CZ165698A3 - Enzym způsobující větvení bramborového škrobu - Google Patents

Description

Enzym způsobující větvení bramborového škrobu ffitarob-Brancbífig—Eftgymo 1I-)-

Oblast techniky Předkládaný vynález se vztahuje k novému enzymu brambor způsobujícímu větvení škrobu. Konkrétně se předkládaný vynález vztahuje k aminokyselinové sekvenci druhého enzymu způsobujícího větvení bramborového škrobu (SBE II z starch branching enzyme), dále s touto sekvencí souvisejícímu fragmentu a korespondujícím DNA. Dále se vynález vztahuje k vektorům skládajících se z takových sekvencí DNA, které jsou použitelné k produkci transgenních brambor a k použití těchto brambor k produkci škrobu.

Dosavadní stav techniky Škrob je složitá směs rozličných molekulových forem, odlišujících se stupněm polymerizace a větvení glukosových řetězců. Škrob se skládá z amylózy a amylopektinu, přičemž amylóza je složená z v podstatě lineárního a-1,4-glukanu a amylopektin je složený z a-1,4-glukanů spojených vzájemně přes a-1,6-můstky, takže vzniká rozvětvený polyglukan. Znamená to , že škrob není jednotný hrubý materiál. Škrob je syntetizován v nejméně třech enzymatických reakcích, ve kterých jsou zahrnuty ADPglukozofosforyláza (EC 2.7.7.27), syntetáza škrobu (EC 2.4.1.21) a enzym větvící škrob (větvící faktor) (EC 2.4.1.18). Předpokládá se, že enzym větvící škrob (SBE, také nazývaný Q-enzym či větvící faktor) má dvě různé enzymatické aktivity. Katalyzuje jednak hydrolýzu a-1,4-glykosidických vazeb a jednak vznik 1,6-glykosidických vazeb vznikajících během syntézy větvených komponent škrobu, například amylopektinu. 1 ·· ·· « · · ♦ • · · · ··· ·♦· • · ·» ·♦ • ·· ·· · ·« · · · · ·♦ • · · · · · • ··· · · · · • · · · · ··· ·· ·· ···

Rostlinný škrob je hodnotný zdroj obnovitelné suroviny, používané například v chemickém průmyslu (Visser a Jacobsen, 1993). Kvalita škrobu musí splňovat nároky průmyslových procesů, v kterých je uniformita struktury důležitým kritériem. Pro průmyslové aplikace jsou potřeba rostliny obsahující škrob složený buď jen z amylózy nebo rostliny mající škrob obsahující pouze amylopektin.

Postupy zvyšující poměr amylózy ku amylopektinu ve škrobu byly již navrženy. Například v WO95/04826 jsou popsány sekvence DNA, kódující enzymy snižující větvení tedy se schopností snížit nebo zvýšit stupeň větvení amylopektinu v trangenních rostlinách, například v bramborech. V W092/14827 jsou popsány plazmidy mající sekvence, které po inzerci do genomu rostlin způsobují změny v koncentraci uhlohydrátů a uhlodrátovém složení regenerovaných rostlin. Tyto změny mohou být získány pomocí sekvence větvícího enzymu, která je umístěna na těchto plazmidech. Předpokládá se, že tento větvící enzym zvyšuje poměr amylózy ku amylopektinu v rostlinném škrobu, zvláště v komerčně využívaných rostlinách. W092/14827 popisuje pouze dosud známý škrobový větvící enzym u brambor a není známo ani odborníkům, zdali jsou v procesu syntézy větveného škrobu brambor zahrnuty ještě další enzymy. V Mol Gen Genet (1991) 225: 286-296, Visser et al.,je popsána inhibice exprese genu, pomocí antisence konstruktu, pro granulově vázanou syntetázu škrobu. Inhibice enzymu u škrobu bramborových hlíz byla až 100%, což znamená, že se v těchto případech tvořil bezamylózový škrob. Předcházejíc! způsob nebyl nicméně takto úspěšný v případě inhibice amylopektinu a alternativní metoda inhibice amylopektinu je proto stále vysoce žádoucí (Muller-Róber and KoPmann, 1994, Martin a Smith, 1995). 2 « Μ ·# · Ο ·* •« · ι · · · · * · · * • « « ·» · · · · · • ··· ·· · · · ***··· • · · · * · · ««· ·· Μ ··· ·· *·

Podstata vynálezu Předmětem předkládaného vynálezu je změna stupně větvení amylopektinu a poměru amylopektin/amylóza v bramborovém škrobu. Podle předkládaného vynálezu je tento cíl dosažen objevem nově izolované sekvence DNA, kódující druhý enzym větvení škrobu brambor (SBE II), a pomocí fragmentů odvozených od této sekvence, které po inzerci do genomu rostlin způsobují změny ve stupni a poměru větvení škrobu v regenerovaných rostlinách. V předkládaném vynálezu je též zahrnuta aminokyselinová sekvence SBE II a fragmentů od ní odvozených.

Jsou zahrnuty také varianty výše zmiňované sekvence DNA vyplývající z degenerace genetického kódu.

Nová sekvence DNA kódující SBE II, obsahující 3074 nukleotidů a také korespondující aminokyselinová sekvence obsahující 878 aminokyselin je ukázána v SEQ ID No. 1. Jeden fragment o délce 1393 nukleotidů výše uvedené sekvence DNA, korespondující s nukleotidy 1007 až 2399 DNA sekvence v SEQ ID No.l. a také korespondující aminokyselinová sekvence obsahující 464 aminokyselin jsou ukázány v SEQ ID No.2. Dále jsou poskytovány vektory obsahující výše zmíněnou sekvenci izolované DNA a regulační části DNA aktivní v bramborách. Sekvence DNA může být vložena ve vektorech v orientaci „sence" nebo „antisence,, (obrácené) ve vztahu k promotoru, který následuje bezprostředně před touto sekvencí DNA.

Poskytnut je také postup vedoucí k produkci transgenních brambor se sníženým stupněm větvení škrobového amylopektinu. Tento postup obsahuje následující kroky: a) přenos a vložení vektoru dle objevu do genomu buněk brambory a za b) regeneraci intaktní, celé rostliny z transformovaných buněk.

Konečně vynález poskytuje použití výše zmíněných transgenních brambor pro produkci škrobu. 3 * · v · * · v · • *· «· · • · • »· «· t« · • · · ·· ♦ · · · »·· · · · · %

• · · · ««· ··« V následující části je vynález popsán detailněji. V této části je popsána také experimentální část a doprovodné obrázky. Přehled obrázků na výkresech

Obr.l ukazuje SDS polyakrylamidovou elektroforézu proteinů extrahovaných ze škrobu normálních brambor (linie A) a trangenních brambor (linie B). Chybějící proteinové skvrny jsou označeny šipkami. Linie M jsou markéry molekulových hmotností (kDa).

Obr.2 ukazuje 4 peptidové sekvence odvozené z naštěpených proteinů škrobu bramborových hlíz. Příklady provedení vynálezu

Izolace škrobu z bramborových hlíz.

Rostliny brambor (Solanum tuberosum) byly pěstovány na poli. Oloupané hlízy kultivaru Early Puritán nebo transgenní linie brambor prakticky postrádající syntetázu škrobu I vázanou na granule (SvalOf Weibull AB, International application number PCT/SE91/00892) byly homogenizovány při 4°C. Do frakce zbavené hrubých částic (juice fraction), obsahující velkou část škrobu, byly ihned přidány: Tris - HC1 pufr, pH 7,5 tak, aby jeho výsledná koncentrace byla 50 mM, Na4P207 (Na-dithionite) tak, aby jeho výsledná koncentrace byla 30 mM a EDTA tak, aby výsledná koncentrace byla 10 mM. Škrobové granule sedimentovaly během 30 minut, poté byly 4x promyty desetinásobným množstvím promývacího pufru (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA). Škrob, který mezi každým promytím sedimentoval 30 minut při 4°C byl nakonec třikrát promyt třemi objemy acetonu, usušen přes noc volně na vzduchu a skladován při -20°C. 4 • e • · ·· ··

··· ··· · ♦

« • · · · • · ♦ ♦ • ·

Extrakce proteinů bramborového škrobu

Skladovaný škrob (20g) byl kontinuálně smíchán s 200 ml extrakčního pufru (50 mM Tris-HCl* pH 7,5, 2% (hm./obj.) sodiumdodecylsulfát (SDS), 5 mM EDTA) postupným přidáváním pipetou při 85°C tak dlouho, dokud škrob nezželatinoval.

Vzorky byly poté na jednu hodinu zmraženy při -70°C. Po rozmražení při 50°C byly vzorky centrifugovány 20 minut při 12000 x g a 10°C. Supernatant byl shromažďován a znovu centrifugován 15 minut při 3000 x g. Výsledný supernatant byl zfiltrován přes filtry 0,45 pm a k němu byly následně přidány 2,25 objemy ledového acetonu. Po 30 minutách inkubace při 4°C byla sraženina proteinů oddělena centrifugaci (3000 x g po 30 minut při 4°C) a rozpuštěna v 50mM Tris-HCl, pH 7,5. Část každé preparace byla analyzována pomocí SDS polyakrylamidové elektroforézy podle Laemmliho (1970)(Obr.l). Proteiny ve zbylé části preparace byly zkoncentrovány vysrážením trichloroctovou kyselinou (10¾) a poté rozděleny na 8% SDS polyakrylamidovém gelu dle Laemmliho (1970). Proteiny v gelu byly obarveny Commassie Brilliant Blue R-250 (0.2% v roztoku 20% metanolu, 0,5% octové kyseliny a 79.5% H20) . Štěpení proteinů v gelu a sekvenování peptidů

Obarvené proužky proteinů označené šipkami (Obr.l), korespondující s molekulovou hmotností okolo 100 kDa, byly vyříznuty a dvakrát promyty v 0,2 M roztoku NH4HC03 v 50% acetonitrilu za stálého míchání při 35°C. Doba každého promývání byla 20 minut. Po každém promytí byl roztok odstraněn a kousky gelu byly vysušeny odpařením v digestoři. Dobře vysušené kousky gelu byly poté každý zvlášť položeny na parafilm a k nim byly přidány 2 μΐ roztoku 0,2 M NH4C03, 0,02% Tween-20. Poté byly na kousky gelu naneseny 2 μΐ (25 μg) modifikovaného trypsinu (Promega, Madison, WI, USA). Po jejich vsáknutí byly nanášeny 5 μΐ objemy 0,2 M NH4C03 tak dlouho, 5 dokud gely nenabyly svých původních velikostí. Kousky gelů byly dále rozděleny na tři části a přeneseny do ependorfek. Do každé bylo přidáno 200 μΐ 0,2 M NH4C03. Proteiny obsažené v kouscích gelu se poté rozkládaly přes noc při 37°C (Rosenfeld et al. 1992). Po úplném rozkladu byla přidána trifluoroctová kyselina tak, aby výsledná koncentrace byla 1% . Supernatant byl odebrán a uschován. Kousky gelu byly dále extrahovány dvakrát 200 μΐ směsi obsahující 60% acetonitril, 0,1% trifluoroctovou kyselinu a 0,02% Tween - 20. Tyto supernatanty byly spojeny s ostatními supernatanty a jejich objem byl redukován na 50μ1 odpařením. Extrahované peptidy byly rozděleny na chromatografickém systému SMART (Pharmacia, Uppsala, Sweden) s kolonou μΡΡΟ C2/C18 SC2.1/10. Peptidy byly eluovány 0-60% gradientem acetonitrilu v 0,1% trifluoroctové kyselině. Separace trvala 60 min při průtoku 100 μΐ/min. Peptidy byly sekvenovány na sekvenátoru Applied Biosystems 470A s plynou fází a s on-line PTH aminoanalyzátorem (120A) nebo na modelu 476A dle návodu výrobce (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Čtyři ze sekvenovaných peptidů daly jednoduše interpretovatelné sekvence (Obr.2). Prohledání databází ukázalo, že tyto čtyři peptidy vykazují podobnost se škrobovými větvícími enzymy. Zajímavé bylo zjištění, že tyto peptidy byly více příbuzné škrobovému větvícímu enzymu II z jiných rostlinných druhů než škrobovému větvícímu enzymu I z brambor.

Konstrukce oligonukleotidů kódujících peptidy 1 a 2

Degenerované oligonukleotidy kódující peptid 1 a 2 byly syntetizovány jako primery (v obou směrech):

Oligonukleotid 1: 5'- gtaaaacgacggccagt - TTYGGNGTNTGGGARATHTT - 3' (residua 2 až 8 peptidu 1) 6

Oligonukleotid 2: 5'- aattaaccctcactaaaggg -CKRTCRAAYTCYTGIARNCC - 3' (residua 2 až 8 peptidu 2, obrácený řetězec), kde H je A, C nebo T, I je inosin, K je G nebo T. N je A,C,G nebo T, R je A nebo G, Y je C nebo T. Báze označené malými písmeny byly přidány jako připojovací (tag) sekvence.

Purifikace mRNA z bramborových hlíz , syntéza cDNA a PCR amplifikace cDNA fragmentů korespondujících se škrobovým větvícím enzymem brambor II pomocí PCR.

Celková RNA ze zralých bramborových hlíz (S. tuberosum cv. Amanda) byla izolována podle Logemanna et al. (1987).

První řetězec cDNA byl syntetizován s použitím 2 μg celkové RNA a 60 pmolů oligo-dT30 jako primer pro kódující řetězec. Primer byl připojen na polyA mRNA při 60°C po dobu 5 minut. Prodloužení cDNA bylo provedeno pomocí systému Riboclone cDNA Synthesis Systém M-MLV (H-) (Promega) dle technického manuálu výrobce. cDNA kódující nový škrobový větvící enzym II (dle vynálezu) byl amplifikován na přístroji Perkin-Elmer GeneAmp 9600 PCR thermocycler (Perkin-Elmer Cetus Instruments, CT, USA) s použitím dvou degenerovaných priraerů odvozených od peptidů 1 a 2 (viz výše) za následujících podmínek: 1 mM dNTP, 1 μΜ primery a příslušné množství cDNA popsané výše. Celkový objem reakční směsi byl 20 μΐ a obsahoval 1 x pufr AmpliTaq a 0,8 U AmpliTaq (Perkin-Elmer Cetus). Podmínky v cykleru byly následující: 96°C po dobu jedné minuty, 80°C ve chvíli, kdy byl enzym přidán do reakční směsi (tím byla spuštěna reakce). Při této teplotě byla reakce udržována po dobu cca 15 minut. Následoval nezamyšlený pokles teploty na 25°C, pět cyklů při 94°C po dobu 20 sekund, 1 min při 45°C, jednominutový vzrůst na 72°C, dvě minuty při 72°C, 30 cyklů: 5 sekund při 94°C, 20 sekund při 45°C a 2 min+2sek. při 72°C. Teplota 72°C byla 7 t ·· • t • • · • · M « · ♦ * • é é · • · • « · • 1 • • · • · • ··· · • * • • · · · • · * • · • • • • • ··· · · • · • * • m nakonec udržována po následujících 10 minut před ochlazením na 4°C.

Vzorek z této reakce (0,1 μΐ) byl reamplifikován za následujících podmínek: 96°C po dobu 1 min., 80°C ve chvíli, kdy byl enzym přidán do reakční směsi (tím byla spuštěna reakce), při této teplotě byla reakce udržována po dobu cca 5 minut. Následovalo pět cyklů: 20 sekund při 94°C, 1 minuta při 45°C, 2 minuty při 72°C a 25 cyklů: 5 sekund při 94°C. 30 sekund při 45°C, 2 min. + 2 sek. při 72°C. Teplota 72°C byla nakonec udržována po následujících 10 minut před ochlazením na 4°C. Po dokončení PCR amplifikace byla reakce nanesena na 1,5% agarozový gel Seakem (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA). Po elektroforéze a obarvení gelu etidiumbromidem byl nejsilnější proužek o velikosti 1500 bp vyříznut a fragmenty byly eluovány třepáním ve vodě (200 μΐ) po dobu jedné hodiny. Tento fragment byl po reamplifikaci s použitím primerů korespondujících s tag sekvencemi (v oliginukleotidech 1 a 2) a purifikaci pomocí elektroforézy na agarozovém gelu tak, jak byla popsána výše a následné extrakce z gelu s použitím extrakčního kitu Qiaex (DIAGEN GmbH, Hilden, Germany) dle instrukcí výrobce, použit jako templát pro sekvenování. Sekvenování bylo prováděno s použitím kitů DyeDeoxy Terminátor Cycle Sequences kit (Perkin-Elmer Cetus Instruments) a s použitím tag sekvencí a interních primerů. Sekvenování bylo analyzováno na přístroji Applied Biosystem 373A DNA sequencer podle návodu výrobce. Sekvence byla poté sestavena a obsahovala 1393 bp. K dokončení stanovení sekvence škrobového větvícího enzymu II, byly 5' a 3' konce úplné DNA amplifikovány ze stejné celkové RNA jako v předchozím případě s použitím techniky "rapid amplification of cDNA ends" (RACE) při které byly použity specifické primery odvozené ze sekvence dlouhé 1393 bp. V případě amplifikace 3'- konce byl použit primer T29G proti polyA konci a v případě 5' konce byl použit kit 5' /3' RACE kit od firmy Boehringer Mannheim (Cat. No. 1734792). 8 § ·* ♦ ·» · ♦ · · » «· • · · · · · · · « ·«· «# · ···· • ··· ψ · · · · ··· ··· • · · * · · · ··♦ ·« *· ··* «· ··

Fragmenty z těchto amplifikací byly opět stejným způsobem sekvenovány s použitím interních a koncových primerů. Sekvence z těchto dvou konců byly přidány Jc 1393 párům bází tak, že nám dala složenou celou délku sekvence cDNA. Z této sekvence byly odvozené primery tak, aby bylo možné amplifikovat celou kódující část v jednom kuse. Částečné osekvenování amplifikované kódující cDNA potvrdilo přítomnost cDNA korespondující se složenou sekvencí. Celková délka cDNA je 3074 bp a translaovaná sekvence se skládala z 878 aminokyselin. Protein v konečné formě obsahuje 830 aminokyselin.

Porovnání takto zjištěné sekvence s údaji v databankách EMBL a GenBank ukázalo 68% identitu se škrobovým větvícím enzymem I z brambor a asi 80% identitu se škrobovým větvícím enzymem II z jiných rostlinných druhů. Vynálezci proto pojmenovali enzym kódovaný novou sekvencí větvícího enzymu "škrobový větvící enzym brambor II"(potato starch branching enzyme II).

Transformace rostlin brambor

Izolovaná úplná cDNA škrobového větvícího enzymu brambor II a další funkčně aktivní fragmenty v rozmezí 50 -3074 párů bází byly klonovány v obrácené orientaci za promotory aktivními v bramborových hlízách. Termínem „funkčně aktivní" jsou označovány fragmenty, které ovlivní poměr amylózy ku amylopektinu v bramborovém škrobu. Aminokyselinová sekvence a sekvence DNA SBE II a dále jeden fragment DNA a jemu odpovídající aminokyselinová sekvence, (které jsou předmětem vynálezu) jsou ukázány v SEQ ID No.l a 2.

Jako promotory byly vybrány například: papatin promotor, promotor genu kódujícího vázanou škrobsyntázu I nebo promotory izolované z genů kódujících větvící enzym brambor I a II.

Konstrukty byly klonovány známými technikami, buď pomocí Ti-plazmidu, vektoru vhodného pro transformaci brambor 9 v ·* ·Λ · ·· ·· ··· · · ·*· · « • · · ·· * ···· • ··· φ · · · · ·Μ ··· • # · · · · f *·· ♦· ·· ··· «9 «9 zprostředkovanou Agrobacterium trumefaciens, nebo pomocí vektoru vhodného k použití balistickými technikami či elektroporací. „Sence" i „antisence" konstrukty obsahovaly všechny potřebné regulační elementy.

Transgenní rostliny brambor poté transkribují specificky v hlízách konstrukt - inverzní škrobový větvící enzym II - což vede k antisence inhibici enzymu. Dále ke snížení a změně způsobu větvení amylopektinu a také ke změně poměru amylózy ku amylopektinu, což se poté projeví u jejich bramborového škrobu.

Antisence konstrukt pro škrobový větvící enzym II byl také použit v kombinaci s antisence konstrukty pro škrobový větvící enzym I, pro škrobsyntázu II vázanou na granule, pro rozpustnou bramborovou škrobsyntázu II a III, pro škrobový D-enzym a pro enzym způsobující snížené větvení (debranching enzyme) bramborového škrobu. Tyto konstrukty byly vytvořeny s cílem transformovat brambory a změnit stupeň větvení amylopektinu a poměr amylózy ku amylopektinu. To poskytne novou a hodnotnou surovinu pro procesy v průmyslu škrobu.

Kompletní sekvence cDNA kódující tento enzym je v odlišných konstruktech klonována v „sence" orientaci pod jedním či více promotory výše uvedenými. Tyto konstrukty jsou přeneseny do vhodných transformačních vektorů popsaných výše a tyto jsou poté použity k transformaci brambor. Regenerované transformované brambory produkují nadbytek škrobového větvícího enzymu II v hlízách , což vede k zvýšenému stupni a změně větvení amylopektinu či inhibici transkripce endogenního škrobového větvícího enzymu II působením kosuprese. Výsledkem je poté snížení větvení amylopektinu. 10 • »

Literatura

Muller-Rčber, B., Kosmann, J., (1*994) Approaches to influence starch quantity and starch quality in transgenic plantss.

Plant Cell Environm. 17, 601-613

Martin, C., Smith, A. (1995) Starch Biosynnthesis. Plant Cell 7, 971-985

Laemmli, U.K. (1979) Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nátuře 227, 680-685.

Logemann, J., Schell , J. and Willmitzer , L. (1987). Improved method for the isolation of RNA frorn planttissues. Anal. Biochem. 163, 16-20

Rosenfeld, J., Capdeville, J, Guillemont, J.C. Ferrara, P. (1992). In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one - or two - dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem 203, 173-179.

Visser, R.G.F., Jacobsen, E. (1993) Towards modifying plants for altered starch content and composition. TibTech 11, 63-68 11 * · · · • · » • · I • · · · · · • · ·» · » • «* · · φ Μ * I · « Μ • · · · t · • · · · # · · · • · · · » • · ♦ · · · · · · · SEQ ID No.1

Sekvenovaná molekula: cDNA

Jméno: bell (branching enzyme II - větvící enzym) ze Solanum tuberosum (brambor) Délka sekvence: 3074 bp AAACCTCCTC CACTCAGTCT TTGTTTCTCT CTCTCTTCAC GCTTCTCTTG GCGCCTTGAA 60 CTCAGCAATT TGACACTCAG TTAGTTACAC TNCCATCACT TATCAGAXCT CJMOTTC 120 TCTTAATTCC AACCAAGGAA TGAATAAAAA GATAGATTTG TAAAAACCCT AAGGAGAGAA 180 G?AGA?AG ATG GTG TAT ACA CTC TCT GGA GTT CGT TTT CCT ACX CTI CCA 230

Met Val Tyr Thr· Leu Ser Gly Val Arg Phe Pro Thr Val Pro -45 -40 -35 TCA GTG TAC AAA TCT AAT GGA TTC AGC AGT AAT GGT GAX CGG AGG AAT 278

Ser Val Tyr Lys Ser Asn Gly Phe Ser Ser Asn Gly Asp Arg Arg Asn -30 -25 -20 GCT AAT NTT TCT GIA TTC TTG AAA AAG CAC TCT CTT TCA CGG AAG ATC 326

Ala Asn Xaa Ser Val Phe Leu Lys lys His Ser Leu Ser Arg Lys Ile -15 -10 -5 TTG GCT GAA AAG TCT TCT TAC AAT TCC GAA TCC CGA CCT TCT ACA GTT 374

Leu Ala Glu Lys Ser Ser Tyr Asn Ser Glu Ser Arg Pro Ser Thr Val 15 10 GCA GCA TCG GGG AAA GTC CTT GTG CCT GGA ACC CAG AGT GAX AGC TCC 422

Ala Ala Ser Gly lys Val Leu Val Pro Gly Thr Gin Ser Asp Ser Ser 15 20 25 30 TCA TCC TCA ACA GAC CAA ΪΤΤ GAG TTC ACT GAG ACA TCT CCA GAA AAT 470

Ser Ser Ser Thr Asp Gin Phe Glu Phe Thr Glu Thr Ser Pro Glu Asn 35 40 45 TCC CCA GCA TCA ACT GAT GTA GAT AGT TCA ACA ATG GAA CAC GCT AGC 518

Ser Pro Ala Ser Thr Asp Val Asp Ser Ser Thr Met Glu Mls Ala ser 50 55 60 CAG ATT AAA ACT GAG AAC GAT GAC GTT GAG CCG TCA AGT GAT CTT ACA 566

Gin Ile Lys Thr Glu Asn Asp Asp Val Glu Pro Ser Ser Asp Leu Thr 65 70 75 GGA AGT GTT GAA GAG CTG GAT TTT GCT TCA TCA CTA CAA CTA CAA GAA 614

Gly Ser Val Glu Glu Leu Asp Phe Ala Ser Ser Leu Gin Leu Gin Glu 80 85 '90 GGT GGT AAA CTG GAG GAG TCT AAA ACA TTA AAT ACT TCT GAA GAG ACA 662

Gly Gly Lys Leu Glu Glu Ser Lys Thr Leu Asn Thr Ser Glu Glu Thr 95 100 105 110 ATT ATT GAT GAA TCT GAT AGG ATC AGA GAG AGG GGC ATC CCT CCA CCT 710

Ile Ile Asp Glu Ser Asp Arg Ile Arg Glu Arg Gly Ile Pro Pro Pro 115 120 125 GGA CIT GGT CAG AAG ATT TAT GAA ATA GAC CCC CTT TTG ACA AAC TAT 758

Gly Leu Gly Gin Lys Ile Tyr Glu Ile Asp Pro Leu Leu Thr Asn Tyr 130 135 140 CGT CAA CAC CTT GAT TAC AGG TAT TCA CAG TAC AAG AAA CTG AGG GAG 806

Arg Gin His Leu Asp Tyr Arg Tyr Ser Gin Tyr Lys Lya Leu Arg Glu 145 150 155 12 t ·· ·· 9 «· 19 ·*+» * 9 ·* 9 9 9 « 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • ··· # · · 9 9 999 999 • · · * · * · 999 «· 99 999 «· 99 GCA ATI GAC AAG TAT GAG GGT GCT TTG GAA GCT TTT TCT CCT GGT TAX Ala Ile Asp Lys Tyr Glu Gly Gly Leu Glu Ala Phe Ser Arg Gly Tyr ieo 165 4 no 854 Q& AAA ATG GCT TIC ACT CCT AGT GCT ACA GCT ATC ACT TAC CGT GAG Glu Lys Mat Gly Ehe Thr Arg Ser Ala Thr Gly Ile Thr Tyr Arg Glu 175 180 185 190 902 TGG GCT CCT GCT GCC CAG TCA GCI GCC CIC ATT GGA GAT TXCAAC AAT Trp Ala Pro Gly Ala Gin Ser Ala Ala Leu Ile Gly Asp Phe Asn Asn 195 200 205 950 TGG GAC GCA AAT GCT GAC ATT ATG ACT CG5 AAT GAA TTT GCT GTC TGG Trp Asp Ala Asn Ala Asp Ile Met Thr Arg Asn Glu Pha Gly Val Trp 210 215 220 998 gag απ rrr ctg cca aat aai gig gai ggt tct cct cca att cct cai io46

Glu Ila Phe Leu Sto Asn Asn Val Aap Gly Ser Pro Ala Ile Pro His 225 230 235 GGG TCC AGA GTG AAG ATA CCT ATG GAC ACT CCA TCA GCT 6Π AAG GAT 1094

Gly Ser Arg Val Lys Ile Arg Met As? Thr Pro Ser Gly Val Lys Asp 240 245 250 TCC ATT CCT GCT TGG ATC AAC TAC TCT TTA CAG CTT CCT GAT GAA ATT Ser Ile Pro Ala Trp Ile Asn Tyr Ser Leu Gin Leu Pro Asp Glu Ile 255 260 255 270 1142 CCA ΤΑΓ AAT GGA ΑΙΑ TAT TAT GAT CCA CCC GAA GAG GAG AGG TAX ATC Prc Tyr Asn Gly Ile Tyr Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Glu Arg Tyr Ile 275 2S0 285 1190 TTC CAA CAC CCA CGG CCA AAG AAA CCA AAG TCG CTG AGA ATA TAT GAA Phe Gin His Pro Arg Pro Lys lys Pro Lya Ser Leu Arg 11« Tyr Glu 290 295 300 1236 TCT CAI ATT GGA ATG AGT AGÍ CCG GAG CCT AAA ATT AAC TCA TAC CTG Ser His Ile Gly Met Ser Ser Pro Glu Pro Lys Ile Asn Ser Tyr Val 305 310 315 1286 AAT TTT AGA GAT GAA GIT CTT CCT CCC ATA AAA AAG CTT GQ3 TAC AAT Asn Phe Arg Asp Glu Val Leu Pro Arg Ile Lys Lys Leu Gly Tyr Asn 320 325 330 1334 .. GCG CTG CAA ATT AIG GCT ATT CAA GAG CAI TCT TAT TAT GCI AGT TTT Ala Val Gin Ile Mat Ala Ile Gin Glu His Ser Tyr Tyr Ala Ser Phe 335 340 345 350 1382 GCT TAT CAT CTC ACA AAT TTT TTH GCA CCA AGC AGC CCT TXT GGA ACH Gly Tyr His Val Thr Asn Phe Xaa Ala Pro Ser Ser Arg Pha Gly Thr 355 360 3 65 143C CCC GAC GAC CTT AAG TCT TTG ATT GAT AAA GCT CAT GAG CIA GGA ATT Pro Asp Asp Leu Lys ser Leu Ile Asp Lys Ala His Glu Leu Gly Ile 370 375 380 1478 CTT GTE CTC ATG GAC ATT GTT CAC AGC CAT GCA TCA AAT AAT ACT TTA Vil Val I--su y.í-. Ar? Ile Val Eli S^r Hii Ala Ser Asn Χϊγ. chr Leu 335 250 255 1526 GAT GGA CTG AAC AM TTT GAC GGC ACA GAT ACT TCT TAC TT7 CAC TCT 1574

Asp Gly Leu Asn Mat Ehe Aap Gly Thr Asp Ser Cys Tyr Ehe His Ser 13 • ·· *« ♦ * • · · ♦ ♦ ♦ + *

GGA GCT CGT GGT TAT CAT TGG ATG TGG GAT TCC CGC CTC TTT AAC TAT Gly Ala Arg Gly Tyr His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asa Tyř 415 420 425 430 GGA AAC TGG GAG STA CTT AGG TAT CTT CTC TCA AAT GCG AGA TGG TGG Gly Asa Trp Glu Val Leu Axg Tyr Leu Leu Ser Asa Ala Arg Trp Trp 435 440 445 TTG GAT GAG TTC AAA ITT GAT GGA ΤΓΤ AGA TTT GAT GGT GIG ACA TCA Leu Asp Glu Ehe Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser 450 455 460 AXG ATG TAT ACT CAC CAC GGA TTA TCG GIG GGA TTC ACT GGG AAC TAC Met Met Tyr Thr His His Gly Leu Ser Val Gly Ehe Thr Gly Asn Tyr 465 470 475 GAG GAA TAC TIT GGA CTC GCA ACT GAT GTG GAT GCT GET GIG TAT CTG Glu Glu Tyr Phe Gly Leu Ala Thr Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu 480 4 85 480 ATG CTG GTC AAC GAT CTT ATT CAT GGG CTT TTC CCA GAT GCA ATT ACC Mat Leu Val Asa Asp Leu Ha His Gly Leu Phe Pro Asp Ala Tle Thr 485 500 505 510 ATT GGT GAA GAT GTT AGC GGA ATG CCG ACA TTT TNT ATT CCC GTT CAA Ile Gly Glu Asp Val Ser Gly Met Pro Thr Phe Xaa Ile Pro Val Gin 515 520 525 GAT GGG GGT GTT GGC TTT GAC TAT CCG CTG CAT ATG GCA ATT GCT GAT Asp Gly Gly Val Gly Phe Asp Tyr Arg Leu His Met Ala Ile Ala Asp 530 535 540 AAA TGG ATT GAG TTG CTC AAG AAA CGG GAT GAG GAT TGG AGA GTG GGT Lys Trp Ile Glu Leu Leu Lys Lys Asg Asp Glu Asp Trp Arg Val Gly 545 550 553 GAT ATT GIT CAT ACA CTG ACA AAT AGA AGA TGG TCG GAA AAG TGI GTT Asp Ile Val His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Ser Glu Lys Cys Val 560 5 65 570 TCA TAC GCT GAA AGI CAT GAT CAA GCT CIA GTC GGT GAT AAA ACT ATA Ser Tyr Ala Glu Ser His Asp Gin Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile 575 530 555 580 GCA TTC TGG CTG ATG GAC AAG GAT ATG TAT GAT TTT ATG GCT CTG GAT Ala Phe Trp Leu Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Ehe Met Ala Leu Asp 585 600 605 AGA CCS-TCA ACA TCA TTA AIA GAT CGT GGG AXA GCA TTG CAC AAG ATG Arg Pro Ser Thr Ser Leu Ile Asp Arg Gly Ile Ala Leu Bis Lys Met 610 615 620 ATT AGG CTT GTA ACT ATG GGA TTA GGA GGA GAA GGG TAC CTA AAT TTC Ile Arg Leu Val Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asa Phe 625 $30 635 ATG GGA AAT GAA TTC GGC CAC CCT GAG TGG ATT GAT TTC CCT AGG GCT Mat Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Zle Asp Phe Prs Arg Ala 1622 1670 1715 1766 1814 1862 1910 1959 2006 2054 2102 2150 2188 2246 2294 GAA CAA CAC CTC TCT GAT GGC TCA GIA ATT CCC GGA AAC CAA TTC ACT Glu Gin His Leu Ser Asp Gly Ser Val Ile Pro Gly Asn Gin Phe Ser 655 660 , 665 67014 2342 • ♦· ·· ·♦ ♦ · · ft • · · · f • ··· · · · ♦ · « · ··· ♦ « ·· XAT GAT AAA TGC AGA CGG AGA ITT GAC CTG GGA GAT GCA GAA TAX TTA 2390

Tyr Asp lys Cya Arg Axg Arg Phe Asp Leu Gly Asp Ala Glu Tyr Leu 675 630 635 AGA TAC CST GGG 1TG CAA GAA TTT <ΆΟ CGG GCT ATG CAG TAX CTT GAA 2438

Arg Tyr Arg Gly Leu Gin Glu Phe Asp Arg Ala Met Gin Tyr Leu Glu 690 695 700 GAT AAA TAI GAG TTT ATG ACT TCA GAA CAC CAG TTČ AIA TCA CGA AAG 2486

Asp Lys Tyr Glu Ehe Met Thr Ser Glu fíis Gin Phe Ile Ser Arg Lys 705 710 715 GAT GAA GGA GAT AGG ATG ATT GTA TTT GAA AAA GGA AAC CIA GTT TTT 2534

Asp Glu Gly Asp Arg Met Ile Val Ehe Glu Lys Gly Asn Leu Val Phe 720 725 730 GTC TTT AAT TTT CAC TGG ACA AAA AGC TAX TCA GAC TAT CGC ΑΪΑ GGC 2582

Val Phe Asn Phe His Trp Thr Lys Ser Tyr Ser Asp Tyr Arg Ile Gly 735 740 745 750 TGC CTG AAG CCT GGA AAA TAC AAG GTT GCC TTG GAC TCA GAT GAT CCA 2630

Cys Leu Lys Pro Gly Lys Tyr Lys Val Ala Leu Asp Ser Asp Asp Pro 755 760 765 crr TTT GGT GGC Tle GGG AGA ATT GAT CAI AAT GCC GAA TAT TTC ACC 2678

Leu Phe Gly Gly Phe Gly Arg Ile Asp His Asn Ala Glu Tyr Phe Thr 770 775 780 TTT GAA GGA TGG TAT GAT GAT CGT CCT CGT TCA ATT ATG GTG TAT GCA 2721

Phe Glu Gly Trp Tyr Asp Asp Arg Pro Arg Ser Ile Met Val Tyr Ala 785 790 795 CCT AGT AGA ACA GCA GTG GTC TAT GCA CIA GTA GAC AAA GAA GAA GAA 2774

Pro Ser Arg Thr Ala Val Val Tyr Ala Leu Val Asp Lys Glu Glu Glu 800 805 810 GAA GAA GAA GAA GTA GCA GTA GTA GAA GAA GTA GTA GTA GAA GAA GAA 2822

Glu Glu Glu Glu Val Ala Val Val Glu Glu Val Val Val Glu Glu Glu 815 820 825 830 TGA ACGAA CTTGTGATCG CGTTGAAAGA TTTGAAGGCT ACATAGAGCT TCTTGACGTA 2880 TCTGGCAATA TTGCATCAGT CTTGGCGGAA TXTCATGTGA CAAAAGGTTT GCAAXTCXTT 2940 CCACTAITAG TAGTGCAACG ATATACGCAG AGAIGAAGTG CTGCACAAAC ATATGTAAAA 3000 TCGATGAATT TATGTCGAAT GCTGGGACGG GCTTCAGCAG GTTTTGCTTA GTGAGITCTG 3060 TAAATTGTCA TCTC 3074 15 ♦ ·· ·· · ·· ♦· ««·· * · ·· t « · « β · · · * · · · t · • *♦· · « · · * ··· + ·· • · t t · · ♦ «·· ·· ·· f·! «· ·· SEQ ID No.2

Sekvenovaná molekula: cDNA

Jméno: fragment genu bell (branching enzyme II - větvící enzym) ze Solanum tuberosum (brambor) Délka sekvence: 1393 bp T CTG CCA. AAT AAT CTG GAT GGT TCX CCX GCA ATT CCT CAI GGG TCC AGA 49

Leu Pro Asn Asn Val Asp Gly Ser Pro Ala Ile Pro His Gly Ser Arg 1 5 ·' 10 15 CTG AAG ATA CGT ATG GAC ACT CCA TCA GGI GTT AAG GAT TCC ATT CCT 97

Val Lys Ila Axg Met Asp Thr Pro Ser Gly Val Lys Asp Ser Ile Pro 20 25 30 GCT TGG ATC AAC TAC TCT TTA CAG CIT CCT GAT GAA ATT CCA TAT AAT 145

Ala Trp Ile Asn lyr Ser Leu Gin Leu Pro Asp Glu Ile Pro Tyr Asn 35 40 45 GGA ATA TAT TAT GAT CCA CCC GAA GAG GAG AGG TAT ATC TTC CAA CAC 193

Gly Ile Tyr Tyr Aap Pro Pro Glu Glu Glu Arg Tyr Ile Phe Gin His 50 55 60 CCA CGG CCA· AAG AAA CCA AAG TCG CTG AGA ATA TAT GAA TCT CAT ATT 241

Pro Arg Pro Lys Lya Pro Lya Ser Leu Arg Ile Tyr Glu Ser HÍ3 Ile 65 70 75 80 GGA ATG AGT AGT CCG GAG CCT AAA ATT AAC TCA TAC GTG AAT TTT AGA 289

Gly Met Ser ser Pro Glu Pro Lys Ile Asn Ser Tyr Val Asn Pha Arg 65 90 95 GAT GAA GTT CTI CCT CGC ATA AAA AAG CIT GGG TAC AAT GOG GTG CAA 337

Asp Glu Val Leu Pro Arg Ile Lys Lys Leu Gly Tyr Asn Ala Val Gin 100 105 110

ATT ATG GCT ATT CAA GAG CAT TCT TAT TAT GCT AGT TTC GCT TAT CAT 38S

Ile Met Ala Ile Gin Glu His Ser Tyr Tyr Ala Ser Phe Gly Tyr His 115 120 125 GTC ACA AAT TTT TTN GCA CCA AGC AGC CCT TTT GGA ACM CCC GAC GAC 433

Val Thr Asn Phe Xaa Ala Pro Ser Ser Arg Phe Gly Thr Pro Asp Asp 130 135 140 CIT AAG TCT TTG ATT GAT AAA GCT CAT GAG CIA GGA ATT GTC GTT CTC 481

Leu Lys Ser Leu Ile Asp Lys Ala His Glu Leu Gly Ile Val Val Leu 145 150 155 160 ATG GAC ATT GTT CAC AGC CAT GCA TCA AAT AAT ACT TTA GAT GGA CTG 529

Met Asp Xle Val Eis Ser His Ala Ser Asn Asn Thr Leu Asp Gly Leu 165 170 175 AAC ATG TTT GAC GGC ACA GAT AGT TGT TAC TTT CAC TCT GGA GCT CGT 577

Asn Met Phe Asp Gly Thr Asp Ser Cys Tyr Phe His Ser Gly Ala Arg 180 185 190 GGT TAT CAT TGG AXG TGG GAT TCC CGC CTC TTT AAC TAT GGA AAC TGG 625

Gly Tyr His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly Asn Trp 195 200 205 GAG GTA CTT AGG TAT CTX CTC TCA AAT GCG AGA TGG TGG TTG GAT GAG 673

Glu Val Leo Arg Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Arg Trp Trp Leu Asp Glu 210 215 220 16 • • · ·♦ • » • · • « • • · ·· ·· • « · • ♦ • ♦ · • · * ♦ «# • · # • • · t • • « • • ··· • · · • · · ·· • » **· . · • • · rrc AAA TXT GAT GSA TTT AGA TTT GAT GCT GTG ACA TCA ATG ATG TAT 721

Phe Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thx Ser Met Met Tyr 225 ’ 230 235 240 ACT CAC CAC GGA TTA TCO GTG GGA TTC ACT GGG AAC TAC GAG GAA TAC 769

Thx Kia His Gly Leu Ser Val Gly Phe Thr Gly Asn Tyr Glu Glu Tyr 245 250 255 TTT GGA CTC GCA ACT GAT GTG GAT GCT GTT GTG TAT CTG ATG CTG GTC 812

Phe Gly Leu Ala Thr Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met Leu Val 260 265 270 AAC GAT Ctr ATT CAT GGG 'CIT TTC CCA GAT GCA ATT ACC ATT GGI GAA 865

Asn Asp Leu Tle His Gly Leu Phe Pro Asp Ala Ile Thr Ile Gly Glu 275 260 285 GAT GTT AGC GGA ATG CCG ACA TTT TNT ATT CCC GTT CAA GAT GGG GGT 913

Asp Val Ser Gly Met Pro Thr Phe 2<aa Ile Pro Val Gin Asp Gly Gly 290 295 300 GTT GGC TTT GAC TAT CGG CTG CAT ATG GCA ATT GCT GAT AXA TGG ATT 961

Val Gly Phe Asp Tyr Arg Leu His Met Ala Ile Ala Asp Lys Trp Ile 305 310 315 320 GAG TTG CTC AAG AAA CGG GAT GAG GAT TGG AGA GTG GGT .GAT ATT GTT 1019

Glu Leu Leu Lys Lys Arg Asp Glu Asp Trp Arg Val Gly Asp Ile Val 325 330 335 CAT ACA CTG ACA AAT AGA AGA TGG TCG GAA AAG TGT GTT TCA TAC GCT 1057

His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Ser Glu Lys Cya Val Ser Tyr Ala 340 345 350 GAA AGT CAT GAT CAA GCT CIA GTC GCT GAI AAA ACT ATA GCA TTC TGG H05

Glu Ser His Asp Gin Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala Phe Trp 355 * 360 ’ 365 CTG ATG GAC AAG GAT ATG TAT GAT TTT ATG GCT CTG GAT AGA CCT TCA H53

Leu Met Asp Lys Asp Mat Tyr Asp Phe Met Ala Leu Asp Arg Pro Ser 370 375 330 ACA TCA TTA ATA GAT CCT GGG ATA GCA TTG CAC AAG ATG ATT AGG CTT 1201

Thr Ser Leu Ile Asp Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met Ile Arg Leu 385 390 395 400 GIA ACI ATG GGA TTA GGA GGA GAA GGG TAC CTA AAT TTC ATG GGA AAT 1249

Val Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met Gly Asn 405 410 415 GAA TTC GGC CAC CCT GAG TGG ATT GAT TTC CCT AGG GCT GAA CAA CAC 1297

Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Ala Glu Gin His 420 425 430 CTC TCT GAT GGC TCA GCA ATT CCC GGA A&C CAA TTC AGT TAT GAT AAA 1345

Leu Ser Asp Gly Ser Val II a Pro Gly Asn Gin Phe Ser Tyr Asp Lys 435 440 445 TGC ASI CGG AGA TTT GAC CTG GGA GAT GCA GAA TAT TTA AGA TAC CGT 1393

Cya Arg Arg Arg Phe Asp Leu Gly Asp Ala Glu Tyr Leu Arg Tyr Arg 4oG 4oc izZ 17

Claims (18)

1. τ> V • ·# ·· · ·· «· ·· · t ♦ · ·· « » » · • · · ♦ · · ···· • ··· · · t · · «·· ··· • · · · · · » ··· Ψ· #· ··· · + «9 PATENTOVÉ NÁROKY 1. Aminokyselinová sekvence větvícího škrobového enzymu brambor II (SBE II) obsahující aminokyselinovou sekvenci tak, jak je ukázána na SEQ ID No.1.
2. 2. Fragmenty aminokyselinové sekvence větvícího škrobového enzymu brambor II (SBE II), schopné ovlivnit poměr amylózy a amylopektinu v bramborovém škrobu jako též snížení nebo změna větvení amylopektinu.
3. 3. Fragment podle nároku 1, který má aminokyselinovou sekvenci tak, jak je to ukázáno na SEQ ID No.2
4. 4. Izolovaná sekvence DNA kódující větvící škrobový enzym brambor II (SBE II) obsahující nukleotidovou sekvenci ukázanou na SEQ ID No.l a varianty vyplývající z degenerovanosti genetického kódu.
5. 5. Fragmenty izolované sekvence DNA ukázané na SEQ ID No.l a kódující Škrobový větvící enzym brambor II (SBE II), schopné ovlivnit poměr amylózy a amylopektinu v bramborovém škrobu jako též snížení nebo změna větvení amylopektinu.
6. 6. Fragmenty podle nároku 5 obsahující 50-3074 bp nukleotidové sekvence ukázané na SEQ ID No.l a varianty vyplývající z degenerovanosti genetického kódu.
7. 7. Fragmenty podle nároku 5 obsahující nukleotidové sekvence ukázané na SEQ ID No.2
8. 8. Vektor obsahující celou nebo funkčně aktivní část izolované sekvence DNA podle nároku 4-7 a regulační oblasti aktivní v bramborách
9. 9. Vektor podle nároku 8, v kterém je sekvence DNA v obrácené (antisence) orientaci vůči promotoru bezprostředně jí předcházej íčímu.
10. 10. Proces produkce transgenních brambor s buď zvýšeným nebo sníženým stupněm větvení škrobového amylopektinu vyznačující se zahrnutím následujících kroků: a) přenos a vnesení vektoru dle nároku 8 do genomu buněk brambor a b) regenerace intaktních, celých rostlin z transformovaných buněk.
11. 11. Proces produkce transgenních brambor se sníženým stupněm větvení škrobového amylopektinu vyznačující se zahrnutím následujících kroků: a) přenos a vnesení vektoru dle nároku 9 do genomu buněk brambor a b) regenerace intaktních, celých rostlin z transformovaných buněk.
12. 12. Proces podle nároku 11, v kterém vektor obsahuje také antisence konstrukt enzymu způsobujícího větvení bramborového škrobu I (Starch Branching Enzyme I, SBE I)
13. 13. Proces podle nároku 11 nebo 12, v kterém vektor obsahuje také antisence konstrukt granulově vázané syntetázy škrobu brambor.
14. 14. Proces podle jednoho či více nároků 11 - 13, v kterém vektor obsahuje také antisence konstrukt rozpustné syntetázy škrobu II a III brambor.
15. 15. Proces podle jednoho či více nároků 11 - 14, v kterém vektor obsahuje také antisence konstrukt D-enzymu (disproportionating enzym) brambor.
16. 16. Proces podle jednoho či více nároků 11 - 15, v kterém vektor obsahuje také antisence konstrukt odvětvovacího škrobového enzymu brambor.
17. 17. Transgenní brambory získatelné procesem podle jakéhokoliv z nároků 10 - 16.
18. 18. Použití transgenních brambor podle nároku 17 k produkci škrobu.