CZ199995A3 - Dna sequence encoding novel insulin biosynthetic precursors and insulin preparation process - Google Patents

Dna sequence encoding novel insulin biosynthetic precursors and insulin preparation process Download PDF

Info

Publication number
CZ199995A3
CZ199995A3 CZ951999A CZ199995A CZ199995A3 CZ 199995 A3 CZ199995 A3 CZ 199995A3 CZ 951999 A CZ951999 A CZ 951999A CZ 199995 A CZ199995 A CZ 199995A CZ 199995 A3 CZ199995 A3 CZ 199995A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dna sequence
insulin
transformed
site
dna
Prior art date
Application number
CZ951999A
Other languages
English (en)
Inventor
Silvija Mestric
Peter J Punt
Radovan Valinger
Den Hondel Cees A M J J Van
Original Assignee
Pliva Pharm & Chem Works
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pliva Pharm & Chem Works filed Critical Pliva Pharm & Chem Works
Publication of CZ199995A3 publication Critical patent/CZ199995A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Tento vynález se týká DNA sekvencí kódujících nové biosyntetické prekursory insulinu a přípravy insulinu kultivací transformovaných buněk obsahujících takovéto DNA sekvence.
Dosavadní stav techniky
Insulin je hormon, jehož primární rolí je řízení transportu glukosy z krevního oběhu do buněk, kde je metabolizována.
Insulin sestává z dvou řetězců aminokyselin: Řetězce A, obsahujícího 21 aminokyselin a řetězce B, obsahujícího 30 aminokyselin, přičemž tyto řetězce jsou vázány jeden k druhému dvěma disulfidovými můstky. Třetí disulfidový můstek se nalézá v řetězci A.
Primární forma insulinové molekuly je syntetizována jako nascentní polypeptidový řetězec nazývaný preproinsulin, jenž sestává ze signálního peptidu a proinsulinu. Signální peptid směruje nascentní řetězec skrz endoplasmatické retikulum. Proinsulin se tvoří z preproinsulinu v oblasti lumenu endoplasmatického retikula, když polypeptidový řetězec prochází membránou. Proinsulin zahrnuje polypeptidový řetězec obsahující 35 aminokyselin, jenž není přítomný v insulinu. Tento spojovací peptid neboli C-peptid spojuje karboxy- konec řetězce B s aminokoncem řetězce A budoucí molekuly insulinu. Z lumenu endoplasmatického retikula je proinsulin směrován ke Golgiho aparátu, kde začíná proteolysa spojovacího peptidu. Spojovací neboli C-peptid je odštěpen enzymovým systémem podobným systému trypsin / karboxypeptidasa B, jenž působí u sekvence dvou následujících basických aminokyselin, a tvoří se insulin (Steiner et al. , J. Cell Biol. 24, (1984). 121-130).
Význam C-peptidu spočívá v tom, že spojuje řetězce A a B tak, aby se umožnila správná tvorba disulfidových můstků v molekule insulinu (Bell et al., Nátuře 284, (1980) 26-32) nebo v tom, že řídí trypsinu podobný konvertující enzym ke zpracování proinsulinu v místě se dvěma basickými aminokyselinami (Thim et al., PNAS, 83 (1986) 6766-6770).
Produkce biosyntetického lidského insulinu byla zveřejněna hlavně v bakteriích Escherichia coli a Saccharomyces cerevisiae. Pro všechny je společné, že DNA sekvence kóduje buď celý proinsulin, modifikovanou část proinsulinu nebo zvlášt řetězce A a B.
V bakterii E. coli byl insulin prostřednictvím oddělených řetězců A a al., Diabetes Care 4 (1982) 147-154) nebo produkován buď B (Chance et jako proinsulin,
EP 55945.
V kvasinkách S. cerevisiae byl insulin produkován prostřednictvím proinsulinu, avšak s velmi nízkým výtěžkem, EP-A-121 884. Různé modifikace C-peptidu zlepšují výtěžek a správnou tvorbu insulinové molekuly v kvasinkách.
Insulinové prekursory vzorce B-X-A, kde B a A representují řetězce B a A a kde X representuje peptid obsahující od 2 do 35 aminokyselin, jsou popsány v DK-A-5284/87.
Insulinové prekursory vzorce B-X-Y-A, kde B a A representují řetězce B a A a kde X a Y každý representuje lysin nebo arginin jsou zveřejněny v EP-A-347 845.
V EP-A-163 529 jsou popsány insulinové prekursory obsahující peptidový řetězec B(1-29)-A(1-21) spojený s krátkým peptidem majícím 2 až 8 aminokyselin. Modifikace prekursorů des-B(30) insulinu se vzorcem B(1-29)-X1-X2-Y2-Y1~A(1-21) jsou popsány v EP-A-347 845.
V EP-A-249 350 jsou popsány glukoamylasový promotor a signální sekvence pro sekreci bílkovin v plísních jako hostiteli. Jako příklad byl exprimovaný trimer proinsulinu též zařazen do takovéhoto vektoru exprese.
Mnohé polypeptidy pro léčebné nebo diagnostické účele, např. erythropoietin, tPA a faktor VIII, byly N-glykosylovány (Parekh et al., TIBTECH 7 (1989) 117-121). Zde byl též popsán trojnásobně zvýšený výtěžek bovinního chymosinu (glykochymosinu) v plísni A. niger var. awamori dosažený zavedením N-glykosylačního konsensus místa do kódující sekvence. Fúzí prochymosinového a glukoamylasového genu byl dosažen ještě vyšší výtěžek, ale fúzí glykochymosinu ke glukoamylase nebylo dosaženo žádného dalšího zvýšení výtěžku (Berka et al., Biochem. Soc. Trans. 19 (1991) 681-685).
V případě aspartátové proteinasy (reninu), jež je mikrobiálního původu a slouží jako náhražka chymosinu, bylo pozorováno, že hyperglykosylace může snižovat enzymovou aktivitu, když nastává v kritickém místě molekuly (Berka et al., Biochem. Soc. Trans. 19 (1991) 681-685; Aikawa et al., J. Biol. Chem. 265 (1991) 13955-13959).
Mutace glykosylovaného asparaginu v kódující oblasti reninu vedla k významnému snížení sekrece v buňkách kvasinek (Aikawa et al., J. Biol. Chem. 265 (1991) 13955-13959).
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou DNA sekvence kódující nové biosyntetické prekursory insulinu a použití eukaryotických buněk, zvláště buněk plísní, k preparaci insulinu.
Cíle se dosahuje sekvencí DNA zahrnující kódující sekvenci pro insulinový prekursor vzorce B-Pg-A, kde B a A representují řetězec B resp. řetězec A a kde Pg representuje modifikovaný C-peptid nebo jakýkoli počet aminokyselin obsahující přinejmenším jedno konsensus místo N-glykosylace.
řetězce Ba A signály proteolytického zpracování specifického chemického štěpení.
Výhodné je modifikovat proinsulinový gen vytvořením glykosylačního místa AsnXSer. Toho lze dosáhnout v sekvenci
Pg spojuje nebo místy
C-peptidu např. změnou kodonu GCC pro aminokyselinu Ala-C-20 na kodon AAC pro Asn.
Stejného principu lze použít u des-B(30)-proinsulinu.
Vynález je založen na zjištění, že výtěžek imunoreaktivního insulinu, měřený metodou RIA, je mnohem vyšší u transformantů obsahujících DNA sekvence vzorce B-Pg-A ve fúzi k chránící bílkovině než u transformantů obsahujících nemodifikované DNA sekvence proinsulinu ve fúzi k chránící bílkovině. Buňky transformované vektorem obsahujícím DNA sekvence proinsulinu bez fuze nebo proinsulinu modifikovaného N-glykosylačním konsensus místem bez fuze dávají velmi nízké nebo žádné výtěžky imunoreaktivního insulinu, měřené metodou RIA.
Zavedení N-glykosylačního konsensus místa do oblasti odstupu mezi řetězci [spacer}, jenž není součástí molekuly maturního insulinu, znamenitě zvyšuje expresi v buňkách plísní, jež jsou transformovány DNA sekvencemi kódujícími takovéto fúzované prekursory insulinu. Bílkovina fúzovaná s proinsulinem může být buď zpracována v hostitelském organismu samotném anebo odstraněna pozdějším enzymatickým nebo chemickým štěpením.
DNA sekvence kódující řečený modifikovaný prekursor insulinu může být připravena oligonukleotidovou syntézou celé DNA sekvence v kombinaci s PCR nebo in vitro mutagenesou. Kodony DNA sekvence mohou být též optimalizovány pro expresi ve vhodném organismu, s výhodu v kmeni plísně.
Vynález se též týká postupu přípravy insulinu kultivací vhodných buněk ve vhodném kultivačním médiu, s výhodou buněk plísní, transformovaných vektorem obsahujícím DNA sekvenci kódující insulinový prekursor vzorce B-Pg-A.
Exprese a sekrece peptidu shora uvedeného vzorce lze dosáhnout použitím vektoru, v němž je kódující sekvence regulována promotorem, signální sekvencí a terminátorem funkčním ve vhodném organismu. Mohou být jimi například Pgja^ a signální sekvence galA genu nebo jejich části, vhodné pro expresi v Aspergillus sp. (Cullen et al., Biotechnology, 5 (1987) 369-376). Exprese a sekrece tohoto peptidu lze též dosáhnout použitím vektoru exprese, v němž je DNA sekvence kódující insulinový prekursor shora uvedeného vzorce fúzovaná ke genu chránící bílkoviny prostřednictvím signálu pro zpracování (Ward et al., Biotechnology, 8 (1990) 435-440; Broekhuijsen et al.,
J. Biotech. 31 (1993) 135-145) nebo místa chemického štěpení.
Vynález se dále týká DNA sekvencí kódujících farmaceutické do nichž se pro vyšší expresi nebo N-glykosylační konsensus místo do jímž není peptidy nebo bílkoviny, sekreci proteinu zavádí neesenciálního místa jakékoli oblasti odstupu, kódována maturní bílkovina.
Stručný popis obrázků
Obr. 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci jak přirozeného tak kodonové optimalizovaného proinsulinového genu a odpovídající aminokyselinovou sekvenci, s použitím konvenčních zkratek pro nukleotidy a aminokyseliny.
Obr. 2 popisuje dva typy kazet pro expresi lidského proinsulinového genu a schematicky ukazuje lidský proinsulinový gen a mutantní gen, obsahující N-glykosylační konsensus místo.
Obr. 3 vysvětluje strategii konstrukce lidského proinsulinového genu a mutantního genu, obsahujícího N-glykosylační konsensus místo pro dva typy kazet exprese prostřednictvím fragmentů syntetizovaných separátně pomocí překrývajících se oligonukleotidů v kombinaci s PCR.
Obr. 4 ukazuje 14 oligonukleotidů navržených pro syntézu lidského proinsulinového genu a mutantního genu, obsahujícího N-glykosylační konsensus místo.
Obr. 5 vysvětluje na příkladu syntézy fragmentu I nový přístup, jenž byl použit k syntéze lidského proinsulinového genu využitím překrývajících se, komplementárních oligonukleotidů v kombinaci s PCR.
Obr. 6 schematicky ukazuje syntézu fragmentu IV (oligonukleotidy jsou vyznačeny jen šipkami).
Obr. 7 schematicky ukazuje syntézu fragmentu II, fragmentu III a fragmentu V (oligonukleotidy jsou vyznačeny jen šipkami).
Obr. 8 ukazuje konstrukci plasmidů pPZG301, pPZG302, pPZG303, pPZG304, pPZG302.
Obr. 9 ukazuje konstrukci plasmidů pPZG311, pPZG302.
Obr. 10 ukazuje konstrukci vektoru exprese pro filamentární plísně a kazetu exprese typu I.
Obr. 11 ukazuje konstrukci vektoru exprese pro filamentární plísně a kazetu exprese typu II.
Obr. 12 ukazuje sekvenci u spojení GlaG2 genu glaA.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Syntéza lidského proinsulinového genu a mutantního genu, obsahujícího N-glykosylační konsensus místo pomocí překrývajících se oligonukleotidů v kombinaci s polymerasovou řetězovou reakcí (PCR).
a) Metody
Všechny pokusy v manipulaci DNA byly provedeny s použitím standardních metod, jak jsou popsány v Maniatis T., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A. (1982).
Všechny chemikálie, enzymy a plasmidy jsou dostupné z různých komerčních zdrojů, pokud se neuvádí jinak. Pufry a reakční podmínky pro digesce restrikčními endonukleasami se použily podle doporučení výrobců, pokud není vyznačeno jinak.
Chemická syntéza oligonukleotidů byla provedena na zakázku u fy. ISOGEN Bioscience, Amsterdam, Nizozemí. Vzorky DNA byly dodávány v lyofilizované formě jako sodné sole s volnými hydroxylovými skupinami na 5' a 3' konci. Takováto DNA byla rozpouštěna ve sterilní MQ H20. Koncentrace jednovláknových DNA oligonukleotidů byla stanovována měřením absorbance Α260· Vzorky rozpuštěných DNA oligonukleotidů byly skladovány při -20°C.
Polymerasová řetězová reakce, dále označována jako PCR, byla prováděna s přístrojem fy. Perkin Elmer Cetus (761 Main Ave., Norwalk CT 06859), soupravou GeneAmp™ DNA Amplification Reagent Kit a enzymem AmpliTaq™ Recombinant Taq DNA Polymerase. Koncentrované roztoky a reakční směsi byly připravovány podle Perkin Elmer Cetus Protocol for DNA Amplification jak je doporučováno výrobcem s tou výjimkou, že v reakční směsi nebyla žádná templátová DNA, ale jen oligonukleotidy v koncentraci 100 pmol na jednu reakci (100 μΐ). Profil teplotního cyklu pro každou PCR byl: Teplota tání 94°C / 1 min, teplota navázání oligonukleotidů [annealing] 40°C / 1 min (pro fragmenty I a IV) nebo 50°C / 1 min (pro fragmenty II, III a V), polymerizační teplota 72°C / 1 min. Cyklů bylo 25. Po posledním cyklu byla doba polymerizace prodloužena na 7 minut k dokončení polymerizace všech řetězců. Vzorek byl pak ochlazen na 4°C. Produkty PCR byly izolovány z reakční směsi dvěma kroky chloroformové extrakce. DNA pak byla sražena isopropanolem, vysušena ve vakuu a rozpuštěna v 50 μΐ TE pufru.
V pokusech s transformací a s amplifikací plasmidů byla použita bakterie E. coli K12 (Yanisch-Perron et al., Gene 21 (1985) 103-119).
Návrhy oligonukleotidů
Syntetický lidský proinsulinový gen byl odvozen z publikované sekvence lidského insulinového genu (Bell et al., Nátuře 284 (1980) 26-32). Mělo by být uvedeno, že když se gen syntetizuje, lze provádět určité modifikace: Je možné používat různé, ve většině případů preferované, kodony, zavádět dodatečné funkční DNA sekvence a restrikční místa k umožnění ligace do vektoru exprese, měnit jeden nebo více kodonů kódující oblasti k produkci strukturně modifikovaného polypeptidu s v podstatě stejnou aktivitou nebo použitím.
V předkládaném vynálezu byl syntetický lidský proinsulinový gen pro expresi v plísni modifikován. Byly použity kodony, jež jsou nejčastěji využívány v glukoamylasovém G 1 genu filamentární plísně A. niger, jenž je exprimován ve vysokém množství (Boel et al., EMBO J., 2 (1984) 1097-1102; Nunberg et al., Mol. Cell. Biol., 4_ (1984) 2306-2315); ve většině případů jsou stejné jako lidské kodony s výjimkou určitých oblastí, kde by se výběrem preferovaných kodonu stal oligonukleotid velice bohatým na CG nukleotidy, což by mohlo způsobovat problémy v sekvenování a možná dokonce v PCR. Proto byly některé, většinou Gly kodony, změněny z GGC na GGT, což je druhý preferovaný Gly kodon v glukoamylasovém genu filamentární plísně A. niger (Obr. 1).
K 5' konci syntetického proinsulinového genu byly zavedeny dodatečné DNA sekvence kódující buď 18 aminokyselin signálního peptidu glukoamylasového (GlaA) genu anebo 6 aminokyselin propeptidu genu GlaA, obsahující Lys-Arg místo proteolytického štěpení, aby bylo možno zkonstruovat dva typy kazet exprese. V prvním případě (I) byl syntetický lidský proinsulinový gen regulován glukoamylasovým promotorem (PgiaA^ a signální sekvencí (sSglaA) glukoamylasového genu, zatímco ve druhém případě (II) byl pod řízením PgiaA proinsulinový gen fúzován s úplným genem glaA filamentární plísně A. niger prostřednictvím odstupového peptidu, obsahujícího signál zpracování proteinu podobný KEX-2 (Obr. 2).
Připraven byl též mutant syntetického lidského proinsulinového genu nesoucí konsensus místo N-glykosylace pro studium vlivu na úroveň exprese a sekrece. Jelikož C-peptid není esenciální pro funkci insulinu, protože je odštěpen v procesu sekrece, mutace byla zavedena do kódující oblasti C-peptidu lidského proinsulinového genu (BCA). Mutant (BPgA) nesoucí konsensus místo N-glykosylace AsnXSer byl připraven změnou kodonu GCC pro aminokyselinu Ala-C20 na kodon AAC pro aminokyselinu Asn (Obr. 2).
Pro syntézu lidského proinsulinového genu byl zaveden nový přístup, v němž se použily překrývající se, komplementární oligonukleotidy v kombinaci s PCR. Principem metody bylo použít během PCR dva střední, překrývající se, komplementární oligonukleotidy současně jako templáty a primery a takto umožnit
Taq DNA polymerase zvětšit je, t.j. prodloužit je během prvního cyklu.
oligonukleotidy oligonukleotidy
Ve druhém překrýváj í a umožňují cyklu se takovéto zvětšené se sousedícími 3' nebo 5' tím Taq DNA polymerase dále zvětšovat již zvětšené střední oligonukleotidy. Takto Taq DNA polymerasa ve skutečnosti vyplňuje mezery mezi chemicky syntetizovanými, překrývajícími se nukleotidy a vytváří dvoušroubovíci DNA. Syntéza lidského proinsulinového genu a jeho mutantu obsahujícího konsensus místo N-glykosylace byla provedena ve fragmentech, jež byly separátně syntetizovány pomocí PCR. Štěpení genu na fragmenty bylo umožněno přítomností dvou štěpících míst pro restrikční enzym Pstl v kódující oblasti C-peptidu (Obr. 3). Bylo navrženo čtrnáct oligonukleotidů: Deset oligonukleotidů (B3, B4, B5, B6, Cl, C2, C3, Al, A2, a A3) bylo odvozeno z DNA sekvence kódující lidský proinsulin s kodony preferovanými pro expresi ve filamentární plísni A. niger, dva oligonukleotidy (B1 a B2) byly navrženy pro zavedení signální sekvence glaA genu a dodatečných restrikčních míst k umožnění ligace do vektoru exprese typu I, jeden oligonukleotid (B7) byl navržen pro zavedení oblasti odstupu sekvence glaA(G2) genu a dodatečných restrikčních míst k umožnění ligace do vektoru exprese typu II, a jeden oligonukleotid (C4) byl navržen k zavedení mutace nesoucí konsensus místo N-glykosylace (Obr. 4).
b) PCR syntéza fragmentů I - V
Fragmenty I a IV
Fragmenty I a IV byly V prvním kroku PCR byla reakce B4, a vedla k produktu B3/B4.
syntetizovány krok za krokem. provedena s oligonukleotidy B3 a V následujícím kroku byl 1 μΐ produktu B3/B4 smíchán v reakční směsi PCR s: a) oligonukleotidy B2 a B5 pro fragment I, a b) oligonukleotidy B7 a B5 pro fragment XV. Byly získány produkty B2/B3/B4/B5 a B7/B3/B4/B5. Ve třetím kroku byl 1 μΐ produktu B2/B3/B4/B5 použit pro PCR s oligonukleotidy B1 a B6 pro fragment I a 1 μΐ produktu B7/B3/B4/B5 byl smíchán v reakční směsi PCR s oligonukleotidy B7 a B6 pro fragment IV. Byly získány produkty B1/B2/B3/B4/B5/B6 a B7/B3/B4/B5/B6. Jejich velikosti odpovídaly očekávaným, a produkty byly digerovány příslušnými restrikčními enzymy na fragment I a na fragment IV (Obr. 5 a 6).
Fragmenty II, III a V
Fragmenty II, III a V byly syntetizovány v jednom kroku. PCR byla provedena s oligonukleotidy: a) Cl, C2, C3; b) Al, A2, A3; a c) C2, C4, C5. PCR produkty C1/C2/C3, A1/A2/A3 a C2/C4/C5 měly očekávanou velikost a byly digerovány příslušnými restrikčními enzymy na fragment II, na fragment III a na fragment V (Obr. 7).
Klonování PCR-syntetizovaných fragmentů do vektoru pUC19 a analýza sekvence DNA
Plasmid pUC19 byl digerován: a) Pstl, b) Pstl/EcoRI, a c) Pstl/Sall a ligován s patřičným fragmentem I-V za vzniku plasmidů pPZG301, pPZG302, pPZG303, pPZG304 a pPZG305 (Obr. 8). Těmito plasmidy byla transformována bakterie E. coli JM109. Ze získaných transformantů byla pDNA izolována mini-preparací a analyzována restrikčními enzymy. Transformanty E. coli obsahující správné plasmidy byly rozrůstány, jejich pDNA izolována pomocí kolony QIAGEN typ 20 a sekvenována pomocí soupravy SEQUENASER Version 2.0 kit. Vektory obsahující správně syntetizovanou a vloženou sekvenci byly použity pro další konstrukce.
PPZG311 a pPZG312
Vektory obsahující úplný lidský proinsulinový gen a mutantní gen s konsensus místem N-glykosylace se signální sekvencí glaA genu byly konstruovány jak následuje: pPZG311 byl konstruován ligací 173 bp EcoRI-Pstl fragmentu izolovaného z pPZG301, 75 bp Pstl-Pstl fragmentu izolovaného z pPZG302 a 74 bp Pstl-Sall fragmentu izolovaného z pPZG303 do EcoRI/SalI digerovaného pUC19 vektoru. pPZG312 byl konstruován ligací 173 bp EcoRI-Pstl fragmentu izolovaného z pPZG301, 75 bp Pstl-Pstl fragmentu izolovaného z pPZG305 a 74 bp Pstl-Sall fragmentu izolovaného z pPZG303 do EcoRI/SalI digerovaného pUC19 vektoru (Obr. 9).
Příklad 2
Konstrukce vektoru exprese pro filamentární plíseň
I. Kazeta exprese typu I pAN52-7NotBCA a pAN52-7NotBPgA pAN52-7NouiďA (Verdoes et al., Gene (1994) v tisku) byl digerován parciálně Ncol a Sáli. 7,55 kb Sall-Ncol fragment nesoucí promotor glaA a terminační oblast trpC genu byl izolován a ligován s 317 bp Ncol-Sall fragmentem plasmidu pPZG311 za vzniku plasmidu pAN52-7NotBCA a s 317 bp Ncol-Sall fragmentem plasmidu pPZG312 za vzniku plasmidu pAN52-7NotBPgA (Obr. 10).
pAN52-7BCAamdS a pAN52-7BPgAamdS
5,0 kb Notl fragment nesoucí gen acetamidasy (amdS) z A. nidulans byl zaligován do Notl místa plasmidů pAN52-7NotBCA a pAN52-7NotBPgA za vzniku plasmidů pAN52-7BCAamdS a pAN52-7BPgAamdS (Obr. 10).
I. Kazeta exprese typu II pAN56-7BCAamdS a pAN56-7BPgAamdS
Vektory pro fúzované bílkoviny glukoamylasa-proinsulin a glukoamylasa-proinsulinový mutant s konsensus místem N-glykosylace byly konstruovány jak následuje: Plasmid pPZG304 byl digerován EcoRV a AlwNI. Fragment EcoRV-AlwNI o 25 bp, nesoucí sekvenci šesti aminokyselin oblasti odstupu, byl ligován s 3,07 kb Sall-EcoRV fragmentem z pAN56-7 nesoucím glaA(G2) gen za vzniku fragmentu SalI-AlwNI. Vektor pAN56-7 byl získán z vektoru pAN56-4 (Broekhuijsen et al., J. Biotech. 31 (1993) 135-145), v němž byl gpdA promotor nahrazen 4,2 kb Notl-Ncol fragmentem z pAN52-7, nesoucím glaA promotor, a v něž byl odstraněn interleukinový gen odstraněn, s ponecháním EcoRV místa nahoru od GlaG2. Fragment AlwNI-SalI byl pak ligován s 10, 6 kb HindlII-SalI fragmentem z pABl-6S (Den Herder et al., Mol. Gen. Genet. 233 (1992) 404-410), jenž měl promotor glaA a gen amdS as a) 1,06 kb AlwNI-HindlII fragmentem z pAN52-7BCA za vzniku plasmidu pAN56-7BCAamdS a b) 1,06 kb AlwNI-HindlII fragmentem z pAN52-7BPgA za vzniku vektoru pAN56-7BPgAamdS (Obr. 11). V oblasti odstupu bylo dibazické místo zpracování Lys-Arg. Sekvence kolem míst fuze glukoamylasového genu s lidským proinsulinovým genem (BCA) a proinsulinovým mutantem (BPgA) pomocí oblasti odstupu je ukázána v Obr. 12.
Příklad 3
Transformace filamentární plísně Aspergillus niger
Transformace filamentární plísně Aspergillus niger byla provedena podle již popsaných metod (Goosen et al., Curr. Genet. 11 (1987) 499-503; Kelly a Hyneš, EMBO J. 4 (1985) 475-479; Van Hartingsvelt et al., Mol. Gen. Genet. 206 (1987) 71-75).
Filamentární plíseň Λ. niger N402 (Bos, C. J. et al., Curr. Genet. 14 (1988) 437-443) byla transformována vektory exprese pAN52-7BCAamdS, pAN52-7BPgAamdS, pAN56-7BCAamdS a pAN56-7BPgAamdS. Kolonie byly selektovány na kultivačním médiu s acetamidem nebo akrylamidem jako jedinými zdroji uhlíku a dusíku. Provedla se další analýza transformantů vycházející z jednotlivých spor.
Příklad 4
Sekrece lidského insulinu do kultivačního média
1. Kultivace transformantů A. niger nesoucích lidský proinsulinový gen a mutantní gen s konsensus místem N-glykosylace
Kolem 108 spor selektovaných transformantů bylo naočkováno do 500 ml Erlenmeyerových baněk obsahujících 100 ml tekutého kultivačního média obsahujícího: 70 mM NaN03, 7 mM KCl, 11 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 4 % dextran, stopové prvky (1 : 1000; 76 mM ZnSO4, 178 mM H3BO3, 25 mM MnCl2, 18 mM FeSO4, 7,1 mM CoCl2, 6,4 mM CuSO4, 6,2 mM Na2Mo04, 174 mM EDTA) a vitaminy (1 : 1000; 100 mg/1 thiamin, 100 mg/1 riboflavin, 100 mg/1 nikotinamid, 50 mg/1 pyridoxin, 10 mg/1 kyselina panthotenová, 0,2 mg/ml biotin). Transformanty rostly při 32°C po 36 hodin. Vzorky byly analyzovány na přítomnost insulinu.
2. Exprese insulinu
Exprese imunoreaktivního lidského insulinu byla demonstrována soupravou Pharmacia INSULIN RIA 100 fy. Kabi Pharmacia Diagnostics. Vzorky transformantů kultivovaných fermentací byly filtrovány, filtráty neutralizovány, ředěny pokud to bylo potřebné a pak podrobeny stanovení RIA (radioimunotestu) (Livessy et al., Clin. Biochem. 13 (1980)
151-155). Hladina exprese imunoreaktivního lidského insulinu (mU/1) v A. niger je ukázána v Tabulce 1.
Tabulka 1
Hladina exprese imunoreaktivního lidského insulinu v různých transofrmantech A. niger-.
Transformant
Plasmid
Imunoreaktivní insulin (mU/1)
A. niger 7650 [NCAIM (P) F 00215] PAN52-7BCAamďS 0
A. niger 7651 [NCAIM (P) F 00216] Ρ AN5 2-7 BPg AamdS 2
A. niger 7649 [NCAIM (P) F 00214] PAN56-7BCAamdS 56
A. niger 7638 [NCAIM (P) F 00213] PAN56-7BPgAamdS 776
Transformanty A. niger 7650, A. niger 7651, A. niger 7649 a A. niger 7638 byly uloženy v Národní sbírce zemědělských a průmyslových mikroorganismů, H-1502 Budapest, P.O.B. 53,
Maďarsko dne 8. NCAIM (P) F 00215, a NCAIM (P) F 00213 července 1994 pod přístupovými čísly NCAIM (P) F 00216, NCAIM (P) F 00214, a v souladu s Budapešťskou dohodou o mezinárodním uznávání uložení mikroorganismů pro účele patentovacího postupu, Prohlášením v případě původního uložení, podle Pravidla 6.1.
Z Tabulky je zřejmé, že existuje značný rozdíl v expresi transformantů obsahujících různé vektory. Daleko nej lepší výsledky se ukazují u transformanta získaného transformací vektorem, jenž má lidský proinsulinový gen, nesoucí konsensus místo N-glykosylace, fúzovaný s glukoamylasovou bílkovinou.

Claims (13)

  1. P A Τ Ε N T 0 V É N Á R 0 K Y 1. DNA sekvence v y z n ačující se tím, že obsahuje sekvenci kódující insulinové prekursory vzorce - B-Pg-A, kde B a A representují řetězec B respektive A lidského insulinu a kde Pg representuje modifikovaný - C-peptid nebo libovolný počet aminokyselin, zahrnující přinejmenším jedno konsensus místo N-glykosylace,
    a Pg spojuje řetězce Ba A prostřednictvím signálu proteolytického zpracování nebo místa chemického štěpení.
  2. 2. DNA sekvence vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci kódující insulinové prekursory vzorce B(29)-Pg-A, kde B(29) representuje B(l-29), A representuje řetězec A lidského insulinu a kde Pg representuje modifikovaný C-peptid nebo libovolný počet aminokyselin, zahrnující přinejmenším jedno konsensus místo N-glykosylace, a Pg spojuje řetězce B a A prostřednictvím signálu proteolytického zpracování nebo místa chemického štěpení.
  3. 3. DNA sekvence podle nároků 1 až 2 vyznačující se tím, že obsahuje kodony preferované pro expresi v určitém hostiteli.
  4. 4. DNA sekvence podle nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že je fúzovaná s genem chránící bílkoviny prostřednictví oblasti odstupu, nesoucí signál proteolytického zpracování nebo místo chemického štěpení.
  5. 5. DNA sekvence vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci kódující farmaceutický peptid nebo protein, jenž má zavedeno konsensus místo N-glykosylace v neesenciálním místě kterékoli oblasti odstupu.
  6. 6. Transformované buňky vyznačující se tím, ž e obsahují DNA sekvenci podle nároků 1 až 5.
  7. 7. Transformované buňky plísně vyznačující se tím, že obsahují DNA sekvenci podle nároků 1 až 5.
  8. 8. Transformované buňky plísně Aspergillus sp.
    vyznačující se tím, že obsahují DNA sekvenci podle nároků 1 až 5.
  9. 9. Transformované buňky vyznačující se tím, ž e obsahují segment DNA podle nároků 1 až 5.
  10. 10. Transformované buňky plísně vyznačující se tím, že obsahují segment DNA podle nároků 1 až 5.
  11. 11. Transformované buňky plísně Aspergillus sp.
    vyznačující se tím, že obsahují segment DNA podle nároků 1 až 5.
  12. 12. Postup pro přípravu insulinu vyznačující se kultivací vhodných buněk, s výhodou buněk plísně, transformovaných vektorem obsahujícím sekvenci DNA podle nároků 1 až 4.
  13. 13. Postup pro přípravu farmaceutických peptidů nebo proteinů vyznačující se kultivací vhodných buněk, s výhodou buněk plísně, transformovaných vektorem obsahujícím sekvenci DNA podle nároku 5.
CZ951999A 1994-08-05 1995-08-03 Dna sequence encoding novel insulin biosynthetic precursors and insulin preparation process CZ199995A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HR940432A HRP940432B1 (en) 1994-08-05 1994-08-05 Dna sequences encoding biosynthetic insulin precursors and process for preparation of insulin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ199995A3 true CZ199995A3 (en) 1996-02-14

Family

ID=10946142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ951999A CZ199995A3 (en) 1994-08-05 1995-08-03 Dna sequence encoding novel insulin biosynthetic precursors and insulin preparation process

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0704527B1 (cs)
CN (1) CN1126761A (cs)
AT (1) ATE239791T1 (cs)
BG (1) BG62336B1 (cs)
CA (1) CA2155451A1 (cs)
CZ (1) CZ199995A3 (cs)
DE (1) DE69530647T2 (cs)
ES (1) ES2198428T3 (cs)
HR (1) HRP940432B1 (cs)
PL (1) PL309882A1 (cs)
PT (1) PT704527E (cs)
SI (1) SI9500250A (cs)
SK (1) SK97195A3 (cs)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9513967D0 (en) * 1995-07-08 1995-09-06 Univ Leicester Insulin
AU5504999A (en) * 1998-07-20 2000-02-14 Frenken, Leon Gerardus Joseph Production of proteins
CA2356109C (en) 1999-01-06 2008-04-22 Genentech, Inc. Insulin-like growth factor (igf) i mutant variants
JP3406244B2 (ja) * 1999-04-30 2003-05-12 伊藤ハム株式会社 新規な融合蛋白質からの組み換えインスリンの製造方法
DE19947456A1 (de) * 1999-10-02 2001-04-05 Aventis Pharma Gmbh C-Peptid zur verbesserten Herstellung von Insulin und Insulinanaloga
DK1265630T3 (da) 2000-03-24 2006-10-09 Genentech Inc Anvendelse af insulin til behandling af brusksygdomme
WO2002100887A2 (en) * 2001-06-08 2002-12-19 Novo Nordisk A/S Method for making insulin precursors and insulin precursor analogs
US9074015B2 (en) * 2010-07-28 2015-07-07 Smartcells, Inc. Recombinantly expressed insulin polypeptides and uses thereof
AR087433A1 (es) * 2011-08-08 2014-03-26 Merck Sharp & Dohme Analogos de insulina n-glicosilados
WO2020071551A1 (ja) 2018-10-05 2020-04-09 株式会社癌免疫研究所 良性腫瘍の予防または治療薬

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1260858A (en) * 1985-03-28 1989-09-26 Lawrence S. Cousens Expression using fused genes providing for protein product
FI872102L (fi) * 1986-06-06 1987-12-07 Panlabs Inc Expressionssystem hos filamentala fungi.
CA1340772C (en) * 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
DK300090D0 (da) * 1990-12-19 1990-12-19 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser
BR9400600A (pt) * 1994-02-17 1995-10-24 Finep Financiadora De Estudos Processos para produção de uma protéina recombinante e/ou de glicosilfosfatidilinositol (GPI) em células de microorganismos eucariontes e para a obtenção de leveduras de S. cerevisae; célula de levedura sequência de nucleotídios; meio de cultura; medicamento ou vacina; e produto dos ditos processos

Also Published As

Publication number Publication date
CA2155451A1 (en) 1996-02-06
HRP940432B1 (en) 2003-10-31
PT704527E (pt) 2003-09-30
ES2198428T3 (es) 2004-02-01
EP0704527B1 (en) 2003-05-07
BG62336B1 (bg) 1999-08-31
DE69530647T2 (de) 2004-03-11
HRP940432A2 (en) 1997-08-31
SI9500250A (en) 1996-02-29
EP0704527A2 (en) 1996-04-03
SK97195A3 (en) 1996-02-07
EP0704527A3 (en) 1997-08-27
BG99844A (bg) 1996-02-28
ATE239791T1 (de) 2003-05-15
CN1126761A (zh) 1996-07-17
PL309882A1 (en) 1996-02-19
DE69530647D1 (de) 2003-06-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3017962B2 (ja) ヘマトクリット値を上昇させるための医薬組成物の製造方法
US4661454A (en) GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
JP3577311B2 (ja) インスリン様成長因子結合タンパク質の製造
CA1340772C (en) Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
EP0228449B1 (en) Fibroblast growth factor
JP5503968B2 (ja) 成熟インスリンポリペプチドの作製方法
JP2634193B2 (ja) ヒトプロアポリポタンパク質ａ−１の発現
US7166446B2 (en) Method for expression of heterologous proteins in yeast
JP4597668B2 (ja) 遺伝子およびポリペプチド配列
JPH0217156B2 (cs)
CN105308067B (zh) 制备成熟胰岛素多肽的方法
JP2001512684A (ja) 新規のｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子配列およびそれらの使用方法
ES2198428T3 (es) Secuencias de adn codificantes de precursores de insulina biosinteticos y procedimiento para la preparacion de insulina.
US6861237B2 (en) Production of heterologous polypeptides in yeast
KR20010020482A (ko) 개량된 단백질 발현균주
EP0409098B1 (en) The expression and secretion of mature human beta interleukin-1 in bacillus subtilis and means and methods for its achievement
CN101243190B (zh) 制备成熟胰岛素多肽的方法
EP1211314A2 (en) Expression of a human insulin precursor in p. pastoris
JP2002538757A (ja) 食欲制御活性を有するポリペプチド
CN115947864A (zh) 一种融合蛋白、生长激素及其制备方法
HUT72848A (en) Dna sequences encoding novel biosynthetic insulin precursors and process for preparation of insulin
US7638618B2 (en) Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest
KR100284036B1 (ko) 재조합 인간 형질전환 성장인자-베타 유전자, 그의 발현벡터 및 인간 형질전환 성장인자-베타의 제조방법
BG60508B2 (bg) Днк последователности кодиращи еритропоетин
HU210608A9 (hu) Inzulinszerű növekedési faktort kötő protein, valamint a proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények Az átmeneti oltalom az 1-7. igénypontokra vonatkozik.

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic