CZ20021050A3

CZ20021050A3 - Imunostimulační nukleové kyseliny

Info

Publication number: CZ20021050A3
Application number: CZ20021050A
Authority: CZ
Inventors: Arthur M. Krieg; Christian Schetter; Jörg Vollmer
Original assignee: University Of Iowa Research Foundation; Coley Pharmaceutical Gmbh
Priority date: 1999-09-25
Filing date: 2000-09-25
Publication date: 2003-01-15
Also published as: IL148843A0; HRP20020249A2; BG65736B1; EP1700603A3; EP1221955B1; ES2248126T3; ATE304361T1; US7271156B2; US20030212026A1; DE60022665T2; KR100863630B1; AP2002002484A0; CA2388055A1; UA77152C2; KR20020068509A; AU2005203408A1; EP1221955A2; SK287400B6; CN1939541A; EP1700603A2

Description

nukleové kyseliny a použití těchto prostředků. Nukleové kyseliny bohaté na T obsahují poly-T sekvence a/nebo obsahující více než 25 % T nukleotidů. TG nukleové kyseliny obsahují TG dinukleotidy. Nukleové kyseliny bohaté na C obsahují alespoň jeden poly-C region a/nebo více než 50 % nukleotidů. Tyto imunostimulační nukleové kyseliny účinkují podobně jako nukleové kyseliny obsahující CpG motivy.

CO Řešení také zahrnuje výhodné CpG nukleové kyseliny.

<

O

IO o

CN

O

CM

N o

Ιοΰί Imunostimulační nukleové kyseliny

Oblast techniky

Vynález se týká prostředků obsahujících imunostimulační nukleové kyseliny a způsobů použití těchto prostředků. Nukleové kyseliny bohaté na T obsahují poly-T sekvence a/nebo obsahující více než 25% T nukleotidů. TG nukleové kyseliny obsahují TG dinukleotidy. Nukleové kyseliny bohaté na C obsahují alespoň jeden poly-C region a/nebo více než 50% nukleotidů. Tyto imunostimulační nukleové kyseliny účinkují podobně jako nukleové kyseliny obsahující CpG motivy. Vynález také zahrnuje výhodné CpG nukleové kyseliny.

Dosavadní stav techniky

Bakteriální DNA má imunostimulační účinky na aktivaci Blymfocytů a NK buněk, ale DNA z obratlovců nikoliv (Tokunaga, T. et al., 1988, Jpn. J. Cancer Res. 79: 682-686; Tokunaga, T. et al., 1984, JNCI 72: 955-962; Messina, J.P. et al., 1991, J. Immunol. 147: 1759-1764; a přehled uvedený v Krieg, 1998, v Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein a A.M. Krieg (ed.), John Wiley a Sons, Inc., New York, NY, str. 431-448). Nyní je známo, že tyto imunomodulační účinky bakteriální DNA jsou důsledkem přítomnosti nemethylovaných CpG dinukleotidů v určitém kontextu baží (CpG motivů), které jsou běžné v bakteriální DNA, nebo které jsou methylované nebo málo přítomné v DNA obratlovců (Krieg et al., 1995, Nátuře 374: 546-549; Krieg, 1999, Biochim. Biophys. Acta 93321:1-10). Imunostimulační účinky bakteriální DNA mohou být napodobeny syntetickými oligonukleotidy (ODN) obsahujícími tyto CpG motivy. Takové CpG ODN mají vysoce stimulační účinky na lidské a myší leukocyty, indukují proliferaci B-lymfocytů; sekreci cytokinů a imunoglobulinů; lytickou aktivitu NK buněk

(přirozených zabiječů) a sekreci IFN-γ; a aktivaci dendritických buněk (DC) a jiných buněk prezentujících antigen k expresi kostimulačních molekul a sekreci cytokinů, zejména Thl-cytokinů, které jsou významné pro navození Thl-imunitní reakce. Tyto imunostimulační efekty přirozeného fosfodiesterového skeletu CpG ODN jsou vysoce CpG specifické v tom, že tyto účinky v podstatě zrušeny tehdy, když je CpG motiv methylován, změněn na GpC nebo jinak eliminován nebo pozměněn (Krieg et al., 1995, Nátuře 374: 546-549; Hartmann et al., 1999, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96: 9305-10). Fosfodiesterové CpG ODN mohou být připraveny v lipidech, kamenci nebo jiném vehikulu s depotními vlastnostmi nebo se zlepšeným vychytáváním do buněk, za účelem zlepšení imunostimulačního účinku (Yamamoto et al., 1994, Microbiol. Immunol. 38: 831-836; Gramzinski et al., 1998, Mol. Med. 4: 109-118).

V dřívějších pokusech se předpokládalo, že imunostimulační CpG motiv má vzorec purin-purin-CpG-pyrimidin-pyrimidin (Krieg et al., 1995, Nátuře 374: 546-549; Pisetsky, 1996, J. Immunol. 156: 421-423; Hacker et al., 1998, EMBO J., 17: 6230-6240; Lipford et al., 1998, Trends in Microbiol. 6: 496-500). Nicméně, nyní je jasné, že myší lymfocyty odpovídají dosti dobře na fosfodiesterové CpG motivy, které nemají tento vzorec (Yi et al., 1998, J. Immunol. 160: 5898-5906) a totéž platí pro lidské B-lymfocyty a dendritické buňky (Hartmann et al., 1999, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 96: 9305-10; Liang, 1996, J. Clin. Invest. 98: 1119-1129).

Několik výzkumníků zkoumalo, zda může mít obsah nukleotidů efekty nezávislé na sekvenci ODN. Bylo zjištěno, že ODN jsou obecně bohaté na GG, CCC, CC, CAC a CG sekvence, zatímco mají nižší obsah TT nebo TTC nukleotidových sekvencí ve srovnání

s předpokládaným náhodným využitím kodonů (Smetsers et al., 1996, Antisense Nucleic Acid Drug Develop. 6: 63-67). Toto nabízí možnost, že nadměrně exprimované sekvence mohou obsahovat výhodné cílové elementy pro protismyslné oligonukleotidy a naopak. Jedním důvodem pro vyloučení použití ODN bohatých na thymidin z pokusů s protismyslnými oligonukleotidy je to, že degradace ODN nukleasami přítomnými v buňkách uvolňuje volný thymidin, který soutěží s ³Hthymidinem, který se často používá v pokusech pro hodnocení buněčné proliferace (Matson et al., 1992, Antisense Research a Development, 2: 325-330).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká imunostimulačních nukleových kyselin bohatých na pyrimidin (bohatých na Py) a v některých provedeních bohatých na thymidin (T), které nevyžadují přítomnost CpG motivu. Předkládaný vynález se také částečně týká objevu, že nukleové kyseliny, které obsahují TG dinukleotidový motiv, jsou také imunostimulační. Vynález je založen částečně na neočekávaném objevu, že sekvence nukleové kyseliny, které neobsahují CpG motivy, jsou imunostimulační. Pomocí analýzy imunostimulačních vlastností mnoha sekvencí nukleových kyselin bylo zjištěno, že tyto sekvence mohou být bohaté na Py, bohaté na T nebo že mohou obsahovat TG motivy. Také bylo zjištěno, že tyto sekvence přednostně aktivují imunitní buňky nepocházející z hlodavců. Sekvence bohaté na Py a TG jsou pouze minimálně imunostimulační pro hlodavčí imunitní buňky, ve srovnání s non-hlodavčími imunitními buňkami. Proto je možné pomocí způsobu podle předkládaného vynálezu indukovat imunitní reakci u non-hlodavců podáním imunostimulačních nukleových kyselin bohatých na Py a nebo TG. Imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py a TG podle ♦ · · · ··· ···· • · · ····· ·· · ·· · · · · · * · · · · předkládaného vynálezu mohou volitelně obsahovat CpG motivy. Tyto objevy mají značný význam pro klinický vývoj imunostimulačních nukleových kyselin obsahujících a neobsahujících CpG.

V jednom aspektu se vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího účinné množství izolované imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py nebo TG a farmaceuticky přijatelný nosič. V jiných aspektech se vynález týká prostředku obsahující ho imunostimulační nukleovou kyselinu bohatou na Py nebo TG. V jiných provedení může být imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T. V ještě jiném provedení může být imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T a také může obsahovat alespoň jeden TG motiv.

Výhodně je nukleová kyselina bohatá na Py nukleová kyselina bohatá na Τ. V některých provedení je imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T poly-T nukleová kyselina obsahující 5' TTTT 3’. V jiném provedení póly T nukleová kyselina obsahuje 5'X1X2TTTTX3X43', kde Xi, X2> X3 a X4 jsou nukleotidy. V některých provedení je X1X2 TT a/nebo X3X4 je TT. V jiných provedení je X1X2 vybrán ze skupiny skládající se z TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA a GC; a/nebo je X3X4 vybrán ze skupiny skládající se z TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA, a GC.

Imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T může obsahovat pouze jeden póly T motiv nebo může obsahovat více póly T motivů. V některých provedení obsahuje imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T alespoň 2, alespoň 3, alespoň 4, alespoň 5, alespoň 6, alespoň 7 nebo alespoň 8 T motivů. V jiných provedení obsahuje alespoň 2, alespoň 3, alespoň 4, alespoň 5, alespoň 6, alespoň 7 nebo alespoň 8 CpG motivů. Ve výhodném provedení se střídá více póly CpG motivů a póly T motivů.

V ještě jiném provedení obsahuje alespoň jeden z více póly T motivů alespoň 3, alespoň 4, alespoň 5, alespoň 6, alespoň 7, alespoň 8 nebo alespoň 9 sousedních T nukleotidových zbytků. V jiných provedení jsou póly T motivy alespoň 3 a alespoň 3 motivy obsahují alespoň 3 sousední T nukleotidové zbytky nebo jsou póly T motivy alespoň 4 a alespoň 4 motivy obsahují alespoň 3 sousední T nukleotidové zbytky.

V některých případech imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T neobsahuje póly T motivy, ale místo toho obsahuje více než 25% T zbytků. V jiných provedení imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na T obsahují póly T motivy a také obsahují více než 25% T zbytků, ve výhodném provedení obsahuje imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T více než 35% T zbytků, více než 40% T zbytků, více než 50% T zbytků, více než 60% T zbytků, více než 80% T zbytků nebo více než 90% T nukleotidových zbytků. V důležitém provedení obsahuje nukleová kyselina alespoň 50% T zbytků.

Imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na T a TG mohou mít jakoukoliv délku větší než 7 nukleotidů, ale v některých provedeních mohou mít délku mezi 8 a 100 nukleotidovými zbytky. Ve výhodném provedení obsahuje imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T alespoň 20 nukleotidů, alespoň 24 nukleotidů, alespoň 27 nukleotidů nebo alespoň 30 nukleotidů. Ve výhodném provedení obsahuje TG imunostimulační nukleová kyselina 15 až 25 nukleotidů. Imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na T a Tg mohou být jednořetězcové nebo dvouřetězcové.

V jednom výhodném provedení má imunostimulační nukleová kyselina region bohatý na T umístěný ve středu své délky (tj. přibližně stejný počet nukleotidů sousedí s regionem bohatým na T na 5' a 3' koncích).

Nukleová kyselina bohatá na T je v některých provedeních vybrána ze skupiny skládající se ze SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793, 794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 a 910-913. V jiných provedení jsou nukleové kyseliny bohaté na T sekvence vybrané ze skupiny skládající se ze SEQ

ID NO: 64	, 98,	112,	146,	185, 204, 208,	, 214,	. 224,	233,	. 244,
246,	247,	258,	262,	263,	265, 270-273,	300,	305,	316,	317,
343,	344,	350,	352,	354,	374, 376, 392,	. 407,	. 411,	413,	, 429-
432,	434,	435,	443,	474,	475, 498-501,	518,	687,	692,	693,
804,	862,	883,	884,	888,	890 a 891.

V jiných provedení je imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nukleová kyselina bohatá na C. Imunostimulační nukleová kyselina bohatá na C je nukleová kyselina obsahující alespoň jeden a výhodně alespoň 2 poly-C regiony, nebo nukleová kyselina obsahující 50% nebo více C nukleotidů.

Imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py a TG mohou obsahovat jeden nebo více CpG motivů. Motivy mohou být methylováné nebo nemethylované. V jiných provedení neobsahují imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py a TG CpG dinukleotidy.

V jiných provedení obsahují imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py a TG také poly-A, póly G a/nebo póly C motivy. V ještě jiném provedení neobsahuje imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG dvě póly C sekvence alespoň 3 sousedních C nukleotidových zbytků nebo neobsahuje póly A sekvence s alespoň 3 sousedními A nukleotidovými zbytky. V jiných provedení imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG obsahuje více než 25% C nukleotidů nebo více než 25% A nukleotidů. V ještě jiném provedení imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG neobsahuje poly-C sekvence, poly-G sekvence nebo poly-A sekvence.

Póly G nukleová kyselina je v některých provedení vybrána ze skupiny skládající se ze SEQ ID NO: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936 a 938.

V jiných provedení obsahuje póly G nukleová kyselina sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434,

435, 475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628,

660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926,

927, 932 a 937.

V jiné aspektu vynálezu mohou být imunostimulační nukleové kyseliny definovány jako kyseliny obsahující TG motiv a takové kyseliny jsou zde označovány jako TG imunostimulační nukleové kyseliny. TG nukleová kyselina v jednom provedení obsahuje alespoň jeden TG dinukleotid mající sekvenci následujícího vzorce: 5 ’N1X1TGX2N23' . V podobném provedení je Ni nukleová kyselina sekvence složené z mnoha nukleotidů v rozmezí od (11— N2) do (21-N2) a N2 je nukleová kyselina sekvence složené z mnoha nukleotidů v rozmezí od (11-Ni) do (21-Ni) . V příbuzném provedení je X2 thymidin.

V jiných provedení má TG nukleová kyselina alespoň • · • · · ♦ * • · · · · · ·

následující vzorec: 5' XiX₂TGX₂ 3'. V ještě jiném provedení TG nukleová kyselina obsahuje následující sekvenci:

5’NiXiX₂TGX₃X4N₂3 ' . V příbuzném provedení je Ni sekvence nukleové kyseliny složená z mnoha nukleotidů v rozmezí od (9-N₂) do (19— N₂) a N₂ je sekvence nukleové kyseliny složená z mnoha nukleotidů v rozmezí od (9-Ni) do (19-Ni) . V jednom výhodném provedení je X₃ thymidin. X_xX₂ jsou nukleotidy, které mohou být vybrány ze skupiny skládající se z GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA a TT, a X₃X₄ jsou nukleotidy, které mohou být vybrány ze skupiny skládající se z TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA a CA. V některých výhodných provedeních je X₃thymidin. V důležitém provedení jsou X3X4 nukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující TT, TC, TA a TG. V jiných provedeních jsou XiX₂ GA nebo GT a X3X4 jsou TT. V ještě jiných provedeních jsou Xi nebo X₂ nebo oba puriny a a X₃ nebo X₄ jsou pyrimidiny nebo jsou XiX₂ GpA a X₃ nebo X₄ nebo oba jsou pyrimidiny. V jednom provedení je X₂ T a X₃ je pyrimidin.

V jednom provedení je 5'XiX₂TGX₃X₄3' sekvence TG nukleové kyseliny nebo celá délka nebo nějaký fragment TG nukleové kyseliny nepalindromická sekvence, a v jiných provedeních se jedná o palindromickou sekvenci.

V některých výhodných provedeních je TG nukleová kyselina také bohatá na T.

Imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na TG a Py mají v některých provedeních nukleotidový skelet, který obsahuje alespoň jednu modifikaci, jako je fosforothioátová modifikace. Nukleotidový skelet může být chimérický nebo je výhodně nukleotidový skelet zcela modifikovaný. Ve výhodném provedení má imunostimulační nukleová kyselina póly T motiv a fosforothioátový skelet.

Jiným aspektem vynálezu je přípravek obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu, ve formě nukleové kyseliny bohaté na Py nebo TG, a antigen, kde nukleová kyselina neobsahuje nemethylované CpG motivy.

Jiným přípravkem podle předkládaného vynálezu je přípravek obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu bohatou na Py nebo TG a antimikrobiální činidlo, kde nukleová kyselina neobsahuje nemethylované CpG motivy. Výhodně je antimikrobiální činidlo vybráno ze skupiny zahrnující antivirová činidla, antiparazitární činidla, antibakteriální činidla a antimykotická činidla.

Jiným přípravkem podle předkládaného vynálezu je přípravek s prodlouženým uvolňováním obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu bohatou na Py a/nebo TG, kde nukleová kyselina bohatá na Py a/nebo TG neobsahuje nemethylované CpG motivy.

Vynález také poskytuje nutriční doplňky obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu bohatou na Py a/nebo TG a přepravní vehikulum vybrané ze skupiny zahrnující kapsle, pilulky a sublinguální tablety, kde nukleová kyselina bohatá na Py a/nebo TG neobsahuje nemethylované CpG motivy.

Je třeba si uvědomit, že když je žádoucí podat oligonukleotid bohatý na Py, například poly-T oligonukleotid nebo oligonukleotid bohatý na T, C nebo TG oligonukleotid, tak může být také žádoucí podat oligonukleotid bohatý na Py nebo TG oligonukleotid současně s fyzikálně separovaným CpG oligonukleotidem, TG oligonukleotidem nebo oligonukleotidem bohatým na Py. Alternativně může být CpG, TG motiv nebo motiv

bohatý na Py přítomen ve stejné kontinuální nukleové kyselině jako TG oligonukleotid nebo oligonukleotid bohatý na Py.

V ještě dalších provedeních mohou být všechny nebo některé kombinace TG a CpG nukleových kyselin a nukleových kyselin bohatých na Py podány současně buď na jednotlivých nukleových kyselinách, nebo na stejné molekule nukleové kyseliny. Současným podáním je míněno podání v dostatečně krátkém časovém odstupu pro dosažení kombinovaného účinku obou oligonukleotidů, kde tento účinek je výhodně větší než účinek dosažený při podání každého oligonukleotidu samostatně ve stejné dávce.

CpG oligonukleotidy mají obecně, vzorec 5 ' X1X2CG3X43 ', kde Xi, X2, X3 a X4 jsou nukleotidy a kde alespoň C z CpG je nemethylovaný. Výhodně mají CpG oligonukleotidy délku 8-100 nukleotidů a mají modifikované skelety Konkrétní struktury jsou uvedeny v publikovaných PCT přihláškách, US přihláškách a citovaných odkazech, jejichž objevy jsou zde uvedeny ve své úplnosti. V jednom provedení neobsahuje CpG oligonukleotid póly T a TG motivy a není bohatý na T.

V jiných provedeních má CpG oligonukleotid sekvenci vybranou ze skupiny skládající se ze SEQ ID NO: 1, 3, 4, 1416, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71,

72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260265, 270-273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-

352,	354,	357,	361-365,	367-369,	373-376,	378-385,	388-392,
394,	395,	399,	401-404,	406-426,	429, 433,	434-437,	439, 441-
443,	445,	447,	448, 450,	453-456,	460-464,	466-469,	472-475,
477,	478,	480,	483-485,	488, 489,	492, 493	, 495-502	, 504-505,

504-505 ♦ φφ ·Φ ·· φφφ φ · · φ φφφ φ · φφφ φφ φφ • φ φ φ φ φ φ φφφ φφ φφ φφ φ φ φφφφ

507-509, 511, 513-529, 532-541, 543-555, 564-566, 568-576,

578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619-622, 625646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718-732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 790, 792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904 a 909-913.

V jiném provedení neobsahuje oligonukleotid bohatý na Py nebo TG CpG motivy. Toto provedení vynálezu také zahrnuje farmaceutické prostředky a kity, které obsahují jak CpG oligonukleotid (který nemusí obsahovat póly T a TG motivy a nemusí být bohatý na T) a oligonukleotid bohatý na Py a/nebo TG oligonukleotid fyzikálně separovaný od CpG oligonukleotidů. Farmaceutické přípravky jsou v účinném množství a obvykle obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče, jak jsou uvedeny dále pro oligonukleotidy bohaté na Py a pro TG oligonukleotidy. Kity obsahují alespoň jeden zásobník obsahující oligonukleotid, kterým je bohatý na Py nebo TG oligonukleotid (nebo některé jejich kombinace). Stejný zásobník, nebo v jiném provedení druhý zásobník, může obsahovat oligonukleotid s CpG motivem, který nemusí obsahovat motivy bohaté na Py a/nebo TG motivy. Kit také obsahuje návod pro podání oligonukleotidů jedinci. Kity mohou také obsahovat zásobník obsahující rozpouštědlo nebo ředidlo.

Nakonec, jak je zde uvedeno, CpG oligonukleotid fyzikálně separovaný od oligonukleotidů bohatého na PY nebo od TG oligonukleotidů může být použit společně s oligonukleotidy bohatými na Py nebo TG oligonukleotidy ve způsobech, prostředcích a produktech popsaných výše.

V jiných aspektech se vynález týká imunostimulačních » ·· ft · ft • ft ftft ftftftft oligonukleotidů majících chimérické skelety ve kterých nemusí být přítomen CpG motiv. Vynález je částečně založen na objevu, že sekvence nukleové kyseliny, které neobsahují CpG motivy, jsou imunostimulační, a dále na objevu, že sekvence s chimérickými skelety měly neočekávaně zlepšené imunostimulační vlastnosti. Proto se v jednom aspektu vynález týká oligonukleotidu majícího vzorec: 5' Y1N1ZN2Y23', kde Yi a Y2 jsou, nezávisle, molekuly nukleové kyseliny tvořené 1 až 10 nukleotidy, kde Yi obsahuje alespoň jednu modifikovanou internukleotidovou vazbu a Y2 obsahuje alespoň jednu modifikovanou internukleotidovou vazbu a kde Ni a N2 jsou molekuly nukleové kyseliny, které jsou - nezávisle - tvořeny 0 až 5 nukleotidy, ale kde N1ZN2 má celkem alespoň 6 nukleotidů a kde nukleotidy N1ZN2 mají fosfodiesterový skelet, a kde Z je motiv imunostimulační nukleové kyseliny neobsahující CG.

V jednom provedení je Z sekvence nukleové kyseliny vybraná ze skupiny zahrnující TTTT, TG a sekvence, kde alespoň 50% baží sekvence jsou T.

V některých provedeních mají Yi a/nebo Y2 délku mezi 3 a 8 nukleotidy. V jiných provedeních jsou Yi a/nebo Y2 složeny z alespoň 3 G, alespoň 4 G, alespoň 7 G nebo pouze z G.

V jiných provedeních jsou Yi a/nebo Y2 vybrány ze skupiny zahrnující TCGTCG, TCGTCGT a TCGTCGTT (SEQ ID NO: 1145).

V ještě jiných provedeních Yi a/nebo Y2 obsahují alespoň jednu, dvě, tři, čtyři nebo pět poly-A, póly T nebo poly-C sekvencí.

Centrální nukleotidy (N1ZN2) vzorce Y1N1ZN2Y2 mají fosfodiesterové internukleotidové vazby a Yi a Y2 mají alespoň jednu modifikovanou internukleotidovou vazbu. V některých provedeních mají Yi a/nebo Y2 mají alespoň dvě modifikované internukleotidové vazby. V jiných provedení mají Yi a Y2 mezi dvěma a pěti modifikovanými internukleotidovými vazbami.

• ·* «» *· · · · · « • · · < · **« ·· • ♦ • ·

V ještě jiných provedeních obsahuje Y_x dvě modifikované internukleotidové vazby a Y₂ obsahuje pět modifikovaných internukleotidových vazeb nebo obsahuje Yi pět modifikovaných internukleotidových vazeb a Y₂ obsahuje dvě modifikované internukleotidové vazby. Modifikovanou internukleotidovou vazbou je v některých provedeních fosforothioátová modifikovaná vazba, fosforodithioátová modifikovaná vazba nebo p-ethoxy modifikovaná vazba.

Části vzorce Υ]ΝιΖΝ₂Υ₂ mohou volitelně tvořit palindrom. Tak tvoří v některých provedeních nukleotidy N_XZN₂ palindrom.

V některých provedeních není palindrom přímá repetitivní sekvence. V jiných provedeních nukleotidy ΝχΖΝ₂ netvoří palindrom.

V jiných provedeních má ΝχΖΝ₂ sekvenci nukleotidů vybranou ze skupiny zahrnující: GATITTATCGTC (SEQ ID NO:1098), TCGATTTTCGA (SEQ ID NO: 1099); TCATTTTTATGA (SEQ ID NO: 1100); GTTTTTTACGAC (SEQ ID NO: 1101); TCAATTTTTGA (SEQ ID NO: 1102); ACGTTTTTTACGT (SEQ ID NO: 1103); TCGTTTTTACGA (SEQ ID NO: 1104); TCGATTTTTACGTCGA (SEQ ID NO: 1105); AATTTTTTAACGTT (SEQ ID NO: 1106); TCGTTTTTTAACGA (SEQ ID NO: 1107);

ACGTTTTTTTAACGT (SEQ ID NO: 1108); GATTTTTATCGTC (SEQ ID NO: 1109); GACGATTTTTCGTC (SEQ ID NO: 1110); GATTTTAGCTCGTC (SEQ ID NO: 1111); GATTTTTACGTC (SEQ ID NO: 1112); ATTTTATCGT (SEQ ID NO: 1113); AACGATTTTTCGTT (SEQ ID NO: 1114); TCACTTTTGTGA (SEQ ID NO: 1115); TCGTATTTTA (SEQ ID NO: 1116); ACTTTGTACCGGT (SEQ ID NO: 1117); TCGATTTTTCGACGTCGA (SEQ ID NO: 1118); ACGATTTTTCGT (SEQ ID NO: 1119); GATGATCGTC (SEQ ID NO: 1120);

TCGATGTCGA	(SEQ	ID	NO:	1121);	TCATGTATGA	(SEQ	ID	NO:	1122);
GTGTTACGAC	(SEQ	ID	NO:	1123);	TCAATGTTGA	(SEQ	ID	NO:	1124) ;
ACGTGTACGT	(SEQ	ID	NO:	1125);	TCGTGTACGA	(SEQ	ID	NO:	1126);

TCGATGTACGTCGA (SEQ ID NO: 1127); AATGTTAACGTT (SEQ ID NO:

• «· ·»	«	• ·		·· •	9	9 ·
« ·	«	9 9	··*	9	9	4
					•	e
• 9	•	« ·	• ·	9	«	•
·*·		9 9		99		··· ·

1128); TCGTGTTAACGA (SEQ ID NO: 1129); ACGTGTTAACGT (SEQ ID NO: 1130); GATGTATCGTC (SEQ ID NO: 1131); GACGATGTCGTC (SEQ ID NO: 1132); GATGAGCTCGTC (SEQ ID NO: 1133); GATGTACGTC (SEQ ID NO: 1134); ATGATCGT (SEQ ID NO: 1135); AACGATGTCG1T (SEQ ID NO: 1136); TCACTGGTGA (SEQ ID NO: 1137); TCGTATGA (SEQ ID NO: 1138); ACTGGTACCGGT (SEQ ID NO: 1139); TCGATGTCGACGTCGA (SEQ ID NO: 1140); a ACGATGTCGT (SEQ ID NO: 1141).

Prostředek může volitelně obsahovat farmaceutický nosič a/nebo může být připraven v přepravním prostředku. V některých provedeních je přepravní prostředek vybrán ze skupiny zahrnující kationtové lipidy, proteiny pronikající do buněk a prostředky se zpomaleným uvolňováním. V jednom výhodném provedení je prostředkem biodegradovatelný polymer. V jiném provedení je prostředkem s prodlouženým uvolňováním mikročástice.

Jiným aspektem vynálezu je přípravek obsahující imunostimulační oligonukleotid vzorce Y1N1ZN2Y2 a antigen.

Jiným přípravkem podle předkládaného vynálezu je přípravek obsahující oligonukleotid vzorce Y1N1ZN2Y2 a antimikrobiální činidlo, kde nukleová kyselina neobsahuje nemethylované CpG motivy. Výhodně je antimikrobiální činidlo vybráno ze skupiny zahrnující antivirová činidla, antiparazitární činidla, antibakteriální činidla a antimykotická činidla.

Jiným přípravkem podle předkládaného vynálezu je přípravek s prodlouženým uvolňováním obsahující oligonukleotid vzorce Y1N1ZN2Y2.

Vynález také poskytuje nutriční doplňky obsahující oligonukleotid vzorce Y1N1ZN2Y2 v přepravním vehikulu vybraném • · ·«· · ♦ · • · · ···· · · ze skupiny zahrnující kapsle, pilulky a sublinguální tablety.

V některých provedeních mají imunostimulační nukleové kyseliny obsahující nemethylovaný CG dinukleotid, TG dinukleotid nebo sekvenci bohatou na Py zcela fosfodiesterový skelet a v jiných provedeních mají imunostimulační nukleové kyseliny obsahující nemethylovaný CG dinukleotid, TG dinukleotid nebo sekvenci bohatou na Py modifikovaný skelet, který může volitelně obsahovat vazby vybrané ze skupiny zahrnující fosforothioátové, fosforodithioátové a p-ethoxy vazby.

V jednom provedení má imunostimulační nukleová kyselina obsahující nemethylovaný CG dinukleotid vzorec obsahující: 5'XiX2CGX3X43', kde Xi, X2, X3 a X4 jsou nukleotidy. V jiných provedeních obsahuje imunostimulační sekvence nukleové kyseliny alespoň jednu sekvenci následujícího vzorce: 5' TCNT X1X2CGX3X43', kde N je sekvence nukleové kyseliny složená z od přibližně 0 do 25 nukleotidů, kde alespoň jeden nukleotid má modifikovanou internukleotidovou vazbu, a kde nukleová kyselina má 100 nebo méně nukleotidů. V některých provedeních jsou X1X2 nukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující: GT, GG, GA a AA, a X3X4 nukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující: TT, CT nebo GT. Ve výhodném provedení jsou X1X2 GA a X3X4 jsou TT.

V jiném provedení obsahuje sekvence imunostimulační nukleové kyseliny obsahující CG dinukleotid alespoň jednu z následujících sekvencí: ATCGACTCTCGAGCGTTCTC (SEQ ID No.15); TCCATGTCGGTCCTGCTGAT (SEQ ID No.32); TCCATGTCGGTZCTGATGCT (SEQ ID No.31 ); ATGGACTCTCGAGCGTTZTC (SEQ ID No.18);

TCCATGTCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No.28); GGGGGG (SEQ ID No.12); TCCATGACGGTCCTGATGCT (SEQ ID No.35); TCCATGGCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No.34); TCCATGACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No.7);

TCCATGTCGTTCCTGATGCT (SEQ ID No.38); GGGGTCAGTCTTGACGGGG (SEQ ID No.41); TCCATGTCGCTCCTGATGCT (SEQ ID No.37); TCCATGTCGATCCTGATGCT (SEQ ID No.36); TCCATGCCGGCCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No.33); TCCATAACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No.3); TCCATGACGTTCCTAATGCT (SEQ ID No.7); TCCATGACGTCCCTGATGCT (SEQ ID No 39); TCCATCACGTGCCTGATGCT (SEQ ID No.48);

TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No.10); ATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No.70); TCTCCCAGCGCGCGCCAT (SEQ ID No.12);

TCCATGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No.73); TCCATAGCGTTCCTAGCGTT (SEQ ID No.74); TCCTGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No.76); TCCTGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No.77); TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT (SEQ ID No.52); TCCTTGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No. 121); TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT (SEQ ID No.208); TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT (SEQ ID No.120); TCCATGCGTTGCGTTGCGTT (SEQ ID No.81); TCCACGACGTTTTCGACGTT (SEQ ID No.82); TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No.47); TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID No.46); TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID No.49); GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No.56); TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT (SEQ ID No.48); TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No.84); TGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No.50); TCGTCGTCGTCGTT (SEQ ID No. 51); a TGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No.85). V jiném provedení je imunostimulační nukleovou kyselinou obsahující TG sekvenci nebo sekvenci bohatou na Py nukleová kyselina popsaná výše.

V jiném aspektu se předkládaný vynález týká farmaceutických prostředků a kitů, které obsahují jak oligonukleotid mající vzorec Y1N1ZN2Y2, tak CpG oligonukleotid (který může volitelně neobsahovat póly T a TG motivy a nemusí být bohatý na Py), kde oligonukleotid bohatý na Py a TG oligonukleotid jsou fyzikálně separované od oligonukleotidu vzorce Y1N1ZN2Y2. Farmaceutické prostředky obsahují účinná množství a obvykle obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče, které jsou podrobně popsány dále. Kity obsahují alespoň jeden

9 zásobník obsahující oligonukleotid vzorce Y1N1ZY2N2. Stejný zásobní, nebo v jiných provedeních druhý zásobník, může obsahovat oligonukleotid s CpG motivem, který nemusí obsahovat motivy bohaté na Py a/nebo TG motivy a/nebo TG oligonukleotid nebo oligonukleotid bohatý na Py (nebo některé jejich kombinace). Kit také obsahuje návod pro podání oligonukleotidů jedinci. Kity mohou také obsahovat zásobník obsahující rozpouštědlo nebo ředidlo.

Jak bylo uvedeno, může být oligonukleotid vzorce Y1N1ZY2N2, který je fyzikálně separovaný od CpG, TG oligonukleotid nebo oligonukleotidu bohatého na Py, může být použit společně s CpG, TG oligonukleotidy nebo oligonukleotidy bohatými na Py ve způsobech, prostředcích a produktech podle předkládaného vynálezu.

V jiném aspektu se předkládaný vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího alespoň dva oligonukleotidy podle předkládaného vynálezu, kde alespoň dva oligonukleotidy mají různé sekvence, a farmaceuticky přijatelný nosič.

V jiném aspektu vynález poskytuje vakcinační přípravek. Vakcína obsahuje kompozici podle předkládaného vynálezu spolu s antigenem.

V jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro stimulací imunitní reakce. Způsob zahrnuje podání imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py nebo TG jedinci (ne hlodavci) v množství účinném pro indukci imunitní reakce u jedince. Výhodně je imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG podána orálně, lokálně, v prostředku s prodlouženým uvolňováním, slizničně, systémově, parene^rálně nebo intramuskulárně. Když je imunostimulační nukleová kyselina • · ♦ · · · «· ····· · · « bohatá na Py nebo TG podána na povrch sliznice, tak může být podána v množství účinném pro indukci slizniční imunitní reakce nebo systémové imunitní reakce. Ve výhodných provedeních je slizniční povrch vybrán ze skupiny zahrnující orální, nasální, rektální, vaginální a oční sliznici.

V některých provedeních způsob zahrnuje imunizaci jedince antigenem, kde imunitní reakce je specifická pro antigen. Antigen může být kódovaný nukleokyselinovým vektorem, který může být podán jedinci. V některých provedeních je antigen vybrán ze skupiny zahrnující nádorové antigeny, virové antigeny, bakteriální antigeny, parazitární antigeny a peptidové antigeny.

Imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py a TG jsou schopné vyvolat široké spektrum imunitních reakcí, například mohou být tyto imunostimulační nukleové kyseliny použity pro přesměrování Th2 na Thl imunitní odpověď. Nukleové kyseliny bohaté na Py a TG mohou být také použity pro aktivaci imunitních buněk, jako jsou leukocyty, dendritické buňky a NK buňky. Aktivace může být provedena in vivo, in vitro nebo ex vivo, tj. pomocí izolace imunitních buněk od jedince, kontaktování imunitních buněk s imunostimulační nukleovou kyselinou bohatou na Py a TG v množství účinném pro aktivaci imunitních buněk a podání aktivovaných imunitních buněk zpět jedinci. V některých provedeních dendritické buňky exprimují nádorový antigen. Dendritické buňky mohou být vystaveny působení nádorového antigenu ex vivo.

Imunitní reakce produkovaná nukleovými kyselinami bohatými na Py nebo TG nukleovými kyselinami může také vést k indukci produkce cytokinů, například produkce IL-6, IL-12, IL-18, TNF,

IFN-α a IFN-γ.

V ještě jiném provedení jsou nukleové kyseliny bohaté na Py nebo TG nukleové kyseliny použitelné pro léčbu nádorů.

Nukleové kyseliny bohaté na Py a TG jsou také použitelné podle jiných aspektů vynálezu pro prevenci nádorů (například pro redukci rizika vzniku nádorů) u jedince s rizikem vzniku nádorů. Nádor může být vybrán ze skupiny zahrnující nádory žlučových cest, prsu, čípku děložního, choriokarcinom, karcinom tlustého střeva, karcinom endometria, žaludku, intraepitelové neoplasie, lymfomy, nádory jater (například malobuněčné a nemalobuněčné), melanom, neuroblastomy, nádory dutiny ústní, nádory vaječníků, nádory slinivky břišní, nádory prostaty, nádory rekta, sarkomy, nádory štítné žlázy a nádory ledvin, stejně jako jiné karcinomy a sarkomy. V některých významných provedeních je nádor vybrán ze skupiny zahrnující nádory kostí, mozku nebo CNS, nádory pojivové tkáně, nádory jícnu, oka, Hodgkinův lymfom, karcinom hrtanu, karcinomy dutiny ústní, karcinom kůže a karcinom varlat.

Nukleové kyseliny bohaté na Py a TG nukleové kyseliny mohou být také použity pro zlepšení reaktivity nádorových buněk na protinádorovou terapii, a v tomto případě jsou Py-bohaté nebo TG imunostimulační nukleové kyseliny podány společně s protinádorovým činidlem. Protinádorovou terapií může být chemoterapie, vakcina (například in vitro aktivované dendritické buňky nebo vakcina obsahující nádorový antigen) nebo terapie na bázi protilátek. Tento poslední uvedený způsob terapie zahrnuje podání protilátky specifické pro buněčný povrchový antigen nádorové buňky, kdy vzniklá imunitní reakce vede k buněčné cytotoxicitě závislé na antigenů (ADCC).

V jednom provedení může být protilátka vybrána ze skupiny zahrnující Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDECY2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex,

Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-l, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab a ImmuRAIT-CEA.

Tak je v jednom aspektu vynálezu jedinci s nádorem nebo s rizikem vzniku nádoru podána imunostimulační nukleová kyselina a protinádorový lék. V některých provedeních je protinádorový lék vybrán ze skupiny zahrnující chemoterapeutická činidla, imunoterapeutická činidla a nádorové vakciny. Chemoterapeutické činidlo může být vybráno ze skupiny zahrnující methotrexat, vincristin, adriamycin, cisplatinu, chlore.thylnitrosomočoviny neobsahující cukr, 5fluoruracil, mitomycin C, bleomycin, doxorubicin, dacarbazin, taxol, fragylin, Meglamin GLA, valrubicin, carmustain a poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inhibitor RAS farnesyl transferasy, inhibitor farnesyl transferasy, MMP, MTNLY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, 1NP-470, Hycamtin, Topotecan, PKC412, Valspodar/P8C833, Novantron/Mitroxantron, Metaret/Suramin, Batimastat, E7070, BCH-4556, C8-682, 9-AC, AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZDO101, 181641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/Valrubicin, Metastron/deriváty stroncia,

Temodal/Temozolomid, Evacet/liposomální doxorubicin,

Yewtaxan/Paclitaxel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabin, Furtulon/Doxifluridin, Cyclopax/orální paclitaxel, orální Taxoid, SPU-O77/Cisplatina, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inhibitor RAS onkogenu, BMS182751/orální platinu, UFT (Tegafur/Uracil),

Ergamisol/Levamisol, Eniluracil/776C85/5FU enhancer,

Campto/Levamisol, Camptosar/Irinotecan, Tomudex/Ralitrexed, Leustatin/Cladribin, Paxex/Paclitaxel, Doxil/liposomální doxorubicin, Caelyx/liposomální doxorubicin,

Fludara/Fludarabin, Pharmorubicin/Epirubicin, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis-Naphtalimid, LU 103793/Dolastain, Caelyx/ liposomální doxorubicin, Gemzar/Gemcitabin, ZD 0473/Anormed,

YM 116, jódová zrna, CDK4 a CDK2 inhibitory, PARP inhibitory, D4809/Dexifosamid, Ifes/Mesnex/Ifosamid, Vumon/Teniposide, Paraplatin/karboplatina, Plantinol/cisplatina, Vepeside/Etoposid, ZD 9331, Taxotere/Docetaxel, proléčivo guanin-arabinosidu, Taxanové analogy, nitrosomočoviny, alkylační činidla, jako je melfelan a cyklofosfamid, aminoglutethimid, Asparaginasa, Busulfan, karboplatina, Chlorombucil, Cytarabin HCl, Dactinomycin, Daunorubicin HC1, Estramustin fosfát sodný, Etoposid (VP16-213), Floxuridin, Fluoruracil (5-FU), Flutamid, Hydroxymočovina (hydroxykarbamid), Ifosfamid, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, Leuprolid acetát (analog faktoru uvolňujícího LHRH), Lomustin (CCNU), Mechlorethamin HCl (dusíkatý yperit), Mercaptopurin, Mesna, Mitotan (ο.ρ'-DDD), Mitoxantrone HCl, Oktreotid, Plicamycin, Procarbazin HCl, Streptozocin, Tamoxifen-citrát, Thioguanin, Thiotepa, Vinblastin sulfát, Amsacrin (m-AMSA), Azacitidin, Erythropoietin, Hexamethylmelamin (HMM), Interleukin 2, Mitoguazon (methyl-GAG; methyl glyoxal bisguanylhydrazon; MGBG), Pentostatin (2'deoxycoformycin), Semustin (methyl-CCNU), Teniposid (VM-26) a Vindesinsulfát, ale tento výčet není omezující.

Imunoterapeutické činidlo může být vybráno ze skupiny zahrnující Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex,

Bexxar, LDP-O3, iort6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, 0V103,

3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, t A

·** ·· 99 «Α ·· AA··

MELIMMUNE-l, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab a ImmuRAIT-CEA, ale tento výčet není vyčerpávající.

Nádorová vakcina může být vybrána ze skupiny zahrnující EGF, Anti-idiotypové nádorové vakciny, Gp75 antigen, GMK melanom $ vakcinu, MGV-gangliosidovou konjugátovou vakcinu, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL theratop,

BLP25 (MUC-1), liposomální idiotypovou vakcinu, Melacine, peptidové antigenní vakciny, toxin/antigenové vakciny, vakciny na bázi MVA, PACIS, BCG vakciny, TA-HPV, TA-CIN, DISC-virus a ImmuCyst/TheraCys, ale tento výčet není vyčerpávající.

V ještě jiném provedení se způsoby týkají prevence nebo léčby nádorů, a v takových způsobech je jedincům dále podáván interferon-a.

Vynález se v jiných aspektech týká způsobů pro prevenci onemocnění u jedince. Způsob zahrnuje pravidelné podávání imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py nebo TG jedinci pro navození reaktivity imunitního systému pro prevenci onemocnění u jedince. Příklady onemocnění, které by mohly být preventivně řešeny za použití profylaktické metody podle předkládaného vynálezu, jsou mikrobiální infekce (například sexuálně přenosné nemoci) a anafylaktický šok při potravinových alergiích.

V jiných aspektech se vynález týká způsobu pro indukci vlastní imunitní reakce tak, že se jedinci podá imunostimulační nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG v množství účinném pro aktivaci vlastní imunitní reakce.

• · 0 0 0 • Β · · · · 0 ·· · e* ·· <0 ··«0

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu nebo prevenci virové nebo retrovirové infekce. V tomto způsobu je jedinci s virovou nebo retrovirovou infekcí nebo s rizikem jejího vzniku podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro léčbu nebo prevenci virové nebo retrovirové infekce. V některých provedeních je virem virus hepatitidy, HIV, hepatítidy B, hepatitidy C, herpes virus nebo papilloma virus.

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu nebo prevenci bakteriální infekce. V tomto způsobu je jedinci s bakteriální infekcí nebo s rizikem jejího vzniku podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro léčbu nebo prevenci bakteriální infekce.

V některých provedeních je bakteriální infekce způsobena intracelulárními bakteriemi.

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu nebo prevenci parazitární infekce. V tomto způsobu je jedinci s parazitární infekcí nebo s rizikem jejího vzniku podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro léčbu nebo prevenci parazitární infekce.

V některých provedeních je parazitární infekce způsobena intracelulárním parazitem. V jiných provedeních je parazitární infekce způsobena non-helmintickým parazitem.

V některých provedeních je jedincem člověk a v jiných provedeních je jedincem obratlovec jiný než člověk vybraný ze skupiny zahrnující psi, kočky, koně, krávy, prasata, kozy, ryby, opice, kuřata a ovce.

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu nebo ♦ · » ♦ · w * · • * * ··♦ 9 9 9

9 9 9 β · Λ 9 9 9

999 99 99 99 9 · ···· prevenci asthmatu, ve kterém je jedinci s asthmatem nebo s rizikem jeho vzniku podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro léčbu nebo prevenci asthmatu. V některých provedeních je asthmatem alergické asthma.

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu nebo prevenci alergie, ve kterém je jedinci s alergií nebo s rizikem jejího vzniku podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro léčbu nebo prevenci alergie.

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro léčbu nebo prevenci imunodeficitu, ve kterém je jedinci s imunodeficitem nebo s rizikem jeho vzniku podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro léčbu nebo prevenci imunodeficitu.

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob pro indukci Thl imunitní reakce, ve kterém je jedinci podán jakýkoliv z prostředků podle předkládaného vynálezu v množství účinném pro indukci Thl imunitní reakce.

V jednom provedení způsoby podle předkládaného vynálezu zahrnují podání oligonukleotidu vzorce 5'YiNiZN2Y23' a imunostimulační nukleové kyseliny obsahující nemethylovaný CG dinukleotid,TG dinukleotid nebo sekvenci bohatou na Τ. V tomto provedení je oligonukleotid obsahující 5Ύ1Ν1ΖΝ2Υ23' podán separované od imunostimulační nukleové kyseliny. V některých provedeních jsou oligonukleotid obsahující 5Ύ1Ν1ΖΝ2Υ23' a imunostimulační nukleová kyselina podávány v střídavém týdenním protokolu a v jiném provedení jsou oligonukleotid obsahující 5Ύ1Ν1ΖΝ2Υ23' a imunostimulační nukleová kyselina podávány v střídavém dvoutýdenním protokolu.

Vynález poskytuje v jiném aspektu prostředek obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu a protinádorové činidlo, které jsou zapracovány ve farmaceuticky přijatelném nosiči a které jsou v množství účinném pro léčbu nádoru nebo pro redukci rizika vzniku nádoru. Ve významných provedeních je imunostimulační nukleová kyselina vybrána ze skupiny zahrnující nukleovou kyselinu bohatou na T, TG nukleovou kyselinu a nukleovou kyselinu bohatou na C.

Vynález dále poskytuje kit obsahující první zásobník obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu a alespoň jeden další zásobník (například druhý zásobník) obsahující protinádorové činidlo, a návod k použití. V jednom provedení kit dále obsahuje interferon-α, který může být samostatně uložen v ještě dalším zásobníku (například třetím zásobníku).

V důležitém provedení kit obsahuje vehikulum pro zpomalené uvolňování obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu, a alespoň jeden zásobník pro protinádorové činidlo, a návod k použití uvádějící dobu podání protinádorového činidla. Imunostimulační nukleová kyselina může být vybrána ze skupiny zahrnující nukleové kyseliny bohaté na Py, TG nukleové kyseliny a CpG nukleové kyseliny, kde CpG nukleová kyselina má nukleotidovou sekvenci obsahující SEQ ID NO: 246.

Vynález dále poskytuje způsob pro prevenci nebo léčbu asthmatu nebo alergie, který zahrnuje podání imunostimulační nukleové kyseliny a léku pro asthma/alergii v množství účinném pro léčbu nebo prevenci asthmatu nebo alergie. V důležitých provedeních je imunostimulační nukleová kyselina vybrána ze skupiny zahrnující nukleové kyseliny bohaté na T, TG nukleové kyseliny a nukleové kyseliny bohaté na C.

·« «» ‘J J ϊ : ii·· í * * ;

» · * · ·« · ««· *** ·· «* 1 v ·* ··««

V jednom provedení je imunostimulační nukleová kyselina nukleová kyselina bohatá na T. V příbuzném provedení má nukleová kyselina bohatá na T nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 a 910-913.

V jiném provedení má nukleová kyselina bohatá na T nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID

NO:	64, 98	, 112	, 146, 185, 204, 2C	18, 21	4, 2.	24, 233, 244, 246,
247,	258,	262,	263, 265, 270-273,	300,	305,	316, 317, 343,
344,	350,	352,	354, 374, 376, 392,	407,	411	-413, 429-432, 434,
435,	443,	474,	475, 498-501, 518,	687,	692,	693, 804, 862,
883,	884,	888,	890 a 891.

V ještě dalším provedení není nukleová kyselina bohatá na T TG nukleová kyselina. V ještě dalším provedení není nukleová kyselina bohatá na T CpG nukleová kyselina.

V jiném provedení je imunostimulační nukleová kyselina TG nukleová kyselina. V ještě dalším provedení není TG nukleová kyselina bohatá na T. V ještě dalším provedení není TG nukleová kyselina CpG nukleová kyselina.

V jednom provedení je imunostimulační nukleová kyselina CpG nukleová kyselina, kde CpG nukleová kyselina má nukleotidovou sekvenci obsahující SEQ ID NO: 246.

V jiném provedení je lék proti asthmatu/alergii vybrán ze skupiny zahrnující inhibitor PDE-4, bronchodilatátor/P~2 agonista, činidlo otevírající K+ kanál, antagonista VLA4, antagonista neurokinifj, inhibitor syntézy TXA2, xanthanin, ·* · * * • · · · · · · 9 9 φ antagonista kyseliny arachidonové, inhibitor 5-lipooxygenasy, antagonista thromboxinového A2 receptorů, antagonista tromboxanu A2, inhibitor 5-lipox aktivačního proteinu a inhibitor proteasy, například. V některých důležitých provedeních je lékem proti asthmatu/alergii bronchodilatátor/β2 agonista vybraný ze skupiny zahrnující salmeterol, salbutamol, terbutalin, D2522/formoterol, fenoterol a orciprenalin.

V jiných provedeních je lék proti asthmatu/alergii vybraný ze skupiny zahrnující antihistaminika a, induktory prostaglandinů. V jednom provedení je antihistaminikum vybrané ze skupiny zahrnující loratidin, cetirizin, buclizin, analogy ceterizinu, fexofenadin, terfenadin, desloratidin, norastemizol, epinastin, ebastin, astemizol, levocabastin, azelastin, tranilast, terfenadin, mizolastin, betatastin,

CS560 a HSR 609. V jiném provedení je induktorem prostaglandinů S-5751.

V jiných provedeních je lék proti asthmatu/alergii vybraný ze skupiny zahrnující steroidy a imunomodulátory. Imunomodulátory mohou být vybrány ze skupiny zahrnující protizánětlivá činidla, antagonisty leukotrienů, IL4 muteiny, solubilní IL4 receptory, imunosupresiva a anti-IL4 protilátky, antagonisty IL4, anti-IL-5 protilátky, solubilní IL-13 receptor-Fc fúzní proteiny, anti-IL9 protilátky, CCR3 antagonisté, CCR5 antagonisté, inhibitory VLA4 a činidla inhibující IgE. V jednom provedení je činidlem inhibujícím IgE anti-IgE.

V jiném provedení je steroid vybrán ze skupiny zahrnující beclomethason, fluticason, triamcinolon a budesonid. V ještě jiném provedení je imunosupresivem tolerizující peptidová

vakcína.

V jednom provedení je imunostimulační nukleová kyselina podána současně s lékem proti alergii/asthmatu. V jiném provedení je jedincem imunokompromitovaný jedinec.

Imunostimulační nukleové kyseliny jsou podány jedinci ve způsobech týkajících se prevence a léčby asthmatu/alergie způsobem popsaným pro jiné aspekty vynálezu.

V jiném aspektu vynález poskytuje kit obsahující první zásobník pro imunostimulační nukleovou kyselinu a alespoň jeden další zásobník (například druhý zásobník) pro lék proti asthmatu/alergii, a návod k použití. Imunostimulační nukleové kyseliny použitelné v kitu jsou zde popsané. V důležitých provedeních je imunostimulační nukleová kyselina vybrána ze skupiny zahrnující nukleové kyseliny bohaté na T, TG nukleové kyseliny a nukleové kyseliny bohaté na C. V jiném významném provedení kit obsahuje vehikulum se zpomaleným uvolňováním obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu, a alespoň jeden zásobník pro lék proti asthmatu/alergii a návod popisující dobu podání léku proti asthmatu/alergii. Lék proti asthmatu/alergii může být ze skupiny léků proti asthmatu/alergii popsaných ve výše uvedených metodách určených pro prevenci nebo léčbu asthmatu/alergie.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje prostředek obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu a lék proti asthmatu/alergii, které jsou připraveny ve farmaceuticky přijatelném nosiči a které jsou v množství účinném pro prevenci nebo léčbu imunitní reakce asociované s expozicí mediátoru asthmatu nebo alergie. Imunostimulační nukleová kyselina může být vybrána ze skupiny imunostimulačních » * 9 » » · » · • · 9 ♦ f * · nukleových kyselin popsaných pro výše uvedené metody a prostředky. V důležitých provedeních je imunostimulační nukleová kyselina vybrána ze skupiny zahrnující nukleové kyseliny bohaté na T, TG nukleové kyseliny a nukleové kyseliny bohaté na C. Lék proti asthmatu/alergii může být ze skupiny léků proti asthmatu/alergii popsaných ve výše uvedených metodách určených pro prevenci nebo léčbu asthmatu/alergie.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje prostředek obsahující imunostimulační nukleovou kyselinu vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 95- 136, SEQ ID NO: 138-152,

SEQ	ID	NO:	154-222,	SEQ	ID	NO: 224-	245,	SEQ ID	NO: 247-	261,
SEQ	ID	NO:	263-299,	SEQ	ID	NO: 301,	SEQ	ID NO:	303-409,	SEQ ID
NO:	414	-420	, SEQ ID	NO:	424	, SEQ ID	NO:	426-947	, SEQ ID	NO:

959-1022, SEQ ID NO: 1024-1093, a farmaceuticky přijatelný nosič. Výhodně je imunostimulační nukleová kyselina přítomná v prostředku v účinném množství. V jednom provedení je imunostimulační nukleová kyselina přítomna v množství účinném pro indukci imunitní reakce. V jiném provedení je imunostimulační nukleová kyselina přítomna v množství účinném pro prevenci nebo léčbu nádorů. V ještě jiném provedení je imunostimulační nukleová kyselina přítomna v množství účinném pro prevenci nebo léčbu asthmatu/alergie. Vynález také poskytuje kity obsahující jakýkoliv z výše uvedených přípravků imunostimulačních nukleových kyselin a návod k použití.

V ještě jiném aspektu vynález obsahuje přípravek imunostimulační nukleové kyseliny skládající se v podstatě z:

5' M1TCGTCGTTM23', kde alespoň jeden z C je nemethylovaný, kde Mi je nukleová kyselina obsahující alespoň jeden nukleotid, kde M2 je nukleová kyselina obsahující 0-50 nukleotidů a kde imunostimulační nukleová kyselina je tvořena méně než 100 nukleotidy.

» ·· 4 · 44 44 ··

9 9 4 4 4 9 4 4 9 « · · · Β 4 9 4 Β · Β «» 9 9 4 4 9 4 4 4 4 4

944 49 44 44 49 4449

V ještě dalších aspektech se vynález týká farmaceutického přípravku imunostimulační nukleové kyseliny obsahující: 5'TCGTCGTT3', kde alespoň jeden z C je nemethylovaný, kde imunostimulační nukleová kyselina obsahuje méně než 100 nukleotidů a fosfodiesterový skelet, a prostředek s prodlouženým uvolňováním. V některých provedeních je prostředkem s prodlouženým uvolňováním mikročástice. V jiných provedeních prostředek obsahuje antigen.

Každé provedení předkládaného vynálezu může zahrnovat různá další provedení. Proto se předpokládá, že každý aspekt vynálezu zahrnuje jakýkoliv element nebo kombinaci elementů.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1A je histogram exprese CD86 (osa y) CD19+ buňkami po expozici těchto buněk oligonukleotidům uvedeným na ose x v koncentraci 0,15 gg/ml.

Obr. 1B je tabulka s daty z obr. 1A.

Obr. 1C je histogram exprese CD86 (osa y) CD19+ buňkami po expozici těchto buněk oligonukleotidům uvedeným na ose x v koncentraci 0,30 μg/ml.

Obr. ID je tabulka s daty z obr. 1C.

Obr. 2 je graf srovnávající schopnosti ODN 2137, ODN 2177, ODN 2200 a ODN 2202 stimulovat proliferací B-lymfocytů v koncentraci v rozmezí od 0,2 μ9/ιη1 do 20 μg/ml.

Obr. 3 je graf srovnávající schopnosti ODN 2188, ODN 2189, ODN 2190 a ODN 2182 stimulovat proliferací B-lymfocytů v koncentraci v rozmezí od 0,2 gg/ml do 20 gg/ml.

Obr. 4 je sloupcový graf ukazující aktivaci B-lymfocytů « · · · · ftft 9 9 ftft ···♦ ftftft ftftftft • ft · ft ftft.*· · · · • ft 9 9 9 ftft ftft· · · • ftft ftftftft ftft· ··· ·· ft· ·· ·« ftftftft závislou na dávce indukovanou non-CpG ODN. PBMC dárce krve se inkubovaly s uvedenými koncentracemi ODN 2006 (SEQ ID NO:

246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 5126 (SEQ ID NO: 1058) a 5162 (SEQ ID NO: 1094) a barvily se mAb pro CD19 (markér B lymfocytů) a CD86 (markér pro aktivaci Blymfocytů, B7-2). Exprese byly měřena průtokovou cytometrii.

Obr. 5 je sloupcový graf ukazující aktivaci B-lymfocytů jinou sadou non-CpG ODN. PBMC od jednoho representativního dárce se stimulovaly 0,4 μg/ml, 1,0 μg/ml nebo 10,0 gg/ml následujících ODN: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2196 (SEQ ID NO: 913), 2194 (SEQ ID NO: 911), 5162 (SEQ ID NO: 1094), 5163 (SEQ ID NO: 1095), 5168 (SEQ ID NO: 1096) a 5169 (SEQ ID NO: 1097) a exprese markéru aktivace CD86 (B7-2) na CD19-pozitivních B-lymfocytech se měřila průtokovou cytometrii.

Obr. 6 je sloupcový graf ukazující aktivaci B-lymfocytů nonCpG ODN 1982 a 2041. PBMC se inkubovaly s uvedenými koncentracemi ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 1982 (SEQ ID NO:

225) a 2041 (SEQ ID NO: 282) a aktivace B-lymfocytů (exprese markéru aktivace CD86) se měřila průtokovou cytometrii.

Obr. 7 je sloupcový graf ukazující aktivaci NK buněk indukovanou non-CpG ODN. PBMC dárce krve se inkubovaly s 6 gg/ml následujicích ODN: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 911) a 5126 (SEQ ID NO: 1058) a barvily se mAb pro CD3 (markér T lymfocytů), CD56 (markér NK buněk) a CD69 (časný markér pro aktivaci). Exprese CD69 na CD56-pozitivních NK buňkách byla měřena průtokovou cytometrii.

Obr. 8 je sloupcový graf ukazující zesílení cytotoxicity zprostředkované NK buňkami indukované non-CpG ODN. Lýza K-562 ·· ·· ·* ·· 44 • · 4 4 4 4*44 • · 4 · · 4 · 4 4 4 • · 4444 444 ·· *· ·· ·4 4444 cílových buněk zprostředkovaná NK buňkami se měřila pomocí inkubace PBMC přes noc s 6 pg/ml ODN 2006 (SEQ ID NO: 246),

2194 (SEQ ID NO: 911) a 5126 (SEQ ID NO: 1058).

Obr. 9 je sloupcový graf ukazující aktivaci NK T-lymfocytů indukovanou non-CpG ODN. PBMC jednoho representativního dárce krve se inkubovaly s 6 pg/ml následujících ODN: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 911) a 5126 (SEQ ID NO:

1058) po dobu 24 hodin a aktivace NKT buněk se měřila průtokovou cytometrií po barvení buněk mAb pro CD3 (markér T lymfocytů), CD56 (markér NK buněk) a CD69 (časný markér pro aktivaci).

Obr. 10 je sloupcový graf ukazující stimulaci monocytů indukovanou různými CpG a non-CpG ODN. PBMC se inkubovaly s 6 pg/ml následujících ODN: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID

NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2178 (SEQ ID NO: 428), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 911), 5126 (SEQ ID NO:

1058) a 5163 (SEQ ID NO: 1095) a barvily se mAb pro CD14 (markér monocytů) a CD80 (B7-1, aktivační markér. Exprese byla měřena průtokovou cytometrií.

Obr. 11 je sloupcový graf ukazující uvolňování TNFa po kultivaci lidských buněk s non-CpG ODN. PBMC se kultivovaly po dobu 24 hodin s nebo bez 6 pg/ml uvedených ODN nebo s 1 pg/ml

LPS jako pozitivní kontrolou a TNFa se měřil pomocí ELISA.

Obr. 12 je sloupcový graf ukazující uvolňování IL-6 po kultivaci lidských buněk s non-CpG ODN, který ukazuje stejný průběh uvolňování jako TNFa. PBMC se kultivovaly s uvedenými

ODN (1 pg/ml) a IL-6 se měřil v supernatantech pomocí ELISA.

4 ··	9 9	44	99	44
♦•4 4	• 4	•	4 4	4 «
4 · ·	4 4	4 4 4	4 4	4
4 4 4	4 ·	4 4	4 4	4
·· 4 « ·	« ·	4 4	4«	• 444

Podrobný popis vynálezu

V jednom aspektu se vynález týká objevu, že nukleové kyseliny bohaté na pyrimidiny (Py), zejména thymidin (T), stejně jako nukleové kyseliny obsahující TG dinukleotidové motivy, jsou účinné ve zprostředkování imunostimulačních účinků. Je známo, že nukleové kyseliny obsahující CpG jsou terapeutické a profylaktické přípravky, které stimulují imunitní systém k léčbě nádorů, infekčních onemocnění, alergií, asthmatu a jiných onemocnění a napomáhají při obraně proti oportunním infekcím po protinádorových chemoterapiích. Silná, ale vyvážená buněčná a humorální imunitní reakce vznikající po stimulaci CpG odráží vlastní obranný systém organismu proti invadujícím patogenům a nádorovým buňkám. CpG sekvence, které jsou relativně vzácné v lidské DNA, jsou často nacházeny v DNA infekčních organismů, jako jsou bakterie. Lidský imunitní systém se vyvinul pro rozpoznávání CpG sekvencí jako velmi časného signálu infekce, a tyto sekvence iniciují okamžitou a účinnou imunitní reakci proti invadujícím patogenům bez toho, že by docházelo k nežádoucím reakcím často pozorovaným u jiných imunostimulačních činidel. Proto mohou nukleové kyseliny obsahující CpG, jejíž účinek spočívá ve vlastních imunitních obraných mechanismech, využívat jedinečnou a přirozenou dráhu pro imunoterapii. Efekty CpG nukleových kyselin na imunomodulaci byly objeveny předkladately vynálezu a byly důkladně popsány v souvisejících patentových přihláškách, jako jsou US patentové přihlášky pořadové č.: 08/386063, podaná 2.7.1995 (a související PCT US 95/01570); 08/738652, podaná 30.10.1996; 08/960774, podaná 30.10.1997 (a související PCT/US97/19791, WO 98/18810); 09/191170, podaná 13.11.1998; 09/030701, podaná 25.2.1998 (a

• ··		to·			··	to·		• to
»· ·	•	•	•	•		•	to	• ·
to to	•	•	•	to	• ·	to	•	•
• ·	•	•	•	•	•	•	to	to
·«« «to		toto			··	to ·		• ••to

související PCT/US98/03678; 09/082649 podaná 20.5.1998 (a související PCT/US98/10408); 09/325193, podaná 03.6.1999 (a související PCT/US98/04703); 09/286098, podaná 2.4.1999 (a související PCT/US99/07335); 09/306281, podaná 6.5.1999 (a související PCT/US99/09863). Obsahy těchto patentů a patentových přihlášek jsou zde uvedeny jako odkazy.

Objevy předkládaného vynálezu jsou použitelné na všechny výše popsané použití nukleových kyselin obsahujících CpG, stejně jako na jakékoliv jiné známé použití CpG nukleových kyselin. Vynález zahrnuje, v jednom aspektu, objev, že nukleové kyseliny bohaté na Py, zejména T, a TG nukleové kyseliny mají imunostimulační vlastnosti podobné jako mají CpG oligonukleotidy bez ohledu na to, zda je přítomen CpG motiv. Proto je vynález použitelný pro jakýkoliv způsob stimulace imunitního systému za použití nukleových kyselin bohatých na Py nebo TG nukleových kyselin. Překvapivě bylo zjištěno, že chimérické oligonukleotidy neobsahující CpG motiv jsou imunostimulační a mají mnohé profylaktické a terapeutické aktivity vlastní CpG oligonukleotidům.

Nukleová kyselina bohatá na Py je imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T nebo na C. V některých provedeních jsou výhodné nukleové kyseliny bohaté na T. Nukleová kyselina bohatá na T je nukleová kyselina, která obsahuje alespoň jednu póly T sekvenci a/nebo která obsahuje více než 25% T nukleotidů. Nukleová kyselina obsahující poly-T sekvenci obsahuje alespoň čtyři T v řadě, jako například 5'TTTT3'. Výhodně obsahuje nukleová kyselina bohatá na T více než jednu póly T sekvenci. Ve výhodných provedeních může obsahovat nukleová kyselina bohatá na T 2, 3, 4 atd. póly T sekvence, jako je oligonukleotid č. 2006 (SEQ ID NO: 246). Jedním z nejvíce imunostimulačních oligonukleotidů bohatých na T

0 • * · • · · 0 · · · 0 0 0 000 00 00 00 0 0 0000 podle předkládaného vynálezu je nukleová kyselina složená zcela z T nukleotidů, jako je oligonukleotid č. 2183 (SEQ ID NO: 433). Jiné nukleové kyseliny bohaté na T podle předkládaného vynálezu obsahují více než 25% T nukleotidů, ale neobsahují nutně póly T sekvence. V těchto nukleových kyselinách bohatých na T mohou být T nukleotidy separovány od sebe jinými typy nukleotidových zbytků, tj. G, C a A.

V některých provedeních obsahuje nukleová kyselina bohatá na T více než 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% a 99% T nukleotidů nebo jakékoliv procento mezi uvedenými hodnotami. Výhodně obsahují nukleové kyseliny bohaté na T alespoň jednu póly T sekvenci a více než 25% T nukleotidů.

Podle předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že obsah T v ODN má dramatický vliv na imunostimulační účinky ODN a že ODN bohaté na T mohou aktivovat více typů lidských imunitních buněk za absence jakýchkoliv CpG motivů. Oligonukleotid mající 3' poly-T region a 2 5' CG, například ODN 2181 (SEQ ID NO: 431) je vysoce imunostimulační. Oligonukleotid podobné délky, ODN 2116 (SEQ ID NO: 357), který obsahuje dva CG dinukleotidy na 5' konci a poly-C region na 3' konci, byl také imunogenní, ale méně než oligonukleotid bohatý na T, když bylo provedeno srovnání za standardních podmínek. Ačkoliv mají C a T téměř stejnou strukturu, jsou jejich efekty na imunostimulační vlastnosti ODN různé. Oba mohou indukovat imunitní reakci, ale různě silnou. Tak jsou oligonukleotidy bohaté na T i oligonukleotidy bohaté na C použitelné podle předkládaného vynálezu, ale výhodnější jsou oligonukleotidy bohaté na T.

Dále, pokud je obsah T v ODN redukován inkorporací jiných baží, jako je G, A nebo C, tak jsou redukovány imunostimulační Účinky (ODN č. 2188 (SEQ ID NO: 905), 2190 (SEQ ID NO: 907),

2191 (SEQ ID NO: 908) a 2193 (SEQ ID NO: 910)).

• ·· ·· ·· ** »*

9 · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 999 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9·9 99 99 99 »· «<-··

Nukleová kyselina bohatá na C je nukleová kyselina, která obsahuje alespoň jeden nebo lépe alespoň dva póly C regiony nebo která obsahuje alespoň 50% C nukleotidů. Poly-C region je region tvořený alespoň čtyřmi T zbytky v řadě. Poly-C regionem je například 5'CCCC3'. V některých provedeních je výhodné, aby měl poly-C region vzorec 5'CCCCCC3'. Jiné nukleové kyseliny bohaté na C podle předkládaného vynálezu obsahují více než 50%

C nukleotidů, ale neobsahují nutně póly C sekvence. V těchto nukleových kyselinách bohatých na C mohou být C nukleotidy separovány od sebe jinými typy nukleotidových zbytků, tj. G, T a A. V některých provedeních obsahuje nukleová kyselina bohatá na C více než 60%, 70%, 80%, 90% a 99% C nukleotidů nebo jakékoliv procento mezi uvedenými hodnotami. Výhodně obsahují nukleové kyseliny bohaté na C alespoň jednu póly C sekvenci a více než 50% C nukleotidů, a v některých provedeních jsou také bohaté na T.

Jak je uvedeno v příkladech, u několika ODN, o kterých se dříve soudilo, že nejsou imunostimulační, včetně dvou ODN SEQ ID NO: 225 a SEQ ID NO: 282, o kterých bylo dříve uváděno, že nejsou imunostimulační a které se používaly jako kontrolní ODN (Takahashi, T. et al., 2000, J. Immunol. 164: 4458), bylo zjištěno, že jsou imunostimulační. Naše pokusy prokázaly, že tyto ODN mohou stimulovat B-lymfocyty, ačkoliv při vyšších koncentracích ve srovnání s CpG ODN (obr. 6). Dlouhý poly-T ODN (30 mer) indukoval, alespoň v některých pokusech, srovnatelně silnou aktivaci B-lymfocytů ve srovnání s jedním z nejsilnějších CpG ODN aktivátorů B-lymfocytů. Tyto pokusy také ukázaly překvapivé zjištění, že i poly-C ODN mohou stimulovat B-lymfocyty.

Nicméně, imunostimulace těmito ODN nebyla omezena na Blymfocyty. Různé pokusy jasně prokázaly, že takovými non-CpG

9 *· «	♦	99 •	•	99 •	•	99	9	99 9 ·
• ♦	•	•	•	9 99	•		a	9
• ·	•	•	•	• ·	«		•	9
«· · ··		·♦		··		99		999·

ODN mohou být aktivovány monocyty, NK buňky a i NKT-lymfocyty (Obr. 7-10). Oproti poly-T a poly-C sekvencím nebylo při použití poly-A sekvencí dosaženo imunostimulace (alespoň pro monocyty, B-lymfocyty a NK buňky). Je zajímavé, že bylo zjištěno, že vložení CpG motivu do SEQ ID NO: 225 zesiluje imunostimulační aktivitu, zatímco prodloužení poly-T řetězcem nikoliv. Toto naznačuje, že CpG ODN a ODN bohaté na T mohou účinkovat různými způsoby nebo dráhami. Je také možné, že inserce poly-T motivu do různých pozic SEQ ID NO: 225 může způsobit změnu imunostimulačních vlastnosti.

Termíny TG nukleová kyselina nebo TG imunostimulační nukleová kyselina, jak jsou zde použity, označují nukleovou kyselinu obsahující alespoň jeden TpG dinukleotid (thymidinguanin dinukleotidovou sekvenci, tj. TG DNA nebo DNA obsahující 5' thymidin a potom 3' guanosin, které jsou vázané fosfátovou vazbou), která aktivuje složku imunitního systému.

V jednom provedení vynález poskytuje TG nukleovou kyselinu vzorce:

5'NiXiTGX₂N₂3' kde Xi a X₂ jsou nukleotidy a N je jakýkoliv nukleotid a Ni a N₂jsou sekvence nukleové kyseliny složené z jakéhokoliv počtu N, s podmínkou, že celkový součet Ni a N₂ je v rozmezí od 11 do 21. Například, pokud je Ni 5, tak může být N₂ 6 (celková délka oligonukleotidu je potom 15 nukleotidů). TG mohou být umístěny kdekoliv v oligonukleotidovém řetězci, včetně 5' konce, centra a 3' konce. Tak může být Ni 0 - 21, včetně, s podmínkou, že N₂je vybrán tak, aby součet Ni a N₂ byl 11 až 21, včetně. Obdobně může být N₂ 0 - 21, včetně, s podmínkou, že Ni je vybrán tak, aby součet Ni a N₂ byl 11 až 21, včetně. V některých

• ··	«9 • •	• 4 9 • 99	4 4		• 4 • 9 9
99 9 • ·	• •	• •
4	4
• 9	<·	•	•	» 9	•		•	9
99 9	94		99	49		• 4		• 949

provedeních je Xi adenin, guanin nebo thymidin a X2 je cytosin, adenin nebo thymidin. V jiných provedeních je X2 thymidin.

V jiných provedeních je Xi cytosin a/nebo X2 je guanin.

V jiných provedeních, která jsou popsána dále, může nukleová kyselina obsahovat jiné motivy, pokud je tak dlouhá, aby to bylo možné.

V jiném provedení vynález poskytuje TG nukleovou kyselinu vzorce:

5'NiXiX₂TGX3X4N₂3' kde Χι, X2, X3 a X4 jsou nukleotidy. V některých provedeních jsou X1X2 nukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující: GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, TpA a TpT; a X3X4 jsou nukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující: TpT, CpT, ApT, ApG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA a CpA; N je jakýkoliv nukleotid a Ni a N2 jsou sekvence nukleové kyseliny složené z jakéhokoliv počtu nukleotidů, s podmínkou, že celkový součet Ni a N2 je v rozmezí od 9 do 19. V některých provedeních jsou X1X2 GpA a X3X4 jsou TpT. V jiných provedeních jsou Xi nebo X2 nebo oba oba puriny a X3 nebo X4 nebo oba jsou pyrimidiny, nebo jsou X1X2 GpA a X3 nebo X4 nebo oba jsou pyrimidiny. V jednom výhodném provedení jsou X3X4 nukleotidy vybrané ze skupiny zahrnující: TpT, TpC a TpA.

Imunostimulační nukleová kyselina může mít jakoukoliv velikost (tj. délku), pokud je tvořena alespoň 4 nukleotidy.

V důležitých provedeních mají imunostimulační nukleové kyseliny délku 6 až 100 nukleotidů. V ještě jiných provedeních je délka v rozmezí od 8 do 35 nukleotidů. Výhodně mají TG oligonukleotidy velikost od 15 do 25 nukleotidů.

Velikost (tj. počet nukleotidových zbytků v nukleové

• ··			··	··		··
• » *	•	•	*	•	•	• ·
• · ·	•	•		•	•	•
• · ·	•	•	• ·	•	•	•
·· ··		··	··	··		····

kyselině) imunostimulační nukleové kyseliny může také přispívat k stimulační aktivitě nukleové kyseliny. Bylo zjištěno, že i pro vysoce imunostimulační nukleové kyseliny ovlivňuje délka nukleové kyseliny rozsah imunostimulace, který může být dosažen. Bylo prokázáno, že se zvyšováním délky nukleové kyseliny bohaté na T až na 24 nukleotidů se zvyšuje imunostimulace. Pokusy prezentované v příkladech demonstrují, že když se délka nukleové kyseliny bohaté na T zvyšuje od 18 do 27 nukleotidů, tak se významně zvyšuje schopnost nukleové kyseliny stimulovat imunitní reakci (srovnej ODN 2194, 2183, 2195 a 2196, které mají zmenšující se velikost od 27 do 18 nukleotidů). Zvyšující se délka nukleové kyseliny až do 30 nukleotidů má dramatický vliv na biologické vlastnosti nukleové kyseliny, ale zdá se, že zvyšování délky nad 30 nukleotidů nemá další vliv na imunostimulační účinek (srovnej ODN 2179 a 2006).

Bylo prokázáno, že TG nukleové kyseliny délky od 15 do 25 nukleotidů mohou mít lepší imunostimulační vlastnosti. Proto v jednom aspektu vynález poskytuje oligonukleotid délky 15-27 nukleotidů (tj. oligonukleotid délky 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 nukleotidů), kterým může být nukleová kyselina bohatá na T nebo TG nukleová kyselina, nebo jím může být TG nukleová kyselina bohatá na T. V jenom provedení není oligonukleotid nukleová kyselina bohatá na T ani TG nukleová kyselina. V jiných provedeních neobsahuje oligonukleotid CG motiv. Vynález také poskytuje oligonukleotidy délky 15-27 nukleotidů, oligonukleotidy délky 18-25 nukleotidů, oligonukleotidy délky 20-23 nukleotidů a oligonukleotidy délky 23-25 nukleotidů. Jakákoliv výše uvedené provedení týkající se oligonukleotidů délky 15-27 nukleotidů se také tkají oligonukleotidů jiných délek. Vynález dále zahrnuje použití jakéhokoliv z výše uvedených oligonukleotidů • · · · ·· ·· » · ·· · · v uvedených způsobech.

Ačkoliv je maximální imunostimulace dosaženo při použití některých nukleových kyselin délky 24-30 nukleotidů, stejně jako při použití některých TG nukleových kyselin délky 15 až 25 nukleotidů, mohou být ve způsobech podle předkládaného vynálezu použity kratší nebo delší imunostimulační nukleové kyseliny. Pro usnadnění vychytávání v buňkách mají imunostimulační nukleové kyseliny výhodně minimální délku 6 nukleotidů. Nukleové kyseliny jakékoliv délky větší než 6 nukleotidů (i délky mnoho kb) mohou indukovat imunitní reakci podle předkládaného vynálezu, pokud obsahují dostatečné imunostimulační motivy, protože větší nukleové kyseliny jsou degradovány v buňkách. Výhodně mají imunostimulační nukleové kyseliny délku 8 až 100 nukleotidů a v některých provedeních mají imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na T délku 24 až 40 nukleotidů a imunostimulační TG nukleové kyseliny mají délku 15 až 25 nukleotidů.

V jednom provedení vynález poskytuje nukleovou kyselinu bohatou na T vzorce:

5'NiXiX2TGX₃X4N₂3' kde Xi, X₂, X3 a X-s jsou nukleotidy. V jednom provedeních jsou XiX₂ TT a/nebo X3X4 jsou TT. V jiném provedení jsou XiX₂ vybrány ze skupiny zahrnující následující nukleotidy: TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA a GC; a X3X4 jsou vybrány ze skupiny zahrnující následující nukleotidy: TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA a GC.

V některých provedeních je výhodné, aby imunostimulační nukleové kyseliny neobsahovaly poly-C (CCCC) nebo poly-A • · · · · · · • · · · · · · · (AAAA). V jiných provedeních je výhodné, aby imunostimulační nukleové kyseliny obsahovaly poly-C, poly-A, poly-G (GGGG) nebo více GG. Zejména poly-G nebo mnohotné GG motivy mají dramatické vlivy na některé imunostimulační nukleové kyseliny. Vliv těchto non-T sekvencí závisí částečně na stavu skeletu nukleové kyseliny. Například, pokud má nukleová kyselina fosfodiesterový skelet nebo chimérický skelet, tak má zahrnutí těchto sekvencí v nukleové kyselině pouze minimální, pokud nějaký, vliv na biologickou aktivitu nukleové kyseliny. Když je skelet zcela fosforothioátový (nebo obsahuje jinou fosfátovou modifikaci) nebo je významně fosforothioátový, tak může použití těchto sekvencí mít větší vliv na biologickou aktivitu nebo kinetiku biologické aktivity, za snížení účinnosti TG imunostimulačních nukleových kyselin nebo nukleových kyselin bohatých na T.

Ačkoliv bylo prokázáno, že nukleové kyseliny bohaté na C mají imunostimulační vlastnosti, může mít inserce poly-C sekvencí do nukleové kyseliny bohaté na T, která redukuje relativní zastoupení T nukleotidů v nukleové kyselině, negativní vliv na nukleovou kyselinu. Ačkoliv se předkladatelé vynálezu nevážou na konkrétní mechanismus, předpokládá se, že si imunitní systém vyvinul mechanismy pro odlišení nukleových kyselin majících jiné nukleotidové vlastnosti, snad vznikající v důsledku jiných sad vazebných proteinů, které rozpoznávají jiné sekvence, nebo specifických vazebných proteinů, které rozpoznávají všechny imunostimulační sekvence, ale s jinými afinitami. Obecně, nejvíce imunostimulační jsou nukleové kyseliny obsahující nemethylované CpG motivy, po nich nukleové kyseliny bohaté na T, TG nukleové kyseliny a nukleové kyseliny bohaté na C. Nicméně, tato generalizace má mnoho výjimek. Například nukleová kyselina velmi bohatá na T (SEQ ID NO: 886) je v některých testech více imunostimulační než

některé nukleové kyseliny obsahující CpG (například fosforothioátová CpG nukleová kyselina obsahující jediný CpG motiv).

Také bylo zjištěno, že přidání poly-A koncovky k imunostimulační nukleové kyselině může zesílit aktivitu nukleové kyseliny. Bylo zjištěno, že když se vysoce imunostimulační CpG nukleová kyselina (SEQ ID NO: 246) modifikuje přidáním poly-A koncovky (AAAAAA) nebo poly-T koncovky (TTTTTT), tak má vzniklý oligonukleotid zvýšenou imunostimulační aktivitu. Schopnost poly-A nebo poly-T koncovky zvyšovat imunostimulační vlastnosti oligonukleotidu byla podobná. SEQ ID NO: 246 je oligonukleotid bohatý na T, Je pravděpodobné, že když se poly-A a poly-T koncovky přidají k nukleové kyselině, která není bohatá na T, budou mít větší vliv na imunostimulační schopnost nukleové kyseliny, protože když se poly-T koncovka přidá k nukleové kyselině, která je již bohatá na T, tak se imunostimulační vlastnosti adice polyT koncovky jistým způsobem naředí, i když ne zcela. Toto zjištění má významné důsledky pro použití poly-A regionů.

Proto v některých provedeních obsahují imunostimulační nukleové kyseliny poly-A region a v jiných nikoliv.

Některé imunostimulační nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu obsahují jeden nebo více CG motivů. Přítomnost CG motivů b imunostimulačních nukleových kyselinách také ovlivňuje biologickou aktivitu nukleových kyselin. Pokud je celková délka imunostimulační nukleové kyseliny 20 nukleotidů nebo méně, tak jsou CpG motivy významné pro určování imunostimulačního účinku nukleové kyseliny, a methylace těchto motivů snižuje imunostimulační účinky nukleové kyseliny. Pokud je délka imunostimulační nukleové kyseliny zvýšena na 24, tak je imunostimulační účinek nukleové

kyseliny méně závislý na CpG motivech a není nadále vyrušen methylací CpG motivů nebo jejich inverzí na GC dinukleotidy, s podmínkou, že jsou přítomné jiné zde popsané imunostimulační vlastnosti.

Například, ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) je vysoce imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T délky 24 nukleotidů s čtyřmi CpG dinukleotidy. Nicméně, ODN 2117 (SEQ ID NO: 358), ve které jsou CpG motivy methylovány, je také vysoce imunostimulační. ODN 2137 (SEQ ID NO: 886), ve které jsou CpG motivy ODN2006 invertovány na GpC, a která v důsledku tohoto obsahuje šest TG dinukleotidů, je také imunostimulační. Imunostimulační účinky nukleových kyselin, jako je ODN 2117 a 2137, jsou regulovány jejich obsahem T a TG. každá z těchto tří nukleových kyselin je bohatá na T a ODN 2137 je také bohatá na TG. Pokud je jejich obsah T snížen insercí jiných baží, jako je A (ODN 2117 (SEQ ID NO: 358)) nebo když je jejich obsah TG snížen substitucí TG AG, tak jsou jejich imunostimulační účinky mírně oslabeny. V jiném příkladu má nukleová kyselina délky 24 nukleotidů, ve které jsou všechny pozice náhodné, pouze mírný imunostimulační účinek (ODN 2182 (SEQ ID NO: 432)). Podobně, nukleová kyselina délky 24 nukleotidů s jiným složením nukleotidů má jiné imunostimulační účinky, které závisejí na obsahu T (ODN 2188 (SEQ ID NO:

905)), 2189 (SEQ ID NO: 906), 2190 (SEQ ID NO: 907)), 2191 (SEQ ID NO: 908)), 2193 (SEQ ID NO: 910), 2183 (SEQ ID NO:

433) a 2178 (SEQ ID NO: 428)). ODN 2190, který obsahuje TGT motivy, je více imunostimulační než ODN 2202, který obsahuje TGG motivy. Proto jsou v některých provedeních výhodné TGT motivy. V ještě jiných provedeních je počet TG motivů důležitý v tom, že zvýšený počet TG motivů vede k vyšší imunostimulaci. Některé výhodné TG nukleové kyseliny obsahují alespoň 3 TG motivy.

Příklady CpG nukleových kyselin jsou sekvence uvedené v tabulce A, jako je SEQ ID NO: 1, 3, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91,

93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354, 357, 361-365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399,

401-404,	406-426,	429, 433, 434-437,	439, 441-443,	445, 447,
448, 450,	453-456,	460-464, 466-469,	472-475, 477,	478, 480,
483-485,	488, 489,	492, 493, 495-502	, 504-505, 507	-509, 511,
513-529,	532-541,	543-555, 564-566,	568-576, 578,	580, 599,
601-605,	607-611,	613-615, 617, 619-	622, 625-646,	648-650,
653-664,	666-697,	699-706, 708, 709,	711-716, 718-	732, 736,
737, 739-	744, 746,	747, 749-761, 763	, 766-767, 769	, 772-779,
781-783,	785-786,	790, 792, 798-799,	804-808, 810,	815, 817,

818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874877, 879-881, 883-885, 888-904 a 909-913.

V některých provedeních vynálezu imunostimulační nukleové kyseliny obsahují CpG dinukleotidy a v jiných provedeních imunostimulační nukleové kyseliny neobsahují CpG dinukleotidy. CpG dinukleotidy mohou být methylované nebo nemethylované. Nukleová kyselina obsahující alespoň jeden nemethylovaný CpG dinukleotid je nukleová kyselina, která obsahuje nemethylovanou dinukleotidovou sekvenci cytosin-guanin (tj. CpG DNA nebo DNA obsahující nemethylovaný 5' cytosin následovaný 3' guanosinem, kde tyto dva zbytky jsou vázány fosfátovou vazbou) a aktivuje imunitní systém. Nukleová kyselina obsahující alespoň jeden methylovaný CpG dinukleotid je nukleová kyselina, která obsahuje methylovanou • · • · · · • * dinukleotidovou sekvenci cytosin-guanin (tj. methylováný 5' cytosin následovaný 3' guanosinem, kde tyto dva zbytky jsou vázány fosfátovou vazbou).

Příklad nukleových kyselin bohatých na T, které neobsahují CpG nukleové kyseliny, jsou nukleové kyseliny uvedené v tabulce A, jako jsou SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793, 794,

797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 a 910913. Příklad nukleových kyselin bohatých na T, které obsahují CpG nukleové kyseliny, jsou nukleové kyseliny uvedené v tabulce A, jako jsou SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376,

392, 407, 411, 413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501,

518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890 a 891.

Imunostimulační nukleové kyseliny mohou být dvouřetězcové nebo jednořetězcové. Obecně, dvouřetězcové molekuly jsou stabilnější in vivo, zatímco jednořetězcové nukleové kyseliny mají vyšší imunostimulační aktivitu. Proto je v některých aspektech vynálezu výhodnější, aby byla nukleová kyselina jednořetězcové, a v jiných aspektech je výhodnější, aby bylaq nukleová kyselina dvouřetězcové.

Termíny nukleová kyselina bohatá na T a TG nukleová kyselina, jak jsou zde použity, označují imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na T a imunostimulační TG nukleové kyseliny, v příslušném pořadí, pokud není u vedeno jinak. Nukleové kyseliny bohaté na T podle předkládaného vynálezu jsou sekvence popsané výše, stejně jako nukleové kyseliny uvedené v tabulce A, které obsahují alespoň jeden póly T motiv • · a/nebo obsahují více než 25%, lépe více než 35%, T nukleotidů. Nukleové kyseliny bohaté na C jsou nukleové kyseliny, které obsahují alespoň jeden, výhodně alespoň dva, poly-C regiony.

TG nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou nukleové kyseliny uvedené výše, stejně jako specifické nukleové kyseliny uvedené v tabulce A, které obsahují alespoň jeden TG motiv.

Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou - ale nemusí - také obsahovat poly-G motiv. Nukleové kyseliny obsahující poly-G jsou také imunostimulační. Různé práce, včetně Pisetsky a Reich, 1993, Mol. Biol. Reports 18: 217-221; Krieger a Herz, 1994, Ann. Rev. Biochem. 63: 601-637; Macaya et al., 1993, PNAS, 90: 3745-3749; Wyatt et al., 1994, PNAS, 91: 1356-1360; Rando a Hogan, 1998, v Applied Antisense Oligonucleotide Technology, vyd. Krieg a Stein, str. 335-352; a Kimura et al., 1994, J. Biochem. 116: 991-994; také popisují imunostimulační vlastnosti poly-G nukleových kyselin.

Poly-G nukleové kyseliny jsou výhodně nukleové kyseliny následujícího vzorce:

5' X1X2GGGX3X4 3' kde Xi, X2, X3, X4 jsou nukleotidy. Ve výhodném provedení jsou alespoň jeden z X3 a X4 G. V jiném výhodném provedení jsou X3 i X4 G. V ještě jiném výhodném provedení je výhodný vzorec 5' GGGNGGG3' nebo 5' GGGNGGGNGGG 3', kde N znamená 0 až 20 nukleotidů. V jiných provedeních neobsahuje póly G nukleová kyselina nemethylované CG dinukleotidy, jako jsou například nukleové kyseliny uvedené dále jako SEQ ID NO: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936 a

938. V jiných provedeních obsahuje póly G nukleová kyselina alespoň jeden nemethylovaný CG dinukleotid, jako jsou například nukleové kyseliny uvedené dále jako SEQ ID NO: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265,

315, 329,	434,	435,	475,	519,	521-524, 526, 527, 535,	554,
565, 609,	628,	660,	661,	662,	725, 767, 825, 856, 857,	876,
892, 909,	926,	927,	932	a 937.
Termíny	nukleová	kyselina	a oligonukleotid jsou

zaměnitelné a označují více nukleotidů (tj. molekul obsahujících sacharid (například ribosu nebo deoxyribsu) navázaný na fosfátovou skupinu a na nějakou organickou bázi, kterou je buď substituovaný pyrimidin (například cytosin (C), thymidin (T) nebo uráčil (U)), nebo substituovaný purin (například adenin (A) nebo guanin (G)). Tyto termíny označují jak oligoribonukleotidy, tak oligodeoxyribonukleotidy. Termíny také zahrnují polynukleosidy (tj. polynukleotid minus fosfát) a jakékoliv jiné organické baze obsahující polymer. Molekuly nukleové kyseliny mohou být získány z existujících zdrojů nukleových kyselin (například genomové nebo cDNA), ale výhodně jsou syntetické (například produkované syntézou nukleových kyselin).

Termíny nukleová kyselina a oligonukleotid také zahrnují nukleové kyseliny nebo oligonukleotidy se substitucemi nebo modifikacemi, jako jsou substituce nebo modifikace baží a/nebo sacharidů. Například tyto termíny zahrnují nukleové kyseliny se sacharidy skeletu, které jsou kovalentně navázané na organické skupiny s nízkou molekulovou hmotností jiné než hydroxylové skupiny v 3' pozici a jiné než fosfátové skupiny v 5' pozici. Takto modifikované nukleové kyseliny mohou obsahovat 2'-0-alkylované ribosové skupiny. Dále mohou modifikované nukleové kyseliny obsahovat sacharidy, jako je arabinosa,

místo ribosy. Tak mohou mít nukleové kyseliny heterogenní složení skeletu a mohou obsahovat jakoukoliv možnou kombinaci polymerových jednotek navázaných na sebe, jak je tomu u peptidových-nukleových kyselin (které mají aminokyselinový skelet s nukleotidovými bázemi). V některých provedeních jsou nukleové kyseliny homogenní ve složení skeletu. Nukleové kyseliny také obsahují substituované puriny a pyrimidiny, jako jsou C-5 propinové modifikované baze (Wagner et al., Nátuře Biotechnology 14: 840-844, 1996). Mezi puriny a pyrimidiny patří, například, adenin, cytosin, guanin, thymidin, 5methylcytosin, 2-aminopurin, 2-amino-6-chlorpurin, 2,6diaminopurin, hypoxanthin a jiné přirozené a nepřirozené nukleobáze, substituované a nesubstituované aromatické skupiny. Jiné takové modifikace jsou dobře známé odborníkům v oboru.

Pro použití v předkládaném vynálezu mohou být nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu syntetizovány de novo za použití jakéhokoliv z mnoha v oboru známých způsobů. Například mohou být použity b-kyanethyl-fosforoamiditová metoda (Beucage, S.L. a Caruthers, M.H., Tet. Let. 22: 1859, 1981); nukleosid-H-fosfonátová metoda (garreg et al., Tet. Let. 27: 4051-4054, 1986; Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14: 53995407, 1986; Geregg et al., Tet. Let. 27: 4055-4058, 1986; Gaffney et al., tet. Let. 29: 2619-2622, 1988). Tyto chemické reakce mohou být provedeny za použití různých automatizovaných syntezátorů nukleových kyselin dostupných na trhu. Tyto nukleové kyseliny jsou označovány jako syntetické nukleové kyseliny. Alternativně mohou být dinukleotidy bohaté na T a/nebo TG dinukleotidy produkovány ve velkém rozsahu v plasmidech (viz Sambrook T. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) a mohou být separovány do menších částí nebo mhou • toto to· ·· ·· *· ···· to · · · · « · toto· ····· ·· · toto ··· ·· · · · « · ··· toto ·· ·· «· ···· být aplikovány dohromady. Nukleové kyseliny mohou být připraveny z existujících sekvenci nukleové kyseliny (například genomové nebo cDNA) za použití známých technik, jako jsou techniky využívající restrikčních enzymů, exonukleas nebo endonukleas. Nukleové kyseliny připravené tímto způsobem jsou označovány jako izolované nukleové kyseliny. Izolovaná nukleová kyselina je obecně nukleová kyselina, která je separovaná od složek, se kterými je za normálních okolností asociována. Příkladem izolované nukleové kyseliny je nukleová kyselina, která je separována od buněk, od jádra, od mitochondrií nebo od chromatinu. Termíny nukleové kyseliny bohaté na Py a TG nukleové kyseliny označují jak syntetické, tak izolované nukleové kyseliny bohaté na Py a TG nukleové kyseliny.

Pro použití in vivo mohou být nukleové kyseliny bohaté na Py a TG nukleové kyseliny relativně resistentní na degradaci (např. mohou být stabilizované). Stabilizovaná molekula nukleové kyseliny označuje molekulu nukleové kyseliny, která je relativně resistentní na degradaci in vivo (například prostřednictvím exo- nebo endonukleas). Stabilizace může být funkcí délky nebo sekundární struktury. Nukleové kyseliny délky stovek kb jsou relativně resistentní na degradaci in vivo. Pro kratší nukleové kyseliny může jejich sekundární struktura stabilizovat a zvyšovat jejich efekt. Například, pokud je 3' konec nukleové kyseliny komplementární k předešlému regionu, tak se může otočit a vytvořit určitou smyčku, ve které jsou nukleové kyseliny stabilizované a proto aktivnější.

Alternativně může být stabilizace nukleové kyseliny provedena pomocí modifikací fosfátového skeletu. Výhodné stabilizované nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mají modifikovaný skelet. Bylo prokázáno, že modifikace • · ♦ · skeletu nukleové kyseliny zvyšuje aktivitu nukleových kyselin bohatých na Py nebo TG nukleových kyselin, když jsou podány in vivo. Tyto stabilizované struktury jsou výhodné, protože molekuly bohaté na Py a TG molekuly podle předkládaného vynálezu mají alespoň částečně modifikovaný skelet. Konstrukty bohaté na Py a TG konstrukty obsahující fosforothioátové vazby mají maximální aktivitu a chrání nukleové kyseliny před degradací intracelulárními exo- a endo-nukleasami. mezi další modifikované nukleové kyseliny patří fosfodiesterové modifikované nukleové kyseliny, kombinace fosfodiesterových a fosforothioátových nukleových kyselin, methylfosfonát, methylfosforothioát, fosforodithioát, p-ethoxy a jejich kombinace. Každá z těchto kombinací a jejich konkrétní efekty na buňky imunitního systému jsou popsány konkrétněji pro CpG nukleové kyseliny v PCT publikovaných patentových přihláškách PCT/US95/01570 (WO 96/02555) a PCT/US97/19791 (WO 98/18810), které uplatňují prioritu z US pořadové č. 08/386063 a 08/960774, podaných 7.2.1995 a 30.10.1997, v příslušném pořadí, jejichž obsahy jsou zde uvedeny jako odkazy. Předpokládá se, že tyto modifikované nukleové kyseliny mohou vykazovat vyšší stimulační aktivitu v důsledku vyšší resistence na nukleasy, vyššího vychytávání do buněk, vyšší vazby proteinů a/nebo pozměněné intracelulární lokalizace.

Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou volitelně být chimérické oligonukleotidy. Chimérické oligonukleotidy jsou oligonukleotid vzorce: 5ΎιΝιΖΝ₂Υ₂3'. Yi a Y₂ jsou molekuly nukleové kyseliny obsahující mezi 1 a 10 nukleotidy. Yi a Y₂každý obsahují alespoň jednu modifikovanou internukleotidovou vazbu. Protože alespoň dva nukleotidy chimérických oligonukleotidů obsahují modifikace skeletu, jsou tyto nukleové kyseliny příkladem jednoho typu stabilizovaných imunostimulačních nukleových kyselin.

* ···

V souvislosti s chimérickými oligonukleotidy jsou Yi a Y2 nezávislé jeden na druhém. To znamená, že Yi a Y2 mohou nebo nemusí mít různé sekvence a různé vazby ve skeletu ve srovnání s ostatními ve stejné molekule. Sekvence jsou různé, ale v některých případech jsou Yi a Y2 poly-G sekvence. Poly-G sekvence obsahují alespoň 3 G v řadě. V jiných provedeních jsou poly-G sekvencemi sekvence obsahující alespoň 4, 5, 6, 7 nebo 8 G v řadě. V jiných provedeních mohou být Yi a Y2 TCGTCG, TCGTCGT nebo TCGTCGTT (SEQ ID NO: 1145) . Yi a Y₂ mohou také obsahovat poly-C, poly-T nebo poly-A sekvence. V jiných provedeních mohou obsahovat Yi a Y2 mezi 3 a 8 nukleotidy.

Ni a N2 jsou molekuly nukleové kyseliny obsahující mezi 0 a 5 nukleotidy tak, aby N1ZN2 obsahoval celkem 6 nukleotidů. Nukleotidy N1ZN2 mají fosfodiesterový skelet a nezahrnují nukleové kyseliny mající modifikovaný skelet.

Z je imunostimulační nukleokyselinový motiv, ale nezahrnuje CG. Například může být Z nukleová kyselina bohatá na T, například obsahující TTTT motiv, nebo sekvence, kde alespoň 50% baží sekvence jsou T, nebo může být Z TG sekvence.

Centrální nukleotidy (N1ZN2) vzorce Yi N1ZN2Y2 obsahují fosfodiesterové internukleotidové vazby a Yi a Y2 obsahují alespoň jednu, ale i více než jednu nebo i všechny, modifikované internukleotidové vazby. Ve výhodných provedeních obsahují Yi a/nebo Y alespoň dvě nebo dvě až pět modifikovaných internukleotidových vazeb, nebo obsahuje Yi dvě modifikované internukleotidové vazby a Y2 pět modifikovaných internukleotidových vazeb, nebo obsahuje Yi pět modifikovaných internukleotidových vazeb a Y2 dvě modifikované internukleotidové vazby. Modifikovanou internukleotidovou »· ·» • 9 9

9 9 99 vazbou je v některých provedeních fosforothioátová modifikovaná vazba nebo p-ethoxy modifikovaná vazba.

Modifikovaná skelety, jako jsou fosforothioáty, mohou být syntetizovány za použití automatizovaných technik využívajících buď fosforoamidátové, nebo H-fosfonátové chemie. Aryl- a alkyl-fosfonáty mohou být vyrobeny například způsobem popsaným v US patentu č. 4469863; a alkylfosfotriestery (ve kterých je nabitá kyslíková skupina alkylovaná způsobem popsaným v US patentu č. 5023243 a v Evropském patentu č. 092574) mohou být připraveny automatizovanou syntézou na pevné fázi za použití komerčně dostupných činidel. Byly popsány způsoby pro jiné modifikace a substituce DNA skeletu (Uhlmann, E. a Peyman, A., Chem. Rev. 90: 544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1: 165,

1990) .

Mezi další stabilizované nukleové kyseliny patří: neionické DNA analogy, jako jsou alkyl- a aryl-fosfáty (ve kterých je nabitý fosfonátový kyslík nahrazen alkylovou nebo arylovou skupinou), fosfodiestery a alkylfosfotriestery, ve kterých je nabitá kyslíková skupiny alkylována. Nukleové kyseliny, které obsahují diol, jak je tetraethylenglykol nebo hexaethylenglykol, na jednom nebo obou koncích, jsou také významně resistentní na degradaci nukleasami.

V případě, že je nukleová kyselina bohatá na Py nebo TG nukleová kyselina podána současně s antigenem, který je kódovaný nukleokyselinovým vektorem, tak je výhodné, aby byl skelet nukleové kyseliny bohaté na Py nebo TG nukleové kyseliny chimérickou kombinací fosfodiesteru a fosforothioátu (nebo jiných fosfátových modifikací). Buňka může mít potíže s vychytáváním plasmidového vektoru za přítomnosti zcela

99 99 99 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 999 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 9999 fosforothioátové nukleové kyseliny, proto, když jsou vektor a nukleová kyselina podány jedinci, tak je výhodné, aby nukleová kyselina měla chimérický skelet nebo fosforothioátový skelet, ale aby byl plasmid asociovaný s vehikulem, které jej přepraví přímo do buněk, což eliminuje potřebu vychytávání buňkami.

Taková vehikula jsou známá v oboru a patří mezi ně například liposomy a genová děla.

Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, stejně jako různé kontrolní nukleové kyseliny, jsou uvedeny v následující tabulce A.

Tabulka A

SEQ ID NO:	ODN sekvence	skelet³ —
1	tctcccagcgtgcgccat	s
2	ataatccagcttgaaccaag	s
3	ataatcgacgttcaagcaag	s
4	taccgcgtgcgaccctct	s
5	ggggagggt	s
6	ggggagggg	s
7	ggtgaggtg	s
8	tccatgtzgttcctgatgct	o
9	gctaccttagzgtga	o
10	tccatgazgttcctgatgct	o
11	tccatgacgttcztgatgct	o
12	gctagazgttagtgt	o
13	agctccatggtgctcactg	s
14	cca cgt ega ccctcaggcga	s
1S	gcacatcgtcccgcagccga	s
16	gtcactcgtggtacctcga	s
17	gttggatacaggccagactttgttg	o
18	gattcaacttgcgctcatcttaggc	o
19	accatggacgaactgtttcccctc	s
20	accatggacgagctgtttcccctc	s
21	accatggacgacctgtttcccctc	s
22	accatggacgtactgtťtcccctc	s
23	accatggacggtctgtttcccctc	s
24	accatggacgttctgtttcccctc	s
25	ccactcacatctgctgctccacaag	o
26	acttctcatagtccctttggtccag	o

·9

9 9

99

9 9

9 99

9 •

·♦··

27	tccatgagcttcctgagtct	o
28	gaggaaggigiggaigacgt	o
29	gtgaaticgttcicgggict	O
30	aaaaaa	s
31	cccccc	s
32	ctgtca	s
33	tcgtag	s.
34	tcgtgg	s
35	cgtcgt	s
36	tccatgtcggtcctgagtct	sos
37	tccatgccggtcctgagtct	sos
38	tccatgacggtcctgagtct	sos
39	tccatgacggtcctgagtct	sos
40	tccatgtcgatcctgagtct	sos
41	tccatgtcgctcctgagtct	sos
42	tccatgtcgttcctgagtct.	sos
43	tccatgacgttcctgagtct	sos
44	tccataacgttcctgagtct	sos
45	tccatgacgtccctgagtct	sos
46	tccatcacgtgcctgagtct	sos
47	tccatgctggtcctgagtct	sos
48	tccatgtzggtcctgagtct	sos
49	ccgcttcctccagatgagctcatgggtttctccaccaag	o
50	cttggtggagaaacccatgagctcatctggaggaagcgg	o
51	ccccaaagggatgagaagtt	o
52	agatagcaaatcggctgacg	o
53	ggttcacgtgctcatggctg	o
54	tctcccagcgtgcgccat	s
55	tctcccagcgtgcgccat	s
56	taccgcgtgcgaccctct	s
57	ataatccagcttgaaccaag	s
58	ataatcgacgttcaagcaag	s
59	tccatgattttcctgatttt	o
60	ttgtttttttgtttttttgttttt	s
61	ttttttttgtttttttgttttt	o
62 '	tgctgcttttgtgcttttgtgctt	s
63	tgctgcttgtgcttttgtgctt	o
64	gcattcatcaggcgggcaagaat	o
65	taccgagcttcgacgagatttca	o
66	gcatgacgttgagct	s
67	cacgttgaggggcat	s
68	ctgctgagactggag	s
69	tccatgacgttcctgacgtt	s
70	gcatgagcttgagctga	o
71	tcag.cgtgcgcc	s
72	atgacgttcctgacgtt	s
73	ttttggggttttggggtttt	s
74	tctaggctttttaggcttcc	s
75	tgcattttttaggccaccat	s
76	tctcccagcgtgcgtgcgccat	s
77	tctcccagcgggcgcat	s

• v ·· • · * • · ··· · · · • · * · ·· 99 ·<· 99

9 9 · • 41 9

9 9 9

9 9

9999

78	tctcccagcgagcgccat	s
79	tctcccagcgcgcgccat	s
80	ggggtgacgttcagggggg	sos
81	ggggtccagcgtgcgccatggggg	sos
82	ggggtgtcgttcagggggg	sos
83	tccatgtcgttcctgtcgtt	s
84	tccatagcgttcctagcgtt	s
85	tcgtcgctgtctccgcttctt	s
86	gcatgacgttgagct	sos
87	tctcccagcgtgcgccatat	sos
88	tccatgazgttcctgazgtt	s
89	gcatgazgttgagct	o
90	tccagcgtgcgccata	sos
91	tctcccagcgtgcgccat	o
92	tccatgagcttcctgagtct —	o
93	gcatgtcgttgagct .	sos
94	tcctgacgttcctgacgtt	s
95	gcatgatgttgagct	o
96	gcatttcgaggagct	o
97	gcatgtagctgagct	o
98	tccaggacgttcctagttct	o
99	tccaggagcttcctagttct	o
100	tccaggatgttcctagttct	o
101	tccagtctaggcctagttct	o
102	tccagttcgagcctagttct	o
103	gcatggcgttgagct	sos
104	gcatagcgttgagct	sos
105	gcattgcgttgagct	sos
106	gcttgcgttgcgttt	sos
107	tctcccagcgttgcgccatat	sos
108	tctcccagcgtgcgttatat	sos
109	tctccctgcgtgcgccatat	sos
110	tctgcgtgcgtgcgccatat	sos
111	tctcctagcgtgcgccatat	sos
112	tctcccagcgtgcgcctttt	sos
113	gctandcghhagc	o
114	tcctgacgttccc	o
115	ggaagacgttaga	o
116	tcctgacgttaga	o
117	tcagaccagctggtcgggtgttcctga	o
118	tcaggaacacccgaccagctggtctga	o
119	gctagtcgatagc	o
120	gctagtcgctagc	o
121	gcttgacgtctagc	o
122	gcttgacgtttagc	o
123	gcttgacgtcaagc	o
124	gctagacgtttagc	o
125	tccatgacattcctgatgct	o
126	gctagacgtctagc	o
127	ggctatgtcgttcctagcc	o
128	ggctatgtcgatcctagcc	o

φφ φφ «

• *· ·· φ · • · · φ · · · • · φ • ΦΦ φφ • φ • ··· • φ • · φφ φφ

9 9 ·

Φ Φ Φ • Φ Φ

8 9 ?Φ ·ΦΦ·

129	ctcatgggtttctccaccaag	O
130	cttggtggagaaacccatgag	o
131	tccatgacgttcctagttct	o
132	ccgcttcctccagatgagctcatg	o
133	catgagctcatctggaggaagcgg	o
134	ccagatgagctcatgggtttctcc	o
135	ggagaaacccatgagctcatctgg	o
136	agcatcaggaacgacatgga	o
137	tccatgacgttcctgacgtt	rna
138	gcgcgcgcgcgcgcgcgcg	o
139	ccggccggccggccggccgg	o
140	ttccaatcagccccacccgctctggccccaccctcaccctcca	o
141	tggagggtgagggtggggccagagcgggtggggctgattggaa	0
142	tcaaatgtgggattttcccatgagtct	o
143	agactcatgggaaaatcccacatttga	o
144	tgccaagtgctgagtcactaataaaga	o
145	tctttattagtgactcagcacttggca	o
146	tgcaggaagtccgggttttccccaacccccc	o
147	ggggggttggggaaaacccggacttcctgca	o
148	ggggactttccgctggggactttccagggggactttcc	sos
14 9	tccatgacgttcctctccatgacgttcctctccatgacgttcctc	o
150	gaggaacgtcatggagaggaacgtcatggagaggaacgtcatgga	o
151	ataatagagcttcaagcaag	s
152	tccatgacgttcctgacgtt	s
153	tccatgacgttcctgacgtt	sos
154	tccaggactttcctcaggtt	s
155	tcttgcgatgctaaaggacgtcacattgcacaatcttaataaggt	o
156	accttattaagattgtgcaatgtgacgtcctttagcatcgcaaga	o
157	tcctgacgttcctggcggtcctgtcgct	o
158	tcctgtcgctcctgtcgct	o
159	tcctgacgttgaagt	o
160	tcctgtcgttgaagt	o
161	tcctggcgttgaagt	o
162	tcctgccgttgaagt	o
163	tccttacgttgaagt	o
164	tcctaacgttgaagt	o
165	tcctcacgttgaagt	o
166	tcctgacgatgaagt	o
167	tcctgacgctgaagt	0
168	tcctgacggtgaagt	o
169	tcctgacgtagaagt	o
170	tcctgacgtcgaagt	o
171	tcctgacgtgaaagt	o
172	tcctgagcttgaagt	o
173	gggggacgttggggg	o
174	tcctgacgttccttc	o
175	tctcccagcgagcgagcgccat	s
176	tcctgacgttcccctggcggtcccctgtcgct	o
177	tcctgtcgctcctgtcgctcctgtcgct	o
178	tcctggcggggaagt	o
179	tcctgazgttgaagt	o

• · • · • · • · • · · · • · ·· · I

180	tcztgacgttgaagt	o
181	tcctagcgttgaagt	O
182	tccagacgttgaagt	o
183	tcctgacggggaagt	o
184	tcctggcggtgaagt	o
185	ggctccggggagggaatttttgtctat	o
186	atagacaaaaattccctccccggagcc	o
187	tccatgagcttccttgagtct	rna
188	tcgtcgctgtctccgcttctt	so
189	tcgtcgctgtctccgcttctt	s2O
190	tcgagacattgcacaatcatctg	O
191	cagattgtgcaatgtct ega	O
192	tccatgtcgttcctgatgcg	O
193	gcgatgtcgttcctgatgct	o
194	gcgatgtcgttcctgatgcg	o
195	tccatgtcgttccgcgcgcg	o
196	tccatgtcgttcctgccgct	o
197	tccatgtcgttcctgtagct	o
198	gcggcgggcggcgcgcgccc	o
199	atcaggaacgtcatgggaagc	o
200	tccatgagcttcctgagtct	p-ethoxy
201	tcaacgtt	p-ethoxy
202	tcaagctt	p-ethoxy
203	tcctgtcgttcctgtcgtt	s
204	tccatgtcgtttttgtcgtt	s
205	tcctgtcgttccttgtcgtt	s
206	tccttgtcgttcctgtcgtt	s
207	btccattccatgacgttcctgatgcttcca ...	os
208	tcctgtcgttttttgtcgtt	s
209	tcgtcgctgtctccgcttctt	s
210	tcgtcgctgtctgcccttctt	s
211	tcgtcgctgttgtcgtttctt	s
212	tcctgtcgttcctgtcgttggaacgacagg	o
213	tcctgtcgttcctgtcgťttcaacgtcaggaacgacagga	o
214	ggggtctgtcgttttgggggg	sos
215	ggggtctgtgcttttgggggg	sos
216	tccggccgttgaagt	o
217	tccggacggtgaagt	o
218	tcccgccgttgaagt	o
219	tccagacggtgaagt	o
220	tcccgacggtgaagt	o
221	tccagagcttgaagt	o
222	tccatgtzgttcctgtzgtt	s
223	tccatgacgttcctgacgtt	sos
224	ggggttgacgttttgggggg	sos
225	tccaggacttctctcaggtt	s
226	tttttttťtttttttttttt	s
227	tccatgccgttcctgccgtt	s
228	tccatggcgggcctggcggg	s
229	tccatgacgttcctgccgtt	s
230	tccatgacgttcctggcggg	s

231	tccatgacgttcctgcgttt	s
232	tccatgacggtcctgacggt	s
233	tccatgcgtgcgtgcgtttt	s
23-.	tccatgcgttgcgttgcgtt	s
235	btccattccattctaggcctgagtcttccat	os
236	tccatagcgttcctagcgtt	o
237	tccatgtcgttcctgtcgtt	0
236	tccatagcgatcctagcgat	o
239	tccattgcgttccttgcgtt	o
240	tccatagcggtcctagcggt	o
241	tccatgattttcctgcagttcctgatttt
242	tccatgacgttcctgcagttcctgacgtt	s
243	ggcggcggcggcggcggcgg	o
244	tccacgacgttttcgacgtt	s
245	tcgtcgttgtcgttgtcgtt	s
246	tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt	s
247	tcgtcgttgtcgttttgtcgtt	s
248	gcgtgcgttgtcgttgtcgtt	s
249	czggczggczgggczccgg	o
250	gcggcgggcggcgcgcgccc	s
251	agicccgigaacgiattcac	o
252	tgtcgtttgtcgtttgtcgtt	s
253	tgtcgttgtcgttgtcgttgtcgtt	s
254	tgtcgttgtcgttgtcgttgtcgtt	s
255	tcgtcgtcgtcgtt	s
256	tgtcgttgtcgtt	s
257	cccccccccccccccccccc	s
258	tctagcgtttttagcgttcc	sos
25S	tgcatcccccaggccaccat	s
26C	tcgtcgtcgtcgtcgtcgtcgtt	sos
261	tcgtcgttgtcgttgtcgtt	sos
262	tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt	sos
263	tcgtcgttgtcgttttgtcgtt	sos
264	ggggagggaggaacttcťtaaaattcccccagaatgttt	o
265	aaacattctgggggaattttaagaagttcctccctcccc	o
266	atgtttacttcttaaaattcccccagaatgttt	o
267	aaacattctgggggaattttaagaagtaaacat	o
268	atgtttactagacaaaattcccccagaatgttt	o
269	aaacattctgggggaattttgtctagtaaacat	o
270	aaaattgacgttttaaaaaa	sos
271	ccccttgacgttttcccccc	sos
272	ttttcgttgtttttgtcgtt
272	tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt	sos
274	ctgcagcctgggac	o
275	acccgtcgtaattatagtaaaaccc	o
276	ggtacctgtggggacattgtg	o
277	aacaccgaacgtgagagg	o
278	tccatgccgttcctgccgtt	o
279	tccatgacggtcctgacggt	o
28C	tccatgccggtcctgccggt	o
281	tccatgcgcgtcctgcgcgt	o

• · · • · ··

282	ctggtctttctggtttttttctgg	s
283	tcaggggtggggggaacctt	sos
284	tccatgazgttcctagttct	0
285	tccatgatgttcctagttct	O
286	cccgaagtcatttcctcttaacctgg	o
287	ccaggttaagaggaaatgacttcggg	o
> 288	tcctggzggggaagt	o
289	gzggzgggzggzgzgzgccc	X
290	tccatgtgcttcctgatgct	o
291	tccatgtccttcctgatgct
292	tccatgtcgttcctagttct
293	tccaagtagttcctagttct	o
294	tccatgtagttcctagttct	o
295	tcccgcgcgttccgcgcgtt	s
296	tcctggcggtcctggcggtt	s
297	tcctggaggggaagt	o
298	tcctgggggggaagt	o
299	tcctggtggggaagt	o
300	tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt	o
301	ctggtctttctggtttttttctgg	o
302	tccatgacgttcctgacgtt	o
303	t ccaggacttct ctcaggtt	sos
304	t zgt zgttttgtzgttttgtzgtt	o
305	btcgtcgttttgtcgttttgtcgttttttt	os
306	gctatgacgttccaaggg	s
307	tcaacgtt	s
308	tccaggactttcctcaggtt	o
309	ctctctgtaggcccgcttgg	s
310	ctttccgttggacccctggg -	s
311	gtccgggccaggccaaagtc	š
312	gtgcgcgcgagcccgaaatc	s
313	tccatgaigttcctgaigtt	s
314	aatagtcgccataacaaaac	0
315	aatagtcgccatggcggggc	o
316	btttttccatgtcgttcctgatgcttttt	os
317	tcctgtcgttgaagtttttt	o
318	gctagctttagagctttagagctt	o
319	tgctgcttcccccccccccc	o
320	tcgacgttcccccccccccc	o
321	t cgtcgtt cccccccccccc	o
322	tcgtcgttcccccccccccc	o
323	tcgccgttcccccccccccc	o
324	t cgt cgatcccccccccccc	o
325	tcctgacgttgaagt	s
326	tcctgccgttgaagt	s
327	tcctgacggtgaagt	s
328	tcctgagcttgaagt	s
329	tcctggcggggaagt	s
330	aaaatctgtgcttttaaaaaa	sos
331	gatccagtcacagtgacctggcagaatctggat	o
332	gatccagattctgccaggtcactgtgactggat	0

• ·· ·· ·· ·· · · • · · · · · · ···· • · · ····· · · · ·· ··· · · · · · · · • · · · · · · · · · ··· ·· ·· ·· ·· ···· . 60

333	gatccagtcacagtgactcagcagaatctggat	0
334	gatccagattctgctgagtcactgtgactggat	0
335	tcgtcgttccccccczcccc	o
336	tzgtqgttcccccccccccc	o
337	tzgtcgttcccccccccccc	o
338	tcgtzgttcccccccccccc	o
339	tcgtcgctcccccccccccc	o
340	tcgtcggtcccccccccccc	o
341	tcggcgttcccccccccccc	o
342	ggccttttcccccccccccc	0
343	tcgtcgttttgacgttttgtcgtt	s
344	tcgtcgttttgacgttttgacgtt	s
345	ccgtcgttcccccccccccc	o
346	gcgtcgttcccccccccccc	o
347	tcgtcattcccccccccccc	o
348	acgtcgttcccccccccccc	o
349	ctgtcgttcccccccccccc	o
350	btttttcgtcgttcccccccccccc	os
351	tcgtcgttccccccccccccb	o
352	tcgtcgttttgtcgttttgtcgttb	o
353	tccagttccttcctcagtct	o
354	tzgtcgttttgtcgttttgtcgtt	o
355	tcctggaggggaagt	s
356	tcctgaaaaggaagt	s
357	tcgtcgttccccccccc	s
358	tzgtzgttttgtzgttttgtzgtt	s
359	ggggtcaagcttgagggggg	sos
360	tgctgcttcccccccccccc	s
361	tcgtcgtcgtcgtt	s2
362	tcgtcgtcgtcgtt	s20
363	tcgtcgtcgtcgtt	os2
364	tcaacgttga	s
365	tcaacgtt	s
366	atagttttccattttttťac
367	aatagtcgccatcgcgcgac	o
368	aatagtcgccatcccgggac	o
369	aatagtcgccatcccccccc	o
370	tgctgcttttgtgcttttgtgctt	o
371	ctgtgctttctgtgtttttctgtg	s
372	ctaatctttctaatttttttctaa	s
373	tcgtcgttggtgtcgttggtatcgtt·	s
374	tcgtcgttggttgtcgttttggtt	s
375	accatggacgagctgtttcccctc
376	tcgtcgttttgcgtgcgttt	s
377	ctgtaagtgagcttggagag
378	gagaacgctggaccttcc
379	cgggcgactcagtctatcgg
380	gttctcagataaagcggaaccagcaacagacacagaa
381	ttctgtgtctgrtgctggttccgctttatctgagaac
382	cagacacagaagcccgatagacg
383	agacagacacgaaacgaccg

• · · ·

384	gtctgtcccatgatctcgaa
385	gctggccagcttacctcccg
386	ggggcctctatacaacctggg
387	ggggtccctgagactgcc
388	gagaacgctggaccttccat
389	tccatgtcggtcctgatgct
390	ctcttgcgacctggaaggta
391	aggtacagccaggactacga
392	accatggacgacctgtttcccctc
393	accatggattacctttttcccctt
394	atggaaggtccagcgttctc	o
395	agcatcaggaccgacatgga	O
396	ctctccaagctcacttacag
397	tccctgagactgccccacctt
398	gccaccaaaacttgtccatg
399	gtccatggcgtgcgggatga
400	cctctatacaacctgggac
401	cgggcgactcagtctatcgg
402	gcgctaccggtagcctgagt
403	cgactgccgaacaggatatcggtgatcagcactgg
404	ccagtgctgatcaccgatatcctgttcggcagtcg
405	ccaggttgtatagaggc
406	tctcccagcgtacgccat	s
407	tctcccagcgtgcgtttt	s
408	tctcccgacgtgcgccat	s
409	tctcccgtcgtgcgccat	s
410	ataatcgtcgttcaagcaag	s
411	tcgtcgttttgtcgttttgtcgt	s2
412	tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt	s2
413	tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt	s2 .
414	tcntcgtnttntcgtnttntcgtn	s
415	tctcccagcgtcgccat	s
416	tctcccatcgtcgccat	s
417	ataatcgtgcgttcaagáaag	s
418	ataatcgacgttcccccccc	s
419 '	tctatcgacgttcaagcaag	s
420	tcc tga cgg gg agt	s
421	tccatgacgttcctgatcc
422	tccatgacgttcctgatcc
423	tccatgacgttcctgatcc
424	tcc tgg cgt gga agt	s
425	tccatgacgttcctgatcc
426	tcgtcgctgttgtcgtttctt	s
427	agcagctttagagctttagagctt	s
428	cccccccccccccccccccccccc	s
429	tcgtcgttttgtcgttttgtcgttttgtcgtt	s
430	tcgtcgttttttgtcgttttttgtcgtt	s
431	tcgtcgtttttttttttttt	s
432	tttttcaacgttgatttttt	sos
433	tttttttttttttttttttttttt	s
434	ggggtcgtcgttttgggggg

• · · ·

4 3Ξ	tcgtcgttttgtcgttttgggggg
435	tcgtcgctgtctccgcttcttcttgcc	s
43'	tcgtcgctgtctccg	s
435	ctgtaagtgagcttggagag
435	gagaacgctggaccttccat
445	ccaggttgtatagaggc
441	gctagacgttagcgtga
442	ggagctcttcgaacgccata
442	tctccatgatggttttatcg
4 4 4	aaggtggggcagtctcaggga
445	atcggaggactggcgcgccg
446	ttaggacaaggtctagggtg
447	accacaacgagaggaacgca
445	ggcagtgcaggctcaccggg
445	gaaccttccatgctgtt
4 51	gctagacgttagcgtga
451	gcttggagggcctgtaagtg
452	gtagccttccta
452	cggtagccttccta
454	cacggtagccttccta
455	agcacggtagccttccta
455	gaacgctggaccttccat
457	gaccttccat
455	tggaccttccat
455	gctggaccttccat
4 6C	acgctggaccttccat ; 2
461	taagctctgtcaacgccagg
4 62	gaaaacgctggaccttccatgt
462	tccatgtcggtcctgatgct
464	ttcatgccttgcaaaatggcg 2
465	tgctagctgtgcctgtacct
465	agcatcaggaccgacatgga
4 6	gaccttccatgtcggtcctgat
465	acaaccacgagaacgggaac
465	gaaccttccatgctgttccg , ,
47C	caatcaatctgaggagaccc
471	tcagctctggtactttttca
472	tggttacggtctgtcccatg
472	gtctatcggaggactggcgc . ,
474	cattttacgggcgggcgggc .. ,
475	gaggggaccattttacgggc
475	tgtccagccgaggggaccat
477	cgggcttacggcggatgctg . .
475	tggaccttctatgtcggtcc . 2
475	tgtcccatgtttttagaagc
461	gtggttacgg.tcgtgcccat
481	cctccaaatgaaagaccccc
462	ttgtactctccatgatggtt
482	ttccatgctgttccggctgg Έ
484	gaccttctatgtcggtcctg
482	gagaccgcccgaccttcgat

.63

486	ttgccccatattttagaaac
487	ttgaaactgaggtgggac
488	ctatcggaggactggcgcgcc
489	cttggagggcctcccggcgg
490	gctgaaccttccatgctgtt
491	tagaaacagcattcttctťttagggcagcaca
4 92	agatggttctcagataaagcggaa
4 93	ttccgctttatctgagaaccatct
494	gt cccaggttgtatagaggctgc
495	gcgccagtcctccgatagac
496	atcggaggactggcgcgccg
497	ggtctgtcccatatttttag
498	tttttcaacgttgagggggg	SOS
499	tttttcaagcgttgatttttt	sos
500	ggggtcaacgttgatttttt	sos
501	ggggttttcaacgttttgagggggg	sos
502	ggttacggtctgtcccatat
503	ctgtcccatatttttagaca
504	accatcctgaggccattcgg
505	cgtct at cgggcttctgtgtctg
506	ggccatcccacattgaaagtt
507	ccaaatatcggtggtcaagcac
508	gtgcttgaccaccgatatttgg
509	gtgctgatcaccgatatcctgttcgg
510	ggccaactttcaatgtgggatggcctc
511	ttccgccgaatggcctcaggatggtac
512	tatagtccctgagactgccccaccttctcaacaacc
513	gcagcctctatacaacctgggacggga
514	ctatcggaggactggcgcgccg
515	tatcggaggactggcgcgccg
516	gatcggaggactggcgcgccg
517	ccgaacaggatatcggtgatcagcac
518	ttttggggtcaacgttgagggggg .
519	ggggtcaacgttgagggggg	sos
520	cgcgcgcgcgcgcgcgcgcg	s
521	ggggcatgacgttcgggggg	ss
522	ggggcatgacgttcaaaaaa	s
523	ggggcatgagcttcgggggg	s
524	ggggcatgacgttcgggggg	sos
525	aaaacatgacgttcaaaaaa	sos
526	aaaacatgacgttcgggggg	sos
527	ggggcatgacgttcaaaaaa	sos
528	accatggacgatctgtttcccctc	s
529	gccatggacgaactgttccccctc	s
530	cccccccccccccccccccc	sos
531	gggggggggggggggggggg	sos
532	gctgtaaaatgaatcggccg	sos
533	ttcgggcggactcctccatt	sos
534	tatgccgcgcccggacttat	sos
535	ggggtaatcgatcagggggg	sos
536	tttgagaacgctggaccttc	sos

• 4 ··

9 9 • 4

444 9 9 9 9 9 9 9 ·4· 44 ·· 44 ·4 ·444

537	gatcgctgatctaatgctcg	SOS
538	gtcggtcctgatgctgttcc	sos
539	tcgtcgtcagttcgctgtcg	sos
540	ctggaccttccatgtcgg	sos
541	gctcgttcagcgcgtct	sos
542	ctggaccttccatgtc	sos
543	cactgtccttcgtcga	sos
544	cgctggaccttccatgtcgg	sos
545	gctgagctcatgccgtctgc	sos
546	aacgctggaccttccatgtc	sos
547	tgcatgccgtacacagctct	sos
548	ccttccatgtcggtcctgat	sos
549	tactcttcggatcccttgcg	sos
550	ttccatgtcggtcctgat	sos
551	ctgattgctctctcgtga	sos
552	ggcgttattcctgactcgcc	o
553	cctacgttgtatgcgcccagct	o
554	ggggtaatcgatgagggggg	o
555	ttcgggcggactcctccatt	o
556	tttttttttttttttttttt	o
557	gggggttttttttttggggg	o
558	tttttcgagggggggttttt	o
559	ggggggggggggggggggt	o
560	aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa	o
561	cccccaaaaaaaaaaccccc	o
562	aaaaaccccccccccaaaaa	o
563	tttgaattcaggactggtgaggttgag	o
564	tttgaatcctcagcggtctccagtggc	o
565	aattctctatcggggcttctgtgtctgttgctggttccgctttat	o
566	ctagataaagcggaaccagcaacagacacagaagccccgatagag	o
567	ttttctagagaggtgcacaatgctctgg	o
568	tttgaattccgtgtacagaagcgagaagc	o
569	tttgcggccgctagacttaacctgagagata	0
570	tttgggcccacgagagacagagacacttc	o
571	tttgggcccgcttctcgcttcťgtacacg	o
572	gagaacgctggaccttccat	s
573	tccatgtcggtcctgatgct	s
57 4	ctgtcg	s
575	tcgtga	s
576	cgtega	s
577	agtgct	s
578	ctgtcg	o
579	agtgct	o
580	cgtcga	o
581	tcgtga	o
582	gagaacgctgčagcttcgat	o
583	actacacgtaagcgtga	o
584	gagascgctcgaccttccat	o
585	gagaacgctggacctatccat	o
586	gctagaggttagcgtga	o
587	gaaaacgctagacttccat	0

·· ·· ·· ·· ·· • · · · ··· ·«·· ·· · ····· ·· * ·· ··· ·· ··· · · ··· ···· ··· ··· ·· ·· ·· ·· ····

588	tcacgctaacgtctagc	O
589	bgctagacgttagcgtga	o
590	atggaaggtcgagcgttctc	o
591	gagaacgctggaccttcgat	o
592	gagaacgatggaccttccat	o
593	gagaacgctggatccat	o
594	gagaacgctccagcactgat	o
595	tccatgtcggtcctgctgat	o
596	atgtcctcggtcctgatgct	o
597	gagaacgctccaccttocat	o
598	gagaacgctggaccttcgta	o
599	batggaaggtccagcgttctc	. o
600	tcctga	o
601	tcaacgtt	o
602	aacgtt	o
603	aacgttga	o
604	tcacgctaacctctagc	o
605	gagaacgctggaccttgcat	o
606	gctggaccttccat	o
607	gagaacgctggacctcatccat	o
608	gagaacgctggacgctcatccat	o
609	aacgttgaggggcat	o
610	atgcccctcaacgtt	o
611	tcaacgttga	o
612	gctggaccttccat	o
613	caacgtt	o
614	acaacgttga	o
615	tcacgt	o
616	tcaagctt	o
617	tcgtca	o
618	aggatatc	o
619	tagacgtc	o
620	gacgtcat	o
621	ccatcgat	o
622	atcgatgt	o
623	atgcatgt	o
624	ccatgcat	o
625	agcgctga	o
626	tcagcgct	o
627	ccttcgat	o
628	gtgccggggtctccgggc	s
629	gctgtggggcggctcctg	s
630	btcaacgtt	o
631	ftcaacgtt	o
632	faacgttga	o
633	tcaacgt	s
634	aacgttg	s
635	cgacga	o
636	tcaacgtt	o
637	tcgga	o
638	agaacgtt	o

• « • ···

639	tcatcgat	O
640	taaacgtt	s
64 I	ccaacgtt	s
642	gctcga	s
643	cgacgt	s
64 4	cgtcgt	s
645	acgtgt	s
64 6	cgttcg	s
647	gagcaagctqgaccttccat	s
648	cgcgta	s
649	cgtacg	s
650	tcaccggt	s
651	caagagatgctaacaatgca	s
652	acccatcaatagctctgtgc	s
653	ccatcgat	o
654	tcgacgtc	o
655	ctagcgct	o
656	taagcgct	o
657	tcgcgaattcgcg	o
658	atggaaggtccagcgttct	o
659	actggacgttagcgtga	o
660	cgcctggggctggtctgg	o
661	gtgtcggggtctccgggc	o
662	gtgccggggtctccgggc	o
663	cgccgtcgcggcggttgg	o
664	gaagttcacgttgaggggcat	o
665	atctggtgagggcaagctatg	s
666	gttgaaacccgagaacatcat	s
667	gcaacgtt	o
668	gtaacgtt	o
669	cgaacgtt	o
670	gaaacgtt	o
671	caaacgtt	o
672	ctaacgtt	o
673	ggaacgtt	o
674	tgaacgtt	o
675	acaacgtt	o
676	ttaacgtt	o
677	aaaacgtt	0
678	ataacgtt	o
679	aacgttct	o
680	tccgatcg	o
681	tccgtacg	o
682	gctagacgctagcgtga	o
683	gagaacgctggacctcatcatccat	o
684	gagaacgctagaccttctat	o
685	actagacgttagtgtga	o
686	cacaccttggtcaatgtcacgt	o
687	tctccatcctatggttttatcg	o
688	cgctggaccttccat	o
689	caccaccttggtcaatgtcacgt	o

690	gctagacgttagctgga	o
691	agtgcgattgcagatcg	O
692	ttttcgttttgtggttttgtggtt
693	ttttcgtttgtcgttttgtcgtt
694	tttttgttttgtggttttgtggtt
695	accgcatggattctaggcca	s
696	gctagacgttagcgt	o
697	aacgctggaccttccat	o
698	tcaazgtt	o
699	ccttcgat	o
700	actagacgttagtgtga	s
701	gctagaggttagcgtga	s
702	atggactctccagcgttctc	o
703	atcgactctcgagcgttctc	o
704	gctagacgttagc	o
705	gctagacgt	o
706	agtgcgattcgagatcg	o
707	tcagzgct	o
708	ctgattgctctctcgtga	o
709	tzaacgtt	o
710	gagaazgctggaccttccat	o
711	gctagacgttaggctga	o
712	gctacttagcgtga	o
713	gctaccttagcgtga	o
714	atcgacttcgagcgttctc	o
715	atgcactctgcagcgttctc	o
716	agtgactctccagcgttctc	o
717	gccagatgttagctgga	o
718	atcgactcgagcgttctc	o
719	atcgatcgagcgttctc	o
720	bgagaacgctcgaccttcgat	o
721	gctagacgttagctgga	sos
722	atcgactctcgagcgttctc	sos
723	tagacgttagcgtga	o
724	cgactctcgagcgttctc	o
725	ggggtcgaccttggagggggg	sos
726	gctaacgttagcgtga	o
727	cgtcgtcgt	o
728	gagaacgctggaczttccat	o
729	atcgacctacgtgcgttztc	o
730	atzgacctacgtgcgttctc	o
731	gctagazgttagcgt	o
732	atcgactctcgagzgttctc	o
733	ggggtaatgcatcagggggg	sos
734	ggctgtattcctgactgccc	s
735	ccatgctaacctctagc	o
736	gctagatgttagcgtga	o
737	cgtaccttacggtga	o
738	tccatgctggtcctgatgct	o
739	atcgactctctcgagcgttctc	o
740	gctagagcttagcgtga	o

• 4« · · 44

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 444

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 • 44 *4 44 · 4

4

4444

4

741	atcgactctcgagtgttctc	O
7 4 2	aacgctcgaccttcgat	o
74 Ξ	ctcaacgctggaccttccat	o
74-.	atcgacctacgtgcgttctc	o
74;	gagaatgctggaccttccat	o
74 6	tcacgctaacctctgac	o
74'	bgagaacgctccagcactgat	o
74 S	bgagcaagctggaccttccat	o
745	cgctagaggttagcgtga	o
75C	gctagatgttaacgt	o
752	atggaaggtccacgttctc	o
752	gctagatgttagcgt	o
752	gctagacgttagtgt	o
754	tccatgacggtcctgatgct	o
752	tccatggcggtcctgatgct	o
756	gctagacgatagcgt	o
757	gctagtcgatagcgt	o
756	tccatgacgttcctgatgct	o
755	tccatgtcgttcctgatgct	o
760	gctagacgttagzgt	o
7 61	gctaggcgttagcgt	o
7 62	tccatgtzggtcctgatgct	o
762	tccatgtcggtzctgatgct	o
764	atzgactctzgagzgttctc	o
7 65	atggaaggtccagtgttctc	o
766	gcatgacgttgagct	o
767	ggggtcaacgttgagggggg	s
768	ggggtcaagtctgagggggg	sos
765	cgcgcgcgcgcgcgcgcgcg	o
770	cccccccccccccccccccqcccccccč	s
771	ccccccccccccccccccccccccccccccccccc	s
772	tccatgtcgctcctgatcct	o
773	gctaaacgttagcgt	o
774	tccatgtcgatcctgatgct	o
775	tccatgccggtcctgatgct	o
776	aaaatcaacgttgaaaaaaa	sos
777	tccataacgttcctgatgct	o
776	tggaggtcccaccgagatcggag	o
775	cgtcgtcgtcgtcgtcgtcgt	s
78C	ctgctgctgctgctgctgctg	s
781	gagaacgctccgaccttcgat	s
782	gctagatgttagcgt	s
782	gcatgacgttgagct	s
784	tcaatgctgaf	o
7 85	tcaacgttgaf	o
786	tcaacgttgab	0
787	gcaatattgcb	o
786	gcaatattgcf	o
785	agttgcaact	o
7 90	tcttcgaa	o
791	tcaacgtc	o

• ·· *7		9	• v •		M· •	·· »	•	»· « ·
• ·		•	•	•	• ·»	•	•	«
• i		•	•	•	• »	•	•	•
·· ·	··		« fc		··	··		····

792	ccatgtcggtcctgatgct	o
793	gtttttatataatttggg	O
794	tttttgtttgtcgttttgtcgtt	o
795	ttggggggggtt	s
796	ggggttgggggtt	s
797	ggtggtgtaggttttgg	o
798	bgagaazgctcgaccttcgat	o
799	tcaacgttaacgttaacgtt	o
800	bgagcaagztggaccttccat	o
801	bgagaazgctccagcactgat	o
802	tcaazgttgax	o
803	gzaatattgcx	o
804	tgctgcttttgtcgttttgtgctt	o
805	ctgcgttagcaatttaactgtg	o
806	tccatgacgttcctgatgct	s
807	tgcatgccgtgcatccgtacacagctct	5
808	tgcatgccgtacacagctct	5
809	tgcatcagctct	S
810	tgcgctct	s
811	cccccccccccccccccccc	s
812	cccccccccccc	s
813	cccccccc	s
814	tgcatcagctct	sos
815	tgcatgccgtacacagctct	o
816	gagcaagctggaccttccat	s
817	tcaacgttaacgttaacgttaacgttaacgtt	s
818	gagaacgctcgaccttcgat	s
819	gtccccatttcccagaggaggaaat	o
820	ctagcggctgacgtcatcaagctag	o
821	ctagcttgatgacgtcagccgctag	o
822	cggctgacgtcatcaa	s
823	ctgacgtg	o
824	ctgacgtcat	o
825	attcgatcggggcggggcgag	o
826	ctcgccccgccccgatcgaat	o
827	gactgacgtcagcgt	o
828	ctagcggctgacgtcataaagctagc	s
829	ctagctttatgacgtcagccgctagc	s
830	ctagcggctgagctcataaagctagc	s
831	ctagtggctgacgtcatcaagctag	s
832	tccaccacgtggtctatgct	s
833	gggaatgaaagattttattataag	o
834	tctaaaaaccatctattcttaaccct	o
835	agctcaacgtcatgc	o
836	ttaacggtggtagcggtattggtc	o
837	ttaagaccaataccgctaccaccg	o
838	gatctagtgatgagtcagccggatc	o
839	gatccggctgactcatcactagatc	o
840	tccaagacgttcctgatgct	o
841	tccatgacgtccctgatgct	o
842	tccaccacgtggctgatgct	o

843	ccacgtggacctctagc	O
844	tcagaccacgtggtcgggtgttcctga	o
845	tcaggaacacccgaccacgtggtctga	o
846	catttccacgatttccca	o
847	ttcctctctgcaagagact	o
848	tgtatctctctgaaggact	o
849	ataaagcgaaactagcagcagtttc	o
350	gaaactgctgctagtttcgctttat	o
851	tgcccaaagaggaaaatttgtttcatacag	o
852	ctgtatgaaacaaattttcctctttgggca	o
853	ttagggttagggttagggtt	ss
854	tccatgagcttcctgatgct	ss
855	aaaacatgacgttcaaaaaa	ss
856	aaaacatgacgttcgggggg	ss
857	gaggcatgagcttcgggggg	sos
858	ctaagctgacgtcatcaagctagt	o
859	tctgacgtcatctgacgttggctgacgtct	o
8 60	ggaattagtaatagatatagaagtt	o
861	tttaccttttataaacataactaaaacaaa	o
862	gcgtttttttttgcg	s
8 63	atatctaatcaaaacattaacaaa	o
864	tctatcccaggtggttcctgttag	o
865	btccatgacgttcctgatgct	o
866	btccatgagcttcctgatgct	o
867	tttttttttttttf	o
868	tttttttttttttf	so
869	ctagcttgatgagctcagccgctag	o
870	ttcagttgtcttgctgcttagctaa	o
871	tccatgagcttcctgagtct	s
872	ctagcggctgacgtcatcaatctag	o
873	tgctagctgtgcctgtacct	s
874	atgctaaaggacgtcacattgca	o
875	tgcaatgtgacgtcctttagcat	o
876	gtaggggactttccgagctcgagatcctatg	o
877 .	cataggatctcgagctcggaaagtcccctac	o
878	ctgtcaggaactgcaggtaagg	o
879	cataacataggaatatttactcctcgc	o
880	ctccagctccaagaaaggacg	o
881	gaagtttctggtaagtcttcg	o
882	tgctgcttttgtgcttttgtgctt	s
883	tcgtcgttttgtggttttgtggtt	s
884	tcgtcgtttgtcgttttgtcgtt	s
885	tcctgacgttcggcgcgcgccc	s
886	tgctgcttttgtgcttttgtgctt
887	tccatgagcttcctgagctt	s
888	tcgtcgtttcgtcgttttgacgtt	s
88 9	tcgtcgtttgcgtgcgtttcgtcgtt	s
890	tcgcgtgcgttttgtcgttttgacgtt	Ξ
891	t tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt	s
892	tcctgacgggaaagt	S
893	tcctggcgtggaagt	s

.71

894	tcctggcggtgaagt	s
895	tcctggcgttgaagt	s
896	tcctgacgtggaagt	s
897	gcgacgtt cggcgcgcgccc	s
898	gcgacgggcggcgcgcgccc	s
899	gcggcgtgcggcgcgcgccc	s
900	gcggcggtcggcgcgcgccc	s
901	gcgacggtcggcgcgcgccc	s
902	gcggcgťtcggcgcgcgccc	s
903	gcgacgtgcggcgcgcgccc	s
904	tcgtcgctgtctccg	s
905	tgtgggggttttggttttgg	s
906	aggggaggggaggggagggg	s
907	tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt	s
908	ctctctctctctctctctctct	chimeric
909	ggggtcgacgtcgagggggg	s
910	atatatatatatatatatatat	s
911	ttttttttttttttttttttttttttt	s
912	ttttttttttttttttttttt	s
913	tttttttttttttttttt	s
914	gctagaggggagggt
915	gctagatgttagggg
916	gcatgagggggagct
917	atggaaggtccagggggctc
918	atggactctggagggggctc
919	atggaaggtccaaggggctc
920	gagaaggggggaccttggat
921	gagaaggggggaccttccat
922	gagaaggggccagcactgat
923	tccatgtggggcctgatgct
924	t ccatgaggggcct gatgct
925	tccatgtggggcctgctgat
926	atggactctccggggttctc
927	atggaaggtccggggttctc
928	atggactctggaggggtctc
929	atggaggctccatggggctc
930	atggactctggggggttctc
931	tccatgtgggtggggatgct
932	tccatgcgggtggggatgct
933	t ccatgggggtcctgatgct
934	tccatggggtccctgatgct
935	tccatggggtgcctgatgct
936	tccatggggttcctgatgct
937	tccatcgggggcctgatgct
938	gctagagggagtgt
939	tttttttttttttttttt	s
940	gmggtcaacgttgagggmggg	s
941	ggggagttcgttgaggggggg	s
942	tcgtcgtttccccccccccc	s
943	ttggggggttttttttttttttttt	s
944	tttaaattttaaaatttaaaata	s

94 5	ttggtttttttggtttttttttgg	s
946	tttcccttttccccttttcccctc	s
947	ggggtcatcgatgagggggg s	sos
948	tccatgacgttcctgacgtt
949	tccatgacgttcctgacgtt
950	tccatgacgttcctgacgtt
951	tccatgacgttcctgacgtt
952	tccatgacgttcctgacgtt
953	tccatgacgttcctgacgtt
954	tccatgacgttcctgacgtt
955	tccatgacgttcctgacgtt
956	tccatgacgttcctgacgtt
957	tccatgacgttcctgacgtt
958	tccatgacgttcctgacgtt
959	gggggacgatcgtcggggg	sos
960	gggggtcgtacgacgggggg	sos
961	tttttttttttttttttttttttt	Po
962	aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa	po
963	cccccccccccccccccccccccc	po
964	tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt
965	tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt
966	tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt
967	tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt
968	ggggtcaacgttgagggggg
969	ggggtcaacgttgagggggg
970	ggggtcaagcttgagggggg
971	tgctgcttcccccccccccc
972	ggggacgtcgacgtgggggg	sos
973	ggggtcgtcgacgagggggg-	sos
974	ggggtcgacgtacgtcgagggggg	sos
975	ggggaccggtaccggtgggggg	sos
97 6	gggtcgacgtcgagggggg	sos
977	ggggtcgacgtcgaggggg	sos
978	ggggaacgttaacgttgggggg	sos
979	ggggtcaccggtgagggggg	sos
980	ggggtcgttcgaacgagggggg	sos
981	ggggacgttcgaacgtgggggg	sos
982	tcaactttga	s
983	tcaagcttga	s
984	tcacgatcgtga	s
985	tcagcatgctga	s
986	gggggagcatgctggggggg	sos
987	gggggggggggggggggggg	sos
988	gggggacgatatcgtcgggggg	sos
989	gggggacgacgtcgtcgggagg	sos
390	gggggacgagctcgtcgggggg	sos
991	gggggacgtacgtcgggggg	sos
992	tcaacgtt
393	tccataccggtcctgatgct
994	tccataccggtcctaccggt	s

• * • ·

I» · · ·

995	gggggacgatcgttgggggg	sos
996	ggggaacgatcgtcgggggg	sos
997	ggg ggg acg atc gtc ggg ggg	SOS
998	999 gga ega tcg tcg ggg ggg	sos
999	aaa gac gtt aaa	Po
1000	aaagagcttaaa	po
1001	aaagazgttaaa	PO
1002	aaattcggaaaa	PO
1003	gggggtcatcgatgagggggg	sos
1004	gggggtcaacgttgagggggg	sos
1005	atgtagcttaataacaaagc	po
1006	ggatcccttgagttacttct	po
1007	ccattccacttctgattacc	Po
1008	tatgtattatcatgtagata	PO
1009	agcctacgtattcaccctcc	po
1010	ttcctgcaactactattgta	Po
1011	atagaaggccctacaccagt	PO
1012	ttacaccggtctatggaggt	Po
1013	ctaaccagatcaagtctagg	Po
1014	cctagacttgatctggttag	Po
1015	tataagcctcgtccgacatg	PO
1016	catgtcggacgaggcttata	PO
1017	tggtggtggggagtaagctc	PO
1018	gagctactcccccaccacca	Po
. 1019	gccttcgatcttcgttggga	PO
1020	tggacttctctttgccgtct	PO
1021	atgctgtagcccagcgataa	po
1022	accgaatcagcggaaagtga	PO
1023	tccatgacgttcctgacgtt
1024	ggagaaacccatgagctcatctgg
1025	accacagaccagcaggcaga
1026	gagcgtgaactgcgcgaaga
1027	tcggtacccttgcagcggtt
1028	ctggagccctagccaaggat
1029	gcgactccatcaccagcgat
1030	cctgaagtaagaaccagatgt
1031	ctgtgttatctgacatacacc
1032	aattagccttaggtgattggg
1033	acatctggttcttacttcagg
1034	ataagtcatattttgggaactac
1035	cccaatcacctaaggctaatt
1036	ggggtcgtcgacgagggggg	sos
1037	ggggtcgttcgaacgagggggg	sos
1038	ggggacgttcgaacgtgggggg	sos
1039	tcctggcgqggaagt	s
1040	ggggaacgacgtcgttgggggg	sos
1041	ggggaacgtacgtcgggggg	sos
1042	ggggaacgtacgtacgttgggggg	sos
1043	ggggtcaccggtgagggggg	sos

L04 4	goggtcgacgtacgtcgagggggg	sos
104 5	ggggaccggtaccggtgggggg	sos
104 6	gggtcgacgtcgagggggg	sos
1047	ggggtcgacgtcgagggg	sos
1048	ggggaacgttaacgttgggggg	sos
:049	ggggacgtcgacgtggggg	sos
1050	gcactcttcgaagctacagccggcagcctctgat
1051	cggctcttccatgaggtctttgctaatcttgg
1052	cggctcttccatgaaagtctttggacgatgtgagc
1053	tcctgcaggttaagt	s
1054	gggggtcgttcgttgggggg	sos
1055	gggggatgattgttgggggg	sos
-.056	gggggazgatzgttgggggg	sos
1051	gggggagctagcttgggggg	sos
1058	ggttcttttggtccttgtct	s
1059	ggttcttttggtcctcgtct	s
1060	ggttcttttggtccttatct	s
1061	ggttcttggtttccttgtct	s
1062	tggtcttttggtccttgtct	s
1063	ggttcaaatggtccttgtct	5
064	gggtcttttgggccttgtct	S
1065	tccaggacttctctcaggtttttt	S
1066	tccaaaacttctctcaaatt	s
1067	tactacttttatacttttatactt	s
1068	tgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtg	s
1069	ttgttgttgttgtttgttgttgttg	s
1070	ggctccggggagggaatttttgtctat	s
1071	gggacgatcgtcggggggg	sos
1072	gggtcgtcgacgaggggggg	sos
1073	ggtcgtcgacgaggggggg	sos
1074	gggtcgtcgtcgtggggggg	sos
1075	ggggacgatcgtcggggggg	sos
1076	ggggacgtcgtcgtgggggg	sos
1077	ggggtcgacgtcgacgtcgaggggggg	sos
1078	ggggaaccgcggttggggggg	sos
1079	ggggacgacgtcgtggggggg	sos
1080	tcgtcgtcgtcgtcgtggggggg	sos
1081	tcctgccggggaagt	s
1082	tcctgcaggggaagt	s
1083	tcctgaaggggaagt	s
1084	tcctggcgggcaagt	s
1085	tcctggcgggtaagt	s
1086	tcctggcgggaaagt	s
1087	tccgggcggggaagt	s
1088	tcggggcggggaagt	s
1089	tcccggcggggaagt	s
1090	gagggacgttggggg	s
1091	gaggttttttttttgggggg	sos
1092	ggggccccccccccgggggg	sos

1093	ggggttgttgttgttgggggg	Sos
1094	tttttttttttttttttttttttttttttt
1095	aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
1096	cccccccccccccccccccccccccccccc
1097	cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcg

Ačkoliv jsou efekty CpG u myší dobře charakterizovány, informace týkající se člověka jsou omezené. CpG fosforothioátové oligonukleotidy se silnou imunostimulační aktivitou v myším systému vykazují nižší aktivitu u lidských a jiných než hlodavčích imunitních buněk. V příkladech vynálezu je popsán vývoj účinného lidského CpG motivu a charakterizace jeho účinků a mechanismů účinku na lidské primární Blymfocyty. DNA obsahující tento CpG motiv silně stimuluje primární lidské B-lymfocyty k proliferaci, produkci IL-6 a expresi zvýšených množství CD86, CD40, CD54 a MHCII. Zvyšuje DNA vazebnou aktivitu transkripčních faktorů NFKB a AP-1, stejně jako fosforylaci stresem aktivovaných protein-kinas JNK a p38, a transkripčního faktoru ATF-2. B-lymfocytární signalizační dráhy aktivované CpG DNA byly odlišné od drah aktivovaných receptorem B-lymfocytů, který aktivuje ERK a různé izoformy JNK, ale který neaktivuje p38 a ATF-2. Obecně jsou data týkající se přenosu signálu iniciovaného CpG DNA v souladu s daty získanými u myší (Hacker, H. et al., 1998, EMBO J., 17: 6230, Yi A.K. a Krieg A.M., 1998, J. Immunol.

161: 4493).

Výhodným nehlodavčím motivem je 5'-TCGTCGTT-3'. Výměny baží v nej účine jším 8-merovém CpG motivu (5'-TCGTCGTT-3') snižovaly aktivitu oligonukleotidu. Thymidiny v 5' a 3' pozicích tohoto motivu byly důležitější než thymidin ve střední pozici. Adenin a guanosin ve střední pozici snižovaly aktivitu.

Naše pokusy prokázaly, že jeden lidský CpG motiv ve • ·· · · · · ·· ·· qf. ······· · · · · • to ··· ·· · ·· · · ··· to··· ··· ··· ·· ·· ·· «· ···· fosfodiesterovém oligonukleotidu (2080) je dostatečný pro produkci maximálního účinku, a že další CpG motivy (2059) nezvyšují dále tuto aktivitu. Oligonukleotid s 8-merovým motivem 5'-TCGTCGTT-3' (2080) obsahujícím dva CpG dinukleotidy měl v pokusech nejvyšší aktivitu. Substituce baží sousedících s dvěma CpG dinukleotidy (5' pozice, střední pozice, 3' pozice) snižovala aktivitu této sekvence. Oba CpG dinukleotidy v 8merovém CpG motivu byly nutné pro optimální aktivitu (2108,

2106). Methylace cytidinu CpG dinukleotidů (2095) rušila aktivitu 2080, zatímco methylace nepříbuzného cytidinu (2094) nikoliv. Přidání dvou CpG motivů do sekvence 2080 nevedlo v sekvenci 2059 k dalšímu zvýšení aktivity fosfodiesterového oligonukleotidu. Sekvence 2080 s fosforothioátovým skeletem (2116) měla menší aktivitu, což naznačuje, že další CpG motivy jsou výhodné pro účinný fosforothioátový oligonukleotid.

V předkládaném vynálezu bylo zjištěno, že imunostimulační nukleové kyseliny mají dramatický imunostimulační účinek na lidské buňky, jako jsou NK buňky, B-lymfocyty a DC, in vitro.

Bylo prokázáno, že použité testy in vitro určují in vivo účinnost jako vakcinačního adjuvans u obratlovců jiných než hlodavců (příklad 12), což naznačuje, že imunostimulační nukleové kyseliny jsou účinným terapeutickým činidlem pro vakcinaci u člověka, v nádorové imunoterapii, imunoterapii asthmatu, celkovém posílení imunitní reakce, regeneraci hematopoesy po radiaci nebo chemoterapii a v jiných ímunomodulačních aplikacích.

Tak jsou imunostimulační nukleové kyseliny použitelné v některých aspektech vynálezu jako profylaktické vakcina pro léčbu jedinců s rizikem vzniku infekce infekčním organismem nebo s rizikem vzniku nádoru, u kterého byl identifikován specifický nádorový antigen, nebo alergie nebo asthmatu, u

·· ·· • · · · · · ·

9 99 9999 kterých je znám alergen nebo predispozice k asthmatu. Imunostimulační nukleové kyseliny mohou být také podávány bez antigenů nebo alergenu pro krátkodobější ochranu před infekcí, alergií nebo nádory, a v tomto případě umožní opakované dávky dlouhodobější ochranu. Jako rizikový jedinci jsou zde označováni jedinci s jakýmkoliv rizikem vzniku infekce patogenem nebo nádoru nebo expozice alergenu. Například může být rizikovým jedincem ten, který plánuje cestu do oblastí, kde se vyskytuje infekční agens, nebo jedinec, který je díky svému životnímu stylu nebo lékařským zákrokům vystaven působení kapalin, které mohou obsahovat infekční organismy, nebo přímo organismům, nebo také jedinec, který žije v oblasti, ve které se vyskytují infekční organismy nebo alergeny. Mezi jedince s rizikem infekce také patří obecná populace, které zdravotnické organizace doporučují vakcinaci antigenem konkrétního infekčního organismu. Pokud je antigenem alergen a u jedince se vyvíjí alergická reakce na tento konkrétní antigen a jedinec může být vystaven působení antigenů, například během pylové sezóny, tak je tento jedinec rizikový z hlediska expozice antigenů. Mezi jedince rizikové z hlediska vzniku alergie nebo asthmatu patří jedinci, u kterých byla identifikována alergie nebo asthma, ale kteří nemají aktivní onemocnění během léčby imunostimulačními nukleovými kyselinami, stejně jako jedinci, kteří jsou považováni za rizikové z hlediska vzniku těchto onemocnění z důvodů genetických faktorů nebo faktorů prostředí.

Jedinci rizikový z hlediska vzniku nádorů jsou ti, kteří mají vysokou pravděpodobnost vzniku nádorů. Mezi takové jedince patří například, jedinci s genetickou abnormalitou, u které bylo prokázáno, že koreluje s vyšší pravděpodobností vzniku nádorů, a jedinci vystavení působení látek způsobujících nádory, jako je tabák, azbest nebo jiné chemické toxiny, nebo jedinci, kteří byly dříve léčení pro nádory a jsou v remisi. Když je jedinec rizikový z hlediska vzniku nádoru léčen antigenem specifickým pro určitý typ nádoru, pro který má jedinec vyšší riziko, a imunostimulační nukleovou kyselinou, tak může být schopen zabíjet nádorové buňky hned po jejich vzniku. Když se u jedince začíná tvořit nádor, tak se u jedince vyvíjí specifická imunitní reakce proti nádorovému antigenu.

Kromě použití imunostimulačních nukleových kyselin pro profylaktickou léčbu zahrnuje předkládaný vynález také použití imunostimulačních nukleových kyselin pro léčbu jedince s infekcí, alergií, asthmatem nebo nádorem.

Jedincem s infekcí je jedinec, který byl vystaven působení infekčního patogenu a který má akutně nebo chronicky detekovatelné hladiny patogenu v těle. Imunostimulační nukleové kyseliny mohou být použity s antigenem pro vyvolání systémové nebo slizniční imunitní reakce specifické pro antigen, která je schopna redukovat množství nebo eradikovat infekční patogen. Infekční onemocnění je onemocnění vznikající v důsledku přítomnosti cizorodého mikroorganismu v těle. Je důležité vyvinout účinné vakcinační strategie a léčby pro ochranu sliznic těla, které jsou primárním místem průniku patogenu.

Jedincem s alergií je takový jedinec, u kterého je riziko alergické reakce v odpovědi na alergen. Alergie je získaná hypersensitivita na substanci (alergen). Alergickými onemocněními jsou, například, ekzém, alergická rhinitis nebo koryza, senná rýma, konjunktivitida, bronchiální asthma, urtikarie a potravinové alergie, a jiná atopická onemocnění.

• · • · ··

V současné době jsou alergické nemoci obvykle léčeny injekcí malých dávek antigenů, po kterých následuje postupné zvyšování dávek antigenů. Předpokládá se, že tento postup indukuje vznik tolerance na antigen a brání dalším alergickým reakcím. U těchto metod může však trvat několik let, než začnou být účinné a jsou asociované s vedlejšími účinky, jako je anafylaktický šok. Způsoby podle předkládaného vynálezu eliminují tyto problémy.

Alergie jsou obvykle způsobeny tvorbou IgE protilátek proti škodlivým alergenům. Cytokiny, které jsou indukovány systémovým nebo slizničním podáním imunostimulační nukleové kyseliny, jsou především třídy Thl (příklady jsou IL-12 a IFNγ) a tyto cytokiny indukují jak protilátkovou, tak buněčnou imunitní reakci. Typy protilátek asociovaných s Thl reakcí jsou obvykle více protektivní, protože mají vysoké neutralizační a opsonizační schopnosti. Dalším hlavním typem imunitní reakce, která je asociovaná s produkcí IL-4, IL-5 a IL-10 cytokinů, je Th-2 imunitní reakce. Th2 reakce je především protilátková reakce a tyto protilátky mají méně protektivní účinky proti infekci a některé Th2 izotypy (například IgE) jsou asociované s alergií, obecně se zdá, že alergická onemocnění jsou asociovaná s Th2 imunitní reakcí, zatímco Thl imunitní reakce poskytuje nej lepší ochranu proti infekci, ačkoliv je nadměrná Thl odpověď asociovaná s autoimunitním onemocněním. Z důvodu schopnosti imunostimulační nukleové kyseliny posunout imunitní odpověď u jedince z Th2 (která je asociovaná s produkcí IgE protilátek a alergií) k Thl reakci (která je protektivní před alergickými reakcemi), může být dávka imunostimulační nukleové kyseliny účinná pro indukci imunitní reakce podána jedinci pro léčbu nebo prevenci alergie.

• ·» *· ·· ·· ·» • * · · · · · · · · « • 99 9 9 999 9 9 ·

Tak mohou mít imunostimulační nukleové kyseliny významné terapeutické použití při léčbě alergických a nealergických onemocnění, jako je asthma. Th2 cytokiny, zejména IL-4 a IL-5, jsou elevovány v dýchacích cestách asthmatiků. Tyto cytokiny způsobují významné příznaky asthmatické zánětlivé reakce, včetně přesmyku na IgE izotyp, chemotaxe eosinofilů a aktivace a růstu žírných buněk. Thl cytokiny, zejména IFN-γ a IL-12, mohou potlačovat tvorbu Th2 klonů a produkci Th2 cytokinů. Asthma označuje onemocnění respiračního systému charakterizované zánětem, zúžením dýchacích cest a zvýšenou reaktivitou dýchacích cest na inhalované látky. Asthma je často, ačkoliv ne vždy, asociované s atopickými nebo alergickými příznaky.

Jedinci s nádorem jsou jedinci s detekovatelnými nádorovými buňkami. Nádorem může být maligní nebo nemaligní nádor. Mezi nádory patří, například, nádory žlučových cest; nádory mozku; nádory prsu; nádory čípku děložního; choriokarcinom; nádory tlustého střeva; nádory endometria; nádory jícnu; nádory žaludku; intraepitělové neoplasie; lymfomy; nádory jater; nádory plic (například malobuněčný a nemalobuněčný karcinom); melanom; neuroblastom; nádory dutiny ústní; nádory ovaria; nádory slinivky břišní; nádory prostaty; nádory rekta; sarkomy; nádory kůže; testikulární nádory; nádory štítné žlázy; a nádory ledvin; stejně jako jiné karcinomy a sarkomy.

V jednom provedení je nádorem vlasatobuněčná leukemie, chronická myeloidní leukemie, kožní T-lymfocytární leukemie, folikulární lymfom, maligní melanom, spinocelulární karcinom, karcinom ledvin, karcinom prostaty, karcinom močového měchýře nebo karcinom tlustého střeva.

Jedinci podle předkládaného vynálezu jsou jedinci jiní než hlodavci. Jedinec jiný než hlodavec je člověk nebo obratlovec,

A »* »« AA *A ·Α ···· · · · 9 9 9 9

9 9 9 9 999 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 »9 99 ·*. 99 9999 jako například pes, kočka, kůň, kráva, prase, ovce, koza, kuře, primát, například opice, a ryba (užitkové druhy), například losos, ale ne hlodavec, jako je myš nebo krysa.

Tak může být předkládaný vynález také použit pro léčbu nádorů u živočichů jiných než člověk. Nádory jsou jednou z hlavních příčin úmrtí domácích zvířat (tj. koček a psů).

Nádory obvykle postihují starší zvířata, která se, v případě domácích mazlíčků, integrovala do rodiny. 45% psů starších 10 let pravděpodobně podlehne tomuto onemocnění. Nej častější léčbou je chirurgická léčba, chemoterapie a radioterapie. Mezi další léčebné modality, které jsou používané s určitými úspěchy, patří laserová terapie, kryoterapie, hypertermie a imunoterapie. Volba léčby závisí na typu nádorů a na stupni disseminace. Pokud není maligní nádor omezen na jedinou oblast v těle, je obtížné odstranit pouze maligní tkáň bez postižení normálních buněk.

Maligními onemocněními běžně diagnostikovanými u psů a koček jsou lymfosarkom, osteosarkom, nádory mléčné žlázy, mastocytom, nádory mozku, melanom, adenoskvamozní karcinom, karcinoid plic, karcinom bronchiálních žlázek, bronchiolární karcinom, fibrom, myxochondrom, plicní sarkom, neurosarkom, osteom, papilom, retinoblastom, Ewingův sarkom, Wilmsův tumor, Burkittův lymfom, mikrogliom, neuroblastom, osteoklastom, orální neoplasie, fibrosarkom, osteosarkom a rhabdomyosarkom. mezi další neoplasie u psů patří genitální spinocelulární karcinom, přenosné venerální nádory, testikulární nádory, seminom, nádor ze Sertoliho buněk, hemangiopericytom, histiocytom, chlorom (granulocytární sarkom), korneální papilom, korneální spinocelulární karcinom, hemangiosarkom, pleurální mesoteliom, bazocelulární karcinom, thymom, nádory žaludku, karcinom nadledvin, orální papilomatosa,

99 »* 99 99 «φ

9 · 9 9* · 9 · « • · 9 9 » 99« 9 9 9 *9 *99 9« 999 9 9

999 9999 999 ·9· ·· 9· 99 99 9999 hemangioendoteliom a kystadenom. Mezi další malignity diagnostikované u koček patří folikulární lymfom, střevní lymfosarkom, fibrosarkom a plicní spinocelulární karcinom. U fretek, populárních domácích zvířat, často vzniká insulinom, lymfom, sarkom, neurinom, nádor z buněk pankreatických ostrůvků, žaludeční MALT lymfom a adenokarcinom žaludku.

Mezi malignity postihující zemědělská zvířata patří leukemie, hemangiopericytom a hovězí oční neoplasie (u dobytka); prepuciální fibrosarkom, ulcerosní spinocelulární karcinom, prepuciální karcinom, neoplasie pojivové tkáně a mastocytom (u koní); hepatocelulární karcinom (u prasat); lymfom a plicní adenomatosa (u ovcí); plicní sarkom, lymfom,

Rousův sarkom, retikuloendoteliosa, fibrosarkom, nefroblastom, B-lymfocytární lymfom a lymfoidní leukosa (u ptáků); retinoblastom, jaterní neoplasie, lynfosarkom (lymfoblastický lymfom), plasmatocytoidní leukemie a sarkom vzduchového měchýře (u ryb), kaseozní lymfadenitida (CLA): chronická, infekční, přenosná nemoc ovcí a koz způsobená bakterií Corynebacterium pseudotuberculosis, a nakažlivý plicní nádor ovcí způsobený jaagsiekte.

Jedinec je vystavený působení antigenu. Termín vystavený působení antigenu, jako je zde použit, označuje buď aktivní krok kontaktování jedince s antigenem, nebo pasivní expozici jedince antigenu in vivo. Způsoby pro aktivní expozici jedince antigenu jsou dobře známé v oboru. Obecně, antigen je podán přímo jedinci prostřednictvím intravenosního, intramuskulárního, orálního, transdermálního, slizničního, intranasálního, intratracheálního nebo podkožního podání.

Antigen může být podán systémově nebo lokálně. Způsoby pro podání antigenu a imunostimulační nukleové kyseliny jsou podrobněji popsány dále. Jedinec je pasivně exponován antigenu tehdy, když se antigen stane dostupným pro imunitní buňky v těle. Jedinec může být pasivně exponován antigenu například průnikem cizorodého antigenu do těla nebo vznikem nádorových buněk exprimujících cizorodé antigeny na svém povrchu.

Způsoby, ve kterých je jedinec pasivně exponován antigenu, mohou být závislé na načasování podání imunostimulační nukleové kyseliny. Například, u jedince, u kterého je riziko vzniku nádoru nebo infekčního onemocnění nebo alergické nebo asthmatické reakce, může být imunostimulační nukleová kyselina podávána pravidelně v době, kdy je riziko nejvyšší, tj. během alergické sezóny nebo po expozici látce způsobující nádory. Další imunostimulační nukleová kyselina může být podána turistům před cestou do cizích zemí, kde je riziko infekce infekčním agens. Obdobně může být imunostimulační nukleová kyselina podána vojákům nebo civilistům při riziku použití biologických zbraní za účelem indukce systémové nebo slizniční imunitní reakce na antigen a při a když je jedinec exponován antigenu.

Antigen je molekula schopná vyvolat imunitní reakci. Antigeny jsou například buňky, buněčné extrakty, proteiny, polypeptidy, peptidy, polysacharidy, polysacharidové konjugáty, peptidy a nepeptidové sloučeniny napodobující polysacharidy a jiné molekuly, malé molekuly, lipidy, glykolipidy, karbohydráty, viry a virové extrakty a mnohobuněčné organismy jako jsou parazity, a alergeny. Termín antigen zahrnuje jakoukoliv molekulu, která je rozpoznávána imunitním systémem hostitele jako cizorodá. Mezi antigeny patří nádorové antigeny, mikrobiální antigeny a alergeny.

Nádorový antigen je sloučenina, jako je peptid nebo protein, asociovaná s nádory nebo povrchem nádorů, která může • · • · • * vyvolat imunitní reakci, když je exprimována na povrchu buněk prezentujících antigen v asociaci s MHC molekulou. Nádorové antigeny mohou být připraveny z nádorových buněk buď přípravou surových extraktů nádorových buněk, jak je popsáno například v Cohen et al., 1994, Cancer Research, 54: 1055, nebo částečným přečištěním antigenů, rekombinantní syntézou nebo de novo syntézou známých antigenů. Mezi nádorové antigeny patří, například, antigeny, které jsou exprimovány rekombinantně, jejich imunogenní části nebo celé nádory. Takové antigeny mohou být isolovány nebo připraveny rekombinantně nebo jinými způsoby známými v oboru.

Mikrobiální antigen je antigen mikroorganismu jako je virus, bakterie, parazit nebo houba. Mezi takové antigeny patří intaktní mikroorganismy, stejně jako jejich přirozené izoláty a fragmenty a deriváty, a také syntetické sloučeniny, které jsou identické nebo podobné přirozeným mikrobiálním antigenům a indukují imunitní reakci specifickou pro tento mikroorganismus. Sloučenina je podobná přirozenému mikrobiálnímu antigenu, pokud indukuje imunitní reakci (humorální a/nebo buněčnou) k přirozenému mikrobiálnímu antigenu. Takové antigeny jsou v oboru běžně používány a jsou známé odborníkům v oboru.

Příklady virů, které byly zjištěny u člověka, jsou: Retroviridae (například viry lidské imunodeficience, jako je HIV-1 (též označovaný jako HTLV-III, LAV nebo HTLV-II/LAV, nebo HIV-III; a jiné izoláty, jako je HIV-LP; Picornaviridae (například polio viry, virus hepatitidy A; enteroviry, lidské Coxsackie viry, rhinoviry, echoviry); Calciviridae (například kmeny způsobující gastroenteritidu); Togaviridae (například viry koňské encefalitidy, viry zarděnek); Flaviridae (například viry horečky dengue, viry encefalitidy, viry žluté ft * · · · • · ·· · » zimnice); Coronoviridae (například coronaviry); Rhabdoviradae (například viry vesikulární stomatitidy, viry vztekliny); . Filoviridae (například virus ebola); Paramyxoviridae (například parainfluenzové viry, virus spalniček, virus příušnic, respiračně syncytiální virus); Orthomyxoviridae (například chřipkové viry); Bungaviridae (například Hantaan viry, bunga viry, phleboviry a Nairo viry); Arenaviridae (viry hemorhagické horečky); Reoviridae (například reoviry, orbiviry a rotaviry); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus hepatitidy B); Parvoviridae (parvoviry); Papovaviridae (papilloma viry, polyoma viry); Adenoviridae (většinou adenoviry);

Herpesviridae (herpes simplex virus (HSV) 1 a 2, virus varicella zoster, cytomegalovirus (CMV), herpes virus; Poxviridae (variola viry, viry vakcinie, pox viry); a Iridoviridae (například virus africké prasečí horečky); a neklasifikované viry (například etiologické agens spongiformních encefalopatií, agens hepatitidy delta (předpokládá se, že se jedná o defektní satelit viru hepatitidy B), agens non-A, non-E hepatitidy (třídy 1 = přenosné vnitřně; třídy 2 = přenosné parenterálně (tj. Hepatitida C); Norwalk a příbuzné viry a astroviry).

Jak gram negativní, tak gram pozitivní bakterie působí jako antigeny u obratlovců. Mezi takové gram-pozitivní bakterie patří například Pasteurella species, Staphylococci species, a Streptococcus species. Mezi gram-negativní bakterie patří, například, Escherichia coli, Pseudomonas species a Salmonella species. Příklady infekčních bakterií jsou, například, Helicobacter pylori, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sp. (například M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus skupiny A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus skupiny B), Streptococcus (viridans),

Streptococcu^faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobní sp.), Streptococcus pneumoniae, patogenní

Campylobacter sp., Enterococcus sp. , Haemophilus influenzae,

Bacillus antracis, Corynebacterium diphtheriae,

Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira,

Rickettsia a Actinomyces israelli.

Příklady hub jsou Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans.

Mezi další infekční organismy (tj. prvoky) patří Plasmodium spp., jako je Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovále a Plasmodium vivax a Toxoplasma gondii.

Mezi krevní a/nebo tkáňové parazity patří Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmania spp., Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense a Trypanosoma rhodesiense (Africká spává nemoc), Trypanosoma cruzi (Chagasova nemoc) a Toxoplasma gondii.

Další relevantní mikroorganismy jsou popsány v literatuře, viz například C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, jejíž celý obsah je zde uveden jako odkaz. Ačkoliv se výše popsané mikrobiální antigeny týkají lidských onemocnění, je vynález také použitelný pro léčbu jiných obratlovců. U obratlovců jiných než je člověk se • · také mohou vyvinout infekce, které mohou být preventivně nebo kurativně léčeny imunostimulačními nukleovými kyselinami podle předkládaného vynálezu. Například, kromě léčby infekčních onemocnění u člověka jsou způsoby podle předkládaného vynálezu také použitelné pro léčbu infekcí u zvířat.

Termíny léčba, léčený, léčení, jak jsou zde použity s ohledem na infekční onemocnění, označují profylaktickou léčbu, která zvyšuje resistenci jedince (jedince rizikového z hlediska infekce) na infekci patogenem, nebo jinými slovy, které snižují pravděpodobnost, že se jedinec stane infikovaný patogenem, stejně jako léčbu jedince (infikovaného jedince, který byl infikován, za účelem redukce nebo eliminace infekce nebo za účelem její prevence.

Mnoho vakcín pro léčbu obratlovců jiných než je člověk je popsáno v Bennet, K. Compendium of Veterinary Products, 3. vydání, North American Compediums, Inc., 1995. Jak bylo uvedeno výše, mezi antigeny patří infekční mikroby, jako jsou viry, paraziti, bakterie a houby a jejich fragmenty, které jsou odvozené od přirozených zdrojů nebo synteticky. Mezi infekční viry pro obratlovce včetně člověka patří retroviry, RNA viry a DNA viry. tato skupina retrovirů zahrnuje jak jednoduché retroviry, tak komplexní retroviry. mezi jednoduché retroviry patří podskupina B retrovirů, podskupina C retrovirů a podskupina D retrovirů. Příkladem retrovirů podskupiny B je virus myšího mamárního tumoru (MMTV). Mezi retroviry typu C patří skupina A podskupiny C (jako je virus Rousova sarkomu (RSV), virus ptačí leukemie (ALV) a virus ptačí myeloblastosy (AMV)) a skupina B podskupiny C (jako je virus kočičí leukemie (FeLV), virus giboni leukemie (GALV), virus nekrosy sleziny (SNV), virus retikuloendoteliosy (RV) a virus opičího sarkomu (SSV) ) .Mezi retroviry typu D patří virus Mason-Pfizerovij opice • · · • * S · · · · ·· *·« ·· · · ·* * * (MPMV) a opičí retrovirus typu 1 (SRV-1). Mezi komplexní retroviry patří podskupiny lentivirů, viry T-lymfocytární leukemie a foamy viry. Mezi lentiviry patří HIV-1, ale též HIV-2, SIV, Visna virus, virus kočičí imunodeficience (FIV), a virus koňské infekční anemie (EIAV). Mezi viry T-lymfocytární leukemie patří HTLV-1. HTLV-II, virus opičí T-lymfocytární leukemie (STLV) a virus hovězí leukemie (BLV). Mezi foamy viry patři lidský foamy virus (HFV), opičí foamy virus (SFV) a hovězí foamy virus (BFV).

Příklady jiných RNA virů, které jsou antigeny u obratlovců, jsou například členové rodiny Reoviridae, včetně rodu Orthoreovirus (různé serotypy savčích a ptačích retrovirů), rod Orbivirus (Bluetongue virus, Eugenangee virus, Kemerovo virus, virus africké koňské nemoci a virus coloradské klíšťové horečky), kmen Rotavirus (lidský rotavirus, nebraský virus průjmu telat, opičí rotavirus, hovězí nebo ovčí rotavirus, ptačí rotavirus); rod Picornaviridae, včetně kmenu Enterovirus (poliovirus, Coxsackie virus A a B, enterocytopatický lidský orfan (ECHO) virus, virus hepatitidy A, opičí enteroviry, virus myší encefalomyelitidy (ΜΕ), poliovirus muris, hovězí enteroviry, prasečí enteroviry, kmen Cardiovirus (virus encefalomyokarditidy (EMC), Mengovirus), kmen Rhinovirus (lidské rhinoviry, včetně alespoň 113 subtypů; další rhinoviry), rod Apthovirus (slintavka a kulhavka (FMDV); čeleď Calciviridae, včetně viru vesikulárního exanthemu prasat, víru San Miguel lvounů, kočičího picornaviru a viru Norwalk; čeleď Togaviridae, včetně rodu Alphavirus (virus východní koňské encefalitidy, Semliki forest virus, Sindbis virus, Chikungunya virus, 0’Nyong-Nyong virus, Ross river virus, virus venezuelské koňské encefalitidy, virus západní koňské encefalitidy) , rodu Flavirius (virus žluté zimnice přenášený moskyty, virus horečky Dengue, virus japonské encefalitidy,

virus saintlouiské encefalitidy, virus Murray Valley encefalitidy, západonilský virus, Kunjin virus, virus středoevropské klíšťové encefalitidy, virus dálněvýchodní klíšťové encefalitidy, Kyasanur forest virus, Louping III virus, Powassan virus, virus Omské hemorrhagické horečky), rodu Rubivirus (Rubella virus), rodu Pestivirus (virus onemocnění sliznic, virus prasečí cholery, virus hraniční nemoci); čeleď Bunyaviridae, včetně rodu Bunyvirus {Bunyamwera a příbuzné viry, viry kalifornské encefalitidy), rodu Phlebovirus (virus sicilské horečky, virus Rift Valley horečky), rodu Nairovirus (virus krymské-konžské hemorhagické horečky, virus nairobské nemoci ovcí) a rodu Uukuvirus (Uukuniemi a příbuzné viry); čeleď Orthomyxoviridae, včetně rodu Influenza viru (Influenza virus typu A, mnoho lidských subtypů); virus prasečí chřipky, a viry ptačí a koňské chřipky; influenza typu B (mnoho lidských subtypů), a influenza typu C (možná samostatný rod); čeleď

Paramyxoviridae, včetně rodu Paramyxovirus (parainfluenza virus typu I, Sendai virus, hemadsorpční virus, Parainfluenza viry typu 2 až 5, virus Newcastelské nemoci, virus příušnic), rodu Morbillivirus (spalničkový virus, virus subakutní sklerozující panencefalitidy, virus psinky, Rinderpest virus), rodu Pneumovirus (respiračně syncytiální virus (RSV), hovězí respiračně syncytiální virus a Pneumonia virus); čeleď Rhabdoviridae, včetně rodu Vesiculovirus (VSV), Chandipura virus, Flanders-Hart Park virus), rodu Lyssavirus (virus vztekliny), rybí Rhabdoviry a dva pravděpodobné Rhabdoviry (Marburg virus a Ebola virus); čeleď Arenaviridae, včetně viru lymfocytární choriomeningitidy (LCM), komplexu Tacaribe viru a viru Lassa; čeleď Coronoaviridae, včetně viru infekční bronchitidy (IBV), viru hepatitidy, lidského enterálního koronaviru a viru kočičí infekční peritonitidy (kočičí koronavirus).

• * ♦ ·

Příklady jiných DNA virů, které jsou antigeny u obratlovců, /

jsou například clen^čceledi Poxviridae, vcetne rodu Orthopoxvirus (Variola major, Variola minor, virus opičích neštovic, kravských, bizoních, králičích a Ectromelia neštovic), rodu Leporipoxvirus (Myxom, Fibrom), rodu Avípoxvirus (drůbeží neštovice, jiné ptačí poxviry), rodu Capripoxvirus (ovčí, kozí neštovice), rodu Suipoxvirus (prasečí neštovice), rodu Parapoxvirus (virus kontaktní dermatitidy, pseudocowpox virus, virus hovězí papulární stomatitidy); čeleď Iridoviridae (virus africké prasečí horečky, Frog viry 2 a 3, virus rybí lymfocystosy); čeleď Herpesviridae, včetně ali^-a-Herpesvirů (Herpes Simplex Typy 1 a 2, Varicella-Zoster, virus koňských potratů, koňský herpes virus 2 a 3, pseudorabies virus, virus infekční hovězí keratokonjunktivitidy, virus infekční hovězí rhinotracheitidy, virus kočičí rhinotracheitidy, virus infekční laryngotracheitidy), Beta-herpesviry (Lidský cytomegalovirus a cytomegaloviry prasat a opic); gamma-herpesviry (virus Epstein-Barrové (EBV), virus Marekov^J nemoci, Herpes saimiri, Herpesvirus ateles, Herpesvirus sylvilagus, morčecí herpes virus, virus Lucké nádoru); čeleď Adenoviridae, včetně rodu Mastadenovirus (lidské podskupiny A,B,C,D,E a nezařazené kmeny; opičí adenoviry (alespoň 23 serotypů), virus infekční psí hepatitidy a adenoviry dobytka, prasat, ovcí, žab a mnoha dalších druhů, rodu Aviadenovirus (ptačí adenoviry); a nekultivovatelné adenoviry; čeleď Papoviridae, včetně rodu Papillomavirus (lidské papilloma viry, hovězí papilloma viry, Shope králičí papiloma virus, a různé patogenní papilloma viry jiných druhů), rodu Polyomavirus (polyomavirus, opičí vakuolizační virus (SV -40), králičí vakuolizační virus (RKV), K virus, BK virus, JC virus, a jiné primáti polyoma viry, jako je lymfotropní papilloma virus); čeleď Parvoviridae, včetně • »· * · ·· ·· *· • · · · 119 · · · · ··· ····· · · * :: : · : :: : : :

·*« ·· ·· ·· ·· ···· rodu adeno-asociovaných virů, rodu Parvovirus (virus kočičí panleukopenie, hovězí parvovirus, psí parvovirus, Aleutský virus nemoci norků, atd.). Konečně, mezi DNA viry mohou patřit viry, které neodpovídají výše uvedeným čeledím, jako je virus Kuru a Creutzfeld-Jakobovy nemoci a agens chronické infekční neuropatie (CHINA virus).

Každý z výše uvedených seznamů je pouze ilustrativní a není omezující.

Kromě použití imunostimulačních nukleových kyselin pro indukci imunitní reakce specifické pro antigen u člověka jsou způsoby podle předkládaného vynálezu vhodné pro léčbu ptáků, jako jsou slepice, kuřata, krocani, kachny, husy, křepelky a bažanti. Ptáci jsou cílem pro různé infekce.

Líhnoucí se ptačí mláďata jsou vystavena působení patogenních mikroorganismů krátce po vylíhnutí. Ačkoliv jsou tito ptáci nejprve chráněny před patogeny mateřskými protilátkami, je tato ochrana pouze dočasná a vlastní nezralý imunitní systém ptáčete musí začít chránit jedince před infekcí. Často je žádoucí zabránit infekci u ptáčat, když jsou nejvíce vnímavá k infekci. Také je žádoucí bránit infekci u starších ptáků, zejména jsou-li chováni v uzavřených boxech, kde dochází k rychlému šíření onemocnění. Proto je žádoucí podat imunostimulační nukleové kyseliny a non-nukleokyselinová adjuvans podle předkládaného vynálezu ptákům pro zesílení imunitní reakce specifické pro antigen, když je antigen přítomen.

Příkladem časné infekce kuřat je infekce virem kuřecí infekční anemie (CIAV). CIAV byl poprvé izolován v Japonsku v roce 1979 během výzkumu týkajícího se vakcinace proti

ΛΛ «······ · · · ·

99 ····· · · 9

9 ··· · · · · · · to ··· ···· ··· «·· ·· ·· ·· ·· ····

Marekově nemoci (Yuasa et al., 1979, Avian Dis. 23: 366-385).

Od této doby byl CIAV detekován u komerčně chované drůbeže ve všech zemích produkujících drůbež (van Bulow et al., 1991, str. 690-699), v Diseases of Poultry, 9. vydání, Iowa State University Press).

Infekce CIAV vede k rozvoji klinického onemocnění, které je charakterizované anemií, krvácením a imunosupresí a které se rozvíjí u vnímavých mladých kuřat. Atrofie thymu a kostní dřeně a konzistentní léze u kuřat infikovaných CIAV jsou také charakteristikami CIAV infekce. Deplece lymfocytů v thymu a občas ve Fabriciově burse vede k imunosupresi a zvýšení citlivosti na sekundární virové, bakteriální nebo mykotické infekce, které potom komplikují průběh onemocnění.

Imunosuprese může způsobovat zhoršení onemocnění po infekci virem MarekovlJ nemoci (MDV), virem infekční bursitidy, virem retikuloendoteliosy, adenovirem nebo reovirem. Bylo popsáno, že patogenese MDV je zesílena CIAV (DeBoer et al., 1989, st. 28, v Proceedings of the 38^th Wes^trn Poultry Disease Conference, Tempe, Ariz.). Dále bylo popsáno, že CIAV zhoršuje příznaky infekční bursitidy (Rosenberg et al., 1989, Avian Dis. 33:707-713). U kuřat se s věkem vyvíjí resistence na experimentálně indukované onemocnění způsobené CAA. Tato resistence je v podstatě dokončená ve věku 2 týdnů, ale starší ptáci jsou stále ještě citliví na infekci (Yuasa, N. et al., 1979, výše; Yuasa, N. et al., Arian Diseases, 24: 202-209, 1980). Nicméně, pokud jsou kuřata duálně infikována CAA a imunosupresivním agens (IBDV, MDV atd.), je resistence vznikající s věkem oddálena (Yuasa et al., 1979 a 1980, výše; Bulow von V. et al., J. Veterinary Medicine 33: 93-116, 1986). Charakteristikou CIAV je to, že může potencovat přenos onemocnění včetně vysoké resistence na inaktivaci v prostředí a některá běžná dezinfekční činidla. Ekonomický vliv CIAV <*··· 9 9 9 * * « 9

999 9 9 9 9 9 99 · infekce na drůbežářství je jasný ze skutečnosti, že 10% až 30% infikovaných ptáků hyne.

Vakcinace ptáků může být, podobně jako vakcinace jiných obratlovců, provedena v jakémkoliv věku. Obvykle je vakcinace prováděna do 12 týdne věku pro živé mikroorganismy a mezi 1418 týdnem pro inaktivované mikroorganismy nebo vakciny jiného typu. Při vakcinaci ve vajíčku může být vakcinace provedena v poslední čtvrtině vývoje embrya. Vakcína může být aplikována podkožně, sprejem, orálně, nitroočně, intratracheálně, nasálně nebo jinou metodou aplikace přes sliznici. Tak mohou být imunostimulační nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu podány ptákům nebo non-lidským obratlovcům za použití běžných vakcinačních protokolů a antigen může být podáván po vhodné době, která je zde popsána.

Dobytek a užitková zvířata jsou také citlivá na infekci. Onemocnění, která postihují tato zvířata, mohou způsobovat závažné ekonomické ztráty, zejména mezi dobytkem. Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro prevenci infekce u užitkových zvířat, jako jsou krávy, koně, prasata, ovce a kozy.

Krávy mohou být infikovány dobytčími viry. Virus průjmu dobytka (BVDV) je malý obalený RNA virus a náleží, společně s virem cholery ježků (HOCV) a virem hraniční nemoci ovcí (BDV) do rodu pestivirus. Ačkoliv byly pestiviry dříve řazeny do čeledi Togaviridae, některé studie je reklasifikuji do čeledi Flaviviridae společně s virem hepatitidy C (HCV) (Francki et al., 1991).

BVDV, který je významným patogenem dobytka, může být rozdělen, podle analýz buněčné kultury, na cytopatogenní (CP) t · a necytopatogenní (NCP) biotyp. NCP biotyp je rozšířenější, ačkoliv se u dobytka vyskytují oba biotypy. Když je březí kráva infikována kmenem NCP, tak může vrhnout tele trvale infikované a specificky imunotolerantní, které šíří virus po celý svůj život. Trvale infikované tele se může nakazit slizničním onemocněním a od zvířete mohou být potom izolovány oba biotypy. Klinickými příznaky jsou potraty, teratogenese a respirační potíže, postižení sliznic a mírný průjem. Dále může vzniknout těžká trombocytopenie, asociovaná s epidemií ve stádě, a která může vést k úhynu, a kmeny asociované s touto manifestací se zdají být virulentnější než klasické BVDV.

Koňské herpes viry (EHV) jsou skupinou antigenně odlišných biologických činidel, které způsobují různé infekce u koní, od subklinických až do fatálních. Patří sem koňský herpesvirus-1 (EHV-1), ubikvitní patogen u koní. EHV-1 je spojen s epidemiemi potratů, onemocnění respiračního traktu a onemocněními centrálního nervového systému. Primární infekce horního respiračního traktu u mladých koní vede k febrilnímu onemocnění, které trvá 8 až 10 dnů. Imunologicky zkušené klisny mohou být reinfikovány cestou respiračního traktu bez manifestace onemocnění, takže k potratu obvykle dojde bez varovných příznaků. Neurologický syndrom je spojený s respiračním onemocnění nebo potratem a může postihovat zvířata jakéhokoliv pohlaví v jakémkoliv věku a projevuje se ztrátou koordinace, slabostí a paralýzou zadních končetin (Telford, E.A.R. et al., Virology 189: 304-316, 1992). Mezi další EHV patří EHV-2 nebo koňský cytomegalovirus, EHV-3, virus koňského koitálního exantému a EHV-4, který byl dříve označován jako podtyp 2 EHV-1.

Ovce a kozy mohou být infikovány různými mikroorganismy, včetně visna-maedi.

• ···

Primáti, jako jsou lidoopi a makakové, mohou být infikováni virem opičí imunodeficience. Bylo popsáno, že vakcíny obsahující inaktivovaný virus a bezbuněčné vakcíny obsahující virus opičí imunodeficience, jsou účinné v dosažení ochrany u makaků (Stott et al., 1990, Lancet 36: 1538-1541; Desrosiers et al., PNAS USA (1989) 86: 6353-6357; Murphey Corb et al., (1989) Science 246: 1293-1297; a Carlson et al., (1990), AIDS Res. Human Retroviruses 6: 1239-1246). Rekombinantní HIV gpl20 vakcína byla účinná v prevenci infekce u šimpanzů (Berman et al., 1990, Nátuře 345: 622-625).

Kočky, jak domácí, tak divoké, jsou citlivé na infekci různými mikroorganismy, například kočičí infekční peritonitida je onemocnění, které se vyskytuje u domácích i u divokých koček, jako jsou lvi, levhartů, gepard a jaguárů. Když je žádoucí zabránění této a jiných typů infekcí u koček, tak může být způsob podle předkládaného vynálezu použit pro vakcinaci koček za účelem jejich ochrany před infekcí.

Domácí kočky mohou být infikovány několika retroviry, včetně viru kočičí leukemie (FeLV), viru kočičího sarkomu (FeSV), endogenního Concornaviru (RD-114) a kočičího viru vyvolávajícího syncytie (FeSFV). Z těchto virů je FeLV nejvýznamnějším patogenem způsobujícím různé příznaky, včetně lymforetikulárních a myeloidních neoplasií, anemií, autoimunitních onemocnění a imunodeficitu, který se podobá lidskému syndromu získané imunodeficience (AIDS). Nedávno byl konkrétní replikace deficitní FeLV mutant, označený jako FeLVAIDS, spojen s imunosupresivními účinky.

Objev kočičího T-lymfotropního lentiviru (též označovaného jako viru kočičí imunodeficience) byl prvně popsán v Pedersen « ·· 00 00 ·· ·· ···* »»· * * * * • « · · · »♦· « · * et al. (1987) v Science, 235: 790-793. Charakteristiky FIV byly popsány v Yamamoto et al., 1988, Leukemia, December Supplement 2: 204S-215S; Yamamoto et al., 1988, Am. J. Vet. Res. 49: 146-1258; a Ackley et al., 1990, J.Virol. 64: 56525655. Klonování a analýza sekvence FIV jsou popsány v Olmsted et al., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2448-2452 a 86: 4355-4360.

Kočičí infekční peritonitida (FIP) je sporadické onemocnění vyskytující se nepředvídatelně u domácích a divokých koček. Ačkoliv je FIP primárně onemocněním domácích koček, bylo diagnostikováno též u lvů, pum, levhartů, gepardů a jaguárů. Mezi menší divoké kočky, které byly postiženy FIP, patří rys a karakal, pouštní kočka a manul. U domácích koček se onemocnění vyskytuje převážně u mladých zvířat, ačkoliv citlivé k infekci jsou kočky jakéhokoliv věku. Pík incidence se objevuje mezi 6. a 12. měsíci věku. Pokles incidence se pozoruje mezi 5. a 13. rokem věku a potom se mezi 14. a 15. rokem incidence opět zvyšuj e.

Virová, bakteriální a parazitární onemocnění u ryb, měkkýšů nebo jiných vodních živočichů, jsou významným problémem pro rybářský průmysl. V důsledku vysoké hustoty zvířat v chovných nádržích nebo uzavřených mořských farmách mohou infekční nemoci eradikovat velkou část zvířat, například ryb, měkkýšů nebo jiných vodních živočichů. Prevence onemocnění je výhodnější léčbou u ryb než intervence při rozvinutém onemocnění. Vakcinace ryb je jedinou preventivní metodou, kterou je možno dosáhnout dlouhodobé ochrany v důsledku imunity. Vakcinace na bázi nukleových kyselin jsou popsány v US patentu č. 5780448 (Davis).

Imunitní systém ryb má mnoho rysů společných s imunitním systémem savců, jako je přítomnost B-lymfocytů, T-lymfocytů, « * · · · • « · · ··· ·· «·«· lymfokinů, komplementu a imunoglobulinů. Ryby mají podtřídy lymfocytů s úlohami patrně stejnými, jako mají B a T-lymfocyty savců. Vakciny mohou být aplikovány ve formě imerze nebo orálně.

Mezi vodní živočichy patří, avšak neomezují se na ně, ryby, měkkýši a jiní vodní živočichové. Mezi ryby patří všechny ryby s obratly, které mohou mít kostěný nebo chrupavčitý skelet, jako jsou například lososovití, kapr, sumec, platýs, pražma a kaníc. Lososovití jsou čeledí ryb, do které patří pstruh (včetně pstruha duhového), losos a sivěn alpský. Neomezující příklady měkkýšů jsou mlži, humři, garnáti, krabi a ústřice. Mezi další chované vodní živočichy patří bez omezení úhoři, olihně a chobotnice.

Mezi polypeptidy virových vodních patogenů patří, však neomezují se na ně, glykoprotein (G) nebo nukleoprotein (N) viru hemorhagické septikemie (VHSV); G nebo N proteiny viru infekční hematopoetické nekrosy (IHNV); VP1, VP2, VP3 nebo N strukturální proteiny viru infekční nekrosy pankreatu (IPNV);

G protein jarní viremie kaprů (SVC); a protein asociovaný s membránou, tegumin nebo kapsidový protein nebo glykoprotein viru sumečka skvrnitého (channel catfish virus, CCV) .

Mezi typické parazity koní patří Gasterophilus spp.;

Eimeria leuckarti; Giardia spp; Tritrichomonas equi; Babesia spp. (RBC); Theileria equi; Trypanosoma spp.; Klossiella equi; Sarcocystis spp.

Mezi typické parazity prasat patří Eimeria bebliecki, Eimeria scabra, Isospora suis, Giardia spp.; Balantidium coli, Entamoeba histolytica; Toxoplasma gondii a Sarcocystis spp. a Trichinella spiralis.

Mezi typické parazity dobytka patří Eimeria spp., Cryptosporidium sp., Giardia spp.; Toxoplasma gondii; Babesia bovis (RBC) , Babesia bigemina (RBC) , Trypanosoma spp.

(plasma), Theileria spp. (RBC); Theileria parva (lymfocyty), Tritrichomonas foetus a Sarcocystis spp.

Mezi hlavní parazity dravců patři Trichomonas gallinae; Coccidia {Eimeria spp.); Plasmodium relictum, Leucocytozoon danilewskyi (sovy), Haemoproteus spp., Trypanosoma spp.; Histomonas, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium baileyi, Giardia, Eimeria, Toxoplasma.

Mezi typické parazity infikující kozy a ovce patří Eimeria spp., Cryptosporidium sp., Giardia sp., Toxoplasma gondii, Babesia spp. (RBC), Trypanosoma spp. (plasma), Theileria spp. (RBC) a Sarcocystis spp.

Mezi typické parazitární infekce drůbeže patří kokcidiosa způsobená Eimeria acervulina, E. necatrix, E. tenella,

Isospora spp. a Eimeria truncata; histomoniasa, způsobená Histomonas meleagridis a Histomonas gallinarum; trichomoniasa způsobená Trichomonas gallinae; a hexamitiasa způsobená Hexamita meleagridis. Drůbež může být také infikována Eimeria maxima, Eimeria meleagridis, Eimeria adenoeides, Eimeria meleagrimitis, Cryptosporidium, Eimeria brunetti, Eimeria adenoeides, Leucocytozoon spp., Plasmodium spp., Haemoproteus meleagridis, Toxoplasma gondii a Sarcocystis. Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro léčbu a/nebo prevenci parasitárních infekcí u psů, koček, ptáků, ryb a fretek. Mezi typické ptačí parazity patří Trichomonas gallinae; Eimeria spp., Isospora spp., Giardia; Cryptosporidium; Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii,

• · • 0 0

0 • 0

0

0000 • 00 0 • 0

Haemoproteus/Parahaemoproteus, Plasmodium spp., Leucocytozoon/ Akiba, Atoxoplasma, Trypanosoma spp. Mezi typické parazity infikující psi patří Trichinella spiralis: Isospora spp., Sarcocystis spp., Cryptosporidium spp., Hammondia spp.,

Giardia duodenalis (canis); Balantidium coli; Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis; Toxoplasma gondii; Trypanosoma cruzi; Babesia canis; Leishmania amastigotes; Neospora caninum.

Mezi typické parazity infikující kočky patří Isospora spp., Toxoplasma gondii, Sarcocystis spp., Hammondia hammondi, Besnoitía spp., Giardia spp., Entamoeba histolytica;

Hepatozoon canis, Cytauxzoon sp., Cytauxzoon sp., Cytauxzoon sp. (erytrocyty, RE buňky).

Mezi typické parazity infikující ryby patří Hexamita spp., Eimeria spp., Cryptobia spp., Nosema spp., Myxosoma spp., Chilodonella spp., Trichodina spp., Plistophora spp., Myxosoma Henneguya; Costia spp., Ichthyophithirius spp. a Oodinium spp.

Mezi typické parazity infikující divoká zvířata patří Giardia spp. (masožravci, býložravci), Isospora spp. (masožravci), Eimeria spp. (masožravci, býložravci), Theileria spp. (býložravci), Babesia spp. (masožravci, býložravci), Trypanosoma spp. (masožravci, býložravci), Schistosoma spp. (býložravci), Fasciola hepatica (býložravci), Fascioloides magna (býložravci), Fasciola gigantica (býložravci), Trichinella spiralis (masožravci, býložravci).

Parazitární infekce v zoo mohou být také vážným problémem. Mezi typické parazity čeledi bovidae (buvolec, antilopa, banteng, oryx, gaur, impala, klipspringer, kudu, gazela) patří • 4« 44 ·4 • 4 4 4 · ·4

4 4 4 4 44·

4 4 4 4 4 4 ··« ·· ·4 ··

100 ·· · 4 4

4 4

4444

Eimeria spp. Mezi typické parazity čeledi ploutvonožců (tuleň, lachtan) patří Eimeria phocae. Mezi typické parazity čeledi camelidae (velbloudi, lamy) patří Eimeria spp. Mezi typické parazity čeledi giraffidae (žirafy) patří Eimeria spp. Mezi typické parazity čeledi elephantidae (slon africký a indický) patří Fasciola spp. Mezi typické parazity nižších primátů (šimpanzi, orangutani, lidoopi, paviáni, makakové, opice) patří Giardia sp.; Balantidium coli, Entamoeba histolytica, Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii; Plasmodium spp. (RBC), Babesia spp. (RBC), Trypanosoma spp. (plasma), Leishmania spp. (makrofágy)..

Polypeptidy bakteriálních patogenů jsou například Feregulovaný zevní membránový protein, (IROMP), zevní membránový protein (OMP) a A-protein Aeromonis salmonicida, který způsobuje furunkulosu, p57 protein Renibacterium salmoninarum, který způsobuje bakteriální onemocnění ledvin (BKD), hlavní povrchový antigen (rosa), povrchový cytotoxin (mpr), povrchový hemolysin (ish), flagelární antigen Yersiniosy; extracelulární protein (ECP), Fe-regulovaný zevní membránový protein (IROMP), strukturální protein Pasteurellosy; OMP a flagelární protein Vibrosis anguillarum a V. ordalii; a flagelární protein, OMP protein, aroA, purA Edwardsiellosis ictaluri a E. tarda; a povrchový antigen Ichthyophthirius; a strukturální a regulační protein Cytophaga columnari a strukturální a regulační protein Rickettsia.

Polypeptidy parazitárních patogenů jsou například povrchové antigeny Ichthyophthirius.

Alergen je substance (antigen), která může indukovat alergickou nebo asthmatickou reakci u vnímavého jedince.

Seznam alergenů je mimořádně rozsáhlý a zahrnuje pyly, hmyzí

101 ·* · ·· *9 ·♦ ·· ·· • · · · · · · · • ··»·· ·· ♦ ··· · · · · · · · • · · · · · · · · · ·»· ·« ·· *· ·· ·♦·· jedy, zvířecí srst, spory hub a léky (např. penicilín).

Příklady přirozených, zvířecích a rostlinných alergenů jsou, například, proteiny specifické pro následující druhy rody:

Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (například Dermatophagoides^farinae) ; Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia); Lolium (například Lolium perenne nebo Lolium multi^florum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris);

Plantago (například Plantago lanceolata); Parietaria (například Parietaria officinalis nebo Parietaria judaica); Blattella (například Blattella germanica); Apis (například Apis multi^florum) ; Cupressus (například Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica a Cupressus macrocarpa);

Juniperus (například Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis a Juniperus ashel); Thuya (například Thuya orientalis); Chamaecyparis (například Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (například Periplaneta americana); Agropyron (například Agropyron repens); Secale (například Secale cereale); Triticum (například Triticum aestivum); Dactylis (například Dactylis glomerata); Festuca (například Festuca elatior); Poa (například Poa pratensis nebo Poa compressa); Avena (například Avena sativa); Holcus (například Holcus lanatus); Anthoxanthum (například Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (například Arrhen^herum elatius); Agrostis (například Agrostis alba); Phleum (například Phleum pratense); Phalaris (například Phalaris arundinacea); Paspalum (například Paspalum notatum); Sorghum (například Sorghum halepensis); a Bromus (například Bromus inermis).

102

• ·· ·	99 9	9 * 9	9	99 •	9	99	9	99 9 9
• ·	«	9	•	• 9 9	9		9	4
								9
• 9	•	9	9	9 9	9		9	9
• 9«	··	• 9		99		99		• 999

Antigenem může být antigen, který je kódovaný nukleovou kyselinou nebo vektorem nebo ké|trý může být kódovaný nukleokyselinovým vektorem. V případě nukleokyselinového vektoru je vektor podán jedinci a antigen je exprimován in vivo. V druhém případu může být antigen podán přímo jedinci. Antigen nekódovaný v nukleokyselinovém vektoru může být jakýkoliv typ antigenu, který není nukleovou kyselinou. Například, v některých aspektech vynálezu je antigenem nekódovaným v nukleokyselinovém vektoru polypeptid. Drobné modifikace primární aminokyselinové sekvence polypeptidových antigenů mohou také vést k zisku polypeptidu, který má v podstatě stejnou antigenní aktivitu ve srovnání s nemodifikovaným polypeptidem. Takové modifikace mohou být cílené, vytvořené například místně cílenou mutagenesí, nebo mohou být spontánní. Všechny polypeptidy produkované těmito modifikacemi jsou zahrnuty, pokud je zachována mutagenicita. Polypeptidem může být například virový polypeptid.

Termín „v podstatě přečištěný, jak je zde použit, označuje polypeptid, který v podstatě neobsahuje jiné proteiny, lipidy, karbohydráty nebo jiné materiály, se kterými je za přirozených okolností asociován. Odborník v oboru může přečistit bakteriální nebo virové polypeptidy za použití standardních technik pro přečištění proteinů. V podstatě přečištěný protein obvykle vytváří jeden hlavní proužek na neredukujicím polyakrylamidovém gelu. V případě částečně glykosylovaných polypeptidů nebo polypeptidů obsahujících několik start kodonů může být na neredukujícím polyakrylamidovém gelu přítomno několik proužků, ale tyto proužky mají jednoznačný charakter pro daný polypeptid. Čistota virového nebo bakteriálního polypeptidu může být také určena analýzou amino-terminální aminokyselinové sekvence. Další typy antigenů, které nejsou kódované nukleokyselinovým vektorem, jako jsou polysacharidy,

103

• ·· 9		•	•	9	•	•	9	99 « ·
• 9		•	9	•	·»«	•	9	•
9 9		•	9		9 9	4	9	9
999	4«		99		99	99		9999

malé molekuly, mimetika atd., jsou také zahrnuty v předkládaném vynálezu.

Vynález také využívá polynukleotidy kódující antigenní polypeptidy. Předpokládá se, že antigen může být podán subjektu ve formě molekuly nukleové kyseliny, která kóduje antigen, takže je antigen exprimován in vivo. Takové antigeny podané jedinci v nukleokyselinovém vektoru jsou označovány jako antigeny kódované nukleokyselinovým vektorem. Nukleová kyselina kódující antigen je operativně navázaná na genovou expresní sekvenci, která řídí expresi nukleové kyseliny pro antigen v eukaryotické buňce. Genová expresní sekvence je jakákoliv regulační nukleotidová sekvence, jako je promotorové sekvence nebo kombinace promotor-zesilovač exprese, která usnadňuje účinnou transkripci a translaci antigenní nukleové kyseliny, na kterou je operativně navázaná. Genová expresní sekvence může být například savčí nebo virový promotor, jako je konstitutivní nebo indukovatelný promotor. Mezi konstitutivní savčí promotory patří, například, promotory následujících genů: genu pro hypoxantin-fosforibosyl transferasu (HPTR), adenosin-deaminasu, pyruvát kinasu, baktin a jiné konstitutivní promotory. Příklady virových promotorů, které fungují konstitutivně v eukaryotických buňkách, zahrnují, například, promotory z cytomegaloviru (CMV), opičího viru (SV40), papilloma viru, adenoviru, viru lidské imunodeficience (HIV), viru Rousova sarkomu, cytomegaloviru, dlouhé terminální repetice (LTR) viru Moloney leukemie, a thymidin-kinasový promotor viru herpes simplex. Další konstitutivní promotory jsou známé odborníkům v oboru. Promotory použitelné jako genové expresní sekvence v předkládaném vynálezu jsou také indukovatelné promotory. Indukovatelné promotory jsou exprimovány za přítomnosti indukčního činidla. Například metallothioneinový promotor je

104

• ··				•v	··
• ·	•	• ·	•	•	•	•
• ·	•	• ·	···	v	•
• ·	•	• ·	• ·	0	•	•
·· ··				··	··>

indukován k podpoře transkripce a translace za přítomnosti některých iontů kovů. Další indukovatelné promotory jsou známé odborníkům v oboru.

Obecně, genové expresní sekvence by měly zahrnovat, podle potřeby, 5non-transkribující se a 5netranslatující se sekvence podílející se na iniciaci transkripce a translace, v příslušném pořadí, jako je TATA box, čepičkové sekvence,

CAAT sekvence a podobně. Konkrétně budou takové 5netranskribující se sekvence zahrnovat promotorový region, který obsahuje promotorovou sekvenci pro transkripční kontrolu operativně navázanou na antigenní nukleovou kyselinu. Genové expresní sekvence volitelně zahrnují sekvence zesilovače transkripce nebo předcházející aktivátorové sekvence, podle potřeby.

Antigenní nukleová kyselina je operativně navázaná na genovou expresní sekvenci. Termíny sekvence nukleové kyseliny pro antigen a genová expresní sekvence operativně navázané označují sekvence kovalentně vázané tak, že dochází k expresi nebo transkripci a/nebo translaci sekvence kódující antigen pod vlivem nebo kontrolou genové expresní sekvence. Dvě DNA sekvence jsou operativně navázané na sebe tehdy, když indukce promotoru v 5genové expresní sekvenci vede k transkripci sekvence pro antigen a když charakter vazby mezi dvěma DNA sekvencemi (1) nezpůsobuje mutaci posunující čtecí rámec; (2) neinterferuje se schopností promotorového regionu řídit transkripci sekvence pro antigen, nebo (3) neinterferuje se schopností příslušného RNA transkriptu být translatován na protein. Tak je genová expresní sekvence operativně navázaná na sekvenci nukleové kyseliny pro antigen tehdy, když jsou genové expresní sekvence schopné dosáhnout transkripci nukleové kyseliny pro antigen, po které je transkript • ·

105 translatován do požadovaného proteinu nebo polypeptidu.

Nukleová kyselina pro antigen podle předkládaného vynálezu může být předložena imunitnímu systému samostatně, nebo v asociaci s vektorem. V nej širším smyslu je vektorem jakékoliv vehikulum schopné usnadnit přenos nukleové kyseliny pro antigen k buňkám imunitního systému tak, že antigen může být exprimován a prezentován na povrchu buněk imunitního systému. Vektor obvykle transportuje nukleové kyseliny k imunitním buňkám s redukovanou degradací ve srovnání s degradací, ke které by docházelo za nepřítomnosti vektoru. Vektor volitelně obsahuje výše uvedené genové expresní sekvence pro zesílení exprese nukleové kyseliny pro antigen v buňkách imunitního systému. Obecně, mezi vektory použitelné v předkládaném vynálezu patří například plasmidy, fágemidy, viry, jiná vehikula odvozená od virů nebo bakterií, kde tyto vektory byly upraveny insercí nebo inkorporací sekvence nukleové kyseliny pro antigen. Virové vektory jsou výhodným typem vektorů a patří mezi ně například sekvence nukleové kyseliny z následujících virů: retrovirů, viru Moloney myší leukemie, viru Harveova'myšího sarkomu, viru myších nádorů mléčné žlázy a viru Rousova sarkomu; adenoviru, adenoasociovaného viru, virů typu SV-40; polyoma virů; viru Epsteina-Barrové; herpes viru; viru vakcinie; polio viru; a RNA virů, jako je retrovirus. Je také možno využít dalších v oboru známých vektorů.

Výhodné virové vektory jsou získány z necytopatických eukaryotických virů, ve kterých byly neesenciální geny nahrazeny požadovaným genem. Mezi necytopatické viry patří retroviry, jejichž životní cyklus zahrnuje reverzní transkripci virové RNA do DNA s následnou integrací proviru do buněčné DNA hostitele. Retroviry byly schváleny pro klinické • · · · ··· ··· • · · · ···· · ·

106 ··· ·· *· *· ·· ···· studie genové terapie na lidech. Nejvhodnější jsou ty retroviry, které jsou neschopné replikace (t.j. mohou řídit syntézu požadovaných proteinů, ale nemohou vyrábět infekční částice). Takové geneticky upravené retrovirové expresní vektory jsou použitelné pro vysoce účinnou transdukci genů in vivo. Standardní protokoly pro produkci replikace-defektních retrovirů (včetně kroků inkorporace exogenního genetického materiálu do plasmidů, transfekce přenosových buněk obsahujících plasmidy, produkce rekombinantních retrovirů přenosovou buněčnou linií, odběru virových částic z tkáňového kultivačního media, a infekce cílových buněk virovými částicemi), jsou uvedeny v Kriegler, M. Gene Transfer a Expresion, A Laboratory Manual, W.H. Freeman c.o., New York (1990), a Murry, E-J- Methods in Molecular Biology, svazek 7, Humana Press, lne., Cliffton, New Jersey (1991).

Výhodným virem pro některé aplikace je adeno-asociovaný virus, což je dvoj řetězcový DNA virus. Adeno-asociovaný virus může být upraven tak, aby byl neschopen replikace a může infikovat různé typy a druhy buněk. Další jeho výhodou je: stabilita vůči teplu a lipidovým rozpouštědlům; vysoká frekvence přenosu v buňkách různých linií, včetně hematopoetických buněk; a chybění inhibice superinf ekce, což umožňuje provedení více sérií transdukce. Významné je to, že adeno-asociovaný virus se může integrovat do lidské buněčné DNA místně cíleným způsobem, což minimalizuje možnost inserční mutagenese a variabilitu exprese insertovaného genu. Dále, infekce přirozeným adenovirem byla sledována v tkáňové kultuře po více než 100 pasáží za nepřítomnosti selekčního tlaku, což naznačuje, že genomová integrace adeno-asociovaného viru je relativně stabilní událostí. Adeno-asociovaný virus může také půSJsbit extrachromosomálně.

107

Mezi další vektory patří plasmidové vektory. Plasmidové vektory byly důkladně popsány v oboru a jsou dobře známé odborníkům v oboru. Viz Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, COld Spring Harbor Laboratory Press, 1989. V několika posledníchletech byly plasmidové vektory ověřeny jako zejména výhodné pro transport genů do buněk in vivo, protože se nemohou integrovat do genomu a replikovat v genomu hostitele. Nicméně, tyto plasmidy obsahující promotor kompatibilní s hostitelskou buňkou, mohou exprimovat peptid z genu operativně kódovaného plasmidem. Mezi některé běžně používané plasmidy patří pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 a pBlueScript. Další plasmidy jsou dobře známé odborníkům v oboru. Dále, plasmidy mohou být vhodně upraveny za použití restrikčních enzymů a ligačních reakcí pro odstranění a přidání specifických fragmentů DNA.

Nedávno bylo zjištěno, že plasmidy nesoucí geny mohou být dopraveny do imunitního systému za použití bakterie. Modifikované formy bakterií, jako je Salmonella, mohou být transfektovány plasmidem a mohou být použity jako transportní vehikula. Bakteriální transportní vehikula mhou být podána hostiteli orálně nebo jiným způsobem, bakterie přenášejí plasmid k buňkám imunitního systému, například k B-lymfocytům, dendritickým buňkám, pravděpodobně průnikem přes střevní bariéru, vysoké hladiny imunitní ochrany byly dosaženy za použití této techniky. Takové metody přenosu jsou použitelné pro aspekty předkládaného vynálezu využívající systémové podání antigenu, imunostimulační nukleové kyseliny a/nebo jiná terapeutická činidla.

Tak jsou imunostimulační nukleové kyseliny použitelné jako vakcinační adjuvans. Již dříve bylo zjištěno, že CpG oligonukleotidy jsou výbornými vakcinačními adjuvans. Bylo

108 ·;

• · · · ·«·· • · · · · · · · · • · · · ♦ · · · ·· ·· ♦· ·· ···· však také prokázáno, že CpG ODN, které jsou vynikajícími vakcinačními adjuvans u myší, nejsou výhodnými adjuvans u zvířat jiných než jsou hlodavci. Pro identifikaci nejlepších imunostimulačních nukleových kyselin pro použití jako vakcinační adjuvans u člověka nebo jiných živočichů jiných než hlodavců byl proveden in vivo skríning různých nukleových kyselin. Několik testů in vitro bylo hodnoceno u myší na jejich prediktivní hodnotu pro adjuvantní aktivitu u myší in vivo. Během tohoto pokusu byl identifikován test in vitro, který určuje účinnost in vivo. Bylo zjištěno, spíše překvapivě, že aktivace jak B-lymfocytů, tak NK buněk koreluje se schopností imunomodulačních nukleových kyselin zesilovat imunitní reakci in vivo proti antigenů.

Dobrá prediktivní hodnota aktivace B-lymfocytů pro adjuvantní aktivitu vakcíny in vivo je s největší pravděpodobností spojena s centrální úlohou B-lymfocytů ve vzniku specifické imunitní reakce. Polyklonální proliferace Blymfocytů (indukovaná imunostimulačními nukleovými kyselinami) zvyšuje pravděpodobnost vzniku B-lymfocytů/T-pomocných lymfocytů specifických pro antigen. Dále, zesílená exprese kostimulační molekuly CD86 na polyklonálně expandovaných Blymfocytech aktivuje T-pomocné lymfocyty specifické pro antigen. B-lymfocyty také zvyšují svou expresi CD40 v reakci na imunostimulační nukleové kyseliny, což zlepšuje schopnost CD40L exprimujících T-pomocných lymfocytů stimulovat Blymfocyty. Zvýšená syntéza ICAM-1 na B-lymfocytech usnadňuje mezibuněčný kontakt. Proto má aktivační status polyklonálních B-lymfocytů zásadní význam pro iniciaci specifické protilátkové reakce.

Příspěvek aktivity NK buněk k indukci specifických protilátek byl nicméně překvapivý. NK buňky jsou součástí • ·

109 • · · 9 · · · 9 9 9 *99 99 99 99 99 9999 imunitního systému a jako takové se podílejí na první linii obrany proti patogenům. S největší pravděpodobností souvisejí cytokiny produkované NK buňkami po aktivaci s iniciací specifické imunitní reakce. Proto se v jednom aspektu vynález týká způsobu pro identifikaci adjuvans pomocí detekce aktivace K buněk. Test aktivity NK buněk může být proveden způsobem popsaným v následujících příkladech nebo za použití jiných známých testů aktivity NK buněk. Je však výhodné, aby byla použita smíšená populace buněk, jako jsou PBMC, z důvodu možnosti, že aktivace NK buněk je nepřímý účinek. Test je výhodně použit pro identifikaci imunostimulačních nukleových kyselin, které jsou použitelné jako adjuvans u člověka a jiných zvířat kromě hlodavců.

Indukce cytokinů byla také identifikována jako významný prediktor adjuvantní aktivity in vivo. Protože je sensitivita lidských primárních monocytů na endotoxin o 2 řády vyšší než myších, je nutno zabránit endotoxinové kontaminaci imunostimulačních nukleových kyselin použitých pro testování v lidském systému (Hartmann G., a Krieg, Ά.Μ. 1999, Gene Therapy 6: 893). Protože jsou TNF-α, IL-6 a IL-12 produkovány lidskými monocyty v reakci na i malá množství endotoxinu, je jejich hodnota pro vysoce účinný skríningový test omezená. Na druhé straně, lidské NK buňky a B-lymfocyty vykazují pouze mírnou aktivaci endotoxinem a proto jsou vhodné pro testování imunostimulační aktivity.

Stimulace buněčných funkcí v NK buňkách nebo B-lymfocytech (t.j. lytické aktivity, proliferace) vyžaduje silněji imunostimulační nukleové kyseliny než indukce markérů aktivace na jejich povrchu (CD69, CD86). Pro oba typy buněk vykazuje použití povrchových markérů aktivace buněk vyšší nespecifické pozadí, které lze přisoudit fosforothioátovému skeletu, ve

110 srovnání s funkčními testy. Tato vysoká sensitivita povrchových markérů vyžaduje použití nízkých koncentrací imunostimulační nukleové kyseliny pro optimální rozlišení mezi imunostimulačními nukleovými kyselinami podobné aktivity.

Proto umožňuje použití povrchových markérů srovnání imunostimulačních nukleových kyselin se slabou aktivitou, zatímco funkční testy jsou výhodné pro srovnání imunostimulačních nukleových kyselin s vysokou aktivitou. Je jasné, že optimální koncentrace imunostimulační nukleové kyseliny pro stimulaci B-lymfocytů a NK buněk se liší. Zatímco 0,6 pg/ml ODN je již maximum pro stimulaci B-lymfocytů, může optimální aktivace NK buněk vyžadovat 6 gg/ml ODN. Jak aktivace B-lymfocytů, tak funkční aktivita NK buněk byly měřeny pomocí čerstvě izolovaných PBMC. Již dříve bylo zjištěno, že vysoce přečištěné lidské primární B-lymfocyty jsou aktivovány CpG DNA. Existence přímého účinku CpG DNA na NK buňky je méně jasná, a sekundární mechanismus zprostředkovaný jiným typem PBMC buněk může přispívat k CpG-indukované funkční aktivitě NK buněk.

Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být podány jedinci společně s antimikrobiálním činidlem. Termín antimikrobiální činidlo, jak je zde použit, označuje přirozenou nebo syntetickou sloučeninu, která může usmrcovat nebo inhibovat infekční mikroorganismy. Typ antimikrobiálního činidla použitelného ve způsobu podle předkládaného vynálezu bude záviset na typu mikroorganismu, kterým je jedinec infikován, nebo který by mohl být infikován. Mezi antimikrobiální činidla patří, avšak nejsou na ně omezeny, antibakteriální činidla, anti-virová činidla, anti-mykotická činidla a anti-parasitární činidla. Výrazy jako anti-infekční činidlo, anti-bakteriální činidlo, anti-virové činidlo a anti-mykotické činidlo, anti-parasitární činidlo a *' · · · · · » · ft • · ····· ft· ·

111 parasiticid jsou dobře známé v oboru a jsou definovány ve standardních lékařských učebnicích. Stručně, anti-bakteriální činidla usmrcují nebo inhibují bakterie a patří mezi ně antibiotika, stejně jako jiné syntetické nebo přirozené sloučeniny mající podobnou funkci. Antibiotika jsou molekuly s nízkou molekulovou hmotností, které jsou produkovány jako sekundární metabolity buňkami, jako jsou mikroorganismy. Obecně, antibiotika interferují s jednou nebo více bakteriální funkcí nebo strukturou, které jsou specifické pro mikroorganismus a které nejsou přítomné v hostitelských buňkách. Anti-virová činidla mohou být izolována z přirozených zdrojů nebo mohou syntetizována a jsou použitelná pro zabíjení nebo inhibici virů. Anti-mykotická činidla jsou používána pro léčbu superficiálních mykotických infekcí, stejně jako oportunních a primárních systémových mykotických infekcí. Anti-parazitární činidla zabíjejí nebo inhibují parazity.

Příklady anti-parazitárních činidel, též označovaných jako parasiticidy, použitelných pro aplikaci u člověka, jsou albendazol, amfotericin B, benznidazol, bithionol, chlorochin HC1, chlorochin fosfát, clindamycin, dehydroemetin, diethylkarbamazin, diloxanid furoát, eflornithin, furazolidaon, glukokortikoidy, halofantrin, jodochinol, ivermectin, mebendazol, mefloquin, meglumin-antimoniát, melarsoprol, metrifonat, metronidazol, niklosamid, nifurtimox, oxamnichin, paromomycin, pentamidin-isethionát, piperazin, praziquantel, primaquinfosfát -, proguanil, pyrantel pamoát, pyrimethanminsulfonamidy, pyrimethamin-sulfadoxin, chinacrin HC1, chinin sulfát, chinidín glukonát, spiramycin, natriumstiboglukonát (natrium-antimonium-glukonát), suramin, tetracyklin, doxycyklin, thiabendazol, tinidazol, trimethroprim-sulfamethoxazol a tryparsamid, kde tato činidla jsou použita samostatně nebo v kombinaci.

112

Mezi paraziticidy používané u non-lidských jedinců patří například, piperazin, diethylkarbamazin, thiabendazol, fenbendazol, albendazol, oxfendazol, oxibendazol, febantel, levamisol, pyrantel-tartrát, pyrantel pamoát, dichlorvos, ivermectin, doramectic, milbemycin-oxim, iprinomectin, moxidectin, N-butylchlorid, toluen, hygromycin B thiacetarsemid sodný, melarsomin, praziquantel, epsiprantel, benzimidazoly, jako je fenbendazol, albendazol, oxfendazol, clorsulon, albendazol, amprolium; decochinat, lasalocid, monensin sulfadimethoxin; sulfamethazin, sulfachinoxalin, metronidazol.

Mezi antiparazitární činidla používaná u koní patří například mebendazol, oxfendazol, febantel, pyrantel, dichlorvos, trichlorfon, ivermectin, piperazin; pro S. westeri: ivermectin, benzimidc.azoly, jako je thiabendazol, cambendazol, oxibendazol a fenbendazol. Mezi antiparazitární činidla používaná u psů patří milbemycin oxin, ivermectin, pyrantel pamoát a kombinace ivermectinu a pyrantelu. Mezi antiparazitární činidla používaná u prasat patří levamisol, piperazin, pyrantel, thiabendazol, dichlorvos a fenbendazol. Mezi antihelmintika používaná u ovcí koz patří levamisol a ivermectin. Caparsolat je účinný při léčbě D. immitis (heartworm) u koček.

Antibakteriální činidlajzabíjej i bakterie nebo inhibují jejich růst. Antibiotika, která jsou účinná v zabíjení nebo inhibici široké škály bakterií, jsou označována jako širokospektrá antibiotika. Další typy antibiotik jsou účinné především proti gram-pozitivním nebo gram-negativním bakteriím. Tyto typy antibiotik jsou označované jako antibiotika s úzkým spektrem. Další antibiotika, která jsou ··

113

• · 4··· ··· ·· ·· ·· 99 9999 účinná proti jedinému organismu nebo nemoci a ne proti jiným bakteriím, jsou označována jako antibiotika s omezeným spektrem. Antibakteriální činidla jsou někdy dělena podle primárního způsobu účinku. Obecně jsou antibakteriální činidla inhibitory syntézy buněčné stěny, inhibitory buněčné membrány, inhibitory syntézy proteinů, inhibitory syntézy nebo funkce nukleových kyselin a kompetitivní inhibitory.

Mezi antibakteriální činidla použitelná v předkládaném vynálezu patří, přirozené peniciliny, semi-syntetické peniciliny, kyselina klavulanová, cefalosporiny, bacitracin, ampicilin, karbenicilin, oxacilin, azlocilin, mezlocilin, piperacilin, methicilin, dicloxacilin, nafcilin, cefalotin, cefapirin, cefalexin, cefamandol, cefaclor, cefazolin, cefuroxin, cefoxitin, cefotaxim, cefsulodin, cefetamet, cefixim, ceftriaxon, cefoperazon, ceftazidin, moxalaktam, karbapenemy, imipenemy, monobaktamy, aztreonam, vankomycin, polymyxin, amfotericin B, nystatin, imidazoly, clotrimazol, miconazol, ketoconazol, itraconazol, fluconazol, rifampiny, ethambutol, tetracykliny, chloramfenicol, makrolidy, aminoglykosidy, streptomycin, kanamycin, tobramycin, amikacin, gentamicin, tetracyklin, minocyklin, doxycyklin, chlortetracyklin, erythromycin, roxithromycin, klarithromycin, oleandomycin, azithromycin, chloramfenicol, chinolony, kotrimoxazol, norfloxacin, ciprofloxacin, enoxacin, kyselina nalidixová, temafloxacin, sulfonamidy, gantrisin a trimethoprim; acedapson; acetosulfon sodný; alamecin; alexidine; amdinocilin; amdinocilin pivoxil; amicyklin; amifloxacin; amifloxacin mesylát ; amikacin; amikacin sulfát; kyselina aminosalicylová; aminosalicyl^t sodný; amoxicilin; amfomycin; ampicilin; ampicilin sodný; apalcilin sodný; apramycin; aspartocin; astromicin sulfát; avilamycin; avoparcin; azithromycin; azlocilin; azlocilin sodný;

114 *· toto toto toto • · * to to · • · · · · to · • · * · · to · • · to v <>· •· ·· ·· «tototo bacampicilin hydrochlorid; bacitracin; bacitracin methylendisalicylát; bacitracin zinečnatý; bambermyciny; calciumbenzoylpas; berythromycin; betamicin sulfát; biapenem; biniramycin; bifenamin hydrochlorid; bispyrithion magsulfex; butikacin; butirosin sulfát; kapreomycin sulfát; karbadox; karbenicilin sodný; karbenicilin indanyl sodný; karbenicilin fenyl-sodný; karbenicilin draselný; carumonam sodný; cefaclor; cefadroxil; cefamandol; cefamandol ňafat; cefamandol sodný; cefaparol; cefatrizin; cefazaflur sodný; cefazolin; cefazolin sodný; cefbuperazon; cefdinir; cefepim; cefepim hydrochlorid; cefetecol; cefixim; cefmenoxim hdrochlorid; cefmetazol; cefmetazol sodný; cefonicid sodný; cefonicid sodný; cefoperazon sodný; ceforanid; cefotaxim sodný; cefotetan; cefotetan dvoj sodný; cefotiam hydrochlorid; cefoxitin; cefoxitin sodný; cefpimizol; cefpimizol sodný; cefpiramid; cefpiramid sodný; cefpirom sulfát; cefpodoxim proxetil; cefprozil; cefroxadin; cefsulodin sodný; ceftazidim; ceftibuten; ceftizoxim sodný; ceftriaxon sodný; cefuroxim; cefuroxim axetíl; cefuroxim pivoxetil; cefuroxim sodný; cefacetril sodný; cefalexin; cefalexin hydrochlorid; cefaloglycin; cefaloridin; cefalothin sodný; cefapirin sodný; cefradin; cetocyklin hydrochlorid; cetofenicol;

chloramfenikol; chloramfenikol palmitat; komplex chloramfenikol-pantothenat; chloramfenikol natrium-sukcinát;

chlorhexidin fosfanilat; chloroxylenol; chlortetracyklin bisulfát; chlortetracyklin hydrochlorid; cinoxacin;

ciprofloxacin; ciprofloxacin hydrochloride; cirolemycin;

clarithromycin; clinafloxacin hydrochlorid; clindamycin;

clindamycin hydrochlorid; clindamycin palmitát hydrochlorid;

clindamycin fosfát; clofazimin; cloxacilin benzathin;

cloxacilin sodný; cloxyquin; colistimethat sodný; colistin sulfát; coumermycin; coumermycin sodný; cyclacilin;

cykloserin; dalfopristin; dapson; daptomycin; demeclocyklin;

• ·· · · ♦♦ ·· 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 999 9 9 9

115 demeclocyklin hydrochorid; demecyklin; denofungin; diaveridin; dicloxacilin; dicloxacilin sodný; dihydrostreptomycin sulfát; dipyrithion; dirithromycin; doxycyklin; doxycyklin vápenatý; doxycyklin fosfatex; doxycyklin hyclat; droxacin sodný; enoxacin; epicilin; epitetracyklin hydrochorid; erythromycin; erythromycin acistrat; erythromycin estolat; erythroxnycin ethylsukcinát; erythromycin gluceptat; erythromycin laktobionat; erythromycin propionát; erythromycin stearát; ethambutol hydrochlorid; ethionamid; fleroxacin; floxacilin; fludalanin; flumequin; fosfomycin; fosfomycin tromethamin; fumoxicilin; furazolium chlorid; furazolium tartrát; fusidát sodný; kyselina fusidová; gentamicin sulfát; gloximonalp; gramicidin; haloprogin; hetacilin; hetacilin draselný; hexedin; ibafloxacin; imipenem; isokonazol; isepamicin; isoniazid; josamycin; kanamycin sulfát; kitasamycin; levofuraltadon; levopropylcillin draselný; lexithromycin; lincomycin; lincomycin hydrochlorid; lomefloxacin;

lomefloxacin hydrochlorid; lomefloxacin mesylat; loracarbef; mafenide; meclocyklin; meclocyklin sulfosalicylát; megalomicin kalium-fosfát; mequidox; meropenem; methacyklin; methacyklin hydrochlorid; methenamin; methenamin hippurát; methenamin mandelat; methicilin sodný; metioprim; metronidazol hydrochlorid; metronidazol fosfát; mezlocilin; mezlocilin sodný; minocyklin; minocyklin hydrochlorid; mirincamycin hydrochlorid; monensin; monensin sodný; nafcilin sodný; nalidixat sodný; kyselina nalidixová; natamycin; nebramycin; neomycin palmitát; neomycin sulfát; neomycin undecylenat; netilmicin sulfát; neutramycin; nifuraden; nifuraldezon; nifuratel; nifuratrone; nifurdazil; nifurimid; nifurpirinol; nifurquinazol; nifurthiazol; nitrocyklin; nitrofurantoin; nitromid; norfloxacin; novobiocin sodný; ofloxacin; ormetoprim; oxacilin sodný; oximonam; oximonam sodný; kyselina oxolinová; oxytetracyklin; oxytetracyklin vápenatý;

116 oxytetracyklin hydrochloride; paldirnycin; parachlorofenol; paulomycin; pefloxacin; pefloxacin mesylat; penamecilin; penicilín G benzathin; penicilín G, draselná sůl; penicilín G prokain; penicilín G, sodná sůl; penicilín V; penicillin V benzathin; penicilín V hydrabamin; penicilín V, draselná sůl; pentizidon sodný; fenylaminosalicylát; piperacilin sodný; pirbenicilin sodný; piridicilin sodný; pirlimycin hydrochlorid; pivampicilin hydrochlorid; pivampicilin pamoat; pivampicilin probenat; polymyxin B sulfát; porfyromycin; propikacin; pyrazinamid; pyrithione zinečnatý; chindekamin acetat; chinupristin; racefenikol; ramoplanin; ranimycin; relomycin; repromicin; rifabutin; rifametan; rifamexil; rifamid; rifampin; rifapentin; rifaximin; rolitetracyklin; rolitetracyklin nitrát; rosaramicin; rosaramicin butyrát; rosaramicin propionát; rosaramicin natrium-fosfát; rosaramicin stearat; rosoxacin; roxarson; roxithromycin; sancyklin; sanfetrinem sodný; sannoxicilin; sarpicilin; scopafungin; sisomicin; sisomicin sulfát; sparfloxacin; spectinomycin hydrochlorid; spiramycin; stalirnycin hydrochlorid; steffimycin; streptomycin sulfát; streptonicozid; sulfabenz; sulfabenzamid; sulfacetamid; sulfacetamid sodný; sulfacytin; sulfadiazin; sulfadiazin sodný; sulfadoxin; sulfalen; sulfamerazin; sulfameter; sulfamethazin; sulfamethizol; sulfamethoxazol; sulfamonomethoxin; sulfamoxol; sulfanilat zinku; sulfanitran; sulfasalazin; sulfasomizol; sulfathiazol; sulfazamet; sulfisoxazol; sulfisoxazol acetyl; sulfisoxazol diolamin; sulfomyxin; sulopenem; sultamicilin; suncilin sodný; talampicilin hydrochlorid; teicoplanin; temafloxacin hydrochlorid; temocilin; tetracyklin; tetracyklin hydrochlorid; tetracyklin v komplexu s fosfátem; tetroxoprim; thiamfenikol; thifencilin draselný; ticarcilin kresyl sodný; ticarcilin disodný; ticarcilin monosodný; ticlaton; tiodonium chlorid; tobramycin; tobramycin sulfát; tosufloxacin;

117 ·· *· ·· ·· ·· • · · » · *··Α • · · · f ·· « « « ··· ·· ·· ·· 99 ·*·· trimethoprim; trimethoprim sulfát; trisulfapyrimidiny;

troleandomycin; trospectomycin sulfát; tyrothricin;

vancomycin; vancomycin hydrochlorid; virginiamycin; a zorbamycin.

Antivirová činidla jsou sloučeniny, které brání infekci buněk viry nebo replikaci virů v buňkách. Existuje mnohem méně antivirových léků než antibakteriálních léků, protože proces virové replikace je velmi podobný replikatí. DNA v hostitelské buňce, takže by nespecifická antivirová činidla mohla být toxická pro hostitele. Existuje několik stadií v procesu virové infekce, která mohou být blokována nebo inhibována antivirovými činidly. Mezi tato stadia patří navázání viru na hostitelskou buňku (imunoglobuliny nebo vazebné peptidy), rozbalení viru (například amantadin), syntéza nebo translace virové DNA nebo RNA (například analogy nukleosidů), zrání nových virových proteinů (například inhibitory proteas) a množení a uvolnění viru.

Analogy nukleotidů jsou syntetické sloučeniny, které jsou podobné nukleotidům, ale které mají nekompletní nebo abnormální deoxyribosu nebo ribosovou skupinu. Po průniku nukleotidového analogu do buňky je tento analog fosforylován, za vzniku trifosfátu, který kompetuje s normálními nukleotidy o inkorporaci do virové DNA nebo RNA. Po inkorporaci trifosfátové formy nukleotidového analogu do rostoucího nukleokyselinového řetězce způsobuje tento analog ireversibilní asociaci s virovou polymerasou a tak k ukončení řetězce. Mezi nukleotidové analogy patří, například, acyklovir (používaný pro léčbu infekce virem herpes simplex a varicellazoster), gancyklovir (používaný pro léčbu cytomegalovirové infekce), idoxuridin, ribavirin (používaný pro léčbu infekce respiračně syncitiálním virem), dideoxyinosin, dideoxycytidin

118

• ··	·* ·»		··
• · · ·	• · ·	• · · ·
• · *	• · ···	• ·	•
·· · · ·	·· ·*		·· · ·

a zidovudin (azidothymidin).

Interferony jsou cytokiny, které jsou secernovány buňkami infikovanými virem, stejně jako buňkami imunitního systému. Interferony se váží na specifické receptory na buňkách v sousedství infikovaných buněk, kde způsobují změny, které chrání buňky před infekcí virem. Alfa a beta interferon také indukují expresi MHC molekul třídy I a II na povrchu infikovaných buněk, což vede ke zvýšené prezentaci antigenů pro rozpoznávání imunitním systémem hostitele. Alfa a betainterferony jsou dostupné jako rekombinantní formy a jsou používané pro léčbu chronické hepatitidy B a C. V dávkách, při kterých jsou účinné pro antivirovou terapii, mají interferony závažné nežádoucí účinky, jako je horečka, úbytek hmotfbsti a chátrání.

Terapie imunoglobuliny se používá pro prevenci virových infekcí. Terapie virových infekcí imunoglobuliny je jiná než terapie bakteriálních infekcí, protože místo toho, aby byla tato terapie specifická pro antigen se imunoglobuliny váží na extracelulární viriony a brání jejich navázání a vstupu do buněk, které jsou vnímavé na virovou infekci. Terapie je použitelná pro prevenci virových infekcí po dobu, po kterou jsou protilátky přítomné v hostiteli. Obecně existují dva typy imunoglobulinové terapie: normální imunoglobulinová terapie a hyperimunoglobulinová terapie. Normální imunoglobulinová terapie využívá protilátek, které jsou připraveny ze séra normálních dárců krve. Tento produkt obsahuje nízké titry protilátek k různým lidským virům, jako je virus hepatitidy A, parvovirus, enterovirus (zejména u novorozenců).

Hyperimunoglobulinová terapie využívá protilátek, které jsou připraveny ze séra jedinců, kteří mají vysoké titry protilátky k určitému viru. Tyto protilátky jsou potom znovu použity k

119 • ·* ·· 99 »9 99

99 999 9999 • 99 999*9 >9 9

999 999 9 999

9<9 *9 «9 99 99 9999 určitému viru. Příklady hyper-imunoglobulinů jsou zoster imunoglobulin (použitelný pro prevenci varicelly u imunokompromitovaných dětí a novorozenců), lidský imunoglobulin proti vzteklině (použitelný pro ex-post profylaxi u jedinců pokousaných zvířetem nakaženým vzteklinou), imunoglobulin proti hepatitidě B (použitelný pro prevenci infekce virem hepatitidy B, zejména u jedinců vystavených viru) a RSV imunoglobulin (použitelný pro léčbu infekcí respiračně syncytiálním virem).

Jiným typem imunoglobulinové terapie je aktivní imunizace.

Aktivní imunizace zahrnuje podávání protilátek nebo fragmentů protilátek k virovým povrchovým proteinům. Dva typy vakcín, které jsou dostupné pro aktivní imunizaci proti hepatitidě B, obsahují protilátky proti hepatitidě B získané ze séra a rekombinantní protilátky proti hepatitidě B. Obě vakcíny jsou připraveny z HBsAg. Protilátky jsou podávány ve třech dávkách jedincům s vysokým rizikem infekce virem hepatitidy B, jako jsou zdravotníci, sexuální partneři chronických nosičů a děti.

Mezi anti-virová činidla použitelná v předkládaném vynálezu tedy patří například imunoglobuliny, amantadin, interferon, analogy nukleosidů a inhibitory proteasy. Konkrétními příklady anti-virových činidel jsou acemannan; acyklovir; acyklovir sodný; adefovir, alovudin; alvircept sudotox; amantadin hydrochlorid; aranotin; arildon; atevirdin mesylat; avridin; cidofovir; cipamfylin; cytarabin hydrochlorid; delavirdin mesylat; desciclovir; didanosin; disoxaril; edoxudin; enviraden; enviroxim; famciclovir; famotin hydrochlorid; fiacitabin; fialuridin; fosarilat; foscarnet sodný; fosfonet sodný; ganciclovir; ganciclovir sodný; idoxuridin; kethoxal; lamivudin; lobucavir; memotin hydrochlorid; methisazon; nevirapin; penciclovir; pirodavir; ribavirin; rimantadin • »· ·» 99 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 · » ·

120 • · · · · 9 · · * * ··· 99 99 99 99 9999 hydrochlorid; saquinavir mesylat; somantadin hydrochlorid;

sorivudin; statolon; stavudin; tiloron hydrochlorid;

trifluridin; valacyclovir hydrochlorid; vidarabin; vidarabin fosfát; vidarabin natrium-fosfát; viroxim; zalcitabin;

zidovudin; a zinviroxim.

Anti-mykotická činidla jsou vhodná pro léčbu a prevenci infekce houbami. Anti-mykotická činidla jsou někdy klasifikována podle mechanismu účinku. Některá anti-mykotická činidla účinkují jako inhibitory syntézy buněčné stěny tím, že inhibují glukosa-synthasu. Mezi taková činidla patří, například, basiungin/ECB. Další anti-mykotická činidla destabilizují integritu membrány. Mezi tato činidla patří, například, imidazoly, jako je clotrimazol, sertakonazol, flukonazol, itrakonazol, ketokonazol, mikonazol a vorikonazol, stejně jako FK 463, amfotericin Β, BAY 38-9502, MK 991, pradimicin, UK 292, butenafin a terbinafin. Jiná antimykotická činidla způsobují rozpad chitinu (například chitinasy) nebo imunosupresi (501 krém). Některé příklady komerčně dostupných činidel jsou uvedeny v tabulce B.

Tabulka B

Společnost	Obchodní název	Generický název	Indikace	Mechanismus účinku
Pharmacia a Upjohn	PNU 196443	PNU 196433	anti-mykotikum	n/k
Lilly	LY 303366	Basiungin/ECB	Mykotické infekce	anti- mykotikum/inhibitor syntézy buněčné stěny/inhibitor glukosa synthasy
Bayer	Canesten	Klotrimazol	Mykotické infekce	destab. integrity membrány
Fujisawa	FK463	FK463	Mykotické infekce	Destabilizátor integrity membrány
Mylan	Sertaconazol	Sertaconazol	Mykotické infekce	Destabilizátor

121

0 00	0 »	·*	• 4	00
00 »	0	0	•	»	• 9	0 «
• ·	•	«	•	4 4*	e 4	4
• ·	0	•	•	0 0	0 ·	4
00 4 00		04		00	00	04 00

integrity membrány

Genzyme	Chitinasa	Chitinasa	Mykotické infekce, systémová	rozpad chitinu
Liposome	Abelcet	Amfotericin B, liposomální	Mykotické infekce, systémová	Destabilizátor integrity membrány
Sequus	Amphotec	Amfotericin B, liposomální	Mykotické infekce, systémová	Destabilizátor integrity membrány
Bayer	BAY 38-9502	BAY 38-9502	Mykotické infekce, systémová	Destabilizátor integrity membrány
Pfizer	Diflucan	Fluconazol	Mykotické infekce, systémová	Destabilizátor integrity membrány
Johnson a Johnson	Sporanox	Itraconazol	Mykotické infekce, systémová	Destabilizátor integrity membrány
Sepracor	Itraconazol (2R,4S)	Itraconazol (2R,4S)	Mykotické infekce, systémová	Destabilizátor integrity membrány
Johnson a Johnson	Niyoral	Ketoconayol	Mykotické infekce, systémová	Destabilizátor integrity membrány
Johnson a Johnson	Monistat	Miconayol	Mykotické infekce, systémová	Destabilizátor integrity membrány
Merck	MK991	MK991	Mykotické infekce, systémová	Destabilizátor integrity membrány
Bristol Mzers Squib	'Pradimicin	Pradimicin	Mykotické infekce, systémová	Destabilizátor integrity membrány
Pfizer	UK/292.663	UK-292.663	Mykotické infekce, systémová	Destabilizátor integrity membrány
Pfizer	Voriconazol	Voriconayol	Mykotické infekce, systémová	Destabilizátor integrity membrány
Mylan	501 Cream	501 Cream	zanetliva onemocněni mykoticka	imunosuprese
Mylan	Mentax	butenafin	nehtove mykozy	Destabilizátor integrity membrány
Schering Plough	antimykotikum	antimykotikum	oprotunní infekce	Destabilizátor integrity membrány
Alza	Mycelex Troche	Clotrimazol	orální soor	stabilizátor integrity membrány
Novartis	Lamisil	Terbinafin	Onychomykosa	Destabilizátor

integrity membrány • 9 99

9 9 • 9

122

9 9 » · ·

9 9 9

9 9

999 99

9 9 · ·99

9 9 9

99

9 • * *

····

Tak patří mezi antimykotika použitelná v předkládaném vynálezu například imidazoly, FK 463, amfotericin B, BAY 389502, MK 991, pradimicin, UK 292, butenafin; chitinasa; 501 krém; acrisorcin; ambruticín; amorolfin; amfotericin B; azaconazol; azaserin; basifungin; bifonazol; bifenamin hydrochlorid; bispyrithion magsulfex; butokonazol nitrát; kalcium-undecylenat; candicidin; carbol-fuchsin; chlordantoin; ciclopirox; ciclopirox olamine; cilofungin; cisconazole; clotrimazol; cuprimyxin; denofungin; dipyrithion; doconazol; econazol; econazol nitrát; enilconazol; ethonam nitrát; fenticonazol nitrát; filipin; fluconazol; flucytosin; fungimycin; griseofulvin; hamycin; isoconazol; itraconazol; kalafungin; ketoconazol; lomofungin; lydimycin; mepartricin; miconazole; miconazole nitrát; monensin; monensin sodný; naftifin hydrochlorid; neomycin undecylenat; nifuratel; nifunneron; nitralamin hydrochlorid; nystatin; kyselina oktanová; orconazol nitrát; oxiconazol nitrát; oxifungin hydrochlorid; parconazol hydrochlorid; partricin; jodid draselný; proclonol; pyrithion zinečnatý; pyrrolnitrin; rutamycin; sanguinarium chlorid; saperconazol; scopafungin; selenium sulfid; sinefungin; sulconazol nitrát; terbinafin; terconazol; thiram; ticlaton; tioconazol; tolciclat; tolindat; tolnaftat; triacetin; triafungin; kyselina undecylenová; viridofulvin; undecylenat zinku; a zinoconazol hydrochlorid.

Imunostimulační nukleové kyseliny mohou být kombinovány s jinými terapeutickými činidly, jako jsou adjuvans pro zesílení imunitní reakce. Imunostimulační nukleové kyseliny a jiné terapeutické činidlo mohou být podány simultánně nebo sekvenčně. Když jsou jiná terapeutická činidla podána simultáně, tak mohou být podána ve stejné nebo jiném prostředku, ale vždy jsou podána současně. Další terapeutická činidla jsou podána sekvenčně s jinými činidly a • ·

123 imunostimulační nukleovou kyselinou, když je podání jiných terapeutických činidel a nukleových kyselin samostatné. Doba mezi podání sloučenin je v řádu minut nebo déle. Dalšími terapeutickými činidly jsou adjuvans, cytokiny, protilátky nebo antigeny atd.

Imunostimulační nukleové kyseliny jsou použitelné jako adjuvans pro indukci systémové imunitní reakce. Tyto přípravky mohou být podány jedincům vystaveným působení antigenů za účelem zesílení imunitní reakce na antigen.

Kromě imunostimulačních nukleových kyselin mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu podány také s nonnukleokyselinovým adjuvans. Non-nukleokyselinové adjuvans je jakákoliv molekula nebo sloučenina kromě imunostimulační nukleové kyseliny, která může stimulovat protilátkovou a/nebo buněčnou imunitní reakci. Mezi taková adjuvans patří, například, adjuvans pro dosažení depo-efektu, imunostimulační adjuvans a adjuvans pro dosažení depo efektu a stimulaci imunitního systému.

Adjuvans, které vytváří depo-efekt, je adjuvans, které způsobuje pomalé uvolňování antigenů do těla, což prodlužuje expozici imunitních buněk antigenů. Do této třídy adjuvans patří, například, kamenec (například hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý); nebo emulzní prostředky obsahující minerální olej, neminerální olej nebo emulze olej ve vodě nebo voda v oleji, jako je Seppic ISA serie Montanide adjuvans (například, Montanide ISA 720, AirLiquide, Paris, France); MF59 (emulze skvalen-ve-vodě stabilizovaná Spán 85 a Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA; a PROVAX (emulze olej ve vodě obsahující stabilizační detergens a čindlo vytvářející micely; IDEC, Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA).

124 • · ·

Imunostimulační adjuvans je adjuvans, které způsobuje aktivaci buněk imunitního systému. Může napřílad indukovat produkci a sekreci cytokinů buňkami imunitního systému. Tato třída adjuvans zahrnuje, například, saponiny přečištěné z kůry stromu Q. saponaria, jako je QS21 (glycolipid, který eluuje ve 21. píku při HPLC frakcionaci; Aquila Biofarmaceuticals, Inc,, Worcester, MA); póly[di(karboxylatfenoxy)fosfazen (pCPP polymer; Virus Research Institute, USA); deriváty lipopolysacharidů, jako je monofosforyllipid A (MpL; Ribi ImmunoChem Research, Inc,, Hamilton, Ml), muramyl-dipeptid (MDP; Ribi) a threonyl-muramyl dipeptid (t-MDP; Ribi); OM-174 (glucosamin-disacharid příbuzný lipidu A; OM Farma SA, Meyrin, Switzerland); a Leishmaniový elongační faktor (přečištěný Leishmaniový protein; Corixa Corporation, Seattle, WA).

Adjuvans, která vytvářejí depo-efekt a stimulují imunitní systém, jsou ty sloučeniny, které mají obě výše uvedené funkce. Tato třída adjuvans zahrnuje, například, ISCOMS (imunostimulační komplexy, které obsahují smíšené saponiny, lipidy a tvoří částice velikosti virů s póry, které mohou udržovat antign; CSL, Melbourne, Australia); SB-AS2 (SmithKline Beecham adjuvantní systém #2, což je emulze olejve-vodě obsahující MPL a QS21: SmithKline Beecham Biologicals [SBB], Rixensart, Belgium); SB-AS4 (SmithKline Beecham adjuvantní systém #4, který obsahuje kamenec a MPL; SBB, Belgium); non-iontové blokové kopolymery, které tvoří micely, jako je CRL 1005 (tyto obsahují lineární řetězec hydrofobních polyoxypropylenů obklopený řetězcem polyoxyethylenu; Vaxcel, Inc., Norcross, GA) ; a Syntex Adjuvant Formulation (SAF, emulze olej ve vodě obsahující Tween 80 a neiontový blokový kopolymer; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO).

125 • · · • · · ·

• · · · · ·

Imunostimulační nukleové kyseliny jsou také použitelné jako slizniční adjuvans. Drive bylo popsáno, že jak slizniční, tak systémová imunita je indukována slizniční aplikací CpG nukleové kyseliny. Systémová imunita indukovaná v reakci na CpG nukleové kyseliny zahrnuje jak protilátkovou, tak buněčnou reakci na specifické antigeny, které nejsou schopny indukovat systémovou imunitní reakci, když jsou podány pouze na sliznici. Dále, jak CpG nukleové kyseliny, tak cholera toxin (CT, slizniční adjuvans, které indukuje Th2-reakci), indukují Cti. Toto je překvapivé, protože při systémové imunizaci je přítomnost Th2-protilátek spojena s chyběním CTL (Schirmbeck et al., 1995). Podle zde prezentovaných výsledků se předpokládá, že imunostimulační nukleové kyseliny budou účinkovat podobným způsobem.

Dále, imunostimulační nukleové kyseliny indukují slizniční reakci jak lokálně (například v plících), tak na vzdálených sliznicích (například v dolním trávicím traktu).

Imunostimulační nukleové kyseliny indukují významné koncentrace IgA protilátek na vzdálených sliznicích. CT se obecně považuje za vysoce účinné slizniční adjuvans. Jak bylo popsáno dříve (Snider, 1995), CT indukuje především protilátky IgGl izotypu, které jsou charakteristické pro reakci Th2-typu. Naopak, imunostimulační nukleové kyseliny indukují spíše Thl reakci s IgG2a protilátkami, zejména po dosycovací imunizaci nebo při kombinaci dvou adjuvans. Protilátky Thl typu mají obecně lepší neutralizační schopnost a kromě toho je Th2 reakce v plících značně nežádoucí, protože je spojena s asthmatem (Kay, 1996, Hogg, 1997). Použití imunostimulačních nukleových kyselin jako sliJti-čních adjuvans má výhody, které chybějí ostatním slizničním adjuvans. Imunostimulační nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou také použitelné jako slizniční adjuvans pro indukci jak systémové, tak

126 • · · ·

9 • · * • 9

slizniční imunitní reakce.

Slizniční adjuvans označované jako non-nukleokyselinové slizniční adjuvans může být také podáno s imunostimulačními nukleovými kyselinami. Non-nukleokyselinové slizniční adjuvans je adjuvans jiné než imunostimulační nukleová kyselina, které může indukovat slizniční imunitní reakci u jedinci po podání na povrch sliznice v kombinaci s antigenem. Mezi slizniční adjuvans patří, například, bakteriální toxiny, jako je např. Cholera toxin (CT), deriváty CT, jako je CT B podjednotka (CTB) (Wu et al., 1998, Tochikubo et al., 1998); CTD53 (Val na Asp) (Fontana et al., 1995); CTK97 (Val na Lys) (Fontana et al., 1995); CTK104 (Tyr na Lys) (Fontana et al., 1995); Cm53/K63 (Val na Asp, Ser na Lys) (Fontana et al., 1995);

CTH54 (Arg na His) (Fontana et al., 1995); C1N107 (His na Asn) (Fontana et al., 1995); CTE114 (Ser na Glu) (Fontana et al., 1995); CTE112K (Glu na Lys) (Yamamoto et al., 1997a); CTS61F (Ser na Phe) (Yamamoto et al., 1997a, 1997b); CTS106 (Pro na Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995); a CTK63 (Ser na Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995), Zonula occludens toxin, zot, Escherichia coli termolabilní enterotoxin, labilní Toxin (LT), LT deriváty, jako je LT B podjednotka (LTB) (Veerweij et al., 1998); LT7K (Arg na Lys) (Komase et al., 1998, Douce et al., 1995); LT61F (Ser na Phe) (Komase et al., 1998); LT112K (Glu na Lys) (Komase et al.,

1998); LT118E (Gly na Glu) (Komase et al., 1998); LT146E (Arg na Glu) (Komase et al., 1998); LT192G (Arg na Gly) (Komase et al., 1998); LTK63 (Ser na Lys) (Marchetti et al., 1998, Douce et al., 1997, 1998, Di Tommaso et al., 1996); a LTR 72 (Ala na Arg) (Giuliani et al., 1998), Pertussis toxin, PT, (Lycke et al., 1992, Spangler BD, 1992, Freytag a Clemments, 1999, Roberts et al., 1995, Wilson et al., 1995) včetně PT9K/129G (Roberts et al., 1995, Cropley et al., 1995); deriváty toxinů

(viz dále) (Holmgren et al., 1993, Verweij et al., 1998, Rappuoli et al., 1995, Freytag a Clements, 1999); deriváty lipidu A (např. monofosforyllipid A, MPL) (Sasaki et al.,

1998, Vancott et al., 1998); deriváty muramyldipeptidu (MDP) (Fukushima et al., 1996, Ogawa et al., 1989, Michalek et al., 1983, Morisaki et al., 1983); proteiny zevní bakteriální membrány (například zevní membránový protein A (OspA), lipoprotein Borrelia burgdorferi, zevní membránový protein Neisseria meningitidis)(Marinaro et al., 1999, Van de Verg et al., 1996); emulze olej ve vodě (např. MF59) (Barchfield et al., 1999, Verschoor et al., 1999, O'Hagan, 1998); soli hliníku (Isaka et al., 1998,1999); a Saponiny (např. QS21) Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worster, MA) (Sasaki et al., 1998, MacNealet al., 1998), ISCOMS, MF-59 (emulze skvalen-vevodě stabilizovaná Spán 85 a Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA); Seppic ISA serie montanidových adjuvans (např. Montanide ISA 720; AirLiquide, Paris, France); PROV A-X (emulze olej-ve-vodě obsahující detergens a činidlo vytvářející micely; IDEC Pharmaceutical Corporation, San Diego, CA); Syntext Adjuvant Formulation (SAF, Syntex Chemicalx, Inc. Boulder, CO); póly(di(karboxylátfenoxy)fosfazen (PCPP polymer, Virus Research Institute; USA) a Leishmaniový elongační faktor (Corixa Corporation, Seattle,

WA) .

Imunitní reakce mohou být také indukovány nebo zesíleny současným podáním nebo kolineární expresí cytokinů (Bueler a Mulligan, 1996; Chow et al., 1997; Geissler et al., 1997; Iwasaki et al., 1997; Kim et al., 1997) nebo B-7 kostimulačních molekul (Iwasaki et al., 1997; Tsuji et al., 1997) s imunostimulačními nukleovými kyselinami. Cytokiny mohou být podány přímo s imunostimulačními nukleovými kyselinami nebo mohou být podány ve formě nukleokyselinového

128 • · ·« • · · vektoru, který kóduje cytokin, takže je cytokin exprimován in vivo. V jednom provedení je cytokin podán ve formě plasmidového expresního vektoru. Termín „cytokin označuje různorodou skupinu solubilních proteinů a peptidů, které působí jako humorální regulátory v nano- až pikomolárních koncentracích a které, za normálních nebo patologických podmínek, modulují funkční aktivity jednotlivých buněk a tkání. Tyto proteiny také přímo zprostředkují interakce mezi buňkami a regulují procesy, které probíhají v extracelulárním prostředí. Příklady cytokinů jsou, například, IL-2, IL-4, IL5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů (GM-CSF), faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF), interferon-gamma (IFN-gamma), IFN-alfa, faktor nekrosy nádorů (TNF), TGF-beta, FLT3 ligand a CD40 ligand.

Cytokiny mají úlohu v řízení reakce T-lymfocytů. Pomocné (CD4+) T-lymfocyty koordinují imunitní reakci u savců prostřednictvím produkce solubilních faktorů, které působí na jiné buňky imunitního systému, včetně jiných T-lymfocytů. Většina zralých CD4+ T pomocných buněk exprimuje jeden ze dvou cytokinových profilů: Thl nebo Th2. Thl podskupina indukuje oddálenou hypersensitivitu, buněčnou imunitu a přesmyk imunoglobulinů na třídy IgGža. Th2 podskupina indukuje humorální imunitu aktivací B-lymfocytů, podporou produkce protilátek a indukcí přesmyku protilátek na IgGi a IgE. V některých provedeních je výhodné, aby byl cytokinem Thl cytokin.

Nukleové kyseliny jsou také užitečné pro přesměrování imunitní reakce z Th2 imunitní reakce na Thl imunitní reakci. Přesměrování Th2 na Thl imunitní reakci může být hodnoceno měřením koncentrací cytokinů produkovaných v odpovědi na

129 nukleovou kyselinu (například indukcí monocytů a jiných buněk k produkci Thl cytokinů, včetně IL-12, IFN-gamma a GM-CSF). Přesměrování nebo vyvážení imunitní reakce z Th2 na Thl odpověď je zejména vhodné při léčbě nebo prevenci asthmatu. Například, účinné množství pro léčbu asthmatu může být množství použitelné pro přesměrování imunitní reakce Th2 typu, která je asociovaná s asthmatem, na reakci Thl typu. Th2 cytokiny, zejména IL-4 a IL-5, jsou zvýšené v dýchacích cestách asthmatiků. Tyto cytokiny podporují významné aspekty asthmatické zánětlivé reakce, včetně přesmyku na IgE izotyp, chemotaxe eosinofilů a aktivace a růstu žírných buněk. Thl cytokiny, zejména IFN-gamma a IL-12, mohou potlačovat tvorbu Th2 klonů a produkci Th2 cytokinů. Imunostimulační nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu způsobují zvýšení Thl cytokinů, které napomáhají vyvážejí imunitního systému a brání nebo snižují nežádoucí účinky spojené s převládající imunitní reakcí Th2 typu.

Nukleové kyseliny jsou také použitelné pro zlepšení přežívání, diferenciace, aktivace a zrání dendritických buněk. Imunostimulační nukleové kyseliny mají jedinečnou schopnost podporovat přežívání buněk, diferenciaci, aktivaci a zrání dendritických buněk. Dendritické prekursorové buňky izolované z krve pomocí imun?nagnetického třídění buněk získávají morfologické a funkční charakteristiky dendritických buněk během dvoudenní inkubace s GM-CSF. Bez GM-CSF tyto buňky podléhají apoptose. Imunostimulační nukleové kyseliny jsou lepší než GM-CSF v podpoře přežívání a diferenciace dendritických buněk (exprese MHC II, velikosti buněk, granularity). Imunostimulační nukleové kyseliny také indukují zrání dendritických buněk. Protože dendritické buňky tvoří vazbu mezi nespecifickou a specifickou imunitou, tím že prezentují antigen a exprimují rozpoznávací receptory, které • “

130 :: · ·.

• · · · ·

detekují mikrobiální molekuly, jako je LPS, v jejich lokálním prostředí, podporuje možnost aktivace dendritických buněk imunostimulačními nukleovými kyselinami jejich použití pro in vivo a ex vivo imunoterapii onemocnění, jako jsou nádory a alergická nebo infekční onemocnění. Imunostimulační nukleové kyseliny jsou také použitelné pro aktivaci a indukci zrání dendritických buněk.

Imunostimulační nukleové kyseliny také zvyšují lytickou aktivitu přirozených zabiječů a buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC). ADCC může být provedena za použití imunostimulačních nukleových kyselin v kombinaci s protilátkami specifickými pro buněčné cíle, jako jsou nádorové buňky. Když je imunostimulační nukleová kyselina podána jedinci současně s protilátkou, tak je imunitní systém příjemce indukován k zabíjení nádorových buněk. Mezi protilátky použitelné v ADCC patří protilátky, které interagují s buňkami v těle. V oboru bylo popsáno mnoho protilátek specifických pro buněčné cíle a mnohé takové protilátky jsou komerčně dostupné. Příklady takových protilátek jsou uvedeny dále v seznamu protinádorové imunoterapie.

Imunostimulační nukleové kyseliny mohou být také podány s protinádorovou terapií. Protinádorová terapie zahrnuje protinádorové léky, ozařování a chirurgické výkony. Termín protinádorový lék označuje činidla, která jsou podávána jedincům za účelem léčby nádorů. Termín léčba nádorů označuje prevenci vzniku nádorů, redukci příznaků nádorů a/nebo inhibici růstu nádoru. V jiných aspektech je protinádorový lék podán jedinci s rizikem vzniku nádoru za účelem redukce rizika vzniku nádoru. Jsou zde popsány různé typy léků pro léčbu nádorů. Pro účely této přihlášky jsou protinádorové léky klasifikovány jako chemoterapeutická činidla, *· *· ³ · · • ···

131 • ·

imunoterapeutická činidla, protinádorové vakcíny, hormonální léky a modifikátory biologické odpovědi.

Termín protinádorový lék označuje činidla, která jsou podávána jedincům za účelem léčby nádorů. Termín léčba nádorů označuje prevenci vzniku nádorů, redukci příznaků nádorů a/nebo inhibici růstu nádoru. V jiných aspektech je protinádorový lék podán jedinci s rizikem vzniku nádoru za účelem redukce rizika vzniku nádoru. Jsou zde popsány různé typy léků pro léčbu nádorů. Pro účely této přihlášky jsou protinádorové léky klasifikovány jako chemoterapeutická činidla, imunoterapeutická činidla, protinádorové vakcíny, hormonální léky a modifikátory biologické odpovědi. Způsoby podle předkládaného vynálezu zahrnují použití jednoho nebo více protinádorových léků společně s imunostimulačními nukleovými kyselinami. Například může být imunostimulační nukleová kyselina podána s chemoterapeutickým a imunoterapeutickým činidlem. Alternativně může být protinádorovým lékem kombinace imunoterapeutického činidla a protinádorové vakcíny, nebo chemoterapeutického činidla a protinádorové vakcíny nebo chemoterapeutického činidla, imunoterapeutického činidla a protinádorové vakcíny, která je podávána jedinci za účelem léčby nebo prevence nádorů.

Protinádorové léky působí různými způsoby. Některé protinádorové léky působí tak, že ovlivňují fyziologické mechanismy, které jsou specifické pro nádorové buňky.

Příkladem je cílené ovlivnění specifických genů a jejich genových produktů (tj. proteinů), které jsou mutované u nádorů. Mezi takové geny patří onkogeny (napři&ad Ras, Her2, bcl-2), tumor-supresorové geny (například EGF, p53, Rb) a geny buněčného cyklu (například CDK4, p21, telomerasa).

Protinádorové léky mohou ovlivňovat dráhy přenosu signálu a ·· »· > · · ♦

132 • 0 * · · < ·· 00 molekulární mechanismy, které změněny v nádorových buňkách. Cílené ovlivnění nádorových buněk prostřednictvím epitopů exprimovaných na jejich povrchu lze provést pomocí monoklonálních protilátek. Tento typ protinádorové léčby se obecně označuje jako imunoterapie.

Jiné protinádorové léky ovlivňují jiné než nádorové buňky. Například některé léky indukují imunitní systém k napadání nádorových buněk (tj. protinádorové vakciny). Ještě jiné léky, označované jako inhibitory angiogenese, ovlivňují tok krve v solidních nádorech. Protože většina maligních nádorů může metastazovat (tj. šíří se z primárního místa dále, kde vytvářejí sekundární nádory), jsou léky působící proti metastazování také použitelné pro léčbu nádorů. Mezi angiogenní mediátory patří bazický FGF, VEGF, angiopoetiny, angiostatin, endostatin, TNFa, TNP-470, trombospondin-1, trombocytární faktor 4, CAI a některé členy integrinové rodiny proteinů. Jednou kategorií tohoto typu je lék označovaný jako inhibitor metaloproteinasy, který inhibuje enzymy používané nádorovými buňkami v primárním místě nádoru k extravazaci do jiných tkání.

Některé nádorové buňky jsou antigenní a mohou být proto rozpoznány imunitním systémem. V jednom aspektu je kombinované podání imunostimulační nukleové kyseliny a protinádorových léků, zejména imunoterapeutických léků, použitelné pro stimulaci specifické imunitní reakce proti nádorovému antigenů. Nádorový antigen, jak je zde použito, je sloučenina, jako je peptid, asociovaná s nádorem nebo povrchem nádorových buněk, která může vyvolat imunitní reakci, když je exprimována na povrchu buněk prezentujících antigen společně s MHC molekulou. Nádorové antigeny, jako jsou antigeny přítomné v protinádorových vakcínách nebo antigeny používané **

133 • « » »« ··»· » ·

Β

A •

• A* • » »·ι<

• » · i • · · a ·· *· v přípravě protinádorové imunoterapie, mhou být připraveny ze surových extraktů nádorových buněk, jak je popsáno v Cohen et al., 1994, Nádory Research, 54: 1055, nebo částečným přečištěním antigenů, za použití rekombinantní technologie, nebo de novo syntézou známých antigenů. Nádorové antigeny mohou být použity ve formě imunogenních částí konkrétního antigenů, nebo může být v některých případech použito celých buněk nebo nádorové hmoty. Takové antigeny mohou být izolovány nebo připraveny rekombinantně nebo jakýmikoliv jinými prostředky známými v oboru.

Teorie imunologického dohledu spočívá v tom, že primární funkcí imunitního systému je detekce a eliminace neoplastických buněk před vznikem nádoru. Základním principem této teorie je to, že nádorové buňky jsou antigenně odlišné od normálních buněk a tak vyvolávají imunitní reakce, které jsou podobné rejekci imunolťígicky inkopatibilních allotransplantátů. Studie potvrdily, že se nádorové buňky liší, kvalitativně nebo kvantitativně, v expresi antigenů. Například, nádorově specifické antigeny jsou antigeny, které jsou specificky asociované s nádorovými buňkami, ale ne s normálními buňkami. Příklady nádorově specifických antigenů jsou virové antigeny v nádorech indukovaných DNA nebo RNA viry. Antigeny asociované s nádory jsou přítomné jak v nádorových buňkách, tak v normálních buňkách, ale v nádorových buňkách jsou přítomné v jiném množství nebo formě. Příklady takových antigenů jsou onkofetální antigeny (například karcinoembryonální antigen), diferenciační antigeny (například T a Tn antigeny) a produkty onkogenů (například HER/neu).

Byly identifikovány různé typy buněk, které mohou zabíjet nádorové buňky in vitro a in vivo: přirození zabiječi (NK

134 buňky), cytolytické T-lymfocyty (CTL), žabíječí aktivovaní lymfokiny (LAK) a aktivované makrofágy. NK buňky mohou zabíjet nádorové buňky bez předchozí senzibilizace specifickými antigeny a jejich aktivita nevyžaduje přítomnost antigenů třídy I kódovaných hlavním histokompatibilním komplexem (MHC) na cílových buňkách. Předpokládá se, že NK buňky se podílejí na kontrole rostoucích nádorů a na kontrole růstu metastas. Oproti NK buňkám mohou CTL zabíjet nádorové buňky pouze potom, co byly senzibilizované k nádorovým antigenům a poté, co je nádorový antigen exprimován na nádorových buňkách, které také exprimují MHC třídy I. CTL se považují za efektorové buňky při rejekci transplantovaných nádorů a nádorů způsobených DNA viry. LAK buňky jsou podskupinou nulových lymfocytů odlišnou od NK a CTL populací. Aktivované makrofágy mohou zabíjet nádorové buňky způsobem, který není po aktivaci ani závislý na antigenů, ani MHC restrihovaný. Předpokládá se, že aktivované makrofágy snižují růst nádorů, do kterých infiltrovaly. Testy in vitro identifikovaly jiné imunitní mechanismy, jako je buněčná cytotoxická reakce závislá na protilátkách a lýza protilátkami a komplementem. Nicméně se předpokládá, že tyto imunitní efektorové mechanismy jsou méně významné in vivo než funkce NK, CTL, LAK a makrofágů in vivo (pro přehled viz Piessens, W.F. a David, J. Tumor Immunology, v Scientifics American Medicine, svazek 2, Scientific American Books, N.Y. str. 1-13, 1996).

Cílem imunoterapie je zesílení imunitní reakce pacienta na existující nádor. Jedna metoda imunoterapie zahrnuje použití adjuvans. Adjuvantní substance odvozené od mikroorganismů, jako je bacillus Calmette-Guerinové, zesilují imunitní reakci a zvyšují resistenci na nádory u zvířat.

Imunoterapuetická činidla jsou léky, které jsou odvozeny od

135 • · AAA AAAA ·· A A A A A AA A protilátek nebo fragmentů protilátek, které se specificky váží na antigen a rozpoznávají antigen. Termín nádorový antigen je obecně definován jako antigen exprimovaný na nádorových buňkách. Ještě lépe je antigen takový, který není exprimován na normálních buňkách, nebo alespoň není exprimován v takovém množství jako na nádorových buňkách. Protilátkové imunoterapie účinkují tak, že se váží na povrch nádorových buněk a tak stimulují endogenní imunitní systém k útoku na nádorové buňky. Jindy může protilátka působit jako přepravní vehikulum pro specifické zacílení toxických substancí do nádorových buněk. Protilátky jsou obvykle konjugovány na toxiny, jako je ricin (například z ricinových semen), calicheamycin a maytansinoidy, na radioaktivní izotopy, jako je jód-131 a yttrium-90, na chemoterapeutická činidla (jak jsou zde popsána) nebo na modifikátory biologické odpovědi. Tímto způsobem mohou být toxické substance koncentrovány v regionu nádoru nebo může být minimalizována nespecifická toxicita pro normální buňky. Kromě použití protilátek, které jsou specifické pro nádorové antigeny jsou ve způsobech podle předkládaného vynálezu použitelné protilátky, které se váží na cévy, například na endotelové buňky. Tyto protilátky jsou použitelné proto, že solidní nádory jsou závislé na nově vytvořených cévách a většina nádorů může indukovat a stimulovat růst nových krevních cév. Proto je jednou strategií protinádorové léčby napadaní krevních cév nádoru a/nebo pojivové tkáně (nebo stromatu) podporující takové cévy.

136

Tabulka C

Protinádorová imunoterapeutická činidla ve vývoji nebo na trhu
Prodejce	obchodní název (generický název)	Indikace
IDEC/Genentech, Inc.IHoffinannLaRoche (první monoklonální protilátka licencovaná pro léčbu nádorů v USA	RituxanTM (rituximab, Mabthera) (mECC2B8, chimérická myší/lidská anti-CD20 MAb)
Genentech/Hoffinann-La Roche	Herceptin. anti-Her2 hMAb	prs/vaječníky
Cytogen Corp.	Quadramet (CYT-424) radioterapeutické činidlo	kostní metastasy
Centocor/Glaxo/Ajinomoto	Panorex@ (17-1 A) (myší monoklonální protilátka)	Adjuvant terapie kolorektálního karcinomu (Dukes-C)
Centocor/Ajinomoto	Panorex@ (17-IA) (chimérická myší monoklonální protilátka)	Pancreas, plíce, prs, vaječníky
IDEC	IDEC- Y2B8 (myší, anti-CD20 MAb značená Yttriem-90)	non-Hodgkinský lymfom
ImClone Systems	BEC2 (anti-idiotypová MAb, napodobuje GD3 epitop) (s BCG)	malobuněčný karcinom plic
ImClone Systems	C225 (chimérická monoklonální protilátka receptoru pro epidermální růstový faktor (EGF)	karcinom ledvin
T echniclone International/ Alpha Therapeutics	Oncolym(Lym-l monoklonální protilátka vázaná na jód-131)	non-Hodgkinský lymfom
Protein Design Labs	SMARTM195 Ab, humanizovaná	Akutní myleoidní leukemie
Techniclone Corporation/Cambridge Protilátka Technology	131-1 LYM-I (OncolymTM)	non-Hodgkinský lymfom
Aronex Pharmaceuticals. lne.	ATRAGEN®	Akutní promyelocytámí leukemie
ImClone Systems	C225 (chimérická anti-EGFr monoklonální protilátka + + eisplatina nebo radiace	nádory hlavy a krku nemalobuněčné nádory plic

137

Altarex, Canada	Ovarex (B43.13, anti-idiotypová CAI2S, myší MAb)	Ovaria
Coulter Phanna (Klinické výsledky byly pozitivní, ale lék byl spojen s významnou toxicitou pro kostní dřeň	Bexxar (anti-CD20 Mab značená 131-1)	non-Hodgkinský lymfom
Aronex Phannaceuticals, lne.	ATRAGEN®	Kaposiho sarkom
IDEC Pharmaceuticals CorpJGenentech	RjtuxanTM (MAb proti CD20) pan-B Ab při kombinaci s chemoterapií	B lymfocytámí lymfom
LeukoSite/llex Oncology	LDP-03, huMAb k leukocytámímu antigenu CAMPATH	Chronická lymfocytámí leukemie (CLL)
Center of Molecular Immunology	ior tó (anti CD6. mvŠí MAK) CTCL	Nádory
Medarex.lNovartis	MDX-210 (humanizovaná anti-HER-2 bispecifickáká protilátka)	prso, vaječníky
Medarex.lNovartis	MDX-210 (humanizovaná antí-HER-2 bispecifickáká protilátka)	Prostata, nemalobuněčné plíce pankreas, prs
Medarex	MDX-Π (komplement aktivující receptor (CAR) monoklonální protilátka)	Akutní myelogenní leukemie (AML)
Medarex.Novartis	MDX-210 (humanizovaná anti-HER-2 bispecifická protilátka)	ledviny a střevo
Medarex	MDX-Π (komplement aktivující receptor (CAR) monoklonální protilátka)	Ex vivo zpracování kostní dřeně při akutní myeloidni leukémii (AML)
Medarex	MDX-22 (humanizovaná bispecifická protilátka, MAb-konjugáty) (aktivátory komplementové kaskády)	Akutní myleoidní leukemie
Cytogen	OVIO3 (Yttriem-90 značená protilátka)	vaječníky
Cytogen	OVIO3 (Yttriem-90 znaečná protilátka)	Prostata
Aronex Pharmaceuticals, lne.	ATRAGEN®	non-Hodgkinský lymfom
Glaxo Wellcome plc	3622W94 Mab, která se váže na EGP40 (17-IA) pankarcinomový antigen na adenokarcinomech	nemalobuněčný karcinom plic prostata (adjuvantně)
Genentech	Anti-VEGF, RhuMAb (inhibuje angiogenesi)	plíce, prs, prostata kolorekfální karcinom
Protein Design Labs	Zenapax (SMART Anti- Tac (IL-2 receptor) Ab, humanizovaná)	Leukemie, lymfom
Protein Design Labs	SMART M19S Ab, humanizovaná	Akutní promyelocytámí leukemia
ImClone Systems	C22S (chimérická anti-EGFr monoklonální protilátka) + taxol	prs
ImClone Systems (licensed lřom RPR)	C22S (chimérická anti-EGFr monoklonální protilátka) + doxorubicin	prostata
ImClone Systems	C22S (chimérická anti-EGFr monoklonální protilátka) + adriamycin	prostata
ImClone Systems	BEC2 (anti-idiotypová MAb, napodobuje GD3 epitop)	Melanom
Medarex	MDX-210 (humanizovaná anti-HER-2 bispecifická	Nádory

• ft ftft • · · • » • ·

138

	protilátka)		I
Medarex	MDX-220 (bispecifická pro nádory exprimující TAG-72)	plíce, střevo, prostata ovarium, endometrium, pancreasa žaludek
Medarex/Novartis	MDX-210 (humanizovaná anti-HER-2 bispecifická protilátka)	Prostata
Medarex/Merck KgaA	MDX-447 (humanizovaná anti-EGF receptor bispecifická protilátka)	EGF receptor obsahující nádory (hlava a krk, prostata, plíce, močový měchýř, cervix, ovaria)
MedarexlNovartis ’’	komb. terapie s GCSF pro různé nádory, hlavně prsu
IDEC	MELIMMUNE-2 (myší monoklonální protilátka - terapeutická vakcína)	Melanom
ImEC	MELIMMUNE-1 (myší monoklonální protilátka - terapeutická vakcína )	Melanom
Immunomedics. Inc.	CEACIDE™ (1-131)	kolorektální nádory a jiné
NeoRx	TM Pretarget radioaktivní protilátky	non-Hodgkinský B lymfocytámí lymfom
Novophann Biotech, Inc.	NovoMAb-G2 (pankarcinomová specifická Ab )	Nádory
Techniclone Corporation/ Cambridge Protilátka Technology	TNT (chimérická MAb k histonovým antigenům)	mozek
Techniclone International/ Cambridge Protilátka Technology	TNT (chinteric MAb to histone antigens)	Brain
Novophann	Gliomab-H (Monoclonals - Humanizovaná Abs)	Brain, melanomas, neuroblastomas
Genetics Institute/ AHP	GNI-2S0 Mab	Colorectal
Merck KgaA	EMD-72000 (chimérická-EGF antagonist)	Nádory
Immunomedics	LymphoCide (humanizovaná LL2 protilátka)	non-Hodgkin's B-ccll lymfom
Immunex/ A HP	CMA 676 (monoklonální protilátka conjugate)	Akutní myelogenous leukemia
Novophann Biotech, Inc.	Monopharm-C	Colon, lung. pancreatic
Novopharm Biotech, Inc.	4BS anti-idiotype Ab	Melanoma, small-cell lung
Center of Molecular Immunology	ior egflr3 (anti EGF-R humanizovaná Ab)	Radioimunoterapie
Center of Molecular Immunology	ior cS (myší MAb kolorekt.) pro radioimunoterapii	kolorektální nádory
Creative BioMoleculesl Chiron	BABS (biosyntetická protilátka proti vazebnému místu) Proteiny	nádory prsu
ImClone SystemsIChugai	FLK-2 (monoklonální protilátka k fetální jaterní tinase-2 (FLK-2»	angiogenese spojená s nádory
ImmunoGen, Inc.	íonjugát humanizovaná MAb/malé molekuly	malobuněčný karicnom plic
Medarex, Inc.	VÍDX-260 bispecifická, zaměřená na GD-2	Melanom, gliom, neuroblastom
Procyon Biopharma	ANAAb	nádory
Protein Designs Labs	SMARTID10 AB	3-lymfocytámí lymfom
Protein Designs Labs/Novartis	SMART ABL 364 Ab	prs, plíce, kolon
Immunomedics, Inc.	mmuRAIT-CEA	tolorektální nádory

139

Ještě dalšími typy chemoterapeutických činidel, které mohou být použity podle předkládaného vynálezu, jsou aminoglutetimid, asparaginasa, busulfan, karboplatina, chlorambucil, cytarabin HCl, daktinomycin, daunorubicin HCl, estramustin fosfát sodný, etoposid (VP-16-213), floxuridin, fluoruracil (5-FU), flutamid, hydroxymočovina (hydroxykarbamid), ifosfamid, interferon a-2A, a-2b, leuprolid acetát (analog LHRH), lomustin (CCNU), mechloretamin HCl (dusíkatý yperit), merkaptopurin, mesna, mitotan (o.p. DDD), mitoxantron HCl, oktreotid, plicamycin, prokarbazin HCl, streptozotocin, tamoxifen citrát, thioguanin, thiotepa, vinblastin sulfát, amsacrin (m-AMSA), azacitidin, eyrthropoetin, hexamethylmelamin (HMM), interleukin-2, mitoguazon (methyl-GAG); methyl-glyoxal bis-guanylhydrazon (MGBG); pentostatin (2'-deoxykoformycin), semustin (methylCCNU), teniposid (VM-26) a vindesin-sulfát.

Protinádorové vakciny jsou léky, které jsou určeny pro stimulaci endogenní imunitní reakce na nádorové buňky.

Současné vakcíny přednostně aktivují humorální imunitní systém (tj. imunitní reakci závislou na protilátkách). Jiné, v současnosti vyvíjené vakcíny, jsou zaměřeny na aktivaci buněčného imunitního systému včetně cytotoxických T-lymfocytů, které mohou zabíjet nádorové buňky. Nádorové vakcíny obvykle zesilují prezentaci nádorových antigenu jak na buňkách prezentujících antigen (například makrofágách nebo dendritických buňkách) a/nebo na jiných buňkách imunitního systému, jako jsou T-lymfocyty, B-lymfocyty a NK buňky.

Ačkoliv mohou mít protinádorové vakcíny různé formy, jak je popsáno dále, je jejich cílem přenos nádorových antigenů a/nebo antigenů asociovaných s nádorem k buňkám prezentujícím antigen (APC) za účelem usnadnění endogenního zpracování

140 • φφ ·· Φ· φφφφ φ * φ φ φφφ φφφφ • ΦΦ ΦΦΦ·· φφ · • · ··· ·· ··· · · • · · ···· φ · φ ·♦· ·· φφ ·· φφ «··· takových antigenů APC a jejich prezentace na povrchu buněk v kontextu s MHC molekulami třídy I. Jedna forma vakcíny je celobuněčná vakcína, která je přípravkem nádorových buněk, které byly odebrány od jedince, které byly zpracovány ex vivo a které byly vráceny jako celé buňky jedinci. Lyzáty nádorových buněk mohou být také použity jako protinádorové vakcíny pro vyvolání imunitní reakce. Jinou formou nádorové vakcíny je peptidová vakcína, která používá nádorově specifické nebo s nádorem asociované malé proteiny pro aktivaci T-lymfocytů. Proteiny asociované s nádorem jsou proteiny, které nejsou asociované výlučně s nádorovými buňkami (tj. normální buňky mohou také exprimovat tyto antigeny.

Nicméně, exprese antigenů asociovaných s nádorem je obvykle zvýšená v nádorech určitého typu. Ještě jinou formou protinádorových vakcín je vakcína dendritických buněk, která obsahuje celé dendritické buňky, které byly vystaveny in vitro působení nádorového antigenů nebo antigenů asociovaného s nádorem. Lyzáty nebo membránové frakce dendritických buněk mohou být také použity jako nádorové vakcíny. Vakcíny dendritických buněk jsou schopny přímo aktivovat buňky prezentující antigen. Mezi další nádorové vakcíny patří gangliosidové vakcíny, vakcíny proteinů tepelného šoku, virové a bakteriální vakcíny a nukleokyselinové vakcíny.

Použití imunostimulačních nukleových kyselin společně s protinádorovými vakcinami poskytuje lepší humorální a buněčnou imunitní reakce specifickou pro antigen, kromě aktivace NK buněk a endogenních dendritických buněk, a dosahuje vyšších koncentrací IFNa. Toto zlepšení umožňuje použití vakcíny s nižší dávkou antigenů pro dosažení stejného účinku. V některých případech mohou být protinádorové vakcíny použity s adjuvans, jak jsou popsána výše.

• *· ·· « * ·· ·· ···· ··· · · · · • · · · · ··· · · ·

141 • · · · • · ·· · ···

Termín nádorový antigen označuje antigeny, které jsou jinak exprimovány na nádorových buňkách a které mohou být využity pro cílené zaměření nádorových buněk. Nádorové antigeny jsou antigeny, které mohou potenciálně stimulovat imunitní reakce specifické pro nádory. Některé z těchto antigenů jsou kódované, ale ne nutně exprimované, normálními buňkami. Tyto antigeny mohou být charakterizované jako normálně silentní (tj. neexprimované) v normálních buňkách, ale exprimované pouze v některých stadiích diferenciace a dočasně exprimované jako embryonální a fetální antigeny. Jiné nádorové antigeny jsou kódované mutantními buněčnými geny, jako jsou onkogeny /například aktivovaný ras onkogen), supresorovými geny (například mutantní p53), fúzními proteiny vzniklými v důsledku delecí nebo chromosomálních translokací.

Ještě jiné nádorové antigeny mohou být kódované virovými geny, jako jsou geny RNA a DNA nádorových virů.

Jiné vakciny mohu mít formu dendritických buněk, které byly vystaveny působení nádorových antigenů in vitro, zpracovaly antigen a mohou exprimovat nádorové antigeny na svém povrchu v kontextu s MHC molekulami pro účinnou prezentaci antigenu jiným buňkám imunitního systému.

Imunostimulační nukleové kyseliny jsou použity v jednom aspektu vynálezu společně s nádorovými vakcínami na bázi dendritických buněk. Dendritická buňka je profesionální buňka prezentující antigen. Dendritické buňky tvoří spojení mezi vlastním a získaným imunitním systémem tím, že prezentují antigeny a díky svým receptorům detekují mikrobiální molekuly, jako je LPS, ve svém okolí. Dendritické buňky účinně internalizuji, zpracovávají a prezentují solubilní antigeny, se kterými se setkají. Proces internalizace a prezentace antigenu způsobuje rychlé zvýšení exprese hlavního

142 • · ·♦ • · · • · · · · • · · · · histokompatibilního komplexu (MHC) a jiných kostimulačních molekul, produkci cytokinů a migraci do lymfatických orgánů, kde se předpokládané podílejí na aktivaci T-lymfocytů.

Tabulka D uvádí seznam protinádorových vakcin, které se vyvíjejí nebo jsou na trhu.

Vyvíjené nebo prodávané protinádorové vakcíny
Výrobce	Obchodní název (generický název)	Indikace
Center of Molecular Immunology	EGF	nádory
Center of Molecular Immunology		gangliosidová nádorová vakcína
Center of Molecular Immunology	anti-idiotypová	nádory
ImClone Systems/memorial Sloan- Ketterin Cancer Center	Gp75 antigen	meianom
ImClone Systems/memorial Sloan- Ketterin Cancer Center	anti-idiotypové Ab	nádory
Progenic Pharmaceuticals, lne.	GMK melanomová vakcína	meianom
Progenic Pharmaceuticals, lne.	MGV gangliosidová konjugátová vakcína	lymfom, kolorekt.
Corixa	Her2/neu	prs, ovarium
AVAX Technologies, lne.	Ovarex	ovarium
AVAX Technologies, lne.	M-Vax, autologní celé buňky	meianom
AVAX Technologies, lne.	O-Vax, autologní celé buňky	ovarium
Biomira Inc./Chiron	L-Vax, autologní celé buňky	leukemie-AML
Biomira Inc./Chiron	theratope, Stn-KLH	prs, kolorekt.
Biomira lne.	BLP25, MUC-1 peptidová vakcína enkapsulovaná v liposomálním systému	plíce
Biomira lne.	BLP25, MUC-1 peptidová vakcína enkapsulovaná v liposomálním systému + liposomální IL-2	plíce
Biomira lne..	liposomální idiotypová vakcína	B-lymfocytámí lymfom
Ribi Immunochem	melacin, buněčný lyzát	meianom
Corixa	peptidové antigeny, mikrosférový přepravní systém a LelF adjuvans	prs
Corixa	peptidové antigeny, mikrosférový přepravní systém a LelF adjuvans \|	prostata

·· »· ·· ·* ·· • · ·»· * » * * ·· ·····. · · ·

143

Corixa	peptidové antigeny, mikrosférový přepravní systém a LelF adjuvans	ovarium
Corixa	peptidové antigeny, mikrosférový přepravní systém a LelF adjuvans	lymfom
Corixa	peptidové antigeny, mikrosférový přepravní systém a LelF adjuvans	plíce
Virus research Institute	Toxin/antigen rekombinantní přepravní systém	nádory
Appolon Inc.	Genevax-TCR	T-lymfocytámí lymfom
Bavarian Nordic Research Institute A/S	MVA vakcina (virus vakcinie	melanom
BioChem Pharma/Bio/Chem Vaccine	PACIS, BCG vakcina	močový měchýř
Cantab Pharmaceuticals	TA-HPV	cervix
Cantab Pharmaceuticals	TA-CIN	cervix
Cantab Pharmaceuticals	DISC-virus, imunoterapie	nádory
Pasteur Merieux Connaught	ImmuCyst®/TheraCys® - BCG Imunoterapeutikum (bacillus Calmette-Guerinové/Connaught), pro intravesikální léčbu povrchového karcinomu močového měchýře	močový měchýř

Termín chemoterapeutické činidlo, jak je zde použit, zahrnuje všechny další formy protinádorových léků, které nespadají do kategorie imunoterapeutických činidel a protinádorových vakcín. Mezi chemoterapeutická činidla patří jak chemická, tak biologická činidla. Tato činidla inhibuji inhibují buněčnou aktivitu, kterou nádorové buňky potřebují pro trvalé přežívání. Do kategorie chemoterapeutických činidel patří alkylační činidla/alkaloidy, antimetabolity, hormony a analogy hormonů, a různá antineoplastická činidla. Většina z těchto činidel je přímo toxická pro nádorové buňky a nevyžadují imunostimulaci. Kombinace chemoterapie a podávání imunostimulačních nukleových kyselin zvyšuje maximální tolerovatelné dávky chemoterapie.

144 ·» • · · · • · · • · · • · · · · ·· • · · « • · · • « · · · · · *· ·· · ♦ · · ··

Chemoterapeutická činidla, která se v současnosti vyvíjejí nebo používají, jsou uvedeny v tabulce E.

Tabulka E

Vyvíjené nebo prodávané protinádorové lékyt
Prodejce	Obchodní název TNP 470/AGM 1470	Generický název Name	Indikace
Abbott	Fragylin	Anti-angiogenese u nádorů

Takeda TNP 470/AGM 1470	Fragylin	Anti-angiogenese u nádorů
Scotia Meglamine GLA	Meglamine GLA Valrubicin Valrubicin	Nádory močového měchýře
Medeva Valstar Medeva Valstar	Nádory močového měchýře, refraktemí karcinom in šitu Nádory močového měchýře, papilámí
Rhone Poulenc Gliadel Wafer	Cannustaine + Polifepr Osan	Nádory mozku
	Warner Lambert	nepopsané nádory (b)	nepopsané nádory (b)	Nádory
	Bristol Myers Squib	Inhibitor RAS Famesyl Transferasy	Inhibitor RAS Famesyl Transferasy	Nádory
	Novartis	MMI270	MMI270	Nádory
	Bayer	BAY 12-9566	BAY 12-9566	Nádory
	Merck	Inhibitor Famesyl Transferasy	Inhibitor famesyl transferasy	Nádoiy (Solidní nádory pankreas,, kolon, plíce, prs)
	Pfizer	PFE	MMP	Nádory, angiogenese
	Pfizer	PFE	Tyrosin Kinasa	Nádory, angiogenese
	Lilly	MTA/LY231514	MTA/LY231514	Solidní nádory
	Lilly	L y 264618/Lometexol	Lometexol	Solidní nádory
	Scotia	Glamolec	LiGLA (lithium-gamma linolenat)	Nádory pankreasu, prsu, steřva
	Warner Lambert	CI-994	CI-994	Nádory, Solidní nádoiy Leukemie
	Schering AG	inhibitor angiogenese	inhibitor angiogenese	Nádory / kardio
	Takeda	TNP-470	n/k	Maligní nárdory
	Smithkline Beecham	Hycamtin	Topotecan	Metastatické nádory ovaria
	Novartis	PKC 412	PKC 412	Nádory s mnohotnou lékovou resistencí
	Novartis	Valspodar	PSC 833	Myeloidní

·♦ ·» *» *· ·» » · * · · ··« • · » · ··« · · ·

145 • » · ···· ·«« ··· ·· ·· ·». >» ·«··

			leukemie/ovariální nádory
	Immunex	Novantrone	Mitoxantron	Bolest při hormonálně refraktemích nádorech prostaty
	Warner Lambert	Metař et	Suramin	Prostata
	Genentech	Anti-VEGF	Anti- VEGF	Prostata /Prs /kolorektum /NSCL nádory
	British Biotech	Batimastat	Batimastat (BB94)	Pterygium
	Eisai	E 7070	E 7070	Solidní nádory
	Biochem Pharma	BCH-4556	BCH-4556	Solidní nádory
	Sankyo	CS-682	CS-682	, Solidní nádory
	Agouron	AG2037	AG2037	Solidní nádory
	IDEC Pham a 9-AC		Solidní nádory
		9-AC
	Agouron	\| VEGF/b-FGF Inhibitors	VEGF/b-FGF Inhibitors	Solidní nádory
	Agouron	AG3340	AG3340	Solidní nádory / Makulámí degenerace

Vertex	Incel	VX-710	Solidní nádory - IV
Vertex	VX-853	VX-853	Solidní nádory - Orální
Zeneca	ZD0101 (inj)	ZD0101	Solidní nádory
Novartis	ISI641	ISL 641	Solidní nádory
Novartis	ODN 698	OON698	Solidní nádory
Tanube Seiyaku	TA 2516	Marimistat	Solidní nádory
British Biotech	Marimastat	Marimastat (BB 2516)	Solidní nádory
Celltech	COP 845	Aggrecanase Inhibitor	Solidní nádory /Prs
Chiroscience	D2163	D2163	Solidní nádory / Metastasy
Warner Lambert	PD 183805	PO 183805
Oaiichi	0X895 lf	0X895 lf	Nádory
Daiichi	Lemonal OP 2202	Lemonal OP 2202	Nádory
Fujisawa	FK317	FK317	Protinádorové antibiotikum
Chugai	Picibanil	OK-432	maligní nádory
Nycomed Amersham	AD 32/valrubicin	Valrubicin	Nádory močového měchýře - refraktemí karcinom in šitu
Nycomed Amersham	Metastron	Derivát stroncia	Nádory kostí (adjuvantní terapie)
Schering Plough	Temodal	Temozolomide	Nádory mozku
Schering Plough	Temodal	Temozolonide	Nádory mozku
Liposome	Evacet	Doxorubicin, Liposomal	Nádory prsu
Nycomed Amersham	Yewtaxan	Paclitaxel	Nádory prsu - pokročilé Nádory ovaria - pokročilé
Bristol Myers Squib	Taxol	Paclitaxel	Nádory prsu - pokročilé Nádory ovaria - pokročilé NSCLC
Roche	Xeloda	Capecitabine	Nádory prsu, kolorektální nádory

·· »» * · « « • · · · 0 «

4 9 «· ··<·

146 «· ♦

>·· * · • · • · Λ • · ·· • « « • 4 ··· • · · « • · · · ·* ♦ <

Roche	Furtulon	Doxifluridine	Nádory prsu, kolorektální nádory, nádory žaludku
Pharmacia & Upjohn	Adriamycin	Doxorubicin	Nádory prsu, Leukemie
Ivax	Cyclopax	Paclitaxel, Orální	Nádory prsu/ovaria
Rhone Poulenc	Orální taxoid	Orální taxoid	různé nádory
AHP	Novantrone	Mitoxantrone	Nádory
Sequus	SPI-O77	Cisplatina, Stealth	Nádory
Hoechst	HMR1275	Flavopiridol	Nádory
Pfizer	CP-358, 774	EGFR	Nádory
Pfizer	CP-609,754	Inhibitor RAS onkogenů	Nádory
Bristol Myers Squib	BMS-182751	orální platina	Nádory (plíce, ovaria)
Bristol Myers Squib	UFR (Tegafur/Uracil)	UFR (Tegafur/Uracil)	Nádory orální
Johnson & Johnson	Ergamisol	Levamisol	Nádory
.Glaxo Wellcome	Eniluracil/776C85	5FU Enhancer	Nádory, Refraktemí solidní & kolorektální
Johnson & Johnson	Ergamisol	Levamisole	Nádory střeva
Rhone Poulenc	Campto	Irinotecan	Kolorektální nádory, cervix
Pharmacia & Upjohn	Camptosar	Irinotecan	Kolorektální nádory, cervix
Zeneca	Tomudex	Ralitrexed	Kolorektální nádory, plíce

1			Nádory, nádory prsu
Johnson & Johnson	Leustain	Cladribine	Vlasatobuněčná leukemie
Ivax	Paxene	Paclitaxel	Kaposiho sarkom
Sequus	Doxil	Doxorubicin, Liposomální	KS/Nádory
Sequus	Caelyx	Doxorubicin, Liposomální	KS/Nádory
Schering AG	Fludara	Fludarabin	Leukemie
Pharmacia & Upjohn	Pharmorubicin	Epirubicin	Nádory prsu/plic
Chiron	DepoCyt	DepoCyt	Neoplastická meningitis
Zeneca	ZDI839	ZD 1839	NSCLC, pankreas
BASF	LU 79553	Bis-naftalimid	onkologie
BASF	LU 103793	Dolastain	onkologie
Shering Plough	Caelyx	Doxorubicin- Liposomální	Nádory prsu/ovaria
Lilly	Gemzar	Gemcitabine	Pankreas, NSCLC, prs, močový měchýř a ovarium
Zeneca	ZD 0473/Anormed	ZD 0473/Anormed	NSCL na bázi platiny, ovarium atd.
Yamanouchi	YM 116	YM116	Nádory prostaty
Nycomed	SeedslI-125 Rapid St	Jodová zrna	Nádory prostaty

147 •· 90 0 0

Amersham
Agouron	Cdk41cdk2 inhibitory	cdk41cdk2 inhibitory	solidní nádory
Agouron	PARP inhibitory	PARP Inhibitory	solidní nádory
Chiroscience	D4809	Dexifosamid	solidní nádory
Bristol Myers Squib	UFT (Tegafur/Uracil)	UFT (Tegafiir/Uracil)	solidní nádory
Sankyo	Krestin	Krestin	solidní nádory
Asta Medica	Ifex/Mesnex	Ifosamide	solidní nádory
Bristol Meyers Squib.	Ifex/Mesnex	Ifosamide	solidní nádory
BriStol Myers Squib	Vumon	Teniposide	solidní nádory
Bristol Myers Squib	Paraplatin	karboplatina	solidní nádory
Bristol Squib	Myers Plantinol \|	Cisplatina, Stealth	1
Bristol Myers Squib	Plantinol	Cisplatina
Bristol Myers Squib	Vepesid	Etoposid	solidní nádory, melanom
Zeneca	ZD9331	ZD9331	solidní nádory, pokročilé kolorektální nádory
Chugai	Taxotere	Docetaxel	solidní nádory, nádory prsu
Rhone Poulenc	Taxotere	Docetaxel	solidní nádory, nádory prsu
Glaxo Wellcome	Prodrug guanin- arabinosidu	Prodrug arabinosidu	T - Leukemie/Lymfom & B-lymfocyt Neoplasm
Bristol Myers Squib	Taxanový analog	Taxanový analog	po taxolu

V jednom provedení využívají způsoby podle předkládaného vynálezu imunostimulační nukleové kyseliny jako náhradu místo terapie lFN-α při léčbě nádorů. V současnosti některé léčebné protokoly indikují IFNa. Protože je IFNa produkován po podání některých imunostimulačních nukleových kyselin, mohou být tyto nukleové kyseliny použity pro vyvolání endogenní tvorby IFNa.

Vynález také zahrnuje způsob pro indukci pro antigen nespecifické imunoaktivace a resistence na různé infekční noxy za použití imunostimulačních nukleových kyselin. Termín imunoaktivace nespecifická pro antigen označuje aktivaci imunitních buněk jiných než jsou B-lymfocyty, jako jsou například NK buňky, T-lymfocyty nebo jiné buňky imunitního systému, které mohou odpovídat na antigen nezávislým způsobem.

148

Široké spektrum resistence na infekční agens je indukováno proto, že buňky imunitního systému jsou v aktivní formě a jsou indukovány k reakci na jakékoliv vniklé sloučeniny nebo mikroorganismy. Buňky nejsou specificky aktivovány k určitému antigenu. Toto je zejména užitečné v obraně proti biologickým zbraním a za některých okolností popsaných výše, jako například u cestovatelů.

Stimulační index konkrétní imunostimulační nukleové kyseliny může být testován v různých imunotestech. Výhodně je stimulační index imunostimulační nukleové kyseliny pro proliferaci B-lymfocytů alespoň přibližně 5, lépe alespoň přibližnělO, ještě lépe alespoň přibližně 15 a nejlépe alespoň o

přibližně 20, jak je určilo inkorporací H uridinu v kultuře myších B-lymfocytů, která byla kontaktována s 20 μΜ nukleové kyseliny na dobu 20 hodin při 37 °C a která byla pulsovaná 1 gCi ³H uridinu; kde tyto buňky byly odebrány a hodnoceny o 4 hodiny později, jako je podrobně popsáno v PCT publikovaných patentových přihláškách PCT/US95/01570 (WO 96/02555) a PCT/US97/19791 (WO 98/18810), které uplatňují prioritu z US pořadové číslo 08/386063 a 08/960774, podaných 7.2.1995 a 30.10.1997, v příslušném pořadí. Pro použití in vivo je důležité, aby byly imunostimulační nukleové kyseliny schopné účinně indukovat imunitní reakci, jako je například produkce protilátek.

Imunostimulační nukleové kyseliny jsou účinné u obratlovců jiných než jsou hlodavci. Různé imunostimulační nukleové kyseliny mohou způsobovat optimální imunostimulaci, podle typu jedince a sekvence imunostimulační nukleové kyseliny. U mnoha obratlovců bylo podle předkládaného vynálezu zjištěno, že jsou reaktivní na stejné imunostimulační nukleové kyseliny, které se někdy označují jako imunostimulační nukleové kyseliny

149 f 9 9 9 9 9 9 9 · 9 · •99 99·*· 99 9 specifické pro člověka. Hlodavci, nicméně, reagují na jiné nukleové kyseliny. Jak je zde uvedeno, imunostimulační nukleová kyselina způsobující optimální stimulaci u člověka nemusí obvykle způsobovat optimální stimulaci u myší a naopak. Imunostimulační nukleová kyselina způsobující optimální stimulaci u člověka často způsobuje optimální stimulaci u jiných zvířat, jako jsou krávy, koně, ovce, atd. Odborník v oboru může identifikovat optimální sekvence nukleové kyseliny použitelné pro konkrétní druh za použití rutdisních testů a/nebo znalostí v oboru.

Imunostimulační nukleové kyseliny mohou být přímo podány jedinci nebo mohou být podány společně s transportním komplexem pro nukleové kyseliny. Trarfportní komplex pro nukleové kyseliny označuje molekulu nukleové kyseliny asociovanou s (například iontově nebo kovalentně vázanou; nebo enkapsulovanou v) prostředku pro cílený trdPsport (jako je například molekula, která se váže s vysokou afinitou na cílové buňky (například na povrchy B-lymfocytů a/nebo je ve zvýšené míře vychytávány cílovými buňkami). Příklady komplexů pro transport nukleových kyselin jsou nukleové kyseliny asociované se sterolem (například cholesterolem), lipidem (například kationtovým lipidem, virosomem nebo liposomem), nebo činidlem cíleně se vážícím na cílové buňky (jako je například ligand rozpoznávaný specifickým receptorem cílových buněk). Výhodné komplexy mohou být dostatečně stabilní in vivo pro zabránění významného nenavázání před interé(nlizací do cílových buněk. Nicméně, komplex může být štěpitelný za vhodných podmínek uvnitř buňky, takže je nukleová kyselina uvolněna ve funkční formě.

Transportní vehikula nebo prostředky pro transport antigenu a nukleové kyseliny na povrchy jsou popsané. Imunostimulační

150

nukleová kyselina a/nebo antigen a/nebo terapeutické činidlo mohou být podány samostatně (například v salinickém roztoku nebo pufru) nebo za použití jakýchkoliv vehikul známých v oboru. Například byla popsána následující transportní vehikula: kochleáty (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); emulsomy (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOM (Mowat et al., 1993, Carsson et al., 1991, Hu et al., 1998, Morein et al., 1999); liposomy (Childers et al., 1999,

Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); živé bakteriální vektory (například Salmonella, Escherichia coli, Bacillus Calmette-Guerinové, Shigella, Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al., 1993,

Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); živé virové vektory (například virus vakcinie, adenovirus, virus herpes simplex) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); mikrosféry (Gupta et al., 1998; Jones et al., 1996; Maloy et al. , 1994; Moore et al., 1995; O'Hagan et al., 1994; Eldridge et al., 1989); nukleokyselinové vakciny (Fynan et al., 1993; Kuklin et al., 1997; Sasaki et al., 1998; Okada et al., 1997; Ishii et al., 1997); Polymery (například karboxymethylcelulosa, chitosan) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); polymerové kruhy (Wyatt et al., 1998); proteosomy (Vancott et al., 1998; Lowell et al., 19988, 1996, 1997); fluorid sodný (hashi et al., 1998); transgenní rostliny (Tacekt et al., 1998; Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); virosomy (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); virům podobné částice (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998). Jiné transportní prostředky jsou známé v oboru a něketré jejich další příklady jsou uvedeny dále v popisu vektorů.

Termín účinné množství imunostimulační nukleové kyseliny

151

označuje množství nezbytné nebo dostatečné pro realizaci požadovaného biologického účinku, například, účinné množství imunostimulační nukleové kyseliny pro indukci slizniční imunity je množství, které je nutné pro indukci vzniku IgA reakce na antigen po expozici antigenů, zatímco množství nutné pro indukci systémové imunity je množství, které způsobí vznik IgG reakce na antigen po expozici antigenů. V kombinaci se zde uvedenými fakty je možno pomocí výběru různých aktivních sloučenin a faktorů jako je účinnost, realtivní biologická dostupnost, tělesná hmotnost pacienta, závažnost nežádoucích účinků a preferovaný způsob podání možno naplánovat účinný profylaktický nebo terapeutický režim, který nemá významnější toxicitu a který je účinný pro léčbu konkrétního jedince.

Účinné množství pro konkrétní aplikaci se může lišit v závislosti na faktorech jako je léčené onemocnění, konkrétní podaná imunostimulační nukleová kyselina, antigen, velikost jedince nebo závažnost onemocnění nebo stavu. Odborník v oboru může empiricky určit účinné množství konkrétní imunostimulační nukleové kyseliny a/nebo antigenů a/nebo jiného terapeutickéhočinidla bez nutnosti zbytečných pokusů.

Konkrétní dávky sloučenin pro slizniční nebo lokální podání jsou obvykle v rozmezí od přibližně 0,1 pg do přibližně 10 mg na aplikaci, podle toho, zda se aplikace provádí denně, jednou týdně nebo měsíčně nebo v jakémkoliv jiném intervalu. Častěji jsou slizniční nebo lokální dávky v rozmezí od přibližně 10 pg do 5 mg na podání, nejčastěji jsou v rozmezí od přibližně 100 pg do 1 mg, s 2-4 apliakcemi oddělenými dny nebo týdny. Ještě častěji jsou imunostimulační dávky v rozmezí od 1 pg do 10 mg na aplikaci, nejčastěji od 10 pg do 1 mg, s denním nebo týdením podáním. Dávky sloučenin pro parenterální podání za účelem indukce imunitní reakce specifické pro antigen, kdy jsou sloučeniny podány s antigenem, ale ne s jiným terapeutickým

152

činidlem, jsou obvykle 5- až 10000-krát vyšší než účinné slizniční dávky pro imunostimulační aplikaci nebo pro použití jako adjuvans ve vakcíně, častěji jsou 10- až 1000-krát vyšší a nejčastěji jsou 20- až 100-krát vyšší. Dávky sloučenin uvedené pro parenterální podání za účelem indukce nespecifické imunitní reakce nebo pro zesílení ADCC nebo indukce imunitní reakce specifické pro antigen, když jsou imunostimulační nukleové kyseliny podány v kombinaci s jiným terapeutickým činidlem nebo ve specializovaných transportních prostředcích, jsou obvykle v rozmezí od přibližně 0,1 pg do 10 mg na aplikaci, podle toho, zda je aplikace prováděna denně, týdně nebo měsíčně nebo v jiných intervalech, častěji jsou parenterální dávky pro tyto účely v rozmezí od přiblžině 10 pg do 5 mg na aplikaci a lépe od přibližně 100 pg do 1 mg, s 2-4 aplikacemi v rozmezí dnů až týdnů. V některých provedeních mohou být použity parenterální dávky 5- až 10000-krát vyšší než typické zde popsané dávky.

Pro jakoukoliv zde popsanou sloučeninu může být terapeuticky účiné množství určeno nejprve na zvířecích modelech. Terapeuticky účinná dávka může být také určena z dat pro CpG oligonukleotidy získaných na člověku (byly zahájeny klinické pokusy na lidech) a získaných pro sloučeniny, které mají podobné farmakologické aktivity, jako jsou jiná slizniční adjuvans, například LT a jiné antigeny pro vakcinaci, pro slizniční nebo lokální podání. Vyšší dávky jsou nutné pro parenterální aplikaci. Aplikovaná dávka může být upravena podle relativní biologické dostupnosti a účinnosti podané sloučeniny. Úprava dávek pro dosažení maximální účinnosti podle způsobů popsaných výše a jiných způsobů dobře známých v oboru je v rozsahu schopností odborníků v oboru.

Prostředky podle předkládaného vynálezu jsou podány ve

153 * ·· ·· ·» ·9 99 ♦ ··« 9 9 9 9 9 9 9

999 99999 99 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 9999 farmaceuticky přijatelných roztocích, které mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné koncentrace solí, pufrovacích činidel, konzervačních činidel, kompatibilních nosičů, adjuvans a volitelně jiných terapeutických činidel.

Pro použití v terapii může být účinné množství imunostimulační nukleové kyseliny podáno jedinci jakýmkoliv způsobem, který přepraví nukleovou kyselinu na požadovaný povrch, například sliznici, nebo do systému. Podání farmaceutických prostředků podle předkládaného vynálezu může být provedeno jakýmkoliv způsobem známým odborníkům v oboru.

Výhodnými způsoby podání jsou orální, parenterální, intramuskulární, intranasální, intratracheální, inhalační, oční, vaginální a rektální podání.

Pro orální podání mohou být sloučeniny (tj. imunostimulační nukleové kyseliny, antigeny nebo jiná terapeutická činidla) připraveny smísením aktivní sloučeniny s farmaceuticky přijatelnými nosiči dobře známými v oboru. Takové nosiče umožňují formulování sloučenin podle předkládaného vynálezu ve formě tablet, pilulek, dražé, kapslí, kapalin, gelů, sirupů, kaší, suspenzí a podobně, pro orální aplikaci léčenému jedinci. Farmaceutické prostředky pro orální použití mohou být získány jako pevné přísady, případně pomocí rozemletí získané směsi, a zpracováním směsi granulí,po přidání vhodných pomocných činidel, za zisku tablet nebo dražé. Vhodnými přísadami jsou, například, plniva jako jsou sacharidy, jako je laktosa, sacharosa, manitol nebo sorbitol; celulosové prostředky, jako je například kukuřičný škrob, pšeničný škrob, rýžový škrob, bramborový škrob, želatina, tragant, methylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, karboxymethylcelulosa sodná, a/nebo polyvinylpyrrolidon (PVP).

Pokud je to vhodné, mohou být přidána činidla podporující

154 • · · ·· ·· ······ rozpadavost, jako je zesítěný polyvinylpyrrolidon, agar nebo kyselina alginová, nebo její soli, jako je alginát sodný. Volitelně mohou být orální prostředky připraveny v solných roztocích nebo pufrech pro neutralizaci vnitřních kyselých podmínek, nebo mohou být podány bez nosičů.

Jádra dražé mohou být potažena vhodným potahem. Pro tento účel mohou být použity koncentrované roztoky sacharidů, které mohou volitelně obsahovat klovatiny, jako je arabská klovatina, talek, polyvinylpyrrolidon, karbopol gel, polyethylenglykol a/nebo oxid titaničitý, roztoky laků, a vhodná organická rozpouštědla a nebo směsi rozpouštědel. Do potahů pro tablety nebo dražé mohou být přidány barviva nebo pigmenty pro identifikaci nebo charakterizaci různých kombinací dávek aktivních sloučenin.

Mezi farmaceutické prostředky, které mohou být použity orálně, patří vytlačitelné kapsle vyrobené z želatiny, stejně jako měkké, uzavřené kapsle vyrobené ze želatiny a změkčovacího činidla, jako je glycerol nebo sorbitol.

Vytlačitelné kapsle mohou obsahovat aktivní činidla ve směsi s plnivy jako je laktosa, pojivý jako jsou škroby, a/nebo kluznými činidly jako je talek nebo magnesium-stearát, a volitelně se stabilizátory. V měkkých kapslích mohou být aktivní sloučeniny rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodných kapalinách, jako jsou mastné oleje, kapalný parafin nebo kapalné polyethylenglykoly. Dále mohou být přidána stabilizační činidla. Také mohou být použity mikrosféry připravené pro orální podání. Takové mikrosféry jsou dobře známé v oboru. Všechny prostředky pro orální podání by měly být v dávkách vhodných pro takové podání.

Pro bukální podání mohou být prostředky ve formě tablet

155 ··· ·· ·· ·· ·· ··♦· nebo pastilek připravených běžným způsobem.

Při inhalačním podání mohou být sloučeniny pro použití v předkládaném vynálezu výhodně podány ve formě aerosolového spreje z tlakovaného zásobníku nebo nebulizéru, s použitím vhodného hnacího plynu, například dichlordifluormethanu, trichlorfluormethanu, dichlortetrafluorethanu, oxidu uhličitého a nebo jiného vhodného plynu. V případě tlakovaného aerosolu může být dávková jednotka určena chlopní pro podání odměřitelného množství. Kapsle a patrony vyrobené například ze želatiny pro použití v inhalátoru nebo insuflátoru mohou být připraveny takové, které obsahují směs sloučeniny a vhodné práškové baze, jako je laktosa nebo škrob.

Sloučeniny mohou být, když je žádoucí jejich systémové podání, připraveny ve formě vhodné pro parenterální podání injekcí, například bolusovou injekcí nebo kontinuální infusí. Prostředky pro injekce mohou být prezentovány ve formě dávkové jednotky, například jako ampule nebo v multi-dávkových zásobnících, s přidaným konzervačním činidlem. Prostředky mohou být ve formě suspenzí, roztoků nebo emulzí v oleji nebo ve vodném vehikulu, a mohou obsahovat další pomocná činidla, jako jsou suspendační, stabilizační a/nebo disperzní činidla.

Mezi farmaceutické prostředky pro parenterální podání patří vodné roztoky aktivních sloučenin ve formě rozpustné ve vodě. Dále mohou být připraveny suspenze aktivních sloučenin jako vhodné olejové injekční suspenze. Mezi vhodná lipofilní rozpouštědla nebo vehikula patří mastné oleje, jako je sezamový olej, nebo syntetické estery mastných kyselin, jako je ethyloleát nebo triglyceridy, nebo liposomy. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat substance, které zvyšují viskozitu suspenze, jako je karboxymethylcelulosa sodná, sorbitol nebo

156 • ·· 4» 44 44 ··

4··4 4·4 4 4 0 4 ·«· 4 < 0 44 · « 4

4« · · · 0 0 444 4 4

4 · 44·· 444

000 40 «· 44 00 4000 dextran. Volitelně může suspenze také obsahovat vhodná stabilizační činidla nebo činidla zvyšující rozpustnost sloučenin, což umožní přípravu vysoce koncentrovaných roztoků.

Alternativně mohou být aktivní sloučeniny ve formě prášku pro rekonstituci vhodným vehikulem, například sterilní apyrogenní vodou, před použitím.

Sloučeniny mohou být také ve formě rektálních nebo vaginálních prostředků, jako jsou čípky nebo retenční nálevy, například obsahujících vhodné čípkové baze, jako je kakaové máslo nebo jiné glyceridy.

Kromě prostředků popsaných výše mohou být sloučeniny připraveny také ve formě depotních prostředků. Takové dlouhodobě působící prostředky mohou být připraveny za použití vhodných polymerních nebo hydrofobních materiálů (například jako emulze v přijatelném oleji) nebo vhodných iontoměničových pryskyřic, nebo jako špatně rozpustné deriváty, například jako špatně rozpustné soli.

Farmaceutické prostředky mohou také obsahovat vhodné pevné nebo gelové nosiče nebo přísady. Příklady takových nosičů nebo přísad jsou uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé sacharidy, škroby, deriváty celulosy, želatina a polymery, jako jsou polyethylenglykoly.

Vhodné kapalné nebo pevné farmaceutické prostředky jsou například vodné nebo salinické roztoky pro inhalaci, mikroenkapsulované, enkochleované, potažené na mikroskopické částice zlata, obsažené v liposomech, nebulizované, aerosoly, pelety pro implantaci do kůže, nebo prostředky sušené na drsném objektu, ze kterého jsou seškrábnuty na kůži. Mezi

157 • · • 4 * · ·· farmaceutické prostředky patří také granule, prášky, tablety, potahované tablety, (mikro)kapsle, čípky, sirupy, emulze, suspenze, krémy, kapky nebo prostředky s prodlouženým uvolňováním aktivních sloučeni, ve kterých jsou přísady a aditiva a/nebo pomocná činidla, jako jsou činidla podporující rozpadavost, pojivá, potahovací činidla, bobtnavá činidla, kluzná činidla, chuťová korigens, sladidla nebo solubilizační činidla použita způsobem popsaným výše. Farmaceutické prostředky jsou vhodné pro použití v různých systémech pro aplikaci léků. Pro stručný přehled metod aplikace léků viz Langer, Science, 249: 1527-1533, 1990, což je zde uvedeno jako odkaz.

Imunostimulační nukleové kyseliny a volitelně jiná terapeutická činidla a/nebo antigeny mohou být aplikovány sami o sobě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli. Při použití v medicíně by soli měly být farmaceuticky přijatelné, ale farmaceuticky nepřijatelné soli mohou být použity při přípravě farmaceuticky přijatelných solí. Mezi takové soli patří, například, soli připravené z následujících kyselin: kyseliny chlorovodíkové, bromovodíkové, sírové, dusičné, fosforečné, maleinové, octové, salicylové, p-toluensulfonové, vinné, citrónové, methansulfonové, mravenčí, malonové, jantarové, naftalen-2-sulfonové a benzensulfonové. Také mohou být takové soli připraveny z alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, jako jsou sodné, draselné nebo vápenaté soli karboxylové skupiny.

Mezi vhodná pufrovací činidla patří: kyselina octová a její sůl (1-2% hmot./obj.); kyselina boritá a její sůl (0,5-2,5% hmot./obj.); kyselina citrónová a její sůl (1-3% hmot./obj.); a kyselina fosforečná a její sůl (0,8-2% hmot./obj.). Mezi vhodná konzervační činidla patří benzalkoniumchlorid (0,003158 • *· ·» ·« 99 ·· • · * · · · 9 9 9 9 9

9 9 9 ···· · · ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 9999

0,03% hmot./obj.); chlorbutanol (0,3-0,9% hmot./obj.); parabeny (0,01-0,25% hmot./obj.) a thimerosal (0,004-0,02% hmot./obj.).

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují účinné množství imunostimulační nukleové kyseliny a volitelně antigeny a/nebo jiná terapeutická činidla volitelně obsažená ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Termín farmaceuticky přijatelný nosič označuje jeden nebo více kompatibilních pevných nebo kapalných plniv, ředidel nebo enkapsulačních substancí, které jsou vhodné pro podání člověku nebo jinému obratlovci. Termín nosič označuje organickou nebo anorganickou přísadu, přirozenou nebo syntetickou, se kterou je aktivní složka smísena za účelem usnadnění aplikace. Složky farmaceutického prostředku mohou být také smíšeny se sloučeninami podle předkládaného vynálezu a se sebou navzájem tak, že nedochází k interakci, která by nežádoucím způsobem narušila požadovanou farmaceutickou účinnost.

Imunostimulační nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být podány ve směsi s dalšími adjuvans, jinými terapeutickými činidly nebo antigeny. Směs se může skládat z několika dalších imunostimulačních nukleových kyselin nebo několika antigenů nebo terapeutických činidel.

Jsou možné různé způsoby podání. Konkrétní způsob podání bude záviset na vybraném adjuvans a antigenů, léčeném onemocnění a dávce nutné pro dosažení terapeutické účinnosti.

Způsoby podle předkládaného vynálezu, obecně řečeno, mohou být prováděny za použití jakéhokoliv způsobu podání, který je lékařsky přijatelný, což znamená za použití jakéhokoliv způsobu, kterým je možno dosáhnout účinné úrovně imunitní reakce bez toho, že by byly způsobeny klinicky nepřijatelné

159 • 4 ·<► 4· 44 44 • · 4 4 4 4 4 4 4 • · · 4 ·«4 «φ 4 nežádoucí účinky. Výhodné způsoby podání jsou způsoby popsané výše.

Prostředky jsou výhodně ve formě dávkových jednotek a mohou být připraveny jakýmkoliv způsobem známým ve farmacii. Všechny způsoby zahrnují krok smísení sloučenin s nosičem, který je tvořen jednou nebo více pomocnými přísadami.Obecně jsou prostředky připraveny uniformním a důkladným promísením sloučenin s kapalným nosičem, jemně děleným pevným nosičem . nebo oběmi, a potom, pokud je to nutné, formováním produktu. Kapalnými dávkovými jednotkami jsou fioly nebo ampule. Pevné dávkové jednotky jsou tablety, kapsle a čípky. Při léčbě pacientů je dávka v závislosti na aktivitě sloučeniny, způsobu podání, cíly imunizace (tj. profylaxi nebo terapii), charakteru a závažnosti onemocnění, věku a tělesné hmotnosti pacienta různá. Podání dané dávky může být provedeno jako jediné podání ve formě dávkové jednotky, nebo jako aplikace několika menších dávkových jednotek. Opakované podání dávek v určených intervalech týdnů nebo měsíců je obvyklé při dosycení reakcí specifických pro antigen.

Mezi další systémy pro aplikaci patří systémy s načasovaným uvolňováním, oddáleným uvolňováním nebo zpomaleným uvolňováním. Takové systémy umožňují redukci opakovaného podávání sloučenin, což zvyšuje snadnost aplikace pro lékaře i pacienta. V oboru je známo mnoho systémů pro takové podání sloučenin. Mezi takové systémy patří systémy na bázi polymeru, jako je póly(laktid-glykolid), kopolyoxaláty, polykaprolaktony, polyesteramidy, polyortoestery, kyselina polyhydroxymáselná a polyanhydridy. Mikrokapsle z uvedených polymerů obsahujících léky jsou popsány například v US patentu 5075109. Mezi transportní systémy patří také nepolymerové systémy, jako jsou: lipidy včetně sterolů, jako je

160 ·· · · AAA « aaa a a aaa a a a • A AAA AA A A A A A • AA AAAA AAA •AA AA AA AA AA AAAA cholesterol, estery cholesterolu a mastné kyseliny nebo neutrální tuky, jako jsou mono-, di- a triglyceridy;

hydrogelové systémy; sylastické systémy; peptidové systémy;

voskové potahy; lisované tablety využívající běžná pojivá a přísady; částečně fúzované implantáty a podobně. Mezi specifické příklady patří: (a) erozní systémy, ve kterých je činidlo podle předkládaného vynálezu obsaženo v matrici, jako je matrice popsaná v US patentech č. 4452775, 4675189 a

5736152; a (b) difusní systémy, ve kterých je aktivní složka vymývána řízenou rychlostí z polymeru, jak je popsáno v US patentech č. 3854480, 5133974 a 5407686. Také mohou být použity pumpy, které jsou určeny pro implantaci.

Předkládaný vynález je dále ilustrován v následujících příkladech, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Celý obsah všech citací (včetně literárních citací, udělených patentů, publikovaných patentovaných přihlášek a projednávaných patentových přihlášek) je zde uveden jako odkaz.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody:

Oligonukleotidy: Přirozené fosfodiesterové a fosforothioatemmodifikované ODN byly zakoupeny od Operon Technologies (Alameda, CA) a Hybridon Specialty Products (Milford, MA). ODN byly testovány na endotoxin za použití LAL-testu (LAL-assay BioWhittaker, Walkersville, MD; dolní limit detekce 0,1 EU/ml). Pro testy in vitro se ODN naředily v TE-pufru (10 mM Tris, pH 7, 0,1 mM EDTA) a skladovaly se při -20° C. Pro použití in vivo se ODN naředily ev fosfátem pufroavném salinickém roztoku (0,1 M PBS, pH 7,3) uskladnily se při 4°C.

161 • »φ φ* φ* φφ ·Φ φφ φ φ φφφ φφφφ φ φ · φ φ φ φφ φφ · φφ φφφ ·· Φ·· · · φφφ φφφφ φφφ φφφ φφ ·· φφ φφ φφφφ

Všechna ředění byla provedena za použití apyrogenních činidel.

Izolace lidských PBMC a buněčná kultura: Mononukleámí buňky periferní krve (PBMC) se izolovaly z periferní krve zdravých dobrovolníků pomocí Ficoll-Paque odstředění s gradientem hustoty (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) způsobem popsaným dříve (Hartmann et al., 1999 Proč. Nati.

Acad. Sci USA 96:9305-10). Buňky se supendovaly v RPMI 1640 kultivačním mediu doplněném 10% (obj./obj.) teplem inaktivovaným (56°C, 1 h) FCS (HyClone, Logan, UT), 1,5 mM Lglutaminu, 100 U/ml penicilinu a 100 gg/ml streptomycinu (všechny od Gibco BRL, Grand Island, NY) (kompletní medium).

Buňky (konečná koncentrace 1 x 10⁶ buněk/ml) se kultivovaly v kompletní mediu v 5% CO2 humidifikovaném inkubátoru při teplotě 37°C. ODN a LPS (ze Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) nebo anti-IgM se použily jako stimuly. Pro měření lytické aktivity lidských NK se PBMC inkubovaly při 5 x 10⁶/jamku ve 24-jamkových plotnách. Kultury se odebíraly po 24 hodinách a buňky se použily jako standardy v 4 hodinovém testu uvolňování ⁵¹Cr proti K562 buňkám, jak bylo popsáno dříve (Ballas et al., 1996 J. Immunol. 157:1840-1845).

Pro test proliferace B-lymfocytů se 1 μCi ³H thymidinu přidal na dobu 18 hodin před odběrem a množství inkorporovaného ³H thymidinu se určilo scintilací v den 5. Standardních odchylky ve 3 jamkách byly < 5%.

Průtoková cytometrie na lidských PBMC: Povrchové antigeny na primátích PBMC se barvily způsobem popsaným dříve (Hartmann et al., 1998 J. Pharmacol. Exp. Ther. 285:920928). Monoklonální protilátky k CD3 (UCHT1), CD14 (MSE2), CD19 (B43), CD56 (B159), CD69 (FNSO) a CD86 (2331 [FUN-1]) se zakoupily od Pharmingen, San Diego, CA. IgGi,_K (MOPC-21) a IgG2b,K (Hartmann et al., 1999 Proč. Nati. Acad. Sci USA 96:9305-10) se použily

162 « ** ·» ··«· ··» »··· • · · · · ··· « · 9 • · · « · « · ··· · a • · · » · · « ··· ··· ·« ·· u ·· ···· jako kontroly pro nespecifické barvení. NK buňky se identifikovaly podle exprese CD56 na CD3, CD14 a CD19 negativních buňkách, zatímco B-lymfocyty se identifikovaly podle exprese CD19. Data z průtokové cytometrie pro 10000 buněk na vzorek se získala na FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Životaschopnost buněk v FSC/SSC vstupu použitém pro analýzu se stanovila pomocí barvení propidium jodidem (2 pg/ml) a zjistilo se, že je vyšší než 98%. Data byla analyzována za použití počítačového programu FlowJo (verze 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).

Výsledky:

Příklad I: CpG-dependentní stimulace lidských B-lymfocytů závisí na methylaci a délce ODN.

Lidské PBMC se získaly od normálních dárců a kultivovaly se po dobu 5 dnů při koncentraci 2 x 10⁵ buněk/jamku s uvedenými koncentracemi uvedených ODN sekvencí. Jak je uvedeno v tabulce F, lidské PBMC proliferují více než je základní proliferace, když jsou kultivovány s různými CpG ODN, ale také vykazují určitou proliferaci, když jsou kultivovány s ODN, které neobsahují jakýkoliv CpG motiv. Význam nemethylovaných CpG motivů pro dosažení optimální imunostimulace s těmito ODN je demonstrován skutečností, že ODN 1840 (SEQ ID NO: 83) indukuje 56603 pulsů inkorporace ³H-thymidinu, zatímco stejný ODN bohatý na T s methylovanými CpG motivy (non-CpG), 1979 (SEQ ID NO:

222) indukuje nižší, ale stále ještě zvýšenou, aktivitu (pouze 18618 pulsů) při stejné koncentraci 0,6 pg/ml. Snížená proliferace při vyšších koncentracích ODN může být artefaktem toho, že buňky jsou za těchto pokusných podmínek vyčerpány, nebo může odrážet určitou toxicitu vyšších koncentrací ODN. zajímavé je, že kratší ODN obsahující CpG motivy, jako jsou 13-14-merové 2015 a 2016, jsou méně stimulační i přes toto to

163 to toto • · to « • · to • to · • · · ··· ·· to to > > to ··« to 9 · to· · toto • to • to· • · • · • · •to ·*«· skutečnost, že jejich molární koncentrace může být ve skutečnosti vyšší, protože jsou ODN přidávány spíše podle hmotnosti než podle molarity. Toto prokazuje, že délka ODN může být také významnou determinantou imunitních účinků ODN. Non-CpG ODN, ale slabě bohatý na T (přibližně 30%), 1982 (SEQ ID NO: 25), způsobuje pouze slabé zvýšení bazální proliferace.

Tabulka F

Koncentrace oligonukleotidu
ODN	0,15 pg/ml	0,6 pg/ml	2 pg/ml
Pouze základ	648	837	799
1840 (SEQ ID NO: 83)	5744	56603	31787
2016 (SEQ ID NO: 256)	768	4607	20497
1979 (SEQ ID NO: 222)	971	18618	29246
1892 (SEQ ID NO: 135)	787	10078	22850
2010 (SEQ ID NO: 250)	849	20741	8054
2012 (SEQ ID NO: 252)	2586	62955	52462
2013 (SEQ ID NO: 253)	1043	47960	47231
2014 (SEQ ID NO: 254)	2700	50708	46625
2015 (SEQ ID NO: 255)	1059	23239	36119

Čísla udávají cpm inkorporace ³H-thymidinu pro kultury lidských PBMC získané způsobem uvedeným výše.

164 « 4 • 4 • · 4·

Příklad 2: Aktivace aktivity lidských NK buněk závislá na koncentraci ODN bohatých na thymidin

Lidské PBMC se kultivovaly po dobu 24 hodin s panelem různých CpG nebo non-CpG ODN ve dvou různých koncentracích a potom se testovaly na jejich schopnost zabíjet NK cílové buňky, jak bylo popsáno výše (Ballas et al., 1996, J. Immunol. 157: 1840-1845). Zabíjení se měří v lytických jednotkách neboli v L.U. Lidský dárce použitý v tomto pokusu měl základní pozadí 3,69 LU, které se zvýšilo na 180,36 LU při použití pozitivní kontroly, IL-2. CpG oligonukleotid 2006 (SEQ ID NO: 246) indukoval vysokou úroveň NK lytické funkce při nízké koncentraci 0,6, a nižší úroveň při koncentraci 6,0.

Překvapivě si ODN bohaté na T, ve kterých byly CpG motivy 2006 methylované (ODN 2117 (SEQ ID NO: 358)) nebo invertované na GpC (ODN 2137 (SEQ ID NO: 886)) zachovávaly silné imunostimulační účinky při vysokých koncentracích ODN, jak je uvedeno v tabulce G. Tyto imunostimulační účinky závislé na koncentraci nejsou obecnou vlastností fosforothioátového skeletu, protože pokusy popsané dále ukazují, že poly-A ODN je nestimulační. Určitá stimulace se pozoruje pro 24-bazí dlouhý ODN, ve kterém jsou pozice všech baží náhodné tak, že A, C? G a T se vyskytují s frekvencí 25% pro každou pozici (ODN 2182 (SEQ ID NO: 42)). Nicméně, stimulační účinek takových 24bazových ODN je značně zesílen tehdy, když se jednou o čistý poly-T, protože v tomto případě je stimulace pozorována i při nejnižší koncentraci 0,6 gg/ml (ODN 2183 (SEQ ID NO: 433)). Skutečnost, že stimulační aktivita ODN SEQ ID NO: 433 při této nejnižší koncentraci je vyšší než u jakéhokoliv ODN testovaného v této nízké koncentraci, mimo optimální lidské imunostimulační ODN SEQ ID NO: 246. Skutečně, vyšší koncentrace ODN SEQ ID NO: 433 stimulují více NK aktivity než

165

jakýkoliv fosforothioátový ODN s výjimkou silného CpG ODN 2142 (SEQ ID NO: 890), který má o něco vyšší imunostimulační účinek. Pokud se obsah G v ODN SEQ ID NO: 246 zvýší vzhledem k obsahu T přidáním více G, tak dojde úměrně ke snížení poměru T nukleotidů k snížení imunostimulačního účinku ODN (viz ODN 2132 (SEQ ID NO: 373)) . Proto je obsah T v ODN významnou determinantou jeho imunostimulační aktivity. Ačkoliv je poly-T ODN nejvíce imunostimulační z non-CpG ODN, jsou jiné baze také významné pro určení imunostimulačního účinku non-CpG ODN. ODN 2131 (SEQ ID NO: 372), ve kterém je o něco více než polovina baží T a který neobsahuje G, je imunostimulační v koncentraci 6 μς/ιηΐ, ale má menší aktivitu než jiné ODN bohaté na T. Když je 6 A v ODN 2131 (SEQ ID NO: 372) nahrazeno 6 G, tak může být zvýšen imunostimulační efekt ODN (viz ODN 2130 (SEQ ID NO:

371)).

166 ··· ·» ·· ·β ·· ····

Tabulka G

Lidské PBL kultivované přes noc s oligonukleotidy

MR 3605

SR 256 %SR 7.11

efektor > kontrola [RM]	0.63 2.65	1.25 5.45	2.50 10.15	5.00 17.65	10.00 29.92	20.00-
39.98	L.U.
samotná	3.69
+ IL2(100U/ml)	35.95	57.66	86.26	100.39	99.71	93.64	180.36
+ 1585(0.6 ug/ml)	3.75	6.10	12.14	23.70	36.06	43.98	5.48
+ 1585 (6.0 ug/ml)	15.42	31.09	47.07	73.34	94.29	97.73	35.85
+ 2006(0.6 ug/ml)	6.71	15.99	26.92	44.75	64.12	68.83	16.96
+ 2006(6.0 ug/ml)	6.19	8.18	16.13	24.35	39.35	56.07	8.04
+ 2117(0.6 ug/ml)	4.54	4.73	9.56	18.04	28.57	39.85	3.49
+ 2117(6.0 ug/ml)	7.03	10.76	16.90	30.59	52.14	59.46	10.96
+ 2137(0.6 ug/ml)	4.61	5.35	10.04	15.16	23.79	37.86	2.57
+ 2137(6.0 ug/ml)	7.99	10.37	16.55	32.32	49.78	60.30	11.01
+ 2178(0.6 ug/ml)	2.88	4.52	11.47	16.05	24.85	34.27	2.37
+ 2178(6.0 ug/ml)	4.21	5.03	11.16	16.39	28.22	36.45	2.94
+ 2182(0.6 ug/ml)	2.42	6.57	10.49	19.73	26.55	35.30	2.89
+ 2182(6.0	4.11	7.98	14.60	26.56	40.40	51.98	7.59

ug/ml) • · o· · · ·· ·· • · · 9 · ·*··

9 99999 99 9

167

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9 9 9 99 9 9

+ 2183 (0.6 ug/ml)	3.73	8.46	15.52	24.48	37.78	56.77	7.80
+ 2183(0.6 ug/ml)	8.86	12.89	23.08	41.49	66.26	75.85	16.57
+ 2140 (0.6 ug/ml)	3.78	5.27	12.30	20.79	35.75	45.62	5.40
+ 2140 (6.0 ug/ml)	6.56	13.24	21.26	37.96	60.80	73.05	14.82
+ 2141 (0.6 ug/ml)	2.63	6.34	10.21	17.73	30.93	43.57	4.29
+ 2141 (6.0 ug/ml)	4.98	15.30	25.22	37.88	58.47	69.12	14.83
+ 2142(0.6 ug/ml)	3.18	3.66	6.99	14.62	19.68	32.52	1.56
+ 2142(6.0 ug/ml)	7.08	15.80	25.65	41.72	68.09	73.14	17.11
+ 2143 (0.6 ug/ml)	4.12	6.90	10.77	22.96	35.78	42.94	5.19
+ 2143 (6.0 ug/ml)	3.16	8.40	12.38	21.69	34.80	54.21	6.64
+ 2159(6.0 ug/ml)	5.05	11.76	21.67	41.12	51.68	65.47	13.19
+ 2132 (6.0 ug/ml)	4.23	6.06	10.50	18.74	32.68	44.06	4.61
+ 2179(6.0 ug/ml)	6.14	9.49	21.06	42.48	60.12	71.87	14.54
+ 2180(6.0 ug/ml)	2.37	8.57	15.44	29.66	44.35	61.31	9.47
+ 2133 (6.0 ug/ml)	6.53	12.58	23.10	38.03	61.16	68.36	14.62
+ 2134 (6.0 ug/ml)	7.51	12.14	21.14	32.46	54.47	67.12	12.98
+ 2184(6.0 ug/ml)	5.22	9.19	17.54	30.76	45.35	63.55	10.42
+ 2185(6.0 ug/ml)	8.11	14.77	26.27	40.31	55.61	70.65	15.60
+ 2116(6.0 ug/ml)	5.58	10.54	16.77	37.82	59.80	66.33	13.07
+ 2181 (6.0 ug/ml)	4.43	9.85	17.55	27.05	53.16	69.16	11.43
+ 2130(6.0	3.81	8.07	17.11	27.17	42.04	53.73	8.27

ug/ml) • · · · · · · ···· • · · ····· · · ·

168 ··· ·· «· ·· ·· ····

+ 2131 (6.0 ug/ml)	2.29	6.73	7.30	18.02	32.73	49.06	5.08
+ 2156(0.3 ug/ml)	2.50	5.26	8.20	15.95	26.64	33.07	2.31
+ 2156(1.0 ug/ml)	5.91	10.99	17.31	26.97	50.64	63.78	10.84
+ 2157(0.3 ug/ml)	2.36	4.00	6.65	12.94	24.13	38.86	2.58
+ 2157(1.0 ug/ml)	3.72	9.55	17.15	34.55	52.27	65.33	11.58
+ 2158(0.3 ug/ml)	1.25	2.36	6.90	16.39	15.63	29.82	1.17
+ 2158 (1.0 ug/ml)	4.73	7.26	11.07	15.55	30.80	43.71	4.16
+ 2118 (0.6 ug/ml)	1.55	3.38	6.85	13.36	20.15	27.71	1.13
+ 2118(6.0	2.65	3.88	9.29	12.19	22.47	28.99	1.34

ug/ml)

Příklad 3: Indukce proliferace B-lymfocytů non-CpG ODN bohatými na T

Pro hodnocení schopnosti ODN bohatých na T aktivovat proliferaci B-lymfocytů se lidské PBMC barvily cytoplasmatickým barvivém CSFE, inkubovaly se po dobu 5 dnů s uvedenými ODN v koncentraci 0,15 nebo 0,3 gg/ml a potom se analyzovaly průtokovou cytometrií. B-lymfocyty se identifikovaly podle markéru CD19. CpG ODN 2006 byl silným induktorem proliferace B-lymfocytů a tento efekt byl redukován, když byly CpG motivy methylovány nebo invertovány na GpC, jak je Vtd&t W ‘6 v koncentraci ODN 0,3 μg/ml.

Složení baží ODN se zdá být významné pro imunostimulační efekty. Snížení obsahu T v ODN významně snižuje imunostimulační účinky, jak je tomu u ODN 2177 (SEQ ID NO:

427), kde je 6 z T přítomných v ODN 2137 (SEQ ID NO: 886) nahrazeno A, což vede ke značné redukci imunostimulačního účinku. Význam T pro imunostimulační účinky ODN je také vidět ve srovnání ODN 2116 (SEQ ID NO: 357) a 2181 (SEQ ID NO: 431),

169 které se liší na 3' konci ODN. ODN 2181, jehož 3' konec je polyT, je více stimulační než ODN 2116, jehož 3' konec je poly-C, i přes skutečnost, že oba ODN mají TCGTCG na 5' konci.

Příklad 4: Proliferace B-lymfocytů indukovaná TG oligonukleotidy

Stimulační účinky TG motivů jsou uvedeny na obr. 2. ODN 2137 má identické složení baží jako ODN 2006, ale CG motivy byly všechny invertovány na GC, za vzniku nukleové kyseliny neobsahující CG. ODN nicméně obsahuje 6 TG dinukleotidů. V ODN 2177 byly všechny TG dinukleotidy ODN 2137 změněny na AG. Ačkoliv obsahuje ODN 2177 pouze 6 adeninů, je v podstatě nestimulační v koncentraci 0,2 pg/ml. Pro srovnání, ODN délky 24 baží, ve kterém je každá pozice náhodná (ODN 2182) indukuje >12% B-lymfocytů k proliferaci v koncentraci 0,2 pg/ml. Tyto výsledky ukazují, že stimulační efekty ODN 237 jsou nejen efekty fosforothioátového skeletu, ale souvisejí s přítomností TG dinukleotidů.

Pro stanovení efektu různého počtu TG dinukleotidových motivů se srovnávaly ODN 2200 a ODN 2202, jak je uvedeno na obr. 2. Oba ODN obsahují 18 T a 6 G, ale v ODN 2200 jsou všechny G za sebou, takže obsahuje pouze jeden TG dinukleotid, zatímco v ODN 2202 jsou G rozděleny do GG dinukleotidů v celém ODN, takže ODN obsahuje tři TG. ODN 2202 je více imunostimulační než ODN 2200, což je v souladu s modelem, že alespoň tři TG motivy v ODN jsou nutné pro optimální stimulační aktivitu. Je pravděpodobné, že mohou být dosaženy ještě vyšší úrovně stimulace, když budou TG motivy optimalizovány způsobem podle předkládaného vynálezu.

Příklad 5: Efekty TTG versus TTG motivů

170

Obr. 3 ukazuje výsledky pokusů provedených pro testování obsahu TG ve smyslu relativního množství T versus G a souvislosti se stimulačním účinkem na ODN. Obr. ukazuje, že ODN, ve kterém jsou všechny baze randomizované jako T nebo G (ODN 2188 (SEQ ID NO: 905)) není imunostimulační v koncentraci 0,2 gg/ml, podobně jako ODN, ve kterém byly všechny baze randomizované jako A nebo G (ODN 2189 (SEQ ID NO: 906)). Nicméně, při vyšší koncentraci 2 gg/ml byl randomizovaný T/G ODN 2188 významně více stimulační. Tato úroveň stimulace je stále nižší než úroveň dosažená se zcela randomizováným ODN (ODN 2182 (SEQ ID NO: 432)). Nejvyšší stimulace při nízkých koncentracích se pozoruje u ODN, ve kterém je polovina baží T a druhá polovina je T nebo G (ODN 2190 (SEQ ID NO: 907)). Protože je každá druhá baze jistě T, nemohou zde být žádné TG motivy. Data na obr. 3 ukazují, že zvyšující se obsah TG v ODN zvyšuje jejich imunostimulační aktivitu.

V jiných pokusech, jejichž výsledky zde nejsou zobrazeny, vykazoval ODN 2190 (SEQ ID NO. 907) stimulaci NK aktivity srovnatelnou s ODN 2188 (SEQ ID NO. 905) nebo ODN 2189 {SEQ ID NO. 906).

Příklady 6-8

Úvod:

Výše jsme prokázaly, že póly T sekvence mohou zesilovat stimulaci B a NK buněk. Dále jsme zkoumali schopnost různých non-CpG ODN bohatých na T, stejně jako póly C ODN stimulovat lidské B-lymfocyty, NK buňky a monocyty.

Materiály a metody:

Oligonukleotidy: Fosforothioatem-modifikované ODN se zakoupily

171 od ARK Scientific GmbH (Darmstadt, Germany). Použité sekvence byly: 1982: 5'tccaggacttctctcaggtt-3’ (SEQ ID NO: 225), 2006:

5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3' (SEQ ID NO: 246), 2041: 5'-ctggtctttctggtttttttctgg-3' (SEQ ID NO: 282), 2117: 5'-tzgtzgttttgtgtzgttttgtzgtt-3’ (SEQ ID NO: 358), 2137: 5'-tgctgcttttgtgcttttgtgctt-3' (SEQ ID NO: 886), 2183: 5'-ttttttttttttttttttttt'-3' (SEQ ID NO: 433), 2194: 5' -ttttttttttttttttttttttttttt-3’ (SEQ ID NO: 911 ), 2196: 5’-tttttttttttttttttt-3' (SEQ ID NO: 913), 5126: 5’ggttcttttggtccttgtct-3' (SEQ ID NO: 1058), 5162: 5'-tttttttttttttttttttttttttttt-3’ (SEQ ID NO: 1094), 5163: 5’-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3' (SEQ ID NO: 1095), 5168:

5'cccccccccccccccccccccccccccccc-3' (SEQ ID NO: 1096) a 5169:

5'cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcg-3’ (SEQ ID NO: 1097). Většina ODN byla testována na obsah LPS za použití LAL testu (BioWhittaker, Belgium) (dolní limit detekce 0,1 EU/ml). Pro všechny testy byly ODN ředěny v TE pufru a skladovány při -20 °C. Všechna ředění byla provedena za použití apyrogenních činidel.

Buněčné přípravky a buněčné kultury: Lidské PBMC byly izolovány z periferní krve zdravých dobrovolníků získaných v German Red Cross (Ratingen, Gennany), jak je popsáno v příkladu 1, ale veškerý materiál byl zakoupen od Life Technologies, Germany a byl testován na endotoxin. Pro testy aktivace B lymfocytů, NK buněk a monocytů byly PBMC kultivovány v kompletním mediu v koncentraci 2xl0⁶ buněk/ml v 200 μΐ v 96-jamkových plotnách s oblým dnem, v zvlhčovaném inkubátoru při teplotě 37 °C. Různé ODN, LPS (Sigma) nebo IL-2 (R&D Systems, USA) byly použity jako stimuly. V uvedených časech byly buňky sklízeny pro průtokovou cytometrii.

Průtoková cytometrie: MAb použité pro barvení povrchových

172

4 antigenů byly: CD3, CD14, CD19, CD56, CD69, CD80 a CD86 (všechny od Pharmingen/Becton Dickinson, Germany). Pro monocyty byly Fc receptory blokovány za použití lidského IgG (Myltenyi, Germany), jak bylo ppsáno dříve (Bauer, M et al., 1999 Immunology 97:699). Data z průtokové cytometrie pro alespoň 1000 uněk specifickované subpopulace (8 buněk, monocyty, NK buňky, NKT buňky nebo T-lymfocyty) byly získány na FACSCalibur (Becton Dickinson). Data byla analyzována za použití programu CellQuest (Becton Dickinson).

Cytotoxicita zprostředkovaná NK buňkami: PBMC se kultivovaly přes noc s nebo bez 6 gg/ml ODN nebo 100 U/ml IL-2 při teplotě 37°C, 5% CO2. Další ráno se K-562 cílové buňky značily fluorescentním barvivém, CFSE, jak bylo popsáno výše pro lidské B lymfocyty (Hartmann, G., a A. M. Krieg, 2000, J. Immunol. 164:944). PBMC se přidaly v různých poměrech (50:1, 25:1 a 12,5:1) k 2xl0⁵ cílových buněk a provedla se inkubace po dobu 4 hodin při teplotě 37°C. Buňky se odebraly a inkubovaly se s DNA-specifickým barvivém 7-AAD (Pharmingen) za účelem detekce apoptotických buněk. Výsledky byly měřeny průtokovou cytometrií.

ELISA: PBMC (3xl0⁶ buněk/ml) se kultivovalo s uvedenými koncentracemi ODN nebo LPS po dobu 24 hodin (IL-6, IFNy a TNFa) nebo 8 hodin (IL-ΐβ) ve 48-jamkových plotnách ve zvlhčované atmosféře při teplotě 37°C. Supernatanty se odebraly a cytokiny se měřily za použití OPTeia ELISA Kitů (Pharmingen) pro IL-6, IFNy a TNFa, nebo za použití Eli-pair ELISA testu (Hoelzel, Germany) pro IL-ΐβ, podle návodu výrobce,

Příklad 6: Aktivace B-lymfocytů indukovaná ODN neobsahujícími CpG motivy • · · · · ·

9· · · '«· t 9 9

173

V pokusech popsaných výše v příkladu 3 jsme prokázaly, že ODN bohaté na T mohou aktivovat T-lymfocyty. Rozšířily jsme tyto pokusy na použití dalších ODN a jiných buněk a činidel.

V první sadě pokusů jsme srovnávaly aktivační potenciál nonCpG ODN bohatých na T s velmi účinným CpG ODN 2006 (SEQ ID NO: 246). PBMC (2xl0⁶ buněk/ml) dárce krve (n=2) se inkubovaly s uvedenými koncentracemi ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 5126 (SEQ ID NO: 1058) a 5162 (SEQ ID NO: 1094). Buňky se inkubovaly po dobu 48 hodin při 37°C způsobem popsaným výše a barvily se mAb pro CD19 (markér B lymfocytů) a CD86 (markér aktivace B-lymfocytů, B72). Exprese byla měřena průtokovou cytometrií.

Za použití různých koncentrací ODN jsme ukázaly (obr. 4), že ODN bohaté na T bez CpG motivu mohou indukovat stimulaci lidských B-lymfocytů. ODN 5126 (SEQ ID NO: 1058), který obsahuje pouze jednu poly-T sekvenci, ale více než 50% T, způsobuje vyšší aktivaci lidských B-lymfocytů. Ačkoliv má určitou podbnost se SEQ ID NO: 246 (například více než 80% obsah T/G), neobsahuje tento ODN žádný známý imunostimulační CpG motiv. Překvapivě, pro všechny testované ODN bohaté na T byl nejvyšší stimulační index získán pro koncentrace mezi 3 a 10 ml. Nejvyšší stimulační index z testovaných ODN měl CpG/Tbohatý ODN SEQ ID NO: 246 v koncentraci 0,4 gg/ml. Zajímavé je, že se aktivita při vyššíh koncentracích snižovala.

Póly A, póly C a póly T sekvence se syntetizovaly a testovaly se na biologickou aktivitu. PBMC (2xl0⁶ buněk/ml) od jednoho reprezentativního dárce (n=3) se stimulovaly způsobem popsaným výše za použití 0,4 gg/ml, 1,0 gg/ml nebo 10,0 gg/ml následujících ODN: 2006 (SEQ ID NO: 246), 2196 (SEQ ID NO:

913) (póly T, 18 baží), 2194 (SEQ ID NO: 911) (póly T, 27 baží), 5162 (SEQ ID NO: 1094) (póly T, 30 baží), 5163 (SEQ ID

174 » *

NO: 1095) (póly A, 30 baží), 5168 (SEQ ID NO: 1096) (póly C, baží) a 5169 (SEQ ID NO: 1097) (póly CG, 30 baží). Exprese aktivačního markéru CD86 (B7-2) na CD19-pozitivních Blymfocytech byla měřena průtokovou cytometrií.

Obr. 5 demonstruje to, že délka sekvence, alespoň pro póly T ODN, má významný vliv na její aktivitu. Póly T sekvence obsahující pouze 18 baží (SEQ ID NO: 913) byla méně stimulační než sekvence obsahující 27 baží (SEQ ID NO: 911) nebo sekvence obsahující 30 baží (SEQ ID NO: 1094), s jasnou změnou stimulace: SEQ ID NO: 1094 > SEQ ID NO: 911 > SEQ ID NO: 913. Póly A (SEQ ID NO: 1095) nebo póly CG (SEQ ID NO: 1097) sekvence, naopak, neindukovaly aktivaci lidských B-lymfocytů. Překvapivě bylo také zjištěno, že póly C sekvence (SEQ ID NO: 1096) mohou aktivovat lidské B-lymfocyty, alespoň ve vyšších koncentracích (10 gg/ml) (Obr. 5).

Dva další ODN bohaté na T, konkrétně 1982 (SEQ ID NO: 225) a 2041 (SEQ ID NO: 282) neobsahující CpG motivy, byly testovány na jejich efekty na lidské B-lymfocyty. PBMC (n=2) byly inkubovány s uvedenými koncentracemi ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 1982 (SEQ ID NO: 225) a 2041 (SEQ ID NO: 282), jak je popsáno výše. Aktivace B-lymfocytů (exprese aktivačního markéru CD86) se měřila průtokovou cytometrií.

Obr. 6 ukazuje, že non-CpG ODN bohaté na T jsou imunostimulační v koncentracích vyšších než 1 gg/ml. Inkorporace CpG motivu do 1982 zesiluje jeho imunostimulační aktivitu. Prodloužení pomocí póly T sekvence nezesiluje imunostimulační aktivitu tohoto ODN již bohatého na T, ale místo toho mírně snižuje aktivační potenciál.

Příklad 7: Imunostimulace non-CpG ODN se odráží v zesílení • · · * «toto · «toto • · · ··»· to· *· * »« · • to ·

175 aktivace NK, cytotoxicity NK a aktivace monocytů

NK buňky, stejně jako monocyty, se testovaly na jejich reakci na non-CpG ODN. PBMC (2xl0⁶buněk/ml) se inkubovaly s 6 pg/ml následujících ODN (n=4): 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO: 886), 2183 (SEQ ID NO: 433),

2194 (SEQ ID NO: 911) a 5126 (SEQ ID NO: 1058). Po 24 hodinách kultivace při 37 °C se buňky sklízely a barvily se mAb na CD3 (markér pro T-lymfocyty), CD56 (markér pro NK buňky) a CD69 (markér časné aktivace), jak je popsáno výše. Exprese CD69 na CD56-pozitivních NK buňkách se měřila průtokovou cytometrií.

Obr. 7 ukazuje, že pro póly T ODN mohou být pozorovány podobné efekty jako na obr. 5. Stimulace NK buněk, stejně jako B-lymfocytů, může být ovlivněna délkou ODN. ODN 2183 (SEQ ID NO: 433) (21 baží) indukoval aktivaci NK buněk, ale v menším rozsahu než delší ODN 2194 (SEQ ID NO: 911) (27 baží), jak se měřilo zesílenou expresí časného aktivačního markéru CD69. ODN 5126 (SEQ ID NO: 1058) také aktivoval lidské NK buňky (obr.

7) .

Předpokládá se, že protinádorové aktivita CpG ODN může být hodnocena podle schopnosti ODN zesilovat cytotoxicitu zprosteřdkovanou NK buňkami in vitro. ODN obsahující na 3a 5konci řetězce póly G měly nejvyšší indukci cytotoxicity (Ballas, Z.K. et al., 1996, J. Immunol. 157: 1840). Pro testování vlivu non-CpG ODN bohatých na T na cytotoxicitu NK buněk jsme analyzovaly efekt ODN 2194 (SEQ ID NO: 911) a 5126 (SEQ ID NO: 1058) na lýzu zprostředkovanou NK buňkami (obr.

8) . Lýza K-562 cílových buněk zprostředkovaná NK buňkami se měřila po inkubaci PBMC přes noc s 6 ug/ml ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), SEQ ID NO: 911 (SEQ ID NO: 911) (póly T, 27 baží) a 5126 (SEQ ID NO: 1058), způsobem popsaným výše. SEQ ID NO:

176 ♦ * · ····· · · · * · · * · « · * · · · · • · · * · · · · » · ··♦ ·* ** ·· ♦· ····

1058 vykazovala malé zvýšení lýzy lidskými NK buňkami ve srovnání se stavem bez ODN. SEQ ID NO: 911 a SEQ ID NO: 246 zesilovaly cytotoxicitu lidských NK buněk v ještě větší míře.

Dřívější práce prokázaly, že nejen NK buňky, ale také NKT buňky jsou mediátory cytotoxické reakce na nádorové buňky (14). Proto jsme se zaměřily na potenciální aktivaci lidských NKT buněk non-CpG ODN bohatými na T. PBMC od jednoho reprezentativního dárce (n=2) se inkubovaly s 6 gg/ml ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO:

886), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 913) a 5126 (SEQ ID NO: 1058) po dobu 24 hodin způsobem popsaným výše. Aktivace NKT buněk byla měřena průtokovou cytometrií po barvení buněk mAb pro CD3 (markér T-lymfocytů), CD56 (markér NK buněk) a CD69 (markér časné aktivace). Ukázaná je exprese CD69 na CD3 a CD56 dvojitě pozitivních buňkách (NKT buňkách).

Na obr. 9 je popsáno, že jak SEQ ID NO: 911, tak SEQ ID NO:

1058, stimulují NKT buňky. Podobně jako pro NK buňky byla SEQ ID NO: 911 (póly T) aktivnější než sekvence SEQ ID NO: 1058.

Dále, jak je popsáno pro B-lymfocyty a NK buňky, dílka ODN měla určitý význam pro imunostimulační potenciál, kdy delší ODN měly větší účinky na NKT buňky. Podobné výsledky byly získány pro lidské T-lymfocyty.

Jiným typem buněk podílejících se na obraně proti infekcím jsou monocyty. Tyto buňky uvolňují po aktivaci různé cytokiny a mohou vyzrávat na dendritické buňky (DC), což jsou profesionální buňky prezentující antigen (Roitt, I., J.

Brostoff, and D. Male, 1998, Imunology, Mosby, London). Obr.

ukazuje aktivaci lidských monocytů po kultivaci PBMC s různými ODN. PBMC (2xl0⁶ buněk/ml) se inkubovaly s 6 gg/ml

2006 (SEQ ID NO: 246), 2117 (SEQ ID NO: 358), 2137 (SEQ ID NO:

177

886), 2178 (SEQ ID NO: 1096), 2183 (SEQ ID NO: 433), 2194 (SEQ ID NO: 911), 5126 (SEQ ID NO: 1058) a 5163 (SEQ ID NO: 1095) přes noc při 37 °C, jak bylo popsáno výše. Buňky se odebraly a barvily se na CD14 (markér pro monocyty) a CD87 (B7-1, markér aktivace). Exprese se měřila průtokovou cytometrií.

Jak bylo demonstrováno výše pro NK buňky a B-lymfocyty, sekvence bohaté na T (například SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 911) různé délky indukovaly stimulaci monocytů, ale měly různé úrovně aktivity, například SEQ ID NO: 433 > SEQ ID NO: 911.

Póly A (SEQ ID NO: 1095), stejně jako póly C (SEQ ID NO: 1096 (2178)) sekvence, naopak, nezpůsobovaly aktivaci monocytů (jak je měřena podle zvýšení CD80 při koncentraci ODN 6 gg/ml).

Příklad 8: Indukce uvolňování cytokinů pomocí non-CpG ODN

Potom byla hodnocena schopnost různých ODN bohatých na T ovlivňovat uvolňování cytokinů. PBMC (3xl0⁶ buněk/ml) se kultivovaly po dobu 24 hodin s nebo bez 6 gg/ml uvedených ODN nebo 1 gg/ml LPS jako pozitivní kontroly (n=2). Po inkubaci se supernatanty odebraly a TNFa se měřil pomocí ELISA způsobem popsaným výše a výsledky jsou uvedeny na obr. 11. PBMC se kultivovaly s uvedenými ODN (1,0 gg/ml), jak je uvedeno an obr. 11, a IL-6 se měřil v supernatantech ELISA a výsledky jsou uvedeny na obr. 12.

Obr. 11 a 12 demonstrují, že non-CpG ODN bohaté na T a CpG ODN bohaté na T mohou indukovat sekreci prozánětlivých cytokinů TNFa a IL-6. Pro oba cytokiny bylo zjištěno, že ODN 5126 (SEQ ID NO: 1058) byl ve většině testů stejně účinný jako ODN 2194 (SEQ ID NO: 911). Je známo, že CpG ODN ovlivňuje Thl/Th2 rovnováhu přednostně tím, že indukuje Thl cytokiny

178

A A

A AAA

AAA AAAA AAA ··· ·· ·· AA AA AAAA (Krieg, A.M. 1999, Biochemica et Biophysica Acta 93321:1). Pro testování toho, zda zůsobuje ODN bohatý na T stejný posun k Thl cytokinům se měřila produkce IFNy v PBMC. V první sadě pokusů se prokázalo, že - jak je popsáno pro IL6 a TNFa, ODN SEQ ID NO: 1058 a SEQ ID NO: 911 indukují uvolňování srovnatelných množství tohoto Thl cytokinu IFNy. Dále se zjistilo, že jiný prozánětlivý cytokin, IFNP, se uvolňuje po kultivaci PBMC s těmito dvěma ODN. Ačkoliv bylo množství těchto cytokinů indukované ODN bohatými na T bez CpG motivů menší než množství indukované CpG ODN SEQ ID NO: 246, byla tato množství výrazně vyšší než kontrola.

Příklady 9-11

Úvod

Vynález popisuje optimální CpG motiv pro aktivaci imunitního systému u obratlovců jiných než jsou hlodavci. Bylo zjištěno, že fosfodiesterový oligonukleotid obsahující tento motiv silně stimuluje expresi CD86, CD40, CD54 a MHCII, syntézu IL-6 a proliferaci primárních lidských B-lymfocytů.

Tyto efekty vyžadují internalizaci oligonukleotidu a zrání v endosomu. Tento CpG motiv byl asociovaný s prodlouženou indukcí NFkB p50/p65 heterodimeru a proteinu 1 aktivujícího komplex transkripčního faktoru (AP-1). Aktivace transkripčního faktoru CpG ODN předcházela zvýšená fosforylace stresových kinas c-jun NH2 terminální kinasy (JNK) a p38, a aktivačního transkripčního faktoru 2 (ATF-2). Oproti CpG vedla signalizace přes receptor B-lymfocytů k aktivaci extracelulární receptorové kinasy (ERK) a k fosforylaci různých izoforem JNK.

Materiály a metody ·· ·· ·· ♦ · ·· • · · · 9 9 9 9 9

9 9 9 999 9 9 9

179

Start sekvence

Střední baze

Lidský CpG motiv

Oligonukleotidy: Nemodifikované (fosfodiesterové, PE) a modifikované ODN resistentní na nukleasu (fosforothioátové,

PS) ODN byly zakoupeny od Operon Technologies (Alameda, CA) a Hybridom Specialty Products (Milford, MA). Použité sekvence jsou uvedeny v tabulce Η. E. coli DNA a DNA z telecího brzlíku byly zakoupeny od Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Vzorky genomové DNA byly přečištěny extrakcí fenol-chloroform-isoamyl alkoholem (25/24/1) a srážením ethanolem. DNA byla přečištěna z endotoxinu opakovanou extrakcí tritonem x-114 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a byla testována na endotoxín za použití LAL-testu (LAL-test BioWhittaker, Walkerscille, MD; dolní limit detekce je 0,1 EU/ml) a testem na endotoxin s vysokou sensitivitou, který byl popsán dříve (dolní limit detekce 0,0014 EU/ml) (Hartmann G., and Krieg, A.M., 1999. CpG DNA and LPS induce distinct patterns of activation in human monocytes. Gene therapy 6: 893). Obsah endotoxinu ve vzorcích DNA byl menší než 0,0014 U/ml. E. coli a DNA z telecího thymu se zpracovaly na jednořetězcovou DNA před použitím pomocí varu po dobu 10 minut a potom ochlazením na ledu po dobu 5 minut. Vzorky DNA se ředily v TE pufru za použití apyrogenních činidel.

Tabulka H: Panel použitých oligonukleotidů¹

Sekvence 5 -> 3

TCG ACG TTC CCC CCC CCC CČ

f.

/

TCG GCG TTC CCC CCC CCC CC TCG CCG TTC CCC CCC CCC CC TCG TCG TTC CCC CCC CCC CC

Název (SEQ ID NO: )

PE 2079 (320)

PE 2100 (341) PE 2082 (323) PE 2080 (321)

180 ·· ·· ► · · 4 » * ·

5 sousedící baze	RE 2105 (346) PE 2107 (348) PE 2104 (345)
3sousedící baze	PE 2098 (339) PE 2099 (340) PE 2083 (324)
První CpG deletovaný	PE 2108 (349)
Druhý CpG deletovaný	PE 2106 (347)
Methylace	PE 2095 (336) PE 2094 (335)
Non CpG kontrola
2080	PE 2078 (319)
	PE 2101 (342)
PS forma 2080 Další CpG motivy Nejlepší PS Methylovaný 2006	PS 2116 (357) PE 2059 (300) PS 2006 (246) PS 2117 (358)

GCG TCG TTC CCC CCC CCC CC ACG TCG TTC CCC CCC CCC CC CCG TCG TTC CCC CCC CCC CC

TCG TCG CTC CCC CCC CCC CC TCG TCG GTC CCC CCC CCC CC TCG TCG ATC CCC CCC CCC CC

CTG TCG TTC CCC CCC CCC CC TCG TCA TTC CCC CCC CCC CC

TZG TZG TTC CCC CCC CCC CC TCG TCG TTC CCC CCC ZCC CC

TGC TGC TTC CCC CCC CCC CC

GGC CTT TTC CCC CCC CCC CC

TCG TCg TTC CCC CCC CCC CC TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TZG TZG TTT TGT ZGT TTT GTZ GTT ¹PE, fosfodiester; PS, fosforothioát; tučně, změna baží; tučně Z, methylovaný cytidin; podtržené, CpG dinukleotidy.

Příprava buněk a buněčná kultura: Lidské mononukleární buňky periferní krve (PBMC) se izolovaly z periferní krve zdravých dobrovolníků pomocí Ficoll-Paque odstředění s gradientem hustoty (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) způsobem popsaným dříve (Hartmann et al., 1996, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6: 291) . Buňky se supendovaly v RPMI 1640 kultivačním mediu doplněném 10% (obj./obj.) teplem

181 • · · • ··· • * · ·♦·· ··· ··· ·· ·· ·· ·· 9999 inaktivovaným (56°C, 1 h) FCS (HyClone, Logan, UT) , 1,5 mM Lglutaminu, 100 U/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu (všechny od Gibco BRL, Grand Island, NY) (kompletní medium).

Všechny sloučeniny byla testované na endotoxin.

Životaschopnost se určovala před a po inkubaci s ODN pomocí hodnocení vylučování trypanové modři (běžná mikroskopie) nebo propidum jodidu (analýza průtokovou cytometrií). Ve všech pokusech bylo 96% až 99% PBMC životaschopných. Buňky konečná koncentrace 1 x 10⁶ buněk/ml) se kultivovaly v kompletním mediu v 5% CO2 v humidifikovaném inkubátoru při teplotě 37°C. Různé oligonukleotidy (viz tabulku I, koncentrace uvedené v legendě k obrázku), LPS (ze Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) nebo anti-IgM se použily jako stimuly.

Chlorochin (5 pg/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) se použil pro blokování endosomální maturace/acidifikace. V vedených časech se buňky odebíraly pro průtokovou cytometrii, jak je popsána dále.

Pro testy přenosu signálu se lidské primární B-lymfocyty izolovaly imunomagnetickým tříděním buněk za použití VARIOMACS techniky (Miltenyi Biotec, Inc., Auburn, CA) podle návodu výrobce. Stručně, PBMC získané z „buffy coats zdravých dárců krve (Elmer L., DeGowin Blood Center, University of Iowa) se inkubovaly s protilátkou k CD19 konjugovanou na mikrokorálky a nechaly se projít přes pozitivní selekční kolonu. Čistota Blymfocytů byla vyšší než 95%. Po stimulaci se připravily buněčné extrakty (westernové hybridizace) a jaderné extrakty EMSA) pro testování přenosu signálu.

Pro testy vazby CPG na proteiny se Ramos buňky (lidská Blymfocytární linie Burkittova lymfomu, ATCC-CRL 1923 nebo CRL-1596; Intervirology 5: 319-334, 1975) kultivovaly v kompletním mediu. Nezpracované buňky se odebraly a připravil

182

• ·	*·	«	to· to	9	to· 9	99 9	9	• to • 9
• ·		•	•	•	♦ ·*	•	9	«
• ·		•	•	•	• ·	«	•	•
			99		99	99		9999

se extrakt cytosolových proteinů, který se analyzoval na přítomnost vazebných proteinů pro CpG oligonukleotidy pomocí EMSA a UV-zesítění, jak jsou popsány dále.

Průtoková cytometrie: Barvení povrchových antigenů se provedlo způsobem popsaným dříve (Hartmann et al., 1998 J. Pharmacol. Exp. Ther. 285:920). Monoklonální protilátky k HLA-DR se zakoupily od Immunotech, Marseille, France. Všechny ostatní protilátky se zakoupily od Pharmingen, San Diego, CA: mAb k CD19 (B43), CD40 (5C3), CD54 (HA58), CD86 (2331 fFUN-1]). IgGi,_K (MOPC-21) a IgG2b,K se použily jako kontroly pro specifické barvení. Intracelulární cytokinové barvení pro IL-6 se provedlo způsobem popsaným dříve (Hartmann G., and Krieg, A.M., 1999. CpG DNA and LPS induce distinct patterns of activation in human monocytes. Gene therapy 6: 893). Stručně, PBMC (konečná koncentrace 1 x 10⁶ buněk/ml) se inkubovaly za přítomnosti brefeldinu A (konečná koncentrace 1 pg/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Po inkubaci se buňky odebraly a barvily se za použití FITC-značené mAb k CD19 (B43), PEznačené krysí mAb proti lidskému IL-6 (MQ2-6A3, Pharmingen) a Fix a Perm Kitu (Caltag Laboratories, Burlingame, CA). Data z průtokové cytometrie pro 5000 buněk na vzorek se získala na FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Neživotaschopné buňky se vyloučily z analýzy barvením propidium jodidem (2 pg/ml). Data se analyzovala za použití počítačového programu FlowJo (verze 2.5.1, Tree Star, lne., Stanford, CA).

Proliferační test: CSFE (5- a 6-karboxyfluorescein diacetátsukcinimidyl ester,Molecular Probes, USA) je intracelulární fluorescentní barvivo odvozené od fluoresceinu, které se dělí rovnoměrně mezi dceřiné buňky po dělení buněk. Barvení buněk CFSE umožňuje jak kvantifikaci, tak imunofenotypizaci

183

• ··	*·		*·
• » «	•	•		•	•	* 9
• · ·	•	•	··*	•	•	9
• · · ·· ·*	• · ··	w ·	• ··	•	9 999 9

(fykoerythrinem značené protilátky) proliferujících buněk ve směsi buněk. Stručně, PBMC se promyly dvakrát v PBS, resuspendovaly se v PBS obsahujícím CFSE v konečné koncentraci 5 μΜ a inkubovaly se při teplotě 37 °C po dobu 10 minut. Buňky se promyly třikrát PBS a inkubovaly se po dobu 5 dnů jak je uvedeno v legendě k obrázku. Proliferující CDl9-pozitivní Blymfocyty se identifikovaly podle snížení obsahu CFSE za použití průtokové cytometrie.

Příprava extraktů celých buněk, jaderných extraktů a extraktů cytosolových proteinů: Pro westernovou hybridizaci se připravily extrakty celých buněk. Primární B-lymfocyty se ošetřily mediem, fosfodiesterovými oligonukleotidy 2080 (SEQ ID NO: 321) nebo 2078 (SEQ ID NO: 319) v koncentraci 30 gg/ml, nebo anti-IgM (10 gg/ml). Buňky se odebraly, promyly se dvakrát ledově chladným PBS obsahujícím 1 mM Na3V0í, resuspendovaly se v lyzačním pufru (150 mM NaCl, 10 mM TRIS, pH 7,4, 1% NP40, 50 mM NaF, 30 mg/ml leupeptinu, 50 mg/ml aprotininu, 5 mg/ml antipainu, 5 mg/ml pepstatinu, 50 ggml fenylmethylsulfonylchloridu (PMSF)), inkubovaly se po dobu 15 minut na ledu a odstředily se při 14000 rpm během 10 minut. Supernatant se zmrazil při -80 °C. Pro přípravu jaderných extraktů se primární B-lymfocyty resuspendovaly v hypotonickém pufru (10 mM HEPES/KOH (pH 7,9), 10 mM KCl, 0,05% NP40, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM dithiothreitolu (DTT), 0,5 mM PMSF, 30 mg/ml leupeptinu, 50 mg/ml aprotininu, 5 mg/ml antipainu, 5 mg/ml pepstatinu). Po 15 minutách inkubace na ledu se suspenze odstředila při 1000 x g během 5 minut. Peletovaná jádra se resuspendovala v extrakčním pufru (20 mM HEPES (pH 7,9), 450 mM NaCl, 50 mM NaF, 20% glycerolu, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 30 mg/ml leupeptinu, 50 mg/ml aprotininu, 5 mg/ml antipainu, 5 mg/ml pepstatinu) a provedla se 1 hodinová inkubace na ledu. jaderná suspenze se odstředila po dobu 10

184 minut při 16000 g při teplotě 4 °C. Supernatant se ochladil a uskladnil se při -80 °C. Cytosolové extrakty pro testy vazby CpG na proteiny se připravily z nestimulovaných Ramos buněk, které se lyžovaly v hypotonickém pufru způsobem popsaným pro přípravu jaderného extraktu. Po odstředění se supernatant odebral jako cytoplasmatická frakce a uskladnil se při -80 °C. Koncentrace proteinů se měřila za použití Bradfordova proteinového testu (Bio-Rad, Hercules, CA) podle návodu výrobce.

Westernová hybridizace: Stejné koncentrace extarktů celých buněk (25 gg/dráhu) se zahřívaly v SDS vzorkovém pufru (50 mM Tris-HCl, pH 6,8; 1% β-merkaptoethanolu; 2% SDS; 0,1% bromfenolové modři; 10% glycerolu) po dobu 4 minut před zpracováním elektroforesou na 10% polyakrylamidovém gelu obsahujícím 0,1% SDS (SDS-PAGE). Po elektroforese se proteiny přenesly na Immobilion-P přenosové membrány (Millipore Corp., Bedford, MA). Bloty se blokovaly 5% odtučněným sušeným mlékem. Použily se specifické protilátky proti fosforylované formě extracelulární receptorové kinasy (ERK), c-jun NH2-terminální kinasy (JNK), p38 a aktivačnímu transkripčnímu faktoru 2 (ATF2) (New England BioLabs, Beverly, MA). Bloty se vyvíjely v činidle se zesílenou chemiluminiscencí (ECL; Amersham International, Aylesbury, UK) podle návodu výrobce.

Test elektroforetické mobility (EMSA): Prod etekci DNA-vazebné aktivity aktivátorového proteinu 1 pro transkripční faktor (AP-1) a NFKB se jaderné extrakty (1 gg/dráhu) analyzovaly EMSA za použití dsODN 5GAT CTA GTG ATG AGT CAG CCG GAT C 3 (SEQ ID NO: 838) obsahujícího AP-1 vazebnou sekvenci, a NFKB URE z cmyc promotorového regionu 5TGC AGG AAG TCC GGG TTT TCC CCA ACC CCC C 3 (SEQ ID NO: 1142) jako sond. DN se značily na konci T4·· ·· ·« ·· • · · » · · • ··· · · ·

185 polynukelotid kinasou (New England Biolabs) a (γ- P)ATP (Amersham, Arlington Heights, IL). Vazebné reakce se provedly s 1 gg extarktu jaderného proteinu v DNA-avzebném pufru (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 40 mM MgCl2, 20 mM EDTA, 1 mM dithiothreitolu, 8% glycerolu a 100-400 ng póly (dl-dC) s 20000-40000 cpm značeného ODN v 10 μΐ celkovém objemu. Specificita NFKB proužků se potvrdila kompetitivními testy s chladnými oligonukleotidy z nepříbuzných vazebných míst transkripčního faktoru (10-100 ng. Pro test superposunu se 2 μg specifických protilátek k c-rel, p50 a p65 (Santa Cruz Biotechnology, lne., Santa Cruz, CA) přidaly do reakční směsi na dobu 30 minut před přidáním radioaktivně značené sondy. Po inkubaci po dobu 30 minut při teplotě místnosti se přidal zaváděcí pufr a sondy se elektroforezovaly na 6% polyakrylamidovém gelu v Tris-boritan-EDTA pracovním pufru (90 mM Tris, 90 mM kyselianboritá, 2 mM EDTA, pH 8,0). Gely se sušily a potom se zpracovaly autoradiografií.

UV-zesítění a denaturační proteinová elektroforesa

Jaderné extrakty se inkubovaly se značeným fosfodiesterovým oligonukleotidem způsobem popsaným pro EMSA. Komplexy DNAprotein se zesítily UV světlem v Startalinker (Startagene) během 10 minut. Sondy se smísily s SDS-vzrkovým pufrem, vařily se po dobu 10 minut a vnesly se na 7,5% SDS-PAGE. Gel se sušil na Whatmanově papíru a zpracoval se autoradiografií. Graf vzdálenosti v závislosti na molekulové hmotnosti se použil jako standardní křivka, která se použila pro výpočet přibližné molekulové hmotnosti zesítěných komplexů protein-ODN. Molekulová hmotnost oligonukleotidu byla odečtena od této hodnoty za zisku velikosti.

Příklad 9: Identifikace optimálního CpG motivu pro použití samostatně nebo v kombinaci s ODN bohatým na T ·· ·· ·· ·· 99

9 ··· ···· • · 9 9 999 99 9

186

Fosforothioátové oligonukleotidy obsahující myší CpG motiv GACGTT (SEQ ID NO: 1143) (napřílkad 1862 (SEQ ID NO: 69)) a použité v koncentracích, které jsou aktivní v myších Blymfocytech (Yi A.K., Chang M., Peckham, D.W., Krieg A.M., a Ashman R.F. 1998, CpG oligodeoxyribonucleotides rescue mature spleen B cells from spontaneous apoptosis and promote cell cycle entry., J. Immunol. 160: 5898), mají slabou nebo žádnou imunostimulační aktivitu na lidské imunitní buňky. Při vyšších koncentracích měl tento ODN určitý stimulační vliv na lidské B-lymfocyty.

V dřívějších pokusech s aktivací B-lymfocytů u myší se zjistilo, že CpG-dinukleotid obklopený dvěma 5puriny a dvěma 3pyrimidiny a výhodně 6-merovým motivem 5ACGTT3(SEQ ID NO: 1143) byl optimální pro aktivitu fosfodiesterového oligonukleotidu (Krieg, A.M. et al., 1995, Nátuře 374: 546, Ya A.K., Chang, M. et al., 1998, J. Immunol. 160: 5898).

Pro identifikaci optimálního motivu pro stimulaci imunitní reakce u člověka a obratlovců jiných než hlodavců jsme navrhli sérií ODN a testovali jsme jejich aktivitu. Nejprve jsme navrhli 20 měrový fosfodiesterový oligonukleotid s TC dinukleotidem na 5konci před optimálním CpG motivem

5GACGTT3(SEQ ID NO: 1143) a potom následovala póly C koncovka (2079: 5TCG ACG TTC CCC CCC CCC CC 3(SEQ ID NO: 320)). Bylo zjištěno, že tento oligonukleotid, když je přidán k primárním B-lymfocytům za stejných podmínek jako jsou podmínky optimální pro E. coli DNA (opakované přidávání v 0 hodině, 4 hodině a 18 hodině; 30 gg/ml pro každý čas) stimuluje vyšší úroveň exprese CD86 na lidských primárních B-lymfocytech po dvou dnech. Pro stanovení vztahu struktura-funkce pro CpG motivy jsme nahradili baze sousedící s CpG dinukleotidy za zachování dvou

187 • ·

CpG dinukleotidů v sekvenci. Změna adeninu umístěného mezi dvěma CpG dinukleotidy na thymidin (2080 (SEQ ID NO: 321)) vedla k dosažení o něco vyšší aktivity. Nahrazení guanosinem (2100 (SEQ ID NO: 341)) nebo cytidinem (2082 (SEQ ID NO: 323)) v této pozici nemělo vliv ve srovnání s 2079 (SEQ ID NO: 320). Naopak, nahrazení thymidinu 3 k druhému CpG dinukleotidu puriny guanosinem (2099 (SEQ ID NO: 340)) nebo adeninem (2083 (SEQ ID NO: 324)) vedlo k významnému poklesu aktivity oligonukleotidu, zatímco nahrazení pyrimidinem cytidinem vedlo k pouze slabému snížení aktivity. Thymidin bezprostředně 5k prvnímu CpG dinukleotidu byl také významný. Nahrazení thymidinu jakoukoliv jinou baží (2105 (SEQ ID NO: 346), guanosin; (2107 (SEQ ID NO: 348), adenin; 2104 (SEQ ID NO: 345), cytidin, vedlo k významnému snížení aktivity oligonukleotidu. Eliminace prvního (2108 (SEQ ID NO: 349)) nebo druhého (2106 (SEQ ID NO: 347)) CpG dinukleotidu také částečně redukovalo aktivitu.

Přidání více 5GTCGTT3 (SEQ ID NO: 114 4) CpG motivů k fosfodiesterovému oligonukleotidu obsahujícímu 8-merový duplexní CpG motiv (5CGTCGTT3 (SEQ ID NO: 1145), 2080 (SEQ ID NO: 321)) nezesilovalo dále expresi CD86 na B-lymfocytech (2059 (SEQ ID NO: 300)). Oligonukleotid se stejnou sekvencí jako 2080 (SEQ ID NO: 321), ale s fosforothioátovým skeletem, nevykazoval vyšší než bazální aktivitu (2116 (SEQ ID NO:

357)). Toto bylo překvapivé, protože bylo popsáno, že fosforothioátový skelet značně stabilizuje oligonukleotidy a zesiluje stimulaci indukovanou CpG (krieg, A.M., Yi, A.K., Matson, S., Waldschmidt T.J., Bishop, G.A., Teasdale, R., Koretzky, G.A., a Klinman, D.M., 1995, CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nátuře 374: 546). Proto jsme provedly další strukturálně-funkční analýzu fosforothioátových oligonukleotidů obsahujících 5CTCGTT3 (SEQ

188

ID NO: 1144) a 5TCGTCGTT3(SEQ ID NO: 1145) motivy, která ukázala, že další CpG motivy (2006 (SEQ ID NO: 246)) zvyšují aktivitu fosforothioátových oligonukleotidů.

Přečištěné B-lymfocyty izolované z periferní krve imunomagnetickým tříděním buněk byly aktivovány CpG DNA ve stejném rozsahu jako nepřečištěné B-lymfocyty v PBMC. Proto je aktivace B-lymfocytů primární reakcí a ne sekundárním efektem způsobeným cytokiny secernovanými jinými buňkami.

Kromě kostimulační molekuly CD86 je funkční stav Blymfocytu charakterizován dalšími povrchovými markéry. Například, aktivované T-helper lymfocyty stimulují B-lymfocyty ligací na CD40, vazba na jiné imunitní buňky je zprostředkována prostřednictvím intercelulární adhesní molekuly 1 (ICAM-1, CD54) a hlavní histokompatibilní komplex II (MHC II) je odpovědný za prezentaci antigenů. Zjistili jsme, že exprese CD40, CD54 a MHC II na B-lymfocytech byla zesílena CpG oligonukleotidem 2080 (SEQ ID NO: 321). Non-CpG kontrolní oligonukleotid 2078 (SEQ ID NO: 319) nevykazoval žádnou aktivitu ve srovnání s mediem samotným.

Když se PBMC inkubovaly po dobu 5 dnů za přítomnosti 2080 (SEQ ID NO: 321) (přidaného v 0 hodině, 4 hodinách a 18 hodinách a každé další ráno), tak bylo zjištěno, že v subpopulaci lymfocytů se zvyšuje velikost buněk (FCS) a že jsou tyto buňky jsou více granulární (SSC). Pro zjištění, zda reprezentuje tato subpopulace proliferující B-lymfocyty, jsme barvily čerstvě izolované PBMC CFSE (5- (a 6-) karboxyfluoresceindiacetátsukcinimidylester) v den 0 a inkubovaly jsme je po dobu 5 dnů s 2080 (SEQ ID NO: 321) způsobem popsaným výše. CFSE je fluorescentní molekula, která se ireverzibilně váže na buněčné proteiny. Každé buněčné

189 • · · · · · « • · ··· » · <

dělení snižuje barvení CFSE o 50%. Buňky barvené slabě CFSE (proliferující buňky) byly hlavně CD19-pozitivní B-lymfocyty. Oligonukleotid 2080 (SEQ ID NO: 321) indukovat 60-70% CD19 pozitivních B-lymfocytů k proliferaci během 5 dnů. Kontrolní oligonukleotid 2078 (SEQ ID NO: 319) indukoval méně než 5 % Blymfocytů k proliferaci. Proliferující B-lymfocyty (nízký CFSE) vykazovaly větší velikost buněk (FCS) a vyšší granularitu.

Proliferující B-lymfocyty exprimovaly vyšší koncentrace CD86 než neproliferující buňky (není uvedeno). V souladu s tímto zjištěním vedl oligonukleotidový panel testovaný výše pro indukci exprese CD86 k téměř identickému charakteru proliferace B-lymfocytů. Nahrazení 3 thymidinu snižovalo aktivitu více než změna thymidinu ve střední pozici.

Příklad 10: Aktivace B-lymfocytů vyžaduje endosomální maturaci/acidifikaci

Již dříve bylo popsáno, že chlorochin, inhibitor endosomální acidifikace, blokuje CpG-zprostředkovanou stimulaci myších buněk prezentujících antigen a B-lymfocytů, bez ovlivnění efektů vyvolaných LPS (Hacker, H. et al., 1998, EMBO J. 17: 6230, Yi, A.K. et al., 1998, J. Immunol. 160:

4755, MacFarlane, D.E. and Manžel, L., 1998, J. Immunol. 160: 1122). Zjistili jsme, že adice 5 gg/ml chlorochinu zcela blokuje CpG DNA zprostředkovanou indukci exprese CD86 na primárních B-lymfocytech (MFI CD86: 2006 (SEQ ID NO: 246), 4,7 vs. 1,4; E. coli DNA, 3,4 vs. 1,4; pouze medium, 0,9; n = 4). Dále, chlorochin zcela inhiboval indukci proliferace Blymfocytů fosforothioátovým oligonukleotidem 2006 (SEQ ID NO: 246) měřenou testem CFSE proliferace, stejně jako standardním testem. Tyto výsledky naznačují, že stejně jako u myších buněk

190

vyžaduje aktivace lidských B-lymfocytů CpG DNA vychytávání DNA v endosomech a následnou endosomální acidifikaci.

Příklad 11: Analýza subcelulárních dějů probíhajících po stimulaci lidských B-lymfocytů optimálním lidským ODN

Protože je CpG motiv nutný pro maximální aktivaci Blymfocytů významně odlišný u myší (GACGTT) (SEQ ID NO: 1143) a člověka (TCGTCGTT) (SEQ ID NO: 1145), zajímalo nás, zda jsou základní signální děje srovnatelné. Rychlá indukce vazebné aktivity NFKB byla zjištěna u myších B-lymfocytů a makrofágů (Stacey, K.J. et al., 1996, J. Immunol. 157: 2116, Yi A.K. et al., 1998, J. Immunol. 160: 4755). Pro etstování toho, zda reaguje NFKB u člověka na CpG DNA, se lidské primární Blymfocyty izolovaly z periferní krve pomocí imunomagnetického třídění buněk a inkubovaly se s CpG oligonukleotidem 2080 (SEQ ID NO: 321), non-CpG kontrolním oligonukleotidem 2078 (SEQ ID NO: 319) nebo s mediem. V uvedených časech se buňky odebraly a připravily se jaderné extrakty. Za přítomnosti CpG oligonukleotidu se vazebná aktivita NFKB zvýšila během jedné hodiny a udržovala se po dobu 18 hodin (podslední testovaný čas). Non-CpG kontrolní oligonukleotid 2078 (SEQ ID NO: 31) nevykazoval vyšší aktivitu NFKB ve srovnání s buňkami inkubovanými pouze s mediem. NFKB proužek byl identifikován chladnou kompeticí a v testu superposunu se prokázalo, že se skládal z p50 a p65 podjednotek.

Transkripční faktor aktivační protein-1 (AP-1) se podílí na regulaci časných genů a exprese cytokinů (Karin M., 1995, The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J. Biol. Chem. 270: 16483). V myších B-lymfocytech je vazebná aktivita AP-1 indukována v reakci na CpG DNA (Yi,

A.K., and Krieg, A. M., 1998, Rapid induction of mitogen191 • · · · · · · * * · ··· 9 9 •·· * · · · · · · • · ·· ♦· · · · activated protein kinases by immune stimulatory CpG DNA. J.

Immunol. 161: 4493). Pro stanovení toho, zda může být tento transkripční faktor indukován také CpG DNA u člověka jsme testovaly vazebnou aktivitu AP-1 na DNA v primárních lidských B-lymfocytech. Buňky se inkubovaly s CpG oligonukleotidem 2080 (SEQ ID NO: 321) nebo s kontrolním oligonukleotidem 2078 (SEQ ID NO: 319). Připravily se jaderné extrakty a vazebná aktivita AP-1 se analyzovala EMSA. Vazebná aktivita AP-1 se zesílila během jedné hodiny a byla zvýšená do 18 hodin (poslední testovaná doba), což ukazuje na dlouhotrvající reakci.

Protože je aktivita AP-1 indukována mnoha stimuly (Angel P., and Karin, M., 1991, The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation. Biochim.

Biophys Acta 1072: 129), zajímaly jsme se o dráhy přenosu signálu před AP-1. Komplex AP-1 tanskripčního faktoru integruje různé dráhy mitogenem aktivované protein kinasy (MAPK) (Karin, Μ., 1995. The regulation of AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases. J. Biol. Chem. 270: 16483). Westernové hybridizace se provedly za použití extraktů celých buněk z primárních B-lymfocytů inkubovaných s CpG oligonukleotidem 2080 (SEQ ID NO: 321), kontrolním 2078 (SEQ ID NO: 319) nebo pouze s mediem. Použily se specifické protilátky k fosforylované formě JNK, p-38, ATF-2 a ERK. Silná indukce fosforylace JNK byla zjištěna 30 minut a 60 minut po expozici CpG-DNA, zatímco non-CpG oligonukleotid neměl žádnou aktivitu vyšší než základní. Protein kinasa p38, jiná stresem aktivovaná protein kinasa (SAPK), byla také fosforylovaná v reakci na CpG DNA během 60 minut. ATF-2, substrát jak p38, tak JNK (Gupta, S., Campbel, D., Derijard, B., and Davis R.J.,

1995, Transcription factor ATF2 regulation by the JNK signál transduction pathway. Science 267: 389) a složka AP-1 komplexu, vykazoval slabou fosforylaci po 30 minutách, která

192 • 99 99 99 99 99

9 9 · * 9 9 • •9 99999 99 9 se zvýšila po 60 minutách. CpG DNA neindukovala žádnou významnou fosforylaci ERK. Naopak, anti-IgM, stimulující receptor B-lymfocytů, spouštěl fosforylaci ERK. Anti-IgM aktivoval jiné izoformy JNK než CpG DNA.

Příklad 12: Test na adjuvantní aktivitu in vivo

Byl vyvinut in vitro skríningový test pro identifikaci ODN použitelného jako adjuvans in vivo u člověka a jiných zvířat (ne hlodavců). Protože jsme pozorovali nejen kvantitativní, ale také kvalitativní odlišnosti v aktivitách různých CpG u ymší, testovaly jsme nejprve panel CpG a non-CpG kontrolních ODN na myších buňkách za účelem identifikace testů in vitro se spolehlivou a silnou korelací s adjuvantní aktivitou s povrchovým antigenem hepatitidy B (HBsAg). Systematicky jsme testovaly panel více než 250 ODN v odpovídajících lidských testech za účelem identifikace sekvencí s imunostimulační aktivitou in vitro. Potom jsme testovaly, zda ODN s nejvyšší aktivitou v těchto testech na člověku také aktivuje proliferaci B-lymfocytů u šimpanzů a opic, a nakonec jsme testovaly, zda jsou aktivní jako adjuvans s HBsAg na šimpanzech a makakách in vivo. tyto pokusy ukázaly, že sekvence, počet a mezery mezi jednotlivými CpG motivy přispívají k imunostimulační aktivitě CpG fosforothioátových ODN. ODN s TC dinukleotidem na 5koncí následovaným třemi 6merovými CpG motivy (5GTCGTT3) separovanmi TT dinukleotidy konsistentně vykazoval nejvyšší aktivitu pro lidské, šimpanzí a makačí leukocyty. U šimpanzů nebo opic vakcínvaných proti hepatitidě B s tímto CpG ODN adjuvans se vyvinul 15-krát vyšší titr anti-HBs protilátky než u jedinců vakcinovaných bez adj uvans.

Materiály a metody

193

Oligodeoxynukleotidy: Fosforothioatem-modifikované ODN se zakoupily od Operon Technologies (Alameda, CA) a Hybridon Specialty Products (Milford, MA). ODN se testovaly na endotoxin za použití LAL-testu (LAL-assay Bio Whittaker, Walkersville, MD; dolní limit detekce 0,1 EU/ml). Pro testy in vitro se ODN naředily v TE-pufru (10 mM Tris, pH 7,0, 1 mM EDTA) a uskladnily se při -20° C. Pro použití in vivo se ODN naředily ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (0,1 M PBS, pH 7,3 ) a uskladnily se při 4°C. Všechna ředění se provedla za použití apyrogenních činidel.

Kultury buněk myší sleziny: Sleziny se odebraly od 6-12 týdnů θ starých samic BALB/c (The Jackson Laboratory), 2 x 10 splenocytů se kultivovalo s 0.2 μΜ ODN po dobu 4 hodin (TNFa) nebo 24 hodin (IL-6, IFN-γ, IL-12), a cytokiny se detekovaly ELISA, jak bylo popsáno dříve (Yi A. K., Klinman D. M., Martin T. L., Matson S., a Krieg A. M. 1996. Rapid immune activation by CpG motifs in bacterial DNA. Systemic induction of IL-6 transcription through an antioxidant-sensitive pathway. J Immunol 157:5394). Pro hodnocení proliferace B-lymfocytů indukované CpG se od buněk sleziny odstranily T-lymfocyty pomocí anti-Thy-1.2 a komplementu a odstředěním přes lympholyte M^R (Cedarlane Laboratories, Homby, ON, Canada), buňky se kultivovaly po dobu 44 hodin s uvedenými ODN a potom se pulsovaly po dobu 4 hodin 1 μθϊ ³H thymidinu, jak bylo popsáno dříve (Krieg A. M., Yi A. K., Matson S., Waldschmidt T. I., Bishop G. A., Teasdale R., Koretzky G. A., a Klinman D. M. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation. Nátuře 374:546). Pro testování lytické aktivity NK buněk se z myších buněk sleziny depletovaly B-lymfocyty za použití magnetických korálků potažených kozím anti-myším Ig, jak bylo popsáno dříve (Ballas Z. K., a Rasmussen W., 1993, Lymphokine-activated killer cells. VII. IL-4 induces an

194 •A *♦ AA AA AA • · 9 9 9 9 • A 99 999 9 9 « • · · · · « AAA A A • · AAAA AAA ·· · · ·· A· AAAA

NK 1. l⁺CD8a⁺P“TCR-ap B220⁺ lymphokine-activated killer subset. J Immunol 150:17). Buňky se kultivovaly v koncentraci 5 x 10⁶/jamku ve 24-jamkových plotnách a odebíraly se v 18 hodině pro použití jako efektorové buňky ve standardním 4 hodinovém testu uvolňování ⁵¹Cr proti YAC-1 cílovým buňkám. Jedna jednotka (LU) byla definována jako počet buněk potřebných k dosažení 30% specifické lýzy.

Imunizace myší proti HBsAg a hodnocení humorální reakce:

Skupiny 6-8 týdnů starých samic BALB/c myší (n = 5 nebo 10,

Charles River, Montreal, QC) se imunizovaly proti HBsAg způsobem popsaným dříve (Davis H. L., et al, 1998, J. Immunol. 160:870). Stručně, každé myši se podala jediná i.m. injekce 50 μι PBS obsahujícího 1 gg rekombinantního HBsAg (Medix Biotech, Foster City, CA) a 10 μg CpG ODN nebo non-CpG ODN jako jediné adjuvans nebo v kombinaci s kamencem (Alhydrogel 85,

Superfos Bíosector, Vedbaek, Denmark; 25 mg Al /mg HBsAg).

Kontrolní myši se imunizvaly HBsAg bez adjuvans nebo s kamencem. Plasma se odebírala od myší v různé časy po imunizaci a Abs specifické k HBsAg (anti-HBs) se kvantifikovaly ELISA testem s konečným ředěním (v trojím provedení), jak bylo popsáno dříve (Davis H. L et al., 1998 J. Immunol 160:870). Konečné titry se definovaly jako nejvyšší ředění plasym, které vedlo k hodnotě absorbance (OD450) dvakrát vyšší než neimunní plasma s hraniční hodnotou 0,05.

Izolace primátích PBMC a kultivace buněk: Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) se izolovaly z periferní krve zdravých dobrovolníků, šimpanzů nebo makaků pomocí odstředění s Ficollhypaque gradientem hustoty (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), jak bylo popsáno dříve (Hartmann G., et al., 1996, Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:291). Buňky se suspendovaly s RPMI 1640 kultivačním mediem doplněným 10%

195 (obj./obj.) teplem inaktivovaným (56°C, 1 hodina) FCS (HyClone, Logan, UT), 1,5 mM L-glutaminem, 100 U/ml penicilinem a 100 gg/ml streptomycinem (všechny od Gibco BRL, Grand Island, NY) (kompletní medium). Buňky (konečná koncentrace 1 x 10⁶ buněk/ml) se kultivovaly v kompletním mediu a 5 % CO2 ve zvlhčovaném inkubátoru při teplotě 37°C. ODN a LPS (ze Salmonella typhimurium, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) nebo anti-IgM se použily jako stimuly. Pro měření lytické aktivity lidských NK buněk se PBMC inkubovaly v koncentraci 5 x 10⁶/jamku ve 24-jamkových plotnách. Kultury se odebíraly po 24 hodinách a buňky se použily jako efektory ve standardním 4hodinovém testu uvolňování ⁵¹Cr proti K562 cílovým buňkám, jak je popsáno dříve (Ballas Z. K., Rasmussen W. L., a Krieg A. M. 1996. Induction of NK activity in murine a human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides a bacterial DNA. J.Immunol. 157:1840; Ballas Z. K., a Rasmussen W., 1993, Lymphokineactivated killer cells. VII. IL-4 induces an

NK 1. l⁺CD8a⁺P^_TCR-aP B220⁺ lymphokine-activated killer subset. J Immunol 150:17). Pro proliferaci B-lymfocytů se 1 μθί ³H thymidinu přidal 18 hodin před odběrem buněk a množství inkorporovaného ³H thymidinu se určilo scintilačním odečtem v den 5. Standardní odchylky pro tři jamky byly < 5%.

Průtoková cytometrie na primátích PBMC: Povrchové antigeny na primátích PBMC se barvily způsobem popsaným dříve (Hartmann et al., 1998 J. Pharmacol. Exp. Ther. 285:920928). Monoklonální protilátky k CD3 (UCHT1), CD14 (MSE2), CD19 (B43), CD56 (B159), CD69 (FNSO) a CD86 (2331 [FUN-1]) se zakoupily od Pharmingen, San Diego, CA. IgGi,_K (MOPC-21) a IgG2b,K (Hartmann et al., 1999 Proč. Nati. Acad. Sci USA 96:9305-10) se použily jako kontroly pro nespecifické barvení. NK buňky se identifikovaly podle exprese CD56 na CD3, CD14 a CD19 negativních buňkách, zatímco B-lymfocyty se identifikovaly

196 *· ** ·· ·· 99 ·· · ♦ » * » * » • · · · ··· 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 •99 ·· ·· ««»·«» podle exprese CD19. Data z průtokové cytometrie pro 10000 buněk na vzorek se získala na FACScan (Beckton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Životaschopnost buněk v FSC/SSC vstupu použitém pro analýzu se stanovila pomocí barvení propidium jodidem (2 gg/ml) a zjistilo se, že je vyšší než 98%. Data byla analyzována za použití počítačového programu FlowJo (verze 2.5.1, Tree Star, lne., Stanford, CA).

Imunizace šimpanzů a makaků proti HBsAg a hodnocení protilátkové odpovědi: 14 makaků (2,0-3,5 kg) se imunizovalo pediatrickou dávkou Engerix-B (SmithKline Beecham Biologicals, Rixensart, BE) obsahující 10 Hg HBsAg adsorbovaného na kamenec (25 mg Al³⁺/mg HBsAg). Tato dávka byla podána samostatně (n=5) nebo v kombinaci s CpG ODN 1968 (n=5, 500 Hg) nebo CpG ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) (n=4, 150 Hg). 4 šimpanzi (10-20 kg) byly imunizovaní stejným způsobem, kdy dvěma byla podána kontrolní vakcína (pouze Engerix B) a dvěma experimentální vakcína (Engerix-B plus 1 mg CpG ODN 2006). Všechny vakciny byly podány i.m. do pravé paže v celkovém objemu 1 ml. pice se chovaly v boxech v Primáte Research Center (Bogor, Indonesia) a šimpanzi se chovali v Bioqual (Rockville, MD). Zvířata se denně sledovala specialistou. Nebyly zaznamenány žádné příznaky nemoci nebo lokální nežádoucí reakce v místě injekce, plasma se získala IV punkcí před a v různou dobu po imunizaci a uskladnila se zmrazená (-20 °C) do testování na protilátky. Anti-HBs protilátky se detekovaly za použití komerčního ELISA kitu (Monolisa Anti-HBs; Sanofi Pasteur, Montreal, QC) a titry se vyjádřily v mlU/ml podle srovnání se standardy definovanými WHO (Monolisa anti-HBs Standards; Sanofi-Pasteur).

Výsledky

Identifikace CpG ODN s jinými profily imunomodulačních ··* ·· ·· ♦♦ ·« ···· aktivit in vitro: Naše pokusy ukázaly, že konkrétní baze na 5 a 3 koncích CpG dinukleotidu v CpG motivu mohou mít vliv na úroveň imunostimulace syntetickým ODN, ale není jasné, zda mohou mít různé CpG motivy různý vliv na imunomodulační účinky. Pro hodnocení této možnosti jsme testovaly panel CpG ODN na jejich schopnost indukovat lytickouaktivitu NK buněk, proliferaci B-lymfocytů a stimulaci syntézy TNFa, IL-6, IFN-γ a IL-12 v myších buňkách sleziny. Imunostimulační aktivity ODN bez CpG motivů (ODN 1982 (SEQ ID NO: 225), ODN 1983 (SEQ ID NO: 226) ) byly negativní nebo slabé ve srovnání s CpG ODN. ODN s neoptimálními CpG motivy (ODN 1628 (SEQ ID NO: 767), ODN 1758 (SEQ ID NO: 1)) byly méně aktivní než ODN obsahující CpG motivy obklopené dvěma 5' puriny a dvěma 3' pyrimidiny (ODN 1760 (SEQ ID NO: 3), ODN 1826 (SEQ ID NO: 69), ODN 1841 (SEQ ID NO: 84)). ODN 1826 obsahující dva optimální myší CpG motivy (5' GACGTT 3') (SEQ ID NO: 1143) měl nejvyšší aktivitu v 5 ze 6 provedených měření. S výjimkou ODN 1628 vykazovaly všechny ODN podobný charakter aktivity (lýzy zprostředkované NK buňkami, proliferace B-lymfocytů, produkce IL-12, IL-6, TNFa a IFNy). Dále, ODN 1628, který byl v tomto panelu jedinečný v tom, že obsahoval dva regiony bohaté na G, vykazoval přednostní indukci syntézy IFN-γ, ale relativně slabou stimulaci jiných aktivit.

Identifikace in vitro testů, které korelují s adjuvantní aktivitou in vivo: Protože je adjuvantní aktivita in vivo konečným cílem, pokusili jsme se identifikovat testy in vitro, které by predikovaly adjuvantní aktivitu CpG ODN in vivo.

Stejné ODN použité pro testy in vitro se proto testovaly na jejich adjuvantní aktivitu při imunizaci myší proti HBsAg.

Toto bylo provedeno jak s ODN samotný, tak s ODN v kombinaci s kamencem, protože dřívější pokusy ukázaly silnou synergii pro CpG ODN a kamencová adjuvans (PCT publikovaná patentová ·♦ ·· > · · « ) * «

198 přihláška WO 98/40100).

BALB/c myši imunizované HBsAg bez adjuvans dosahovaly pouze nízkých titrů anti-HBs ve 4 týdnu a toto nebylo ovlivněno přidáním kontrolního ODN. Naopak, adice CpG ODN zvýšila titry anti-HBs 5 až 40 násobně, podle použité sekvence. Když se přidal kamenec, tak byly titry anti-HBs přibližně 6-krát vyšší než při použití HBsAg samotného. Konkrétně, kontrolní ODN neměl žádný vliv a různé CpG ODN zvyšovaly tyto titry 2- až 36-násobně. Výsledky získané s různými ODN samotnými korelují velmi silně (r=0,96) s výsledky získanými při použití ODN plus kamenec. Když se provedla lineární regresní analýza, tak bylo dosaženo velmi vysokého stupně korelace mezi některými testy in vitro a in vivo zvýšením titrů anti-HBs. Ze všech testovaných parametrů in vitro měla indukce lytické aktivity NK buněk nejlepší korelaci s adjuvantní aktivitou in vivo (bez kamence, r=0,98; s kamencem, r = 0,95; p < 0,0001). Dobrá korelace s adjuvantní aktivitou byla také získána pro stimulaci B-lymfocytů (r=0,84 a 0,7), stejně jako pro sekreci TNF-α (r=0,9 a 0,88), IL-12 (r=0,88 a 0,86) a IL-6 (r=0,85 a 0,91). Jediný test in vitro, který nekoreloval s adjuvantní aktivitou, byla sekrece IFN-γ (r=0,57 a 0,68). Tato data ukazují, že in vitro testy na lytickou aktivitu NK buněk, aktivaci B-lymfocytů a produkci TNFa, IL-6 a IL-12, poskytují hodnotnou informaci in vitro pro predikci adjuvantní aktivity daného ODN in vivo.

Skríning panelu fosforothioátových ODN na aktivaci lidských NK buněk: V předchozích pokusech jsme zjistily, že syntéza zánětlivých cytokinů lidskými PBMC je indukována extrémně nízkými koncentracemi endotoxinu (indukovaná sekrece TNFa je detekovatelná již při 6 pg/ml endotoxinu, což je o 2 řády vyšší sensitivita než u myších imunitních buněk). Naopak,

199 ·· ·· *· 89 88 • · 8 8 8 8 9 9 9

8 9 888 99 8

9 8 8 8 9 8 9 8 8 ··· ·· ·· ♦· ·· ··*· aktivace lidských B-lymfocytů a indukce lytické aktivity lidských NK buněk endotoxinem je vzácnou událostí i při vysoké koncentraci endotoxinů. Na základě těchto výsledků jsme vybrali aktivaci NK buněk (lytickou aktivitu a expresi CD69) a B-buněk (proliferaci a expresi CD86) jako nejvíce specifické a reprodukovatelné testy s nízkou variabilitou mezi subjekty a použili jsme tyto testy pro in vitro skríning souboru ODN.

Nejprve jsme testovali vliv fosforothioátových ODN obsahujících různé kombinace a permutace CpG motivů na lýzu cílových buněk NK buňkami. Pro jednoznačnost a srozumitelnost prezentace jsou uvedena pouze data pro vybrané reprezentativní CpG a kontrolní ODN. Lidské PBMC se inkubovaly s různými fosforothioátovými ODN (6 μg/ml) po dobu 24 hodin a testovaly se na svou schopnost lyžovat ⁵¹C - značené K562 buňky. ODN s dvěma 6-merovými CpG motivy (buď 5' GACGTT 3' (SEQ ID NO:

1143), nebo 5' GTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1144)) v kombinaci s TpC na 5' konci ODN (ODN 1840 5' TCCATGTCGTTCCTGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 83), ODN 1851 5' TCC TGA CGTTCCTGACGTT 3' (SEQ ID NO: 94) nebo s alespoň třemi 6-merovými motivy bez TpC na 5' konci (ODN 2013 (SEQ ID NO: 253)) vykazovaly střední aktivitu.

Vysoká aktivita byla zjištěna, když 5' TpC přímo předcházel 6merovému lidskému CpG otivu (5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1145)) a následovaly dva 6-merové motivy (ODN 2005 (SEQ ID NO: 245),

ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) a ODN 2007 (SEQ ID NO: 247)).

Nej lepší výsledky byly získány tehdy, když byly 6-merové CpG motivy separovány od sebe navzájem a od 5' 8-merového TpT motivu (ODN 2006 (SEQ ID NO: 246)).

Exprese aktivačního markéru CD69 se rychle zvyšuje na povrchu NK buněk po stimulaci. Pro potvrzení výsledků z testu lýzy NK buňkami se PBMC inkubovaly po dobu 18 hodin s ODN (2 μg/ml). Exprese CD69 se hodnotila na CD56 pozitivních NK

200 • ·« «« 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 999 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 β

9 9 9 9 9 9 9 9 9 ··· *» ·· »· ·» ··*« buňkách (CD3, CD14 a CD19 negativní). Ačkoliv byla indukce

CD69 méně omezená sekvencí než stimulace funkční aktivity NK buněk, vykazovaly kontrolní ODN (ODN 1982, ODN 2116, ODN 2117,

ODN 2010) pouze slabou aktivitu srovnatelnou se základní aktivitou. ODN s dvěma lidskými CpG motivy separovanými 5'TTTT 3' (DN 1965 (SEQ ID NO: 208)) nebo čtyřmi lidskými CPG motivy bez vmezeřené sekvence (ODN 2013 (SEQ ID NO: 253)) byly relativně více aktivní v indukci exprese CD69 než ve stimulaci lytické aktivity NK buněk. Optimální funkční aktivita NK buněk, stejně jako exprese CD69, byla získána s ODN obsahujícím TpC dinukleotid předcházející lidskému CpG motivu, a další lidský motiv v sekvenci (ODN 2006 (SEQ ID NO: 246),

ODN 2007 (SEQ ID NO: 247)).

Aktivita fosforothioátových ODN ve stimulaci B-lymfocytů: V předchozích pokusech jsme zjistili, že procento proliferujících B-lymfocytů (CFSE test, viz oddíl metody) koreluje s povrchovou expresí ko-stimulační CD86 na Blymfocytech, jak je měřena průtokovou cytometrií. Proto jsme použily expresi CD86 na B-lymfocytech pro skríning panelu ODN na jejich imunostimulační aktivity. PBMC se inkubovaly s 0,6 gg/ml ODN. Exprese CD86 (průměrná intenzita fluorescence, MFI) se hodnotila na CD19 pozitivních B-lymfocytech. Póly C ODN (ODN 2017 (SEQ ID NO: 257)) nebo ODN bez CpG dinukleotidů (ODN 1982 (SEQ ID NO: 225)) selhaly ve stimulaci lidských Blymfocytů za těchto experimentálních podmínek.

Fosforothioátový ODN (ODN 2116 (SEQ ID NO: 256)) s jedním optimálním lidským CpG motivem předcházejícím TpC (5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1145)) měl slabou aktivitu. Přítomnost jednoho lidského 6-merového CpG motivu (5' GTCGTT 3' (SEQ ID NO:

1144)) neměla žádný aktivační efekt. Dva z těchto CpG motivů uvnitř sekvence nevykazovaly žádnou (ODN 1960 (SEQ ID NO:

203), ODN 2016 (SEQ ID NO: 256)) nebo slabou (ODN 1965 (SEQ ID

201

• · · »·· ·» e · · · ·· 00

0

0000

NO: 208)) aktivitu závislou na sekvenci. Když byl ODN složen z tří nebo čtyř kopií tohoto motivu (ODN 2012 (SEQ ID NO: 252), ODN 2013 (SEQ ID NO: 253), ODN 2014 (SEQ ID NO: 254)), tak mohla být detekována střední aktivita vzhledem k B-lymfocytům. Kombinace lidského 8-merového CpG motivu na 5' konci ODN s dvěma 6-merovými CpG motivy (ODN 2005 (SEQ ID NO: 245), ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), ODN 2007 (SEQ ID NO: 247), ODN 2102 (SEQ ID NO: 343), ODN 2103 (SEQ ID NO: 344)) vedla k významnému zvýšení schopnosti ODN stimulovat B-lymfocyty. Vzdálenost mezi jednotlivými motivy byla zásaní. Separace CpG motivů TpT byla výhodná (ODN 2006 (SEQ ID NO: 246)) ve srovnání s neseparovanými CpG motivy (ODN 2005 (SEQ ID NO: ); též viz srovnání ODN 1965 (SEQ ID NO: 208) s ODN 1960 (SEQ ID NO: 203)). Lidský 6-merový CpG motiv (5' GTCGTT 3') byl lepší než optimální myší 6-merový CpG motiv (5' GACGTT 3' (SEQ ID NO: 246)), když byl kombinován s lidským 8-merovým CpG motivem na 5' konci (ODN 2006 vs. ODN 2102 (SEQ ID NO: 343) a ODN 2103 (SEQ ID NO: 344)). (TCG)_poiy ODN byl inaktivní nebo pouze slabě aktivní, stejně jako ODN obsahující CpG dinukleotidy obklopené guaniny nebo jinými CpG dinukleotidy (ODN 2010 (SEQ ID NO: 250)). Dohromady data pro NK buňky a B-lymfocyty ukazují, že z testovaných ODN má ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) nejvyšší imunostimulační aktivitu pro lidské imunitní buňky.

Srovnávací analýza účinnosti CpG fosforothioátových ODN u různých primátů: Různé CpG motivy jsou optimální pro aktivaci myších a lidských imunitních buněk. Dále, počet a lokalizace CpG motivů v aktivním fosforothioátovém ODN je odlišný u myší a u člověka. Chtěli jsme vědět, zda mají CpG fosforothioátové ODN podobnou aktivitu u různých druhů primátů. Srvnávali jsme panel CpG ODN na jejich schopnost indukovat proliferaci Blymfocytů u člověka, šimpanzů a makaků rhesus a cynomolgus. Schopnost ODN stimulovat proliferaci lidských B-lymfocytů

202 · · · · 9 9 9 9 • 9 9 9 · 9 9 · · ·

(tabulka J) dobře koreluje s jejich schopností indukovat expresi CD86 na B-lymfocytech. ODN 2006 (SEQ ID NO: 246), který vykazoval nejvyšší aktivitu v lidských B-lymfocytech a NK buňkách, byl také nej aktivnější ve stimulaci proliferace Blymfocytů od šimpanzů a makaků rhesus (tabulka J). ODN 1968 (SEQ ID NO: 211) a ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) měly nejvyšší aktivaci B-lymfocytů cynomolgus opic in vitro (SI 25 a 29, v příslušném pořadí, při 6 gg ODN/ml). Překvapivě, CpG ODN 2007 (SEQ ID NO: 247), který vykazoval podobně vysokou aktivitu jako optimální ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) na lidských buňkách, nestimuloval proliferaci B-lymfocytů šimpanzů a makaků rhesus, a ODN 1968 (SEQ ID NO: 211) vykazoval slabou aktivitu. CpG ODN původně identifikované podle vysoké aktivity u myší (ODN 1760 (SEQ ID NO: 3), ODN 1826 (SEQ ID NO: 69)), měly slabou aktivitu u opic (tabulka J).

Tabulka J: Proliferační reakce PBMC na fosforothioátové CpG

ODN u primátů.

člověk šimpanz ........

makak rhesus

i bez adice	0.5+-0.1	0.5+-0.1	0.5+-0.0
ODN 1760 (SEQ ID NO.: 3)	23+-7	0.3+-0.1	0.5+-0.3
ODN 1826 (SEQ ID NO.: 69)	0.8+-0.1	0.4+-0.1	0.6+-0.1
ODN 1968 (SEQ ID NO.: 211)	35+-9	20.0+-3.8	1.9+-0.7
ODN 1982 (SEQ ID NO.: 225)	9.7+-1.1	2.5+-1.1	0.7+-0.1
ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246)	58+-8	27.4+-8.9	6.3+-3.3
ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247)	47+-11	0.5+-0.1	0.4+-0.2

203

PBMC se připravily z periferní krve a inkubovaly se s ODN (0,6 gg/ml), uvedeným zpsuobem, po dobu 5 dnu. Proliferace se měřila podle vychytávání ³H thymidinu (cpm/1000) během posledních 18 hodin. Více než 95% proliferujících buněk byly B-lymfocyty, jak bylo určeno za použití CFSE testu. Byly testováni čtyři lidští probandi, šest šimpanzů a dva makakové rhesus.

In vivo adjuvantní aktivita CpG ODN u šimpanzů a opic cynomolgus. Pro hodnocení toho, zda mají CpG ODN se silnou stimulační aktivitou na primáti buňky in vitro detekovatelnou adjuvantní aktivitu in vivo se opice cynomolgus a šimpanzi imunizovaly Engerix B, která obsahuje HBsAg adsorbovaný na kamenec, samostatně nebo s přidáním ODN 1968 (500 pg) nebo ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) (1 mg), v příslušném pořadí. Ve srovnání s kontrolami, kterým nebyly podány CpG ODN byly anti-HBs titry ve 4-týdnu po první imunizaci a 2 týdny po dosycovací imunizaci 66- a 16-násobně vyšší, v příslušném pořadí, u opic, a 15- a 3-krát vyšší u šimpanzů (tabulka K). Tak byl pozorován jasný adjuvantní efekt CpG ODN a toto bylo výrazné hlavně po první imunizaci.

204 • · · <

·· ·· ··· ·

Tabulka K: Anti-HBs reakce u primátů imunizovaných proti HBsAg CpG ODN³

Druh primáta	Anti-Hbs (mlU/ml)
	n	CpG ODN	4 týdny po 1 imunizaci	2 týdny po dosyc. imunizaci
opice cynomolgus	5	žádný	15 ± 44	4880 ± 13113
5	ODN 1968 (500 pg) (SEQ ID NO: 211)	995 ± 1309	76449 ± 42094
Šimpanzi	2	žádný	6, 11	3712, 4706
2	ODN 2006 (1 mg) (SEQ ID NO: 246)	125, 135	9640, 16800

³ Zvířata byla imunizovaná i.m. injekcí Engerix B obsahující 10 pg HBsAg adsorbovaného na kamenec, samostatně nebo s přidaným CpG ODN. Opice cynomolgus byly imunizovány dosycovací dávkou 10 týdnů po první dávce a šimpanzi byli imunizováni dosycovací dávkou 4 týdny po první dávce. Anti-HBs byly stanoveny ELISA testem; hodnoty pro opice jsou GMT ± SEM (n=5), zatímco pro šimpanze jsou uvedeny jednolivé hodnoty pro dva jedince v každé skupině.

• · · • ♦ · ·

Claims

7V Uoi. - Mq

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití imunostimulační nukleové kyseliny bohaté na Py, kde nukleovou kyselinou je nukleová kyselina bohatá na T, která je více než 60% T a obsahuje dinukleotid CpG, pro výrobu léčiva pro stimulaci imunitní reakce u jedince jiného než hlodavce.
2. Použití podle nároku 1, kde imunostimulační nukleovou kyselinou bohatou na T je póly T nukleová kyselina zahrnující ₅, _{TTTT 3},.
3. Použití podle nároku 2, kde póly T nukleová kyselina zahrnuj e

5' ΧχΧ₂ΤΤΤΤΧ₃Χ₄ 3' , kde Xi, X₂, X3 a X₄ jsou nukleotidy.
4. Použití podle nároku 3, kde X_xX₂ je TT.
5. Použití podle nároku 3, kde X₃X₄ je TT.
6. Použití podle nároku 3, kde XjX₂ je vybrán ze skupiny zahrnující TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA a GC.
7. Použití podle nároku 3, kde X₃X₄ je vybrán ze skupiny zahrnující TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA a GC.
8. Použití podle nároku 1, kde imunostimulační nukleová kyselina bohatá na T má nukleotidové složení takové, že více než 80 % nukleotidů je T.
9. Použití podle nároku 1, upravené pro léčbu dále zahrnující expozici jedince antigenů, kde imunitní reakce je imunitní

206

44 · • · 4 • 4 4 4 • ····· 4

4 4 4 reakce specifická pro antigen.
10. Použití podle nároku 1, upravené pro léčbu nebo prevenci astmatu u jedince, trpícího nebo ohroženého astmatem.
11. Použití podle nároku 1, upravené pro léčbu nebo prevenci alergie u jedince, trpícího nebo ohroženého alergií.
12. Použití podle nároku 1, upravené pro léčbu nebo prevenci nádoru u jedince, trpícího nebo ohroženého nádorem.
13. Použití podle nároku 1, kde imunostimulační nukleová kyselina dále zahrnuje motiv TG.
14. Prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje oligonukleotid se sekvencí nukleových kyselin TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT (SEQ ID NO: 343).

15. Použití prostředku podle nároku 14 pro výrobu léčiva pro podávání jedinci jinému než hlodavci pro léčbu nebo prevenci alergie nebo astmatu.

> 9 9 ·· »· · * • · I · · · · · · · ♦ • 9 · · · · · · ·· · · · · · · 9 9 9 9 9 ··· · · · · ··· ··· ·· ·· ·· 99 9999

SEZNAM SEKVENCÍ Tfy - /0Í0 <110> University of Iowa Research Foundation Coley Pharmaceutical Group GmbH <120> Imunostimulační nukleové kyseliny <130> C1039/7035W0 (HCL/MAT) <150> US 60/156,113 <151> 1999-09-25 <150> US 60/156,135 <151> 1999-09-27 <150> US 60/227,436 <151> 2000-OS-23 <160> 1145 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Syntetická sekvence <400> 1 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 2 ataatccagc ttgaaccaag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 3 ataatcgacg ttcaagcaag 20

<210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 4

taccgcgtgc gaccctct 18 <210> 5 <211> 9 <212> DNA * ·« · · · · • · « · 9 · · • · · » · · · · • · · • · <213> Umělá sekvence <400> 5 ggggagggt <210> 6 <211> 9 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 6 ggggagggg <210> 7 <211> 9 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 7 ggtgaggtg <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> modifikovaná báze <222> (8) . . . (8) <223> m5c <400> 8 tccatgtngt tcctgatgct <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> modifikovaná báze <222> (11)...(11) <223> m5c <400> 9 gctaccttag ngtga <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> modifikovaná báze <222> (8)...(8) <223> m5c <400> 10 tccatgangt tcctgatgct <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<221> modifikovaná báze <222> (13)...(13) <223> m5c <400> 11 tccatgacgt tcntgatgct 20

<210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> <221> modifikovaná báze <222> (7) . . . (7) <223> m5c <400> 12

gctagangtt agtgt 15

<210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 13

agctccatgg tgctcactg 19

<210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence

<400> 14 ccacgtcgac cctcaggcga

<210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 15

gcacatcgtc ccgcagccga

<210> <211> <212> <213> 16 19 DNA Umělá sekvence <400> 16 gtcactcgtg gtacctcga <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence

<400> 17 gttggataca ggccagactt tgttg

<210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 18 gattcaactt gcgctcatct taggc <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 19 accatggacg aactgtttcc cctc <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 20 accatggacg agctgtttcc cctc <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 21 accatggacg acctgtttcc cctc <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 22 accatggacg tactgtttcc cctc <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 23 accatggacg gtctgtttcc cctc <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 24 accatggacg ttctgtttcc cctc <210> 25

·· · · <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 25 ccactcacat ctgctgctcc acaag 25

<210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 26

acttctcata gtccctttgg tccag 25

<210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <400> 27

tccatgagct tcctgagtct 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence