsyntázového genového kódování, která vede k získání této rezistence. Dalším

01-48-99 Če ·· ···· · · ···· • · · · · · cílem vynálezu je poskytnout rostliny cukrové řepy, které by byly rezistentní proti tomuto herbicidu. Tyto a další cíle vynálezu se stanou zřejmějšími po prostudování následujícího popisu a přiložených výkresů.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 schematicky znázorňuje způsob produkce imidazolinonově rezistentních rostlin cukrové řepy podle vynálezu. R = rezistentní; IM = imidazolinon; S = citlivý; SU = sulfonylmočovina; Sur = AIS alela, dominantní pro SU-R, TP-R a IM-S; SIR-13 = ALS alela, dominantní pro SU-S, TP-S a IM-R; TP = triazolopyrimidin. REL-1 byl výchozí materiál pro získání imidazolinonově rezistence.

Obr. 2 znázorňuje vývojový diagram ukazující jednotlivé kroky produkce rostliny mutanta cukrové řepy.

Obr. 3 znázorňuje graf ukazující rezistenci rostlin cukrové řepy proti postemergentně, postřikem aplikovanému imazethapyru.

Obr. 4 znázorňuje graf ukazující rezistenci proti imazethapyru v ALS testu buněčné kultury.

Vynález se týká rostlinného materiálu cukrové řepy sestávajícího z buněk mutovaných acetolaktátsyntázovým genovým kódováním, které mají rezistenci proti imidazolinonovým herbicidům a tato rezistence se přenáší běžným křížením rostlin, získaných z těchto buněk.

01-48-99 Če • · • · · · • ·

Vynález se dále týká způsobu produkce herbicidní rezistence u rostliny cukrové řepy, který zahrnuje vystavení prvních buněk rostlin cukrové řepy působení imidazolinonového herbicidu, na který jsou první buňky citlivé, v kultivačním médiu; a výběr sekundárních buněk majících herbicidní rezistenci, přičemž tuto rezistenci lze přenést křížením rostliny obsahující sekundární buňky.

Konečně se vynález týká způsobu udílení herbicidní rezistence rostlinám cukrové řepy, který zahrnuje vystavení prvních buněk rostlin cukrové řepy působení imidazolinonového herbicidu, na který jsou první buňky citlivé, přičemž tato expozice se provádí v kultivačním médiu; výběr sekundárních buněk majících herbicidní rezistenci, přičemž tuto rezistenci lze přenést křížením rostliny obsahující sekundární buňky; vypěstování první rostliny ze sekundárních buněk, přičemž tato rostlina má zmíněnou herbicidní rezistenci; a křížení první rostliny s druhou rostlinnou za vzniku hybridní rostliny, která má rovněž tuto herbicidní rezistenci.

Rostlinu cukrové řepy REL-1 (Regenerating, East Lansing-1), která byla uvolněna v roce 1987, lze získat od výzkumného genetika Dr. Josepha Saunderse, Ministerstvo zemědělství US, East Lansing, Michigan. Je dostupná zdarma. REL-1 je citlivá proti imidazolinonovým (IM-S), sulfonylmočovinovým (SU-S) a triazolopyridinsulfonamidovým (TP-S) herbicidům, jak naznačuje obr. 1.

Za použití pletivové a suspenzní kultury se vyvinula linie, která byla heterozygotní rezistenci (IM-R). Tato buněčná

6. května 1996 uložena do sbírky pro imidazolinonovou linie (semena) byla kultur American Type úmluvy, jako

Culture Collection, podle Budapešťské

01-48-99 Če • ·

ATCC 97534 a zde je označována jako Sir-13. Tato buněčná linie je dostupná na požádání, po uvedení označení a čísla, ale není na ni udělena žádná licence. Pěstováním elitních rostlinných linií cukrové řepy, zejména Beta vulgaris L._rlze vyprodukovat rezistentní rostliny cukrové řepy, které jsou zvláště vhodné pro komerční využití. Pro přenos imidazolinonové rezistence na další druhy řepy, například na červenou řepu, lze použít tradiční pěstitelské techniky.

Rostliny cukrové řepy, rezistentní proti imidazolinonovým herbicidům, zejména imazethapyru, řeší problém, vznikající při použití těchto herbicidů v oblastech pěstování cukrové řepy a týkajícící dalšího využití půdy, na kterou se tyto herbicidy aplikují. Mezi použitím těchto herbicidů a následným využitím pole pro pěstování rostlin cukrové řepy musí v současné době uběhnout čtyřicetiměsíční klidová perioda. Další výhodou vynálezu je ta skutečnost, že vysoká imidazolinonové rezistence umožňuje použít imidazolinonové herbicidy pro kontrolu plevele v cukrové řepě.

Následující příklad 1 ukazuje izolaci a vypěstování nové rostliny cukrové řepy (Sir-13).

01-48-99 Če • · • · · · · ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

1. Selekce imidazolinonové rezistentních variet cukrové řepy (Sir-13).

Specifikace materiálů

Rel-1	(Regenerating	East	Lansing-1)	je vysoce	re-
	generovatelná	linie	dvoudomé	cukrové řepy,	u
	které plodí	pouze	samčí rostliny a která	se
	použila pro počáteční buněčnou	selekci, při	níž

se získal herbicidně rezistentní mutant s rezistencí proti imidazolinonům a který se použil jako citlivý kontrolní vzorek pro většinu experimentů.

CR1-B Tento izolát cukrové řepy se vyvinul naočkováním Rel-1 buněk na médium, obsahující imazethapyr. Tato varieta je imidazolinonově rezistentní a nemá žádnou křížovou rezistenci proti sulfonylmočovinám.

93R30B Reprezentativní vybraný izolát, který nemá tendenci se dále reprodukovat. To je anomální důsledek buněčných kultivačních postupů.

a. Rostliny, které měly sloužit jako výchozí materiály pro somaklonální selekci, se zvolily na základě své schopnosti tvořit za podmínek zahrnujících vysokou koncentraci cytokininu (v B1 médiu) pletivo a regenerovat z tohoto pletiva nové výhonky.

01-48-99 Če

Protokol pro B1 médium: 30 g/1 sacharózy

100	mg/1	myo-inositolu
1, 65	g/i	NH₄NO₃
1, 90	g/1	kno₃
0,44	g/1	CaCl₂.2H₂O
0,37	g/i	MgSO₄.7H₂O
0, 17	g/i	KH₂PO₄
6,2	mg/1	H3BO3

16.8 mg/1 MnSO₄.H₂O

10,6 mg/1 ZnSO₄.7H₂O

0,88 mg/1 KI

0,25 mg/1 Na₂Mo0₄.2H₂0

0,025 mg/1 CuSO₄.5H₂O

0, 025 mg/1 CoCl₂.6H₂0

37,3 mg/1 Na₂EDTA

27.8 mg/1 FeSO₄.7H₂O mg/1 thiaminu

0,5 mg/1 pyridoxinu

0,5 mg/1 kyseliny nikotinové mg/1 benzylaminopurinu pH 5,95

B1 pevné médium se vařilo v autoklávu s 9 g/1 agaru rostlinné kultury a podle potřeb selekčního schématu modifikovalo filtrem sterilizovanými herbicidními zásobními roztoky. Agarové médium se nalilo do jednorázově použitelných umělohmotných Petriho misek o rozměrech 15 x 100 mm.

01-48-99 Če • · · ·

BI kapalné médium se přidalo ve 40ml alikvotních podílech do 125ml Erlenmeyerových baněk a vařilo v autoklávu, aby mohlo být použito v kapalných suspenzních kulturách.

Pro selekci imidazolinonové rezistentní variety Sir-13 se jako výchozí materiál použil Rel-1.

b. Pro selekci imidazolinonové rezistentní varianty se použil následující postup, který je rovněž znázorněn na obr. 2.

Kotoučové explantáty listů se připravily z rychle se rozvíjejících listů výchozí rostliny. Povrchy listů se sterilizovaly (krok 1) dvěma po sobě jdoucími dvacetiminutovými oplachy 15% komerční bělící lázní a 0,25% tritonem X-100 (T-9284, Sigma Chern. Co., St. Louis, MO) . Listy se dvakrát opláchly sterilní deionizovanou vodou. Listové kotouče se vyřízly pomocí korkovrtu č. 3, sterilizovaného plamenem.

Listové kotouče se asepticky umístily na pevné médium BI (krok 2). Kotouče se inkubovaly ve tmě, při 30^eC, 4 až 8 týdnů, dokud se z listového kotouče nezískala drolivá, bílá, pletivová tkáň. Pletivové tkáně se mechanicky separovaly pomocí nůžek a následně přemístily do 125ml Erlenmeyerových baněk (krok 3), obsahujících 40 ml kapalného média Bl. Baňky se umístily na otočnou protřepávačku při 50 Hz, za nízké intenzity fluorescenčního světla (30 gE/m²s). Kapalné kultury se po jednom týdnu přemístily do čerstvého média Bl.

Dva týdny po aktivaci kapalné kultury se buněčné shluky separovaly pomocí buněčného disociačního síta (Sigma

CD-I) s velikostí ok 60 mesh. Po sedimentaci buněk se

01-48-99 Če • · · · odstranily přibližně dvě třetiny objemu kapalného média. V kroku 4 se buňky resuspendovaly ve zbývajícím médiu a lml alikvotní podíly se rovnoměrně rozprostřely na pevném Bl médiu, obohaceném 50 nM imazethapyrovým herbicidem (PURSUIT, American Cyanamid, Wayne, NJ). Plotny se zabalily a inkubovaly ve tlumeném fluorescenčním světle (5 až 10 pE/m²s) po dobu osmi až dvanácti týdnů.

c. Při 50 nM imazethapyrové koncentraci všechny citlivé buňky odumřely. Buněčné shluky, které při této koncentraci přežily a rostly, byly identifikovány jako potenciálně rezistentní variety. V kroku 5 se tyto buněčné shluky (1 až 3 mm v průměru) přenesly do čerstvého pevného Bl média, které neobsahovalo herbicid, a nechaly se růst za mírného světla (10 až 20 pE/m²s) . Každá potenciálně rezistentní varieta se individuálně identifikovala a skladovala samostatně.

d. V kroku 6 se bílé, drolivé pletivo oddělovalo každé čtyři až šest týdnů do čerstvého pevného média Bl, dokud z pletiva nevyrostly jednotlivé výhonky. Tyto výhonky se přenesly do média, určeného pro udržování těchto výhonků (M20), které mělo následující složení:

01-48-99 Če

Protokol pro M20 médium:

g/1 sacharózy

100 mg/1 myo-inositolu

1,65 g/1 NH4NO3

1,90 /1 KNO₃

0,44 g/1 CaCl₂.2H₂O

0,37 g/1 MgSO₄.7H₂O

0,17 g/1 KH₂PO₄

6,2 mg/1 H₃BO₃

16.8 mg/1 MnSO₄.H₂O

10, 6 mg/1 ZnSO₄.7H₂O

0,88 mg/1 KI

0,25 mg/1 Na₂Mo0₄.2H₂0

0,025 mg/1 CuSO₄.5H₂O

0, 025 mg/1 CoCl₂.6H₂0

37,3 mg/1 Na₂EDTA

27.8 mg/1 FeSO₄.7H₂O mg/1 thiaminu

0,5 mg/1 pyridoxinu

0,5 mg/1 kyseliny nikotinové mg/1 benzylaminopurinu pH 5,95

M20 pevné médium se vařilo v autoklávu s 9 g/1 agaru rostlinné kultury a modifikovalo podle potřeb selekčního schématu filtračně sterilizovanými herbicidními zásobními roztoky. Agar se nalil do umělohmotných Petriho misek na

jedno použití 0	rozměrech	20 x 100 ml.
Kultury	výhonků	se skladovaly	za mírného
fluorescenčního	světla	10 až 20 gE/m²s	a propagovaly

rozřezáním pomocí skalpelu. U těchto výhonkových kultur se určovala hladina rezistence způsobem, který bude popsán dále.

01-48-99 Če •Φ ΦΦΦΦ • φ

ΦΦΦΦ

2. Míra imidazolinonové rezistence ve výhonkové kultuře

V kroku 7 se herbicidní rezistence výhonkových kultur určovala tak, že se na každou plotnu s médiem M20, obohaceným logaritmicky se zvyšujícími koncentracemi imidazolinonového herbicidu od 1 nM do 0,1 mM umístily tři malé, stejně velké řezy výhonků. Odezvy kultury Sir-13 se porovnaly s odezvami výhonkových kultur citlivé kontroly (Rel-1). Výhonkové kultury se tři týdny skladovaly při 25°C a světelné intenzitě 20 pE/m^zs. Odezva výhonkové kultury se určila hodnocením poškození výhonků a čerstvé hmotnosti tři týdny po přenesení do selekčního média. Hodnotu herbicidní rezistence určoval poměr hodnot I₅o rezistentní a citlivé kultury (I₅₀ - herbicidní koncentrace, způsobující 50% poškození).

Křížová rezistence každé variety se určila výše popsaným způsobem s tou výjimkou, že se v médiu použil jiný herbicid. Výhonková kultura Sir-13 vykazovala dvěstědvacetinásobnou rezistenci proti imazethapyru a žádnou rezistenci proti sulfonylmočovinovému herbicidu chlorsulfuron nebo triazolonpyrimidinsulfonanilidovému herbicidu flumetsulam, jak ukazuje tabulka 1.

01-48-99 Če

4« ··*♦ • » · • 444 4 · * • · • 44* 444 •4 ···♦ • · • 4·· • 4 • 44 • 4 ’* • 4 4 W

I 4 4 4 «44 444 t 4

3. Regenerace a pěstování rostliny

V kroku 8 se výhonkové kultury Sir-13 regenerovaly podobným způsobem na celé rostliny. Dva týdny po předchozí subkultivaci výhonků se výhonky Sir-13 přemístily do 125ml Erlenmeyerových baněk obsahujících 40 ml N3 média, které podporuje zakořenění rostlin.

Protokol pro N3 médium:

g/1 sacharózy

100	mg/1	myo-inositol
1, 65	g/i	NH₄NO₃
1, 90	g/1	kno₃
0,44	g/1	CaCl₂.2H₂O
0,37	g/i	MgSO₄.7H₂O
0,17	g/i	KH₂PO₄
6,2 :	mg/1	h₃bo₃

16.8 mg/1 MnS0₄.H₂0

10,6 mg/1 ZnSO₄.7H₂O

0,88 mg/1 KI

0,25 mg/1 Na₂Mo0₄.2H₂0

0,025 mg/1 CuSO₄.5H₂O

0, 025 mg/1 CoCl₂.6H₂O

37,3 mg/1 Na₂EDTA

27.8 mg/1 FeSO₄.7H₂O mg/1 thiaminu

0,5 mg/1 pyridoxinu

0,5 mg/1 kyseliny nikotinové mg/1 kyseliny naftalenoctové pH 5,95

N3 médium se přidalo ve 40ml alikvotních podílech do 125ml Erlenmeyerových baněk, načež se do každé baňky přidalo 9 g/1 agaru (0,45 g) a médium se vařilo v autoklávu, aby

01-48-99 Če • · toho g/1 agaru (0,45 g) a médium se vařilo v autoklávu, aby mohlo být dále použito při zakořeňováni výhonkových kultur. Kultury se následně na 24 hodin přemístily na denní světlo se střední světelnou intenzitou (40 až 60 pE/m²s), kde se udržovala teplota 25°C. O šest až osm týdnů později se zpravidla vytvořily kořeny.

V kroku 9 se zakořeněné výhonky (R₀-generace) zasadily do hrnkové směsi Baccto (Michigan Peat Co., Houston, TX) a umístily do skleníku. V kroku 10 se rostliny R₀-generace Sir-13 zkřížily s rostlinou cukrové řepy s hladkým kořenem s označením 293. Semena Fi-generace z těchto křížení byla samoopylovací a poskytla semena R₂-generace. Dalo se předpokládat, že imidazolinonová rezistence je dominantním nebo semi-dominantním monogenním znakem. Rostliny F₂-generace by se měly segregovat v genotypovém štěpném poměru 1 homozygotně rezistentní ku 2 heterozygotně rezistentnímu ku 1 homozygotně citlivému, v případě imidazolinonové rezistence.

Sir-13 dědičnost jako monogenní dominantní znak

Tento poměr se určil analyzováním potomstva každé rostliny F₂-generace. V případě Sir-13 se nechaly rostliny F₂-generace samoopylit a z každé rostliny se odděleně sebrala semena. Tito potomci se vypěstovali ve skleníku a ve stadiu dvou až .čtyř listů se postříkali čtvrtinovou polní aplikační dávkou imazethapyrového (PURSUIT) herbicidu (28,35 g účinné látky/A + 1,1365 dm³/A Sunlt-II (AGSCO Fargo) + 1, 1365 dm³/A 28% UAN (močovinoamoniumnitrát)). Tato dávka umožnila rozlišení rostlin, které mají jednu nebo dvě kopie Sir-13 alely z citlivých rostlin.

Všechny Sir-13 rodiny se rozdělily do kategorií podle zda byly homozygotně rezistentní, heterozygotně

01-48-99 Če ·· ···· · · · · • · · · · ·

rezistentní nebo homozygotně citlivé na základě testování segregace potomků. Výsledky jasně ukazují, že na Sir-13 F₂ segregaci lze pro příslušné kategorie, jak ukazuje tabulka 2, aplikovat poměr 1:2:1.

TABULKA 2

Označení předků	Genotypový štěpný poměr	Počet F₂ předků
Homozygotně rezistentní	All R	12
Heterozygotně rezistentní	3R:1S	35
Homozygotně citliví	All S	15

Tyto výsledky ukazují, že Sir-13 je monogenně dominantním znakem. Tento stupeň dominance nebo semidominance nebyl doposud zjištěn.

4. Imidazolinonové rezistence celých rostlin

Homozygotní (nesegregující) Sir-13 rostliny F₂“generace se samoopylily za vzniku homozygotních Sir-13 F₃ semen. Rel-1 klony se nechaly samoopylit a produkovaly citlivá semena Si-generace. Semena se vysela ve skleníku do hrnkové směsi Baccto a po čtrnácti dnech vyjednotila tak, aby v každém hrnku zůstala pouze jedna rostlina. Rostliny se ve stadiu, kdy měly dva až čtyři listy, postříkaly 0, 0,26, 1,1, 4,4, 17,5, 70 nebo 280 g účinné složky/ha imazethapyru (PURSUIT) nebo AC 299,263 (RAPTOR). Všechna ošetření se aplikovala v objemu 239 1/ha a obsahovala následující aditiva: Sunlt-II při 1% obj. a 28% UAN při 1% obj. Každé ošetření se opakovalo čtyřikrát. Čerstvá hmotnost výhonků se stanovila dvacátý den po ošetření. Odezvy Sir-13 a citlivé řepy jsou znázorněny na obrázku 3.

01-48-99 Če

Sir-13 homozygoty vykazovaly stodvacetinásobnou a devadesátinásobnou rezistenci proti imazethapyru resp. AC 299,263.

5. Odezva ALS cílového enzymu na imazethapyr

K parciální purifikaci ALS z rychle se rozvíjejících listů rostlin cukrové řepy, pěstovaných ve skleníku, se použily standardní postupy (Hart a kol., Weed Science 40:378-383 (1992)). Extrakty z homozygotních Sir-13 rostlin F₃-generace a semena Rel-1 S_x se analyzovaly s cílem určit aktivitu ALS enzymu v přítomnosti logaritmicky se zvyšujících koncentrací imazethapyru. ALS aktivita se určila z listových extraktů REL-1 a Sir-13 linií cukrové řepy. Rostliny se nechaly vyrůst ve skleníku výše popsaným způsobem až do stadia, kdy měly čtyři až šest listů. ALS aktivita z čerstvých extraktů se určovala v přítomnosti imazethapyru při logaritmicky se zvyšujících koncentracích. Pro tyto účely se použily způsoby a postupy, které byly modifikací způsobů a postupů navržených Rayem (Plant Physiol. 75:827-831 (1984)) a Shanerem a kol., (Plant Physiol. 76:545-546 (1984)). 10 g listů cukrové řepy se homogenizovalo ve 40 ml studeného homogenizačního pufru (0,1 M K₂HPO₄, pH 7,5, 1 mM pyruvátu sodného, 0,5 mM MgCl₂, 0,5 mM thiaminpyrofosfátu, 10 μΜ flavinadenindinukleotidu, 10% (obj.) glycerol) a 2,5 g polyvinylpolypyrolidonu. Homogenát se přefiltroval přes osm vrstev procezovacích plátýnek a odstřeďoval při 27 000 G po dobu dvaceti minut. Po odstranění supernatantu se u homogenátu dosáhlo 50% nasycení přidáním síranu amonného. Tento roztok se jednu hodinu udržoval při 0°C, načež se 15 minut odstřeďoval při 18 000 G, pelety se opět rozpustily v 1 ml resuspendačního pufru (0,1 M K₂HPO₄, pH 7,5, 20 mM pyruvátu sodného, 0,5 mM

01-48-99 Če » · · · · • · • · · · ···· ·· · · • · · · · · ···· · · · · • ·· ··· ···

MgCl₂) a zbavil soli na koloně Sephadex G-25 PD-10 (Pharmacia, lne., Piscataway, NJ) . Enzymové extrakty se okamžitě použily pro analýzu.

ALS aktivita se měřila přidáním 0,2 ml enzymového přípravku (naředěným v poměru 3:1 resuspendačním pufrem) do

1,3 ml reakčního pufru (25 mM K₂HP0₄, pH 7,0, 0, 625 mM MgCl₂, 25 mM pyruvátu sodného, 0,625 mM thiaminpyrofosfátu, 1,25 μΜ flavinadenindinukleotidu) a jednohodinovou inkubací při 35°C. Reakční směsi obsahovaly 0, 4, 40, 400, 4 000, 40 000, 400 000 nebo 4 000 000 nM imazethapyru nebo 0, 0, 9, 9, 90, 900, 9 000 nebo 90 000 nM chlorsulfuronu. Reakce se zastavila přidáním 50 μΐ 6N H₂SO₄ a patnáctiminutovou inkubací při 60°C. Tento způsob, jak popsal Westerfield (J. Biol. Chem. 16:495-502 (1945)), rovněž dekarboxyluje ALS enzymový produkt acetolaktát za vzniku acetoinu. Obarvený acetoinový komplex se připravil přidáním 1 ml 2,5% hmotn. α-naftolu a 0,25% hmotn. kreatinu ve 2,5N NaOH a patnáctiminutovou inkubací při 60°C.

Koupený acetoin se použil jako standard pro kolorimetrickou reakci. Koncentrace acetoinu se určily na základě měření absorpce reakčního roztoku při 530 nm. Experimenty pro každý herbicid se opakovaly třikrát. Koncentrace proteinu v extraktech se určila Bratfordovou metodou (Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)) za použití albuminu bovinního séra pro sestavení standardní křivky.

Experimenty se prováděly dvakrát a ošetření se opakovala třikrát. Obr. 4 znázorňuje odezvu ALS extraktů z homozygotu Sir-13 a citlivé variety Rel-1. Sir-13 vykazuje stopadesátinásobnou rezistenci proti imazethapyru při dané hladině enzymu (jak ukázal poměr hodnot I₅₀ pro rezistentní

01-48-99 Če • · · · » · • · · · · · · · · · · · • ··· · · · ······ • · · · · · · ······· · · ··· ·· · · a citlivé linie). Obrázek 3 ukazuje čtyřicetičtyřnásobnou rezistenci pro výše diskutovanou celou rostlinu.

6. Počet ALS genových kopií

Analýza Southernova přenosu se prováděla s cílem určit počet ALS genových kopií, přítomných v citlivé varietě cukrové řepy. Genomová DNA se izolovala z citlivých rostlin F₃-generace, vypěstovaných z původního mutantu Sir-13, a analyzovala se za použití běžně praktikovaných technik (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley And Sons, New York (1991)). Podobným způsobem se analyzovala genomová DNA, získaná z komerční variety cukrové řepy. V obou liniích cukrové řepy byla detekována jediná kopie ALS genu. Tato skutečnost by naznačovala, že by veškerá ALS enzymová aktivita homozygotně mutantního typu cukrové řepy sestávala z rezistentní enzymové formy.

7. Mutace ALS genu

Ke stanovení molekulové báze pro ALS enzymovou rezistenci se použily standardní techniky, které se používají pro sekvencování dvou oblastí ALS genu, ve kterých se vyskytovaly dříve zveřejněné mutace způsobující herbicidní rezistenci (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, New York (1991) ) . ALS gen cukrové řepy byl již sekvencován (patent US 5,378,824) a rovněž byly navrženy primery polymerázové řetězové reakce (PCR) pro amplifikaci těchto dvou oblastí genu, které jsou v již uveřejněných případech zodpovědné za herbicidní rezistenci rostlin. Porovnání sekvenčních dat, získaných z rezistentní (Sir-13) a citlivé (Rel-1) cukrové řepy, naznačilo jedinou nukleotidovou změnu z guanidinu na adenin v poloze 337 v nukleotidové sekvenci, která způsobuje

01-48-99 Če • · · · • · • · · · • · · nahrazení alaninu threoninem v poloze 113 v ALS aminokyselinové sekvenci cukrové řepy. Toto místo, jak bylo zjištěno dříve, se podílí rovněž na imidazolinonové rezistenci u řepeně (Bernasconi a kol., J. Biol. Chem. 270:17381-17385 (1995)) a sulfonylmočovinové rezistenci u kvasinek (patent US 5,378,824). Žádné další podstatné změny v těchto dvou oblastech analyzovaného ALS genu oproti standardnímu typu nukleové sekvence nebyly zjištěny.

Nakonec je třeba zmínit, že výše uvedené příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Rostlinný materiál cukrové řepy, vyznačený tím, že sestává z buněk mutovaných acetolaktátsyntázovým genem kódujícím syntézu, v níž jsou modifikovány nukleotidy v poloze 337, kde je guanin nahrazen adeninem, přičemž mutované buňky mají rezistenci proti imidazolinonovému herbicidu a tato rezistence se přenáší konvenčním křížením rostlin vyprodukovaných z buněk a tyto buňky jsou regenerovatelné na rostlinu.
2. Rostlinný materiál cukrové řepy podle nároku 1, vyznačený tím, že se odvodí z citlivých buněk rodičovské rostliny cukrové řepy, označených jako REL-1 a uložených pod označením ATCC 97885, které nemají žádnou rezistenci proti herbicidům, kultivací citlivých buněk v kultivačním médiu s uvedeným herbicidem za účelem výběru mutovaných buněk.
3. Rostlinný materiál cukrové řepy podle nároku 1, vyznačený tím, že je uložen ve formě semene pod označením ATCC 97534 (SIR-13).
4. Rostlinný materiál cukrové řepy podle nároku 1, vyznačený tím, že má formu semene nebo propagačního materiálu.

01-48-99 Če
5. Způsob produkce herbicidní rezistence v rostlině cukrové řepy, vyznačený tím, že zahrnuje:

(a) vystavení prvních buněk cukrové řepy působení imidazolinonového herbicidu, na který jsou první buňky citlivé, v kultivačním médiu; a (b) výběr druhých buněk, které mají herbicidní rezistenci, s mutovaným acetolaktátsyntázovým genem kódujícím syntézu, ve kterém jsou nukleotidy v poloze 337 modifikovány z guaninu na adenin, přičemž tuto rezistenci lze přenášet křížením rostliny obsahující druhé buňky.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že druhé buňky jsou odvozené z prvních buněk rostliny cukrové řepy, označených jako REL-1 a uložených pod označením ATCC 97885.
7. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že druhé buňky jsou uloženy ve formě semene pod označením ATCC 97534 (Sir-13).
8. Způsob udílení herbicidní rezistence rostlině cukrové řepy, vyznačený tím, že zahrnuje:

(a) vystavení prvních buněk cukrové řepy působení imidazolinonového herbicidu, na který jsou první buňky citlivé, v kultivačním médiu;

(b) výběr druhých buněk, které mají herbicidní rezistenci;

01-48-99 Če .··.:*·· ί*·’ ···· · · · · · · ·· · • · · · · ·· ······ • · · · · · · ···· ··· ·· ··· ·· ·· (c) růst první rostliny z druhých buněk, přičemž tato rostlina má herbicidní rezistenci a mutovaný acetolaktátsyntázový gen kódující syntázu, ve kterém jsou nukleotidy v poloze 337 modifikovány z guaninu na adenin; a (d) křížení prvních rostlin s druhými rostlinami za vzniku hybridních rostlin, které mají herbicidní rezistenci.
9. Způsob udílení herbicidní rezistence dalším druhům řepy, vyznačený tím, že zahrnuje:

(a) vystavení prvních buněk cukrové řepy působení imidazolinonového herbicidu, na který jsou první buňky citlivé, v kultivačním médiu;

(b) výběr druhých buněk, které mají herbicidní rezistenci;

(c) růst první rostliny z druhých buněk, přičemž tato rostlina má herbicidní rezistenci a mutovaný acetolaktátsyntázový gen kódující syntázu, ve kterém jsou nukleotidy v poloze 337 modifikovány z guaninu na adenin; a (d) křížení prvních rostlin s druhými rostlinami za vzniku hybridních rostlin, které mají herbicidní rezistenci.
10. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že se první buňky v kroku (a) odvodí z cukrové řepy označené jako REL-1 a uložené pod označením ATCC 97885.

01-48-99 Če
11. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že druhé buňky jsou uloženy ve formě semene pod označením ATCC 97534 (SIR-13).
12. Způsob kontroly plevele rostoucího společně s rostlinami cukrové řepy, vyznačený tím, že zahrnuj e:

(a) vypěstování semen polní cukrové řepy, které obsahují buňky s mutovaným acetolaktátsyntázovým genem kódujícím syntázu, ve kterém jsou nukleotidy v poloze 337 modifikovány z guaninu na adenin, přičemž mutované buňky mají rezistenci proti imidazolinonovému herbicidu a tato rezistence se přenáší konvenčním křížením rostlin vyprodukovaných z buněk určených pro produkci rostliny cukrové řepy; a (b) aplikaci imidazolinonového herbicidu na rostlinu na poli za účelem kontroly plevelů.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačený tím, že se tato rostlina odvodí z citlivých buněk rodičovské rostliny cukrové řepy, označených jako REL-1 a uložených pod označením ATCC 97885, které nemají žádnou rezistenci proti herbicidům, kultivací citlivých buněk v kultivačním médiu s uvedeným herbicidem za účelem výběru mutovaných buněk.
14. Způsob podle nároku 12, vyznačený tím, že rostlina je odvozena ze semene uloženého pod označením ATCC 97534 (SIR-13).