CZ301569B6 - Zpusob detekovatelného znacení pestiviru - Google Patents

Abstract

Podstatu rešení tvorí zpusob detekovatelného znacení pestiviru, pri nemž se deaktivuje RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein E.sup.RNS.n. delecemi a/nebo mutacemi alespon jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu za predpokladu, že aminokyselina v polohách 297 a/nebo 346 je odlišná od lysinu, jak je zobrazeno na Obr. 1 v prípade CSFV kmen Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech, pricemž deaktivace RNázové aktivity vede ke vzniku utlumeného (atenuovaného, oslabeného) pestiviru.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu detekovatelného značení pestivirů, při němž se deaktivuje RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoproteín E^RNS delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu za předpokladu, že aminokyselina v polohách 297 a/nebo 346 je odlišná od lysinu, přičemž deaktivace RNázové aktivity vede ke vzniku ztlumeného (atenuova10 ného, oslabeného) pestivirů.

Dosavadní stav techniky

Pestiviry jsou kauzativní agens ekonomicky významných onemocnění zvířat v mnoha zemích po celém světě. V současné době známé virové izoláty se dělí do tři různých druhů, které společně tvoří jeden rod v čeledi Flaviviridae.

I. Virus bovinní virové diarrhey (BVDV) způsobuje bovinní virové průjmové (BVD) aone20 mocnění sliznic (MD) u telat (popisuje se v publikaci Baker, 1987; Moenning and

Plagemann, 1992, Thiel et al., 1996).

II. Virus klasické prasečí horečky (CSFV), který se nazývá virus cholery suis (CSF), odpovídá za klasickou prasečí horečku (CSF) nebo choleru suis (HC) (popisuje se v publikaci

Moenning and Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996).

III. „Border disease virus“ (BDV) se v typickém případě vyskytuje u ovcí a způsobuje „Border disease“ (BD). Uvádí se, že symptomy podobné MD u telat se také objevují po intrauterinní Moennig and Plagemann, 1992, Thiel et al., 1996).

Za použití jiné klasifikace se pestiviry popisuji v publikaci Becher, P., Konig, M., Paton, D. J., Thiel, H. J., 1995, Futher characterizatíon of border disease virus isolates; evidence for the presence of more than three species within the genus pesivirus. Virology 209 (1), 200-206 nebo v jiných publikacích.

Pestiviry jsou malé viry s obalem a sgenomem tvořeným jednořetězcovou RNA pozitivní polarity, které chybí sekvence čepičky na 5'-konci a 3'poly(A). Virový genom kóduje polyprotein, který obsahuje přibližně 4000 aminokyselin, přičemž úpravami při a po translaci vzniká konečný produkt štěpení. Uvedené postupy zahrnují buněčné a virové proteázy. Virové proteiny se uspořádaly do polyproteinu za účelem vzniku NH^-H^-C- E^Rřís-El-E2-p7-NS2-NS3NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH (popisuje se v publikaci Rice, C. M. 1996. The pestiviruses, In Fields Virology, eds. Fields, Β. N., Knipe, D. M., and Howley, Ρ. M. (Lippincott-Raven, Philadelphia), pp. 931-959). Protein C a glykoproteiny E^RNS, El a E2 reprezentuji strukturální komponenty pestivirových virionů (Thiel, H. Jstark, R., Weiland, E., Rumenapf, T. and

Meyers, G. 1991. Hog cholera virus; molecular composition ofvirions from a pestivirus. J. Virol.

65: 4705-4712.31). Zjistilo se, že E2 a v menším rozsahu E“¹⁸ tvoří cíle neutralizačních protilátek (popisuje se v publikaci Donis, R. O., Corapi, W., and Dubovi, E. J. 1988. Neutralizing monoclonal antibodies to bovine viral diarrhea virus hind to the 56K to 58K glycoprotein. J. Gen. Virol. 69: 77-86, Paton, D. J., Lowings, J. P., Barrett, A. D. 1992. Epitop mapping of the gp53 envelope protein of bovine viral dianrhea virus. Virology 190: 763-772, van Rijn, P. A., van

Gennipi, H. G., de Meijer, E. J., Moormann, R. J. 1993. Epitope mapping of envelope glycoprotein El of hog cholera virus strain Brescia. J. Gen. Virol. 74:2053-2060, Weiland, E., Stark, R., Haas, B., Rumenapf, T., Meyers, G. and Thiel, H. J. (1990). Pestivirus glykoproteín which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer, J. Virology 64,

3563-3569).

-1JUIJU7 DO

Glykoproteinu E^RNS chybí membránová kotva a vylučuje se v podstatném množství z infikovaných buněk. Uvádí se, že uvedený protein vykazuje aktivity RNázy (popisuje se v publikaci Hulst, Μ. M., Himes, G., Newbigin, E:, Moormann, R. J. M. 1994. Glycoprotein E2 of classical swine fever virus: expression in insect cells and Identification as a ríbonuclesa. Virology 200: 558-565, Schneider, R,, G. Unger, R. Stark, E. Schneider-Scherzer, and H.J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169— 1171, Windish, J. M., Schneider, R., Stark, R., Weiland, E., Meyers, G. and Thiel, H. J. 1996. Rnase of classical swine fever virus: biochemical characterization and inhibition by vimsio neutralizing monoclonal antibodies. J. Virol. 70: 352-358). Funkce uvedené enzymatické aktivity ve virovém životním cyklu nejsou známy. V případě vakcinačního kmene CSFV dochází k experimentálnímu poškození RNázy místně řízenou metagenezí a vede ke vzniku cytopatogenního viru, který vykazuje růstové charakteristiky v buněčné kultuře shodné s virem divokého typu (popisuje se v publikaci Hulst, Μ. M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and

Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E¹“ of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157). Enzymatická aktivita závisí na přítomnosti dvou pruhů aminokyselin, které jsou konzervativní mezi pestivirem E^rns a různými RNázami rostlinného nebo fungálního původu. Obě uvedené konzervativní sekvence obsahují histidinový zbytek (popisuje se v publikaci Schneider, R., G. Unger, R. Stark,

E. Schneider-Scherzer, and H. J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease, Science 261: 1169-1171). Záměna každého ztěchto zbytků v proteinu E^RNS vakcinačního kmene CSFV za lyzin vede k destrukci aktivity RNázy (popisuje se v publikaci Hulst, Μ. M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E^ffl9 of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus, J, Virol. 72: 151-157). Zavedení těchto mutací do genomu vakcinačního kmene CSFV neovlivňuje schopnost viru nebo jeho růstové vlastnosti, ale vede to ke vzniku viru, který vykazuje slabě cytopatogenní fenotyp (popisuje se v publikaci Hulst, M. M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E^ms of classical swine fever virus results in a cyto30 pathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157).

Vakcíny obsahují utlumené a usmrcené viry nebo virové proteiny exprimované v heterogenních expresívních systémech, které se vytvořily pro CSFV a BVDV a v současné době se používají. Strukturální základ utlumení těchto virů, které se používají jako živé vakcíny není znám. To vede k nebezpečí nepředpokládaných revertantů vznikajících zpětnou mutací nebo rekombínací, k čemu může dojít po vakcinaci. Na druhé straně účinnost deaktivovaných vakcín nebo heterologně exprimovaných virových proteinů (podjednotkové vakcíny) při indukci imunity je spíše nízká.

V obecném případě živé vakcíny s definovanými mutacemi, jako základ pro utlumení, umožní obejít nevýhody vytvoření vakcín. Potencionální cíle tlumicích mutací u pestiviru nejsou v současné době dostupné. Další výhodou uvedených tlumicích mutací je jejich molekulová jedinečnost, která umožňuje je použít jako jednoznačné značení v případě utlumených pestivirů a ty se odlišují od obecných pestivirů.

Vzhledem k důležitosti účinnosti a bezpečnosti stejně jako detekovatelné profylaxe a léčbě pestivirových infekcí existuje nutnost vytvořit živé a specificky utlumené vakcíny s vysokým potencionálem indukce imunity stejně jako nutnost definovat základy utlumení, které utlumené viry odlišují od patogenních pestivirů.

Proto základní řešený problém uvedeného vynálezu je vytvořit specifiky utlumené a detekovatelné značené pestiviry vhodné při použití jako živé utlumené vakcíny s vysokou účinností při indukci imunity, což jako výsledek této metody je odlišuje od patogenních obecných pestivirů.

-2Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob detekovatelného značení pestivirů, při němž se deaktivuje RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein E^RNS delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu za předpokladu, že aminokyselina v polohách 297 a/nebo 346 je odlišná od lysinu, jak je zobrazeno na Obr. 1 v případě CSFV kmen Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech, přičemž deaktivace RNázové aktivity vede ke vzniku utlumeného (atenuovaného, oslabeného) pestivirů.

io Termín „vakcína“ znamená farmaceutickou kompozicí obsahující alespoň jeden imunologicky aktivní komponent, který indukuje imunologickou odezvu u zvířat a je možné nikoli nezbytné použít jeden nebo více dalších komponentů, které zesilují imunologickou aktivitu uvedeného aktivního komponentu. Vakcína může dále obsahovat další komponenty, které jsou typické pro farmaceutické kompozice. Imunologicky aktivní komponent vakcíny může obsahovat celý živý organizmus buď v jeho původní formě, nebo jako utlumené organizmy v tak zvané upravené živé vakcíně (MLV) nebo v organizmech deaktivovaných vhodnými metodami v tzv. mrtvých vakcínách (KV). V jiné formě imunologicky aktivního komponentu vakcíny mohou být obsaženy vhodné elementy uvedených organizmů (podjednotkové vakcíny), přičemž jejich elementy se tvoří buď porušením celého organizmu, nebo kultivací kultury uvedených organizmů a násled20 nými kroky čištění, které vedou ke vzniku požadované struktury nebo vhodnou manipulací podobného vhodného systému, přičemž použití není omezeno na bakterie, hmyz nebo jiné druhy a následnou izolaci a čištění nebo indukci uvedeného syntetického postupu u zvířete nebo vytvoření vakcíny přímým zavedením genetického materiálu za použití vhodných farmaceutických prostředků (polynukleotidová vakcína). Vakcína může obsahovat jeden nebo současně více ele25 mentů, které se popisují shora v textu.

Další komponenty pro zvýšení imunitní odezvy jsou konstituenty, které se běžně nazývají adjuvans, jako je například hydroxid hlinitý, minerální nebo jiné oleje nebo podpůrné molekuly přidané do vakcíny nebo vytvořené v těle po indukci takovými dalšími komponenty, kterými jsou například interferony, interleukiny nebo růstové faktory.

Termín „farmaceutický prostředek“ v podstatě obsahuje jeden nebo více ingrediencí schopných modifikovat fyziologické například imunologické funkce organizmu. Tento prostředek se aplikuje do živého organizmu nebo na jeho povrch. Mohou to být například antibiotika nebo anti35 parazitika stejně jako konstituenty knim přidané za účelem dosáhnout jiných jevů, jako jsou znaky zpracování, sterility, stability, možnosti aplikace prostředku enterální nebo parenterální cestou, jako je orální, intranasální, intravenózní, intramuskulámí, podkožní, intradermální nebo jinou vhodnou cestou, tolerance po aplikaci a řízené uvolněné vlastnosti.

Vakcína podle vynálezu znamená vakcínu popsanou shora v textu, kde jeden imunologicky aktivní komponent je pestivirus neboje pestivirového původu.

Termín „živá vakcína“ znamená vakcínu obsahující živý zvláště pak živý virový aktivní komponent.

Termín „pestivirus“ znamená všechny pestiviry charakterizované tím, že patří do stejného rodu jako BVDV, CSFV a BDV v čeledi Flaviviridae a exprimují glykoprotein E^RNS. Uvedený termín samozřejmě také znamená všechny pestiviry, jak se popisují v publikaci Becher et al., (1995) nebo jiné, které exprimují glykoprotein E^RN . Termín „aktivita RNázy“ znamená schopnost so glykoproteinu E^RNS hydrolyzovat RNA.

Je nutné poznamenat, že termín „glykoprotein E0“ se často používá současně s glykoproteinem E^, jak se popisuje v uvedených publikacích.

-3CZ, JU13O7 DO

Termín „deaktivace RNázové aktivity nacházející se v uvedeném glykoproteinu“ znamená neschopnost nebo omezenou schopnost upraveného glykoproteinu E^RNÍhydrolyzovat RNA, což se porovnává s nemodifikovaným divokým typem uvedeného glykoproteinu E.

Deaktivace RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS se může dosáhnout delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu, jak se uvádí zde a v publikaci Hulst, Μ. M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E¹“ of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157). V preferovaném provedení vynálezu se popisují io živé vakcíny, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

Ukázalo se, že glykoprotein E^RNS tvoří homodimér vázaný na disulfid o molekulové hmotnosti 97 000, kde každý monomér obsahuje 227 aminokyselin, které odpovídají aminokyselinám

268 až 494 polyproteinu CSFV, jak se popisuje v publikaci Rumenapf et al. (1993). Prvních 495 aminokyselin exprimovaných Alfortovým kmenem CSFV je zobrazeno na obrázku č. 1. Genomová sekvence Alfortova kmene CSFV je dostupná v GenBank/knihovna dat EMBL s číslem uložení J04385. V jiném případě aminokyselinová sekvence v případě kmene CP7 BVDV se může najít v GenBank/knihovně dat EMBL (s číslem uložení U63479). Dvě oblasti aminokyselin jsou v glykoproteinu E^RNS vysoce konzervativní stejně jako v některých rostlinných a fungálních proteinech, které vykazují RNázovou aktivitu (popisuje se v publikaci Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. Sehneider-Scherzer, and H. J. Thiel. 1993. Identification of a struetural glycoproteinn of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171). Tyto dvě oblasti jsou zvláště důležité pro RNázovou enzymatickou aktivitu. První oblast obsahuje oblast aminokyselin v polohách 295 až 307 a druhá oblast obsahuje aminokyseliny v poloze 338 až 357 uvedeného virového proteinu, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě Alfortova kmene CSFV (Číslování se provádí podle publikované dedukované aminokyselinové sekvence Alfortova kmene CSFV (popisuje se v publikaci Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H. J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567). Amino30 kyseliny, které jsou důležité pri RNázové aktivitě, jak se uvádí shora v textu, nejsou žádným způsobem omezeny na přesné polohy, jak se definuje v případě Alfortova kmene CSFV, ale používají se jednoduchým způsobem, aby se ukázalo, že preferované aminokyseliny jsou v uvedené poloze nebo odpovídají aminokyselinám v uvedené poloze jiných kmenů jak je možné zjistit v obecném případě u BVDV, BDV a pestiviru, protože jsou vysoce konzervativní.

V případě pestivirů, které jsou jiné než Alfortův kmen CSFV, číslování poloh preferovaných aminokyselin se často liší, ale odborník v oboru molekulární biologie pestivirů jednoduše identifikuje tyto preferované aminokyseliny na základě jejich polohy vztažené vůči vysoce konzervativním aminokyselinám uvedeného glykoproteinu. V jednom určitém nelimitujícím příkladu je poloha CSFV Alfort 346 identická s polohou 349 kmene cp7 BVDV.

Vynález popisuje ve více preferovaném provedení vynálezu vakcínu podle vynálezu, kde uvedené deaktivuj ící delece a/nebo mutace se nacházejí v aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě CSFV Alfortova kmene nebo odpovídá polohám aminokyselin uvedeného glykoproteinu v jiných kmenech.

Ve velmi preferovaném provedení vynálezu se uvádí, že deaktivace uvedené RNázové aktivity deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346 uvedeného glykoproteinu vede ke vzniku zvláště použitelné živé vakcíny. Vynález dále popisuje vakcíny podle vynálezu, kde RNázová aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č, 1 v případě so CSFV Alfortova kmene.

Vynález demonstruje, že pestiviry jsou dostupné a kódují protein E^RNS bez RNázové aktivity, v případě, že se deletuje histidinový zbytek v poloze 346 virového polyproteinu (číslování se provádí v souladu s publikovanou sekvencí CSFV Alfort/Tubingen (popisuje se v publikaci

Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H. J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence

-4of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567), který reprezentuje jeden z konzervativních zbytků putatívního místa E^R^^S RNázy. Vynález dále popisuje, že delece histidinů v proteinu E^RNS pestivirů BVD (v poloze 349, číslováno v souladu se sekvencí BVDV CP7 GenBank/EMBL (číslo uložení U63479) vede ke vzniku dostupného viru, kde glykoprotein

E^rns ztratil RNázovou aktivitu. Na rozdíl od bodových mutací, kde dochází k záměně jedné aminokyseliny za jinou, de léční mutanti jsou v obecném případě daleko stabilnější s ohledem na revertanty. Infekce prasat mutantem patogenního kmene CSFV Alfort/Tubíngen exprimujícím E^rns s touto deleci nevede k horečce ani k jiným typickým klinickým příznakům infekcí CSFV, zatímco infekce virem divokého typu způsobuje horečku, průjem, anorexii, apatyi, depleci ío B-buněk a poruchy centrálního nervového systému. Tyto prasata se usmrtila 14 dní po inokulaci ve fázi umírání, kdy se objevilo silné krvácení kůže a vnitřních orgánů. Infikovaná prasata nevykazují ani viremn ani depleci B-buněk, jak se ukázalo v testech provedených 3., 5., 7., 10. a 14 den po infekci, zatímco CSFV se jednoduše izolovaly ze vzorků krve získaných z prasat inokulovaných virem divokého typu. Deleění mutant se zjevně replikuje ve zvířatech, jak se indikuje indukcí neutralizujících protilátek (popisuje se v příkladu 3, tabulka č. 3c). Imunní odezva na mutantní virus je dostatečná, aby umožnila přežít smrtelnou dávku 2x10⁵ TCID₅₀ vysoce patogenní infekce kmenem CSFV Eystrup (Konig, 1994), který je heterologní s kmenem Alfort. Testovaná zvířata nevykazují typické klinické příznaky infekce CSFV, jako je horečka, průjem, krvácení, deplece B-buněk nebo anorexie, po opakované infekci. Tato data demonstrují, že infekce prasat s delečními mutanty indukuje imunitní odezvu dostatečnou pro ochranu proti přísné vakcinaci.

V nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují vakcíny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivovala deleci histidinového zbytku v poloze 346, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort,

V dalším preferovaném provedení vynálezu se popisuje BCDV vakcíny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort.

V jiném provedení vynálezu se popisují utlumené pestiviry, kde RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^RNS se deaktivuje deleci a/nebo mutací alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu s podmínkou, že aminokyseliny v polohách 297 a/nebo 346 uvedeného glykoproteinu, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě CSFV, nejsou lyzin. Rekombinantní pesti35 virus, kde aminokyseliny v poloze 297 a/nebo 346 uvedeného glykoproteinu jsou lyzin, se popisují v publikaci Hulst, Μ. M., F. E: Panoto, A. Hooekmann, H. G. P. van Gennip., and Moormann, R. J. M. 1998. Inactivation of the Rnase activity of glycoprotein E^ms of classical swine fever virus results in a cytopathologenic virus. J. Virol. 72: 151-157. Tyto zvláštní pestiviry demonstrovaly cytopatické účinky v ledvinových buňkách prasat. Až do dnešního dne nedošlo ke zhodnocení nových tlumicích rysů způsobených deaktivací enzymatické aktivity proteinu E^RNS.

V preferovaném provedení vynálezu popisuje pestiviiy podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi provedenými na aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě CSFV Alfortova kmene.

Ve více preferovaném provedení vynálezu se popisují pestiviry podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort.

V nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují pestiviry, kde RNázová aktivita je potlačena deleci histidinového zbytku v poloze 346, jak se popisuje na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort.

-5V dalším nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují pestiviry BVDV, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě CSFV Alfortova kmene.

Utlumené pestiviry a aktivní komponenty vakcín podle vynálezu se mohou jednoduše připravit rekombinantními metodami modifikace nukleové kyseliny, které vedou k expresi mutantní aminokyselinové sekvence v glykoproteinu E^RNS. Vynález dále popisuje nukleové kyseliny kódující glykoprotein E^RNS, kde RNázová aktivita obsažená v uvedeném glykoproteinu se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu s podio mínkou, že aminokyseliny v poloze 297 a/nebo 346 glykoproteinu, jak se popisuje na obrázku č.

v případě CSFV Alfortova kmene, nejsou lyzin.

V preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi, které se nacházejí v aminokyselinách v poloze 296 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Ve více preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

V nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

V dalším nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují nukleové kyseliny BVDV podle vynálezu, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Nukleotidy například DNA nebo RNA je možné také použít při přípravě vakcín tvořených DNA, RNA nebo vektory, V těchto vakcínách se nukleotidy aplikují přímo do zvířete nebo nepřímo prostřednictvím vektoru, které v tomto případě nepochází z původního viru. Nukleotidové a vektorové vakcíny jsou dobře známy v oboru.

Dále vynález popisuje použití nukleových kyselin podle vynálezu vhodných pro přípravu nukleotidových a/nebo vektorových vakcín.

Vakcíny, utlumené pestiviry a nebo nukleové kyseliny podle vynálezu je možné zvláště použít při přípravě farmaceutického prostředku.

Dále vynález popisuje farmaceutické prostředky obsahující vakcínu podle vynálezu a/nebo pesti45 virus podle vynálezu a/nebo nukleotidovou sekvenci podle vynálezu. Jeden neomezující příklad takového farmaceutického prostředku se připravuje následujícím způsobem: supematant infikované buněčné kultury se smíchá se stabilizátorem (například spermidin a/nebo BSA (albumin bovinního séra) a směs se následně lyofilizuje nebo dehydratuje jinými metodami. Před vakcinaci se uvedená směs opětně hydrazuje vodou (například fyziologickým roztokem, PBS (fyziologic50 kým roztokem pufrovaným fosforečnanem)) nebo nevodnými roztoky (například emulzí, adjuvans založeným na hliníku).

Vynález se dále popisuje způsob tlumení pestivirů. Vynález dále popisuje jedinečnou a nepředvídatelnou metodu tlumení pestivirů charakterizovanou tím, že se deaktivuje RNázová aktivita v glykoproteinu E^RNS.

-6Specificky utlumené pestiviry je zvláště výhodné použít při přípravě vakcín. Vynález dále popisuje metody produkce specificky utlumených pestivirových vakcín charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita glykoproteinu E .

Deaktivace RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS poskytuje novou metodu detekovatělně značených pestivirů. Vynález dále popisuje metodu detekovatelného značení pestivirů charakterizovanou tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^RNS. Nepřítomnost RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS pestivirů podle vynálezu nyní umožňuje detekovatelné značení uvedených pestivirů. Značené a neznačené pestiviry nebo E^RNS vylučované z buněk infikovaných pestivirem v tělních tekutinách se mohou jasně odlišit přítomností a nepřítomností RNázové aktivity glykoproteinů E^RNS po izolaci a testování uvedené enzymatické aktivity.

ís V případě pestivirů deaktivace jejich RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^ delecí a/nebo mutací se může provést řadou jiných způsobů. Takové pestiviry se mohou jednoduše detekovat vzhledem ke struktuře vzniklé na základě takových delecí a/nebo mutací. Sekvenční rozdíl sekvence nukleové kyseliny změněného glykoproteinu E^RNS je detekovatelný sekvenováním nukleové kyseliny nebo metodou PCR, jak se popisuje v příkladu 8. Změněná proteinová sekvence se mohou detekovat specifickými monoklonálními protilátkami, které nerozeznávají nezměněné proteiny. Je také možné detekovat změněný a tím také strukturálně značené proteiny tím, že se naváží specifické monoklonální protilátky, které nerozeznávají nezměněné glykoproteiny E^RNS za podmínek, že se přítomnost pestivirů může stanovit jiným způsobem. Delece a/nebo mutace odstraňující RNázovou aktivitu u značených virů povede k různým imunitním odezvám u zvířat, kdy se porovnávají s odezvou, která je výsledkem infekcí neznačenými pestiviry.

Preferované provedení vynálezu popisuje metody utlumení pestivirů, způsoby produkce specificky utlumené pestivirové vakcíny a způsoby vhodné pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu, přičemž jde o metody vztahující se k deaktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená

RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

Preferované provedení vynálezu popisuje metody utlumení pestivirů, metody produkce speci35 ficky utlumených pestivirových vakcín a metody vhodné pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu. Tyto metody souvisí s deaktivací glykoproteinu E^RNS, kde uvedené delece a/nebo mutace se provedly na aminokyselinách v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 a/nebo 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám vjiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Dále vynález popisuje způsoby utlumení pestivirů, metody produkce specificky utlumené pestivirové vakcíny a metod vhodných pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby se vztahují k deaktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám vjiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Dále vynález popisuje způsoby utlumení pestivirů, metody produkce specificky utlumené pestivirové vakcíny a metody vhodné pro detekovatelné značení pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby se vztahují k deaktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám vjiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

-7CZ 301569 B6

Vynález dále popisuje vakcíny a/nebo jiné farmaceutické prostředky, které je možné částečně použít při profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat. Vynález dále popisuje metody použitelné při profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat charakterizovaných tím, že vakcína podle vynálezu nebo jiný farmaceutický prostředek podle vynálezu se aplikuje zvířeti, který potřebuje takovou profylaxi nebo léčbu.

Vynález dále popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestiviru charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^R ,

Vynález dále popisuje způsob přípravy specificky značených pestivirů charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^RNS.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů a způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecemi a/nebo mutacemi aminokyselin v poloze 295 až 307 a/nebo v poloze 338 až 357, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu E^RNS, kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí a/nebo mutací aminokyseliny v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob přípravy specificky utlumených pestivirů, způsob přípravy specificky značených pestivirů podle vynálezu. Tyto způsoby zahrnují způsoby příbuzné aktivaci glykoproteinu E , kde uvedená RNázová aktivita se deaktivuje delecí a/nebo mutací histidinového zbytku v poloze 346, jak se uvádí na obrázku č. 1 v případě kmene CSFV Alfort nebo odpovídá aminokyselinám v jiných kmenech uvedeného glykoproteinu.

Vakcíny nebo jiné farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou použitelné při profylaxi a léčbě pěsti virové infekce u zvířat.

Vynález popisuje použití vakcíny podle vynálezu pří profylaxi a léčbě pestivirových infekcí u zvířat. Dále vynález popisuje použití farmaceutického prostředku podle vynálezu vhodného pro profylaxi a léčbu pestivirových infekcí u zvířat.

Pestiviry a/nebo nukieové kyseliny podle vynálezu jsou použitelné aktivní komponenty farmaceutického prostředku nebo vakcíny. Vynález se proto popisuje použití pestiviru podle vynálezu a/nebo nukieové kyseliny podle vynálezu při přípravě vakcíny nebo farmaceutického prostředku.

Jak se popisuje shora v textu deaktivace RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS posky50 tuje novou metodu značení pestivirů.

Vynález dále popisuje způsoby vhodné pro rozlišení detekovatelně značených pestivirů podle vynálezu od neznačených a pravděpodobně patogenních pestivirů, Takové metody jsou zvláště použitelné při stanovení účinností značených pestivirů u zvířat. Prokázalo se, že zvíře, kterému se aplikovala vakcína, vykazuje, po získání vzorku z takového zvířete a testování, pozitivní značení.

-8Neoznačená a specificky neznačená zvířata, které vykazují přítomnost pestivirů se mohou ihned oddělit, izolovat nebo usmrtit, aby se předešlo rozšíření patogenní infekce na další zvířata.

Vynález popisuje metodu detekovatelně značených pestivirů charakterizovaných tím, že se deaktivuje RNázová aktivita obsažená v glykoproteinu E^RNS. Nepřítomnost RNázové aktivity obsažené v glykoproteinu E^RNS pestivirů podle vynálezu nyní umožňuje detekovatelné značení těchto pestivirů. Výsledné značené a neznačené pestiviry se mohou jasně odlišit přítomností nebo nepřítomností RNázové aktivity glykoproteinu E^RNS na izolaci a testování takové enzymatické aktivity. Stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti této enzymatické aktivity na získání vzorku io obsahující pestivirus nebo jeho materiál se může uskutečnit za použití standardních metod, jak se například popisuje v příkladu 2 nebo v publikaci Hulst, Μ. M., Himes, G., Newbigin, E,, Moormann, R. J. M. 1994, Giycoprotein E2 of classical swine fever virus: expressíon in insect cells and identification as a ribonucleasa. Virology 200: 558-565.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob vhodný pro odlišení zvířat infikovaných pestivirem od zvířat vakcinovaných specificky utlumeným pestívirem podle vynálezu, který obsahuje následující kroky:

(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se předpokládá pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení absence nebo přítomnosti RNázové aktivity glykoproteinu E^RNS v uvedeném vzorku, (3) korelace nepřítomnosti RNázové aktivity glykoproteinu E^RNS s vakcinovaným zvířetem a korelace přítomnosti uvedené aktivity s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete.

Vynález popisuje pestiviry, kde se deaktivovala jejich RNázová aktivita v glykoproteinu E^ deleci a/nebo mutací. Takové pestiviry je možné jednoduše detekovat na základě jejich struktury, která vzniká uvedenými delecemi a/nebo mutacemi. Sekvenční rozdíl genu E^RNS, který kóduje změněný glykoprotein E^RNS, je detekovatelný sekvenační metodou nebo PCR. Vynález popisuje preferované provedení metody vhodné pro odlišení zvířat infikovaných pestivirem od zvířat, kterým se aplikovala vakcína se specificky utlumenými pestiviry podle vynálezu. Tato metoda zahrnuje následující kroky:

(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení nukleotidové sekvence pestivirového genomu nebo proteinu v uvedeném vzorku, (3) korelace deleci a/nebo mutací nukleotidové sekvence proteinu E^RNS přítomné ve vakcíně s vakcinovaným zvířetem a korelace nepřítomnosti uvedených deleci a/nebo mutací s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete.

Strukturální změny, které jsou výsledkem změněné proteinové sekvence glykoproteinu E^RNS pestivirů podle vynálezu, se mohou detekovat specifickými monoklonálními nebo polyklonálními protilátkami, které nerozeznávají nezměněné proteiny.

Další provedení vynálezu popisuje způsob odlišení zvířat infikovaných pestiviry od zvířat 50 vakcinovaných utlumeným pestivirem podle vynálezu, který zahrnuje kroky:

(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína,

-9(2) stanovení modifikovaného glykoproteínu E^RNS utlumeného pestivirů specifickým navázáním monoklonálních nebo polyklonálních protilátek na glykoproteínu E^RN* přítomný v uvedeném vzorku, přičemž uvedené glykoproteiny se modifikovaly metodou podle vynálezu, přičemž uvedené monoklonální nebo polyklonální protilátky se nevážou na nemodifikované glyko5 proteiny E^RNS, (3) korelace specifického navázání uvedených monoklonálních nebo polyklonálních protilátek s vakcinovaným zvířetem a korelace nepřítomnosti protilátek, které se váží na pestivirovou infekci uvedeného zvířete za podmínky, že přítomnost pestivirového materiálu v uvedeném io zvířeti a/nebo v uvedeném vzorku se stanoví jiným způsobem.

Je možné detekovat změněné a strukturálně značené proteiny pomocí neschopnosti vázat specifické nebo polyklonální protilátky, které rozeznávají pouze nezměněné glykoproteiny E^RNS, přičemž přítomnost pestivirů se může stanovit jiným způsobem. V preferovaném provedení is vynálezu se popisuje metoda pro odlišení zvířat infikovaných pestiviry od zvířat vakcinovaných utlumeným pestivirem podle vynálezu, který zahrnuje kroky:

(1) získání vzorku ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení modifikovaného glykoproteínu E^RNS pestivirů specifickým navázáním monoklonálních nebo polyklonálních protilátek na glykoproteínu E^RNS přítomný v uvedeném vzorku, přičemž uvedené glykoproteiny se nemodifikovaly metodou podle vynálezu, přičemž uvedené monoklonální nebo polyklonální protilátky se nevážou na modifikované glykoproteiny E^RNS, (3) korelace specifického navázání uvedených monoklonálních nebo polyklonálních protilátek s pestivirovou infekcí uvedeného zvířete a korelace nepřítomnosti protilátek, které se váží na vakcinované zvíře za podmínky, že přítomnost pestivirového materiálu v uvedeném zvířeti a/nebo v uvedeném vzorku se stanoví jiným způsobem.

Výsledkem modifikace struktury a nepřítomnosti RNázové aktivity ve značených vírech podle vynálezu ve srovnání s odezvami vycházejícími z neznačených pestivirových infekcí budou různé imunitní odezvy u zvířat. Pestiviry podle vynálezu vyvolávají různou a zřetelnou imunitní odezvu, buněčnou stejně jako humorální, které se liší od nemodifikované stejně jako patogenní imunitní odezvy. Výsledkem aplikace glykoproteinů E^RNS podle vynálezu jsou polyklonální protilátky, které se liší svojí vazebnou specifitou, když se porovnávají s polyklonálními protilátkami vzniklými aplikací nemodifikovaných glykoproteinů. Tyto rozdíly ve vazebné specifitě poskytují značení vhodné pro rozlišení zvířat vakcinovaných pestiviry podle vynálezu od zvířat ínfikova40 ných obecnými pestiviry. Popisují se testy, které se používají pro zjištění specifických polyklonálních protilátek v testovacím séru, které se buď váží na epitop divokého typu, nebo značí deleční mutaci uvedeného epitopu za účelem diferenciace infikovaných a vakcinovaných zvířat.

V publikaci Kit, M. and S. Kit, 1991. Sensitive glykoprotein glll blocking ELISA to distrinquish between peudorabies (Aujeszky's disease)-infected and vaccinated pigs. Vetrinary Microbiology

28: 141-155 se například popisují testy použitelné v případě prasat infikovaných a vakcinovaných pseudorabies.

V preferovaném provedení vynálezu se popisuje způsob rozlišení zvířat infikovaných pestivirem od zvířat vakcinovaných utlumeným pestivirem podle vynálezu, který zahrnuje následující kroky:

1) získání vzorku polyklonálních protilátek ze zvířete, u kterého se očekává pestivirová infekce nebo kterému se aplikovala vakcína, (2) stanovení nespecifického navázání uvedených polyklonálních protilátek na nemodifikovaný glykoprotein E^RNS nebo na glykoproteiny E^RNS upravený podle vynálezu,

-10(3) korelace navázání uvedených polyklonálních protilátek na nemodifikovaný glykoprotein E^rns s pestivirovou infekcí a korelace nepřítomnosti protilátek, které se váží na uvedené polyklonální protilátky proti glykoproteinu E^RNS, který se upravil podle vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázku ě. 1 je zobrazeno prvních 495 aminokyselin exprimovaných kmenem Alfort CSFV. io Zobrazená sekvence ukazuje prvních 495 aminokyselin jak se exprimují kmenem Alfort CSFV (popisuje se v publikaci Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H. J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567). Jeden monomer glykoproteinu E^RNS uvedeného kmene odpovídá aminokyselinám 268 až 494, jak se popisuje v publikaci Rumenapf, T., Unger, G., Strauss, J. H. and Thiel, H. J. 1993. Processing of the evelope glycoproteins of pestiviruses. J. Virol. 67: 3288-3294. Podtrženy jsou zbytky 295 až

307 a338a357 reprezentující oblasti vykazující homologii s rostlinnými a fungálními RNázami (popisuje se v publikaci Schneider, R., G. Unger, R. Stark, E. Schneider-Scherzer, and H. J. Thiel. 1993. Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171).

Na obrázku č. 2 je zobrazena teplotní křivka teplot měřená v rektu zvířat po testované infekci. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 2. dne až do 18. dne po infekci. Uvádí se křivka tělesné teploty měřené v rektu v případě každého zvířete ve skupině infikované virem V(pA/CSFV) (nepřetržitá Čára) získaného z plazmidu pA/CSFV nebo virem V(pA/C-34625 d) získaným z plazmidu pA/C-346-d (tečkovaná čára).

Na obrázku č. 3 je znázorněna křivka tělesné teploty zvířat po infekci. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 1. dne až do 21. dne po infekci. Zvířata infikovaná mutantem C-346-d [V~(pA/C-346-d)] se po 69 dnech infikovala letální dávkou CSFV kmene

Eystrup. Detaily se popisují v textu. Uvádí se křivka tělesné teploty měřené v rektu v případě každého zvířete ve skupině infikované virem CSFV kmene Eystrup v koncentraci 2xlO⁵TCID₅o.

Na obrázku č. 4 je zobrazena teplotní křivka teplot měřená v rektu zvířat po testované infekci. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 0. dne až do 18. dne po infekci.

Uvádí se křivka tělesné teploty měřené v rektu v případě každého zvířete ve dvou skupinách infikovaných buď C-346-d [VpA/CSFV)] (tečkovaná čára), nebo znovu získaného viru C-346-d/RS [VpA/C-346-d)] (nepřetržitá čára).

Na obrázku č. 5 je zobrazena tělesná teplota zvířat měřená v rektu po infekci v experimentu č. 2.

Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně od 1. dne až do 10. dne po infekci virem. Zvířata infikovaná mutantem C-346-d se po 37 dnech infikovala letální dávkou CSFV kmene Eystrup (2x10⁵ TCIDso).

Na obrázku č. 6 je zobrazená tělesná teplota zvířat měřená v rektu, která se ošetřila dvojitým mutantem popsaným v příkladu 6 dále v textu. Tělesná teplota zvířat měřená v rektu se zaznamenávala denně před a po infekci virem s mutantem V(pA/C-297-L/346-L).

Na obrázku č. 7 je zobrazena diskriminace mezi C-346-d a CSFV, který nevykazuje deleci histidinového kodonu 346, pomocí RT-PCR podle příkladu 8.

a) Primer ΟΙ H-3/OI E^m3Stop umožňuje specificky amplifikovat pruh získaný z RNA obsahující deleci kodonu 346 (C-346-d), jak se popisuje detailněji v příkladu 8, Naopak RNA, která neobsahuje uvedenou deleci nereaguje s uvedeným párem primerů (C-WT, C-346-L, C-346-K).

- 11 CZ. JUlDOy HO

b) a c) Další dvě kombinace primerů (ΟΙ H+2 a ΟΙ H+3) umožní amplifikovat pruhy získané z RNA, které neobsahují deleci kodonu 346 (ΟΙ H+2 a ΟΙ H+3). Žádný pruh není možné pozorovat v případě, že se jako templát použije RNA z 346 deleěního mutantu C-346-d.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Vytvoření pestivirových mutantů, které neobsahují Rnázu io

Při tvorbě subklonů se jako počáteční materiál použily klony cDNA v plné délce pA/CSV (popisuje se v publikaci Meyers, G., Thiel, H. J. and Rumenapf, T. 1996a. Classical swine fever virus: Recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. J. Virol. 67: 7088-709526) nebo pA/BVDV (popisuje se v publikaci Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., Thiel, H. J. and Kummerer, Β. M. 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral dierrhea viruses from cDNA constructs. J. Virol., 70: 8606-8613), ze kterých je možné získat infekční cRNA transcripcí in vitro. V případě CSFV se fragment Xhol/SspI pA/CSFV klonoval do plazmidu pBluescrípt SK+, který se štěpil restrikčními enzymy Xhol a Smál. V případě BVDV se fragment XhoI/BglII z pA/BVDV klonoval do plazmidu pCITE-2C, který se štěpí! stejnými restrikčními enzymy. Z těchto konstrukcí vznikla jednořetězcová plazmidová DNA za použití Kunkelovi metody (popisuje se v publikaci Kunkel, T. A., J. D. Roberts, and R. A. Zakour. 1987. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Methods Enzymol. 154: 367-392), přičemž se používají buňky E. coli CJ 236 (BioRad) a jednořetězcové fágy VCMS (Stratagene).

Jednořetězcová DNA se přeměnila na dvouřetězcovou za použití sady „Phagemid in vitro Mutagenesis Kit“ (BioRad). Některé ze syntetických oligonukleotidů, které se používají jako primery při přípravě požadovaných pestivirových mutantů, jsou uvedeny dále v textu:

C-297-L: AGGAGCTTACTTGGG ATCTG

C-346-L: GGAACAAACTTGGATGGTGT

C-297-K: ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC

C-346-K: ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA

C-346-d: GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC

B-346-d; CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAACTGG

Pří transformaci buněk mikroorganizmu E. coli XL-1 Blue (Stratagene) se použila dvouřetězcová plazmidová DNA, Kolonie bakterií, které nesou plazmidy, se izolovaly selekcí na ampicilinu. Připravila se plazmidová DNA a dále se analyzovala sekvenováním nukleotidů za použití sekvenační sady s polymerázou T7 (Pharmacia). Plazmidy obsahující požadované mutace a nevykazující žádné další změny na druhém místě se použily při konstrukci klonů cDNA v plné délce. V případě CSFV se fragment Xhol/Ndel z mutagenizovaného plazmidu začlenil spolu s frag35 mentem Ndel/BglII odvozeného z plazmidu 578 (pCITE 2A, obsahující fragment XhoI/BglII z pA/CSFV) do plazmidu pA/CSFV štěpeného restrikčními enzymy Xhol a BglII. Za účelem získání mutantu BVDV CP7 se fragment XhoI/BglII obsahující deleci začlenil do pA/BVDV, který se štěpil restrikčními enzymy Xhol a Ncol, spolu s fragmentem BglII/NcoI izolovaným pA/BVDV/Ins- cRNA se transkribovala z konstrukce pA/BVDV/Ins- za vzniku BVDV, který není cytopatogenní a je vhodný pro transkripci do vhodných buněk (popisuje se v publikaci Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., Thiel, H. J. and Kummerer, Β. M. 1996b, Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral dierrhea viruses from cDNA constructs. J. Virol., 70: 8606-8613). Amplifíkovaly se různé délky klonů a izolovaly se jednotlivé plazmidy. Přítomnost požadovaných mutací se prokázala sekvenováním DNA. Po linearizaci DNS restrikě-12ním enzymem Srfl (klony CSFV plné délky) nebo Smal/klony BVDV plné délky) se cRNA přepsala, jak se popisuje shora v textu v publikacích publikaci Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., Thiel, H. J. and Kummerer, Β. M. 1996b. Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral dierrhea viruses from cDNA constructs. J. Virol. 70: 8606—8613, Meyers, G., Thiel,

H. J. and Rumenapf, T. 1996a. Classical swine fever virus: Recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. J. Virol. 67: 7088-709526. RNA se čistila gelovou filtrací a extrakcí směsí chloroformu a fenolu a použila se při transfekci buněk prasečích (PK15) nebo bovinních ledvin (MDBK klon B2) (konstrukce CSFV nebo BVDV). Transfekce se analyzovala imunofluorescencí se sérem specifickým pro io virus. V případě, kde se mohl získat požadovaný mutant (je pozitivní imunofluorescenčním testu), se viry amplifikovaly pasážováním ve stejné buněčné linii za použití transfekčních experimentů. Další analýza mutantů CSFV zahrnuje stanovení jednokrokových růstových křivek a charakterizaci virové RNA Northemovým blotem za použití sond cDNA, které jsou specifické pro virus, stejně jako reverzní transkripční polymerázovou řetězovou reakci (RT-PCR) a násled15 né sekvenování fragmentů PCR, aby se ověřila přítomnost požadovaných mutací ve virovém genomu. Ve všech případech se prokázala přítomnost požadovaných mutací. Všechny získané viry rostly dobře a produkovaly podobné množství RNA právě tak jako virus, který vznikl z plazmidu, jenž vykazuje sekvenci divokého typu.

Schopnost mutantů přežít se prokázala transfekci cRNA a oddělením buněk po třech dnech. Část buněk se nanesla na plotny o průměru 3,5 cm, den poté se fixovaly směsí aceton/methanol a pak se analyzovaly imunofluorescencí za použití směsi monoklonálních protilátek specifických pro BVDV (popisuje se v publikaci Weiland, E., Thiel, H. J., Hess, G., and Weíland, F., (1989). Development of monoclonal neutralizing antibodies against bovine viran diarrhea virus after pretreatment of mice with normál bovine ceils and cyclophosphamide. J. Virol. Methods 24: 237-244). Všechny buňky byly pozitivní, zatímco kontrola buněk transfekovaných neinfekční RNA nevykazuje žádný signál. Zčásti buněk transfekovaných cRNA se produkoval extrakt v jednom cyklu zmražení a tání. Čerstvé buňky se infikovaly tímto buněčným extraktem a za použití imunofluorescence specifické pro BVDV se tři dni po infekci prokázalo, že jsou BVDV pozitivní.

V tabulce Č. 1 je uvedeno shrnutí různých změn zavedených do konzervativních sekvencí E^RNS reprezentující putativní aktivní místo RNázy, které kóduje určitý virový mutant.

-13ksZ ouisoy ho

Tabulka č. 1;

název	sekvence v motivu RNázy	aktivity RNázy	schopnost mutantů
			přežit

pA/CSFV	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	+	+
C-297-L	..sllgiwpekic. ..	...RHEWNKHGWCNW..	-	+
C-346-L	..SLHGIWPEKIC...	.. .RHEWNKHGWCNW..	-	+
C-297-L/346-L .	..SLHGIWPEKIC. ..	.. .RHEWNKHGWCNW..		+
C-297-K	..SLKGIWPEKIC...	. . .RHEWNKHGWCNW. .	-	+
C-346-K	..SLHGIWPEKIC...	. ..RHEWNKKGWCNW..	-	+
C-297-d	..SLHGIWPEKIC...·	...RHEWNKHGWCNW..	-	•
C-346-d	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWNK_GWCNW..	-	+
C-296/7/8-C	..S___IWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-345/6/7-d	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWN___WCNW..	•	-
C*345/6-d	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWN__GWCNW..	-	-
O346/7-d	..SLHGIWPEKIC...	. .. RH E W N K _ _W C N W..	-	-
C-342-d	..SLHGIWPEKIC...	... R H _ W N K a G W C N W ..	-	-
C-342/6-d	..SLHGIWPEKIC...	...RH_WNK pGWCNW.,	-	-
C-301-d	..SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-295-S/G	..GLHG1WPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-
C-3Q0-W/G	..SLHGIGPEKIC...	. . . R HEWNKHGWCNW, .	-	+
C-302-E/A	..SLHGIWPAKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-305-C/G	..SLHGIWPEKIG...	...RHEWNKHGWCNW,.	-	-
C-300-W/G-302-E/A .SLHGIGPAKIC..	. ...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-340-R/G	..SLHGIWPEKIC.. .	...GHEWN KHGWC NW..	-	-
C-343-W/G	..SLHGIWPEKIC...	...RHEGNKHGWCNW..	-	-
C’345’K/A	..SLHGIWPEKIC...	...rhewnahgwcnw..	-	-
C-297-K/346-K .,	..SLKGIWPEKIC...	. ..rhewnkkgw cnw ..	-	+
C-297-K/346-L..	.SLKGIWPEKIC...	...RHEW N KKGWCNW ..	•	+
pA/BVDV	.SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	+	+
8-346-d	.SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW,.	-	+

Popis tabulky č. 1: Test aktivity RNázy se provedl v krátkodobém testu. Buňky BHK21 se infikovaly virem vakcínie vTF7-3 (popisuje se v publikaci Fuerst T. R. et al., 1986. Eukaryotic transient expression systém based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase. Proč. Nati. Acad. Sci. 83: 8122-8126) a pak se transfekovaly konstrukcí cDNA (5 pg plazmidové DNA, transfekce za použití Superfect, jak doporučuje dodavatel firma Qiagen). Po 10 hodinách inkubace při teplotě 37 °C v inkubátoru v atmosféře CO₂ se transfekované buňky analyzovaly a stanovila se aktivita RNázy, jak se popisuje dále v textu. Schopnost io buněk přežít se stanovila způsobem popsaným dále v textu.

Příklad 2: Účinek různých mutací na RNázovou aktivitu glykoproteinu E^RNS

Za účelem testování účinku různých mutací na RNázovou aktivitu glykoproteinu E^RNS se vhodné buňky infikovaly mutantními viry. V případě CSFV se provedla infekce při hodnotě multiplicity infekce (m.o.i.) 0,01. Infekce divokým virem sloužila jako pozitivní kontrola, zatímco neínfikované buňky se použily jako negativní kontrola. 48 hodin po infekci se buňky promyly dvakrát fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem a lyžovaly se v lyzačním pufru o objemu

-140,4 ml (20 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mg/ml albuminu bovinního séra, 1 % Triton XI00, 0,1 % deoxycholová kyselina, 0,1 % SDS). Lyzát se přenesl do reakční zkumavky o objemu 1,5 ml, sonifíkoval se (sonikátor Branson B12, za podmínek 120 W, 20 s ve vodní lázni). Dále se centrifugoval po dobu 5 min. při 14 000 ot./min. v Eppendorfových zkumavkách při teplotě 4°C a supematant se ultracentrifugoval ve stolní ultracentrifuze Beckmann po dobu 60 min., při teplotě 4 °C a otáčkách 45 000 ot/min za použití rotoru TLA 45. Stanovení RNázové aktivity se provedlo v objemu 200 μΙ, který obsahuje 5 nebo 50 μΐ supernatantu z druhého stupně centrifugace a 80 pg Poly/rU (Pharmacia) v pufru, který je vhodný pro RNázový test (40 mM Tris-acetát (hodnota pH je 6,5), 0,5 mM EDTA, 5 mM dithiothreitol io (DTT)). Po inkubaci reakční směsi při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny se přidalo 200 μΐ 1 M kyseliny perchloristé, 20 mM LaSO₄. Po inkubaci na ledu po dobu 15 minut se směs centrifiigovala po dobu 15 minut, při teplotě 4°C a při otáčkách 14 000 ot./min. V Eppendorfových zkumavkách. K supematantu se přidala voda v množství, které odpovídá 3 objemům a alikvot směsi se analyzoval měřením optické hustoty při vlnové délce 260 nm za použití spektro15 fotometru Ultrospec 3000 (Pharmacia), Ve všech případech mutace zavedená do genu E^ms zcela zrušily RNázovou aktivitu (uvádí se v tabulce č. 1).

V případě mutantu BVDV se RNázová aktivita testovala v materiálu získaným po transfekci RNA bez pasážování získaných virů. Buňky transfekované vhodnou RNA se 72 hodin po trans20 fekci rozdělily a nanesly se na dvě plotny. O 24 hodin později se připravil z jedné plotny buněčný extrakt a analyzovala se RNázová aktivita způsobem, který se popisuje shora v textu. Za účelem prokázat infekci se buňky z druhé plotny analyzovaly fluorescenčním testem s monoklonálními protilátkami, které jsou specifické pro BVDV (popisuje se v publikaci Weiland, E., Thiel, Η. I, Hess, G., and Weiland, F., (1989). Development of monoclonal neutralizing antibodies against bovine viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normál bovine cells and cyclophosphamide. J. Virol. Methods 24: 237-244), a zjistilo se, že jsou 100% pozitivní. Transfekce se provedla za použití RNA transkribované z pA/BVDV/Ins- a z pA/B-346-d, což je plazmid ekvivalentní k ρΑ/BVDV/Ins-, ale neobsahuje deleci kodonu ekvivalentního skodonem 346 v genomu CSFV Alfort. Netransfekované buňky MDBK sloužily jako negativní kontrola.

Tabulka č. 2A: Stanovení RNázové aktivity různých virů

	Alfort	C-WT	C-297-L	C-346-L	C-346-d	C-346- d/Rs	kontrola
OD26O	2,4	2,3	1,1	1,1	1,1	2,3	1,1

	Alfort	C-WT	C-297-L	C-346-L	C-297-K	C-346-K	C-297- t/346-L
OD26O	2,09	2,16	0,715	0,77	0,79	0,766	0,77

	C-297-K/346-L	C-297-K/346-K	C-346-d	kontrola
OD2SO	0,725	0,835	0,8	0,84

Popis tabulky č. 2A:

Buňky PK se infikovaly indikovanými viry pri hodnotě m.o.i. (multiplicita infekce) 0,01, inkubovaly se po dobu 48 hodin pri teplotě 37 °C v inkubátoru v atmosféře CO₂ a pak se lyžovaly a podrobily testu RNázové aktivity. Rozpustná RNA pocházející z inkubace s různými buněČ40 nými extrakty se kvantifikovala měřením optické hustoty při vlnové délce 260 nm. Pozorované rozdíly RNázové aktivity jsou způsobeny různým množstvím proteinu E“*® ve vzorcích, protože se po kvantifikaci E^RNS radioaktivním značením, imunologickým srážením a analýzou radioakti-15vity za použití fosforimageru získaly stejné hodnoty. Snížení koncentrace E^RNS v testu na pouze jednu desetinu obvyklého množství nezměnilo podstatně výsledné hodnoty optické hustoty, což indikuje, že vybrané podmínky testu se saturovaly vzhledem k E™.

Kmen CSFV Alfort; všechny ostatní víry se získaly z RNA transkribované in vitro plazmidu: například C-WT zpA/CSFV, C-297-L zpA/C-297-L, atd., viru C-346-d/Rs získaného z pA/C-346-d/Rs (vytvořeného zvrácením mutace v pA/C-346-d záměnou fragmentu cDNA za ekvivalentní fragment získaný z pA/CSFV). Jako kontrol se použil extrakt neinfikovaných buněk PK15.

Tabulka č. 2B

	B-WT	B-346-d	kontrola
OD260	2,5	1,1	1,1

Popis tabulky Č. 2B: Buňky NDBK se infikovaly in vitro transkribovanou RNA. 72 hodin po transfekci se rozdělily a RNázová aktivita se analyzoval o 24 hodin později. Infekce buněk se prokázala imunofluorescenění analýzou, jak se popisuje v textu.

B-WT je virus získaný z pA/BVDV/Ins-; B-346~d je virus získán z pA/B-346-d; jako kontrola slouží extrakt z neinfikovaných buněk MDBK.

Příklad 3: Patogenita CSFV po aktivaci RNázy

Za účelem testování jak poškození RNázové aktivity ovlivňuje patogenicitu pestivirů v jejich přirozeném hostiteli, se provedly experimenty na zvířatech s mutantem V(pA/C-346-d) (v tabulce se uvádí jako C-346-d). Viry získané z klonu plné délky CSFV bez mutace (V(pA/CSFV)) slouží jako pozitivní kontrola (v tabulce označeno jako C-WT). Pro každý mutant se použily tri selata (plemeno: German Landrace, hmotnost přibližně 25 kg). Použitá infekční dávka je lxl O⁵ TCID50 na jedno zvíře, přičemž dvě třetiny inokulátu se aplikovalo nasálně (jedna třetina do každé nozdry) a jedna třetina do svalu. Dvě skupiny se ustájily v oddělených izolačních jednotkách. Krev se zvířatům odebrala dvakrát před infekcí a 3,, 5., 7., 10., 12. a 14. den po infekci. Každý den se zaznamenávala tělesná teplota zvířat (uvedeno na Obrázku Č. 2). Zvířata infikována virem divokého typu vykazují typické symptomy klasické prasečí horečky, jako je teplota, ataxie, anorexie, průjem, poruchy centrálního nervového systému, hemoragie na kůži (uvádí se v tabulce

Č. 3). Virus je možné získat z krve třetí den (zvíře č. 68) a 5., 7., 10., 14., den (zvířata č. 68, 78, 121) (uvádí se v tabulce č. 3B). Zvířata se usmrtila ve fázi odumírání 14. den po infekci. V tuto dobu se detekovaly virové neutralizační protilátky. Naopak u zvířat infikovaných mutantem se neprojevily klinické příznaky (uvádí se v tabulce č. 3a). Tělesná teplota zvířat zůstala v normálu (uvádí se na obrázku č. 2) po celou dobu experimentu a zvířata stále přijímala potravu. Z krve nebylo možné izolovat virus. Zvířata však byla jasně infikována virem a virus se replikoval a u všech zvířat se vytvořily neutralizační protilátky (uvádí se v tabulce Č. 3c).

-16Tabulka č. 3a: Klinické příznaky po testované infekci

Experiment č. 1
zvife č. 1	infekce s	klinické příznaky
		teplota	průjem	poruchy CNS	anorexie	krváče ni kůře	apatie	eutanizi e	krváceni orgánů pří nekropsii
68	C-WT	+	+	+	+	+	+	+
78	C-WT	+	+	+	+	+	+	+	+
121	C-WT	+	+	+	+	’+	+	+
70	C-346-d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.
72	C-346-d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.
74	C-346~d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.

Popis tabulky č. 3a: Ve studii se použilo 6 selat (plemeno: „German land race“, tělesná hmotnost přibližně 25 kg) rozdělených do dvou skupin (každá skupina se ustájila odděleně). Tři zvířata se infikovala CSFV-WT (lxlO⁵ TCIDJ0) a 3 zvířata se infikovala C-346-d (lxIO⁵ TCID50). Zaznamenávala se tělesná teplota v rektu a klinické příznaky a vše se shrnulo, jak se uvádí v tabulce, přičemž zkratka n.a. znamená neuskutečnila se nekropsie.

io Tabulka ě. 3b: Viremie krevních buněk po testu infekce

Experiment č. 1
zvife i. 1	infekce 3	klinická příznaky
		3	5	7	l'Ó	14
68	C-WT	-1-	+	+	+	+
78	C-WT		+	+	+
121	C-WT	-	+		+
70	C-346-d	-	-		-	-
72	C-346-d	-	-	-	-	-
74	C-346-d	-	-	-	-	-

Popis tabulky č. 3b: Viremie krevních buněk se detekovala společnou kultivací krve s buňkami PK15. Po inkubaci při teplotě 37 °C po dobu 72 hodin se buňky promyly PBS, fixovaly se ledem chlazenou směsí aceton/methanol a infekce se analyzovala imunofiuorescencí s monoklonálními protilátkami, které jsou specifické pro glykoprotein E2 (mAb A18, popisuje se v publikaci Weiland, E., Stark, R., Haas, B., Rumenapf, T,, Meyers, G. and Thiel, H. J. (1990). Pestivirus glykoprotein which induces neutralízing antibodies forms part of a disulfíde-linked heterodimer. J. Virology 64,3563-3569).

-17CZ 3U1569 B6

Tabulka č. 3c: Vývoj neutralizačního titru séra specifického pro CSFV

dny po infekci	-3	0	17	25	69	76	79	87
prase č. 70			1:18	1:162	1:162	1:162	1:486	1:1458
prase č. 72			1:18	1:54	1:486 i j	1:1458	1:1458	1:4374
prase č. 74			1:6	1:54	1:162	1:162	1:486	1:1458

Popis tabulky č. 3c: Titry protilátek prasat infikovaných virovým mutantem C-346-d se stanovil v různé časové okamžiky během experimentu:

μΐ ředěného séra se smíchalo s 50 μΐ kultivačního média, které obsahuje 30 TCIDg₀ viru (CSFV Alfort/Tubingen). Po 90 minutách inkubace při teplotě 37 °C se přidalo 100 μΐ buněk (1,5x10⁴ buněk) a směs se nanesla na destičku s 96 prohlubněmi. Po 72 hodinách inkubace se buňky zafixovaly ledem chlazenou směsí acetonu/methanolu a analyzovala se infekce imunoio fluorescencí s monoklonálními protilátkami, které jsou specifické pro glykoprotein £2 (mAb

A18, popisuje se v publikaci Weiland, E., Stark, R., Haas, B., Rumenapf, T., Meyers, G. and

Thiel, H. J. (1990). Pestivirus glykoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer. J. Virology 64,3563-3569). 69 dní po infekci se zvířatům aplikovalo 2x10⁵ TCID50 CSFV kmen Eystrup. Tabulka uvádí nejvyšší ředění séra, které způsobuje celkovou neutralizaci vstupního množství viru.

Příklad 4: Vyvolání ochranné imunity infekcí viru, který nevykazuje RNázovou aktivitu.

Za účelem analyzovat, zda infekce s mutantním virem povede k ochranné imunitě, se přibližně 9 týdnů po infekci s mutantem CSFV za použití vysoce patogenního heterologního kmene CSFV (kmen Eystrup, pocházející od firmy Boehring) provedl vakcinační experiment. Při infekci se použila dávka 2x10⁵ TCID₅o viru. V předchozích několika experimentech se zjistilo, že toto množství viru je dostatečné pro vyvolání letálního onemocnění (popisuje se v publikaci Konig,

Matthias, 1994. Virus der Klassischen Schweinepest: Untersuchungen zuř Pathogenese und zuř Induktion einer protektiven Immunoantwort. Dissertation, Tirarztliche Hochschule Hannover, Germany). Zvířata, která se dříve infikovala CSFV RNázovým mutantem, nevykazují klinické příznaky onemocnění, ale zvýšil se jejich titr neutralizačních protilátek, což ukazuje na produktivní infekcí a replikaci zavedeného viru.

Příklad 5: Ověření principu utlumení

Aby se ukázalo, že pozorované utlumení mutantního viru je způsobené deleci histidinu v poloze

346 polyproteinu a nikoliv nedefinovanou druhým místem mutace, tak se znovu připravila sekvence divokého typu záměnou fragmenty Xhol/Ndel o velikosti 1,6 kb klonu pAC/C-346-d v plné délce za odpovídající fragment pA/CSFV vykazující sekvenci divokého typu. Fragment vystřižený z pAC/C-346-d se analyzoval sekvenací nukleotidů za účelem naj ít mutace. S výjimkou delece tripletového kódujícího histidin v poloze 346 polyproteinu se nezjistil žádný rozdíl s ohledem na sekvenci divokého typu. Z konstrukce cDNA s mutantem se mohl získat virus (V(pA/C-346-d/RS), kteiý rostl stejně dobře jako virus divokého typu a vykazuje stejnou RNázovou aktivitu (popisuje se v tabulce č. 2A).

-18i/UAUVZ

V druhém experimentu na zvířatech se získaný virus použil při infekci prasat. Jako kontrola se použil deleční mutant. Opět se použily dvě skupiny obsahující tři zvířata. Tyto zvířata byla mladší (plemeno: „German landrace, přibližná tělesná hmotnost 29 kg) než zvířata použitá v prvním experimentu. Při infekci se použila dávka 5x10⁴ TCID50 viru. Zvířata infikovaná mutantem nevykazují žádné klinické příznaky (uvádí se v tabulce č. 5, na obrázku č. 4). Pouze u jednoho zvířete se objevila teplota a trvale jeden den. U těchto zvířat se vyvinuly neutralizační protilátky, které chrání zvíře proti letální dávce CSFV. Další vakcinace se provedla infekcí kmenem Eystrup v dávce 2x10⁵ TCID50. Zvířata po vakcinaci nevykazují klinické příznaky a tělesná teplota vykazuje normální hodnoty (uvádí se na obrázku č. 5). Naopak u prasat infikovaných delečním mutantem a u zvířat inokulovaných získaným virem divokého typu se vyvinula fatální klasická prasečí horečka. Jedno zvíře se muselo utratit 11 dní po infekci, ostatní dvě o tři dni později. Všechna zvířata vykazují typické symptomy klasické prasečí horečky. To znamená průjem, anorexie a patologické příznaky, jako je krvácení z různých orgánů, které zahrnují ledviny.

Tabulka ě. 5a: Klinické příznaky po testované infekci

Experiment č. 2
zvíře č. 1	infekce 3	klinické příznaky
		teplota	průjem	poruchy CMS	anorexie	krváce ni kůžt	apatie	eutan&zi e	krváceni orgánů při nekropsii
43	C-346-d	+ *	—	—	-	-	-	-	n.a.
47	C-346-d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.
87	C-3íÉ-d	-	-	-	-	-	-	-	n.a.
27	C-346- d/RS	+	+	+	+	+	+	+	+
28	C-346- d/RS	+	+	+		+	+	+	+
30	C-346- d/RS	+		+			+	+	+
		* teplota pouze jeden den

Tabulka ě. 5a: Ve studii se použilo 6 selat (plemeno: „German land race“, tělesná hmotnost přibližně 20 kg) rozdělených do dvou skupin (každá skupina se ustájila odděleně). Tri zvířata se infikovala C-346-d (5x10⁴ TCIDjq) a 3 zvířata se infikovala C-346-d/RS (5x10⁴ TCIDjo). C-346-d/RS se získal z mutantu C-346-d znovu získáním sekvence divokého typu genu E^RNS. Zaznamenávala se tělesná teplota měřená v rektu a klinické příznaky a vše se shrnulo, jak se uvádí v tabulce, přičemž zkratka n.a. znamená neuskutečnila se nekropsie.

Tabulka č. 5b: Diagnostický RNázový test za použití virů získaných z infikovaných zvířat během viremie

	Alfort	zvíře f. 3 C-297-K	zvíře č. 5 0-297-K	zvíře č. 27 C-346-L	zvíře č. 26 C-346-d/RS	zvíře č. 30 C-346-d/RS	kontrola
OD26O	1/84	0,60	0/56	1/84	1,93	1/94	0,49

-19Virus se získal z krve zvířat 27, 28 a 30 (jak se popisuje v příkladu 5) a 7. den po infekci se pomnožil v buněčné kultuře, titroval se a testovala se RNázová aktivita, jak se popisuje shora v textu. Neinfikované buňky PK15 a buňky (slouží jako kontrola) infikované CSFV divokého typu (Alford) slouží jako kontroly. Zvířata 3 a 5 se infikovaly mutantem C-297-K, zatímco zvířata 27,28 a 30 se infikovala mutantem C-346-d/RS, jak se uvádí v tabulce.

Příklad 6: Účinky dvojité mutace v glykoproteinu E^RNS io Za účelem testování účinků dvojité mutace v glykoproteinu E^RNS na schopnost viru se replikovat v jeho přirozeném hostiteli a na jeho patogenitu se provedl experiment na zvířeti s mutantem V(pA/C-297-L/346-L). Virus získaný z klonu CSFV plné délky, který neobsahuje mutaci (V(pA/CSFV) sloužil jako pozitivní kontrola. Pro každý mutant se použila tri selata (plemeno: German Landrace, hmotnost přibližně 25 kg). Použitá infekční dávka je IxlO⁵ TCID₅₀ najedno zvíře, přičemž dvě třetiny inokulátu se aplikovalo nasálně (jedna třetina do každé nozdry) a jedna třetina do svalu. Krev se zvířatům odebrala dvakrát před infekcí (den 0) a 5., 8., 12. a 20. den po infekci. Každý den se zaznamenávala tělesná teplota zvířat (uvedeno na obrázku č. 6). Zvířata infikována dvojitým mutantem nevykazují typické symptomy a nikdy nepřestaly přijímat potravu. Zvířata neměla teplotu po dobu celého experimentu (zvířata 45/2 a 45/3) s výjimkou zvířete 45/1, které mělo 8. den teplotu pravděpodobně způsobenou bakteriální infekcí poranění pravé zadní nohy. Po léčbě uvedeného zvířete antibiotiky se 10. den hodnota tělesné teploty vrátila na normální hodnotu (obrázek č. 6). Z krve všech zvířat se virus izoloval 5. den, zatímco později nebylo možné viremii detekovat (uvádí se v tabulce ě. 6a). U všech zvířat se vytvořily neutralizační protilátky (uvádí se v tabulce č. 6b). V případě zvířete 45/1 se stanovil přibližně

4,5 měsíce po infekci opět neutralizační titr a zjistilo se, že jeho hodnota je 1:4374. Infekce s dvojitým mutantem přešla v dlouhotrvající imunologickou paměť.

Tabulka č. 6a: Test viremie

dny po infekci	5	8	12
prase 45/1	+	-	-
prase 45/2	+	-	-
prase 45/3	+		—

Tabulka č. 6b: Neutralizační titry

zvíře	den 0	20. den po infekci
45/1	-	1:128
45/2	-	1:256
45/3	-	1:256

Příklad 7: Princip imunogenicity a utlumení viru BVDV „B-346-d“

Tento experiment se navrhl za účelem zjistit princip utlumení stejně jako imunogenicity viru BVDV „B-346—d“ získaného zpA/B-346-d porovnáním s virem „B-WT“, který se získal z pA/BVDV/Ins- Virus „B-346-d“ nese samozřejmě mutaci v původním BVDV v poloze 349,

-20ale nazval se „B-346“, aby indikoval polohu relativní k poloze 346 CSFV Alfort zobrazené na obrázku č. 1.

Vybraly se tri skupiny zvířat, které mají séra BVDV negativní a jsou 3 až 6 měsíců stará. Každá skupina 1 a 2 obsahovala 5 zvířat, zatímco skupina 3 obsahovala 3 zvířata. Zvířata ve skupině 1 a 2 se infikovala aplikací 2x10⁵ TCIDjo mutantu B-346-d (skupina 1) nebo B-WT (skupina 2) v objemu 5 ml. Zvířata se infikovala do svalu (gluteální sval), intranasálně a podkožně (v oblastí lopatky). V období 14 dní po infekci se u obou skupin zvířat monitorovala virémie pomocí parametrů, jako je virémie krevních buněk a výskyt viru v nosních stěrech. Navíc se sledovaly io klinické parametry jako je tělesná teplota měřená v rektu, počet bílých krvinek a obecné zdravotní parametry.

Za účelem zkoumání ochranné imunity proti infekci antigenně heterologním a virulentním izolátem BVDV (č. 13) se 77. den po infekci opakovala vakcinace zvířat v první skupině mutantem

B-346-d. Zvířata skupiny 3 sloužila jako pozitivní kontrola a infikovala se způsobem popsaným v případě zvířat skupiny 1 s virulentním izolátem BVDV. Virus BVDV (č. 13) patří k odlišné antigenní skupině (typ II), zatímco virus B-346-d spadá na základě klasifikace popsané v publikaci Pellerin, C., et al., Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains associated with severe outbreaks and high mortalities, Virology 203, 1994:260-268, do antigenní skupiny I. Zvířata ve skupině 1 a 3 se infikovala dávkou 2x10⁶ TCID₅o izolátů BVDV (č. 13) v objemu 5 ml. Zvířata se infikovala do svalu (gluteální sval), intranasálně a podkožně (v oblasti lopatky). V období 14 dní po infekci se u obou skupin zvířat pozorovala virémie a zaznamenávala se pomocí parametrů, jako je virémie krevních buněk a výskyt viru v nosních stěrech. Navíc se sledovaly klinické parametry jako je tělesná teplota měřená v rektu, počet bílých krvinek a obecné zdravotní parametry.

Po infekci mutantem „B-346-d“ zvířata nevykazují typické klinické příznaky infekce virem BVDV, jako je zvýšená tělesná teplota měřená v rektu (tabulka č. 7a) nebo jiné respirační klinické symptomy (nejsou uvedeny).

Redukovaná virémie krevních buněk (tabulka č. 7b) a přítomnost viru v nosním výtěru (tabulka č. 7c) neindikuje jasně utlumení B-346-d ve srovnání s B-WT.

Virulentní izolát BVDV č. 13 vyvolává u zvířat skupiny 3 silnou virémii s typickými příznaky infekce BVDV, jako je zvýšená tělesná teplota měřená v rektu po dobu několika dní (uvádí se v tabulce č. 7c), silnou leukopenii (uvádí se v tabulce č. 7e), rozsáhlou virémii krevních buněk (uvádí se v tabulce č. 7e), rozsáhlou virémii krevních buněk (uvádí se v tabulce č. 7f) a zastoupení víru ve stěru nasální tekutiny (uvádí se v tabulce č. 7g). Naopak zvířata skupiny 1, která se vakcinovala infekcí s B-346-d, nevykazují po infekci virulentním izolátem BVDV č. 13, skoro žádné klinické příznaky, které jsou typické pro infekci BVDV. Po infekci nedošlo k podstatnému zvýšení tělesné teploty měřené v rektu (uvádí se v tabulce č. 7d). Pozorovaná leukopenie byla zanedbatelná vzhledem k síle a délce trvání (uvádí se v tabulce č. 7e). Z krve se neízoloval žádný virus BVDV (uvádí se v tabulce č. 7f) a pouze u jednoho zvířete bylo možné detekovat virus v nosním stěru (uvádí se v tabulce č. 7g).

Proto infekce mutantem B-346-d vyvolává silnou imunitu, které jasně redukuje klinické příznaky, zastoupení viru a virémii krevních buněk po opakované infekci heterologním izolátem BVDV.

-21VZj JUlďD? DO

Tabulka č. 7a: Průměrná tělesná teplota měřená v rektu ve skupině 1 (B-346-d) a 2 (B-WT)

den stud i.e	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
skup lna 1	38,9	39,1	39,0	38,7	38,8	38,7	38,7	38,5	38,7	38,5 4	38,5	38,5	38,4	38,9	38,7
skup lna 2	38,8	39,0	38,9	38,6	38,6	38,7	38,6	38,4	39,1	38,4	38,7	38,6	38,7	38,6	38,6

Zvířata ze skupiny 1 se infikovala v den 0 6x10⁶ TCID50 B-346-d, zatímco zvířata ze skupiny 2 se infikovala 6xl0⁶ TCID50 B-WT.

Tabulka ě. 7b: Virémie krevních buněk u zvířat skupiny 1 a 2

skupina	zvíře	násilni stéry první den	násilni stery poslední den	trváni přítomnosti viru v nasilnich □térech (dny}	prúroérné trváni skupiny (dfty)
1	1	6	6	1	1,4
2	4	6	2
3	5	5	1
4	-	-	0
5	6	9	3
2	6	4	8	5	4,4
7	4	7	4
8	4	7	4
9	4	7	4
10	4	8	5

Krev zředěná EDTA se denně testovala až do desátého dne po infekci mutanty B-346-d ío a B-WT. Do každé ze třech kultur buněk telecích varlat v kultivačním médiu, které obsahuje heparin (jako prevenci srážení v koncentraci 1 jednotka/ml), se přidalo 0,2 ml krve. Po celonoční inkubaci se směs inokuía a kultivačního média nahradila čerstvým kultivačním médiem, které neobsahuje heparin. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se buňky infikované BVDV detekovaly fluorescencí s polyklonálním sérem specifickým pro BVDV. Negativní kultury se mrazily a následně rozmrazily. Aby se potvrdila nepřítomnost BVDV se 0,2 ml uvedené rozmražené kultury prošlo druhou pasáží na buňkách Cte.

-22Tabulka č. 7c: Virus zastoupený v nosní tekutině

skupina	sviře	násilni štíry první den	naeálni štíry poslední den	trváni přítomnosti viru v v exudátu	průmlrný počet dni, kdy se virus detekoval ve skupin!
1	1	4	8	4	2,6
2	6	6	1
3	4	4	1
4	5	7	3
5	3	6	4
2	6	6	8j	3	3,6
7	5	7	3
8	5	8	<
9	5	6	2
10	3	9	6

Nosní exudát se centrifugoval (lOOOg) za účelem odstranit velký debris a kontaminanty. Odstranil se supematant a 0,2 ml se naneslo do každé ze tří buněčných kultur. Po celonoční inku5 bací se směs inokula a kultivačního média nahradila 2 ml čerstvého kultivačního média. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se detekovaly buňky infikované BVDV v imunofluorescenčním testu za použití polyklonálního séra, které je specifické pro BVDV.

io Tabulka č. 7d: Průměrná tělesná teplota měřená v rektu ve skupině 1 a 3

den stu- die	-1	-2	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	12	14
sku- pina 1	38,4	38,6	38,5	38,5	38,6	38,4	38,4	38,4	38,3	38,4	38,4	38,4	38,4	38,4	33,5
sku- pina 3	38, 8	39,1	3B, 8	39,1	39,4	39,7	40,2	40,2	40,4	41,3	40,2	40,1	40,2	40,8	40,4

Tělesná teplota měřená v rektu se zaznamenávala až 16 dní po infekci, Zvířata ze skupiny 1 a 3 se infikovala 6x10⁶ TCID₅₀ virulentního izolátů BVDV #13.

Tabulka č: 7e: Průměrný počet bílých krvinek

der. stu- die	-1	-2	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	12	14
sku- pina 1	11,9	11,9	11.3	10,8	9,2	8,2	'8,9	9,9	11,2	11,6	11,6	10,6	ΙΟ,Τ	10,8	9,4
sku- pina 3	11,7	15,0	13,8	11,1	7,7	9,8	7,4	6,3	8,7	6,7	7,0	8,1	6,2	6,4	6,2

-23CL· juisov bó

Vzorky krvinek v EDTA se odebíraly denně ode dne -2 do 14. dne po infekci z každého zvířete v obou skupinách. Počet bílých krvinek ve vzorcích krve v EDTA se stanovil za použití přístroje Sysmex Mikro-Cell Counter F800.

Tabulka č. 7f: BVDV izolovaný ze vzorku krve

skupina	zvíře	virus detekovaný v krvi první den	virus detekovaný v krvi poslední den	doba trváni přítomnosti viru v krvi ídny)	průměrná doba trváni (dny)
1	1	-	-	0	0
2	-	-	0
3	-	-	0
4	-	-	0
5	-	-	%
3	11	3	10	8	9,7
12	12	14	12
13	3	9	9

Krev ředěná EDTA se denně testovala až do desátého dne po infekci. Do každé ze třech kultur buněk telecích varlat v kultivačním médiu, které obsahuje heparin (jako prevenci srážení v koncentraci 1 jednotka/ml), se přidalo 0,2 ml krve. Po eelonoční inkubaci se směs inokula a kultivačního média nahradila čerstvým kultivačním médiem, které neobsahuje heparin. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se buňky infikované BVDV detekovaly fluorescencí s polyklonálním sérem specifickým pro BVDV. Negativní kultury se mrazily a následné rozmrazily. Aby se potvrdila nepřítomnost BVDV, 0,2 ml uvedené rozmražené kultury prošlo druhou pasáží na is buňkách Cte.

Tabulka č. 7g: Virus zastoupený v nosní tekutině

skupina	zvíře	nasální štíry první den	nasální štíry poslední den	trváni přítomnosti viru v v nosní tekutině ídny)	průměrná doba trváni (dny ve skupině)
1	1	3	4	2	0,8
2	-	-	0
3	-	-	0
4	-	-	0
5	4	5	2
3	11	3	14	12	10
12	3	14	12
13	3	8	6

Nosní exudát se centrifugoval (1000 g) za účelem odstranit velký debrís a kontaminanty. Odstranil se supematant a 0,2 ml se naneslo do každé ze tří buněčných kultur. Po eelonoční inkubaci se směs inokula a kultivačního média nahradila 2 ml Čerstvého kultivačního média. Po inkubaci po dobu 4 až 6 dní se detekovaly buňky infikované BVDV v imunofluorescenčním testu za použití polyklonálního séra, které je specifické pro BVDV.

-24Příklad 8: Diskriminace mezi C-346-d a CSFV, který nevykazuje delecí histidínového kodonu 346 pomocí RT-PCR

Sekvence RNA kódující konzervativní motiv RNázy v CSFV glykoproteinu je silně konzervativní. Mezi všemi známými sekvencemi CSVF se nezjistily v oblasti odpovídající zbytkům 1387 až 1416 publikované sekvence CSFV kmene Alfort (Meyers, G., Rumenapf, T. and Thiel, H. J. 1989. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171: 555-567) žádné změny nukleotidů. Oligonukleotidové primery získané to z této konzervativní oblasti genomu se mohou použít v testu RT-PCR za účelem detekce všech izolátú CSFV (uvádí se na obrázku ě. 7). Následkem toho je možné nepřítomnost tripletu kódujícího histidin 346 (nukleotidy 1399-1401) detekovat RT-PCR s vhodně navrženým primerem. Syntetizovaly se různé oligonukleotidy, které pokrývají konzervativní oblast, které buď obsahovaly, nebo neobsahovaly histidinový kodon. Tyto oligonukleotidy sloužily jako primery proti směru exprese genu při reakcích RT-PCR spolu s oligonukleotidem E^RNS-Stop, který sloužil jako primer po směru exprese genu. RNA čištěná z tkáňové kultury buněk se infikovala mutanty C-346-d, C-WT, C-346-L nebo C-346-K se použila jako templát. Reverzní transkripce 2 pg teplem denaturované RNA (2 min při teplotě 92 °C, 5 minut na ledu v 11,5 μΐ vody v přítomnosti 30 pMol reverzního primem) se provedla po přidání 8 μΐ směsi RT (125 mM Tris/HCl pH 8,3,

182,5 mM Kel, 7,5 mM MgCl2, 25 mM dithiotreitol, 1,25 mM každého dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 15 U RNAguard (Pharmacia, Freiburg, Germany) a 50 U Superscript (Life Technologies/BLR, Eggenstein, Germany) po dobu 45 minut při teplotě 37 °C. Po ukončení reverzní transkripce se zkumavky umístily na led a přidalo se 30 μΐ směsi pro PCR (8,3 mM Tris/HCl, pH 8,3, 33,3 mM Kel, 2,2 mM MgCl_z, 0,42 mM každého dATP, dTTP, dCTP, dGTP,

0,17% Triton XI00, 0,03% albuminu bovinního séra, 5U polymerázy Taq (Appligene,

Heidelberg, Germany) a 16,7 % DMSO). V případě, že se použil primer ΟΙ H+3, reakční směs pro amplifikaci neobsahovala DMSO. Amplifikace se provedla v 36 cyklech (30 vteřin při teplotě 94 °C, 30 vteřin při teplotě 57 ^eC, 45 vteřin při teplotě 74 °C. 1 μΐ amplifikační reakce se nanesl na 1% agarózový gel a amplifikovaný produkt se oddělil na elektroforéze a obarvil se ethídium30 bromidem. Jak se uvádí na obrázku č. 7, pár primerů ΟΙ H-3/OI E^msStop umožňuje specificky amplifikovat pruh získaný z RNA obsahující delecí kodonu 346, zatímco další dva primery umožňují získat produkty obsahující kodon 346. Když se jako templát použila RNA delecí uvedeného kodonu, pak se na elektroforéze nepozoroval žádný pruh.

Primery vhodné pro RT-PCR:

primery proti směru exprese genu:

ΟΪ H-3: TGGAACAAAGGATGGTGT

ΟΙ H+2: TGGAACAAACATGGATGG Ol H+3: GAATGGAACAAACATGGA primery po směru exprese genu:

Ol E^msStop: GGAATTCTGAGGCATAGGCACCAAACCAGG

-25Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: I:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

io (ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = BVDV Erns delece v poloze 346/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

Met 1

Glu

Leu

Ile

Thr 5

Asn

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Tyr

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Ala

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Gin

Ala

Gly

Asn 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Glu 35

Arg

Gly

Val

Ile

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Lys 50

Arg

Gly

Glu

Arg

Glu 55

Val

Pro

Thr

Asn

Leu 60

Ala

Ser

Leu

Pro

Lys 65

Arg

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

Ser

Lys 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Leu

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Leu

Phe

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Lys

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Glu

Glu

Ala

Ser 110

Met

Cys

Glu

Thr

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Ser

Arg

Leu

Tyr

His 13 0

Ile

Tyr

Val

Cys

Ile 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Ile 140

Val

Lys

Ser

Ala

Thr 145

Lys

Asp

Arg

Gin

Lys 150

Val

Leu

Lys

Trp

Val 155

His

Asn

Lys

Leu

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Ser

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Thr

Lys

Asp

Glu

Gly 175

Val

val

Arg

Lys

Lys 180

Gin

Gin

Lys

Pro

Asp 185

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly Arg 190

Met

Lys

Tle

Thr 195

Pro

Lys

Glu

Ser

Glu 200

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr 205

Lys

Pro

Pro

-26Asp Ala Thr Ile Val Val Asp Gly val Lys Tyr Gin Val Lys Lys Lys

210 215 220

Gly

Lys

Val

Lys

Ser

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

225

230

235

240

Asn

Lys

Pro

Gin

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

245

250

255

Trp

Ala

Ile

Ile

Ala

Leu

Val

Phe

Phe

Gin

Val

Thr

Met

Gly

Glu

Asn

260

265

270

Ile

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu

Gin

Asp

Asn

Gly

Thr

Glu

Gly

Ile

Gin

Arg

275

280

285

Ala

Met

Phe

Gin

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His Gly

Ile

Trp

Pro

290

295

300

Glu

Lys

Ile

Cys

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

305

310

315

320

Leu

Lys

Ala

Ile

His

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Lys

Thr

Asn

Tyr

325

330

335

Thr

Cys

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn

340

345

350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Glu

Pro

Trp

Ile

Leu

Leu

Met

Asn

Lys

Thr

Gin

Ala

355

360

365

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly

Gin

Pro

Leu

Arg

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

370

375

380

Tyr

Asp

Arg

Asp

Ser

Asp

Leu

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asp

Ser

385

390

395

400

Pro

Thr

Pro

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

405

410

415

Gly

Ile

Leu

Val

Gin

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Glu

Ile

Ala

val

Ser

Asp

420

425

430

Val

Leu

Phe

Lys

Glu

His

Asp

Cys

Thr

Ser

Val

Ile

Gin

Asp

Thr

Ala

435

440

445

His

Tyr

Leu

val

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Ser

Leu

Glu

Ser

Ala

Arg

Gin

450

455

460

Gly

Thr

Ala

Lys

Leu

Thr

Thr

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Gly

Ile

Leu

465

470

475

480

Gly

Lys

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

485

490

-27LZ. JUlDOy BO (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

ío /poznámka - BVDV Erns mutant 295 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15 10 15

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp SO

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg ISO

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp Asp Gly 170

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210 215 220

Lys 225

Cly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 27o

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Cly

Val

Asn

Arg

Gly 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cya 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

pro

Trp

ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 43S

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

ser

Trp 470

Leu

Gly Arg

Gin

Leu 47S

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495

-29(2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 492 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

ío /poznámka = CSFV Ems mutant delece 296-7-8/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys
1	5	10	15
Pro Val Gly	Val Glu 20	Glu Pro Val Tyr Asp Thr 25	Ala Gly Arg Pro Leu 30
Phe Gly Asn 35	Pro ser	Glu Val His Pro Gin Ser 40	Thr Leu Lys Leu Pro 45
His Asp Arg 50	Gly Arg	Gly Asp Ile Arg Thr Thr 55	Leu Arg Asp Leu Pro 60
Arg Lys Gly 65	Asp Cys	Arg Ser Gly Asn His Leu 70 75	Gly Pro Val Ser Gly 80
Tle Tyr Ile	Lys Pro 85	Gly Pro Val Tyr Tyr Gin 90	Asp Tyr Thr Gly Pro 95
Val Tyr His	Arg Ala 100	Pro Leu Glu Phe Phe Asp 105	Glu Ala Gin Phe Cys 110
Glu Val Thr 115	Lys Arg	Ile Gly Arg Val Thr Gly 120	Ser Asp Gly Lys Leu 125
Tyr His Ile 130	Tyr Val	Cys Val Asp Gly Cys Ile 135	Leu Leu Lys Leu Ala 140
Lys Arg Gly	Thr Pro	Arg Thr Leu Lys Trp Ile	Arg Asn Phe Thr Asn

145 150 155 160

Cys

Pro

Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala ser Gly Ser

16 S

170

175

Lys

Asp

Lys

Lys

Pro

ABp

Arg

Met

Asn

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys

Ile

Ala

180

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Val

GlU

Gly

val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

Lys

Gly Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

22S

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys

Lys

Gly

290

295

300

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

ile

Arg

Gly

305

310

315

320

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Clu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

Arg

Leu

Gin

325

330

33S

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp

340

345

350

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly

355

360

365

Pro

Pro

Asp

LyS

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

Thr

370

375

380

Asp

Val

Asn

Val

val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

Leu

Thr

385

390

395

400

Gly Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

Ile

Glu

405

410

415

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

val

Ser

Val

Glu

Asp

ile

Leu

Tyr

Gly

Asp

420

425

430

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

ASp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu

Asp

435

440

445

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg

val

450

455

460

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

Leu

Glu

46S

470

475

480

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490

-31 CZ 301569 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Ems mutant delece v poloze 297/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 35

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 13 0

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

bys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Glu 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His Asn ‘ 235

Lys .

Asn

Lys

Pro 240

pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu :

Leu .

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 230

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys

290

295

300

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile

305

310

315

320

Arg Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

Arg

325

330

335

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

340

345

350

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leil

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

355

360

365

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys Arg

Tyr

Asp

Lys

370

375

380

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

385

390

395

400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

405

410

415

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

420

425

430

Gly Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

435

440

445

Leu

ASp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

450

455

460

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

465

470

475

480

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490

-33(2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Ems mutant delece v poloze 297 K/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

Met 1

Glu Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu Lys 45

Leu

pro

His

Asp Arg 50

Gly

Arg

Gly Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr Ile

Lys

Pro 95

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr Thr Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 14 5

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

LyS

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro Glu

Ser

Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Lys

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

θίγ

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495

-35LÁ JU1OO7 DO (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Ems mutant 297 L/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

HiS 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu Lys 45

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro Val

Ser

Gly 80

ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr Thr

Gly 95

Pro

val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp Gly 125

Lys

Leu

Tyr

His 13 0

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Asp

Gly

Ala Ser

Gly

Ser

165 170 175

Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala

180

185

190

Pro

Arg

Glu

His

GlU

Lys

Asp Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro

Asp Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Lys Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly Lys

Val

210

215

220

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

HÍS

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Ly3

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Leu

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

HÍS

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg Tyr

Asp

370

375

3 80

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

bys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495

-37(2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

i o /poznámka = CSFV Ems mutant delece v poloze 301 / (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

Met 1	Glu	Leu	Asn	His Phe Glu Leu 5	Leu	Tyr 10	Lys	Thr	Ser Lys	Gin 15	Lys
Pro	Val	Gly	Val 20	Glu Glu Pro Val	Tyr 25	Asp	Thr	Ala	Gly Arg 30	Pro	Leu
Phe	Gly	Asn 35	Pro	Ser Glu Val His 40	Pro	Gin	Ser	Thr	Leu Lys 45	Leu	Pro
His	Asp 50	Arg	Gly	Arg Gly Asp Ile 55	Arg	Thr	Thr	Leu 60	Arg Asp	Leu	Pro
Arg 65	Lys	Gly	Asp	Cys Arg Ser Gly 70	Asn	His	Leu 75	Gly	Pro Val	Ser	Gly 80
Tle	Tyr	Ile	Lys	Pro Gly Pro Val 85	Tyr	Tyr 90	Gin	Asp	Tyr Thr	Gly 95	Pro
Val	Tyr	His	Arg 100	Ala Pro Leu Glu	Phe 105	Phe	Asp	Glu	Ala Gin 110	Phe	Cys
Glu	Val	Thr 115	Lys	Arg Ile Gly Arg 120	Val	Thr	Gly	Ser	Asp Gly 125	Lys	Leu
Tyr	His 130	Ile	Tyr	Val Cys Val Asp 135	Gly	Cys	Ile	Leu 140	Leu Lys	Leu	Ala
Lys 145	Arg	Gly	Thr	Pro Arg Thr Leu 150	Lys	Trp	Ile 155	Arg	Asn Phe	Thr	Asn 160
Cys	Pro	Leu	Trp	Val Thr Ser Cys 165	Ser	Asp 170	Asp Gly	Ala Ser	Gly 175	Ser
bys	Asp	Lys	Lys 180	Pro Asp Arg Met	Asn 185	Lys	Gly	Lys	Leu Lys 190	Ile	Ala
Pro	Arg	Glu 195	His	Glu Lys Asp Ser 200	Lys	Thr	Lys	Pro	Pro Asp 205	Ala	Thr
Ile	Val 210	Val	Glu	Gly Val Lys Tyr 215	Gin	Ile	Lys	Lys 220	Lys Gly	Lys	Val

Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro
225	230	235	240
Pro Glu Ser Arg	Lys Lys Leu Glu Lys 245	Ala Leu 250	Leu Ala Trp Ala Val 255
Ile Thr Ile Leu 250	Leu Tyr Gin Pro Val 265	Ala Ala	Glu Asn Ile Thr Gin 270
Trp Asn Leu Ser 275	Asp Asn Gly Thr Asn 280	Gly Ile	Gin Arg Ala Met Tyr 285
Leu Arg Gly Val 290	Asn Arg Ser Leu His 295	Gly Ile	Trp Glu Lys Ile Cys 300
Lys Gly Val Pro 305	Thr His Leu Ala Thr 310	Asp Thr 315	Glu Leu Lys Glu Ile 320
Arg Gly Met Met	Asp Ala Ser Glu Arg 325	Thr Asn 330	Tyr Thr Cys Cys Arg 335
Leu Gin Arg His 340	Glu Trp Asn Lys His 345	Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn 350
Ile Asp Pro Trp 355	Ile Gin Leu Met Asn 360	Arg Thr	Gin Thr Asn Leu Thr 365
Glu Gly Pro Pro 370	Asp Lys Glu Cys Ala 375	Val Thr	Cys Arg Tyr Asp Lys 380
Asn Thr Asp Val 385	Asn Val val Thr Gin 390	Ala Arg 395	Asn Arg Pro Thr Thr 400
Leu Thr Gly Cys	Lys Lys Gly Lys Asn 405	Phe Ser 410	Phe Ala Gly Thr Val 415
Ile Glu Gly Pro 420	Cys Asn Phe Asn Val 425	Ser Val	Glu Asp Ile Leu Tyr 430
Gly Asp His Glu 435	Cys Gly Ser Leu Leu 440	Gin Asp	Thr Ala Leu Tyr Leu 445
Leu Asp Gly Met 450	Thr Asn Thr Ile Glu 455	Asn Ala	Arg Gin Gly Ala Ala 460
Arg Val Thr Ser 465 Leu Glu Arg Arg	Trp Leu Gly Arg Gin 470 Ser Lys Thr Trp Phe	Leu Ser 475 Gly Ala	Thr Ala Gly Lys Lys 480 Tyr Ala Leu

485 490 cz juioov oo (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

ío /poznámka = CSFV Ems mutant 302 A/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu Lys 45

Leu

pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 7S

Gly

Pro Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro

Gly

Pro

val

Tyr

Tyr

Gin

Asp

Tyr Thr

Gly

Pro

90 95

Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 100 105 110

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp Gly 125

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 14 0

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 16S

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys	Ile	Ala
	180	185	190
Pro Arg Glu	His Glu Lys Asp	Ser Lys	Thr Lys Pro Pro Asp	Ala	Thr
195		200	205
Ile Val Val	Glu Gly Val Lys	Tyr Gin	Ile Lys Lys Lys Gly	Lys	Val
210	215		220
Lys Gly Lys	Asn Thr Gin Asp	Gly Leu	Tyr His Asn Lys Asn	Lys	Pro
225	230		235		240
Pro Glu Ser	Arg Lys Lys Leu	Glu Lys	Ala Leu Leu Ala Trp	Ala	Val
	245		250	255
Ile Thr Ile	Leu Leu Tyr Gin	Pro Val	Ala Ala Glu Asn Ile	Thr	Gin
	260	265	270
Trp Asn Leu	Ser Asp Asn Gly	Thr Asn	Gly Ile Gin Arg Ala	Met	Tyr
275		280	285
Leu Arg Gly	Val Asn Arg Ser	Leu His	Gly Ile Trp Pro Ala	Lys	Ile
290	295		300
Cys Lys Gly	Val Pro Thr His	Leu Ala	Thr Asp Thr Glu Leu	Lys	Glu
305	310		315		320
Ile Arg Gly	Met Met Asp Ala	Ser Glu	Arg Thr Asn Tyr Thr	Cys	Cys
	325		330	335
Arg Leu Gin	Arg His Glu Trp	Asn Lys	His Gly Trp cys Asn	Trp	Tyr
	340	345	350
Asn Ile Asp	Pro Trp Ile Gin	Leu Met	Asn Arg Thr Gin Thr	Asn	Leu
355		360	365
Thr Glu Gly	Pro Pro Asp Lys	Glu Cys	Ala Val Thr Cys Arg	Tyr	Asp
370	375		380
Lys Asn Thr	Asp Val Asn Val	val Thr	Gin Ala Arg Asn Arg	Pro	Thr
38S	390		395		400
Thr Leu Thr	Gly Cys Lys Lys	Gly Lys	Asn Phe Ser Phe Ala	Gly	Thr
	405		410	415
Val Ile Glu	Gly Pro Cys Asn	Phe Asn	Val Ser Val Glu Asp	Ile	Leu
	420	425	430
Tyr Gly Asp	His Glu Cys Gly	Ser Leu	Leu Gin Asp Thr Ala	Leu	Tyr
435		440	445
Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn	Thr Ile	Glu Asn Ala Arg Gin	Gly	Ala
450	455		460
Ala Arg val	Thr Ser Trp Leu	Gly Arg	Gin Leu Ser Thr Ala	Gly Lys
465	470		475		480
Lys Leu Glu	Arg Arg Ser Lys	Thr Trp	Phe Gly Ala Tyr Ala	Leu

485 490 495

-41LZ ου 1309 BO (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 495 aminokyselin s (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Ems mutant 305 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin	LyS
1	5	10	15
Pro Val	Gly Val Glu Glu Pro	Val Tyr Asp	Thr Ala Gly Arg Pro	Leu
	20	25	30
Phe Gly	Asn Pro Ser Glu Val	His Pro Gin	ser Thr Leu Lys Leu	Pro
	35	40	45
His Asp	Arg Gly Arg Gly Asp	ile Arg Thr	Thr Leu Arg Asp Leu	Pro
50	55		60
Arg Lys	Gly Asp Cys Arg Ser	Gly Asn His	Leu Gly Pro Val Ser	Gly
65	70		75	80
Ile Tyr	Ile Lys Pro Gly Pro	Val Tyr Tyr	Gin Asp Tyr Thr Gly	Pro
	85	90	95
Val Tyr	His Arg Ala Pro Leu	Glu Phe Phe	Asp Glu Ala Gin Phe	Cys
	100	105	110
Glu Val	Thr Lys Arg Ile Gly	Arg Val Thr	Gly Ser Asp Gly Lys	Leu
	115	120	125
Tyr His	Ile Tyr Val Cys Val	Asp Gly Cys	Ile Leu Leu Lys Leu	Ala
130	135		140
Lys Arg	Gly Thr Pro Arg Thr	Leu Lys Trp	ile Arg Asn Phe Thr	Asn
145	150		155	160
Cys Pro	Leu Trp Val Thr Ser	Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly	Ser
	165	170	175
Lys Asp	Lys Lys Pro Asp Arg	Met Asn Lys	Gly Lys Leu Lys Ile	Ala
	180	185	190
Pro Arg	Glu His Glu Lys Asp	Ser Lys Thr	Lys Pro Pro Asp Ala	Thr
	195	200	205
Ile Val	Val Glu Gly val Lys	Tyr Gin Ile	Lys Lys Lys Gly Lys	Val
210	215		220

-42Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro

225 230 235 240

Pro Glu

Ser

Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Gly

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

val

Asn

Val

Val Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe Asn

Val

Ser

val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg Arg

Ser

Lys

Thr Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495

-43CZ JU13O9 HO (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Ems mutant 340 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lya Thr Ser Lys Gin Lys

1

5

10

15

Pro

Val

Gly Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn Pro 35

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

HiS

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His Arg

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin

Phe

Cys

100 105 110

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

lle

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

lle

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Asp

Gly

Ala

ser

Gly

Ser

165 170 175

Lys	Asp	Lys	Lys 180	Pro	Asp	Arg	Met
Pro	Arg	Glu 195	His	Glu	Lys	Asp	Ser 200
Ile	Val 210	Val	Glu	Gly	Val	Lys 215	Tyr

Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala 185 190

Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr 205

Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val 220

-44Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro

225 230 235 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr Asn 280

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg Gly 290

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cy3 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Gly 340

His

Glu

Trp

Asn Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 35S

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu Met 360

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

. Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

val

ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe Asn 425

Val

Ser

val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

cys

Gly

Ser Leu 440

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 430

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

-45CL JU130* BO (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 493 aminokyselin (B)TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Erns mutant delece 342-6/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu Tyr 10

Lys

Thr

ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr Asp 25

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg ISO

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

-46Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro

225 230 235 240

Pro	Glu	Ser	Arg	Lys 245	Lys	Leu	Glu	Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val 250 255
Tle	Thr	Ile	Leu	Leu	Tyr	Gin	Pro	Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin
			260					265 270
Trp	Asn	Leu	Ser	Asp	Asn	Gly	Thr	Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr
		275					280	285
Leu	Arg	Gly	Val	Asn	Arg	ser	Leu	His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile
	290					295		300
Cys	Lys	Gly	Val	Pro	Thr	His	Leu	Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu
305					310			315 320
Ile	Arg	Gly	Met	Met	Asp	Ala	Ser	Glu Arg Thr Asn Tyr Thr cys Cys
				325				330 335
Arg	Leu	Gin	Arg	His	Trp	Asn	Lys	Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile
			340					345 350
Asp	Pro	Trp	Ile	Gin	Leu	Met	Asn	Arg Thr Gin Thr Asn Leu Thr Glu
		355					360	365
Gly	Pro	Pro	Asp	Lys	Glu	Cys	Ala	Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asn
	370					375		380
Thr	Asp	Val	Asn	Val	Val	Thr	Gin	Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu
385					390			395 400
Thr	Gly	Cys	Lys	Lys	Gly	Lys	Asn	Phe Ser Phe Ala Gly Thr Val Ile
				405				410 415
Glu	Gly	Pro	Cys	Asn	Phe	Asn	Val	Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly
			420					425 430
Asp	His	Glu	Cys	Gly	Ser	Leu	Leu	Gin Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Leu
		435					440	445
Asp	Gly	Met	Thr	Asn	Thr	Ile	Glu	Asn Ala Arg Gin Gly Ala Ala Arg
	450					455		460
Val	Thr	Ser	Trp	Leu	Gly	Arg	Gin	Leu Ser Thr Ala Gly Lys Lys Leu
465					470			475 480
Glu	Arg	Arg	ser	Lys	Thr	Trp	Phe	Gly Ala Tyr Ala Leu

435

490

-47CZ JU1307 bO (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Ems mutant delece v poloze 342/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

Met 1	Glu Leu Asn His 5	Phe	Glu	Leu	Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin	Lys
10	15
Pro	Val Gly Val Glu 20	Glu	Pro	Val	Tyr Asp Thr Ala Gly 25	Arg Pro 30	Leu
Phe	Gly Asn Pro ser 35	Glu	Val	His 40	Pro Gin Ser Thr Leu 45	Lys Leu	Pro
His	Asp Arg Gly Arg 50	Gly Asp 55	Ile	Arg Thr Thr Leu Arg 60	Asp Leu	Pro
Arg 65	Lys Gly Asp cys	Arg 70	Ser	Gly	Asn His Leu Gly Pro 75	Val Ser	Gly 80
Ile	Tyr ile Lys Pro 85	Gly	Pro	Val	Tyr Tyr Gin Asp Tyr 90	Thr Gly 95	Pro
Val	Tyr His Arg Ala 100	Pro	Leu	Glu	Phe Phe Asp Glu Ala 105	Gin Phe 110	Cys
Glu	Val Thr Lys Arg 115	Ile	Gly	Arg 120	Val Thr Gly Ser Asp 125	Gly Lys	Leu
Tyr	His Ile Tyr val 13 0	Cys	Val 135	Asp	Gly Cys Ile Leu Leu 140	Lys Leu	Ala
Lys 145	Arg Gly Thr Pro	Arg 150	Thr	Leu	Lys Trp Ile Arg Asn 155	Phe Thr	Asn 160
Cys	Pro Leu Trp Val 165	Thr	Ser	Cys	Ser Asp Asp Gly Ala 170	Ser Gly 175	Ser
Lys	Asp Lys Lys Pro 180	Asp	Arg	Met	Asn Lys Gly Lys Leu 185	Lys Ile 190	Ala
Pro	Arg Glu His Glu 195	Lys	Asp	Ser 200	Lys Thr Lys Pro Pro 205	Asp Ala	Thr
Ile	Val Val Glu Gly	Val	Lys	Tyr	Gin Ile Lys Lys Lys	Gly Lys	Val

210 215 220

-48Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro

225 230 235 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 26Q

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Trp

Asn

Lys

His 345

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp 350

Tyr

Asn

Ile

Asp

Pro 355

Trp

Tle

Gin

Leu

Met 350

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr 365

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly 370

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu 375

cys

Ala

Val

Thr

cys 330

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

A^n

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

385

390

395

400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys 405

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe 410

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr 415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro 420

Cys

Asn

Phe

Asn

Val 425

Ser

Val

Glu

Asp

Ile 430

Leu

Tyr

Gly

Asp

His 435

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu 440

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala 445

Leu

Tyr

Leu

Leu

Asp 450

Gly

Met

Thr

Asn

Thr 455

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg 460

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg 465

Val

Thr

Ser

Trp

Leu 470

Gly Arg

Gin

Leu

Ser 475

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys 480

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser 485

Lys

Thr Trp

Phe

Gly 490

Ala

Tyr

Ala

Leu

-49CZ JU 15)09 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

ío /poznámka = CSFV Ems mutant 343 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 95

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

-50Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys pro Pro Asp Ala Thr

195 200 205

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 250

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

GlU

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Gly

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Aep

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

cys

Asn

Phe

Asn 425

val

Ser

Val

Glu

Asp 430

ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 4 90

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

-51 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 492 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Erns delece v poloze 346-7/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

Met 1

GlU

Leu

Asn,

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Vál 210

val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Tle

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val

245

2S0

255

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 2 75

Ser

Asp

Asn

Gly Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 235

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn.

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Trp 345

cys

Asn

Trp

Tyr

Asn 350

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile 355

Gin

Leu

Met

Asn

Arg 360

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu 365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro 370

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala 375

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr 380

Asp

Lys

Asn

Thr

Asp 385

Val

Asn

val

val

Thr 390

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg 3 95

Pro

Thr

Thr

Leu

Thr 400

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly 405

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe 410

Ala

Gly

Thr

Val

Ile 415

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn 420

Phe

Asn

Val

Ser

Val 425

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr 430

Gly

Asp

His

Glu

Cys 435

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin 440

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr 445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met 450

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu 455

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly 460

Ala

Ala

Arg

Val

Thr 465

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg 470

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala 475

Gly

Lys

Lys

Leu

Glu 480

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490

53vz, ouiooy do (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 493 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Ems mutant v poloze 345-6/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

Met Glu Leu Agn His Phe Glu Leu
1	5
Pro	Val	Gly	Val 20	Glu	Glu	Pro	Val
Phe	Gly	Asn 35	Pro	Ser	Glu	Val	His 40
His	Asp 50	Arg	Gly	Arg	Gly Asp 55	Ile
Arg 65	Lys	Gly	Asp	Cys	Arg 70	Ser	Gly
Ile	Tyr	Ile	Lys	Pro 85	Gly	Pro	Val
Val	Tyr	His	Arg 100	Ala	Pro	Leu	Glu
Glu	Val	Thr 115	Lys	Arg	Ile	Gly Arg 120
Tyr	HiS	Ile	Tyr	Val	Cys	val	Asp
	130					135
Lys	Arg	Gly	Thr	Pro	Arg	Thr	Leu

145 150

Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 10 15

Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 25 30

Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro 45

Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 60

Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 75 80

Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 90 95

Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 105 110

Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 125

Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 140

Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn 155 ieo

Cys Pro	Leu Trp	val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly ser
165	170	175
Lys Asp	Lys Lya 180	Pro Asp	Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala 185 190
Pro Arg	Glu His 195	Glu Lys	Asp Ser Lys Thr Lys 200	Pro Pro Asp Ala Thr 205
Ile Val 210	val Glu	Gly Val	Lys Tyr Gin Ile Lys 215	Lys Lys Gly Lys Val 220
Lys Gly Lys Asn 225	Thr Gin 230	Asp Gly Leu Tyr His 235	Asn Lys Asn Lys Pro 240
Pro Glu	Ser Arg	Lys Lys 245	Leu Glu Lys Ala Leu 250	Leu Ala Trp Ala Val 255
Ile Thr	Ile Leu 260	Leu Tyr	Gin Pro Val Ala Ala 265	Glu Aen Ile Thr Gin 270
Trp Asn	Leu Ser 275	Asp Asn	Gly Thr Asn Gly Ile 280	Gin Arg Ala Met Tyr 285
Leu Arg Gly Val 290	Asn Arg	Ser Leu His Gly Ile 295	Trp Pro Glu Lys ile 300
Cys Lys 305	Gly Val	Pro Thr 310	His Leu Ala Thr Asp 315	Thr Glu Leu Lys Glu 320
Ile Arg	Gly Met	Met Asp 325	Ala ser Glu Arg Thr 330	Asn Tyr Thr cys Cys 335
Arg Leu	Gin Arg 340	His Glu	Trp Asn Gly Trp Cys 345	Asn Trp Tyr Asn. Ile 350
Asp Pro	Trp Tle 355	Gin Leu	Met Asn Arg Thr Gin 360	Thr Asn Leu Thr Glu 365
Gly Pro 370	Pro Asp	Lys Glu	Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asn 375 380
Thr Asp 385	Val Asn	Val Val 390	Thr Gin Ala Arg Asn 395	Arg Pro Thr Thr Leu 400
Thr Gly	Cys Lys	Lys Gly 405	Lys Asn Phe Ser Phe 410	Ala Gly Thr Val Ile 415
Glu Gly	Pro Cys 420	Asn Phe	Asn Val Ser Val Glu 425	Asp Ile Leu Tyr Gly 430
Asp His	Glu Cys 435	Gly Ser	Leu Leu Gin Asp Thr 440	Ala Leu Tyr Leu Leu 445
Asp Gly 450	Met Thr	Asn Thr	Ile Glu Asn Ala Arg 455	Gin Gly Ala Ala Arg 460
Val Thr 465 Glu Arg	Ser Trp Arg Ser	Leu Gly 470 Lys Thr 485	Arg Gin Leu Ser Thr 475 Trp Phe Giy Ala Tyr 490	Ala Gly Lys Lys Leu 480 Ala Leu

UZ JU1OO7 DD (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Ems mutant 345 A/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

Met Glu Leu Asn Hia Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys
1	5	10	15
Pro	Val Gly Val Glu Glu	Pro Val Tyr Asp Thr	Ala Gly Arg Pro Leu
	20	25	30
Phe	Gly Asn Pro Ser Glu	Val His Pro Gin Ser	Thr Leu Lys Leu Pro
	35	40	45
His	Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr	Leu Arg Asp Leu Pro
	50	55	60
Arg	Lys Gly Asp Cys Arg	Ser Gly Asn His Leu	Gly Pro Val Ser Gly
65	70	75	80
Ile	Tyr Ile Lys Pro Gly	Pro Val Tyr Tyr Gin	Asp Tyr Thr Gly Pro
	85	90	95
Val	Tyr His Arg Ala Pro	Leu Glu Phe Phe Asp	Glu Ala Gin Phe Cys
	100	105	110
Glu	Val Thr Lys Arg Ile	Gly Arg Val Thr Gly	Ser Asp Gly Lys Leu
	115	120	125
Tyr	His Ile Tyr Val Cys	Val Asp Gly Cys Ile	Leu Leu Lys Leu Ala
	130	135	140
Lys	Arg Gly Thr Pro Arg	Thr Leu Lys Trp Ile	Arg Asn Phe Thr Asn
145	150	155	160
Cys	Pro Leu Trp Val Thr	Ser Cys Ser Asp Asp	Gly Ala Ser Gly Ser
	165	170	175
Lys	Asp Lys Lys Pro Asp	Arg Met Asn Lys Gly	Lys Leu Lys Ile Ala
	ISO	185	190
Pro	Arg Glu His Glu Lys	Asp Ser Lys Thr Lys	Pro Pro Asp Ala Thr
	195	200	205
Ile	Val Val Glu Gly Val	Lys Tyr Gin Ile Lys	Lys Lys Gly Lys Val
	210	215	220
Lys	Gly Lys Aen Thr Gin	Asp Gly Leu Tyr His	Asn Lys Asn Lys Pro

225 230 235 240

-56Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val

245 250 255

Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro val Ala Ala Glu Asn Xle Thr Gin
	260	265	270
Trp Asn Leu	Ser Asp Asn Gly Thr	Asn	Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr
275	280		285
Leu Arg Gly	Val Asn Arg Ser Leu	His	Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile
290	295		300
Cys Lys Gly	Val Pro Thr His Leu	Ala	Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu
305	310		315 320
Ile Arg Gly	Met Met Asp Ala Ser	Glu	Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys
	325		330 335
Arg Leu Gin	Arg His Glu Trp Asn	Ala	His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr
	340	345	350
Asn Ile Asp	Pro Trp Ile Gin Leu	Met	Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu
355	360		365
Thr Glu Gly	Pro Pro Asp Lys Glu	Cys	Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp
370	375		380
Lys Asn Thr	Asp Val Asn Val Val	Thr	Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr
385	390		395 400
Thr Leu Thr	Gly Cys Lys Lys Gly	Lys	Asn phe Ser Phe Ala Gly Thr
	405		410 415
Val Ile Glu	Gly Pro Cys Asn Phe	Asn	Val Ser Val Glu Asp Ile Leu
	420	425	430
Tyr Gly Asp	HÍ3 Glu Cys Gly Ser	Leu	Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr
435	440		445
Leu Leu Asp	Gly Met Thr Asn Thr	Ile	Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala
450	455		460
Ala Arg Val	Thr Ser Trp Leu Gly Arg	Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys
465	470		475 480
Lys Leu Glu	Arg Arg Ser Lys Thr Trp	Phe Gly Ala Tyr Ala Leu

485 490 495

-57Í.L JU130V BO (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 493 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Ems mutant delece v poloze 346-7/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin	Lys
1	5	10	15
Pro Val	Gly Val Glu Glu Pro 20	Val Tyr Asp 25	Thr Ala Gly Arg Pro 30	Leu
Phe Gly	Asn Pro Ser Glu Val 35	His Pro Gin 40	Ser Thr Leu Lys Leu 45	Pro
His Asp 50	Arg Gly Arg Gly Asp 55	Ile Arg Thr	Thr Leu Arg Asp Leu 60	Pro
Arg Lys 65	Gly Asp Cys Arg Ser 70	Gly Asn His	Leu Gly Pro Val Ser 75	Gly 80
Ile Tyr	Ile Lys Pro Gly Pro 85	Val Tyr Tyr 90	Gin Asp Tyr Thr Gly 95	Pro
Val Tyr	His Arg Ala Pro Leu 100	Glu Phe Phe 105	Asp Glu Ala Gin Phe 110	Cys
Glu Val	Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr 115 120	Gly Ser Asp Gly Lys 125	Leu
Tyr His 130	Ile Tyr Val Cys Val 135	Asp Gly Cys	Ile Leu Leu Lys Leu 140	Ala
Lys Arg 145	Gly Thr Pro Arg Thr 150	Leu Lys Trp	Ile Arg Asn Phe Thr 155	Asn 160
Cys Pro	Leu Trp Val Thr Ser 165	Cys Ser Asp 170	Asp Gly Ala Ser Gly 175	Ser
Lys Asp	Lys Lys Pro Asp Arg 180	Met Asn Lys 185	Gly Lys Leu Lys Ile 190	Ala
Pro Arg	Glu His Glu Lys Asp 195	Ser Lys Thr 200	Lys Pro Pro Asp Ala 205	Thr
Ile Val 210	Val Glu Gly val Lys 215	Tyr Gin Ile	Lys Lys Lys Gly Lys 220	Val

Lys Gly Lys 225	Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lya Asn Lys Pro
230	235	240
Pro Glu Ser	Arg Lys Lys Leu Glu	Lys Ala Leu Leu	Ala Trp Ala Val
	245	250	255
Ile Thr Ile	Leu Leu Tyr Gin Pro	Val Ala Ala Glu	Asn Ue Thr Gin
	260	265	270
Trp Asn Leu	Ser Asp Asn Gly Thr	Asn Gly Ile Gin	Arg Ala Met Tyr
275	280		285
Leu Arg Gly	Val Asn Arg Ser Leu	His Gly Ile Trp	Pro Glu Lys Ile
290	295	300
Cys Lys Gly	Val Pro Thr His Leu	Ala Thr Asp Thr	Glu Leu Lys Glu
305	310	315	320
Ile Arg Gly	Met Met Asp Ala Ser	Glu Arg Thr Asn	Tyr Thr Cys Cys
	325	330	335
Arg Leu Gin	Arg His Glu Trp Asn	Lys Trp Cys Asn	Trp Tyr Asn Ile
	340	345	350
Asp Pro Trp	Ile Gin Leu Met Asn	Arg Thr Gin Thr	Asn Leu Thr Glu
355	360		365
Gly Pro Pro	Asp Lys Glu Cys Ala	Val Thr Cys Arg	Tyr Asp Lys Asn
370	375	380
Thr Asp Val	Asn Val Val Thr Gin	Ala Arg Asn Arg	Pro Thr Thr Leu
385	390	395	400
Thr Gly Cys	Lys Lys Gly Lys Asn	Phe Ser Phe Ala	Gly Thr Val Ue
	405	410	415
Glu Gly Pro	Cys Asn Phe Asn Val	Ser Val Glu Asp	Ue Leu Tyr Gly
	420	425	430
Asp His Glu	Cys Gly Ser Leu Leu	Gin Asp Thr Ala	Leu Tyr Leu Leu
435	440		445
Asp Gly Met	Thr Asn Thr Ile Glu	Asn Ala Arg Gin	Gly Ala Ala Arg
450	455	460
Val Thr Ser	Trp Leu Gly Arg Gin	Leu Ser Thr Ala	Gly Lys Lys Leu
465	470	475	480
Glu Arg Arg	Ser Lys Thr Trp Phe	Gly Ala Tyr Ala	Leu

485 490

-59CZ JU1OO7 OO (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 494 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Ems mutant v poloze 346/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin	Lys
1	5	10	15
Pro Val	Gly Val Glu Glu Pro	Val Tyr Asp	Thr Ala Gly Arg Pro	Leu
	20	25	30
Phe Gly	Asn Pro Ser Glu Val	His Pro Gin	Ser Thr Leu Lys Leu	Pro
	35	40	45
His Asp	Arg Gly Arg Gly Asp	Ile Arg Thr	Thr Leu Arg Asp Leu	Pro
50	55		60
Arg Lys	Gly Asp Cys Arg Ser	Gly Asn His	Leu Gly Pro Val Ser	Gly
65	70		75	80
Ile Tyr	ile Lys Pro Gly Pro	Val Tyr Tyr	Gin Asp Tyr Thr Gly	Pro
	85	90	95
Val Tyr	His Arg Ala Pro Leu	Glu Phe Phe	Asp Glu Ala Gin Phe	Cys
	100	105	110
Glu Val	Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr	Gly Ser Asp Gly Lys	Leu
	115	120	125
Tyr His	Ile Tyr val cys Val	Asp Gly Cys	Ile Leu Leu Lys Leu	Ala
130	135		140
Lys Arg	Gly Thr Pro Arg Thr	Leu Lys Trp	Ile Arg Asn Phe Thr	Asn
145	150		155	160
Cys Pro	Leu Trp Val Thr Ser	Cys Ser Asp	Asp Gly Ala Ser Gly	Ser
	165	170	175
Lys Asp	Lys Lys Pro Asp Arg	Met Asn Lys	Gly Lys Leu Lys Ile	Ala
	180	185	190
Pro Arg	Glu His Glu Lys Asp	Ser Lys Thr	Lys Pro Pro Asp Ala	Thr
	195	200	205
Ile Val	Val Glu Gly Val Lys	Tyr Gin Ile	Lys Lys Lys Gly Lys	Val
210	215		220

-60UV

Lys Gly Lys 225

Asn

Thr

Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lye

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

340

345

350

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

3SS

360

365

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

370

375

380

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr

305

390

3 95

400

Leu

Thr

Gly

cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

405

410

415

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

420

425

430

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

435

440

445

Leu

Asp

Gly

Mét

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala

450

455

460

Axg

val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

465

470

475

480

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490

-61 CL JU1509 Bb (2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Ems mutant 346 K/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15 10 15

Pro

val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 65

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

ATg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Ly3

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Xle

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 32S

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

Lys

Gly Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

CyS

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly Arg

Gin

Leu 47S

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

ser

Lys

Thr Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495

-63CZ JU1509 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Ems mutant 346 L/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr Asp 25

Thr

Ala

Gly Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

ASp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Tle

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

-64JU1OV7 DD

Cys Pro	Leu Trp	Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly
165	170	175
Lys Asp	Lys Lys	Pro Asp	Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys	Ile
	180		185 190
Pro Arg	Glu His	Glu Lys	Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp	Ala
	195		200 205
Ile Val	Val Glu	Gly Val	Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly	Lys
210			215 220
Lys Gly	Lys Asn	Thr Gin	Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn	Lys
225		230	235
Pro Glu	Ser Arg	Lys Lya	Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp	Ala
		245	250	255
ile Thr	Ile Leu	Leu Tyr	Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile	Thr
	260		265 270
Trp Asn	Leu Ser	Asp Asn	Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala	Met
	275		280 285
Leu Arg	Gly Val	Asn Arg	Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu	Lys
290			295 300
Cys Lys	Gly Val	Pro Thr	His Leu Ala Thr Aep Thr Glu Leu	Lys
305		310	315
Ile Arg	Gly Met	Met Asp	Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr	Cys
		325	330	335
Arg Leu	Gin Arg	His Glu	Trp Asn Lys Leu Gly Trp Cys Asn	Trp
	340		345 350
Asn Ile	Asp Pro	Trp Ile	Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr	Asn
	355		360 365
Thr Glu	Gly Pro	Pro Asp	Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg	Tyr
370			375 380
Lys Asn	Thr Aap	Val Asn	Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg	Pro
385		390	395
Thr Leu	Thr Gly	Cys Lys	Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala	Gly
		405	410	415
Val Ile	Glu Gly	Pro Cys	Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp	Ile
	420		425 430
Tyr Gly Asp His	Glu Cys	Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala	Leu
	435		440 445
Leu Leu	Asp Gly	Met Thr	Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin	Gly
450			455 460
Ala Arg	Val Thr	Ser Trp	Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala	Gly
465		470	475
Lys Leu	Glu Arg	Arg Ser	Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala	Leu
		485	490	4 95

Ser

Ala

Thr

Val

Pro

240

Val

Gin

Tyr

Ile

Glu

320

Cys

Tyr

Leu

Asp

Thr

400

Thr

Leu

Tyr

Ala

Lys

480

-65cl bo (2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

/poznámka = CSFV Ems mutant 297 K 346 K/

(xi)	Popis sekvence:!	SEQ ID NO: 21:
Met 1	Glu Leu Asn	His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 5 10 15
Pro	Val Gly Val 20	Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 25 30
Phe	Gly Asn Pro 35	Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro 40 45
His	Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60
Arg 65	Lys Gly Asp	Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 70 75 80
Ile	Tyr Ile Lys	Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95
Val	Tyr His Arg 100	Ala Pro Leu Glu phe phe Asp Glu Ala Gin Phe cys 105 110
Glu	Val Thr Lys 115	Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 120 125
Tyr	His Ile Tyr 130	Val Cys val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 135 140
Lys 145	Arg Gly Thr	Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn 150 155 160
Cys	Pro Leu Trp	Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser 165 170 175
Lys	Asp Lys Lys 180	Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala 185 190
Pro	Arg Glu His 195	Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr 200 205
Ile	Val Val Glu 210	Gly Val Lys Tyr Gin ile Lys Lys Lys Gly Lys Val 215 220
Lys 225	Gly Lys Asn	Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro 230 235 240

Pro Glu

Ser

Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Lys

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Giy

val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Lys

Gly Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

cys

Asn

Phe

Asn

val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

GlU

Arg Arg

Ser

Lys

Thr Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

495 490 495

-67CL JUIOOV «0 (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Erns mutant 297 K 346 L/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

Met 1	Glu	Leu	Asn	His 5	Phe	Glu	Leu Leu Tyr 10	Lys	Thr ser Lys	Gin 15	Lys
Pro	Val	Gly	Val 20	Glu	Glu	Pro	Val Tyr Asp 25	Thr	Ala Gly Arg 30	Pro	Leu
Phe	Gly	Asn 35	Pro	Ser	Glu	Val	His Pro Gin 40	Ser	Thr Leu Lys 45	Leu	Pro
His	Asp 50	Arg	Gly	Arg	Gly	Asp 55	Ile Arg Thr	Thr	Leu Arg Asp 60	Leu	Pro
Arg 65	Lys	Gly	Asp	Cys	Arg 70	Ser	Gly Asn His	Leu 75	Gly Pro Val	Ser	Gly 80
Ile	Tyr	Ile	Lys	Pro 35	Gly	Pro	Val Tyr Tyr 90	Gin	Asp Tyr Thr	Gly 95	Pro
Val	Tyr	His	Arg 100	Ala	Pro	Leu	Glu Phe Phe 105	Asp	Glu Ala Gin 110	Phe	Cys
Glu	Val	Thr 115	Lys	Arg	Ile	Gly	Arg val Thr 120	Gly	Ser Asp Gly 125	Lys	Leu
Tyr	His 130	Ile	Tyr	Val	Cys	Val 135	Asp Gly Cys	Ile	Leu Leu Lys 140	Leu	Ala
Lys 145	Arg	Gly	Thr	Pro	Arg 150	Thr	Leu Lys Trp	Ile 155	Arg Asn Phe	Thr	Asn 160
Cys	Pro	Leu	Trp	val 165	Thr	Ser	Cys Ser Asp 170	Asp	Gly Ala Ser	Gly 175	ser
Lys	Asp	Lys	Lys 180	Pro	Asp	Arg	Met Asn Lys 185	Gly	Lys Leu Lys 190	Ile	Ala
Pro	Arg	Glu 195	His	Glu	Lys	Asp	Ser Lys Thr 200	Lys	Pro Pro Asp 20S	Ala	Thr
Ile	Val 210	Val	GlU	Gly	Val	Lys 215	Tyr Gin Ile	Lys	Lys Lys Gly 220	Lys	Val

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Lys

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Leu

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly Asp His

i Glu Cys

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala 450 455 460

Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys 465 470 475 480

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 495

-69(2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Erns mutant 297 L 346 L/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly Arg

Gly Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala.

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Tle 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

Leu

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

Leu

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

HÍ3

Glu

cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Giy

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

435 490 495

-71juiomr oo (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = BVDV protein Ems/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

Met Glu Leu Ile Thr 1 5	Asn	Glu	Leu	Leu	Tyr 10	Lys	Thr	Tyr Lys Gin Lys 15
Pro Ala Gly Val Glu 20	Glu	Pro	Val	Tyr 25	Asp	Gin	Ala	Gly Asn Pro Leu 30
Phe Gly Glu Arg Gly 35	Val	Ue	His 40	Pro	Gin	Ser	Thr	Leu Lys Leu Pro 45
His Lys Arg Gly Glu 50	Arg	Glu 55	Val	Pro	Thr	Asn	Leu 60	Ala Ser Leu Pro
Lys Arg Gly Asp Cys 65	Arg 70	Ser	Gly	Asn	ser	Lys 75	Gly	Pro Val Ser Gly 80
Ile Tyr Leu Lys Pro 85	Gly	Pro	Leu	Phe	Tyr 90	Gin	Asp	Tyr Lys Gly Pro 95
Val Tyr His Arg Ala 100	Pro	Leu	Glu	Phe 105	Phe	Glu	Glu	Ala Ser Met Cys 110
Glu Thr Thr Lys Arg 115	Ile	Gly Arg 120	val	Thr	Gly	Ser	Asp Ser Arg Leu 125
Tyr His Ile Tyr Val 130	Cys	Ue 13S	Asp	Gly	Cys	Ue	Ue 140	Val Lys Ser Ala
Thr Lys Asp Arg Gin 145	Lys 150	Val	Leu	Lys	Trp	Val 155	HÍS	Asn Lys Leu Asn 160
Cys Pro Leu Trp Val 165	Ser	Ser	Cys	Ser	Asp 170	Thr	Lys	Asp Glu Gly Val 175
val Arg Lys Lys Gin 180	Gin	Lyg	Pro	Asp 185	Arg	Leu	Glu	Lys Gly Arg Met 190
Lys Ue Thr Pro Lys 195	Glu	Ser	Glu 200	Lys	Asp	Ser	Lys	Thr Lys Pro Pro 205
Asp Ala Thr Ue Val 210	Val	Asp 215	Gly	Val	Lys	Tyr	Gin 220	val Lys Lys Lys

Gly Lys Val Lys 225	Ser Lys Asn Thr Gin Aep Gly Leu Tyr His Asn Lys
230	235	240
Asn Lys Pro Gin	Glu Ser	Arg Lys Lys Leu Glu	Lys Ala Leu Leu Ala
	245	250	255
Trp Ala Ile Ile	Ala Leu	Val Phe Phe Gin Val	Thr Met Gly Glu Asn
260		265	270
Ile Thr Gin Trp	Asn Leu	Gin Asp Asn Gly Thr	Glu Gly Ile Gin Arg
275		280	285
Ala Met Phe Gin	Arg Gly	Val Asn Arg Ser Leu	His Gly Ile Trp Pro
290		295	300
Glu Lys Ile Cys	Thr Gly	Val Pro Ser His Leu	Ala Thr Asp Thr Glu
305	310	315	320
Leu Lys Ala Ile	His Gly	Met Met Asp Ala Ser	Glu Lys Thr Asn Tyr
	325	330	335
Thr Cys Cys Arg	Leu Gin	Arg His Glu Trp Asn	Lys His Gly Trp Cys
340		345	350
Asn Trp Tyr Asn	Ile Glu	Pro Trp Ile Leu Leu	Met Asn Lys Thr Gin
355		360	365
Ala Asn Leu Thr	Glu Gly	Gin Pro Leu Arg Glu	Cys Ala Val Thr Cys
370		375	380
Arg Tyr Asp Arg	Asp Ser	Asp Leu Asn val Val	Thr Gin Ala Arg Asp
335	390	395	400
Ser Pro Thr Pro	Leu Thr	Gly Cys Lys Lys Gly	Lys Asn Phe Ser Phe
	405	410	415
Ala Gly Ile Leu	Val Gin	Gly Pro Cys Asn Phe	Glu Ile Ala Val Ser
420		425	430
Asp Val Leu Phe	Lys Glu	His Asp Cys Thr Ser	Val Ile Gin Asp Thr
435		440	445
Ala His Tyr Leu	Val Asp	Gly Met Thr Asn Ser	Leu Glu Ser Ala Arg
450		455	460
Gin Gly Thr Ala	Lys Leu	Thr Thr Trp Leu Gly Arg Gin Leu Gly Ile
465	470	475	4B0
Leu Gly Lys Lys	Leu Glu	Asn Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala
	485	490	495

-73(2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = BVDV protein Ems/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys

5 10 15

Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu

25 30

Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45

His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60

Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly

70 75 90

Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro

90 95

Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 100 105 110

Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125

Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 130 135 140

Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn

145 150 155 160

Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser

165 170 175

Lys	Asp	Lys	Lys 180	Pro
Pro	Arg	Glu 195	His	Glu
Ile	Val 210	Val	Glu	Gly
Lys 225	Gly Lys	Asn	Thr
Pro	Glu	Ser	Arg	Lys 245
Ile	Thr	Ile	Leu 260	Leu
Trp	Asn	Leu 275	Ser	Asp
Leu	Arg 290	Gly	Val	Asn
Cys 305	Lys	Gly	Val	Pro
Ile	Arg	Gly	Met	Met 325
Arg	Leu	Gin	Arg 340	His
Asn	Ile	Asp 355	Pro	Trp
Thr	Glu 370	Gly	Pro	Pro
Lys 385	ASn	Thr	Asp	Val
Thr	Leu	Thr	Gly	Cys 405
Val	Ile	Glu	Gly 420	Pro
Tyr	Gly Asp 435	His	Glu
Leu	Leu 450	Asp Gly	Met
Ala 465	Arg	val	Thr	Ser
Lys	Leu	Glu	Arg	Arg

485

Asp	Arg	Met	Asn 185	Lys
Lys	Asp	Ser 200	Lys	Thr
Val	Lys 215	Tyr	Gin	Ile
Gin 230	Asp	Gly	Leu	Tyr
Lys	Leu	Glu	Lys	Ala 2S0
Tyr	Gin	Pro	Val 265	Ala
Asn	Gly	Thr 280	Asn	Gly
Arg	Ser 295	Leu	His	Gly
Thr 310	His	Leu	Ala	Thr
Asp	Ala	Ser	Glu	Arg 330
Glu	Trp	Asn	Lye 345	His
Ile	Gin	Leu 360	Met	Asn
Asp	Lys 375	Glu	Cys	Ala
Asn 390	val	Val	Thr	Gin
Lys	Lys	Gly Lys	Asn 410
Cys	Asn	Phe	Asn 425	Val
Cys	Gly	Ser 440	Leu	Leu
Thr	Asn 455	Thr	Ile	Glu
Trp	Leu	Gly Arg	Gin

470

Ser Lys Thr Trp Phe 490

Gly Lys Leu Lys Ile Ala 190

Lys Pro Pro Asp Ala Thr 205

Lys Lys Lys Gly Lys Val 220

His Asn Lys Asn Lys Pro 235 240

Leu Leu Ala Trp Ala Val 255

Ala Glu Asn Ile Thr Gin 270

Ile Gin Arg Ala Met Tyr 285

Ile Trp Pro Glu Lys Ile 300

Asp Thr Glu Leu Lys Glu 315 320

Thr Asn Tyr Thr Cys Cys 335

Gly Trp Cys Asn Trp Tyr 350

Arg Thr Gin Thr Asn Leu 365

Val Thr Cys Arg Tyr Asp 3Θ0

Ala Arg Asn Arg Pro Thr 395 400

Phe Ser Phe Ala Gly Thr 415

Ser Val Glu Asp Ile Leu 430

Gin Asp Thr Ala Leu Tyr 445

Asn Ala Arg Gin Gly Ala 460

Leu Ser Thr Ala Gly Lys 475 480

Gly Ala Tyr Ala Leu 495

-75(2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

io /poznámka = CSFV Ems mutant 300 G/ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lye

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp Asp 170

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 19S

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Gly 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lye

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

GlU

Arg 330

Thr Asn

Tyr

Thr

cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly Cys 405

LyS

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

Hifí

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495

-77CL JU13O9 BO (2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 495 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (C) DRUH ŘETĚZCE (D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (D) Jiné informace:

i o /poznámka = CSFV Ems mutant 300 G 302 A/ (xi) Popis sekvence: SEQ IDNO: 27:

Met 1	Glu	Leu	Asn	His 5	Phe	Glu	Leu
Pro	Val	Gly	Val 20	Glu	Glu	Pro	Val
Phe	Gly	Asn 35	Pro	Ser	Glu	Val	His 40
His	Asp 50	Arg	Gly	Arg	Gly	Asp 55	Ile
Arg 65	Lys	Gly	Asp	Cys	Arg 70	Ser	Gly
Ile	Tyr	Ile	Lys	Pro 85	Gly	Pro	Val
Val	Tyr	His	Arg 100	Ala	Pro	Leu	Glu
Glu	Val	Thr 115	Lys	Arg	Ile	Gly	Arg 120
Tyr	His 130	Ile	Tyr	Val	Cys	val 135	Asp
Lys 145	Arg	Gly	Thr	Pro	Arg 150	Thr	Leu
Cys	Pro	Leu	Trp	Val 165	Thr	Ser	Cys
Lys	Asp	Lys	Lys 180	Pro	Asp	Arg	Met
Pro	Arg	Glu 195	His	Glu	Lys	Asp	Ser 200
Ile	Val 210	Val	Glu	Gly	Val	Lys 215	Tyr

Leu	Tyr 10	Lys	Thr	Ser Lys	Gin 15	Lys
Tyr 25	Asp	Thr	Ala	Gly Arg 30	Pro	Leu
Pro	Gin	ser	Thr	Leu 45	Lys	Leu	Pro
Arg	Thr	Thr	Leu 60	Arg	Asp	Leu	Pro
Asn	His	Leu 75	Gly	Pro	Val	Ser	Gly 80
Tyr	Tyr 90	Gin	Asp	Tyr	Thr	Gly 95	Pro
Phe 105	Phe	Asp	Glu	Ala	Gin 110	Phe	cys
Val	Thr	Gly	Ser	Asp	Gly	Lys	Leu

125

Gly	Cys	Ile	Leu 140	Leu	Lys	Leu	Ala
Lys	Trp	Ile 155	Arg	Asn	Phe	Thr	Ash 160
Ser	Asp 170	ASp	Gly	Ala	Ser	Gly 175	Ser
Asn 185	Lys	Gly Lys	Leu	Lys 190	Ile	Ala
Lys	Thr	Lys	Pro	Pro 205	Asp	Ala	Thr
Gin	Ile	Lys	Lys	Lys	Gly	Lys	Val

220

-78Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro

225 230 235 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Gly 300

Pro

Ala

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Tle

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Tle

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob detekovatelného značení pestivirů, vyznačující se tím, že se deaktivuje RNázová aktivita, kterou vykazuje glykoprotein E^RNS delecemi a/nebo mutacemi alespoň jedné aminokyseliny uvedeného glykoproteinu, za předpokladu, že aminokyselina v polohách 297 a/nebo 346 glykoproteinu je odlišná od lysinu, jakje zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene ío Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech, přičemž deaktivace RNázové aktivity vede ke vzniku utlumeného pestivirů.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené delece a/nebo mutace k deaktivaci RNázové aktivity se nacházejí v polohách 295 až 307 a /nebo v polohách 338 až 357

   15 uvedeného glykoproteinu, jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.
3. 3. Způsob podle kteréhokoliv z nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že RNázová aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací aminokyseliny v poloze 346 uvedeného glykoproteinu,

   20 jak je zobrazeno na obr. 1 v případě CSFV kmene Alfort nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.
4. 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že RNázová aktivita se deaktivuje deleci nebo mutací histidinového zbytku v poloze 346 uvedeného glyko25 proteinu, jak je zobrazeno na obr, 1 v případě CSFV kmene Alfort, nebo v odpovídajících polohách v jiných kmenech.