ES2198428T3 - Secuencias de adn codificantes de precursores de insulina biosinteticos y procedimiento para la preparacion de insulina. - Google Patents

Secuencias de adn codificantes de precursores de insulina biosinteticos y procedimiento para la preparacion de insulina.

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN PRECURSORES DE INSULINA DE FORMULA B-PG-A, DONDE B Y A REPRESENTAN CADENAS B- Y A-, RESPECTIVAMENTE, Y PG REPRESENTA UN PEPTIDO -C MODIFICADO O CUALQUIER NUMERO DE AMINOACIDOS QUE INCLUYAN AL MENOS UNA LOCALIZACION DE CONSENSO DE GLICOSILACION. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE INSULINA CULTIVANDO CELULAS APROPIADAS, PREFERIBLEMENTE CELULAS FUNGALES, TRANSFORMADAS CON UN VECTOR QUE INCLUYE UNA SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA UN PRECURSOR DE INSULINA DE LA FORMULA DADA. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A SECUENCIAS DE DNA QUE CODIFICAN PEPTIDOS FARMACEUTICOS Y PROTEINAS EN LA QUE LA LOCALIZACION DE CONSENSO DE N-GLICOSILACION SE INTRODUCE EN UNA LOCALIZACION NO ESENCIAL EN CUALQUIER REGION ESPACIADORA PARA UNA EXPRESION Y SECRECION MAS ELEVADAS DE PROTEINAS.

Description

Secuencias de ADN codificantes de precursores de insulina biosintéticos y prodedimiento para la preparación de insulina.
Esta invención se relaciona con secuencias de ADN codificantes de nuevos precursores de insulina biosintéticos y con la preparación de insulina cultivando células transformadas que contienen dichas secuencias de ADN.
La insulina es una hormona, cuya función primaria es controlar el transporte de glucosa desde el torrente sanguíneo hasta las células en las cuales se metaboliza.
La insulina consiste en dos cadenas de aminoácidos: la Cadena A consiste en 21 aminoácidos y la cadena B consiste en 30 aminoácidos, estando unidas las cadenas entre sí por dos puentes disulfuro. Un tercer puente disulfuro se encuentra en la cadena A.
La forma primaria de la molécula de insulina se sintetiza como cadena polipeptídica naciente, denominada preproinsulina, que consiste en un péptido señal y proinsulina. El péptido señal dirige la cadena naciente a través del retículo endoplásmico. La proinsulina se produce a partir de la preproinsulina en el área del lumen del retículo endoplásmico tan pronto como la cadena polipeptídica atraviesa la membrana. La proinsulina abarca una cadena polipeptídica consistente en una cadena de 35 aminoácidos que no está presente en la insulina. El péptido de conexión o péptido C une el extremo C de la cadena B con el extremo N de la cadena A de la futura molécula de insulina. Desde el lumen del retículo endoplásmico, la proinsulina se dirige al aparato de Golgi, donde comienza la proteolisis del péptido de conexión. El péptido de conexión o péptido C es cortado por un sistema enzimático similar al sistema de tripsina/carboxipeptidasa B, que actúa en la secuencia de dos aminoácidos básicos consecutivos, y se produce la insulina (Steiner y col., J. Cell Biol. 24 (1984), 121-130).
La importancia del péptido C es que une las cadenas B y A para permitir la apropiada formación de puentes disulfuro en la molécula de insulina (Bell y col., Nature 284 (1980), 26-32) o que dirige la enzima conversora de tipo tripsina para procesar la proinsulina en el sitio con dos aminoácidos básicos (Thim y col., PNAS, 83(1986), 6766-6770).
La producción de insulina humana biosintética ha sido descrita principalmente en la bacteria Escherichia coli y en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Es común para todas ellas que la secuencia de ADN codifica para la totalidad de la proinsulina, para una parte modificada de la proinsulina o por separado para las cadenas A y B.
En la bacteria E. coli, se ha producido insulina bien a través de las cadenas A y B por separado (Chance y col., Diabetes Care, 4 (1982), 147- 154), bien como proinsulina, EP 55945.
En la levadura S. cerevisiae, se ha producido insulina a través de la proinsulina, pero con un rendimiento muy bajo, EP-A-121 884. Diversas modificaciones del péptido C mejoran el rendimiento y la formación apropiada de la molécula de insulina en la levadura.
Se describen precursores de insulina de fórmula B-X-A, donde B y A representan las cadenas B y A y X representa un péptido consistente en 2 a 35 aminoácidos, en DK-A-5284/87.
Se describen precursores de insulina de fórmula B-X-Y-A, donde B y A representan las cadenas B y A y X e Y representan cada uno lisina o arginina, en EP-A-195 691.
En EP-A-163 529 se describen precursores de insulina que contienen la cadena peptídica B(1-29)-A(1-21) unida con un péptido corto que tiene de 2 a 8 aminoácidos. Se describen modificaciones de precursores de des-B(30)insulina de fórmula B(1-29)-X_{1}-X_{2}-Y_{2}-Y_{1}-A(1-21) en EP-A-347 845.
En EP 249 350 se describen un promotor de glucoamilasa y una secuencia señal para la secreción de proteínas en hongos como hospedadores. Como ejemplo, el trímero de proinsulina expresado fue también insertado en dicho vector de expresión.
Muchos polipéptidos para uso terapéutico o diagnóstico, por ejemplo eritropoyetina, tPA y factor VIII, han sido N-glicosilados (Parekh y col., TIBTECH, 7 (1989), 117-121).
Se ha descrito también un rendimiento triplemente aumentado de la quimosina bovina (glicoquimosina) en el hongo A. niger var. awamori, que se consigue mediante la introducción de un sitio consenso de N-glicosilación en una secuencia codificante. Mediante una fusión del gen de la proquimosina y de la glucoamilasa, se consiguió un rendimiento incluso mayor, pero no se consiguió ningún mayor aumento del rendimiento mediante una fusión de la glicoquimosina con la glucoamilasa (Berka y col., Biochem. Soc. Trans., 19 (1991), 681- 685).
En el caso de la proteinasa aspártica (renina), que es de origen microbiano y sirve como substituto de la quimosina, se ha observado que la hiperglicosilación puede reducir la actividad enzimática si se produce en un sitio crítico de la molécula. (Berka y col., Biochem. Soc. Trans., 19 (1991), 681-685; Alkawa y col., J. Biol. Chem. 265 (1990), 
\hbox{13955-13959).}
Una mutación de la asparagina glicosilada en la región codificante de la renina dio lugar a una reducción significativa de la secreción en células de levadura (Aikawa y col., J. Biol. Chem., 265 (1990), 13955-13959).
El objeto de la invención son secuencias de ADN codificantes de nuevos precursores biosintéticos de insulina y el uso de células eucarióticas, en particular de células fúngicas, para la preparación de insulina.
Se ha conseguido este objeto por medio de una secuencia de ADN que comprende una secuencia codificante para precursores de la insulina de fórmula B-Pg-A, donde B y A representan la cadena B y A, respectivamente, y Pg representa un péptido C o cualquier número de aminoácidos que contienen al menos un sitio consenso de N-glicosilación. Pg une las cadenas B y A procesando señales de procesamiento proteolítico o sitios de escisión química específicos.
Se prefiere la modificación del gen de la proinsulina para crear un sitio de N-glicosilación AsnXSer. Se puede conseguir esto en una secuencia de péptido C, por ejemplo cambiando el codon GCC para el aminoácido Ala-C-20 por el codon AAC para Asn.
Se puede aplicar el mismo principio a la des-B(30)-proinsulina.
La invención se basa en el descubrimiento de que el rendimiento de insulina inmunorreactiva, medido por el método RIA, es mucho mayor en transformantes que tienen una secuencia de ADN de fórmula B-Pg-A fusionada a proteína protectora que en transformantes que tienen una secuencia de ADN no modificada de proinsulina fusionada con una proteína protectora. Las células transformadas con un vector que contiene la secuencia de ADN de la proinsulina no fusionada o de la proinsulina modificada no fusionada con sitio consenso de N-glicosilación dan un rendimiento muy bajo o ninguno en absoluto de insulina inmunorreactiva, medido por el método RIA.
Por lo tanto, la introducción del sitio consenso de N-glicosilación en una región ligante que no forma parte de una molécula de insulina madura aumenta notablemente la expresión en células fúngicas transformadas con la secuencia de ADN que codifica dichos precursores de insulina fusionados. La proteína fusionada y la proinsulina pueden ser procesadas en el organismo hospedador mismo o ser eliminadas por una escisión enzimática o química posterior.
La secuencia de ADN codificante de dicho precursor de insulina modificado puede ser preparada por síntesis oligonucleotídica de toda la secuencia de ADN en combinación con PCR o por mutagénesis in vitro. La secuencia de ADN puede ser también optimizada en cuanto a codones para expresión en un organismo adecuado, preferiblemente una cepa fúngica.
La invención se relaciona también con un procedimiento para la preparación de insulina cultivando células adecuadas, preferiblemente células fúngicas, transformadas con un vector que contiene una secuencia de ADN codificante de un precursor de insulina de fórmula B-Pg-A en un medio de cultivo adecuado.
La expresión y la secreción del péptido de la fórmula anterior pueden conseguirse usando un vector en el cual la secuencia codificante es regulada por un promotor, una secuencia señal y un finalizador funcional en un organismo adecuado. Por ejemplo, puede ser P_{glaA} y una secuencia señal del gen glaA o una parte del mismo adecuada para la expresión en Aspergillus sp. (Cullen y col., Biotechnology, 5 (1987), 369-376). La expresión y la secreción del péptido pueden ser también conseguidas usando un vector de expresión en el cual se fusiona la secuencia de ADN codificante del precursor de insulina de la fórmula anterior con el gen de una proteína protectora mediante una señal de procesado (Ward y col., Biotechnology, 8 (1990), 435-440; Broekhuijsen y col., J. Biotech., 31 (1993), 135-145) o un sitio de escisión química.
La Fig. 1 muestra una secuencia de nucleótidos tanto del gen de proinsulina natural como del optimizado en codones y una secuencia correspondiente de aminoácidos usando abreviaturas convencionales para nucleótidos y aminoácidos.
La Fig. 2 describe dos tipos de cassettes de expresión del gen de proinsulina humano y muestra esquemáticamente el gen de proinsulina humano y el gen mutante que tiene un sitio consenso de N-glicosilación.
La Fig. 3 explica la estrategia de construcción del gen de proinsulina humano y del gen mutante que contiene un sitio consenso de N-glicosilación para dos tipos de cassettes de expresión a través de fragmentos sintetizados por separado por ``oligonucleótidos solapantes en combinación con PCR''.
La Fig. 4 muestra 14 oligonucleótidos diseñados para la síntesis del gen de proinsulina humano y del gen mutante que contiene un sitio consenso de N-glicosilación.
La Fig. 5 explica, en el ejemplo de la síntesis del fragmento I, la nueva aproximación que se usó para la síntesis del gen de proinsulina humano usando oligonucleótidos complementarios solapantes en combinación con PCR.
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La Fig. 6 muestra esquemáticamente la síntesis del fragmento IV (los oligonucleótidos están indicados sólo por flechas).
La Fig. 7 muestra esquemáticamente la síntesis del fragmento II, del fragmento III y del fragmento V (los oligonucleótidos están indicados sólo por flechas).
La Fig. 8 muestra la construcción de los plásmidos pPZG301, pPZG302, pPZG303, pPZG304 y pPZG305.
La Fig. 9 muestra la construcción de los plásmidos pPZG311 y pPZG312.
La Fig. 10 muestra la construcción de los vectores de expresión fúngica filamentosos para la expresión de cassettes de tipo I.
La Fig. 11 muestra la construcción de los vectores de expresión fúngica filamentosos para la expresión de cassettes de tipo II.
La Fig. 12 muestra la secuencia de la unión GlaG2 del gen glaA.
Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis del gen de proinsulina humano y del gen mutante que contiene un sitio consenso de N-glicosilación por oligonucleótidos solapantes en combinación con la reacción en cadena de polimerasa (``PCR'') a) Metodología
Se hicieron todos los experimentos de manipulación de ADN usando métodos estándar de biología molecular según se describe en Maniatis, T. y col., ``Molecular Cloning, A Laboratory Manual'', Cold Spring Harbor Laboratory, EE.UU. (1982).
Todos los agentes químicos, enzimas y plásmidos, a menos que se indique algo diferente, pueden ser adquiridos de diversas fuentes comerciales. Los tampones y las condiciones de reacción para las digestiones con endonucleasas restrictivas fueron usados según las recomendaciones del fabricante, a menos que se indique algo diferente.
La síntesis química de oligonucleótidos fue realizada, bajo pedido, por ``ISOGEN Bioscience'', Amsterdam, Países Bajos. Las muestras de ADN fueron suministradas en forma liofilizada como sales sódicas con grupos hidroxilo libres en los extremos 5' y 3'. Dicho ADN fue disuelto en H_{2}O MQ estéril. La concentración de oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla fue determinada midiendo la absorbancia a A_{260}. Las muestras de oligonucleótidos de ADN disueltos fueron guardadas a -20ºC.
Se realizó la reacción en cadena de polimerasa, también indicada como PCR, por medio de un aparato de Perkin Elmer Cetus (761 Main Ave., Norwalk CT 06859) y con el Kit de Reactivos para Amplificación de ADN GeneAmp^{TM} con ADN Polimerasa Taq Recombinante AmpliTaq^{TM}. Las soluciones concentradas y las mezclas de reacción fueron preparadas según el ``Protocolo para Amplificación de ADN de Perkin Elmer Cetus'' según las recomendaciones del fabricante, con la excepción de que, en la mezcla de reacción, no había ADN plantilla, sino sólo oligonucleótidos en una concentración de 100 pmol por reacción (100 \mul). El perfil de ciclos de temperatura para cada PCR era: temperatura de fusión 94ºC/1 min, temperatura de hibridación 40ºC/1 min (para los fragmentos I y IV) o 50ºC/1 min (para los fragmentos II, III y V), temperatura de polimerización 72ºC/1 min. Hubo 25 ciclos. Después del último ciclo, se prolongó el tiempo de polimerización 7 minutos para completar la polimerización de todas las cadenas. A continuación, se enfrió la muestra a 4ºC. Se aislaron los productos de la PCR de la mezcla de reacción por dos etapas de extracción con cloroformo. Se precipitó entonces el ADN con isopropanol, se secó a vacío y se disolvió en 50 \mul de tampón TE.
Se usó la bacteria E. coli K12, JM109 (Yanish-Perron y col., Gene, 33 (1985), 103-119) en los experimentos de transformación y amplificación de los plásmidos. La transformación y la electroporación de E. coli fueron realizadas según métodos previamente descritos (Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166 (1983), 557-580; Biorad Genepulser).
Diseño de oligonucleótidos
Se derivó el gen de proinsulina humano sintético de la secuencia publicada del gen de insulina humano (Bell y col., Nature, 284 (1980), 26-32). Habría que señalar que, cuando se sintetiza el gen, se pueden hacer ciertas modificaciones: es posible usar varios codones, en la mayor parte de los casos preferidos, para introducir secuencias de ADN funcionales adicionales y sitios de restricción con objeto de permitir una ligación con vectores de expresión para cambiar uno o más codones de una región codificante para producir un polipéptido estructuralmente modificado, aún con substancialmente la misma actividad o utilidad.
En la presente invención, se modificó el gen de proinsulina humano sintético para expresión en hongos. Se usaron los codones más frecuentemente utilizados del gen de glucoamilasa G1 del hongo filamentoso A. niger, que se expresa en grandes cantidades (Boel y col., EMBO J., 3 (1984), 1097-1102; Nunberg y col., Mol. Cell. Biol., 4 (1984), 2306-2315), y eran en la mayoría de los casos los mismos que los codones humanos, excepto en algunas regiones, en las que eligiendo codon preferido el oligonucleótido se volvía muy rico en nucleótidos CG, lo que causaría problemas en la secuenciación y posiblemente incluso en la PCR. Por lo tanto, se cambiaron algunos codones, mayormente de Gly, de GGC a GGT, que es el segundo codon de Gly preferido en el gen de glucoamilasa del hongo filamentoso A. niger (Fig. 1).
Se introdujeron en el extremo 5' del gen de proinsulina sintético secuencias de ADN adicionales codificantes de 18 aminoácidos del péptido señal del gen de glucoamilasa (glaA) o de 6 aminoácidos del propéptido del gen glaA que contienen el sitio de escisión proteolítica Lys-Arg con objeto de posibilitar la construcción de dos tipos de cassettes de expresión. En el primer caso (I) se reguló el gen de proinsulina humano sintético por medio del promotor de glucoamilasa (p_{glaA}) y de la secuencia señal (ss_{glaA}) del gel de glucoamilasa, mientras que, en el segundo caso (II) se fusionó el gen de proinsulina con la totalidad del gen glaA del hongo filamentoso A. niger por medio de un péptido espaciador que contiene una señal procesadora de proteína de tipo KEX-2 bajo el control de p_{glaA} (Fig. 2 y Fig. 12).
Se preparó también un mutante del gen de proinsulina humano sintético portador del sitio consenso de N-glicosilación para estudiar la influencia sobre los niveles de expresión y secreción. Como el péptido C no es esencial para la función de la insulina, ya que se escinde en el proceso de secreción, se introdujo una mutación en la región codificante del péptido C del gen de proinsulina humano (BCA). Se preparó un mutante (BPgA) portador de un sitio consenso de N-glicosilación AsnXSer cambiando el codon GCC para el aminoácido Ala-C20 por el codon AAC para el aminoácido Asn (Fig. 2).
Para la síntesis del gen de proinsulina humano, se introdujo una nueva aproximación, donde se usaron oligonucleótidos complementarios solapantes en combinación con PCR. El principio del método era usar, durante la PCR, dos oligonucleótidos complementarios solapantes medios simultáneamente como plantilla y cebadores, permitiendo así a la ADN polimerasa Taq ``aumentarlos'', es decir, alargarlos durante el primer ciclo. En el segundo ciclo, dichos oligonucleótidos ``aumentados'' se solapan con el oligonucleótido 3' o 5' vecino, permitiendo así a la ADN polimerasa Taq ``aumentar adicionalmente'' oligonucleótidos medios ya ``aumentados''. De esta forma, la ADN polimerasa Taq rellena realmente los huecos entre oligonucleótidos solapantes químicamente sintetizados y crea una doble hélice de ADN. La síntesis del gen de proinsulina humano y su mutante que contiene un sitio consenso de N-glicosilación fue realizada en fragmentos, que fueron sintetizados por separado por PCR. La escisión de los genes en fragmentos fue posible gracias a la presencia de dos sitios de escisión para la enzima de restricción PstI en la región codificante del péptido C (Fig. 3). Se diseñaron catorce oligonucleótidos: diez oligonucleótidos (B3, B4, B5, B6, C1, C2, C3, A1, A2 y A3) fueron deducidos de la secuencia codificante de ADN de la proinsulina humana con codones preferidos para la expresión en el hongo filamentoso A. niger, dos oligonucleótidos (B1 y B2) fueron diseñados para la introducción de la secuencia señal del gen glaA y sitios de restricción adicionales para hacer posible la ligación en vector de expresión de tipo I, un oligonucleótido (B7) fue diseñado para la introducción de la región espaciadora de la secuencia del gen glaA (G2) y sitios de restricción adicionales para hacer posible la ligación con vector de expresión de tipo II y un oligonucleótido (C4) fue diseñado para la introducción de mutación portador de sitio consenso de N-glicosilación (Fig. 4).
b) Síntesis por PCR de los fragmentos I-V
Fragmentos I y IV
Los fragmentos I y IV fueron sintetizados ``paso a paso''. En la primera etapa de la PCR, se llevó a cabo una reacción con los oligonucleótidos B3 y B4, dando lugar al producto B3/B4. En el siguiente ``paso'', se mezcló 1 \mul del producto B3/B4 en la mezcla de reacción de PCR con: a) oligonucleótidos B2 y B4 para el fragmento I y b) oligonucleótidos B7 y B5 para el fragmento IV. Se obtuvieron los productos B2/B3/B4/B5 y B7/B3/B4/B5. En el tercer ``paso'', se usó 1 \mul del producto B2/B3/B4/B5 para la PCR con los oligonucleótidos B1 y B6 para el fragmento I y se mezcló 1 \mul del producto B7/B3/B4/B5 en la mezcla de PCR con los oligonucleótidos B7 y B6 para el fragmento IV. Se obtuvieron los productos de PCR B1/B2/B3/B4/B5/B6 y B7/B3/B4/B5/B6. Su tamaño se correspondía con el esperado y los productos fueron digeridos con enzimas de restricción apropiadas, dando como resultado el fragmento I y el fragmento IV (Figs. 5 y 6).
Fragmentos II, III y V
Se sintetizaron los fragmentos II, III y V en un ``paso''. Se llevó a cabo al PCR con los oligonucleótidos: a) C1, C2, C3; b) A1, A2, A3, y c) C2, C4, C5. Los productos de PCR C1/C2/C3, A1/A2/A3 y C1/C4/C3 eran del tamaño esperado y fueron digeridos con enzimas de restricción apropiadas, dando como resultado el fragmento II, el fragmento III y el fragmento V (Fig. 7).
Clonación de los fragmentos sintetizados por PCR en el vector pUC19 y análisis de la secuencia de ADN
Se digirió el plásmido pUC19 con las enzimas de restricción: a) PstI, b) PstI/EcoRI y c) PstI/SalI y se ligó con fragmentos I-V apropiados, dando lugar a los plásmidos pPZG301, pPZG302, pPZG303, pPZG304 y pPZG305 (Fig. 8). Con estos plásmidos, se transformó la bacteria E. coli JM109. Se aisló ADNp de los transformantes obtenidos por ``minipreparación'' y se analizó con enzimas de restricción. Se hicieron crecer transformantes de E. coli que contenían los plásmidos correctos, se aisló su ADNp por medio de una columna ``QUIAGEN typ 20'' y se secuenció con el ``kit SEQUENASE® Versión 2.0''. Se usaron los vectores que llevaban una secuencia correctamente sintetizada e insertada para otras construcciones.
pPZG311 y pPZG312
Se construyeron vectores portadores del gen completo de la proinsulina humano y del gen mutante con sito consenso de N-glicosilación con la secuencia señal del gen glaA como sigue: se construyó pPZG311 por ligación del fragmento EcoRI- PstI de 173 pb aislado de pPZG301, el fragmento PstI-PstI de 75 pb aislado de pPZG302 y el fragmento PstI-SalI de 74 pb aislado de pPZG303 en el vector pUC19 digerido con EcoRI/SalI. Se construyó pPZG312 por ligación del fragmento EcoRI- PstI de 173 pb aislado de pPZG301, el fragmento Pst-PstI de 75 pb aislado de pPZG305 y el fragmento PstI-SalI de 74 pb aislado de pPZG303 en el vector pUC19 digerido con EcoRI/SalI (Fig. 9).
Ejemplo 2 Construcción del vector de expresión fúngico filamentoso I. Cassette de expresión de tipo I
pAN52-7NotBCA y pAN52-7NotBPgA
Se digirió pAn52-7NotuidA (Verdoes y col., Gene (1994), en impresión) parcialmente con NcoI y SalI. Se aisló un fragmento SalI-NcoI de 7,55 kb portador del promotor glaA y de la región de finalización del gen trpC y se ligó con el fragmento Nco-SalI de 317 pb del plásmido pPZG311, dando lugar al plásmido pAN52-7NotBCA, y con el fragmento NcoI-SalI de 317 pb del plásmido pPZG312, dando lugar al plásmido pAN52-7NotBPgA (Fig. 10).
pAN52-7BCAamdS y pAN52-7BPgAamdS
Se ligó un fragmento NotI de 5,0 kb portador del gen de acetamidasa (amdS) de A. nidulans en el sitio NotI de los plásmidos pAN52-7NotBCA y pAN52- 7NotBPgA, dando lugar a los plásmidos pAN52-7BCAamdS y pAN52-7BPgAamdS (Fig. 10).
II. Cassette de expresión de tipo II
pAN56-7BCAamdS y pAN56-7BPgAamdS
Se construyeron vectores para la proteína fusionada glucoamilasa-proinsulina y para el mutante glucoamilasa-proinsulina con el sitio consenso de N-glicosilación como sigue: se digirió el plásmido pPZG304 con EcoRV y AlwNI. Se ligó el fragmento EcoRV-AlwNI de 25 pb portador de la secuencia para el espaciador de 6 aminoácidos con el fragmento SalI-EcoRV de 3,07 kb de pAN56-7 portador del gen glaA(G2), dando lugar al fragmento SalI-AlwNI. Se obtuvo el vector pAN56-7 del vector pAN56-4 (Broekhuijsen y col., J. Biotech., 31 (1993), 135-145), en donde se substituyó el promotor gpdA por el fragmento NotI-NcoI de 4,2 kb de pAN52-7 portador del promotor glaA y en donde se había eliminado el gen de interleukina, dejando el sitio EcoRV aguas arriba de GlaG2. Se ligó entonces el fragmento AlwNI-SalI con el fragmento HindIII-SalI de 10,6 kb de p-AB1-6S (Den Herder y col., Mol. Gen. Genet., 233 (1992), 404-410), que tiene el promotor glaA y el gen amdS, y con a) el fragmento AlwNI-HindIII de 1,06 kb de pAN52-7BCA, dando lugar al plásmido pAN56- 7BCAamdS, y b) el fragmento AlwNI-HindIII de 1,06 kb de pAN52-7BPgA, dando lugar al vector pAN56-7BPgAamdS (Fig. 11). En el espaciador, hay un sitio de procesamiento dibásico Lys-Arg. En la Fig. 12 se muestra la secuencia que existe alrededor del sitio de fusión del gen de glucoamilasa con el gen de proinsulina humano (BCA) y el mutante de proinsulina (BPgA) por medio de una región espaciadora.
Ejemplo 3 Transformación del hongo filamentoso Aspergillus niger
Se llevó a cabo la transformación del hongo filamentoso Aspergillus niger según métodos ya descritos (Goosen y col., Curr. Genet., 11 (1987), 499-503; Kelly y Hynes, Embo J., 4 (1985), 475-479; Van Hartingsveldt y col., Mol. Gen. Genet., 206 (1987), 71-75).
Se transformó el hongo filamentoso A. niger N402 (Bos, C.J. y col., Curr. Genet., 14 (1988), 437-443) con los vectores de expresión pAN52-7BCAamdS, pAN52-7BPgAamdS, pAN56-7BCAamdS y pAN56-7BPgAamdS. Se seleccionaron las colonias en medios de cultivo con acetamida o acrilamida como única fuente de carbono y de nitrógeno. Partiendo de esporas simples, se realizó un mayor análisis de los transformantes.
Ejemplo 4 Secreción de insulina humana al medio de cultivo 1. Cultivo de transformantes de A. niger portadores del gen de proinsulina humana y del gen mutante con el sitio consenso de N-glicosilación
Se inocularon aproximadamente 10^{8} esporas de transformantes seleccionados en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml de medio de cultivo líquido consistente en: NaNO_{3} 70 mM, KCl 7 mM, KH_{2}PO_{4} 11 mM, MgSO_{4} 2 mM, 4% de dextrina, elementos traza (1:1.000; ZnSO_{4} 76 mM, H_{3}BO_{3} 178 mM, MnCl_{2} 25 mM, FeSO_{4} 18 mM, CoCl_{2} 7,1 mM, CuSO_{4} 6,4 mM, Na_{2}MoO_{4} 6,2 mM, EDTA 174 mM) y vitaminas (1:1.000; 100 mg/L de tiamina, 100 mg/L de riboflavina, 100 mg/L de nicotinamida, 50 mg/L de piridoxina, 10 mg/L de ácido pantoténico, 0,2 mg/L de biotina). Se hizo crecer a los transformantes a 32ºC durante 36 horas. Se analizaron las muestras en cuanto a la presencia de insulina.
2. Expresión de la insulina
Se demostró la expresión de insulina humana inmunorreactiva por medio del kit ``INSULIN RIA 100 de Pharmacia'', Kabi Pharmacia Diagnostics. Se filtraron muestras de transformantes cultivados por fermentación, se neutralizaron los filtrados, se diluyeron en caso de ser necesario y se sometieron después a determinación por RIA (radioinmunoensayo) (Livessy y col., Clin. Biochem., 13 (1980), 151-55). En la Tabla 1, se muestra el nivel de expresión de insulina humana inmunorreactiva (mU/L) en transformantes de A. niger.
TABLA 1
Nivel de expresión de insulina humana inmunorreactiva en
diversos transformantes de A. niger
Transformante Plásmido Insulina inmunorreactiva (mU/L)
A. niger 7650 [NCAIM PAN52-7BCAamdS 0
(P) F 001215]
A. niger 7651 [NCAIM PAN52-7BPgAamdS 2
(P) F 001216]
A. niger 7649 [NCAIM PAN56-7BCAamdS 56
(P) F 001214]
A. niger 7638 [NCAIM PAN56-7BPgAamdS 776
(P) F 001213]
Se depositaron los transformantes A. niger 7650, A. niger 7651, A. niger 7649 y A. niger 7638 en la ``National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms'', H-1502 Budapest, P.O.B. 53, Hungría, el 8 de Julio de 1994 bajo los números de acceso NCAIM (P) F 001215, NCAIM (P) F 001216, NCAIM (P) F 001214 y NCAIM (P) F 001213 y según el Tratado de Budapest en el Depósito de Microorganismos con Fines de Procedimientos de Patentes, Declaración en el Caso de un Depósito Original, de acuerdo con la Norma 6.1.
Es evidente por la Tabla que existe una clara diferencia en la expresión de los transformantes que contienen diversos vectores. Con mucho, el mejor resultado corresponde a un transformante obtenido por transformación con un vector que tenía un gen de proinsulina humano portador del sitio consenso de N-glicosilación fusionado a la proteína glucoamilasa.

Claims (8)

1. Secuencia de ADN consistente en una secuencia codificante del precursor de insulina de fórmula B-Pg-A, donde B y A representan las cadenas B y A de la insulina humana, respectivamente, Pg representa el péptido C modificado o cualquier número de aminoácidos que contienen al menos un sitio consenso de N-glicosilación y Pg une las cadenas B y A por señales de procesamiento proteolítico o sitios de escisión química específicos.
2. Secuencia ADN consistente en una secuencia codificante del precursor de insulina de fórmula B(29)-Pg-A, donde B(29) representa los aminoácidos 1-29 de la cadena B de la insulina humana, A representa la cadena A de la insulina humana, Pg representa el péptido C modificado o cualquier número de aminoácidos que contienen al menos un sitio consenso de N-glicosilación y Pg une las cadenas B y A por señales de procesamiento proteolítico o sitios de escisión química específicos.
3. Secuencia de ADN según la reivindicación 1 ó 2 con codones preferidos para la expresión en hospedadores particulares.
4. Secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 fusionada a un gen de proteína protectora por medio de una región espaciadora portadora de una señal de procesamiento proteolítico o de un sitio de escisión química específico.
5. Células transformadas de un hospedador adecuado que contienen una secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Células fúngicas transformadas que contienen una secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Células fúngicas de Aspergillus sp. transformadas que contienen una secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. Un procedimiento para la preparación de insulina por cultivo de células adecuadas, preferiblemente células fúngicas, transformadas con un vector que contiene una secuencia de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
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