PL202509B1

PL202509B1 - Żywa szczepionka zawierająca atenuowane pestiwirusy, atenuowane pestiwirusy, kwas nukleinowy kodujący glikoproteinę ERNS, ich zastosowanie i kompozycje farmaceutyczne zawierające oraz sposób atenuowania i oznaczania pestiwirusa i sposób odróżniania zwierząt zainfekowanych od zaszczepionych specyficznie pestiwirusem

Info

Publication number: PL202509B1
Application number: PL348019A
Authority: PL
Inventors: Gregor Meyers
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmed
Priority date: 1998-06-05
Filing date: 1999-05-26
Publication date: 2009-06-30
Also published as: JP4632540B2; DE69928700T2; SK18232000A3; AU4369299A; EP1203812A3; EP1203813A2; SI1084251T1; JP5247770B2; HU228471B1; CN100374563C; PL202161B1; CZ301570B6; CA2330241A1; ES2253457T3; ES2257476T3; HUP0102707A2; TR200103664T2; ATE316380T1; PT1203813E; CN101085346A

Abstract

Wynalazek dotyczy zywej szczepionki z atenuowanych pestiwirusów charakteryzuj acych si e tym, ze ich aktywnosc enzymatyczna zwi azana z glikoprotein a E RNS zosta la inaktywowana, szcze- pionki i kompozycji farmaceutycznej z pestiwirusem, kwasu nukleinowego, sposobu przygotowania, zastosowania i wykrywania atenuowanych pestiwirusów oraz sposobu rozró zniania zwierz at zainfe- kowanych od zwierz at zaszczepionych specyficznie pestiwirusem. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy żywej szczepionki zawierającej atenuowane pestiwirusy, atenuowanych pestiwirusów, kwasu nukleinowego kodującego glikoproteinę E^RNS i ich zastosowania. Wynalazek obejmuje też kompozycje farmaceutyczne zawierające pestiwirus lub kwas nukleinowy oraz sposób atenuowania i oznaczania pestiwirusa i sposób odróżniania zwierząt zainfekowanych od zwierząt zaszczepionych specyficznie pestiwirusem. Sposób atenuowania pestiwirusów polega na inaktywowaniu

RNS aktywności rybonukleazy (aktywności RNazy) związanej z glikoproteiną E^RNS.

Pestiwirusy są czynnikami sprawczymi istotnych ekonomicznie chorób zwierzęcych w wielu krajach świata. Znane obecnie izolaty wirusa można podzielić na trzy różne rodzaje, tworzące wspólnie rodzinę Flaviviridae.

I. Wirus bydlęcej biegunki wirusowej (Bovine viral diarrhea virus (BVDV) powodujący bydlęcą biegunkę wirusową (BVD, bovine viral diarrhea) oraz chorobę śluzówki (mucosal disease) bydła (Baker, 1987; Moening i Plagemann, 1992; Thiel i wsp 1996).

II. Wirus klasycznej cholery świń (classical swinne fever virus, CSFV), odpowiedzialny za cholerę świń (swine fever, CSF; inna nazwa hog cholera, HC) (Moening i Plagemann 1992; Thiel i wsp 1996).

III. Wirus choroby pogranicza (border disease virus BDV) zwykle atakujący owce, powodujący chorobę pogranicza (border disease, BD). Objawy podobne do MD u bydła opisano również po wewnątrzmacicznej infekcji małych owiec wirusem BDV (Moening i Plagemann 1992; Thiel i wsp 1996).

Alternatywna klasyfikację pestiwirusów podał Becher i wsp (1995), a także inni autorzy.

Pestiwirusy to małe, posiadające otoczkę wirusy z genomem zbudowanym z jednoniciowego (+)RNA, nie posiadające czapeczki na 5' końcu ani sekwencji 3' poli(A). Genom wirusa koduje polibiałko o długości około 4000 aminokwasów, ulegające cięciu w ko-translacyjnej i potranslacyjnej obróbce, w której uczestniczą komórkowe i wirusowe proteazy. Białka wirusowe ułożone są w obrębie polibiałka w następującej kolejności NH2-N^pro-C-E^RNS-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH (Rice, 1996). Białko C i glikoproteiny E^RNS, E1 i E2 są strukturalnymi składnikami wirionów pestiwirusa (Thiel i wsp 1991). E2 i w mniejszym stopniu E^RNSsą cząsteczkami docelowymi, neutralizowanymi przez przeciwciała (Donis i wsp 1998; Paton i wsp 1992; van Rijn i wsp 1993; Weiland i wsp 1990). E^RNS nie posiada zakotwiczenia membranowego i jest wydzielane w znaczących ilościach przez zainfekowane komórki; białko to jak wykazano wykazuje aktywność RNazy (Hulst i wsp 1994; Schneider i wsp 1993; Windisch i wsp 1996). Funkcja tej aktywności enzymatycznej w cyklu życia wirusa jest jak na razie nieznana. W przypadku przygotowanej szczepionki przeciw szczepowi CSFV usunięcie aktywności RNazy w wyniku kierowanej mutagenezy, prowadzi do powstania wirusa cytopatogennego o charakterystyce wzrostu w hodowli komórkowej podobnej do wirusa dzikiego (Hulst i wsp 1998). Aktywność enzymatyczna zależy od obecności obu sekwencji aminokwasowych, konserwowanych ewolucyjnie w E^RNS różnych pestiwirusów i różnych znanych RNaz roślinnych i grzybowych. Zawierają one fragment konserwowany ewolucyjnie obejmujący resztę histydynową (Schneider i wsp 1993). Wymiana każdej z tych reszt na lizynę w białku E^RNS szczepu CSFV stosowanego do przygotowania szczepionki prowadzi do zniszczenia aktywności RNazy (Hulst et al 1998). Wprowadzenie mutacji do genomu szczepu CSFV nie wpływa na żywotność wirusa lub charakter wzrostu lecz prowadzi do powstania wirusa wykazującego fenotyp nieznacznie cytopatogenny (Hulst et al 1998).

Dla CSFV i BVDV opracowano i stosuje się obecnie szczepionki obejmujące atenuowane lub zabite wirusy lub białka wirusowe eksprymowane w heterologicznych systemach ekspresyjnych. Podstawy strukturalne atenuacji tych wirusów stosowanych jako żywe szczepionki nie są znane. Stwarza to niebezpieczeństwo powstawania nieprzewidywalnych rewertantów przez mutacje powrotne lub rekombinację po zaszczepieniu.

Z drugiej strony skuteczność szczepionek inaktywowanych lub białek eksprymowanych w układach heterologicznych (szczepionki podjednostkowe) w wywoływaniu zjawiska odporności jest ograniczona.

Ogólnie szczepionki żywe z określonymi mutacjami stanowiącymi podstawę atenuacji powinny uniemożliwiać zaistnienie niekorzystnych zjawisk związanych z obecnie stosowanymi generacjami szczepionek. Nie są dostępne potencjalne miejsca docelowe dla mutacji atenuujących u pestiwirusów.

Kolejną korzyścią z opracowania mutacji atenuujących jest ich molekularna unikalność, dzięki czemu mogą służyć jako znaczniki dla atenuowanych pestiwirusów, pozwalając rozróżnić atenuowane pestiwirusy od pestiwirusów dzikich.

Ze względu na znaczenie związane z opracowaniem efektywnej i bezpiecznej szczepionki, jak również sposobu detekcji i leczenia infekcji pestiwirusowych istnieje potrzeba opracowania żywej

PL 202 509 B1 i w konkretnie atenuowanej szczepionki, o wysokiej zdolnoś ci do wywoł ywania odpowiedzi immunologicznej, jak również o konkretnej podstawie atenuacji, tak by można rozróżnić pestiwirusa atenuowanego od pestiwirusa dzikiego.

Problemem technicznym leżącym u podstaw wynalazku jest dostarczenie określonych atenuowanych i oznaczonych wykrywalnie pestiwirusów do stosowania jako szczepionka żywa, atenuowana, o wysokiej zdolności wywoływania odpowiedzi immunologicznej, jak również w wyniku zastosowania metody rozróżnienia atenuowanych od patogennych pestiwirusów.

Żywa szczepionka zawierająca atenuowany pestiwirus i ewentualnie substancje pomocnicze, według wynalazku charakteryzuje się tym, że pestiwirus ma unieczynnioną aktywność RNazy związaną z glikoproteiną E^RNS w wyniku delecji i/lub mutacji co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny.

Delecje i/lub mutacje umiejscowione są w aminokwasach glikoproteiny w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji dla szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadających im pozycjach w innych szczepach.

Aktywność RNazy jest unieczynnioną przez delecję i/lub mutację umiejscowioną w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji dla szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadających jej pozycjach w innych szczepach, w glikoproteinie.

Korzystnie aktywność RNazy jest unieczynnioną przez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających jej pozycjach w innych szczepach, w glikoproteinie.

Korzystnie aktywność RNazy jest unieczynnioną przez mutację reszty histydynowej w pozycjach 297 i 346 do leucyny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających jej pozycjach w innych szczepach, w glikoproteinie.

Szczepionka według wynalazku ma aktywność RNazy unieczynnioną przez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających jej pozycjach w innych szczepach BVDV, w glikoproteinie.

Szczepionka według wynalazku zawierająca pestiwirus BVDV, której aktywność RNazy jest unieczynnioną przez mutację reszty histydynowej w pozycjach 297 i 346 do leucyny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających jej pozycjach w innych szczepach BVDV, glikoproteinie.

Atenuowany pestiwirus ma aktywność RNazy związaną z glikoproteiną E^RNS, która jest unieczynnioną w wyniku delecji i/lub mutacji co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny, przy czym aktywność RNazy jest unieczynnioną w wyniku delecji i/lub mutacji umiejscowionej na aminokwasach w pozycji 295 do 307 i/lub pozycji 338 do 357 jak przedstawiono przykł adowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających jej pozycjach w innych szczepach, z ograniczeniem, że aminokwasy w pozycji 297 i/lub 346 glikoproteiny nie są lizyną.

Korzystnie pestiwirus ma aktywność RNazy unieczynnioną w wyniku delecji i/lub mutacji aminokwasu w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach.

Pestiwirus ma korzystnie aktywność RNazy unieczynnioną w wyniku delecji reszty histydynowej w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach.

Pestiwirus według wynalazku ma aktywność RNazy unieczynnioną w wyniku mutacji reszty histydyny w pozycjach 297 i 346 glikoproteiny do leucyny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadają cej jej pozycji w innych szczepach.

Pestiwirus według wynalazku jest pestiwirusem BVDV i jego aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku delecji reszty histydyny w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadają cej jej pozycji w innych szczepach BVDV.

Korzystnie pestiwirus BVDV jest pestiwirusem BVDV i jego aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku mutacji reszty histydyny w pozycjach 297 i 346 glikoproteiny do leucyny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach BVDV.

Kwas nukleinowy kodujący glikoproteinę E^RNS, charakteryzuje się tym, że aktywność RNazy związana z glikoproteiną unieczynniana jest w wyniku delecji i/lub mutacji co najmniej jednego amino4

PL 202 509 B1 kwasu glikoproteiny, przy czym aktywność RNazy związana z glikoproteiną unieczynniana jest w wyniku delecji i/lub mutacji aminokwasów w pozycjach od 295 do 307 i/lub od 338 do 357, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, przy założeniu, że aminokwasy w pozycji 297 i/lub 346 nie są lizyną.

Kwas nukleinowy według wynalazku charakteryzuje się tym, że aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku delecji i/lub mutacji aminokwasu w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach.

Korzystnie kwas nukleinowy ma aktywność RNazy unieczynnioną w wyniku delecji reszty histydynowej w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach.

Korzystnie kwas nukleinowy ma aktywność RNazy unieczynnioną wyniku mutacji reszty histydynowej w pozycji 297 do 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, do leucyny.

Kwas nukleinowy jest kwasem nukleinowym BVDV i jego aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku delecji reszty histydynowej w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadają cej jej pozycji w innych szczepach BVDV, w glikoproteinie.

Kwas nukleinowy według wynalazku jest kwasem nukleinowym BVDV i jego aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku mutacji reszty histydynowej w pozycji 297 do 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, do leucyny.

Zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego glikoproteinę E^RNS do wytwarzania szczepionek nukleotydowych i/lub wektorowych stanowi przedmiot wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna zawierająca żywą szczepionkę, zawierającą atenuowany pestiwirus do zapobiegania lub leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt.

Inna kompozycja farmaceutyczna zawierająca atenuowany pestiwirus i ewentualnie dopuszczalne farmaceutycznie substancje pomocnicze przeznaczona jest do zapobiegania lub do leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt.

Natomiast kompozycja farmaceutyczna zawierająca kwas nukleinowy kodujący glikoproteinę E^RNS i ewentualnie dopuszczalne farmaceutycznie substancje pomocnicze jest wykorzystywana do zapobiegania lub do leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt.

Sposób atenuowania pestiwirusa, w którym unieczynnia się aktywność RNazy związanej z glikoprotein ą E^RNS, przy czym aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję i/lub mutacje co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny a delecję i/lub mutacje umiejscowione są w aminokwasach w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadają cych im pozycjach w innych szczepach glikoproteiny, przy czym delecję i/lub mutacje skutkują unieczynnieniem pestiwirusa.

Sposób, w którym aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję i/lub mutację aminokwasu w pozycji 346, jak przedstawiono przykł adowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach glikoproteiny a korzystnie aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach glikoproteiny.

Aktywność RNazy unieczynnia się poprzez mutację reszty histydynowej w pozycjach 297 i 346 do leucyny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach glikoproteiny.

Sposób wykrywalnego oznaczania pestiwirusa obejmuje etap, w którym unieczynnia się aktywność RNazy związaną z glikoproteiną E^RNS poprzez delecję i/lub mutacje co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny, z ograniczeniem, że aminokwasy w pozycji 297 i/lub 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach glikoproteiny, nie są lizyną oraz unieczynnienie aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS skutkuje unieczynnieniem pestiwirusa.

PL 202 509 B1

Delecję i/lub mutacje umiejscawia się w aminokwasach w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach.

Aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję lub mutację aminokwasu w pozycji 346 likoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach.

Korzystnie aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepionki do wytwarzania leku do zapobiegania lub do leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt oraz zastosowanie atenuowanego pestiwirusa do wytwarzania szczepionki do zapobiegania lub do leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt i zastosowanie kwasu nukleinowego kodują cego glikoproteinę E^RNS do wytwarzania szczepionki do zapobiegania lub do leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt.

Sposób rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem, według wynalazku charakteryzuje się tym, że specyficznie atenuowany pestiwirus jest atenuowany zgodnie z opisaną procedurą, przy czym sposób obejmuje etapy, w których:

(1) określa się sekwencję nukleotydową pestiwirusa w próbce uzyskanej od zwierzęcia podejrzewanego o zainfekowanie pestiwirusem lub od zwierzęcia zaszczepionego;

(2) koreluje się delecję i/lub mutacje w sekwencji nukleotydowej E^RNS obecnej w szczepionce ze zwierzęciem zaszczepionym i koreluje się nieobecność delecji i/lub mutacji z infekcją pestiwirusową u zwierzęcia.

Ten sposób rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem, w którym specyficznie atenuowany pestiwirus jest atenuowany zgodnie z procedurą, przy czym sposób obejmuje etapy, w których:

RNS (1) identyfikuje się zmodyfikowaną glikoproteinę E^RNS atenuowanego pestiwirusa przez specyRNS ficzne wiązanie mono- lub poliklonalnego przeciwciała specyficznego względem glikoproteiny E^RNS obecną w próbce uzyskanej od zwierzęcia podejrzewanego o zainfekowanie pestiwirusem lub od zwierzęcia zaszczepionego, gdzie glikoproteiną została zmodyfikowana a mono- lub poliklonalne RNS przeciwciało nie wiąże się z niezmodyfikowaną glikoproteiną E^RNS;

(2) przeprowadza się korelację specyficznego wiązania mono- lub poliklonalnego przeciwciała ze zwierzęciem zaszczepionym i powiązanie braku wiązania przeciwciała ze zwierzęciem zainfekowanym pestiwirusem, przy założeniu, że obecność materiału pestiwirusowego w zwierzęciu i/lub w próbce została ustalona innymi sposobami.

(1) identyfikuje się zmodyfikowaną glikoproteinę E^RNS pestiwirusa przez specyficzne wiązanie mono- lub poliklonalnego przeciwciała do glikoproteiny E^RNS obecnej w próbce uzyskanej od zwierzęcia podejrzewanego o zainfekowanie pestiwirusem lub od zwierzęcia zaszczepionego, gdzie glikoproteiną nie została zmodyfikowana a mono- lub poliklonalne przeciwciała nie wiążą się ze zmodyfikowaną glikoproteiną E^RNS;

(2) przeprowadza się korelację specyficznego wiązania mono- lub poliklonalnego przeciwciała z infekcją pestiwirusową u zwierzęcia i powiązanie nieobecności wiązania przeciwciała ze zwierzęciem zaszczepionym, przy założeniu, że obecność materiału pestiwirusowego w zwierzęciu i/lub w próbce, został a ustalona innymi sposobami.

A ponadto sposób rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem, charakteryzuje się tym, że specyficznie atenuowany pestiwirus jest atenuowany zgodnie z opisaną procedurą, przy czy sposób obejmuje etapy, w których: RNS (1) określa się nieobecność lub obecność aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNSw próbce uzyskanej od zwierzęcia podejrzewanego o zainfekowanie pestiwirusem lub od zwierzęcia zaszczepionego;

PL 202 509 B1 (2) przeprowadza się korelację nieobecności aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNSze zwierzęciem zaszczepionym i powiązanie obecności aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS ze zwierzęciem zainfekowanym pestiwirusem.

Sposób rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem, korzystnie charakteryzuje się też tym, że specyficznie atenuowany pestiwirus jest atenuowany zgodnie z opisaną procedurą, przy czym sposób obejmuje etapy, w których:

(1) identyfikuje się specyficzne wiązanie próbki poliklonalnych przeciwciał do nie zmodyfikowanej glikoproteiny E^RNS w pestiwirusie lub glikoproteiny E^RNS w atenuowanym pestiwirusie zgodnie z opisaną procedurą , przy czym próbkę poliklonalnych przeciwciał uzyskuje się od zwierz ę cia podejrzewanego o zainfekowanie pestiwirusem lub od zwierzęcia zaszczepionego;

(2) przeprowadza się korelację wiązania przeciwciał poliklonalnych z nie zmodyfikowaną glikoproteiną E^RNS w pestiwirusie z infekcją pestiwirusową i powiązanie wiązania przeciwciał poliklonalnych z glikoproteiną E^RNS w pestiwirusie atenuowanym zgodnie z opisaną procedurą ze zwierzę ciem zaszczepionym.

Opis wynalazku

Nieoczekiwanie stwierdzono, iż pestiwirusy można specyficznie atenuować przez inaktywację aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS. Atenuowane pestiwirusy dostarczają obecnie żywych szczepionek o wysokiej immunogeniczności. Zatem, w jednym z aspektów wynalazek dostarcza żywej szczepionki obejmującej pestiwirusa, charakteryzującej się tym, że aktywność RNazy związana z glikoproteiną E^RNS została inaktywowana.

Termin „szczepionka dotyczy kompozycji farmaceutycznej obejmującej co najmniej jeden aktywny immunologicznie składnik indukujący odpowiedź immunologiczną w organizmie zwierzęcia i obejmującej ewentualnie jeden lub więcej dodatkowych składników wzmagających aktywność immunologiczną składnika aktywnego. Szczepionka może dodatkowo obejmować kolejne składniki typowe dla kompozycji farmaceutycznych. Składnik aktywny immunologicznie szczepionki może obejmować żywe organizmy albo w ich naturalnej formie albo organizmy atenuowane, w przypadku tak zwanej zmodyfikowanej żywej szczepionki (modified live vaccine, MLV) lub organizmy inaktywowane odpowiednimi sposobami, w przypadku tak zwanej szczepionki martwej (killed vaccine, KV). W innej postaci składnik aktywny immunologicznie szczepionki może obejmować użyteczne elementy organizmu (szczepionka podjednostkowa; subunit vaccine), w której elementy powstają w wyniku zniszczenia całego organizmu lub hodowli organizmów i oczyszczania prowadzącego aż do powstania pożądanych struktur (struktury) lub poprzez procesy syntezy indukowane właściwą manipulacją użytecznego systemu, na przykład bakteryjnego, ssaka, owadziego lub innego gatunku oraz następującej później izolacji i oczyszczeniu lub poprzez indukowanie procesu syntezy w organizmie zwierzęcia poprzez bezpośrednie wprowadzenie materiału genetycznego z wykorzystaniem użytecznej kompozycji farmaceutycznej (szczepionka polinukleotydowa).

Dodatkowe składniki wzmagające odpowiedź immunologiczną to składniki zwykle określane mianem adjuwantów, takie jak na przykład wodorotlenek glinowy, olej mineralny lub inny olej, lub składniki dodatkowe dodawane do szczepionki lub tworzone przez organizm po indukcji wywołanej przez składniki dodatkowe, takie jak interferony, interleukiny lub czynniki wzrostowe.

„Kompozycja farmaceutyczna zasadniczo składa się z jednego lub więcej składników zdolnych do modyfikowania fizjologicznych np. immunologicznych funkcji organizmu, do którego jest wprowadzana lub organizmu znajdującego się w niej lub na jej powierzchni, w rodzaju (nieograniczająco) antybiotyku lub substancji przeciwpasożytniczej, jak również z innych składników dodanych do niej dla osiągnięcia innych celów, takich jak zmiana cech, sterylność, łatwość podania kompozycji drogą jelitową lub pozajelitową, na przykład doustną, donosową, dożylną, domięśniową, podskórną, śródskórną lub w inny użyteczny sposób, tolerancję po podaniu, kontrolowane uwalnianie.

Szczepionka według wynalazku dotyczy szczepionki, tak jak zdefiniowano to powyżej, gdzie jednym immunologicznie aktywny składnikiem jest pestiwirus lub składnik pochodzący z pestiwirusa.

Termin „żywa szczepionka dotyczy szczepionki obejmującej żywy, w szczególności żywy, aktywny składnik wirusowy.

Termin „pestiwirus stosowany tu dotyczy wszystkich pestiwirusów, charakteryzujących się przynależnością do tego samego rodzaju, jak BVDV, CSFV i BDV należące do rodziny Flaviviridae oraz charakteryzujący się ekspresją glikoproteiny E^RNS. Oczywiście termin ten odnosi się do wszystkich pestiwirusów, tak jak scharakteryzowali je Becher i wsp (1995) lub do innych wirusów eksprymuPL 202 509 B1 jących glikoproteiny E^RNS. Termin „aktywność RNazy stosowany tu dotyczy zdolności glikoproteiny E^RNS do hydrolizowania RNA.

Należy zauważyć, iż termin glikoproteiną EO jest często stosowanym w publikacjach synoniRNS mem glikoproteiny E^RNS.

Termin „inaktywacja aktywności RNazy związanej z glikoproteiną dotyczy niezdolności lub ograniczonej zdolności zmodyfikowanej glikoproteiny E^RNS do hydrolizowania RNA, w porównaniu z niezmodyfikowaną glikoproteiną E^RNS typu dzikiego.

Inaktywację aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS można uzyskać przez delecję i/lub mutacje co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny, jak to przedstawiono poniżej oraz przez Hulsta i wsp (1998). Zatem w korzystnym zastosowaniu wynalazek dostarcza żywą szczepionkę, w której aktywność RNazy została inaktywowana poprzez delecję i/lub mutacje co najmniej jednej reszty aminokwasowej w glikoproteinie.

Wykazano, że glikoproteina E^RNS tworzy homodimer związany mostkiem dwusiarczkowym o wielkości około 97 kD, w którym każdy monomer składa się z 227 aminokwasów odpowiadających aminokwasom od pozycji 268 do 494 polibiałka CSFV, tak jak przedstawił to Rumenapf i wsp (1993). Pierwszych 495 aminokwasów w postaci ulegającej ekspresji w szczepie Alfort CSFV przedstawia Fig. 1 (informacje tę jedynie zacytowano). Sekwencja genomowa szczepu Alfort CSFV jest osiągalna w bazie danych GeneBank/EMBL pod numerem JO4358, alternatywnie sekwencja aminokwasowa szczepu CP7 BVDV dostępna jest w bazie danych GeneBank/EMBL pod numerem U63479. Dwa regiony aminokwasowe są wysoce konserwowane ewolucyjnie w obrębie glikoproteiny E^RNS, podobnie jak ma to miejsce w niektórych grzybowych i roślinnych białkach o aktywności RNaz (Schneider i wsp, 1993). Oba regiony mają istotne znaczenie dla aktywności enzymatycznej RNazy. Pierwszy region obejmuje pozycje aminokwasowe 295 - 307 a drugi region obejmuje pozycje aminokwasowe 338 - 357 polibiałka, tak jak przedstawia to Fig. 1 dla szczepu Alfort CSFV (numery odnoszą się do opublikowanej, wydedukowanej sekwencji aminokwasowej CSFV szczepu Alfort, wg. Meyersa i wsp 1989). Aminokwasy szczególnie istotne dla aktywności RNazy nie są w żadnej mierze ograniczone do dokładnych pozycji zdefiniowanych dla szczepu Alfort CSFV, lecz podane są jedynie dla przykładu w celu wskazania preferowanych aminokwasów, należących do obszaru wskazanego lub mu odpowiadającego w BVDV, BVD i ogólnie w pestiwirusach, o ile są one wysoce konserwatywne. Dla pestiwirusów innych niż CSFV szczepu Alfort konkretne pozycje aminokwasowe korzystnych aminokwasów mogą być inne, lecz dla eksperta w biologii molekularnej pestiwirusów łatwe jest zidentyfikowanie tych konkretnych aminokwasów, z uwagi na ich względne położenie wobec wysoce konserwowanych aminokwasów glikoproteiny. W jednym, szczególnym przykładzie, pozycja 346 dla szczepu Alfort odpowiada pozycji 349 w BVDV szczepu cp7.

W rezultacie w preferowanym zastosowaniu szczepionki według wynalazku, gdzie delecję i/lub mutacje inaktywujące umieszczone są w rejonie od pozycji 295 do 307 i/lub pozycji 338 do 357, jak przedstawia to Figura 1 dla szczepu Alfort CSFV przykładowo lub w pozycjach im odpowiadających w innych szczepach pestiwirusów.

W szczególnie korzystnym zastosowaniu wynalazek ujawnia iż inaktywacja aktywnoś ci RNazy przez delecję lub mutacje aminokwasu w pozycji 346 glikoproteiny dają szczególnie użyteczną żywą szczepionkę. Zatem wynalazek dotyczy szczepionki, w której aktywność RNazy jest unieczynnioną przez delecję lub mutację aminokwasu w pozycji 346 w glikoproteinie, jak przykładowo przedstawia to Fig. 1 dla szczepu CSFV Alfort lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

Wynalazek pokazuje iż pestiwirusy są zdolne do życia i że wytwarzają białko E^RNS pozbawione aktywności RNazy, gdy reszta histydynowa w pozycji 346 polibiałka wirusowego (pozycje według opublikowanej sekwencji CSFV szczepu Alfort/Tubingen (Meyers i wsp 1989), która to reszta jest jedną z reszt przypuszczalnego miejsca aktywnego RNazy E^RNS zostanie usunięta. Wykazano również w wynalazku, że delecja odpowiadają cej jej reszty histydynowej w biał ku E^RNS pestiwirusa BVD (pozycja 349, pozycja według sekwencji BVDV CP7, z GeneBank (U63479) prowadzi do powstania białka E^RNS pozbawionego aktywności RNazy. W odróżnieniu od mutacji punktowych zmieniających jeden aminokwas w drugi, mutant delecyjny jest dużo bardziej stabilny i nie ulega łatwo rewersji. Zainfekowanie świń mutantem patogennego wirusa CSFV Alfort/Tubingen eksprymującego E^RNS z delecją nie prowadzi do rozwoju cholery czy innych typowych objawów infekcji, charakterystycznych dla infekcji wirusem typu dzikiego: gorączki, biegunki, anoreksji, apatii, zmniejszenia ilości komórek B oraz reakcji ze strony układu nerwowego. Świnie w stanie agonalnym, wykazujące poważne krwotoki skórne i z organów wewnętrznych, zostały zabite 14 dni po podaniu wirusa. Świnie zainfekowane zmutowanym

PL 202 509 B1 wirusem nie wykazywały wiremii ani zmniejszenia ilości komórek B: 3, 5, 7, 10 i 14 dni po infekcji, podczas gdy można było łatwo wyizolować CSFV z krwi pochodzącej od świń zainfekowanych wirusem typu dzikiego. Mutant delecyjny ulegał replikacji w zwierzętach, co wykazało powstanie przeciwciał neutralizujących (Przykład 3, Tabela 3c). Odpowiedź immunologiczna wobec zmutowanego wirusa była wystarczająca do przeżycia letalnej dawki prowokującej o wartości 2 x 10⁵ TCID50 wysoce patogennego szczepu CSFV Eystrup (Konig, 1994), będącego wirusem heterologicznym względem szczepu Alfort. Ponadto testowane zwierzęta nie wykazywały typowych klinicznych oznak infekcji CSFV, takich jak gorączka, biegunka, wylewy krwi, zmniejszenie ilości komórek B czy anoreksji po infekcji prowokującej tym szczepem. Wskazuje to, że infekcja świń mutantem delecyjnym indukuje odpowiedź immunologiczną wystarczającą do ochrony zwierzęcia przed bardziej patogennym szczepem.

Zatem w najbardziej korzystnym zastosowaniu wynalazek dotyczy szczepionek, w których aktywność RNazy glikoproteiny ulega inaktywacji poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono to na Fig. 1 dla CSFV szczepu Alfort lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

W kolejnym najbardziej korzystnym zastosowaniu wynalazek dotyczy szczepionek przeciw BVDV według wynalazku, w których aktywność RNazy glikoproteiny ulega inaktywacji poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono to na Figurze 1 dla CSFV szczepu Alfort, przykładowo lub w odpowiedniej pozycji innych niż BVDV szczepów.

W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza atenuowanych pestiwirusów, w których aktywno ść

RNazy związana z glikoproteiną E^RNS jest inaktywowana poprzez delecję i/lub mutacje co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny, przy założeniu, że aminokwasy w pozycjach 297 i/lub 346 glikoproteiny jak przedstawia do dla CSFV Figura 1, nie są lizyną. Zrekombinowane pestiwirusy, w których aminokwasy w pozycji 297 i/lub 346 glikoproteiny są lizyną opisał Hulst i wsp w 1998. Te szczególne pestiwirusy wykazują efekt cytopatyczny w komórkach nerki świni. Do tej pory nie wiedziano nic RNS o zaskakującej i innowacyjnej cesze atenuacji poprzez inaktywację enzymatycznej aktywności E^RNS.

W korzystnym zastosowaniu, z wymienionych przyczyn szczepionki według wynalazku dotyczą również pestiwirusów, w których aktywność RNazy glikoproteiny inaktywowana jest poprzez delecję i/lub mutacje dotyczące aminokwasów w pozycjach 295 - 307 i/lub 338 - 357, jak przedstawia to Figura 1 dla szczepu CSFV Alfort, przykładowo lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

W bardziej korzystnym zastosowaniu wynalazku szczepionki wedł ug wynalazku dotyczą również pestiwirusów, w których aktywność RNazy glikoproteiny inaktywowana jest poprzez delecję i/lub mutacje dotyczące aminokwasów w pozycji 346, jak przedstawia to Figura 1 dla szczepu CSFV Alfort, przykładowo lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

W najkorzystniejszym zastosowaniu, szczepionki wedł ug wynalazku dotyczą również pestiwirusów, w których aktywność RNazy glikoproteiny inaktywowana jest poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawia to Figura 1 dla szczepu CSFV Alfort, przykł adowo lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

W kolejnym, najkorzystniejszym zastosowaniu, wynalazek dotyczy pestiwirusów BVDV, w których aktywność RNazy glikoproteiny inaktywowana jest poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawia to Figura 1 dla szczepu CSFV Alfort, przykładowo lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów BVDV.

Atenuowane pestiwirusy i aktywne składniki szczepionek według wynalazku mogą być łatwo przygotowane technikami rekombinacji i modyfikacji genetycznej, prowadzącymi do ekspresji zmutowanej sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E^RNS. Zatem, kolejny aspekt wynalazku dotyczy kwasów nukleinowych kodujących glikoproteinę E^RNS, w której aktywność RNazy związana z nią została unieczynnioną poprzez delecję i/lub mutacje co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny z zastrzeżeniem, że aminokwasy w pozycjach 297 i/lub 346 glikoproteiny, jak ją przedstawiono na Figurze 1 dla szczepu CSFV Alfort, nie są lizynami.

W korzystnym zastosowaniu wynalazek dotyczy szczepionek, kwasów nukleinowych według wynalazku, charakteryzujących się tym, że aktywność RNazy glikoproteiny inaktywowana jest poprzez delecję i/lub mutacje aminokwasów w pozycji 295 - 307 i/lub 338 - 257, jak przedstawiono to na Figurze 1 dla CSFV szczepu Alfort, przykładowo lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

W kolejnym, bardziej korzystnym zastosowaniu wynalazek dotyczy, z powodów podanych powyżej dla szczepionek, kwasów nukleinowych według wynalazku, charakteryzujących się tym, że aktywność RNazy glikoproteiny inaktywowana jest poprzez delecję i/lub mutację aminokwasu w 346, jak przedstawiono to na Figurze 1 dla CSFV szczepu Alfort, przykładowo lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

PL 202 509 B1

W najkorzystniejszym zastosowaniu wynalazek dotyczy kwasów nukleinowych, charakteryzują cych się tym, że aktywność RNazy glikoproteiny inaktywowana jest poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono to na Figurze 1 dla CSFV szczepu Alfort, przykładowo lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

W kolejnym najkorzystniejszym zastosowaniu kwasów nukleinowych BVDV według wynalazku, charakteryzujących się tym, że aktywność RNazy glikoproteiny inaktywowana jest poprzez delecję rety histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono to na Figurze 1 dla CSFV szczepu Alfort, przykładowo lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów BVDV.

Nukleotydy, np. DNA lub RNA są również użyteczne do przygotowania szczepionek DNA, RNA i/lub szczepionek wektorowych. W szczepionkach tych nukleotydy są podawane bezpośrednio do organizmu zwierzęcia lub pośrednio poprzez wektory inne niż wyjściowe wirusy. Szczepionki nukleotydowe i szczepionki wektorowe są dobrze znane specjalistom.

W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy uż ycia kwasów nukleinowych według wynalazku do przygotowania szczepionek nukleotydowych i/lub wektorowych.

Szczepionki, atenuowane pestiwirusy, i/lub kwasy nukleinowe według wynalazku są szczególnie użyteczne do przygotowania kompozycji farmaceutycznej.

W rezultacie kolejny aspekt wynalazku dotyczy kompozycji farmaceutycznych obejmujących szczepionkę według wynalazku, i/lub pestiwirusy według wynalazku, i/lub sekwencje nukleotydowe według wynalazku. W jednym, nie ograniczającym przykładzie takiej kompozycji farmaceutycznej, podanym wyłącznie dla ilustracji, kompozycja farmaceutyczna może być przygotowana jak następuje:

supernatant z hodowli komórkowej zainfekowanych komórek mieszany jest ze stabilizatorem (np.

spermidyną i/lub BSA) i mieszanina jest następnie liofilizowana lub odwadniana innymi metodami.

Przed zaszczepieniem mieszanina jest uwadniana do roztworu wodnego (np. sól fizjologiczna, PBS) lub roztworu nie wodnego (np. emulsja olejowa, adjuwant oparty na wodorotlenku glinu).

W dodatkowym aspekcie wynalazek dotyczy metody atenuowania pestiwirusów, unikalnej i nieRNS oczekiwanej metody, poprzez inaktywację aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS.

Tak atenuowane pestiwirusy są szczególnie użyteczne do przygotowania szczepionek.

Unieczynnienie aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS dostarcza zaskakującej i nowej metody wykrywalnego znakowania pestiwirusów.

W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza metody wykrywalnego znakowania pestiwirusów charakteryzujących się tym, że aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS jest zinaktywowana.

Cecha braku aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS pestiwirusów według wynalazku umożRNS liwia wykrywalne znakowanie pestiwirusów. Oznaczone lub nieoznaczone pestiwirusy lub E^RNS wydzielana z komórek zainfekowanych pestiwirusami w płynach ciała mogą być łatwo rozróżnione przez

RNS obecność lub braku obecności aktywności glikoproteiny E^RNS.

RNS

W przypadku pestiwirusów z unieczynnioną aktywnością RNazy związanej z glikoproteiną E^RNSpoprzez delecję i/lub mutacje, można zastosować szereg innych technik. Tego typu pestiwirusy można łatwo wykryć ze względu na strukturalne konsekwencje delecji i/lub mutacji. Na przykład różnica sekwencji kwasu nukleinowego kodującego zmienioną glikoproteinę E^RNS można wykryć stosując sekwencjonowanie kwasu nukleinowego lub technikę PCR, jak wykazano to w przykładzie 8; zmienioną sekwencje białka można wykryć stosując specyficzne przeciwciała monoklonalne, które nie rozpoznają niezmienionego białka. Możliwe jest również wykrywanie zmienionych, a zatem oznaczonych strukturalnie białek, ze względu na brak wiązania specyficznych przeciwciał monoklonalnych rozpoznających niezmienioną glikoproteinę E^RNS przy założeniu, że obecność pestiwirusów można ustalić inaczej. Oczywiście, delecję i/lub mutacje uszkadzające aktywność RNazy w oznaczonych tym samych wirusach, prowadzą do różnej odpowiedzi immunologicznej w organizmach zwierząt, w porównaniu z odpowiedzią na infekcję pestiwirusami nieoznaczonymi.

Wynalazek dotyczy szczepionek i/lub innych kompozycji farmaceutycznych szczególnie użytecznych dla zapobiegania i leczenia infekcji pestiwirusowych zwierząt. Zatem, kolejny aspekt wynalazku dotyczy sposobów profilaktyki i leczenia infekcji pestiwirusowych zwierząt, polegających na tym, że szczepionka według wynalazku lub inna kompozycja farmaceutyczna według wynalazku podawana jest zwierzęciu potrzebującemu tego typu profilaktyki lub leczenia.

Szczepionki lub inne kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są użyteczne w zapobieganiu i leczeniu infekcji pestiwirusowych u zwierząt. Zatem w jednym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wykorzystania szczepionki według wynalazku do zapobiegania i leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt. W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza dostarcza sposobu wykorzystania

PL 202 509 B1 kompozycji farmaceutycznej według wynalazku do zapobiegania i leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt.

Pestiwirusy i/lub kwasy nukleinowe według wynalazku są użytecznymi czynnikami aktywnymi kompozycji farmaceutycznej lub szczepionki. Zatem w kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu użycia pestiwirusa i/lub kwasu nukleinowego według wynalazku do przygotowania szczepionki lub kompozycji farmaceutycznej.

Jak wspomniano, inaktywacja aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS dostarcza nieoczekiwanej i nowej metody oznaczania pestiwirusów.

W konsekwencji w jednym aspekcie wynalazek dostarcza sposobów rozróżniania wyznakowanych w sposób wykrywalny pestiwirusów według wynalazku od niewyznakowanych i przypuszczalnie patogennych pestiwirusów. Sposoby takie są szczególnie użyteczne do śledzenia skuteczności wyznakowanych pestiwirusów w organizmie zwierząt. Zwierzęta leczone szczepionką mogą być wykrywane na podstawie obecności wyznakowanych pestiwirusów, po uzyskaniu próbki tkanki takich zwierząt i przeprowadzeniu testu na znacznik. Nie zawierające znacznika zwierzęta, a w szczególności zwierzęta nie zawierające znacznika lecz zawierające pestiwirusa, można łatwo oddzielić, izolować lub zabić, w celu uniemożliwienia rozprzestrzeniania się patogennej infekcji na inne zwierzęta.

Wynalazek dostarcza sposobu wyznakowania w sposób wykrywalny pestiwirusów charakteryzujących się unieczynnieniem aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS. Cecha nieobecności aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS pestiwirusów według wynalazku umożliwia wyznakowania w sposób wykrywalny pestiwirusów. W wyniku tego wyznakowane i niewyznakowane pestiwirusy można łatwo rozróżnić ze względu na cechę obecności lub nieobecności aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS po izolacji i przetestowaniu ich aktywności enzymatycznej. Określenie obecności lub nieobecności aktywności enzymatycznej po uzyskaniu próbki zawierającej pestiwirusa można prowadzić standardowymi metodami np. opisanymi w Przykładzie 2 lub przez Hulsta i wsp (1994).

Zatem korzystne zastosowanie wynalazku dostarcza sposobu rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem według wynalazku, obejmującego następujące etapy:

(1) Uzyskanie próbki od zwierzęcia podejrzewanego o zainfekowanie pestiwirusem lub od zwierzęcia zaszczepionego;

RNS (2) Określenie obecności lub nieobecności aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS we wspomnianej próbce;

RNS (3) Powiązanie nieobecności aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS ze zwierzęciem zaszczepionym i powiązanie obecności wspomnianej aktywności ze zwierzęciem zainfekowanym pestiwirusem.

Wynalazek dostarcza pestiwirusów z unieczynnioną aktywnością RNazy związaną z glikoproteiną E^RNS w wyniku delecji i/lub mutacji. Pestiwirusy takie łatwo wykryć ze względu na strukturalne konRNS sekwencje delecji i/lub mutacji. Różnice sekwencji genu kodującego zmienioną glikoproteinę E^RNSłatwo wykryć przez sekwencjonowanie lub techniką PCR. W wyniku tego wynalazek dostarcza w korzystnym zastosowaniu sposobu rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem według wynalazku, obejmującego następujące etapy:

(2) Określenie sekwencji nukleotydowej genomu pestiwirusa lub białka we wspomnianej próbce; RNS (3) Powiązanie delecji i/lub mutacji w genie kodującym glikoproteinę E^RNS ze zwierzęciem zaszczepionym i powiązanie nieobecności delecji i/lub mutacji ze zwierzęciem zainfekowanym pestiwirusem.

RNS

Ponadto zmiany strukturalne wynikające ze zmiany sekwencji białka glikoproteiny E^RNS pestiwirusa według wynalazku można wykryć specyficznymi mino- lub poliklonalnymi przeciwciałami, nie rozpoznającymi nie zmienionego białka.

Zatem w kolejnym zastosowaniu wynalazek dostarcza sposobu rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem według wynalazku, obejmującego następujące etapy:

(2) Określenie zmodyfikowanej glikoproteiny E^RNS atenuowanego pestiwirusa przez specyficzne wiązanie mono- lub poliklonalnego przeciwciała specyficznego względem glikoproteiny E^RNS obecnej

PL 202 509 B1 w próbce, gdy glikoproteiną został a zmodyfikowana sposobem wedł ug wynalazku, gdy mono- lub RNS poliklonalnego przeciwciała nie wiążą się z niezmodyfikowaną glikoproteiną E^RNS;

(3) Powiązanie specyficznego wiązania mono- lub poliklonalnego przeciwciała ze zwierzęciem zaszczepionym i powiązanie niemożność wiązania przeciwciała ze zwierzęciem zainfekowanym pestiwirusem, przy założeniu, że obecność materiału pestiwirusowego w zwierzęciu i/lub próbce została ustalona innymi metodami.

Z drugiej strony moż liwe jest wykrycie strukturalne wyznakowanych białek przez niemożność wiązania specyficznego przeciwciała mono- lub poliklonalnego rozpoznającego niezmienioną glikoproteinę E^RNS, gdy tylko obecność pestiwirusa została ustalona innym sposobem. Zatem w kolejnym korzystnym zastosowaniu wynalazek dostarcza sposobu rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem według wynalazku, obejmującego następujące etapy:

(2) Określenie niemodyfikowanej glikoproteiny E^RNS pestiwirusa przez specyficzne wiązanie mono- lub poliklonalnego przeciwciała specyficznego względem glikoproteiny E^RNS obecnej w próbce, gdy glikoproteiną nie została zmodyfikowana sposobem według wynalazku, gdy mono-lub poliklonalRNS nego przeciwciała nie wiążą się ze zmodyfikowaną glikoproteiną E^RNS;

(3) Powiązanie specyficznego wiązania mono- lub poliklonalnego przeciwciała ze zwierzęciem zainfekowanym pestiwirusem i powiązanie nieobecności wiązania przeciwciała ze zwierzęciem zaszczepionym, przy założeniu że obecność materiału pestiwirusowego w zwierzęciu i/lub próbce została ustalona innymi metodami.

Oczywiście modyfikacje strukturalne i nieobecność aktywności RNazy w wyznakowanych wirusach według wynalazku prowadzi do odmiennej odpowiedzi immunologicznej u zwierząt, w porównaniu z odpowiedzią na infekcje niewyznakowanymi pestiwirusami. Pestiwirusy według wynalazku wywołują różną i odrębną odpowiedź immunologiczną, zarówno komórkową, jak humoralną, która różni je RNS od niezmodyfikowanych i przypuszczalnie patogennych pestiwirusów. Na przykład glikoproteiną E^RNSwedług wynalazku prowadzi do powstania poliklonalnych przeciwciał różniących się specyficznością wiązania w porównaniu z poliklonalnymi przeciwciałami powstającymi w wyniku podania niezmodyfikowanej glikoproteiny. Ta różnica w specyficzności wiązania dostarcza znacznika do rozróżniania zwierząt zaszczepionych pestiwirusem według wynalazku od zwierząt zaszczepionych pestiwirusem typu dzikiego. Testy wykrywające serotypy specyficznych przeciwciał poliklonalnych, które albo wiążą się z epitopem typu dzikiego lub epitopem wyznakowanym mutacją delecyjną dla celu rozróżnienia zwierząt zainfekowanych od zaszczepionych opisano np. dla świń zainfekowanych i zaszczepionych wirusem choroby Aujeszkyego (Kit i wsp 1991).

W korzystnym zastosowaniu wynalazek dostarcza sposobu rozróż niania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem według wynalazku, obejmującego następujące etapy:

(2) Określenie dowolnego specyficznego wiązania wspomnianego przeciwciała poliklonalnego RNS RNS względem niezmodyfikowanej glikoproteiny E^RNS lub zmodyfikowanej glikoproteiny E^RNS według wynalazku;

(3) Powiązanie specyficznego wiązania przeciwciał poliklonalnych względem niezmodyfikowanej glikoproteiny E^RNS ze zwierzęciem zainfekowanym pestiwirusem i powiązanie wiązania przeciwciała poliklonalnego do zmodyfikowanej glikoproteiny E^RNS ze zwierzęciem zaszczepionym według wynalazku.

Odnośniki

1. Baker JC 1987 Bovine viral diarrhea virus: a review. J Am Vet Med Assoc 190: 1449-1458.

2. Bewcher P, Konig M, Paton DJ, Thiel 1995 Further characterization of border disease virus isolates: evidence for the presence of more than three species within the genus pestivirus. Virology 209(1): 200 - 206

3. Donis RO, Corapi W, Dubovi EJ 1988 Neutralizing monoclonal antibodies to bovine viral diarrhea virus bind to the 56k to 58k glycoprotein. J Gen Virol 69: 77 - 86.

4. Fuerst TR i wsp 1986 Eucariotic transient expression system based on recombinant vaccine virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase. PNAS 83: 8122 - 8126.

5. Hulst MM, Himes G, Newbigin E, Moormann RJM 1994 Glycoprotein E2 of the classical swine fever virus: expression in insect cells and identification as a ribonuclease. Virology 200: 558 - 565.

PL 202 509 B1

6. Hulst MM, Panoto A, Hooekmann HGP, van Gennip, Moormann RJM 1998 Inactivation of the RNase activity of glycoprotein Erns of classical swine fever virus results in cytopathogenic virus. J Virol 72: 151 - 157.

7. Kit M, Kit S 1991Sensitive glycoprotein gIII blocking ELISA to distinguish between pseudorabies (Aujeszky's disease) infected and vaccinated pigs. Veterinary Microbiol 28: 141 - 155.

8. Kunkel TA, Roberts JD, Zakour RA 1987 Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Methods Enzymol 154: 367 - 392.

9. Konig, Matthias 1994 Virus der klassischen Schweinepest: untersuchungen zur pathogenese und zur induktion eine protektiven immunantwort. Dissertation Tierarztliche Hochschule Hannover, Niemcy.

10. Meyers G, Rumenapf T, Thiel H-J 1989 Molecular cloning and nucleotide sequence of hog cholera virus. Virology 171: 555 - 567.

11. Meyers G, Tautz N, Becher P, Thiel H-J, Kummerer BM 1996b Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral diarrhea viruses from cDNA constructs. J Virol 70: 8606 - 8613.

12. Meyers G, Thiel H-J, Rumenapf T 1996a Classical swine fever virus. Recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. J Virol 67: 7088 - 709526.

13. Moennig V, Plaggemann J 1992 The pestiviruses Adv Virus Res 41: 53-91.

14. Paton DJ, Lowings JP, Barrett AD 1992 Epitop mapping of the gp53 envelope protein of bovine viral diarrhea virus. Virology 190: 763 - 772.

15. Pellerin C i wsp Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains with severe outbreaks and high mortalities. Virology 203: 1994: 260 - 268.

16. Rice CM 1996 The Pestiviruses. In Fields Virology. wyd. Fields BN, Knipe DM, Howley PM Philadelphia str 931 - 959.

17. Rumenapf T, Unger G, Strauss JH, Thiel J-H 1993 Processing of the envelope glycoproteins of pestiviruses. J Virol 67: 3288-3294.

18. Schneider RG, Unger R, Stark E, Schneider-Scherzer E, Thiel H-J 1993 Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169 - 1171.

19. Thiel H-J, Plagemann GW, Moennig V 1996 The pestiviruses. In Fields Virology. wyd. Fields BN, Knipe DM, Howley PM Philadelphia str 1059 - 73.

20. Thiel H-J, Stark R, Weiland E, Rumenapf T, Meyers G 1991 Hog cholera virus: molecular composition of virions from pestivirus. J Virol 65: 4705 - 4712.31.

21. van Rijn PA, van Gennip HG, de Meijer EJ, Moormann RJ 1993 Epitope mapping of envelope glycoprotein of hog cholera virus strain Brescia. J Gen Virol 74: 2053 - 2060.

22. Weiland E, Thiel H-J, Hess G, Weiland F 1989 Development of monoclonal neutralizing antibodies against bovine viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normal bovine cells and cyclophosphamide. J Virol Methods 24: 237 - 244.

23. Weiland E, Stark R, Haas B, Rumenapf T, Meyers G, Thiel H-J 1990 Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer. J Virol 64: 3563 - 3569.

24. Weiland E, Ahl R, Stark R, Weiland F, Thiel H-J 1992 A second envelope glycoprotein mediates neutralization of pestivirus, hog cholera virus. J Virol 66: 3677 - 3682.

25. Windisch JM, Schneider R, Stark R, Weiland E, Meyers G, Thiel H-J 1996 RNase of classical swine fever virus: biochemical characterization and inhibition by virus-neutralizing monoclonal antibodies. J Virol 70: 352 - 358.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Tworzenie mutantów RNazo-ujemnych pestiwirusów

Rozpoczynając procedurę z pełnej długości klonów cDNA pA/CSFV (Meyers i wsp 1996a) lub pA/BVDV (Meyers i wsp 1996b), z których otrzymać można infekcyjny cRNA techniką transkrypcji in vitro, uzyskano subklony. W przypadku CSFV, fragment XhoI/SspI plazmidu pA/CSFV sklonowano w plazmidzie pBluescript SK⁺ przecię tym XhoI i Smal. W przypadku BVDV fragment XhoI/BglII z plazmidu pA/BVDV sklonowano w plazmidzie pCITE-2C przeciętym tymi samymi enzymami. Jednoniciowy plazmidowy DNA uzyskano z plazmidów metodą Kunkela (Kunkel i wsp 1987) stosując E. coli szczep CJ236 (BioRad) i jednoniciowego faga VCMS (Stratagene). Jednoniciowy DNA przekształcono w DNA dwuniciowy stosują c Phagemid In Vitro Mutagenesis Kit (BioRad). Niektóre z syntetycznych

PL 202 509 B1 oligonukleotydów stosowanych jako startery do utworzenia pożądanych, zmutowanych pestiwirusów przedstawiono poniżej dla przykładu:

C-297-L: AGGAGCTTACTTGGGATCTG

C-346-L: GGAACAAACTTGGATGGTGT

C-297-K: ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC

C-346-K: ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA

C-346-d: GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC

B-346-d: CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAACTGG

Dwuniciowy plazmidowy DNA stosowano do transformacji komórek E.coli szczepu XL 1-Blue (Stratagene). Kolonie bakteryjne niosące plazmid izolowano poprzez selekcję ampicilinową. Plazmidowy DNA izolowano i dalej analizowano stosując technikę sekwencjonowania z polimerazą faga T7 (Sequenase, Pharmacia). Plazmidy zawierające pożądane mutacje, bez dodatkowych zmian sekwencji stosowano do konstruowania pełnej długości klonów cDNA. W przypadku CSFV, fragment XhoI/NdeI ze zmutagenizowanego plazmidu wstawiano wraz z fragmentem Ndel/BgIII pochodzącym z plazmidu 578 (pCITE 2A, zawierającym fragment XhoI/BglII z pA/CSFV) do plazmidu pA/CSFV przeciętego XhoI i Bglll. W celu uzyskania mutanta BVDV CP7, fragment XhoI/BglII wyizolowany z plazmidu pA/BVDV przeciętego XhoI i Ncol wraz z fragmentem Bglll/Ncol wyizolowanym z plazmidu pA/BVDV/Ins-. Z kostruktu pA/BVDV/Ins- transkrybowano w użytecznych komórkach cRNA dający niecytopatogenny wirus BVDV (Meyers i wsp 1996b). Różne klony o pełnej długości następnie amplifikowano i izolowano plazmidy. Po linearyzacji enzymem Srfl (klon CSFV pełnej długości) lub Smal (klon BVDV pełnej długości) cRNA transkrybowano jak poprzednio (Meyers i wsp 1996b). RNA oczyszczano przez filtrację żelową i ekstrakcję fenolem/chloroformem i stosowano do transfekcji świńskich komórek nerki (PK15) lub bydlęcej nerki (MDBK, klon B2) (odpowiednio konstruktami CSFV lub BVDV). Transfektanty analizowano immunofluorescencyjnie stosując przeciwciała specyficzne względem wirusa. W przypadku uzyskania pożądanej mutacji (pozytywny sygnał immunofluorescencyjny), mutanty odzyskiwano, amplifikując wirusy przez pasażowanie w tych samych komórkach, które stosowano do transfekcji. Dalsza analiza mutantów CSFV obejmowała określanie krzywych wzrostu i charakterystykę wirusowego RNA techniką Northerna z sondami cDNA specyficznymi względem wirusa, jak również odwrotna transkrypcję i PCR (RT-PCR) oraz bezpośrednie sekwencjonowanie amplikonów w celu potwierdzenia obecności mutacji. We wszystkich przypadkach potwierdzono obecność pożądanej mutacji w wirusowym genomie. Wszystkie wirusy wzrastały jednakowo dobrze i produkowały podobne ilości RNA, takie jak wirusy uzyskane z plazmidów niosących sekwencje typu dzikiego.

Żywotność mutantów BVDV wykazano przez transfekcję odpowiednich cRNA i podział grupy transfekowanych komórek 3 dni później.

Część komórek wysiano na szalkę o średnicy 3.5 cm, utrwalono mieszaniną acetonu i metanolu dzień później i analizowano immunofluorescencyjnie stosując mieszaninę przeciwciał monoklonalnych specyficznych wobec BVDV (Wieland i wsp 1989). Wszystkie komórki okazały się być dodatnie w tym teście, podczas gdy kontrola, w postaci komórek transfekowanych nieinfekcyjnym RNA nie wykazywała sygnału.

Z części komórek transfekowanych odpowiednim cRNA, uzyskiwano ekstrakt stosując jeden cykl zamrażania i rozmrażania. Świeże komórki infekowane tym ekstraktem okazywały się BVDV pozytywne w teście immunofluorescencyjnym z użyciem przeciwciał specyficznych wobec BVDV, w trzy dni po infekcji.

Tabela 1 zbiera dane o różnych zmianach wprowadzonych do konserwowanej sekwencji aminokwasowe j E^RNS, reprezentującej przypuszczalne miejsce aktywne RNazy kodowanej przez wskazane mutanty wirusowe.

Opis do tabeli 1: Test na obecność RNazy wykonywano w postaci testu transfekcji przejściowej.

Komórki BHK21 infekowano wirusem Vaccina vTF7-3 (Fuerst i wsp 1986) a następnie transf ekowano odpowiednimi konstruktami cDNA (5 μg plazmidowego DNA, transfekcje dokonywano stosując Superfect, zgodnie ze wskazaniami producenta, Qiagene). Po 10 godzinach inkubacji w 37°C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla, transfekowane komórki lizowano i procesowano w celu określenia aktywności RNazy, jak przedstawiono to poniżej. Żywotność określano tak, jak to przedstawiono poniżej.

PL 202 509 B1

Tabela 1

Nazwa	w .. i · nxi a Aktywność Żywotność Motyw sekwencu RN Azy ' , ^J RNAzy mutanta
pA/CSFV ..	.SLHGIWPEKIC. ..	...RHEWNKHGWCNW.. +	+
C-297-L ..	.SLLGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW.. -	+
C-346-L . .	.SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKLGWCNW.. -	+
r> i m te i	o i i r* » »a/ o c t/ i c . o l l ϋ i w r c r\ ι υ. . .	D LI C lAf kl 1/ 1 r> \Kt Γ> KI lAf . . . Γ\ Π U W IN r\ U W V* IM w . . -
C-297-K ..	.SLKGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW.. -	+
C-346-K ,.	.SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKKGWCNW.. -	+
C-297-d ..	. S L_G 1W Ρ E K1 C...	...RHEWNKHGWCNW.. -	-
C-346-d ..	.SLHGIWPEKIC...	...RHEWNK.GWCNW. . -	+
C-296/7/8-d ..	.S___IWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW.. -	-
C-345/6/7-d ..	.SLHGIWPEKIC...	...RHEWN___WCNW .. -	-
C-345/6-d ,.	.SLHGIWPEKIC...	...RHEWN__GWCNW.. -	-
C-346/7-d ..	.SLHGIWPEKIC...	...RHEWNK _ _WCNW.. -	•
C-342-d ..	.SLHGIWPEKIC...	... R H _ W Ν K H G W C N W .. -	-
C-342/6-d ..	.SLHGIWPEKIC...	... RH_ W Ν K _G W CN W .. -	•
C-301-d ..	.SLHGI W_EKIC...	...RHEWNKHGWCNW.. -	-
C-295-S/G ..	.GLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW.. -	+
C-300-W/G ..	.SLHGIGPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW.. -	+
C-302-E/A ..	.SLHGIWPAKIC...	...RHEWNKHGWCNW.. -	-
C-305-C/G ..	.SLHGIWPEKIG...	...RHEWNKHGWCNW.. -	-
C-300-W/G-302-E/A.SLHGIGPAKIC...	...RHEWNKHGWCNW.. -	-
C-340-R/G ..	.SLHGIWPEKIC...	...GHEWNKHGWCNW.. -	-
C-343-W/G ..	.SLHGIWPEKIC.. .	...RHEGNKHGWCNW.. -	-
C-345-K/A ..	.SLHGIWPEKIC...	...RHEWNAHGWCNW.. -	-
C-297-K/346-K..	.SLKGIWPEKIC...	...RHEWNKKGWCNW., -	+
C-297-K/346-L ..	.SLKGIWPEKIC...	...RHEWNKKGWCNW.. -	+
P r z y k ł a d	2

RNS

Wpływ różnych mutacji na aktywność RNazową glikoproteiny E^RNSW celu przetestowania wpł ywu róż nych mutacji na aktywność RNazy zwią zanej z glikoproteiną

RNS

E^RNS użyteczne komórki infekowano zmutowanymi wirusami. W przypadku CSFV infekcje prowadzono przy wartości m.o.i. 0.01. Infekcja typem dzikim wirusa służyła jako kontrola pozytywna, podczas gdy niezainfekowane komórki były kontrolą negatywną. W 48 godzinie po infekcji komórki przemywano dwa razy buforem PBS i lizowano 0.4 ml buforu lizującego (20 mM TRIS/HCl; 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mg/ml BSA; 1% Triton X100; 0.1% kwas deoksycholowy; 0.1% SDS). Lizat przenoszono do 1.5 ml probówek reakcyjnych i sonikowano (Branson sonifier B12, 120 W, 20 sek w naczynku z lodem), klarowano przez wirowanie (5 min 14000 rpm, Eppendorf Centrifuge, w 4°C) i supernatant poddawano ultrawirowaniu (stołowa wirówka Beckmana, 60 minut w 4°C przy 45000 rpm w rotorze

TLA 45). Określanie aktywności RNazy prowadzono w całkowitej objętości 200 μΐ obejmującej 5 lub 50 μΐ supernatantu po drugim etapie wirowania i 80 μg Poly(rU) (Pharmacia) w buforze do RNazy (40 mM

TRIS-octan pH 6.5; 0.5 mM EDTA; 5 mM DTT). Po inkubacji mieszaniny reakcyjnej w 37°C przez 1 godzinę dodawano 200 μl mieszaniny 1.2 M kwasu nadchlorowego i 20 mM LaSO₄. Po 15 minutach inkuPL 202 509 B1 bacji na lodzie mieszaninę wirowano przez 15 minut w 4°C przy 14000 rpm w wirówce Eppendorfa. Do supernatantu dodawano 3 objętości wody i próbkę mieszaniny analizowano mierząc gęstość optyczną przy 260 nm stosując spektrofotometr Ultrospec 3000 (Pharmacia). We wszystkich przypadkach mutacje wprowadzone do genu kodującego E^RNS całkowicie unieczynniały aktywność RNazy (Tabela 1).

W przypadku mutantów BVDV aktywność RNazy testowano z materiałem uzyskanym po transfekcji RNA bez pasażowania odzyskanego wirusa. Komórki transfekowane odpowiednim RNA dzielono na grupy 72 godziny po transfekcji i wysiewano na dwie szalki. 24 godziny później komórki z jednej szalki ekstrahowano, preparowano i analizowano pod względem aktywności RNazy tak, jak to podano powyżej. W celu potwierdzenia infekcji komórki z drugiej szalki analizowano immunofluorescencyjnie stosując przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw BVDV (Weiland i wsp 1989) -wszystkie komórki były w tym teście pozytywne. Transfekcję prowadzono przy pomocy RNA transkrybowanych z pA/BVDV/Ins- i pA/B-346-d, plazmidu równoważ nego pA/BVDV/Ins-, lecz zawierają cego delecję kodonu odpowiadającego kodonowi 346 w CSFV szczepu Alfort. Nie transfekowane komórki MDBK stanowiły kontrole negatywną.

T a b e l a 2A

Określenie aktywności RNazy różnych wirusów

	Al fort	C-WT	C-297-L	C-346-L	C-346-d	C-346-d/Rs	kontrola
OD260	2.4	2.3	1.1	1.1	1.1	2.3	1.1
	Al fort	C-WT	C-297-L	C-346-L	C297-K	C-346-K	C-297-L/346-L
OD260	2.09	2.16	0.715	0.77	0.79	0.766	0.77
	C-297-K/346-L	C-297-K/346-K	C-346-d	kontrola
OD260	0.725	0.835	0.8	0.84

Opis tabeli 2A:

Komórki PK15 zainfekowano wskazanym wirusem przy wartości m.o.i. 0.01, inkubowano w 37° C przez 48 godzin w atmosferze CO2 i nast ę pnie lizowano i poddano testowi wykrywają cemu aktywność RNazy. Rozpuszczalna w kwasie frakcja RNA powstająca w wyniku inkubacji z różnymi ekstraktami komórkowymi została zmierzona ilościowo przy OD260. Obserwowane różnice w aktywnoRNS ści RNazy nie wynikały z różnic w ilości białka E^RNS w próbkach, ponieważ podobne wartości uzyskiRNS wano po oszacowaniu ilości E^RNS z wykorzystaniem znakowania izotopowego, immunoprecypitacji RNS i analizy radioaktywnoś ci z wykorzystaniem fosfoimagera. Ponadto zmniejszenie stężenia E^RNS w teście do jedynie 1/10 zwykle stosowanej wartości nie zmieniło uzyskiwanych wartości OD w sposób

RNS znaczący, co wskazuje iż w wybranych warunkach testu E^RNS wysycała mieszaninę reakcyjną.

Szczep CSFV Alfort: wszystkie wirusy uzyskano z RNA transkrybowanego in vitro z plazmidów: np. C-WT z plazmidu pA/CSFV; C-297-L z plazmidu pA/C-297-L itd wirus C-346-d/Rs uzyskano z plazmidu pA/C-346-d/Rs (uzyskanego w wyniku rewersji mutacji w plazmidzie pA/C-346-d przez wymianę odpowiedniego fragmentu cDNA z odpowiadającym mu fragmentem pochodzącym z plazmidu pA/CSFV; kontrola: ekstrakt z niezainfekowanych komórek PK15.

T a b e l a 2B

	BN-WT	B-346-d	kontrola
OD260	2.5	1.1	1.1

Opis Tabeli 2B

Komórki MDBK zainfekowano transkrybowanym in vitro RNA, podzielono na grupy w 72 godziny po infekcji i analizowano 24 godziny później stosując test na aktywność RNazy. Zainfekowanie komórek sprawdzano stosując analizę immunofluorescencyjną, jak przedstawiono w tekście.

B-WT: wirus uzyskany z plazmidu pA/BVDV/Ins-; B-346-d wirus uzyskany z plazmidu pA/B-346-d; kontrola: ekstrakt z niezainfekowanych komórek MDBK.

P r z y k ł a d 3: Patogenność CSFV po inaktywacji RNazy

W celu okreś lenia czy zniszczenie aktywnoś ci RNazy wpł ywa na patogenność pestiwirusów wobec ich naturalnego gospodarza, przeprowadzono doświadczenia na zwierzętach z wykorzystaniem zmutowanego wirusa V(pA/C-346-d) (oznaczonego C-346-d w Tabelach). Wirus uzyskany z klonu CSFV

PL 202 509 B1 pełnej długości bez mutacji (V(pA/CSFV) posłużył jako kontrola pozytywna (C-WT w Tabelach). Dla każdego mutanta wykorzystano trzy prosiaki (rasa: German landrace; około 25 kg masy ciała). Zwierzętom podano 1 x 10⁵ TCID50 na zwierzę; dwie trzecie inokulatu podawano donosowo (1/3 do każdej jamy), jedną trzecią domięśniowo. Wspomniane dwie grupy zwierząt przetrzymywano w osobnych, izolowanych pomieszczeniach. Z każdego zwierzęcia pobierano próbki krwi dwa razy przed infekcją oraz w dniach: 3, 5, 7, 10, 12 i 14. Każdego dnia mierzono temperaturę ciała zwierząt (Figura 2). Zwierzęta zainfekowane dzikim typem wirusa wykazywały typowe objawy klasycznej cholery świń: gorączkę, ataksję, anoreksję, biegunkę, zaburzenia ze strony centralnego układu nerwowego, podskórne wylewy krwi (Tabela 3a). Wirus izolowano z krwi w 3 dniu (zwierzę #68) i w dniu 5, 7, 10, 14 (zwierzęcia #68, #78, #121) (Tabela 3b). Zwierzęta zabito w stanie agonalnym w 14 dniu po infekcji. W tym czasie nie wykryto przeciwciał neutralizujących wirusa. Natomiast odmiennie zwierzęta zainfekowane wirusem zmutowanym nie prezentowały objawów klinicznych (Tabela 3a). Temperatura ciała pozostawała prawidłowa (Figura 2) w czasie trwania eksperymentu i zwierzęta nie przestawały normalnie się odżywiać. W czasie eksperymentu nie można było wyizolować wirusa ze krwi wspomnianych zwierząt. Jednakże zwierzęta były zainfekowane i wirus ulegał replikacji, jako że u zwierząt powstały przeciwciała neutralizujące wirusa (Tabela 3c).

T a b e l a 3a:

Objawy kliniczne po infekcji testowej

Eksperyment 1
zwierzę nr	zainfekowane wirusem	objawy choroby
		gorączka	biegunka	zaburzenia CSN	anoreksja	wylewy podskórne	apatia	stan agonalny w momencie zabicia	wylewy krwi w orga- nach wewnętrznych w badaniu po- śmiertnym
#68	C-WT	+	+	+	+	+	+	+	+
#78	C-WT	+	+	+	+	+	+	+	+
#121	C-WT	+	+	+	+	+	+	+	+
#70	C-WTC-346-d	-	-	-	-	-	-	-	nb
#72	C-WTC-346-d	-	-	-	-	-	-	-	nb
#74	C-WTC-346-d	-	-	-	-	-	-	-	nb

Opis Tabeli 3a:

Zaszczepiono 6 prosiaków (rasy German land; około 25 kg masy ciała) w dwu grupach (każda ₅ z grup przetrzymywana osobno). Trzy zwierzę ta zainfekowano CSFV-WT (1 x 10⁵TCID50), a trzy zwierzęta wirusem C-346-d (1 x 10⁵TCID50). Temperaturę odbytniczą i objawy kliniczne zebrano w tabeli, nb - nie badano pośmiertnie.

T a b e l a 3b

Wiremia we krwi po infekcji testowej

Eksperyment 1
Zwierzę nr	zainfekowane wirusem	wiremia w dniu po infekcji
1	2	3	4	5	6	7
		3	5	7	10	14
#68	C-WT	+	+	+	+	+
#78	C-WT	+	+	+	+	+

PL 202 509 B1 cd. tabeli 3b

1	2	3	4	5	6	7
#121	C-WT	+	+	+	+	+
#70	C-346-d	-	-	-	-	-
#72	C-346-d	-	-	-	-	-
#74	C-346-d	-	-	-	-	-

Opis Tabeli 3b:

Wykrywano wiremię w komórkach krwi przez wspólną hodowlę krwi z komórkami PK15. Po inkubacji w 37°C przez 72 godziny komórki przemywano buforem PBS, utrwalano mieszaniną acetom/metanol o temperaturze lodu i analizowano wystąpienie infekcji techniką immunofluorescencji z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciw glikoproteinie E2 (mAb A18, Weiland i wsp 1990).

T a b e l a 3c:

Powstawanie miana przeciwciał neutralizujących specyficznie CSFV

dni po infekcji	-3	0	17	25	69	76	79	87
#70	-	-	1:18	1:162	1:162	1:162	1:486	1:1458
#72	-	-	1:18	1:54	1:486	1:1458	1:1458	1:4374
#74	-	-	1:6	1:54	1:162	1:162	1:486	1:1458

Opis Tabeli 3c:

Miana przeciwciał u świń zainfekowanych zmutowanym wirusem C-346-d określone w różnych czasach w czasie eksperymentu.

μΐ rozcieńczonej surowicy mieszano z 50 μΐ podłoża zawierającego 30 TCID₅₀ wirusa (CSFV Alfort/Tubingen). pod 90 minutach inkubacji w 37°C, 100 μl zawiesiny komórek (1.5 x 10⁴ komórek) dodawano i mieszaninę dodawano do studzienek płytki 96 studzienkowej. Po 72 godzinach komórki utrwalano mieszaniną acetom/metanol o temperaturze lodu i analizowano wystąpienie infekcji techniką immunofluorescencji z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciw glikoproteinie E2 (mAb A18, Weiland i wsp 1990). W dniu 69 po infekcji zwierzętom podawano 2 x 105 TCID50 wirusa CSFV szczepu Eystrup. Tabela podaje najwyższe rozcieńczenia surowicy prowadzące do całkowitej neutralizacji wprowadzanego wirusa.

P r z y k ł a d 4: Indukowanie ochronnej odporności przez infekcję wirusem RNazo-ujemnym

W celu przeanalizowania, czy infekcja zmutowanym wirusem prowadzi do odporność ochronnej, przeprowadzono eksperyment około 9 tygodni po infekcji zmutowanym szczepem CSFV, wykorzystując wysoce patogenny szczep heterologiczny CSFV (Eystrup, Boehring). Do infekcji zastosowano 2 x 10⁵TCID50 wirusa. Ta ilość wirusa wystarczała do zaindukowania śmiertelnej choroby w kilkunastu poprzednio prowadzonych doświadczeniach (Konig, 1994). Jak się okazało, zwierzęta poprzednio infekowane zmutowanym wirusem CSFV nie wykazywały objawów choroby po wystawieniu na działanie patogennego szczepu. U zwierząt nie wykryto ani gorączki (Figura 3), ani nie zanotowano wiremii, lecz wzrost poziomu przeciwciał neutralizujących, co wskazuje na infekcję związaną z syntezą i replikacja wirusa patogennego.

P r z y k ł a d 5: Potwierdzenie zasady atenuacji

W celu wykazania iż obserwowana atenuacja wirusa zmutowanego wynika rzeczywiście z delecji histydyny w pozycji 346 polibiałka i nie jest wynikiem niezidentyfikowanej drugiej mutacji, przywrócono sekwencje typu dzikiego poprzez wymianę fragmentu o wielkości 1.6 kb XhoI/NdeI pochodzącego z klonu pełnej długości pA/C-346-d na odpowiedni fragment z pA/CSFV o dzikiej sekwencji. Fragment wspomniany wycięty z pA/C-346-d zsekwencjonowano w poszukiwaniu mutacji. Za wyjątkiem delecji kodonu His346 polibiałka, nie znaleziono zmian w porównaniu z sekwencją dziką. Z konstruktu cDNA z rewersją mutacji można uzyskać wirusa V(pA/C-346-d/Rs), który wzrasta równie dobrze, co typ dziki i wykazuje jednakową z nim aktywność RNazy (Tabela 2A).

W drugim doświadczeniu z wykorzystaniem zwierząt zrewertowany wirus zastosowano do infekcji świń. Jako kontrolę użyto mutanta delecyjnego. Dwie grupy zwierząt składające się z trzech świń użyto w doświadczeniu. Ponieważ zwierzęta były młodsze (German landrace, około 20 kg masy ciała), niż zwierzęta stosowane w pierwszym eksperymencie zastosowano wirus w dawce 5 x 10⁴TCID50.

PL 202 509 B1

Zwierzęta zainfekowane szczepem zmutowanym nie wykazywały objawów choroby (Tabela 5, Figura 4). Tylko jedno ze zwierząt miało gorączkę przez 1 dzień. Zwierzęta te wytworzyły przeciwciała neutralizujące i były chronione przed letalną dawką CSFV. Podano 5 x 10⁴TCID50 patogennego wirusa szczepu Eystrup. Zwierzęta zaszczepione w ten sposób nie wykazywały klinicznych objawów choroby, a temperatura ich ciała pozostawała prawidłowa (Figura 5). W odróżnieniu od świń zainfekowanych mutantem delecyjnym, zwierzęta innokulowane rewertantem rozwijały typowe objawy choroby. Jedno ze zwierząt zabito w 11 dniu po infekcji, dwa inne trzy dni później. Wszystkie zwierzęta wykazywały typowe objawy klasycznej cholery świń, a więc gorączkę, biegunkę, anoreksję, i patologiczne objawy typu wylewów krwi w różnych organach wewnętrznych, włączając w to nerki.

T a b e l a 5a

Kliniczne objawy po infekcji testowej

Eksperyment 2
zwierzę nr	zainfekowane wirusem	objawy choroby
		gorączka	biegunka	zaburzenia CSN	anoreksja	wylewy podskórne	apatia	stan agonalny w mo- mencie zabicia	Wylewy krwi w organach wewnętrz- nych w badaniu pośmiertnym
#43	C- 346-d	+*		-	-	-	-	-	nb
#47	C- 346-d	-	-	-	-	-	-	-	nb
#87	C- 346-d	-	-	-	-	-	-	-	nb
#27	C- 346-d/Rs	+	+	+	+	-	+	+	+
#28	C- 346-d/Rs	+	+	+	+	-	+	+	+
#30	C- 346-d/Rs	+	+	+	+	-	+	+	+

* - gor ą czka tylko przez 1 dzień ; nb - nie badano Tabela 5a:

Zaszczepiano 6 prosiaków (rasy German land; około 20 kg masy ciała) w dwu grupach (każda z grup przetrzymywana osobno). 3 zwierzęta zainfekowano zmutowanym wirusem C-346-d (5 x

10⁴TCID50), a trzy zwierzęta wirusem C-346-d/Rs (1 x 10⁴TCID50). C-346-d/Rs otrzymano z C-346-d RNS przez przywrócenie sekwencji E^RNS typu dzikiego. Temperaturę odbytniczą i objawy kliniczne zebrano w tabeli, nb - nie badano poś miertnie

T a b e l a 5b

Diagnostyczny test RNazy z wykorzystaniem wirusów uzyskanych ze zwierząt w trakcie wiremii

	Alfort	zwierzę #3 C-297-K	zwierzę #5 C-297-K	zwierzę #27 C-346-d/Rs	zwierzę #28 C-346-d/Rs	zwierzę #30 C-346-d/Rs	kontrola
OD260	1.84	0.60	0.56	1.84	1.93	1.94	0.49

Wirusy uzyskiwano z krwi zwierząt 3 i 5 dnia po infekcji i ze zwierząt # 27, 28, 30 (z doświadczenia nr 2) (opisane w Przykładzie 5) w 7 dniu po infekcji, namnażano w hodowli komórkowej, mianowano i testowano na obecność aktywności RNazy, jak podano to powyżej. Nie zainfekowane komórki PK15 i komórki (kontrola) zainfekowane dzikim szczepem CSFV Alfort służyły za kontrolę. Zwierzęta 3 i 5 zostały zainfekowane zmutowanym szczepem C-297-K, podczas gdy zwierzęta 27, 28 i 30 zostały zainfekowane zmutowanym szczepem C-346-d/Rs, jak wskazano to w tabeli.

P r z y k ł a d 6

RNS

Wpływ podwójnej mutacji w sekwencji kodującej E^RNS W celu przebadania wpływu podwójnej RNS mutacji w obrębie sekwencji kodującej E^RNS na zdolność wirusów do replikacji w naturalnym gospodarzu i na patogenność, przeprowadzono doświadczenie z wykorzystaniem zwierząt oraz zmutowanego szczepu V(pA/C-297-L/346-L). Wirus uzyskano z pełnej długości klonu CSFV bez mutacji (V)pA/CSFV))

PL 202 509 B1 służącego także jako kontrola pozytywna. Każdy zmutowany wirus testowano z wykorzystaniem trzech prosiaków (German landrace; około 25 kg masy ciała). Dawka infekcyjna wynosiła 1 x 10⁵TCID50 na każde zwierzę; 2/3 inokulowano dwie trzecie inokulatu podawano donosowo (1/3 do każdej jamy), jedną trzecią domięśniowo. Wspomniane dwie grupy zwierząt przetrzymywano w osobnych, izolowanych pomieszczeniach. Z każdego zwierzęcia pobierano próbki krwi przed infekcją (dzień 0) oraz w dniach: 5, 8, 12 i 20. Każ dego dnia mierzono temperaturę ciała zwierząt (Figura 6). Zwierzęta zainfekowane podwójnym mutantem nie prezentowały typowych objawów klasycznej cholery świń i nie zaprzestały jedzenia pokarmu. Zwierzęta nie miały gorączki w trakcie całego eksperymentu (zwierzęta 45/2 i 45/3) za wyjątkiem zwierzęcia 45/1 w dniu 8, prawdopodobnie spowodowanej infekcją bakteryjną w wyniku zranienia prawej tylniej nogi. Po leczeniu tego zwierzęcia antybiotykiem w dniu 10, temperatura powróciła do normy w ciągu jednego dnia (Figura 6). U wszystkich zwierząt izolowano wirusa z krwi w dniu 5, i nie obserwowano wiremii póź niej (Tabela 6a).

U wszystkich zwierząt powstały przeciwciała neutralizujące wirusa (Tabela 6b). U zwierzęcia 45/1 miano przeciwciał neutralizujących oznaczono ponownie w około 4.5 miesiąca po infekcji i wynosiło ono wtedy 1:4374. Zatem, infekcja podwójnym mutantem prowadziła do długotrwałej pamięci immunologicznej.

T a b e l a 6a Testowanie wiremii

dni po infekcji	5	8	12
45/1	+	-	-
45/2	+	-	-
45/3	+	-	-

T a b e l a 6b

Miano przeciwciał neutralizujących

zwierzę	dzień 0	dzień 20 po infekcji
45/1	-	1:128
45/2	-	1:256
45/3	-	1:256

P r z y k ł a d 7 Immunogenność i zasada atenuacji wirusa BVDB „B-346-d

W celu sprawdzenia zasady atenuacji jak również immunogennoś ci wirusa BVDV „ B-346-d uzyskanego z pA/B-346-d zaplanowano eksperyment porównujący go z wirusem „B-WT uzyskanym z pA/BVDV/Ins-. Wirus „B-346-d jest wirusem zmutowanym, wywodzącym się z wyjściowego wirusa BVDV, z mutacją wprowadzoną w pozycji 349, i nazwanym „B-346 w celu wskazania odpowiadającej pozycji 346 w szczepie CSFV Alfort (Figura 1).

Wybrano trzy grupy seroujemnych względem wirusa BVDV zwierząt w wieku 3-6 miesięcy. Grupę 1 i 2 tworzyło 5 zwierząt, a grupę 3 - trzy osobniki. Zwierzęta z grupy 1 i 2 zainfekowano podając im 2 x 10⁶TCID50 wirusa B-346-d (grupa 1) lub B-WT (grupa 2) w objętości dawki 5 ml. Zwierzęta zainfekowano domięśniowo (mięsień pośladkowy), donosowo i podskórnie (nad łopatką). W czasie 14 dni po infekcji śledzono wiremię w obu grupach, oznaczając wiremię we krwi oraz wirusa obecnego w śluzie nosowym. Ponadto okreś lano inne parametry istotne klinicznie: temperaturę, liczbę białych krwinek oraz ogólny stan zdrowia.

Odporność ochronną skierowaną przeciw infekcji antygenowo heterologicznego i wirulentnego szczepu BVDV (#13) oznaczano prowadząc infekcję prowokującą 77 dni po wspomnianej infekcji zwierzęta z grupy 1 szczepem B-346-d. Zwierzęta z grupy 3 stanowiły kontrolę i infekowano je zgodnie z procedurą przyjętą dla zwierząt z grupy 1, wirulentnym szczepem BVDV. Wirus BVDV (#13) należy do odmiennej grupy antygenowej (typ II), podczas gdy wirus B-346-d należy do grupy typu I, zgodnie z klasyfikacją przedstawioną przez Pellerina i wsp, 1994. Zwierzęta z grupy 1 i 3 zostały zaszczepione dawką 2 x 10⁶TCID50 wirusa BVDV (#13) w objętości dawki 5 ml. Zwierzęta zainfekowano domięśniowo (mięsień pośladkowy), donosowo i podskórnie (nad łopatką). 14 dni po infekcji śledzono wiremię w obu grupach, oznaczając wiremię we krwi oraz wirusa obecnego w śluzie nosowym.

Ponadto określano inne parametry istotne klinicznie: temperaturę, liczbę białych krwinek oraz ogólny stan zdrowia.

PL 202 509 B1

Po infekcji szczepem B-346-d zwierzęta nie wykazywały typowych klinicznych objawów infekcji BVDV takich jak wzrost temperatury odbytniczej (Tabela 7a) ani żadnych objawów ze strony układu oddechowego (nie przedstawiono).

Zmniejszona wiremia w leukocytach (Tabela 7b) i obecność wirusa w śluzie nosowym (Tabela 7c) wskazywały wyraźnie na atenuację wirusa B-346-d w porównaniu z B-WT.

Wirulentny izolat #13 indukował w organizmach zwierząt z grupy 3 silną wiremię z typowymi objawami infekcji BVDV, takimi jak wzrost temperatury mierzonej w odbycie w ciągu ponad 7 dni (Tabela 7d), silna leukopenia (Tabela 7e), przedłużająca się wiremia w leukocytach (Tabela 7f) i obecność wirusa w śluzie nosowym (Tabela 7g). Natomiast zwierzęta z grupy 1, które zostały zaszczepione przez zainfekowanie wirusem B-346-d nie wykazywały prawie wcale klinicznych objawów typowych dla infekcji BVDV po podaniu w teście prowokacji wirulentnego izolatu BVDV #13. Nie obserwowano objawów wzrostu temperatury mierzonej w odbycie (Tabela 7d). Leukopenia miała nieznaczne nasilenie, zarówno co do zakresu, jak czasu trwania (Tabela 7e). Z krwi nie można było wyizolować BVDV (Tabela 7f) i tylko u jednego zwierzęcia można było wyizolować wirusa z śluzu nosowego (Tabela 7g).

Zatem infekcja szczepem B-346-d indukuje silną odporność, wyraźnie zmniejszającą objawy kliniczne, obecność wirusa w śluzie nosowym oraz wiremię we krwi, po wystawieniu na działanie prowokujące heterologicznego izolatu BVDV.

T a b e l a 7a

Średnia temperatura ciała mierzona w odbycie zwierząt grupy 1 (B-346-d) i grupy 2 (B-WT)

dzień badania	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
grupa 1	38.8	39.1	39.0	38.7	38.8	38.7	38.7	38.5	38.7	38.5	38.5	38.5	38.4	38.9	38.7
grupa 2	38.8	39.0	38.8	38.6	38.6	38.7	38.6	38.4	39.1	38.4	38.7	38.6	38.7	38.6	38.6

T a b e l a 7b

Wiremia w leukocytach w grupie 1 i 2

grupa	zwierzę	dzień pojawienia się śluzu w jamie nosowej	dzień zaniku śluzu w jamie nosowej	Czas występowania śluzu w jamie nosowej	Średni czas w grupie
1	1	6	6	1	1.4
2	4	6	2
3	5	5	1
4	-	-	0
5	6	9	3
2	6	4	8	5	4.4
7	4	7	4
8	4	7	4
9	4	7	4
10	4	8	5

Próbki krwi na EDTA zbierano codziennie aż do 10 dnia po infekcji szczepami B-346-d i B-WT. 0.2 ml krwi dodawano do każdej z 3 hodowli komórek jąder cielęcia (Cte) w pożywce zawierającej heparynę (1U/ml, by zapobiec skrzepnięciu). Po inkubacji przez noc zastępowano pożywkę świeżą porcją pożywki bez heparyny. Po inkubacji przez od 4 do 6 dni, zainfekowane BVDV komórki wykrywano immunofluorescencyjnie stosując poliklonalne przeciwciało specyficzne względem BVDV. Hodowle sero-ujemne zamrażano i następnie rozmrażano. 0.2 ml zawiesiny następnie pasażowano na nowe komórki Cte w celu potwierdzenia nieobecności BVDV.

PL 202 509 B1

T a b e l a 7c

Obecność wirusa w śluzie z nosa

Grupa	zwierzę	dzień pojawienia się śluzu w jamie nosowej	dzień zaniku śluzu w jamie nosowej	liczba dni w których wirus obecny był w śluzie	średni czas występowania wirusa dla grupy
1	1	4	8	4	2.6
2	6	6	1
3	4	4	1
4	5	7	3
5	3	6	4
2	6	6	8	3	3.6
7	5	7	3
8	5	8	4
9	5	6	2
10	3	9	6

Wymazy nosowe wirowano (1000 g) w celu usunięcia większych resztek komórkowych i zanieczyszczeń. Supernatant usuwano i 0.2 ml wysiewano na trzy hodowle komórkowe. Po inkubacji przez noc pożywkę zastępowano świeżą (2 ml). Po inkubacji przez 4 - 6 dni zainfekowane BVDV komórki wykrywano immunofluorescencyjnie stosując poliklonalne przeciwciało specyficzne względem BVDV.

T a b e l a 7d

Średnia temperatura ciała mierzona w odbycie zwierząt grupy 1 i 2

dzień badania	-2	-1	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	12	14
grupa 1	38.4	38.6	38.5	38.5	38.6	38.4	38.4	38.4	38.3	38.4	38.4	38.4	38.4	38.4	38.4
grupa 3	38.8	39.1	38.8	39.1	39.4	39.7	40.2	40.2	40.4	41.3	40.2	40.1	40.2	40.8	40.4

Temperatury odbytnicze mierzono w ciągu 16 dni po infekcji prowokującej. Zwierzęta z grupy 1 i 3 infekowano wirusem w ilości 6 x 10⁶TCID50 wirulentnego izolatu #13 BVDV.

T a b e l a 7e Średnie miana leukocytów

dzień badania	-2	-1	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	12	14
grupa 1	11.9	11.9	11.3	10.8	9.2	8.2	8.9	9.9	11.2	11.6	11.6	10.6	10.8	10.8	9.4
grupa 3	11.7	15.8	13.8	11.1	7.7	9.8	7.4	6.8	7.5	8.7	7.0	8.1	6.2	6.4	6.2

Próbki krwi na EDTA zbierano od dnia -2 do 14 po infekcji prowokującej w obu grupach. Liczbę białych ciałek krwi oznaczano stosując automatyczny licznik komórek Sysmex Micro-Cell Counter F800.

T a b e l a 7f

Wirus BVDV izolowany z próbek krwi

grupa	zwierzę	Dzień pojawienia się wirusa we krwi	dzień zaniku wirusa we krwi	liczba dni w których wirus obecny był we krwi	średni czas występowania wirusa dla grupy
1	2	3	4	5	6
1	1	-	-	0	0
2	-	-	0
3	-	-	0

PL 202 509 B1 cd. tabeli 7f

1	2	3	4	5	6
	4	-	-	0
5	-	-	0
3	11	3	10	8	9.7
12	3	14	12
13	3	9	9

Próbki krwi na EDTA zbierano codziennie aż do 10 dnia po infekcji prowokującej. 0.2 ml krwi dodawano do każdej z 3 hodowli komórek jąder cielęcia (Cte) w pożywce zawierającej heparynę (1U/ml, by zapobiec skrzepnięciu). Po inkubacji przez noc zastępowano pożywkę świeżą porcją pożywki bez heparyny. Po inkubacji przez od 4 do 6 dni, zainfekowane BVDV komórki wykrywano immunofluorescencyjnie stosując poliklonalne przeciwciało specyficzne względem BVDV. Hodowle seroujemne zamrażano i następnie rozmrażano. 0.2 ml zawiesiny następnie pasażowano na nowe komórki Cte w celu potwierdzenia nieobecności BVDV.

T a b e l a 7g

Obecność wirusa w płynie z jamy nosowej

grupa	zwierzę	dzień pojawienia się śluzu w jamie nosowej	dzień zaniku śluzu w jamie nosowej	liczba dni w których wirus obecny był w śluzie	średni czas występowania wirusa dla grupy
1	1	3	4	2	0.8
2	-	-	0
3	-	-	0
4	-	-	0
5	4	5	2
3	11	3	14	12	10
12	3	14	12
13	3	8	6

P r z y k ł a d 8 Rozróż nienie mię dzy szczepem C-346-d i szczepem CSFV bez delecji kodonu histydynowego 346, z wykorzystaniem techniki RT-PCR.

RNS

Sekwencja kodująca konserwowanego motywu RNazy glikoproteiny E^RNS wirusa CSFV jest silnie konserwowana ewolucyjnie. Wśród wszystkich znanych sekwencji CSFV nie zanotowano zmian w regionie obejmującym reszty 1387-1416 (pozycje zgodne z opublikowaną sekwencją CSFV szczepu Alfort, Meyers i wsp 1987). Można zatem użyć starterów komplementarnych do tego regionu genomu wirusa w reakcji RT-PCR, w celu testowania wszystkich izolatów CSFV (patrz Figura 7). W teście RT-PCR można wykryć brak kodonu histydynowego w pozycji 346 (w sekwencji nukleotydowej pozycje 1399-1401), stosując użyteczne startery. Zsyntezowano różne oligonukleotydy, komplementarne do regionu konserwowanego, które obejmowały lub nie obejmowały kodon histydynowy. Oligonukleotydy

RNS te służyły jako startery z końca 5' w reakcji RT-PCR z oligonukleotydem E^RNS-Stop, jako starterem 3'.

RNA oczyszczone z hodowli tkankowej komórek zainfekowanych C-346- d, C-WT, C-346-L lub

C-346-K stosowano jako matrycę w reakcji. Prowadzono odwrotną transkrypcję 2 μg zdenaturowanego termicznie RNA (2 minuty w 92°C, 5 minut w lodzie, w 11 μ! wody w obecności 30 pmola startera 3') po dodaniu 8 μ! mieszaniny RT (125 mM TRIS/HCI pH 8.3, 182.5 mM KCI1, 7.5 mM MgCl₂, 25 mM DTT, 1.25 mM każdego z dNTP) oraz 15 U RNAguard (Pharmacia) oraz 50 U polimerazy Superscript (LifeTechnologies/BRL) przez 45' w 37°C. Po ukończeniu reakcji odwrotnej transkrypcji probówki umieszczano w lodzie i dodawano 30 μ! mieszaniny PCR (8.3 mM TRIS/HC1 pH 8.3, 3.3 mM KCI, 2.2 mM

PL 202 509 B1

MgCl2, 0.42 mM każdego z dNTP, 0.17% Triton X-100, 0.03% BSA, 5U Taq polimerazy (Appligene) oraz 16.7% DMSO. Gdy stosowano starter OI H+3 mieszanina reakcyjna do amplifikacji nie zawierała

DMSO. Amplifikację prowadzono przez 38 cykli (30 sek 94°C; 30 sek 57°C; 45 sek 74°C). 1 μ! mieszaniny po reakcji PCR analizowano elektroforetycznie w 1% żelu agarozowym i barwiono bromkiem etydyny. Jak wykazano na Figurze 7, para starterów OIH-3/OI E^RNS-Stop pozwalała na specyficzną amplifikację fragmentu pochodzącego z RNA z delecją kodonu 346, podczas gdy inne dwie pary starterów pozwalały na powielenie odcinka bez delecji kodonu 346. W tym drugim przypadku nie powstawał produkt z matrycą zawierającą delecję kodonu 346.

Startery do RT-PCR startery 5':

OI H-3: TGGAACAAAGGATGGTGT

OI H+2: TGGAACAAACATGGATGG

OI H+3: GAATGGAACAAACATGGA

Starter 3':

OI E^RNSStop: GGAATTCTCAGGCATAGGCACCAAACCAGG

Opis Figur

Figura 1: Sekwencja pierwszych 495 aminokwasów szczepu Alfort CSFV

Zestawienie sekwencji pokazuje pierwszych 495 aminokwasów eksprymowanych przez szczep Alfort CSFV (Meyers i wsp 1989). Jeden monomer glikoproteiny E^RNS szczepu odpowiada aminokwasom od pozycji 268 do 495 (Rumenapf i wsp 1993). Podkreślone reszty aminokwasowe w pozycjach 295 - 307 i 338 - 357 obejmują region wykazujący homologię z roślinnymi i grzybowymi RNazami (Schneider i wsp 1993).

Figura 2: Krzywa temperatury ciała mierzonej w odbycie zwierząt po infekcji testowej

Dzienna temperatura mierzona w odbycie od dnia 2 przed infekcją, do dnia 18 po infekcji. Krzywa temperatury jest przedstawiona dla każdego zwierzęcia zainfekowanego wirusem V(pA/CSFV) (linia ciągła) uzyskanego z plazmidu pA/CSFV lub wirusem V(pA/C-346-d) uzyskanego z plazmidu pA/C-346-d (linia przerywana).

Figura 3: Krzywa temperatury ciała mierzonej w odbycie zwierząt po infekcji prowokującej szczepem wirulentnym.

Dzienną temperaturę ciała mierzono w odbycie zwierząt w dniach 1 - 21 po infekcji prowokującej wirusem CSFV szczepu Eystrup, zostały zainfekowane mutantem C-346-d (V(pA/C-346-d) na 69 dni przedtem, jak opisano to dokładnie w tekście. Krzywa zmian temperatury ciała mierzonej w odbycie podana jest dla każdego zwierzęcia z grupy wystawionej na prowokujące działanie 2 x 10⁵TCID50 CSFV szczepu Eystrup.

Figura 4: Krzywa temperatury ciała mierzonej w odbycie zwierząt po infekcji testowej.

Dzienną temperaturę ciała mierzono w odbycie zwierząt w dniach 0 - 18 po infekcji. Krzywa zmian temperatury ciała mierzonej w odbycie podana jest dla każdego zwierzęcia z dwóch grup zainfekowanych albo wirusem C-346-d [V(pA/C-346-d)] (linia przerywana) albo rewertantem C-346-d/Rs [V(pA/C-346-d/Rs)] (linia ciągła).

Figura 5: Krzywa temperatury ciała mierzonej w odbycie zwierząt po infekcji prowokującej w doświadczeniu #2.

Dzienną temperaturę ciała mierzono w odbycie zwierząt w dniach 1-10 po infekcji prowokującej wirusem. Zwierzęta zainfekowane szczepem zmutowanym C-346-d 37 dni przed wystawieniem na prowokujące działanie 2 x 10⁵TCID50 CSFV szczepu Eystrup.

Figura 6: Krzywa temperatury ciała mierzonej w odbycie zwierząt po infekcji podwójnym mutantem wg Przykładu 6.

Dzienną temperaturę ciała mierzono w odbycie zwierząt przed i po prowokującej infekcji podwójnym mutantem V(pA/C-297-L/346-L).

Figura 7: Rozróżnienie między szczepami C-346-d i CSFV bez delecji w kodonie histydynowym 34 z wykorzystaniem techniki RT-PCR wg Przykładu 8

a) Para starterów OI H-3/OI E^RNSStop umożliwia specyficzną amplifikację w postaci prążka z wykorzystaniem RNA obejmującego delecję kodonu 346 (C-346-d) jak przedstawiono to szczegółowo w Przykładzie 8. Natomiast RNA nie zawierający delecji nie oddziaływuje z parą starterów (C-WT, C-346-L, C-346-K).

PL 202 509 B1

b) i c) Dwie inne kombinacje starterów (OI H+2 i OI H+3) powielają prążek pochodzący z RNA nie zawierającego delecji kodonu 346 (OI H+2 i OI H+3). Nie obserwowano powstawania prążka stosując jako matrycę RNA z mutanta delecyjnego C-346-d.

LISTA SEKWENCJI <110> Boehringer Ingelheira Vetraedica GmbH <120» Atenuowane Peatiwirusy <130» Atenuowane Pestiwirusy - PCT/EP <140» PCT/BP99/03642 <141» 1999-05-27 <150» BP 98110356,7 <151» 1998-06-05 <160» 27 <170» Patentln Ver. 2.1 <210» 1 <211» 494 <212» PRT <213» BVDV Brna delecja w pozycji 346 <400» 1

Met 1

Glu

Leu

Ile

Thr 5

Aan

Glu

Leu

Tyr 10

Lya

Thr

Tyr

Lya

Gin 15

Lya

Pro

Ala

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Aap

Gin

Ala

Gly

Aan 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Glu 35

Arg

Gly

Val

Ile

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lya

Leu

Pro

His

Lys 50

Arg

Gly

Glu

Arg

Glu 55

Val

Pro

Thr

Aan

Leu 60

Ala

Ser

Leu

Pro

Lys 65

Arg

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

Ser

Lys 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Leu

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Leu

Phe

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Lys

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Glu

Ala

Ser 110

Met

cys

Glu

Thr

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Ser

Arg

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Ile 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Ile 140

Val

Lys

Ser

Ala

Thr 145

Lys

Asp

Arg

Gin

Lys 150

Val

Leu

Lys

Trp

Val 155

His

Asn

Lys

Leu

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Thr

Lys

Asp

Glu

Gly 175

Val

Arg

Lys

Lys 180

Gin

Lys

Pro

Asp 185

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly 190

Arg

Met

Lys

Ile

Thr 195

Pro

Lys

Glu

Ser

Glu 200

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr 205

Lys

Pro

PL 202 509 B1

Asp

Ala 210

Thr

Ile

Val

Asp 215

Gly Val

Lys

Tyr

Gin 220

Val

Lys

Gly 225

Lys

Val

Lys

Ser

Lys 230

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly 235

Leu

Tyr

His

Asn

Lys 240

Asn

Lys

Pro

Gin

Glu 245

Ser

Arg

Lys

Leu 250

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu 255

Ala

Trp

Ala

Ile

Ile 260

Ala

Leu

Val

Phe

Phe 265

Gin

Val

Thr

Met

Gly 270

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin 275

Trp

Asn

Leu

Gin

Aflp 280

Asn

Gly

Thr

Glu

Gly 285

Ile

Gin

Arg

Ala

Met 290

Phe

Gin

Arg

Gly

val 295

Asn

Arg

Ser

Leu

His 300

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu 305

Lys

Ile

Cys

Thr

Gly 310

Val

Pro

Ser

His

Leu 315

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu 320

Leu

Lys

Ala

Ile

His 32S

Gly

Met

Asp

Ala 330

Ser

Glu

Lys

Thr

Asn 335

Tyr

Thr

Cys

Arg 340

Leu

Gin

Arg

His

Glu 345

Trp

Asn

Lys

Gly

Trp 350

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn 355

Ile

Glu

Pro

Trp

Ile 360

Leu

Met

Asn

Lys 365

Thr

Gin

Ala

Asn

Leu 370

Thr

Glu

Gly

Gin

Pro 375

Leu

Arg

Glu

Cys

Ala 380

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr Asp Arg Asp Ser Asp Leu Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asp Ser

385 390 395 400

Pro Thr Pro Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala

405 410 415

Gly Ile Leu Val Gin Gly Pro Cys Asn Phe Glu Ile Ala Val ser Asp 420 425 430

Val Leu Phe Lys Glu His Asp Cys Thr Ser Val Ile Gin Asp Thr Ala 435 440 445

His Tyr Leu Val Asp Gly Met Thr Asn Ser Leu Glu Ser Ala Arg Gin 450 455 460

Gly Thr Ala Lys Leu Thr Thr Trp Leu Gly Arg Gin Leu Gly Ile Leu 465 470 475 480

Gly Lys Lys Leu Glu Asn Lys Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala 485 490 <210> 2 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 295 G <400> 2

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15 10 15

PL 202 509 B1

Pro Val

Gly

Val 20

Glu

. Glu

i Pro

. Val

Tyr 25

' Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Olu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly BO

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg ISO

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys ISO

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

ASp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ly3 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Gly 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340 345 350

PL 202 509 B1

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Asp

Lys 37S

Glu

cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly Cys 405

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Olu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495 <210> 3 <211> 492 <212> PRT <213> CSPV Erns mutant 296-7-8-delecja <400> 3

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

PL 202 509 B1

145 150 155 160

cys

Pro Leu Trp Val Thr ¹⁶⁵

Ser

Cys Ser

Asp Asp Gly Ala Ser 170

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Pro

Aep

Arg

Met

Asn

Łys

Gly

Łys

Leu

Łys

Ile

Ala

180

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Łys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

Łys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Łys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

280

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Ile

Trp

Pro

Glu

Łys

ile

Cys

Lys

Gly

290

295

300

Val

Pro

Thr

Kis

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile

Arg

Gly

305

310

315

320

Met

ASp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

Arg

Leu

Gin

325

330

335

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

His

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp

340

345

350

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly

355

360

365

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

Thr

370

375

380

Asp

Val

Asn

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

Leu

Thr

385

390

395

400

Gly

Cys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

Ile

Glu

405

410

415

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp

420

425

430

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

Leu

Asp

435

440

445

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

Arg

Val

450

455

460

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Leu

Glu

465

470

475

480

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

PL 202 509 B1

485 490 <210> 4 <211> 494 <212» PRT <213> CSFV Bras mutant 297-delecja <400» 4

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr Asp 25

Thr

Ala

Gly Acg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275 280 285

PL 202 509 B1

Leu Arg Gly val 290	Asn Arg Ser Leu Gly Ile 295	Trp	Pro 300	Glu	Lys	Ile	cys
Lys Gly Val Pro	Thr His Leu Ala Thr Asp	Thr	Glu	Łeu	Lys	Glu	Ile
305	310	315					320
Arg Gly Met Met	Asp Ala Ser Glu Arg Thr	Asn	Tyr	Thr	Cys	Cys	Arg
	325 330					335
Łeu Gin Arg His	Glu Trp Asn Lys His Gly	Trp	Cys	Asn	Trp	Tyr	Asn
340	345				350
Ile Asp Pro Trp	Ile Gin Leu Met Asn Arg	Thr	Gin	Thr	Asn	Leu	Thr
355	360			365
Glu Gly Pro Pro	Asp Lys Glu Cys Ala Val	Thr	Cys	Arg	Tyr	Asp	Lys
370	375		380
Asn Thr Asp Val	Asn Val Val Thr Gin Ala	Arg	Asn	Arg	Pro	Thr	Thr
385	390	395					400
Łeu Thr Gly Cys	Lys Lys Gly Lys Asn Phe	Ser	Phe	Ala	Gly	Thr	Val
	405 410					415
Ile Glu Gly Pro	Cys Asn Phe Asn Val Ser	Val	Glu	Asp	Ile	Leu	Tyr
420	42S				430
Gly Asp His Glu	Cys Gly Ser Leu Leu Gin	Asp	Thr	Ala	Leu	Tyr	Leu
435	440			445
Leu Asp Gly Met	Thr Asn Thr Ile Glu Asn	Ala	Arg	Gin	Gly	Ala	Ala
450	455		460
Arg Val Thr Ser	Trp Leu Gly Arg Gin Leu	Ser	Thr	Ala	Gly	Lys	Lys
465	470	475					480
Leu Glu Arg Arg	Ser Lys Thr Trp Phe Gly	Ala	Tyr	Ala	Leu
	485 490
<210> 5
<211> 495
<212> PRT
<213> CSFV Erns	mutant 297 K
<400> 5
Met Glu Leu Asn	His Phe Glu Leu Leu Tyr	Lys	Thr	Ser	Lys	Gin	Lys
1	5 10					15
Pro Val Gly Val	Glu Glu Pro Val Tyr Asp	Thr	Ala	Gly	Arg	Pro	Leu
20	25				30
Phe Gly Asn Pro	Ser Glu Val His Pro Gin	Ser	Thr	Leu	Lys	Leu	Pro
35	40			45
His Asp Arg Gly	Arg Gly Asp Ile Arg Thr	Thr	Leu	Arg	Asp	Leu	Pro
50	55		60
Arg Lys Gly Asp	Cys Arg Ser Gly Asn His	Leu	Gly	Pro	Val	Ser	Gly
65	70	75					80
Ile Tyr Ile Lys	Pro Gly Pro Val Tyr Tyr	Gin	Asp	Tyr	Thr	Gly	Pro
	85 90					95

PL 202 509 B1

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

. Phe 105

; Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Pbe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

Lys

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 350

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 330

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420 425 430

PL 202 509 B1

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cy»

Gly

Ser 440

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Het

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 440

Arg

Gin

Gly Ala

Ala 465

Arg

val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

<210> 6 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Ems mutant 297 L <400> €

Het Glu Łeu Asn His Phe Glu beu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys
1	5	10	15
Pro	Val Gly Val Glu Glu	Pro Val Tyr Asp Thr	Ala Gly Arg Pro Leu
	20	25	30
Phe	Gly Asn Pro Ser Glu	Val His Pro Gin Ser	Thr Leu Lys Leu Pro
	35	40	45
His	Asp Arg Gly Arg Gly	Asp Ile Arg Thr Thr	Leu Arg Asp Leu Pro
	50	55	60
Arg	Lys Gly Asp Cys Arg	Ser Gly Asn His Leu	Gly Pro Val Ser Gly
65	70	75	80
Ile	Tyr Ile Lys Pro Gly	Pro Val Tyr Tyr Gin	Asp Tyr Thr Gly Pro
	85	90	95
Val	Tyr His Arg Ala Pro	Leu Glu Phe Phe Asp	Glu Ala Gin Phe Cys
	100	105	110
Glu	Val Thr Lys Arg Ile	Gly Arg Val Thr Gly	Ser Asp Gly Lys Leu
	115	120	125
Tyr	His Ile Tyr Val Cys	Val Asp Gly Cys Ile	Leu Leu Lys Leu Ala
	130	135	140
Lys	Arg Gly Thr Pro Arg	Thr Leu Lys Trp Ile	Arg Asn Phe Thr Asn
145	150	155	160
Cys	Pro Leu Trp Val Thr	Ser cys Ser Asp Asp	Gly Ala Ser Gly Ser
	165	170	175
Lys	Asp Lys Lys Pro Asp	Arg Met Asn Lys Gly	Lys Leu Lys Ile Ala
	180	185	190
Pro	Arg Glu His Glu Lys	Asp Ser Lys Thr Lys	Pro Pro Asp Ala Thr
	195	200	205
Ile	Val Val Glu Gly Val	Lys Tyr Gin Ile Lys	Lys Lys Gly Lys Val
	210	215	220
Lys	Gly Lys Asn Thr Gin	Asp Gly Leu Tyr His	Asn Lys Asn Lys Pro

PL 202 509 B1

225 230 235 240

Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys 245	Ala Leu Leu Ala Trp 250	Ala Val 255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val	Ala Ala Olu Asn Ile	Thr Gin
260 265	270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn	Gly Ile Gin Arg Ala	Met Tyr
275 280	285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu Leu	Gly Ile Trp Pro Glu	Lys Ile
290 295	300
Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala	Thr Asp Thr Glu Leu	Lys Glu
305 310	315	320
Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu	Arg Thr Asn Tyr Thr	Cys Cys
325	330	335
Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys	His Gly Trp Cys Asn	Trp Tyr
340 345	350
Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met	Asn Arg Thr Gin Thr	Asn Leu
355 360	365
Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys	Ala Val Thr Cys Arg	Tyr Asp
370 375	380
Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr	Gin Ala Arg Asn Arg	Pro Thr
385 390	395	400
Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys	Asn Phe Ser Phe Ala	Gly Thr
405	410	415
Val Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn	Val Ser Val Glu Asp	Ile Leu
420 425	430
Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu	Leu Gin Asp Thr Ala	Leu Tyr
435 440	445
Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile	Glu Asn Ala Arg Gin	Gly Ala
450 455	460
Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg	Gin Leu Ser Thr Ala	Gly Lys
465 470	475	480
Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp	Phe Gly Ala Tyr Ala	Leu
485	490	495
<210> 7
<211> 494
<212> PRT
<213> CSFV Erns mutant 301- delecja
<400> 7
Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu	Tyr Lys Thr Ser Lys	Gin Lys
1 5	10	15
Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr ,	Asp Thr Ala Gly Arg	Pro Leu
20 25	30

PL 202 509 B1

Phe

; Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

, Val

His 40

i Prc

i Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

- Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

. His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 100

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Glu

Lys

Ile

Cys

Lys 305

Gly

Val

Pro

Thr

His 310

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr 315

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile 320

Arg

Gly

Met

Asp 325

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr 330

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys 335

Arg

Leu

Gin

Arg

His 340

Glu

Trp

Asn

Lys

His 345

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp 350

Tyr

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu .

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

355 360 365

PL 202 509 B1

Glu

Gly 370

Pro

Asp

Lys

Glu 375

cys

Ala

Val

Thr

Cys 380

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn 385

Thr

Asp

Val

Asn

Val 390

Val

Thr

Gin

Ala

Arg 395

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr 400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys 405

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe 410

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr 415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro 420

Cys

Asn

Phe

Asn

Val 425

Ser

Val

Glu

Asp

Ile 430

Leu

Tyr

Gly Aap

His 435

Olu

Cys

Gly

Ser

Leu 440

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala 445

Leu

Tyr

Leu

Asp 450

Gly

Met

Thr

Asn

Thr 455

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg 460

Gin

Gly

Ala

Arg 465

Val

Thr

Ser

Trp

Leu 470

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser 475

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys 480

Leu

Glu

Arg

Ser 485

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly 490

Ala

Tyr

Ala

Leu

<210> 8 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Ems mutant 302 A <400> 8

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

ASp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly

Ser

165 170 175

PL 202 509 B1

Lys

Asp

Lys

Lys iao

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

. Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Sin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Ala

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495 <210> 9

PL 202 509 B1 <211> 495 <212> PRT <213> CSPV Erna mutant 305 G <400> 9

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Siu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Olu

Val

Bis 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu Lys 45

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro

Gly

Pro

Val

Tyr

Gin

Asp

Tyr Thr

Gly

Pro

Θ5 90 95

Val Tyr

Glu val

Tyr His 130

Lys Arg 145

Cys Pro

His Arg 100

Thr Lys 115

Ile Tyr

Gly Thr

Leu Trp

Ala Pro

Arg Ile

Val Cys

Pro Arg 150

Val Thr

Leu Glu

Gly Arg 120

Vał Asp 135

Thr Leu

Ser Cys

Phe Phe 10S

Val Thr

Gly Cys

Lys Trp

Ser Asp

Asp Glu

Gly Ser

Ile Leu 140

Ile Arg 155

Asp Gly

Ala Gin 110

Asp Gly 125

Leu Lys

Asn Phe

Phe Cys

Lys Leu

Leu Ala

Thr Asn 160

Gly Ser

Ala Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr

275

280

285

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Gly

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

PL 202 509 B1

305 310 3X5 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 36S

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Asp

Lys 375

Glu

cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 38S

Asn

Thr

Aep

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Gin

Asp

Thr 44S

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495 <210> 10 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 340 G <400> 10

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

PL 202 509 B1

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 13S

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Łeu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Aep

Lys

Lys ISO

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Łeu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Gly 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435 440 445

PL 202 509 B1

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

<210» 11 <211» 493 <212» PRT <213» CSPV Ems mutant 342-6- delecja <400» 11

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Olu

Leu

Leu Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr Asp 25

Thr

Ala

Gly Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro

Gly

Pro

Val

Tyr Tyr

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly

Pro

90 95

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

¹⁴⁵ ISO 155 ISO

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Asp

Ala

Thr

195 200 205

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245 250 255

PL 202 509 B1

Ile

: Thr

Ile

Leu 260

Leu

. Tyr

- Gin Pro

» Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

> Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

. Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 31S

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

Bis

Trp

Asn

Lys

Gly Trp 345

Cys

Asn

Trp

Tyr 350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp 355

Ile

Gin

Leu

Met

Asn 360

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn 365

Leu

Thr

Glu

Gly

Pro 370

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys 375

Ala

Val

Thr

Cys Arg 380

Tyr Asp

Lys

Asn

Thr 385

Asp

Val

Asn

Val

Val 390

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn 395

Arg

Pro

Thr

Leu 400

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys 405

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser 410

Phe

Ala

Gly

Thr

Val 415

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys 420

Asn

Phe

Asn

Val

Ser 425

Val

Glu

Asp

Ile

Leu 430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu 435

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu 440

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu 445

Tyr

Leu

Asp

Gly 450

Met

Thr

Asn

Thr

Ile 455

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin 460

Gly

Ala

Arg

Val 465

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly 470

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr 475

Ala

Gly

Lys

Leu 480

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490

<210> 12 <211> 494 <212> PRT <213> CSFV :

Erns

mutant

342-

delecja

<400> 12 Met Glu Leu 1

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro Val Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe Gly Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His Asp Arg

Gly

Arg

Gly

Asp

Ile

Arg

Thr

Leu

Arg

Asp

Leu

Pro

PL 202 509 B1

55 60

Arg 65

Lys

Gly Asp

Cys

Arg 70

Ser

Qly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Trp

Asn

Lys

His 345

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp 350

Tyr

Asn

Ile

Asp

Pro 355

Trp

Ile

Gin

Leu

Met 360

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr 365

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly 370

Pro

Asp

Lys

Glu 375

Cys

Ala

Val

Thr

Cys 380

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

PL 202 509 B1

38S

390

395

400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys 405

Łys

Gly

Lys

Asn

Phe 410

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr 415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro 420

Cys

Asn

Phe

Asn

Val 425

Ser

Val

Glu

Asp

Ile 430

Leu

Tyr

Gly

Asp

His 435

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu 440

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala 445

Leu

Tyr

Leu

Aep 450

Gly

Met

Thr

Asn

Thr 4S5

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg 460

Gin

Gly

Ala

Arg 465

Val

Thr

Ser

Trp

Leu 470

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser 475

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys 480

Leu

Glu

Arg

Ser

Łys

Thr

Trp

Phe

Gly Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 <210> 13 <211» 495 <212> PRT

<213> CSFV Ems mutant 343 G

<400> 13

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 135

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

PL 202 509 B1

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Het

Tyr

Leu

Arg Gly 290

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Gly

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495 <210> 14 <211> 492 <212> PRT <213> CSFV Erns 345-7- delecja

PL 202 509 B1 <400> 14

Met Glu 1	i Leu	. Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr 5 10	Lys	Thr	Ser	Lys	Gin 15	Lys
Pro Val	Gly	Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp 20 25	Thr	Ala	Gly	Arg 30	Pro	Leu
Phe Gly	Asn 35	Pro Ser Glu Val	His Pro Gin 40	Ser	Thr	Leu 45	Lys	Leu	Pro
His Aep 50	Arg	Gly Arg Gly Asp 55	Ile Arg Thr	Thr	Leu 60	Arg	Asp	Leu	Pro
Arg Lys 65	Gly	Asp Cys Arg Ser 70	Gly Asn His	Leu 75	Gly	Pro	Val	Ser	Gly 80
Ile Tyr	Ile	Lys Pro Gly Pro 85	Val Tyr Tyr 90	Gin	Asp	Tyr	Thr	Gly 95	Pro
Val Tyr	His	Arg Ala Pro Leu 100	Glu Phe Phe 105	Asp	Glu	Ala	Olu 110	Phe	Cys
Glu Val	Thr 115	Lys Arg Ile Gly	Arg Val Thr 120	Gly	Ser	Asp 125	Gly	Lys	Leu
Tyr His 130	Ile	Tyr val cys Val 135	Asp Gly Cys	Ile	Leu 140	Leu	Lys	Leu	Ala
Lys Arg 145	Gly	Thr Pro Arg Thr 150	Leu Lys Trp	Ile 155	Arg	Asn	phe	Thr	Asn 160
Cys Pro	Leu	Trp Val Thr Ser 165	Cys Ser Asp 170	Asp	Gly	Ala	Ser	Gly 175	Ser
Lys Asp	Lys	Lys Pro Asp Arg 180	Met Asn Lys 185	Gly	Lys	Leu	Lys 190	Ile	Ala
Pro Arg	Glu 19S	His Glu Lys Asp	Ser Lys Thr 200	Lys	Pro	Pro 205	Asp	Ala	Thr
Ile Val 210	Val	Glu Gly Val Lys 215	Tyr Gin Ile	Lys	Lys 220	Lys	Gly	Lys	Val
Lys Gly 225	Lys	Asn Thr Gin Asp 230	Gly Leu Tyr	His 235	Asn	Lys	Asn	Lys	Pro 240
Pro Glu	Ser	Arg Lys Lys Leu 24S	Glu Lys Ala 250	Leu	Leu	Ala	Trp	Ala 255	Val
Ile Thr	Ile	Leu Leu Tyr Gin 260	Pro Val Ala 265	Ala	Glu	Asn	Ile 270	Thr	Gin
Trp Asn	Leu 275	Ser Asp Asn Gly	Thr Asn Gly 280	Ile	Gin	Arg 285	Ala	Met	Tyr
Leu Arg 290	Gly	Val Asn Arg Ser 295	Leu His Gly	Ile	Trp 300	Pro	Glu	Lys	Ile
Cys Lys 305	Gly	Val Pro Thr His 310	Leu Ala Thr	Asp 315	Thr	Glu	Leu	Lys	Glu 320
Ile Arg -	Gly	Met Met Asp Ala ,	Ser Glu Arg	Thr	Asn	Tyr	Thr	Cys	Cys

325 330 335

PL 202 509 B1

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Trp 345

cys

Asn

Trp Tyr

Asn 350

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile 355

Gin

Leu

Met

Asn

Arg 360

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu 365

Thr

Glu

Gly

Pro

Pro 370

Aap

Lys

Glu

cys

Ala 375

val

Thr

Cys

Arg

Tyr Asp 3B0

Lys

Asn

Thr

Asp 385

Val

Asn

Val

Thr 390

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg 395

Pro

Thr

Leu

Thr 400

Gly

Cys

Lys

Gly 405

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe 410

Ala

Gly

Thr

Val

Ile 415

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn 420

Phe

Asn

Val

Ser

Val 425

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr 430

Gly Asp

His

Glu

cys 435

Gly

Ser

Leu

Gin 440

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr 445

Łeu

Leu

Αβρ

Gly

Met 450

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu 455

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly 460

Ala

Arg

Val

Thr 465

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg 470

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala 475

Gly

Lys

Leu

Glu 480

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 <210> 15 <211> 493 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 345-6- delecja <400> 15

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His

Ile

Tyr

val

Cys

Val

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu

Lys

Leu

Ala

PL 202 509 B1

130

135

140

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg ISO

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asa 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

ASp

Ala

Thr

Ile

Val

GlU

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Gly

Lys

Val

210 215 320

Lys Oly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro 225 230 235 240

Pro

i Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

, Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 31S

Thr

GlU

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Gly 345

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr 350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp 355

Ile

Gin

Leu

Met

Asn 360

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn 36S

Leu

Thr

Glu

Gly

Pro 370

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys 375

Ala

Val

Thr

Cys

Arg 380

Tyr

Asp

Lys

Asn

Thr 385

Asp

Val

Asn

Val

Val 390

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn 39S

Arg

Pro

Thr

Leu 400

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys 405

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser 410

Phe

Ala

Gly

Thr

Val 415

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys 420

Asn

Phe

Asn

Val

Ser 425

Val

Glu

Asp

Ile

Leu 430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu 435

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu 440

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu 445

Tyr

Leu

Asp

Gly 450

Met

Thr

Asn

Thr

Ile 455

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin 460

Gly

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly .

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Leu

PL 202 509 B1

465 470 475 480

Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 <90 <210> 16 <211» 495 <212» PRT <213» CSFV Ems mutant 345 A

<400> 16
Met Olu 1	Leu Asn His Phe Glu 5	Leu Leu	Tyr 10	Lys	Thr	Ser	Lya	Gin 15	Lys
Pro Val	Gly Val Glu Glu Pro 20	Val Tyr 25	Asp	Thr	Ala	Gly Arg 30	Pro	Leu
Phe Gly	Asn Pro Ser Glu Val 35	His Pro 40	Gin	Ser	Thr	Leu 45	Lys	Leu	Pro
His Asp 50	Arg Gly Arg Gly Asp 55	Ile Arg	Thr	Thr	Leu 60	Arg	Asp	Leu	Pro
Arg Lys 65	Gly Asp Cys Arg Ser 70	Gly Asn	His	Leu 75	Gly	Pro	Val	Ser	Gly 80
Ile Tyr	Ile Lys Pro Gly Pro 85	Val Tyr	Tyr 90	Gin	Asp	Tyr	Thr	Gly 95	Pro
Val Tyr	His Arg Ala Pro Leu 100	Glu Phe 105	Phe	Asp	Glu	Ala	Gin 110	Phe	Cys
Glu Val	Thr Lys Arg Ile Gly 115	Arg Val 120	Thr	Gly	Ser	Asp 125	Gly	Lys	Leu
Tyr His 130	Ile Tyr Val Cys Val 135	Asp Gly	Cys	Ile	Leu 140	Leu	Lys	Leu	Ala
Lys Arg 145	Gly Thr Pro Arg Thr 150	Leu Lys	Trp	Ile 155	Arg	Asn	Phe	Thr	Asn 160
Cys Pro	Leu Trp Val Thr Ser 165	Cys Ser	Asp 170	Asp	Gly	Ala	Ser	Gly 175	Ser
Lys Asp	Lys Lys Pro Asp Arg 180	Met Asn 185	Lys	Gly	Lys	Leu	Lys 190	Ile	Ala
Pro Arg	Glu His Glu Lys Asp 195	Ser Lys 200	Thr	Lys	Pro	Pro 205	ASp	Ala	Thr
Ile Val 210	Val Glu Gly Val Lys 215	Tyr Gin	Ile	Lys	Lys 220	Lys	Gly	Lys	Val
Lys Gly 225	Lys Asn Thr Gin Asp 230	Gly Leu	Tyr	His 235	Asn	Lys	Asn	Lys	Pro 240
Pro Glu	Ser Arg Lys Lys Leu 245	Glu Lys	Ala 250	Leu	Leu	Ala	Trp	Ala 255	Val
Ile Thr	Ile Leu Leu Tyr Gin 260	Pro Val 265	Ala	Ala	Glu	Asn	Ile 270	Thr	Gin

PL 202 509 B1

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 3X0

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Ala 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 355

Thr

Asn

Łeu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cy·

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Łeu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495 <210> 17 <211> 493 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 346-7-delecja <400> 17

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

vai 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn

His

Leu

Gly

Pro

Val

Ser

Gly

70 75 80

PL 202 509 B1

Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyi 85	• Tyr Gin Asp 90	Tyr Thr Gly Pro 95
Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe	i Phe Asp Glu	Ala Gin Phe Cys
100 105		110
Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val	Thr Gly Ser	Asp Gly Lys Leu
115 120		125
Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Aap Gly	Cys Ile Leu	Leu Lys Leu Ala
130 ' 135	140
Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lye	Trp Ile Arg	Asn Phe Thr Asn
145 150	155	160
Cys pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser	Asp Asp Gly	Ala Ser Gly Ser
165	170	175
Lye Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn	Lys Gly Lys	Leu Lys Ile Ala
180 185		190
Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys	Thr Lys Pro	Pro Asp Ala Thr
195 200		205
Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin	Ile Lye Lys	Lys Gly Lye Val
210 215	220
Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu	Tyr His Asn	Lys Asn Lys Pro
225 230	235	240
Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys	Ala Leu Leu	Ala Trp Ala Val
245	250	255
Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val	Ala Ala Glu	Asn Ile Thr Gin
260 265		270
Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn	Gly Ile Gin	Arg Ala Met Tyr
275 280		285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His	Gly Ile Trp	Pro Glu Lys Ile
290 295	300
Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala	Thr Asp Thr	Glu Leu Lys Glu
305 310	31S	320
Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu	Arg Thr Asn	Tyr Thr Cys Cys
325	330	335
Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Lys	Trp Cys Asn	Trp Tyr Asn Ile
340 345		350
Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg	Thr Gin Thr	Asn Leu Thr Glu
355 360		365
Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val	Thr Cys Arg	Tyr Asp Lys Asn
370 375	380
Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala ,	Arg Asn Arg	Pro Thr Thr Leu
385 390	395	400
Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe	Ser Phe Ala	Gly Thr Val Ile

40S 410 415

PL 202 509 B1

Glu

Gly

Pro

Cye 420

Asn

Phe

Asn

Val

Ser 425

Val

Glu

Asp

Ile

Leu 430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu 435

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu 440

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu 445

Tyr

Leu

Asp

Gly 450

Met

Thr

Asn

Thr

Ile 455

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin 460

Gly

Ala

Arg

Val 465

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly 470

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr 475

Ala

Gly

Lys

Leu. 480

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 <210» 18 <211> 494 <212> PRT

<213» CSFV :

Brna

mutant

346-

delecja

<400» 18

Met

Glu

Leu

Asn

His

Phe

Glu

Leu

Tyr

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin

Lys

1

5

10

15

Pro

Val

Gly

Val

Glu

Pro

Val

Tyr

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg

Pro

Leu

20

25

30

Phe

Gly

Asn

Pro

Ser

Glu

Val

His

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu

Lys

Leu

Pro

35

40

45

His

Asp

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp

Ile

Arg

Thr

Leu

Arg

Asp

Leu

Pro

50

55

60

Arg

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn

His

Leu

Gly

Pro

Val

Ser

Gly

65

70

75

80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro

Gly

Pro

Val

Tyr

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly

Pro

85

90

95

Val

Tyr

His

Arg

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin

Phe

Cys

100

105

110

Glu

Val

Thr

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

115

120

125

Tyr

His

Ile

Tyr

Val

Cys

Val

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu

Lys

Leu

Ala

130

135

140

Lys

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

145

150

155

160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly

Ser

165

170

175

Lys

Asp

Lys

Pro

Asp

Arg

Met

Asn

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys

Ile

Ala

180

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Gly

Lys

Val

PL 202 509 B1

210 215 220

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 25S

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Łeu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 2Θ0

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Olu 320

Tle

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp 350

Tyr

Asn

Ile

Asp

Pro 355

Trp

Ile

Gin

Leu

Met 360

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr 365

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly 370

Pro

Asp

Lys

Glu 375

Cys

Ala

Val

Thr

Cys 380

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn 385

Thr

Asp

Val

Asn

Val 390

Val

Thr

Gin

Ala

Arg 395

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr 400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys 405

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe 410

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr 415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro 420

Cys

Asn

Phe

Asn

Val 425

Ser

Val

Glu

Asp

Ile 430

Leu

Tyr

iy

Asp

His 435

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu 440

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala 445

Leu

Tyr

Leu

Asp 450

Gly

Met

Thr

Asn

Thr 455

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg 460

Gin

Gly

Ala

Arg 465

Val

Thr

Ser

Trp

Leu 470

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser 475

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys 480

Leu

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 <210> 19 <211> 495 <212> PRT

<213> CSFV Erns	mutant	346 K
<400> 19 Met Glu Leu Asn	His Phe	Glu Leu	Leu Tyr Lys	Thr Ser Lys Gin Lys
1	5		10	15

PL 202 509 B1

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Aan 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Łys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr

Łys

Arg

Ile

Gly Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

lis 120 125

Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Łys Leu Ala 130 135 140

Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn 145 150 155 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340 345 350

PL 202 509 B1

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

cys 405

Lys

Łys

Gly Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Łys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495 <210> 20 <211> 495 <212> PRT

<213> CSFV Erns

mutant :

346 :

L

<400> 20 Met Glu Leu 1

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

PL 202 509 B1

Cys Pro Leu

Trp Val Thr 165

Ser

Cys Ser Asp 170

Asp Gly Ala Ser

Gly Ser 175

Lys

Asp

Lys

Pro

ASP

Arg

Met

Asn

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys

Ile

Ala

ISO

185

190

Pro

Arg

Glu

His

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr

Lys

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Gly

Lys

Val

210

215

220

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

2Θ0

285

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

His

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

290

29S

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Leu

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340

345

350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

375

380

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr

385

390

395

400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

465

470

475

480

Lys

Leu

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495

PL 202 509 B1 <210» 21 <211» «95 <212» PRT <213» CSPV Bras mutant 297 K 346 K <400» 21

Met Glu Leu 1	Asn His 5	Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr 10	Ser Lys	Gin 15	Lys
Pro Val Gly	Val Glu 20	Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala 25	Gly Arg 30	Pro	Leu
Phe Gly Asn 35	Pro Ser	Glu Val His Pro Gin Ser Thr 40	Leu Lys 45	Leu	Pro
His Asp Arg 50	Gly Arg	Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu 55 60	Arg Asp	Łeu	Pro
Arg Lys Gly Asp Cys 65	Arg Ser Gly Asn His Leu Gly 70 75	Pro Val	Ser	Gly 80
ile Tyr Ile	Lys Pro 85	Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp 90	Tyr Thr	Gly 95	Pro
Val Tyr His	Arg Ala 100	Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu 105	Ala Gin 110	Phe	Cys
Glu Val Thr 115	Lys Arg	Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser 120	Asp Gly 125	Lys	Leu
Tyr His Ile 130	Tyr Val	Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu 135 140	Leu Lys	Leu	Ala
Lys Arg Gly 145	Thr Pro	Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg 150 155	Asn Phe	Thr	Asn 160
Cys Pro Leu	Trp Val 165	Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly 170	Ala Ser	Gly 175	Ser
Lys Asp Lys	Lys Pro 180	Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys 185	Leu Lys 190	Ile	Ala
Pro Arg Glu 195	His Glu	Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro 200	Pro Asp 205	Ala	Thr
Ile Val Val 210	Glu Gly	Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys 215 220	Lys Gly	Lys	Val
Lys Gly Lys 225	Asn Thr	Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn 230 235	Lys Asn	Lys	Pro 240
Pro Glu Ser	Arg Lys 245	Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu 250	Ala Trp	Ala 255	Val
Ile Thr Ile	Leu Leu 260	Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu 265	Asn Ile 270	Thr	Gin
Trp Asn Leu 275	Ser Asp	Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin 280	Arg Ala 285	Met	Tyr
Leu Arg Gly	Val Asn	Arg Ser Leu Lys Gly Ile Trp	Pro Glu	Lys	Ile

PL 202 509 B1

290

295

300

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr ³¹⁰

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435 440 445

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495 <210> 22 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 297 Κ 346 L <400> 22

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Giy 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

PL 202 509 B1

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

. Pro Leu Glu Phe Phe 105

ί Asp

Olu

Ala

Gin 110

Phe

cys

Glu

. Val

Thr 115

Lys

Arg

r Ile

: Gly Arg Val Thr 120

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val Asp Gly Cys 135

Ile

Łeu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr Leu Lys Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser Cys Ser Asp 170

Aep

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 1Θ0

Pro

Asp

Arg Met Asn Lys 185

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp Ser Lys Thr 200

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys Tyr Gin Ile 215

Lys

Lys 220

Lys

Gly Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp Gly Leu Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu Glu Lys Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin Pro Val Ala 265

Ala

Olu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly Thr Asn Gly 280

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser Leu Lys Gly 295

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His Leu Ala Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 32S

Asp

Ala Ser Glu Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp Asn Lys Leu 345

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin Leu Met Asn 360

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Asp

Lys Glu Cys Ala 375

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 335

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val Val Thr Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys Gly Lys Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys .

Asn Phe Asn Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420 425 430

PL 202 509 B1

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser Leu 440

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Het

Thr

Asn 455

Thr Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 48S

Ser

Lys

Thr Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

<210> 23 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Bras mutant 297 L 346 L <400> 23

Net 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

•Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225 230 235 240

PL 202 509 B1

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Łeu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg Gly 290

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

Leu

Gly Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Łeu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495 <210? 24 <211? 495 <212? PRT <213? BVDV białko Erns <400? 24

Met 1

Glu

Leu

Ile

Thr 5

Asn

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Tyr

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Ala

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Gin

Ala

Gly

Asn 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Glu

Arg

Gly

Val

Ile

His

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu

Lys

LeU

Pro

PL 202 509 B1

35

40

45

His

Lys 50

Arg

Gly

Glu

Arg

Glu 55

Val

Pro

Thr

Asn

Leu 60

Ala

Ser

Leu

Pro

Lys 65

Arg

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

Ser

Łys 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Leu

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Leu

Phe

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Łys

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Glu

Ala

Ser 110

Met

cy·

Glu

Thr

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Ser

Arg

Leu

Tyr

His

Ile

Tyr

Val

Cys

Ile

Asp Gly Cys

Ile

Val

Lys

Ser

Ala

130 135 140

Thr Lys Asp Arg Gin Lys Val Leu Lys Trp Val His Asa Lys Leu Asn 145 150 155 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Ser

Cys

Ser

Αβρ 170

Thr

Lys

ASp

Glu

Gly 175

Val

Arg

Lys

Lys 180

Gin

Lys

Pro

Asp 185

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly 190

Arg

Met

Lys

Ile

Thr 195

Pro

Lys

Glu

Ser

Glu 200

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr 205

Lys

Pro

Asp

Ala 210

Thr

Ile

Val

Asp 215

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin 220

Val

Lys

Gly 225

Lys

Val

Lys

Ser

Lys 230

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly 235

Leu

Tyr

His

Asn

Lys 240

Asn

Lys

Pro

Gin

Glu 245

Ser

Arg

Lys

Leu 250

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu 255

Ala

Trp

Ala

Ile

Ile 260

Ala

Leu

Val

Phe

Phe 265

Gin

Val

Thr

Met

Gly 270

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin 275

Trp

Asn

Leu

Gin

Asp 280

Asn

Gly

Thr

Glu

Gly 285

Ile

Gin

Arg

Ala

Met 290

Phe

Gin

Arg

Gly

Val 295

Asn

Arg

Ser

Leu

His 300

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu 305

Lys

Ile

Cys

Thr

Gly 310

Val

Pro

Ser

His

Leu 315

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu 320

Leu

Lys

Ala

Ile

His 325

Gly

Met

Asp

Ala 330

Ser

Glu

Lys

Thr

Asn 335

Tyr

Thr

Cys

cys

Arg 340

Leu

Gin

Arg

His

Glu 345

Trp

Asn

Lys

His

Gly 350

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr 355

Asn

Ile

Glu

Pro

Trp 360

Ile

Leu

Met

Asn 365

Lys

Thr

Gin

Ala

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly

Gin

Pro

Leu

Arg

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

PL 202 509 B1

370

375

380

Arg 385

Tyr

Asp

Arg

Asp

Ser 390

Asp

Leu

Asn

Val

Val 395

Thr

Gin

Ala

Arg

A»P 400

Ser

Pro

Thr

Pro

Leu 405

Thr

Gly

cys

Lys

Łys 410

Gly

Łys

Asn

Phe

Ser 415

Phe

Ala

Gly

Ile

Leu 420

Val

Gin

Gly

Pro

Cys 425

Asn

Phe

Glu

Ile

Ala 430

Val

Ser

Asp

Val

Leu 435

Phe

Lys

Glu

His

Asp 440

Cys

Thr

Ser

Val

Ile 445

Gin

*»P

Thr

Ala

His 450

Tyr

Leu

Val

Asp

Gly 455

Met

Thr

Asn

Ser

Leu 460

Glu

Ser

Ala

Arg

Gin 465

Gly

Thr

Ala

Lys

Leu 470

Thr

Trp

Leu

Gly Arg 475

Gin

Leu

Gly

Ile 480

Leu

Gly

Lys

Leu 485

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys 490

Thr Trp

Phe

Gly

Ala 495

<210» 25 <211» 495 <212> PRT <213» CSFV białko Eictea <400» 25

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 1 S 10 15

Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30

Phe

Gly

Α3Π 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly

Ser

165 170 175

PL 202 509 B1

Lys

Asp

Lys

Lye 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly Lye

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Łys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lye Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lye Lye

Łys

Gly

Lys

Val

210 215 220

Lys 225

Gly

Lye

Asn

Thr

Gin 230

Aap

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Łys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu

Ser

Aap

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275 280 285

Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly ile Trp pro Glu Lys Ile 290 295 300

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 31S

Thr

Glu

Leu

Łys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

Hia

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Aan 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 35S

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Ly3

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495 <210> 26 <211> 495

PL 202 509 B1 <212> PRT <213> CSFV Ems mutant 300 O <400> 26

Met 1

Glu

Łeu

Asn

His 5

Phe

¹ Glu

; Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Łys

Gin 15

Łys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Łeu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Łeu 45

Lye

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly Arg

Gly Asp 55

Ile

Arg

Thr

Łeu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly Asp

cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Łys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Łys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Łeu 140

Łeu

Łys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Łeu

Łys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Łys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Łys

Asn

Lys

pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Łeu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Gly 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Ly3

Glu 320

PL 202 509 B1

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Olu

Arg Thr Asn Tyr 330

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 34S

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Olu 370

Gly

Pro

Asp

Lys 375

Glu

cys

Ala

Val

Thr 380

cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

cys 405

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Oly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

cys

Gly

Ser 440

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu.

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 495 <210> 27 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 300 G 302 A <400> 27

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

cys

Glu

Val

Thr

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

PL 202 509 B1

115

120

125

Tyr

His

Ile

Tyr

Val

Cye

Val

Asp

Gly

Cys

Ile

Łeu

Łys

Łeu

Ala

130

135

140

Łye

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Łeu

Łye

Trp

Ile

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

145

150

155

160

Cys

Pro

Łeu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly

Ser

165

170

175

Łye

Asp

Łye

Pro

Aep

Arg

Met

Asa

Lys

Gly

Łys

Leu

Łys

Ile

Ala

180

185

190

Pro

Arg

Glu

Bis

Glu

Łye

Asp

Ser

Łye

Thr

Łye

Pro

Asp

Ala

Thr

195

200

205

Ile

Val

Glu

Gly

Val

Łye

Tyr

Gin

Ile

Łye

Łys

Gly Lys

val

210

215

220

Łys 225

Gly

Łys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Łeu

Tyr

Bis 235

Asn

Łys

Asn

Łys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Łys

Łeu

Glu

Łya

Ala

Łeu

Ala

Trp

Ala

Val

245

250

255

Ile

Thr

Ile

Łeu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260

265

270

Trp

Asn

Łeu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275

230

285

Łeu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Łeu

His

Gly

Ile

Gly

Pro

Ala

Łys

Ile

290

295

300

Cys

Lys

Gly

Val

Pro

Thr

His

Łeu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Łys

Glu

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys

325

330

335

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Łeu

355

360

365

Thr

Glu

Gly

Pro

Asp

Łys

Glu

Cys

Ala

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr

Asp

370

330

375

Lys 335

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys

Łys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

405

410

415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn.

Val

Ser

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

420

425

430

Tyr

Gly Asp

His

Glu

Cys

Gly

Ser

Łeu

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Leu Asp

Gly

Met

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly

Ala

450

455

460

Ala Arg Val Thr Ser Trp Łeu Gly Arg Gin Łeu Ser Thr Ala Gly Łye

465

470

475

480

Łya Łeu Olu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Łeu

485

490

495

PL 202 509 B1

Claims

1. Żywa szczepionka zawierająca atenuowany pestiwirus i ewentualnie substancje pomocnicze, znamienna tym, że pestiwirus ma unieczynnioną aktywność RNazy związaną z glikoproteiną E^RNS w wyniku delecji i/lub mutacji co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny.

2. Szczepionka według zastrz. 1, znamienna tym, że delecję i/lub mutacje umiejscowione są w aminokwasach glikoproteiny w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji dla szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadają cych im pozycjach w innych szczepach.

3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że aktywność RNazy jest unieczynnioną przez delecję i/lub mutację umiejscowioną w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji dla szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadają cych jej pozycjach w innych szczepach, w glikoproteinie.

4. Szczepionka według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że aktywność RNazy jest unieczynnioną przez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających jej pozycjach w innych szczepach, w glikoproteinie.

5. Szczepionka według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że aktywność RNazy jest unieczynnioną przez mutację reszty histydynowej w pozycjach 297 i 346 do leucyny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających jej pozycjach w innych szczepach, w glikoproteinie.

6. Szczepionka według zastrz. 1 zawierająca pestiwirus BVDV, znamienna tym, że aktywność RNazy jest unieczynnioną przez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających jej pozycjach w innych szczepach BVDV, w glikoproteinie.

7. Szczepionka według zastrz. 1 zawierająca pestiwirus BVDV, znamienna tym, że aktywność RNazy jest unieczynnioną przez mutację reszty histydynowej w pozycjach 297 i 346 do leucyny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających jej pozycjach w innych szczepach BVDV, glikoproteinie.

8. Atenuowany pestiwirus, znamienny tym, że aktywność RNazy związana z glikoproteiną E^RNS jest unieczynnioną w wyniku delecji i/lub mutacji co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny, przy czym aktywność RNazy jest unieczynnioną w wyniku delecji i/lub mutacji umiejscowionej na aminokwasach w pozycji 295 do 307 i/lub pozycji 338 do 357 jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających jej pozycjach w innych szczepach, z ograniczeniem, że aminokwasy w pozycji 297 i/lub 346 glikoproteiny nie są lizyną.

9. Pestiwirus według zastrz. 8, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku delecji i/lub mutacji aminokwasu w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadają cej jej pozycji w innych szczepach.

10. Pestiwirus według zastrz. 9, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku delecji reszty histydynowej w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadają cej jej pozycji w innych szczepach.

11. Pestiwirus według zastrz. 8, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku mutacji reszty histydyny w pozycjach 297 i 346 glikoproteiny do leucyny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadają cej jej pozycji w innych szczepach.

12. Pestiwirus według zastrz. 8, znamienny tym, że jest pestiwirusem BVDV i jego aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku delecji reszty histydyny w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach BVDV.

13. Pestiwirus BVDV według zastrz. 8, znamienny tym, że jest pestiwirusem BVDV i jego aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku mutacji reszty histydyny w pozycjach 297 i 346 glikoproteiny do leucyny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach BVDV.

PL 202 509 B1

14. Kwas nukleinowy kodujący glikoproteinę E^RNS, znamienny tym, że aktywność RNazy związana z likoproteiną unieczynnioną jest w wyniku delecji i/lub mutacji co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny, przy czym aktywność RNazy związana z glikoproteiną unieczynnioną jest w wyniku delecji i/lub mutacji aminokwasów w pozycjach od 295 do 307 i/lub od 338 do 357, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, przy założeniu, że aminokwasy w pozycji 297 i/lub 346 nie są lizyną.

15. Kwas nukleinowy według zastrz. 14, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku delecji i/lub mutacji aminokwasu w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach.

16. Kwas nukleinowy według zastrz. 15, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku delecji reszty histydynowej w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadają cej jej pozycji w innych szczepach.

17. Kwas nukleinowy według zastrz. 14 albo 15 albo 16, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku mutacji reszty histydynowej w pozycji 297 do 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, do leucyny.

18. Kwas nukleinowy według zastrz. 14 albo 15 albo 16, znamienny tym, że jest kwasem nukleinowym BVDV i jego aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku delecji reszty histydynowej w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach BVDV, w glikoproteinie.

19. Kwas nukleinowy według zastrz. 14 albo 15 albo 17, znamienny tym, że jest kwasem nukleinowym BVDV i jego aktywność RNazy unieczynnioną jest w wyniku mutacji reszty histydynowej w pozycji 297 do 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub w odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, do leucyny.

20. Zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego glikoproteinę E^RNS opisanego w zastrz. 14 do wytwarzania szczepionek nukleotydowych i/lub wektorowych.

21. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca żywą szczepionkę, zawierającą atenuowany pestiwirus, opisaną w zastrz. 1.

22. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 21 do zapobiegania lub leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt.

23. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca atenuowany pestiwirus opisany w zastrz. 8, i ewentualnie dopuszczalne farmaceutycznie substancje pomocnicze.

24. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 23 do zapobiegania lub do leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt.

25. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca kwas nukleinowy kodujący glikoproteinę E^RNS opisany w zastrz. 14, i ewentualnie dopuszczalne farmaceutycznie substancje pomocnicze.

26. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 25 do zapobiegania lub leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt.

27. Sposób atenuowania pestiwirusa, znamienny tym, że unieczynnia się aktywność RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS, przy czym aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję i/lub mutacje co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny a delecję i/lub mutacje umiejscowione są w aminokwasach w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach glikoproteiny, przy czym delecję i/lub mutacje skutkują unieczynnieniem pestiwirusa.

28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję i/lub mutację aminokwasu w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach glikoproteiny.

29. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze

PL 202 509 B1 identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach glikoproteiny.

30. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnia się poprzez mutację reszty histydynowej w pozycjach 297 i 346 do leucyny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadają cych im pozycjach w innych szczepach glikoproteiny.

31. Sposób wykrywalnego oznaczania pestiwirusa, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym unieczynnia się aktywność RNazy związaną z glikoproteiną E^RNS poprzez delecję i/lub mutacje co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny, z ograniczeniem, że aminokwasy w pozycji 297 i/lub 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach glikoproteiny, nie są lizyną oraz unieczynnienie aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS skutkuje unieczynnieniem pestiwirusa.

32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że delecję i/lub mutacje umiejscawia się w aminokwasach w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadają cych im pozycjach w innych szczepach.

33. Sposób według zastrz. 31 albo 32, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję lub mutację aminokwasu w pozycji 346 likoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadają cych im pozycjach w innych szczepach.

34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346 glikoproteiny, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadają cych im pozycjach w innych szczepach.

35. Zastosowanie szczepionki określonej w zastrz. 1, do wytwarzania leku do zapobiegania lub do leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt.

36. Zastosowanie atenuowanego pestiwirusa z zastrz. 8 do wytwarzania szczepionki do zapobiegania lub do leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt.

37. Zastosowanie kwasu nukleinowego kodującego glikoproteinę E^RNS opisanego w zastrz. 14 do wytwarzania szczepionki do zapobiegania lub do leczenia infekcji pestiwirusowych u zwierząt.

38. Sposób rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem, znamienny tym, że specyficznie atenuowany pestiwirus jest atenuowany zgodnie z procedurą opisaną w zastrz. 27, przy czym sposób obejmuje etapy, w których:

39. Sposób rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem, znamienny tym, że specyficznie atenuowany pestiwirus jest atenuowany zgodnie z procedurą opisaną w zastrz. 27, przy czym sposób obejmuje etapy, w których:

RNS (1) identyfikuje się zmodyfikowaną glikoproteinę E^RNS atenuowanego pestiwirusa przez specyRNS ficzne wiązanie mono- lub poliklonalnego przeciwciała specyficznego względem glikoproteiny E^RNS obecną w próbce uzyskanej od zwierzęcia podejrzewanego o zainfekowanie pestiwirusem lub od zwierzęcia zaszczepionego, gdzie glikoproteina została zmodyfikowana zgodnie ze sposobem z zaRNS strz. 27, a mono- lub poliklonalne przeciwciało nie wiąże się z niezmodyfikowaną glikoproteiną E^RNS;

(2) przeprowadza się korelację specyficznego wiązania mono- lub poliklonalnego przeciwciała ze zwierzęciem zaszczepionym i powiązanie braku wiązania przeciwciała ze zwierzęciem zainfekowanym pestiwirusem, przy założeniu że obecność materiału pestiwirusowego w zwierzęciu i/lub w próbce została ustalona innymi sposobami.

40. Sposób rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem, znamienny tym, że specyficznie atenuowany pestiwirus jest atenuowany zgodnie z procedurą opisaną w zastrz. 27, przy czym sposób obejmuje etapy, w których:

PL 202 509 B1 (1) identyfikuje się zmodyfikowaną glikoproteinę E^RNS pestiwirusa przez specyficzne wiązanie mono- lub poliklonalnego przeciwciała do glikoproteiny E^RNS obecnej w próbce uzyskanej od zwierzęcia podejrzewanego o zainfekowanie pestiwirusem lub od zwierzęcia zaszczepionego, gdzie glikoproteiną nie została zmodyfikowana procedurą z zastrz. 27, a mono- lub poliklonalne przeciwciała nie RNS wiążą się ze zmodyfikowaną glikoproteiną E^RNS;

41. Sposób rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem, znamienny tym, że specyficznie atenuowany pestiwirus jest atenuowany zgodnie z procedurą opisaną w zastrz. 27, przy czy sposób obejmuje etapy, w których: RNS (1) określa się nieobecność lub obecność aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNSw próbce uzyskanej od zwierzęcia podejrzewanego o zainfekowanie pestiwirusem lub od zwierzęcia zaszczepionego;

RNS (2) przeprowadza się korelację nieobecności aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNSze zwierzęciem zaszczepionym i powiązanie obecności aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS ze zwierzęciem zainfekowanym pestiwirusem.

42. Sposób rozróżniania zwierząt zainfekowanych pestiwirusem od zwierząt zaszczepionych specyficznie atenuowanym pestiwirusem, znamienny tym, że specyficznie atenuowany pestiwirus jest atenuowany zgodnie z procedurą opisaną w zastrz. 27, przy czym sposób obejmuje etapy, w których:

(1) identyfikuje się specyficzne wiązanie próbki poliklonalnych przeciwciał do nie zmodyfikowanej glikoproteiny E^RNS w pestiwirusie lub glikoproteiny E^RNS w atenuowanym pestiwirusie zgodnie z procedurą opisaną w zastrz. 27, przy czym próbkę poliklonalnych przeciwciał uzyskuje się od zwierzęcia podejrzewanego o zainfekowanie pestiwirusem lub od zwierzęcia zaszczepionego;

(2) przeprowadza się korelację wiązania przeciwciał poliklonalnych z nie zmodyfikowaną glikoproteiną E^RNS w pestiwirusie z infekcją pestiwirusową i powiązanie wiązania przeciwciał poliklonalnych z glikoproteiną E^RNS w pestiwirusie atenuowanym zgodnie z procedurą opisaną w zastrz. 27 ze zwierzęciem zaszczepionym.