CZ301494B6 - Živá vakcína - Google Patents

Abstract

Podstatu rešení tvorí živá vakcína obsahující utlumený pestivirus, pricemž v této vakcíne je deaktivována RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein E.sup.RNS.n. delecemi a/nebo mutacemi alespon jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu. Vakcínu je možno použít k lécení a profylaxi infekcí, vyvolaných pestivirem. Soucást rešení tvorí také zpusob rozlišení zvírat, infikovaných pestivirem od zvírat, ockovaných specificky utlumeným pestivirem, který byl oslaben zpusobem podle kteréhokoliv z nároku 9 až 12, postup spocívá v 1) identifikaci nukleotidové sekvence pestiviru ve vzorku, odebraném zvíreti, podezrelému z infekce pesticidem nebo ockovanému zvíreti, 2) korelaci delecí a/nebo mutací nukleotidové sekvence E.sup.RNS.n. prítomné ve vakcíne s ockovaným zvíretem a korelaci neprítomnosti uvedených delecí a/nebo mutací s pestivirovou infekcí zvírete.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká živé vakcíny, obsahující utlumený (oslabený, atenuovaný) pestivirus, v níž je RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein E^RNS deaktivována delecemi a/nebo mutacemi uvedeného glykoproteinu. Vynález se rovněž týká způsobu utlumení pestivirů a způsobu rozlišení zvířat, infikovaných pesíivirem od zvířat, očkovaných utlumeným pestivirem

IU

Dosavadní stav techniky

Pestiviry jsou kauzativní agens ekonomicky významných onemocnění zvířat v mnoha zemích po 15 celém světě. V současné době známé virové izoláty se dělí do tří různých druhů, které společně tvoří jeden rod v čeledí Flaviviridae.

I. Virus bovinní virové diarhey (BVDV) způsobuje bovinní virové průjmové (BVD) a onemocnění sliznic (MD) u telat (popisuje se v publikaci Baker, 1987; Moenning and Plage20 mann, 1992, Thiel et al., 1996).

II. Virus klasické prasečí horečky (CSFV), který se nazývá virus cholery suis (CSF), odpovídá za klasickou prasečí horečku (CSF) nebo choleru suis (HC) (popisuje se v publikaci Moenning and Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).

III. „Border disease virus“ (BDV) se v typickém případě vyskytuje u ovcí a způsobuje „Border disease“ (BD). Uvádí se, že symptomy podobné MD u telat se také objevují po intrauterínní infekci u jehňat s BDV (popisuje se v publikacích Moennig and Plagemann, 1992, Thiel et al., 1996).

Za použití jiné klasifikace se pestiviry popisují v publikaci Becher, P., Konig, M., Paton, D. 1, Thiel, H. J., 1995, Futher characterization of border disease virus isolates: evidence for the presence of more than three species within the genus pestivirus. Virology 209 (1), 200-206 nebo v jiných publikacích.

Pestiviry jsou malé viry s obalem a s genomem tvořeným jednořetězovou RNA pozitivní polarity, které chybí sekvence čepičky na 5'-konci a 3'póly (A). Virový genom kóduje póly protein, který obsahuje přibližně 4 000 aminokyselin, přičemž úpravami při a po translaci vzniká konečný produkt štěpení. Uvedené postupy zahrnují buněčné a virové proteázy. Virové proteiny se uspořáda40 íy do polyproteinu za účelem vzniku NH₂-11¹™--C-E^rns-E1-E2--p7---NS2- NS3 NS4A--NS4B

NS5A-NS5B-COOH (popisuje se v publikaci Rice, C. M. 1996. The pestiviruses. In Fields Virology, eds. Fields, Β. N., Knipe, D. M,, and Howley, P. M. (Lippincott-Raven, Philadelphia), pp. 931-959). Protein C a glykoproteiny E^RNS, El a E2 reprezentují strukturální komponenty pestivirových virionů (Thiel, H. Jstark, R., Weiland, E., Rumenapf, T. and Meyers, G. 1991. Hog cholera virus; molecular composition of virions from a pestivirus. J. Vtrol. 65; 4705^1712.31).

Zjistilo se, že E2 a v menším rozsahu E^RNS tvoří cíle neutralizačních protilátek (popisuje se v publikaci Donis, R. O,, Corapi, W., and Dubovi, E. J. 1988. Neutralizing monoclonal antibodies to bovine virai diarrhea virus hind to the 56K to 58K giycoprotein. J. Gen. Viroi. 69: 77-86, Paton, D. J., Lowings, ). P., Barrett, A. D, 1992, Epitop mapping of the gp53 envelope protein of bovine viral diarrhea virus. Virology 190: 763-772, van Rijn, P. A., van Gennip, H. G., de

Meijer, E. J., Moormann, R. J. 1993. Epitope mapping of envelope giycoprotein El of hog cholera virus strain Brescia. J. Gen. Viroi. 74: 2053-2060, Weiland, E., Stark, R., Haas, B., Rumenapf, T., Meyers, G. and Thiel, H. J. (1990). Pestivirus glykoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide- linked heterodimer. J. Virology 64, 3563-3569).

Glykoproteinu E^RNS chybí membránová kotva a vylučuje se v podstatném množství z infikovaných buněk. Uvádí se, že uvedený protein vykazuje aktivity RNázy (popisuje se v publikaci

Hulst, Μ. M., Himes, G., Newbigin, E. Moormann, R. J. M. 1994. Glycoprotein E2 ofclassical swine fever virus: expression in insect cells and Identification as a ribonucleasa. Virology 200:

558-565, Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. Schneider- Scherzer. and H. J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171, Windish, J. M„ Schneider, R„ Stark, R., Weiland, E., Meyers, G. and Thiel, H. J. 1996. Rnase of classical swine fever virus: biochemical characterization and inhibition by virus-neutralizing monoclonal antibodies. J. Virol. 70: 352-358). Funkce uvedené enzymatické aktivity ve virovém io životním cyklu nejsou známy. V případě vakcinačního kmene CSFV dochází k experimentálnímu poškození RNázy místně řízenou mutagenezí a vede ke vzniku cytopatogenního viru, který vykazuje růstové charakteristiky v buněčné kultuře shodné s virem divokého typu (popisuje se v publikaci Hulst, Μ. M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. lnactivation of the Rnase activity of glycoprotein E^ms of classical swine fever virus results in a eytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157). Enzymatická aktivita závisí na přítomnosti dvou pruhů aminokyselin, které jsou konzervativní mezi pestivirem E^RNS a různými RNázami rostlinného nebo fungálního původu. Obě uvedené konzervativní sekvence obsahují histidinový zbytek (popisuje se v publikaci Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. SehneiderScherzer, and H. J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171.). Záměna každého z těchto zbytků v proteinu E^RNS vakcinačního kmene CSFV za lyzin vede k destrukci aktivity RNázy (popisuje se v publikaci Hulst, Μ. M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1988. lnactivation of the Rnase activity of glycoprotein E^m!l of classical swine fever virus results in a eytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157). Zavedení těchto mutací do genomu vakcinační25 ho kmene CSFV neovlivňuje schopnost viru nebo jeho růstové vlastností, ale vede to ke vzniku viru, který vykazuje slabě cytopatogenní fenotyp (popisuje se v publikaci Hulst, Μ. M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1988. lnactivation of the Rnase activity of glycoprotein E^I11S of classical swine fever virus results in a eytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157).

Vakcíny obsahují utlumené a usmrcené viry nebo virové proteiny exprimované v heterogenních expresívních systémech, které se vytvořily pro CSFV a BVDV a v současné době se používají. Strukturální základ utlumení těchto virů. které se používají jako živé vakcíny není znám. To vede k nebezpečí nepředpokládaných revertantů vznikajících zpětnou mutací nebo rekombinací, k če35 mu múze dojít po vakcinaci, Na druhé straně účinnost deaktivovaných vakcín nebo heterologně exprimovaných virových proteinu (podjednotkové vakcíny) při indukci imunity je spíše nízká.

V obecném případě živé vakcíny s definovanými mutacemi, jako základ pro utlumení, umožní obejít nevýhody vytvoření vakcín. Potencionální cíle tlumicích mutací u pěsti virů nejsou v sou40 časné době dostupné. Další výhodou uvedených tlumicích mutací je jejich molekulová jedinečnost, která umožňuje je použít jako jednoznačné značení v případě utlumených pěst i virů a ty se odlišují od obecných pestivirů.

Vzhledem k důležitosti účinnosti a bezpečnosti stejně jako detekovatelné profy laxe a léčbě pesti45 virových infekcí existuje nutnost vytvořit živé a specificky utlumené vakcíny s vysokým potenciálem indukce imunity stejně jako nutnost definovat základy utlumení, které utlumené viry odlišuji od patogenních pestivirů.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří živá vakcína obsahující utlumený pestivirus, přičemž v této vakcíně je deaktivována RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein E^RNS delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu. Vakcínu je možno použít k léčení a pro55 fylaxi infekcí, vyvolaných pestivirem. Součást řešení tvoří také způsob rozlišení zvířat, infikovaCZ 301494 B6 ných pestivirem od zvířat, očkovaných specificky utlumeným pestivirem, který byl oslaben způsobem podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12, postup spočívá v

1) identifikaci nukleotidové sekvence pestiviru ve vzorku, odebraném zvířeti, podezřelému z infekce pesticidem nebo očkovanému zvířeti.

2) korelaci delecí a/nebo mutací nukleotidové sekvence E^RNS přítomné ve vakcíné s očkovaným zvířetem a korelaci nepřítomnosti uvedených delecí a/nebo mutací s pestivirovou infekcí zvířete.

io Termín „vakcína” znamená farmaceutickou kompozici obsahující alespoň jeden imunologicky aktivní komponent, který indukuje imunologickou odezvu u zvířat a je možné nikoli nezbytné použít jeden nebo více dalších komponentů, které zesilují imunologickou aktivitu uvedeného aktivního komponentu. Vakcína může dále obsahovat další komponenty, které jsou typické pro farmaceutické kompozice. Imunologicky aktivní komponent vakcíny může obsahovat celý živý organizmus buď v jeho původní formě nebo jako utiumene organizmy v tak zvané upravené živé vakcíně (MLV) nebo v organizmech deaktivovaných vhodnými metodami v tzv. mrtvých vakcínách (KV). V jiné formě imunologicky aktivního komponentu vakcíny mohou být obsaženy vhodné elementy uvedených organizmů (podjednotkové vakcíny), přičemž jejich elementy se tvoří buď porušením celého organizmu nebo kultivaci kultury uvedených organizmů a následný20 mi kroky čištění, které vedou ke vzniku požadované struktury nebo vhodnou manipulací podobného vhodného systému, přičemž použití není omezeno na bakterie, hmyz nebo jiné druhy a následnou izolaci a čištění nebo indukci uvedeného syntetického postupu u zvířete nebo vytvoření vakcíny přímým zavedením genetického materiálu za použití vhodných farmaceutických prostředků (polynukleotidová vakcína). Vakcína může obsahovat jeden nebo současně více elemen25 tů. které se popisují shora v textu.

Další komponenty pro zvýšení imunitní odezvy jsou konstituenty, které se běžně nazývají adjuvans, jako je například hydroxid hlinitý, minerální nebo jiné oleje nebo podpůrné molekuly přidané do vakcíny nebo vytvořené v těle po indukci takovými dalšími komponenty, kterými jsou například interferony, interleukiny nebo růstové faktory.

Termín „farmaceutický prostředek” v podstatě obsahuje jeden nebo více ingrediencí schopných modifikovat fyziologické například imunologické funkce organizmu. Tento prostředek se aplikuje do živého organizmu nebo na jeho povrch. Mohou to být například antibiotika nebo antiparazi35 tiká stejně jako konstituenty k nim přidané za účelem dosáhnout jiných jevů, jako jsou znaky zpracování, sterility, stability, možnosti aplikace prostředku enterální nebo parenterální cestou, jako je orální, intranasální, intravenózní, intramuskulámí, podkožní, intradermální nebo jinou vhodnou cestou, tolerance po aplikaci a řízené uvolněné vlastnosti.

Vakcína podle vynálezu znamená vakcínu popsanou shora v textu, kde jeden imunologicky aktivní komponent je pestivirus neboje pestivirového původu.

Termín „živá vakcína” znamená vakcínu obsahující živý zvláště pak živý virový aktivní komponent,

Termín „pestivirus” znamená všechny pestiviry charakterizované tím, že patří do stejného rodu jako BVDV, CSEV a BDV v čeledi Flaviviridae a exprimují glykoprotein E^RNS, Uvedený termín samozřejmě také znamená všechny pestiviry, jak se popisují v publikaci Becher et al., (1995) nebo jiné, které exprimují glykoprotein E^KNS. Termín „aktivita RNázy“ znamená schopnost glykoproteinu E^RNS hydro lyžovat RNA.

Je nutné poznamenat, že termín „glykoprotein E0“ se často používá současně s glykoproteinem E^RNS, jak se popisuje v uvedených publikacích.

-3CZ 301494 B6

Termín „deaktivace RNázové aktivity nacházející se v uvedeném glykoproteinu znamená neschopnost nebo omezenou schopnost upraveného glykoproteinu E^RNS hydrolyzovat RNA. což se porovnává s nemodifikovaným divokým typem uvedeného glykoproteinu F.^RNS.

Deaktivace RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS se může dosáhnout delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu, jak se uvádí zde a v publikaci Hulst, Μ. M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E'^ns of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157). V preferovaném provedení vynálezu se popisují io živé vakcíny, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

Ukázalo se, že glykoprotein E^RNS tvoří homodimér vázaný na disulfid o molekulové hmotností 97 000, kde každý monomer obsahuje 227 aminokyselin, které odpovídají aminokyselinám

268 až 494 polyproteinu CSFV, jak se popisuje v publikaci Rumenapf et al. (1993). Prvních

495 aminokyselin exprimovaných Alfortovým kmenem CSFV je zobrazeno na obrázku č. 1. Genomová sekvence Alfortova kmene CSFV je dostupná v GenBank/knihovna dat EMBL s číslem uložení J04385. V jiném případě aminokyselinová sekvence v případě kmene CP7 BVDV se může najít v GenBank/knihovně dat EMBL (s číslem uložení U63479). Dvě oblasti aminokyselin jsou v glykoproteinu E^RNS vysoce konzervativní stejně jako v některých rostlinných a fungálních proteinech, které vykazují RNázovou aktivitu (popisuje se v publikaci Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. Schneider-Scherzer, and Η. T Thiel. 1993. Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171). Tyto dvě oblasti jsou zvláště důležité pro RNázovou enzymatickou aktivitu. První oblast obsahuje oblast aminokyselin v polohách 295 až 307 a druhá oblast obsahuje aminokyseliny v poloze 338 až 357 uvedeného virového proteinu, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě Alfortova kmene CSFV (Číslování se provádí podle publikované dedukované aminokyselinové sekvence Alfortova kmene CSFV (popisuje se v publikaci Meyers, G„ Rumenapf, T. and Thiel, Η. T 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence ofthe genome of hog cholera virus. Virology 171: 555 567). Aminokyseto liny, které jsou důležité při RNázové aktivitě, jak se uvádí shora v textu, nejsou žádným způsobem omezeny na přesné polohy, jak se definuje v případě Alfortova kmene CSFV, ale používají se jednoduchým způsobem, aby se ukázalo, že preferované aminokyseliny jsou v uvedené poloze nebo odpovídají aminokyselinám v uvedené poloze jiných kmenů jak je možné zjistit v obecném případě u BVDV, BDV a pěsti virů, protože jsou vysoce konzervativní. V případě pestivirů, které jsou jiné než Alfortův kmen CSFV, číslování poloh preferovaných aminokyselin se často liší, ale odborník v oboru molekulární biologie pestivirů jednoduše identifikuje tyto preferované aminokyseliny na základě jejich polohy vztažené vůči vysoce konzervativním aminokyselinám uvedeného glykoproteinu. V jednom určitém nelimitujícím příkladu je poloha CSFV Alfort 346 identická s polohou 349 kmene cp7 BVDV.

Vynález popisuje ve více preferovaném provedení vynálezu vakcínu podle vynálezu, kde uvedené deaktivuj ící delece a/nebo mutace se nacházejí v aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se popisuje na obrázku č. I v případě CSFV Alfortova kmene nebo odpovídá polohám aminokyselin uvedeného glykoproteinu v jiných kmenech.

Ve velmi preferovaném provedení vynálezu se uvádí, že deaktivace uvedené RNázové aktivity delecí nebo mutací aminokyseliny v poloze 346 uvedeného glykoproteinu vede ke vzniku zvláště použitelné živé vakcíny. Vynález dále popisuje vakcíny podle vynálezu, kde RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě

CSFV Alfortova kmene.

Vynález demonstruje, že pestiviry jsou dostupné a kódují protein E^RNS bez RNázové aktivity, v případě, že se deletuje histidinový zbytek v poloze 346 virového polyproteinu (číslování se provádí v souladu s publikovanou sekvencí CSFV Alfort/Tubingen (popisuje se v publikaci Meyers.

G„ Rumenapf, T. and Thiel, Η. T 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence ofthe

-4CZ JU14y4 B6 genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567), který reprezentuje jeden z konzervativních zbytků putativního místa E^RNS RNázy. Vynález dále popisuje, že delece histidinu v proteinu

E^RNS pestiviru BVD (v poloze 349, číslováno v souladu se sekvencí BVDV CP7 GenBank/EMBL (číslo uložení U63479) vede ke vzniku dostupného viru, kde glykoprotein E^RNS ztratil RNázovou aktivitu. Na rozdíl od bodových mutací, kde dochází k záměně jedné aminokyseliny za jinou, deleční mutanti jsou v obecném případě daleko stabilnější s ohledem na revertanty. Infekce prasat mutantem patogenního kmene CSFV Alfort/Tubingen exprimujícím E^RNS s touto deleci nevede k horečce ani k jiným typickým klinickým příznakům infekcí CSFV, zatímco infekce virem divokého typu způsobuje horečku, průjem, anorexii, apatyi, depleci B-buněk a poruchy centrálio ního nervového systému. Tyto prasata se usmrtila 14 dní po inokulaci ve fázi umíráni, kdy se objevilo silné krvácené kůže a vnitřních orgánů. Infikovaná prasata nevykazují ani viremii ani depleci B-buněk, jak se ukázalo v testech provedených 3., 5., 7., 10. a 14 den po infekci, zatímco CSFV se jednoduše izolovaly ze vzorků krve získaných z prasat inokulovaných virem divokého typu. Deleční mutant se zjevně replikuje ve zvířatech, jak se indikuje indukcí neutralizujících (5 protilátek (popisuje se v příkladu 3, tabulka č. 3c). imunní odezva na mutantní virus je dostatečná, aby umožnila přežít smrtelnou dávku 2x10^ TClD₅o vysoce patogenní infekce kmenem CSFV Eystrup (Konig, 1994), který je heterologní s kmenem Alfort. Testovaná zvířata nevykazují typické klinické příznaky infekce CSFV, jako je horečka, průjem, krvácení, deplece B-buněk nebo anorexie, po opakované infekci. Tato data demonstrují, že infekce prasat s delečními mutanty indukuje imunitní odezvu dostatečnou pro ochranu proti přísné vakcinaci.

V nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují vakcíny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivovala deleci hístidinového zbytku v poloze 346, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort.

V dalším preferovaném provedení vynálezu se popisuje BCDV vakcíny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci hístidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort.

V jiném provedení vynálezu se popisují utlumené pestiviry, kde RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^RNS se deaktivuje deleci a/nebo mutací alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu s podmínkou, že aminokyseliny v polohách 297 a/nebo 346 uvedeného glykoproteinu, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě CSFV, nejsou lyzin. Rekombinantní pestivirus, kde aminokyseliny v poloze 297 a/nebo 346 uvedeného glykoproteinu jsou lyzin, se popisují v publikaci Hulst, Μ. M.. F. E: Panoto, A. Hooekmann. H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E^ms of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157. Tyto zvláštní pestiviry demonstrovaly cytopatické účinky v ledvinových buňkách prasat. Až do dnešního dne nedošlo ke zhodnocení nových tlumicích rysů způsobených deaktivací enzymatické aktivity proteinu E^RNS.

to

V preferovaném provedeni vynálezu popisuje pestiviry podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje dclccemi a/nebo mutacemi provedenými na aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě CSFV A1 fořtova kmene.

Ve více preferovaném provedení vynálezu se popisují pestiviry podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort.

V nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují pestiviry, kde RNázová aktivita je potlačena deleci hístidinového zbytku v poloze 346. jak se popisuje na obrázku č. I v případě kmene CSFV Alfort.

-5CZ 301494 Bó

V dalším nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují pestiviry BVDV, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě CSFV Alfortova kmene.

Utlumené pestiviry a aktivní komponenty vakcín podle vynálezu se mohou jednoduše připravit rekombinantními metodami modifikace nukleové kyseliny, které vedou k expresi mutantní aminokyselinové sekvence v glykoproteinu E^RNS. Vynález dále popisuje nukleové kyseliny kódující glykoprotein E^RNS, kde RNázová aktivita obsažená v uvedeném glykoproteinu se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu s podmínkou, lo že aminokyseliny v poloze 297 a/nebo 346 glykoproteinu, jak se popisuje na obrázku ě. 1 v případě CSFV Alfortova kmene, nejsou lyzin.

V preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi, které se nacházejí v aminokyselinách is v poloze 296 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se uvádí na obrázku ě. I v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Ve více preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

V nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

V dalším nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny BVDV podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Nukleotidy například DNA nebo RNA je možné také použít při přípravě vakcín tvořených DNA, RNA nebo vektory. V těchto vakcínách se nukleotidy aplikují přímo do zvířete nebo nepřímo prostřednictvím vektorů, které v tomto případě nepochází z původního viru. Nukleotidové a vektorové vakcíny jsou dobře známy v oboru.

Dále vynález popisuje použití nukleových kyselin podle vynálezu vhodných pro přípravu nukleotidových a/nebo vektorových vakcín.

Vakcíny, utlumené pestiviry a nebo nukleové kyseliny podle vynálezu je možné zvláště použít při přípravě farmaceutického prostředku.

Dále vynález popisuje farmaceutické prostředky obsahující vakcínu podle vynálezu a/nebo pěsti45 virus podle vynálezu a/nebo nukleotidovou sekvenci podle vynálezu, Jeden neomezující příklad takového farmaceutického prostředku se připravuje následujícím způsobem: supematant infikované buněčné kultury se smíchá se stabilizátorem (například spermidin a/nebo BSA (albumin bovinního séra) a smčs se následně lyofilizuje nebo dehydratuje jinými metodami. Před vakcinaci se uvedená směs opětně hydrazuje vodou (například fyziologickým roztokem, PBS (fyziologicko kým roztokem puťrovaným fosforečnanem) nebo nevodnými roztoky (například emulzí, adjuvans založeným na hliníku).

Vynález dále popisuje způsob tlumení pestivirů. Vynález dále popisuje jedinečnou a nepředvídatelnou metodu tlumení pestivirů charakterizovanou tím, že se deaktivuje RNázová aktivita v gly55 koproteinu E^RNS.

-6CZ 301494 B6

Specificky utlumené pestiviry je zvláště výhodné použít při přípravě vakcín. Vynález dále popisuje metody produkce specificky utlumených pestivirových vakcín charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita glykoproteínu E^RNS.

Deaktivace RNázové aktivity obsažené v glykoproteínu E^RNS poskytuje novou metodu detekovatelně značených pestivirů. Vynález dále popisuje metodu detekovatelného značení pestivirů charakterizovanou tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteínu E^RNS. Nepřítomnost RNázové aktivity obsažené v glykoproteínu E^RNS pestivirů podle vynálezu nyní umožňuio je detekovatelné značení uvedených pestivirů. Značené a neznačené pestiviry nebo E^rss vylučované z buněk infikovaných pestivirem v tělních tekutinách se mohou jasně odlišit přítomností a nepřítomností RNázové aktivity glykoproteinů E^rns po izolaci a testování uvedené enzymatické aktivity.

V případě pestivirů deaktivace jejich RNázová aktivity obsažené v glykoproteínu E'¹¹” deíeci a/nebo mutací se může provést řadou jiných způsobů. Takové pestiviry se mohou jednoduše detekovat vzhledem ke struktuře vzniklé na základě takových delecí a/nebo mutací. Sekvenční rozdíl sekvence nukleové kyseliny změněného glykoproteínu E^RNS je detekovatelný sekvenováním nukleové kyseliny nebo metodou PCR, jak se popisuje v příkladu 8. Změněné proteinové sekven20 ce se mohou detekovat specifickými monoklonálními protilátkami, které nerozeznávají nezměněné proteiny. Je také možné detekovat změněné a tím strukturálně značené proteiny tím, že se naváží specifické monoklonální protilátky, které nerozeznávají nezměněné glykoproteiny E^RNS za podmínek, že se nepřítomnost pestivirů může stanovit jiným způsobem. Detece a/nebo mutace odstraňující RNázovou aktivitu u značených vírů povede k různým imunitním odezvám u zvířat, kdy se porovnávají s odezvou, která je výsledkem infekcí neznačenými pestiviry.

Preferované provedení vynálezu popisuje metody utlumení pestivirů, způsoby produkce specificky utlumené pěst i virové vakcíny a způsoby vhodné pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu, přičemž jde o metody vztahující se k deaktivaci glykoproteínu E^RNS, kde uvedená RNá30 zová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteínu.

Preferované provedení vynálezu popisuje metody utlumení pestivirů, metody produkce specificky utlumených pestivirových vakcín a metody vhodné pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu. Tyto metody souvisí s deaktivací glykoproteínu E^RNS, kde uvedené delece a nebo mutace se provedly na aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 a/nebo 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteínu.

Dále vynález popisuje způsoby utlumení pestivirů, metody produkce specificky utlumené pěst i virové vakcíny a metod vhodných pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby se vztahuji k deaktivaci glykoproteínu E^!ÍN\ kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmeny CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám vjiných kmenech uvedeného glykoproteínu.

Dále vynález popisuje způsoby utlumení pestivirů, metody produkce specificky utlumené pestivírové vakcíny a metody vhodné pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu. Tvto způsoby se vztahují k deaktivaci glykoproteínu E^rnS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene

CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám vjiných kmenech uvedeného glykoproteínu.

Vynález dále popisuje vakcíny a/nebo jiné farmaceutické prostředky, které je možné částečně použít při profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat. Vynález dále popisuje metody použitelné při profy laxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat charakterizovaných tím, že vakcína podle

vynálezu nebo jiný farmaceutický prostředek podle vynálezu se aplikuje zvířeti, který potřebuje takovou profylaxi nebo léčbu.

Vynález dále popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů charakterizovaných tím.

že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^RNS.

Vynález dále popisuje způsob přípravy specificky značených pestivirů charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^RNS.

id V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů a způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminoky seliny uvedeného glykoproteinu,

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi aminokyselin v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kme20 nech uvedeného glykoproteinu,

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje dele25 cí a/nebo mutací aminokyseliny v poloze 345, jak se uvádí na obrázku č, 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje de lečí a/nebo mutací histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č, 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Vakcíny nebo jiné farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou použitelné při profylaxi a léčbě pěsti virové infekce u zvířat.

Vynález popisuje použití vakcíny podle vynálezu při profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat. Dále vynález popisuje použití farmaceutického prostředku podle vynálezu vhodného pro profylaxi a léčbu pestivirových infekcí u zvířat.

Pestiviry a/nebo nukleové kyseliny podle vynálezu jsou použitelné aktivní komponenty farmaceutického prostředku nebo vakcíny, Vynález proto popisuje použití pestivirů podle vynálezu a/nebo nukleové kyseliny podle vynálezu při přípravě vakcíny nebo farmaceutického prostředku,

Jak se popisuje shora v textu deaktivace RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS poskytuje novou metodu značení pestivirů.

Vynález dále popisuje způsoby vhodné pro rozlišení detekovatelně značených pestivirů podle vynálezu od neznačených a pravděpodobně patogenních pestivirů. Takové metody jsou zvláště použitelné při stanovení účinnosti značených pestivirů u zvířat. Prokázalo se, že zvíře, kterému se aplikovala vakcína, vykazuje, po získání vzorku z takového zvířete a testování, pozitivní značení. Neoznačené a specificky neznačená zvířata, která vykazují přítomnost pestivirů se mohou ihned oddělit, izolovat nebo usmrtit, aby se předešlo rozšíření patogenní infekce na další zvířata.

-8Cl 301494 B6

Vynález popisuje metodu detekovatelné značených pěst i virů charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^RNS. Nepřítomnost RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS pestivirů podle vynálezu nyní umožňuje detekovatelné značení těchto pestivirů. Výsledné značené a neznačené pestiviry se mohou jasně odlišit přítomností nebo nepřítomností RNázové aktivity glykoproteinu E^RNS na izolaci a testování takové enzymatické aktivity. Stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti této enzymatické aktivity na získání vzorku obsahující pestivirus nebo jeho materiál se může uskutečnit za použití standardních metod, jak se například popisuje v příkladu 2 nebo v publikaci Hulst, Μ. M., Himes, G., Newbigín, E., Moormann. R. J. M. 1994. Glycoprotein E2 of elassieal swine ťever virus: expression in insect cells io and Identification as a ríbonucleas. Virology 200: 558-565.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob vhodný pro odlišení zvířat infikovaných pěsti virem od zvířat vakcino váných specificky utlumeným pěsti virem podle vynálezu, který obsahuje následující kroky:

(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se předpokládá pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení absence nebo přítomnosti RNázové aktivity glykoproteinu E^RNS v uvedeném vzor20 ku, (3) korelace nepřítomnosti RNázové aktivity glykoproteinu E^RNS s vakcinovaným zvířetem a korelace přítomnosti uvedené aktivity s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete.

Vynález popisuje pestiviry, kde se deaktivovala jejich RNázová aktivita v glykoproteinu ff delecí a/nebo mutací. Takové pestiviry je možné jednoduše detekovat na základě jejich struktury, která vzniká uvedenými de lečem i a/nebo mutacemi. Sekvenční rozdíl genu E^RN\ který kóduje změněný glykoproteín E^RNS, je detekovatelný sekvenační metodou nebo PCR. Vynález popisuje preferované provedení metody vhodné pro odlišení zvířat infikovaných pěsti virem od zvířat, kterým se aplikovala vakcína se specificky utlumenými pestiviry podle vynálezu. Tato metoda zahrnuje následující kroky:

(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení nukleotidové sekvence pestivirového genomu nebo proteinu v uvedeném vzorku, (3) korelace delecí a/nebo mutací nukleotidove sekvence proteinu E^RNS přítomné ve vakcíně s vakcinovaným zvířetem a korelace nepřítomnosti uvedených delecí a/nebo mutací s pesti40 virovou infekcí uvedeného zvířete.

Strukturální změny, které jsou výsledkem změněné proteinové sekvence glykoproteinu E^RNS pestivirů podle vynálezu, se mohou detekovat specifickými monoklonálními nebo polyklonálními protilátkami, které nerozeznávají nezměněné proteiny.

Další provedení vynálezu popisuje způsob odlišení zvířat infikovaných pestiviry od zvířat vakeinovaných utlumeným pestivirem podle vynálezu, který zahrnuje kroky:

(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se apliko50 vala vakcína, (2) stanovení modifikovaného glykoproteinu E^RNS utlumeného pestivirů specifickým navázáním monoklonálních nebo polyklonálních protilátek na glykoproteinu E^RNS přítomný v uvedeném vzorku, přičemž uvedené glykoproteiny se modifikovaly metodou podle vynálezu, přičemž

-9C7. 301494 B6 uvedené monokíonální nebo polyklonální protilátky se nevážou na nemodifikované glykoproteiny E^RNS, (3) korelace specifického navázání uvedených monoklonálních nebo polyklonálních protilátek s vakcinovanýrn zvířetem a korelace nepřítomnosti protilátek, které se váží na pěsti virovou infekci uvedeného zvířete za podmínky, že přítomnost pestivirového materiálu v uvedeném zvířeti a/nebo v uvedeném vzorku se stanoví jiným způsobem.

Je možné detekovat změněné a strukturálně značené proteiny pomocí neschopností vázat speciιυ fické nebo polyklonální protilátky, které rozeznávají pouze nezměněné glykoproteiny E^RNS, přičemž přítomnost pestivirů se může stanovit jiným způsobem. V preferovaném provedení vynálezu se popisuje metoda pro odlišení zvířat infikovaných pestiviry od zvířat vakcinovaných utlumeným pestivirem podle vynálezu, který zahrnuje kroky:

(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení nemodifikovaného glykoproteinu E^rnS pestivirů specifickým navázáním monoklonálních nebo polyklonálních protilátek na glykoproteiny E^RNS přítomný v uvedeném

2« vzorku, přičemž uvedené glykoproteiny se nemodifikovaly metodou podle vynálezu, přičemž uvedené monokíonální nebo polyklonální protilátky se nevážou na modifikované glykoproteiny E^RNS, (3) korelace specifického navázání uvedených monoklonálních nebo polyklonálních protilátek s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete a korelace nepřítomnosti protilátek, které se váží na vakcinované zvíře za podmínky, že přítomnost pestivirového materiálu v uvedeném zvířeti a/nebo v uvedeném vzorku se stanoví jiným způsobem.

Výsledkem modifikace struktury a nepřítomnosti RNázové aktivity ve značených virech podle vynálezu ve srovnání s odezvami vycházejícími z neznačených pestivirových infekcí budou různé imunitní odezvy u zvířat. Pestiviry podle vynálezu vyvolávají různou a zřetelnou imunitní odezvu, buněčnou stejně jako humorální, které se liší od nemodifikované stejně jako patogenní imunitní odezvy. Výsledkem aplikace glykoproteinů E^RNS podle vynálezu jsou polyklonální protilátky, které se liší svojí vazebnou specifitou, když se porovnávají s polyklonálními protilátkami vzniklými aplikací nemodifikovaných glykoproteinů. Tyto rozdíly ve vazebné spec i fl tě poskytují značení vhodné pro rozlišení zvířat vakcinovaných pestiviry podle vynálezu od zvířat infikovaných obecnými pestiviry. Popisují se testy, které se používají pro zjištění specifických polyklonálních protilátek v testovacím séru, které se bud¹ váží ne epitop divokého typu nebo značí deleční mutaci uvedeného epitopu za účelem diferenciace infikovaných a vakcinovaných zvířat.

V publikaci Kit, M. and S. Kit, 1991. Sensitive glykoprotein gill blocking ELISA to distinquish between pseudorabies (Aujeszky's disease)- infected and vaccinated pigs. Veterinary Microbiology 28: 141-155 se například popisují testy použitelné v případě prasat infikovaných a vakcinovaných pseudorabies.

V preferovaném provedení vynalezu se popisuje způsob rozlišení zvířat infikovaných pestivirem od zvířat vakcinovaných utlumeným pestivirem podle vynálezu, který' zahrnuje následující kroky:

1) získání vzorku polyklonálních protilátek ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení nespecifického navázání uvedených polyklonálních protilátek na nemodifikovaný glykoprotein E^RNS nebo na glykoproteiny E^RNS upravený podle vynálezu,

- 10CZ 301494 B6 (3) korelace navázání uvedených polvklonálních protilátek na nemodifikovaný glykoprotein

E^1íns s pestivirovou infekcí a korelace nepřítomnosti protilátek, které se váží na uvedené polyklonální protilátky proti glykoproteinu E^RN\ který se upravil podle vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázku č. 1 je zobrazeno prvních 495 aminokyselin exprimovaných kmenem Alfort CSFV. Zobrazená sekvence ukazuje prvních 495 aminokyselin jak se exprimují kmenem Alfort CSEV io (popisuje se v publikaci Meyers, G._f Rumenapf, T. and Thiel, El. J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence oťthe genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567). Jeden monomer glykoproteinu E^RNS uvedeného kmene odpovídá aminokyselinám 268 až 494, jak se popisuje v publikaci Rumenapf, T., Unger, G., Strauss, J. H, and Thiel, H. J. 1993. Processing of the evelope glycoproteins of pěstiviruses. J. Virol. 67: 3288-3294, Podtrženy jsou zbytky 295 až 307 i? a 338 a 357 reprezentující oblasti vykazující homofogii s rostlinnými a fungáinimi RNázami (popisuje se v publikaci Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. Sehneider-Scherzer, and

H. J. Thiel. 1993. Identification of a struetural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease.

Science 261: 1169-1171).

Na obrázku č. 2 je zobrazena teplotní křivka teplot měřená v rektu zvířat po testované infekci.

Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 2. dne až do 18. dne po infekcí.

Uvádí se křivka tělesné teploty měřené v rektu v případě každého zvířete ve skupině infikované virem v(pA/CSFV) (nepřetržitá čára) získaného z plazmidu pA/CSFV nebo virem V(pA/C-346d) získaným z plazmidu pA C-346- d (tečkovaná čára).

Na obrázku ě. 3 je znázorněna křivka tělesné teploty zvířat po infekci. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 1. dne až do 21. dne po infekci. Zvířata infikovaná mutantem C-346-d [V(pA/C-346-d)] se po 69 dnech infikovala letální dávkou CSFV kmene Eystrup. Detaily se popisují v textu. Uvádí se křivka tělesné teploty měřené v rektu v případě každého zvířete ve skupině infikované virem CSFV kmene Eystrup v koncentraci 2x10^sTCID_5O.

Na obrázku č. 4 je zobrazena teplotní křivka teplot měřená v rektu zvířat po testované infekci.

Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 0. dne až do 18. dne po infekci.

Uvádí se křivka tělesné teploty měřené v rektu v případě každého zvířete ve dvou skupinách 35 infikovaných bud¹ C-346-d [V(pA/CSFV)J (tečkovaná čára) nebo znovu získaného viru C-346d/RS [V(pA/C-346-d)J (nepřetržitá čára).

Na obrázku č. 5 je zobrazena tělesná teplota zvířat měřená v rektu po infekci v experimentu č, 2.

Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 1. dne až do 10. dne po infekci 40 virem. Zvířata infikovaná mutantem C-346-d se po 37 dnech infikovala ietální dávkou CSFV kmene Eystrup (2x10⁵ TCID₅₍₎).

Na obrázku č. 6 je zobrazená tělesná teplota zvířat měřená v rektu, která se ošetřila dvojitým mutantem popsaným v příkladu 6 dále v textu. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zazname45 návala denně před a po infekci virem s mutantem V(pA/C-297-L/346-L).

Na obrázku ě. 7 je zobrazena diskriminace mezi C-346-d a CSFV, který nevykazuje deleci histidinového kodonu 346, pomocí RT-PCR podle příkladu 8.

a) Primer ΟΙ H-3/OI E^msStop umožňuje specificky amplifikovat pruh získaný z RNA obsahující deleci kodonu 346 (C-346-d), jak se popisuje detailněji v příkladu 8. Naopak RNA, která neobsahuje uvedenou deleci nereaguje s uvedeným párem primerů (C-WT, C- 346-U. C-346-K).

- 11 C7. 301494 B6

b) a e) Další dvě kombinace příměrů (Ol H+2 a ΟΙ H+3) umožní ampliflkovat pruhy získané z RNA, které neobsahují delecí kodonu 346 (ΟΙ H+2 a Ol H+3). Žádný pruh není možné pozorovat v případě, že se jako templát použije RNA z 346 delečního mutantu C-346-d.

s

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Vytvoření pestivirových mutantú, které neobsahují Rnázu io

Pří tvorbě subklonů se jako počáteční materiál použily klony cDNA v plné délce pA/CSV (popisuje se v publikaci Meyers, G., Thiel, H. J. and Rumenapf, T. 1996a. Classícal swine fever virus: Recovery of infectious viruses from eDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. J. Virol, 67; 7088-709526) nebo pA/BVDV (popisuje se v publi15 kaci Meyers, G., Tautz, N., Becher, P„ Thiel, H. J. and Kummerer, Β. M. 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral dierrhea viruses from cDNA constructs. J. Virol., 70: 8606-8613), ze kterých je možné získat infekční cRNA transcripcí in vitro. V případě CSFV se fragment Xhol/SspI pA/CSFV klonoval do plazmidu pBluescript SK+, který se štěpil restrikčními enzymy Xhol a Smál. V případě BVDV se fragment Xhol/BglII z pA/BVDV klonoval do plazmidu pCITE-2C, který se štěpil stejnými restrikčními enzymy, Z těchto konstrukcí vznikla jednořetězcová plazmidová DNA za použití Kunkelovy metody (popisuje se v publikaci Kunkel, T. A., J. D. Roberts, and R. A. Zakour. 1987. Rapid and efficient síte-speeifíe mutagenesis witbout pbenotypic selection, Methods Enzymol. 154: 367-392), přičemž se používají buňky E. coli CJ 236 (BioRad) a jed no řetězcové fágy VCMS (Stratagene). Jedno25 řetězcová DNA se přeměnila na dvouřetězcovou za použití sady „Phagemíd in vitro Mutagenesis Kir‘ (BioRad). Některé ze syntetických oligonukleotidů, které se používají jako primery při přípravě požadovaných pestivirových mutantú, jsou uvedeny dále v textu:

C-297-L: AGGAGCTTACTTGGGATCTG

C-346-L: GGAACAAACTTGGATGGTGT

C-297-K: ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC

C-346-K: ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA

C-346-d: GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC

B-346-d: CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAACTGG

Při transformaci buněk mikroorganizmu E. coli XL 1 Blue (Stratagene) se použila dvouřetezcová au plazmidová DNA. Kolonie bakterií, které nesou plazmidy, se izolovaly selekcí na ampicilinu.

Připravila se plazmidová DNA a dále se analyzovala sekvenováním nukleotidů za použití sekvenační sady s polymerázou T7 (Pharmacia). Plazmidy obsahující požadované mutace a nevykazující žádné další změny na druhém miste se použily při konstrukci klonů cDNA v plné délce. V případě CSFV se fragment Xhol/Ndel z mutagenizovaného plazmidu začlenil spolu s fragmen35 tem Ndel/BgHI odvozeného z plazmidu 578 (pCITE 2A, obsahující fragment Xhol/BglII zpA/CSFV) do plazmidu pA/CSFV štěpeného restrikčními enzymy Xhol a Bglll. Za účelem získání mutantu BVDV CP7 se fragment Xhol/BglII obsahující delecí začlenil do pA/BVDV, který se štěpil restrikčními enzymy Xhol a Ncol, spolu s fragmentem BglII/NcoI izolovaným pA/BVDV/Ins--. cRNA se transkribovala z konstrukce pA/BVDV/Ins- za vzniku BVDV, který není cytopatogenní a je vhodný pro transkripci do vhodných buněk (popisuje se v publikaci Meyers, Ci., Tautz, N„ Becher, P., Thiel, H, J. and Kummerer. Β. M. 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral dierrhea viruses from cDNA constructs. J, Virol., 70: 8606-8613). Amplifikovaly se různé délky klonů a izolovaly se jednotlivé plazmidy. Přítomnost požadovaných mutací se prokázala sekvenováním DNA. Po linearizaci DNS restrikčním enzymem Srfl (klony CSFV plné délky) nebo Smál /klony BVDV plné délky) se cRNA přepsala, jak se popisuje shora v textu v publikacích Meyers, G., Tautz, N., Becher, P..

Thiel, H. J. and Kummerer, Β. M. 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovíne viral dierrhea viruses ťrom cDNA constructs. J. Virol., 70: 8606-8613, Meyers, G„ Thiel,

H. J. and Rumenapf, T. 1996a. Classical swine fever virus: Recovery of infectious viruses ťrom cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. T Virol. 67: 7088-709526. RNA se čistila gelovou filtrací a extrakcí směsí chloroformu a fenolu a použila se při transfekci buněk prasečích (PK15) nebo bovinních ledvin (MDBK klon B2) (konstrukce CSFV nebo BVDV). Transfekce se analyzovala imunofluoreseencí se sérem specifickým pro io virus. V případě, kde se mohl získat požadovaný mutant (je pozitivní imunofluorescenčním testu), se viry amplifikovalv pasážováním ve stejné buněčné linii za použití transfekčních experimentů. Další analýza mutantů CSFV zahrnuje stanovení jednokrokových růstových křivek a charakterizaci vírové RNA Northemovým blotem za použití sond cDNA, které jsou specifické pro virus, stejně jako reverzní transkripční polymerázovou řetězovou reakci (RT-PCR) a násled15 né sekvenováni fragmentů PCR, aby se ověřila přítomnost požadovaných mutací ve virovém genomu. Ve všech případech se prokázala přítomnost požadovaných mutací. Všechny získané viry rostly dobře a produkovaly podobné množství RNA právě tak jako virus, který vznikl z plazmidu, jenž vykazuje sekvenci divokého typu.

2ΰ Schopnost mutantů přežít se prokázala transfekcí cRNA a oddělením buněk po třech dnech. Část buněk se nanesla na plotny o průměru 3,5 cm, den poté se fixovaly směsí aceton/metanoi a pak se analyzovaly imunofluoreseencí za použiti směsi monoklonálních protilátek specifických pro BVDV (popisuje se v publikaci Weiland, E„ Theil, Η. T, Hess, G., and Weiland, F., (1989). Development of monoclonal neutralízing antibodies against bovíne viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normál bovine cells and cyclophosphamide. J. Virol. Methods 24: 237-244). Všechny buňky byly pozitivní, zatímco kontrola buněk transfekovaných neinfekční RNA nevykazuje žádný signál. Zčásti buněk transfekovaných cRNA se produkoval extrakt v jednom cyklu zmražení a tání. Čerstvé buňky se infikovaly tímto buněčným extraktem a za použití imunofluorescence specifické pro BVDV se tři dni po infekci prokázalo, že jsou BVDV pozitivní.

b \|C

V tabulce č, 1 je uvedeno shrnutí různých změn zavedených do konzervativních sekvencí E reprezentující putativní aktivní místo RNázy, které kóduje určitý virový mutant

Ϊ abulka č. 1:

název i sekvence v incLivj RNázy

	aktivita	schopnost
		tantů . ořeiít |

pA/CSFV	. . SLHGI W P E K l C.. .	...rhewnkhgwcnw,.	+
C-297-L	. . S LLG l W P E Kl C. . .	...RHEWNKHGWCNW..	-	+
C-34B-L	..SLHGIWPEKIC...	, , . R H EW N KLGW C N W . .	-	+
C-297-L7346-L .	..SLLGIWPEKIC...	...RH EW N KLG W C N W ..	-	+
C-297-K	.. S LKG I W P EKl C. . .	...rhewnkhgwcnw,.	-	+
C-346-K	..SLHGIWPEKIC...	, ,, R Η E W N K K G W C N W . ,	-	+
C-297-d	,.SL_GIWPEK!C. ..	. ., R H EW N KHGWC N W . .	-	-
C-346-d	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW.,	-	+
C-296/7/8-d .	..S___IWPEKIC.,,	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-345/6/7-d	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWN___WCNW.,	-	-
C-345/6-d	..SLHGIWPEKIC.,.	...RHEWN __GW CN W . .	-	-
C-346/7-d	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWNK _ _WCNW..	-	-
C-342-d	..SLHGIWPEKIC...	... R H_W N KHGWC N W ..	-	-
C-342/6-d	, .SLHGIWPEKIC. . .	.. .R H_W N K _G W C N W . .	-	-
C-301-d	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-295-S/G	. . G L H G I W P E K I C.. .	, . . R H EW N KHG W C N W . .	-	+
C-300-W/G	..SLHGIGPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	+
C-302-E/A	. . SLHG I W P AK l C...	...rhewnkhgwcnw..	-	-
C-305-C/G	,,SLHGIWPEK!G...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-300-W/G-302-E/A .SLHGlGPAKIC, ..	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-340-R/G	..SLHGIWPEKIC...	...GHEWNKHGWCNW..	-	-
C-343-W/G	..SLHGIWPEKIC...	...RHEGNKHGWCNW..	-	-
C-345-K/A	..SLHGIWPEKIC...	.. .RHEWN AHGWCNW.,	-	-
C-297-K7346-K .	..SLKGIWPEKIC...	. .. R HEWNKKGWCN W . .	-	+
C-297-K/346’L .	. . SLKG i W P EKI C. . . ,	RHEWN KKGWCNW..	-	+
pA/BVDV	.SLHGIWPEKIC...	...rhewnkhgwcnw..	+	+
3‘346-c	.SLHGIWPEKIC...	...RHEWNK_GWCNW..	-

Popis tabulky č. 1: Test aktivity RNázy se provedl v krátkodobém testu. Buňky BHK2I se infikovaly virem vakeínie vTF7 3 (popisuje se v publikaci Fuerst T. R. et al., 1986. Eukaryotic transient expression systém based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase. Proč. Nati. Acad. Sci. 83: 8122-8126) a pak se transfekovaly konstrukcí cDNA (5 pg plazmidové DNA, transfekce za použití Superfect, jak doporučuje dodavatel firma Qiagen)). Po 10 hodinách inkubace při teplotě 37 °C v inkubátoru v atmosféře CO? se transfekované buňky analyzovaly a stanovila se aktivita RNázy, jak se popisuje dále v textu). Schopnost id buněk přežít se stanovila způsobem popsaným dále v textu.

Příklad 2: Účinek různých mutací na RNázovou aktivitu glykoproteinu E^RNS

Za účelem testování účinku různých mutací na RNázovou aktivitu glykoproteinu E^kNS se vhodné buňky infikovaly mutantními viry. V případě CSFV se provedla infekce při hodnotě muItiplicity infekce (m.o.i.) 0.01. Infekce divokým virem sloužila jako pozitivní kontrola, zatímco neinfikované buňky se použily jako negativní kontrola. 48 hodin po infekcí se buňky promyly dvakrát . 14.

fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem a lyžovaly se v lyzačním pufru o objemu

0,4 ml (20 mM Tris/HCI, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA. 2 mg/ml albuminu bovinního séra, 1 %

Triton X100, 0,1 % deoxycholová kyselina, 0,1 % SDS), Lyzát se přenesl do reakční zkumavky o objemu 1,5 ml, sonifikoval se (sonikátor Branson B12, za podmínek 120 W, 20 s ve vodní lázni). Dále se centrifugoval po dobu 5 min. při 14 000 ot./min. v Eppendorfových zkumavkách při teplotě 4 °C a supematant se ultracentrifugoval ve stolní ultracentrifuze Beckmann po dobu 60 min., při teplotě 4 °C a otáčkách 45 000 ot./min za použití rotoru TLA 45. Stanovení RNázové aktivity se provedlo v objemu 200 μΐ, který obsahuje 5 nebo 50 μΐ supematantu z druhého stupně centrifugace a 80 pg Poly/rU (Pharmacia) v pufru, který je vhodný pro RNázový test (40 mM ío Tris-acetát (hodnota pH je 6,5), 0,5 mM EDTA, 5 mM dithiotreitol (DTT)). Po inkubaci reakční směsi při teplotě 37 °C po jedné hodiny se přidalo 200 μΐ, 1, M kyseliny perehloristé, 20 mM LaSO₄. Po inkubaci na ledu po dobu 15 minut se směs centrifugovala po dobu 15 minut, při teplotě 4 °C a pří otáčkách 14 000 ot./min v Eppendorfových zkumavkách. K. supematantu se přidala voda v množství, které odpovídá 3 objemům a alikvot směsí se analyzoval měřením optické hustoty při vlnové délce 260 nm za použití spektrofotometru Ultrospec 3000 (Pharmacia). Ve všech případech mutace zavedené do genu E^ms zcela zrušily RNázovou aktivitu (uvádí se v tabulce č. 1).

V případě mutantu BVDV se RNázová aktivita testovala v materiálu získané po transfekcí RNA bez pasážování získaných virů. Buňky transfekované vhodnou RNA se 72 hodin po transfekcí rozdělily a nanesly se na dvě plotny. O 24 hodin později se připravil zjedné plotny buněčný extrakt a analyzovala se RNázová aktivita způsobem, který se popisuje shora v textu. Za účelem prokázat infekci se buňky z druhé plotny analyzovaly fluorescenčním testem s monoklonálnímí protilátkami, které jsou specifické pro BVDV (popisuje se v publikaci Weiland, E., Thiel, Η. T,

Hess, G., and Weiland, F„ (1989). Development of monoclonal neutralizing antibodies against bovine viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normál bovíne cells and cyclophosphamide. J. Virol. Methods 24: 237-244), a zjistilo se, že jsou 100% pozitivní, Transfekce se provedla za použití RNA transkribované z ρΛ/BVDV/Ins- a zpA/B-346-d, což je plazmid ekvivalentní k ρΑ/BVDV/Ins-, ale neobsahuje deleci kodonu ekvivalentního s kodonem 346 v genomu CSFV Alfort. Netransfekované buňky MDBK sloužily jako negativní kontrola.

Tabulka č. 2A: Stanovení RNázové aktivity různých virů

	Aifort	C-WT	C-297-L	C-346-L	C-346-d	C-346- d/Fs	kontrola 1 í
j ODzeo	2,4	2,3	1/1	1/1	1,1	2/3	1/1 1 '
	Alfort	C-WT	C-297-L	2-346-L	C -297 -K	C-346-K	C-237- L/346-L
OD25o	2,09	2,16	0,715	0,77	0,79	0,766	0,77

	C-297-K/346-L	C-297-K/346-K	C-346-d	kontrola
OD260	0, 725	0/835	0/8	0/84

Popis tabulky č.2A:

Buňky PK se infikovaly indikovanými viry při hodnotě m.o.i. (multiplicita infekce) 0,01, inkubovaly se po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C v inkubátoru v atmosféře CO? a pak se lyžovaly to a podrobily testu RNázové aktivity. Rozpustná RNA pocházející z inkubace s různými buněčnými extrakty se kvantifikovala měřením optické hustoty při vlnové délce 260 nm. Pozorované rozdíly RNázové aktivity jsou způsobeny různým množstvím proteinu E^RNS ve vzorcích, protože

- 15CZ 301494 Bó se po kvantifikaci E^RNS radioaktivním značením, imunologickým srážením a analýzou radioaktivity za použití fosforimageru získaly stejné hodnoty. Snížení koncentrace E¹⁵ v testu na pouze jednu desetinu obvyklého množství nezměnilo podstatně výsledné hodnoty optické hustoty, což indikuje, že vybrané podmínky testu se saturovaly vzhledem k E^ms.

Kmen CSFV Alfort; všechny ostatní viry se získaly z RNA transkribované in vitro plazmidů: například C-WT zpA/CSFV, C-297-L z pA/C-297-L, atd., viru C-346-aJ/Rs získaného z pA C 346—d/Rs (vytvořeného zvrácením mutace v pA/C-346-d záměnou fragmentu cDNA za ekvivalentní fragment získaný z pA/CSFV). Jako kontrol se použil extrakt neinfikovanýeh buněk io PK15.

Tabulka č. 2B

B-WT	3-346d	j kontrola
2,5	1-, -	íbl 1 [ i

!5 Popis tabulky č. 2B: Buňky NDBK se infikovaly in vitro transkribovanou RNA. 72 hodin po transfekci se rozdělily a RNázová aktivita se analyzovala o 24 hodin později. Infekce buněk se prokázala imunofluorescenéní analýzou, jak se popisuje v textu.

B-WT je virus získaný z pA/BVDV/lns-; B-346-d je virus získaný z pA.B 346- d; jako 20 kontrola slouží extrakt z neinfikovanýeh buněk MDBK.

Příklad 3: Patogenita CSFV po aktivaci RNázy

Za účelem testování jak poškození RNázové aktivity ovlivňuje patogenicitu pestivirů v jejích přirozeném hostiteli, se provedly experimenty na zvířatech s mutantem V/pA/C-346-d) (v tabulce se uvádí jako C--346—d). Viry získané z klonu plné délky CSFV bez mutace (V(pA/CSFV)) slouží jako pozitivní kontrola (v tabulce označeno jako C-WT). Pro každý mutant se použily tři selata (plemeno: German Landrace, hmotnost přibližně 25 kg). Použitá infekční dávka je 1 x I O⁵ TCID_M) .to na jedno zvíře, přičemž dvě třetiny ínokulátu se aplikovalo nasálnČ (jedna třetina do každé nozdry) a jedna třetina do svalu. Dvě skupiny se ustálily v oddělených izolačních jednotkách. Krev se zvířatům odebrala dvakrát před infekcí a3„5., 7,,10., 12. al4. den po infekci. Každý den se zaznamenávala tělesná teplota zvířat (uvedeno na Obrázku č. 2). Zvířata infikována virem divokého typu vykazují typické symptomy klasické prasečí horečky, jako je teplota, ataxie, anorexie, průjem, poruchy centrálního nervového systému, hemoragie na kůži (uvádí se v tabulce č. 3). Virus je možné získat z krve třetí den (zvíře ě. 68) a 5., 7„ 10., 14., den (zvířata č. 68, 78, 121) (uvádí se v tabulce Č. 3B). Zvířata se usmrtila ve fázi odumírání 14. den po infekci. V tuto dobu se detekovaly virové neutralizační protilátky. Naopak u zvířat infikovaných mutantem se neprojevily klinické příznaky (uvádí se v tabulce č. 3a). Tělesná teplota zvířat zůstala v normálu to (uvádí se na obrázku č. 2) po celou dobu experimentu a zvířata stále přijímala potravu. Z krve nebylo možné izolovat virus. Zvířata však byla jasně infikována virem a virus se replikoval a u všech zvířat se vytvořily neutralizační protilátky (uvádí se v tabulce č. 3c).

- 16CZ 301494 B6

Tabulka č, 3a: Klinické příznaky po testované infekci

Experiment č. 1

z víře £.	-f.tekce 3	klinické	příznaky 1
i 1		teplota 1 1	průjem 1	poruchy CMS	anorexie 1 1	krváce· ni kůže	apatie	eutanázi e	krvácení orgánů pfi nenropari
68	C-WT	+ i	4-	4-		+	4-	4-	1 -1
(78	C-WT	+	+	4-	4-	4-	+	+	4-
! 121	C-WT	1 + i	+	+	+	-	4-	4-	+
7 0	i C-34Ó-Q	!	-	-	-	-	-	-	: t, a · i
72	C-J46-d	1 i - 1	1 1	-	i	-	,· 1 — 1	i “ 1	1n.a. !
74	C	-	-		i Γ	-	-	-	n.a. j

Popis tabulky č. 3a: Ve studii se použilo 6 selat (plemeno: ..German land raceT tělesná hmotnost přibližně 25 kg) rozdělených do dvou skupin (každá skupina se ustájila odděleně). Tři zvířata se infikovala CSFV-WT (lxl O⁵ TCTDS0) a 3 zvířata se infikovala C-346-d (lxlO⁵ TCID50). Zaznamenávala se tělesná teplota v rektu a klinické příznaky a vše se shrnulo, jak se uvádí v tabulce, přičemž zkratka n.a. znamená neuskutečnila se nekropsie, io Tabulka č. 3b: Viremie krevních buněk po testu infekce

Experiment č. 1

zvíře č, 1	jinfekce 3	i Klinické příznaky
!	i3	5	7	10	14
68	jc-w?	i	4-	4-	4-	Γ
7S	C-WT	-	+	-	+ i 1	4-
121	C-WT	-	4-	4-	+	-t-
70	C-34Ě -d	-		-	-	-
1 7 2	C-34f>d	f í	-	-	-	-
/ 4	C-34fi-d	-	-	-	-	-

Popis tabulky č. 3b: Viremie krevních buněk se detekovala společnou kultivací krve s buňkami

PK15. Po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 72 hodin se buňky promyly PBS, fixovaly se ledem chlazenou směsí aceton/methanol a infekce se analyzovala imunofiuorescencí s monoklonálními ís protilátkami, které jsou specifické pro glykoprotein E2 (mAb A18, popisuje se v publikaci

Weiland, E., Stark, R„ Haas, B„ Rumenapf, T., Meyers, G. and Thiel, H, J, (1990). Pestivirus glykoprotein which induces neutralízing antibodies forms part of a disulfíde-linked heterodimer. J. Virology 64, 3563-3569),

- 17 C'Z 301494 B6

Tabulka č.3c: Vývoj neutralizačního titru séra specifického pro CSFV

J:iy po infekci	-3	0	17	25	69	76 :	,79	87
prase [č. 7C 1 1		1	1:18	1:162	1:162	1:162	1:486	1:	1458
íprase č. 72 ;			1:18	1:54	1:486 i 1	1:1458 1	1:1458 i 1		4 374
prase č. 74			1:6	1:54	1:162 i	1:162	1:486	1:	1458

Popis tabulky č. 3c: Titry protilátek prasat infikovaných virovým mutantem C-346-d se stanovil v různé časové okamžiky bčhcrn experimentu:

μΙ ředěného séra se smíchalo s 50 μΐ kultivačního média, které obsahuje 30 TCIDso viru (CSFV Alťort/Tubingen). Po 90 minutách inkubace při teplotě 37 °C se přidalo 100μΙ buněk (1,5x10⁴ buněk) a směs se nanesla na destičku s 96 prohlubněmi. Po 72 hodinách inkubace se buňky zafixovaly ledem chlazenou směsí acetonu/methanolu a analyzovala se infekce imuno’ io fluorescencí s monoklonálními protilátkami, které jsou specifické pro glykoprotein F2 (mAb

A18, popisuje se v publikaci Weiland, E., Stark, R.. Haas, B., Rumenapf, T., Mevers, G, and

Thiel, H. J. (1990). Pestivirus glykoprotein which induees neutralizing antibodies forms part of a disulfide- linked heterodimer. J. Virology 64, 3563-3569). 69 dní po infekci se zvířatům aplikovalo 2xl0⁵ TCIDso CSFV kmen Eystrup. Tabulka uvádí nejvyšší ředění séra, které způsobuje i? celkovou neutralizaci vstupního množství viru.

Příklad 4: Vyvolání ochranné imunity infekcí viru, který nevykazuje RNázovou aktivitu.

Za účelem analyzovat, zda infekce s mutantním virem povede k ochranné imunitě, se přibližně týdnů po infekci s mutantem CSFV za použití vysoce patogenního heterologního kmene CSFV (kmen Eystrup, pocházející od firmy Behring) provedl vakcinační experiment. Při infekci se použila dávka 2xI0⁵ TCID₅₀ viru. V předchozích několika experimentech se zjistilo, že toto množství viru je dostatečné pro vyvolání letálního onemocnění (popisuje se v publikaci Konig,

Matthias, 1994. Virus der Klassischen Schweinepest: Untersuchungen zur Pathogenese und zuř

Induktion einer protektiven Immunoantwort. Disscrtation, Tirarztliche Hochschule Hannover,

Germany). Zvířata, která sc drive infikovala CSFV RNázovým mutantem, nevykazují klinické příznaky onemocnění, ale zvýšil se jejích titr neutralizačních protilátek, což ukazuje na produktivní infekci a replikaci zavedeného viru.

Příklad 5: Ověření principu utlumení

Aby se ukázalo, že pozorované utlumení mutantního viru je způsobené delecí histidinu v poloze 35 346 polyproteinu a nikoliv nedefinovaným druhým místem mutace, tak se znovu připravila sekvence divokého typu záměnou fragmenty Xhol/NdcI o velikosti 1,6 kb klonu pAC/C 346 d v plné délce za odpovídající fragment pA/CSFV vykazující sekvenci divokého typu. Fragment vystřižený z pAC/C-346-d se analyzoval sekvenací nukleotidů za účelem najít mutace. S výjimkou delece tripletovčho kódujícího histidinu v poloze 346 polyproteinu se nezjistil žádný rozdíl s ohledem na sekvenci divokého typu. Z konstrukce cDNA s mutantem se mohl získat virus (V(pA/C-346-d/Rs), který rostl stejně dobře jako virus divokého typu a vykazuje stejnou

RNázovou aktivitu (popisuje se v tabulce č. 2A).

- 18CZ 301494 B6

V druhém experimentu na zvířatech se získaný virus použil při infekci prasat. Jako kontrola se použil deleční mutant. Opět se použily dvě skupiny obsahující tři zvířata. Tato zvířata byla mladší (plemeno: ..German landrace, přibližná tělesná hmotnost 29 kg) než zvířata použitá v prvním experimentu. Při infekci se použila dávka 5x10⁴ TCID50 víru. Zvířata infikovaná mutantem nevv5 kazují žádné klinické příznaky (uvádí se v tabulce č. 5, na obrázku ě. 4). Pouze u jednoho zvířete se objevila teplota a trvala jeden den. U těchto zvířat se vyvinuly neutralizační protilátky, které chrání zvíře proti letální dávce CSFV. Další vakcinace se provedla infekcí kmenem Eystrup v dávce 2x10²⁵ TC1D5O. Zvířata po vakcinaci nevykazují klinické příznaky a tělesná teplota vykazuje normální hodnoty (uvádí se na obrázku č. 5). Naopak u prasat infikovaných de leč ním io mutantem a u zvířat inokulovaných získaným virem divokého typu se vyvinula fatální klasická prasečí horečka. Jedno zvíře se muselo utratit 11 dní po infekci, ostatní dvě o tří dny později. Všechna zvířata vykazují typické symptomy klasické prasečí horečky. To znamená průjem, anorexie a patologické příznaky, jako je krvácení z různých orgánů, které zahrnují ledviny,

Tabulka č. 5a: Klinické příznaky po testované infekci i Experiment č. 2

zvíře č.	infekce 3	J klinické í	příznaky
		xepiota i	p tůjem	1 ýid CMS	anoícx.e	krváče ní kú že	apatie	er.tar.4zi e	krváceni orgánů při l , t
43	C-346-d	+ *	-	-	-	-	-	-	n.a.
47	C-346 -d	-	-	-	-	-	-	-	n.a. ί
87	C-346-d í ..	-	-	-	p	-	-	-	n.a.
27	C-346- d/RS	+ i	+		+	+	+	+	+
28	C-346- ' d/RS	+	Η	+	+	+	-h	+	+
30	C-34Í- d/RS	+		T		+	+	+	4-
		* teplota púu	Íze jeden den

Tabulka č. 5a: Ve studii se použilo 6 selat (plemeno: „German land race“, tělesná hmotnost ?.o přibližně 20 kg) rozdělených do dvou skupin (každá skupina se ustájila odděleně). Tři zvířata sc infikovala C 346 -d (5x10⁴ TDICSU) a 3 zvířata se infikovala C-346-d/RS (5x10⁴ TCID5o).

C-346-d/RS se získal z mutantu C-346-d znovu získáním sekvence divokého typu genu E^RNS. Zaznamenávala se tělesná teplota měřená v rektu a klinické příznaky a vše se shrnulo, jak se uvádí v tabulce, přičemž zkratka n.a. znamená neuskutečnila se nekropsie.

Tabulka č. 5b: Diagnostický RNázový test za použití virů získaných z infikovaných zvířat během viremie

	Alfort	zvíte č. 3 C-297-K	[zvíře Č, 5 IC-287-K	svítě ¢. 27 C-346-L	zvíře č- 28 2-346-d/RS	zvíře č. 30 C-346-d/RS	kontroL.i
OD260	1,84	0,60	0,56	1,84	1,93	1,94	0,49

- 19 CZ 301494 B6

Virus se získal z krve zvířat 27, 28 a 30 (jak se popisuje v příkladu 5) a 7. den po infekci se pomnožil v buněčné kultuře, titroval se a testovala se RNázová aktivita, jak se popisuje shora v textu. Neinťikované buňky PKJ5 a buňky (slouží jako kontrola) infikované CSFV divokého typu {Alford) slouží jako kontroly. Zvířata 3 a 5 se infikovaly mutantem C-297-K, zatímco zvířata 27, 28 a 30 se infikovala mutantem C-346-d/RS, jak se uvádí v tabulce.

Příklad 6: Účinky dvojité mutace v glykoproteinu F^RNS id Za účelem testování účinků dvojité mutace v glykoproteinu F^RNS na schopnost viru se replikovat v jeho přirozeném hostiteli a na jeho patogenitu se provedl experiment na zvířeti s mutantem V(pA/C-297-L/346-L). Virus získaný z klonu CSFV plné délky, který neobsahuje mutaci (V(pA/CSFV) sloužil jako pozitivní kontrola. Pro každý mutant se použily tri selata (plemeno: German Landrace, hmotnost přibližně 25 kg). Použitá infekční dávka je lxlO⁵ TCID^ najedno is zvíře, přičemž dvě třetiny inokulátu se aplikovalo nasálně (jedna třetina do každé nozdry) a jedna třetina do svalu. Krev se zvířatům odebrala dvakrát před infekcí (den 0) a 5., 8., 12. a 20. den po infekci. Každý den se zaznamenávala tělesná teplota zvířat (uvedeno na obrázku č. 6). Zvířata infikována dvojitým mutantem nevykazují typické symptomy a nikdy nepřestala přijímat potravu. Zvířata neměla teplotu po dobu celého experimentu (zvířata 45/2 a 45/3) s výjimkou zvířete

45/1. které mělo 8. den teplotu pravděpodobně způsobenou bakteriální infekcí poranění pravé zadní nohy. Po léčbě uvedeného zvířete antibiotiky se 10. den hodnota tělesné teploty vrátila na normální hodnotu (obrázek č. 6). Z krve všech zvířat se virus izoloval 5. den, zatímco později nebylo možné viremii detekovat (uvádí se v tabulce č. 6a). U všech zvířat se vytvořily neutralizační protilátky (uvádí se v tabulce č. 6b). V případě zvířete 45/1 se stanovil přibližně 4,5 měsíce po infekci opět neutralizační titr a zjistilo se, že jeho hodnota je 1:4374. Infekce s dvojitým mutantem přešla v dlouhotrvající imunologickou paměť.

Tabulka č. 6a: Test viremie

jdny po infekci	5	8	12
prase 45/1	t	-	1
prase 45/2	t-	-
prase 45/3	4-	-	-

Tabulka č. 6b: Neutralizační titry

zví ře	den 0	| 20. den po infekci 1
45/1 1	-	1:223
45/2	-	1:256
45/3	-	1:256

Příklad 7: Princip imunogenicity a utlumení viru BVDV „B-346- d“

Tento experiment se navrhl za účelem zjistit princip utlumení stejně jako imunogenicity viru BVDV „B-346-d“ získaného z ρΑ/Β-346-d porovnáním s virem „B-WT“, který se získal z pA/BVDV/Ins- Virus „B-346-d“ nese samozřejmě mutaci v původním BVDV v poloze 349, ale nazval se „B-346“, aby indikoval polohu relativní k poloze 34b CSFV AIFort zobrazené na obrázku č.l.

-20CZ 301494 B6

Vybraly se tři skupiny zvířat, které mají séra BVDV negativní a jsou 3 až 6 měsíců stará. Každá skupina 1 a 2 obsahovala 5 zvířat, zatímco skupina 3 obsahovala 3 zvířata. Zvířata ve skupině 1 a2 se infikovala aplikací 2xl0⁵ TCID₅₀ mutantu B-346-d (skupina 1) nebo B WT (skupina 2) s v objemu 5 ml. Zvířata se infikovala do svalu (gluteální sval), intranasálně a podkožně (v oblasti lopatky). V období 14 dní po infekci se u obou skupin zvířat monitorovala viremie pomocí parametrů, jakoje viremie krevních buněk a výskyt viru v nosních sterech. Navíc se sledovaly klinické parametry jako je tělesná teplota měřená v rektu, počet bílých krvinek a obecné zdravotní parametry.

io

Za účelem zkoumání ochranné imunity proti infekci antigenně heterologním a virulentním izolátem BVDV (č, 13) se 77. den po infekci opakovala vakcinace zvířat v první skupině mutantem B-346-d. Zvířata skupiny 3 sloužila jako pozitivní kontrola a infikovala se způsobem popsaným v případě zvířat skupiny 1 s virulentním izolátem BVDV. Virus BVDV (č. 13) patří k odlišné antigenní skupině (typ II), zatímco virus B-346-d spadá na základě klasifikace popsané v publikaci Pellerin, C., et al., Identification of a new group of bovine viral diarrhca virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities. Virology 203, 1994:260-268, do antigenní skupiny I. Zvířata ve skupině 1 a 3 se infikovala dávkou 2x10⁶ TCID™ izolátu BVDV (č. 13) v objemu 5 ml. Zvířata se infikovala do svalu (gluteální sval), intranasálně a podkožně (v oblasti lopatky). V období 14 dní po infekci se u obou skupin zvířat pozorovala viremie a zaznamenávala se pomocí parametrů, jakoje viremie krevních buněk a výskyt viru v nosních sterech. Navíc se sledovaly klinické parametry jako je tělesná teplota měřená v rektu, počet bílých krvinek a obecné zdravotní parametry.

Po infekci mutantem „B-346-d“ zvířata nevykazují typické klinické příznaky infekce virem BVDV, jako je zvýšená tělesná teplota měřená v rektu (tabulka č. 7a) nebo jiné respirační klinické symptomy (nejsou uvedeny).

Redukovaná viremie krevních buněk (tabulka č, 7b) a přítomnost viru v nosním výtěru (tabulka

č. 7c) neindikuje jasně utlumení B-346-d ve srovnání s B-WT.

Virulentní izoláí BVDV č. 13 vyvolává u zvířat skupiny 3 silnou vircmii s typickými příznaky infekce BVDV, jako je zvýšená tělesná teplota měřená v rektu po dobu několika dní (uvádí se v tabulce č. 7c), silnou leukopenii (uvádí se v tabulce č. 7e), rozsáhlou vircmii krevních buněk (uvádí se v tabulce č. 70 a zastoupení víru ve steru nasální tekutiny (uvádí se v tabulce č. 7g). Naopak zvířata skupiny 1, která se vakcinovala infekcí s B-346-d, nevykazují po infekci virulentním izolátem BVDV č. 13, skoro žádné klinické příznaky, které jsou typické pro infekci BVDV. Po infekci nedošlo k podstatnému zvýšení tělesné teploty měřené v rektu (uvádí se v tabulce č. 7d). Pozorovaná leukopenie byla zanedbatelná vzhledem k síle a délce trvání (uvádí se v tabulce č. 7e). Z krve sc neizoloval žádný virus BVDV (uvádí se v tabulce č. 71) a pouze u jednoho zvířete bylo možné detekovat virus v nosním steru (uvádí se v tabulce č. 7g).

Proto infekce mutantem 13-346—d vyvolává silnou imunitu, které jasně redukuje klinické příznaky, zastoupení viru a viremii krevních buněk po opakované infekci heterologním izolátem

BVDV.

-21 CZ 301494 B6

Tabulka č. 7a: Průměrná tělesná teplota měřená v rektu ve skupině 1 (B-346-d) a 2 (B-WT)

Sen st jd :.e	0	1	2	3	4	5 1	6 1	7	8	9	10	11	121	13	14
skup : na	38,8	39, 1	39,0	38,7	38, 8	38,7	38, 7 '	i 38, 5	38, 7	39, 5	39,5	38, 5	38, 4	36, 9	38,7
						1 1 1	i 1
3 K'Jp ina 2	39, 3 ;	,39r3 ' 1	39,9 l	30,5	39,5	33,7 j	33,5	38,4	39, 1	38,4	38, 7 ; i	1 38, 6 í	38,7 (38,5	38, 6

Zvířata ze skupiny 1 se infikovala v den 0 6x10⁶ TCIDso 13 346(.1, zatímco zvířata ze skupiny 2 se infikovala 6x10° TCIDso B-WT.

Tabulka č. 7b; Viremíe krevních buněk u zvířat skupiny 1 a 2

skupina	zvíře	Fnasálni átěťy první den	nasáiní stěry posledni den	trváni přítomnosti viru v ridsáinich stérech (dny)	průměrné trvám skupiny (dny)
1		6 i	6	1	1,4 1 l·
2 μ ... . s	6	2
3	i 5	5	1
4	-	-	0 H	1
γς- b		9 .....	3
2	6	4	8	5	Ji Ji
7	4	7	4
8	4	7	4
9	4	7	4
10	4	8	5

Krev ředěná EDTA se denně testovala až do desátého dne po infekci mutanty B-346-d a B-WT. ni Do každé ze třech kultur buněk telecích varlat v kultivačním médiu, které obsahuje heparin (jako prevenci srážení v koncentraci 1 jednotka/ml), se přidalo 0,2 ml krve. Po celonoční inkubaci se směs inokula a kultivačního média nahradila čerstvým kultivačním médiem, které neobsahuje heparin. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se buňky infikované BVDV detekovaly fluorescencí s polyklonálním sérem specifickým pro BVDV. Negativní kultury se mrazily a následně rozinra15 žily. Aby se potvrdila nepřítomnost BVDV se 0,2 ml uvedené rozmražené kultury prošlo druhou pasáží na buňkách Cte.

CZ. 301494 Bó

Tabulka č. 7c: Virus zastoupený v nosní tekutině

skupina	jviře	nasďiní utěry pevní den	nasální stery trváni přítcmcsti j poslední den viru v v exudátu <	průměrný podet dr.í, kdy se virus detekoval ve skupině
i	1	4	8	4	2,6
2	6	6	1
3	4	4	1
4	5	7 j 3
3	3	6	4
2	6	6	8	3	3, 6
7	5	7	3
8	5	8	4
9	5	6 2
10	3 i	9 i 6

Nosní exudát se centrifugoval (1000 g) za účelem odstranit velký debrís a kontaminanty. Odstranil se supernatant a 0,2 ml se naneslo do každé ze tří buněčných kultur. Po eelonoční inkubaci se směs inokula a kultivačního média nahradila 2 ml čerstvého kultivačního média. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se detekovaly buňky infikované BVDV v imunofluorescenčním testu za použití polyklonálního séra, které je specifické pro BVDV.

io Tabulka č. 7d: Průměrná tělesná teplota měřená v rektu ve skupině 1 a 3

I den st„- die		-2	0	1	2	3 ]	14	5	6	7	3	9	10 1	I12	,14
sku- pina 1	3S, 4 1 i	38,6 1	36,5	38, S	38, 6	33, 4	i	38,4	38, 3	38,4	36, 4	36,4	38,4	38,4	38,5
sku- pina 3	38,8	39,1	i 38,8	33, 1	33,4	39,7	40,2	4C, Z	40, 4	41,3	40,2	40, 1 1	40,2 t	4 0,8	40, 4 í

Tělesná teplota měřená v rektu se zaznamenávala až 16 dní po infekci. Zvířata ze skupiny 1 a 3 se infikovala 6x10^ó TCID_5y virulentního izolátu BVDV #13.

Tabulka č. 7e: Průměrný počet bílých krvinek

den stu- die		-2	---'	Γ1	2	3	4	'b 1	1 6 I	7	9	9	10	12	1 14
sku- pina 1	11,9	11,9 i	11,3	ID,8	9,2	0,2	8,9	9,9	11,2	11,6	11, 6	10,6	10, 8	10,8	9,4
S ku- pina 3	11,7	15,6	13,a	11, 1	7,7	3,8	7, 4	. 6, S 1 1	8,7	3,7	7,0	9,1	b , 2	6,4	&, 2

-1; _

C7. 301494 B6

Vzorky krvinek v EDTA se odebíraly denně ode dne -2 do 14. dne po infekci z každého zvířete v obou skupinách. Počet bílých krvinek ve vzorcích krve v EDTA se stanovil za použití přístroje

Sysmex Vlikro Cell Counter E800.

Tabulka Č. 7f: BVDV izolovaný ze vzorku krve

skupina	zvíře	virus detekovaný v krvi první der.	virus detekovaný v krvi poslední der.	doba trvání při toronosti viru v krví (dny)	průměrná doba trvár.í [dny)
1	1	-	-	0	° 1
2	-	0
3	r (0 ..	í
4	-	-	0
5	-	-	%	1
3	11	3	10	8	9,7
12	12	14	12
13	3	9	9

Krev ředěná EDTA se denně testovala až do desátého dne po infekci. Do každé ze třech kultur buněk telecích varlat v kultivačním médiu, které obsahuje heparin (jako prevenci srážení io v koncentraci 1 jednotka/ml), se přidalo 0,2 ml krve. Po celonoční inkubaci se směs inokula a kultivačního média nahradila čerstvým kultivačním médiem, které neobsahuje heparin.

Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se buňky infikované BVDV detekovaly fluorescencí s polyklonálním sérem specifickým pro BVDV. Negativní kultury se mrazily a následně rozmrazily. Aby se potvrdila nepřítomnost BVDV, 0,2 ml uvedené rozmražené kultury prošlo druhou pasáží na buň15 kách Cte.

Tabulka č. 7g; Virus zastoupený v nosní tekutině

skupina	zvíře	nasální stery první den	n.inálUi Stéry poslední den	trvání přítomností viru v v nosní tekutině (dny)	průměrná doba i trvání (dny ve skupině)
1	1	3	4	2	0,8 i
2	-	-	0
3	-	!o
4	-	3
5	4	5	2 !
3	11	3	: 14	12 i	10
12	3	' 14	12
13	3	8	6

Nosní exudát se centrifugoval (1000 g) za účelem odstranit velký debris a kontaminanty. Odstranil se supematant a 0,2 ml se naneslo do každé ze tří buněčných kultur. Po celonoční inkubaci se směs inokula a kultivačního média nahradila 2 ml čerstvého kultivačního média. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se detekovaly buňky infikované BVDV v imunofluorcscenčnírn testu za použití polyklonálního séra, které je specifické pro BVDV.

-24CZ 301494 B6

Příklad 8: Diskriminace mezi C-346-d a CSFV, který nevykazuje deleci histidinového kodonu

346 pomocí RT-PCR

Sekvence RNA kódující konzervativní motiv RNázy v CSFV glykoproteinů E^RNS je silně konzervativní. Mezi všemi známými sekvencemi CSFV se nezjistily v oblasti odpovídající zbytkům 1387 až 1416 publikované sekvence CSFV kmene Alfort (Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H. J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567) žádné změny nukleotidů. Oligonukleotidové primery získané z této konzerio vativní oblasti genomu se mohou použít v testu RT-PCR za účelem detekce všech izolátů CSFV (uvádí se na obrázku č. 7). Následkem toho je možné nepřítomnost tripletu kódujícího histidin 346 (nukleotidy 1399-1401) detekovat RT-PCR s vhodně navrženým primerem. Syntetizovaly se různé oligonukleotidy, které pokrývají konzervativní oblast, které buď obsahovaly nebo neobsahovaly histidinový kodon. Tyto oligonukleotidy sloužily jako primery proti směru exprese genu při reakcích KÍ-PCR spolu s oiigonukieotidcm E^-Siop, který sloužil jako piiiuei po směru exprese genu. RNA čištěná z tkáňové kultury buněk se infikovala mutanty C-346-d, CWT, C-346-L nebo C-346-K se použila jako templát. Reverzní transkripce 2 pg teplem denaturované RNA (2 min při teplotě 92 °C, 5 minut na ledu v 11.5 μί vody v přítomnosti 30 pMol reverzního primeru) se provedla po přidání 8 μί směsi RT (125 mM Tris/HCl pH 8,3, 182,5 mM

K.CI, 7,5 mM MgCb, 25 mM dithiotreitol, 1,25 mM každého dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 U RNAguard (Pharmacia, Freiburg, Germany) a 50 U Superscript (Life Technologies/BLR, Eggenstein, Germany) po dobu 45 minut pří teplotě 37 °C. Po ukončení reverzní transkripce se zkumavky umístily na led a přidalo se 30 μί směsí pro PCR (8,3 mM Tris/HCl, pH 8,3, 33.3 mM KCf 2,2 mM MgCÍ, 0,42 mM každého dATP. dTTP. dCTP, dGTP, 0,17 % Triton XI00, 0,03 % albuminu bovinního séra, 5 U polymerázy Taq (Appligene, Heidelberg, Germany) a 16.7% DMSO). V případě, že se použil primer ΟΙ H+3, reakční směs pro amplifikaci neobsahovala DMSO. Amplifikace se provedla v 36 cyklech (30 vteřin při teplotě 94 °C, 30 vteřin při teplotě 57 °C, 45 vteřin při teplotě 74 °C). 1 μί amplifikační reakce se nanesl na 1% agarózový gel a amplifikovaný produkt se oddělil na elektroťoréze a obarvil se ethidiumbromidem. Jak se uvádí na obrázku č. 7. pár primerů Ol H-3/OI E^msStop umožňuje specificky amplifikovat pruh získaný z RNA obsahující deleci kodonu 346, zatímco další dva primery umožňují získat produkty obsahující kodon 346, Když se jako templát použila RNA deleci uvedeného kodonu, pak se na elektroforéze nepozoroval žádný pruh.

3? Primery vhodné pro RT-PCR:

primery proti směru exprese genu:

ΟΙ H-3: TGGAACAAAGGA!GGTGT

Ol H+2: TGGAACAAACATGGATGG ΟΙ H43: CiAATGGAACAAACATGGA primery po směru exprese genu:

OI E^msStop: GGAATTCTGAGGCATAGGCACCAAACCAGG

-25CZ 301494 B6

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1: s (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová io (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = BVDV Erns delece v poloze 346/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1;

Met 1

Glu

Leu

Ile

Thr 5

Asn.

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Tyr

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Ala

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Gin

Ala

Gly

Asn 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Glu 35

Arg

Gly

Val

Ile

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Lys 50

Arg

Gly

Glu

Arg

Glu 55

Val

Pro

Thr

Asn

Leu 60

Ala

Ser

Leu

Pro

Lys 65

Arg

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

Ser

Lys 75

Gly

Pro

val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Leu

Lys

Pro 35

Gly

Pro

Leu

Phe.

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Lys

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Glu

Glu

Ala

Ser 110

Met

Cys

Glu

Thr

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Ser

Arg

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Ile 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Ile 140

Val

Lys

Ser

Ala

Thr 145

Lys

Asp

Arg

Gin

Lys 150

Val

Leu

Lys

Trp

Val 155

HIS

Asn.

Lys

Leu

Asn 160

Cys

pro

Leu

Trp

Val 165

Ser

Ser

Cys

ser

Asp 170

Thr

Lys

Asp

Glu

Gly 175

Val

Val

Arg

Lys

Lys 180

Gin

Gin

Lys

Pro

Asp 185

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly 190

Arg

Met

Lys

Ile

Thr 195

Pro

Lys

Glu

Ser

Glu 200

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr 205

Lys

Pro

Pro

-26CZ 301494 Bó

Asp Ala Thr

Ile

Val Val Asp Gly Val Lys Tyr Gin

Val

Lys

Lys

Lys

210

215

220

Gly

Lys

Val

Lys

Ser

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

225

230

235

240

Asn

Lys

Pro

Gin

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

245

250

255

Trp

Aid

Ile

Ile

Ί

Leu

Val

Phe

Db61

Gin

Val

Thr

Met

Gly

Glu

Asn

260

265

270

Ile

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu

Gin

Asp

Asn

Gly

Thr

Glu

Gly

Ile

Gin

Arg

275

280

285

Ala

Met

Phe

Gin

Arg

dy

Val

rt5H

Gr- J-

Leu

Hic

m i/

Ile

Tr~n — r

prn

290

295

300

Glu

Lys

Ile

Cys

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

305

310

315

320

Leu

Lys

Ala

Ile

His

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Lys

Thr

Asn

Tyr

325

330

3 35

Thr

Cys

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn

340

345

350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Glu

Pro

Trp

Ile

Leu

Leu

Met

Asn

Lys

Thr

Gin

Ala

355

360

365

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly

Gin

Pro

Leu

Arg

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

370

375

380

Tyr

Asp

Arg

Asp

Ser

Asp

Leu

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asp

Ser

385

390

395

400

Pro

Thr

Pro

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

405

410

415

Gly

Ile

Leu

Val

Gin

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Glu

Ile

Ala

Val

Ser

Asp

420

425

430

Val

Leu

Phe

Lys

Glu

His

Asp

Cys

Thr

Ser

Val

Ile

Gin

Asp

Thr

Ala

435

440

445

His

Tyr

Leu

Val

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Ser

Leu

Glu

Ser

Ala

Arg

Gin

450

455

460

Gly

Thr

Ala

Lys

Leu

Thr

Thr

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Gly

Ue

Leu

465

470

475

4S0

Gly

Lys

Lys

Leu

GIu

Α3Π

Lys

Ser

Lys

Thr

Tr^

Phe

Gly

Ala

435 490

-27CZ 301494 Bó (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

s (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = BVDV Ems mutant 295 0/ iš (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Met 1

Glu

Leu ,

Asn His ; S

Phe Glu

Leu

Leu '

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 50

Ile

Tyr

Ile

Lys

pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val·

iyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

cys

Glu

val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

-28CZ 301494 B6

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

24 0

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Gly

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Tle

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

o 4 r JÍL

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

35 5

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

ASp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Tle

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Aep

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

430

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

435

490

495

-29CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 492 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Erns mutant delece 296—7—8/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly SO

Tle

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

Hí 3 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Tle

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Tle

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

145 150 155 ISO

Cys

Pro

Leu Trp Val Thr Ger Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly

Ser

165

170

175

Lys

Asp

Lys

Lys

Pro

Á3p

Arg

Mer

Asn

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys

Ile

Ala

180

135

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

AJa

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

2 5 0

1 c e

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

A3n

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Aan

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu.

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys

Lys

Gly

290

295

300

Val

Pro

Thr

F i s

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile

Arg

Gly

3 05

310

315

320

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

Arg

Leu

Gin

325

330

335

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp

340

345

350

Prú

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly

355

3 60

365

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

Thr

370

375

380

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

Leu

Thr

385

390

395

400

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

Ile

Giíi

405

410

415

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp

420

425

430

His

Glu

Cys

Glv

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu

Asp

435

440

445

Gly

Met

Thr

Asn.

Thr

Ile

UXu.

Asn

Ala

rtTy

Gin

r·? i f * Z

Ala

Ala

Arg

Val

450

455

460

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

Leu

Glu

465

470

475

480

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

435 490 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Erns mutant delece 297/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

Eis

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly Θ0

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

LyS

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

- v CZ 301494 B6

Lys 225

Gly

Lys Asn Thr Gin 230

Asp

Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn 235

Lys

Pro 240

pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu .

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu

LeU

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Asn

tily

Thr 280

At>u

A T-rr a 285

Ala

Met

Tyr

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys

290

295

300

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile

305

310

315

320

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

Arg

325

330

335

Leu

Gin

Arg

Uis

Glu

Trp

Λ ΠΤΊ riun

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

340

345

350

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

355

360

365

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

370

375

380

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

385

390

395

400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

405

410

415

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

ASp

Ile

Leu

Tyr

420

425

430

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

435

440

445

Leu

Asp

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

450

455

460

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

465

470

475

480

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490

- jj CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

io (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Erns mutant delece v poloze 297 K/

(xi)

Popis

sekvi

mce:

SEQ

ID NO: 5:

Met

Glu

Leu

Asn

His

Phe

Glu

Leu

Leu

Tvr

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin

Lys

1

5

LO

15

Pro

Val

Gly

Val

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg

Pro

Leu

20

25

30

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

Glu

Val

His

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

35

40

45

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu

Arg

Asp

Leu

Pro

50

55

60

Arg

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn

His

Leu

Gly

Pro

Val

Ser

Gly

65

70

75

80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly

Pro

85

90

95

val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

ASp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 14 5

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 17Q

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

ser

Lys

Asp

Lys

Lys íao

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val·

-34CZ 3U1494 H6

Lys Gly Lys 225

Asn Thr Gin Asp Gly 230

Leu

Tyr His Asn 235

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

rtSiA

T JJ*— <wt

£ΛΙ

TV c*r^

ň ςπ

rtl

Gly

Tle

G1 n

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Lys

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

cys

Lys

Gly

Val

Pro

mU. « Lili.

T.T i.U tj

L^u

,Ma

Tjn

Aer·, 1 ‘“ť

Thr

Glu

Leu

T,va

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Τ'/r

Thr

Cys

cys

325

230

335

Arg

Leu

Gin.

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

3 60

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

C-ly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495

-35CZ 301494 Bó (2) Informace o SEQ ID NO; 6;

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE;

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP; aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE;

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Ems mutant 297 \j 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Met 1

Glu Leu Asn

His 5

Phe Glu Leu Leu

Tyr 10

Lys Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

pro

val

Gly

Val

GiU

Glu

Pro

Val

Tyr

ASp

Thr

Ala

Gly

Arg

Pro

Leu

20

25

30

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

GLu

Val

His

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

35

40

45

HÍS

Asp

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu

Arg

Asp

Leu

Pro

50

55

60

Arg

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn

His

Leu

Gly

Pro

Val

Ser

Gly

65

70

75

90

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly

Pro

85

90

95

val

Tyr

His

Arg

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin

Phe

Cys

100

105

110

Glu

Val

Thr

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

115

120

125

Tyr

His

Ile

Tyr

Val

Cys

Val

Asp

Gly

Cys

Zle

Leu

Leu

Lys

Leu

Ala

13 0

135

14 0

Lys

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

145

150

155

160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly

Ser

165

170

175

-36CZ 301494 B6

Lys

ASp

Lys

Ly3 Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys

Ile

Ala

ISO

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

K_LL>

Α% ΰ

Lys

Asn

T ,

TÍM-* £ j- V-/

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

val

Asn

Arg

Ser

Leu

Leu

Gly

Tle

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

34Q

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

l’hr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Al a

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

430

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495

-37CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSVF Ems mutant delece v poloze 301/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Aap

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 90

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

lle

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

I le 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Tle

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

-38 CZ 301494 B6

Lys 225

Gly

Lys Asn Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His Asn Lys Aan Lys 235

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

ile

Gin

Arg

Ala

Met

ryr

275

280

235

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Glu

Lys

Ile

Cys

290

295

300

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile

305

310

315

320

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

Arg

325

330

335

Leu.

Gin

Arg

His

Glu

Tm - ~ ť

Asn

Lys

His

Gly

Tv-n --ť

Cys

Asn

Τ1 ΓΊ-Ι - - ť

Tyr

Asn

340

345

350

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

355

360

365

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

370

375

380

Asn

Thr

ASp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

395

390

395

400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

val

405

410

415

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

420

425

430

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

435

440

445

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Tle

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

4S0

455

460

Arg

val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

465

470

475

480

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

- 19CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Ems mutant 302 A/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

'lYr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

í±e

Tyr

val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 14 0

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

-40CZ 301494 B6

Lys Asp Lys

Lys 180

Pro Asp Arg

Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys

Ile

Ala

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

lie

Val

Val

Glu

Gly

val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

Lys

Gl y

Lys

X iii

r·*! π VJ.*,

Λ * “ť

Gly

Leu

*TNr-r

His

Asn

T.vs — u -

Isti

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

val

245

250

255

T l.e

Thr

Ile

Leu-

Leu

Tyr

z-l 7 — kJ2.ll

Pro

τι-, 3 v a-L

Λ Ί ΛΧ d

xt, il-LCl

ni ,, UIXU

Aon j J-kJ+i

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

230

2B5

Leu.

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Ala

Lys

Ile

290

2 9 5

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

HÍS

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu.

Leu

Asp

Giy

Met

Thr

As a

Thr

v T «. irC

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

C1 y

a1 a

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495

-41 CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Erns mutant 305 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9;

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

GlU

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn. 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 95

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 13 0

Ile

Tyr

V a L

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

?ro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 130

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Tle

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

A3p

Ala

Thr

Ile

val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

I le

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210 215 220

-42 CZ 301494 B6

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

ash

Gly

Ile

Gin

Arg

AIu

Met

Ty£

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Gly

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

HÍ3

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

lie

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

'R, AŮÍi

Arg

Lili.

ni „ KJ-Lli

mk v»

Asn

T

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

ΑΞΌ

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

HiS

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

ASP

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

44S

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

4Θ0

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495

-43CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka CSFV Ems mutant 340 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO: 10:

Met 1

Glu Leu Asn

His 5

Phe Glu

Leu Leu Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg

Pro

Leu

20

25

30

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

Glu

Val

His

Pro

Gin

Ser

Thr

LOU

Lys

Leu

Pro

35

40

45

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Gly .Asp

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu

Arg

Asp

Leu

Pro

50

55

50

Arg

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn

His

Leu

Gly

Pro

Val

Ser

Gly

65

70

75

80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly

Pro

85

90

95

Val

Tyr

His

Arg

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin

Phe

Cys

100

105

110

Glu

Val

Thr Lys 115

Arg Ile Gly Arg 120

Val

Thr Gly Ser Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His

Ile

Tyr

Val

Cys

Val

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu

Leu

Lys

Leu

Ala

130

135

140

Lys

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

145

150

155

160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly

Ser

155

170

175

Lys

Asp

Lys

Lys

Pro

Asp

Arg

Met

Asn

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys

Ile

Ala

180

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

-44CZ 301494 B6

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lya

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lya

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

A

LrCLÍ

Λ -“ť

Asn

m w — — Y

Thr

Asn

qT w --4

Ile

Gin

ΔκΓΓ ---—'

a 1λ

Mpt

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lyy

Gly

V dl

Pro

ryiU X AiX.

tt 4 ~ íí. j_

r .-l’. ,

Ala

rpV, X 1±X

TV >X 14. X-

Clu

L^u

T -.rc r'

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Gly

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

?ro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

495

-45 CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 493 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka - CSFV Erns mutant delece 342-6/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

Met

Glu

Leu

Asn

His

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin

Lys

1

5

10

15

Pro

Val

Gly

Val

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg

Pro

Leu

20

25

30

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

Glu

Val

His

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

35

40

45

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu

Arg

Asp

Leu

Pro

50

55

60

Arg

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn

His

Leu

Gly

Pro

Val

Ser

Gly

65

70

75

80

Ile

Tyr

Zle

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

P/r 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn ίσο

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 17 5

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 195

lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val 210 215 220

- 46 *

CZ. 301494 Bó

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His ,

Asn

Lys

Asn

Lys

pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu :

Leu .

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Ly3

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Trp

Asn

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Ašň

Ile

340

345

350

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

355

3 60

ť r j υ j

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

370

375

380

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

Leu

385

390

395

400

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

Ile

405

410

415

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

val

Ser

Val

Glu

ASp

Ile

Leu

Tyr

Gly

420

425

430

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu

435

440

445

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg

450

4 55

460

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

Leu

4Ó5

470

475

480

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490

-47CZ 301494 B6 ιο (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Ems mutant delece v poloze 342/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

Met Glu 1

Leu

Asn His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg

Pro

Leu

2C

25

30

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

Glu

Val

His

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

35

40

45

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu

Arg

Asp

Leu

Pro

50

55

60

Arg

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn

His

Leu

Gly

Pro

Val

Ser

Gly

65

70

75

80

lle

Tyr

Ile

Lys

Pro

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly

Pro

85

90

95

Val

Tyr

His

Arg

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin

Phe

Cys

100

105

110

Glu

Val

Thr

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg

val

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

115

120

125

Tyr

His

Ile

Tyr

Val

Cys

Val

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu

Leu

Lys

Leu

Ala

130

135

140

Lys

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

145

150

155

160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly

Ser

165

170

175

Lys

Asp

Lys

Lys

Pro

Asp

Arg

Met

Asn.

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys

Ile

Ala

180

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

A3p

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210 215 220

-48CZ 301494 Bó

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

G.ln

260

265

270

crp

Asn

Leu

Ser

Aoxi

«V — XX14.

rtotx

r-t 1 - .

ti Λ A-L<-

i — TJ J.11

TV

Ά 1 -v 1 1

Mst

'Pwi·* * 2 *

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

VJJLU

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

HÍS

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

340

345

350

Ile

ASp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

355

360

365

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

370

375

380

Asn

Thr

Asp

Val

Apn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

385

390

395

400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

405

410

415

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Aen

Phe

Asn

val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

420

425

430

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

435

440

445

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

450

455

460

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

465

470

475

480

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

-49CZ 301494 Bó (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Erns mutant 343 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys

5 10 15

Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu

25 30

Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45

His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60

Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80

Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95

Val· Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 100 105 110

Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125

Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 130 135 140

Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn

145 150 155 160

Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser

165 170 175

Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala ISO 185 190

-50CZ 301494 B6

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

T/r

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

TiTp

7\ 1 nx cl

Vsi

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

C-lu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Gly

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trn

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

4 00

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Tip

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

495

-51 CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 492 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Erns mutant delece 346-7/ is (xi) Popis sekvence: SEQ ÍD NO: 14:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

GlU

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

ASp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Tle

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Tle 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 195

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

GlU

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

HÍS

Asn.

Lys

Asn.

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

. Glu

. Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

. Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Iie

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

290

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pra

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Ly3

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

ASp

Ala

Ser

Glu

Atg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

32S

330

335

Arg

Leu

Gin.

Arg

Iii 3

Glu

Trp

Asn

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp

340

345

350

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly

3 55

360

365

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

Thr

370

375

380

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

Leu

Thr

385

390

395

400

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

Ile

Glu

405

410

415

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Iie

Leu

Tyr

Gly

Asp

420

425

430

His

Glu

Cys

ciy

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu

Asp

435

440

445

Gly

Met

Thr

Asn

TA tiU-k

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg

Val

450

455

460

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

Leu

Glu

465

470

475

480

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

-53CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

> (A) DÉLKA: 493 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Ems mutant delece 345-6/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15

Met 1	Glu	Leu	Asn	His 5	Phe	Glu
Pro	Val	Gly	Val 20	Glu	Glu	Pro
Phe	Gly	Asn 35	Pro	Ser	Glu	Val
His	Asp 50	Arg	Gly	Arg	Gly	Asp 55
Arg 65	Lys	Gly	Asp	Cys	Arg 70	Ser
Ile	Tyr	Ile	Lys	Pro 85	Gly	Pro
Val	Tyr	His	Arg 100	Ala	Pro	Leu
Glu	Val	Thr 115	Lys	Arg	Ile	Gly
Tyr	His	Ile	Tyr	Val	Cys	Val
	130					135
Lys	Arg Gly Thr	Pro	Arg	Thr

145 150

Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 10 15

Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 25 30

His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro 40 45

Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 60

Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 75 ao

Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 90 95

Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 105 110

Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 120 125

Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 14 0

Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn 155 150

- 54 CZ 30ί494 B6

Cys Pro

Leu

Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp

Asp Gly Ala Ser

Gly 175

Ser

165

170

Lys

Asp

Lys

Lys

Pro

Asp

Arg

Met

Asn

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys

Ile

Ala

180

135

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

ASD

Ala

Thr

195

200

205

Tle

t r- 1 v c* -l

y-, i

Glu

Πΐ

Val

T,\ZC5 — J '

Tví-

Gin

Tip

Lys

Tys

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

dy

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

?ro

Glu

Ser

a κγύ X X^.

Í.TJ--5 — 4

Tys

Len

G1 u

Lva

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Tle

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn.

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Tle

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

2 30

235

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Giu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

Ile

340

345

350

Asp

Pro

Trp

Tle

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

355

360

365

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

370

375

380

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

?ro

Thr

Thr

Leu

3 85

390

395

400

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

Tle

405

410

415

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

Gly

420

425

430

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu

435

440

445

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg

450

455

460

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

Leu

465

470

475

430

Glu ,

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

- 55 CZ 301494 B6 ίο (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRLH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Erns mutant 345 A/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

Met Glu Leu Asn H.is

Phe

Glu

Leu Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

1

5

Pro

Val

Gly

Val

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg

Pro

Leu

20

25

30

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

Glu

Val

His

Pro

Cln

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

35

40

45

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp

rie

Arg

Thr

Thr

Leu

Arg

Asp

Leu

Pro

50

55

60

Arg

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn

His

Leu

Gly

Pro

Val

Ser

Gly

65

70

75

80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly

Pro

85

90

95

Val

Tyr

His

Arg

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin

Phe

Cys

100

105

110

Glu

Val

Thr

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

115

120

125

Tyr

His

Ile

Tyr

Val

Cys

Val

Asp

Gly

Cys

ile

Leu

Leu

Lys

Leu

Ala

130

135

140

Lys

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Tle

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

145

150

155

160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly

Ser

165

170

175

Lys

Asp

Lys

Lys

Pro

Asp

Arg

Met

Asn

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys

Ile

Ala

180

135

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

val

Glu

Gly

val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210 215 220

- 56CZ 301494 Bó

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

' Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

' Lys 245

: Lys

Leu

L Glu

. Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

. Leu

. Tyr

Gin

. Prc

» Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Ala 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tvr

Asn

Tle

Asp 3 55

Pro

Trp

Ile

η Ϊ «

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Γ .^1 1

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 4 65

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

-57CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 493 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Erns mutant delece v poloze 346-7/ i? (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr io

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

Hia

Asp 50

Arg

Gly Arg

Gly Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 13 5

Asp

Gly

Cys

ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys ISO

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 135

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ger 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val

Val

Glu

Gly

val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly Lys

Val

210 215 220

-58CZ 301494 B6

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

-Γ.-

Λ 1 LU Í.J

Leu

Oar

Δ. en — r-

niv

Thr

Asn

Glv

Tle

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

XJ-Í f-

L£U

Ala

Thr

Λ cí Tb

Thr

Glu

Leu

Γ.νς — j ’

Gin

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

Ile

340

345

350

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

355

360

365

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

370

375

380

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

Leu

335

390

395

400

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

Ile

405

410

415

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

val

Ser

Val

Giu

Asp

Tle

Leu

Tyr

Gly

420

425

430

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu

435

440

445

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

GlU

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg

450

455

450

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

Leu

465

470

475

480

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490

-59CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Ems mutant delece v poloze 346/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

lle

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

LyS 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

-60CZ 301494 B6

Lys 225

Gly Lys

Asn

Thr

Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys

Pro 240

230

235

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

cly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Ary

rtj.a

πβ ÍL

m. ... x / *

275

280

285

Leu.

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

340

345

350

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

355

360

365

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

370

375

380

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

385

390

395

400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

405

410

415

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

420

425

430

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

435

440

445

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Al a

450

455

460

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

465

470

475

480

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

-61 Q7. 301494 Bó (2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Ems mutant delece 346 K/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

Met Glu. Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys

1

5

10

15

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

As? 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 8o

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 15$

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

ASp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

-62CZ 301494 B6

Lys Gly Lys 225

Asn Thr Gin Asp Gly 230

Leu

Tyr

His Asn 235

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Tle

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Cln

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ila

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

HÍS

Glu

Trp

Asn

Lys

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

3 o G

3 65

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

4S5

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

4S5 490 495

-63CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

í (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY; protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Erns mutant 346 L/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

Mec Glu 1

Leu Asn

His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys

5

10

15

Pro

Val

Gly

val

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg

Pro

Leu

20

25

30

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

Glu

Val

His

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

35

4 0

45

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu

Arg

Asp

Leu

Pro

50

55

60

Arg

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn

His

I-eu

Gly

Pro

Val

Ser

Gly

65

70

75

80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro

Gly

Pro

val

Tyr

Tyr

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly

Pro

85

90

95

Val

Tyr

His

Arg

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin

Phe

Cys

100

105

110

Glu

Val

Thr

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

115

120

125

Tyr

His

Ile

Tyr

Val

Cys

Val

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu

Leu

Lys

Leu

Ala

130

135

140

Lys

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

145

150

155

160

-64’

Cys

Pro Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp Asp Gly Ala ser Gly Ser

170

175

Lys

Asp

Lys

Lys

Pro

Asp

Arg

Met

Asn

Lys

Cly

Lys

Leu

Lys

Ile

Ala

190

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

τ 1 _ J.

Val

Tí, 1 v

Glu

Gly

Val

Lys

Τλλτ- -

Gin

Tlř-

Lys

T,vs

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

23 0

235

240

Γι»-λ i' i.

Λ») M

Ser

a -r-í-i •—

Lys

Lys

Len

m u

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Tle

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Tle

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

27 5

290

235

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

235

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Leu

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn.

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

C-ly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

495

-65CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Ems mutant 297 K 346 K/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly ao

He

Tyr

Ile

Lys

Pro Θ5

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

?he

ASp

Glu

Al a

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

val

Cys

Val 13S

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn ISO

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 130

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

- 66 CZ 301494 B6

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lya

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Lys

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

255

Λ Λ Λ J vu

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

±hx

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

335

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Cly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

435

490

495

-67CZ 301494 Bó (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka - CSFV Ems mutant 297 K 346 L/

(xi) Popis :

sekvence: SEQ ID NO

: 22:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg Pro 30

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Tle

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr Gly 95

Pro

Val

'Tyr

His

Arg 1Q0

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin Phe 110

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys Ile 190

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp Ala

Thr

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly Lys

Val

210 215 220

-68CZ 301494 B6

Lys 225

Gly Lys

Asn Thr

Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys

230

235

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

260

265

270

Trp

Asn.

Leu

Sed

Asp

Asn

VJXJ

mu X XX-L.

ÍUU4A

Piv

Ile

Gin

fl -r*rr --□

Ala

Met

275

290

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Lys

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

290

295

300

Cys

Lys

Gly

VaJ

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

mL 1 XXX.

ni., Oiu

Τ Λ, η XJk- kU

x,ys

305

310

315

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Leu

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ce

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

385

390

395

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

405

410

41S

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

' His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

450

455

460

Ala

Arg

' Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

465

470

475

Lys

Leu

. Glu

. Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

495

Pro

240

Val

Gin

Tyr

Ile

Glu.

320

Cys

Tyr

Leu

Asp

Thr

400

Thr

Leu

Tyr

Ala

Lys

480

-60CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

Kl (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka - CSFV Ems mutant 297 L 346 L/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

Met Glu 1

Leu Asn His 5

Phe

Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys

10

15

Pro

Val

Gly

Val

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg

Pro

Leu

20

25

30

Phe

Gly

Asn

Pro

ser

Glu

Val

His

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

35

40

45

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu

Arg

Asp

Leu

Pro

50

55

60

Arg

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn

His

Leu

Gly

Pro

Val

Ser

Gly

65

70

7 5

80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly

Pro

85

90

95

Val

Tyr

His

Arg

Ala

pro

Leu

Glu

Phe

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin

Phe

Cys

100

105

110

Glu

Val

Thr

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

115

120

125

Tyr

Kis

Ile

Tyr

Val

Cys

Val

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu

Leu

Lys

Leu

Ala

130

13 5

140

Lys

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

145

150

155

160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly

Ser

165

170

175

Lys

Asp

Lys

Lys

Pro

Asp

Arg

Met

Asn

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys

Ile

Ala

180

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210 215 220

-70CZ 301494 B6

Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly 225 230

Pro	Glu	Ser	Arg	Lys 245	Lys	Leu	Glu
Ile	Thr	Ile	Leu 260	Leu	Tyr	Gin	Pro
Trp	Asn	Leu 275	Ser	Asp	Asn	Gly	Thr 280
Leu	Arg 290	Gly	Val	Asn	Arg	Ser 295	Leu
Cys 305	Lys	Gly	Val	Pro	Thr 310	His	Leu
Ile	Arg	Gly	Met	Met 325	Asp	Al a	Ser
Arg	Leu	Gin	Arg 340	His	Glu	Trp	Asn
Asn	lle	Asp 355	Pro	Trp	lle	Gin	Leu 360
Thr	Glu 370	Gly	Pro	Pro	Asp	Lys 375	Glu
Lys 385	Asn	Thr	Asp	Val	Asn 390	Val	Val
Thr	Leu	Thr	Gly	Cys 405	Lys	Lys	Gly
Val	Ile	Glu	Gly 420	Pro	Cys	Asn	Phe
Tyr	Gly	Asp 435	His	GlU	Cys	Gly	Ser 440
Leu	Leu 450	Asp	Gly	Met	Thr	Asn 455	Thr
Ala 465	Arg	Val	Thr	Ser	Trp 470	Leu	Gly
Lys	Leu	Glu	Arg	Arg	ser	Lys	Thr

435

Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro 235 240

Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val 250 255

Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin 265 270

Asn Gly lle Gin Arg Ala Met Tyr 285

Leu Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile 300

ALa Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu 315 320

Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys 330 335

Lys Leu Gly Trp Cys Asn Trp Tyr 345 350

Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu 365

Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp 380

Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr 395 400

Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr 410 415

Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu 425 430

Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr 445

Tle Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala 460

Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys 475 480

Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 490 495

-71 Cl 301494 Bó (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka - BVDV protein Ems/

(xi) r

opis s

ekveti

ice: S

EQIDNO:

24:

Met

Glu

Leu

Ile

Thr

Asn

Glu

Leu

Leu

Tyr

Lys

Thr

Tyr

Lys

Gin

Lys

1

5

10

15

Pro

Ala

Gly

Val

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr

Asp

Gin

Ala

Gly

Asn.

Pro

Leu

20

25

30

Phe

Gly

Glu

Arg

Gly

Val

Ile

His

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

40 45

His Lys Arg 50

Gly Glu

Arg

Glu Val Pro Thr Asn Leu Ala Ser Leu Pro

55

60

Lys

Arg

Gly

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn

Ser

Lys

Gly

Pro

Val

Ser

Gly

65

70

75

80

ile

Tyr

Leu

Lys

Pro

Gly

Pro

Leu

Phe

Tyr

Gin

Asp

Tyr

Lys

Gly

Pro

85

90

95

Val

Tyr

His

Arg

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe

Phe

Glu

Glu

Ala

Ser

Met

Cys

100

105

110

Glu

Thr

Thr

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Asp

Ser

Arg

Leu

115

120

125

Tyr

His

Ile

Tyr

val

Cys

Ile

Asp

Gly

Cys

Ile

Ile

Val

Lys

Ser

Ala

130

135

140

Thr

Lys

Asp

Arg

Gin

Lys

Val

Leu

Lys

Trp

Val

His

Asn

Lys

Leu

Asn

145

150

155

160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Ser

Ser

Cys

Ser

Asp

Thr

Lys

Asp

Glu

Gly

Val

165

170

175

Val

Arg

Lys

Lys

Gin

Gin

Lys

Pro

Asp

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

Met

18 0

185

190

Lys

Tle

Thr

Pro

Lys

Glu

Ser

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

195

200

205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val

Val

Asp

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Val

Lys

Lys

Lys

210

21S

220

-72CZ 301494 B6

Gly Lys Val Lys 225

Ser

Lys 230

Asn Thr Gin Asp

Gly Leu Tyr His Asn Lys

235

240

Asn

Lys

Pro

Gin

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

245

250

255

Trp

Ala

Ile

Ile

Ala

Leu

Val

Phe

Phe

Gin

Val

Thr

Met

Gly

Glu

Asn

260

265

270

TT 1 *. ±±C

mu *i> Α4Α»

r-i Ί SJ J.J.A

*

Asn

Leu

Gin

Ζι.ςη

Civ -A

^hr

Clu

Gly

Ile

Gin

Arg

275

230

285

Ala

Met

Phe

Gin

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

290

295

300

Glu

bys

Ile

Cyy

Tni~

Gly

Val

P ΊΓΟ

T.T „ lij.

T í-n , JJt. UL

Ti 1 Λ Jk LA

Thr

Λ cr. 1

Thr

Gin

305

310

315

320

Leu

Lys

Ala

Ile

His

Gly

Met

Met

ASp

Ala

Ser

Glu

Lys

Thr

Asn

Tyr

325

330

335

Thr

Cys

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

340

345

350

Asn

Trp

Tyr

Asn

Ile

Glu

Pro

Trp

Ile

Leu

Leu

Met

Asn

Lys

Thr

Gin

355

360

365

Ala

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly

Gin

Pro

Leu

Arg

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

370

375

380

Arg

Tyr

Asp

Arg

Asp

Ser

Asp

Leu

Asn

val

val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asp

395

390

395

400

Ser

Pro

Thr

Pro

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

405

410

415

Ala

Gly

Ile

Leu

Val

Gin

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Glu

Ile

Ala

Val

Ser

420

425

430

Asp

Val

Leu

Phe

Lys

Glu

His

Asp

Cys

Thr

Ser

Val

Ile

Gin

Asp

Thr

435

440

445

Ala

His

Tyr

Leu

Val

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Ser

Leu

Glu

Ser

Ala

Arg

450

455

460

Gin

Gly

Thr

Al a

Lys

Leu

Thr

Thr

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Gly

Ile

465

470

475

480

Leu

Gly

Lys

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

4Θ5

490

495

-73 CZ 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

' (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE;

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV protein Erns/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu .45

Lys

Leu

Pro

HÍS

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

val

Thr

Ser

cys

Ser

Asp

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly

Ser

165 170 175

74CZ 301494 Bó

Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala

180

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210

21S

220

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

Asn

Lys

Aoii

Lys

FtC

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

GJy

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

GlU

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

ASp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

3 90

3 95

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485

490

495

- 75 CZ. 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

iu (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka - CSFV Erns mutant 300 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cyg

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 130

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

-76CZ 301494 B6

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

HÍS

Gly

Ile

Gly 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

val

Pro

Thr 310

HÍS

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 42S

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

/1 1 , r uiy

Met

Thr

Asn 455

Thr

TLs

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 455

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

-77C7. 301494 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

s (A) DÉLKA; 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Erns mutant 300 G 302 A/ 15 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

LyS

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Α3Π 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

-78CZ 301494 B6

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

lle

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

2 70

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Aia

nec

•Tyr

275

230

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

HÍ3

Gly

Ile

Gly

Pro

Ala

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

ηή

Gly

Trp

Cvs

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

lle

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

3S0

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

3 95

400

Thr

Leu

Thr

Gly

cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Giy

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

lle

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala .

Arg

Val

Thr .

Ser

Trp

Leu '

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg Arg

Ser

Lys 1

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495

Claims (2)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Živá vakcína obsahující utlumený pestivirus, vyznačující se tím, žc v ní je ? deaktivována RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein E^RNS delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

   2. Vakcína podle nároku I, vy z n a č uj í c í se t í m , že uvedené delece a/nebo mutace se nacházejí v polohách 295 až 307 a/nebo v polohách 338 až 357 uvedeného glykoproteinu, jak je in zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmen AIfořt nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.

   3. Vakcína podle kteréhokoliv z nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, Že RNázová aktivita je deaktivována delecí nebo mutací aminokyseliny v poloze 346 uvedeného glykoprotei15 nu, jakje zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmen Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.

   4. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že RNázová aktivita je deaktivována delecí histidinového zbytku v poloze 346 uvedeného glykoproteinu, jak

   2o je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmen Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.

   5. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že RNázová aktivita je deaktivována mutací histidinového zbytku v polohách 297 a 346 uvedeného glyko25 proteinu na leucin, jak je zobrazeno na obr. I v případě CSFV kmen Alfort nebo v odpovídajících polohách vjiných kmenech.

   6. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, obsahující pestivirus BVDV, vyznačující se tím, že RNázová aktivita je deaktivována delecí histidinového zbytku v poloze 346

   30 uvedeného glykoproteinu, jakje zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmen Alfort nebo v odpovídajících polohách vjiných kmenech BVDV.

   7. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo 5, vyznačující se tím, že RNázová aktivita je deaktivována mutací histidinového zbytku v polohách 297 a 346 uvedeného

   35 glykoproteinu na leucin, jak je zobrazeno na obr. I v případě CSFV kmen Alfort nebo v odpovídajících polohách vjiných kmenech BVDV.

   8. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, Že obsahuje vakcínu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.

   9. Způsob utlumení pestivirů, v y z n a č uj í c í se t í m , že se deaktivuje RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein E^RNS delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu, přičemž uvedené delece a/nebo mutace se nacházejí v polohách 295 až 307 a/nebo v polohách 338 až 357 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě

   45 CSFV kmen Alfort nebo v odpovídajících polohách vjiných kmenech a vedou k utlumení pestiviru.

   10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny v poloze 346 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno na

   50 obr. I v případě CSFV kmen Alfort nebo v odpovídajících polohách vjiných kmenech.

   11. Způsob podle kteréhokoliv z nároku 9 nebo 10, vyznačující se tím, žc RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno na obr, 1 v případě CSFV kmen Alfort nebo v odpovídajících polohách vjiných kme55 nech.

   -80CZ 301494 B6

   12. Způsob podle kteréhokoliv z nároku 9 nebo 10. vyznačující se tím. že RNázová aktivita se deaktivuje mutací histidinového zbytku v polohách 297 a 346 uvedeného glykoproteinu na leucin, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmen Alfort nebo v odpovídajících polo5 hách v jiných kmenech.

   13. Použití vakcíny podle kteréhokoliv znároků 1 až 7 nebo farmaceutického prostředku podle nároku 8 pro výrobu léčiva pro profylaxi a léčení infekcí, vyvolaných pestivirem u živočichů.

   io 14. Způsob rozlišení zvířat, infikovaných pestivirem od zvířat, očkovaných specificky utlumeným pestivirem, který byl oslaben způsobem podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12, vyznačující se tím, že zahrnuje !} identifikaci nukleotidové sekvence nestiviru ve vzorku, odebraném zvířeti, podezřelému

   15 z infekce pesticidem nebo očkovanému zvířeti,
2. 2) korelaci deleci a/nebo mutací nukleotidové sekvence E^RNS přítomné ve vakcíně s očkovaným zvířetem a korelaci nepřítomnosti uvedených deleci a/nebo mutací s pestivirovou infekcí zvířete.

   15. Způsob rozlišení zvířat, infikovaných pestivirem od zvířat, očkovaných specificky utlumeným pestivirem, který byl oslaben způsobem podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12, vyznačující se tím, že zahrnuje

   1) identifikaci upraveného glykoproteinu h^RNS utlumeného pestiviru specifickým navázáním monoklonálních nebo polyklonalních protilátek na glykoproteiny E^R,NS, přítomné ve vzorku zvířete, podezřelého z infekce pestivirem nebo očkovaného zvířete, přičemž glykoproteiny byly upraveny způsobem podle kteréhokoliv znároků 9 až 12 a uvedené monoklonální nebo polyklonální protilátky se na tyto glykoproteiny nevážou,

   30 2) korelaci specifického navázání monoklonálních nebo polvklonálních protilátek s očkovaným zvířetem a korelaci nepřítomnosti vazby protilátky na pestivirovou infekci zvířete za předpokladu, že přítomnost pestivirového materiálu u zvířete a/nebo v odebraném vzorku se stanoví jiným způsobem.

   35 16. Způsob rozlišení zvířat, infikovaných pestivirem od zvířat, očkovaných specificky utlumeným pestivirem, který byl utlumen způsobem podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12, vyznačující se tím. že zahrnuje

   1) identifikaci neupraveného glykoproteinu E^kNS utlumeného pestiviru specifickým navázáním io monoklonálních nebo polyklonalních protilátek na glykoproteiny F.^RNS, přítomné ve vzorku zvířete, podezřelého z infekce pestivirem nebo očkovaného zvířete, přičemž glykoproteiny nebyly upraveny způsobem podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12 a uvedené monoklonální nebo polyklonální protilátky se na upravené glykoproteiny nevážou,

   45 2) korelaci specifického navázání monoklonálních nebo polyklonálních protilátek s infikovaným zvířetem a korelaci nepřítomnosti vazby protilátky na očkované zvíře za předpokladu, že přítomnost pestivirového materiálu u zvířete a/nebo v odebraném vzorku se stanoví jiným způsobem.

   50 17. Způsob rozlišení zvířat, infikovaných pestivirem od zvířat, očkovaných specificky utlumeným pestivirem, který byl utlumen způsobem podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12, vyznačující se tím, že zahrnuje

   1) stanovení přítomnosti nebo absence RNázové aktivity glykoproteinu E^KNS ve vzorku,

   55 odebraném zvířeti, podezřelému z infekce pestivirem nebo očkovanému zvířeti,

   -81 CZ 301494 B6

   2) korelaci absence RNázové aktivity glykoproteinu E^RNS s očkovaným zvířetem a korelaci přítomnosti uvedené aktivity s pestivirovou infekcí zvířete.

   5 18. Způsob rozlišení zvířat, infikovaných pestivirem od zvířat, očkovaných specificky utlumeným pestivirem, který byl utlumen způsobem podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12, vyznačující se tím, že zahrnuje

   1) identifikaci specifického navázání polyklonálních nebo protilátek na neupravený glykoio protein E^MNS nebo na glykoprotein E^RNS utlumeného viru, upravený podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12,

   2) korelaci navázání uvedených polyklonálních protilátek na neupravený glykoprotein E^RNS s pestivirovou infekcí a korelaci navázání uvedených polyklonálních protilátek na glykoprotein

   15 E^rns utlumeného pestiviru, modifikovaný způsobem podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12 s očkovaným zvířetem.