CZ20004533A3 - Utlumené pestiviry - Google Patents

Description

Utlumené pestiviry

Oblast techniky

Vynález popisuje způsob utlumení pestivirů deaktivací ribonukleázové aktivity (aktivity RNázy), která je uložena v glykoproteinu E^RNS. Vynález také popisuje pestiviry utlumené podle vynálezu, nukleové kyseliny vhodné pro přípravu takových pestivirů, vakcíny a farmaceutické kompozice, které obsahují v

utlumené pestiviry podle vynálezu. Vynález dále obsahuje * metody rozlišují utlumené viry podle vynálezu a patogenní viry.

Dosavadní stav techniky

Pestiviry jsou kauzativní agens ekonomicky významných onemocnění zvířat v mnoha zemích po celém světě. V současné době známé virové izoláty se dělí do tří různých druhů, které společně tvoří jeden rod v čeledí Flaviviridae.

I. Virus bovinní virové diarery (BVDV) způsobuje bovinní virové průjmové (BVD) a onemocnění sliznic (MD) u telat (popisuje se v publikaci Baker, 1987; Moenning and Plagemann, 1992, Thiel et al., 1996).

II. Virus klasické prasečí horečky (CSFV), který se nazývá virus cholery suis (CSF), odpovídá za klasickou prasečí _f horečku (CSF) nebo choleru suis (HC) (popisuje se v publikaci Moenning and Plagemann, 1992; Thiel et al., r 1996).

III. „Border disease virus (BDV) se v typickém případě vyskytuje u ovcí a způsobuje „Border disease (BD) . Uvádí se, že symptomy podobné MD u telat se také objevují po intrauterinní infekci u jehňat s BDV (popisuje se v publikacích Moennig and Plagemann, 1992, Thiel et al. , 1996).

Za použití jiné klasifikace se pestiviry popisují v publikaci Becher , P., Konig, M., Paton, D.J., Thiel, H. J., 1995, Futher characterization of border disease virus isolates: evidence for the presence of more than three species within the genus pesivirus. Virology 209 (1), 200-206 nebo v jiných publikacích.

Pestiviry jsou malé viry s obalem a s genomem tvořeným jednořetězovou RNA pozitivní polarity, které chybí sekvence čepičky na 5'-konci a 3'poly(A). Virový genom kóduje , polyprotein, který obsahuje přibližně 4 000 aminokyselin, přičemž úpravami pří a po translaci vzniká konečný produkt štěpení. Uvedené postupy zahrnují buněčné a virové proteázy. Virové proteiny se uspořádaly do polyproteinu za účelem vzniku NH₂-H^pr°-C-E^RNS-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH (popisuje se v publikaci Rice, C.M. 1996. The pestiviruses. In Fields Virology, eds. Fields, B.N., Knipe, D. M. , and Howley, P. M. (Lippincott-Raven, Philadelphia), pp. 931-959). Protein

C a glykoproteiny E^RNS, El a E2 reprezentují strukturální komponenty pestivirových virionů (Thiel, H. Jstark, R., Weiland, E., Rumenapf, T. and Meyers, G. 1991. Hog cholera virus: molecular composition of virions from a pestivirus. J. Virol. 65: 4705-4712.31). Zjistilo se, že E2 a v menším rozsahu E^RNS tvoří cíle neutralizačních protilátek (popisuje se v publikaci Donis, R. 0., Corapi, W., and Dubovi, E.J. 1988.

# Neutralízing monoclonal antibodies to bovine víral diarrhea virus bind to the 56K to 58K glycoprotein. J. Gen. Virol. 69:

^Λ 77-86, Paton, D.J., Lowings, J.P., Barrett, A.D. 1992. Epitop mapping of the gp53 envelope protein of bovine viral diarrhea virus. Virology 190: 763-772, van Rijn, P.A., van Gennip,

H.G., de Meijer, E. J., Moormann, R. J. 1993. Epitope mapping of envelope glycoprotein El of hog cholera virus strain Brescia. J. Gen. Virol. 74: 2053-2060, Weiland, E., Stark, R., Haas, B., Rumenapf, T., Meyers, G. and Thiel, H. J. (1990). Pestivirus glykoprotein which induces neutralízing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer. J. Virology 64, 3563-3569).

Glykoproteinu E^RNS chybí membránová kotva a vylučuje se v podstatném množství z infikovaných buněk. Uvádí se, že uvedený protein vykazuje aktivity RNázy (popisuje se v publikaci Hulst, Μ. Μ. , Himes, G., Newbigin, E., Moorraann, R. J. M. 1994. Glycoproteín E2 of classical swine fever virus: expression in insect cells and identífication as a ribonuclesa. Virology 200: 558-565, Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. Schneider-Scherzer, and H. J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoproteinn of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171, Windish, J. M., Schneider, R., Stark, R. , Weiland, E., Meyers, G. and Thiel, H.J. 1996. Rnase of classical swine fever virus: biochemical characterization and inhibition by virus-neutralizing monoclonal antibodies. J. Virol. 70: 352-358). Funkce uvedené enzymatické aktivity ve virovém životním cyklu nejsou známy. V případě vakcinačního kmene CSFV dochází k experimentálnímu poškození RNázy místně řízenou mutagenezí a vede ke vzniku cytopatogenního viru, který vykazuje růstové charakteristiky v buněčné kultuře shodné s virem divokého typu (popisuje se v publikaci Hulst, M.M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoproteín E^ms of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151157). Enzymatická aktivita závisí na přítomnosti dvou pruhů aminokyselin, které jsou konzervativní mezi pestivirem E^RNS a různými RNázami rostlinného nebo fungálního původu. Obě uvedené konzervativní sekvence obsahují histidinový zbytek (popisuje se v publikaci Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. Schneider-Scherzer, and H. J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoproteinn of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171).). Záměna každého z těchto zbytků v proteinu E^RNS vakcinačního kmene CSFV za lyzin vede • · · k destrukci aktivity RNázy (popisuje se v publikaci Hulst, M.M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E^ms of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157). Zavedení těchto mutací do genomu vakcinačního kmene CSFV neovlivňuje schopnost viru nebo jeho růstové vlastnosti, ale vede to ke vzniku viru, který vykazuje slabě cytopatogenní fenotyp (popisuje se v publikaci Hulst, M.M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E^ms of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157).

Vackiny obsahuji utlumené a usmrcené viry nebo virové proteiny exprimované v heterogenních expresívních systémech, které se vytvořily pro CSEV a BVDV a v současné době se používají. Strukturální základ utlumení těchto virů, ktreé se používají jako živé vakcíny není znám. To vede k nebezpečí nepředpokládaných revertantů vznikajících zpětnou mutací nebo rekombinací, k čemu může dojít po vakcinaci. Na druhé straně účinnost deaktivovaných vakcín nebo heterologně exprimovaných virových proteinů (podjednotkové vakcíny) při indukci imunity je spíše nízká.

V obecném případě živé vakcíny s definovanými mutacemi, * jako základ pro utlumení, umožní obejít nevýhody vytvoření vakcín. Potencionální cíle tlumících mutací u pestivirů nejsou v současné době dostupné. Další výhodou uvedených tlumících mutací je jejich molekulová jedinečnost, která umožňuje je použít jako jednoznačné značení v případě utlumených pestivirů a ty se odlišují od obecných pestivirů.

Vzhledem k důležitosti účinnosti a bezpečnosti stejně jako detekovatelné profylaxe a léčbě pestivirových infekcí existuje nutnost vytvořit živé a specificky utlumené vakcíny s vysokým • · · · · · · • · · · · ··· •·· » * ······· · potencionálem indukce imunity stejně jako nutnost definovat základy utlumení, které utlumené viry odlišují od patogenních pestivirů.

Proto základní řešený problém uvedeného vynálezu je vytvořit specifiky utlumené a detekovatelně značené pestiviry vhodné při použití jako živé utlumené vakcíny s vysokou účinností při indukci imunity, což jako výsledek této metody je odlišuje od patogenních obecných pestivirů.

Podstata vynálezu

Řešení shora uvedeného technického problému se dosáhne popisem a provedením vynálezu charakterizované v nárocích.

Překvapivě se zjistilo, že pestiviry se mohou specificky tlumit deaktivací aktivity RNázy obsažené v glykoproteinu E^.

Utlumené pestiviry tedy poskytují živé vakcíny s vysokou imunogenicitou.

Utlumené pestiviry tvoří živou vakcínu obsahující pestivirus, kde se deaktivuje aktivita RNázy zahrnutá v glykoproteinu E^RNS

Termín „vakcína” znamená farmaceutickou kompozici obsahující alespoň jeden imunologicky aktivní komponent, který indukuje imunologickou odezvu u zvířat a je možné nikoli nezbytné použít jeden nebo více dalších komponentů, které zesilují imunologickou aktivitu uvedeného aktivního komponentu. Vakcína může dále obsahovat další komponenty, které jsou typické pro farmaceutické kompozice. Imunologicky aktivní komponent vakcíny může obsahovat celý živý organizmus buď v jeho původní formě nebo jako utlumené organizmy v tak zvané upravené živé vakcíně (MLV) nebo v organizmech deaktivovaných vhodnými metodami v tzv. mrtvých vakcínách • φ * « · # · · · φφφ · · · · φ φ · · * • · · · φ φ φ * · * (KV). V jiné formě imunologicky aktivního komponentu vakcíny mohou být obsaženy vhodné elementy uvedených organizmů (podjednotkové vakcíny), přičemž jejich elementy se tvoří buď porušením celého organizmu nebo kultivací kultury uvedených organizmů a následnými kroky čištění, které vedou ke vzniku požadované struktury nebo vhodnou manipulací podobného vhodného systému, přičemž použití není omezeno na bakterie, hmyz nebo jiné druhy a následnou izolaci a čištění nebo indukci uvedeného syntetického postupu u zvířete nebo vytvoření vakcíny přímým zavedením genetického materiálu za použití vhodných farmaceutických prostředků (polynukleotidová vakcína). Vakcína může obsahovat jeden nebo současně více elementů, které se popisují shora v textu.

Další komponenty pro zvýšení imunitní odezvy jsou konstituenty, které se běžně nazývají adjuvans, jako je například hydroxid hlinitý, minerální nebo jiné oleje nebo podpůrné molekuly přidané do vakcíny nebo vytvořené v těle po indukci takovými dalšími komponenty, kterými jsou například interferony, interleukiny nebo růstové faktory.

Termín „farmaceutický prostředek v podstatě obsahuje jeden nebo více ingrediencí schopných modifikovat fyziologické například imunologické funkce organizmu. Tento prostředek se aplikuje do živého organizmu nebo na jeho povrch. Mohou to být například antibiotika nebo antiparazitika stejně jako konstituenty k ním přidané za účelem dosáhnout jiných jevů, jako jsou znaky zpracování, sterility, stability, možnosti aplikace prostředku enterální nebo parenterální cestou, jako je orální, intranasální, intravenózní, intramuskulární, podkožní, intradermální nebo jinou vhodnou cestou, tolerance po aplikaci a řízené uvolněné vlastnosti.

Vakcína podle vynálezu znamená vakcínu popsanou shora v textu, kde jeden imunologicky aktivní komponent je pestivirus nebo je pěstivirového původu.

Termín „živá vakcína znamená vakcínu obsahující živý zvláště pak živý virový aktivní komponent.

Termín „pestivirus znamená všechny pestiviry charakterizované tím, že patří do stejného rodu jako BVDV, CSFV a BDV v čeledi Flavíviridae a exprimují glykoprotein E^RNS. Uvedený termín samozřejmě také znamená všechny pestiviry, jak se popisují v publikaci Becher et al., (1995) nebo jiné, které exprimují glykoprotein E^RNS. Termín „aktivita RNázy znamená schopnost glykoproteinu E^RNS hydrolyzovat RNA.

Je nutné poznamenat, že termín „glykoprotein EO se často používá současně s glykoproteinem E^, jak se popisuje v uvedených publikacích.

Termín „deaktivace RNázové aktivity nacházející se v uvedeném glykoproteinu znamená neschopnost nebo omezenou schopnost upraveného glykoproteinu E^ hydrolyzovat RNA, což se porovnává s nemodifikovaným divokým typem uvedeného glykoproteinu E^RNS.

Deaktivace RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS se může dosáhnout delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu, jak se uvádí zde a v publikaci Hulst, M.M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E^ms of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151157). V preferovaném provedení vynálezu se popisují živé vakcíny, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

• · · · · · · ··· • ····· ·«···«· · · • · · · · ··· «···· ·· · ·♦ ···

Ukázalo se, že glykoprotein E^RNS tvoří homodimér vázaný na disulfid o molekulové hmotnosti 97 000, kde každý monomér obsahuje 227 aminokyselin, které odpovídají aminokyselinám 268 až 494 polyproteinu CSFV, jak se popisuje v publikaci Rumenapf et al. (1993). Prvních 495 aminokyselin exprimovaných Alfortovým kmenem CSFV je zobrazeno na obrázku č. 1. Genomová sekvence Alfortova kmene CSFV je dostupná v GenBank/knihovna dat EMBL s číslem uložení J04385. V jiném případě aminokyselinová sekvence v případě kmene CP7 BVDV se může najít v GenBank/knihovně dat EMBL (s číslem uložení U63479) . Dvě oblasti aminokyselin jsou v glykoproteinu E^RNS vysoce konzervativní stejně jako v některých rostlinných a fungálních proteinech, které vykazují RNázovou aktivitu (popisuje se v publikaci Schneider, R. , G. Unger, R. Stark, E. SchneiderScherzer, and H. J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoproteinn of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171). Tyto dvě oblasti jsou zvláště důležité pro RNázovou enzymatickou aktivitu. První oblast obsahuje oblast aminokyselin v polohách 295 až 307 a druhá oblast obsahuje aminokyseliny v poloze 338 až 357 uvedeného virového proteinu, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě Alfortova kmene CSFV (číslování se provádí podle publikované dedukované aminokyselinové sekvence Alfortova kmene CSFV (popisuje se v publikaci Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H.J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567). Aminokyseliny, které jsou důležité při RNázové aktivitě, jak se uvádí shora v textu, nejsou žádným způsobem omezeny na přesné polohy, jak se definuje v případě Alfortova kmene CSFV, ale používají se jednoduchým způsobem, aby se ukázalo, že preferované aminokyseliny jsou v uvedené poloze nebo odpovídají aminokyselinám v uvedené poloze jiných kmenů jak je možné zjistit v obecném případě u BVDV, BDV a pestivirů, protože jsou vysoce konzervativní. V případě pestivirů, které • · ··· ·· · * · · · · « · · · *· ···· ·· · ····· ·····«· · · • · · · · ·· ··· jsou jiné než Alfortův kmen CSFV, číslování poloh preferovaných aminokyselin se často liší, ale odborník v oboru molekulární biologie pestivirů jednoduše identifikuje tyto preferované aminokyseliny na základě jejich polohy vztažené vůči vysoce konzervativním aminokyselinám uvedeného glykoproteinu. V jednom určitém nelimitujícím příkladu je poloha CSFV Alfort 346 identická s polohou 349 kmene cp7 BVDV.

Vynález popisuje ve více preferovaném provedení vynálezu vakcínu podle vynálezu, kde uvedené deaktivující delece a/nebo mutace se nacházejí v aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě CSFV Alfortova kmene nebo odpovídá polohám aminokyselin uvedeného glykoproteinu v jiných kmenech.

Ve velmi preferovaném provedení vynálezu se uvádí, že deaktivace uvedené RNázové aktivity deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346 uvedeného glykoproteinu vede ke vzniku zvláště použitelné živé vakcíny. Vynález dále popisuje vakcíny podle vynálezu, kde RNázová aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. Iv případě CSFV Alfortova kmene.

Vynález demonstruje, že pestiviry jsou dostupné a kódují protein E^RNS bez RNázové aktivity, v případě, že se deletuje histidinový zbytek v poloze 346 virového polyproteinu (číslování se provádí v souladu s publikovanou sekvencí CSFV Alfort/Tubingen (popisuje se v publikaci Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H.J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567), který reprezentuje jeden z konzervativních zbytků putativního místa E^RNS RNázy. Vynález dále popisuje, že delece histidinu v proteinu E^RNS pestivirů BVD (v poloze 349, číslováno v souladu se sekvencí BVDV CP7 GenBank/EMBL (číslo uložení U63479) vede ke vzniku dostupného viru, kde glykoprotein E^RNS ztratil RNázovou aktivitu. Na rozdíl od bodových mutací, kde dochází k záměna jedné aminokyseliny za jinou, deleční mutanti jsou v obecném případě daleko stabilnější s ohledem na revertanty. Infekce prasat mutantem patogeního kmene CSFV Alfort/Tubingen exprimujícím E^ s touto delecí nevede k horečce ani k jiným typickým klinickým příznakům infekcí CSFV, zatímco infekce virem divokého typu způsobuje horečku, průjem, anorexii, apatyi, depleci B-buněk a poruchy centrálního nervového systému. Tyto prasata se usmrtila 14 dní po inokulaci ve fázi umírání, kdy se objevilo silné krvácení kůže a v nitřních orgánů. Infikovaná prasata nevykazují ani viremii ani depleci B-buněk, jak se ukázalo v testech porvedených 3., 5., 7., 10. a 14 den po infekci, zatímco CSFV se jednoduše izolovaly ze vzorků krve získaných z prasat inokulovaných virem divokého typu. Deleční mutant se zjevně replikuje ve zvířatech, jak se indikuje indukcí neutralizujících protilátek (popisuje se v příkladu 3, tabulka č. 3c) . Imunní odezva na mutantní virus je dostatečná, aby umožnila přežít smrtelnou dávku 2xl0⁵ TCID50 vysoce patogenní infekce kmenem CSFV Eystrup (Konig, 1994), který je heterologní s kmenem Alfort. Testovaná zvířata nevykazují typické klinické příznaky infekce CSFV, jako je horečka, průjem, krvácení, deplece B-buněk nebo anorexie, po opakované infekci. Tato data demonstrují, že infekce prasat s delečními mutanty indukuje imunitní odezvu dostatečnou pro ochranu proti přísné vakcinaci.

V nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují vakcíny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivovala delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort.

V dalším preferovaném provedení vynálezu se popisuje BCDV vakcíny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se

deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. Iv případě kmene CSFV Alfort.

V jiném provedení vynálezu se popisují utlumené pestiviry, kde RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^RNS se deaktivuje delecí a/nebo mutací alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu s podmínkou, že aminokyseliny v polohách 297 a/nebo 346 uvedeného glykoproteinu, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě CSFV, nejsou lyzin. Rekombinantní pestivirus, kde aminokyseliny v poloze 297 a/nebo 346 uvedeného glykoproteinu jsou lyzin, se popisují v publikaci Hulst, M.M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E^ras of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151157. Tyto zvláštní pestiviry demonstrovaly cytopatické účinky v ledvinových buňkách prasat. Až do dnešního dne nedošlo ke zhodnocení nových tlumících rysů způsobených deaktivací enzymatické aktivity proteinu E^RNS.

V preferovaném provedení vynálezu popisuje pestiviry podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi provedenými na aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě CSFV Alfortova kmene.

« Ve více preferovaném provedení vynálezu se popisují pestiviry podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. Iv případě kmene CSFV Alfort.

V nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují pestiviry, kde RNázová aktivita je potlačena delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se popisuje na obrázku č. Iv případě kmene CSFV Alfort.

• ··· · · · · • ···· ·· · •·· · · ······· · · • · · · · » · ····· ·· · ·· · · *

V dalším nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují pestiviry BVDV, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. Iv případě CSFV Alfortova kmene.

Utlumené pestiviry a aktivní komponenty vakcín podle vynálezu se mohou jednoduše připravit rekombinantními metodami modifikace nukleové kyseliny, které vedou k expresi mutantní aminokyselinové sekvence v glykoproteinu E^RNS. Vynález dále popisuje nukleové kyseliny kódující glykoprotein E^RNS, kde RNázová aktivita obsažená v uvedeném glykoproteinu se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu s podmínkou, že aminokyseliny v poloze 297 a/nebo 346 glykoproteinu, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě CSFV Alfortova kmene, nejsou lyzin.

V preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi, které se nacházejí v aminokyselinách v poloze 296 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Ve více preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346,

jak se uvádí na obrázku č. 1	v případě	kmene CSFV Alfort nebo
odpovídá aminokyselinám	v jiných	kmenech	uvedeného
glykoproteinu.
V nejvíce preferovaném	provedení	vynálezu	se popisují

nukleové kyseliny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci histidinového zbytku v poloze 346, jak se ····· ··*···· « · • · · · · · · • · ·· · ·· ··· uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

V dalším nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny BVDV podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Nukleotidy například DNA nebo RNA je možné také použít při přípravě vakcín tvořených DNA, RNA nebo vektory. V těchto vakcínách se nukleotidy aplikují přímo do zvířete nebo nepřímo prostřednictvím vektorů, které v tomto případě nepochází z původního viru. Nukleotidové a vektorové vakcíny jsou dobře známy v oboru.

Dále vynález popisuje použití nukleových kyselin podle vynálezu vhodných pro přípravu nukleotidových a/nebo vektorových vakcín.

Vakcíny, utlumené pestiviry a nebo nukleové kyseliny podle vynálezu je možné zvláště použít při přípravě farmaceutického prostředku.

Dále vynález popisuje farmaceutické prostředky obsahující vakcínu podle vynálezu a/nebo pestivirus podle vynálezu a/nebo nukleotidovou sekvenci podle vynálezu. Jeden neomezující příklad takového farmaceutického prostředku se připravuje následujícím způsobem: supernatant infikované buněčné kultury se smíchá se stabilizátorem (například spermidin a/nebo BSA (albumin bovinního séra) a směs se následně lyofilizuje nebo dehydratuje jinými metodami. Před vakcinací se uvedená směs opětně hydratuje vodou (například fyziologickým roztokem, PBS (fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem)) nebo nevodnými roztoky (například emulzí, adjuvans založeným na hliníku).

Vynález se dále popisuje způsob tlumení pestivirů. Vynález dále popisuje jedinečnou a nepředvídatelnou metodu tlumení pestivirů charakterizovanou tím, že se deaktivuje RNázová aktivita v glykoproteinu E^RNS.

Specificky utlumené pestiviry je zvláště výhodné použít při přípravě vakcín. Vynález dále popisuje metody produkce specificky utlumených pestivirových vakcín charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita glykoproteinu E^RNS.

Deaktivace RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS poskytuje novou metodu detekovatelně značených pestivirů. Vynález dále popisuje metodu detekovatelného značení pestivirů charakterizovanou tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^. Nepřítomnost RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS pestivirů podle vynálezu nyní umožňuje detekovatelně značení uvedených pestivirů. Značené a neznačené pestiviry nebo E^RNS vylučované z buněk infikovaných pestivirem v tělních tekutinách se mohou jasně odlišit přítomností a nepřítomností RNázové aktivity glykoproteinu E^RNS po izolaci a testování uvedené enzymatické aktivity.

V případě pestivirů deaktivice jejich RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS delecí a/nebo mutací se může provést řadou jiných způsobů. Takové pestiviry se mohou jednoduše detekovat vzhledem ke struktuře vzniklé na základě takových delecí a/nebo mutací. Sekvenční rozdíl sekvence nukleové kyseliny změněného glykoproteinu E^RNS je detekovatelný sekvenováním nukleové kyseliny nebo metodou PCR, jak se popisuje v příkladu 8. Změněná proteinová sekvence se mohou detekovat specifickými monoklonálními protilátkami, které nerozeznávají nezměněné proteiny. Je také možné detekovat změněný a tím také strukturálně značené proteiny tím, že se naváží specifické monoklonální protilátky, které nerozeznávají nezměněné glykoproteiny E^RNS za podmínek, že se přítomnost pestivirů může stanovit jiným způsobem. Delece a/nebo mutace odstraňující RNázovou aktivitu u značených virů povede k různým imunitním odezvám u zvířat, kdy se porovnávají s odezvou, která je výsledkem infekcí neznačenými pestiviry.

Preferované provedení vynálezu popisuje metody utlumení pestivirů, způsoby produkce specificky utlumené pestivirové vakcíny a způsoby vhodné pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu, přičemž jde o metody vztahující se k deaktivaci glykoproteinu E^, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

Preferované provedení vynálezu popisuje metody utlumení pestivirů, metody produkce specificky utlumených pestivirových vakcín a metody vhodné pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu. Tyto metody souvisí s deaktivací glykoproteinu E^RNS, kde uvedené delece a/nebo mutace se provedly na aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 a/nebo 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Dále vynález popisuje způsoby utlumení pestivirů, metody produkce specificky utlumené pestivirové vakcíny a metod vhodných pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby se vztahují k deaktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Dále vynález popisuje způsoby utlumení pestivirů, metody produkce specificky utlumené pestivirové vakcíny a metody • · · ·· · »· • 0 · 0 · » · · · vhodné pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby se vztahují k deaktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci histidínového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Vynález dále popisuje vakcíny a/nebo jiné farmaceutické prostředky, které je možné částečně použít při profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat. Vynález dále popisuje metody použitelné při profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat charakterizovaných tím, že vakcína podle vynálezu nebo jiný farmaceutický prostředek podle vynálezu se aplikuje zvířeti, který potřebuje takovou profylaxi nebo léčbu.

Vynález dále popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^RNS.

Vynález dále popisuje způsob přípravy specificky značených pestivirů charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^RNS.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů a způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi aminokyselin v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 • »···· *······ · · • ·«·« ··· • · · · · ·· · ·· ··· až 357, jak se uvádí na obrázku č. Iv případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci a/nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci a/nebo mutací histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Vakcíny nebo jiné farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou použitelné při profylaxi a léčbě pestivirové infekce u zvířat.

Vynález popisuje použití vakcíny podle vynálezu při profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat. Dále vynález popisuje použití farmaceutického prostředku podle vynálezu vhodného pro profylaxi a léčbu pestivirových infekcí u zvířat.

Pestiviry a/nebo nukleové kyseliny podle vynálezu jsou použitelné aktivní komponenty farmaceutického prostředku nebo vakcíny. Vynález se proto popisuje použití pestivirů podle vynálezu a/nebo nukleové kyseliny podle vynálezu při přípravě vakcíny nebo farmaceutického prostředku.

Jak se popisuje shora v textu deaktivace RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS poskytuje novou metodu značení pestivirů.

Vynález dále popisuje způsoby vhodné pro rozlišení detekovatelně značených pestivirů podle vynálezu od neznačených a pravděpodobné patogenních pestivirů. Takové metody jsou zvláště použitelné při stanovení účinnosti značených pestivirů u zvířat. Prokázalo se, že zvíře, kterému se aplikovala vakcína, vykazuje, po získání vzorku z takového zvířete a testování, pozitivní značení. Neoznačená a specificky neznačená zvířata, které vykazují přítomnost pestivirů se mohou ihned oddělit, izolovat nebo usmrtit, aby se předešlo rozšíření patogenní infekce na další zvířata.

Vynález popisuje metodu detekovatelně značených pestivirů charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^RNS. Nepřítomnost RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS pestivirů podle vynálezu nyní umožňuje detekovatelně značení těchto pestivirů. Výsledné značené a neznačené pestiviry se mohou jasně odlišit přítomností nebo nepřítomností RNázové aktivity glykoproteinu E^rns na izolaci a testování takové enzymatické aktivity. Stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti této enzymatické aktivity na získání vzorku obsahující pestivirus nebo jeho materiál se může uskutečnit za použití standardních metod, jak se například popisuje v příkladu 2 nebo v publikaci Hulst, M. M., Himes, G., Newbigin, E., Moormann, R. J. M. 1994. Glycoprotein E2 of classical swine fever virus: expression in insect cells and identification as a ribonuclesa. Virology 200: 558-565.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob vhodný pro odlišení zvířat infikovaných pestivirem od zvířat

I « · • · ·

vakcinovaných specificky utlumeným pestivirem podle vynálezu, který obsahuje následující kroky:

(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se předpokládá pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení absence nebo přítomnosti RNázové aktivity glykoproteinu E^RNS v uvedeném vzorku, (3) korelace nepřítomnosti RNázové aktivity glykoproteinu E^RNS s vakcinovaným zvířetem a korelace přítomnosti uvedené aktivity s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete.

Vynález popisuje pestiviry, kde se deaktivovala jejich

RNázová aktivita v glykoporteinu E^RNS delecí a/nebo mutací. Takové pestiviry je možné jednoduše detekovat na základě jejich struktury, která vzniká uvedenými delecemi a/nebo mutacemi. Sekvenční rozdíl genu E^RNS, který kóduje změněný glykoprotein E^RNS, je detekovatelný sekvenační metodou nebo PCR. Vynález popisuje preferované provedení metody vhodné pro odlišení zvířat infikovaných pestivirem od zvířat, kterým se aplikovala vakcína se specificky utlumenými pestiviry podle vynálezu. Tato metoda zahrnuje následující kroky:

(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení nukleotidové sekvence pestivirového genomu nebo proteinu v uvedeném vzorku, (3) korelace delecí a/nebo mutací nukleotidové sekvence proteinu E^RNS přítomné ve vakcíně s vakcinovaným zvířetem a korelace nepřítomnosti uvedených delecí a/nebo mutací s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete.

Strukturální změny, které jsou výsledkem změněné proteinové sekvence glykoproteinu E^RNS pestivirů podle vynálezu, se mohou detekovat specifickými monoklonálními nebo polyklonálními protilátkami, které nerozeznávají nezměněné proteiny.

« » ···· · * » · · ♦ * ··· » *” · · · · • ····* «··*··· · «

0 · ♦ · · * · · ♦

Další provedení vynálezu popisuje způsob odlišení zvířat infikovaných pestiviry od zvířat vakcinovaných utlumeným pestivirem podle vynálezu, který zahrnuje kroky:

(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení modifikovaného glykoproteinu E^RNS utlumeného pestiviru specifickým navázáním monoklonálních nebo polyklonálních protilátek na glykoproteinu E^RNS přítomný v uvedeném vzorku, přičemž uvedené glykoproteiny se modifikovaly metodou podle vynálezu, přičemž uvedené monoklonální nebo polyklonální protilátky se nevážou na nemodifikované glykoproteiny E^RNS, (3) korelace specifického navázání uvedených monoklonálních nebo polyklonálních protilátek s vakcinovaným zvířetem a korelace nepřítomnosti protilátek, které se váží na pestivirovou infekci uvedeného zvířete za podmínky, že přítomnost pestivirového materiálu v uvedeném zvířeti a/nebo v uvedeném vzorku se stanoví jiným způsobem.

Je možné detekovat změněné a strukturálně značené proteiny pomocí neschopnosti vázat specifické nebo polyklonální protilátky, které rozeznávají pouze nezměněné glykoproteiny E^rns, přičemž přítomnost pestiviru se může stanovit jiným způsobem. V preferovaném provedení vynálezu se popisuje metoda pro odlišení zvířat infikovaných pestiviry od zvířat vakcinovaných utlumeným pestivirem podle vynálezu, který zahrnuje kroky:

(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení nemodifikovaného glykoproteinu E^ pestiviru specifickým navázáním monoklonálních nebo polyklonálních protilátek na glykoproteiny E^RNS přítomný v uvedeném vzorku, přičemž uvedené glykoproteiny se nemodifikovaly metodou podle vynálezu, přičemž uvedené monoklonální nebo • · · · s · β · « ·· *· polyklonální protilátky se nevážou na modifikované glykoproteiny E^RNS, (3) korelace specifického navázání uvedených monoklonálních nebo polyklonálních protilátek s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete a korelace nepřítomnosti protilátek, které se váží na vakcinované zvíře za podmínky, že přítomnost pestivirového materiálu v uvedeném zvířeti a/nebo v uvedeném vzorku se stanoví jiným způsobem.

Výsledkem modifikace struktury a nepřítomnosti RNázové aktivity ve značených virech podle vynálezu ve srovnání s odezvami vycházejícími z neznačených pestivirových infekcí budou různé imunitní odezvy u zvířat. Pestiviry podle vynálezu vyvolávají různou a zřetelnou imunitní odezvu, buněčnou stejně jako humorální, které se liší od nemodifikované stejně jako patogenní imunitní odezvy. Výsledkem aplikace glykoproteinů E^rns podle vynálezu jsou polyklonální protilátky, které se liší svojí vazebnou s polyklonálními nemodifikovaných když se vzniklými Tyto rozdíly porovnáváji aplikací ve vazebné specifitou, protilátkami glykoproteinů.

specifitě poskytují značení vhodné pro rozlišení zvířat vakcinovaných pestiviry podle vynálezu od zvířat infikovaných obecnými pestiviry. Popisují se testy, které se používají pro zjištění specifických polyklonálních protilátek v testovacím séru, které se buď váží na epitop divokého typu nebo značí deleční mutaci uvedeného epitopu za účelem diferenciace infikovaných a vakcinovaných zvířat. V publikaci Kit, M. and S. Kit, 1991. Sensitive glykoprotein glll blocking ELISA to distínquish between pseudorabies (Aujeszky's disease)infected and vaccinated pigs. Vetrinary Microbiology 28: 141155 se například popisují testy použitelné v případě prasat infikovaných a vakcinovaných pseudorabies.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob rozlišení zvířat infikovaných pestivirem od zvířat • ·· ·· · ·· · ··** · · · ···· ··· ···· · · · • ····· ······· · · • · · · · » · · ····· ·* · ·· ··· vakcinovaných utlumeným pestivirem podle vynálezu, který zahrnuje následující kroky:

1) získání vzorku polyklonálních protilátek ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína,

2) stanovení nespecifického navázání uvedených polyklonálních protilátek na nemodifikovaný glykoprotein E^RNS nebo na glykoproteiny E^RNS upravený podle vynálezu,

3) korelace navázání uvedených polyklonálních protilátek na nemodifikovaný glykoprotein E^RNS s pestivirovou infekcí a korelace nepřítomnosti protilátek, které se váží na uvedené polyklonální protilátky proti glykoproteinu E^RNS, který se upravil podle vynálezu.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je zobrazeno prvních 495 aminokyselin exprimovaných kmenem Alfort CSFV. Zobrazená sekvence ukazuje prvních 495 aminokyselin jak se exprimují kmenem Alfort CSFV (popisuje se v publikaci Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H.J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567). Jeden monomer glykoproteinu aminokyselinám 268 až

RNS

E

494, uvedeného kmene odpovídá jak se popisuje v publikaci

Rumenapf, T., Unger, G., Strauss, J.H. and Thiel, H.J. 1993. Processing of the evelope glycoproteins of pestiviruses. J. Virol. 67: 3288-3294. Podtrženy jsou zbytky 295 až 307 a 338 a 357 reprezentující oblasti vykazující homologii s rostlinnými a fungálními RNázami (popisuje se v publikaci Schneider, R. , G. Unger, R. Stark, E. Schneider-Scherzer, and H. J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoproteinn of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171).

Na obrázku č. 2 je zobrazena teplotní křivka teplot měřená v rektu zvířat po testované infekci. Tělesná teplota zvířat • · · β · · · ····· ·· · ·· ··· měřená v rektu se zaznamenávala denně od 2. dne až do 18. dne po infekci. Uvádí se křivka tělesné teploty měřené v rektu v případě každého zvířete ve skupině infikované virem V (pA/CSFV) (nepřetržitá čára) získaného z plazmidů pA/CSFV nebo virem V(pA/C-346-d) získaným z plazmidů pA/C-346-d (tečkovaná čára).

Na obrázku č. 3 je znázorněna křivka tělesné teploty zvířat po infekci. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 1. dne až do 21. dne po infekci. Zvířata infikovaná mutantem C-346-d [V (pA/C-34 6-d) ] se po 69 dnech infikovala letální dávkou CSFV kmene Eystrup. Detaily se popisují v v textu. Uvádí se křivka tělesné teploty měřené v rektu v případě každého zvířete ve skupině infikované virem CSFV kmene Eystrup v koncentraci 2xl0⁵TCID₅₀.

Na obrázku č. 4 je zobrazena teplotní křivka teplot měřená v rektu zvířat po testované infekci. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 0. dne až do 18. dne po infekci. Uvádí se křivka tělesné teploty měřené v rektu v případě každého zvířete ve dvou skupinách infikovaných buď C-346-d [V(pA/CSFV)] (tečkovaná čára) nebo znovu získaného viru C-346-d/RS [V(pA/C-346-d)] (nepřetržitá čára).

Na obrázku č. 5 je zobrazena tělesná teplota zvířat měřená v rektu po infekci v experimentu č. 2. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 1. dne až do 10. dne po infekci virem. Zvířata infikovaná mutantem C-346-d se po 37 dnech infikovala letální dávkou CSFV kmene Eystrup (2xl0⁵ TCID50) Na obrázku č. 6 je zobrazená tělesná teplota zvířat měřená v rektu, která se ošetřila dvojitým mutantem popsaným v příkladu 6 dále v textu. Tělesná teplota zvířat měřená před a po infekci virem diskriminace mezi C-346-d a v rektu se zaznamenávala denně s mutantem V(pA/C-297-L/346-L) .

Na obrázku č. 7 je zobrazena

CSFV, který nevykazuje deleci histidinového kodonu 346, pomoci RT-PCR podle příkladu 8.

a) Primer 01 H-3/0I E^msStop umožňuje specificky amplifikovat pruh získaný z RNA obsahující deleci kodonu 346 (C-346-d), jak se popisuje detailněji v příkladu 8. Naopak RNA, která neobsahuje uvedenou deleci nereaguje s uvedeným párem primerů (C-WT, C-346-L, C-346-K).

b) a c) Další dvě kombinace primerů (01 H+2 a 01 H+3) umožní amplifikovat pruhy získané z RNA, které neobsahují deleci kodonu 346 (01 H+2 a 01 H+3) . Žádný pruh není možné pozorovat v případě, že se jako templát použije RNA z 346 delečního mutantu C-346-d.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Vytvoření pěstivirových mutantů, které neobsahují RNázu

Při tvorbě subklonů se jako počáteční materiál použily klony cDNA v plné délce pA/CSV (popisuje se v publikaci Meyers, G., Thiel, H.J. and Rumenapf, T. 1996a. Classical swine fever virus: Recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. J. Virol. 67: 7088-709526) nebo pA/BVDV (popisuje se v publikaci Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., Thiel, H.J. and Kummerer, B.M. 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral dierrhea viruses from cDNA constructs. J. Virol., 70: 8606-8613), ze kterých je možné získat infekční cRNA transcripcí in vitro. V případě CSFV se fragment Xhol/SspI ρΆ/CSFV klonoval do plazmidu pBluescript SK+, který se štěpil restrikčními enzymy Xhol a Smál. V případě BVDV se fragment Xhol/BglII z pA/BVDV klonoval do • · plazmidu pCITE-2C, který se štěpil stejnými restrikčními enzymy. Z těchto konstrukcí vznikla jednořetězcová plazmidová DNA za použití Kunkelovi metody (popisuje se v publikaci Kunkel, T.A., J. D. Roberts, and R.A. Zakour. 1987. Rapid and efficient síte-specific mutagenesis without phenotypic selection. Methods Enzymol. 154: 367-392), přičemž se používají buňky E. coli CJ 236 (BioRad) a jednořetězcová fágy VCMS (Stratagene). Jednořetězcová DNA se přeměnila na dvouřetězcovou za použití sady „Phagemid in vitro Mutagenesis Kit (BioRad). Některé ze syntetických oligonukleotidů, které se používají jako primery při přípravě požadovaných pestivitrových mutantu, jsou uvedeny dále v textu:

C-297-L: AGGAGCTTACTTGGGATCTG

C-346-L: GGAACAAACTTGGATGGTGT

C-297-K: ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC

C-346-K: ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA

C-346-d: GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC

B-346-d: CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAACTGG

Při transformaci buněk mikroorganizmu E. coli XL-1 Blue (Stratagene) se použila dvouřetězcová plazmidová DNA. Kolonie bakterií, které nesou plazmidy, se izolovaly selekcí na ampicilinu. Připravila se plazmidová DNA a dále se analyzovala sekvenováním nukleotidů za použití sekvenační sady s polymerázou T7 (Pharmacia). Plazmidy obsahující požadované mutace a nevykazující žádné další změny na druhém místě se použily při konstrukcí klonů cDNA v plné délce. V případě CSFV se fragment Xhol/Ndel z mutagenizovaného plazmidu začlenil spolu s fragmentem Ndel/BglII odvozeného z plazmidu 578 (pCITE 2A, obsahující fragment Xhol/BglII z pA/CSFV) do plazmidu pA/CSFV štěpeného restrikčními enzymy Xhol a Bglll. Za účelem získání mutantu BVDV CP7 se fragment Xhol/BglII obsahující • · • · deleci začlenil do pA/BVDV, který se štěpil restrikčními enzymy Xhol a Ncol, spolu s fragmentem BglII/NcoI izolovaným pA/BVDV/Ins-. cRNA se transkribovala z konstrukce pA/BVDV/Insza vzniku BVDV, který není cytopatogenní a je vhodný pro transkripci do vhodných buněk (popisuje se v publikaci publikaci Meyers, G., Tautz, N. , Becher, P., Thiel, H.J. and Kummerer, B.M. 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral dierrhea viruses from cDNA constructs. J. Virol., 70: 8606-8613). Amplifikovaly se různé délky klonů a izolovaly se jednotlivé plazmidy. požadovaných mutací se

Přítomnost

DNA. Po prokázala sekvenováním linearizaci DNS restrikčním enzymem Srfl (klony CSFV plné délky) nebo Smál /klony BVDV plné délky) se cRNA přepsala, jak se popisuje shora v textu v publikacích publikaci Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., Thiel, H.J. and Kummerer, B.M. 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral dierrhea viruses from cDNA constructs. J. Virol., 70: 86068613, Meyers, G., Thiel, H.J. and Rumenapf, T. 1996a. Classical swine fever virus: Recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. J. Virol. 67: 7088-709526.

RNA se čistila gelovou filtrací a extrakcí směsí chloroformu a fenolu a použila se pří transfekci buněk prasečích (PK15) nebo bovinních ledvin (MDBK klon B2) (konstrukce CSFV nebo BVDV). Transfekce se analyzovala imunofluorescencí se sérem specifickým pro virus. V případě, kde se mohl získat požadovaný mutant (je pozitivní imunofluorescenčním testu), se viry amplifikovaly pasážováním ve stejné buněčné linii za použití transfekčních experimentů. Další analýza mutantů CSFV zahrnuje stanovení jednokrokových růstových křivek a charakterizaci virové RNA Northernovým blotem za použití sond cDNA, které jsou specifické pro virus, stejně jako reverzní traskripční polymerázovou řetězovou reakci (RT-PCR) a následné sekvenování fragmentů PCR, aby se ověřila přítomnost • · · ♦ · • · · * · požadovaných mutací ve virovém genomu. Ve všech případech se prokázala přítomnost požadovaných mutací. Všechny získané viry rostly dobře a produkovaly podobné množství RNA pávě tak jako virus, který vznikl z plazmidů, jenž vykazuje sekvenci divokého typu.

Schopnost mutantů přežít se prokázala transfekcí cRNA a oddělením buněk po třech dnech. Část buněk se nanesla na plotny o průměru 3,5 cm, den po té se fixovaly směsí aceton/metanol a pak se analyzovaly imunofluorescenci za použití směsi monoklonálních protilátek specifických pro BVDV (popisuje se v publikaci Weiland, E., Thiel, H. J. , Hess, G., and Weiland, F., (1989). Development of monoclonal neutralizing antibodies against bovine viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normál bovine cells and cyclophosphamide. J. Virol. Methods 24: 237-244). Všechny buňky byly pozitivní, zatímco kontrola buněk transfekovaných neinfekční RNA nevykazuje žádný signál. Z části buněk transfekovaných cRNA se produkoval extrakt v jednom cyklu zmražení a tání. Čerstvé buňky se infikovaly tímto buněčným extraktem a za použití imunofluorescence specifické pro BVDV se tři dni po infekci prokázalo, že jsou BVDV pozitivní.

V tabulce č. 1 je uvedeno shrnutí různých změn zavedených do konzervativních sekvencí E^RNS reprezentující putativní aktivní místo RNázy, které kóduje určitý vírový mutant.

I

Tabulka č. 1:

název

sekvence v motivu RNázy

aktivita RNázy

schopnost mutantů přežit

pA/CSFV	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-i-	·+·
C-297-L	..SLLGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	+
C-346-L	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKLGWCNW..	-	+
C-297-L7346-L .	..SLLGIWPEKIC...	...RHEWNKLGWCNW..	-	+
C-297-K	..SLKGIWPEKIC. ..	...RHEWNKHGWCNW..	-	+
C-346-K	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKKGWCNW..	-	+
C-297-d	,.SL_G!WPEKIC. ..	. ..RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-346-d	..SLHGIWPEKIC...	. . . R Η E W N K_G W C N W . .	-
C-296/7/8-d	. ,S___IWPEKIC. ..	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-345/6/7-d	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWN___WCNW..	-	-
C-345/6-d	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWN__GWCNW..	-	-
C-346/7-d	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWNK __WCNW..	-	-
C-342-d	..SLHGIWPEKIC...	... R H_ W N K H G W C N W ..	-	-
C-342/6-d	..SLHGIWPEKIC...	...RH_WNK _GWCNW..	-	-
C-301-d	. . SLHG I W_EKI C...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-295-S/G	..GLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-
C-300-W/G	..SLHGIGPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-
C-302-E/A	..SLHGIWPAKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-305-C/G	..slhgiwpekig. ..	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-300-W/G-302-E/A .SLHGIGPAKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-340-R/G	..SLHGIWPEKIC...	...GHEWNKHGWCNW..	-	-
C-343-W/G	..SLHGIWPEKIC...	...RHEGNKHGWCNW..	-	-
C-345-K/A	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWNAHGWCNW..	-	-
C-297-K/346-K .	..SLKGIWPEKIC...	...RHEWNKKGWCNW..	-	+
C-297-K/346-L .	..SLKGIWPEKIC...	...RHEWNKKGWCNW..	-	+
pA/BVDV	.SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	+	+ ”
B-346-d	.SLHGIWPEKIC. ..	...RHEWNK_GWCNW..	-	+

Popis tabulky č. 1: Test aktivity RNázy se provedl v krátkodobém testu. Buňky BHK21 se infikovaly virem vakcínie vTF7-3 (popisuje se v publikaci Fuerst T.R. et al., 1986. Eukaryotic transient expression systém based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA • ·· 040 · · ·

000 0 · » 0 0 0 0 0

000 ·*«· 90 0 • 00000 0000000 0 0 • 0409 000

0000· ·· « ·· ··· polymerase. Proč. Nati. Acad. Sci. 83: 8122-8126) a pak se transfekovaly konstrukcí cDNA (5 μς plazmidová DNA, transfekce za použití Superfect, jak doporučuje dodavatel firma Qiagen)). Po 10 hodinách inkubace při teplotě 37 °C v inkubátoru v atmosféře CO₂ se transfekované buňky analyzovaly a stanovila se aktivita RNázy, jak se popisuje dále v textu). Schopnost buněk přežít se stanovila způsobem popsaným dále v textu.

Příklad 2: Účinek různých mutací na RNázovou aktivitu glykoproteinu E^RNS

Za účelem testování účinku různých mutací na RNázovou aktivitu glykoproteinu E^RNS se vhodné buňky infikovaly mutantními viry. V případě CSFV se provedla infekce při hodnotě multiplicity infekce (m.o.i.) 0,01. Infekce divokým virem sloužila jako pozitivní kontrola, zatímco neinfikované buňky se použily jako negativní kontrola. 48 hodin po infekci se buňky promyly dvakrát fyziologickým roztokem pufrovaným fosferečnanem a lyžovaly se v lyzačním pufru o objemu 0,4 ml (20 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mg/ml albuminu bovinního séra, 1 % Triton X100, 0,1 % deoxycholová kyselina,

0,1 % SDS) . Lyzát se přenesl do reakční zkumavky o objemu 1,5 ml, sonifikoval se (sonikátor Branson B12, za podmínek 120 W, 20 s ve vodní lázni) . Dále se centrifugoval po dobu 5 min. při 14 000 ot./min. v Eppendorfových zkumavkách při teplotě 4 °C a supernatant se ultracentrifugoval ve stolní ultracentrifuze Beckmann po dobu 60 min., při teplotě 4 °C a otáčkách 45 000 ot./min za použití rotoru TLA 45. Stanovení RNázové aktivity se provedlo v objemu 200 μΐ, který obsahuje 5 nebo 50 μΐ supernatantu z druhého stupně centrifugace a 80 μg Poly/rU (Pharmacia) v pufru, který je vhodný pro RNázový test (40 mM

Tris-acetát (hodnota pH je 6,5), 0,5 mM EDTA, 5 mM dithiotreitol (DTT)). Po inkubaci reakční směsi při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny se přidalo 200 μΐ 1, M kyseliny perchloristé, 20 mM LaSO₄. Po inkubaci na ledu po dobu 15 minut

	30	• 9* 9 · · • · · · · « · • · » 9 # # > 9 9 9··· «··«·· • 9 9 9 · ••••9 ·« «	• * 9 9 9 9 · * « * • 9 · * » # 9 9 · · ·
se směs centrifugovala po	dobu	15 minut, při teplotě 4 °C a
při otáčkách 14 000 ot	/min.	v Eppendorfových	zkumavkách.
K superntantu se přidala	voda	v množství, které	odpovídá 3

objemům a alikvot směsi se analyzoval měřením optické hustoty při vlnové délce 260 nm za použití spektrofotometru Ultrospec 3000 (Pharmacia). Ve všech případech mutace zavedené do genu E^ms zcela zrušily RNázovou aktivitu (uvádí se v tabulce č. 1).

V případě mutantu BVDV se RNázová aktivita testovala v materiálu získaným po transfekci RNA bez pasážování získaných virů. Buňky transfekované vhodnou RNA se 72 hodin po transfekci rozdělily a nanesly se na dvě plotny. O 24 hodin později se připravil z jedné plotny buněčný extrakt a analyzovala se RNázová aktivita způsobem, který se popisuje shora v textu. Za účelem prokázat infekci se buňky z druhé plotny analyzovaly fluorescenčním testem s monoklonálními protilátkami, které jsou specifické pro BVDV (popisuje se v publikaci Weiland, E., Thiel, H. J., Hess, G., and Weiland, F. , (1989). Development of monoclonal neutralízing antibodies against bovine viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normál bovine cells and cyclophosphamide. J. Virol. Methods 24: 237-244), a zjistilo se, že jsou 100 % pozitivní. Transfekce se provedla za použití RNA transkribované z pA/BVDV/Ins- a z pA/B-346-d, což je plazmid ekvivalentní k ρΑ/BVDV/Ins-, ale neobsahuje deleci kodonu ekvivalentního s kodonem 346 v genomu CSFV Alfort. Netransfekované buňky MDBK sloužily jako negativní kontrola.

Tabulka č. 2A: Stanovení RNázové aktivity různých virů

	Alfort	C-WT	C-297-L	C-346-L	C-346-d	C-346- d/Rs	kontrola
od260	2,4	2,3	1,1	1,1	1,1	2,3	1,1

	Alfort	C-WT	C-297-L	C-346-L	C-297-K	C-346-K	C-297- L/346-L
OD260	2,09	2,16	0,715	0,77	0,79	0,766	0, 77

ř 9 9 « · · 9 • F » · · * «

9 9999999 » » • ti · · *

9 9 9 9 99 9

9 9

	C-297-K/346-L	C-297-K/346-K	C-346-d	kontrola
OD260	0,725	0,835	CO o	0,84

Popis tabulky č.2A:

Buňky PK se infikovaly indikovanými viry při hodnotě m.o.i. (multiplicita infekce) 0,01, inkubovaly se po dobu 48 hodin při teplotě 37°C v inkubátoru v atmosféře CO₂ a pak se lyžovaly a podrobily testu RNázové aktivity. Rozpustná RNA pocházející z inkubace s různými buněčnými extrakty se kvantifikovala měřením optické hustoty při vlnové délce 260 nm. Pozorované rozdíly RNázové aktivity jsou způsobeny různým množstvím proteinu E^RNS ve vzorcích, protože se po kvantifikaci E^RNS radioaktivním značením, imunologickým srážením a analýzou radioaktivity za použití fosforimageru získaly stejné hodnoty. Snížení koncentrace E^ms v testu na pouze jednu desetinu obvyklého množství nezměnilo podstatně výsledné hodnoty optické hustoty, což indikuje, že vybrané podmínky testu se saturovaly vzhledem k E^ms.

Kmen CSFV Alfort; všechny ostatní viry se získaly z RNA transkribované in vitro plazmidů: například C-WT z pA/CSFV, C297-L z pA/C-297-L, atd., viru C-346-d/Rs získaného z pA/C346-d/Rs (vytvořeného zvrácením mutace v pA/C-346-d záměnou fragmentu cDNA za ekvivalentní fragment získaný z pA/CSFV). Jako kontrol se použil extrakt neinfikovaných buněk PK15.

Tabulka č. 2B

	B-WT	B-346-d	kontrola
od260	2,5	1,1	1,1

Popis tabulky č. 2B: Buňky NDBK se infikovaly in vitro transkribovanou RNA. 72 hodin po transfekci se rozdělily a RNázová aktivita se analyzoval o 24 hodin později. Infekce buněk se prokázala imunofluorescenční analýzou, jak se popisuje v textu.

• · · · · • · · · · · • * · · · · ······· * · • fc · * · • · · · · ·

B-WT je virus získaný z pA/BVDV/Ins-; B-346-d je virus získán z pA/B-346-d; jako kontrola slouží extrakt z neinfikovaných buněk MDBK.

Příklad 3: Patogeníta CSFV po aktivaci RNázy

Za účelem testování jak poškození RNázové aktivity ovlivňuje patogenicitu pestivirů v jejich přirozeném hostiteli, se provedly experimenty na zvířatech s mutantem V(pA/C-346-d) (v tabulce se uvádí jako C-346-d). Viry získané z klonu plné délky CSFV bez mutace (V(pA/CSFV)) slouží jako pozitivní kontrola (v tabulce označeno jako C-WT). Pro každý mutant se použily tři selata (plemeno: German Landrace, hmotnost přibližně 25 kg) . Použitá infekční dávka je lxlO⁵

TCID50 na	j edno	zvíře,	přičemž	dvě	třetiny	inokulátu se
aplikovalo	nasálně	(jedna	třetina	do	každé nozdry) a jedna
třetina do	svalu	Dvě	skupiny	se	ustájily	v oddělených

izolačních jednotkách. Krev se zvířatům odebrala dvakrát před infekcí a 3., 5., 7., 10., 12. a 14. den po infekci. Každý den se zaznamenávala tělesná teplota zvířat (uvedeno na Obrázku č. 2). Zvířata infikována virem divokého typu vykazují typické symptomy klasické prasečí horečky, jako je teplota, ataxie, anorexie, průjem, poruchy centrálního nervového systému, hemoragie na kůži (uvádí se v tabulce č. 3) . Virus je možné získat z krve třetí den (zvíře č. 68) a 5., 7., 10., 14., den (zvířata č. 68, 78, 121) (uvádí se v tabulce č. 3B) . Zvířata se usmrtila ve fázi odumírání 14. den po infekci. V tuto dobu se detekovaly virové neutralizační protilátky. Naopak u zvířat infikovaných mutantem se neprojevily klinické příznaky (uvádí se v tabulce č. 3a). Tělesná teplota zvířat zůstala v normálu (uvádí se na obrázku č. 2) po celou dobu exprimentu a zvířata stále přijímala potravu. Z krve nebylo možné izolovat virus. Zvířata však byla jasně infikována virem a virus se replikoval a u všech zvířat se vytvořily neutralizační protilátky (uvádí se v tabulce č. 3c).

« ·· ··· ·· • · · · «·# ···

Tabulka č. 3a: Klinické příznaky po testované infekci ··· · · ····· · · · ····· ·· · ·· ···

Experiment č. 1
zvíře č. 1	infekce s	klinické příznaky
		teplota	průjem	poruchy CNS	anorexie	krváce ní kůže	apatie	eutanázi e	krvácení orgánů při nekropsii
68	C-WT	+	+	+	+	+	+	+	+
78	C-WT	+	+		+	+	+	+	+
121	C-WT	+	+	+	+	+	+	+	+
70	C-346-d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.
72	C-346-d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.
74	C-346-d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.

Popis tabulky č. 3a: Ve studii se použilo 6 selat (plemeno: „German land race, tělesná hmotnost přibližně 25 kg) rozdělených do dvou skupin (každá skupina se ustájila odděleně). Tři zvířata se infikovala CSFV-WT (lxlO⁵ TCID50) a 3 zvířata se infikovala C-346-d (lxlO⁵ TCID₅₀) Zaznamenávala se tělesná teplota v rektu a klinické příznaky a vše se shrnulo, jak se uvádí v tabulce, přičemž zkratka n.a. znamená neuskutečnila se nekropsie.

Tabulka č. 3b: Viremie krevních buněk po testu infekce

Experiment č. 1
zvíře č. 1	infekce s	klinické příznaky
		3	5	7	10	14
68	C-WT	+	+	+		+
78	C-WT	-	+	+	+	+
121	C-WT	-	+	+	+	+
70	C-346-d	-	-	-	-	-
72	C-346-d	-	-	-	-	-
74	C-346-d	-	-	-	-	-

Popis tabulky č. 3b: Viremie krevních buněk se detekovala společnou kultivací krve s buňkami PK15. Po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 72 hodin se buňky promyly PBS, fixovaly • 9 • ···· «· _v

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · • · · · · ··· ····· ·· · ·· ··« se ledem chlazenou směsí aceton/metanol a infekce se analyzovala imunofluorescencí s monoklonálními protilátkami, které jsou specifické pro glykoprotein E2 (mAb A18, popisuje se v publikaci Weiland, E., Stark, R., Haas, B., Rumenapf, T., Meyers, G. and Thiel, H. J. (1990). Pestivirus glykoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer. J. Virology 64, 3563-3569).

Tabulka č. 3c: Vývoj neutralizačního titru séra specifického pro CSFV

dny po infekci	-3	0	17	25	69	76	79	87
prase č. 70			1:18	1:162	1:162	1:162	1:486	1:1458
prase č. 72			1:18	1:54	1:486	1:1458	1:1458	1:4374
prase č. 7 4			1:6	1:54	1:162	1:162	1:486	1:1458

Popis tabulky č. 3c: Titry protilátek prasat infikovaných virovým mutantem C-346-d se stanovil v různé časové okamžiky během experimentu:

μΐ ředěného séra se smíchalo s 50 μΐ kultivačného média, které obsahuje 30 TCID₅₀ viru (CSFV Alf ort/Tubingen) . Po 90 minutách inkubace při teplotě 37°C se přidalo 100 μΐ buněk (l,5xl0⁴ buněk) a směs se nanesla na destičku s 96 prohlubněmi. Po 72 hodinách inkubace se buňky zafixovaly ledem chlazenou směsí acetonu/metanolu a analyzovala se infekce imunofluorescencí s monoklonálními protilátkami, které jsou specifické pro glykoprotein E2 (mAb A18, popisuje se v publikaci Weiland, E., Stark, R., Haas, B., Rumenapf, T., Meyers, G. and Thiel, H. J. (1990). Pestivirus glykoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer. J. Virology 64, 3563-3569). 69 dní po infekci se zvířatům aplikovalo 2xl0⁵ TCID50 CSFV kmen

Eystrup. Tabulka uvádí nejvyšší ředění séra, které způsobuje celkovou neutralizaci vstupního množství viru.

onemocněni

Virus der

Příklad 4: Vyvolání ochranné imunity infekcí viru, který nevykazuje RNázovou aktivitu.

Za účelem analyzovat, zda infekce s mutantním virem povede k ochranné imunitě, se přibližně 9 týdnů po infekci s mutantem CSFV za použití vysoce patogenního heterologního kmene CSFV (kmen Eystrup, pocházející od firmy Behring) provedl vakcinační experiment. Při infekci se použila dávka 2xlO⁵'TCID₅o viru. V předchozích několika experimentech se zjistilo se, že toto množství viru je dostatečné pro vyvolání letálního (popisuje se v publikací Koníg, Matthias, 1994. Klassischen Schweinepest: Untersuchungen zur

Pathogenese und zur Induktion einer protektiven Immunoantwort. Dissertation, Tirarztliche Hochschule Hannover, Germany). Zvířata, která se dříve infikovala CSFV RNázovým mutantem, nevykazují klinické příznaky onemocnění, ale zvýšil se jejich títr neutralizačních protilátek, což ukazuje na produktivní infekci a replikaci zavedeného viru.

Příklad 5: Ověření principu utlumení

Aby se ukázalo, že pozorované utlumení mutantního viru je způsobené deleci histidinu v poloze 346 polyproteinu a nikoliv nedefinovanou druhým místem mutace, tak se znovu připravila sekvence divokého typu záměnou fragmenty Xhol/Ndel o velikosti 1,6 kb klonu pAC/C-346-d v plné délce za odpovídající fragment pA/CSFV vykazující sekvenci divokého typu. Fragment vystřižený z pAC/C-346-d se analyzoval sekvenací nukleotidů za účelem najít mutace. S výjimkou delece tripletového kódujícího histidin v poloze 346 polyproteinu se nezjistil žádný rozdíl s ohledem na sekvenci divokého typu. Z konstrukce cDNA s mutantem se mohl získat virus (V (pA/C-346-d/Rs) , který rostl

stejně dobře jako virus divokého typu a vykazuje stejnou RNázovou aktivitu (popisuje se v tabulce č. 2A).

V druhém experimentu na zvířatech se získaný virus použil při infekci prasat. Jako kontrola se použil deleční mutant. Opět se použily dvě skupiny obsahující tři zvířata. Tyto zvířata byla mladší (plemeno: „German landrace, přibližná tělesná hmotnost 29 kg) než zvířata použitá v prvním experimentu. Při infekci se použila dávka 5xl0⁴ TCID50 viru. Zvířata infikovaná mutantem nevykazují žádné klinické příznaky (uvádí se v tabulce č. 5, na obrázku č. 4) . Pouze u jednoho zvířete se objevila teplota a trvala jeden den. U těchto zvířat se vyvinuly neutralizační protilátky, které chrání zvíře proti letální dávce CSFV. Další vakcinace se provedla infekcí kmenem Eystrup v dávce 2xl0⁵ TCID50. Zvířata po vakcinaci nevykazují klinické příznaky a tělesná teplota vykazuje normální hodnoty (uvádí se na obrázku č. 5) . Naopak u prasat infikovaných delečním mutantem a u zvířat inokulovaných

získaným	virem divokého	typu	se	vyvinula fatální	klasická
prasečí	horečka. Jedno	zvíře	se	muselo utratit 11	dní po
infekci,	ostatní dvě 0	tři	dni	později. Všechna	zvířata
vykazuj í	typické symptomy	klasické	prasečí horečky. To	znamená

průjem, anorexie a patologické příznaky, jako je krvácení z různých orgánů, které zahrnují ledviny.

Tabulka č. 5a: Klinické příznaky po testované infekci

Experiment č. 2
zvíře č. 1	infekce s	klinické příznaky
		teplota	prúj em	poruchy CNS	anorexie	krváce ní kůže	apatie	eutanázi e	krvácení orgánů při nekropsii
43	C-346-d	+ *	-	-	-	-	-	-	n.a.
47	C-346-d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.
87	C-346-Č	-	-	-	-	-	-	-	n.a.

• ·· ··· ·· # » · · ··· ··· ····· ······· ·

27	C-346- d/RS	+	+	+	+	+	+	+	+
28	C-346- d/RS	+	+		+	+	+	+	+
30	C-346- d/RS	+	+	+	+	+	+	+	+
		* teplota pouze jeden den

Tabulka č. 5a: Ve studii se použilo 6 selat (plemeno: „German land race, tělesná hmotnost přibližně 20 kg) rozdělených do dvou skupin (každá skupina se ustájila odděleně). Tři zvířata se infikovala C-346-d (5xl0⁴ TCID₅₀) a 3 zvířata se infikovala

C-346-d/RS (5xl0⁴ TCID₅₀) . C-346-d/RS se získal z mutantu C34 6-d znovu získáním sekvence divokého typu genu E^. Zaznamenávala se tělesná teplota měřená v rektu a klinické příznaky a vše se shrnulo, jak se uvádí v tabulce, přičemž zkratka n.a. znamená neuskutečnila se nekropsie.

Tabulka č. 5b: Diagnostický RNázový test za použití virů získaných z infikovaných zvířat během viremie

	Alfort	zvíře č. 3 C-297-K	zvíře č. 5 C-297-K	zvíře č. 27 C-346-L	zvíře č. 28 C-346-d/RS	zvíře č. 30 C-346-d/RS	kontrola
0^260	1,84	0, 60	0,56	1,84	1,93	1, 94	0, 49

Virus se získal z krve zvířat 27, 28 a 30 (jak se popisuje v příkladu 5) a 7. den po infekci se pomnožil v buněčné kultuře, titroval se a testovala se RNázová aktivita, jak se popisuje shora v textu. Neinfikované buňky PK15 a buňky (slouží jako kontrola) infikované CSFV divokého typu (Alford) slouží jako kontroly. Zvířata 3 a 5 se infkovaly mutantem C297-K, zatímco zvířata 27, 28 a 30 se infikovala mutantem C346-d/RS, jak se uvádí v tabulce.

Příklad 6: Účinky dvojité mutace v glykoproteinu E^RN3

Za účelem testování účinků dvojité mutace v glykoproteinu

E^rns na schopnost viru se replikovat v jeho přirozeném hostiteli a na jeho patogenitu se provedl experiment na zvířeti s mutantem V(pA/C-297-L/346-L). Virus získaný z klonu

CSFV plné délky, který neobsahuje mutaci (V(pA/CSFV) sloužil jako pozitivní kontrola. Pro každý mutant se použily tři selata (plemeno: German Landrace, hmotnost přibližně 25 kg). Použitá infekční dávka je lxlO⁵ TCID₅₀ na jedno zvíře, přičemž dvě třetiny inokulátu se aplikovalo nasálně (jedna třetina do každé nozdry) a jedna třetina do svalu. Krev se zvířatům odebrala dvakrát před infekcí (den 0) a 5., 8., 12. a 20. den po infekci. Každý den se zaznamenávala tělesná teplota zvířat (uvedeno na obrázku č. 6). Zvířata infikována dvojitým mutantem nevykazují typické symptomy a nikdy nepřestaly přijímat potravu. Zvířata neměla teplotu po dobu celého experimentu (zvířata 45/2 a 45/3) s výjimkou zvířete 45/1, které mělo 8. den teplotu pravděpodobně způsobenou bakteriální infekcí poranění pravé zadní nohy. Po léčbě uvedeného zvířete antibiotiky se 10. den hodnota tělesné teploty vrátila na normální hodnotu (obrázek č. 6). Z krve všech zvířat se virus izoloval 5. den, zatímco později nebylo možné viremii detekovat (uvádí se v tabulce č. 6a). U všech zvířat se vytvořily neutralizační protilátky (uvádí se v tabulce č. 6b) . V případě zvířete 45/1 se stanovil přibližně 4,5 měsíce po infekci opět neutralizační titr a zjistilo se, že jeho hodnota je 1:4374. Infekce s dvojitým mutantem přešla v dlouhotrvající imunologickou paměť.

Tabulka č.6a: Test viremie

dny po infekci	5	8	12
prase 45/1	+	-	-
prase 45/2	+	-	-
prase 45/3	+	-	-

Tabulka č. 6b: Neutralizační titry

zvíře	den 0	20. den po infekci
45/1	-	1:128
45/2	-	1:256

• · ·

45/3

1:256

Příklad 7: Princip ímunogenicity a utlumení viru BVDV „B-346d

Tento experiment se navrhl za účelem zjistit princip utlumení stejně jako ímunogenicity viru BVDV „B-346-d získaného z pA/B-346-d porovnáním s virem „B-WT, který se získal z pA/BVDV/Ins-. Virus „B-346-d nese samozřejmě mutaci v původním BVDV v poloze 349, ale nazval se „B-346, aby indikoval polohu relativní k poloze 346 CSFV Alfort zobrazené na obrázku č. 1.

Vybraly se tři skupiny zvířat, které mají séra BVDV negativní a jsou 3 až 6 měsíců stará. Každá skupina 1 a 2 obsahovala 5 zvířat, zatímco skupina 3 obsahovala 3 zvířata. Zvířata ve skupině 1 a 2 se infikovala aplikací 2xl0⁵ TCID50 mutantu B-346-d (skupina 1) nebo B-WT (skupina 2) v objemu 5 ml. Zvířata se infikovala do svalu (gluteální sval), intranasálně a podkožně (v oblasti lopatky). V období 14 dní po infekci se u obou skupin zvířat monitorovala virémie pomocí parametrů, jako je virémie krevních buněk a výskyt viru v nosních stěrech. Navíc se sledovaly klinické parametry jako je tělesná teplota měřená v rektu, počet bílých krvinek a obecné zdravotní parametry.

Za účelem zkoumání ochranné imunity proti infekci antigenně heterologním a virulentním izolátem BVDV (č. 13) se

77. den po infekci opakovala vakcinace zvířat v první skupině mutantem B-346-d. Zvířata skupiny 3 sloužila jako pozitivní kontrola a infikovala se způsobem popsaným v případě zvířat skupiny 1 s virulentním izolátem BVDV. Virus BVDV (č. 13) patří k odlišné antigenní skupině (typ II), zatímco virus B346-d spadá na základě klasifikace popsané v publikaci Pellerin, C., et al., Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks vakcinovala infekcí virulentním izolátem and high mortalities, Virology 203, 1994:260-268, do antigenní skupiny I. Zvířata ve skupině 1 a 3 se infikovala dávkou 2xl0⁶ TCID50 izolátu BVDV (č. 13) v objemu 5 ml. Zvířata se infikovala do svalu (gluteální sval), intranasálně a podkožně (v oblasti lopatky) . V období 14 dní po infekci se u obou skupin zvířat pozorovala virémie a zaznamenávala se pomocí parametrů, jako je virémie krevních buněk a výskyt viru v nosních stěrech. Navíc se sledovaly klinické parametry jako je tělesná teplota měřená v rektu, počet bílých krvinek a obecné zdravotní parametry.

Po infekci mutantem „B-346-d zvířata nevykazují typické klinické příznaky infekce virem BVDV, jako je zvýšená tělesná teplota měřená v rektu (tabulka č. 7a) nebo jiné respirační klinické symptomy (nejsou uvedeny).

Redukovaná virémie krevních buněk (tabulka č. 7b) a přítomnost viru v nosním výtěru (tabulka č. 7c) neindikuje jasně utlumení B-346-d ve srovnání s B-WT.

Virulentní izolát BVDV č. 13 vyvolává u zvířat skupiny 3 silnou virémii s typickými příznaky infekce BVDV, jako je zvýšená tělesná teplota měřená v rektu po dobu několika dní (uvádí se v tabulce č. 7c), silnou leukopenii (uvádí se v tabulce č. 7e), rozsáhlou virémii krevních buněk (uvádí se v tabulce č. 7f) a zastoupení viru ve stěru nasální tekutiny (uvádí se v tabulce č. 7g) . Naopak zvířata skupiny 1, která se s B-346-d, nevykazují po infekci BVDV č. 13, skoro žádné klinické příznaky, které jsou typické pro infekci BVDV. Po infekci nedošlo k podstatnému zvýšení tělesné teploty měřené v rektu (uvádí se v tabulce č. 7d) . Pozorovaná leukopenie byla zanedbatelná vzhledem k síle a délce trvání (uvádí se v tabulce č. 7e) . Z krve se neizoloval žádný virus BVDV (uvádí se v tabulce č. 7f) a pouze u jednoho zvířete bylo možné detekovat virus v nosním stěru (uvádí se v tabulce č. 7g).

Proto infekce mutantem B-346-d vyvolává silnou imunitu, které jasně redukuje klinické příznaky, zastoupení viru a virémii krevních buněk po opakované infekci heterologním izolátem BVDV.

Tabulka č. 7a: Průměrná tělesná teplota měřená v rektu ve skupině 1 (B-346-d) a 2 (B-WT)

den stud ie	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
skup ina 1	38,8	39, 1	39, 0	38,7	38,8	38,7	38,7	38,5	38,7	38,5	38,5	38,5	38,4	38, 9	38,7
skup ina 2	38,8	39,0	38, 9	38,6	38,6	38,7	38, 6	38,4	39, 1	38,4	38,7	38,6	38,7	38, 6	38,6

Zvířata ze skupiny 1 se infikovala v den 0 6χ10^ύ TCID50 B-34 6d, zatímco zvířata ze skupiny 2 se infikovala 6xl0⁶ TCID50 BWT.

Tabulka č. 7b: Virémie krevních buněk u zvířat skupiny 1 a 2

skupina	zvíře	nasálni stery první den	nasálni stěry poslední den	trvání přítomnosti viru v nasálních sterech (dny)	průměrné trvání skupiny (dny)
1	1	6	6	1	1,4
2	4	6	2
3	5	5	1
4	-	-	0
5	6	9	3
2	6	4	8	5	4,4
7	4	7	4
8	4	7	4
9	4	7	4
10	4	8	5

Krev ředěná EDTA se denně testovala až do desátého dne po infekci mutanty B-346-d a B-WT. Do každé ze třech kultur buněk • · telecích varlat v kultivačním médiu, které obsahuje heparin (jako prevenci srážení v koncentraci 1 jednotka/ml), se přidalo 0,2 ml krve. Po celonoční inkubaci se směs inokula a kutlivačního média nahradila čerstvým kultivačním médiem, které neobsahuje heparin. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se buňky infikované BVDV detekovaly fluorescencí s polyklonálním sérem specifickým pro BVDV. Negativní kultury se mrazily a následně rozmrazily. Aby se potvrdila nepřítomnost BVDV se 0,2 ml uvedené rozmražené kultury prošlo druhou pasáží na buňkách Cte.

Tabulka č. 7c: Virus zastoupený v nosní tekutině

skupina	zvíře	nasální stěry první den	nasální stěry poslední den	trvání přítomnosti viru v v exudátu	průměrný počet dní, kdy se virus detekoval ve skupině
1	1	4	8	4	2,6
2	6	6	1
3	4	4	1
4	5	7	3
5	3	6	4
2	6	6	8	3	3, 6
7	5	7	3
8	5	8	4
9	5	6	2
10	3	9	6

Nosní exudát se centrifugoval (1000 g) za účelem odstranit velký debris a kontaminanty. Odstranil se supernatant a 0,2 ml se naneslo do každé ze tří buněčných kultur. Po celonoční inkubaci se směs inokula a kultivačního média nahradila 2 ml čerstvého kultivačního média. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se detakovaly buňky infikované BVDV v imunofluorescenčním testu za použití polyklonálního séra, které je specifické pro BVDV.

Μ 0 v rektu ve « »0 • · · · • · » · · « <

• ·

0« » 0 » · t f * • · 4 0 0 « • ·

Tabulka č. 7d: Průměrná tělesná skupině 1 a 3 teplota měřená

den stu- die	-1	-2	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	12	14
sku- pina 1	38,4	38, 6	38, 5	38,5	38, 6	38,4	38,4	38, 4	38,3	38,4	38,4	38,4	38,4	38, 4	38,5
sku- pina 3	38,8	39, 1	38,8	39,1	39, 4	39,7	40,2	40,2	40,4	41,3	40,2	40,1	40,2	40,8	40,4

Tělesná teplot měřená v rektu se zaznamenávala až 16 dní po infekci. Zvířata ze skupiny 1 a 3 se infikovala 6xl0⁶ TCID₅₀ virulentního izolátu BVDV #13.

Tabulka č: 7e: Průměrný počet bílých krvinek

den stu- die	-1	-2	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	12	14
sku- pina 1	11,9	11,9	11,3	10,8	9,2	8,2	8,9	9, 9	11,2	11, 6	11, 6	10, 6	10,8	10,8	9,4
sku- pina 3	11,7	15,8	13, 8	11, 1	7,7	9,8	7,4	6, 8	8,7	8,7	7,0	8,1	6,2	6,4	6,2

Vzorky krvinek v EDTA se odebíraly denně ode dne -2 do 14. dne po infekci z každého zvířete v obou skupinách. Počet bílých krvinek ve vzorcích krve v EDTA se stanovil za použití přístroje Sysmex Mikro-Cell Counter F800.

Tabulka č. 7f: BVDV izolovaný ze vzorku krve

skupina	zvíře	virus detekovaný v krvi první den	virus detekovaný v krvi poslední den	doba trvání přítomnosti viru v krvi (dny)	průměrná doba trváni (dny)
1	1	-	-	0	0
2	-	-	0
3	-	-	0
4	-		0
5	-	-	O. O
3	11	3	10	8	9,7
12	12	14	12
13	3	9	9

• *

	• • 9 44 :	< · < • í · • · · · * » ·	9 · * * · · · • « * · r 9 « · » · · » • 9 » ·	• · * »
Krev ředěná	EDTA se	denně	testovala až do	desátého	dne po
infekci. Do	každé	ze třech kultur	buněk	telecích	varlat
v kultivačním	médiu,	které	obsahuj e	heparin	(jako	prevenci

srážení v koncentraci 1 jednotka/ml) , se přidalo 0,2 ml krve. Po celonoční inkubaci se směs inokula a kutlivačního média nahradila čerstvým kultivačním médiem, které neobsahuje heparin. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se buňky infikované BVDV detekovaly fluorescencí s polyklonálním sérem specifickým pro BVDV. Negativní kultury se mrazily a následně rozmrazily. Aby se potvrdila nepřítomnost BVDV, 0,2 ml uvedené rozmražené kultury prošlo druhou pasáží na buňkách Cte.

Tabulka č. 7g: Virus zastoupený v nosní tekutině

skupina	zvíře	nasální stery první den	nasální stery poslední den	trvání přítomnosti viru v v nosní tekutině (dny)	průměrná doba trvání (dny ve skupině)
1	1	3	4	2	CO 'o
2	-	-	0
3	-	-	0
4	-	-	0
5	4	5	2
3	11	3	14	12	10
12	3	14	12
13	3	8	6

Nosní exudát se centrifugoval (1000 g) za účelem odstranit velký debris a kontaminanty. Odstranil se supernatant a 0,2 ml se naneslo do každé ze tří buněčných kultur. Po celonoční inkubaci se směs inokula a kultivačního média nahradila 2 ml čerstvého kultivačního média. Po inkubaci po dobu 4 až 5 dní se detakovaly buňky infikované BVDV v imunofluorescenčním testu za použití polyklonálního séra, které je specifické pro BVDV.

Příklad 8: Diskriminace mezi C-346-d a CSFV, který nevykazuje deleci histidinového kodonu 346 pomocí RT-PCR

I

Sekvence RNA kódující konzervativní motiv RNázy v CSFV glykoproteinu E^RNS je silně komzervativní. Mezi všemi známými sekvencemi CSFV se nezjistily v oblasti odpovídající zbytkům 1387 až 1416 publikované sekvence CSFV kmene Alfort (Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H.J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567) žádné změny nukleotidů.

Oligonukleotidové primery získané z této konzervativní oblastí genomu se mohou použít v testu RT-PCR za účelem detekce všech izolátů CSFV (uvádí se na obrázku č. 7). Následkem toho je možné nepřítomnost tripletu kódujícího histidin 346 (nukleotidy 1399-1401) detekovat RT-PCR s vhodně navrženým primerem. Syntetizovaly se různé oligonukleotidy, které pokrývají konzervativní oblast, které buď obsahovaly nebo neobsahovaly histidinový kodon. Tyto oligonukleotidy sloužily jako primery proti směru exprese genu při reakcích RT-PCR spolu s oligonukleotidem E^RNS-Stop, který sloužil jako primer po směru exprese genu. RNA čištěná z tkáňové kultury buněk se infikovala mutanty C-346-d, C-WT, C-346-L nebo C-346-K se použila jako templát. Reverzní transkripce 2 μς teplem denaturované RNA (2 min při teplotě 92 °C, 5 minut na ledu v

11.5 μΐ vody v přítomnosti 30 pMol reverzního primeru) se provedla po přidání 8 μΐ směsi RT (125 mM Tris/HCl pH 8,3,

182.5 mM Kel, 7,5 mM MgCl2, 25 mM dithiotreitol, 1,25 mM každého dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 U RNAguard (Pharmacia, Freiburg, Germany) a 50 U Superscript (Life Technologies/BLR, Eggenstein, Germany) po dobu 45 minut při teplotě 37 °C. Po ukončení reverzní transkripce se zkumavky umístily na led a přidalo se 30 μΐ směsi pro PCR (8,3 mM Tris/HCl, pH8,3, 33,3 mM Kel, 2,2 mM MgCl₂, 0,42 mM každého dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 0,17 % Triton X100, 0,03 % albuminu bovinního séra, 5 U polymerázy Taq (Appligene, Heidelberg, Germany) a 16,7 % DMSO).

V případě, že se použil primer ΟΙ H+3, reakční směs pro amplifikaci neobsahovala DMSO. Amplifikace se provedla v 36 • » · • · · · · • · • ·

cyklech (30 vteřin při teplotě 94 °C, 30 vteřin při teplotě 57 °C, 45 vteřin při teplotě 74 °C). 1 μΐ amplifikační reakce se nanesl na 1% agarózový gel a amplifikovaný produkt se oddělil na elektrof oréze a obarvil se ethidiumbromidem. Jak se uvádí na obrázku č. 7, pár primerů 01 H-3/0I E^msStop umožňuje specificky amplifikovat pruh získaný z RNA obsahující delecí kodonu 346, zatímco další dva primery umožňují získat produkty obsahující kodon 346. Když se jako templát použila RNA delecí uvedeného kodonu, pak se na elektroforéze nepozoroval žádný pruh.

Primery vhodné pro RT-PCR:

primery proti směru exprese genu:

H-3: TGGAACAAAGGATGGTGT

H+2: TGGAACAAACATGGATGG

H+3: GAATGGAACAAACATGGA primery po směru exprese genu:

E^msStop: GGAATTCTGAGGCATAGGCACCAAACCAGG • ·

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 494 aminokyse
(B)	TYP: aminokyselinová
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: protein
(D)	Jiné informace:

/poznámka= BVDV Erns delece v poloze 346/

(xi)

Popis

sekvence:

SEQ Leu

ID Leu

NO: Tyr 10

1:

Met 1

Glu

Leu

Ile

Thr 5

Asn Glu

Lys

Thr

Tyr

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Ala

Gly

Val 20

Glu

Glu Pro

Val

Tyr 25

Asp

Gin

Ala

Gly

Asn 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Glu 35

Arg

Gly

Val Ile

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Lys 50

Arg

Gly

Glu

Arg Glu 55

Val

Pro

Thr

Asn

Leu 60

Ala

Ser

Leu

Pro

Lys 65

Arg

Gly

Asp

Cys

Arg Ser 70

Gly

Asn

Ser

Lys 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Leu

Lys

Pro 85

Gly Pro

Leu

Phe

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Lys

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro Leu

Glu

Phe 105

Phe

Glu

Glu

Ala

Ser 110

Met

Cys

Glu

Thr

Thr 115

Lys

Arg

Ile Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Ser

Arg

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys Ile 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Ile 140

Val

Lys

Ser

Ala

Thr 145

Lys

Asp

Arg

Gin

Lys Val 150

Leu

Lys

Trp

Val 155

His

Asn

Lys

Leu

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Ser Ser

Cys

Ser

Asp 170

Thr

Lys

Asp

Glu

Gly 175

Val

Val

Arg

Lys

Lys 180

Gin

Gin Lys

Pro

Asp 185

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly 190

Arg

Met

Lys

Ile

Thr 195

Pro

Lys

Glu Ser

Glu 200

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr 205

Lys

Pro

Pro

• · • ·

48

• · · • · · · • · • · · · ·

• • · • •

• · • · · • •

• • * · • •

• · • · • · • ·

Asp

Ala

Thr

Ile

Val

Val

Asp

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Val

Lys

Lys

Lys

210

215

220

Gly

Lys

Val

Lys

Ser

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

225

230

235

240

Asn

Lys

Pro

Gin

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

245

250

255

Trp

Ala

Ile

Ile

Ala

Leu

Val

Phe

Phe

Gin

Val

Thr

Met

Gly

Glu

Asn

260

265

270

Ile

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu

Gin

Asp

Asn

Gly

Thr

Glu

Gly

Ile

Gin

Arg

275

280

285

Ala

Met

Phe

Gin

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

290

295

300

Glu

Lys

Ile

Cys

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

305

310

315

320

Leu

Lys

Ala

Ile

His

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Lys

Thr

Asn

Tyr

325

330

335

Thr

Cys

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn

340

345

350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Glu

Pro

Trp

Ile

Leu

Leu

Met

Asn

Lys

Thr

Gin

Ala

355

360

365

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly

Gin

Pro

Leu

Arg

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

370

375

380

Tyr

Asp

Arg

Asp

Ser

Asp

Leu

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asp

Ser

385

390

395

400

Pro

Thr

Pro

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

405

410

415

Gly

Ile

Leu

Val

Gin

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Glu

Ile

Ala

Val

Ser

Asp

420

425

430

Val

Leu

Phe

Lys

Glu

His

Asp

Cys

Thr

Ser

Val

Ile

Gin

Asp

Thr

Ala

435

440

445

His

Tyr

Leu

Val

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Ser

Leu

Glu

Ser

Ala

Arg

Gin

450

455

460

Gly

Thr

Ala

Lys

Leu

Thr

Thr

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Gly

Ile

Leu

465

470

475

480

Gly

Lys

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

485 490 (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová

	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
iii)	DRUH	MOLEKULY: protein
	(D)	Jiné informace:

/poznámka= BVDV Erns mutant 295 G/

(xí)	Popis	sekvence:	SEQ ID NO:	2:
Met Glu 1	Leu Asn 1	His Phe Glu 5	Leu Leu Tyr 10	Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15
Pro Val	Gly Val 20	Glu Glu Pro	Val Tyr Asp 25	Thr Ala Gly Arg Pro Leu 30
Phe Gly	Asn Pro 35	Ser Glu Val	His Pro Gin 40	Ser Thr Leu Lys Leu Pro 45
His Asp 50	Arg Gly	Arg Gly Asp 55	Ile Arg Thr	Thr Leu Arg Asp Leu Pro 60
Arg Lys 65	Gly Asp	Cys Arg Ser 70	Gly Asn His	Leu Gly Pro Val Ser Gly 75 80
Ile Tyr	Ile Lys	Pro Gly Pro 85	Val Tyr Tyr 90	Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 95
Val Tyr	His Arg 100	Ala Pro Leu	Glu Phe Phe 105	Asp Glu Ala Gin Phe Cys 110
Glu Val	Thr Lys 115	Arg Ile Gly	Arg Val Thr 120	Gly Ser Asp Gly Lys Leu 125
Tyr His 130	Ile Tyr	Val Cys Val 135	Asp Gly Cys	Ile Leu Leu Lys Leu Ala 140
Lys Arg 145	Gly Thr	Pro Arg Thr 150	Leu Lys Trp	Ile Arg Asn Phe Thr Asn 155 160
Cys Pro	Leu Trp	Val Thr Ser 165	Cys Ser Asp 170	Asp Gly Ala Ser Gly Ser 175
Lys Asp	Lys Lys 180	Pro Asp Arg	Met Asn Lys 185	Gly Lys Leu Lys Ile Ala 190
Pro Arg	Glu His 195	Glu Lys Asp	Ser Lys Thr 200	Lys Pro Pro Asp Ala Thr 205
Ile Val 210	Val Glu	Gly Val Lys 215	Tyr Gin Ile	Lys Lys Lys Gly Lys Val 220
Lys Gly 225	Lys Asn	Thr Gin Asp 230	Gly Leu Tyr	His Asn Lys Asn Lys Pro 235 240
Pro Glu	Ser Arg	Lys Lys Leu 245	Glu Lys Ala 250	Leu Leu Ala Trp Ala Val 255
Ile Thr	Ile Leu 260	Leu Tyr Gin	Pro Val Ala 265	Ala Glu Asn Ile Thr Gin 270

50

• • 0 0 0 0 • · 0

0 0 0 0 0 · 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 • · 0

0 0 0 0 0 0 0

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Gly 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

• · • · • ·

Γ- η ··· ·«·· · ····· ······ • · · · · ····· · · · (2) Informace ο SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 492 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant delece 296-7-8/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

tys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn • ·

145

150

155

160

Cys

Pro

Leu Trp Val 165

Thr Ser Cys

Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly

Ser

170

175

Lys

Asp

Lys

Lys

Pro

Asp

Arg

Met

Asn

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys

Ile

Ala

180

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys

Lys

Gly

290

295

300

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile

Arg

Gly

305

310

315

320

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

Arg

Leu

Gin

325

330

335

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp

340

345

350

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly

355

360

365

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

Thr

370

375

380

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

Leu

Thr

385

390

395

400

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

Ile

Glu

405

410

415

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp

420

425

430

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu

Asp

435

440

445

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg

Val

450

455

460

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

Leu

Glu

465

470

475

480

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

(2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant delece v poloze 297/

(xi)	Popis	sekvence:	SEQ ID	NO	: 4:
Met Glu 1	Leu Asn	His Phe Glu 5	Leu Leu	Tyr 10	Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15
Pro Val	Gly Val 20	Glu Glu Pro	Val Tyr 25	Asp	Thr Ala Gly Arg Pro Leu 30
Phe Gly	Asn Pro 35	Ser Glu Val	His Pro 40 '	Gin	Ser Thr Leu Lys Leu Pro 45
His Asp 50	Arg Gly	Arg Gly Asp 55	lle Arg	Thr	Thr Leu Arg Asp Leu Pro 60
Arg Lys 65	Gly Asp	Cys Arg Ser 70	Gly Asn	His	Leu Gly Pro Val Ser Gly 75 80
lle Tyr	lle Lys	Pro Gly Pro 85	Val Tyr	Tyr 90	Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 95
Val Tyr	His Arg 100	Ala Pro Leu	Glu Phe 105	Phe	Asp Glu Ala Gin Phe Cys 110
Glu Val	Thr Lys 115	Arg lle Gly	Arg Val 120	Thr	Gly Ser Asp Gly Lys Leu 125
Tyr His 130	lle Tyr	Val Cys Val 135	Asp Gly	Cys	lle Leu Leu Lys Leu Ala 140
Lys Arg 145	Gly Thr	Pro Arg Thr 150	Leu Lys	Trp	lle Arg Asn Phe Thr Asn 155 160
Cys Pro	Leu Trp	Val Thr Ser 165	Cys Ser	Asp 170	Asp Gly Ala Ser Gly Ser 175
Lys Asp	Lys Lys 180	Pro Asp Arg	Met Asn 185	Lys	Gly Lys Leu Lys lle Ala 190
Pro Arg	Glu His 195	Glu Lys Asp	Ser Lys 200	Thr	Lys Pro Pro Asp Ala Thr 205
lle Val 210	Val Glu	Gly Val Lys 215	Tyr Gin	lle	Lys Lys Lys Gly Lys Val 220

54

• •

• · • • · • · ·

• · • * ·

• · · • ·

• · • · • · • ·

• • · • • · ·

• · • ·

» · · · •

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys

290

295

300

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile

305

310

315

320

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

Arg

325

330

335

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

340

345

350

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

355

360

365

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

370 375 380

Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr

385 390 395 400

Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr Val

405 410 415

Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr 420 425 430

Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr Leu 435 440 445

Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala Ala 450 455 4S0

Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys Lys 465 470 475 480

Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 495 aminokysel
(B)	TYP: aminokyselinová
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: protein
(D)	Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant delece v poloze 297 K/

	(xi)	Popis sekvence: SEQ	ID NO:	5:
Met	Glu	Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys
1		5	10	15
Pro	Val	Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu
		20 25		30
Phe	Gly	Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro
		35 40		45
His	Asp	Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro
	50	55		60
Arg	Lys	Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly
65		70	75	80
Ile	Tyr	Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro
		85	90	95
Val	Tyr	His Arg Ala Pro Leu Glu Phe	Phe Asp	Glu Ala Gin Phe Cys
		100 105		110
Glu	Val	Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val	Thr Gly	Ser Asp Gly Lys Leu
		115 120		125
Tyr	His	Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly	Cys Ile	Leu Leu Lys Leu Ala
	130	135		140
Lys	Arg	Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys	Trp Ile	Arg Asn Phe Thr Asn
145		150	155	160
Cys	Pro	Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser	Asp Asp	Gly Ala Ser Gly Ser
		165	170	175
Lys	Asp	Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn	Lys Gly	Lys Leu Lys Ile Ala
		180 185		190
Pro	Arg	Glu His Glu Lys Asp Ser Lys	Thr Lys	Pro Pro Asp Ala Thr
		195 200		205
Ile	Val	Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin	Ile Lys	Lys Lys Gly Lys Val
	210	215		220
Lys	Gly	Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu	Tyr His	Asn Lys Asn Lys Pro
225		230	235	240

*« ·

Pro Glu Ser Arg Lys Lys 245

Ile Thr Ile Leu Leu Tyr 260

Trp Asn Leu Ser Asp Asn 275

Leu Arg Gly Val Asn Arg 290

Cys Lys Gly Val Pro Thr 305 310

Ile Arg Gly Met Met Asp 325

Arg Leu Gin Arg His Glu 340

Asn Ile Asp Pro Trp Ile 355

Thr Glu Gly Pro Pro Asp 370

Lys Asn Thr Asp Val Asn 385 390

Thr Leu Thr Gly Cys Lys 405

Val Ile Glu Gly Pro Cys 420

Glu	Lys	Ala 250	Leu	Leu	Ala	Trp	Ala 255	Val
Pro	Val 265	Ala	Ala	Glu	Asn	Ile 270	Thr	Gin
Thr 280	Asn	Gly	Ile	Gin	Arg 285	Ala	Met	Tyr
Leu	Lys	Gly	Ile	Trp 300	Pro	Glu	Lys	Ile
Leu	Ala	Thr	Asp 315	Thr	Glu	Leu	Lys	Glu 320
Ser	Glu	Arg 330	Thr	Asn	Tyr	Thr	Cys 335	Cys
Asn	Lys 345	His	Gly	Trp	Cys	Asn 350	Trp	Tyr
Leu 360	Met	Asn	Arg	Thr	Gin 365	Thr	Asn	Leu
Glu	Cys	Ala	Val	Thr 380	Cys	Arg	Tyr	Asp
Val	Thr	Gin	Ala 395	Arg	Asn	Arg	Pro	Thr 400
Gly	Lys	Asn 410	Phe	Ser	Phe	Ala	Gly 415	Thr
Phe	Asn	Val	Ser	Val	Glu	Asp	Ile	Leu

425 430 ···«· · · · · · ·» · » * Β » ·

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

2) Informace ο SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 495 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
	(D)	Jiné informace:
	/poznámka= CSFV Erns mutant 297
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 6

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Giy

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser 165 170 175

58

• • · · • • • · ·

• · • • · · · • • ·

• · • · • · • · • ·

• « • · · · •

• · • « • · · • · • ·

Lys

Asp

Lys

Lys

Pro

Asp

Arg

Met

Asn

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys

Ile

Ala

180

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Leu

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370 375 380

Lys 385

Asn Thr Asp Val

Asn 390

Val

Val

Thr Gin Ala Arg Asn 395

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 495 • · • ·

	f- Λ ··« · · * · ·· j y · ····· ······· · • · · · · · « ····· ·· · ··
(2)	Informace o SEQ ID NO:	7 :
	(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
		(A) DÉLKA: 494	aminokyselin

(B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka= CSVF Erns mutant delece v poloze 301/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly Lys Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu Tyr His Asn Lys 235

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Glu

Lys

Ile

Cys

290

295

300

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile

305

310

315

320

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

Arg

325

330

335

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

340

345

350

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

355

360

365

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

370

375

380

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

385

390

395

400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

405

410

415

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

420

425

430

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

435

440

445

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

450

455

460

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

465

470

475

480

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

• · · · · · ···· ··· · · · · • ·

(2)	Informace o SEQ ID NO:	r -I >····#· ··· Ol · ····· ······· · ♦ • ···· ·«· ····· ·· · ·· ··· 8 :
	(i)	CHARAKTERISTIKA	SEKVENCE:
		(A) DÉLKA: 495	aminokyselin

(B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant 302 A/

(xi)	Popis sekvence:	SEQ	' ID	NO	: 8:
Met Glu 1	Leu Asn His Phe Glu 5	Leu	Leu	Tyr 10	Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15
Pro Val	Gly Val Glu Glu Pro 20	Val	Tyr 25	Asp	Thr Ala Gly Arg Pro Leu 30
Phe Gly	Asn Pro Ser Glu Val 35	His 40	Pro	Gin	Ser Thr Leu Lys Leu Pro 45
His Asp 50	Arg Gly Arg Gly Asp 55	Ile	Arg	Thr	Thr Leu Arg Asp Leu Pro 60
Arg Lys 65	Gly Asp Cys Arg Ser 70	Gly	Asn	His	Leu Gly Pro Val Ser Gly 75 80
Ile Tyr	Ile Lys Pro Gly Pro 85	Val	Tyr	Tyr 90	Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 95
Val Tyr	His Arg Ala Pro Leu 100	Glu	Phe 105	Phe	Asp Glu Ala Gin Phe Cys 110
Glu Val	Thr Lys Arg Ile Gly 115	Arg 120	Val	Thr	Gly Ser Asp Gly Lys Leu 125
Tyr His 130	Ile Tyr Val Cys Val 135	Asp	Gly	Cys	Ile Leu Leu Lys Leu Ala 140
Lys Arg 145	Gly Thr Pro Arg Thr 150	Leu	Lys	Trp	Ile Arg Asn Phe Thr Asn 155 160
Cys Pro	Leu Trp Val Thr Ser 165	Cys	Ser	Asp 170	Asp Gly Ala Ser Gly Ser 175

Leu Lys lle Ala 190

Pro Asp Ala Thr 205

Lys Gly Lys Val

Asn Lys Gly Lys 185

Lys Thr Lys Pro

Gin lle Lys Lys 220

Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met 180

Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser 195 200 lle Val Val Glu Gly Val Lys Tyr 210 215

Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro

225 230 235 240

Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val

245 250 255 lle Thr lle Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn lle Thr Gin 2S0 265 270

Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly lle Gin Arg Ala Met Tyr 275 280 285

Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly lle Trp Pro Ala Lys lle 290 295 300

Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu

305 310 315 320 lle Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys

325 330 335

Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr 340 345 350

Asn lle Asp Pro Trp lle Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu 355 360 365

Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp 370 375 380

Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr

385 390 395 400

Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr

405 410 415

Val lle Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp lle Leu 420 425 430

Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr 435 440 445

Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr lle Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala 450 455 460

Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys 465 470 475 480

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 495 • · (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

• ·

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 495 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
	(D)	Jiné informace:
	/poznámka= CSFV Erns mutant 305
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 9

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 14 0

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

• ·

64

• • · • • • • · ·

• · • · • ♦ • · · • • ·

• • • • · • •

1 · • · • * · • · · · • · • ·

» ♦ • · · •

• · • • • • • ·

• » · • • • • · ·

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Gly

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trpí

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 495 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
	(D)	Jiné informace:
	/poznámkaCSFV Erns mutant 340 G/
xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 10

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

lle

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

lle

Tyr

lle

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

lle

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly.

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

lle

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

lle 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

lle

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

lle

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

lle

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

• ·

Lys

Gly

66

• Leu Tyr

• • · • · · His

• · • · · Asn

• · • · Lys

• • · · · • Asn

• · • · • · Lys

• • • · · Pro

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

225

Λ

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Gly

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

470 475

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 495 • · · · • · ·· · » · · · · • · · ► * • · · · · * · • · · • · · · (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 493 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant delece 342-6/

(xi)

Popis

sekvence: :

SEQ

ID

NO:

11:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

• · • ♦ · • »

Lys Gly Lys 225

Asn Arg

Thr Lys 245

Gin 230 Lys

Asp Gly Leu Glu

Leu Tyr Lys Ala 250

His Asn 235 Leu Leu

Lys Asn

Lys Ala 255

Pro 240 Val

Ala

Trp

Pro

Glu

Ser

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Trp

Asn

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

Ile

340

345

350

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

355

360

365

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

370

375

380

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

Leu

385

390

395

400

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

Ile

405

410

415

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

Gly

420

425

430

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu

435

440

445

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg

450

455

460

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

Leu

465

470

475

480

Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 • · ···*· *·»»*·· * · • · · · · » • · · « · · · « » · ·♦· (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant delece v poloze 342/

B	(xi)	Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	12:
	Met Glu 1	Leu Asn	His Phe Glu 5	Leu	Leu	Tyr 10	Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15
	Pro Val	Gly Val 20	Glu Glu Pro	Val	Tyr 25	Asp	Thr Ala Gly Arg Pro Leu 30
	Phe Gly	Asn Pro 35	Ser Glu Val	His 40	Pro	Gin	Ser Thr Leu Lys Leu Pro 45
	His Asp 50	Arg Gly	Arg Gly Asp 55	Ile	Arg	Thr	Thr Leu Arg Asp Leu Pro 60
	Arg Lys 65	Gly Asp	Cys Arg Ser 70	Gly	Asn	His	Leu Gly Pro Val Ser Gly 75 80
	Ile Tyr	Ile Lys	Pro Gly Pro 85	Val	Tyr	Tyr 90	Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 95
	Val Tyr	His Arg 100	Ala Pro Leu	Glu	Phe 105	Phe	Asp Glu Ala Gin Phe Cys 110
	Glu Val	Thr Lys 115	Arg Ile Gly	Arg 120	Val	Thr	Gly Ser Asp Gly Lys Leu 125
-	Tyr His 130	Ile Tyr	Val Cys Val 135	Asp	Gly	Cys	Ile Leu Leu Lys Leu Ala 140
	Lys Arg 145	Gly Thr	Pro Arg Thr 150	Leu	Lys	Trp	Ile Arg Asn Phe Thr Asn 155 160
	Cys Pro	Leu Trp	Val Thr Ser	Cys	Ser	Asp	Asp Gly Ala Ser Gly Ser

165 170 175

Lys Asp Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg Met

Asn Lys Gly Lys Leu Lys

Ile

Ala

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val 210 215 220 • «· ·» · << f » « · · • · * · * « ·♦·*» ’ * * • * · * «·· ·· ··

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

340

345

350

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

355

360

365

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

370

375

3 80

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

385

390

395

400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

405

410

415

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

420

425

430

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

435

440

445

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

450

455

460

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

465

470

475

480

Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 « · (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant 343 G/

(xi)	Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	13:
Met Glu 1	Leu Asn	His Phe Glu 5	Leu	Leu	Tyr 10	Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15
Pro Val	Gly Val 20	Glu Glu Pro	Val	Tyr 25	Asp	Thr Ala Gly Arg Pro Leu 30
Phe Gly	Asn Pro 35	Ser Glu Val	His 40	Pro	Gin	Ser Thr Leu Lys Leu Pro 45
His Asp 50	Arg Gly Arg Gly Asp 55	lle	Arg	Thr	Thr Leu Arg Asp Leu Pro 60
Arg Lys 65	Gly Asp	Cys Arg Ser 70	Gly	Asn	His	Leu Gly Pro Val Ser Gly 75 80
lle Tyr	lle Lys	Pro Gly Pro 85	Val	Tyr	Tyr 90	Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 95
Val Tyr	His Arg 100	Ala Pro Leu	Glu	Phe 105	Phe	Asp Glu Ala Gin Phe Cys 110
Glu Val	Thr Lys 115	Arg lle Gly	Arg 120	Val	Thr	Gly Ser Asp Gly Lys Leu 125
Tyr His 130	lle Tyr	Val Cys Val 135	Asp	Gly	Cys	lle Leu Leu Lys Leu Ala 140
Lys Arg 145	Gly Thr	Pro Arg Thr 150	Leu	Lys	Trp	lle Arg Asn Phe Thr Asn 155 160
Cys Pro	Leu Trp	Val Thr Ser 165	Cys	Ser	Asp 170	Asp Gly Ala Ser Gly Ser 175
Lys Asp	Lys Lys 180	Pro Asp Arg	Met	Asn 185	Lys	Gly Lys Leu Lys lle Ala 190

···· ··· ··· ··* · · * · · · • ····· ······· ·

Pro	Arg	Glu 195	His	Glu	Lys	Asp	Ser 200
Ile	Val 210	Val	Glu	Gly	Val	Lys 215	Tyr
Lys 225	Gly	Lys	Asn	Thr	Gin 230	Asp	Gly
Pro	Glu	Ser	Arg	Lys 245	Lys	Leu	Glu
Ile	Thr	Ile	Leu 260	Leu	Tyr	Gin	Pro
Trp	Asn	Leu 275	Ser	Asp	Asn	Gly	Thr 280
Leu	Arg 290	Gly	Val	Asn	Arg	Ser 295	Leu
Cys 305	Lys	Gly	Val	Pro	Thr 310	His	Leu
Ile	Arg	Gly	Met	Met 325	Asp	Ala	Ser
Arg	Leu	Gin	Arg 340	His	Glu	Gly	Asn
Asn	Ile	Asp 355	Pro	Trp	Ile	Gin	Leu 360
Thr	Glu 370	Gly	Pro	Pro	Asp	Lys 375	Glu
Lys 385	Asn	Thr	Asp	Val	Asn 390	Val	Val
Thr	Leu	Thr	Gly	Cys 405	Lys	Lys	Gly
Val	Ile	Glu	Gly 420	Pro	Cys	Asn	Phe
Tyr	Gly	Asp 435	His	Glu	Cys	Gly	Ser 440
Leu	Leu 450	Asp	Gly	Met	Thr	Asn 455	Thr
Ala 465	Arg	Val	Thr	Ser	Trp 470	Leu	Gly

Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr 205.

Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val 220

Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro 235 240

Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val 250 255

Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin 265 270

Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr 285

His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile 300

Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu 315 320

Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys 330 335

Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr 345 350

Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu 365

Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp 380

Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr 395 400

Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr 410 415

Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu 425 430

Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr 445

Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala 460

Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys 475 480

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 495 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(í) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 492 aminokyse
(B)	TYP: aminokyselinová
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: protein
(D)	Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns čelece v poloze 346-7/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 1S5

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Ί4

Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val 245 250 255

Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin 260 265 270

Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr 275 280 285

Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile 290 295 300

Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu

305 310 315 320

Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys

325

Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn 340

Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg 355 360

Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val 370 375

Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala 385 390

Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe 405

Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser 420

His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin 435 440

Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn 450 455

Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu 465 470

Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly 485

330 335

Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Asp 345 350

Thr Gin Thr Asn Leu Thr Glu Gly 365

Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asn Thr 380

Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu Thr 395 400

Ser Phe Ala Gly Thr Val Ile Glu 410 415

Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly Asp 425 430

Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Leu Asp 445

Ala Arg Gin Gly Ala Ala Arg Val 460

Ser Thr Ala Gly Lys Lys Leu Glu 475 480

Ala Tyr Ala Leu 490 ····· ·*····» · • · · · · » (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 493 aminokyse
(B)	TYP: aminokyselinová
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: protein
(D)	Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant v poloze 345-6/

(xi

)

Popis

sekvence:

SEQ

ID

NO:

15

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu ^45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His

Ile

Tyr

Val

Cys

Val

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu

Leu

Lys

Leu

Ala

130

135

140

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr .

Asn 160

·«·· · · » * · ·

Cys	Pro	Leu	Trp	Val 165	Thr	Ser	Cys
Lys	Asp	Lys	Lys 180	Pro	Asp	Arg	Met
Pro	Arg	Glu 195	His	Glu	Lys	Asp	Ser 200
Ile	Val 210	Val	Glu	Gly	Val	Lys 215	Tyr
Lys 225	Gly	Lys	Asn	Thr	Gin 230	Asp	Gly
Pro	Glu	Ser	Arg	Lys 245	Lys	Leu	Glu
Ile	Thr	Ile	Leu 260	Leu	Tyr	Gin	Pro
Trp	Asn	Leu 275	Ser	Asp	Asn	Gly	Thr 280
Leu	Arg 290	Gly	Val	Asn	Arg	Ser 295	Leu
Cys 305	Lys	Gly	Val	Pro	Thr 310	His	Leu
Ile	Arg	Gly	Met	Met 325	Asp	Ala	Ser
Arg	Leu	Gin	Arg 340	His	Glu	Trp	Asn
Asp	Pro	Trp 355	Ile	Gin	Leu	Met	Asn 360
Gly	Pro 370	Pro	Asp	Lys	Glu	Cys 375	Ala
Thr 385	Asp	Val	Asn	Val	Val 390	Thr	Gin
Thr	Gly	Cys	Lys	Lys 405	Gly	Lys	Asn
Glu	Gly	Pro	Cys 420	Asn	Phe	Asn	Val
Asp	His	Glu 435	Cys	Gly	Ser	Leu	Leu 440
Asp	Gly 450	Met	Thr	Asn	Thr	Ile 455	Glu
Val	Thr	Ser	Trp	Leu	Gly	Arg	Gin
465					470

	• · · * » · · • · • · · · ·	• • · • ·	• · · · • · •	• a · •	• » • · • · • · · · ·
Ser	Asp 170	Asp	Gly	Ala	Ser	Gly 175	Ser
Asn 185	Lys	Gly	Lys	Leu	Lys 190	Ile	Ala
Lys	Thr	Lys	Pro	Pro 205	Asp	Ala	Thr
Gin	Ile	Lys	Lys 220	Lys	Gly	Lys	Val
Leu	Tyr	His 235	Asn	Lys	Asn	Lys	Pro 240
Lys	Ala 250	Leu	Leu	Ala	Trp	Ala 255	Val
Val 265	Ala	Ala	Glu	Asn	Ile 270	Thr	Gin
Asn	Gly	Ile	Gin	Arg 285	Ala	Met	Tyr
His	Gly	Ile	Trp 300	Pro	Glu	Lys	Ile
Ala	Thr	Asp 315	Thr	Glu	Leu	Lys	Glu 320
Glu	Arg 330	Thr	Asn	Tyr	Thr	Cys 335	Cys
Gly 345	Trp	Cys	Asn	Trp	Tyr 350	Asn	Ile
Arg	Thr	Gin	Thr	Asn 365	Leu	Thr	Glu
Val	Thr	Cys	Arg 380	Tyr	Asp	Lys	Asn
Ala	Arg	Asn 395	Arg	Pro	Thr	Thr	Leu 400
Phe	Ser 410	Phe	Ala	Gly	Thr	Val 415	Ile
Ser 425	Val	Glu	Asp	Ile	Leu 430	Tyr	Gly
Gin	Asp	Thr	Ala	Leu 445	Tyr	Leu	Leu
Asn	Ala	Arg	Gin 460	Gly	Ala	Ala	Arg
Leu	Ser	Thr	Ala	Gly	Lys	Lys	Leu

475 480

Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490

	77
Informace o	SEQ ID NO: 16:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 495 aminokyse
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
	(D)	Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns muatnt 345 A/

(xi)	Popis	sekvence:	SEQ ID	NO	: 16:
Met Glu 1	Leu Asn	His Phe Glu 5	Leu Leu	Tyr 10	Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15
Pro Val	Gly Val 20	Glu Glu Pro	Val Tyr 25	Asp	Thr Ala Gly Arg Pro Leu 30
Phe Gly	Asn Pro 35	Ser Glu Val	His Pro 40	Gin	Ser Thr Leu Lys Leu Pro 45
His Asp 50	Arg Gly	Arg Gly Asp 55	Ile Arg	Thr	Thr Leu Arg Asp Leu Pro 60
Arg Lys 65	Gly Asp	Cys Arg Ser 70	Gly Asn	His	Leu Gly Pro Val Ser Gly 75 80
Ile Tyr	Ile Lys	Pro Gly Pro 85	Val Tyr	Tyr 90	Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 95
Val Tyr	His Arg 100	Ala Pro Leu	Glu Phe 105	Phe	Asp Glu Ala Gin Phe Cys 110
Glu Val	Thr Lys 115	Arg Ile Gly	Arg Val 120	Thr	Gly Ser Asp Gly Lys Leu 125
Tyr His 130	Ile Tyr	Val Cys Val 135	Asp Gly	Cys	Ile Leu Leu Lys Leu Ala 140
Lys Arg 145	Gly Thr	Pro Arg Thr 150	Leu Lys	Trp	Ile Arg Asn Phe Thr Asn 155 160
Cys Pro	Leu Trp	Val Thr Ser 165	Cys Ser	Asp 170	Asp Gly Ala Ser Gly Ser 175
Lys Asp	Lys Lys 180	Pro Asp Arg	Met Asn 185	Lys	Gly Lys Leu Lys Ile Ala 190
Pro Arg	Glu His 195	Glu Lys Asp	Ser Lys 200	Thr	Lys Pro Pro Asp Ala Thr 205
Ile Val 210	Val Glu	Gly Val Lys 215	Tyr Gin	Ile	Lys Lys Lys Gly Lys Val 220
Lys Gly 225	Lys Asn	Thr Gin Asp 230	Gly Leu	Tyr	His Asn Lys Asn Lys Pro 235 240

	78	• • » • • · 4	• · • · • · · » · ·	• « » ·	• · • ·	• · • · • · • ·	« • · • • · ·
• · · •	• · · •
Pro Glu Ser Arg Lys Lys	Leu Glu Lys	Ala	Leu	Leu	Ala	Trp	Ala	Val
245		250					255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr	Gin Pro Val	Ala	Ala	Glu	Asn	Ile	Thr	Gin
260	265					270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn	Gly Thr Asn	Gly	Ile	Gin	Arg	Ala	Met	Tyr
275	280				285
Leu Arg Gly Val Asn Arg	Ser Leu His	Gly	Ile	Trp	Pro	Glu	Lys	Ile
290	295			300
Cys Lys Gly Val Pro Thr	His Leu Ala	Thr	Asp	Thr	Glu	Leu	Lys	Glu
305 310			315					320
Ile Arg Gly Met Met Asp	Ala Ser Glu	Arg	Thr	Asn	Tyr	Thr	Cys	Cys
325		330					335
Arg Leu Gin Arg His Glu	Trp Asn Ala	His	Gly	Trp	Cys	Asn	Trp	Tyr
340	345					350
Asn Ile Asp Pro Trp Ile	Gin Leu Met	Asn	Arg	Thr	Gin	Thr	Asn	Leu
355	360				365
Thr Glu Gly Pro Pro Asp	Lys Glu Cys	Ala	Val	Thr	Cys	Arg	Tyr	Asp
370	375			380
Lys Asn Thr Asp Val Asn	Val Val Thr	Gin	Ala	Arg	Asn	Arg	Pro	Thr
385 390			395					400
Thr Leu Thr Gly Cys Lys	Lys Gly Lys	Asn	Phe	Ser	Phe	Ala	Gly	Thr
405		410					415
Val Ile Glu Gly Pro Cys	Asn Phe Asn	Val	Ser	Val	Glu	Asp	Ile	Leu
420	425					430
Tyr Gly Asp His Glu Cys	Gly Ser Leu	Leu	Gin	Asp	Thr	Ala	Leu	Tyr

440

445

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

455

460

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

470

4 75

480

435

Leu Leu Asp 450

Ala Arg Val 465

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 495

(2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 493 aminokyse
(B)	TYP: aminokyselinová
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: protein
(D)	Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant delece v poloze 346-7/

(xi	)	Popis	sekvence:	SEQ	ID	NO:	17:
Met 1	Glu	Leu Asn	His Phe Glu . 5	Leu	Leu	Tyr 10	Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15
Pro	Val	Gly Val 20	Glu Glu Pro	Val	Tyr 25	Asp	Thr Ala Gly Arg Pro Leu 30
Phe	Gly	Asn Pro 35	Ser Glu Val	His 40	Pro	Gin	Ser Thr Leu Lys Leu Pro 45
His	Asp 50	Arg Gly	Arg Gly Asp 55	lle	Arg	Thr	Thr Leu Arg Asp Leu Pro 60
Arg 65	Lys	Gly Asp	Cys Arg Ser 70	Gly	Asn	His	Leu Gly Pro Val Ser Gly 75 80
lle	Tyr	lle Lys	Pro Gly Pro 85	Val	Tyr	Tyr 90	Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 95
Val	Tyr	His Arg 100	Ala Pro Leu	Glu	Phe 105	Phe	Asp Glu Ala Gin Phe Cys 110
Glu	Val	Thr Lys 115	Arg lle Gly	Arg 120	Val	Thr	Gly Ser Asp Gly Lys Leu 125
Tyr	His 130	lle Tyr	Val Cys Val 135	Asp	Gly	Cys	lle Leu Leu Lys Leu Ala 140
Lys 145	Arg	Gly Thr	Pro Arg Thr 150	Leu	Lys	Trp	lle Arg Asn Phe Thr Asn 155 160
Cys i ·	Pro	Leu Trp	Val Thr Ser 165	Cys	Ser	Asp 170	Asp Gly Ala Ser Gly Ser 175
Lys	Asp	Lys Lys 180	Pro Asp Arg	Met	Asn 185	Lys	Gly Lys Leu Lys lle Ala 190
Pro	Arg	Glu His 195	Glu Lys Asp	Ser 200	Lys	Thr	Lys Pro Pro Asp Ala Thr 205
lle	Val 210	Val Glu	Gly Val Lys 215	Tyr	Gin	lle	Lys Lys Lys Gly Lys Val 220 -

Lys 225

Gly

Lys

Asn Thr Gin 230

80

• • Tyr

• • · A · ♦ His 235

• · • · · Asn

• · • · 4 • · Lys

• · · • Asn

• · • · · Lys

• · • · · Pro 240

Asp

Gly

Leu

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

Ile

340

345

350

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

355

360

365

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

370

375

380

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

Leu

385

390

395

400

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

Ile

405

410

415

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

Gly

420

425

430

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu

435

440

445

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg

450

455

460

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

Leu

465

470

475

480

Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 • · (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 494 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
li)	DRUH	MOLEKULY: protein
	(D)	Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant v poloze 346/

(xi)

Popis

sekvence:

SEQ Leu

ID Leu

NO: Tyr 10

18 Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

lle

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

lle

Tyr

lle

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

lle

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

lle

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

lle

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

lle 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

lle

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

lle Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin lle Lys Lys Lys Gly Lys Val

I

210

215

220

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

340

345

350

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

355

360

365

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

370

375

380

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

385

390

395

400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

405

410

415

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

420

425

430

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

435

440

445

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

450

455

460

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

465

470

475

480

Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 (2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 495 aminokyse
(B)	TYP: aminokyselinová
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: protein
(D)	Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant 346 K/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys

1

5

10

15

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Xle

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro 225 230 235 240 • ·

Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val 245 250 255

Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin 260 265 270

Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr 275 280 285

Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile 290 295 300

Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu

305 310 315 320

Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys

325 330 335

Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys Lys Gly Trp Cys Asn Trp Tyr 340 345 350

Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu 355 360 365

Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp 370 375 380

Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr

385 390 395 400

Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr

405 410 415

Val Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu 420 425 430

Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr 435 440 445

Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala

450 455 460 >

Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys

465 470 475 480

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 495 • · (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 495 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(Íi)	DRUH	MOLEKULY: protein
	(D)	Jiné informace:
	/poznámka= CSFV Erns mutant 346 L/
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys Pro

Lys Asp

Pro Arg

Ile Val 210

Lys Gly 225

Pro Glu

Ile Thr

Trp Asn

Leu Arg 290

Cys Lys 305

Ile Arg

Arg Leu

Asn Ile

Thr Glu 370

Lys Asn 385

Thr Leu

Val Ile

Tyr Gly

Leu Leu 450

Ala Arg 465

Lys Leu

Leu Trp

Lys Lys 180

Glu His 195

Val Glu

Lys Asn

Ser Arg

Ile Leu 260

Leu Ser 275

Gly Val

Gly Val

Gly Met

Gin Arg 340

Asp Pro 355

Gly Pro

Thr Asp

Thr Gly

Glu Gly 420

Asp His 435

Asp Gly

Val Thr

Glu Arg

Val Thr 165

Pro Asp

Glu Lys

Gly Val

Thr Gin 230

Lys Lys 245

Leu Tyr

Asp Asn

Asn Arg

Pro Thr 310

Met Asp 325

His Glu

Trp Ile

Pro Asp

Val Asn 390

Cys Lys 405

Pro Cys

Glu Cys

Met Thr

Ser Trp 470

Arg Ser 485

Ser Cys

Arg Met

Asp Ser 200

Lys Tyr 215

Asp Gly

Leu Glu

Gin Pro

Gly Thr 280

Ser Leu 295

His Leu

Ala Ser

Trp Asn

Gin Leu 360

Lys Glu 375

Val Val

Lys Gly

Asn Phe

Gly Ser 440

Asn Thr 455

Leu Gly

Lys Thr

Ser Asp 170

Asn Lys 185

Lys Thr

Gin Ile

Leu Tyr

Lys Ala 250

Val Ala 265

Asn Gly

His Gly

Ala Thr

Glu Arg 330

Lys Leu 345

Met Asn

Cys Ala

Thr Gin

Lys Asn 410

Asn Val 425

Leu Leu

Ile Glu

Arg Gin

Trp Phe 490

Asp Gly

Gly Lys

Lys Pro

Lys Lys 220

His Asn 235

Leu Leu

Ala Glu

Ile Gin

Ile Trp 300

Asp Thr 315

Thr Asn

Gly Trp

Arg Thr

Val Thr 380

Ala Arg 395

Phe Ser

Ser Val

Gin Asp

Asn Ala 460

Leu Ser 475

Gly Ala

Ala Ser

Leu Lys 190

Pro Asp 205

Lys Gly

Lys Asn

Ala Trp

Asn Ile 270

Arg Ala 285

Pro Glu

Glu Leu

Tyr Thr

Cys Asn 350

Gin Thr 365

Cys Arg

Asn Arg

Phe Ala

Glu Asp 430

Thr Ala 445

Arg Gin

Thr Ala

Tyr Ala

Gly Ser 175

Ile Ala

Ala Thr

Lys Val

Lys Pro 240

Ala Val 255

Thr Gin

Met Tyr

Lys Ile

Lys Glu 320

Cys Cys 335

Trp Tyr

Asn Leu

Tyr Asp

Pro Thr 400

Gly Thr 415

Ile Leu

Leu Tyr

Gly Ala

Gly Lys 480

Leu

495

(2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 495 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
	(D)	Jiné informace:
	/poznámka= CSFV Erns mutant 297
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 21

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210 215 220

Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro 225 230 235 240 ·♦,· ·· ·· ·

Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val 245 250 255

Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin 260 265 270

Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr 275 280 285

Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu Lys Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile

290

295

300

Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu

305 310 315 320

Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys

325 330 335

Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys Lys Gly Trp Cys Asn Trp Tyr 340 345 350

Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu 355 360 365

Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp 370 375 380

Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr

385 390 395 400

Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr

405 410 415

Val Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu 420 425 430

Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr 435 440 445

Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala 450 455 460

Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys 465 470 475 480

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu

485 490 495 • ♦ (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 495 aminokyse
(B)	TYP: aminokyselinová
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: protein
(D)	Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant 297 K 346 L/

(xi:

)

Popis

sekvence:

SEQ

ID

NO:

22:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

lle

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

lle

Tyr

lle

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

lle

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

lle

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

lle

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

lle 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

lle

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

lle Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin lle Lys Lys Lys Gly Lys Val 210 215 220

90

• • · * • • • · ·

* » • · • · · • ·

• · • • · • ·

• • · • · · · •

• • · ·

» · • · • »· ·

• ·

Lys 225

Gly Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg Gly 290

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

Lys

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys Gly

Va]

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

Leu

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu Gly 370

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu Asp 450

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu

485 490 495 (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 495 aminokyse
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
	(D)	Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant 297 L 346 L/

(xi;

)

Popis

sekvence:

SEQ

ID

NO:

23

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro 225 230 235 240

I » « « fl • ·

Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu 245

Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro 260

Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr 275 280

Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu 290 295

Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu 305 310

Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser 325

Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn 340

Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gin Leu 355 360

Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu 370 375

Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val 385 390

Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly 405

Val Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe 420

Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser 435 440

Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr 450 455

Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly 465 470

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr 485

Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val 250 255

Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin 265 270

Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr 285

Leu Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile 300

Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu 315 320

Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys 330 335

Lys Leu Gly Trp Cys Asn Trp Tyr 345 350

Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu 365

Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp 380

Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr 395 400

Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr 410 415

Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu 425 430

Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr 445

Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala 460

Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys 475 480

Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 490 495 ·9 9 (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 495 aminokysel
(B)	TYP: aminokyselinová
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: protein
(D)	Jiné informace:

/poznámka= BVDV protein Erns/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

Met Glu Leu Ile 1	Thr 5	Asn	Glu	Leu	Leu	Tyr 10	Lys	Thr	Tyr	Lys	Gin Lys 15
Pro Ala Gly Val 20	Glu	Glu	Pro	Val	Tyr 25	Asp	Gin	Ala	Gly	Asn 30	. Pro Leu
Phe Gly Glu Arg 35	Gly	Val	Ile	His 40	Pro	Gin	Ser	Thr	Leu 45	Lys	Leu Pro
His Lys Arg Gly 50	Glu	Arg	Glu 55	Val	Pro	Thr	Asn	Leu 60	Ala	Ser	Leu Pro
Lys Arg Gly Asp 65	Cys	Arg 70	Ser	Gly	Asn	Ser	Lys 75	Gly	Pro	Val	Ser Gly 80
Ile Tyr Leu Lys	Pro 85	Gly	Pro	Leu	Phe	Tyr 90	Gin	Asp	Tyr	Lys	Gly Pro 95
Val Tyr His Arg 100	Ala	Pro	Leu	Glu	Phe 105	Phe	Glu	Glu	Ala	Ser 110	Met Cys
Glu Thr Thr Lys 115	Arg	Ile	Gly	Arg 120	Val	Thr	Gly	Ser	Asp 125	Ser	Arg Leu
Tyr His Ile Tyr 130	Val	Cys	Ile 135	Asp	Gly	Cys	Ile	Ile 140	Val	Lys	Ser Ala
Thr Lys Asp Arg 145	Gin	Lys 150	Val	Leu	Lys	Trp	Val 155	His	Asn	Lys	Leu Asn 160
Cys Pro Leu Trp	Val 165	Ser	Ser	Cys	Ser	Asp 170	Thr	Lys	Asp	Glu	Gly Val 175
Val Arg Lys Lys 180	Gin	Gin	Lys	Pro	Asp 185	Arg	Leu	Glu	Lys	Gly 190	Arg Met
Lys Ile Thr Pro 195	Lys	Glu	Ser	Glu 200	Lys	Asp	Ser	Lys	Thr 205	Lys	Pro Pro
Asp Ala Thr Ile 210	Val	Val	Asp 215	Gly	Val	Lys	Tyr	Gin 220	Val	Lys	Lys Lys

Gly 225	Lys	Val	Lys	Ser	Lys 230	Asn	Thr
Asn	Lys	Pro	Gin	Glu 245	Ser	Arg	Lys
Trp	Ala	Ile	Ile 260	Ala	Leu	Val	Phe
Ile	Thr	Gin 275	Trp	Asn	Leu	Gin	Asp 280
Ala	Met 290	Phe	Gin	Arg	Gly	Val 295	Asn
Glu 305	Lys	Ile	Cys	Thr	Gly 310	Val	Pro
Leu	Lys	Ala	Ile	His 325	Gly	Met	Met
Thr	Cys	Cys	Arg 340	Leu	Gin	Arg	His
Asn	Trp	Tyr 355	Asn	Ile	Glu	Pro	Trp 360
Ala	Asn	Leu	Thr	Glu	Gly	Gin	Pro
	370					375
Arg 385	Tyr	Asp	Arg	Asp	Ser 390	Asp	Leu
Ser	Pro	Thr	Pro	Leu 405	Thr	Gly	Cys
Ala	Gly	Ile	Leu 420	Val	Gin	Gly	Pro
Asp	Val	Leu 435	Phe	Lys	Glu	His	Asp 440
Ala	His 450	Tyr	Leu	Val	Asp	Gly 455	Met
Gin 465	Gly	Thr	Ala	Lys	Leu 470	Thr	Thr

	« • β * « · ř ftft·	·· . » • · · 1 • ·	·· ·	• ·	t ·
c * • > « « • ··	r » · · · fc » •	• • β • •	• * < · *
Gin	Asp	Gly 235	Leu	Tyr	His	Asn	Lys 240
Lys	Leu 250	Glu	Lys	Ala	Leu	Leu 255	Ala
Phe 265	Gin	Val	Thr	Met	Gly 270	Glu	Asn
Asn	Gly	Thr	Glu	Gly 285	Ile	Gin	Arg
Arg	Ser	Leu	His 300	Gly	Ile	Trp	Pro
Ser	His	Leu 315	Ala	Thr	Asp	Thr	Glu 320
Asp	Ala 330	Ser	Glu	Lys	Thr	Asn 335	Tyr
Glu 345	Trp	Asn	Lys	His	Gly 350	Trp	Cys
Ile	Leu	Leu	Met	Asn 365	Lys	Thr	Gin
Leu	Arg	Glu	Cys 380	Ala	Val	Thr	Cys
Asn	Val	Val 395	Thr	Gin	Ala	Arg	Asp 400
Lys	Lys 410	Gly	Lys	Asn	Phe	Ser 415	Phe
Cys 425	Asn	Phe	Glu	Ile	Ala 430	Val	Ser
Cys	Thr	Ser	Val	Ile 445	Gin	Asp	Thr
Thr	Asn	Ser	Leu 460	Glu	Ser	Ala	Arg
Trp	Leu	Gly	Arg	Gin	Leu	Gly	Ile

475 480 f~ Leu Gly Lys Lys Leu Glu Asn Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala 485 490 495 (2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 495 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
ii)	DRUH	MOLEKULY: protein

(D) Jiné informace: /poznámka= CSFV protein Erns / (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu •45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 14 0

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys Asp

Lys Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn Lys 185

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

3 95

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495 (2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 495 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselinová
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
	(D)	Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant 300 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

o

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

98 Gly Leu

Tyr

• · · • · · ·

• · • • · • · Lys

• • · • a · · · « Asn

• • • · • Lys

• · • · · • · • · · Pro 240

• • · · His 235

• · · • · Asn

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Gly

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 495 (2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 495 aminokyselin
(B)	TYP: aminokyselinová
(C)	DRUH ŘETĚZCE:
(D)	TOPOLOGIE:
DRUH	MOLEKULY: protein
(D)	Jiné informace:

/poznámka= CSFV Erns mutant 300 G 302 A/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 11S

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

• ♦ · · · · · ·· · · · ···

100

• · ·

• ·

•

• ·

• ·

• · ·

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

lle

Thr

lle

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

lle

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

lle

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

lle

Gly

Pro

Ala

Lys

lle

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

lle

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

lle

Asp

Pro

Trp

lle

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

lle

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

lle

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

lle

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

495

101

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   TUn -VB 3

   Ví se tím, že delecemi a/nebo

   3,

   RNázová

   4,

   RNázová

   1. Živá vakcína obsahující pestivirus, vyznačuj ící se tím, že se deaktivuje RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein E^RNS.

   2. Vakcína podle nároku 1, vyznačující uvedená RNázová aktivita se deaktivuje mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

   Vakcína podle nároku 2, vyznačující se tím, že uvedené delece a/nebo mutace se nacházejí v aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmen Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   Vakcína podle libovolného z nároků 1 až vyznačující se tím, že uveden;

   aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346 uvedeného glykoproteinu, jak se zobrazuje jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmen Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   Vakcína podle libovolného z nároků 1 až vyznačující se tím, že uvedená aktivita se deaktivuje deleci histidinového zbytku v poloze 346 uvedeného glykoproteinu, jak se zobrazuje jako příklad na obrázku č. 1 v případě CSFV kmen Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   Vakcína podle libovolného z nároků 1 až 5 obsahující pestivirus BVDV, vyznačující se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci histidinového zbytku v poloze 346 uvedeného glykoproteinu, jak je • · · · · · ·· ···· ··· ···

   102 zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmen Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech BVDV.

   7. Pestivirus, kde RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein E^RNS, se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu s podmínkou, že aminokyseliny v poloze 297 a/nebo 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech, není lyzin.

   8. Pestivirus podle nároku 7, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   9. Pestivirus podle nároku 7 nebo 8, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   10. Pestivirus podle libovolného nároku 7 až 9, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   11. Pestivirus BVDV podle libovolného z nároků 7 až 10, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech BVDV.

   12. Nukleová kyselina kódující glykoprotein E^RNS, kde RNázová aktivita, kterou vykazuje uvedený glykoprotein, se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu s podmínkou, že • · · ··· ·· ···· ··· ··· • · · · · · ····«·· ·

   103 ····· ·· · ·· ··· aminokyseliny v poloze 297 a/nebo 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídajícím polohám v jiných kmenech, není lyzin.

   13. Nukleová kyselina podle nároku 12, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi aminokyselin uvedeného glykoproteinu v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   14. Nukleová kyselina podle nároku 12 nebo 13, kde uvedená

   RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   15. Nukleová kyselina podle libovolného z nároků nároku 12 až 14, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   16. Nukleová kyselina BVDV podle libovolného z nároků 12 až 15, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech BVDV.

   17. Použití nukleových kyselin podle libovolného z nároků 12 až 16 při přípravě nukleotidových a/nebo vektorových vakcín.

   18. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje vakcínu podle libovolného z nároků 1 až 6 a/nebo pestivirus podle libovolného z nároků 7 až 11 a/nebo nukleotidovou sekvenci podle libovolného z nároků 12 až 16.

   104 • · · • · · · • · · • · · · · • · • > · · ·

   19. Způsob utlumení pestivirů, vyznačuj ící se tím, že se charakterizuje deaktivací RNázové aktivity, kterou vykazuje glykoprotein E^.

   20. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se tím, že RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

   21. Způsob podle nároku 19 nebo 20, vyznačuj ící se tím, že uvedené delece a/nebo mutace se nacházejí u aminokyselin uvedeného glykoproteinu v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   22. Způsob podle libovolného z nároků 19 až 21, vyznačující se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí a/nebo mutací aminokyseliny uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   23. Způsob podle libovolného z nároků 19 až 22, vyznačující se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   24. Způsob produkce specificky utlumené vakcíny, vyznačující se tím, že se charakterizuje deaktivací RNázové aktivity, kterou vykazuje glykoprotein gRNS

   25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

   ·*»· c » · *··

   105 • ···«· ··««·»· · • ···« ··» ·*··« ·· · ««. ···

   26. Způsob podle nároku 24 nebo 25, vyznačuj ící se tím, že uvedené delece a/nebo mutace se nacházejí u aminokyselin uvedeného glykoproteinu v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se zobrazuje jako příklad na obrázku č. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   27. Způsob podle libovolného z nároků 24 až 26, vyznačující se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   28. Způsob podle libovolného z nároků 24 až 27, vyznačující se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   29. Způsob vhodný pro detekovatelně značení pestivirů, vyznačující se tím, že se charakterizuje deaktivací RNázové aktivity, kterou vykazuje glykoprotein t-iRNS

   30. Způsob podle nároku 29, vyznačuj ící se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

   31. Způsob podle nároku 29 nebo 30, vyznačuj ící se tím, že uvedené delece a/nebo mutace se nacházejí u aminokyselin uvedeného glykoproteinu v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   32. Způsob podle libovolného z nároků 29 až 31, vyznačuj ící se tím, že uvedená RNázová • ·

   106 aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   33. Způsob podle libovolného z nároků 29 až 32, vyznačující se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci histidinového zbytku uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   34. Způsob profylaxe a léčby pestivirové infekce u zvířat, vyznačující se tím, že se charakterizuje aplikací vakcíny podle libovolného z nároků 1 až 6 nebo farmaceutického prostředku podle nároku 18 zvířeti, které vyžaduje takovou profylaxi nebo léčbu.

   35. Způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, vyznačující se tím, že se charakterizují deaktivací RNázové aktivity, kterou vykazuje glykoprotein .RNS

   36. Způsob podle nároku 35, vyznačuj ící se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

   37. Způsob podle nároku 35 nebo 36, vyznačuj ící se tím, že uvedené delece a/nebo mutace se nacházejí na aminokyselinách uvedeného glykoproteinu v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   38. Způsob podle libovolného z nároků 35 až 37, vyznačující se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako • ·

   10í *··· · · vyznačuj ící deaktivací uvedené

   -iRNS příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   39. Způsob podle libovolného z nároků 36 až 38, vyznačující se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   40. Způsob přípravy specificky značených pestivirů, se tím, že se charakterizuje

   RNázové aktivity, kterou vykazuje glykoprotein E^f

   41. Způsob podle se tím, že delecemi a/nebo uvedeného glykoproteinu.

   42. Způsob podle nároku 40 nebo 41, vyznačuj ící se tím, že uvedené delece a/nebo mutace se nacházejí u aminokyselin uvedeného glykoproteinu v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   43. Způsob podle libovolného z nároků 40 až 42, vyznačující se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   44. Způsob podle libovolného z nároků 40 až 43, vyznačující se tím, že uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku uvedeného glykoproteinu v poloze 346, jak je zobrazeno jako příklad na obrázku č. Iv případě CSFV kmene Alfort nebo odpovídající polohám v jiných kmenech.

   nároku 40, vyznačuj ící uvedená RNázová aktivita se deaktivuje mutacemi alespoň jedné aminokyseliny

   108 • ······· · · • · · · · · ····· ·· · ·· ···

   45. Použití vakcíny podle libovolného z nároků 1 až 6 při profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat.

   46. Použití farmaceutického prostředku podle nároku 18 při profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat.

   47. Použití pestiviru podle libovolného z nároků 7 až 11 a/nebo nukelotidové sekvence podle libovolného z nároků 12 až 16 při přípravě vakcíny nebo farmaceutického prostředku.

   48. Způsob rozlišení zvířat infikovaných pestivirem od zvířat vakcinovaných specificky utlumeným pestivirem, kde specificky utlumený pestivirus se utlumil způsobem podle libovolného z nároků 19 až 23, vyznačuj ící se tím, že způsob rozlišení zahrnuje:

   1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se předpokládá pestivirová infekce nebo které se vakcinovalo,
2. 2) identifikaci nukleotidové sekvence pestiviru v uvedeném vzorku,
3. 3) korelaci delecí a/nebo mutací nukleotidové sekvence E^RNS, jak je přítomna ve vakcíně, s vakcinovaným zvířetem a korelaci nepřítomnosti uvedených delecí a/nebo mutací s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete.

   49. Způsob podle nároku se tím, že zahrnuje: 48, vyzná č u j ící 1) získání vzorku ze zvířete, u kterého infekce nebo které se vakcinovalo, se očekává pestivirová 2) identifikaci upraveného glykoproteinu E^ utlumeného pestiviru specifickým navázáním monoklonálních nebo

   polyklonálních protilátek na glykoproteiny přítomné v uvedeném vzorku, přičemž uvedené glykoproteiny se upravily způsobem podle libovolného z nároků 19 až 23 a uvedené monoklonální nebo polyklonální protilátky se nevážou na neupravené glykoproteiny E^,

   3) korelaci specifického navázání uvedených monoklonálních nebo polyklonálních protilátek s vakcinovaným zvířetem a korelaci nepřítomnosti navázání protilátky na pestivirovou

   I • · · ··· · · · ···· ··· ····

   10 5 ····· ······· · · • · · · · · · · ····· ·· · ·· ··· infekci uvedeného zvířete za podmínky, že přítomnost pestivirového materiálu v uvedeném zvířeti a/nebo v uvedeném vzorku se stanoví jiným způsobem.

   50. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:

   1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo které se vakcinovalo,

   2) identifikaci nepraveného glykoproteinu pestivirů specifickým navázáním monoklonálních nebo polyklonálních protilátek na glykoproteiny E^RNS přítomné v uvedeném vzorku, přičemž uvedené glykoproteiny se neupravily způsobem podle libovolného z nároků 19 až 23 a uvedené monoklonální nebo polyklonální protilátky se nevážou na upravené glykoproteiny gRNS

   3) korelaci specifického navázání uvedených monoklonálních nebo polyklonálních protilátek s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete a korelaci nepřítomnosti navázání protilátky na vakcinované zvíře za podmínky, že přítomnost pestivirového materiálu v uvedeném zvířeti a/nebo uvedeného vzorku se stanoví jiným způsobem.

   51. Způsob podle nároku 48, vyznačující se tím, že zahrnuje:

   1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo které se vakcinovalo,

   2) stanovení přítomnosti nebo absence RNázové aktivity glykoproteinu E^RNS v uvedeném vzorku,

   3) korelaci nepřítomnosti RNázové aktivity glykoproteinu E^ s vakcinovaným zvířetem a korelaci přítomnosti uvedené aktivity s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete.

   52. Způsob podle nároku 48, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje:

   1) získání vzorku polyklonálních protilátek ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo které se vakcinovalo,

   I • ·· ·· · ·· · ···· ··· ···· lir?·· ···. ·· · ± ± ····· ······· · · • ···· ··· • · · · · ·· · «· ··«

   2) identifikaci specifického navázání polyklonálních protilátek na neupravený glykoprotein E^RNS nebo glykoprotein E^RNS upravený podle vynálezu,

   3) korelaci navázání uvedených polyklonálních protilátek na neupravený glykoprotein E^RNS s pestivirovou infekcí a korelaci navázání uvedených polyklonálních protilátek na glykoprotein E^RNS upravený podle vynálezu s vakcinací.