PL202161B1 - Sposób wytwarzania specyficznie atenuowanej szczepionki zawierającej pestiwirusy oraz sposób wytwarzania specyficznie atenuowanych pestiwirusów i specyficznie oznaczonych pestiwirusów - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania specyficznie atenuowanej szczepionki zawieraj acej pestiwirusa, zna- mienny tym, ze obejmuje etap, w którym unieczynnia si e aktywno sc RNazy zwi azanej z glikoprotein a E RNS pestiwirusa. 2. Sposób wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze aktywno sc RNazy unieczynnia sie poprzez de- lecj e i/lub mutacj e co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny E RNS . 3. Sposób wed lug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze wspomniane delecje i/lub mutacje wpro- wadza si e w aminokwasach wspomnianej glikoproteiny, w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357, jak przedstawiono przyk ladowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadaj acych im pozycjach w innych szczepach. 4. Sposób wed lug zastrz. 3, znamienny tym, ze wspomnian a aktywnosc RNazy unieczynnia sie poprzez delecj e i/lub mutacj e aminokwasu w pozycji 346, jak przedstawiono przyk ladowo w se- kwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadaj acej jej pozycji w innych szczepach, we wspomnianej glikoproteinie. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania specyficznie atenuowanej szczepionki zawierającej pestiwirusy, specyficznie atenuowanych pestiwirusów i specyficznie oznaczonych pestiwirusów, gdzie pestiwirusy atenuowane są poprzez inaktywowanie aktywności rybonukleazy (aktywności RNazy) RNS związanej z glikoproteiną E^RNS.

Pestiwirusy są czynnikami sprawczymi istotnych ekonomicznie chorób zwierzęcych w wielu krajach świata. Znane obecnie izolaty wirusa można podzielić na trzy różne rodzaje, tworzące wspólnie rodzinę Flaviviridae.

I. Wirus bydlęcej biegunki wirusowej (Bovine viral diarrhea virus (BVDV) powodujący bydlęcą biegunkę wirusową (BVD, bovine viral diarrhea) oraz chorobę śluzówki (mucosal disease) bydła (Baker, 1987; Moening i Plagemann, 1992; Thiel i wsp 1996).

II Wirus klasycznej cholery świń (classical swinne fever virus, CSFV), odpowiedzialny za cholerę świń (swine fever, CSF; inna nazwa hog cholera, HC) (Moening i Plagemann 1992; Thiel i wsp. 1996)

III Wirus choroby pogranicza (border disease virus BDV) zwykle atakujący owce, powodujący chorobę pogranicza (border disease, BD). Objawy podobne do MD u bydła opisano również po wewnątrzmacicznej infekcji małych owiec wirusem BDV (Moening i Plagemann 1992; Thiel i wsp 1996).

Alternatywną klasyfikację pestiwirusów podał Becher i wsp (1995), a także inni autorzy.

Pestiwirusy to małe, posiadające otoczkę wirusy, z genomem zbudowanym z jednoniciowego (+) RNA, nie posiadającego czapeczki na 5' końcu ani sekwencji 3' poli(A). Genom wirusa koduje polibiałko o długości około 4000 aminokwasów, ulegające cięciu w kotranslacyjnej i potranslacyjnej obróbce, w której uczestniczą komórkowe i wirusowe proteazy. Białka wirusowe ułożone są w obrębie polibiałka w następującej kolejności NH2-N^pro-C-E^RNS-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5BCOOH (Rice, 1996). Białko C i glikoproteiny E^RNS, E1 i E2 są strukturalnymi składnikami wirionów pestiwirusa (Thiel i wsp 1991). E2 i w mniejszym stopniu E^RNS są cząsteczkami docelowymi, neutralizowanymi przez przeciwciała (Donis i wsp 1998; Paton i wsp 1992; van Rijn i wsp 1993; Weiland i wsp 1990). E^RNS nie posiada zakotwiczenia membranowego i jest wydzielane w znaczących ilościach przez zainfekowane komórki; białko to jak wykazano wykazuje aktywność RNazy (Hulst i wsp 1994; Schneider i wsp 1993; Windisch i wsp 1996). Funkcja tej aktywności enzymatycznej w cyklu życia wirusa jest jak na razie nieznana. W przypadku przygotowanej szczepionki przeciw szczepowi CSFV usunięcie aktywności RNazy w wyniku kierowanej mutagenezy, prowadzi do powstania wirusa cytopatogennego o charakterystyce wzrostu w hodowli komórkowej podobnej do wirusa dzikiego (Hulst i wsp 1998). Wspomniana aktywność enzymatyczna zależy od obecności dwu sekwencji aminokwasowych, konserwowanych ewolucyjnie w E^RNS różnych pestiwirusów i różnych znanych RNaz roślinnych i grzybowych. Zawierają one fragment konserwowany ewolucyjnie obejmujący resztę histydynową (Schneider i wsp 1993). Wymiana każdej z tych reszt na lizynę w białku E^RNS szczepu CSFV stosowanego do przygotowania szczepionki prowadzi do zniszczenia aktywności RNazy (Hulst i wsp 1998). Wprowadzenie wspomnianych mutacji do genomu wspomnianego szczepu CSFV nie wpływa na żywotność wirusa lub charakter wzrostu lecz prowadzi do powstania wirusa wykazującego fenotyp nieznacznie cytopatogenny (Hulst i wsp 1998).

Dla CSFV i BVDV opracowano i stosuje się obecnie szczepionki obejmujące atenuowane lub zabite wirusy lub białka wirusowe eksprymowane w heterologicznych systemach ekspresyjnych. Podstawy strukturalne atenuacji tych wirusów stosowanych jako żywe szczepionki nie są znane. Stwarza to niebezpieczeństwo powstawania nieprzewidywalnych rewertantów przez mutacje powrotne lub rekombinację po zaszczepieniu. Z drugiej strony skuteczność szczepionek inaktywowanych lub białek eksprymowanych w układach heterologicznych (szczepionki podjednostkowe) w wywoływaniu zjawiska odporności jest ograniczona.

Ogólnie szczepionki żywe z określonymi mutacjami stanowiącymi podstawę atenuacji powinny uniemożliwiać zaistnienie niekorzystnych zjawisk związanych z obecnie stosowanymi generacjami szczepionek. Obecnie nie są dostępne potencjalne miejsca docelowe dla mutacji atenuujących u pestiwirusów.

Kolejną korzyścią z opracowania wspomnianych mutacji atenuujących jest ich molekularna unikalność, dzięki czemu mogą służyć jako znaczniki dla atenuowanych pestiwirusów, pozwalające rozróżnić atenuowane pestiwirusy od pestiwirusów dzikich.

Ze względu na znaczenie związane z opracowaniem efektywnej i bezpiecznej szczepionki, jak również sposobu detekcji i leczenia infekcji pestiwirusowych istnieje potrzeba opracowania żywej i w konkretny sposób atenuowanej szczepionki, o wysokiej zdolności do wywoływania odpowiedzi

PL 202 161 B1 immunologicznej, jak również o konkretnej podstawie atenuacji, tak by można pestiwirusa atenuowanego rozróżnić od pestiwirusa dzikiego.

Zatem, problemem technicznym leżącym u podstaw wynalazku, jest dostarczenie w określony sposób atenuowanych i oznaczonych w sposób wykrywalny pestiwirusów, mogących być stosowanych jako szczepionka żywa, atenuowana, o wysokiej zdolności wywoływania odpowiedzi immunologicznej.

Nieoczekiwanie stwierdzono, iż pestiwirusy można specyficznie atenuować przez inaktywację aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS. Atenuowane pestiwirusy dostarczają obecnie szczepionek o wysokiej immunogeniczności.

Sposób wytwarzania specyficznie atenuowanej szczepionki zawierającej pestiwirusa według RNS wynalazku obejmuje etap, w którym unieczynnia się aktywność RNazy związaną z glikoproteiną E^RNS pestiwirusa. Korzystnie, aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję i/lub mutację co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny E^RNS. Wspomniane delecje i/lub mutacje wprowadza się w aminokwasach wspomnianej glikoproteiny, w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach. W korzystnym wariancie wspomnianą aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję i/lub mutację aminokwasu w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, we wspomnianej glikoproteinie. Korzystnie, aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346.

Sposób wytwarzania specyficznie atenuowanych pestiwirusów według wynalazku obejmuje etap, w którym unieczynnia się aktywność RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS, korzystnie poprzez delecję i/lub mutację co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny E^RNS. Delecje i/lub mutacje umiejscawia się w aminokwasach w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach. W korzystnym wariancie aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję lub mutację reszty histydynowej w pozycji 346 w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, we wspomnianej glikoproteinie. Korzystnie, poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346.

Sposób wytwarzania specyficznie oznaczonych pestiwirusów zgodnie z wynalazkiem obejmuje etap, w którym unieczynnia się aktywność RNazy związaną z glikoproteiną E^RNS, korzystnie poprzez delecję lub mutację co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny E^RNS. Wspomniane delecje i/lub mutacje umiejscawia się korzystnie w aminokwasach w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach, wspomnianej glikoproteiny. W korzystnym wariancie aktywność RNazy unieczynnia sie poprzez delecję i/lub mutację aminokwasu w pozycji 346, korzystnie poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, we wspomnianej glikoproteinie.

Stosowany tu termin „szczepionka” dotyczy kompozycji farmaceutycznej obejmującej co najmniej jeden aktywny immunologicznie składnik indukujący odpowiedź immunologiczną w organizmie zwierzęcia, i obejmującej ewentualnie lecz niekoniecznie jeden lub więcej dodatkowych składników wzmagających aktywność immunologiczną wspomnianego składnika aktywnego. Szczepionka może dodatkowo obejmować kolejne składniki typowe dla kompozycji farmaceutycznych. Składnik aktywny immunologicznie szczepionki może obejmować w tym wypadku organizmy atenuowane, w przypadku tak zwanej zmodyfikowanej żywej szczepionki (modified live vaccine, MLV) lub organizmy inaktywowane odpowiednimi sposobami, w przypadku tak zwanej szczepionki martwej (killed vaccine, KV).

Dodatkowe składniki wzmagające odpowiedź immunologiczną to składniki zwykle określane mianem adjuwantów, takie jak na przykład wodorotlenek glinowy, olej mineralny lub inny olej, lub składniki dodatkowe dodawane do szczepionki lub tworzone przez organizm po indukcji wywołanej przez wspomniane składniki dodatkowe, takie jak w sposób nieograniczający interferony, interleukiny lub czynniki wzrostowe.

Szczepionka według wynalazku dotyczy szczepionki, tak jak zdefiniowano to powyżej, gdzie jedynym immunologicznie aktywnym składnikiem jest pestiwirus lub składnik pochodzący z pestiwirusa.

Termin „żywa szczepionka” dotyczy szczepionki obejmującej żywy, w szczególności żywy, aktywny składnik wirusowy.

PL 202 161 B1

Termin „pestiwirus” stosowany tu dotyczy wszystkich pestiwirusów, charakteryzujących się przynależnością do tego samego rodzaju, jak BVDV, CSFV i BDV należące do rodziny Flaviviridae, oraz charakteryzujący się ekspresją glikoproteiny E^RNS. Oczywiście termin ten odnosi się do wszystkich pestiwirusów, tak jak scharakteryzowali je Becher i wsp (1995) lub do innych wirusów eksprymujących glikoproteiny E^RNS. Termin „aktywność RNazy” stosowany tu dotyczy zdolności glikoproteiny E^RNS do hydrolizowania RNA.

Należy zauważyć, iż termin glikoproteiną EO jest często stosowanym w publikacjach synoniRNS mem glikoproteiny E^RNS.

Termin „inaktywacja (unieczynnienie) aktywności RNazy związanej z wspomnianą glikoproteiną” dotyczy niezdolności lub ograniczonej zdolności zmodyfikowanej glikoproteiny E^RNS do hydrolizowania RNA, w porównaniu z niezmodyfikowaną glikoproteiną E^RNS typu dzikiego.

Inaktywację aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS można uzyskać przez delecję i/lub mutacje co najmniej jednego aminokwasu wymienionej glikoproteiny, jak to przedstawiono poniżej oraz przez Hulsta i wsp (1998). Zatem w korzystnym zastosowaniu wynalazek dostarcza żywej szczepionki, w której wspomniana aktywność RNazy została inaktywowana poprzez delecję i/lub mutacje co najmniej jednej reszty aminokwasowej we wspomnianej glikoproteinie.

Wykazano, że glikoproteina E^RNS tworzy homodimer związany mostkiem dwusiarczkowym, o wielkości około 97 kD, w którym każdy monomer składa się z 227 aminokwasów odpowiadających aminokwasom od pozycji 268 do 494 polibiałka CSFV, tak jak przedstawił to Rumenapf i wsp (1993). Pierwszych 495 aminokwasów w postaci ulegającej ekspresji w szczepie Alfort CSFV przedstawia figura 1 (informacje tę jedynie zacytowano). Sekwencja genomowa szczepu Alfort CSFV jest osiągalna w bazie danych GeneBank/EMBL pod numerem J04358, alternatywnie sekwencja aminokwasowa szczepu CP7 BVDV dostępna jest w bazie danych GeneBank/EMBL pod numerem U63479. Dwa regiony aminokwasowe są wysoce konserwowane ewolucyjnie w obrębie glikoproteiny E^RNS, podobnie jak ma to miejsce w niektórych grzybowych i roślinnych białkach o aktywności RNaz (Schneider i wsp, 1993). Wspomniane dwa regiony mają istotne znaczenie dla aktywnoś ci enzymatycznej RNazy. Pierwszy region obejmuje pozycje aminokwasowe 295-307 i drugi region obejmuje pozycje aminokwasowe 338-357 wspomnianej polibiałka, tak jak przedstawia to figura 1 dla szczepu Alfort CSFV (numery odnoszą się do opublikowanej, wydedukowanej sekwencji aminokwasowej CSFV szczepu Alfort, wg. Meyersa i wsp 1989). Aminokwasy szczególnie istotne dla aktywności RNazy wspomniane powyżej, nie są w żadnej mierze ograniczone do dokładnych pozycji zdefiniowanych dla szczepu Alfort CSFV, lecz podane są jedynie dla przykładu w celu wskazania preferowanych aminokwasów, należących do obszaru wskazanego lub mu odpowiadającego w BVDV, BVD i ogólnie w pestiwirusach, o ile są one wysoce konserwatywne. Dla pestiwirusów innych niż CSFV szczepu Alfort konkretne pozycje aminokwasowe korzystnych aminokwasów mogą być inne, lecz dla eksperta w biologii molekularnej pestiwirusów łatwe jest zidentyfikowanie tych konkretnych aminokwasów, z uwagi na ich względne położenie wobec wysoce konserwowanych aminokwasów wspomnianej glikoproteiny. W jednym, szczególnie nie ograniczają cym przykł adzie, pozycja 346 dla szczepu Alfort odpowiada pozycji 349 w BVDV szczepu cp7.

W rezultacie wynalazek dostarcza szczepionki, gdzie wspomniane delecje i/lub mutacje inaktywujące umieszczone są w rejonie od pozycji 295 do 307 i/lub pozycji 338 do 357, jak przedstawia to figura 1 lub tożsama z nią sekwencja o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV w sposób przykładowy, lub w pozycjach im odpowiadających w innych szczepach pestiwirusów.

Inaktywacja wspomnianej aktywności RNazy przez delecje lub mutacje aminokwasu w pozycji 346 wspomnianej glikoproteiny dają szczególnie użyteczną żywą szczepionkę.

Wynalazek pokazuje iż pestiwirusy są zdolne do życia i że wytwarzają białko E^RNS pozbawione aktywności RNazy, gdy reszta histydynowa w pozycji 346 polibiałka wirusowego (pozycje według opublikowanej sekwencji CSFV szczepu Alfort/Tubingen (Meyers i wsp 1989), która to reszta jest jedną z reszt przypuszczalnego miejsca aktywnego RNazy E^RNS, zostanie wydeletowana. Wykazano

RNS również w wynalazku, że delecja odpowiadającej jej reszty histydynowej w białku E^RNS pestiwirusa BVD (pozycja 349, pozycja według sekwencji BVDV CP7, z GeneBank (U63479) prowadzi do powstania białka E^RNS pozbawionego aktywności RNazy. W odróżnieniu od mutacji punktowych zmieniających jeden aminokwas w drugi, mutant delecyjny jest dużo bardziej stabilny i nie ulega łatwo rewerRNS sji. Zainfekowanie świń mutantem patogennego wirusa CSFV Alfort/Tubingen eksprymującego E^RNS z wspomnianą delecją nie prowadzi do rozwoju cholery czy innych typowych objawów infekcji, charakterystycznych dla infekcji wirusem typu dzikiego: gorączki, biegunki, anoreksji, apatii, zmniejszenia ilości

PL 202 161 B1 komórek B oraz reakcji ze strony układu nerwowego. Wspomniane świnie w stanie agonalnym, wykazujące poważne krwotoki skórne i organów wewnętrznych, zostały zabite 14 dni po podaniu wirusa. Świnie zainfekowane zmutowanym wirusem nie wykazywały wiremii, ani zmniejszenia ilości komórek B: 3, 5, 7, 10 i 14 dni po infekcji, podczas gdy można było łatwo wyizolować CSFV z krwi pochodzącej od świń zainfekowanych wirusem typu dzikiego. Mutant delecyjny ulegał replikacji w zwierzętach, co wykazało powstanie przeciwciał neutralizujących (patrz przykład 3, tabela 3c) odpowiedź immunologiczna wobec zmutowanego wirusa była wystarczająca do przeżycia letalnej dawki prowokującej o wartości 2x10⁵ TCID50 wysoce patogennego szczepu CSFV Eystrup (Konig, 1994), bę dącego wirusem heterologicznym względem szczepu Alfort. Ponadto testowane zwierzęta nie wykazywały typowych klinicznych oznak infekcji CSFV, takich jak gorączka, biegunka, wylewy krwi, zmniejszenie ilości komórek B czy anoreksji po infekcji prowokującej wspomnianym szczepem. Wskazuje to, że infekcja świń mutantem delecyjnym indukuje odpowiedź immunologiczną wystarczającą do ochrony zwierzęcia przed bardziej patogennym szczepem.

Zatem w najbardziej korzystnym aspekcie wynalazek dostarcza szczepionek, w których aktywność RNazy glikoproteiny ulega inaktywacji poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono to na figurze 1 dla CSFV szczepu Alfort, w sposób przykładowy lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza atenuowanych pestiwirusów, w których aktywno ść

RNazy związana z glikoproteiną E^RNS jest inaktywowana poprzez delecje i/lub mutacje co najmniej jednego aminokwasu wspomnianej glikoproteiny, przy założeniu że aminokwasy w pozycjach 297 i/lub

346 wspomnianej glikoproteiny jak przedstawia do dla CSFV figura 1, nie są lizyną. Zrekombinowane pestiwirusy, w których aminokwasy w pozycji 297 i/lub 346 wspomnianej glikoproteiny są lizyną opisał

Hulst i wsp w 1998. Te szczególne pestiwirusy wykazują efekt cytopatyczny w komórkach nerki świni.

Do tej pory nie wiedziano nic o zaskakującej i innowacyjnej cesze atenuacji poprzez inaktywację enRNS zymatycznej aktywności E^RNS.

Sposób wytwarzania szczepionek według wynalazku dotyczy również pestiwirusów, w których wymieniona aktywność RNazy glikoproteiny inaktywowana jest poprzez delecje i/lub mutacje dotyczące aminokwasów w pozycjach 295-307 i/lub 338-357, jak przedstawia to figura 1 dla szczepu CSFV Alfort, w sposób przykładowy lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

Sposób według wynalazku dotyczy również pestiwirusów, w których wymieniona aktywność RNazy glikoproteiny inaktywowana jest poprzez delecje i/lub mutacje dotyczące aminokwasów w pozycji 346, jak przedstawia to figura 1 dla szczepu CSFV Alfort, w sposób przykładowy lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

W najkorzystniejszym aspekcie, z przyczyn wymienionych powyż ej, sposób wedł ug wynalazku dotyczy pestiwirusów, w których wymieniona aktywność RNazy glikoproteiny inaktywowana jest poprzez delecje reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawia to figura 1 dla szczepu CSFV Alfort, w sposób przykł adowy lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

Atenuowanie pestiwirusów może być w łatwy sposób przeprowadzone technikami rekombinacji i modyfikacji genetycznej, prowadz ącymi do ekspresji zmutowanej sekwencji aminokwasowej glikoproteiny E^RNS.

Szczepionka i/lub pestiwirusy otrzymane sposobem według wynalazku, mogą stanowić składnik kompozycji farmaceutycznej. Kompozycja farmaceutyczna może być przygotowana jak następuje: supernatant z hodowli komórkowej zainfekowanych komórek mieszany jest ze stabilizatorem (np. spermidyną i/lub BSA) i mieszanina jest następnie liofilizowana lub odwadniana innymi metodami. Przed zaszczepieniem wymieniona mieszanina jest uwadniana do roztworu wodnego (np. sól fizjologiczna, PBS) lub roztworu nie wodnego (np. emulsja olejowa, adjuwant oparty na wodorotlenku glinu.

Wynalazek dotyczy zatem unikalnego sposobu atenuowania pestiwirusów poprzez inaktywację RNS aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS.

Unieczynnienie aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS dostarcza zaskakującego i nowego sposobu wykrywalnego znakowania pestiwirusów. W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu wykrywalnego znakowania pestiwirusów charakteryzującego się tym, że inaktywuje się aktywność RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS. Cecha braku aktywności RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS pestiwirusów umożliwia wykrywalne znakowanie wspomnianych pestiwirusów. Oznaczone lub nieoznaczone pestiwirusy lub E^RNS wydzielana z komórek zainfekowanych pestiwirusami w płynach ciała mogą być łatwo rozróżnione przez cechę obecnoś ci lub braku obecności aktywności glikoproteiny E^RNS.

PL 202 161 B1

W przypadku pestiwirusów z unieczynnioną aktywnością RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS poprzez delecję i/lub mutacje, można zastosować szereg innych technik. Tego typu pestiwirusy można łatwo wykryć ze względu na strukturalne konsekwencje wspomnianych delecji i/lub mutacji. Na

RNS przykład różnicę sekwencji kwasu nukleinowego kodującego zmienioną glikoproteinę E^RNS można wykryć stosując sekwencjonowanie kwasu nukleinowego lub technikę PCR, jak wykazano to w przykładzie 8; zmienioną sekwencję białka można wykryć stosując specyficzne przeciwciała monoklonalne, które nie rozpoznają niezmienionego białka. Możliwe jest również wykrywanie zmienionych, a zatem oznaczonych strukturalnie biał ek, ze wzglę du na brak wią zania specyficznych przeciwciał monoklonalnych rozpoznających niezmienioną glikoproteinę E^RNS przy założeniu że obecność pestiwirusów można ustalić w inny sposób. Oraz, oczywiście, delecje i/lub mutacje uszkadzające aktywność RNazy w oznaczonych tym samym wirusach, prowadzą do różnej odpowiedzi immunologicznej w organizmach zwierzą t, w porównaniu z odpowiedzią na infekcję pestiwirusami nieoznaczonymi.

Korzystne zastosowanie wynalazku we wszystkich aspektach odnoszących się do sposobów atenuacji pestiwirusów, sposobów wytwarzania specyficznie atenuowanej szczepionki i sposobów znakowania w sposób wykrywalny pestiwirusów odnosi się do sposobów związanych z inaktywacją glikoproteiny E^RNS, gdzie wspomniana aktywność RNazy jest unieczynnioną przez delecje i/lub mutacje co najmniej jednego aminokwasu wspomnianej glikoproteiny.

Bardziej korzystne zastosowanie wynalazku we wszystkich aspektach odnoszących się do sposobów atenuacji pestiwirusów, sposobów wytwarzania specyficznie atenuowanej szczepionki i sposobów znakowania w sposób wykrywalny pestiwirusów odnosi się do sposobów związanych z inaktywacją glikoproteiny E^RNS, gdzie wspomniana aktywność RNazy jest unieczynnioną przez delecje i/lub mutacje umiejscowione w aminokwasach w pozycji od 295 do 307 i/lub pozycji 338 do 357, jak przedstawia to figura 1 dla CSFV szczepu Alfort w sposób przykładowy lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

Bardzo korzystne zastosowanie wynalazku we wszystkich aspektach odnoszących się do sposobów atenuacji pestiwirusów, sposobów wytwarzania specyficznie atenuowanej szczepionki i sposobów znakowania w sposób wykrywalny pestiwirusów odnosi się do sposobów związanych z inaktywacją glikoproteiny E^RNS, gdzie wspomniana aktywność RNazy jest unieczynnioną przez delecję i/lub mutację umiejscowioną w aminokwasie w pozycji 346, jak przedstawia to figura 1 dla CSFV szczepu Alfort w sposób przykładowy lub w odpowiedniej pozycji glikoproteiny innych szczepów.

Najkorzystniejsze zastosowanie wynalazku we wszystkich aspektach odnoszących się do sposobów atenuacji pestiwirusów, sposobów wytwarzania specyficznie atenuowanej szczepionki i sposobów znakowania w sposób wykrywalny pestiwirusów odnosi się do sposobów związanych z inaktywacją glikoproteiny E^RNS, gdzie wspomniana aktywność RNazy jest unieczynnioną przez delecję i/lub mutację reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawia to figura 1 dla CSFV szczepu Alfort w sposób przykł adowy lub w odpowiedniej pozycji glikoproteiny innych szczepów.

Wynalazek odnosi się w rezultacie do szczepionek szczególnie użytecznych dla zapobiegania i leczenia infekcji pestiwirusowych zwierzą t.

W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza procesu wytwarzania specyficznie atenuowanych RNS pestiwirusów charakteryzujących się tym, że ich aktywność RNazy związana z glikoproteiną E^RNS została unieczynnioną.

Korzystne zastosowanie wynalazku we wszystkich aspektach dotyczy sposobu wytwarzania specyficznie atenuowanych pestiwirusów, sposobu uzyskania specyficznie wyznakowanych pestiwirusów, polegającego na wykorzystaniu inaktywacji glikoproteiny E^RNS, gdzie wspomniana aktywność RNazy zostaje unieczynnioną w wyniku delecji i/lub mutacji co najmniej jednego aminokwasu wspomnianej glikoproteiny.

Bardziej korzystny aspekt wynalazku dotyczy sposobu otrzymywania specyficznie atenuowanych pestiwirusów, sposobu uzyskania specyficznie wyznakowanych pestiwirusów, polegającego na wykorzystaniu inaktywacji glikoproteiny E^RNS, gdzie wspomniana aktywność RNazy zostaje unieczynnioną w wyniku delecji i/lub mutacji umiejscowionych w aminokwasach w pozycji od 295 do 307 i/lub pozycji 338 do 357, jak przedstawia to figura 1 dla CSFV szczepu Alfort w sposób przykładowy lub w odpowiedniej pozycji innych szczepów.

Bardzo korzystne zastosowanie wynalazku we wszystkich aspektach dotyczy sposobu wytwarzania specyficznie atenuowanych pestiwirusów, sposobu uzyskania specyficznie wyznakowanych pestiwirusów, polegających na wykorzystaniu inaktywacji glikoproteiny E^RNS, gdzie wspomniana aktywność RNazy zostaje unieczynnioną w wyniku delecji i/lub mutacji reszty histydynowej w pozycji

PL 202 161 B1

346, jak przedstawia to figura 1 dla CSFV szczepu Alfort w sposób przykładowy lub w odpowiedniej pozycji glikoproteiny innych szczepów.

Wynalazek w korzystnych przykładach wykonania został zilustrowany na rysunku, na którym: figura 1 przedstawia sekwencję pierwszych 495 aminokwasów szczepu Alfort CSFV odpowiadającą sekwencji 25 listy sekwencji; zestawienie sekwencji pokazuje pierwszych 495 aminokwasów RNS eksprymowanych przez szczep Alfort CSFV (Meyers i wsp 1989). Jeden monomer glikoproteiny E^RNS wspomnianego szczepu odpowiada aminokwasom od pozycji 268 do 495 (Rumenapf i wsp 1993). Podkreślone reszty aminokwasowe w pozycjach 295-307 i 338-357 obejmują region wykazujący homologię z roślinnymi i grzybowymi RNazami (Schneider i wsp 1993);

figura 2 przedstawia krzywą temperatury ciała mierzonej w odbycie zwierząt po infekcji testowej:

Dzienna temperatura mierzona w odbycie od dnia 2 przed infekcją, do dnia 18 po infekcji. Krzywa temperatury jest przedstawiona dla każdego zwierzęcia zainfekowanego wirusem V(pA/CSFV) (linia ciągła) uzyskanego z plazmidu pA/CSFV lub wirusem V(pA/C-346-d) uzyskanego z plazmidu pA/C-346-d (linia przerywana);

figura 3 przedstawia krzywą temperatury ciała mierzonej w odbycie zwierząt po infekcji prowokującej szczepem wirulentnym:

Dzienna temperatura ciała mierzona w odbycie zwierząt w dniach 1-21 po infekcji prowokującej wirusem CSFV szczepu Eystrup, zostały zainfekowane mutantem C-346-d (V(pA/C-346-d) na 69 dni przedtem, jak opisano to dokładnie w tekście. Krzywa zmian temperatury ciała mierzonej w odbycie podana jest dla każdego zwierzęcia z grupy wystawionej na prowokujące działanie 2x10⁵TCID50 CSFV szczepu Eystrup;

figura 4 przedstawia krzywą temperatury ciała mierzonej w odbycie zwierząt po infekcji testowej:

Dzienna temperatura ciała mierzona w odbycie zwierząt w dniach 0-18 po infekcji. Krzywa zmian temperatury ciała mierzonej w odbycie podana jest dla każdego zwierzęcia z dwu grup zainfekowanych albo wirusem C-346-d [V(pA/C-346-d)] (linia przerywana) albo rewertantem C-346-d/Rs [V(pA/C-346-d/Rs)] (linia ciągła);

figura 5 przedstawia krzywą temperatury ciała mierzonej w odbycie zwierząt po infekcji prowokującej w doświadczeniu #2:

Dzienna temperatura ciała mierzona w odbycie zwierząt w dniach 1-1o po infekcji prowokującej wirusem. Zwierzęta zainfekowane szczepem zmutowanym C-346-d 37 dni przed wystawieniem na prowokujące działanie 2x10⁵TCID50 CSFV szczepu Eystrup;

figura 6 przedstawia krzywą temperatury ciała mierzonej w odbycie zwierząt po infekcji podwójnym mutantem wg przykładu 6:

Dzienna temperatura ciała mierzona w odbycie zwierząt przed i po prowokującej infekcji podwójnym mutantem V(pA/C-297-L/346-L);

figura 7 przedstawia rozróżnienie między szczepami C-346-d i CSFV bez delecji w kodonie histydynowym 34 z wykorzystaniem techniki RT-PCR wg przykładu 8:

a) Para starterów OI H-3/OI E^RNSStop umożliwia specyficzną amplifikację w postaci prążka z wykorzystaniem RNA obejmującego delecję kodonu 346 (C-346-d) jak przedstawiono to w szczegółach w przykładzie 8. Natomiast RNA nie zawierający wspomnianej delecji nie oddziaływuje z wspomnianą parą starterów (C-WT, C-346-L, C-346-K).

b) i c) Dwie inne kombinacje starterów (OI H+2 i OI H+3) powielają prążek pochodzący z RNA nie zawierającego delecji kodonu 346 (OI H + 2 i OI H + 3). Nie obserwowano powstawania prążka stosując jako matrycę RNA z mutanta delecyjnego C-346-d.

Odnośniki

1. Baker JC 1987 Bovine viral diarrhea virus: a review. J Am Vet Med Assoc 190: 1449-1458.

2. Bewcher P, Konig M, Paton DJ, Thiel 1995 Further characterization of border disease virus isolates: evidence for the presence of more than three species within the genus pestivirus. Virology 209(1): 200-206

3. Donis RO, Corapi W, Dubovi EJ 1988 Neutralizing monoclonal antibodies to bovine viral diarrhea virus bind to the 56k to 58k glycoprotein. J Gen Virol 69: 77-86.

4. Fuerst TR i wsp 1986 Eucariotic transient expression system based on recombinant vaccine virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase. PNAS 83: 8122-8126.

5. Hulst MM, Himes G, Newbigin E, Moormann R JM 1994 Glycoprotein E2 of the classical swine fever virus: expression in insect cells and identification as a ribonuclease. Virology 200: 558-565.

PL 202 161 B1

6. Hulst MM, Panoto A, Hooekmann HGP, van Gennip, Moormann RJM 1998 Inactivation of the RNase activity of glycoprotein E^RNS of classical swine fever virus results in cytopathogenic virus. J Virol 72: 151-157.

7. Kit M, Kit S 1991 Sensitive glycoprotein gIII blocking ELISA to distinguish between pseudorabies (Aujeszky's disease) infected and vaccinated pigs. Veterinary Microbiol 28: 141-155.

8. Kunkel TA, Roberts JD, Zakour RA 1987 Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Methods Enzymol 154: 367-392.

9. Konig, Matthias 1994 Virus der klassischen Schweinepest: untersuchungen zur pathogenese und zur induktion eine protektiven immunantwort. Dissertation Tierarztliche Hochschule Hannover, Niemcy.

10. Meyers G, Rumenapf T, Thiel H-J 1989 Molecular cloning and nucleotide sequence of hog cholera virus. Virology 171: 555-567.

11. Meyers G, Tautz N, Becher P, Thiel H-J, Kummerer BM 1996b Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral diarrhea viruses from cDNA constructs. J Virol 70: 8606-8613.

12. Meyers G, Thiel H-J, Rumenapf T 1996a Classical swine fever virus. Recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic swine fever virus. J Virol 67: 7088-709526.

13. Moennig V, Plaggemann J 1992 The pestiviruses Adv Virus Res 41: 53-91.

14. Paton DJ, Lowings JP, Barrett AD 1992 Epitop mapping of the gp53 envelope protein of bovine viral diarrhea virus. Virology 190: 763-772.

15. Pellerin C i wsp Identification of a new group of bovine viral diarrhea virus strains with severe outbreaks and high mortalities. Virology 203: 1994: 260-268.

16. Rice CM 1996 The Pestiviruses. In Fields Virology. wyd. Fields BN, Knipe DM, Howley PM Philadelphia str 931-959.

17. Rumenapf T, Unger G, Strauss JH, Thiel J-H 1993 Processing of the envelope glycoproteins of pestiviruses. J Virol 67: 3288-3294.

18. Schneider RG, Unger R, Stark E, Schneider-Scherzer E, Thiel H-J 1993 Identification of a structural glycoprotein of an RNA virus as a ribonuclease. Science 261: 1169-1171.

19. Thiel H-J, Plagemann GW, Moennig V 1996 The pestiviruses. In Fields Virology. wyd. Fields BN, Knipe DM, Howley PM Philadelphia str 1059-73.

20. Thiel H-J, Stark R, Weiland E, Rumenapf T, Meyers G 1991 Hog cholera virus: molecular composition of virions from pestivirus. J Virol 65: 4705-4712.31.

21. van Rijn PA, van Gennip HG, de Meijer EJ, Moormann RJ 1993 Epitope mapping of envelope glycoprotein of hog cholera virus strain Brescia. J Gen Virol 74: 2053-2060.

22. Weiland E, Thiel H-J, Hess G, Weiland F 1989 Development of monoclonal neutralizing antibodies against bovine viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normal bovine cells and cyclophosphamide. J Virol Methods 24: 237-244.

23. Weiland E, Stark R, Haas B, Rumenapf T, Meyers G, Thiel H-J 1990 Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide-linked heterodimer. J Virol 64: 3563-3569.

24. Weiland E, Ahl R, Stark R, Weiland F, Thiel H-J 1992 A second envelope glycoprotein mediates neutralization of pestivirus, hog cholera virus. J Virol 66: 3677-3682.

25. Windisch JM, Schneider R, Stark R, Weiland E, Meyers G, Thiel H-J 1996 RNase of classical swine fever virus: biochemical characterization and inhibition by virus-neutralizing monoclonal antibodies. J Virol 70: 352-358.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1. Tworzenie mutantów RNazo-ujemnych pestiwirusów

Rozpoczynając procedurę z pełnej długości klonów cDNA pA/CSFV (Meyers i wsp 1996a) lub pA/BVDV (Meyers i wsp 1996b), z których otrzymać można infekcyjny cRNA techniką transkrypcji in vitro, uzyskano subklony. W przypadku CSFV, fragment XhoI/SspI plazmidu pA/CSFV sklonowano w plazmidzie pBluescript SK⁺ przeciętym XhoI i SmaI. W przypadku BVDV fragment XhoI/BglII z plazmidu pA/BVDV sklonowano w plazmidzie pCITE-2C przeciętym tymi samymi enzymami. Jednoniciowy plazmidowy DNA uzyskano z wspomnianych plazmidów metodą Kunkela (Kunkel i wsp 1987) stosując E. coli szczep CJ236 (BioRad) i jednoniciowego faga VCMS (Stratagene). Wspomniany jednoniciowy DNA przekształcono w DNA dwuniciowy stosując Phagemid In Vitro Mutagenesis Kit (BioRad). Niektóre z syntetycznych oligonukleotydów stosowanych jako startery do utworzenia pożądanych, zmutowanych pestiwirusów przedstawiono poniżej dla przykładu:

PL 202 161 B1

C-297-L: AGGAGCTTACTTGGGATCTG

C-346-L: GGAACAAACTTGGATGGTGT

C-297-K: ACAGGAGCTTAAAAGGGATCTGGC

C-346-K: ATGGAACAAAAAGGGATGGTGTAA

C-346-d: GAATGGAACAAAGGATGGTGTAAC

B-346-d: CATGAATGGAACAAAGGTTGGTGCAACTGG

Dwuniciowy plazmidowy DNA stosowano do transformacji komórek E. coli szczepu XL 1-Blue (Stratagene). Kolonie bakteryjne niosące plazmid izolowano poprzez selekcję ampicilinową. Plazmidowy DNA izolowano i dalej analizowano stosując technikę sekwencjonowania z polimerazą faga T7 (Sequenase, Pharmacia) plazmidy zawierające pożądane mutacje, bez dodatkowych zmian sekwencji stosowano do konstruowania pełnej długości klonów cDNA. W przypadku CSFV, fragment XhoI/NdeI ze zmutagenizowanego plazmidu wstawiano wraz z fragmentem Ndel/BglII pochodzącym z plazmidu 578 (pCITE 2A, zawierającym fragment XhoI/BglII z pA/CSFV) do plazmidu pA/CSFV przeciętego XhoI i BglII. W celu uzyskania mutanta BVDV CP7, fragment XhoI/BglII wyizolowany z plazmidu pA/BVDV przeciętego XhoI i Ncol wraz z fragmentem BglII/Ncol wyizolowanym z plazmidu pA/BVDV/Ins-. Z kostruktu pA/BVDV/Ins- transkrybowano w użytecznych komórkach cRNA dający niecytopatogenny wirus BVDV (Meyers i wsp 1996b). Różne klony o pełnej długości następnie amplifikowano i izolowano plazmidy. Po linearyzacji enzymem Srfl (klon CSFV pełnej długości) lub Smal (klon BVDV pełnej długości) cRNA transkrybowano jak poprzednio (Meyers i wsp 1996b). RNA oczyszczano przez filtrację żelową i ekstrakcję fenolem/chloroformem i stosowano do transfekcji świńskich komórek nerki (PK15) lub bydlęcej nerki (MDBK, klon B2) (odpowiednio konstruktami CSFV lub BVDV). Transfektanty analizowano immunofluorescencyjnie stosując przeciwciała specyficzne względem wirusa. W przypadku uzyskania pożądanej mutacji (pozytywny sygnał immunofluorescencyjny), mutanty odzyskiwano, amplifikując wirusy przez pasażowanie w tych samych komórkach, które stosowano do transfekcji. Dalsza analiza mutantów CSFV obejmowała określanie krzywych wzrostu i charakterystykę wirusowego RNA techniką Northerna z sondami cDNA specyficznymi względem wirusa, jak również odwrotna transkrypcję i PCR (RT-PCR) oraz bezpośrednie sekwencjonowanie amplikonów w celu potwierdzenia obecności mutacji. We wszystkich przypadkach potwierdzono obecność pożądanej mutacji w wirusowym genomie. Wszystkie wirusy wzrastały jednakowo dobrze i produkowały podobne ilości RNA, takie jak wirusy uzyskane z plazmidów niosących sekwencje typu dzikiego.

Żywotność mutantów BVDV wykazano przez transfekcję odpowiednich cRNA i podział grupy transfekowanych komórek 3 dni później, cześć komórek wysiano na szalkę o średnicy 3.5 cm, utrwalono mieszaniną acetonu i metanolu dzień później i analizowano immunoflyuorescencyjnie stosując mieszaninę przeciwciał monoklonalnych specyficznych wobec BVDV (Wieland i wsp 1989). Wszystkie komórki okazały się być dodatnie w tym teście, podczas gdy kontrola, w postaci komórek transfekowanych nieinfekcyjnym RNA nie wykazywała sygnału. Z części komórek transfekowanych odpowiednim cRNA, uzyskiwano ekstrakt stosując jeden cykl zamrażania i rozmrażania. Świeże komórki infekowane tym ekstraktem okazywały się BVDV pozytywne w teście immunofluorescencyjnym z użyciem przeciwciał specyficznych wobec BVDV, w trzy dni po infekcji.

Tabela 1 zbiera dane o różnych zmianach wprowadzonych do konserwowanej sekwencji aminokwasowej E^RNS, reprezentującej przypuszczalne miejsce aktywne RNazy kodowanej przez wskazane mutanty wirusowe.

T a b e l a 1

Nazwa	Motyw sekwencji RNAzy	Aktywność RNAzy	Żywotność mutanta
1	2	3	4	5
pA/CSFV	...SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	+	+
C-297-L	...SLLGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	+
C-346-L	...SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKLGWCNW..	-	+
C-297-L/345-L	...SLLGIWPEKIC...	...RHEWNKLGWCNW..	-	+
C-297-K	...SLKGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	+
C-346-K	...SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKKGWCNW..	-	+

PL 202 161 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5
C-297-d	...SL_GIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-346-d	...SLHGIWPEKIC...	...RHEWNK_GWCNW..	-	+
C-296/7/8-d	...S_ _ _IWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-345/6/7-d	...SLHGIWPEKIC...	...RHEWN_ _ _WCNW..	-	-
C-345/6-d	...SLHGIWPEKIC...	...RHEWN_ _GWCNW..	-	-
C-346/7-d	...SLHGIWPEKIC...	...RHEWNK _ _WCNW..	-	-
C-342-d	...SLHGIWPEKIC...	...RH_WNKHGWCNW..	-	-
C-342/6-d	...SLHGIWPEKIC...	...RH_WNK _GWCNW..	-	-
C-301-d	...SLHGIW_EKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-295-S/G	...GLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	+
C-300-W/G	...SLHGIGPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	+
C-302-E/A	...SLHGIWPAKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-305-C/G	...SLHGIWPEKIC...	...RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-300-W/G-302-E/A	...SLHGIGPAKIC...	RHEWNKHGWCNW..	-	-
C-340-R/G	...SLHGIWPEKIC...	...GHEWNKHGWCNW..	-	-
C-343-W/G	...SLHGIWPEKIC...	...RHEGNKHGWCNW..	-	-
C-345-K/A	...SLHGIWPEKIC...	...RHEWNAHGWCNW..	-	-
C-297-K/346-K	.SLKGIWPEKIC...	...RHEWNKKGWCNW..	-	+
C-297-K/346-L	...SLKGIWPEKIC...	...RHEWNKKGWCNW..	-	+

Opis do tabeli 1: Test na obecność RNazy wykonywano w postaci testu transfekcji przejściowej.

Komórki BHK21 infekowano wirusem Vaccina vTF7-3 (Fuerst i wsp 1986) a następnie transfekowano odpowiednimi konstruktami cDNA (5ng plazmidowego DNA, transfekcje dokonywano stosując Superfect, zgodnie ze wskazaniami producenta, Qiagene). Po 10 godzinach inkubacji w 37°C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla, transfekowane komórki lizowano i procesowano w celu określenia aktywności

RNazy, jak przedstawiono to poniżej. Żywotność określano tak, jak to przedstawiono poniżej.

RNS

P r z y k ł a d 2. Wpływ różnych mutacji na aktywność RNazową glikoproteiny E^RNS.

W celu przetestowania wpływu różnych mutacji na aktywność RNazy związanej z glikoproteiną

RNS

E^RNS użyteczne komórki infekowano zmutowanymi wirusami. W przypadku CSFV infekcje prowadzono przy wartości m.o.i. 0.01. Infekcja typem dzikim wirusa służyła jako kontrola pozytywna, podczas gdy nie zainfekowane komórki były kontrolą negatywną. W 48 godzinie po infekcji komórki przemywano dwa razy buforem PBS i lizowano 0.4 ml buforu lizującego (20 mM TRIS/HCl; 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mg/ml BSA; 1% Triton X100; 0.1% kwas deoksycholowy; 0.1% SDS). Lizat przenoszono do 1.5 ml probówek reakcyjnych i sonikowano (Branson sonifier B12, 120 W, 20 sek w naczynku z lodem), klarowano przez wirowanie (5 min 14000 rpm, Eppendorf Centrifuge, w 4°C) i supernatant poddawano ultrawirowaniu (stołowa wirówka Beckmana, 60 minut w 4°C przy 45000 rpm w rotorze TLA 45). Określanie aktywności RNazy prowadzono w całkowitej objętości 200 μl obejmującej 5 lub 50 μl supernatantu po drugim etapie wirowania i 80 μg Poly(rU) (Pharmacia) w buforze do RNazy (40 mM TRIS-octan pH 6.5; 0.5 mM EDTA; 5 mM DTT). Po inkubacji mieszaniny reakcyjnej w 37°C przez 1 godzinę dodawano 200 μl mieszaniny 1.2 M kwasu nadchlorowego i 20 mM LaSO₄. Po 15 minutach inkubacji na lodzie mieszaninę wirowano przez 15 minut w 4°C przy 14000 rpm w wirówce Eppendorfa. Do supernatantu dodawano 3 objętości wody i próbkę mieszaniny analizowano mierząc gęstość optyczną przy 260 nm stosując spektrofotometr Ultrospec 3000 (Pharmacia). We wszystkich przypadRNS kach mutacje wprowadzone do genu kodującego E^RNS całkowicie unieczynniały aktywność RNazy (tabela 1).

W przypadku mutantów BVDV aktywność RNazy testowano z materiałem uzyskanym po transfekcji RNA bez pasażowania odzyskanego wirusa. Komórki transfekowane odpowiednim RNA dzielono

PL 202 161 B1 na grupy 72 godziny po transfekcji i wysiewano na dwie szalki. 24 godziny później komórki z jednej szalki ekstrahowano, preparowano i analizowano pod względem aktywności RNazy tak, jak to podano powyżej. W celu potwierdzenia infekcji komórki z drugiej szalki analizowano immunofluorescencyjnie stosując przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw BVDV (Weiland i wsp 1989) -wszystkie komórki były w tym teście pozytywne. Transfekcję prowadzono przy pomocy RNA transkrybowanych z pA/BVDV/Ins- i pA/B-346-d, plazmidu równoważnego pA/BVDV/Ins-, lecz zawierającego delecję kodonu odpowiadającego kodonowi 346 w CSFV szczepu Alfort. Nie transfekowane komórki MDBK stanowiły kontrole negatywną.

T a b e l a 2A

Określenie aktywności RNazy różnych wirusów

	Alfort	C-WT	C-297-L	C-346-L	C-346-d	C-346-d/Rs	kontrola
OD260	2.4	2.3	1.1	1.1	1.1	2.3	1.1
	Alfort	C-WT	C-297-L	C-346-L	C297-K	C-346-K	C-297-L/346-L
OD260	2.09	2.16	0.715	0.77	0.79	0.766	0.77
	C-297-K/346-L	C-297-K/346-K	C-346-d	kontrola
OD260	0.725	0.835	0.8	0.84

Opis tabeli 2A:

Komórki PK15 zainfekowano wskazanym wirusem przy wartości m.o.i. 0.01, inkubowano w 37°C przez 48 godzin w atmosferze CO2 i nast ę pnie lizowano i poddano testowi wykrywają cemu aktywność RNazy. Rozpuszczalna w kwasie frakcja RNA powstająca w wyniku inkubacji z różnymi ekstraktami komórkowymi została zmierzona ilościowo przy OD260. Obserwowane różnice w aktywnoRNS ści RNazy nie wynikały z różnic w ilości białka E^RNS w próbkach, ponieważ podobne wartości uzyskiRNS wano po oszacowaniu ilości E^RNS z wykorzystaniem znakowania izotopowego, immunoprecypitacji RNS i analizy radioaktywnoś ci z wykorzystaniem fosfoimagera. Ponadto zmniejszenie stężenia E^RNS w teście do jedynie 1/10 zwykle stosowanej wartości nie zmieniło uzyskiwanych wartości OD w sposób

RNS znaczący, co wskazuje iż w wybranych warunkach testu E^RNS wysycała mieszaninę reakcyjną.

Szczep CSFV Alfort: wszystkie wirusy uzyskano z RNA transkrybowanego in vitro z plazmidów: np. C-WT z plazmidu pA/CSFV; C-297-L z plazmidu pA/C-297-L itd wirus C-346-d/Rs uzyskano z plazmidu pA/C-346-d/Rs (uzyskanego w wyniku rewersji mutacji w plazmidzie pA/C-346-d przez wymianę odpowiedniego fragmentu cDNA z odpowiadającym mu fragmentem pochodzącym z plazmidu pA/CSFV; kontrola: ekstrakt z nie zainfekowanych komórek PK15.

T a b e l a 2B

	BN-WT	B-346-d	kontrola
OD260	2.5	1.1	1.1

Opis tabeli 2B

Komórki MDBK zainfekowano transkrybowanym in vitro RNA, podzielono na grupy w 72 godziny po infekcji i analizowano 24 godziny później stosując test na aktywność RNazy.

Zainfekowanie komórek sprawdzano stosując analizę immunofluorescencyjną, jak przedstawiono to w tekście.

B-WT: wirus uzyskany z plazmidu pA/BVDV/Ins-; B-346-d wirus uzyskany z plazmidu pA/B-346-d; kontrola: ekstrakt z nie zainfekowanych komórek MDBK.

P r z y k ł a d 3. Patogenność CSFV po inaktywacji RNazy W celu okreś lenia czy zniszczenie aktywnoś ci RNazy wpł ywa na patogenność pestiwirusów wobec ich naturalnego gospodarza, przeprowadzono doświadczenia na zwierzętach z wykorzystaniem zmutowanego wirusa V(pA/C-346-d) (oznaczonego C-346-d w tabelach). Wirus uzyskany z klonu CSFV pełnej długości bez mutacji (V(pA/CSFV) posłużył jako kontrola pozytywna (C-WT w tabelach). Dla każdego mutanta wykorzystano trzy prosiaki (rasa: German landrace; około 25 kg masy ciała). Zwierzętom podano 1x10⁵ TCID50 na zwierzę; dwie trzecie inokulatu podawano donosowo (1/3 do każdej jamy), jedną trzecią domięśniowo. Wspomniane dwie grupy zwierząt przetrzymywano w osobnych, izolowanych pomieszczeniach. Z każdego zwierzęcia pobierano próbki krwi dwa razy przed infekcją oraz w dniach: 3, 5, 7, 10, 12 i 14. Każdego dnia mierzono temperaturę ciała zwierząt

PL 202 161 B1 (figura 2). Zwierzęta zainfekowane dzikim typem wirusa wykazywały typowe objawy klasycznej cholery świń: gorączkę, ataksję, anoreksję, biegunkę, zaburzenia ze strony centralnego układu nerwowego, podskórne wylewy krwi (tabela 3a). Wirus izolowano z krwi w 3 dniu (zwierzę #68) i w dniu 5, 7, 10, 14 (zwierzęcia #68, #78, #121) (tabela 3b). Zwierzęta zabito w stanie agonalnym w 14 dniu po infekcji. W tym czasie nie wykryto przeciwciał neutralizujących wirusa. Natomiast odmiennie zwierzęta zainfekowane wirusem zmutowanym nie prezentowały objawów klinicznych (tabela 3a). Temperatura ciała pozostawała prawidłowa (figura 2) w czasie trwania eksperymentu i zwierzęta nie przestawały normalnie się odżywiać. W czasie eksperymentu nie można było wyizolować wirusa ze krwi wspomnianych zwierząt. Jednakże zwierzęta były zainfekowane i wirus ulegał replikacji, jako że u zwierząt powstały przeciwciała neutralizujące wirusa (tabela 3c).

T a b e l a 3a:

Objawy kliniczne po infekcji testowej

Eksperyment 1
zwierzę nr	zainfekowane wirusem	objawy choroby
		gorączka	biegunka	zaburzenia CSN	anoreksja	wylewy podskórne	apatia	stan agonalny w momencie zabicia	wylewy krwi w organach wewnętrznych w badaniu po- śmiertnym
#68	C-WT	+	+	+	+	+	+	+	+
#78	C-WT	+	+	+	+	+	+	+	+
#121	C-WT	+	+	+	+	+	+	+	+
#70	C-WTC-346-d	-	-	-	-	-	-	-	nb
#72	C-WTC-346-d	-	-	-	-	-	-	-	nb
#74	C-WTC-346-d	-	-	-	-	-	-	-	nb

Opis Tabeli 3a:

Zaszczepiano 6 prosiaków (rasy German land; około 25 kg masy ciała) w dwu grupach (każda z grup przetrzymywana osobno). 3 zwierzęta zainfekowano CSFV-WT (1x10⁵TCID50), a trzy zwierzęta wirusem C-346-d (1x10⁵TCID50). Temperaturę odbytniczą i objawy kliniczne zebrano w tabeli, nb - nie badano pośmiertnie

T a b e l a 3b

Wiremia we krwi po infekcji testowej

Eksperyment 1
zwierzę nr	zainfekowane wirusem	wiremia w dniu po infekcji
		3	5	7	10	14
#68	C-WT	+	+	+	+	+
#78	C-WT	+	+	+	+	+
#121	C-WT	+	+	+	+	+
#70	C-346-d	-	-	-	-	-
#72	C-346-d	-	-	-	-	-
#74	C-346-d	-	-	-	-	-

PL 202 161 B1

Opis Tabeli 3b:

Wykrywano wiremię w komórkach krwi przez wspólną hodowlę krwi z komórkami PK15. Po inkubacji w 37°C przez 72 godziny komórki przemywano buforem PBS, utrwalano mieszaniną acetom/metanol o temperaturze lodu i analizowano wystąpienie infekcji techniką immunofluorescencji z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciw glikoproteinie E2 (mAb A18, Weiland i wsp 1990).

T a b e l a 3c:

Powstawanie miana przeciwciał neutralizujących specyficznie CSFV

dni po infekcji	-3	0	17	25	69	76	79	87
#70	-	-	1:18	1:162	1:162	1:162	1:486	1:1458
#72	-	-	1:18	1:54	1:486	1:1458	1:1458	1:4374
#74	-	-	1:6	1:54	1:162	1:162	1:486	1:1458

Opis Tabeli 3c:

Miana przeciwciał u świń zainfekowanych zmutowanym wirusem C-346-d określone w różnych czasach w czasie eksperymentu.

μΐ rozcieńczonej surowicy mieszano z 50 μΐ podłoża zawierającego 30 TCID₅₀ wirusa (CSFV Alfort/Tubingen). Po 90 minutach inkubacji w 37°C, 100 μl zawiesiny komórek (1.5x10⁴ komórek) dodawano i mieszaninę dodawano do studzienek płytki 96 studzienkowej. Po 72 godzinach komórki utrwalano mieszaniną acetom/metanol o temperaturze lodu i analizowano wystąpienie infekcji techniką immunofluorescencji z przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciw glikoproteinie E2 (mAb A18, Weiland i wsp 1990). W dniu 69 po infekcji zwierzętom podawano 2x10⁵ TCID50 wirusa CSFV szczepu Eystrup. Tabela podaje najwyższe rozcieńczenia surowicy prowadzące do całkowitej neutralizacji wprowadzanego wirusa.

P r z y k ł a d 4. Indukowanie ochronnej odporności przez infekcję wirusem RNazo-ujemnym

W celu przeanalizowania, czy infekcja zmutowanym wirusem prowadzi do odporności ochronnej, przeprowadzono eksperyment około 9 tygodni po infekcji zmutowanym szczepem CSFV, wykorzystując wysoce patogenny szczep heterologiczny CSFV (Eystrup, Boehring). Do infekcji zastosowano 2x10⁵TCID50 wirusa. Ta ilość wirusa wystarczała do zaindukowania śmiertelnej choroby w kilkunastu poprzednio prowadzonych doświadczeniach (Konig, 1994). Jak się okazało, zwierzęta poprzednio infekowane zmutowanym wirusem CSFV nie wykazywały objawów choroby po wystawieniu na działanie patogennego szczepu. U zwierząt nie wykryto ani gorączki (figura 3), ani nie zanotowano wiremii, lecz wzrost poziomu przeciwciał neutralizujących, co wskazuje na infekcję związaną z syntezą i replikacja wirusa patogennego.

P r z y k ł a d 5. Potwierdzenie zasady atenuacji

W celu wykazania iż obserwowana atenuacja wirusa zmutowanego wynika rzeczywiście z delecji histydyny w pozycji 346 polibiałka i nie jest wynikiem niezidentyfikowanej drugiej mutacji, przywrócono sekwencje typu dzikiego poprzez wymianę fragmentu o wielkości 1.6 kb XhoI/NdeI pochodzącego z klonu pełnej długości pA/C-346-d na odpowiedni fragment z pA/CSFV o dzikiej sekwencji. Fragment wspomniany wycięty z pA/C-346-d zsekwencjonowano w poszukiwaniu mutacji. Za wyjątkiem delecji kodonu His346 polibiałka, nie znaleziono zmian w porównaniu z sekwencją dziką. Z konstruktu cDNA z rewersją mutacji można uzyskać wirusa V(pA/C-346-d/Rs), który wzrasta równie dobrze, co typ dziki i wykazuje jednakową z nim aktywność RNazy (tabela 2A).

W drugim doświadczeniu z wykorzystaniem zwierząt zrewertowany wirus zastosowano do infekcji świń. Jako kontrolę użyto mutanta delecyjnego. Dwie grupy zwierząt składające się z trzech świń użyto w doświadczeniu. Ponieważ zwierzęta były młodsze (German landrace, około 20 kg masy ciała), niż zwierzęta stosowane w pierwszym eksperymencie zastosowano wirus w dawce 5x10⁴ TCID50. Zwierzęta zainfekowane szczepem zmutowanym nie wykazywały objawów choroby (tabela 5, figura 4). Tylko jedno ze zwierząt miało gorączkę przez 1 dzień. Zwierzęta te wytworzyły przeciwciała neutralizujące i były chronione przed letalną dawką CSFV. Podano 5x10⁴ TCID50 patogennego wirusa szczepu Eystrup. Zwierzęta zaszczepione w ten sposób nie wykazywały klinicznych objawów choroby, a temperatura ich ciała pozostawała prawidłowa (figura 5). W odróżnieniu od świń zainfekowanych mutantem delecyjnym, zwierzęta inokulowane rewertantem rozwijały typowe objawy choroby. Jedno ze zwierząt zabito w 11 dniu po infekcji, dwa inne trzy dni później. Wszystkie zwierzęta wykazywały

PL 202 161 B1 typowe objawy klasycznej cholery świń, a więc gorączkę, biegunkę, anoreksję, i patologiczne objawy typu wylewów krwi w różnych organach wewnętrznych, włączając w to nerki.

T a b e l a 5a

Kliniczne objawy po infekcji testowej

Eksperyment 2
zwierzę nr	zainfekowane wirusem	objawy choroby
		gorączka	biegunka	zaburzenia CSN	anoreksja	wylewy pod-skórne	apatia	stan agonalny w momencie zabicia	wylewy krwi w organach wewnętrznych w badaniu pośmiertnym
#43	C- 346-d	+*		-	-	-	-	-	nb
#47	C- 346-d	-	-	-	-	-	-	-	nb
#87	C- 346-d	-	-	-	-	-	-	-	nb
#27	C- 346-d/Rs	+	+	+	+	-	+	+	+
#28	C- 346-d/Rs	+	+	+	+	-	+	+	+
#30	C- 346-d/Rs	+	+	+	+	-	+	+	+

* - gor ą czka tylko przez 1 dzień ; nb - nie badano

Tabela 5a:

Zaszczepiano 6 prosiaków (rasy German land; około 20 kg masy ciała) w dwu grupach (każda z grup przetrzymywana osobno). 3 zwierzę ta zainfekowano zmutowanym wirusem C-346-d (5x10⁴TCID50), a trzy zwierzęta wirusem C-346-d/Rs (1x10⁴TCID50). C-346-d/Rs otrzymano z C-346-d przez przywrócenie sekwencji E^RNS typu dzikiego. Temperaturę odbytniczą i objawy kliniczne zebrano w tabeli, nb - nie badano poś miertnie

T a b e l a 5b

Diagnostyczny test RNazy z wykorzystaniem wirusów uzyskanych ze zwierząt w trakcie wiremii

	Alfort	zwierzę #3 C-297-K	zwierzę #5 C-297-K	zwierzę #27 C-346-d/Rs	zwierzę #28 C-346-d/Rs	zwierzę #30 C-346-d/Rs	kontrola
OD260	1.84	0.60	0.56	1.84	1.93	1.94	0.49

Wirusy uzyskiwano z krwi zwierząt 3 i 5 dnia po infekcji i ze zwierząt # 27, 28, 30 (z doświadczenia nr 2) (opisane w przykładzie 5) w 7 dniu po infekcji, namnażano w hodowli komórkowej, mianowano i testowano na obecność aktywności RNazy, jak podano to powyżej. Nie zainfekowane komórki PK15 i komórki (kontrola) zainfekowane dzikim szczepem CSFV Alfort służyły za kontrolę. Zwierzęta 3 i 5 zostały zainfekowane zmutowanym szczepem C-297-K, podczas gdy zwierzęta 27, 28 i 30 zostały zainfekowane zmutowanym szczepem C-346-d/Rs, jak wskazano to w tabeli.

P r z y k ł a d 6

RNS

Wpływ podwójnej mutacji w sekwencji kodującej E^RNS

W celu przebadania wpływu podwójnej mutacji w obrębie sekwencji kodującej ERNS na zdolność wirusów do replikacji w naturalnym gospodarzu i na patogenność, przeprowadzono doświadczenie z wykorzystaniem zwierzą t oraz zmutowanego szczepu V(pA/C-297-L/346-L). Wirus uzyskano z pełnej długości klonu CSFV bez mutacji (V)pA/CSFV)) służącego także jako kontrola pozytywna. Każdy zmutowany wirus testowano z wykorzystaniem trzech prosiaków (German landrace; około 25 kg masy ciała). Dawka infekcyjna wynosiła 1x10⁵TCID50 na każde zwierzę; 2/3 inokulowano dwie trzecie inokulatu podawano donosowo (1/3 do każdej jamy), jedną trzecią domięśniowo. Wspomniane dwie grupy zwierząt przetrzymywano w osobnych, izolowanych pomieszczeniach. Z każdego zwierzęcia pobierano próbki krwi przed infekcją (dzień 0) oraz w dniach: 5, 8, 12 i 20. Każdego dnia mierzono temperaturę ciała zwierząt

PL 202 161 B1 (figura 6). Zwierzęta zainfekowane podwójnym mutantem nie prezentowały typowych objawów klasycznej cholery świń i nie zaprzestały jedzenia pokarmu. Zwierzęta nie miały gorączki w trakcie całego eksperymentu (zwierzęta 45/2 i 45/3) za wyjątkiem zwierzęcia 45/1 w dniu 8, prawdopodobnie spowodowanej infekcją bakteryjną w wyniku zranienia prawej tylniej nogi. Po leczeniu tego zwierzęcia antybiotykiem w dniu 10, temperatura powrócił a do normy w ciągu jednego dnia (figura 6). U wszystkich zwierząt izolowano wirusa z krwi w dniu 5, i nie obserwowano wiremii później (tabela 6a). U wszystkich zwierząt powstały przeciwciała neutralizujące wirusa (tabela 6b). U zwierzęcia 45/1 miano przeciwciał neutralizujących oznaczono ponownie w około 4.5 miesiąca po infekcji i wynosiło ono wtedy 1:4374. Zatem, infekcja podwójnym mutantem prowadziła do długotrwałej pamięci immunologicznej.

T a b e l a 6a

Testowanie wiremii

dni po infekcji	5	8	12
45/1	+	-	-
45/2	+	-	-
45/3	+	-	-

T a b e l a 6b

Miano przeciwciał neutralizujących

zwierzę	dzień 0	dzień 20 po infekcji
45/1	-	1:128
45/2	-	1:256
45/3	-	1:256

P r z y k ł a d 7. Immunogenność i zasada atenuacji wirusa BVDB „B-346-d”

W celu sprawdzenia zasady atenuacji jak równie ż immunogennoś ci wirusa BVDV „B-346-d” uzyskanego z pA/B-346-d zaplanowano eksperyment porównujący go z wirusem „B-WT” uzyskanym z pA/BVDV/Ins-. Wirus „B-346-d” jest wirusem zmutowanym, wywodzą cym się z wyjś ciowego wirusa BVDV, z mutacją wprowadzoną w pozycji 349, i nazwanym „B-346” w celu wskazania odpowiadającej pozycji 346 w szczepie CSFV Alfort (figura 1).

Wybrano trzy grupy seroujemnych względem wirusa BVDV zwierząt w wieku 3-6 miesięcy. Grupę 1 i 2 tworzyło 5 zwierząt, a grupę 3 - trzy. Zwierzęta z grupy 1 i 2 zainfekowano podając im 2x10⁶TCID50 wirusa B-346-d (grupa 1) lub B-WT (grupa 2) w objętości dawki 5 ml. Zwierzęta zainfekowano domięśniowo (mięsień pośladkowy), donosowo i podskórnie (nad łopatką). W czasie 14 dni po infekcji śledzono wiremię w obu grupach, oznaczając wiremię we krwi oraz wirusa obecnego w śluzie nosowym. Ponadto określano inne parametry istotne klinicznie: temperaturę, liczbę białych krwinek oraz ogólny stan zdrowia.

Odporność ochronną skierowaną przeciw infekcji antygenowo heterologicznego i wirulentnego szczepu BVDV (#13) oznaczano prowadząc infekcję prowokującą 77 dni po wspomnianej infekcji zwierzęta z grupy 1 szczepem B-346-d. Zwierzęta z grupy 3 stanowiły kontrolę i infekowano je zgodnie z procedurą przyjętą dla zwierząt z grupy 1, wirulentnym szczepem BVDV. Wirus BVDV (#13) należy do odmiennej grupy antygenowej (typ II), podczas gdy wirus B-346-d należy do grupy typu I, zgodnie z klasyfikacją przedstawioną przez Pellerina i wsp, 1994. Zwierzęta z grupy 1 i 3 zostały zaszczepione dawką 2x10⁶TCID50 wirusa BVDV (#13) w objętości dawki 5 ml. Zwierzęta zainfekowano domięśniowo (mięsień pośladkowy), donosowo i podskórnie (nad łopatką). W czasie 14 dni po infekcji śledzono wiremię w obu grupach, oznaczając wiremię we krwi oraz wirusa obecnego w śluzie nosowym. Ponadto określano inne parametry istotne klinicznie: temperaturę, liczbę białych krwinek oraz ogólny stan zdrowia.

Po infekcji szczepem B-346-d zwierzęta nie wykazywały typowych klinicznych objawów infekcji BVDV takich jak wzrost temperatury odbytniczej (tabela 7a) ani żadnych objawów ze strony układu oddechowego (nie przedstawiono).

Zmniejszona wiremia w leukocytach (tabela 7b) i obecność wirusa w śluzie nosowym (tabela 7c) wskazywały wyraźnie na atenuację wirusa B-346-d w porównaniu z B-WT.

Wirulentny izolat #13 indukował w organizmach zwierząt z grupy 3 silną wiremię z typowymi objawami infekcji BVDV, takimi jak wzrost temperatury mierzonej w odbycie w ciągu ponad 7 dni (tabela 7d), silna leukopenia (tabela 7e), przedłużająca się wiremia w leukocytach (tabela 7f) i obecność wirusa w śluzie nosowym (tabela 7g). Natomiast zwierzęta z grupy 1, które zostały zaszczepione przez

PL 202 161 B1 zainfekowanie wirusem B-346-d nie wykazywały prawie wcale klinicznych objawów typowych dla infekcji BVDV po podaniu w teście prowokacji wirulentnego izolatu BVDV #13. Nie obserwowano objawów wzrostu temperatury mierzonej w odbycie (tabela 7d). Leukopenia miała nieznaczne nasilenie, zarówno co do zakresu, jak czasu trwania (tabela 7e). Z krwi nie można było wyizolować BVDV (tabela 7f) i tylko u jednego zwierzęcia można było wyizolować wirusa z śluzu nosowego (tabela 7g).

Zatem infekcja szczepem B-346-d indukuje silną odporność, wyraźnie zmniejszającą objawy kliniczne, obecność wirusa w śluzie nosowym oraz wiremię we krwi, po wystawieniu na działanie prowokujące heterologicznego izolatu BVDV.

T a b e l a 7a

Średnia temperatura ciała mierzona w odbycie zwierząt grupy 1 (B-346-d) i grupy 2 (B-WT)

dzień badania	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14
grupa 1	38.8	39.1	39.0	38.7	38.8	38.7	38.7	38.5	38.7	38.5	38.5	38.5	38.4	38.9	38.7
grupa 2	38.8	39.0	38.8	38.6	38.6	38.7	38.6	38.4	39.1	38.4	38.7	38.6	38.7	38.6	38.6

T a b e l a 7b

Wiremia w leukocytach w grupie 1 i 2

grupa	zwierzę	dzień pojawienia się śluzu w jamie nosowej	dzień zaniku śluzu w jamie nosowej	czas występowania śluzu w jamie nosowej	Średni czas w grupie
1	1	6	6	1	1.4
2	4	6	2
3	5	5	1
4	-	-	0
5	6	9	3
2	6	4	8	5	4.4
7	4	7	4
8	4	7	4
9	4	7	4
10	4	8	5

Próbki krwi na EDTA zbierano codziennie aż do 10 dnia po infekcji szczepami B-346-d i B-WT. 0.2 ml krwi dodawano do każdej z 3 hodowli komórek jąder cielęcia (Cte) w pożywce zawierającej heparynę (lU/ml, by zapobiec skrzepnięciu). Po inkubacji przez noc zastępowano pożywkę świeżą porcją pożywki bez heparyny. Po inkubacji przez od 4 do 6 dni, zainfekowane BVDV komórki wykrywano immunofluorescencyjnie stosując poliklonalne przeciwciało specyficzne względem BVDV. Hodowle seroujemne zamrażano i następnie rozmrażano. 0.2 ml zawiesiny następnie pasażowano na nowe komórki Cte w celu potwierdzenia nieobecności BVDV.

T a b e l a 7c

Obecność wirusa w śluzie nosowym

grupa	zwierzę	dzień pojawienia się śluzu w jamie nosowej	dzień zaniku śluzu w jamie nosowej	liczba dni w których wirus obecny był w śluzie	średni czas występowania wirusa dla grupy
1	2	3	4	5	6
1	1	4	8	4	2.6
2	6	6	1
3	4	4	1
4	5	7	3
5	3	6	4

PL 202 161 B1 cd. tabeli 7c

1	2	3	4	5	6
2	6	6	8	3	3.6
7	5	7	3
8	5	8	4
9	5	6	2
10	3	9	6

Wymazy nosowe wirowano (1000g) w celu usunięcia większych resztek komórkowych i zanieczyszczeń. Supernatant usuwano i 0.2 ml wysiewano na trzy hodowle komórkowe. Po inkubacji przez noc pożywkę zastępowano świeżą (2 ml). Po inkubacji przez 4-6 dni zainfekowane BVDV komórki wykrywano immunofluorescencyjnie stosując poliklonalne przeciwciało specyficzne względem BVDV.

T a b e l a 7d

Średnia temperatura ciała mierzona w odbycie zwierząt grupy 1 i 2

dzień badania	-2	-1	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	12	14
grupa 1	38.4	38.6	38.5	38.5	38.6	38.4	38.4	38.4	38.3	38.4	38.4	38.4	38.4	38.4	38.4
grupa 3	38.8	39.1	38.8	39.1	39.4	39.7	40.2	40.2	40.4	41.3	40.2	40.1	40.2	40.8	40.4

Temperatury odbytnicze mierzono w ciągu 16 dni po infekcji prowokującej. Zwierzęta z grupy 1 i 3 infekowano wirusem w ilości 6x10⁶TCID50 wirulentnego izolatu #13 BVDV.

T a b e l a 7e Średnie miana leukocytów

dzień badania	-2	-1	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	12	14
grupa 1	11.9	11.9	11.3	10.8	9.2	8.2	8.9	9.9	11.2	11.6	11.6	10.6	10.8	10.8	9.4
grupa 3	11.7	15.8	13.8	11.1	7.7	9.8	7.4	6.8	7.5	8.7	7.0	8.1	6.2	6.4	6.2

Próbki krwi na EDTA zbierano od dnia -2 do 14 po infekcji prowokującej w obu grupach. Liczbę białych ciałek krwi oznaczano stosując automatyczny licznik komórek Sysmex Micro-Cell Counter F800.

T a b e l a 7f

Wirus BVDV izolowany z próbek krwi

grupa	zwierzę	dzień pojawienia się wirusa we krwi	dzień zaniku wirusa we krwi	liczba dni w których wirus obecny był we krwi	średni czas występowania wirusa dla grupy
1	1	-	-	0	0
2	-	-	0
3	-	-	0
4	-	-	0
5	-	-	0
3	11	3	10	8	9.7
12	3	14	12
13	3	9	9

Próbki krwi na EDTA zbierano codziennie aż do 10 dnia po infekcji prowokującej. 0.2 ml krwi dodawano do każdej z 3 hodowli komórek jąder cielęcia (Cte) w pożywce zawierającej heparynę (lU/ml, by zapobiec skrzepnięciu). Po inkubacji przez noc zastępowano pożywkę świeżą porcją pożywki bez heparyny. Po inkubacji przez od 4 do 6 dni, zainfekowane BVDV komórki wykrywano immunofluorescencyjnie stosując poliklonalne przeciwciało specyficzne względem BVDV. Hodowle

PL 202 161 B1 seroujemne zamrażano i następnie rozmrażano. 0.2 ml zawiesiny następnie pasażowano na nowe komórki Cte w celu potwierdzenia nieobecności BVDV.

T a b e l a 7g

Obecność wirusa w płynie z jamy nosowej

grupa	zwierzę	dzień pojawienia się śluzu w jamie nosowej	dzień zaniku śluzu w jamie nosowej	liczba dni w których wirus obecny był w śluzie	średni czas występowania wirusa dla grupy
1	1	3	4	2	0.8
2	-	-	0
3	-	-	0
4	-	-	0
5	4	5	2
3	11	3	14	12	10
12	3	14	12
13	3	8	6

Wymazy nosowe wirowano (1000g) w celu usunięcia większych resztek komórkowych i zanieczyszczeń. Supernatant usuwano i 0.2 ml wysiewano na trzy hodowle komórkowe. Po inkubacji przez noc pożywkę zastępowano świeżą (2 ml). Po inkubacji przez 4-6 dni zainfekowane BVDV komórki wykrywano immunofluorescencyjnie stosując poliklonalne przeciwciało specyficzne względem BVDV.

P r z y k ł a d 8. Rozróż nienie mię dzy szczepem C-346-d i szczepem CSFV bez delecji kodonu histydynowego 346, z wykorzystaniem techniki RT-PCR

RNS

Sekwencja kodująca konserwowanego motywu RNazy glikoproteiny E^RNS wirusa CSFV jest silnie konserwowana ewolucyjnie. Wśród wszystkich znanych sekwencji CSFV nie zanotowano zmian w regionie obejmującym reszty 1387-1416 (pozycje zgodne z opublikowaną sekwencją CSFV szczepu Alfort, Meyers i wsp 1987). Można zatem użyć starterów komplementarnych do tego regionu genomu wirusa w reakcji RT-PCR, w celu testowania wszystkich izolatów CSFV (patrz figura 7). W teście RT-PCR można wykryć brak kodonu histydynowego w pozycji 346 (w sekwencji nukleotydowej pozycje 1399-1401), stosując użyteczne startery. Zsyntezowano różne oligonukleotydy, komplementarne do regionu konserwowanego, które obejmowały lub nie obejmowały kodon histydynowy. Oligonukleotydy te

RNS służyły jako startery z końca 5' w reakcji RT-PCR z oligonukleotydem E^RNS-Stop, jako starterem 3'. RNA oczyszczone z hodowli tkankowej komórek zainfekowanych C-346-d, C-WT, C-346-L lub C-346-K stosowano jako matrycę w reakcji. Prowadzono odwrotną transkrypcję 2 μρ zdenaturowanego termicznie RNA (2 minuty w 92°C, 5 minut w lodzie, w 11 μ! wody w obecności 30 pmola startera 3') po dodaniu 8 μ! mieszaniny RT (125 mM TRIS/HCl pH 8.3, 182.5 mM KCl, 7.5 mM MgCl2, 25 mM DTT, 1.25 mM każdego z dNTP) oraz 15 U RNAguard (Pharmacia) oraz 50 U polimerazy Superscript (LifeTechnologies/BRL) przez 45' w 37°C. Po ukończeniu reakcji odwrotnej transkrypcji probówki umieszczano w lodzie i dodawano 30 μ! mieszaniny PCR (8.3 mM TRIS/HCl pH 8.3, 3.3 mM KCl, 2.2 mM MgCl₂, 0.42 mM każdego z dNTP, 0.17% Triton X-100, 0.03% BSA, 5U Taq polimerazy (Appligene) oraz 16.7% DMSO. Gdy stosowano starter OI H+3 mieszanina reakcyjna do amplifikacji nie zawierała DMSO. Amplifikację prowadzono przez 38 cykli (30 sek 94°C; 30 sek 57°C; 45 sek 74°C). 1 μl mieszaniny po reakcji PCR analizowano elektroforetycznie w 1% żelu agarozowym i barwiono bromkiem etydyny. Jak wykazano na figurze 7, para

RNS starterów Ol H-3/ 01 E^RNS-Stop pozwalała na specyficzną amplifikację fragmentu pochodzącego z RNA z delecją kodonu 346, podczas gdy inne dwie pary starterów pozwalały na powielenie odcinka bez delecji kodonu 346. W tym drugim przypadku nie powstawał produkt z matrycą zawierającą delecję kodonu 346.

Startery do RT-PCR startery 5':

OI H-3: TGGAACAAAGGATGGTGT

OI H+2: TGGAACAAACATGGATGG

OI H+3: GAATGGAACAAACATGGA

Starter 3':

OI E^RNS Stop: GGAATTCTCAGGCATAGGCACCAAACCAGG

PL 202 161 B1

PL 202 161 B1

Asp Ala 210	, Thr Ile Val Val	Asp Gly Val 215	Lys Tyr	Gin Val 220	Lys	Lys	Lys
Gly Lys	Val Lys Ser Lys	Asn Thr Gin	i Asp Gly	Leu Tyr	His	Asn	Lys
225	230		235				240
Asn Lys	Pro Gin Glu Ser	Arg Lys Lys	Leu Glu	Lys Ala	Leu	Leu	Ala
	245		250			255
Trp Ala	Ile Ile Ala Leu	Va 1 Phe Phe	Gin Val	Thr Met	Gly	Glu	Asn
	260	265			270
Ile Thr	Gin Trp Asn Leu	Gin Asp Asn	Gly Thr	Glu Gly	Ile	Gin	Arg
	275	280		285
Ala Met	Phe Gin Arg Gly	Val Asn Arg	Ser Leu	His Gly	Ile	Trp	Pro
290		295		300
Glu Lys	Ile Cys Thr Gly	Val Pro Ser	His Leu	Ala Thr	Asp	Thr	Glu
305	310		315				320
Leu Lys	Ala Ile His Gly	Met Met Asp	Ala Ser	Glu Lys	Thr	Asn	Tyr
	325		330			335
Thr Cys	Cys Arg Leu Gin	Arg His Glu	Trp Asn	Lys Gly	Trp	Cys	Asn
	340	345			350
Trp Tyr	Asn Ile Glu Pro	Trp Ile Leu	Leu Met	Asn Lys	Thr	Gin	Ala
	355	360		365
Asn Leu	Thr Glu Gly Gin	Pro Leu Arg	Glu Cys	Ala Val	Thr	Cys	Arg
370		375		380
Tyr Asp	Arg Asp Ser Asp	Leu Asn Val	Val Thr	Gin Ala	Arg	Asp	Ser
385	390		395				400
Pro Thr	Pro Leu Thr Gly	Cys Lys Lys	Gly Lys	Asn Phe	Ser	Phe	Ala
	405		410			415
Gly Ile :	Leu Val Gin Gly :	Pro Cys Asn	Phe Glu	Ile Ala	Val	Ser	Asp
	420	425			430
Val Leu 1	Phe Lys Glu His Asp Cys Thr	Ser Val	Ile Gin	Asp	Thr	Ala
435	440		445
His Tyr Leu Val Asp Gly Met Thr Asn	Ser Leu	Glu Ser	Ala	Arg	Gin
450	455		460
Gly Thr Ala Lys Leu Thr Thr Trp Leu 1	Gly Arg	Gin Leu	Gly	Ile	Leu
465	470		475				480
Gly Lys Lys Leu Glu Asn Lys Ser Lys '	Thr Trp	Phe Gly	Ala

485 490 <210> 2 <211> 495 <=212> PRT <213> CSFV Erns mutant 295 G

<400> 2
Met Glu Leu Asn	His	Phe Glu Leu Leu Tyr Lys	Thr Ser Lys Gin Lys
1	5	10	15

PL 202 161 B1

Pro

. Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Αβρ

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

ASp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245 250

Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin 260 265 270

Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly He Gin Arg Ala Met Tyr 275 280 285

Leu Arg Gly Val Asn Arg Gly Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile 290 295 300

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Clu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

cys 335

cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

PL 202 161 B1

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

He

Gin

Leu 360

Mat

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala. 465

Arg

Val

Thr

ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

<210> 3 <211> 492

<212> PRT <213> CSFV

Erns

mutant

296-

7-8-

delecja

<400=· 3 Met Glu 1

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

e

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Aep

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

PL 202 161 B1

145

150

155

160

Cys Pro Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

ASp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys Asp Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro Arg Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile Val Val 210

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys Gly Lys 225

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro Glu Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile Thr Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp Asn Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu Arg Gly 290

Val

Asn

Arg

Ser 295

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys 300

Ile

Cys

Lys

Gly

Val Pro Thr 305

His

Leu

Ala 310

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu 315

Lys

Glu

Ile

Arg

Gly 320

Met Met Asp

Ala

Ser 325

Glu

Arg

Thr

Asn

Tyr 330

Thr

Cys

Cys

Arg

Leu 335

Gin

Arg His Glu

Trp 340

Asn

Lys

His

Gly

Trp 345

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn 350

Ile

Asp

Pro Trp Ile 355

Gin

Leu

Met

Asn

Arg 360

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu 365

Thr

Glu

Gly

Pro Pro Asp 370

Lys

Glu

Cys

Ala 375

Val

Thr

Cys

Arg

Tyr 380

Asp

Lys

Asn

Thr

Asp Val Asn 385

Val

Val

Thr 390

Gin

Ala

Arg

Asn

Arg 395

Pro

Thr

Thr

Leu

Thr 400

Gly Cys Lys

Lys

Gly 405

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe 410

Ala

Gly

Thr

Val

Ile 415

Glu

Gly Pro Cys

Asn 420

Phe

Asn

Val

Ser

Val 425

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr 430

Gly

Asp

His Glu Cys 435

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin 440

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr 445

Leu

Leu

ASp

Gly Met Thr 450

Asn

Thr

Ile

Glu 455

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly 460

Ala

Ala

Arg

Val

Thr Ser Trp 465

Leu

Gly

Arg 470

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala 475

Gly

Lys

Lys

Leu

Glu 480

Arg Arg Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

PL 202 161 B1 <210> 4 <211» 494 <212» PRT .

<213» CSFV Ems mutant 297- delec;ja

<400» 4 Met Glu 1

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

nys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly Arg 30

pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

PL 202 161 B1

Leu

Arg 290

Gly

Vał

Asn

Arg

Ser 295

Leu

Gly

Ile

Trp

Pro 300

Glu

Lys

Ile

Cys

Lys 305

Gly

Val

Pro

Thr

His 310

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr 315

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile 320

Arg

Gly

Met

Met

Asp 325

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr 330

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys 335

Arg

Leu

Gin

Arg

His 340

Glu

Trp

Asn

Lys

His 345

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp 350

Tyr

Asn

Ile

Asp

Pro 355

Trp

Ile

Gin

Leu

Met 360

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr 365

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly 370

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu 375

Cys

Ala

Val

Thr

Cys 380

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn 385

Thr

Asp

Val

Asn

Val 390

Val

Thr

Gin

Ala

Arg 395

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr 400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys 405

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe 410

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr 415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro 420

Cys

Asn

Phe

Asn

Val 425

Ser

Val

Glu

Asp

Ile 430

Leu

Tyr

Gly

Asp

His 435

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu 440

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala 445

Leu

Tyr

Leu

Leu

Asp 450

Gly

Met

Thr

Asn

Thr 455

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg 460

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg 465

Val

Thr

Ser

Trp

Leu 470

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser 475

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys 480

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Łys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

4SS 490 <210> 5 <211> 495 <212=· PRT <213=· CSFV Erns mutant 297 K <400> 5

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

His

Asp SO

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 65

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gin

Pro

Leu

Leu

Ser

Gly

Lys

Leu

Pro

Pro

Gly

Pro

PL 202 161 B1

Val

Tyi

- His

Arg 100

Ala

, Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys-

Glu Val

Thr 115

Lys

Arg Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Αβρ 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

e

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

Lys

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr .

Leu '

Thr '

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile Glu Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

PL 202 161 B1

Τγτ

GJy

Asp 435

Hn

Glu

Cys

Gly

Sei 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Lev

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Alg

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu λ oe

485 «Ο <210> 6 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Erna mutant 297 L

<400> 6	Phe	Glu	Leu Leu Tyr Lys Thr 10	Ser	Lys	Gin 15	Lys
Met 1	Glu	Leu	Asn	His 5
Pro	Val	Gly	Val 20	Glu	Glu	Pro	Val Tyr Asp Thr Ala 25	Gly	Arg 30	Pro	Leu
Phe	Gly	Asn 35	Pro	Ser	Glu	Val	His Pro Gin Ser Thr 40	Leu 45	Lys	Leu	Pro
His	Asp 50	Arg	Gly	Arg	Gly	Asp 55	Ile Arg Thr Thr Leu 60	Arg	Asp	Leu	Pro
Arg	Lys	Gly	Asp	Cys	Arg	Ser	Gly Asn His Leu Gly	Pro	val	Ser	Gly O Λ

Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 ⁹⁵

Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 100 1°5 H°

Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu US 120 125

Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 130 135 ¹⁴⁰

Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn

145 ISO 155 ISO

Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser

165 170 US

Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala 180 185 190

Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr 195 200 205

Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val 210 215 220

Lys Gly Lys Aon Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro

PL 202 161 B1

225

230

235

240

Pio

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 25S

Val

He

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Giy

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

Leu

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Tle

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 37S

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

<210> 7 <211> 494 <212> PRT <213> CSFV Erna mutant 301- rift1.ecja <400> 7 _Tv_

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gl Y

5 10 ' ¹⁵

Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 2S 30

PL 202 161 B1

Phe Gly

Asn 35

i Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gir

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg Lys 65

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

val

Ser

Gly 80

Ile Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu Val

Thr 11S

Lys

Arg

Ile

Gly Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 13S

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Glu

Lys

Ile

Cys

Lys 305

Gly

Val

Pro

Thr

His 310

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr 315

Glu

Leu

Lys

Glu

Ile 320

Arg

Gly Met

Met

Asp 325

Ala

Ser

Glu

Arg

Thr 330

Asn

Tyr

Thr

Cys

Cys 335

Arg

Leu

Gin Arg

His 340

Glu

Trp

Asn

Lys

His 345

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp 350

Tyr

Asn

ile .

Asp Pro '

Trp

Ile

Gin

Leu

Met

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn

Leu

Thr

360 365

PL 202 161 B1

Glu

Gly 370

Fro

Pro

Asp

Lys

Glu 375

Cys

Ala

Val

Thr

Cys 360

Arg

Tyi

Asp

Lys

Asn 385

Thr

Asp

Val

Asn

Val 390

Val

Thr

Gin

Ala

Arg 395

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr 400

Łeu

Thr

Gly

Cys

Lys 405

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe 410

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr 415

val

Ile

Glu

Gly

Pro 420

Cys

Asn

Phe

Asn

Val 425

Ser

Val

Glu

Asp

Ile 430

Leu

Tyr

Gly

Asp

His 435

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu 440

Łeu

Gin

Asp

Thr

Ala 445

Leu

Tyr

Leu

Leu

Asp 450

Gly

Met

Thr

Asn

Thr 455

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg 460

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys SflO

465 470 *⁷5

Leu Glu Arg Arg Ser Lye Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 «0 <210> 8 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Ems mutant 3 02 A

<400> 8

Glu Leu

Leu

Tyr Lys Thr Ser Lys Gin

Lys

Met 1

Glu Leu Asn His 5

Phe

10

15

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 12S

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

PL 202 161 B1

Lys

Asp

» Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ais

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Vał

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Vał

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Ala

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp 370 375 380

Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr

385 390 395 ⁴⁰⁰

Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr

405 410 41⁵

Val Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu 420 425 430

Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr 435 440 445

Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala 450 455 460

Ala Arq Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys 465 470 475 480

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490 495 <210? 9

PL 202 161 B1 <2.11; 493 <2 12; PRT <213» CSFV Erns mutant 305 G

<400> 5 Met Glu 1

Leu

Asn

His S

Phe

GlU

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

Kie 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

ASp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp SS

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Yal

Ser

Gly eo

Tle

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Aep

Tyr

Thr

Gly 95

pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 14 5

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

phe

Thr

Asn 160

cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

cys

Ser

ASP 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

P

Arg

Glu 195

Bis

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

tle

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

'rp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Oly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

eu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

iy

Lys

Gly

Yal

Pro

Thr

His

Leu

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu

PL 202 161 B1

305

310

315

320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

ASp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala «ς

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

90

Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr

40S

410

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 490 ⁴⁹⁵ <210> 10 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 340 G

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys

5

Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 3°

Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45

His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 6°

Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75

Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 ⁹⁵

Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys

100

105

PL 202 161 B1

Glu Vsl

Thr 115

Lys

Arg

: Ile

Gly

Arę 120

Val

Thr

dy

Ser

Asp 125

Gly

Łys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Vał

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

LyE

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys ISO

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 165

Lys

Gly

Łys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Gly 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Łys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr Gly .

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

PL 202 161 B1

Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly ^Alc 450 455 <60

Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys 465 470 <75 ⁴⁸⁰

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu * __ λ aa A <210> 11 <211> 493 <212> PRT .

<213> CSPV Ems mutant 342-6- delecja

<400> 11 Met Glu Leu 1

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

val

Ser

Gly 80

Tle

Tyr

Tle

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 23Ó

ASp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala *5 «

Val

245 ²⁵⁰

PL 202 161 B1

lir

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thx'

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Ket

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Olu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

cys

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Trp

Asn

Lys

Gly Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

Asn

Ile

340 345 350

Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu Thr Glu 355 360 365

Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asn 370 375 380

Thr Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu

385 390 395 <00

Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser Phe Ala Gly Thr Val Ile

405 410 415

Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val Glu Asp Ile Leu Tyr Gly 420 425 430

Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr Leu Leu 435 440 445

Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala Ala Arg 450 455 460

Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser Thr Ala Gly Lys Lys Leu 465 470 475 480

Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala Tyr Ala Leu 485 490

<210> 12 <211> 494 <212> PRT <213> CSFV	Erns	mutant	342-	delecja
<400> 12 Met Glu Leu 1	Asn	His 5	Phe	Glu	Leu	Leu	Tyr 10	Lys	Thr	Ser	Lys
Pro Val Gly	Val 20	Glu	Glu	Pro	Vał	Tyr 25	Asp	Thr	Ala	Gly	Arg 30
Phe Gly Asn 35	Pro	Ser	Glu	Val	His 40	Pro	Gin	Ser	Thr	Leu 45	Lys
His Asp Arg	Gly	Arg	Gly	Asp	Ile	Arg	Thr	Thr	Leu	Arg	Asp

Gin

Pro

Leu

Leu

Lys

Leu

Pro

Pro

PL 202 161 B1

50

55

60

Arg es

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

val

ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

ASP

Tyr

Thr

Gly 95

pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

ASp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Giy

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Trp

Asn

Lys

His 345

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp 350

Tyr

Asn

Ile

Asp

Pro 3S5

Trp

Ile

Gin

Leu

Met 360

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr 365

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly 370

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu 375

Cys

Ala

Val

Thr

Cys 380

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Asn

Val

Val

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn

. Arg

pro

. Thr

Thr

PL 202 161 B1

3S5 Leu

Thr

390

395

Ala Gly

Thr 415

400 Val

Gly

Cys

Lys 405

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe 410

Ser Phe

Ile

Glu

Gly

Pro 420

Cys

Asn

Phe

Asn

Val 425

Ser

Val

Glu

Asp

Ile 430

Leu

Tyr

Gly

Asp

His 435

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu 440

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala 445

Łeu

Tyr

Leu

Leu

Asp 450

Gly

Met

Thr

Asn

Thr 455

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg 460

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg 46S

Val

Thr

Ser

Trp

Leu 470

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser 475

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys 480

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser 485

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly 490

Ala

Tyr

Ala

Leu

<210> 13 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Ems mutant 343 G

<400> 13

Glu Leu

Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin

Lys

Met 1

Glu Leu

Asn

His 5

Phe

10

15

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

vał

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys

Pro

Asp

Arg

Met

Asn

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys i on

Ile

Ala

180

PL 202 161 B1

Prc

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lye

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

I’e

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Gly

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 486

Ser

Lys

Thr Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

<210> 14 <211? 492 <212? PRT <213? CSFV Ems 345-7- delecja

PL 202 161 B1

<400> 14

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr Ser

Lys

Gin 15

Lys

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Vał

Tyr 25

Asp

Thr

Ala Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

GlU

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu Arg 60

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro es

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser Asp ' 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu Leu 140

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg ISO

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Asp

Gly Ala

Ser

Gly

Ser

170 175

Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala 180 185 190

Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr 195 200 205

Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val 210 215 220

Lys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro

225 230 235 240

Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu Lys Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val

245 250 255

Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro Val Ala Ala Glu Asn Ile Thr Gin 260 265 270

Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr Asn Gly Ile Gin Arg Ala Met Tyr 275 280 285

Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile 290 295 300

Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu

305 310 315 ³²⁰

Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys

325 330 ³³⁵

PL 202 161 B1

Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Trp Cys Aac Trp Tyr Asn Ile Asp 340 345 350

Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu Thr Glu Gly 355 360 365

Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Lys Asn Thr 370 375 380

Asp Val Asn Val Val Thr Gin Ala Arg Asn Arg Pro Thr Thr Leu Thr 385 ' 390 395 400

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly 405

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe 410

Ala

Gly

Thr

Val

Ile 415

Glu

Gly

Pro

Cys

Asn 420

Phe

Asn

Val

Ser

Val 425

Glu

Asp

Ile

Leu

Tyr 430

Gly

Asp

His

Glu

Cys 435

Gly

Ser

Leu

Leu

Gin 440

Asp

Thr

Ala

Leu

Tyr 445

Leu

Leu

Asp

Gly

Met 450

Thr

Asn

Thr

Ile

Glu 455

Asn

Ala

Arg

Gin

Gly 460

Ala

Ala

Arg

Val

Thr 465

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg 470

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala 475

Gly

Lys

Lys

Leu

Glu 480

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 <210> 15 <211> 493 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 345-6- delecja <400> 15

Met 1

Glu

Leu

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His

Ile

Tyr

Val

Cys

Val

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu

Leu

Lys

Leu

Ala

PL 202 161 B1

130 13S 140

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg ISO

Thr

Leu

Lys

Trp

ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 19S

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Łys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Łys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly

Leu

Tyr

His

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro

225 230 235 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Łeu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 26S

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg

Ala

Met

Tyr

275 280 28S

Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile 290 295 300

Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu Ala Thr Asp Thr Glu Leu Lys Glu

305 310 315 320

Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Arg Thr Asn Tyr Thr Cys Cys

325 330 335

Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile

340

345

350

Asp

Pro

Trp 355

Ile

Gin

Leu

Met

Asn 360

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn 365

Leu

Thr

Glu

Gly

Pro 370

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys 375

Ala

Val

Thr

Cys

Arg 380

Tyr

Asp

Lys

Asn

Thr 385

Asp

Val

Asn

Val

Val 390

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn 395

Arg

Pro

Thr

Thr

Leu 400

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys 405

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser 410

Phe

Ala

Gly

Thr

Val 415

Ile

Glu

Gly

Pro

Cys 420

Asn

Phe

Asn

Val

Ser 425

Val

Glu

Asp

Ile

Leu 430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu 435

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu 440

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu 445

Tyr

Łeu

Leu

Asp

Gly 450

Met

Thr

Asn

Thr

Ile 455

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin 460

Gly

Ala

Ala

Arg

Val

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys

Leu

PL 202 161 B1

465

470

475

480

Glu Arg Arg

Ser

Lys 485

Thr

Trp Phe

Gly Ala 490

Tyr

Ala

Leu

<210> 16 <211> 495

<212> PRT <213> CSFV

Erns

mutant ;

345 .

A

<400> 16 Met Glu Leu 1

Asn

His 5

Phe

GlU

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg Lys 65

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

cys

Glu Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 12S

Giy

Lys

Leu

Tyr His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 14 0

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys Arg 145

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile Val 210

Val

Olu

Gly

Vsl

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys Gly 225

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

tle Thr

Ile

Leli 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

PL 202 161 B1

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Ala 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

val

Thr

Gin

Ala 39S

Arg

Asn

Arg

pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 4 35

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 4S0

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

<210> 17 <211> 493

<212> PRT <213 > CSFV Ems

mutant 346-'

7-delecja

<400> 17 Met Glu Leu 1

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr Asp 25

Thr

Ala

Gly

Arg 30

pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg

Ser

Gly

Asn His

Leu 7C

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

β5 70

PL 202 161 B1

He

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn

145 ISO 155

Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser 16S 170 17S

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala

Val

245 250 255

Ile

: Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr 350

Asn

Ile

Asp

Pro

Trp 355

Ile

Gin

Leu

Met

Asn 360

Arg

Thr

Gin

Thr

Asn 365

Leu

Thr

Glu

Gly

Pro 370

Pro

Asp

Lys

Glu

Cys 375

Ala

Val

Thr

Cys

Arg 380

Tyr

Asp

Lys

Asn

Thr 385

Asp

Val

Asn

Val

Val 390

Thr

Gin

Ala

Arg

Asn 3 95

Arg

Pro

Thr

Thr

Leu 400

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr

Val

Ile

405 410 415

PL 202 161 B1

Glu

Gly

Pro

Cys 420

Asn

Phe

Asn

Yal

Ser 425

val

Glu

Asp

Ile

Leu 430

Tyr

Gly

Asp

His

Glu 435

Cys

Gly

Ser

Leu

Leu 440

Gin

Asp

Thr

Ala

Leu 445

Tyr

Leu

Leu

Asp

Gly 450

Met

Thr

Asn

Thr

Ile 455

Glu

Asn

Ala

Arg

Gin 460

Gly

Ala

Ala

Arg

Val 465

Thr

Ser

Trp

Leu

Gly 470

Arg

Gin

Leu

Ser

Thr 475

Ala

Gly

Lye

Lys

Leu 480

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 <210> 18 <211> 494 <212> PRT <213> CSFV Ems mutant 346-delecja

<400> 18 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin	Lys
1	5	10	15
Pro Val	Gly Val Glu 20	Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly 25	Arg Pro 30	Leu
Phe Gly	Asn Pro Ser 35	Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu 40 45	Lys Leu	Pro
His Asp 50	Arg Gly Arg	Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg 55 60	Asp Leu	Pro
Arg Lys 65	Gly Asp Cys	Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro 70 75	Val Ser	Gly 80
Ile Tyr	Ile Lys Pro 85	Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr 90	Thr Gly 95	Pro
Val Tyr	His Arg Ala 100	Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala 105	Gin Phe 110	Cys
Glu Val	Thr Lys Arg 115	He Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp 120 125	Gly Lys	Leu
Tyr His 130	Ile Tyr Val	Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu 135 140	Lys Leu	Ala
Lys Arg 145	Gly Thr Pro	Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn 150 155	Phe Thr	Asn 160
Cys Pro	Leu Trp Val 165	Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala 170	Ser Gly 175	Ser
Lys Asp	Lys Lys Pro 180	Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu 185	Lys Ile 190	Ala
Pro Arg	Glu His Glu 195	Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro 200 205	Asp Ala	Thr
:ie Val	Yal Glu Gly	Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys	Gly Lys	val

PL 202 161 B1

210

215

22C

Lys Gly Lys 225

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro Glu

; Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp 350

Tyr

Asn

Ile

Asp

Pro 355

Trp

Ile

Gin

Leu

Met 360

Asn

Arg

Thr

Gin

Thr 365

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly 370

Pro

Pro

Asp

Lys

Glu 375

Cys

Ala

Val

Thr

Cys 380

Arg

Tyr

Asp

Lys

Asn 385

Thr

Asp

Val

Asn

Val 390

Val

Thr

Gin

Ala

Arg 395

Asn

Arg

Pro

Thr

Thr 400

Leu

Thr

Gly

Cys

Lys 405

Lys

Gly

Lys

Asn

Phe 410

Ser

Phe

Ala

Gly

Thr 415

Val

Ile

Glu

Gly

Pro 420

Cys

Asn

Phe

Asn

Val 425

Ser

Val

Glu

Asp

Ile 430

Leu

Tyr

Gly

Asp

His 435

Glu

Cys

Gly

Ser

Leu 440

Leu

Gin

Asp

Thr

Ala 445

Leu

Tyr

Leu

Leu

Asp 450

Gly

Met

Thr

Asn

Thr 455

Ile

Glu

Asn

Ala

Arg 460

Gin

Gly

Ala

Ala

Arg 465

Val

Thr

Ser

Trp

Leu 470

Gly

Arg

Gin

Leu

Ser 475

Thr

Ala

Gly

Lys

Lys 480

Leu <

Glu .

Arg .

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

485 490 <210> 19 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Erns mutant 346 Κ

Met°Glu⁹Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 1 5 10 ^1S

PL 202 161 B1

Pro Vał Gly

Val 20

Glu

. Glu

Pro

Vał

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

pro

Leu

Phe Gly Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His Asp Arg 50

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg Lys Gly 65

ASp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

HiS

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly Θ0

Ile Tyr Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

pro

Val Tyr His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu Val Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr His Ile 130

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys Arg Gly 14S

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys Pro Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys Asp Lys

Lys 190

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro Arg Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile Val Val 210

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys Gly Lys 225

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro Glu Ser ,

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile Thr Ile :

Leu

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin

260 ^{2es 270}

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 28S

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 33S

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

Lys

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

PL 202 161 B1

Asn

Ile

Asp 355

Prc

Trp

Ile

Gin.

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

ASp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp Thr Ala Leu Tyr

4,35 440 ' 445

Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala Arg Gin Gly Ala

450 45S 460

Ala 465

Arg

val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

48S «O <210> 20 <211? 495 <212> PRT <21J> CSFV Erns mutant 346 L

<400> 20 Met Glu Leu 1

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp so

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

phe

Thr

Asn 160

PL 202 161 B1

Cys

pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ais

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Łys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lye

Lys 220

Lye

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 32Ξ

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

Leu

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 3 90

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 47S

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

PL 202 161 B1 <210» 21 <211> 495 <212> PRT <213» CSFV Erns mutant 297 K 346 K <400> 21

Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr

Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp 20 25

Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin 35 <0

His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr 50 55

Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15

Thr Ala Gly Arg Pro Leu 30

Ser Thr Leu Lys Leu Pro

Thr Leu Arg Asp Leu Pro 60

Arg 65

Lys

Gly

ASp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg

val

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

115 120 125

Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 13 0 135 14 0

Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser Gly Ser 165 170 ¹⁷⁵

Lys Asp Lys Lys Pro Asp Arg Met Asn Lys Gly Lys Leu Lys Ile Ala 180 185 190

Pro Arg Glu His Glu Lys Asp Ser Lys Thr Lys Pro Pro Asp Ala Thr 195 200 205

Ile Val Val Glu Gly Val Lys Tyr Gin Ile Lys Lys Lys Gly Lys Val 210 215 220

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

•tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 2S0

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg

Gly

Val

Asn

Arg

Ser

Leu

Lys

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu

Lys

Ile

PL 202 161 B1

295 300

Cys 305

Lys

Gly

Val

pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 33S

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

Lys

Gly

Trp

cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Łys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 38S

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

Asp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala 46S

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

<210> 22 <211> 495

<212> PRT <213> CSFV Ems

mutant 297 K 346 L

<400> 22 Met Glu Leu 1

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

THr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

pro

PL 202 161 B1

vai	Tyr	His	Arg 100	Ala
Glu	Val	Thr 115	Lys	Arg
Tyr	His 130	Ile	Tyr	Val
Lys 145	Arg	Gly	Thr	Pro
Cys	Pro	Leu	Trp	val

165

Lys Asp Lys Lys Pro 180

Pro Arg Glu His Glu 195

Ile Val Val Glu Gly 210

Lys Gly Lys Asn Thr 225

Pro Glu Ser Arg Lys 245

Ile Thr Ile Leu Leu ' 260

Trp Asn Leu Ser Asp 275

Leu Arg Gly Val Asn 290

Cys Lys Gly Val Pro 305

Ile Arg Gly Met Met 325

Arg Leu Gin Arg His 340

Asn Ile Asp Pro Trp 355

Thr Glu Gly Pro Pro 370

Lys Asn Thr Asp Val 385

Thr Leu Thr Gly Cys 405

Val Ile Glu Gly Pro 420

Pro	Leu	Glu	Phe 105	Phe	Asp
Ile	Gly	Arg 120	Val	Thr	Gly
Cys	Val 135	Asp	Gly	Cys	Ile
Arg 150	Thr	Leu	Lys	Trp	Ile 155
Thr	Ser	cys	Ser	Asp 170	Asp
Asp	Arg	Met	Asn 185	Lys	Gly
Lys	Asp	Ser 200	Lys	Thr	Lys
Val	Lys 215	Tyr	Gin	Ile	Lys
Gin 230	Asp	Gly	Leu	Tyr	His 235
Lys	Leu	Glu	Lys	Ala	Leu

250

Tyr Gin Pro Val Ala Ala 265

Asn Gly Thr Asn Gly Ile 280

Arg	Ser 295	Leu	Lys	Gly	Ile
Thr 310	His	Leu	Ala	Thr	Asp 315
Asp	Ala	Ser	Glu	Arg 330	Thr
Glu	Trp	Asn	Lys	Leu	Gly

345

Ile Gin Leu Met Asn Arg 360

Asp Lys Glu Cys Ala Val 375

Asn Val Val Thr Gin Ala 390 395

Lys Lys Gly Lys Asn Phe 410

Cys Asn Phe Asn Val Ser 425

Glu	Ala	Gic 110	Phe	Cys
Ser	Asp 125	Gly	Lys	Leu
Leu 140	Leu	Lys	Leu	Ala
Arg	Asn	Phe	Thr	Asn 160
Gly	Ala	Ser	Gly 175	Ser
Lys	Leu	Lys 190	Ile	Ala
Pro	Pro 205	Asp	Ala	Thr
Lys 220	Lys	Gly	Lys	Val
Asn	Lys	Asn	Lys	Pro 240
Leu	Ala	Trp	Ala 255	Val
Glu	Asn	Ile 270	Thr	Gin
Gin	Arg 285	Ala	Met	Tyr
Trp 300	Pro	Glu	Lys	Ile
Thr	Glu	Leu	Lys	Glu 320
Asn	Tyr	Thr	Cys 335	Cys
Trp	cys	Asn 350	Trp	Tyr
Thr	Gin 365	Thr	Asn	Leu
Thr 380	Cys	Arg	Tyr	Asp
Arg	Asn	Arg	Pro	Thr 400
Ser	Phe	Ala	Gly 415	Thr
Val	Glu	Asp 430	Ile	Leu

PL 202 161 B1

Tyr Gly Asp His Glu 435 Leu Leu Asp Gly Met 450 Ala Arg Val Thr Ser 465 Lys Leu Glu Arg Arg 485

Cys Gly Ser Leu Leu 440 Thr Asn Thr Ile Glu 455

Gin Asp Thr Ala Leu Tyr 445 Asn Ala Arg Gin Gly Ala 460

Trp 470 Ser

Leu Gly Arg

Gin Phe 490

Leu Ser Thr Ala Gly 475

Lys 480

Lys

Thr

Trp

Gly

Ala

Tyr

Ala Leu 495

<2l0> 23 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV Brus

mutant :

297 1

L 346 L

<400> 23 (et Glu Leu 1

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro val Gly

Val 20

Glu

*Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe Gly Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His Asp Arg 50

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg Lys Giy 65

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile Tyr Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val Tyr His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

u Val Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Gly

Lys

Leu

Tyr His Ile 130

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys Arg Gly 14S

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys Pro Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys Asp Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro Arg Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile Val Val 210

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys Gly Lys 22S

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

PL 202 161 B1

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

Leu

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

cys 335

cys

Arg

Leu

Gin

Arg

His

Glu

Trp

Asn

Lys

Leu

Gly

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr

340 345

Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gin Leu Met Asn Arg Thr Gin Thr Asn Leu 355 360 365

Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu Cys Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp 370 375 380

Lys Asn Thr Asp Val Asn Vał Val Thr Gin Ala Arg 385 390 395

Tlił Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys Asn Phe Ser 405 ⁴¹⁰

Val Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe Asn Val Ser Val 420 ⁴²⁵

Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser Leu Leu Gin Asp 435 ⁴⁴⁰

Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr Ile Glu Asn Ala 450 455 460

Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly Arg Gin Leu Ser 465 470 475

Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Phe Gly Ala 485 490

Asn Arg

Phe Ala

Glu Asp 430

Thr Ala 445

Arg Gin

Thr Ala

Pro Thr 400

Gly Thr 415

Ile Leu

Leu Tyr

Gly Ala

Gly Lys 480

Tyr Ala Leu 495 <210> 24 <211> 495 <212> PRT <213? BVDV białko Ems <400> 24 _Tt„

Met Glu Leu Ile Thr Asn Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Tyr Lys Gin Lys

5 10 ¹⁵

Pro Ala Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Gin Ala Gly Asn Pro Leu

2S 30

Phe Gly Glu Arg Gly Val Ile His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro

PL 202 161 B1

35

40

45

His

Lys 50

Arg

Gly

Glu

Arg

Glu 55

Val

Pro

Thr

Asn

Leu 60

Ala

Ser

Leu

Pro

Lys 65

Arg

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

Ser

Lys 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 60

Ile

Tyr

Leu

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Leu

Phe

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Lys

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Glu

Glu

Ala

Ser 110

Met

Cys

Glu

Thr

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Yal

Thr

Gly

Ser

Asp 125

Ser

Arg

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Yal

Cys

Ile 135

Asp

Gly Cys

Ile

Ile 140

Yal

Lys

Ser

Ala

Thr 145

Lys

Asp

Arg

Gin

Lys 150

Val

Leu

Lys

Trp

Val 155

His

Asn

Lys

Leu

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Ser

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Thr

Lys

Asp

Glu

Gly 175

Val

Val

Arg

Lys

Lys 180

Gin

Gin

Lys

Pro

Asp 185

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly 190

Arg

Met

Lys

Ile

Thr 195

Pro

Lys

Glu

Ser

Glu 200

Lys

Asp

Ser

Lys

Thr 205

Lys

Pro

Pro

Asp

Ala 210

Thr

Ile

Val

Val

Asp 215

Gly

Val

Lys

Tyr

Gin 220

Yal

Lys

Lys

Lys

Gly 225

Lys

Val

Lys

Ser

Lys 230

Asn

Thr

Gin

Asp

Gly 235

Leu

Tyr

His

Asn

Lys 240

Asn

Lys

Pro

Gin

Glu 245

Ser

Arg

Lys

Lys

Leu 250

Glu

Lys

Ala

Leu

Leu 255

Ala

Trp

Ala

Ile

Ile 260

Ala

Leu

Val

Phe

Phe 265

Gin

Val

Thr

Met

Gly 270

Glu

Asn

Ile

Thr

Gin 275

Trp

Asn

Leu

Gin

Asp 280

Asn

Gly

Thr

Glu

Gly 285

Ile

Gin

Arg

Ala

Met 290

Phe

Gin

Arg

Gly

Val 295

Asn

Arg

Ser

Leu

His 300

Gly

Ile

Trp

Pro

Glu 305

Lys

Ile

Cys

Thr

Gly 310

val

Pro

Ser

His

Leu 315

Ala

Thr

Asp

Thr

Glu 320

Leu

Lys

Ala

Ile

His 325

Gly

Met

Met

Asp

Ala 330

Ser

Glu

Lyc

Thr

Asn 335

Tyr

Thr

Cys

Cys

Arg 340

Leu

Gin

Arg

His

Glu 345

Trp

Asn

Lys

His

Gly 350

Trp

Cys

Asn

Trp

Tyr 355

Asn

Ile

Glu

Pro

Trp 360

Ile

Leu

Leu

Met

Asn 365

Lys

Thr

Gin

Ala

Asn

Leu

Thr

Glu

Gly

Gin

Pro

Leu

Arg

Glu

Cys

Ala

Yal

Thr

Cys

PL 202 161 B1

370

375

380

Arg 385

Tyr

Asp

Arg

Asp

Ser 390

Asp

Leu

Asn

val

Val 395

Thr

Gin

Ala

Arg

Asp 400

Ser

Pro

Thr

Pro

Leu 405

Thr

Gly

Cys

Lys

Lys 410

Gly

Lys

Asn

Phe

Ser 415

Phe

Ala

Gly

Ile

Leu 420

Val

Gin

Gly

Pro

Cys 425

Asn

Phe

Glu

Ile

Ala 430

Val

Ser

Asp

Val

Leu 435

Phe

Lys

Glu

His

Asp 440

Cys

Thr

Ser

Val

Ile 445

Gin

Asp

Thr

Ala

His 450

Tyr

Leu

Val

Asp

Gly 455

Met

Thr

Asn

Ser

Leu 460

Glu

Ser

Ala

Arg

Gin 465

Gly

Thr

Ala

Lys

Leu 470

Thr

Thr

Trp

Leu

Gly 475

Arg

Gin

Leu

Gly

Ile 480

Leu

Gly

Lys

Lys

Leu 485

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys 490

Thr

Trp

Phe

Gly

Ala 495

<210> 25 <211> 495 <212> PRT <213> CSFV białko Erns

<400> 25

Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin

Lys

Met 1

Glu Leu

Asn

His S

Phe Glu Leu

10

15

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr 115

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg 120

Val

Thr

Gly

Ser

Asp 12S

Gly

Lys

Leu

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

Val 135

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lys 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lys

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 1

Ser

165 170

PL 202 161 B1

Lys

• Asp

' Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn. 185

Lys

Gly

Ly©

Leu

Lys 190

Ile

AlS

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lye

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 285

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Trp 300

Pro

Glu

Lye

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

Ile

Arg

Gly

Met

Met 325

Asp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg

Leu

Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

His

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asn

Ile

Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr

Glu 370

Gly

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

Cys

Arg

Tyr

Asp

Lys 385

Asn

Thr

Asp

Val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr

Leu

Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Phe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val

Ile

Glu

Gly 420

Pro

cys

Asn

Phe

Asn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr

Gly

Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu

Leu 450

ASp

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala . 465

Arg

Val

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys

Leu *

Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

<210> 26 <211> 495

PL 202 161 B1

<212> PRT <213> CSFV

Ems

mutant

300 '

G

<400> 26 Met Glu Leu 1

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro

Val

Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe

Gly

Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His

Asp 50

Arg

Gly

Arg

Gly

Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg 65

Lys

Gly

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

Pro

Val

Ser

Gly 80

Ile

Tyr

Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val

Tyr

His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu

Val

Thr

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

120 125

Tyr His 130

Ile Gly

Tyr Val

Cys Val Asp

Gly Cys

Ile Leu Leu Lys

Leu Ala

Arg ISO

135 Thr Leu

Lys

Trp

Ile 155

140

Lys 145

Arg

Thr

Pro

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 160

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 165

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

Asp

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly

Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val 210

Val

Glu

Gly

Val

Lys 215

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys 220

Lys

Gly

Lys

Val

Lys 225

Gly

Lys

Asn

Thr

Gin 230

Asp

Gly

Leu

Tyr

His 235

Asn

Lys

Asn

Lys

Pro 240

Pro

Glu

Ser

Arg

Lys 245

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala 250

Leu

Leu

Ala

Trp

Ala 255

Val

Ile

Thr

Ile

Leu 260

Leu

Tyr

Gin

Pro

Val 265

Ala

Ala

Glu

Asn

Ile 270

Thr

Gin

Trp

Asn

Leu 275

Ser

Asp

Asn

Gly

Thr 280

Asn

Gly

Ile

Gin

Arg 265

Ala

Met

Tyr

Leu

Arg 290

Gly

Val

Asn

Arg

Ser 295

Leu

His

Gly

Ile

Gly 300

Pro

Glu

Lys

Ile

Cys 305

Lys

Gly

Val

Pro

Thr 310

His

Leu

Ala

Thr

Asp 315

Thr

Glu

Leu

Lys

Glu 320

PL 202 161 B1

Ile Arg Gly

Ket

Met 325

ASp

Ala

Ser

Glu

Arg 330

Thr

Asn

Tyr

Thr

Cys 335

Cys

Arg Leu Gin

Arg 340

His

Glu

Trp

Asn

Lys 345

Kis

Gly

Trp

Cys

Asn 350

Trp

Tyr

Asa Ile Asp 355

Pro

Trp

Ile

Gin

Leu 360

Met

Asn

Arg

Thr

Gin 365

Thr

Asn

Leu

Thr Glu Gly 370

Pro

Pro

Asp

Lys 375

Glu

Cys

Ala

Val

Thr 380

cy»

Arg

Tyr

Asp

Lys Asn Thr 385

Asp

val

Asn 390

Val

Val

Thr

Gin

Ala 395

Arg

Asn

Arg

Pro

Thr 400

Thr Leu Thr

Gly

Cys 405

Lys

Lys

Gly

Lys

Asn 410

Ehe

Ser

Phe

Ala

Gly 415

Thr

Val Ile Glu

Gly 420

Pro

Cys

Asn

Phe

Ąsn 425

Val

Ser

Val

Glu

Asp 430

Ile

Leu

Tyr Gly Asp 435

His

Glu

Cys

Gly

Ser 440

Leu

Leu

Gin

Asp

Thr 445

Ala

Leu

Tyr

Leu Leu Asp 450

Gly

Met

Thr

Asn 455

Thr

Ile

Glu

Asn

Ala 460

Arg

Gin

Gly

Ala

Ala Arg Val 465

Thr

Ser

Trp 470

Leu

Gly

Arg

Gin

Leu 475

Ser

Thr

Ala

Gly

Lys 480

Lys Leu Glu

Arg

Arg 485

Ser

Lys

Thr

Trp

Phe 490

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu 495

<210> 27 <211> 495

<212> PRT <213 > CSFV Ems

mutant 300 C

! 302 A

<400> 27 Met Glu Leu 1

Asn

His 5

Phe

Glu

Leu

Leu

Tyr 10

Lys

Thr

Ser

Lys

Gin 15

Lys

Pro Val Gly

Val 20

Glu

Glu

Pro

Val

Tyr 25

Asp

Thr

Ala

Gly

Arg 30

Pro

Leu

Phe Gly Asn 35

Pro

Ser

Glu

Val

His 40

Pro

Gin

Ser

Thr

Leu 45

Lys

Leu

Pro

His Asp Arg 50

Gly

Arg

Gly Asp 55

Ile

Arg

Thr

Thr

Leu 60

Arg

Asp

Leu

Pro

Arg Lys Gly 65

Asp

Cys

Arg 70

Ser

Gly

Asn

His

Leu 75

Gly

pro

val

Ser

Gly 80

Ile Tyr Ile

Lys

Pro 85

Gly

Pro

Val

Tyr

Tyr 90

Gin

Asp

Tyr

Thr

Gly 95

Pro

Val Tyr His

Arg 100

Ala

Pro

Leu

Glu

Phe 105

Phe

Asp

Glu

Ala

Gin 110

Phe

Cys

Glu Val Thr

Lys

Arg

Ile

Gly

Arg

Val

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Leu

PL 202 161 B1

115

120

125

Tyr

His 130

Ile

Tyr

Val

Cys

val 13S

Asp

Gly

Cys

Ile

Leu 140

Leu

Lys

Leu

Ala

Lye 145

Arg

Gly

Thr

Pro

Arg 150

Thr

Leu

Lye

Trp

Ile 155

Arg

Asn

Phe

Thr

Asn 180

Cys

Pro

Leu

Trp

Val 16S

Thr

Ser

Cys

Ser

Asp 170

ASP

Gly

Ala

Ser

Gly 175

Ser

Lys

Asp

Lys

Lys 180

Pro

Asp

Arg

Met

Asn 185

Lys

Gly Lys

Leu

Lys 190

Ile

Ala

Pro

Arg

Glu 195

His

Glu

Lys

Asp

Ser 200

Lys

Thr

Lys

Pro

Pro 205

Asp

Ala

Thr

Ile

Val

Val

Glu

Gly

val

Lys

Tyr

Gin

Ile

Lys

Lys

Lys

Gly

Lys

Val

210 215 220

Łys Gly Lys Asn Thr Gin Asp Gly Leu Tyr His Asn Lys Asn Lys Pro 225 230 235 ²⁴⁰

Pro Glu Ser Arg Lys Lys Leu Glu 245 Ile Thr Ile Leu Leu Tyr Gin Pro 260	Lys Val 265	Ala Leu Leu Ala Trp Ala Val
250 Ala	Ala Glu Asn	255
Ile 270	Thr Gin
Trp Asn Leu Ser Asp Asn Gly Thr	Asn	Gly	Ile Gin Arg	Ala	Met Tyr
275 280			285
Leu Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu	His	Gly	Ile Gly Pro	Ala	Lys Ile
290 295			300
Cys Lys Gly Val Pro Thr His Leu	Ala	Thr	Asp Thr Glu	Leu	Lys Glu
305 310			315		320
Ile Arg Gly Met Met Asp Ala Ser	Glu	Arg	Thr Asn Tyr	Thr	Cys Cys
325		330			335
Arg Leu Gin Arg His Glu Trp Asn	Lys	His	Gly Trp Cys	Asn	Trp Tyr
340	345			350
Asn Ile Asp Pro Trp Ile Gin Leu	Met	Asn	Arg Thr Gin	Thr	Asn Leu
355 380			365
Thr Glu Gly Pro Pro Asp Lys Glu	Cys	Ala	Val Thr Cys	Arg	Tyr Asp
370 37S			380
Lys Asn Thr Asp Val Asn Val Val	Thr	Gin	Ala Arg Asn	Arg	Pro Thr
385 390			395		400
Thr Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys	Asn	Phe Ser Phe	Ala	Gly Thr
405		410			415
Val Ile Glu Gly Pro Cys Asn Phe	Asn	Val	Ser Val Glu	Asp	Ile Leu
420	425			430
Tyr Gly Asp His Glu Cys Gly Ser	Leu	Leu	Gin Asp Thr	Ala	Leu Tyr
435 440			445
Leu Leu Asp Gly Met Thr Asn Thr	Ile	Glu	Asn Ala Arg	Gin	Gly Ala
450 45S			460
Ala Arg Val Thr Ser Trp Leu Gly	Arg	Gin	Leu Ser Thr	Ala	Gly Lys
465 470			475		480
Lys Leu Glu Arg Arg Ser Lye Thr	Trp	Phe	Gly Ala Tyr	Ala	Leu
485		490			495

Claims (15)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania specyficznie atenuowanej szczepionki zawierają cej pestiwirusa, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym unieczynnia się aktywność RNazy związana z glikoproteiną ERNS pestiwirusa.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ż e aktywność RNazy unieczynnia się poprzez RNS delecję i/lub mutację co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny E^RNS.
3. 3. Sposób wedł ug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ż e wspomniane delecje i/lub mutacje wprowadza się w aminokwasach wspomnianej glikoproteiny, w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wspomnianą aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję i/lub mutację aminokwasu w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, we wspomnianej glikoproteinie.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wspomnianą aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, we wspomnianej glikoproteinie.
6. 6. Sposób wytwarzania specyficznie atenuowanych pestiwirusów, znamienny tym, że obejRNS muje etap, w którym unieczynnia się aktywność RNazy związanej z glikoproteiną E^RNS.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że wspomnianą aktywność RNazy unieczynnia RNS się poprzez delecję i/lub mutację co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny E^RNS.
8. 8. Sposób wedł ug zastrz. 6 albo 7, znamienny tym, ż e delecje i/lub mutacje umiejscawia się w aminokwasach wspomnianej glikoproteiny, w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach.
9. 9. Sposób wedł ug zastrz. 8, znamienny tym, ż e aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję lub mutację aminokwasu w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, we wspomnianej glikoproteinie.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, we wspomnianej glikoproteinie.
11. 11. Sposób wytwarzania specyficznie oznaczonych pestiwirusów, znamienny tym, że obejmuje RNS etap, w którym unieczynnia się aktywność RNazy związaną z glikoproteiną E^RNS.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnia się poprzez RNS delecję lub mutację co najmniej jednego aminokwasu glikoproteiny E^RNS.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że wspomniane delecje i/lub mutacje umiejscawia się w aminokwasach, w pozycji od 295 do 307 i/lub od 338 do 357, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadających im pozycjach w innych szczepach, wspomnianej glikoproteiny.
14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnia sie poprzez delecję i/lub mutację aminokwasu w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, we wspomnianej glikoproteinie.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że aktywność RNazy unieczynnia się poprzez delecję reszty histydynowej w pozycji 346, jak przedstawiono przykładowo w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 25 listy sekwencji szczepu Alfort CSFV lub odpowiadającej jej pozycji w innych szczepach, we wspomnianej glikoproteinie.