RS50325B

RS50325B - Imunostimulatorne nukleinske kiseline

Info

Publication number: RS50325B
Application number: YUP-271/02A
Authority: RS
Inventors: Arthur M. Krieg; Christian Schetter; Jörg Vollmer
Original assignee: University Of Iowa Research Foundation,; COLEY PHARMACEUTICAL GmbH.,
Priority date: 1999-09-25
Filing date: 2000-09-25
Publication date: 2009-09-08
Also published as: IL148843A0; HRP20020249A2; BG65736B1; EP1700603A3; EP1221955B1; ES2248126T3; ATE304361T1; US7271156B2; US20030212026A1; DE60022665T2; KR100863630B1; AP2002002484A0; CA2388055A1; UA77152C2; KR20020068509A; AU2005203408A1; EP1221955A2; SK287400B6; CN1939541A; EP1700603A2

Abstract

Py-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina, koja je T-bogata nukleinska kiselina, čiji je sadržaj T veći od 60% i sadrži CpG dinukelotide, za upotrebu u postupku stimulacije imunog odgovora, koji obuhvata primenu imunostimulatorne nukleinske kiseline ne glodarskom subjektu u količini koja je efikasna za izazivanje imunog odgovora kod ne-glodarskog subjekta Prijava sadrži 27 nezavisnih i 55 zavisnih patentnih zahteva

Description

Stanje tehnike

Bakterijska DNK ima imunostimulatorno dejstvo u vidu aktivacije B ćelija i prirodnih ćelija ubica, ali kičmenjačka DNK nema takvo dejstvo (Tokunaga, T., et al., 1988.Jpn J. Cancer Res.79:682-686; Tokunaga, T., et al., 1984,JNCI72:955-962; Messina, J.P., et al., 1991, J.Immunol.147:1759-1764; i revidirano u Krieg, 1998, u: Applied Oligonucleotide Technologv, C. A. Stein and A. M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp. 431-448). Sada se smatra da su ti imunostimulatorni efekti bakterijske DNK rezultat prisustva nemetilovanih CpG dinukleotida u određenim baznim kontekstima (CpG motivi), koji su česti kod bakterijske DNK, ali su metilovani i neadekvatno predstavljeni kod kičmenjačke DNK (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophvs. Acta 93321:1-10). Imunostimulatorni efekti bakterijske DNK mogu se oponašati sa sintetičkim oligodezoksinukleotidima (ODN) koji sadrže ove CpG motive. Takvi CpG ODN imaju visoko stimulatome efekte na leukocite ljudi i miševa, uključujući proliferaciju B ćelija; citokinsku i imunoglobulinsku sekreciju; litičku aktivnost ćelija prirodnih ubica (NK) i IFN-y sekreciju; i aktivaciju dendritskih ćelija (DCs) i drugih ćelija koje prikazuju antigene, tako da one eksprimiraju kostimulatome molekule i luče citokine, posebno citokine slične Th1 koji su bitni za potpomaganje razvoja Th1-sličnih T ćelijskih odgovora. Ovi imunostimulatorni efekti prirodne fosfodiestarske osnove CpG ODN su visoko CpG specifični u tome da su efekti suštinski poništeni ako je CpG motiv metilovan, promenjen u GpC, ili na drugi način eliminisan ili izmenjen (Krieg et al., 1995 Nature 374:546-549; Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10). Fosfodiestar CpG ODN može biti formulisan u lipidima, stipsi, ili drugim tipovima nosača koji imaju svojstva depoa ili poboljšano preuzimanje od strane ćelija sa ciljem da se povećaju imunostimulatorni efekti (Yamamoto etal, 1994 Microbio. Immunol. 38:831-836; Gramzinski etal, 1998 Mol. Med. 4:109-118).

U ranim studijama, smatralo se da je imunostimulatorni CpG motiv sledio formulu purin-purin-CpG-pirimidin-pirimidin (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Pisetskv, 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hacker et al., 1998 EMBO J. 17:6230-6240; Lipford et al, 1998 Trends in Mjcrobiol. 6:496-500). Međutim, danas je jasno da limfociti miša imaju prilično dobar odgovor na fosfodiestar CpG motive koji ne slede ovu "formulu" (Yi et al., 1998 J. Immunol. 160:5898-5906) i isto važi za humane B ćelije i dendritske ćelije (Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129).

Nekolicina istraživača je ranije posmatralo da ii nukleotidni sadržaj ODN može imati efekte nezavisno od sekvence ODN. Interesantno, pronađeno je da je antisens ODN obično obogaćen u sadržaju CG, CCC, CC, CAC i CG sekvenci, dok sa druge strane imaju smanjenu učestalost pojave TT ili TCC nukleotidnih sekvenci u poređenju sa onim šta bi se moglo očekivati da je upotreba baza bila slučajnim izborom (Smetsers et al., 1996 Antisense Nucleic Acid Drug Develop. 6:63-67). Ovo je povećalo verovatnoću da sekvence sa većom učestalošću mogu sadržati poželjne targeting elemente za antisens oligonukleotide ili obrnuto. Jedan od razloga za izbegavanje upotrebe timidin-bogatih ODN za antisens eksperimente je taj što razlaganje ODN nukleazama koje su prisutne u ćelijama oslobađa slobodni timidin koji ulazi u kompeticiju sa<3>H-timidinom koji se često upotrebljava u eksperimentima da bi se procenila ćelijska proliferacija (Matson et al, 1992 Antisense Research and Deveiopment 2:325-330).

Opis pronalaska

Dati pronalazak se delimično odnosi na pirimidinom bogate (Py-bogate) i u nekim oblicima timidinom (T) bogate imunostimulatorne nukleinske kiseline kojima nije potrebno prisustvo CpG motiva. Dati pronalazak se takođe delimično odnosi na otkriće da su nukleinske kiseline koje sadrže TG dinukleotidni motiv takođe imunostimulatorne. Pronalazak je delimično zasnovan na neočekivanom nalazu da su nukleinsko kiselinske sekvence koje ne sadrže CpG motive imunostimulatorne. Analizama imunostimulatornih svojstava mnogih nukleinsko kiselinskih sekvenci je otkriveno da ove sekvence mogu biti Py-bogate npr., T-bogate ili da mogu da sadrže TG motive. Takođe je otkriveno da ove sekvence pretežno aktiviraju ne-glodarske imune ćelije. Py-bogate i TG sekvence su samo minimalno imunostimulatorne u odnosu na imune ćelije glodara, u poređenju sa ne-glodarskim imunim ćelijama. Prema tome, moguće je na osnovu postupaka pronalaska izazvati imuni odgovor kod ne-glodarskog subjekta primenom Py-bogatih ili TG imunostimulatornih nukleinskih kiselina. Py-bogate i TG imunostimulatorne nukleinske kiseline pronalaska mogu opciono da sadrže CpG motive. Ovi nalazi imaju značajne implikacije za klinički razvoj imunostimulatornih nukleinskih kiselina koje sadrže CpG i imunostimulatornih nukleinskih kiselina koje ne sadrže CpG.

U jednom aspektu pronalazak je farmaceutska kompozicija koja sadrži za stimulaciju imunog odgovora efikasnu količinu izolovanih Py-bogatih ili TG imunostimulatornih nukleinskih kiselina, kao i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugim aspektima pronalazak je kompozicija materije, koja sadrži izolovane Py-bogate ili TG imuostimuatorne nukleinske kiseline. U drugim oblicima, imiinostimulatorna nukleinska kiselina može biti T-bogata. U daljim oblicima imunostimulatorna nukleinska kiselina može biti T-bogata i takođe može imati najmanje jedan TG motiv.

Poželjno Py-bogata nukleinska kiselina je T-bogata nukleinska kiselina. U nekim oblicima T-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina je poli T nukleinska kiselina koja sadrži 5' TTTT 3'. U ostalim oblicima poli T nukleinska kiselina sadrži 5' X1X2TTTTX3X43' gde su X,, X2, X3i X4nukleotidi. U nekim oblicima X^2 je TT i/iliXj)(^je TT. U ostalim oblicima XnX2je izabrano iz grupe koje se sastoji od TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, CG, GT, GG, GA i GC; i/ili XsX4je izabrano iz grupe koja se sastoji od TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC,

CA, CG, GT, GG, GA i GC.

T-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina može imati samo pojedinačan poli T motiv ili može imati više motiva poli T nukleinske kiseline. U nekim oblicima T-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina sadrži najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, ili najmanje 8 T motiva. U ostalim oblicima ona sadrži najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, ili najmanje 8 CpG motiva. U poželjnim oblicima višestruki CpG motivi i poli T motivi su rasuti.

U ostalim oblicima najmanje jedan od više poli T motiva sadrži najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, ili najmanje 9 uzastopnih T nukleotidnih ostataka. U drugim oblicima više poli T motiva je najmanje 3 motiva od kojih svaki sadrži najmanje 3 uzastopna nukleotidna ostatka ili je više poli T motiva najmanje 4 motiva, gde od najmanje 4 motiva svaki sadrži najmanje 3 uzastopna T nukleotidna ostatka.

U nekim slučajevima T-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina može biti oslobođena poli T motiva, ali može sadržati nukleotidni sastav od više od 25% T. U ostalim oblicima T-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina ima poli T motive i takođe poseduje nukleotidni sastav od više od 25% T. U poželjnim oblicima T-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina poseduje nukleotidni sastav od više od 35% T, više od 40% T, više od 50% T, više od 60% T, više od 80% T, ili više od 90% T nukleotidnih ostataka. U važnim oblicima, nukleinska kiselina je najmanje 50% T.

T-bogate i TG imunostimulatorne nukleinske kiseline mogu imati bilo koju dužinu veću od 7 nukleotida, ali u nekim oblicima mogu biti dužine između 8 i 100 nukleotidnih ostataka. U poželjnim oblicima T-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina sadrži najmanje 20 nukleotida, najmanje 24 nukleotida, najmanje 27 nukleotida, ili najmanje 30 nukleotida. U poželjnim oblicima, TG imunostimulatorna nukleinska kiselina jer između 15 i 25 nukleotida dižine. T-bogate i TG imunostimulatorne nukleinske kiseline mogu biti jednolančane ili dvolančane.

U jednom poželjnom obliku, imunostimulatorna nukleinska kiselina ima T-bogat region koji se nalazi na sredini njene dužine (tj., približno isti broj nukleotidnih se nalazi sa obe strane T-bogatog regiona na 5' i 3' krajevima).

T bogata nukleinska kiselina u nekim oblicima je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 i 910-913. U drugim oblicima T bogate nukleinske kiseline su sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890 i 891.

U ostalim oblicima Py-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina je C-bogata nukleinska kiselina. Imunostimulatorna C-bogata nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja obuhvata najmanje jedan i poželjno najmanje 2 poli-C egiona ili koja sadrži 50% ili više C nukleotida.

Py-bogate i TG imunostimulatorne nukleinske kiseline mogu sadržati najmanje jedan ili više CpG motiva. Motivi mogu biti metilovani ili nemetilovani. U drugim oblicima Py-bogate i TG imunostimulatorne nukleinske kiseline su oslobođene od jednog ili više CpG dinukleotida.

U ostalim oblicima Py-bogate i TG imunostimulatorne nukleinske kiseline takođe obuhvataju poli-A, poli G i/ili poli c motive. U daljim oblicima Py-bogata ili TG imunostimulatorna nukleinska kiselina je oslobođena od dve poli C sekvence od najmanje 3 uzastopna C nukleotidna ostatka ili je oslobođena od dve poli A sekvence od najmanje 3 uzastopna A nukleotidna ostatka. U ostalim oblicima Py-bogata ili TG imunostimulatorna nukleinska kiselina sadrži nukleotidni sastav od više od 25% C ili više od 25% A. U daljim oblicima Py-bogata ili TG imunostimulatorna nukleinska kiselina je oslobođena od poli C sekvenci, poli G sekvenci ili poli A sekvenci.

Poli G nukleinska kiselina je u nekim oblicima izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 288, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936 i 938. U ostalim oblicima poli G nukleinska kiselina obuhvata sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEO ID NO: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434, 435, 475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565. 609, 628, .660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927„ 932 i 937.

Na osnovu još jednog od aspekata pronalaska, imunostimulatorne nukleinske kiseline mogu biti određene kao one koje poseduju TG motiv, ovde nazvane TG imunostimulatorne nukleinske kiseline. TG nukleinska kiselina u jednom obliku sadrži najmanje jedan TG dinukleotid koji ima sekvencu koja uključuje najmanje sledeću formulu: 5'N,X1TGX2N23'. U povezanim oblicima,hi]je nukleinsko kiselinska sekvenca koja je sastavljena od određenog broja nukleotida u opsegu od (11-N2) do (21-N?) i N2je nukleinsko kiselinska sekvenca sastavljena od određenog broja nukleotida u opsegu od (11-NO do (21-Ni). U poželjnom obliku, X2je timidin.

U drugim oblicima, TG nukleinska kiselina ima najmanje sledeću formulu: 5'XiX2TGX3X43'. U daljem obliku, TG nukleinska kiselina sadrži sledeću sekvencu: 5'N1X1X2TGX3X4N23\ U povezanim oblicima, N? je nukleinsko kiselinska sekvenca sastavljena od izvesnog broja nukleotida u opsegu od (9-N2) do (19-N2) i N2je nukleinsko kiselinska sekvenca sastavljena od izvesnog broja nukleotida u opsegu od (9-Nt) do (19-N^. U jednom poželjnom obliku, X3je timidin. XtX2su nukleotidi koji se mogu izabrati iz grupe koja se sastoji od GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA i TT, a X3X4su nukleotidi koji se mogu izabrati iz grupe koja se sastoji od TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA i CA. U nekim poželjnim oblicima, X3je timidin. U važnim oblicima, X3X4su nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od TT, TC, TA i TG. U ostalim oblicima X^2 su GA ili GT i X3X4su TT. U daljim oblicima X, ili X2 ili oba su purini i X3ili X4ili oba su pirimidini ili X^2su GpA i X3ili X4ili oba su pirimidini. U jednom obliku X2je T i X3je pirimidin.

U jednom obliku 5'X1X2TGX3X43' sekvenca TG nukleinske kiseline ili celokupna TG nukleinska kiselina ili neki njen fragment je ne-palindromska sekvenca, a u drugim oblicima to je palindromska sekvenca.

U nekim poželjnim oblicima, TG nukleinska kiselina je takođe T-bogata.

Py-bogate i TG imunostimulatorne nukleinske kiseline u nekim oblicima imaju nukleotidnu okosnicu koji obuihvata najmanje jednu modifikaciju osnovnog lanca, kao što je fosforotioatna modifikacija. Nukleotidna okosnica može biti himerna, ili poželjno je nukleotidna okosnica u celini modifikovana. U jednom poželjnom obliku, imunostimulatorna nukleinska kiselina ima poli T motiv i fosforotioatnu okosnicu.

U drugom aspektu pronalazak je kompozicija imunostimulatorne nukleinske kiseline, u obliku Py-bogate ili TG nukleinske kiseline i antigena, gde je nukleinska kiselina oslobođena od nemetilovanonih CpG motiva.

Sledeća kompozicija pronalaska je Py-bo'gata' ili TG imunostimulatorna nukleinska kiselina i anti-mikrobijalni agens, gde je Py-bogata ili TG nukleinska kiselina slobodna od nemetilovanih CpG motiva. Poželjno anti-mikrobijalni agens je izabran iz grupe koja se sastoji od anti-viralnog agensa, anti-parazitskog agensa, anti-bakterijskog agensa i anti-gljivičnog agensa.

Kompozicija formulacije sa produženim dejstvom koja uključuje Py-bogatu i/ili TG imunostimulatornu nukleinsku kiselinu, gde je Py-bogata i/ili TG nukleinska kiselina oslobođena od metilovanih CpG motiva, je data na osnovu još jednog aspekta pronalaska.

Pronalazak takođe obuhvata nutritivne suplemente Py-bogatih ili TG imunostimulatornih nukleinskih kiselina u formulacijama za primenu koje su izabrane iz grupe koja se sastoji od kapsula, pilula, lingvaleta, gde je Py-bogata ili TG nukleinska kiselina oslobođena od nemetilovanih CpG motiva.

Podrazumeva se da kada je pogodno primeniti Py-bogat npr., poli T, T-bogat, C-bogat, ili TG oligonukleotid i CpG oligonukleotid, može takođe biti poželjna koadministracija Py-bogatog ili TG oligonukleotida zajedno sa fizički odvojenim CpG, Py-bogatim ili TG oligonukleotidom. Alternativno, CpG, Py-bogat ili TG motiv može biti prisutan na istoj kontinuiranoj nukleinskoj kiselini kao Py-bogat ili TG oligonukleotid. U daljem obliku, sve ili neke kombinacije Py-bogatih, TG i CpG nukleinskih kiselina mogu se koadministrirati bilo na posebnim nukleinskim kiselinama ili u istom molekulu nukleinske kiseline. Nameravano je da se koadministracijom nukleinske kiseline primene dovoljno vremenski blizu jedna drugoj da bi se postigao kombinovani efekat oba oligonukleotida, poželjno veći od efekta koji je postignut primenom svakog od oligonukleotida pojedninačno u istoj dozi.

CpG oligonukleotidi imaju, generalno, formulu 5'N1X1X2CGX3X43', gde su Xu X2, X3i X4nukleotidi i gde je najmanje C od CpG nemetilovano. Poželjni CpG oligonukleotidi su dužine od 8-100 nukleotida i imaju modifikovane osnovne lance. Određene strukture su date detaljno u objavljenim PCT prijavama, U.S. prijavama, a reference čija su otkrića uključena ovde u celini su ovde citirane. U jednom obliku, CpG oligonukleotid je oslobođen od poli T i TG motiva i nije T-bogat.

U ostalim oblicima, CpG oligonukleotid ima sekvencu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 3, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227- 240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317, 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354, 357, 361-365, 367^369, 373-376, 378-385, 388-392, 394, 395, 399, 401-404, 406-426, 429-433, 434-437, 439, 441-443, 445, 447, 448; 450, 453-456, 460-464, 466-469, 472-475, 477, 478, 480, 483-485, 488, 489, 492, 493, 495-502, 504-505, 507-509, 511, 513-529, 532-541, 543-555, 564-566, 568-576, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619-622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718-732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 790-792, 798-799, 804-808, 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904 i 909-913.

U sledećem obliku, Py-bogat ili TG oligonukleotid je oslobođen od CpG motiva. Ovaj oblik pronalaska takođe obuhvata farmaceutske kompozicije i komplete koji sadrže i CpG oligonukleotid (koji može biti oslobođen od poli T i TG motiva, a da ne bude T bogat) i Py-bogat i/ili TG oligonukleotid fizički odvojen od CpG oligonukleotida. Farmaceutske preparacije su u efikasnim količinama i u tipičnom slučaju obuhvataju farmaceutski prihvatljive nosače, sve kao što su ovde detaljno date u odnosu na Py-bogate i TG oligonukleotide. Kompleti obuhvataju najmanje jedan kontejner koji sadrži oligonukleotid koji je Py-bogat ili TG oligonukleotid (ili neka njihova kombinacija). Isti kontejner, ili u drugim oblicima, drugi kontejner, može sadržati oligonukleotid sa CpG motivom, koji može biti oslobođen od Py-bogatih i/ili TG motiva. Komplet takođe sadrži uputstva za primenu oligonukleotida na subjekta. Kompleti takođe mogu obuhvatati kontejner koji sadrži solvent ili diluent.

Ukratko, kao da je ovde u potpunosti navedeno, CpG oligonukleotid fizički odvojen od Py-bogatog ili TG oligonukleotida se može koristiti zajedno sa Py-bogatim ili TG oligonukleotidima u postupcima, kompozicijama i proizvodima koji su opisani u prethodnom tekstu.

Pronalazak se odnosi u drugim aspektima na imunostimulatorne oligonukleotide koji imaju himerne osnovne lance i koji ne zahtevaju prisustvo CpG motiva. Pronalazak je delimično zasnovan na otkriću da su nukleinsko kiselinske sekvence koje ne sadrže CpG motive bile imunostimulatorne i da one koje imaju himerne osnovne lance imaju neočekivano povećana imunostimulirajuća svojstva. Prema tome, pronalazak se u jednom aspektu odnosi na kompoziciju oligonukleotida koji ima formulu 5'YiN1ZN2Y23', gde su Y1i Y2, nezavisno jedan od drugog, molekuli nukleinskih kiselina koji imaju između 1 i 10 nukleotida, gdeY,obuhvata najmanje jednu modifikovanu vezu između nukleotida i Y2obuhvata najmanje jednu modifikovanu vezu između nukleotida i gde su ^ i N2molekuli nukleinskih kiselina, nezavisni jedan od drugog, koji imaju između 0 i 5 nukleotida, ali gde NiZN2ima najmanje 6 nukleotida u celini i gde nukleotidi f^ZN^imaju fosfodiestarsku okosnicu gde je Z motiv imunostimulatorne nukleinske kiseline, ali ne obuhvata CG. U jednom obliku Z je nukleinsko kiselinska sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od TTTT, TG i sekvenca kod koje je najmanje 50% baza sekvence T.

U nekim oblicima Y1i/ili Y2imaju između 3 i 8 nukleotida. U ostalim oblicima Yii/ili Y2se sastoje od najmanje tri G, najmanje četiri G, najmanje sedam G, ili su svi G. U drugim oblicima Yii/ili Y2su izabrani iz grupe koja se sastoji od TCGTCG, TCGTCGT i TCGTCGTT (SEQ ID NO: 1145). U daljim oblicimaY}i/ili Y2obuhvataju najmanje jednu, dve, tri, četiri, ili pet poli-A, poli-T, ili poli-C sekvenci.

Centralni nukleotidi (NiZN2) formule YiNiZN2Y2imaju fosfodiestarske veze između nukleotida i Yti Y2imaju najmanje jednu modifikovanu vezu između nukleotida. U nekim oblicimaY^i/ili Y2imaju najmanje dve modifikovane internukleotidne veze. U ostalim oblicima Yii/ili Y2imaju između dve i pet modifikovanih internukleotidnih veza. U ostalim oblicima Y^ima dve modifikovane internukleotidne veze i Y2ima pet modifikovanih internukleotidnih veza iliYiima pet modifikovanih internukleotidnih veza i Y2ima dve modifikovane internukleotidne veze. Modifikovana internukleotidna veza, u nekim oblicima je fosforotioatna modifikovana veza, fosforoditioat modifikovana veza ili p-etoksi modifikovana veza.

Delovi formule Y,N!ZN2Y2mogu opciono formirati palindrom. Prema tome, u nekim oblicima nukleotidi NiZN2formiraju palindorm. U nekim oblicima palindrom nije direktno ponavljanje. U ostalim oblicima nukleotidi N,ZN2ne formiraju palindrom.

Na osnovu ostalih oblika N^N2ima sekvencu nukleotida izabranu iz grupe koja se sastoji od GATTTTATCGTC (SEQ ID NO: 1098); TCGAI I I I ICGA (SEQ ID NO: 1099); TCAI I I I IATGA (SEQ ID NO: 1100); GTTTTTTACGAC (SEQ ID NO: 1101); TCAAI I I I ITGA (SEQ ID NO: 1102); ACGTTTTTACGT (SEQ ID NO: 1103); TCGI I I I IACGA (SEQ ID NO: 1104); TCGAI I I I IACGTCGA (SEQ ID NO: 1105); AATTTTTTAACGTT (SEQ ID NO: 1106); TCG I I I I I IAACGA (SEQ ID NO: 1107); ACGI I I I I IAACGT (SEQ ID NO: 1108), GA I I I I IATCGTC (SEQ ID NO: 1109); GACGAI I I I ICGTC (SEQ ID NO: 1110); GATTTTAGCTCGTC (SEQ ID NO: 1111); GAI I I I IACGTC (SEQ ID NO: 1112); ATTTTATCGT (SEQ ID NO: 1113); AACGAI I I I ICGTT (SEQ ID NO: 1114); TCACTTTTGTGA (SEQ ID NO: 1115); TCGTATTTTA (SEQ ID NO: 1116); ACTTTTGTACCGGT (SEQ ID NO: 1117); TCGAI I I I ICGACGTCGA (SEQ ID NO: 1118); ACGATTTTTCGT (SEQ ID NO: 1119), GATGATCGTC (SEQ ID NO: 1120); TCGATGTCGA (SEQ ID NO: 1121); TCATGTATGA (SEQ ID NO: 1122); GTGTTACGAC (SEQ ID NO: 1123); TCAATGTTGA (SEQ ID NO: 1124); ACGTGTACGT (SEQ ID NO: 1125); TCGTGTACGA (SEQ ID NO. 1126); TCGATGTACGTCGA (SEQ ID NO: 1127); AATGTTAACGTT (SEQ ID NO: 1128); TCGTGTT AACGA (SEQ ID NO:- 1129); ACGTGTTAACGT (SEQ ID NO: 1130); GATGTATCGTC (SEQ ID NO: 1131); GACGATGTCGTC (SEQ ID NO: 1132); GATGAGCTCGTC (SEQ ID NO: 1133); GATGTACGTC (SEQ ID NO: 1134); ATGATCGT (SEQ ID NO: 1135); AACGATGTCGTT (SEQ ID NO: 1136); TCACTGGTGA (SEQ ID NO: 1137); TCGTATGA (SEQ ID NO: 1138); ACTGGTACCGGT (SEQ ID NO: 1139); TCGATGTCGACGTCGA (SEQ ID NO: 1140); i ACGATGTCGT (SEQ ID NO: 1141).

Kompozicija može opciono da sadrži farmaceutski nosač i/ili da se formuliše u odgovarajućem obliku za primenu. U nekim oblicima forma za primenu je izabrana iz grupe koja se sastoji od katjonskih lipida, proteina za povećanje permeabilnosti ćelijskih membrana i formulacije sa produženim delovanjem. U jednom poželjnom obliku formulacija sa produženim dejstvom je biorazgradljiv polimer. U drugom obliku formulacija sa produženim dejstvom je mikropartikula.

U sledećem aspektu pronalazak je kompozicija tmunostimulatornog oligonukleotida koja ima formulu Y1NiZN2Y2i antigena.

Sledeća kompozicija pronalaska je imunostimulatorni oligonukleotid koji ima formulu Y1N1ZN2Y2i anti-mikrobijalni terapeutski agens. Poželjno anti-mikrobijalni terapeutski agens je izabran iz grupe koja se sastoji od anti-virusnog agensa, anti-parazitskog agensa, anti-bakterijskog agensa, ili anti-gljivični agensa.

Kompozicija formulacije sa produženim delovanjem uključujući imunostimulatorni oligonukleotid koji ima formulu Y1N1ZN2Y2 je data na osnovu drugog aspekta pronalaska.

Pronalazak takođe obuhvata nutritivne suplemente imunostimulatornog oligonukleotida koji ima formulu Y1N1ZN2Y2u formulaciji za primenu koji je izabran iz grupe koja se sastoji od kapsule, lingvalete i pilule.

U sledećem aspektu goreopisana kompozicija takođe obuhvata imunostimulatornu nukleinsku kiselinu koja ima nemetilovan CG dinukleotid, TG dinukleotid ili Py-bogatu sekvencu gde imunostimulatorna nukleinska kiselina koja ima nemetilovan CG dinukleotid, TG dinukleotid ili Py-bogatu sekvencu ima različitu sekvencu od oligonukleotida koji sadrži 5'Y1NiZN2Y23'.

U nekim oblicima imunostimulatorna nukleinska kiselina koja ima nemetilovan CG dinukleotid, TG dinukleotid ili Py-bogatu sekvencu ima kompletno fosfodietrasku okosnicu, a u drugim oblicima imunostimulatorna nukleinska kiselina koja ima nemetilovan CG dinukleotid, TG dinukleotid ili Py-bogatu sekvencu ima modifikovanu okosnicu, koji opciono može imati internukleotidne veze izabrane iz grupe koja se sastoji od fosforotioata, fosforoditioata i p-etoksi.

U jednom obliku imunostimulatorna nukleinska kiselina koja ima nemetilovani CG dinukleotid ima formulu koja sadrži: 5% X2CGX3X43' gde su XT, X2, X3 i X4 nukleotidi. U ostalim oblicima sekvenca imunostimulatorne amino kiseline obuhvata najmanje sledeću formulu: 5TCNTXiX2CGX3X43' gde je N sekvenca nukleinske kiseline sastavljena od oko 0-25 nukleotida, gde najmanje jedan nukleotid ima modifikovanu internukleotidnu vezu i gde nukleinska kiselina ima 100 nukleotida ili manje. Na osnovu nekih oblika XiX2su nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od: GT, GG, GA i AA i X3X4su nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od: TT, CT ili GT. U poželjnom obliku XiX2su GA i X3X4su TT.

U sledećem obliku sekvenca imunostimulatorne nukleinske kiseline koja ima nemetilovan CG dinukleotid obuhvata najmanje jednu od sledećih sekvenci: ATCGACTCTCGAGCGTTCTC (SEQ ID No. 15); TCCATGTCGGTCCTGCTGAT (SEQ ID No.

32); TCCATGTCGGTZCTGATGCT (SEQ ID No. 31); ATCGACTCTCGAGCGTTZTC (SEQ ID

No. 18); TCCATGTCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 28); GGGGGG (SEQ ID No. 12);

TCCATGACGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 35); TCCATGGCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No.

34); TCCATGACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 7); TCCATGTCGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 38); GGGGTCAGTCTTGACGGGG (SEQ ID No. 41); TCCATGTCGCTCCTGATGCT

(SEQ ID No. 37); TCCATGTCGATCCTGATGCT (SEQ ID No. 36);

TCCATGCCGGTCCTGATGCT (SEQ ID No. 33); TCCATAACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No.

3); TCCATGACGTTCCTGATGCT (SEQ ID No. 7); TCCATG ACGTCCCTG ATG CT (SEQ ID No. 39); TCCATCACGTGCCTGATGCT (SEQ ID No. 48); TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No. 10); ATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No. 70); TCTCCCAGCGCGCGCCAT

(SEQ ID No. 72); TCCATGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No. 73;

TCCATAGCGTTCCTAGCGTT (SEQ ID No. 74); TCCTGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID No.

76); TCCTGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No. 77); TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT (SEQ ID

No. 52); TCCTTGTCGTTCCTGTCGTT (SEQ ID No. 121); TCCTGTCGI lili IGTCGTT (SEQ ID No. 208); TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT {SEQ ID No. 120);

TCCATGCGTTGCGTTGCGTT (SEQ ID No. 81); TCCACGACGTTTTCGACGTT (SEQ ID No.

82); TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 47); TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT

(SEQ ID No. 46); TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID No. 49);

GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 56); TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT (SEQ ID No. 48); TGTCGTTGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 84); TGTCGTTGTCGTTGTCGTT

(SEQ ID No. 50); TCGTCGTCGTCGTT (SEQ ID No. 51); i TGTCGTTGTCGTT (SEQ ID No. 85). U sledećem obliku imunostimulatorna nukleinska kiselina koja ima Py-bogatu ili TG sekvencu je nukleinska kiselina kao što je opisano u prethodnom tekstu.

U sledećem aspektu pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije i komplete koji sadrže i oligonukleotid koji ima formulu Y1N1ZN2Y? i CpG oligonukleotid (koji opciono moze-oiti-oslobođen od poli T i TG motiva, a da ne bude Py-bogat), Py-bogat i/ili TG oligonukleotid fizički odvojen od oligonukleotida koji ima formulu YiNiZN2Y2. Farmaceutske preparacije su u efikasnim količinama i u tipičnom slučaju obuhvataju nosače, sve koji su ovde detaljno dati. Kompleti obuhvataju najmanje jedan kontejner koji sadrži oligonukleotid koji ima formulu YiN)ZN2Y2. Isti kontejner, ili u drugim oblicima, drugi kontejner, može sadržati oligonukleotid sa CpG motivom, koji opciono može biti oslobođen od Py-bogatih i/ili TG motiva i/ili Py-bogatog ili TG oligonukleotida (ili nekih njihovih kombinacija). Komplet takođe sadrži uputstva za primenu oligonukleotida na subjekta. Kompleti takođe mogu da obuhvataju kontejner koji sadrži rastvarač ili razblaživač.

Ukratko, kao da je u potpunosti ovde navedeno, oligonukleotid koji ima formulu Y1N1ZN2Y2koji je fizički odvojen od CpG, Py-bogatog ili TG oligonukleotida se može upotrebiti zajedno sa CpG, Py-bogatim, TG oligonukleotidima, u postupcima, kompozicijama i proizvodima koji su ovde opisani.

U sledećem aspektu pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata najmanje dva oligonukleotida pronalaska, gde najmanje dva oligonukleotida imaju međusobno različite sekvence i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Formulacija vakcine je data na osnovu sledećeg aspekta pronalaska. Vakcina obuhvata bilo koju od kompozicija pronalaska u kombinaciji sa antigenom.

Na osnovu sledećeg aspekta pronalaska dat je postupak za stimulaciju imunog odgovora. Postupak obuhvata primenu Py-bogate ili TG imunostimulatorne nukleinske kiseline na ne-glodarskog subjekta u količini koja efikasno izaziva imuni odgovor kod ne-gtodarskog subjekta. Poželjno Py-bogata ili TG imunostimulatorna nukleinska kiselina je primenjena oralno, lokalno, u formulaciji sa produženim dejstvom, putem primene na površinu sluzokože do , sistemski, parenteralno, ili intramuskulamo. Kada je Py-bogata ili TG imunostimulatorna nukleinska kiselina primenjena na površinu sluzokože može se osloboditi u količini koja je efikasna u izazivanju mukoznog imunog odgovora ili sistmskog imunog odgovora. U poželjnim oblicima površina sluzokože je izabrana iz grupe koja se sastoji od oralne, nazalne, rektalne, vagina Ine i okularne površine.

U nekim oblicima postupak obuhvata izlaganje subjekta antigenu, gde je imuni odgovor antigen-specifičan imuni odgovor. Antigen može biti kodiran vektorom nukleinske kiseline koji se može primeniti na subjekta. U nekim oblicima antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od tumor antigena, viralnog antigena, bakterijskog antigena, parazitskog antigena i peptidnog antigena.

Py-bogate i TG imunostimulatorne nukleinske kiseline su sposobne -da izazovu širok spekar imunog odgovora. Na primer ove imunostimulatorne nukleinske kiseline se mogu upotrebiti da preusmere Th2 u Th1 imuni odgovor. Py-bogate i TG nukleinske kiseline se takođe mogu upotrebiti da aktiviraju imune ćelije, kao što su leukociti, dendritske ćelije i NK ćelije. Aktivacija se može izvestiin vivo, in vitro,iliex vivo,tj., izolovanjem imune ćelije iz subjekta, stavljanjem u dodir imune ćelije sa efikasnom količinom da bi se aktivirala imuna ćelija Py-bogatom ili TG imunostimulatornom nukleinskom kiselinom i ponovnom primenom aktivirane imune ćelije na subjekta. U nekim oblicima dendritska ćelija eksprimira antigen kancera. Dendritska ćelija se može izložiti antigenu kanceraex vivo.

Imuni odgovor proizveden od strane Py-bogatih ili TG nukleinskih kiselina može takođe imati kao rezultat izazivanje proizvodnje citokina, npr., proizvodnje IL-6, IL-12, IL-18 TNF, IFN-a i IFN-y.

U daljem obliku, Py-bogate ili TG nuklinske kiseline su korisne u lečenju kancera. Py-bogate i TG nukleinske kiseline su takođe korisne na osnovu ostalih aspekata pronalaska u prevenciji kancera (npr., smanjenjem rizika za razvoj kancera) kod subjekta kod koga postoji rizik razvoja kancera. Kancer se može izabrati iz grupe koja se sastoji od kancera žučnog trakta, kancera dojke, kancera grlića materice, horiokarcinoma, kancera debelog creva, kancera endometrijuma, kancera želuca, intraepitelijalnih neoplazmi, limfoma, kancera jetre, kancera pluća (npr., male ćelije i ne-male ćelije), melanoma, neuroblastoma, oralnog kancera, kancera jajnika, kacera pankreasa, kancera prostate, kancera rektuma, sarkoma, kancera tiroidne žlezde i kancera bubrega, kao i ostalih karcinoma i sarkoma. U nekim važnim oblicima, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kancera kostiju, mozga i kancera CNS-a, kancera vezivnog tkiva, kancera ždrela, kancera oka, Hodgkin-ovog limfoma, kancera grkljana, kancera oralne šupljine, kancera kože i kancera testisa.

Py-bogate i TG nukleinske kiseline se takođe mogu upotrebiti za poboljšanje odgovora ćelije kancera na terapiju kancera (npr., anti-kancer terapija), opciono kada su Py-bogate ili TG imunostimulatorne nukleinske kiseline primenjene zajedno sa anti-kancer terapijom. Anti-kancer terapija može biti hemoterapija, vakcina (npr., in vitro prajmovana vakcina dendritske ćelije ili vakcina antigena kancera) ili terapija zasnovana na antitelima. Ova poslednje navedena terapija može takođe obuhvatiti primenu antitela koje je specifično za antigen ćelijske površine, na primer, ćelije kancera, gde imuni odgovor kao rezultat ima antigen zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC). U jednom obliku, antitelo može biti izabrano iz grupe koja obuhvata Ributaxin, Herceptin, Ouadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX.11, MDX-22, OV103, 3622VV94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447. MEt:IMMUNE-2, MELIMMUNE-1. CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LvmphoOide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab i ImmuRAIT-CEA.

Stoga, prema nekim od aspekata pronalaska, na subjekta sa kancerom ili na istog kod koga postoji rizik od pojavljivanja kancera primenjuje se imunostimulatorna nukleinska kiselina i anti kancer terapija. U nekim oblicima, anti-kancer terapija je izabrana iz grupe koja se sastoji od hemoterapeutskog agensa, imunoterapeutskog agensa i vakcine za kancer. Hemoterapeutski agens može biti izabran iz grupe koja obuhvata metotreksat, vinkristin, adriamicin, cisplatin, hloroetilnitrozouree koje ne sadrže šećer, 5-fluorouracil, mitomicin C, bleomicin, doksorubicin, dakarbazin, taksol, fragilin, Meglamine GLA, valrubicin, karmustain i poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inhibitor RAS famezil transferaze, inhibitor famezil transferase, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hvcamtin/Topotecan, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrone/Mitroxantrone, Metaret/Suramin, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9-AC, AG3340, AG3433, lncelA/X-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32/Valrubicin, Metastron/strontium derivate, Temodal/Temozolomide, Evacet/lipozomalni doksorubicin, Yewtaxan/Placlitaxel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabine, Furtulon/Doxifluridine, Cyclopax/oralni paklitaksel, Oral Taxoid, SPU-077/Cisplatin, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358

(774)/EGFR, inhibitor CP-609(754)/RAS onkogena, BMS-182751/oralna platina, UFT(Tegafur/Uracil), Ergamisol/Levamisole, Eniluracil/776C85/5FU enhanser, Campto/Levamisole, Camptosar/lrinotecan, Tumodex/Ralitrexed, Leustatin/Cladribine, Paxex/Paclitaxel, Doxil/lipozomalni doksorubicin, Caelyx/lipozomalni doksorubicin, Fludara/Fludarabine, Pharmarubicin/Epirubicin, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/Bis-Naphtalimide, LU 103793/Dolastain, Caetyx/lipozomalni doksorubicin, Gemzar/Gemcitabine, ZD 0473/Anormed, YM 116, granule joda, CDK4 i CDK2 inhibitore, PARP inhibitore, D4809/Dexifosamide, lfes/Mesnex/lfosamide, Vumon/Teniposide, Paraplatin/Carboplatin, Plantinol/cisplatin, Vepeside/Etoposide, ZD 9331,Taxotere/Docetaxel, profarmak guanin arabinozida, Taxane Analog, nitrozouree, alkilujuće agense kao što su melfelan i ciklofosfamid, Aminoglutethimide, Asparaginase, Busulfan, Carboplatin, Chlorombucil, Cvtarabine HCI, Dactinomycin, Daunorubicin HCI, Estramustine phosphate sodium, Etoposide (VP16-213), Floxuridine, Fluorouracil (5-FU), Flutamide, Hydroxyurea (hidroksikarbamid), Ifosfamide, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, Leuprolide acetat (analog LHRH-releasing faktora), Lonuistine (CCNU), Mechlorethamine HCI (nitrogen mustard), Mercaptopurine, Mesna, Mitotane (o.p'-DDD), Mitoxantrone HC1, Octreotide,:Plicamycin,.Procarbazine HC1, Streptozocin, Tamoxifen citrat, Thioguanine, Thiotepa, Vinblastine sulfat, Amsacrine (m-AMSA), Azacitidine, Erithropoietin, Hexamethylmelamine (HMM), Interleukin 2, Mitoguazone (metil-GAG; metil glioksal bis-guanilhidrazon; MGBG), Pentostatin (2'deoksikoformicin), Semustine (metii-CCNU), Teniposide (VM-26) i Vindesine sulfat, ali nije na njih ograničen.

Imunoterapeutski agens može biti izabran iz grupe koja se sastoji od Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolvm, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622VV94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab i ImmuRAIT-CEA, ali nije na njih ograničen.

Vakcina za kancer može biti izabrana iz grupe koja se obuhvata EGF, Anti-idiotipske kancer vakcinu, Gp75 antigen, GMK melanom vakcinu, MGV konjugovanu gangliozidnu vakcinu, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, 0-Vax, L-Vax, STn-KHL theratope, BLP25 (MUC-1), lipozomalnu idiotipsku vakcinu, Melacine, vakcinu sa peptidnim antigenom, toksin/antigen vakcine, MVA-zasnovanu vakcinu, PACIS, BCG vakcinu, TA-HPV, TA-CIN, DISC-virus and lmmuCyst/TheraCys, ali nije na njih ograničen.

U daljem obliku postupaka koji su usmereni na prevenciju ili lečenje kancera, subjektu je moguće dalje primenjivati interferon-a.

Pronalazak se u ostalim aspektima odnosi na postupke za prevenciju bolesti kod subjekta. Postupak obuhvata redovnu primenu na subjekta Py-bogate ili TG imunostimulatorne nukleinske kiseline da bi se poboljšao odgovor imunog sistema u sprečavanju bolesti kod subjekta. Primeri bolesti ili stanja koja mogu biti sprečena korišćenjem profilaktičkih postupaka pronalaska obuhvataju mikrobijalne infekcije (npr., bolesti koje se prenose seksualnim putem) i anafilaktički šok izazvan alergijom na hranu.

U ostalim aspektima, pronalazak je postupak za indukovanje prirodnog imunog odgovora primenom na subjekta Py-bogate ili TG imunostimulatorne nukleinske kiseline u količini koja je efikasna u aktivaciji prirodnog imunog odgovora.

Na osnovu sledećeg aspekta pronalaska dat je postupak za lečenje ili prevenciju viralne ili retroviralne infekcije. Postupak obuhvata primenu na subjekta koji ima ili je u riziku da dobije viralnu ili retroviralnu infekciju, efiksne količine za lečenje ili prevenciju viralne ili retroviralne infekcije bilo koje od kompozicija pronalaska. U nekim oblicima virus je uzrokovan hepatitis virusom, HIV, hepatitiom B, hepatitisom G, herpes virusom, ili papilomavirusom.

Dat je postupak za lečenje ili prevenciju bakterijske infekcije na osnovu sledećeg aspekta pronalaska. Postupak obuhvata primenu na subjekta koji ima ili je u riziku da dobije bakterijsku infekciju, efikasne količine za lečenje ili prevenciju bakterijske infekcije bilo koje od kompozicija pronalaska. U jednom obliku bakterijska infekcija je posledica unutarćelijskih bakterija.

U sledećem aspektu pronalaska je postupak za lečenje ili prevenciju infekcije parazitima primenom na subjekta koji ima ili je u riziku da dobije infekciju parazitima, efikasne količine za lečenje ili prevenciju infekcije parazitima bilo koje od kompozicija pronalaska. U jednom obliku infekcija parazitima je nastala usled intracelularnog parazita. U drugom obliku infekcija parazitom je nastala usled ne-helmintskih parazita.

U nekim oblicima subjekt je čovek, a u ostalim oblicima subjekt je kičmenjak izuzev čoveka izabran iz grupe koja se sastoji od psa, mačke, konja, krave, svinje, koze, ribe, majmuna, kokoške i ovce.

U daljem aspektu, pronalazak je postupak za lečenje ili prevenciju astme primenom na subjekta koji ima ili je u riziku da dobije astmu, efikasne količine za lečenje ili prevenciju astme bilo koje od kompozicija pronalaska. U jednom obliku astma je alergijska astma.

U sledećem obliku pronalazak se odnosi na postupak za lečenje ili prevenciju alergije. Postupak obuhvata primenu na subjekta koji ima ili je u riziku da dobije alergiju, efikasne količine za lečenje ili prevenciju alergije bilo koje od kompozicija pronalaska.

Dat je postupak za lečenje ili prevenciju imune deficijencije na osnovu sledećeg aspekta pronalaska. Postupak obuhvata primenu na subjekta koji ima ili je u riziku za nastajanje imune deficijencije, efikasne količine za lečenje ili prevenciju imune deficijencije bilo koje od kompozicija pronalaska.

U sledećem aspektu pronalazak se odnosi na postupak za izazivanje TH1 imunog odgovora primenom na subjekta bilo koje od kompozicija pronalaska u efikasnoj količini da bi se proizveo TH1 imuni odgovor.

U jednom obliku postupci pronalaska obuhvataju primenu oligonukleotida formule 5'Y1N1ZN2Y23' i imunostimulatorne nukleinske kiseline koja ima nemetilovani CG dinukleotid, TG dinukleotid ili T-bogatu sekvencu. U jednom obliku, oligonukleotid koji sadrži 5,Y1N1ZN2Y23' je primenjen odvojeno od imunostimulatorne nukleinske kisline. U nekim oblicima oligonukleotid koji sadrži 5'Y1N2ZN2Y23' i imunostimulatorna nukleinska kiselina su primenjivani naizmenično tako da je jedne sedmice primenjivan oligonukelotid , a sledeće imunostimulatorna nukleinska kiselina, a u ostalim oblicima oligonukleotid koji sadrži 5y^ 2ZH2y?3f i imunostimulatorna nukleinska kiselina su primenjivani naizmenično tako da je dve sedmice primenjivan oligonukelotid , a sledeće dve sedmice imunostimulatorna nukleinska kiselina.

Pronalazak daje u sledećem aspektu kompoziciju, koja sadrži imunostimulatornu nukleinsku kiselinu i anti-kancer terapiju, formulisanu u farmaceutski prihvatljivom nosaču i u efikasnoj količini za lečenje kancera ili za smanjenje rizika za razvoj kancera. U važnim oblicima, imunostimulatorna nukleinska kiselina je izabrana iz grupe koja se sastoji od T-bogate nukleinske kiseline, TG nukleinske kiseline i C-bogate nukleinske kiseline.

Pronalazak dalje daje komplet koji sadrži prvi kontejner u kome je smeštena imunostimulatorna nukleinska kiselina i najmanje još jedan kontejner (npr., drugi kontejner) u kome je smeštena anti-kancer terapija, kao i uputsvtvo za upotrebu. U jednom obliku, komplet dalje sadrži interferon-a, koji može biti posebno smešten u još jednom kontejneru (npr., treći kontejner). U važnom obliku, komplet sadrži nosač za produženo oslobađanje koji sadrži imunostimulatornu nukleinsku kiselinu i najmanje jedan kontejner u kome je smeštena anti-kancer terapija, kao i uputstva za vreme primene anti-kancer terapije. Imunostimulatorna nukleinska kiselina je izabrana iz grupe koja se sastoji od Py-bogate nukleinske kiseline, TG nukleinske kiseline CpG nukleinske kiseline, gde CpG nukleinska kiselina ima nukleotidnu sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 246.

Pronalazak dalje daje postupak za prevenciju ili lečenje astme ili alergije, što obuhvata primenu imunostimulatorne nukleinske kiseline i leka za astmu/alergiju u efikasnoj količini za lečenje ili prevenciju astme ili alergije. U bitnim oblicima, imunostimulatorna nukleinska kiselina je izabrana iz grupe koja se sastoji od T-bogate nukleinske kiseline, TG nukleinske kiseline i C-bogate nukleinske kiseline.

U jednom olbiku imunostimulatorna nukleinska kiselina je T-bogata nukleinska kiselina. U povezanom obliku, T-bogata nukleinska kiselina ima nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 i 910-913. U drugim oblicima T-bogate nukleinske kiseline su izabrane prema sekvenci iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884, 888, 890 i 891.

U daljem povezanom obliku, T-bogata nukleinska kiselina nije TG nukleinska kiselina. U daljem obliku, T-bogata nukleinska kiselina nije CpG nukleinska kiselina;

U jednom obliku, imunostimulatorna nukleinska kiselina je TG nukleinska kiselina. U daljem povezanom obliku, TG nukleinska kiselina nije T-bogata nukleinska kiselina. U sledećem povezanom obliku, TG nukleinska kiselina nije CpG nukleinska kiselina.

U jednom obliku, imunostimulatorna nukleinska kiselina je CpG nukleinska kiselina, gde CpG nukleinska kiselina ima nukleotidnu sekvencu koja sadrži SEQ ID NO: 246.

U sledećem obliku, lek za astmu/alergiju je lek koji je izabran iz grupe koja se sastoji od PDE-4 inhibitora, agonista bronhodilatatora/beta-2, otvarača K+ kanala, VLA-4 antagonista, Neurokin antagonista, inhibitora sinteze TXA2, ksantatina, antagonista arašidonske kiseline, inhibitora 5 lipoksigenaze, antagonista tromboksin A2 receptora, antagonista tromboksana A2, inhibitora 5-lipoks aktivacionog proteina i inhibitora proteaze, ali nije na njih ograničen. U nekim važnim oblicima, lek za astmu/alergiju je agonist bronhodilatatora/beta-2 izabran iz grupe koja se sastoji od salmeterola, salbutamola, terbutalina, D2522/formoterola, fenoterola i orciprenalina.

U sledećem obliku, lek za astmu/alergiju je lek izabran iz grupe koja se sastoji od anti-histamina i induktora prostaglandina. U jednom obliku, anti-histamin je izabran iz grupe koja se sastoji od loratidina, cetirizina, buclizina, analoga ceterizina, feksofenadina, terfenadina, desloratadina, noratemizola, epinastina, ebastina, astemizola, levokabastina, azelastina, tranilasta, terfenadina, mizolastina, betatastina, CS 560 i HSR 609. U sledećem obliku, induktor prostaglandina je S-5751.

U sledećem obliku, lek za astmu/alergiju je izabran iz grupe koja se sastoji od steroida i imunomodulatora. Imunomodulatori se mogu izabrati iz grupe koja se sastoji od anti-inflamatornih agenasa, antagonista leuktotriena, IL4 muteina, rastvorljivih IL-4 receptora, imunosupresanata, anti-IL-4 antitela, IL-4 antagonista, anti-IL-5 antitela, rastvorljivih IL-13 receptor-Fc fuzionih proteina, anti-IL-9 antitela, CCR3 antagonista, CCR5 antagonista, VLA-4 inhibitora i nishodnih regulatora IgE, ali nisu na njih ograničeni. U jednom obliku, nishodni regulator IgE je anti-lgE.

U sledećem obliku, steroid je izabran iz grupe koja se sastoji od beklometazona, flutikazona, tramcinolona i budezonida. U daljem obliku, imunosupresant je vakcina sa peptidom za stvaranje tolerancije.

U jednom obliku, imunostimulatorna nukleinska kiselina je primenjena istovremeno sa lekom za astmu/alergiju. U sledećem obliku, subjekt je subjekt sa oslabljenim umunim sistemom.

Imunostimulatorne nukleinske kiseline koje bi se primenile na subjekta u postupcima koji su ovde dati i koje se odnose na prevenciju i lečenje astme/alergije su kao što su opisane za ostale aspekte postupka pronalaska.

U sledećem aspektu, pronalazak daje komplet koji sadrži prvi kontejner u kome je smeštena imunostimulatorna nukleinska kiselina i najmanje još jedan kontejner (npr., drugi kontejner) u kome je smešten lek za astmu/alergiju, kao i uputstva za upotrebu. Imunostimulatorna nukleinska kiselina pogodna za upotrebu u kompletu je kao što je ovde opisano. U važnom obliku, imunostimulatorna nukleinska kiselina je izabrana iz grupe koja se sastoji od T-bogate nukleinske kiseline, TG nukleinske kiseline i C-bogate nukleinske kiseline. U sledećem bitnom obliku, komplet sadrži nosač sa produženim dejstvom koji sadrži imunostimulatornu nukleinsku kiselinu i najmanje jedan kontejner u kome je smešten lek za astmu/alergiju. Lek za astmu/ alergiju se može izabrati iz grupe tekova za astmu/alergiju koji su opisani u prethodnim postupcima koji su usmereni na prevenciju i lečenje astme/alergije., kao i uputstva za vreme primene astma/alergijskog medikamenta. Astma/alergijski medikament može biti izabran iz grupe astma/alergijskih medikamenata koji su opisani u prethodnim postupcima usmerenim ka prevenciji i tečenju astme/alergije.

U još jednom aspektu, pronalazak daje kompoziciju, koja sadrži imnuostimulatornu nukleinsku kiselinu i lek za astmu/alergiju i koja je formulisana u farmaceustki-prihvatljivom nosaču i u efiasnoj količini za prevnciju ili lečenje imunog odgovora povezanog sa izlaganjem medijatoru astme ili alergije. Imunostimulatorna nukleinska kiselina se može izabrati iz grupe imunostimulatornih nukleinskih kiselina opisanih za prethodno navedene postupke i kompozicije. U važnim oblicima, imunostimulatorna nuksleinska kiselina je izabrana iz grupe koja se sastoji od T-bogate nukleinske kiseline, TG nukleinske kiseline i C-bogate nukleinske kiseline. Lek za astmu/alergiju se može izabrati iz grupe koja se sastoji od tekova za astmu i lekova za alergiju kao što je opisano u gorenavedenim postupcima i kompozicijama.

U daljem aspektu, pronalazak daje kompoziciju koja sadrži imunostimulatornu nukleinsku kiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 95-136, SEQ ID NO: 138-152, SEOIDNO: 154-222, SEQ ID NO: 224-245, SEQ ID NO: 247-261, SEQ ID NO: 263-299, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 303-409, SEQ ID NO: 414-420, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426-947, SEQ ID NO: 959-1022, SEQ ID NO: 1024-1093 i farmaceutski prihvatljivog nosača. Poželjno, imunostimulatorna nukleinska kiselina je prisutna u kompoziciji u efikasnoj količini. U jednom obliku, imunostimulatorna nukleinska kiselina je prisutna u efikasnoj količini da bi izazvala imuni odgovor. , U sledećem obliku, imunostimulatorna nukleinska kiselina je prisutna u efikasnoj količini za prevenciju ili lečenje kancera. U daljem obliku, imunostimulatorna nukleinska kiselina je prisutna u efikasnoj količini za prevenciju ili lečenje astme/alergije. Pronalazak takođe daje komplete koji sadrže bilo koju od gorenavedenih kompozicija imunostimulatornih nukleinskih kiselina i uputstva za upotrebu.

U sledećem aspektu pronalazak obuhvata kompoziciju imunostimulatorne nukleinske kiseline koja se u osnovi (obavezno) sastoji od: 5'MiTCGTCGTTM23' gde je najmanje jedan C nemetilovan, gde je M? nukleinska kiselina koja ima najmanje jedan nukleotid, gde je M2nukleinska kiselina koja ima između 0 i 50 nukleotida i gde imunostimulatorna nukleinska kiselina ima manje od 100 nukleotida.

U ostalim aspektima pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju imunostimulatorne nukleinske kiseline koja sadrži: 5' TCGTCGTT 3' gde je najmanje jedan C nemetilovan, gde imunostimulatorna nukleinska kiselina ima manje od 100 nukleotida i fosfodiestarska okosnica i formulaciju za produženo oslobađanje. U nekim oblicima formulacija za produženo oslobađanje je mikropartikula. U nekim oblicima kompozicija obuhvata antigen.

Svako od ograničenja pronalaska može obuhvatati različite oblike pronalaska. Stoga je predviđeno da se svako od ograničenja pronalaska koje obuhvata bilo koji element ili kombinaciju elemenata može uključiti u svaki aspekt pronalaska.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Slika 1A je histogram ekspresije CD86 (Y-osa) od strane CD19+ ćelija nakon izlaganja tih ćelija oligonukleotidima koji su prikazani na X-osi u koncentraciji od 0.30 jig/ml.

Slika 1B je table sa podacima iz Slike 1A.

Slika 2 je grafik u kome su upoređivane sposobnosti ODN 2137, ODN 2177, ODN 2200 i ODN 2202 da stimulišu proliferaciju B ćelija u koncentracijama koje se kreću u opsegu od 0.2 ng/ml do 20 jig/ml.

Slika 3 je grafik u kome su upoređivane sposobnosti ODN 2188, ODN 2189, ODN 2190 i ODN 2182 da stimulišu proliferaciju B ćelija u koncentracijama koje se kreću u opsegu od 0.2 jig/ml do 20f-ig/ml.

Slika 4 je histogram koji prikazuje aktivaciju B ćelija zavisnu od doze koja je izazvana sa ne-CpG ODN. PBMC davaoca krvi su inkubirani sa naznačenim koncentracijama ODN 2006 (SEGIDNO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 5126 (SEQ ID NO.: 1058) i 5162 (SEQ ID NO.: 1094) i bojene sa mAb za CD19 (B ćelijski marker) i CD86 (marker aktivacije B ćelija, B7-2). Ekspresija je merena protočnom citometrijom.

Slika 5 je histogram koji prikazuje stimulaciju B ćelija sa raznovrsnim setom ne-CpG ODN-ova. PBMC jednog reprezentativnog davaoca su stimulisani sa 0:4 ug/ml, 1.0 ug/ml ili 10.0^<g>/rnl sledećih ODN-ova: 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2196 (SEQ ID NO.: 913), 2194 (SEQ ID NO.: 911), 5162 (SEQ ID NO.: 1094) i 5163 (SEQ ID NO.: 1095), 5168 (SEQ ID NO.: 1096) i 5169 (SEQ ID NO.: 1097), a ekspresija aktivacionog markera CD86 (B7-2) na CD19-pozitivne B ćelije je merena protočnom citometrijom.

Slika 6 je histogram koji prikazuje aktivaciju B ćelija sa ne-CpG ODN-ovima 1982 i 2041. PBMC su inkubirani sa naznačenim koncentracijama ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), 1982 (SEQ ID NO.: 225) i 2041 (SEQ ID NO.: 282), a aktivacija B ćelija (ekspresija aktivacionog markera CD86) je merena protočnom citometrijom.

Slika 7 je histogram koji prikazuje NK ćelije koje su aktivirane sa ne-CpG odn-ovima. PBMC su inkubirani sa 6ug/ml sledećih ODN-ova: 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 911) i 5126 (SEQ ID NO.: 1058) i bojene sa mAb za CD3 (T ćelijski marker), CD56 (NK ćelijski marker) i CD69 (marker rane aktivacije). Ekspresija CD69 i CD56-pozitivnih NK ćelija je merena protočnom citometrijom.

Slika 8 je histogram koji prikazuje NK-posredovanu citotoksičnost koja je povećana sa ne-CpG ODN: NK-posredovana liza K-562 target (ciljnih) ćelija je merena posle inkubacije PBMC tokom noći sa 6 ug/ml ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2194 (SEQ ID NO.: 911) i 5126 (SEOIDNO.: 1058).

Slika 9 je histogram koji prikazuje NKT ćelije koje se mogu aktivirati sa ne-CpG ODN. PBMC jednog reprezentativnog davaoca su inkubirani sa 6 ug/ml ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ IDNO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEO ID NO.: 911) i 5126 (SEQ ID NO.: 1058) 24 časa i aktivacija NKT ćelija je merena protočnom citometrijom posle bojenja ćelija sa mAb za CD3 (T ćelijski marker), CD56 (NK ćelijski marker) i CD69 (marker rane aktivacije).

Slika 10 je histogram koji prikazuje stimulaciju monocita sa različitim CpG i ne-CpG ODN. PBMC su inkubirani sa 6 ug/ml ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ IDNO.: 886), 2178 (SEQ ID NO.: 428), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ IDNO.: 911), 5126 (SEQ ID NO.: 1058) i 5163 (SEQ ID NO.: 1095) i bojeni za CD14 (marker monocita) i CD80 (B7-1, marker aktivacije). Ekspresija je merena protočnom citometrijom.

Slika 11 je histogram koji prikazuje oslobađanje TNFa posle kultivisanja humanih ćelija sa ne-CpG ODN. PBMC su kultivisani 24 časa sa ili bez 6 ug/ml naznačenih ODN ili 1 ug/ml LPS kao pozitivna kontrola i TNFa je meren pomođu ELISA.

Slika 12 histogram koji prikazuje oslobađanje IL-6 posle kultivisanja sa ne-CpG ODN i pokazuje isti obrazac kao za TNFa. PBMC su kultivisani sa naznačenim ODN (1.0 ug/ml) i IL-6 je meren u supernatantima pomoću ELISA.

Detaljan opis

Pronazak u jednom aspektu obuhvata nalaz da su pirimidinom (Py) bogate i poželjno timidinom (T) bogate nukleinske kiseline kao i nukleinske kiseline koje sadrže TG dinukloetidne motive efikasne u posredovanju imunostimulatornih efekata. Bilo je poznato u prethodnoj tehnici da su nukleinske kiseline koje sadrže CpG terapeutske i profilaktičke kompozicije koje stimulišu imuni sistem da leči kancer, infektivne bolesti, alergiju, astmu i ostale poremećaje i pomažu u zaštiti protiv oportunih infekcija koje se javljaju posle hemotarapija kancera. Jaki, ali istovremeno i uravnoteženi, ćelijski i humoralni odgovori koji rezultuju iz CpG stimulacije reflektuju prirodni sistem odbrane organizma protiv invazionih patogena i kanceroznih ćelija. CpG sekvence su relativno retke kod humane DNK, a s druge strane CpG sekvence se često mogu naći u DNK infektivnih organizama kao što su bakterije. Humani imuni sistem je očigledno evoluirao tako da prepoznaje CpG sekvence kao rani upozoravajući znak infekcije i da inicira trenutan i snažan imuni odgovor protiv invazionih patogena bez uzrokovanja štetnih reakcija koje se često mogu videti kod ostalih imunih stimulatornih agenasa. Prema tome nukleinske kiseline koje sadrže CpG, koje se oslanjaju na ovaj prirodni imuni mehanizam odbrane, mogu koristiti jednistven i prirodni put za imunu terapiju. Efekti CpG nukleinskih kiselina na imunomodulaciju su otkriveni od strane pronalazača sadašnje prijave patenta i detaljno su opisani u prijavama patenta koje su u istovremenom postupku, kao što je U.S. Patent Application Serial Nos: 08/386,063 podnesen 02/07/95 (i vezana PCT US95/01570); 08/738,652 podnesen 10/30/96; 08/960,774 podnešen 10/30/97 (i vezana PCT/US97/19791, WO 98/18810); 09/191,170 podenešen 11/13/98; 09/030,701 podnešen 02/25/98 (i vezana PCT/US98/03678); 09/082,649 podnešen 05/20/98 (i vezana PCT/US98/10408); 09/325,193 podnešen 06/03/99 (i vezana PCT/US98/04703); 09/286,098 podnešen 04/02/99 (i vezana PCT/US99/07335); 09/306,281 podnešen 05/06/99 (i vezana PCT/US99/09863). Celokupni sadržaj svakog od ovih patenata i prijava patenata je ovde uvršćen referencom.

Nalazi sadašnjeg pronalaska su primenljivi za sve goreopisane upotrebe nukleinskih kiselina koje sadrže CpG, kao i za bilo koje druge poznate upotrebe nukleinskih kiselina koje sadrže CpG. Pronalazak obuhvata, u jednom aspektu, otkriće da Py-bogate i poželjno T-bogate i TG nukleinske kiseline imaju slične imunostimulatorne osobine sa CpG nukleotidima bez obzira na to da li je CpG motiv prisutan. Prema tome pronalazak je koristan za bilo koji postupak za stimulisanje imunog sistema korišćenjem Py-bogatih ili TG nukleinskih kiselina. Takođe je otkriveno iznenađujuće u skladu sa pronalaskom da su himerni oligonukleotidi kojima nedostaje CpG motiv imuno stimulatorni i da imaju mnoga od istih profilaktičkih i terapeutskih dejstva kao CpG oligonukleotid.

Py-bogata nukleinska kiselina je T-bogata ili C-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina. U nekim oblicima T-bogate nukleinske kiseline su poželjne. T-bogata nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja obuhvata najmanje jednu poli T sekvencu i/ili koja ima nukleotidni sastav od više od 25% T nukleotidnih ostataka. Nukleinska kiselina koja ima poli-T sekvencu sadrži najmanje četiri T u nizu, kao što je 5TTTT3'. Poželjno T-bogata nukleinska kiselina sadrži više od jedne poli T sekvence. U poželjnim oblicima T-bogata nukleinska kiselina može imati 2,3,4, itd poli T sekvenci, kao što je oligonukleotid #2006 (SEQ ID NO:246). Jedan od najimunostimulatornijih T-bogatih oligonukleotida otkriven na osnovu pronalaska je nukleinska kiselina koja je sastavljena u celini od T nukleotidnih ostataka, npr., oligonukleotid #2183 (SEQ ID NO:433). Ostale T-bogate nukleinske kiseline na osnovu pronalaska imaju nukleotidni sastav od više od 25% T nukleotidnih ostataka, ali ne obuhvataju obavezno poli T sekvencu. U ovim T-bogatim nukleinskim kiselinama T nukleotidni ostaci se mogu razdvojiti jedan od drugog drugim tipovima nukleotidnih ostataka, tj., G, C i A. U nekim oblicima T-bogate nukleinske kiseline imaju nukleotidni sastav od više od 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% i 99% T nukleotidnih ostataka i bilo koji ceo broj % između. Poželjno T-bogate nukleinske kiseline imaju najmanje jednu poli T sekvencu i nukleotidni sastav od više od 25% T nukleotidnih ostataka.

U skladu sa pronalaskom je otkriveno da T sastav ODN ima značajan efekat na imunostimulatorni efekat ODN i da T-bogat ODN može aktivirati više tipova humanih imunih ćelija u odsustvu bilo kog CpG motiva. Oligonukleotid koji ima 3' poli T region i 2 5'CG-a npr., ODN 2181 (SEQ ID NO:431) je vrlo imunostimulatcran. Oligonukleotid slične dužine, ODN 2116 (SEQ ID NO:357) koji sadrži dva CG oligonukleotida na 5' kraju i poli-C region na 3' kraju je bio takođe imunostilmulatoran, ali ne manje od T-bogatog oligonukleotida korišćenjem standardnih eksperimentalnih uslova. Prema tome, iako C i T imaju skoro identične strukture, njihovi efekti na imuna svojstva ODN-a su različita. Oba nukleotida su sposobna da izazovu imuni odgovor, ali u različitom stepenu. Prema tome i T-bogati i C-bogati oligonukleotidi su korisni na osnovu pronalaska, ali T-bogati nukleotidi s u poželjniji. Dalje, ako je T sadržaj ODN redukovan unošenjem ostalih baza kao što je G, A, ili C, tada su imunostimulatorni efekti redukovani (ODN #2188 (SEQ ID NO:905),:2190 :(SE:Q-1D. NO:907), 2191- (SEQ ID NO:908) i 2193 (SEQ ID NO:910)). C-bogata nukleinska kiselina je molekul nukleinske kiseline koji ima najmanje jedan ili poželjno najmanje dva poli-C regiona ili koji je sastavljen od najmanje 50% C nukleotida. Poli-C region je obuhvaćen formulom 5' CCCC 3<*.>U nekim oblicima poželjno je da poli-C region ima formulu 5' CCCCCC 3'. Ostale C-bogate nukleinske kiseline na osnovu pronalaska imaju nukleotidni sastav od više od 50% C nukleotidnih ostataka, ali ne obuhvataju obavezno poli C sekvencu. U ovim C-bogatim nukleinskim kiselinama C nukleotidni ostaci mogu biti razdvojeni jedan od drugog drugim tipovima nukleotidnih ostataka, tj., G, T i A. U nekim oblicima C-bogate nukleinske kiseline imaju nukleotidni sastav od više od 60%, 70%, 80%, 90% i 99% C nukleotidnih ostataka i svaki ceo broj % između. Poželjno, C-bogate nukleinske kiseline imaju najmanje jednu poli C sekvencu i nukleotidni sastav od više od 50% C nukleotidnih ostataka, a unekim slučajevima su takođe i T-bogate.

Kao što je pokazano u Primerima, za nekoliko ODN za koje se ranije verovalo da nisu imunostimulatorni, uključujući dva ODN SEQ ID NO.:225 i SEQ ID NO.: 282 prethodno opisana kao ne-imunostimulatorna i uglavnom korišćena kao kontrolni ODN (Takahashi, T et al 2000. J.Immunol. 164:4458}je otkriveno da su imunostimulatorni. Naši eksperimenti pokazuju da ovi ODN-i mogu da stimulišu B ćelije, iako na većim koncentracijama u poređenju sa CpG ODN (Slika 6). Dugačak Poli T ODN (30mer) indukovao je, bar u nekim eksperimentima, snažnu aktivaciju B ćelija koja se može porediti sa najjačim CpG ODN aktivatorima B ćelija. Ovi eksperimenti su takođe otkrili iznenađujući nalaz da čak Poli C ODN mogu voditi ka stimulaciji B ćelija.

Imunostimulacija ovih ODN-a, međutim, nije ograničena na humane B ćelije. Različite eksperimentalne analize osim toga jasno pokazuju da monociti, NK ćelije i čak NKT ćelije mogu biti aktivirane takvim ne-CpG ODN (Slike 7-10). Nasuprot Poli T i Poli C sekvencama, imunostimulacija sa Poli A sekvencama (bar za monocite, B i NK ćelije) nije postignuta. Interesantno, nađeno je da uvođenje CpG motiva u SEQ ID NO.: 225 povećava imunostimulatornu aktivnost, dok produžavanje sa Poli T lancem nije povećalo imunostimulaciju. Ovo sugeriše da CpG i T-bogati ODN mogu da deluju preko različitih mehanizama ili puteva. Takođe je moguće da umetanje (insercija) poli-T motiva u različite pozicije SEQ ID NO.: 225 može kao rezultat imati promenu u imunostimulatornim svojstvima.

"TG nukleinska kiselina" ili "TG imunostimulatorna nukleinska kiselina" kao što je ovde korišćeno je nukleinska kiselina koja sadrži najmanje jedan TpG dinukleotid (timidin-guanin dinukleotina sekvenca, tj. "TG DNK" ili DNK koja sadrži 5' timidin praćen 3' guanozinom i vezan fosfatnom vezom) i aktivira komponentu imunog sistema.

U jednom obliku pronalazak daje TG nukleinsku kiselinu predstavljenu najmanje formulom:

5'N,X1TGX2N23'

gde su X, i X2nukleotidi i N je bilo koji nukleotid i N, i N2su nukleinsko kiselinske sekvence sastavljene od bilo kog broja N, uz uslov da je suma ukupnih Nii N2u opsegu od 11 do 21. Kao primer, ako je N-, 5, tada N2može biti 6 (što vodi ka ukupnoj dužini oligonukleotida od 15 nukleotida). TG može biti lociran bilo gde unutar oligonukleotidnog lanca, uključujući 5' kraj, centar i 3' kraj. Prema tome, N1može imati vrednost od nule do 21, uključujući 21, uz uslov da je N2odgovarajuće izabran da bi se dobila suma N2i N-, jednaka 11 do 21, uključujući i 21. Slično tome, N2može biti od nule do 21, uključujući 21, uz uslov da je ukupna suma N2i Nijednaka 11 do 21, uključujući i 21. U nekim oblicima Xije adenin, guanin, ili timidin i X2je citozin, adenin, ili timidin. U jednom poželjnom obliku, X2je timidin. U ostalim oblicima Xtje citozin i/ili X2je guanin. U ostalim oblicima, kao što je ovde razmatrano, nukleinska kiselina može obuhvatati neki drugi motiv, uz uslov da je on dovoljno dugačak.

U drugim oblicima TG nukleinska kiselina je predstavljena najmanje formulom:

gde su Xi, Xz, X3i X4nukleotidi. U nekim oblicima, X,X2su nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od: GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, TpA i TpT; i X3X4su nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od: TpT, CpT, ApT, ApG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA i CpA; N je bilo koji nukleotid i Nti N2su nukleinsko kiselinske sekvence sastavljene od bilo kog broja nukleotida uz uslov da je ukupan zbir Nii N2u opsegu od 9 do 19. U nekim oblicima, XiX2su GpA ili GpT i X3X4su TpT. U drugim oblicimaXiili X2ili oba su purini i X3ili X4ili oba su pirimidini ili X-|X2su GpA i X3ili X4ili oba su pirimidini. U jednom poželjnom obliku, X3X4su nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od: TpT, TpC i TpA.

Imunostimulatorna nukleinska kiselina može biti bilo koje veličine (tj., dužine) uz uslov da je to najmanje 4 nukleotida. U važnim oblicima, imunostimulatorne nukleinske kiseline imaju dužinu u opsegu između 6 i 100. U daljim oblicima, dužina je u opsegu između 8 i 35 nukleotida. Poželjno, TG oligonukleotidi se kreću u odnosu na veličinu u opsegu od 15 do 25 nukleotida.

Veličina (tj., broj nukleotidnih ostataka duž nukleinske kiseline) imunostimulatorne nukleinske kiseline može takođe da doprinese stimulatornoj aktivnosti nukleinske kiseline. Iznenađujuće, otkriveno je da čak za visoko imunostimulatorne nukleinske kiseline dužina utiče na stepen tmunostimulacije koja se može postići. Pokazano je da povećnaje dužine T-bogate nukleinske kiseline do 24 nukleotida izaziva povećanu imunostimulaciju. Eksperimenti prikazani u primerima pokazuju da kada je dužina T-bogate nukleinske kiseline povećana od 18-do 27 nukleotida sposobnost nukleinske kiseline da stimuliše imuni odgovor je značajno povećana

(porediti ODN #2194, 2183, 2195 i 2196 koji se smanjuju u veličini od 27-18 nukleotida). Povećanje dužine nukleinske kiseline do 30 nukleotida ima značajan uticaj na biološke osobine nukleinske kiseline, ali povećanje dužine preko 30 nukleotida izgleda da nema dalji uticaj na imuonstimulatomi efekat (npr., porediti ODN 2179 sa 2006).

Pokazano je da TG nukleinske kiseline čija se dužina kreće u opsegu od 15 do 25 nukleotida mogu pokazati povećanu imunostimulaciju. Prema tome, u jednom aspektu, pronalazak daje oligonukleotid koji je dužine 15-27 nukleotida (tj., oligonukleotid čija je dužina 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ili 27 nukleotida) koji može biti T-bogata nukleinska kiselina ili može biti TG nukleinska kiselina, ili može biti oba i T-bogata i TG nukleinska kiselina. U jednom obliku, oligonukleotid nije T-bogata nukleinska kiselina niti je TG nukleinska kiselina. U drugim oblicima, oligonukleotid nema CG motiv. Pronalazak slično tome daje oligonukleotide čija je dužina 15-27 nukleotida, oligonukleotide čija je dužina 18-25 nukleotida, oligonukleotide čija je dužina 20-23 nukleotida i oligonukleotide čija je dužina 23-25 nukleotida. Bilo koji od gorenavedenih oblika koji se odnosi na oligonukleotide dužine 15-27 se takođe odnosi na oligonukleotide ovih različitih dužina. Pronalazak dalje obuhvata upotrebu bilo kog od gorenavedenih oligonukleotida u postupcima koji su ovde navedeni.

lako je postignut maksimalan nivo imune stimulacije sa nekim T-bogatim nukleinskim kiselinama kada je nukleinska kiselina 24-30 nukleotidnih ostataka u dužini, kao i sa nekim nukleinskim kiselinama čija je dužina u opsegu od 15 do 25 nukleotida, kraće ili duže imunostimulatorne nukleinske kiseline mogu takođe da se upotrebe na osnovu postupaka pronalaska. Radi olakšavanja ulaska u ćelije, imunostimulatorne nukleinske kiseline poželjno imaju minimalnu dužinu od 6 nukleotidnih ostataka. Nukleinske kiseline bilo koje veličine veće od 6 nukleotida (čak više kb dužine) su sposobne da izazovu imuni odgovor na osnovu pronalaska ako je prisutno dovoljno imunostimulatornih motiva, s obzirom da se veće nukleinske kiseline razlažu unutar ćelija. Poželjno, imunostimulatorne nukleinske kiseline su u opsegu od 8 i 100 i u nekim oblicima T-bogate imunostimulatorne nukleinske kiseline su između 24 i 40 nukleotida dužine i TG imunostimulatorne nukleinske kiseline su između 15 i 25 nukleotida u dužini.

U jednom obliku T-bogata nukleinska kiselina je predstavljena najmanje formulom:

gde su Xt, X2, X3i X4nukleotidi. U jednom obliku X^2 je TT i/ili X3X4je TT. U drugom obliku X1X2su bilo koji od sledećih nukleotida TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA i GC; i X3X4su bilo koji od sledećih nukleotida TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC,CT, CC,

CA, GT, GG, GA i GC.

U nekim oblicima poželjno je da imunostimulatorne nukleinske kiseline ne sadrže poli-C (CCCC), ili poli-A (AAAA). U drugim oblicima poželjno je da imunostimulatorna nukleinska kiselina obuhvata poli-C, poli-A, poli-G (GGGG) ili višestruke GG. Posebno poli-G ili višestruki GG motivi imaju značajan efekat na neke imunostimulatorne nukleinske kiseline. Efekat ovih ne-T sekvenci delimično zavisi od stanja nukleinsko kiselinskog osnovnog lanca. Na primer, ako nukleinska kiselina ima fosfodiestarsku okosnicu ili himernu okosnicu, uključenje ovih sekvenci u nukleinsku kiselinu će imati samo minimalan, ako uopšte ima efekat, na biološku aktivnost nukleinske kiseline. Ako je okosnica kompletno fosforotioat (ili neka druga fosfatna modifikacija) ili značajno fosforotioat, tada uključenje ovih sekvenci može imati više uticaja na biološku aktivnost ili na kinetiku biološke aktivnosti, uzrokujući opadanje potencije T-bogatih i TG imunostimulatornih nukleinskih kiselina.

lako je pokazano da C-bogate nukleinske kiseline imaju imunostimulirajuća svojstva, insercija Poli-C sekvenci u T-bogatu nukleinsku kiselinu na način koji će smanjiti relativani odnos T nukleotida u nukleinskoj kiselini može imati negativan uticaj na nukleinsku kiselinu. lako prijavioci nisu vezani predloženim mehanizmom, veruje se da je imuni sistem razvio mehanizam za razlikovanje nukleinskih kiselina koje imaju različita nukleotidna svojstva, koja su verovatno rezultat različitih setova vezujućih proteina koji prepoznaju različite sekvence ili specifičnih vezujućih proteina koji prepoznaju sve imunostimulatorne sekvence, ali sa različitim afinitetom. U opštem slučaju, nukleinske kiseline uključujući nemetilovane CpG motive su najviše imunostimulatorne, posle njih su T-bogate nukleinske kiseline, TG nukleinske kiseline i C-bogate nukleinske kiseline. Ovo uopštavanje, međutim, ima mnoge izuzetke. Na primer jaka T-bogata nukleinska kiselina kao SEQ ID NO.: 886 je imunostimulatornija u nekim analizama od nekih nukleinskih kiselina koje sadrže CpG (npr., fosforotioat CpG nukleinska kiselina koja sadrži pojedinačan CpG motiv).

Takođe je otkriveno da dodavanje poli-A repa imunostimulatornoj nukleinskoj kiselini može pojačati aktivnost nukleinske kiseline. Otkriveno je da kada je visoko imunostimulatorna CpG nukleinska kiselina (SEQ ID NO.: 246) modifikovana dodavanjem poli-A repa (AAAAAA) ili poli-T repa (TTTTTT), dobijeni oligonukleotidi imali su povećanu imunostimulatornu aktivnost. Sposobnost poli-A repa i poli-T repa u povećanju imunostimulirajućih svojstava oligonukleotida je bila vrlo slična. SEQ ID NO.: 246 je T-bogat oligonukleotid. Verovatno je da ako se poli-A i poli-T repovi dodaju nukleinskoj kiselini koja nije T-bogata, to će imati veći uticaj na imunostimulirajuću sposobnost nukleinske kiseline. S obzirom da je poli-T rep dodat nukleinskoj kiselini koja je već vrlo T-bogata, imunostimulirajuća svojstva u odnosu na dodavanje poli-T su donekle ublažena, iako ne u potpunosti. Ovi nalazi imaju značajne implikacije u pogledu upotrebe poli-A regiona. Prema tome u nekim oblicima imunostimulatorne nukleinske kiseline obuhvataju poli-A region, a u nekim drugim oblicima ne obuhvataju.

Neke od imunostimulatornih nukleinskih kiselina pronalaska obuhvataju jedan ili više CG motiva. Prisustvo CG motiva u imunostimulatornim nukleinskim kiselinama takođe ima uticaja na biološku aktivnost nukleinskih kiselina. Ako je ukupna dužina imunostimulatorne nukleinske kiseline 20 nukleotidnih ostataka ili manje, tada su CpG motivi važni u određivanju imunog efekta na nukleinsku kiselinu, a metilacija ovih motiva smanjuje jačinu imunostimulatornih efekata nukleinske kiseline. Ako je dužina imunostimulatorne nukleinske kiseline povećana do 24, tada imunostimulatorni efekti nukleinske kiseline postaju manje zavisni od CpG motiva i nisu više poništeni metilacijom CpG motiva ili njihovom inverzijom u GC dinukleotide, uz uslov da su prisutna ostala imunostimulatorna svojstva koja su ovde opisana.

Na primer, ODN 2006 (SEQ ID NO: 246) je visoko imunostimulatorna nukleinska kiselina dužine od 24 nukleotidna ostatka sa četiri CpG dinukleotida. Međutim, ODN 2117 (SEQ ID NO: 358), u kome su CpG motivi metilovani je takođe visoko imunostimulatoran. ODN 2137 (SEQ ID NO: 886), u kome su CpG motivi ODN 2006 invertovani u GpC i koji kao rezultat poseduje šest TG dinukleotida je takođe imunostimulatoran. Imunostimulatorni efekti nukleinskih kiselina kao što je ODN 2117 i 2137 su regulisani njihovim sadržajem T i TG. Svaka od ove tri nukleinske kiseline je T-bogata i ODN 2137 je dodatno TG bogata. Ako je njihov T sadržaj smanjen umetanjem ostalih baza kao što je A (ODN 2117 (SEQ ID NO: 358)) ili je njihov TG sadržaj smanjen supstitucijom TG sa AG, tada su imunostimulatorni efekti donekle smanjeni. U drugom primeru, nukleinska kiselina dužine 24 nukleotida u kojoj su sve pozicije date po principu slučajnosti ima samo skroman imunostimulatorni efekat (ODN 2182 (SEQ ID NO: 432)). Slično tome, nukleinska kiselina dužine 24 nukleotida sa ostalim nukleotidnim kompozicijama ima promenljive imunostimulatorne efekte, u zavisnosti od T sadržaja (ODN 2188 (SEQ ID NO: 905), 2189 (SEQ ID NO: 906), 2190 (SEQ ID NO: 907), 2191 (SEQ ID NO: 908), 2193 (SEQ ID NO: 910), 2183 (SEG ID NO: 433) i 2178 (SEQ ID NO: 428)). ODN 2190 koji sadrži TGT motive je imunostimulatorniji od ODN 2202 koji poseduje TGG motive. Prema tome, u nekim oblicima, TGT motivi su poželjni. U daljim oblicima, broj TG motiva je važan po tome što povećanje broja TG motiva vodi ka povećanju u imunostimulaciji. Neke poželjne TG nukleinske kiseline sadrže najmanje tri TG motiva.

Primeri CpG nukleinskih kiselina obuhvataju, ali nisu na njih ograničeni, one navedene u Tabeli A, kao što su SEQ ID ID: 1, 3, 4, 14-16, 18-24, 28, 29, 33-46, 49, 50, 52-56, 58, 64-67, 69, 71, 72, 76-87, 90, 91, 93, 94, 96, 98, 102-124, 126-128, 131-133, 136-141, 146-150, 152-153, 155-171, 173-178, 180-186, 188-198, 201, 203-214, 216-220, 223, 224, 227-240, 242-256, 258, 260-265, 270-273, 275, 277-281, 286-287, 292, 295-296, 300, 302, 305-307, 309-312, 314-317. 320-327, 329, 335, 337-341, 343-352, 354, 357, 361-365, 367-369, 373-376, 378-385, 388-392. 394, 395, 399, 401-404, 406-426, 429-433, 434-437, 439, 441-443, 445, 447, 448, 450, 453-456, 460-464, 466-469, 472-475, 477, 478, 480, 483-485, 488, 489, 492, 493, 495-502, 504-505, 507-509. 511, 513-529, 532-541, 543-555, 564-566, 568-576, 578, 580, 599, 601-605, 607-611, 613-615, 617, 619-622, 625-646, 648-650, 653-664, 666-697, 699-706, 708, 709, 711-716, 718-732, 736, 737, 739-744, 746, 747, 749-761, 763, 766-767, 769, 772-779, 781-783, 785-786, 790-792, 798-799, 804-808. 810, 815, 817, 818, 820-832, 835-846, 849-850, 855-859, 862, 865, 872, 874-877, 879-881, 883-885, 888-904 i 909-913.

U nekim oblicima pronalaska imunostimulatorne nukleinske kiseline obuhvataju CpG dinukleotide i u ostalim oblicima imunostimulatorne nukleinske kiseline su oslobođene od CpG nukleotida. CpG dinukleotidi mogu biti metilovani ili nemetilovani. Nukleinska kiselina koja sadrži najmanje jedan nemetilovan CpG dinukleotid je molekul nukleinske kiseline koji sadrži nemetilovan citozin-guanin dinukleotidnu sekvencu (tj. "CpG DNK" ili DNK koja sadrži nemetilovani 5' citozin praćen 3' guanozinom i vezan fosfatnom vezom) i aktivira imuni sistem. Nukleinska kiselina koja sadrži najmanje jedan metilovan CpG dinukleotid je nukleinska kiselina koja sadrži metilovanu citozin-guanin dinukleotidnu sekvencu (tj., metilovan 5' citozin praćen 3" guanozinom i vezan fosfatnom vezom).

Primeri T bogatih nukleinskih kiselina koje su oslobođene od CpG nukleinskih kiselina obuhvataju, ali nisu ograničeni samo one navedene u Tabeli A, kao što su SEQ ID NO: 59-63, 73-75, 142, 215, 226, 241, 267-269, 282, 301, 304, 330, 342, 358, 370-372, 393, 433, 471, 479, 486, 491, 497, 503, 556-558, 567, 694, 793-794, 797, 833, 852, 861, 867, 868, 882, 886, 905, 907, 908 i 910-913. Primeri T bogatih nukleinskih kiselina koji obuhvataju CpG nukleinske kiseline obuhvataju, ali nisu ograničeni na one navedene u Tabeli A, kao što su SEQ ID NO: 64, 98, 112, 146, 185, 204, 208, 214, 224, 233, 244, 246, 247, 258, 262, 263, 265, 270-273, 300, 305, 316, 317, 343, 344, 350, 352, 354, 374, 376, 392, 407, 411-413, 429-432, 434, 435, 443, 474, 475, 498-501, 518, 687, 692, 693, 804, 862, 883, 884. 888, 890 i 891.

Imunostimulatorne nukleinske kiseline mogu biti dvolančane ili jednolančane. U opštem slučaju, dvolančani molekuli su stabilnijiin vivo,dok jednolančani molekuli imaju povećanu imunu aktivnost. Prema tome u nekim aspektima pronalaska poželjno je da je nukleinska kiselina jednolančana, a u drugim aspektima je poželjno daje nukleinska kiselina dvolančana.

Termin T-bogata nukleinska kiselina i TG nukleinska kiselina, kao što je ovde korišćeno, se odnose na imunostimulatornu T-bogatu nukleinsku kiselinu i na imunostimulatornu TG nukleinsku kiselinu, respektivno, sem ukoliko nije drugačije naznačeno. T-bogate nukleinsko kiselinske sekvence pronalaska su one koje su detaljno opisane u prethodnom tekstu kao i nukleinske kiseline prikazane u Tabeli A koje imaju najmanje jedan poli T motiv i/ili imaju sastav od više od 25% T ili poželjno 35% nukleotidnih ostataka. C-bogate nukleinske kiseline su one koje imaju najmanje jedan i poželjno dva poli-C regiona. TG nukleinske kiseline pronalaska su one detaljno opisane u prethodnom tekstu kao i specifične nukleinske kiseline prikazane u Tabeli A koje imaju najmanje jedan TG motiv.

Nukleinske kiseline pronalaska mogu, ali ne moraju, da obuhvataju poli G motiv. Nukleinske kiseline koje sadrže poli G su takođe imunostimulatorne. Veliki broj referenci, uključujući Pisetsky and Reich, 1993Mol. Biol. Reports,18:217-221; Krieger and Herz, 1994,Ann. Rev. Biochem.,63:601-637; Macava et al., 1993,PNAS,90:3745-3749; Wyatt et al., 1994,PNAS,91:1356-1360; Rando and Hogan, 1998, In Applied Antisense Oligonucleotide Technology, ed. Krieg and Stein, p. 335-352; i Kimura et al., 1994,J. Biochem.116, 991-994 takođe opisuju imunostimulatorna svojstva poli G nukleinskih kiselina.

Poli G nukleinske kiseline su poželjno nukleinske kiseline koje imaju sledeću formulu:

gde suXuX2, X3i X4nukleotidi. U poželjnim oblicima najmanje jedan od X3i X4su G. U ostalim oblicima oba X3i X4su G. U ostalim oblicima poželjna formula je 5' GGGNGGG 3', ili 5' GGGNGGGNGGG 3<*>gde N predstavlja između 0 i 20 nukleotida. U ostalim oblicima poli G nukleinska kiselina je oslobođena od nemetilovanih CG dinukleotida, kao što su nukleinske kiseline navedene u daljem tekstu kao SEQ ID NO: 5, 6, 73, 215, 267-269, 276, 282, 297-299, 355, 359, 386, 387, 444, 476, 531, 557-559, 733, 768, 795, 796, 914-925, 928-931, 933-936 i 938. U ostalim oblicima poli G nukleinska kiselina obuhvata najmanje jedan nemetilovan CG dinukleotid, kao što su, na primer, nukleinske kiseline navedene u prethodnom tekstu kao SEQ ID NO: 67, 80-82, 141, 147, 148, 173, 178, 183, 185, 214, 224, 264, 265, 315, 329, 434, 435, 475, 519, 521-524, 526, 527, 535, 554, 565, 609, 628, 660, 661, 662, 725, 767, 825, 856, 857, 876, 892, 909, 926, 927, 932 i 937.

Termini "nukleinska kiselina" i "oligonukleotid" su upotrebljavani naizmenično da bi označili višestruke nukleotide (tj. molekule koji sadrže šećer (npr. ribozu ili dezoksiribozu) vezane za fosfatnu grupu i za naizmenične organske baze, koje su bilo supstituisani pirimidin (npr. citozin (C), timidin (T) ili uracil (U)) ili supstituisani purin (npr. adenin (A) ili guanin (G)). Kao što je ovde upotrebljavano, svi termini se odnose na oligoribonukleotide kao i na oligodezoksiribonukleotide. Termini takođe obuhvataju polinukleozide (tj. polinukleotid minus fosfat) i bilo koju drugu organsku bazu koja sadrži polimer. Molekuli nukleinskih kiselina se mogu dobiti od postojećih izvora nukleinskih kiselina (npr., genomska ili cDNK), ali su poželjno sintetičke (npr. proizvedene sintezom nukleinskih kiselina).

Termini nukleinska kiselina i oligonukleotid takođe obuhvataju nukleinske kiseline ili oligonukleoide sa supstitucijama ili modifikacijama, kao što su baze i/ili šećeri. Na primer, oni obuhvataju nukleinske kiseline koje kao oksonicu imaju šećer koji je kovalentno vezan za organske grupe male molekulske težine, a da to nije hidroksil grupa na 3' poziciji i da nije fosfatna grupa na 5' poziciji. Tako modifikovane nukleinske kiseline mogu da sadrže 2'-0-aikilovanu riboza grupu. Dodatno, modifikovane nukleinske kiseline mogu da sadrže šećere kao što je arabinoza umesto riboze. Takve nukleinske kiseline mogu biti heterogene u sastavu osnovnog lanca, pri čemu sadrže bilo koju moguću kombinaciju polimernih jedinica povezanih zajedno kao što je peptid-nukleinska kiselina (koji ima amino kiselinsku okosnicu sa bazama nukleinske kiseline). U nekim oblicima, nukleinske kiseline su homogene u sastavu osnovnog lanca. Nukleinske kiseline takođe sadrže supstituisane purine i pirimidine kao što su C-5 propin modifikovane baze (VVagner et al.,Nature Biotechnology14:840-844, 1996). Purini i pirimidini obuhvataju, ali nisu samo na njih ograničeni, adenin, citozin, guanin, timidin, 5-metilcitozin, 2-aminopurin, 2-amino-6-hloropurin, 2,6-diaminopurin, hipoksantin i ostale nukleobaze koje se ne javljaju u prirodi, supstituisane i nesupstituisane aromatične grupe (delove). Druge takve modifikacije su dobro poznate stručnjacima.

Za korišćenje u tekućem pronalasku, nukleinske kiseline pronalaska se mogu sintetisatide novokorišćenjem bilo kog od velikog broja postupaka koji su dobro poznati u tehnici. Na primer, b-cijanoetil fosforamidit postupak (Beaucage, S.L., and Caruthers, M.H.,Tef. Let.22:1859, 1981); nukleozid H-fosfonat postupak (Garegg et al.,Tet. Let.27:4051-4054, 1986;Froehler et al., Nucl. Acid. Res.14:5399-5407, 1986; Garegget al., Tet. Let.27:4055-4058, 1986, Gaffnevet al., Tet. Let.29:2619-2622, 1988). Ovi hemijski postupci se mogu izvesti pomoću različitih automatskih sintetizatora nukleinskih kiselina koji su dostupni na tržištu. Ove nukleinske kiselina se označavaju kao sintetičke nukleinske kiseline. Alternativno, T-bogati i/ili TG dinukleotidi se mogu proizvesti u velikim količinama u plazmidima, (pogledati Sambrook, T.,et al.,"Molecular Cloning: A Laboratorv Manual", Cold Spring Harbor laboratorv Press, New York, 1989) i podeliti na manje delove ili primeniti kao celina. Nukleinske kiseline se mogu pripremiti od postojećih nukleinsko kiselinskih sekvenci (npr., genomska ili cDNK) korišćenjem poznatih tehnika, kao što su one koje koriste restrikcione enzime, egzonukleaze ili endonukleaze. Nukleinske kiseline pripremljene na ovaj način označavaju se kao izolovane nukleinske kiseline. Izolovane nukleinske kiseline se generalno odnose na nukleinske kiseline koje su odvojene od. komponenti koje su normalno u prirodi sa njima povezane. Kao primer, izolovana nukleinska kiselina može biti ona koja je izdvojena iz ćelije, iz jedra, iz mitohondrije ili iz hromatina. Termini Py-bogate nukleinske kiseline i TG nukleinske kiseline obuhvataju i sintetičke i izolovane Py-bogate nukleinske kisleine i TG nukleinske kiseline.

Za korišćenjein vivo,Py-bogate i TG nukleinske kiseline mogu opciono biti relativno otporne na razlaganje (npr., stabilizovane su). "Stabilizovani molekul nukleinske kiseline" će označavati molekul nukleinske kiseline koji je relativno otporan nain vivorazlaganje (npr. pomođu egzo- ili endo- nukleaze). Stabilizacija može biti funkcija dužine ili sekundarne strukture. Nukleinske kiseline koje su dužine nekoliko desetina do nekoliko stotina kb su relativno otporne nain vivorazlaganje. Za kraće nukleinske kiseline, sekundarna struktura može stabilizovati i povećati njihov efekat. Na primer, ako 3' kraj nukleinske kiseline poseduje samo-komplementarnost sa uzvodnim regionom, tako da se on može saviti unazad i formirati vrstu petlje u vidu stabla, tada nukleinska kiselina postaje stabilizovana i time pokazuje veću aktivnost.

Alternativno, stabilizacija nukleinske kiseline se može postići pomoću modifikacija fosfatnog osnovnog lanca. Poželjne stabilizovane nukleinske kiseline tekućeg pronalaska imaju modifikovanu oksonicu. Pokazano je da modifikacija nukleinsko kiselinskog osnovnog lanca daje povećanu aktivnost Py-bogatih i TG nukleinskih kiselina kada se primenjujuin vivo.Ove stabilizovane strukture su poželjne zbog toga što Py-bogati i TG molekuli pronalaska imaju bar delimično modifikovau okosnicu. Py-bogati i TG konstrukti koji imaju fosfotioatne veze daju maksimalnu aktivnost i štite nukleinsku kiselinu od razlaganja od strane egzo- i endo-nukieaza. Ostale modifikovane nukleinske kiseline obuhvataju fosfodiestarski modifikovane nukleinske kiseline, kombinacije fosfodiestarske i fosfotioatne nukleinske kiseline, metilfosfonat, metilfosforotioat, fosforoditioat, p-etoksi i njihove kombinacije. Svaka od ovih kombinacija i njihovi određeni efekti na imune ćelije su razmatrani detaljnije u odnosu na CpG nukleinske kiseline u PCT Published Patent Applications (PCT objavljene prijave patenta) PCT/US95/01570 (WO 96/02555) i PCT/US97/199891 (WO 98/18810) sa zahtevanim prioritetom za U.S. serijski brojevi 08/386,063 i 08/960,774, podnešen 7. februara, 1995 i 30. oktobra, 1997. respektivno, čiji je celokupni sadržaj uvršćen ovde referencom. Veruje se da ove modifikovane nukleinske kiseline mogu pokazati veću stimuiatornu aktivnost zahvaljujući povećanoj nukleaznoj otpornosti, povećanom preuzimanju od strane ćelija, povećanom vezivanju proteina i/ili promenjenoj unutarćelijskoj lokalizaciji.

Kompozicije pronalaska mogu opciono biti himerni oligonukleotidi. Himerni oligonukleotidi.su oligonukleotidi koji imaju formulu: 5' YtN,ZN2Y23' Y, i Y2su molekuli nukleinskih kiselina koji imaju između 1 i 10 nukleotida Svaki Yni Y2obuhvata najmanje jednu modifikovanu internukleotidnu vezu. S obzirom da najmanje 2 nukleotida himernih oligonukleotida obuhvataju modifikacije osnovnog lanca ove nukleinske kiseline su primer jednog tipa "stabilizovanih imunostimulatornih nukleinskih kiselina".

S obzirom na himerne nukleotide, smatra se da suY,i Y2nezavisni jedan od drugog. Ovo znači da svaki Y-i i Y2može i ne mora imati različite sekvence i međusobno različite veze osnovnog lanca u istom molekulu. Sekvence variraju, ali u nekim slučajevima Y, i Y2imaju poli-G sekvencu. Poli-G sekvenca se odnosi na najmanje 3 G u nizu. U ostalim oblicima poli-G sekvenca se odnosi na najmanje 4, 5, 6, 7, ili 8 G u nizu. U ostalim oblicimaYii Y2mogu biti TCGTCG, TCGTCGT, ili TCGTCGTT (SEQ ID NO: 1145). Y, i Y2mogu takođe imati poli-C, poli-T, ili poli-A sekvencu. U nekim oblicima Yti/ili Y2imaju između 3 i 8 nukleotda.

Nii N2su molekuli nukleinskih kiselina koji imaju između 0 i 5 nukleotida sve dok NiZN2ima ukupno najmanje 6 nukleotida. Nukleotidi NiZN2imaju fosfodiestarsku okosnicu i ne obuhvataju nukleinske kiseline koje imaju modifikovanu okosnicu.

Z je motiv imunostimulatorne nukleinske kiseline, ali ne obuhvata CG. Na primer, Z može biti nukleinska kiselina T-bogate sekvence, npr. uključujući I i I I motiv ili sekvencu gde je najmanje 50% baza sekvence T ili Z može biti TG sekvenca.

Centralni nukleotidi (NiZN2) formule YiN-|ZN2Y2imaju fosfodiestarske internukleotidne veze i Yii Y2imaju najmanje jednu, ali mogu imati više od jedne ili čak sve modifikovane internukleotidne veze. U poželjnim oblicima Yii/ili Y2imaju najmanje dve ili između dve i pet modifikovanih internukleotidnih veza ili Y-iima dve modifikovane internukleotidne veze i Y2ima pet modifikovanih internukleotidnih veza ili Yiima pet modifikovanih internukleotidnih veza i Y2ima dve modifikovane internukleotidne veze. Modifikovana internukleotidna veza, u nekim oblicima je fosforotioat modifikovana veza, fosforoditioat modifikovana veza ili p-etoksi modifikovana veza.

Modifikovani osnovni lanci kao što su fosforotioati se mogu sintetisati korišćenjem automatskih tehnika koje koriste bilo fosforamidat ili H-fosfonat hemijske postupke. Aril- i alkil-fosfonati se mogu napraviti, npr., kao što je opisano u U.S. Patent No. 4,469,863; a alkilfosfortriestri (u kome je naelektrisana kiseonična grupa (deo) alkilovana kao što je opisano u U.S. Patent No. 5,023,243 i European Patent No. 092,574) se mogu pripremiti automatskom sintezom čvrste faze korišćenjem komercijalno dostupnih reagenasa. Postupci za formiranje ostalih modifikacija i supstitucija osnovnog lanca DNK su opisani (Uhlmann, E. And Pevman, A.,Chem. Rev.90:544, 1990; Goodchild, J.,Bioconjugate Chem.1:165, 1990).

Ostale stabilizovane nukleinske kiseline obuhvataju: nejonske DNK analoge, kao što su alkil- i aril-fosfati ( u kojima je naelektrisani fosfonat kiseonik zamenjen alki! ili aril grupom), fosfodiestre i alkilfosfotriestre, u kojima je naelektrisana kiseonična grupa (deo) alkilovana. Pokazano je da su nukleinske kiseline koje sadrže diol, kao što je tetraetilenglikol ili heksaetilenglikol, na jednom ili oba kraja značajno otporne na razgradnju nukleazama.

U slučaju kada je Py-bogta ili TG nukleinska kiselina primenjena zajedno sa antigenom koji je kodiran u nukleinsko kiseiinskom vektoru, poželjno je da okosnica Py-bogate ili TG nukleinske kiseline bude himerna kombinacija fosfodiestra i fosforotioata (ili neke druge fosfatne modifikcije). Ćelije mogu imati problema u preuzimanju plazmidnog vektora u prisustvu kompletno fosforotioatne nukleinske kiseline. Prema tome kada su i vektor i nukleinska kiselina primenjene na subjekta, poželjno je da nukleinska kiselina ima himernu okosnicu ili da ima fosforotioatnu okosnicu, ali da je plazmid spojen sa nosačem koji ga direktno isporučuje u ćeliju, čime se izbegava potreba za ćelijskim unosom. Takvi nosači su poznati u praksi i obuhvataju, na primer, lipozome i genske topove.

Nukleinske kiseline opisane ovde kao i različite kontrolne nukleinske kiseline su predstavljene ispod u Tabeli A.

Dok su CpG efekti kod miševa dobro okarakterisani, informacija koja se tiče humanog sistema je ograničena. CpG fosforotioatni oligonukleotidi sa jakim stimulatornim dejstvom u mišjem sistemu pokazuju niže dejstvo na ljude i ostale ne-glodarske imune ćelije. U primerima je opisan razvoj potentnog CpG motiva i karakterizacija njegovih efekata i mehanizama delovanja na humane primarne B ćelije. DNK koja sadrži ovaj CpG motiv snažno stimuliše primarne humane B ćelije da proliferišu, da proizvode IL-6 i da eksprimiraju povećane nivoe CD86, CD40, CD54 i MHC II. Ovo povećava DNK vezujuću aktivnost transkripcionih faktora NFkB i AP-1, kao i fosforilaciju stresom aktiviranih protein kinaza JNK i p38 i transkripcionog faktora ATF-2. Signalni putevi B ćelija koji su aktivirani CpG DNK su različiti od onih koji su aktivirani receptorom B ćelija koji je aktivirao ERK i različitu izoformu JNK, ali nije aktivirao p38 i ATF-2. Uopšteno, podaci o CpG DNK-iniciranom prenošenju signala su u skladu sa onima koji su dobijeni kod miševa (Hacker H., et al. 1998.Embo J17:6230, Yi A. K., i Krieg A. M. 1998.J. Immunol161:4493).

Poželjan ne-glodarski motiv je 5' TCGTCGTT 3'. Zamena baza unutar najjačeg 8mer CpG motiva (5' TCGTCGTT 3') poništava aktivnost oligonukleotida. Timidini na 5' i 3' poziciji su važniji od timidina na središnjoj poziciji. Adenin ili guanozin na središnjoj poziciji dovode do smanjenja aktivnosti.

Kao napomena, naše studije pokazuju da je jedan humani CpG motiv unutar fosfodiestarskog oligonukleotida (2080) dovoljan da proizvede maksimalan efekat i da dodatni (CpG) motivi (2059) dalje ne povećavaju aktivnost. U studijama je oligonukleotid sa 8mer motivom 5' TCG TCG TT 3' (2080) koji sadrži dva CpG dinukleotida pokazao najveću aktivnost. Zamena baza koje se nalaze sa obe strane dva CpG dinukleotida (5' pozicija, srednja pozicija, 3' pozicija) smanjuje aktivnost ove sekvence. Oba CpG dinukleotida unutar 8mer CpG motiva su potrebne za optimalnu aktivnost (2108, 2106). Citidinska metilacija CpG dinukleotida (2095) je poništila aktivnost 2080, dok metilacija nepovezanog citidina (2094) je nije poništila. Dodavanje dva CpG motiva u sekvencu 2080 što je rezultiralo u 2059 nije dalje povećalo aktivnost fosfodiestarskog oligonukleotida. Sekvenca 2080 sa fosforotioatnim osnovnim lancem

(2116) pokazuje manju aktivnost, sugerišući da su dodatni CpG motivi poželjni za snažan fosforotioatni oligonukleotid.

Otkriveno je na osnovu pronalaska da imunostimulatorne nukleinske kiseline imaju značajne imunostimulatorne efekte na humane ćelije kao što su NK ćelije, B ćelije i DCin vitro .Pokazano je dain vitroanalize koje su ovde korišćene predviđajuin vivoefektivnost kao adjuvant vakcine kod ne-glodarskih kičmenjaka (Primer 12), suge rišući da su imunostimulatorne nukleinske kiseline efikasni terapeutski agensi za humanu vakcinaciju, imunoterapiju kancera, imunoterapiju astme, opšte poboljšanje imunih funkcija, poboljšanje hematopoetskog oporavka posle radijacije ili hemoterapije i ostale imunomodulirajuće primene.

Prema tome, imunostimulatorne nukleinske kiseline su korisne u nekim aspektima pronalaska kao profilaktička vakcina za tretman subjekta koga postoji rizik da se razvije infekcija sa infektivnim organizmom ili za kancer kod koga je identifikovan specifičan kancer antigen ili za alergiju ili astmu gde su poznati alergen ili predispozicija za astmu. Imunostimulatorne nukleinske kiseline se mogu dati bez antigena ili alergena za kraći vremenski period zaštite protiv infekcije, alergije ili kancera i u ovim slučajevima će ponovljene doze obezbediti dugoročnu zaštitu. Subjekat pod rizikom kao što je ovde korišćeno je subjekat koji ima bilo kakav rizik izlaganju infekciji koju izaziva patogen ili kanceru ili alergenu ili rizik od razvoja kancera. Na primer, subjekat pod rizikom može biti subjekat koji planira putovanje na prostor gde je pronađen određen tip infektivnog agensa ili to može biti subjekat koji je svojim načinom života ili medicinskim postupcima izložen telesnim tečnostima koje mogu sadržati infektivne organizme ili direktno organizmu ili čak subjekat koji živi na prostoru gde je identifikovan infektivni organizam ili alergen. Subjekti koji su pod rizikom da razviju infekciju takođe obuhvataju opšte populacije kojima medicinske organizacije preporučuju vakcinaciju sa određenim antigenom ifektivnog organizma. Ako je antigen alergen i subjekat razvije alergijske odgovore na taj određeni antigen i subjekat može biti izložen antigenu, tj., tokom sezone polena, tada je subjekat pod rizikom od izlaganja antigenu. Subjekat pod rizikom da razvije alergiju na astmu obuhvata one subjekte koji su identifikovani da imaju alergiju ili astmu, ali koji nemaju aktivnu bolest tokom tretmana imunostimulatornom nukleinskom kiselinom, kao i subjekti za koje se smatra da su pod rizikom da razviju ove bolesti zbog genetičkih ili sredinskih faktora.

Subjekat kod koga postoji rizik da se razvije kancer je onaj kod koga postoji visoka verovatnoća razvoja kancera. Ovi subjekti obuhvataju, na primer, subjekte koji imaju genetičku abnormalnost, za čije prisustvo je pokazano da je u korelaciji sa većom verovatnoćom razvoja kancera i subjekte izložene kanceru koji izazivaju agensi kao što su duvan, azbest, ili neki drugi hemijski toksini, ili subjekte koji su ranije lečeni od kancera i koji je u očiglednoj remisiji. Kada se subjekt kod koga postoji rizik da se razvije kancer tretira sa antigenom specifičnim za tip kancera za koji postoji rizik da se pojavi kod subjekta i imunostimulatornom nukleinskom kiselinom, subjekat može biti sposoban da ubija ćelije kancera kako se one razvijaju. Ako tumor počinje da se formira u subjektu, subjekat će razviti specifičan imuni odgovor protiv antigena tumora.

Kao dodatak upotrebi imunostimulatornih nukleinskih kiselina u prevenciji, pronalazak takođe obuhvata upotrebu imunostimulatornih nukleinskih kiselina za lečenje subjekta koji ima infekciju, alergiju, astmu, ili kancer.

Subjekat koji ima infekciju je subjekat koji je bio izložen infektivnom patogenu i ima akutno ili hronično detektabilne nivoe patogena u telu. Imunostimulatorne nukleinske kiseline se mogu koristiti sa antigenom da bi se stvorio antigen specifičan sistemski ili mukozni imuni odgovor koji je sposoban da redukuje nivo Ili da potpuno uništi infektivnog patogena. Infektivna bolest, kao što je ovde upotrebljeno, je bolest koja nastaje zbog prisustva stranog mikroorganizma u telu. Posebno je važno da se razviju efikasne strategije vakcinisanja i tretmani da bi se zaštitile površine sluzokože tela, koje su primarno mesto ulaska patogena.

Subjekat koji ima alergiju je subjekat koji ima ili je pod rizikom da razvije alergijsku reakciju kao odgovor na alergen. Alergija se odnosi na stečenu hipersenzitivnost na supstancu (alergen). Alergijska stanja obuhvataju, ali nisu ograničena samo na njih, ekcem, alergijski rinitis ili prehlada, akutni alergijski rinitis, konjuktivitis, bronhijalna astma, urtikarija (koprivnjača) i alrgtje na hranu i ostala atopička stanja.

Trenutno, alergijske bolesti se obično tretiraju injekcijom malih doza antigena pračenom naknadnim povećanjem doze antigena. Veruje se da ovaj postupak izaziva toleranciju prema alergenu da bi se spečile dalje alergijske reakcije. Ovi postupci, međutim, mogu postati efikasni tek posle nekoliko godina primene i povezani su sa rizikom pojave neželjenih efekata kao što je anafilaktički šok. Postupci pronalaska izbegavaju ove probleme.

Alergije su obično izazvane stvaranjem IgE antitela protiv bezopasnih alergena. Citokini koji su indukovani sistemskom ili mukozalnom primenom imunostimulatornih nukleinskih kiselina su pretežno klase nazvane Th1 (primeri su IL-12 i IFN-y)i oni izazivaju i humoralni i ćelijski imuni odgovor. Tipovi antitela povezani sa Th1 odgovorom generalno daju bolju zaštitu usled toga što imaju izražene sposobnosti neutralizacije i opsonizacije. Drugi glavni tip imunog odgovora, koji je povezan sa proizvodnjom IL-4, IL-5 i IL-10 citokina, je označen kao Th2 imuni odgovor. Th2 odgovori obuhvataju pretežno antitela i ovi odgovori imaju manje protektivni efekat protiv infekcije, a neki Th2 izotipovi (npr., IgE) su povezani sa alergijom. Uopšteno, čini se da su alergijske bolesti posredovane Th2 tipom imunih odgovora, dok Th1 odgovori daju najbolju zaštitu protiv infekcije, iako su prekomerni Th1 odgovori povezani sa autoimunom bolesti. Na osnovu sposobnosti imunostimulatornih nukleinskih kiselina da menjaju imuni odgovor od Th2 (koji je povezan sa proizvodnjom IgE antitela i alergijom) u Th1 odgovor (koji štiti protiv alergijskih reakcija), efikasna doza za indukovanje imunog odgovora imunostimulatorne nukleinske kiseline se može primeniti na subjekta za lečenje ili prevenciju alergije.

Prema tome, imunostimulatorne nukleinske kiseline imaju značajnu ulogu u lečenju alergijskih i ne-alergijskih stanja kao što je astma. Th2 citokini, posebno IL-4 i IL-5 su povećani u disajnim putvima subjekta sa astmom. Ovi citokini potpomažu važne aspekte astmatičnog inflamatornog odgovora, uključujući zamenu IgE izotopa, hemotaksiju eozinofila i aktivaciju i rast mastocita. Th1 citokini, posebno IFN-7i IL-12, mogu da suprimiraju formiranje Th2 klonova i proizvodnju Th2 citokina. Astma se odnosi na poremećaj respiratornog sistema koji karakteriše zapaljenje, sužavanje disajnih puteva i povećana reaktivnost disajnih puteva na inhalirane agense. Astma je često, iako ne isključivo povezana sa atopičnim ili alergijskim simptomima.

Subjekat koji ima kancer je subjekat koji ima detektabilne kancerozne ćelije. Kancer može biti maligni ili ne-maligni kancer. Kanceri ili tumori obuhvataju, ali nisu ograničeni samo na njih, kancer žučnog kanala; kancer mozga; kancer dojke; kancer grlića materice; horiokarcinom; kancer debelog creva; kancer endometrijuma; kancer jednjaka; kancer želudca; intraepitelijalne neoplazme; limfomi; kancer jetre; kancer pluća (npr. male ćelije i ne-male ćelije); melanom; neuroblastomi; oralni kancer; kancer jajnika; kancer pankreasa; kancer prostate; rektalni kancer; sarkomi; kancer kože; kancer testisa; tireoidni kancer; i renalni kancer, kao i ostali karcinomi i sarkomi. U jednom obliku kancer je leukemija sa pojavom cilijatnih ćelija, hronična mijelogena leukemija, leukemija kutanih T ćelija, multipni mijelom, folikularni limfom, maligni melanom, karcinom skvamoznih ćelija, kar činom bubrežnih ćelija, karcinom prostate, karcinom ćelija bešike, ili karcinom debelog creva.

Subjekat na osnovu pronalaska je ne-glodarski subjekat. Ne-glodarski subjekat će značiti čoveka ili kičmenjačku životinju uključujući, ali ne ograničavajući se na psa, mačku, konja, kravu, svinju, ovcu, kozu, kokošku, primata, npr., majmuna, ribu (vrste akvakulture), npr. pastrmku, ali posebno isključujući glodare kao što su pacovi i miševi.

Prema tome, pronalazak se takođe može upotrebiti za lečenje kancera i tumora kod ne-humanih subjekata. Kancer je jedan od vodećih uzroka smrti kod životinja kućnih ljubimaca (tj., mačke i psi). Kancer se obično javlja kod starijih životinja koje su, u slučaju kućnih ljubimaca, postali deo porodice. Četrdeset i pet % pasa starijih od 10 godina, ima verovatnoću oboljevanja. Najčešće opcije lečenja obuhvataju operaciju, hemoterapiju i terapiju zračenjem. Ostali modaliteti lečenja koji se koriste sa izvesnim uspehom su laser terapija, krioterapija, hipertermija i imunoterapija. Izbor tretmana zavisi od tipa kancera i stepena širenja. Sem u slučaju da je maligni rast ograničen na malu površinu u telu, teško je ukloniti samo maligno tkivo bez uticaja na normalne ćelije.

Maligni poremećaji često dijagnostifikovani kod pasa i mačaka obuhvataju ali nisu ograničeni na limfosarkom, osteosarkom, tumore mlečne žlezde, mastocitom, tumor mozga, melanom, adenoskvamozni karcinom, karcinoidni tumor pluća, tumor bronhijalne žlezde, bronhiolarni adenokarcinom, fibrom, miksohondrom, plućni sarkom, neurosarkom, osteom, papiloma, retinoblastom, Ewing-ov sarkom, VVilm-ov tumor, Burkitt-ov limfom, mikrogliom, neuroblastom, osteoklastom, oralna neoplazija, fibrosarkom, osteosarkom i rabdomiosarkom. Ostale neoplazije kod pasa obuhvataju karcinom genitalnih skvamoznih ćelija, prenosivi venerični tumor, testikularni tumor, seminom, tumor Sertolijevih ćelija, hemangiopericitom, histiocitom, hlorom (granulocitni sarkom), kornealni papilom, karcinom kornealnih skvamoznih ćelija, hemangiosarkom, pleuralni mezoteliom, tumor bazalnih ćelija, timom, tumor želudca, karcinom nadbubrežne žlezde, oralni papilomastozis, hemangioendoteliom i cistadenom. Dodatni maligniteti dijagnostifikovani kod mačaka obuhvataju folikulami limfom, intestinalni limfosarkom, fibrosarkom i karcinom plućnih skvamoznih ćelija. Za domaću lasicu( Mustela putorius furo),čak popularnijeg kućnog ljubimca je poznato da razvija insulinom, limfom, sarkom, neurom, tumor Langerhansovih ćelija, želudačni MALT limfom i želudačni adenokarcinom.

Neoplazije koje pogađaju životinjski fond na farmama obuhvataju leukemiju, hemangiopericitom i goveđu okularnu neoplaziju (kod stoke); prepucijalni fibrosarkom, karcinom ulcerativnih skvamoznih ćelija, prepucijalni sarkom, neoplazija vezivnog tkiva i mastoci tom (kod konja); hepatocelularni karcinom (kod svinja); limfom i plućni adenomatozis (kod ovaca); plućni sarkom, limfom, Rous sarkom, retikuloendoteliozis, fibrosarkom, nefroblastom, limfom B ćelija i limfoidnu leukozu (kod ptičjih vrsta); retinoblastom, hepatičnu neoplaziju, limfosarkom (limfoblastični limfom), plazmacitoidnu leukemiju i sarkom ribljeg mehura (kod riba), sirasti limfadenitis (CLA): hronične, infektivne, zarazne bolesti ovaca i koza izazvane bakterijomCorynebacterium pseudotuberculosisi zarazni tumor pluća ovaca izazvan plućnom adenomatozom.

Subjekat je izložen antigenu. Kao što je ovde upotrebljeno, termin izložen se odnosi bilo na aktivan korak stupanja u kontakt subjekta sa antigenom ili pasivno izlaganje subjekta antigenuin vivo.Postupci za aktivno izlaganje subjekta antigenu su dobro poznati u tehnici. Uopšteno, antigen je direktno primenjen na subjekta bilo kojim putem kao što je intravenozna, intramuskularna, oralna, transdermalna, mukozalna, intranazalna, intratrahealna, ili subkutana primena. Antigen se može primeniti sistemski ili lokalno. Postupci za primenu antigena i imunostimulatorne nukleinske kiseline su detaljnije opisani u daljem tekstu. Subjekat je pasivno izložen antigenu, ako je antigen postao dostupan za izlaganje imunim ćelijama u telu. Subjekat može biti pasivno izložen antigenu, na primer, ulaskom stranog patogena u telo ili razvojem ćelije tumora koja eksprimira strani antigen na svojoj površini.

Postupci u kojima je subjekat pasivno izložen antigenu mogu biti posebno zavisni od vremena primene imunostimulatorne nukleinske kiseline. Na primer, kod subjekta kod koga postoji rizik od razvoja kancera ili infektivne bolesti ili alergijskog ili astmatičnog odgovora, moguće je redovno primenjivati imnuostimulatornu nukleinsku kiselinu kada je rizik najveći, tj., tokom sezone alergija ili posle izlaganja agensu koji može izazvati kancer. Dodatno, imunostimulatorska nukleinska kiselina se može primeniti na putnike pre njihovog putovanja u strane zemlje gde postoji rizik njihovog izlaganja infektivnim agensima. Slično tome, imunostimulatorska nukleinska kiselina se može primeniti na vojnike ili civile kod kojih postoji rizik od izlaganja biološkom ratu da bi se izazvao sistemski ili mukozni imuni odgovor na antigen kada i ako je subjekat bio izložen njemu.

Antigen kao što se ovde koristi je molekul sposoban da izazove imuni odgovor. Antigeni obuhvataju, ali nisu samo na njih ograničeni, ćelije, ćelijske ekstrakte, proteine, polipeptide, peptide, polisaharide, polisaharidne konjugate, peptidne i ne-peptidne mimetike polisaharida i ostalih molekula, male molekule, lipide, glikolipide, ugljene hidrate, viruse i viralne ekstrakte i višećelijske organizme kao što su paraziti i alergene. Termin antigen obuhvata bilo koji tip molekula koji prepoznaje imuni sistem domaćina kao strani. Antigeni obuhvataju, ali nisu samo na njih ograničeni, antigene kancera, mikrobijalne agense i alergene.

Antigen kancera kao što je ovde koriščeno je jedinjenje, kao što je peptid ili protein, vezan sa površinom ćelija kancera ili tumora i koje je sposobno da izazove imuni odgovor kada je eksprimiran na površini antigen prikazujućih ćelija u kontekstu MHC molekula. Antigeni kancera se mogu pripremiti od ćelija kancera bilo pripremanjem sirovih ekstrakata od ćelija kancera, na primer, kao što je opisano u Cohen, et al., 1994,Cancer Research,54:1055, delimičnim prečišćavanjem antigena, rekombinantnom tehnologijom, iliđe novosintezom poznatih antigena. Antigeni kancera obuhvataju, ali nisu ograničeni na antigene koji su rekombinantno eksprimirani, imunogeni deo, ili ceo tumor ili kancer. Takvi antigeni se mogu izolovati ili pripremiti rekombinantno ili bilo kojim načinima poznatim u tehnici.

Mikrobijalni agens kao što je ovde korišćeno je antig en mikroorganizma i obuhvata, ali nije ograničen na virus, bakteriju, parazite i gljive. Takvi antigeni obuhvataju intaktni mikroorganizam kao i prirodne izolate i fragmente ili njihove derivate i takođe sintetička jedinjenja koja su identična ili slična sa antigenima prirodnih mikroorganizama i indukuju imuni odgovor specifičan za taj mikroorganizam. Jedinjenje je slično antigenu prirodnog mikroorganizma ako isto indukuje imuni odgovor (humoralni i/ili ćelijski) na antigen prirodnog mikroorganizma. Takvi antigeni se rutinski koriste u tehnici i dobro su poznati stručnjacima.

Primeri virusa koji su pronađeni kod čoveka uključuju, ali nisu ograničeni na :Retroviridae(npr. virusi imunodeficijencije kod čoveka, kao što je HIV-1 (takođe označen kao HTLV-III, LAV ili HTLV-III/LAV, ili HIV-III; i drugi izolati kao što je HIV-LP;Picornaviridae(npr. polio virusi, hepatitis A virus; enterovirusi, humani Koksaki virusi, rinovirusi, ehovirusi);Calciviridae(npr. sojevi koji izazivaju gastroenteritis);Togaviridae(npr. virusi encefalitisa kod konja, rubeola virusi);Flaviridae(npr. denga virusi, encefalitis virusi, virusi žute groznice);Coronoviridae(npr. koronavirusi);Rhabdoviradae(npr. virusi vezikularnog stomatitisa, virusi besnila);Filoviridae(npr. ebola virusi);Paramyxoviridae(npr. parainfluenca virusi, virus parotoitisa, virus malih boginja, respiratorni sincicijalni virus);Orthomyxoviridae(npr. influenza virusi);Bungaviridae(npr. Hantaan virusi, bunga virusi, flebovirusi i Nairo virusi); Arena viridae (virusi hemoragične groznice);Reoviridae(npr. reovirusi, orbivirusi i rotavirusi);Bimaviridae; Hepadnaviridae(Hepatitis B virus);Parvovirida(parvovirusi);Papovaviridae(papilloma virusi, polioma virusi);Adenoviridae(većina adenovirusa);Herpesviridae(herpes simplex virus (HSV) 1 and 2, varičela zoster virus, citomegalovirus (CMV), herpes virus;Poxviridae(variola virusi, vakcinia virusi, pox viruses); iIridoviridae(npr. virus afričke svinjske groznice); i neklasifikovani virusi (npr. etiološki agensi spongiformne encefalopatije, agens delta hepatitisa (smatralo se da je defektni satelit virusa hepatitisa B), agensi ne-A, ne-B hepatitisa (klasa 1 = interno se prenosi; klasa 2 = parenteralno se prenosi (t. j. hepatitis C); Norv/alk i srodni virusi i astrovirusi).

Gram negativne i gram pozitivne bakterije imaju ulogu antigena u životinjama kičmenjacima. Takve gram pozitivne bakterije uključuju, ali nisu ograničeni na,Pasteurellavrste,Staphylococcivrste iStreptococcusvrste. Gram negativne bakterije uključuju, ali nisu ograničeni na,Escherichia coli, Pseudomonasvrste iSalmonellavrste. Specifični primeri infektivnih bakterija uključuju, ali nisu ograničeni na,Helicobacter pytoris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteriavrste (npr.M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare,

M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria

meningitidis, Listeria monocylogenes, Streptococcus pyogenes(Grupa A Streptococcus),Streptococcus agalactiae(Grupa B Streptococcus),Streptococcus(viridans grupa),

Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus(anaerobne vrste),Streptococcus pneumoniae,patogeniCampylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzas, Bacillus

antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae,

Clostridium per/ ringers, Closthdium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae,

Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis,

Treponema pallidum, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, i Actinomyces israelli.

Primeri gljiva uključujuCryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum,

Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candidaalbicans.

Drugi infektivni organizmi (t. j., protozoe) uključujuPlasmodium spp.kao što jePlasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovaleiPlasmodiumvivax iToxoplasma gondii.Krvni i/ili tkivni paraziti uključujuPlasmodiumspp.,Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, Leishmaniaspp.,Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambienseiTrypanosoma rhodesiense(Afrička bolest spavanja),Trypanosoma cruzi(Chagas bolest) iToxoplasma gondii.

Drugi medicinski relevantni mikroorganizmi detaljno su opisani u literaturi npr., pogledati C.G.A Thomas,Medical Microbiology,Bailliere Tindall, Great Britain 1983, čiji je celokupni sadržaj uključen ovde na osnovu reference.

lako se mnogi od mikrobskih agenasa koji su opisani u prethodnom tekstu odnose na oboljenja kod čoveka, pronalazak je takođe koristan za lečenje drugih ne-humanih vertebrata. Kod ne-humanih vertebrata takođe se mogu razviti infekcije koje se mogu sprečiti ili tretirati imunostimulatornim nukleinskim kiselinama koje su ovde opisane. Na primer, kao dodatak lečenju infektivnih oboljenja kod čoveka, postupci pronalaska su takođe korisni u lečenju infekcija životinja.

Kao što je ovde korišćeno, termin lečiti, lečen ili lečenje kada je korišćen u odnosu na infektivnu bolest označava profilaktički tretman koji povećava otpornost subjekta (subjekta kod koga postoji rizik od infekcije) na infekciju sa patogenom, ili, drugim rečima, smanjuje verovatnoću da će se subjekt inficirati patogenom kao i tretman nakon što je subjekt (subjekt koji je inficiran) inficiran da bi se izborio sa infekcijom, npr., da bi se ublažila ili eliminisla infekcija ili da bi se sprečilo njeno pogoršanje.

Mnoge vakcine za lečenje ne-humanih vertebrata dati su u Bennett, K.Compendium of Veterinary Products,3rd ed. North American Compendiums, Inc., 1995. Kao što je razmatrano u prethodnom tekstu, antigeni uključuju infektivne mikrobe kao što su virusi, paraziti, bakteriji i gljive ili njihovi delovi, izvedeni iz prirodnih izvora ili sintetisani. Infektivni virusi humanih i ne-humanih vertebrata, uključuju retroviruse, RNK viruse i DNK viruse. Ova grupa retrovirusa uključuje i proste retroviruse i kompleksne retroviruse. Prosti retrovirusi uključuju podgrupe B-tipa retrovirusa, C-tipa retrovirusa i D-tipa retrovirusa. Primer retrovirusa B-tipa je virus tumora mlečne žlezde miša (MMTV). C-tip retrovirusa uključuje podgrupe C- tipa grupa A (uključujući virus Rous sarkoma (RSV), virus leukemije ptica (ALV) i virus mijeloblastozisa ptica (AMV)) i C-tipa grupa B (uključujući virus leukemije mačaka (FeLV), virus leukemije kod majmuna gibona

(GALV), virus nekroze slezine (SNV), virus retikuloendotelioze (RV) i virus simian sarkoma (SSV)). D-tip retrovirusa uključuje Mason-Pfizer virus majmuna (MPMV) i simian retrovirus tip 1 (SRV-1). Kompleksni retrovirusi uključuju podgrupe lentivirusa, viruse leukemije T-ćelija i foamy virusi. Lentivirusi uključuju HIV-1, ali takođe uključuju HIV-2, SIV, Visna virus, virus imunodeficijencije mačaka (FIV) i infektivni virus anemije konja (EIAV). Virusi leukemije T-ćelije uključuju HTLV-1, HTLV-II, simian virus leukemije T-ćelija (STLV) virus leukemije goveda (BLV). Foamy virusi uključuju humani foamy virus (HFV), simian foamy virus (SFV) i foamy virus goveda (BFV).

Primeri drugih RNK virusa koji su antigeni kod životinja vertebrata uključuju, ali nisu ograničeni na, pripadnike familije Reoviridae, uključujući rod Orthoreovirus (višestruki serotipovi i sisarskih i ptičijih retrovirusa), rod Orbivirus (Bluetongue viru s (virus plavog jezika), Bugenangee virus, Kemerovo virus, virus bolesti afričkih konja i Colorado Tick Fever virus), rod Rotavirus (humani rotavirus, virus dijareje Nebraska teladi, simian rotavirus, goveđi ili ovčiji rotavirus, ptičiji rotavirus); porodica Picomaviridae, uključujući rod Enterovirus (poliovirus, Koksaki virus A i B, enteric cvtopathic human orphan (ECHO) virusi, hepatitis A virus, Simian enterovirusi, virusi encefalomijelitisa miša (ME), Poliovirus muris, goveđi enterovirusi, enterovirusi svinje , rod Cardiovirus (Encephalomyocarditis virus (EMC), Mengovirus), rod Rhinovirus (rinovirusi čoveka koji uključuju najmanje 113 podtipova; drugi rinovirusi), rod Apthovirus (Foot and Mouth disease (aftozna groznica - slinavka i šap) (FMDV); porodica Calciviridae, uključujući virus vezikularne egzanteme svinje, virus San Miguel morskog lava, picornavirus mačaka i Norvvalk virus; porodica Togaviridae, uključujući rod Alphavirus (virus encefalitisa istočnog konja, Semliki forest virus, Sindbis virus, Chi kungunya virus, O'Nvong-Nyong virus, Ross river virus, virus encefalitisa venecuelanskog konja, virus encefalitisa zapadnog konja), rod Flavirius (virus žute groznice koji se prenosi komarcima, Denga virus, virus japanskog encefalitisa, virus St. Louis encefalitisa, virus Muoray Valley encefalitisa, West Nile virus, Kunjin virus, Centralnoevropski virus koji se prenosi krpeljima, Dalekoistočni virus koji se prenosi krpeljima, Kyasanur forest virus, Louping III virus, Povvassan virus, virus Omsk hemoragične groznice), rod Rubivirus (Rubella virus), rod Pestivirus (virus mukozne bolesti, virus svinjske groznice, virus granične bolesti); porodica Bunvaviridae, uključujući rod Bunyvirus

(Bunyamwera i srodni virusi, California encefalitis grupa virusa), rod Phlebovirus (Sandfly fever Sicilian virus, Rift Valley fever virus), rod Nairovirus (virus Crimean-Congo hemoragične groznice, virus bolesti Najrobi ovaca), i rod Uukuvirus (Uukuniemi i srodni virusi); porodica Orthomyxoviridae, uključujući rod Influenza virus (Influenza virus tip A, mnogi humani podtipovi); virus gripa svinje, i virusi gripa ptica i konja; virus gripa tip B (mnogi ljudski podtipovi), i virus gripa tip C (mogući zaseban rod); porodica paramyxoviridae, uključujući rod Paramyxovirus (Parainfluenza virus tip 1, Sendai virus, Hemadsorption virus, Parainfluenza virusi tipa 2 do 5, Newcastle Disease virus, Mumps virus (virus parotitisa)), rod Morbillivirus (virus malih boginja, virus subakutnog skleroznog panencefalitisa, distemper virus, Rinderpest virus), rod Pneumovirus (respiratorni sincicijalni virus (RSV), goveđi respiratorni sincicijalni virus i virus upale pluća); porodica Rhabdoviridae, uključujući rod Vesiculovirus (VSV), Chandipura virus, Flanders-Hart Park virus), rod Lvssavirus (virus besnila), Rhabdovirusi riba, i dva verovatna Rhabdovirusa (Marburg virus i Ebola virus); porodica Arenaviridae, uključujući virus limfocitnog horiomeningitisa (LCM), Tacaribe virus kompleks i Lassa virus; porodica Coronoaviridae, uključujući virus infektivnog bronhitisa (IBV), virus hepatitisa, humani enterični korona virus i infektivni peritonitis mačaka (coronavirus mačaka).

Ilustrativni DNK virusi koji su antigeni u životinjama vertebratama uključuju, ali nisu ograničeni na, porodicu Poxviridae, uključujući rod Orthopoxvirus (Variola major, Variola minor, Monkey pox Vaccinia, Cowpox, Buffalopox, Rabbitpox, Ectromelia), Rod Leporipoxvirus (Myxoma, Fibroma), rod Avipoxvirus (Fowlpox, drugi poxvirusi ptica), rod Capripoxvirus (pox virus ovaca, pox virus koza), rod Suipoxvirus (pox virus svinja), rod Parapoxvirus (virus zaraznog postularnog dermatitisa, pseudo kravlji pox virus , virus papularnog stomatitisa goveda); porodica Iridoviridae (virus groznice afričke svine, virusi žaba 2 i 3, Lymphocystis virus riba); porodica Herpesviridae, uključujući alpha-Herpesviruses (Herpes Simplex Tipovi 1 i 2, Varicella-Zoster, virus pobačaja konja, herpes virus konja 2 i 3, pseudorabies virus, virus infektivnog keratokonjuktivitisa goveda, virus infektivnog rinotraheitisa goveda, virus rinotraheitis mačaka, virus infektivnog laringotraheitisa) Beta -herpesvirusi (humani citomegalovirus i citomegalovirusi svinja i majmuna); gamma-herpes virusi (Epstein-Barr virus (EBV), virus Marekovog oboljenja, Herpes saimiri, Herpesvirus ateles, Herpesvirus svlvilagus, herpes virus zamorca, virus Lučke tumora); porodica Adenoviridae, uključujući rod Mastadenovirus (humane podgrupe A,B,C,D,E i negrupisani; simian adenovirusi (najmanje 23 serotipa), infektivni hepatitis pasa i adenovirusi stoke, svinja, ovaca, žaba i mnogih drugih vrsta, rod Aviadenovirus (adenovirusi ptica); i adenovirusi koji se ne mogu kultivisati; porodica Papoviridae, uključujući rod Papillomavirus (humani papilloma virusi, papilloma virusi goveda, virus Shope zečijeg papilloma i različiti patogeni papilloma virusi drugih vrsta), rod Poivomavirus (polvomavirus, Simian vacuolating agent (simian vakuolizujući agens) (SV-40), Rabbit vacuolating agent (zečiji vakuolizujući agens) (RKV), K virus, BK virus, JC virus, i drugi polvoma v irusi primata kao što je Limfotrofički papilloma virus); porodica Parvoviridae uključujući rod Adeno -vezanih virusa, rod Parvovirus (virus panleukopenije mačaka, parvovirus goveda, parvovirus pasa, Aieutian mink disease virus, itd.). Konačno, DNK virusi mogu obuhvatati viruse koji se ne uklapaju u gorenavedene porodice kao što su Kuru i virus Creutzfeldt-Jacob oboljenja i hronični infektivni neuropatski agensi (CHINA virus).

Svaki od gorenavedenih spiskova je ilustrativan i nije namervano da bude ograničavajući.

Kao dodatak upotrebi imunostimulatornih nukleinskih kiselina za indukciju antigen specifičnog imunog odgovora kod ljudi, postupci poželjnih oblika su naročito pogodni za lečenje ptica kao što su kokoške, pilići, ćurke, patke, guske, prepelice i faza ni. Ptice su prve mete za više tipova infekcija.

Ptice koje se izležu su izložene patogenim mikroorganizmima vrlo brzo posle rođenja, lako su ove ptice inicijalno zaštićene protiv patogena antitelima poreklom iz materinskog organizma, ova zaštita je samo privremena i nezreli imuni sistem ptice mora početi da je štiti od patogena. Često je poželjno sprečiti infekciju kod mladih ptica kada su one najosetljivije. Takođe je poželjno sprečiti infekciju kod starijih ptica, posebno kada su ptice smeštene u zatvorenim prostorijama, što vodi brzom širenju bolesti. Prema tome, poželjno je primeniti imunostimulatornu nukleinsku kiselinu i ne-nukleinsko kiselinski adjuvant pronalaska na ptice da bi se pojačao antigen-specifičan imuni odgovor kada je antigen prisuta n.

Primer česte infekcije kod pilića je virus pileće infektivne anemije (CIAV). CIAV je prvi put izolovan u Japanu 1979. tokom istraživanja vakcinacije Marek-ove bolesti (Yuasa et al., 1979, Avian Dis. 23:366-385). Od tada, CIAV je otkriven u komercijanoj živini u svim zemljama glavnim proizvođačima živine (van Bulovv et al., 1991, pp. 690-699) u Diseases of Poultrv, 9th edition, lowa State Universitv Press).

CIAV infekcija rezultuje u kliničkoj bolesti koju karakteriše anemija, krvarenje i imunosupresija, kod mladih osetljivih pilića. Atrofija timusa i koštane srži i konzistentne lezije CIAV-inficiranih pilića su takođe osobine CIAV infekcije. Trošenje limfocita u timusu i povremeno u bursa Fabricius, rezultuje u imunosupresiji i povećanoj podložnosti na sekundarne virusne, bakterijske, ili gljivične infekcije koje zatim komplikuju tok bolesti. Imunosupresija može uzrokovati pogoršanje bolesti posle infekcije sa jednim ili više virusa Marek-ove bolesti (MDV), virusom infektivne burzalne bolesti, virusom retikuloendotelioze, adenovirusom, ili retrovirusom. Objavljeno je da je patogeneza MDV povećana sa CIAV (DeBoer et al., 1989, p.28 In Proceedings of the 38th VVestern Poultrv Diseases Conference, Tempe, Ariz.). Dalje, objavljeno je da CIAV pogoršava simptome infektivne burzalne bolesti (Rosenberg et al., 1989, Avian Dis. 33:707-713). Pilići razvijaju starosnu otpornost na eksperimentalno izazvanu bolest usled CAA. Ovo se suštinski završava sa starošću od 2 nedelje, ali starije ptice su i dalje podložne infekciji (Yuasa, N. Et al., 1979 supra; Yuasa, N. Et al., Arian Diseases 24, 202-209, 1980). Međutim, ako su pilići dvostruko inficirani sa CAA i imunosupresivnim agensom (IBDV, MDV itd.), starosna otpornost na bolest je odložena (Yuasa, N. Et al., 1979 i 1980 supra; Bulow von V. et al., J. Veterinarv Medicine 33, 93-116, 1986). Karakteristike CIAV koje mogu potencirati prenošenje bolesti obuhvataju visoku otpornost na sredinsku inaktivaciju i neka uobičajena dezinfekciona sredstva. Ekonomski uticaj CIAV infekcije na živinsku industriju je jasan iz činjenice da 10% do 30% inficiranih obolelih ptica umre.

Vakcinacija ptica, kao i ostalih kičmenjačkih životinja se može izvesti nezavisno od starosti. Normalno, vakcinacije se izvode do starosti od 12 nedelja sa živim mikroorganizmom i između 14-18 nedelja sa inaktiviranim mikroorganizmom ili drugim tipom vakcine. Zain ovovakcinaciju, vakcinacija se može izvesti u poslednjoj četvrtini embrionalnog razvoja. Vakcina se može pimeniti subkutano, sprejem, oralno, intraokularno, intratrahalno, nazalno, ili ostalim postupcima za mukozno dostavljanje koji su ovde opisani. Prema tome, imunostimulatorne nukleinske kiseline pronalaska se mogu primeniti na ptice i ostale ne-humane kičmenjake korišćenjem rutinskih rasporeda vakcinisanja, a antigen se može primeniti posle odgovarajućeg vremenskog perioda kao što je ovde opisano.

Mačke i životinje sa farmi su takođe podložni infekciji. Bolesti koje pogađaju ove životinje mogu dovesti do velikih ekonomskih gubitaka, posebno među stokom. Postupci pronalaska se mogu upotrebiti za zaštitu od infekcije životinja sa farmi, kao što su krave, konji, svinje, ovce i koze.

Krave mogu biti inficirane goveđim virusima. Virus goveđe viralne dijareje (BVDV) je mali virus sa omotačem i pozitivnim lancem RNK i klasifikovan je, zajedno sa virusom svinjske kolere (groznice) (HOCV) i virusom granične bolesti ovaca (BDV), u rod pestivirusa. lako su pestivirusi ranije klasifikovani u familiju Togaviridae, neke studije su sugerisale njihovu reklasifikaciju unutar familije Flaviviridae zajedno sa grupama flavivirusa i virusa hepatitisa C (HCV) (Francki, etal., 1991).

BVDV, koji je važan patogen stoke se može podeliti, na osnovu analize ćelijske kulture, na citopatogene (CP) i necitopatogene (NCP) biotipove. NCP biotip je rašireniji iako se oba biotipamogu naći kod stoke. Ako se steona krava inficira NCP sojem, krava može oteliti konstantno inficirano i specifično imunotolerantno tele koje će raširiti virus tokom njegovog života. Konstantno inficirano tele može podleći mukoznoj bolesti i tada se mogu izolovati oba biotipa iz životinje. Kliničke manifestacije mogu da obuhvataju pobačaj, teratogenezu i respiratorne probleme, mukoznu bolest i blagu dijareju. Dodatno, teška trombocitopenija, povezana sa epidemijom stada, koja može da rezultuje u smrti životinje, je opisana i sojevi koji su povezani sa ovom bolešću se čine virulentnijim od klasičnih BVDVs.

Herpes virusi konja (EHV) obuhvataju grupu antigeno različitih bioloških agenasa koji uzrokuju različite infekcije kod konja od subkliničkih do fatalne bolesti. Oni obuhvataju herpes virus konja 1(EHV-1), široko rasprostranjen patogen konja. EHV-1 je povezan sa epidemijom pobačaja, bolesti respiratornog trakta i poremećajima centralnog nervnog sistema. Primarna infekcija gornjeg respiratornog trakta mladih konja rezultuje u febrilnoj bolesti koja traje 8 do 10 dana. Imunološki iskusne kobile mogu biti ponovo inficirana preko respiratornog trakta bez toga da bolest postane očigledna, tako da se pobačaj obično javlja bez upozorenja. Neurološki sindrom je povezan sa respiratornom bolešću ili pobačajem i može pogoditi životinje oba pola u bilo kom starosnom dobu, vodeći ka nedostatku koordinacije, slabosti i posteriornoj paralizi (Telford, E. A. R: et al., Virology 189, 304-316, 1992). Ostali EHV obuhvataju EHV-2, ili konjski citomegalovirus, EHV-3, konjski koitalni egzantema virus i EHV-4, prethodno klasifikovan kao EHV-1 podtip 2.

Ovce i koze mogu biti inficirane različitim opasnim mikroorganiz mirna uključujući visna - maedi.

Primati, kao što su majmuni, čovekoliki majmuni i makaki se mogu inficirati simian virusom imunodeficijencije. Primećeno je da vakcina inaktivirane ćelije-virus i vakcina simian virusa imunodeficijencije oslobođena ćelija obezbeđuju zaštitu kod makaka (Stott et al. (1990) Lancet 36:1538-1541; Desrosiers et al. PNAS USA (1989) 86:6353-6357; Murphey-Corb et al.

(1989) Science 246:1293-1297; i Carlson et al. (1990) AIDS Res. Human Retroviruses 6:1239-1246). Objavljeno je da rekombinantna HIV gp120 vakcina obezbeđuje zaštitu kod šimpanzi (Berman et al. (1990) Nature 345:622-625).

Mačke, i domaće i divlje, su podložne infekciji različitim mikroorganizmima. Na primer, infektivni peritonitis mačaka je bolest koja se javlja i kod divljih i kod domaćih mačaka, kao što su lavovi, leopardi, gepardi i jaguari. Kada je poželjno sprečiti infekciju ovim i drugim tipovima patogenih organizama kod mačaka, mogu se upotrebiti postupci pronalaska za vakcinisanje mačaka da bi se zaštitili od infekcije.

Domaće mačke se mogu inficirati sa nekoliko retrovirusa, uključujući, ali ne ograničavajući se na virus mačje leukemije (FeLV), virus mačjeg sarkoma (FeSV), endogeni tip

Concomavirus-a (RD-114) i mačji virus koji formira sincicijum (FeSFV). Od njih, FeLV je najznačajniji patogen, koji uzrokuje raznovrsne simptome, uključujući limforetikularne i mijeloidne neoplazme, anemije, imuno posredovane poremećaje i sindrom imunodeficijencije koji je sličan sindromu stečene imunodeficijencije kod čoveka (AIDS). Nedavno, određeni mutant FeLV sa defektnom replikacijom, označen kao FeL-AlDS, je specifičnije povezan sa imunosupresivnim osobinama.

Otkriće mačjeg T-limfotropnog lentivirusa (takođe označen i kao mačja imunodeficijencija) je prvi put objavljeno u Pedersen et al. (1987) Science 235:790-793. Osobine FIV su objavljene u Yamamoto et al. (1988) Leukemia, December Supplement 2:204S-215S; Yamamoto et al. (1988) Am. J. Vet. Res. 49:1246-1258; i Acklev et al. (1990) J. Virol. 64:5652-5655. Kloniranje i analiza sekvenci FIV je objavljena u Olmsted et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2448-2452 i 86:4355-4360.

Mačji infektivni peritonitis (FIP) je bolest koja se javlja sporadično i nepredvidljivo kod domaćih i divljih pripadnika porodice Felidae. Dok je FIP primarno bolest domaćih mačaka, dijagnostifikovana je kod lavova, puma, leopardova, geparda i jaguara. Manje divlje mačke koje su pogođene sa FIP obuhvataju risa i karakala, peščane mačke i Palasove mačke. Kod domaćih mačaka, bolest se pretežno javlja kod mladih životinja, iako su podložne mačke svih uzrasta. Najčešće se javlja kod mačaka između 6 i 12 meseci starosti. Smanjen o pojavljivanje je zapaženo od 5 do 13 godina starosti, a povećana pojava kod mačaka od 14 do 15 godina starosti.

Virusne, bakterijske i parazitske bolesti kod riba sa perajima, vodenih mekušaca ili rakova ili kod ostalih vodenih životnih oblika predstavljaju ozbiljan problem za industriju akvakulture. Kao posledica velike gustine životinja u tankovima za izleganje ili u zatvorenim oblastima mora za uzgajanje, infektivne bolesti mogu da iskorene veliki deo fonda u, na primer, pogonima za uzgoj riba sa perajima, vodenih mekušaca ili rakova, ili ostalih vodenih životnih oblika. Prevencija bolesti je poželjniji lek posmatrano u odnosu na ove pretnje ribama od intervencije kada je bolest već uznapredovala. Vakcinacija ribe je jedini preventivni postupak koji može ponuditi dugoročnu zaštitu putem imuniteta. Vakcinacije zasnovane na nukleinskim kiselinama su opisane u US Patent No. 5,780,448 izdato za Daviš.

Imuni sitem riba ima mnoge osobine koje su slične imunom sistemu sisara, kao što je prisustvo B ćelija, T ćelija, limfokina, komplementa i imunoglobulina. Ribe imaju podklase limfocita sa ulogom koja je u mnogim aspektima slična sa ulogom B ćelija i T ćelija sisara. Vakcine se mogu primeniti potapanjem ili oralno.

Vrste akvakulture obuhvataju, ali nisu ograničene na ribe sa perajima, vodene mekušce ili rakove i ostale vodene životinje. Ribe sa perajima obuhvataju sve kičmenjač ke ribe, koje mogu biti ribe sa koštanim ili hrskavičavim skeletom, kao što su, na primer, salmonide, šaran, som, žutorepke, morska deverika i morski grgeč. Salmonide su familija riba sa perajima koje obuhvataju pastrmku {uključujućiSalmo gardneri),lososa iSalvelinus alpinus.Primeri vodenih mekušaca ili rakova obuhvataju, ali nisu ograničeni na, mekušce, jastoga, škampe, krabe i ostrige. Ostale kultivisane vodene životinje obuhvataju, ali nisu ograničene na jegulje, sipe i oktopode.

Polipeptidi viralnih patogena akvakulture obuhvataju, ali nisu ograničeni na glikoprotein

(G) ili nukleoprotein (N) virusa viralne hemoragične septikemije (VHSV); G ili N proteini virusa infektivne hematopoetične nekroze (IHNV); VP1, VP2, VP3 ili N strukturni proteini virusa

infektivne nekroze panktreasa (IPNV); G protein spring viremije šarana (SVC); i protein vezan za membranu, tegumin ili kapsid protein ili glikoprotein virusa somova koji žive po kanalima

(CCV).

Tipični paraziti koji inficiraju konje suGasterophilussp p.;Eimeria leuckađi, Giardiaspp.;Trichomonas equi; Babesiaspp. (RBC),Theileria equi; Trypanosomaspp.;Klossiella equi; Sarcocystisspp.

Tipični paraziti koji inficiraju svinje obuhvatajuEimeria bebliecki, Eimeria scabra, Izospora suis, Giardiaspp.;Balantidium coli, Entamoeba histolytica; Toxoplasma gondiiiSarcocystisspp., iTrichinella spiralis.

Galvni paraziti goveda od kojih se korisiti mleko i meso uklljučujuEimeriaspp.,Cryptosporidium sp., Giardia spp. ; Toxoplasma gondii, Babesia bovis(RBC),Babesia bigemina(RBC),Trypanosoma spp.(plazma),Theileriaspp. (RBC);Theileria parva(limfociti);Tritrichomonas foetus;iSarcocystisspp.

Glavni paraziti ptica grabljivica uključujuTrichomonas gallinae;Coccidia( Eimeriaspp.);Plasmodium relictum, Leucocyiozoon danilewskyi(sove),Haemoproteusspp.,Trypanosomaspp.;Histomonas; Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium bailcyi, Giardia, Eimeria;

Toxoplasma.

Tipični paraziti koji inficiraju ovce i koze uključujuEimeriaspp.,Cryptosporidiumsp.,Giardiasp.;Toxoplasma gondii; Babesiaspp. (RBC),Trypanosomaspp. (plazma),Theileriaspp. (RBC); iSarcocystisspp.

Tipične parazitske infekcije živine uključuju coccidiosis izazvanEimeria acervulina, E. necatrix, E. tenella, Isosporaspp. iEimeria truncata;histomoniasis, izazvanaHistomonas meleagridisiHistomonas gallinarum;trichomoniasis izazvanaTrichomonas gallinae;i hexamitiasis izazvanaHexamita meleagridis.Živina takođe može biti inficirana saEmeria

maxima, Emeria meleagridis, Eimeria adenoeides, Eimeria meleagrimitis, Cryptosporidium,

Eimeria brunetti, Emeria adenoeides, Leucocytozoonspp.,Plasmodiumspp.,Hemoproteus

meleagridis, Toxoplasma gondiiiSarcocystis.

Postupci pronalaska se takođe mogu primeniti za lečenje i/ili prevenciju parazitskih infekcija kod pasa, mačaka, ptica, riba i domaćih lasica. Tipični paraziti ptica uključujuTrichomonas gallinae; Eimeriaspp.,Isosporaspp.,Giardia; Cryptosporidium; Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii, Haemoproteus/ Parahaemoproteus, Plasmodiumspp.,Leucocytozoon/ Akiba, Atoxoplasma, Trypanosomaspp. Tipični paraziti koji inficiraju pse uključujuTrichinella spiralis; Isoporaspp.,Sarcocystisspp.,Cryptosporidiumspp.,Hammondiaspp.,Giardia duodenalis ( canis) ; Balantidium coli, Entamoeba histolytica; Hepatozoon canis;

Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi; Babesia canis; Leishmania amastigotes; Neospora

caninum.

Tipični paraziti koji inficiraju vrste mačaka uključujuIsosporaspp.,Toxoplasma gondii, Sarcocystisspp.,Hammondia hammondi, Besnoitiaspp.,Giardiaspp.;Entamoeba histolytica, Hepatozoon canis, Cytauxzoonsp. (eritrociti, RE ćelije).

Tipični paraziti koji inficiraju ribe uključujuHexamitaspp.,Eimeriaspp.;Cryptobiaspp.,Nosemaspp.,Myxosomaspp.,Chilodonellaspp.,Trichodinaspp.;Plistophoraspp.,Myxosoma Henneguya; Costiaspp.,lchthyophithiriusspp., iOodiniumspp.

Tipični paraziti divljih sisara uključujuGiardiaspp. (karnivore, herbivore),Isosporaspp.

(karnivore),Eimeriaspp. (karnivore, herbivore);Theileriaspp. (herbivore),Babesiaspp. (c karnivore, herbivore),Trypanosomaspp. (karnivore, herbivore);Schistosomaspp. (herbivore);Fasciola hepatica(herbivore),Fascioloides magna(herbivore),Fasciola gigantica(herbivore),Trichinella spiralis(karnivore, herbivore).

Infekcije parazitima mogu pretstavljati ozbiljan problem u zoološkim vrtovima. Tipični paraziti porodice bovidae (dorkas antilopa, banteng, eland, gaur, impala, klipspringer, kudu, gazela) uključujuEimeriaspp. Tipični paraziti porodice pinnipedae (foka, morski lav) uključujuEimeriaphocae.Tipični paraziti porodice camelidae (kamile, lame) uključujuEimeriaspp. Tipični paraziti porodice giraffidae (žirafe) uključujuEimeriaspp. Tipični paraziti porodice elephantidae (afrički i azijski) uključujuFasciolaspp. Tipični paraziti nižih primata (šimpanze, orangutani, čovekoliki majmuni, pavijani, makaki, majmuni) uključujuGiardiasp.;Balantidium coli, Entamoeba histolytica, Sarcocystisspp.,Toxoplasma gondii; Plasmodiumspp. (RBC),Babesiaspp. (RBC),Trypanosomaspp. (plazma),Leishmaniaspp. (makrofage).

Polipeptidi bakterijskih patogena uključuju, ali nisu ograničeni na protein spoljašnje membrane regulisan gvožđem (IROMP), protein spoljašnje membrane (OMP) i A-proteinAeromonis salmonicidakoji izaziva furunculosis, p57 proteinRenibacterium salmoninarumkoji izaziva bakterijsko oboljenje bubrega (BKD), glavni površinski antigen (msa), površinski eksprimirani citotoksin (mpr), površinski eksprimirani hemolizin (ish) i flagelarni antigen Yersiniosis; ekstracelularni protein (ECP), protein spoljašnje membrane regulisan gvožđem (IROMP) i strukturni protein Pasteurellosis; OMP i flagelarni proteinVibrosis anguillarumiV. ordalii;flagelarni protein, OMP protein, aroA, i purAEdwardsiellosis ictaluriandE. tarda;i površinski antigenlchthyophthinus;i strukturni i regulatorni proteinCytophaga columnari;i strukturni i regulatorni proteinRickettsia.

Polipeptidi parazitskog patogena uključuju ali nisu ograničeni na površinske antigene

lchthyophthirius.

Alergen označava supstancu (antigen) koja može izazvati alergijski ili astmatični odgovor osetljivog subjekta. Spisak alergena je ogroman i može obuhvatiti polene, otrove insekata, perut životinja, spore gljiva i lekovi (npr. penicilin). Primeri prirodnih, životinjskih i biljnih alergena uključuju ali nisu ograničeni na proteine specifične za sledeće rodove:Canine ( Canis familiaris) ; Dermatophagoides(npr.Dermatophagoides farinae) ; Felis ( Felis domesticus) ; Ambrosia ( Ambrosia artemisifolia; Lolium(npr.Lolium perenneiliLolium multiflorum) ;

Cryptomeria ( Cryptomeria japonica) ; Alternaria ( Alternaria alternata) ; Alder; Alnus ( Alnus

gultinoasa) ; Betula ( Betula verrucosa) ; Quercus ( Ouercus alba) ; Olea ( Olea europa) ; Artemisia

( Arlemisia vulgaris) ; Plantago(npr.Plantago lanceolata) ; Parietaria(npr.Parietaria officinalisiliParietaria judaica) ; Blattella(npr.Blattella germanica) ; Apis(npr.Apis multiflorum) ; Cupressus(npr.Cupressus sempen/ irens, Cupressus arizonicaiCupressus macrocarpa) ; Juniperus(npr.Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communisiJuniperus ashei) ; Thuya(npr.Thuya orientalis) ; Chamaecyparis(npr.Chamaecyparis obtusa) ; Peripianeta(npr.Periplaneta americana) ; Agropyron(npr.Agropyron repens) ; Secale(npr.Secale cereale) ; Triticum(npr.Triticum aestivum) ; Dactylis(npr.Dactylis glomerata) ; Festuca(npr.Festuca elatior) ; Poa(npr.Poa pratensisiliPoa compressa) ; Avena(npr.Avena sativa) ; Holcus(npr.Holcus lanatus) ; Anthoxanthum(npr.Anthoxanthum odoratum) ; Arrhenatherum(npr.Arrhenatherum elatius) ; Agrostis(npr.Agrostis alba) ; Phleum(npr.Phleum pratense) ; Phalaris(npr.Phaiaris arundinacea) ; Paspalum(npr.Paspaium notatum) ; Sorghum(npr.Sorghum halepensis) ;iBromus(npr.Bromus inermis).

Antigen može biti antigen koji kodira nukleinsko kiselinski vektor ili on ne mora biti kodiran u nukleinsko kiselinskom vektoru. U prvom slučaju nukleinsko kiselinski vektor je primenjen na subjekta i antgen je eksprimiranin vivo.U drugom slučaju antigen se može primeniti direktno na subjekat. Antigen koji nije kodiran u nukleinsko kiselinskom vektoru kao što je ovde korišćeno se odnosi na bilo koji tip antigena koji nije nukleinska kiselina. Na primer, u nekim aspektima pronalaska antigen koji nije kodiran u nukleinsko kiselinskom vektoru je polipetid. Manje modifikacije primarnih amino kiselinskih sekvenci polipeptidnih antigena mogu takođe rezultirati u polipeptidu koji ima značajno istu antigenu aktivnost u poređenju sa nemodifikovanom kopijom polipeptida. Takve modifikacije mogu biti namerne, kao što je slučaj sa mutagenezom usmerenom ka određenom mestu, ili mogu biti spontane. Svi polipeptidi proizvedeni ovim modifikacijama su ovde uključeni sve dok postoji antigenost. P olipeptid može biti, na primer, viralni polipeptid.

Termin značajno prečišćen kao što je ovde korišćeno se odnosi na polipeptid koji je značajno oslobođen od ostalih proteina, lipida, ugljenih hidrata ili ostalih materijala sa kojima je obično povezan. Stručnjak može prečistiti viralne ili bakterijske polipeptide korišćenjem standardnih tehnika za prečišćavanje proteina. Značajno čist polipeptid će često proizvesti jednu glavnu traku na ne-redukujućem poliakrilamidnom gelu. U slučaju delimično glikozilovanih polipeptida ili onih koji imaju nekoliko start (početnih) kodona, može biti nekoliko traka na ne-redukujućem poliakrilamidnom gelu, ali će one formirati određeni obrazac za taj polipeptid. Čistoća viralnog i bakterijskog polipeptida se takođe može odrediti analizom amino-terminalne amino kiselinske sekvence. Ostali tipovi antigena koji nisu kodirani nukleinsko kiselinskim vektorom kao što su polisaharidi, mali molekul, mimetici itd. su opisani u prethodnom tekstu i obuhvaćeni su pronalaskom.

Pronalazak takođe koristi polinukleotide koji kodiraju antigene polipeptide. Predviđeno je da se antigen može dostaviti subjektu u nukleinsko kiselinskom molekulu koji kodira antigen i to takav antigen koji se mora eksprimiratiin vivo.Takvi antigeni dostavljeni subjektu u nukleinsko kiselinskom vektoru su antigeni koje kodira nukleinsko kiselinski vektor. Nukleinska kiselina koja kodira antigen je operativno povezana sa sekvencom za ekspresiju gena koja upravlja ekspresijom nukleinske kiseline antigena unutar eukariotske ćelije. Sekvenca za ekspresiju gena je bilo koja regulatorna nukleotidna sekveca, kao što je promotor sekvenca ili kombinacija promotor-pojačivač, koja olakšava efikasnu transkripciju i translaciju nukleinske kiseline antigena za koju je operativno povezana. Sekvenca za gensku ekspresiju može, na primer, biti sisarski ili viralni promotor, kao što je konstitutivni ili inducibilni promotor. Konstitutivni sisarski promotori obuhvataju, ali nisu ograničeni na, promotore za sledeće gene: hipoksantin fosforibozil transferaza (HPTR), adenozin deaminaza, piruvat kinaza, b-aktin promotor i ostali konstitutivni promotori. Primeri viralnih promotora koji konstitutivno funkcionišu u eukariotskim ćelijama obuhvataju , na primer, promotore iz citomegalovirusa (CMV), simian virusa (npr., SV40), papiloma virusa, adenovirusa, HIV viusa, virusa Rous sarkoma, citomegalovirusa, dugačkih terminalnih ponovaka (LTR) Molonev leukemija virusa i ostalih retrovirusa i promotor timidin kinaze herpes simpleks virusa. Ostali konstitutivni promotori su poznati stručnjacima. Promotori korisni kao sekvence za gensku ekspresiju pronalaska takođe obuhvataju inducibilne promotore. Inducibilni promotori se eksprimiraju u prisustvu indukujućeg agensa. Na primer, metalotionein promotor je indukovan da potpomogne transkripciju i translaciju u prisustvu izvesnih metalnih jona. Ostali inducibilni promotori su poznati stručnjacima.

Uopšteno, sekvenca za gensku ekspresiju će obuhvatati, kao neophodne, 5' ne - transkribujuće i 5' ne-translacione sekvence uključene u započinjanje transkripcije i translacije, respektivno, kao što je TATA deo, "capping" sekvenca, CAAT sekvenca i tome slično. Posebno, takve 5' ne-transkribujuće sekvence će obuhvatati region promotora koji obuhvata promotorsku sekvencu za transkripcionu kontrolu operativno spojene nukleinske kiseline antigena. Sekvence za gensku ekspresiju opciono sadrže pojačivačke sekvence ili uzvodne sekvence aktivatore ukoliko je poželjno.

Nukleinska kiselina antigena je operativno povezana za sekvencu za gensku ekspresiju. Kao što je ovde korišćeno, kaže se da su nukleinsko kiselinska sekvenca antigena i sekvenca za gensku ekspresiju operativno povezani kada su kovalentno vezani na takav način da stave ekspresiju ili transkripciju i/ili translaciju sekvence koja kodira antigen pod uticaj ili kontrolu sekvence za gensku ekspresiju. Kaže se da su dve DNK sekvence operativno povezane ako indukcija promotora u 5' sekvenci za gensku ekspresiju rezultira u transkripciji sekvence antigena i ako priroda veze između dve DNK sekvence ne (1) rezultira u uvođenju mutacije koja se karakteriše pomeranjem okvira čitanja, (2) utiče na sposobnost promotorskog regiona da usmeri transkripciju sekvence antigena, ili (3) utiče na sposobnost odgovarajućeg RN K transkripta da se translatira u protein. Prema tome, sekvenca za gensku ekspresiju bi bila operativno povezana sa nukleinsko kiselinskom sekvencom antigena ako je sekvenca za gensku ekspresiju sposobna da utiče na transkripciju te nukleinsko kiselinske sekvence antigena tako da je dobijeni transkript translatiran u željeni protein ili polipeptid.

Nukleinska kiselina antigena pronalaska se može dostaviti imunom sistemu sama ili zajedno sa vektorom. U svom najširem smislu, vektor je bilo koji nosač koji j e sposoban da olakša prenos nukleinske kiseline antigena do ćelija imunog sistema tako da se antigen može eksprimirati i prikazati na površini imune ćelije. Vektor obično prenosi nukleinsku kiselinu do imunih ćelija sa relativno smanjenom degradacijom u odnosu na stepen degradacije koji bi se dobio u odsustvu vektora. Vektor opciono obuhvata goreopisanu sekvencu za gensku ekspresiju da bi se povećala ekspresija nukleinske kiseline antigena u imunim ćelijama. Uopšteno, vektori korisni u pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničeni na, plazmide, fagemide, viruse, ostale nosače dobijene od viralnih ili bakterijskih izvora kojima se rukuje umetanjem ili inkorporacijom nukleinsko kiselinskih sekvenci antigena. Viralni vektori su poželjan tip vektora i obuhvataju, ali nisu ograničeni na, nuklinsko kiselinske sekvence iz sledećih virusa: retrovirus, kao što je Molonev leukemija virus miševa, Harvev sarkom virus miševa, virus tumora mlečne žlezde miševa, virus Rous sarkoma; adenovirus, adeno -povezani virus; SV40-zip virusa; polioma virusi; Epstein-Barr virusi; papiloma virusi; herpes virus; vakccinia virus; polio virus; i RNK virus kao što je retrovirus. Moguće je lako upotrebiti ostale vektore koji nisu navedeni, ali su poznati u metodologi.

Poželjni viralni vektori su zasnovani na ne-citopatskim virusima eukariota u kojima su ne-esencijalni geni zamenjeni sa genom koji nas interesuje. Ne-citopatski virusi obuhvataju retroviruse, čiji životni ciklus obuhvata reverznu transkripciju genomske viralne RNK u DNK sa naknadnom proviralnom integracijom u ćelijsku DNK domaćina. Retrovirusi su dozvoljeni za ispitivanje genske terapije kod ljudi. Najkorisniji su oni retrovirusi koji imaju defektnu reptikaciju (tj., sposobni za usmeravanje sinteze željenih protenina, ali nesposobni za proizvodnju infektivne partikule). Takvi genetički promenjeni retroviralni ekspresioni vektori se generalno koriste za visoko-efikasnu transdukciju genain vivo.Standardni protokoli za proizvodnju retrovirusa sa defektnom replikacijom (uključujući korake ugradnje egzogenog genetičkog materijala u plazmid, transfekciju ćelijske linije za pakovanje sa plazmidom, proizvodnju rekombinantnih retrovirusa od strane ćelijske linije za pakovanje , sakupljanje viralnih partikula iz medijuma kulture tkiva i infekcija target ćelija sa viralnim partikulama) su dati u Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratorv Manual W. H. Freeman C. O., New York (1990) and Murrv, E. J. Methods in Molecular Biologv, vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersev

(1991).

Poželjan virus za izvesne primene je adeno-povezani virus, virus sa dvostrukim lancem DNK. Adeno-povezani virus se može konstruisati tako da ima defektnu replikaciju i da je sposoban da inficira veliki broj različitih ćelijskih tipova i vrsta. Ovaj virus, nadalje, ima prednosti kao što su, stabilnost u odnosu na toplotu i lipidni rastavarač; velika učestalost transdukcije u ćelijama različitog porekla, uključujući hematopoetične ćelije; i nedostatak inhibicije superinfekcije čime se dozvoljavaju višestruke serije transdukcija. Prema podacima, adeno-povezani virus se može ugraditi u ćelijsku DNK čoveka na način koji je specifičan za mesto, čime se minimizuje mogućnost insercione mutageneze i varijabilnost karakteristika ekspresije gena umetnutog retroviralnom infekcijom. Dodatno, adeno-povezane virusne infekcije divljeg tipa su praćene u kulturi tkiva za više od 100 prolaza u odsustvu selekcionih pritisaka, ukazujući na to da je genomska integracija adeno-povezanog virusa relativno stabilan događaj. Adeno-povezani virus može takođe funkcionisati na ekstrahromozomalni način.

Ostali vektori obuhvataju plazmidne vektore. Plazmidni vektori su široko opisani u tehnici i dobro su poznati stručnjacima. Pogledati npr., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1989. U poslednjih nekoliko godina, nađeno ja da su plazmidni vektori posebno pogodni za ubacivanje gena u ćelijein vivozbog njihove nesposobnosti da se repliciraju unutar i integrišu u genom domaćina. Ovi plazmidi, međutim, usled posedovanja promotora kompatibilanog sa ćelijom domaćina, mogu da eksprimiraju peptid od gena koji je operativno kodiran unutar plazmida. Neki često korišćeni plazmidi obuhvataju pBR322, pU18, pU1 9, pRC/CMV, SV40 i pBlueScript. Ostali plazmidi su dobro poznati stručnjacima. Dodatno, plazmidi mogu biti različito projektovani korišćenjem restrikcionih enzima i reakcija ligacije da bi se dodali i uklonili specifični fragmenti

DNK.

Nedavno je otkriveno da se plazmidi koji nose gene mogu dostaviti imunom sistemu korišćenjem bakterija. Modifikovani oblici bakterija kao što jeSalmonellase mogu tra nsinficirati sa plazmidom i upotrebiti kao nosači za dostavljanje. Bakterijski nosači za dostavljenje se mogu primeniti na domaćinski subjekat oralno ili pomoću drugih sredstava primene. Bakterija dostavlja plazmid imunim ćelijama, npr. B ćelijama, dendritskim ćelijama, verovatno prelaženjem kroz crevnu barijeru. Visoki nivoi imune zaštite su postignuti korišćenjem ove metodologije. Takvi postupci dostavljanja su korisni za aspekte pronalaska koji koriste sistemsko dostavljanje antigena, imnuostimulatornu nukleinsku kiselinu i/ili ostale terapeutske agense.

Prema tome, imunostimulatorne nukleinske kiseline su korisne kao adjuvanti vakcine. Ranije je ustanovljeno da su CpG oligonukleotidi odlični adjuvanti vakcine. Takođe je pokazano, međutim, da CpG ODN koji su superiorni adjuvanti vakcine kod miševa nisu poželjni adjuvanti kod ne-glodarskih životinja. Da bi se identifikovale najbolje imunostimulatorne nukleinske kiseline za korišćenje kao adjuvant vakcine kod ljudi i kod ostalih ne-glodarskih životinja, sproveden jein vivoskrining različitih nukleinskih kiselina. Nekolikoin vitroanaliza je procenjivano sa miševima u odnosu na njihovu predviđenu vrednost aktivnosti adjuvanta in vivo kod miševa. Tokom trajanja studije, identifikovan jein vitrotest koji predviđain vivoefiksnost. Otkriveno je, unekoliko iznenađujuće, da je aktivacija i B ćelija i NK ćelija u izraženoj korelaciji sa sposobnošću imunostimulatorne nukleinske kiseline da pojačain vivoimuni odgovor na antigen.

Dobra predviđena vrednost aktivacije B ćelija za aktivnost adjuvantain vivovakcine je najverovatnije povezana sa centralnom ulogom B ćelija u uspostavljanju specifičnog imunog odgovora. Poliklonalna proliferacija B ćelija (indukovana imunostimulatornim nukleinskim kiselinama) povećava verovatnoću podudaranja antigen specifičnih B ćelija/T pomoćnih ćelija. Dalje, povećana ekspresija ko-stimulatornog molekula CD86 na poliklonalno raširene B ćelije aktivira antigen specifične T pomoćne ćelije. B ćelije takođe povećavaju njihovu CD40 ekspresiju kao odgovor na imunostimulatorne nukleinske kiseline povećavajući sposobnost CD40L eksprimirajućih aktiviranih T pomoćnih ćelija da stimulišu B ćelije. Povećana sinteza ICAM-1 na B ćelijama olakšava kontakt ćelija-ćelija. Prema tome, aktivacioni status poliklonalnih B ćelija igra kritičnu ulogu tokom iniciranja specifičnog odgovora antitela.

Doprinos aktivnosti NK ćelija za uspostavljanje specifičnih antitela je bilo, međutim, iznenađujuće. NK ćelije su deo urođenog imunog sistema i kao takve su uključene u prvu liniju odbrane protiv patogena. Najverovatnije je citokin obrazac proizveden od strane NK ćelija nakon aktivacije blisko povezan sa iniciranjem specifičnog imunog odgovora. Prema tome, u jednom aspektu pronalazak se odnosi na postupak za identifikaciju adjuvanta, otkrivanjem aktivacije NK ćelija. Analiza aktivacije NK ćelija se može izvesti kao što je opisano u Primerima u daljem tekstu ili korišćenjem ostalih poznatih analiza aktivnosti NK ćelija. Poželjno je, međutim da se koristi mešana populacija ćelija kao što su PBMC zbog verovatnoće da je aktivacija NK ćelija indirektan rezultat. Analiza je korisnija za identifikovanje imunostimulatornih nukleinskih kiselina koje su korisne kao adjuvanti kod čoveka i kod ne-glodarskih životinja.

Citokin indukcija je takođe identifikovana kao važna u predviđanjuin vivoaktivnosti adjuvanta. S obzirom da je osetljivost na endotoksin primarnog monocita 2 log viša kod čoveka nego kod miša, potreban je izvestan oprez da bi se izbegla kontaminacija imunostimulatornih nukleinskih kiselina upotrebljenih za testiranje endotoksinom u humanom sistemu (Hartmann G., and Krieg A. M. 1999.Gene Therapy6:893). S obzirom da TNF-a, IL-6 i IL-12 proizvode humani monociti kao odgovor i na čak male količine endotoksina, njihova vrednost je ograničena za visoku proizvodnju uin vitroskrining analizama. Sa druge strane, humane B ćelije i NK ćelije pokazuju samo neznatnu aktivaciju endotoksinom pa su prema tome mnogo korisnije u testiranju za imunostimulatorsku aktivnost.

Stimulacija ćelijske funkcije bilo u NK ili B ćelijama (tj., litička aktivnost, proliferacija) zahteva jaču imunostimulatorsku nukleinsku kiselinu nego indukcija aktivacionih markera na njihovoj površini (CD69, CD86). Za oba tipa ćelija, upotreba aktivacionih markera ćelijske površine je pokazala veću nespecifičnost koja se može pripisati fosforotioatnom osnovnom lancu u poređenju sa funkcionalnim analizama. Ova visoka osetljivost površinskih markera zahteva upotrebu niskih koncentracija imunostimulatorne nukleinske kiseline za optimalno razlikovanje imunostimulatornih nukleinskih kiselina sličnog dejstva. Prema tome, upotreba površinskih markera dozvoljava upoređivanje imunostimulatornih nukleinskih kiselina slabog dejstva, dok su funkcionalne analize poželjne za upoređivanje imunostimulatornih nukleinskih kiselina visokog dejstva. Trebalo bi naglasiti da se optimalne koncentracije imunostimulatornih nukleinskih kiselina za stimulisanje B ćelija i NK ćelija razlikuju. Dok je 0.6 ^ig/ml ODN već maksimalan za stimulisanje B ćelija, optimalna aktivacija NK ćelija može zahtevati 6 ug/ml ODN. Aktivacija B ćelija i funkcionalna aktivnost NK ćelija su mereni unutar sveže izolovanih PBMC. Prethodno je nađeno da se visoko prečišćene humane primarne B ćelije mogu aktivirati sa CpG DNK. Postojanje direktnog efekta CpG DNK na NK ćelije je manje jasno, a sekundarni mehanizam posredovan drugim ćelijskim tipom unutar PBMC može doprineti CpG-indukovanoj funkcionalnoj aktivnosti NK ćelija.

Nukleinske kiseline pronalaska se mogu primeniti na subjekta sa anti-mikrobijalnim agensom. Anti-mikrobijalni agens, kao što se ovde koristi, se odnosi na jedinjenje koje se javlja u prirodi ili sintetičko jedinjenje koje je sposobno da ubija ili inhibira infektivne organizme. Tip anti-mikrobijalnog agensa koji se može koristiti na osnovu pronalaska će zavisiti od tipa mikroorganizma sa kojim je subjekat inficiran ili postoji rizik da bude njime inficiran. Anti-mikrobijalni agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na anti -bakterijske agense, anti-viralne agense, anti-gljivične agense i anti-parazitske agense. Izrazi kao što su "anti-infektivan agens", "anti-bakterijski agens", "anti-viralni agens", "anti-gljivični agens", "anti-parazitski agens" i "paraziticid" imaju jasna značenja za stručnjake i definisani su u standardnoj medicinskoj literaturi. Ukratko, anti-bakterijski agensi ubijaju ili inhibiraju bakterije, a obuhvataju antibiotike kao i ostala sintetička ili prirodna jedinjenja koja imaju slične funkcije. Antibiotici su molekuli male molekulske težine koje kao sekundarne metabolite proizvode ćelije, kao što su mikroorganizmi. Uopšteno, antibiotici utiču na jednu ili više bakterijskih funkcija ili struktura koje su specifične za mikroorganizam i koje nisu prisutne kod ćelija domaćina. Anti -viralni agensi se mogu izolovati iz prirodnih izvora ili se mogu sintetisati i korisni su za ubijanje ili inhibiranje virusa. Anti-gljivični agensi se koriste za lečenje gljivičnih infekcija kao i oportunih i primarnih sistemskih gljivičnih infekcija. Anti-parazitski agensi ubijaju ili inhibiraju parazite.

Primeri anti-parazitskih agenasa, takođe označenih kao paraziticidi, koji su korisni za primenu na ljude obuhvataju, ali nisu ograničeni na albendazol, amfotericin B, benznidazol, bitionol, hlorohin HCI, hlorohin fosfat, klindamicin, dehidroemetin, dietilkarbamazin, diloksanid furoat, eflornitin, furazolidaon, glukokortikoidi, halofantrin, jodohinol, ivermektin, mebendazol, meflohin, meglumin antimoniat, melarsoprol, metrifonat, metronidazol, niklozamid, nifurtimoks, oksamnihin, paromomicin, pentamidin izetionat, piperazin, prazikvantel, primahin fosfat, proguanil, pirantel pamoat, pirimetanminsulfamidi, pirimetanmin-sulfadoksin, hinakrin HCI, hinin sulfat, hinidin glukonat, spiramicin, stiboglukonatnatrijum (natrijumantimoniglukonat), suramin, tetraciklin, doksiciklin, tiabendazol, tinidazol, trimetroprim-sulfametoksazol i triparzamid od kojih se neki koriste sami ili u kombinaciji sa drugima.

Paraziticidi upotrebljeni kod ne-humanih subjekata obuhvataju piperazin, dietilkarbamazin, tiabendazol, fenbendazol, albendazol, oksfendazol, oksibendazol, febantel, levamizol, pirantel pamoat, dihlorvos, ivermektin, doramektik, milbemicin oksim, iprinomektin, moksidektin, N-butil hlorid, toluen, higromicin B tiacetarsemidnatrijum, melarzomin, prazikvantel, epsiprantel, benzimidazoli kao što su fenbendazol, albendazol, oksfendazol, klorsulon, albendazol, amprolijum; dekohinat, lazalocid, monensin sulfadimetoksin; sulfmetazin, sulfahinoksalin, metronidazoi.

Paraziticidi korišćeni kod konja obuhvataju mebendazol, oksfendazol, febantel, pirantel , dihlorvos, trihlorfon, ivermektin, piperazin; za S.ivesferi:ivermektin, benzimidazoli kao što su tiabendazol, kambendazol, oksibendazol i fenbendazol. Korisni paraziticidi kod pasa obuhvataju milbemicin oksin, ivermektin, pirantel pamoat i kombinaciju ivermektina i pirantela. Lečenje parazita kod svinje može obuhvatati upotrebu levamizola, piperazina, pirantela, tiabendazola, dihlorvosa i fenbendazola. Kod ovaca i koza antihelmintski agensi obuhvataju levamizol ili ivermektin. Kaparsolat je pokazao izvesnu efikasnost kod lečenjaD. Immitis(srčani crv) kod mačaka.

Antibakterijski agensi ubijaju ili inhibiraju rast ili funkciju bakterija. Velika klasa antibakterijskih agenasa su antibiotici. Antibiotici, koji su efikasni u ubijanju ili inhibiranju velikog broja bakterija, označavaju se kao antibiotici širokog spektra. Ostali tipovi antibiotika su pretežno efikasni protiv klase gram-pozitivnih ili gram- negativnih bakterija. Ovi tipovi antibiotika se označavaju kao antibiotici uskog spektra. Ostali antibiotici koji su efikasni protiv pojedinačnog organizma ili bolesti, a nisu efikasni protiv ostalih tipova bakterija, označavaju se kao antibiotici ograničenog spektra. Antibakterijski agensi su nekad klasifikovani na osnovu njihovog primarnog načina delovanja. Uopšteno, antibakterijski agensi su inhibitori sinteze ćelijskog zida, inhibitori ćelijske membrane, inhibitori sinteze proteina, inhibitori sinteze nukleinskih kiselina ili funkcionalni inhibitori i kompetitivni inhibitori.

Anti-bakterijski agensi koji se mogu koristiti u pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničeni na prirodne peniciline, polu-sintetičke peniciline, klavulansku kiselinu, cefalosporine, bacitracin, ampicilin, karbenicilin, oksacilin, azlocilin, mezlocilin, piperacilin, meticilin, dikloksacilin, nafcilin, cefalotin, cefapirin, cefaleksin, cefamandol, cefaklor, cefazolin, cefuroksin, cefoksitin, cefotaksim, cefsulodin, cefetamet, cefiksim, ceftriakson, cefoperazon, ceftazidin, moksalaktam, karbapenemi, imipenemi, monobaktemi, euztreonam, vankomicin, polimiksin, amfotericin B, nistatin, imidazoli, klotrimazol, mikonazol, ketokonazol, itrakonazol, flukonazol, rifampini, etambutol, tetraciklini, hloramfenikol, makrolidi, aminoglikozidi, streptomicin, kanamicin, tobramicin, amikacin, gentamicin, tetraciklin, minociklin, doksiciklin, hlortetraciklin, eritromicin, roksitromicin, klaritromicin, oleandomicin, azitromicin, hloramfenikol, hinoloni, ko-trimoksazol, norfloksacin, ciprofloksacin, enoksacin, nalidiksična kiselina, temafloksacin, sulfamidi, gantrisin i trimetoprim; Acedapsone ; Acetosulfone Sodium; Alamecin; Alexidine; Amdinocillin; Amdinocillin, Pivoxil; Amicvcline; Amifloxacin; Amifloxacin Mesylate; Amikacin; Amikacin Sulfate; Aminosalicvlic acid; Aminosalicylate sodium; Amoxicillin; Amphomycin; Ampicillin; Ampicillin Sodium; Apalcillin Sodium; Apramycin; Aspartocin; Astromicin Sulfate; Avilamycin; Avoparcin; Azithromycin; Azlocillin; Azlocillin Sodium; Bacampicillin Hydrochloride; Bacitracin; Bacitracin Methylene Disalicylate; Bacitracin Zine; Bambermycins; Benzoylpas Calcium; Berythromycin ; Betamicin Sulfate; Biapenem; Biniramycin; Biphenamine Hydrochloride ; Bispyrithione Magsulfex ; Butikacin; Butirosin Sulfate; Capreomycin Sulfate; Carbadox; Carbenicillin Disodium; Carbenicillin Indanvl Sodium; Carbenicillin Phenyl Sodium; Carbenicillin Potassium; Carumonam Sodium; Cefaclor; Cefadroxil; Cefamandole; Cefamandole Nafate; Cefamandole Sodium; Cefaparole; Cefatrizine; Cefazaflur Sodium; Cefazolin; Cefazolin Sodium; Cefbuperazone; Cefdinir; Cefepime; Cefepime Hvdrochloride; Cefetecol; Cefixime; Cefmenoxime Hydrochloride; Cefmetazole; Cefmetazole Sodium; Cefonicid Monosodium; Cefonicid Sodium; Cefoperazone Sodium; Ceforanide; Cefotaxime Sodium; Cefotetan; Cefotetan Disodium; Cefotiam Hydrochloride; Cefoxitin; Cefoxitin Sodium; Cefpimizole; Cefpimizole Sodium; Cefpiramide; Cefpiramide Sodium; Cefpirome Sulfate; Cefpodoxime Proxetil; Cefprozil; Cefroxadine; Cefsulodin Sodium; Ceftazidime; Ceftibuten; Ceftizoxime Sodium; Ceftriaxone Sodium; Cefuroxime; Cefuroxime Axetil; Cefuroxime Pivoxetil; Cefuroxime Sodium; Cephacetrile Sodium; Cephalexin; Cephalexin Hydrochloride; Cephaloglycin; Cephaloridine; Cephalothin Sodium; Cephapirin Sodium; Cephradine; Cetocycline Hydrochloride; Cetophenicol; Chloramphenicol; Chloramphenicol Palmitate ; Chloramphenicol Pantothenate Complex; Chloramphenicol Sodium Succinate; Chlorhexidine Phosphanilate; Chloroxylenol; Chlortetracycline Bisulfate; Chlortetracycline Hydrochloride; Cinoxacin;Ciprofloxacin; Ciprofloxacin Hydrochloride; Cirolemycin ; Clarithromycin; Clinafloxacin Hydrochloride; Clindamycin; Clindamycin Hydrochloride; ClindamycinPalmitate Hydrochloride; Clindamycin Phosphate; Clofazimine ; Cloxacillin Benzathine; Cloxacillin Sodium; Cloxyquin; Colistimethate Sodium; Colistin Sulfate; Coumermycin;Coumermycin Sodium; Cyclacillin; Cvcloserine; Dalfopristin; Dapsone ; Daptomycin;Demeclocycline; Demec!ocycline HydrochIoride; Demecycline; Denofungin ;Diaveridine; Dicloxacillin; DicIoxacillin Sodium; Dihydrostreptomycin Suifate; Dipyrithione; Dirithromycin; Doxycycline; Doxycycline Calcium; Doxycycline Fosfatex; DoxycycIine Hyclate; Droxacin Sodium; Enoxacin; Epicillin; Epitetracyciine Hydrochloride; Erythromycin; Erythromycin Acistrate; Erythromycin Estolate;Erythromyciri Ethylsuccinate; Erythromycin Gluceptate; Erythromycin Lactobionate; Erythromycin Propionate; Erythromycin Stearate; Ethambutol Hydrochloride; Ethionamide; Fleroxacin; Floxacillin; Fludalanine; Flumequine; Fosfomycin; Fosfomycin Tromethamine; Fumoxicillin; Furazolium Chloride; Furazolium Tartrate; Fusidate Sodium; Fusidic Acid; Gentamicin Sulfate; Gloximonam; Gramicidin; Haloprogin; Hetacillin; Hetacillin Potassium; Hexedine; lbafloxacin; Imipenem; Isoconazole; Isepamicin; Isoniazid; Josamycin; Kanamycin Sulfate; Kitasamycin; Levofuraltadone; Levopropylcillin Potassium; Lexithromycin; Lincomycin; Lincomycin Hydrochloride; Lomefloxacin; Lomefloxacin Hydrochloride; Lomefloxacin Mesylate; Loracarbef; Mafenide; Meclocvcline; Meclocycline Sulfosalicylate; Megalomicin Potassium Phosphate; Mequidox; Meropenem; Methacycline; MethacyclineHydrochloride; Methenamine; Methenamine Hippurate; Methenamine Mandelate;Methicillin Sodium; Metioprim; Metronidazole Hydrochloride; Metronidazole Phosphate; Mezlocillin; Mezlocillin Sodium; Minocycline; Minocvcline Hydrochloride; Mirincamycin Hydrochloride ; Monensin ; Monensin Sodium ; Nafcillin Sodium; Nalidixate Sodium; Nalidixic Acid; Natamycin; Nebramycin; Neomycin Palmitate; Neomvcin Sulfate; Neomycin Undecylenate ; Netilmicin Sulfate; Neutramvcin; Nifuradene; Nifuraldezone; Nifuratel ; Nifuratrone; Nifurdazil; Nifurimide; Nifurpirinol; Nifurquinazol; Nifurthiazole; Nitrocycline; Nitrofurantoin; Nitromide; Norfloxacin;Novobiocin Sodium; Ofloxacin; Ormetoprim; Oxacillin Sodium; Oximonam; Oximonam Sodium; Oxolinic Acid; Oxytetracycline; Oxytetracycline Calcium; Oxytetracycline Hydrochloride; Paldimycin; Parachlorophenol; Paulomycin; Pefloxacin; Pefloxacin Mesylate; Penamecillin; Penicillin G Benzathine; Penicillin G Potassium; Penicillin G Procaine; Penicillin G Sodium; Penicillin V; Penicillin V Benzathine; Penicillin V Hydrabamine; Penicillin V Potassium; Pentizidone Sodium; Phenyl Aminosalicvlate; Piperacillin Sodium; Pirbenicillin Sodium; Piridicillin Sodium; Pirlimvcin Hydrochloride; Pivampicillin Hydrochloride; Pivampicillin Pamoate; Pivampicillin Probenate; Polymyxin B Sulfate; Porfiromvcin ; Propikacin; Pyrazinamide; Pyrithione Zine; Quindecamine Acetate; Ouinupristin; Racephenicol; Ramoplanin; Ranimycin; Relomycin; Repromicin; Rifabutin; Rifametane; Rifamexil; Rifamide; Rifampin; Rifapentine; Rifaximin; Rolitetracycline; Rolitetracycline Nitrate; Rosaramicin; Rosaramicin Butyrate; Rosaramicin Propionate; Rosaramicin Sodium Phosphate; Rosaramicin Stearate; Rosoxacin; Roxarsone; Roxithromycin; Sancvcline; Sanfetrinem Sodium; Sarmoxicillin; Sarpiciilin; Scopafungin ; Sisomicin; Sisomicin Sulfate; Sparfloxacin; Spectinornycin Hydrochloride; Spiramycin; Stallimycin Hydrochloride; Steffimycin; Streptomycin Sulfate; Streptonicozid; Sulfabenz ; Sulfabenzamide; Sulfacetamide; Sulfacetamide Sodium; Sulfacytine; Sulfadiazine; Sulfadiazine Sodium; Sulfadoxine; Sulfalene; Sulfamerazine; Sulfameter; Sulfamethazine; Sulfamethizole; Sulfamethoxazole; Sulfamonomethoxine; Sulfamoxole; Sulfanilate Zine; Sulfanitran ; Sulfasalazine; Sulfasomizole; Sulfathiazole; Sulfazamet; Sulfisoxazole; Sulfisoxazole Acetyl; Sulfisoxazole Diolamine; Sulfomyxin; Sulopenem; Sultamicillin; Suncillin Sodium; Talampicillin Hydrochloride; Teicoplanin; Temafloxacin HydrochIoride; Temocillin; Tetracycline; Tetracycline Hydrochloride; Tetracycline Phosphate Complex; Tetroxoprim; Thiamphenicol; Thiphencillin Potassium; Ticarcillin Cresyl Sodium; Ticarcillin Disodium; Ticarcillin Monosodium; Ticlatone; Tiodonium Chloride; Tobramycin; Tobramycin Sulfate; Tosufloxacin; Trimethoprim; Trimethoprim Sulfate; Trisulfapyrimidines; Troleandomycin; Trospectomycin Sulfate; Tvrothricin; Vancomycin; Vancomycin Hydrochloride; Virginiamycin; i Zorbamvcin.

Antivirusni agensi su jedinjenja koja sprečavaju infekciju ćelija virusima ili replikacijom virusa unutar ćelije. Postoji mnogo manje antiviralnih lekova od antibakterijskih lekova zbog toga što je proces viralne replikacije blisko vezan za DNK replikaciju unutar ćelije domaćina, te bi stoga ne-specifični antiviralni agensi često bili toksični za domaćina. Postoji nekoliko stupnjeva u procesu viralne infekcije koji se mogu blokirati ili inhibirati antiviralnim agensima. Ovi stadijumi obuhvataju, vezivanje virusa za ćeliju domaćina (imunoglobulin ili vezujući peptidi), oslobađanje virusa od omotača (npr. amantadin), sinteza ili translacija viralne mRNK (npr. interferon), replikacija viralne RNK ili DNK (npr. nukleozidni analozi), sazrevanje novih proteina virusa (npr. inhibitori proteaze) i pupljenje i oslobađanje virusa.

Nukleotidni analozi su sintetička jedinjenja koja su slična nukleotidima, ali koja imaju nekompletnu ili abnormalnu deoksiriboza ili riboza grupu. Kada su nukleotidni analozi nađu u ćeliji, oni se fosforilišu, proizvodeći trifosfatnu formu koja je u kompeticiji sa normalnim nukleotidima za inkorporaciju u viralnu DNK ili RNK. Kada je trifosfatna forma nukleotidnog analoga inkorporisana u rastući lanac nukleinske kiseline, ona uzrokuje ireverzibilno spajanje sa viralnom polimerazom i time dovodi do završetka lanca. Nukleotidni analozi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, aciklovir (korišćen za lečenje herpes simpleks virusa i varičela zoster virusa), ganciklovir (koristan za lečenje citomegalovirusa), idoksuridin, ribavirin (koristan za lečenje respiratornog sincicijalnog virusa), dideoksinozin, dideoksicitidin i zidovudin (azidotimidin).

Interferoni su citokini koje izlučuju ćelije inficirane virusom kao i imune ćelije. Interferoni funkcionišu vezivanjem za specifične receptore na ćelijama koje su su sedne inficiranim ćelijama, uzrokujući pramenu u ćeliji koja je štiti od infekcije virusom, a i p-interferon takođe indukuju ekspresiju Klase I i Klase II MHC molekula na površini inficiranih ćelija, rezultirajući u povećanom prikazivanju antigena za prepoznavanje sa imunim ćelijama domaćina, a i p-interferoni su dostupni kao rekombinantni oblici i korišćeni su za lečenje (ironične infekcije hepatitisa B i C. U dozama koje su efikasne za anti-viralnu terapiju, interferoni imaju snažne neželjene efekte kao što su groznica, slabost i gubitak telesne težine.

Imunoglobulinska terapija je upotrebljavana za prevenciju viralne infekcije. Imunoglobulinska terapija za viralne infekcije se razlikuje od terapije kod bakterijskih infekcija, jer pre nego da je antigen-specifična, imunoglobulinska terapija funkcioniše vezivanjem za ekstraćelijske virione i sprečavanjem da se oni vežu i uđu u ćelije koje su podložne viralnoj infekciji. Terapija je korisna za prevenciju viralne infekcije za vremenski period u kome su prisutna antitela kod domaćina. Uopšteno, postoje dva tipa imunoglobulinskih terapija, normalna imunoglobulinska terapija i hiper-imunoglobulinska terapija. Normalna imunoglobulinska terapija koristi proizvod antitela koji je pripremljen od seruma normalnih davaoca krvi i koji je uskladišten. Ovaj uskladišteni proizvod sadrži niske titre antitela za veliki broj humanih virusa, kao što je hepatitis A, parvovirus, enterovirus (posebno kod novorođenčadi). Hiper-imunoglobulinska terapija koristi antitela koja su pripremljena iz seruma pojedinaca koji imaju visoke titre antitela na određeni virus. Ta antitela su zatim upotrebljena protiv specifičnog virusa. Primeri hiper-imunoglobulina obuhvataju zoster imunoglobulin (koristan za prevenciju varičele kod dece i novorođenčadi sa narušenim imunim sistemom), imunoglobulin besnila čoveka (koristan u profilaksi subjekta koga je ugrizla pobesnela životinja), imunoglobulin hepatitisa B (koristan u prevenciji virusa hepatitisa B, posebno kod subjekta koji je izložen virusu) i RSV imunoglobulin (koristan u lečenju infekcija respiratornim sincicijelnim virusom).

Sledeći tip imunoglobulinske terapije je aktivna imunizacija. Ovo obuhvata primenu antitela ili fragmenata antitela na proteine površine virusa. Dva tipa vakcina koje su dostupne za aktivnu imunizaciju heptitisa B obuhvataju serum-izvedena antitela hepatitisa B i rekombinantna antitela hepatitisa B. Oba su pripremljena od HbsAg. Antitela su primenjena u tri doze na subjekta koji je pod visokim rizikom od infekcije virusom heptitisa B, kao što su zdravstveni radnici, seksualni partneri hroničnih nosioca i deca.

Prema tome, antiviralni agensi korisni u pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničeni na imunoglobuline, amantadine, interferon, nukleozidne analoge i inhibitore proteaze. Specifični primeri antiviralni agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na Acemannan; Acvclovir; Acvclovir Sodium; Adefovir; Alovudine; Alvicept Sudotoks; Amantadine Hvdrochloride; Aranotin; Arildone; Ateviridine Mesvlat; Avridine; Cidofovir; Cipamfylline; Cvtarabine Hydrochloride; Delaviridine Mesylate; Desciclovir; Didanosine; Disoxaril; Edoxudine; Enviradene; Enviroxime; Famciclovir; Famotine Hvdrochloride; Fiacitabine; Fialuridine; Fosarilate; Foscamet Sodium; Fosfonet Sodium; Ganciclovir; Ganciclovir Sodium; ldoxuridine; Kethoxal; Lamivudine; Lobucavir; Memotine Hydrochloride; Methisazone; Nevirapine; Penciclovir; Pirodavir; Ribavirin; Rimantadine Hydrochloride; Saquinavir Mesylate; Somantadine Hydrochloride; Sorivudine; Statolon; Stavudine; Tilorone Hvdrochloride; Trifluridine; Valacvclovir Hvdrochloride; Vidarabine; Vidarabine Phosphate; Vidarabine Sodiium Phosphate; Viroxime; Zalcitabine; Zidovudine; i Zinviroxime.

Anti-gljivični agensi su korisni za lečenje i prevenciju infekcije gljivicama. Anti-gljivični agensi su ponekad kalsifikovani na osnovu mehanizma njihovog delovanja. Neki anti-gljivični agensi funkcionišu kao inhibitori ćelijskog zida inhibiranjem glukoza sintaze. Oni obuhvataju , ali nisu ograničeni na, basiungin/ECB. Ostali anti-gljivični agensi funkcionišu tako što destabilizuju integritet membrane. Ovi agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, imidazole, kao što su klotrimazol, sertakonzol, flukonazol, itrakonazol, ketokonazol, mikonazol i vorikonazol, kao i FK 463, amfotericin B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicin, UK 292, butenafin i terbinafin. Ostali anti-gljivični agensi funkcionišu razlaganjem hitina (npr. hitinaza) ili imunosupresijom (501 krema). Neki primeri komercijalno-dostupnih agenasa su prikazani u Tabeli B

Prema tome, anti-gljivični agensi koji mogu biti korisni u pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničeni na imidazole, FK 463, amfotericin B, BAY 38 -9502, MK 991, pradimicin, UK 292, butenafin, hitinazu, 501 kremu, Acrisorcin; Ambruticin; Amorolfine; Amphotericin B; Azaconazole; Azaserine; Basifungin; Bifonazole; Biphenamine Hvdrochloride; Bispvrithione Magsulfex; Butoconazole Nitrate; Calcium Undecvlenate; Candicidin; Carbol-Fuchsin; Chlorđantoin; Ciclopirox; Ciclopirox Olamine; Cilofungin; Cisconazole; Clotrimazole; Cuprimyxin; Denofungin; Dipyrithione; Doconazole; Econazole; Econazole Nitrate; Enilconazole; Ethonam Nitrate; Fenticonazole Nitrate; Filipin; Fluconazole; Flucvtosine; Fungimvcin; Griseofulvin; Hamvcin; Isoconazole; Itraconazole; Kalafungin; Ketoconazole; Lomofungin; Lvmicidin; Mepartricin; Miconazole; Miconazole Nitrate; Monensin; Monensin Sodium; Naftifine Hvdrochloride; Neomvcin Undecylenate; Nifuratel; Nifurmerone; Nitralamine Hydrochloride; Nystatin; Octanoic Acid; Orconazole Nitrate; Oxiconazole Nitrate; Oxifungin Hxdrochloride; Parconazole Hydrochloride; Partricin; Potassium lodide; Proclonol; Pyrithione Zine; Pyrrolnitrin; Rutamvcin; Sanguinarium Chloride; Saperconazole; Scopafungin; Selenium Sulfide; Sinefungin; Sulconazole Nitrate; Terbinafine; Terconazole; Thiram; Ticlatone; Tioconazole; Tolciclate; Tolindate; Tolnaftate; Triacetin; Triafungin; Undecylenic Acid; Virdofulvin; Zine Undecylenate; i Yinoconazole Hydrochloride.

Imunostimulatorne nukleinske kiseline se mogu kombinovati sa ostalim terapeutskim agensima kao što su adjuvanti da bi se pojačali imuni odgovori. Imunostimulatorska nukleinska kiselina i ostali terapeutski agensi se mogu primeniti istovremeno ili sekvencijalno. Kada se istovremeno primenjuju drugi terapeutski agensi, mogu se primeniti u istim ili posebniom formulacijama, ali se primenjuju u isto vreme. Ostali terapeutski agensi se primenjuju sekvencijalno jedan u odnosu na drugi i u odnosu na imunostimulatorsku nukleinskom kiselinu, pri čemu je primena drugih terapeutskih agenasa i imunostimulatorne nukleinske kiseline privremeno odvojena. Razlika u vremenu između primene ovih jedinjenja može biti u minutima ili može biti i veća. Ostali terapeutski agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na adjuvante, citokine, antitela, antigene, itd.

Imunostimulatorne nukleinske kiseline su korisne kao adjuvanti za izazivanje sistemskog imunog odgovora. Prema tome bilo koja se može dostaviti subjektu koji je izložen antigenu da bi se proizveo pojačani imuni odgovor na antigen.

Pored imunostimulatornih nukleinskih kiselina, takođe je moguće primeniti kompozicije pronalaska sa adjuvantima koji nisu nukleinske kiseline. Takav adjuvant je bilo koji molekul ili jedinjenje, osim imunostimulatornih nukleinskih kiselina koje su ovde opisane, koji može da stimuliše humoralni i/ili ćelijski imuni odgovor. Ne-nukleinsko kiselinski adjuvanti obuhvataju, na primer, adjuvante koji stvaraju depo efekat, imunostimulirajuće adjuvante i adjuvante koji stvaraju depo efekat i stimulišu imuni sistem.

Adjuvant koji stvara depo efekat kao što se ovde koristi je adjuvant koji izaziva sporo oslobađanje antigena u telu, čime se produžava izloženost imunih ćelija antigenu. Ova klasa adjuvanata obuhvata, ali nije ograničena na stipsu (npr., aluminijumhidroksid, aluminijumfosfat); ili formulacije na bazi emulzija uključujući mineralno ulje, ne-mineralno ulje, emulziju voda-u-ulju ili ulje-u-vodi-u ulju, ulje-u-vodi emulzije kao što je Seppic ISA serije Montanide adjuvanata (npr., Montanide ISA 720, Airl_iquide, Pariš, France); MF-59 (skvalen-u-vodi emulzija stabilizovana sa Span 85 i Tvveen 80; ChironCorporation, Emervville, CA; i PROVAX (ulje-u-vodi emulzija koja sadrži stabilizujući deterdžent i agens koji formira micele; IDEC, Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA).

Imunostimulirajući adjuvant je adjuvant koji izaziva aktivaciju ćelije imunog sistema. On može, na primer, izazvati imunu ćeliju da proizvodi i luči citokine. Ova klasa adjuvanata obuhvata, ali nije ograničena na saponine prečišćene iz kore drveta Q.saponaria,kao što je QS21 (glikolipid koji eluira u 21-om piku HPLC frakcionisanja; Aguila Biopharmaceuticals, Inc., VVorcester, MA); poli[di(karboksi!atofenoksi)fosfazen (PCPP polimer; Virus Research Institute, USA); derivati lipopolisaharida kao što je monofosforil lipid A (MPL; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), muramil dipeptid (MDP; Ribi) i treonil-muramil dipeptid (t-MDP; Ribi); OM-174 (glukozamin disaharid povezan sa lipidom A; OM Pharma SA, Meyrin, Switzeriand); i faktor elongancije Leishmania-e (prečišćeniLeishmaniaprotein; Corixia Corporation, Seattle, WA).

Adjuvanti koji stvaraju depo efekat i stimulišu imuni sistem su ona jedinjenja koja imaju obe od goreidentifikovanih funkcija. Ova klasa adjuvanata obuhvata, ali nije ograničena na ISCOMS (Imunostimulirajući kompleksi koji sadrže mešane saponine, lipide i formiraju partikule veličine virusa sa porama koje mogu da zadrže antigen; CSL, Melbourne, Australia); SB-AS2 (SmithKIine Beecham adjuvant svstem #2 koji je ulje-u-vodi emulzija koja sadrži MPL i QS21: SmithKIine Beecham Biologicals [SBB], Rixensart, Belgium); SB-AS4 (SmithKIine Beecham adjuvant System #4 koji sadrži stipsu i MPL; SBB, Belgium); ne-jonski blok kopolimeri koji formiraju micele kao što je CRL 1005 (sadrže linearni lanac hidrofobnog polioksopropilena sa obe strane ograničen sa lancima polioksietilena; Vaxcel, Inc., Norcross, GA); i Syntex Adjuvant Formulation (SAF, ulje-u-vodi emulzija koja sadži Tvveen 80 i nejonski blok koppolimer; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO).

Imunostimulatorne nukleinske kiseline takođe mogu biti korisne kao mukozni adjuvanti. Ranije je otkriveno da i sistemski i mukozni imunitet izaziva mukozno primena CpG nukleinskih kiselina. Sistemski imunitet koji je izazvan kao odgovor na CpG nukleinske kiseline obuhvatao je i humoralni i ćelijski poserdovane odgovore na specifične antigene koji nisu bili sposobni da izazivaju sistemski imunitet kada se nasamo primenjuju na mukozu. Dalje, i CpG nukleinske kiseline i toksin kolere (CT, mukozni adjuvant koji izaziva odgovore slične Th2) su izazvali CTL. Ovo je bilo iznenađujuće s obzirom da je sa sistemskom imunizacijom, prisustvo antitela sličnih Th2 normalno povezano sa nedostatkom CTL (Schirmbecket al.,1995). Na osnovu rezultata koji su ovde dati očekuje se da će imunostimulatorne nukleinske kiseline funkcionisati na sličan način.

Dodatno, imunostimulatorne nukleinske kiseline izazivaju mukozni odgovor i na lokalnim (npr., pluća) i udaljenim (npr., creva) mukoznim mestima. Značajni nivoi IgA antitela su indukovani u udaljenim mukoznim mestima imunostimulatornim nukleinskim kiselinama. CT se generalno smatra visoko efikasnim mukoznim adjuvantom. Kao što je prethodno pokazano (Snider 1995), CT pretežno izaziva IgG 1 izotip antitela, koja su pokazatelj Th2-tipa odgovora. Nasuprot tome, imunostimulatorne nukleinske kiseline su više Th1 sa pretežno lgG2a antitelima, posebno posle naknadne imunizacije ili kada su kombinovana dva adjuvanta.

Generalno, Th-1 tip antitela ima bolju sposobnost neutralizovanja, a i Th2 odgovor u plućima je vrlo nepoželjan zbog toga što je povezan sa astmom (Kay, 1996, Hogg, 1997). Prema tome upotreba imunostimulatornih nukleinskih kiselina kao mukoznih adjuvanata ima prednosti koje ostali mukozni adjuvanti ne mogu ostvariti. Imunostimulatorne nukleinske kiseline pronalaska takođe mogu biti korisne kao mukozni adjuvanti za izazivanje i sistemskog i mukoznog imunog odgovora.

Mukozni adjuvanti koji su označeni kao ne-nukleinsko kiselinski mukozni adjuvanti se takođe mogu primeniti sa imunostimulatomim nukleinskim kiselinama. Ne-nukleinsko kiselinski mukozni adjuvant kao što se ovde koristi je adjuvant koji nije imunostimulatorska nukleinska kiselina, a koji je sposoban da izazove mukozni imuni odgovor kod subjekta kada se primeni na mukoznu površinu zajedno sa antigenom. Mukozni adjuvanti obuhvataju, ali nisu ograničeni na bakterijske toksine npr., toksin kolere (CT), derivati CT koji uključuju, ali nisu ograničeni na B podjedinicu CT (CTB) (VVu et al., 1998, Tochikubo et al., 1998); CTD53 (Val u Asp) (Fontana et al., 1995); CTK97 (Val u Lys) (Fontana et al., 1995); CTK104 (Tyr u Lys) (Fontana et al., 1995); CTD53/K63 (Val u Asp, Ser u Lys) (Fontana et al., 1995); CTH54 (Arg u His) (Fontana et al., 1995); CTN107 (His u Asn) (Fontana et al., 1995); CTE114 (Ser u Glu) (Fontana et al., 1995); CTE112K (Glu u Lys) (Yamamoto et al., 1997a); CTS61F (Ser u Phe) (Yamamoto et al., 1997a, 1997b); CTS106 (Pro u Lys) (Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995); i CTK63 (Ser u Lys)

(Douce et al., 1997, Fontana et al., 1995), toksin izZonula occludens,zot, termolabilni enterotoksinEscherichia coli,labilni toksin (LT), LT derivati uključujući, ali ne ograničavajući se na B podjedinicu LT (LTB) (Verweij et al., 1998); LT7K (Arg u Lys) (Komase et al., 1998, Douce et al., 1995); LT61F (Ser u Phe) (Komase et al., 1998); LTI 12K (Glu u Lys) (Komase et al., 1998); LTI 18E (Gly u Glu) (Komase et al., 1998); LT146E (Arg u Glu) (Komase et al., 1998); LT192G (Arg u Gly) (Komase et al., 1998); LTK63 (Ser u Lys) (Marchetti et al., 1998, Douce et al., 1997, 1998, Di Tommaso et al., 1996); i LTR72 (Ala u Arg) (Giuliani et al., 1998), toksin pertuzisa, PT. (Lycke et al., 1992, Spangler BD, 1992, Freytag and Clemments, 1999, Roberts et al., 1995, VVilson et al., 1995) uključujući PT-9K/129G (Roberts et al., 1995, Cropley et al., 1995) ; derivati toksina (pogledati u daljem tekstu) (Holmgren et al., 1993, Vervveij et al., 1998, Rappuoli et al., 1995, Frevtag and Clements, 1999); derivati Lipida A (npr., monofosforil lipid A, MPL) (Sasaki et al., 1998, Vancott et al., 1998; derivati muramil dipeptida (MDP) (Fukushima et al., 1996, Ogavva et al., 1989, Michalek et al., 1983, Morisaki et al., 1983); proteini spoljašnje membrane bakterija (npr., protein A spoljašnje površine (OspA) lipoproteinBorrelia burgdorferi,protein spoljašnje membraneNeisseria meningitidis)( Mar\ naroet al., 1999, Van de Verg et al., 1996) ; emulzije ulje u vodi (npr., MF59) (Barchfield et al., 1999, Verschoor et al., 1999,

O'Hagan, 1998); soli aluminijuma (lsaka et al., 1998, 1999); i saponini (npr., QS21) Aquila Biopharmaceuticals, Inc., VVorster, MA) (Sasaki et al., 1998, MacNeal et al., 1998), ISCOMS, MF-59 (skvalen-u-vodi emulzija stabilizovana sa Span 85 i Tween 80; Chiron Corporation, Emeryville, CA); Seppic ISA serije montanidnih adjuvanata (npr., Montanide ISA 720; Airl_iquide, Pariš, France); PROVAX (ulje-u-vodi emulzijakoja sadrži stabilizujući deterdžent i agens za formiranje micela; IDEC Pharmaceuticals Corporation, San Diego, CA); Syntext Adjuvant Formulation (SAP; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, CO); poli[di(karboksilatofenoksi)fosfazen (PCPP polimer; Virus Research Institute, USA) i elongacioni faktor izLeishmania(Corixa Corporation, Seattle, WA).

Imuni odgovori se takođe mogu izazvati ili pojačati ko-administracijom ili ko-linearnom ekspresijom citokina (Bueler & Mulligan, 1996; Chowet al.,1997; Geissleret al.,1997; Ivvasakief al.,1997; Kimef al.,1997) ili B-7 ko-stimulatornih molekula (Ivvasakief a/.,1997; Tsujieć al.,1997) sa imunostimulatomim nukleinskim kiselinama. Citokini se mogu primeniti direktno sa imunostimulatomim nukleinskim kiselinama ili se mogu primeniti u obliku nukleinsko kiselinskog vektora koji kodira citokin, kao što je citokin koji se može eksprimiratiin vivo.U jednom obliku, citokin je primenjen u obliku plazmidnog ekpresionog vektora. Termin citokin je upotrebljen kao zajednički naziv za raznoliku grupu rastvorljivih proteina i peptida koji se ponašaju kao humoralni regulatori u nano- do pikomolarnim koncentracijama i koji, pod normalnim ili patološkim uslovima, moduliraju funkcionalne aktivnosti pojedinačnih ćelija i tkiva. Ovi proteini takođe direktno posreduju u interakcijama između ćelija i regulišu procese koji se odvijaju u ekstraćlijskoj sredini. Primeri citokina, obuhvataju, ali nisu ograničeni na IL-1, IL-2, IL -4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15. IL-18, stimulirajući faktor kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), stimulirajući faktor kolonije granulocita (G-CSF), interferoni (y-IFN), IFN-a , faktor tumorske nekroze (TNF), TGF-p, FLT-3 ligand i CD40 ligand.

Citokini igraju ulogu u usmeravanju odgovora T ćelija. Pomoćne (CD4+) T ćelije diriguju imuni odgovor sisara preko proizvodnje rastvorijivih faktora koji deluju na ćelije imunog sistema, uključujući i ostale T ćelije. Najzrelije CD4+ T pomoćne ćelije eksprimiraju jedan ili dva profila citokina: Th1 ili Th2. Th1 podgrupa potpomaže hiperenzitivnost odloženog tipa, ćelijski-posredovan imunitet i promena klase imunoglobulina u lgG2a. Th2 podgrupa izaziva humoralni imunitet aktiviranjem B ćelija, potpomaganjem proizvodnje antitela i izazivanjem promene klase u IgGii IgE. U nekim oblicima, poželjno je da citokin bude Th1 citokin.

Nukleinske kiseline su takođe korisne za preusmeravanje imunog odgovora od Th2 imunog odgovora u Th1 imuni odgovor. Preusmeravanje imunog odgovora od Th2 u Th1 imuni odgovor se može proceniti merenjem nivoa citokina koji su proizvedeni kao odgovor na nukleinsku kiselinu (npr., indukovanjem monocita i ostalih ćelija da proizvode Th1 citokine, uključujući IL-12, IFN-y i GM-CSF). Preusmeravanje ili ponovno uspostavljanje ravnoteže imunog odgovora iz Th2 u Th1 odgovor je posebno korisno za lečenje ili prevenciju astme. Na primer, efikasna količina za lečenje astme može biti ona količina korisna za preusmeravanje Th2 tipa imunog odgovora koji je povezan sa astmom u Th1 tip odgovora. Th2 citokini, posebno IL-4 i IL-5 su povećani u disajnim putevima astmatičnih subjekata. Ovi citokini potpomažu važne aspekte astmatičnog inflamatornog odgovora, uključujući zamenu IgE izotipa, hemotaksiju eozinofila i aktivaciju i rast mastocita. Th1 citokini, posebno IFN-y i IL-12, mogu da suprimiraju formiranje Th2 klonova i proizvodnju Th2 citokina. Imunostimulatorne nukleinske kiseline pronalaska izazivaju povećanje u Th1 citokinima koji pomažu da se ponovo uspostavi ravnoteža imunog sistema, sprečavanjem ili smanjivanjem štetnih efekata povezanih sa pretežno Th2 imunim odgovorom.

Nukleinske kiseline su takođe korisne za poboljšanje preživljavanja, di ferencijacije, aktivacije i sazrevanja dendristkih ćelija. Imunostimulatorne nukleinske kiseline poseduju jedinstvenu sposobnost da potpomažu preživljavanje ćelija, diferencijaciju, aktivaciju i saznavanje dendritskih ćelija. Dendritske prekursorske ćelije izolovane iz krvi pomoću imunomagnetskog sortiranja ćelija razvijaju morfološke i funkcionalne osobine dendritskih ćelija tokom dvodnevnve inkubacije sa GM-CSF. Bez GM-CSF ove ćelije podležu apoptozi. Imunostimulatorne nukleinske kiseline su superirorne u odnosu na GM-CSF u podsticanju preživljavanja i diferencijacije dendritskih ćelija (MHC II ekspresija, veličina ćelija, granuliranost). Imunostimulatorne nukleinske kiseline takođe izazivaju sazrevanje dendritskih ćelija. S obzirom da dendritske ćelije ostvaruju vezu između urođenog i stečenog imunog sistema putem prikazivanja antigena kao i njihovom ekspresijom receptora koji prepoznaju određene strukturne šeme i koji detektuju mikrobijalne molekule kao što je LPS u njihovom lokalnom okruženju, sposobnost aktiviranja dendritskih ćelija sa imunostimulatomim nukleinskim kiselinama podržava korišćenje ovih strategija zasnovanih na imunostimulatomim nukleinskim kiselinama zain vivoi exvivoimunoterapiju protiv poremećaja kao što su kancer i alergijske ili infektivne bolesti. Imunostimulatorne nukleinske kiseline su takođe korisne u aktiviranju i izazivanju sazrevanja dendritskih ćelija.

Imunostimulatorne nukleinske kiseline takođe povećavaju litičku aktivnost ćelija prirodnih ubica i antitelo zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC). ADCC se može izvesti korišćenjem imunostimulatorne nukleinske kiseline zajedno sa antitelom specifičnim za ćelijski target, kao što je kancerozna ćelija. Kada se imunostimulatorne nukleinske kiseline primenjuju na subjekta zajedno sa antitelom, imuni sistem subjekta je izazvan da ubija ćelije tumora. Antitela korisna u ADCC proceduri obuhvataju antitela koja interaguju sa ćelijom u telu. Mnoga takva antitela specifična za ćelijske targete su opisana u praksi i mnoga su komercijalno dostupna. Primeri ovih antitela su nabrojani u daljem tekstu pored spiska imunoterapija za kancer.

Imunostimulatorne nukleinske kiseline se takođe mogu primeniti zajedno sa anti-kancer terapijom. Anti-kancer terapije obuhvataju lekove za kancer, zračenje i hirurčke zahvate. Kao što je ovde korišćeno, "lek za kancer" se odnosi na agens koji je primenjen na subjekta radi lečenja kancera. Kao što je ovde upotrebljeno, "lečenje kancera" obuhvata prevenciju razvoja kancera, umanjivanje simptoma kancera, i/ili inhibiranje rasta postojećeg kancera. U ostalim aspektima, lek za kancer je primenjen na subjekta kod koga postoji rizik od razvoja kancera radi smanjivanja rizika da se razvije kancer. Ovde su opisani različiti tipovi lekova za lečenje kancera. Za potrebe ove specifikacije, lekovi za kancer su klasifikovani kao hemoterapeutski agensi, imnuoterapeutski agensi, vakcine za kancer, hormonska terapija i modifikatori biološkog odgovora.

Kao što je ovde upotrebljeno, "lek za kancer" se odnosi na agens koji je primenjen na subjekta radi lečenja kancera. Kao što je ovde korišćeno, "lečenje kancera" obuhvata prevenciju razvoja kancera, umanjivanje simptoma kancera i/ili inhibiranje rasta postojećeg kancera. U ostalim aspektima, lek za kancer je primenjen na subjekta kod koga postoji rizik od razvoja kancera radi smanjivanja rizika da se razvije kancer. Ovde su opisani različiti tipovi lekova za lečenje kancera. Za potrebe ove specifikacije, lekovi za kancer su klasifikovani kao hemoterapeutski agensi, imnuoterapeutski agensi, vakcine za kancer, hormonska terapija i modifikatori biološkog odgovora. Dodatno, namera je bila da postupci pronalaska obuhvate korišćenje više od jednog leka za kancer zajedno sa imunostimulatomim nukleinskim kiselinama. Kao primer, gde je to odgovarajuće, imunostimulatorne nukleinske kiseline se mogu primeniti i sa hemoterapeutskim agensima i sa imunoterapeutskim agensima. Alternativno, lek za kancer može obuhvatiti imunoterapeutski agens i vakcinu za kancer, ili hemoterapeutski agens i vakcinu za kancer, ili hemoterapeutski agens, imunoterapeutski agens i vakcinu za kancer, pri čemu su svi primenjeni na jednog subjekta radi lečenja subjekta koji ima kancer ili kod koga postoji rizik da se razvije kancer.

Lekovi za kancer funkcionišu na različite načine. Neki lekovi za kancer funkcionišu usmeravanjem na fiziološke mehanizame koji su specifični za ćelije tumora. Primeri obuhvataju targeting specifičnih gena i njihovih genskih proizvoda (tj., primarno proteina) koji su mutirali kod kancera. Takvi gene obuhvataju, ali nisu ograničeni na onkogene (npr., Ras, Her2, bcl-2), tumor supresor gene (npr., EGF, p53, Rb) i targete ćelijskog ciklusa (npr., CDK4, p21, telomeraza). Lekovi za kancer mogu alternativno biti ciljani na puteve provođenja signala i molekularne mehanizme koji su promenjeni u kanceroznim ćelijama. Targeting ćelija kancera preko epitopa eksprimiranih na njihovoj ćelijskoj površini je postignut upotrebom monoklonalnih antitela. Ovaj poslednji tip leka za kancer se ovde uopšteno obeiežava kao imunoterapija.

Drugi lekovi za kancer upotrebljavaju se ciljno na ćelije koje nisu ćelije kancera. Na primer, neki lekovi pripremaju imuni sistem da napadne ćelije tumora (tj., vakcine za kancer). Drugi lekovi, nazvani inhibitori angiogeneze, funkcionišu napadanjem zaliha krvi čvrstih tumora. S obzirom da je većina malugnih kancera sposobna da metastazira (tj., postoji primarno mesto tumora, a rasejava se na distalno tkivo čime se formira sekundarni tumor), lekovi koji sprečavaju ovu metastazu su takođe korisni u lečenju kancera. Angiogeni medijatori obuhvataju osnovne FGF, VEGF, angiopoetine, angiostatin, endostatin, TNFa, TNP-470, trombospondin-1, faktor 4 krvnih pločica, CAI i izvesne članove integrin familije proteina. Jedna kategorija ovog tipa lekova je inhibitor metaloproteinaze, koji inhibira enzime koje koriste ćelije kancera da bi izašle iz primarnog mesta tumora i premestile se u drugo tkivo.

Neke ćelije kancera su antigene i prema tome se mogu ciljati imunim sistemom. U jednom aspektu, kombinovana primena imunostimulatornih nukleinskih kiselina i lekova za kancer, posebno onih koji su klasifikovani kao imunoterapija kancera, je korisna za stimuliranje specifičnog imunog odgovora na antigen kancera. "Antigen kancera" kao što je ovde upotrebljeno je jedinjenje, kao što je peptid, povezano sa tumorom ili površinom kancerozne ćelije i koje je sposobno da izazove imuni odgovor kada je eksprimirano na površini antigen prikazujuće ćelije u kontekstu MHC molekula. Antigeni kancera, kao što su oni prisutni kod vakcina za kancer ili oni koji su upotrebljeni za pripremanje imunoterapija kancera, mogu se pripremiti od sirovih ekstrakata ćelija kancera, kao što je opisano u Cohen, et al., 1994,Cancer Research,54:1055, ili delimičnim prečišćavanjem antigena, korišćenjem rekombinantne tehnologije, ili de novo sintezom poznatih antigena. Antigeni kancera se mogu upotrebiti u obliku imunogenih delova određenog antigena ili u nekim slučajevima moguće je upotrebiti celu ćeliju ili masu tumora kao antigen. Takvi antigeni se mogu izolovati ili pripremiti rekombinantno ili bilo kojim drugim sredstvima koja su poznata u tehnici.

Teorija imunog nadzora odnosi se na to da je primarna funkcija imunog sistema detektovanje i eliminisanje neoplastičnih ćelija pre formiranja tumora. Osnovni princip ove teorije je da se kancerozne ćelije antigeno razlikuju od normalnih ćelija i da prema tome izazivaju imune reakcije koje su slične onima koje izazivaju odbijanje imunološki nekompatibilnih alograftova. Studije su potvrdile da se ćelije tumora razlikuju, bilo kvalitativno ili kvantitativno, u njihovoj ekspresiji antigena. Na primer, "tumor-specifični antigeni" su antigeni koji su specifično spojeni sa ćelijama tumora, ali ne i normalnim ćelijama. Primeri tumor specifičnih antigena su viralni antigeni u tumorima indukovani DNK ili RNK virusima. "Tumor-povezani" antigeni su prisutni i kod ćelija tumora i kod normalnih ćelija, ali su prisutn i u različitoj količini ili u različitom obliku kod ćeiij a tumora. Primeri takvih antigena su onkofetalni antigeni (npr., karcinoembrionski antigen), diferencijacioni antigeni (npr., T i Tn antigeni) i proizvodi onkogena (npr., HER/neu).

Identifikovani su različiti tipovi ćelija koje mogu ubiti ciljne ćelije tumorain vitroiin vivo:prirodne ćelije ubice (NK ćelije), citolitički T limfociti (CTL), limfokin -aktivirane ćelije ubice (LAK) i aktivirane makrofage. NK ćelije mogu ubiti ćelije tumora, a da pr ethodno nisu senzitizovane na specifične antigene, a aktivnost ne zahteva prisustvo antigena klase I koje kodira glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) na target ćelijama. Smatra se da NK ćelije učestvuju u kontroli novonastalih tumora i u kontroli metastatičkog rasta. Nasuprot NK ćelijama, CTL mogu ubiti ćelije tumora samo nakon što su one senzitizovane na antigene tumora i kada je target antigen eksprimiran na ćeliji tumora koja takođe eksprimira MHC klasu I. Smatra se da su CTL efektorne ćelije u odbacivanju transplantiranih tumora i tumora nastalih kao posledica DNK virusa. LAK ćelije su podgrupa nultih limfocita koji se razlikuju od NK i CTL populacija. Aktivirani makrofagi mogu ubiti ćelije tumora na način koji ne zavisi od antigena niti je ograničen sa MHC kada je jednom aktiviran. Smatra se da aktivirani makrofagi smanjuju stopu rasta tumora u koje prodiru. Pomoćuin vitroanaliza identifikovani su drugi imuni mehanizmi kao što su antitelo-zavisni, ćelijski-posredovane citotoksične reakcije i liza od strane antitela sa komplementom. Međutim, ovi imunološki efektorni mehanizmi se smatraju manje važnimin vivood funkcije NK, CTL, LAK i makrofagain vivo(za prikaz pogledati Piessens, W. F., i David, J., "Tumor Immunologv", U: Scienti fic America n Medicine, Vol. 2, Scientific American Books, N. Y.. pp. 1-13, 1996.

Cilj imunoterapije je da se poveća pacijentov imuni odgovor na postojeći tumor. Jedan postupak imunoterapije obuhvata korišćenje adjuvanata. Adjuvant supstance dobijene od mikroorganizama, kao što su bacil Calmete-Guerin, pojačavaju imuni odgovor i pojačavaju otpornost na tumore kod životinja.

Imunoterapeutski agensi su lekovi koji se dobijaju od antitela ili fragmenata antitela koji se specifično vezuju ili prepoznaju antigen kancera. Kao što je ovde upotrebljeno antigen kancera je u širem smislu definisan kao antigen eksprimiran od strane kancerozne ćelije. Poželjno, antigen je eksprimiran na površini kancerozne ćelije. Čak još poželjnije, antigen se ne eksprimira od strane normalnih ćelija, ili bar ne na istom nivou kao kod kanceroznih ćelija. Imunoterapije bazirane na antitelima mogu funkcionisati vezivanjem za površinu kanceroznih ćelija i da time stimulisati endogeni imuni sistem da napadne kanceroznu ćeliju. Drugi način na koji funkcioniše terapija bazirana na antitelu jeste kao sistem za ciljano dostavljanje toksičnih supstanci kanceroznim ćelijama. Antitela se obično konjuguju sa toksinima kao što je ricin (npr., iz ricinusovih zrna), kalihemicin i majtanzinoidi, sa radioaktivnim izotopima kao što je Jod-131 i ltrijum-90, sa hemoterapeutskim agensima (kao što je ovde opisano), ili sa modifikatorima biološkog odgovora. Na ovaj način, toksične supstance se mogu koncentrisati u regionu kancera, a ne-specifična toksičnost za normalne ćelije se može minimizovati. Pored upotrebe antitela koja su specifična za antigene kancera, u pronalasku takođe mogu biti korisna i antitela koja se vezuju za krvne sudove, kao što su ona koja se vezuju za endotelijalne ćelije. Ovo je zbog toga što u opštem slučaju čvrsti tumori zavise od novoformiranih krvnih sudova da bi preživeli i prema tome većina tumora je sposobna da privuče i stimuliše rast novih krvnih sudova. Kao rezultat toga, jedna od strategija mnogih lekova za kancer je delovanje na krvne sudove koji hrane tumor i/ili vezivna tkiva (ili stromu) koja podupiru ove krvne sudove.

Upotreba imunostimulatornih nukleinskih kiselina zajedno sa imunoterapeutskim agensima kao što su monoklonalna antitela može povećati dugoročno preživljavanje kroz izvestan broj mehanizama uključujući značajno povećanje ADCC (kao što je razmatrano u prethodnom tekstu), aktivaciju ćelija prirodnih ubica (NK ćelija) i povećanje nivoa IFNa . Nukleinske kiseline kada se koriste zajedno sa monoklonalnim antitelima služe da smanje dozu antitela koja je potrebna da bi se postigao biološki rezultat.

Primeri imunoterapija kancera koje se trenutno koriste ili koje su u razvoju navedeni su u Tabeli C.

Ostali tipovi hemoterapeutskih agenasa koji se mogu koristiti na osnovu pronalaska obuhvataju Aminoglutethimide, Asparaginase, Busulfan, Carboplatin, Chlorombucil, Cvtarabine HCI, Dactinomvcin, Daunorubicin HCI, Estramustine phosphate sodium, Etoposide (VP16-213), Floxouridine, Flourouracil (5-FU), Flutamide, Hydroxyurea (hidroksikarbamid), Ifosfamide, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, Leuprolide acetate (analog LHRH-oslobađajućeg faktora), Lomustine (CCNU), Mechlorethamine HCI (nitrogen mustard), Mercaptopurine, Mesna, Mitotane (o.p'-DDD), Mitoxantrone HCI, Octreotide, Plicamycin, Procarbazine HCI, Streptozocin, Tamoxifen citrate, Thioguanine, Thiotepa, Vinblastine sulfate, Amsacrine (m-AMSA), Azacitidine, Erthropoietin, Hexamethylmelamine (HMM), Interleukin 2, Mitoguazone (metil-GAG; metil glioksal bis-guanilhidrazon; MGBG), Pentostatin (2'deoksikoformicin), Semustine (metil-CCNU), Teniposide (VM-26) i Vindesine sulfate.

Kancer vakcine su lekovi koji su namenjeni da stimulišu endogeni imuni odgovor na kancerozne ćelije. Vakcine koje se trenutno proizvode pretežno aktiviraju humoralni imuni sistem (tj., imuni odgovor zavistan od antitela). Ostale vakcine koje se trenutno razvijaju su fokusirane na aktiviranje ćelijski-posredovanog imunog sistema uključujući citotoksične T limfocite koji su sposobni da ubijaju ćelije tumora. Kancer vakcine generalno povećavaju prikazivanje antigena kancera i antigen prikazujućim ćelijama (npr., makrofagi i dendritske ćelije) i/ili ostalim imunim ćelijama kao što su T ćelije, B ćelije i NK ćelije.

lako kancer vakcine mogu imati jednu od nekoliko formi, kao što je razmatrano u daljem tekstu, njihova uloga je da dopreme antigene kancera i/ili antigene povezane sa antigenima antigen prikazujućim ćelijama (APC) da bi se olakšala endogena obrada takvih antigena od strane APC i krajnje prikazivanje antigena na ćelijskoj površini u kontekstu molekula MHC klase I. Jedan oblik kancer vakcine je vakcina sa celim ćelijama, koja se priprema od kanceroznih ćelija koje su uklonjene iz subjekta, tretirane ex vivo i zatim ponovo ubačene kao cele ćelije u subjekta. Lizati ćelija tumora se takođe mogu koristiti kao kancer vakcine da bi se izazvao imuni odgovor. Drugi oblik kancer vakcine je peptidna vakcina koja koristi kancer-specifične ili kancer-povezane male proteine da bi se aktivirale T ćelije. Kancer- povezani proteini su proteini koje ne eksprimiraju isključivo kancerozne ćelije (tj., ostale normalne ćelije mogu još uvek eksprimirati ove antigene). Međutim, ekspresija kancer-povezanih antig ena je generalno ushodno regulisana sa kancerima određenog tipa. Još jedan oblik kancer vakcine je vakcina dendritske ćelije koja sadrži cele dendritske ćelije koje su bile izložene antigenu kancera ili kancer-povezanom antigenuin vitro.Lizati ili membranske frakcije dendritskih ćelija se takođe mogu koristiti kao kancer vakcine. Vakcine dendritskih ćelija su sposobne da direktno aktiviraju antigen-prikazujuće ćelije. Ostale kancer vakcine obuhvataju gangliozidne vakcine, vakcine sa proteinom toplotnog šoka, viralne i bakterijske vakcine i nukleinsko kiselinske vakcine.

Upotreba imnuostimulatornih nukleinskih kiselina zajedno sa kancer vakcinama daje poboljšani antogen-specifičan humoralni i ćelijski posredovan imuni odgovor, pored aktiviranja NK ćelija i endogenih dendritskih ćelija i povećanih nivoa IFNa. Ovo poboljšanje omogućava da se korišćenjem vakcine sa smanjenom dozom antigena postignu isti korisni efekti. U nekim slučajevima, kancer vakcine se mogu koistiti sa adjuvantima, kao što su oni koji su opisani u prethodnom tekstu.

Kao što je ovde korišćeno, termini "antigen kancera" i "antigen tumora" su naizmenično korišćeni da bi označili antigene koje diferencijalno eksprimiraju kancerozne ćelije i koji se otuda mogu koristiti da bi se ciljale kancerozne ćelije. Antigeni kancera su antigeni koji mogu potencijalno da stimulišu verovatno tumor-specifične imune odgovore. Neki od ovih antigena su kodirani, iako nisu neophodno eksprimirani, od strane normalnih ćelija. Ovi antigeni se mogu okarakterisati kao oni antigeni koji su noramlno tihi (tj., nisu eksprimirani) kod normalnih ćelija, oni antigeni koji su eksprimirani samo u određenim stupnjevima diferencijacije i oni antigeni koji su privremeno eksprimirani kao embrionalni i fetalni antigeni. Ostale antigene kancera kodiraju mutatni ćelijski geni, kao što su onkogeni (npr., aktivirani ras onkogen), supresor geni (npr., mutant p53), fuzioni proteini nastali unutrašnjim delecijama ili hromozomskim translokacijama. Ostale antigene kancera mogu kodirati viralni antigeni kao što su oni koje nose RNK i DNK tumor virusi.

Ostale vakcine koriste oblik dendritskih ćelija koje su bile izložene antigenima kancerain vitro,koje su obradile antigene i koje su sposobne da eksprimiraju antigene kancera na svojoj ćelijskoj površini u kontekstu MHC molekula za efikasno prikazivanje antigena ostalim ćelijama imunog sistema.

Imunostimulatorne nukleinske kiseline su korišćene u jednom aspektu pronalaska zajedno sa kancer vakcinama koje su zasnovane na dendritskim ćelijama. Funkcija dendritskih ćelija je prikazivanje antigena. Dendritske ćelije ostvaruju vezu između urođenog i stečenog imunog sistema putem prikazivanja antigena i ekspresijom receptora koji prepoznaju strukturne šeme i koji otkrivaju mikrobijalne molekule kao LPS u njihovom lokalnom okruženju. Dendritske ćelije efikasno internalizuju (usvajaju), obrađuju i prikazuju rastvorljiv specifičan antigen kome su izložene. Proces internalizacije i prikazivanja antigena izaziva brzu ushodnu regulaciju ekspresije glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i kostimulatomih molekula, proizvodnju citokina i migraciju ka limfatičnim organima, gde se veruje da učestvuju u aktivaciji T ćelija.

U Tabeli D je dat spisak različitih kancer vakcina koje se ili trenutno koriste ili su u razvoju.

Kao što je ovde upotrebljeno, hemoterapeutski agensi obuhvataju sve druge oblike lekova za kancer koji ne potpadaju u kategorije imunoterapeutskih agenasa ili kancer vakcina. Hemoterapeuski agensi kao što je ovde korišćeno obuhvataju i hemijske i biološke agense. Ovi agensi funkcionišu putem inhibicije ćelijske aktivnosti od koje zavisi preživljavanje kancerozne ćelije. Kategorije hemoterapeutskih agenasa obuhvataju alkilujuće/alkaloid agense, antimetabolite, hormone ili analoge hormona i raznovrsne neoplastične lekove. Većina, ako ne i svi ovi antigeni su direktno toksični za ćelije kancera i ne zahtevaju imunu stimulaciju. Kombinacija hemoterapije i primene imunostimulatorne nukleinske kiseline povećava maksimalno podnošljivu dozu hemoterapije.

Hemoterapeutski agensi koji se trenutno razvijaju ili su u kliničkoj upotrebi prikazani su u Tabeli E.

U jednom obliku, postupci pronalaska koriste imunostimulatorne nukleinske kiseline kao zamenu za korišćenje IFNa terapije u lečenju kancera. Trenutno, neki protokoli lečenja zahtevaju upotrebu IFNa. S obzirom da je IFNa proizveden posle primene nekih imunostimulatornih nukleinskih kiselina, moguće je koristiti nukleinske kiseline za endogeno stvaranje IFNa.

Pronalazak takođe obuhvata postupak za indukovanje antigen ne-specifične urođene imune aktivacije i širokog spektra otpornosti na infektivni izazov korišćenjem imunostimuiatonih nukleinskih kiselina. Termin antigen ne-specifična urođena imuna aktivacija kao što je ovde upotrebljeno se odnosi na aktivaciju imunih ćelija, a da to nisu B će lije i da je na primer moguće obuhvatiti aktivaciju NK ćelija, T ćelija ili ostalih imunih ćelija koje mogu da odgovore na antigen nezavistan način, ili neku kombinaciju ovih ćelija. Široki spektar otpornosti na infektivni izazov je indukovan zbog toga što su imune ćelije u aktivnom obliku i pripremljene su da odgovore na bilo koje invazivno jedinjenje ili mikroorganizam. Ćelije ne moraju biti specifično pripremljene na određeni antigen. Ovo je posebno korisno u biološkom ratu, kao i u ostalim situacijama koje su opisane u prethodnom tekstu kao kod putovanja.

Indeks stimulacije određene imunostimulatorne nukleinske kiseline se može testirati različitim imunološkim analizama. Poželjno, indeks stimulacije imunostimulatorne nukleinske kiseline u odnosu na proliferaciju B ćelija je najmanje oko 5, poželjno najmanje oko 10, poželjnije najmanje oko 15 i najpoželjnije najmanje oko 20 kao što je određeno ugrađivanjem<3>H

uridina u kulturu B ćelija miša, koja je bila u dodiru sa 20 u.M nukleinske kiseline 20 sati na 37°C i bila je pulsno obeležena sa 1 u.Ci<3>H uridina; i prikupljena i merena 4 sata kasnije kao što je detaljno opisano u PCT Published Patent Applications PCT/US95/01570 (WO 96/02555) i PCT/US97/19791 (WO 98/18810) zahtevan prioritet za U.S. Serial Nos. 08/386,063 i 08/960,774, dostavljen 7. februara, 1995. i 30. oktobra, 1997., respektivno. Za korišćenjein vivo,na primer, važno je da su imunostimulatorne nukleinske kiseline sposobne da efikasno indukuju imuni odgovor, kao što je, na primer, proizvodnja antitela.

Imunostimulatorne nukleinske kiseline su efikasne kod ne-glodarskih kičmenjaka. Različite imunostimulatorne nukleinske kiseline mogu da izazovu optimalnu imunu stimulaciju u zavisnosti od tipa subjekta i sekvence imunostimulatorne nukleinske kiseline. Nađeno je na osnovu pronalaska da mnogi kičmenjaci reaguju na istu klasu imunostimulatornih nukleinskih kiselina, ponekad označenih kao humane specifične imunostimulatorne nukleinske kiseline. Glodah, međutim, reaguju na različite nukleinske kiseline. Kao što je ovde pokazano, imunostimulatorne nukleinske kiseline koje izazivaju optimalnu stimulaciju kod ljudi ne moraju generalno da izazivaju optimalnu stimulaciju kod miša i suprotno. Imunostimulatorna nukleinska kiselina koja izaziva optimalnu stimulaciju kod ljudi često, međutim, izaziva optimalnu stimulaciju kod ostalih životinja kao što su krave, konji, ovce, itd. Stručnjak može da identifikuje optimalne nukleinsko kiselinske sekvence korisne za određene vrste od interesa upotrebom rutinskih analiza ovde opisanih i/ili poznatih u tehnici, korišćenjem uputstava koja su ovde data.

Imunostimulatorne nukleinske kiseline se mogu direktno primeniti na subjekta ili se mogu primeniti zajedno sa kompleksom za dostavljanje nukleinske kiseline. Kompleks za dostavljanje nukleinske kiseline će označavati molekul nukleinske kiseline spojen sa (npr., jonskom ili kovalnentnom vezom za; ili inkapsuliran unutar) sredstvima za ciljanu upotrebu (npr. molekul koji rezultuju u većem afinitetu vezivanja za target ćeliju (npr., površine B ćelija i/ili povećan unos od strane target ćelija)). Primeri kompleksa za dostavljanje nukleinske kiseline obuhvataju nukleinske kiseline povezane sa sterolom (npr. holesterol), lipidom (npr. katjonski lipid, virozom ili lipozom), ili vezujućim agensom specifičnim za target ćeliju (npr. ligand koji prepoznaje receptor specifičan za target ćeliju). Poželjni kompleksi mogu biti dovoljno stabilniinvivoda bi sprečili značajno razdvajanje pre internalizacije od strane target ćelije. Međutim, kompleks se može razgraditi pod odgovarajućim uslovima unutar ćelije, tako da se nukleinska kiselina oslobađa u funkcionalnom obliku.

Opisani su prenosioci za dostavljanje ili sistemi za dostavljanje za dopremanje antigena i nukleinskih kiselina do određenih površina. Imunostimulatorne nukleinske kiseline i/ili antigen i/ili ostali terapeutici se mogu primeniti sami (npr., u slanom rastvoru ili puferu) ili korišćenjem bilo kojih prenosioca za dostavljanje poznatih u praksi. Na primer, opisani su sledeći prenosioci za dostavljanje: kohleati (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); emulzozomi (Vancott et al., 1998, Lowelletal., 1997); ISCOM (Mowatetal., 1993, Carlsson etal., 1991, Hu etal., 1998, Morein et al., 1999); lipozomi (Childers et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); živi bakterijski vektori (npr.,Salmoneila, Escherichia coli, Bacilus calmatte- guerin, Shigella, Lactobacillus)(Hone et al., 1996, Pouvvels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); živi viralni vektori (npr., Vaccinia, adenovirus, Herpes Simplex)

(Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); mikrosfere (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); vakcine nukleinskih kiselina (Fynan et l„ 1993, Kuklin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); polimeri (npr. karboksimetilceluloze, hitosan) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); polimerni prstenovi (Wyatt et al., 1998); proteozomi (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); natrijumfluorid (Hashi et al., 1998); transgene biljke (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); virozomi (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); partikule slične virusu (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998). Ostali prenosioci za dostavljanje su poznati u tehnici, a u daljem tekstu u kome se razmatraju vektori dati su neki dodatni primeri.

Termin efektivna količina imunostimulatorne nukleinske kiseline se odnosi na količinu koja je neophodna ili dovoljna da bi se postigao željeni biološki efekat. Na primer, efikasna količina imunostimulatorne nukleinske kiseline za indukovanje mukoznog imuniteta je količina koja je neophodna da bi se izazvao razvoj IgA kao odgovor na antigen posle izlaganja antigenu, s obzirom da je količina potrebna za izazivanje sistemskog imuniteta ona količina koja je neophodna da bi se izazvao IgG kao odgovor na antigen posle izlaganja antigenu. Zajedno sa razmatranjima koja su ovde data, biranjem među različitim aktivnim jedinjenjima i merljivim faktorima kao što su potencija, relativna biodostupnost, telesna težina pacijenta, jačina štetnih sporednih efekata i poželjan način primene, može se planirati efikasan profilaktički ili terapeustki režim tretiranja koji ne izaziva značajnu toksičnost, a još je u potpunosti efikasan u lečenju određenog subjekta. Efikasna količina za bilo koju određenu primenu može varirati u zavisnosti od takvih faktora kao što su bolest ili stanje koje se tretira, određena imunostimulatorna nukleinska kiselina koja se primenjuje, antigen, veličina subjekta, ili težina bolesti ili stanja. Stručnjak može empirijski da odredi efikasnu količinu određene imunostimulatorne nuklinske kiseline i/ili antigena i/ili nekog drugog terapeutskog agensa bez potrebe za suvišnim eksperimentisanjem.

Doze jedinjenja za primenu na subjekta koja su ovde opisana za mukozno ili lokalno dostavljanje se u tipičnom slučaju kreću u opsegu od oko 0.1 (ig do 10 mg po primeni, što zavisi od toga da li je moguće primenu izvršiti jednom dnevno, jednom nedeljno, ili jednom mesečno ili u nekom drugom vremenskom periodu između. Tipičnije, mukozne ili lokalne doze se kreću u opsegu od oko 10 u.g do 5 mg po primeni, a najtipičnije od oko 100y. gdo 1 mg, sa 2-4 primene između kojih je vremenski period od nekoliko dana ili sedmica. Tipičnije, doze imunostimulatna se kreću u opsegu od oko 1 ng do 10 mg po primeni, a najtipičnije 10^g do 1 mg, sa primenama jednom dnevno ili jednom nedeljno. Doze jedinjenja za primenu na subjekta koja su ovde opisana za parenteralnu dostavu u svrhu izazivanja antigen-specifičnog imunog odgovora, gde su jedinjenja dostavljena sa antigenom, ali ne i sa drugim terapeutskim agensom, su u tipičnom slučaju 5 do 10,000 puta više od efikasne mukozne doze za adjuvant vakcine ili primene imunostimulanta, a tipičnijelO do 1,000 puta više, a natipičnije 20 do 100 puta više. Doze jedinjenja koja su ovde opisana za parenteralnu dostavu u svrhu izazivanja urođenog imunog odgovora ili za povećanje ADCC ili za izazivanje antigen specifičnog imunog odgovora kada su imunostimulatorne nukleinske kiseline primenjene zajedno sa ostalim terapeutskim agensima ili u specijalnim prenosiocima za dostavu se tipično kreću u opsegu od oko 0.1[ igdo 10 mg po primeni, što zavisi od toga da li se primena daje dnevno, sedmično, ili mesečno ili u bilo kom vremenskom periodu između. Tipičnij e, parenteralne doze za ove svrhe se kreću u opsegu od oko 10 ug do 5 mg po primeni, a najtipičnije od oko 100 u.g do 1 mg, sa 2-4 primene između kojih je period od nekoliko dana ili nedelja. U nekim oblicima, međutim, parenteralne doze za ove svrhe se mogu koristiti u opsegu od 5 do 10,000 puta višim od tipičnih doza koje su opisane u prethodnom tekstu.

Za bilo koje jedinjenje koje je ovde opisano moguće je inicijalno odrediti efikasnu količinu na osnovu animalnog modela. Terapeutski efikasna doza se takođe može primeniti iz podataka dobijenih za CpG oligonukleotide koji su testirani kod ljudi (započeta su humana klinička ispitivanja) i za jedinjenja za koje je poznato da pokazuju slične farmakoločke aktivnosti, kao što su ostali mukozni adjuvanti, npr., LT i ostali antigeni u svrhu vakcinisanja, za lokalnu ili mukoznu primenu. Za parenteralnu primenu potrebne su više doze. Primenjena doza se može podesiti na osnovu relativne jačine primenjenog jedinjenja. Podešavanje doze da bi se postigla maksimalna efikasnost na osnovu postupaka koji su opisani u prethodnom tekstu i ostalih postupaka koji su u tehnici već rutinski, dobro su poznati stručnjacima.

Formulacije pronalaska su primenjene u farmaceutski prihvatljivim rastvorima, koji mogu obično da sadrže farmaceutski prihvatljive koncentracije soli, puferujućih agenasa, zaštitnih supstanci, kompatibilnih nosača, adjuvanata i opciono ostalih terapeutskih sastojaka.

Za korišćenje u lečenju, efikasna količina imunostimulatorne nukleinske kiseline se može primeniti na subjekta bilo kojim načinom koji dostavlja nukleinsku kiselinu željenoj površini, npr., mukozno, sistemski. Primena farmaceutske kompozicije datog pronalaska se može postići bilo kojim sredstvima poznatim stručnjacima. Poželjni putevi primene obuhv ataju, ali nisu ograničeni na oralno, parenteralno, intramuskularno, intranazalno, intratrahealno, inhalacijom, okularno, vaginalno i rektalno.

Za oralnu primenu, jedinjenja (tj., imunostimulatorne nukleinske kiseline, antigeni i ostali terapeutski agensi) se mogu lako formulisati spajanjem aktivnog jedinjenja sa farmaceutski prihvatljivim nosačima dobro poznatim u tehnici. Takvi nosači omogućavaju jedinjenjima pronalaska da se formulišu kao tablete, pilule, dražeje, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, talo zi, suspenzije i tome slično, za oralno uzimanje od strane subjekta koji se tretira. Farmaceutski preparati za oralnu upotrebu se mogu dobiti kao čvrsti inertni punioc, opciono mlevenjem dobijene smeše i obrađivanjem smeše granula, posle dodavanja odgovarajućih pomoćnih sredstava, ukoliko se želi, da bi se dobile tablete ili jezgra dražeja. Pogodni inertni punioci su, posebno, punioci kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol, ili sorbitol; celulozni preparati kao što su kukurzni škrob, pšenični škrob, pirinčani škrob, krompirov škrob, želatin, tragakant guma, metilceluloza, hidroksipropilmetil-celuloza, natrijumkarboksimetilceluloza i/ili polivinilpirolidon (PVP). Ako se želi, moguće je dodati dezintegrante, kao što su unakrsno vezani polivinilpirolidon, agar, ili alginska ksielina ili njena so kao što je natrijumalginat. Opciono oralne formulacije se takođe mogu formulisati u slanom rastvoru ili puferima za neutralizovanje unutrašnjih kiselih uslova, ili se mogu primeniti bez bilo kog nosača.

Jezgra dražeja su data sa odgovarajućim omotačima. Za ovu svrhu se mogu upotrebiti koncentrovani ratsvori šećera, koji mogu opciono sadržati gumu arabiku, talk, polivinilpirolidon, karbopol gel, polietilenglikol i/ili titanijumdioksid, rastvore laka i pogodne organske rastvarače ili smeše rastvarača. Boje ili pigmenti se mogu dodati tabletama ili omotačima dražeja za identifikaciju ili da bi se okarakterisale različite kombinacije doza aktivnog jedinjenja.

Farmaceutski preparati koji se mogu koristiti oralno obuhvataju "push-fit" kapsule napravljene od želatina, kao i mekane, zatvorene kapsule napravljene od želatina i plastifikatora, kao što je glicerol ili sorbitol. "Push-fit" kapsule mogu sadržati aktivne sastojke u smeši sa puniocima kao što su laktoza, vezujućim sredstvima kao što su škrobovi i /ili lubrikantima kao što je talk ili magnezijumsterarat i opciono stabilizatorima. U mekim kapsulama aktivna jedinjenja mogu biti rastvorena ili suspendovana u pogodnim tečnostima, kao što su masna ulja, tečni parafin, ili tečni polietilenglikoli. Dodatno, mogu se dodati stabilizatori. Mogu se koristiti mikrosfere formulisane za oralnu primenu. Takve mikrosfere su dobro definisane u metodologiji. Sve fomulacije za oralnu primenu bi trebalo da budu u dozama pogodnim za takvu primenu.

Za bukalnu primenu, kompozicije mogu biti u obliku tableta ili lozenga formulisanih na konvencionalni način.

Za primenu udisanjem - inhalacijom, jedinjenja za upotrebu na osnovu datog pronalaska se mogu pogodno dostaviti u obliku aerosol spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, uz korišćenje pogodnog prope lant, npr., dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan, ugljendioksid ili neki drugi pogodan gas. U slučaju aerosola pod pritiskom jedinica doze se može odrediti obezbeđivanjem ventila koji bi dostavljao merenu količinu. Kapsule i kertridži npr. želatina za upotrebu u inhaleru ili insuflatoru se mogu formulisati u vidu praška, tako da sadrže smešu jedinjenja i odgovarajućeg praška kao što je laktoza ili škrob.

Kada je poželjno sistemsko dostavljenje, jedinjenja mogu biti formulisana za parenteralnu primenu injekcijom, npr., bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom. Formulacije za injekciju se mogu dati u obliku jedinične doze, npr., u ampulama ili u kontejnerima sa višestrukom dozom, sa dodatim zaštitnim sredstvom. Kompozicije mogu uzeti takve oblike kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim ili vodenim nosačima i mogu sadržati formulišuće agense kao što su suspendujući, stabilizirajući i/ili dispergujući agensi.

Farmaceutske kompozicije za parenteralnu primenu obuhvataju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku koji je rastvorljiv u vodi. Dodatno, suspenzije aktivnih jedinjenja se mogu pripremiti kao odgovarajuće suspenzije uljastih injekcija. Pogodni lipofilni rastvarači ili nosači obuhvataju masna ulja kao što su sezamovo ulje, ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što je etiloleat ili trigliceridi, ili lipozomi. Suspenzije vodenih injekcija mogu sadržati sups tance koje povećavaju viskozitet suspenzije, kao što je karboksimetilceluloza, sorbitol, ili dekstran. Opciono, suspenzije mogu takođe sadržati pogodne stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja da bi se omogućila priprema rastvora visoke koncentracije.

Alternativno, aktivna jedinjenja mogu biti, pre upotrebe, u obliku praška za spajanje sa odgovarajućim nosačem, npr., sterilna pirogen-oslobođena voda.

Jedinjenja se mogu takođe formulisati kao rektalne ili vaginalne kompozicije kao što su supozitorije ili retencioni klistir, npr., koji sadrže konvencionalne supozitorne osnove kao što je kakao puter ili drugi gliceridi.

Pored formulacija koje su opisane prethodno, jedinjenja mogu takođe biti formulisana kao depo preparati. Takve formulacije dugog dejstva mogu se pripremiti sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili u jonoizmenjivačkim smolama, ili umereno rastvorljivim derivatima, na primer, kao umereno rastvorljiva so.

Farmaceutske kompozicije takođe mogu sadržati pogodne nosače ili inertne punioce u čvrstoj ili gel fazi. Primeri takvih nosača ili inertnih punilaca obuhvataju, ali nisu ograničeni na kalcijumkarbonat, kalcijumfosfat, različite šećere, škrobove, derivate celuloze, želatin i polimeere kao što su polietilenglikoli.

Pogodni tečni ili čvrsti oblici farmaceutskih preparata su, na primer, vodeni ili slani rastvori za inhalaciju, mikroinkapsulirani, inkohleirani, kao omotač mikroskopskih zlatnih partikula, sadržani u lipozomima, nebulizovani, aerosoli, granule za implantaciju u kožu, ili sušeni na oštrom objektu za primenu na kožu. Farmaceutske kompozicije takođe obuhvataju granule, praškove, tablete, tablete sa omotačem, (mikro)kapsule, supozitorije, sirupe, emulzije, suspenzije, kreme, kapi ili preparate sa produženim oslobađanjem aktivnih jedinjenja, pri čijem se pripremanju uobičajeno koriste, kao što je opisano u prethodnom tekstu, dezintegratori, vezujuća sredstva, agensi za oblaganje, agensi za bubrenje, lubrikanti, aromati, zaslađivači ili rastvarači. Farmaceutske kompozicije su pogodne za upotrebu u različitim sistemimima za dostavljanje leka. Za kratak pregled postupaka za dostavu leka, pogeldati Langer,Science249:1527-1533, 1990, što je ovde uvršćeno referencom.

Imunostimulatorne nukleinske kiseline i opciono ostali terapeutici i/ili antigeni se mogu primenitiper se(čisto) ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli. Kada se koriste u medicini soli bi trebalo da budu faramaceutski prihvatljive, ali se farmaceutski neprihvatljive soli mogu konvencionalno upotrebiti za pripremanje njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. Takve soli obuhvataju, ali nisu ograničene na, one pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, p-toluensulfo kiseline, vinske, limunske, metansulfo, mravlje, malonske, ćilibame, naftalen-2-sulfo i benzensulfo kiseline. Takođe, takve soli se mogu pripremiti kao soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala, kao što su natrijumove, kalijumove ili kalcijumove soli grupe karboksilne kiseline.

Pogodni puferujući agensi obuhvataju: sirćetnu kiselinu i so (1 -2% w/v); limunsku kiselinu i so (1-3% w/v); bornu kiselinu i so (0.5-2.5% w/v); i fosfornu kiselinu i so (0.8-2% w/v). Pogodna zaštitna sredstva obuhvataju bezalkonijumhlorid (0.003-0.03% w/v); hlorobutanol (0.3-0.9% w/v); parabeni (0.01-0.25% w/v) i timerozal (0.004-0.02% w/v).

Farmaceutske kompozicije pronalaska sadrže efikasnu količinu imunostimulatorne nukleinske kiseline i opciono antigena i/ili ostalih terapeustkih agenasa opciono uključenih u farmaceutski prihvatljiv nosač. Termin farmaceutski prihvatljiv nosač označava jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih punilaca, razblaživača ili inkapsulirajućih supstanci koje su pogodne za primenu na ljude ili ostale kičmenjačke životinje. Termin nosač označava organski ili neorganski sastojak, prirodni ili sintetički, sa kojim je spojen aktivan sastojak da bi se olakšala primena. Sastavni delovi farmaceutskih kompozicija su takođe sposobni da se pomešaju sa jedinjenjima datog pronalaska i jedni sa drugima, na takav način da se ne javlja interakcija koja bi značajno uticala na željenu farmaceutsku efikasnost.

Imunostimulatorne nukleinske kiseline koje mogu biti korisne u pronalasku mogu se primeniti u smešama sa dodatnim adjuvantom (adjuvantima), ostalim terapeuticima, ili antigenom (antigenima). Smeša može sadržati nekoliko adjuvanata pored imunostimulatorne nukleinske kiseline ili nekoliko antigena ili ostalih terapeutika.

Dostupni su različiti putevi primene. Određeni izabrani način će zavisiti, naravno, od određenih adjuvanata ili izabranog antigena, određenog stanja koje se tretira i doze potrebne za terapeutsku efikasnost. Postupci pronalaska, uopšteno govoreći, se mogu obavljati korišćenjem bilo kog načina primene koji je medicinski prihvatljiv, što znači bilo koji način koji proizvodi efikasne nivoe imunog odgovora bez izazivanja klinički neprihvatljivih sporednih efekata. Poželjni načini primene su razmatrani u prethodnom tekstu.

Kompozicije se pogodno mogu formulisati u obliku jedinica doze i mogu se pripremiti bilo kojim od postupaka koji su dobro poznati u tehnici farmacije. Svi postupci obuhvataju dovođenje jedinjenja u dodir sa nosačem koji gradi jedan ili više dopunskih sastojaka. Uopšteno, kompozicije su pripremljene uniformnim i bliskim dovođenjem jedinjenja u dodir sa tečnim nosačem, fino podeljenim čvrstim nosačem, ili i jednim i drugim, a zatim, ako je neophodno, oblikovanjem proizvoda. Tečne jedinice doze su bočice ili ampule. Čvrste jedinice doze su tablete, kapsule i supozitorije. Za lečenje pacijenta, u zavisnosti od delovanja jedinjenja, načina primene, svrhe imunizacije (tj., da li je profilaktička ili terapeutska), prirode i jačine poremećaja, starosti i telesne težine pacijenta, mogu biti neop hodne različite doze. Primena date doze se može izvesti pojedinačnom primenom u vidu pojedinačne jedinice doze ili u nekoliko manjih jedinica doze. Višestruke primene doza u specifičnim vremenskim intervalima od nekoliko nedelja ili meseci je uobičajeno za povećanje antigen-specifičnih odgovora.

Ostali sistemi za dostavljanje mogu obuhvatiti sisteme za dostavljanje sa vremenski određenim oslobađanjem, odloženim oslobađanjem ili produženim oslobađanjem. Takvim sistemima mogu se izbeći ponovljene primene jedinjenja, što je pogodnije za subjekta i lekara. Mnogi tipovi sistema za dostavljanje koji deluju po određenom tipu oslobađanja, dostupni su i poznati stručnjacima. Oni obuhvataju sisteme na bazi polimera kao što su poli(laktid-glikolid), kopolioksalati, polikaprolaktoni, poliestaramidi, poliortoestri, polihidroksibuterna kiselina i polianhidridi. Mikrokapsule gorenavedenih polimera koji sadrže lekove su opisani u, na prim er, U.S. Patent 5,075,109. Sistemi za dostavljanje takođe obuhvataju ne-polimerne sisteme, a to su: lipidi uključujući sterole kao što je holesterol, estri holesterola i masne kiseline ili neutralne masti kao što su mono-, di- i tri-gliceridi; hidrogel sistemi za oslobađanje; sistemi na bazi peptida; omotači od voska; kompresovane tablete koje koriste konvencionalna vezujuća sredstava i inertne puniloce; delimično fuzionisani implantanti; i tome slično. Specifični primeri obuhvataju, ali nisu ograničeni na: (a) erozionalne sisteme u kojima je agens pronalaska sadržan u obliku unutar matriksa kao što su oni opisani u U.S. Patent Nos. 4,452,775, 4,675,189 i 5,736,152 i (b) difuzione sisteme u kojima aktivni sastojak prodire iz polimera sa kontrolisanom stopom kao što je opiano u U.S. Patent Nos. 3,854,480, 5,133,974 i 5,407,686. Dodatno, mogu se upotrebiti sistemi za dostavljanje zasnovani na uređajima koji rade po principu pumpe, od kojih su neki prilagođeni za implantaciju.

Dati pronalazak je dalje ilustrovan sledećim Primerima, koje ne bi trebalo shvatati kao dodatno ograničavajuće. Celokupan sadržaj svih referenci (uključujući literaturne reference, publikovane patente, objavljene prijave patenata i prijave patenata koje su istoveremeno u postupku) citiranih kroz ovu prijavu su ovim eksplicitno uvršćene referencom.

Primeri

Materijal i metode:

Oligodezoksinukleotidi:Nativni fosfodiestar i fosforotioat-modifikovani ODN su nabavljeni iz Operon Technologies (Alameda, CA) i Hvbridon Specialtv Products (Milford, MA). ODN su testirani na endotoksin korišćenjem LAL-analize (LAL-analiza BioVVhittaker, VValkersville, MD; donja detekciona granica 0.1 EU/ml). Zain vitroanalize, ODN su razblaženi u TE-puferu (10 mM Tris, pH 7.0, 1 mM EDTA) i čuvani na -20°C. Zain vivoupotrebu, ODN su razblaženi u slanom rastvoru puferisanom sa fosftanim puferom (0.1 M PBS, pH 7.3) i čuvani na 4°C. Sva razblaženja su izvedena upotrebom pirogen-oslobođenih reagenasa.

Izolacija humanih PBMC i kultura ćelija:Monociti perferne krvi (PBMC) su izolovani iz periferne krvi zdravih dobrovoljaca pomoću Ficoll -Paque centrifugiranja na osnovu gradijenta gustine (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kao što je opisano (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10). Ćelije su suspendovane u RPMI 1640 medijumu kulture kome je dodato 10% (v/v) inaktiviranog toplotom (56°C, 1 h) FCS (HvCIone, Logan, UT), 1.5 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina i 100 ug/ml streptomicina (sve iz Gibco BRL, Grand Island, NY) (kompletan medijum). Ćelije (krajnja koncentracija 1 x 10 6 ćelija/ml) su kultivisane u kompletnom medijumu u 5% C02ovlaženom inkubatoru na 37° C. ODN i LPS (izSalmonella typhimurium,Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ili anti-lgM su upotrebljeni kao stimulusi. Za merenje humane NK liičke aktivnosti, PBMC su inkubirani na 5 x 10<6>/komorici u 24-komornim pločama. Kulture su prikupljene posle 24 sata i ćelije su upotrebljene kao efektori u standardnoj četvoročasovnoj analizi oslobađanja<51>Cr iz K562 target ćelija kao što je prethodno opisano (Ballas et al., 1996 J. Immunol. 157:1840-1845). Za proliferaciju B ćelija, 18 sati pre prikupljanja je dodato 1 u.Ci<3>H timidina, a količina inkorporacije<3>H timidina je određena scincilacionim brojanjem petog dana. Standardne devijacije trostrukih komorica su bile < 5%.

Protočna citometrija na h umanim PBMC:Površinski antigeni na PBMC primata su bojeni kao što je prethodno opisano (Hartmann et al., 1998 J. Pharmacol. Exp. Ther. 285:920-928). Monoklonalna antitela na CD3 (UCHT1), CD14 (M5E2), CD19 (B43), CD56 (B159), CD69 (FN50) i CD86 (2331 [FUN-1]) su nabavljena iz Pharmingen, San Diego, CA. lgG,,K(MOPC-21) i lgG2b,K (Hartmann et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10) su korišćeni za kontrolu na ne-specifično bojenje. NK ćelije su identifikovane CD56 ekpresijom na CD3, CD14 i CD19 negativnim ćelijama, gde su B ćelije identifikovane ekspresijom CD19. Podaci protočne citometrije od 10000 ćelija po uzorku su dobijeni na FACScan (Beckton Dickinson lmmunocytometry Svstems, San Jose, CA). Vijabilnost ćelija unutar FSC/SSV kapije upotrebljene u analizi je ispitavana bojenjem sa propidijumjodidom (2 ug/ml) i nađeno je da je veća od 98%. Podaci su analizirani korišćenjem kompjuterskog programa FlovvJo (version 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).

Rezultati:

Primer 1: CpG- zavisna stimulacija humanih B ćelija zavisi od metilacije i dužine

ODN.

HumaniPBMC su dobijeni od normalnih davaoca i kultivisani pet dana na 2 x 10<3>ćelija/komorici sa naznačenim koncentracijama naznačenih ODN sekvenci. Kao što je pokazano u Tabeli F, humani PBMC proliferišu iznad osnovnog nivoa kada se kultivišu sa velikim brojem različitih CpG ODN, ali takođe pokazuju izvesnu proliferaciju čak i sa ODN koji ne sadrže nijedan CpG motiv. Važnost nemetilovanih CpG motiva u stvaranju optimalne imune stimulacije sa ovim ODN je demonstrirano činjenicom da ODN 1840 (SEQ ID NO. 83) indukuje 56,603 jedinica<3>H-timidin inkorporacija gde isti T-bogati ODN sa metilovanim CpG motivima (ne-CpG), 1979 (SEQ ID NO. 222), indukuje nižu, ali ipak još uvek povećanu aktivnost iznad osnovnog nivoa (samo 18,618 jedinica) na istim koncentracijama od 0.6 u.g/ml. Smanjena proliferacija na većim koncentracijama ODN može biti artefakt ćelija koje postaju iscrpljene pod ovim eksperimentalnim uslovima ili može reflektovati izvesnu toksičnost većih koncentracija ODN. Interesantno, kraći ODN koji sadrže CpG motive, kao što je 13-14meri 2015 i 2016, su manje stimulatorni uprkos činjenici da bi njihove molarne koncentracije ustvari bile veće s obzirom da su ODN dodati pre na osnovu mase nego molariteta. Ovo pokazuje da ODN dužina može takođe biti važna detereminanta u imunim efektima ODN. Ne-CpG ODN, ali neznatno T-bogat ODN (oko 30% T), 1982 (SEQ ID NO. 225), izazvao je samo proliferaciju malog broja ćelija podloge.

Brojevi predstavljaju cpm inkorporacije<3>H-timidina za kulture humanih PBMCs postavljenih kao što je opisano u prethodnom tekstu.

Primer 2. Aktivacija humanih NK ćelija zavisna od koncentracije sa timidin-

bogatim ODN.

Humani PBMC su kultivisani 24 sata sa grupom različitih CpG ili ne-CpG ODN u dve različite koncentracije, a zatim je testirana njihova sposobnost da ubiju ćelije koje predstavljaju ciljne ćelije za NK, kao što je prethodno opisano (Balias et al., 1996 J. Immunol. 157:1840-1845). Ubijanje je mereno u litičkim jedinicama, ili L.U. Humani davaoc koji je korišćen u ovom eksperimentu ima osnovni nivo od 3.69 L.U. koji se povećao do 180.36 L.U. korišćenjem pozitivne kontrole, IL-2. CpG oligo, 2006 (SEQ ID NO. 246), je indukovao visoke nivoe litičke funkcije NK na niskim koncentracijama od 0.6, a niži nivo na koncentraciji od 6.0. Iznenađujuće, T-bogati ODN u kome su CpG motivi 2006 metilovani (ODN na 2117 (SEQ ID NO. 358)) ili invertovani u GpCs (ODN 2137 (SEQ ID NO. 886)) zadržali su snažnu imunostimulatorsku funkciju na višim koncentracijama ODN, kao što je prikazano u Tablei G. Ovi zavisni od koncentracije imunostimulatorni efekti nisu opšte svojstvo fosforotioatnog osnovnog lanca s obzirom da ekperimenti koji su opisani u daljem tekstu pokazuju da je poli-A ODN je nestimulatoran iznad osnovnih nivoa. Izvesna stimulacija je primećena sa 24-baze dugačkim ODN u kome su sve bazne pozicije date po principu slučajnosti tako da će se A, C, G i T pojaviti sa učestalošću od 25% u svakoj od baznih pozicija (ODN 2182 (SEQ ID NO. 432)). Međutim, stimulatorni efekti takvog ODN sa 24-baze su veoma povećani ako je on čist poli-T, u kom slučaju je stimulacija takođe primećena na najnižim koncentracijama od 0.6 u.g/ml (ODN 2183 (SEQ ID NO. 433)). Ustvari, stimulatorna aktivnost ODN SEQ ID NO. 433 na ovoj niskoj koncentraciji je veća nego ona kod bilo kog ODN testiranog na ovoj niskoj koncentraciji, izuzimajući optimalni humani imunostimulatorni ODN SEQ ID NO. 246. Ustvari, veće koncentracije ODN SEQ ID NO: 433 su stimulisale veću aktivnost NK nego bilo koji drugi fosforotioatni ODN, osim snažnog CpG ODN 2142 (SEQ D NO. 890), koji je bio marginalno veći. Ako je G sadržaj ODN SEQ ID NO. 246 relativno povećan u odnosu na sadržaj T dodavanjem više G, što rezultira u smanjenju proporcije T nukleotida, imunostimulatorni efekat ODN je smanjen (pogledati ODN 2132 (SEQ ID NO. 373)). Prema tome, sadržaj T ODN je važna determinanta njegovog imunostimulatornog efekta, lako je poli-T ODN najstimulatorniji ne-CpG ODN, i ostale baze su takođe važne u određivanju imunostimulatornog efekta ne-CpG ODN. ODN 2131 (SEQ ID NO. 372), u kome je nešto više od pola baza T i u kome nema G, je imunostimulatoran na koncentracijama od 6 u.g/ml, ali ima manju aktivnost od ostalih T-bogatih ODN. Ako su 6 A u ODN 2131 (SEQ ID O. 372) zamenjeni sa 6 G, imunostimulatorni efekat ODN može biti povećan (pogledati ODN 2130 (SEQ ID NO. 371)).

Primer 3: Indukcija proliferacije B ćelija sa T- bogatim ne- CpG ODN.

Da bi se procenila sposobnost T-bogatog ODN da aktivira proliferaciju B ćelija, humani PBMC su bojeni sa citoplazmatičnom bojom CSFE, inkubirani pet dana sa naznačenim ODN na bilo 0.15 ili 0.3 ug/ml, a zatim su analizirani protočnom citomerijom. B ćelije su identifikovane određivanjem kritičnog nivoa ćelija pozitivnih na marker linije CD19. CpG ODN 2006 je bio jak induktor proliferacije B ćelija, a ovaj efekat je smanjen ukoliko su CpG motivi metilovani ili invertovani u GpC kao što je prikazano na Slici 1 na koncentraciji ODN od 0.3 ug/ml. Izgleda da je bazni sastav ODN važan u određivanju imunostimulatornog efekta. Smanjivanjem sadržaja T ODN značajno se smanjuje imunostimulatorni efekat, kao što je dato u primerima za ODN 2177 (SEQ ID NO. 427) u kome je 6 prisutnih T u ODN 2137 {SEQ ID NO. 886) zamenjeno u A, što rezultira u veoma smanjenom imunostimulatornom efektu. Značaj T u imunostimulatornom efektu ODN je takođe prikazan upoređivanjem ODN 2116 (SEQ ID NO. 357) i 2181 (SEQ ID NO. 431), koji se razlikuju u 3' kraju ODN. ODN 2181, u kome je 3' kraj poli-T je stimulatorniji od ODN 2116, u kome je 3" kraj poli-C, uprkos činjenici da oba ODN imaju TCGTCG na 5' kraju.

Primer 4: Proliferacija B ćelija indukovana sa TG oligonukleotidima

Stimulatorni efekti TG motiva su prikazani na Slici 2. ODN 2137 ima isti bazni sastav kao ODN 2006, ali su svi CG motivi invertovani u GC što rezultira u CG-oslobođenoj nukleinskoj kiselini. ODN međutim sadrži 6 TG dinukleotida. U ODN 2177, svi TG oligonukleotidi ODN 2137 su promenjeni u AG. lako ODN 2177 sadrži samo 6 adenina, on je zapravo nestimulatoran u koncentracijama od 0.2 ug/ml. Poređenja radi, 24 baze dugačak ODN (ODN 2182), u kome je svaka pozicija data po principu slučajnosti da bi bila bilo koja od četiri baze, indukuje > 12% B ćelija da proliferišu u koncentracijama od 0.2 ug/ml. Ovi rezultati ukazuju da stimulatorni efekti ODN 2137 nisu samo posledica fosforotioatnog osnovnog lanca, već su u vezi sa prisustvom TG nukleotida.

Da bi se odredio efekat različitog broja TG nukleotidnih motiva, upoređivani su ODN 2200 i ODN 2202, kao što je prikazano na Slici 2. Oba ODN sadrže 18 T i 6 G, ali u ODN 2200 svi G su uzastopni, tako da tu postoji samo jedan TG dinukleotid, dok u ODN 2202 G su podeljeni kao GG dinukleotidi kroz ODN tako da ovde postoji tri TG. ODN 2202 je značajno stimulatorniji od ODN 2200, što je u skladu sa modelom da su najmanje tri TG motiva u ODN potrebna za optimalnu stimulatornu aktivnost. Verovatno se čak i viši nivoi stimulacije mogu postići ukoliko su TG motivi optimizovani kao što se ovde razmatra.

Primer 5: Efekti TTG nasuprot TTG motiva.

Slika 3 prikazuje rezultate eksperimenata koji su izvođeni da bi se proučavao TG sadržaj u odnosu na relativne nivoe T prema G, pošto ovi nivoi imaju veze sa stimulatornim efektom ODN. Slika pokazuje da je ODN u kome su sve baze raspoređene po principu slučajnosti tako da budu ili T ili G (ODN 2188 (SEQ ID NO. 905)) nestimulatoran u koncentracijama od 0.2ug/ml, slično ODN u kome su sve baze raspoređene po principu slučajnosti tako da budu ili A ili G (ODN 2189 (SEQ ID NO. 906)). Međutim, na višim koncentracijama od 2 ug/ml, randomizovan T/G ODN 2188 je značajno stimulatorniji. Ovaj poslednje navedeni nivo stimulacije je još uvek niži od onog koji se javlja sa totalno randomizovanim ODN (ODN 2182 (SEQ ID O. 432)). Najveća stimulacija na niskim koncentracijama je primećena sa ODN u kome je polovina baza fiksirana na T, a druga polovina baza randomizovana tako da budu T ili G (ODN 2190 (SEQ ID NO. 907)). S obzirom da je svaka druga baza fiksirana kao T, tu ne može biti TG motiva. Podaci na Slici 3 pokazuju da povećavanje sadržaja TG ODN poboljšava njegovu imunostimulatorsku aktivnost.

U drugim eksperimentima, rezultati za koje nisu ovde dati dijagrami, ODN 2190 (SEQ ID NO. 907) je pokazao stimulaciju aktivnosti NK u poređenju sa ODN 2188 (SEQ ID NO. 905) ili ODN 2189 (SEQ ID NO. 906).

Primeri 6- 8

Uvod:

U prethodnom tekstu smo pokazali da su Poli T sekvence sposobne da povećaju stimulaciju B i NK ćelija. Ovde i u daljem tekstu istražujemo efekat različitih ne-CpG T-bogatih ODN kao i Poli C ODN na njihovu sposobnost da stimulišu humane B ćelije, NK ćelije i monocite.

Materiajl i metode:

Oligonukleotidi: Fosforotioat-modifikovani ODN je nabavljen od ARK Scientific GmbH (Darmsadt, Germanv). Upotrebljene sekvence su bile: 1982: 5'tccaggacttctctcaggtt-3'(SEQ ID NO.: 225), 2006: 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3" (SEQ ID NO.: 246), 2041: 5'-ctggtctttctggtttttttctgg-3'

(SEQ ID NO.: 282), 2117: 5'-tegtzgttttgtgtzgttttgtzgtt-3' (SEQ ID NO.: 358), 2137: 5-tgctgcttttgtgcttttgtgctt-3' (SEQ ID NO.: 886), 2183: 5'-ttttttttttttttttttttt-3' (SEQ ID NO.: 433), 2194: 5^ttmWttttWttttttttttt-3' (SEQ ID NO.: 911), 2196: S'-mttttttttttttttt-S' {SEQ ID NO.: 913), 5126: 5'-ggttcttttggtccttgtct-3' (SEQ ID NO.: 1058), 5162: 5^tttttmWtttmWttttttttt-3' (SEQ ID NO.: 1094), 5163: 5'-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3' (SEQ ID NO.: 1095), 5168: 5'-cccccccccccccccccccccccccccccc-3' (SEQ ID NO.: 1096) i 5169: 5'-cgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcg-3' (SEQ ID NO.: 1097). Većina ODN je testirana za LPS sadržaj korišćenjem LAL analize (BioVVittaker, Belgium) (niža detekciona granica 0.1 EU/ml) koja je takođe ovde opisana. Za sve analize ODN je razblažen u TE puferu i čuvan na -20°C. Sva razblaženja su izvedena korišćenjem pirogen-oslobođenih reagenasa.

Pripremanje ćelija i kultura ćelija: Humani PBMC su izolovani iz periferne krvi zdravih dobrovoljaca, posredstvom Crvenog Krsta Nemačke (Ratingen, Germanv), kao što je opisano u prethodnom tekstu u Primeru 1, ali je sav materijal nabavljen iz Live Technologies, Germanv i testiran na endotoksin. Za analize aktivacije B ćelija, NK ćelija i monocita PBMC su kultivisane u kompletnom medijumu u koncentraciji od 2 x 10<6>ćelija/ml u 200 u.l u 96 pločama sa okruglim dnom u ovlaženom inkubatoru na 37°C. Različiti ODN, LPS (Sigma) ili IL-2 (R&D Svstems, USA) su korišćeni kao stimulusi. U naznačenim vremenskim tačkama, ćelije su prikupljene za protočnu citometriju.

Protočna citometrija: MAb upotrebljeni za bojenje površinskih antigena su bili: CD3, CD14, CD19, CD56, CD69, CD80 i CD86 (svi dobijeni iz Pharmingen/Becton Dickinson, Germanv). Za monocite Fc receptori su blokirani korišćenjem humanog IgG (Myltenyi, Germany) kao što je prethodno opisano (Bauer, M et al 1999lmmunology97:699). Podaci protočne citomerije od najmanje 1000 ćelija naznačene subpopulacije (B ćelije, monociti, NK ćelije, NKT ćelije ili T ćelije) su dobijeni na FACSCalibur (Becton Dickinson). Podaci su analizirani korišćenjem programa CellOuest (Becton Dickinson).

NK-posredovana citotoksičnost: PBMC su kultivisani tokom noći sa ili bez 6 pg/ml ODN ili 100 U/ml IL-2 na 37°C, 5% C02. Sledećeg jutra, K-562 target ćelije su obeležene sa fluorescentnom bojom, CFSE, kao što je prethodno opisano za humane B ćelije (Hartmann, G., and A. M. Krieg 2000J. Immunol.164:944). PBMC su dodati u različitim odnosima (50:1, 25:1 i 12.5:1) u 2 x 10<5>target ćelija i inkubirani 4 sata na 37°C. Ćelije su sakupljene i inkubirane sa DNK-specifičnom bojom 7-AAD (Pharmingen) za detekciju apoptotičnih ćelija. Rezultati su mereni protočnom citometrijom.

ELISA: PBMC (3 x 106 ćelija/ml) su kultivisane sa određenim koncentracijama ODN ili LPS tokom 24 časa (IL-6, IFNy i TNFa) ili 8 časova (IL-1B) u 48-komornim pločama u vlažnoj atmosferi na 37°C. Supernatanti su sakupljeni i citokini su mereni korišćenjem OPTeia ELISA Kompleta (Pharmingen) za IL-6, IFNy i TNFa ili Elipair ELISA analize (Hoelzel, Germanv) za IL-1 p na osnovu protokola proizvođača.

Primer 6: Aktivacija B ćelija indukovana od strane ODN koji nemaju CpG motive

U eksperimentima koji su opisani u prethodnom tekstu u Primeru 3, pokazali smo da su T-bogati ODN sposobni da aktiviraju B ćelije. Ovde smo proširili te studije korišćen jem dodatnog ODN, različite ćelije i izvora reagensa. U prvoj grupi eksperimenata, upoređivali smo aktivacioni potencijal različitih ne-CpG T-bogatih ODN sa veoma jakim poznatim CpG ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246). PBMC (2 x 10<6>ćelija/ml) davaoca krvi (n=2) su inkubirani sa naznačenim koncentracijama ODN-a 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 5126 (SEQ ID NO.: 1058) i 5162 (SEQ ID NO.: 1094). Ćelije su inkubirane 48 sati na 37°C kao što je prethodno opisano i bojene su sa mAb za CD19 (marker B ćelija) i CD86 (marker aktivacije B ćelija, B7-2). Ekspresija je merena protočnom citometrijom.

Korišćenjem različith koncentracija ODN -a, pokazali smo (SI. 4) da T-bogati ODN bez CpG motiva mogu indukovati stimulaciju humanih B ćelij a. ODN 5126 (SEQ ID NO.: 1058) koji sadrži samo pojedinačnu poli-T sekvencu, ali je više od 50% T, prouzrokovao je visoke nivoe aktivacije humanih B ćelija, lako postoje izvesne sličnosti sa SEQ ID NO.: 246 (npr., više od 80% T/G sadržaja), jasno je da ovom ODN nedostaje bilo koji poznati imunostimulatorni CpG motiv. Iznenađujuće, za sve testirane T-bogate ODN, najviši stimulatorni indeks je dobijen na koncentracijama između 3 i 10 u. g/ml. Najviši stimulatorni indeks testiranih ODN je dobijen sa CpG/T-bogatim ODN SEQ ID NO.: 246 na 0.4 u.g/ml. Interesantno, aktivnost se smanjila na visokim koncentracijama.

Poli A, Poli C i Poli T sekvence su sintetisane i testirane u odnosu na biološku aktivnost. PBMC (2 x 10<6>ćelija/ ml) jednog reprezentativnog donora (n=3) stimulisane su kao što je opisano u prethodnom tekstu sa 0.4 u.g/ml, 1.0 uxj/ml ili 10.0 ug/ml sledećih ODN: 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2196 (SEQ ID NO.: 913) (Poli T, 18 baza), 2194 (SEQ ID NO.: 911) (Poli T, 27 baza), 5162 (SEQ ID NO.: 1094) (Poli T, 30 baza), 5163 (SEQ ID NO.: 1095) (Poli A, 30 baza), 5168 (SEQ ID NO.: 1096) (Poli C, 30 baza) i 5169 (SEQ ID NO.: 1097) (Poli CG, 30 baza). Ekspresija aktivacionog markera CD86 (B7-2) na CD19-pozitivnim B ćelijama je merena protočnom citometrijom.

SI. 5 pokazuje da dužina sekvence, barem za Poli T ODN, ima važan uticaj na njenu aktivnost. Pokazano je da je poli T sekvenca koja sadrži samo 18 baza (SEQ ID NO.: 913) manje stimulatoma od one sa 27 baza (SEQ ID NO.: 911) ili one sa 30 baza (SEQ ID NO.: 1094) sa jasnim rangiranjem stimulacije: SEQ ID NO.: 1094 > SEQ ID NO.: 911 > SEQ ID NO.: 913. Nasuprot tome, Poli A (SEQ ID NO.: 1095) ili Poli CG (SEQ ID NO.: 1097) sekvence ne indukuju aktivaciju humanih B ćelija. Iznenađujuće, takođe je otkriveno da Poli C sekvence (SEQ ID NO: 1096) mogu da aktiviraju humane B ćelije bar na visokim koncentracijama (10Mg/ml) (SI. 5).

Druga dva T-bogata ODN-a, 1982 (SEQ ID NO.: 225) i 2041 (SEQ ID NO.: 282) koji nemaju CpG motive testirani su u odnosu na njihov efekat na humane B ćelije. PBMC (n=2) su inkubirani sa naznačenim koncentracijama ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), 1982 (SEQ ID NO.: 225) i 2041 (SEQ ID NO.: 282) kao što je opisano u prethodnom tekstu. Aktivacija B ćelija (ekspresija aktivacionog markera CD86) je merena protočnom citometrijom.

SI. 6 pokazuje da su T-bogati ne-CpG ODN imunostimulatorni na koncentracijama višim od 1 pg/ml. Inkorporacija CpG motiva u 1982 je povećala imunostimulatorsku aktivnost. Produžavanje sa Poli T sekvencom nije pojačalo imunostimulatorsku aktivnost ovog već T-bogatog ODN, već je malo smanjilo aktivacioni potencijal.

Primer 7: imunostimulacija ne- CpG ODN reflektuje se u povećanju aktivacije NK,

NK citotoksičnosti i aktivacije monocita

NK ćelije, kao i monociti testirane su u odnosu na njihov odgovor na ne-CpG ODN-e. PBMC (2 x 10<6>ćelije/ml) su inkubirani sa 6 ug/ml sledećih ODN (n=4): 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 911) i 5126 (SEQ ID NO.: 1058). Posle 24 časa kultivacije na 37°C ćelije su sakupljene i bojene sa mAb za CD3 (marker T ćelija), CD56 (marker NK ćelija) i CD69 (marker rane aktivacije) kao što je opisano u prethodnom tekstu. Ekspresija CD69 na CD56-pozitivnim NK ćelijama je merena protočnom citomtrijom.

SI. 7 pokazuje da se za Poli T ODN mogu posmatrati slični efekti kao što je opisano na SI. 5. Na stimulaciju NK ćelija, kao i B ćelija, može uticati dužina ODN. ODN 2183 (SEQ ID NO.: 433) (21 baza) je indukovao aktivaciju NK ćelija, ali do manjeg stepena od dužeg ODN 2194 (SEQ ID NO.: 911) (27 baza), kao što je izmereno povećanom ekspresijom markera rane aktivacije CD69. Takođe je pokazano da i ODN 5126 (SEQ ID NO.: 1058) aktivira humane NK ćelije (SI. 7).

Veruje se da se anti-tumorno dejstvo CpG ODN može proceniti sposobnošću ODN da poveća NK-posredovanu citotoksičnostin vitro.Pokazano je da ODN koji na 5' i 3' krajevima sadrže lance Poli G vode najvišoj indukciji citotoksičnosti (Ballas. Z. K., et al. 1996J. Immunol.157:1840). Da bi ispitali uticaj ne-CpG T-bogatog ODN na NK citotoksičnost, analizirali smo efekat ODN 2194 (SEQ ID NO.: 911) i 5126 (SEQ ID NO.: 1058) na NK-posredovanu lizu (SI. 8). NK-posredovana liza K-562 target ćelija je merena posle inkubacije PBMC tokom noći sa 6 ug/ml ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), SEQ ID NO.: 911 (SEQ ID NO.: 911) (Poli T, 27 baza) i 5126 (SEQ ID NO.: 1058) kao što je opisano u prethodnom tekstu. SEQ ID NO.: 1058 je pokazao mala povećanja u lizi od strane humanih NK ćelija u poređenju sa ne ODN. SEQ ID NO.: 911 i SEQ ID NO.: 246 dovode, čak u višem stepenu, do povećanja citotoksičnosti humanih NK ćelija.

Prethodni radovi pokazuju da su ne samo NK ćelije, nego i NKT ćelije posrednici citotoksičnih odgovora na ćelije tumora (14). Iz tog razloga smo posmatrali potencijalnu aktivaciju humanih NKT ćelija od strane T-bogatog ne-CpG ODN. PBMC jednog reprezentativnog davaoca (n=2) su inkubirani sa 6 ug/ml ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (EQ ID NO.: 913) i 5126 (SEQ ID NO.: 1058) 24 časa kao što je opisano u prethodnom tekstu. Aktivacija NKT ćelija je merena protočnom citometrijom posle bojenja ćelija sa mAb za CD3 (marker T ćelija), CD56 (marker NK ćelija) i CD69 (marker rane aktivacije). Prikazana je ekspresija CD69 na CD3 i CD56 dvostruko-pozitivnim ćelijama (NKT ćelije).

Na SI. 9, nađeno je da SEQ ID NO.: 911 kao i SEQ ID NO.: 1058 stimulišu NKT ćelije. Slično NK ćelijama SEQ ID NO.: 911 (Poli T) je aktivniji od SEQ ID NO.: 1058. Dodatno, kao što je opisano u prethodnom tekstu za B ćelije i NK ćelije, dužina ODN ima izvestan uticaj na imunostimulatorni potencijal, sa tim da duži ODN ima jače efekte na NKT ćelije. Slični rezultati su primećeni za humane T ćelije.

Drugi tip ćelija imunog sistema koje su uključene u borbu protiv infekcija jesu monociti. Ove ćelije se oslobađaju po aktivaciji različitih citokina i mogu sazreti u dendritske ćelije (DC), profesionalne antigen-prikazujuće ćelije (Roitt, I., J. Brostoff i D. Male. 1998.lmmunology.Mosby, London). SI. 10 prikazuje aktivaciju humanih monocita posle kultivisanja PBMC sa različitim ODN. PBMC (2 x 106 ćelija/ml) su inkubirani sa 6 \ ig/ m\ 2006 (SEQ ID NO.: 246), 2117 (SEQ ID NO.: 358), 2137 (SEQ ID NO.: 886), 2178 (SEQ ID NO.: 1096), 2183 (SEQ ID NO.: 433), 2194 (SEQ ID NO.: 911), 5126 (SEQ ID NO.: 1058) i 5163 (SEQ ID NO.: 1095) tokom noći na 37° C kao što je opisano u prethodnom tekstu (n=3). Ćelije su sakupljene i bojene na CD14 (marker monocita) i CD80 (B7-1, aktivacioni marker). Ekspresija je merena protočnom citometrijom.

Kao što je pokazano u prethodnom tekstu za NK i B ćelije, T -bogate sekvence (npr., SEQ ID NO.: 433, SEQ ID NO.: 911) različite dužine indukuju stimulaciju monocita, ali imaju različite nivoe aktivnosti npr., SEQ ID NO.: 433 > SEQ ID NO.: 911. Nasupot tome, Poli A (SEQ ID NO.: 1095) kao i Poli C (SEQ ID NO.: 1096 (2178) sekvence ne vode ka aktivaciji monocita (mereno ushodnom regulacijom CD80 na koncentraciji od 6 ug/ml ODN).

Primeri 8: indukcija oslobađanja citokina od strane ne -CpG ODN

Kao sledeće, ispitivana je sposobnost različitih T-bogatih ODN da utiču na citokinski milje. PBMC (3 x 10e ćelija/ml) su kultivisani 24 časa bez ili sa 6 u.g/ml naznačenih ODN ili 1ug/ml LPS kao pozitivna kontrola (n=2). Posle inkubacije supernatanti su sakupljeni i TNFa je meren pomoću ELISA kao što je opisano u pretodnom tekstu i rezultati su prikazani na SI. 11. PBMC su kultivisani sa naznačenim ODN (1.0 ug/ml) kao što je opisano na SI. 11 i IL-6 je meren u supernatantima pomoću ELISA i rezultati su prikazani na SI. 12.

SI. 11 i 12 pokazuju da T-bogati ne-CpG i T-bogati/CpG ODN mogu indukovati lučenje pro-inflamatornih citokina TNFa i IL-6. Za oba ciokina, nađeno je da je ODN 5126 (SEQ ID NO.: 1058) potentan kao ODN 2194 (SEQ ID NO.: 911). Poznato je da CpG ODN utiču na ravnotežu Th1/Th2 preferencijalnim indukovanjem Th1 citokina (Krieg, A. M. 1999Biochemica et Biophysica Acta 93321:1).Da bi testirali da li T-bogati ODN izaziva sličnu pramenu ka Th1 citokinima, merena je proizvodnja IFNy kod PBMC. U prvoj grupi eksperimenata, pokazano je da, kao što je opisano za IL-6 i TNFa, ODN SEQ ID NO.: 1058 i SEQ ID NO.: 911 indukuju oslobađanje uporedivih količina ovog Th1 citokina IFNy . Dodatno, pokazano je da je drugi pro-inflamatorni citokin, IL-1B, oslobođen posle kultivisanje PBMC sa ova dva ODN-a. lako je količina ova dva citokina indukovana sa T-bogatim ODN koji nema CpG motive bila manja nego kada je korišćen CpG ODN SEQ ID NO.: 246, količine indukovane sa T-bogatim ODN su bile značajno veće od kontrole.

Primeri 9- 11

Uvod:

Ovde je opisan optimalni CpG motiv za aktivaciju imunog sitema kod ne-glodarskih kičmenjaka. Nađeno je da fosfodiestarski oligonukleotid koji sadrži ovaj motiv snažno stimuliše CD86, CD40, CD54 i MHC II ekspresiju, IL-6 sintezu i proliferaciju primarnih humanih B ćelija. Ovi efekti zahtevaju internalizaciju oligonukleotida i endozomalno sazrevanje. Ovaj CpG motiv je povezan sa produženom indukcijom NFkB p50/p65 heterodimera i kompleksa aktivirajućeg proteina-1 transkripcionog faktora (AP-1). Aktivaciji transkripcionog faktora od strane CpG DNK prethodi povećana fosforilacija stres kinaza c-jun NH2terminalne kinaze (JNK) i p38 i aktivirajućeg transkripcionog faktora -2 (ATF-2). Nasuprot CpG, signalizacija preko receptora B ćelije vodi ka aktivaciji kinaze ekstracelularnog receptora (ERK) i ka fosforilaciji različitih izoformi

JNK.

Materijal i metode:

Oligodezoksinukleotidi:Nemodifikovani (fosfodiestarski, PE) i modifikovani otporan na nukleazu (fosforotioatni, PS) ODN je nabavljen iz Operon Technologies (Alameda, CA) i Hvbridon Specialtv Products (Milford, MA). Upotrebljene sekvence su date u Tabeli H. DNK £.colii DNK timusa teleta su nabavljeni iz Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Uzorci genomske DNK su prečišćeni ekstrakcijom sa fenol -hloroform-izoamil alkoholom (25/24/1) i precipitacijom sa etanolom. DNK je prečišćena iz endotoksina ponovljenim ekstrakcijama sa triton x-114 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i testirana na endotoksin korišćenjem LAL-analize (LAL-analiza BioVVittaker, VValkersville, MD; donja granica detekcije 0.1 EU/ml) i visoko osetljive analize za endotoksin koja je ranije opisana (donja granica detekcije 0.0014 EU/ml) (Hartmann G., and Krieg A. M. 1999. CpG DNA and LPS induce distinct patterns of activation in human monocyt.es.Gene therapy6:893). Sadržaj endotoksina DNK uzoraka je bio ispod 0.0014 EU/ml. DNKE. colii timusa teleta su pretvorenu u jednostruke lance pre upotrebe i to ključanjem 10 minuta, nakon čega sledi hlađenje na ledu od 5 minuta. Uzorci DNK su razblaženi u TE-puferu korišćenjem pirogen -oslobođenih reagenasa.

Pripremanje i kultura ćelija:Humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz periferne kn/i zdravih dobrovoljaca pomoću Ficoll-Paque centrifugiranja na osnovu gradijenta gustine (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kao što je opisano (Hartmann G., et al 1996Antisense Nucleic Acid Drug Dev6:291)) Ćelije su suspendovane u RPMI 1640 medijumu kulture kome je dodato 10% (v/v) toplotom inaktiviran {56°C, 1 h) FCS (HvCIone, Logan, UT), 1.5 mM L-glutamin, 100 U/ml penicilina i 100 ug/ml streptomicina {svi iz Gibco BRL, Grand Island, NY) (kompletan medijum). Sva jedinjenja su nabavljena kao testirana na endotoksin. Vijabilnost je određivana pre i posle inkubacije sa ODN postupkom isključivanja sa tripan plavim (konvencionalna mikroskopija) ili postupkom isključivanja sa propidijumjodidom (analiza protočne citometrije). U svim eksperimentima, 96% do 99% PBMC je bilo vijabilno. Ćelije (krajnja koncentracija 1 x 106 ćelija/ml) su kultivisane u kompletnom medijumu u 5% C02vlažnom inkubatoru na 37 °C. Kao stimulusi su korišćeni različiti oligonukleotidi (pogledati tabelu I, koncentracija kao što je naznačeno u legendama za slike), LPS (izSalmonella typhimurium,Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ili anti-IgM. Hlorohin (5 jag/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) je upotrebljen da blokira endozomalno sazrevanje/zakišeljavanje. U naznačenim vremenskim tačkama, ćelije su sakupljene za protočnu crtometriju kao što je opisano u daljem tekstu.

Za proučavanja signalne transdukcije, humane primarne B-ćelije su izolovane imunomagnetnim sortiranjem ćelija korišćenjem VARIOMACS tehnike (Miltenvi Biotec Inc., Auburn, CA) kao što je opisano od strane proizvođača. Ukratko, PBMC dobijeni iz tankog sloja leukocita dobijenog centrifugiranjem krvi zdravih davaoca (Elmer L. DeGowin Blood Center, Universitv of lowa) inkubirani su sa antitelima konjugovanim sa mikrogranulama na CD19 i propušteni preko kolone za pozitivnu selekciju. Čistoća B ćelija je bila viša od 95%. Posle stimulacije, pripremljeni su ekstrakti celih ćelija (VVestern blot) i ekstrakti jedara (EMSA) za studije signalne transdukcije.

Za studije proteina koji se vezuje za CpG, uzgajane su Ramos ćelije (linija humanih B ćelija Burkitt limfoma, ATCC CRL-1923 ili CRL-1596; lntervirology 5: 319-334, 1975) u kompletnom medijumu. Netretirane ćelije su sakupljene i ekstrakti citosolnih proteina su pripremljeni i analizirani na prisustvo proteina koji se vezuju za CpG oligonuklotid pomoću EMSA i UV-crosslink (stvaranje unakrsnih veza pod UV) kao što je opisano u daljem tekstu.

Protočna citometrija:Bojenje površinskih antigena je izvedeno kao što je prethodno opisano (Hartmann G. Et al. 1998J Pharmacol Exp Ther285:920). Monoklonalna antitela na HLA-DR su nabavljena iz Immunotech, Marseilie, France. Sva ostala antitela su nabavljena iz Pharmingen, San Diego, CA: mABs za CD19 (B43), CD40 (5C3), CD54 (HA58), CD86 (2331 (FUN-1)). IgGi.K(MOPC-21) i lgG2b,Ksu korišćeni za kontrolu za specifično bojenje. Intracelularno citokinsko bojenje za IL-6 je izvedeno kao što je opisano (Hartmann G., and Krieg A. M. 1999. CpG DNA and LPS induce distinct patterns of activation in human monocyt.es.Gene Therapy6:893). Ukratko, PBMC (krajnja koncentracija 1 x 105 ćelija/ml) su inkubirani u prisustvu brefeldina A (krajnja koncentracija 1 u.g/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Posle inkubacije, ćelije su sakupljene i bojene korišćenjem FITC-obeleženog mAB na CD19 (B43), PE-obeležen pacovski anti-humani IL-6 mAb (MQ2-6A3, Pharmingen) i Fix i Perm kompleta (Caltag Laboratories, Burlingame, CA). Podaci protočne citometrije za 5000 ćelija po uzorku su dobijeni na FACScan (Becton Dickinson lmmunocytometry Systems, San Jose, CA). Ne-vijabilne ćelije su isključene iz analiza bojenjem propidijumjodidom (2 ug/ml). Podaci su analizirani korišćenjem kompjuterskog programa FlowJo (version 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).

Proliferaciona analiza:CFSE (5-(i-6-) karboksifluorescein diacetat sukcinimidil estar, (Molecular Probes, USA) je iz fluoresceina izvedeni intracelulami fluorescentni obeleživač koji je jednako podeljen između sestrinskih ćelija po sle ćelijske deobe. Bojenje ćelija sa CFSE omogućava i kvantifikaciju i imunofenotipizaciju (fikoeritrin-obeležena antitela) proliferišućih ćelija u mešanoj ćelijskoj suspenziji. Ukratko, PBMC su dva puta ispirani u PBS, resuspendovani u PBS koji sadrži CFSE u krajnjim koncentracijama od 5 u.M i inkubirani na 37°C 10 minuta. Ćelije su ispirane tri puta sa PBS i inkubirane pet dana kao što je naznačeno u legendama slika. Proliferišuće CD19-pozitivne B ćelije su identifikovane po smanjenom sadržaju CFSE korišćenjem protočne citometrije.

Pripremanje ekstrakta ceiih ćelija, jedarnog ekstrakta i ekstrakta proteina citosola:Za VVestern blot analize, pripremljeni su ekstrakti celih ćelija. Primarne B ćelije su tretirane sa medijumom, fosfodiestarnim oligonukleotidima 2080 (SEQ ID NO.: 321) ili 2078 (SEQ ID NO.: 319) na 30 u.g/ml, ili anti-lgM (10 ug/ml). Ćelije su sakupljene, ispirane dva puta sa ledeno-hladnim PBS koji sadrži 1 mM Na3V04, resuspendovane u puferu za lizu (150 mM NaCI, 10 mM TRIS pH 7.4, 1% NP40, 1 mM Na3V04, 50 mM NaF, 30 mg/ml leupeptina, 50 mg/ml aprotinina, 5 mg/ml antipaina, 5 mg/ml pepstatina, 50 u.g/ml fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF)), inkubirane

15 min na ledu i okretane na 14000 rpm 10 minuta. Supernatant je zamrznut na -80°C. Za pripremanje jedarnih esktrakata primarne B ćelije su resuspendovane u hipotoničnom puferu *

(10 mM HEPES/KOH (pH 7.9), 10 mM KCI, 0.05% NP40, 1.5 mM MgCI2, 0.5 mM ditiotreitol (DTT), 0.5 mM PMSF, 30 mg/ml leupeptina, 50 mg/ml aprotinina, 5 mg/ml antipaina, 5 mg/ml pepstatina). Posle 15 minuta inkubacije na ledu, suspenzija je centrifugirana na 1000 x g 5 minuta. Nataložena jedra su resuspendovana u ekstrakcioni pufer (20 mM HEPES (pH 7.9), 450 mM NaCI, 50 mM NaF, 20% glicerol, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 30 mg/ml leupeptina, 50 mg/ml aprotinina, 5 mg/ml antipaina, 5 mg/ml pepstatina) i inkubirani

na ledu jedan sat. Jedarna suspenzija je centrifugirana 10 minuta na 16,000 g na 4°C. Supernatant je sakupljen i čuvan na -80°C. Citosolni ekstrakti za studije CpG vezujućeg proteina su pripremljeni od nestimulisanih Ramos ćelija, koje su lizirane sa hipotoničnim puferom kao što je opisano za pripremanje jedarnog ekstrakta. Posle centrifugiranja, supernatant je uklonjen kao citoplazmatična frakcija i č uvan je na -80°C. Koncentracije proteina su merene korišćenjem Bradford analize proteina {Bio-Rad, Hercules, CA) na osnovu uputstava proizvođača.

VVestern blot analiza:Jednake koncentracije proteinskih ekstrakata celih ćelija (25 (j.g/liniji) su kuvani u SDS puferu (50 mM Tris-CI, pH 6.8; 1% B-merkaptoetanol; 2% SDS; 0.1% bromfenol plavo; 10% glicerol) 4 minuta pre podvrgavanja elektroforezi na 10% poliakrilamidnom gelu koji sadrži 0.1% SDS (SDS-Page). Posle elekroforeze, proteini su preneseni do Immobilion-P transfer membrana (Millipore Corp. Bedford, MA). Blotovi su blokirani sa 5% nemasnim suvtm mlekom. Korišćena su specifična antitela protiv fosforilisane forme kinaze ekstracelularnog receptora (ERK), c-jun NH2-terminalne kinaze (JNK), p38 i aktivirajućeg transkripcionog faktora-2 (ATF-2) (New England BioLabs, Beverlv, MA). Blotovi su razvijeni u reagensu pojačane hemilu miniscencije (ECL; Amersham International, Aylesbury, U.K.) na osnovu prcedure koju je preporučio proizvođač.

Analiza pomeranja elektroforetske pokretljivosti (EMSA):Da bi se detektovala DNK-vezujuća aktivnost aktivirajućeg proteina-1 transkripcionog faktora (AP-1) i NFkB, jedarni ekstrakti (1 u.g/liniji) su analizirani pomođu EMSA korišćenjem dsODN 5' GAT CTA GTG ATG AGT CAG CCG GAT C 3' (SEQ ID NO.: 838) koji sadrži AP-1 vezujuću sekvencu i NFkB URE iz c-myc promotor regiona 5' TGC AGG AAG TCC GGG TTT TCC CCA ACC CCC C 3' (SEQ ID NO.: 1142), kao pobe. ODN su obeleženi na krajevima sa T4-polinukleotid kinazom (New England Biolabs) i (y-<32>P) ATP (Amersham, Ariington Heights, IL). Reakcije vezivanja su izvedene sa 1 u.g ekstrakta jedarnog proteina u DNK-vezujućem puferu (10 mM Tris-HCI (pH 7.5), 40 mM MgCI2, 20 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 8% glicerol i 100-400 ng poli (dl-dC) sa 20.000-40.000 cpm obeleženog ODN u 10 u.l ukupne zapremine. Specifičnost NFkB traka je potvrđena studijama kompeticije sa hladnim oligonukleotidima iz nesrodnih vezujućih mesta transkripcionog faktora (10-100 ng). Za analizu superpomeranja (supershift), u reakcionu smešu je dodavano 2 ug specifičnih antitela ZA C-Rel, p50 i p65 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) 30 minuta pre nego što je dodata radioaktivno obetežena proba. Posle inkubacije od 30 minuta na sobnoj temperaturi dodat je pufer za punjenje i probe su podvrgnute elektroforezi na 6% poliakrilamidnom gelu u Tris-borat-EDTA puferu (90 mM Tris, 90 mM borna kiselina, 2 mM EDTA, pH 8.0). Gelovi su sušeni i zatim autoradiografisani.

UV-unakrsno vezujuća i denaturišuća elektoroforeza proteina: Jedarni ekstrakti su inkubirani sa obeleženim fosfodiestarskim oligonukleotidom kao što je opisano za EMSA. DNK-protein kompleksi su unakrsno vezivani UV-zračenjem u Stratalinker (Stratagene) 10 minuta. Probe su mešane sa SDS-uzorkom pufera, ključale su 10 minuta i sipane na 7.5% SDS-PAGE. Gel je sušen na VVhatman papiru i podvrgnut je autoradiografiji. Nanošenje tačaka razdaljine nasuprot molekularne težine proteinskih markera je proizvelo standardnu krivu koja je upotrebljena za izračunavanje približne molekularne težine unaksno vezanih protein-ODN kompleksa. Molekularna težina oligonukleotida je oduzeta od ove vrednosti da bi se dobila veličina.

Primer 9: Identifikacija optimalnog CpG motiva za njegovo samostalno korišćenje

ili u kombinaciji sa T- bogatim ODN

Fosforotioatni oligonukleotidi koji sadrže CpG motiv GACGTT (SEQ ID NO.: 1143) miševa (na primer 1826 (SEQ ID NO.: 69)) i koji su upotrebljeni u koncentracijama koje su aktivne kod B ćelija miševa (Yi A. K., Chang M., Peckham D. W., Krieg A. M., and Ashman R. F. 1998. CpG oligodeoxyribonucleotides rescue mature spleen B cells from spontaneous apoptosis and promote cell cycle entry.J. Immunol160:5898), su pokazali malo ili nimalo imunostimulatornog dejstva na humane imune ćelije. Nađeno je da u višim koncentracijama ovaj ODN pokazuje izvestan stimulatorni efekat na humane B ćelije.

U ranijim studijama aktivacije B ćelija kod miševa, nađeno je da su CpG nukleotidi koji su ograničeni sa dva 5' purina i dva 3' pirimidina i poželjno 6mer motiv 5' GACGTT 3' (SEQ ID NO.: 1143) bili optimalni za aktivnost fosfodiestarskog oligonukleotida (Krieg A. M., et al. 1995Nature374:546, Yi A. K., Chang M., et al., 1998J Immunol160:5898).

Da bi se identifikovao optimalan motiv za stimulaciju imunog odgovora kod ljudi i ne-glodarskih kičmenjaka stvorili smo serije ODN i testirali njihovu aktivnost. Prvo smo konstruisali 20merni fosfodiestarski oligonukleotid sa TC dinukleotidom na 5' kraju koji prethodi optimalnom mišjem CpG motivu 5' GACGTT 3' (SEQ ID NO.: 1143), a posle koga se nalazi poli C rep (2079: 5' TCG ACG TTC CCC CCC CCC CC 3' (SEQ ID NO.: 320)). Ukoliko se ovaj oligonukleotid doda humanim primarnim B ćelijama pod istim uslovima koji su određeni kao optimalni za DNKE. coli(ponovljeno dodavanje na 0 sati, 4 sata i 18 sati, 30 pg/ml za svaku tačku vremena) on stimuliše visok nivo ekspresije CD86 na humanim b ćelijama posle dva dana. Da bi odredili strukturno-funkcionalni odnos CpG motiva, zamenili smo baze koje su susedne CpG dinukleotidima, dok smo zadržali dva CpG oligonukleotida unutar sekvence. Zamena adenina koji se nalazi između oba CpG dinukleotida timidinom (2080 (SEQ ID NO.: 321)) je rezultovalo u malo većoj aktivnosti. Zamena sa guanozinom (2100 (SEQ ID NO.: 341)) ili citidinom (2082 (SEQ ID NO.: 323)) na toj poziciji nije pokazala neke velike promene u poređenju sa 2079 (SEQ ID NO.: 320). Nasuprot tome, zamena timidina 3' u drugom CpG dinukleotidu purinskim guanozinom (2099 (SEQ ID NO: 340)) ili adeninom (2083 (SEQ ID NO.: 324)) je rezultovala u velikom padu aktivnosti oligonukleotida, dok je pirimidinski citidin izazvao samo malo smanjenje. Timidin neposredno 5' do prvog CpG oligonukleotida je takođe važan. Zamena timidina bilo kojom drugom bazom (2105 (SEQ ID NO.: 346), guanozinom; 2107 (SEQ ID NO.: 348), adeninom; 2104 (SEQ ID NO.: 345), citidinom) je vodila ka uočljivom smanjenju aktivnosti oligonukleotida. Eliminacija prvog (2108 (SEQ ID NO.: 349)) ili drugog (2106 (SEQ ID NO.: 347)) CpG dinukleotida je takođe delimično smanjila aktivnost.

Dodavanje više 5' GTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1144) CpG motiva fosfodiestarskom oligonukleotidu koji sadrži 8mer dupleks CpG motiv (5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1145), 2080 (SEQ ID NO.: 321)) nije dodatno povećalo ekspresiju CD86 na B ćelijama (2059 (SEQ ID NO.: 300)). Oligonukleotid sa istom sekvencom kao 2080 (SEQ ID NO.: 321), ali sa fosoforotioatnim osnovnim lancem nije pokazao aktivnost iznad osnovnog nivoa (2116 (SEQ ID NO.: 357)). Ovo je bilo iznenađujuće s obzirom da je pokazano da fosforotioatnu okosnicu veoma stabilizuje oligonukleotide i povećava CpG-indukovanu stimulaciju (Krieg A. M., Yi A. K., Matson S., VValdschmidt T. J., Bishop G. A., Teasdale R., Koretzkv G. A., and Klinman D. M. 1995. Cpg motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation.Nature374:546). Zbog toga smo izveli dodatne strukturno-funkcionalne analize fosforotioatnih oligonukleotida koji sadrže 5' GTCGTT 3<*>(SEQ ID NO.: 1144) i 5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1145) motive, a analize su pokazale da dodatni CpG motivi (2006 (SEQ ID NO.: 246)) teže da povećaju aktivnost fosoforotioatnih oligonukleotida.

Prečišćene B ćelije izolovane iz periferne krvi imunomagnetskim sortiranjem ćelija su aktivirane sa CpG DNK do istog stepena kao neprečišćene B ćelije unutar PBMC. Prema tome, aktivacija B ćelija je primarni odgovor, a ne sekundarni efekat izazvan citokinima koje su izlučile druge ćelije.

Pored ko-stimulatornog molekula CD86, funkcionalni stadijum B ćelija je okarakterisan i ostalim površinskim markerima. Na primer, aktivirane T pomoćne ćelije stimulišu B ćelije CD40 ligacijom, intracelularni adhezioni molekul-1 (ICAM-1, CD54) posreduje u vezivanju za ostale imune ćelije, a glavni kompleks histokompatibilnosti II (MHC II) je odgovoran za prikazivanje antigena. Pronašli smo da je B ćelijska ekspresija CD40, CD54 i MHC II bila ushodno regulisana saCpG oligonukleotidom 2080 (SEQ ID NO.: 321). Ne-CpG kontrolni oligonukleotid 2078 (SEQ ID NO.: 319) nije pokazao nikakvu aktivnost u poređenju sa samim medijumom.

Kada su PBMC inkubirani 5 dana u prisustvu 2080 (SEQ ID NO.: 321) (dodat na 0 sati, 4 sata, 18 sati i svako naredno jutro), bilo je intrigirajuće da se kod subpopulacije limfocita povećala veličina ćelija (FSC) i da su postale granuliranije (SSC). Da bi ispitali ovu subpopulaciju predstavljenu proliferišućim B ćelijama, bojili smo sveže izolovane PBMC sa CFSE (5-(i -6-) karboksifluorescein diacetat sukcinimidil estar) na dan 0 i inkubirali ih 5 dana sa 2080 (SEQ ID NO.: 321) kao u prethodnom tekstu. CSFE je fluorescentni molekul koji se ireverzibilno vezuje za ćelijske proteine. Svaka deoba ćelija smanjuuje CFSE bojenje za 50%. Pronađeno je da su ćelije koje se slabo boje sa CFSE (proliferišuće ćelije) većinom CD19 - pozitivne B ćelije. U roku od pet dana oligon ukleotid 2080 (SEQ ID NO.: 321) je indukovao 60 do 70% CD19 pozitivnih B ćečlija da proliferišu. Kontrolni oligonukleotid 2078 (SEQ ID NO.: 319) indukuje manje od 5% B ćelija da proliferišu. Proliferišuće B ćelije (CFSE slabo) su pokazale veću veličinu ćelija (FSC) i veću granuliranost.

Proliferišuće B ćelije su eksprimirale veće nivoe CĐ86 od ne -proliferišućih ćelija (nije pokazano). U skladu sa ovim pronalaskom, oligonukleotidna grupa koji je prethodno testirana za indukciju CD86 ekspresije je rezultirala u skoro identičnom obrascu proliferacije B ćelija. Zamena 3' timidina je smanjila aktivnost više od promene timidina u srednjoj poziciji.

Primer 10: Aktivacija B ćelija zahteva endozomalno sazrevanje/ zakišeljavanje

Prethodno je pokazano da hlorohin, inhibitor endozomalnog zakišeljavanja, blokira CpG-posredovanu stimulaciju antigen prikazujućih ćelija i b ćelija miševa, dok ne utiče na LPS-posredovane efekte (Hacker H„ et al 1998Embo J17:6230, Yi A. K. Et al 1998J Immunol160:4755, Macfarlane D. E., and Manzel L. 1998J Immunol160:1122). Pronašli smo da dodavanje 5 ug/ml hlorohina kompletno blokira CpG DNK-posredovanu indukciju CD86 ekspresije na primarnim B ćelijama (MFI CD86: 2006 (SEQ ID NO.: 246), 4.7 vs 1.4; DNKE. coli,3.4 vs. 1.4; samo medijum, 0.9; n=4). Dodatno, hlorohin kompletno inhibira indukciju proliferacije B ćelija fosforotioatnim oligonukleotidom 2006 (SEQ ID NO.: 246) što je mereno sa CFSE proiiferacionom analizom kao i sa standardom. Ovi rezultati sugerišu da kao i sa ćelijma miša, aktivacija B ćelija sa CpG DNK zahteva unos DNK u endozome i zatim i endozomalno zakišeljavanje.

Primer 11: Analiza sub- ćelijskih događaja koji nastaju posle stimulacije humanih

B ćelija sa optimalnim humanim ODN

S obzirom da su CpG motivi za maksimalnu aktivaciju B ćelija značajno različiti između miševa (GACGTT) (SEQ ID NO.: 1143) i ljudi (TCGTCGTT) (SEQ ID NO.: 1145), interesovalo nas je da li se osnovni intracelularni signalizirajući događaji mogu upoređivati. Brza indukcija NFkB vezujuće aktivnosti je ranije pronađena kod B ćelija i makrofaga miševa (Stacey K. J., et al 1996J Immunol157:2116, Yi A. K. et al 1998J Immunol160:4755). Da bi ispitali NFkB odgovor na CpG DNK kod ljudi, izolovane su humane primarne B ćelije iz periferne krvi imunomagnetnim sortiranjem ćelija i inkubirane su sa CpG oligonukleotidom 2080 (SEQ ID NO.: 321), ne-CpG kontrolnim oligonukleotidom 2078 (SEQ ID NO.: 319), ili medijumom. U naznačenim vremenskim tačkama, ćelije su sakupljene i pripremljeni su jedarn i ekstrakti. U prisustvu CpG oligonukleotida, NFkB vezujuća aktivnost je povećana u okviru jednog sata i zadržana do 18 sati (najkasnija vremenska tačka koja je ispitivana). Ne -CpG kontrolni oligonukleotid 2078 (SEQ ID NO.: 319) nije pokazao povećanu NFkB aktivnost u poređenju sa ćelijama koje su inkubirane samo sa medijumom. NFkB traka je identifikovana hladnom kompeticijom, a pomoću testa superpomeranja (supershift) pokazano je da se sastoji od p50 i p65 podjedinica.

Aktivirajući protein-1 (AP-1) trans kripcioni faktor je uključen u regulaciju ranih gena i ekspresije citokina (Karin M. 1995. The regulation AP-1 activity by mitogen-activated protein kinases.J Biol Chem270:16483). Kod B ćelija miševa, AP-1 vezujuća aktivnost je indukovana kao odgovor na CpG DNK (Yi A. K., and Krieg A. M. 1998. Rapid induction of mitogen-activated protein kinases by immune stimulaton/CpG DNA.J Immunol161:4493). Da bi odredili da li bi ovaj transkripcioni faktor bio indukovan sa CpG DNK kod ljudi, ispitali smo AP-1 DNK vezujuću aktivnost kod humanih primarnih B ćelija. Ćelije su inkubirane sa CpG oligonukleotidom 2080 (SEQ ID NO.: 321) ili kontrolnim oligonukleotidom 2078 (SEQ ID NO.: 319). Jedarni ekstrakti su pripremljeni i AP-1 vezujuća aktivnost je analizirana sa EMSA. AP-1 vezujuća aktivnost je pojačana u okviru jednog sata i povećavala se sve do 18 sati (najkasnija vremenska tačka koja je ispitivana), pokazujući produženi odgovor.

S obzirom da je AP-1 aktivnost indukovana mnogim stimulusima (Angel P., and Karin M. 1991. The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation and transformation.Biochim Biophys Acta1072:129), zanimali su nas putevi prenosa signala uzvodno od AP-1. AP-1 transkripcioni faktor kompleks je integrisao različite puteve mitogen aktivirane protein kinaze (MAPK) (Karin M. 1995. The regulation of AP-1 avtivity by mitogen-activated protein kinases.J S/o/ Chem270:16483). VVestern blotovi su izvedeni korišćenjem ekstrakata celih ćelija iz primarnih B ćelija inkubiranih sa CpG oligonukleotidom 2080 {SEQ ID NO.: 321), kontrolnim 2078 (SEQ ID NO.: 319), ili samo sa medijumom. Upotrebljena su specifična antitela za fosforilisani oblik JNK, p38, ATF-2 i ERK. Jaka indukcija JNK fosforilacije je nađena 30 minuta i 60 minuta posle izlaganja CpG-DNK, dok ne-CpG oligonukleotid nije pokazao nikakvu aktivnost iznad osnovnog nivoa. Protein kinaza p38, druga stres aktivirana protein kinaza (SAPK), je takođe fosforilisana kao odgovor na CpG DNK u okviru od 60 minuta. ATF-2, supstrat i p38 i JNK (Gupta S., Campbell D„ Derijard Đ., and Daviš R. J. 1995 Transcription factor ATF2 regulation by the JNK signal transduction pathway.Science267:389) i komponenta AP-1 kompleksa, su pokazali slabu fosforilaciju posle 30 minuta, koja se povećala posle 60 minuta. CpG DNK nije uspela da indukuje značajnu fosforilaciju ERK. Nasuprot tome, anti-IgM, koji stimuliše B ćelijski receptor, je pokrenuo fosforilaciju ERK. Anti- IgM su aktivirale različite izoforme JNK od CpG DNK.

Primer 12: Analiza in vivo aktivnosti adjuvanta

Razvijena jein vitroskrining analiza za identifikovanje ODN kao adjuvantain vivokod ljudi i ostalih ne-glodarskih životinja. S obzirom da smo videli ne samo kvantitativne već i kvalitativne razlike u aktivnostima različitih CpG ODN kod miševa, prvo smo izvršili skrining grupe CpG i ne-CpG kontrolnih ODN na ćelijama miševa da bi pronašliin vitroanalize sa pouzdanom i snažnom korelacijom sain vivoaktivnošću adjuvanta sa površinskim antigenom hepatitisa B (HbsAg). Zatim smo sistematski testirali grupu od više od 250 ODN u odgovarajućim humanim analizama da bi identifikovali sekvence sain vitroimunostimulatornom aktivnošću. Sledeće smo ispitivali da li ODN sa najvećom aktivnošću u ovim humanim analizama takođe aktivira proliferaciju B ćelija kod šimpanza i majmuna, i konačno, da li su oni aktivni kao adjuvanti sa HbsAg kod šimpanza i makaka majmuna( Macaca cvnomolgus) in vivo.Ove studije su otkrile da sekvenca, broj i razmak pojedinačnih CpG motiva doprinosi imuostimulatornoj aktivnosti CpG fosforotioatnog ODN. ODN sa TC dinukleotidom na 5' kraju, posle koga se nalaze tri 6mer CpG motiva (5' GTCGTT 3') razdvojena sa TT dinukleotidima dosledno pokazuju najveću aktivnost za leukocite ljudi, šimpanzi i r ezus majmuna. Šimpanze ili majmuni koji su vakcinisani jednom protiv hepatitisa B sa ovim CpG ODN adjuvantom su razvili 15 puta više titre anti-HBs antitela od onih koji su primili samu vakcinu.

Materijal i metode

Oligodezoksinukleotidi: Fosforotioatno-modifikovani ODN je nabavljen iz Operon Technologies (Alameda, CA) i Hvbridon Specialtv Products (Milford, MA). ODN su testirani na endotoksin korišćenjem LAL-analize (LAL-analiza BioVVittaker, VValkersville, MD; donja granica detekcije 0.1 EU/ml). Zain vivoanalize, ODN su razblaženi u TE-puferu (10 mM Tris, pH 7.0, 1 mM EDTA) i čuvani na -20°C. Zain vivoupotrebu, ODN su razblaženi u fosfatno puferisanom slanom rastvoru (0.1 M PBS, pH 7.3) i čuvani na 4°C. Sva razblaženja su izvedena korišćenjem pirogen -oslobođenih reagenasa.

Ćelijske kulture slezine miševa: Slezine su uklonjene iz ženki starih 6-12 nedelja BALB/c (The Jackson Laboratorv), 2 x 106 splenocita je kultivisano sa 0.2 |iM ODN 4 sata (TNF-a) ili 24 časa (IL-6, IFN-y, IL-12), a citokini su detektovani pomođu ELISA kao što je prethodno opisano (Yi A. K., Klinman D. M., Martin T. L., Matson S., and Krieg A. M. 1996. Rapid immune

activation by CpG motifs in bacterial DNA. Svstemic induction of IL-6 transcription through an antioxidant-sensitive pathway.J Immunol157:5394). Da bi procenili CpG-indukovanu proliferaciju B ćelija, ćelije slezine su očišćene od T ćelija sa anti-Thy-1.2 i komplementom i centrifugiranjem preko lympholyte M<®>(Cedarlane Laboratories, Hornby, ON, Canada), kultivisane 44 sata sa naznačenim ODN, a zatim radioativno obeležavane 4 sata sa 1 u.Ci<3>H timidinom kao što je prethodno opisano (Krieg A. M., Yi A. K., Matson S., VValdschmidt T. J., Bishop G. A., Teasdale R., Koretzky G. A., and Klinman D. M. 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation.Nature374:546). Da bi ispitali NK litičku aktivnost, ćelije slezine miševa su očišćene od B ćelija korišćenjem magnetskih granula obloženih sa kozjim anti-mišjim Ig kao što je pethodno detaljno opisano (Ballas Z. K., and Rasmussen W. 1993. Lvmphokine-activated killer cells. VII. IL-4 induces an NK1.1<*>CD8 <x<+>B' TCR-aB B220<*>lymphokine-activated killer subset.J Immunol150:17). Ćelije su kultivisane na 5 x 10<6>/komorici u 24-komornim pločama i sakupljane su na 18 sati da bi se upotrebile kao efektorne ćelije u standardnoj četvoročasovnoj analizi oslobađanja<51>Cr iz YAC-1 target ćelija. Jedna jedinica (LU) je definisana kao broj ćelija koji je potreban da bi se postiglo 30% specifične lize.

Imunizacija miševa na HbsAg i procena humoralnog odgovora: Grupe BALB/c ženki miševa starih 6-8 nedelja (n=5 ili 10, Charles River, Montreal, QC) su imunizovane protiv HBsAg kao što je prethodno opisano (Daviš H. L., et al 1998J Immunol160:870). Ukratko, svaki miš je primio jednu IM injekciju od 50 jal PBS koji sadrži 1 u.g rekombinantnog HbsAg (Medix Biotech, Foster City, CA) i 10 ug CpG ODN ili ne-ODN kao sam adjuvant ili spojen sa stipsom (Alhvdrogel "85", Superfos Biosector, Vedbaek, Denmark; 25 mg Al<3+>/mg HBsAg). Kontrolni miševi su imunizovani sa HBsAg bez adjuvanta ili sa stipsom. Plazma je dobijena iz miševa u različita vremena posle imunizacije i Abs specifičan za HBsAg (anti -HBs) su kvantifikovani sa krajnjim razblaženjem ELISA analizom (u triplikatu) kao što je prethodno opisano (Daviš H. L. Et al 1998J Immunol160:870). Krajnji titri su definisani kao najveća razblaženja plazme kod koji je dobijena vrednost apsorbance (OD450) dva puta viša od one kod ne-imune plazme sa plato vrednošću od 0.05.

IzolacijaPBMC primata i kultura ćelija:Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz periferne krvi zdravih dobrovoljaca, šimpanza ili rezus ili makaka( Macaca Cynomolgus)majmuna sa Ficoll-hypaque centrifugiranjem na osnovu gradijenta gustine (Histopaque- 1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kao što je opisano (Hartmann G., et al 1996Antisense Nucleic Acid Drug Dev6:291). Ćelije su suspendovane u RPMI 1640 medijumu kulture kome je dodato 10% (v/v) toplotom inaktiviran (56°C, 1h) FCS (HyClone, Logan, UT), 1.5 mM L-glutamin, 100 U/ml penicilina i 100 u.g/ml streptomicina (svi iz Gibco BRL, Grand Island, NY) (kompletan medijum). Ćelije (krajnja koncentracija 1 x 10<6>ćelija/ml) su kultivisane u kompletnom medijumu u 5% C02ovlaženom inkubatoru na 37°C. Kao stimulusi su upotrebljeni ODN i LPS (izSalmonella typhimurium,Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ili anti-IgM. Za merenje litičke aktivnosti humanih NK ćelija, PBMC su inkubirani na 5 x 10<6>/komorici u 24-komornim pločama. Kulture su sakupljene posle 24 časa, a ćelije su upotrebljene kao efektori u standardnoj analizi oslobađanja<51>Cr iz K562 target ćelija kao što je prethodno opisano (Ballas Z. K., Rasmussen W. L., and Krieg A. M 1996. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA.J Immunol157:1840; Ballas Z. K., and Rasmussen W. 1993. Limphokine-activated killer cells. VII. IL-4 induces an NK1.1<+>CD8 a+B" TCR-aB B220<*>Ivmphokine-activated killer subset.J Immunol150:17). Za proliferaciju B ćelija, 18 sati pre sakupljanja dodato je 1 uCi<3>H timidina, a veličina inkorporacije<3>H timidina je određena scincilacionim brojanjem na dan 5. Standardne devijacije trostrukih komorica su bile < 5%.

Protočna citometrijaPBMCprimata: Površinski antigeni na PBMC primata su bojeni kao što je prethodno opisano (Hartmann G et al 1998J Pharmacol Exp Ther285:920). Monoklonalna antitela na CD3 (UCHT1), CD14 (M5E2), CD19 (B43), CD56 (B159), CD69 (FN50) i CD86 (2331 (FUN-1)) su nabavljena iz Pharmingen, San Diego, CA. IgG^K(MOPC-21) i lgG2b,K (Hartmann G et al 1999PNAS96:9305) su upotrebljeni za kontrolu za ne-specifično bojenje. NK ćelije su identifikovane CD56 ekspresijom na CD3, CD14 i CD19 negativnim ćelijama, s obzirom na to da su B ćelije identifikovane pomoću ekspresije CD19. Podaci protočne citometrije iz 10000 ćelija po uzorku su dobijeni na FAXScan (Beckton Dickinson lmmunocytometry Svstems, San Jose, CA). Vijabilnost ćelija unutar FSC/SSC gate (kritičnih vrednosti) koja je upotrebljena za analizu je ispitivana bojenjem sa propidijumjodidom (2 pg/ml) i nađeno je da je veća od 98%. Podaci su analizirani korišćenjem kompjuterskog programa FlovvJo (version 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA).

Imunizacija šimpanza i makaka majmuna{ Macaca Cynomolgus)na HBsAg i

procena humoralnog odgovora:Četrnaest makaka majmuna (2.0-3.5 kg) je imunizovano sa pedijatrijskom dozom Engerix-B (SmithKIine Beecham Biologicals, Rixensart, BE) koji sadrži 10 pg HBsAg adsorbovan za stipsu (25 mg Ai<3+>/mg HBsAg). On je primenjen sam (n=5), ili zajedno sa CpG ODN 1968 (n=5, 500 ug) ili sa CpG ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) (n=4, 150 pg). Četiri šimpanze (10-20 kg) su imunizovane na isti način primanjem dve kontrolne vakcine (samo Engerix-B) i primanjem dve eksperimentalne vakcine (Engerix-B plus 1 mg CpG ODN 2006). Sve vakcine su primenjene IM u desnu prednju butinu u ukupnoj zapremini od 1 ml. Majmuni su držani u odeljenju za životinje centra za istraživanje primata - Primate Research Center (Bogor, Indonesia) i šimpanze su smeštene u Bioqual (Rockville, MD). Životinje su dnevno posmatrane od strane specijalista za brigu o životinjama. Nisu primećeni simptomi opšte bolesti ili lokalnih štetnih reakcija na mestu injekcije. Plazma je dobijena IV punkcijom pre i u različitim vremenskim tačkama posle imunizacije i čuvana je zaleđena (-20°C) do analize na antitela. Anti-HBs antitela su otkrivena korišćenjem komercijalnog ELISA kompleta (Monolisa Anti-HBs; Sanofi-Pasteur, Montreal, QC) i titri su prikazani u mlU/ml na osnovu poređenja sa VVHO definisanim standardima (Monolisa Anti-HBs Standards; Sanofi-Pasteur).

Rezultati

Identifikacija CpG ODN sa različitim profilimain vitroimunih aktivnosti:

Naše studije su pokazale da određene baze na 5' i 3' krajevima CpG dinukleotida unutar CpG motiva mogu imati uticaj na nivo imune aktivacije sintetičkog ODN, ali nije bilo jasno da li različiti CpG motivi mogu pokazati različite imune efekte. Da bi procenili ovu verovatnoću, testirali smo grupu CpG ODN u odnosu na njihovu sposobnost da indukuju NK litičku aktivnost, proliferaciju B ćelija i da stimulišu sintezu TNF-a, IL-6, IFN-y i IL-12 u ćelijama slezine miševa. Imunostimulatorska aktivnost ODN bez CpG motiva (ODN 1982 (SEQ ID NO.: 225), ODN 1983 (SEQ ID NO.: 226)) je bila negativna ili slaba u poređenju sa CpG ODN. ODN sa neoptimalnim CpG motivima (ODN 1628 (SEQ ID NO.: 767), ODN 1758 (SEQ ID NO.: 1)) su bili manje aktivni od ODN koji sadrže CpG motive ograničene sa dva 5' purina i dva 3' pirimidina (ODN 1760 (SEQ ID NO.: 3), ODN 1826 (SEQ ID NO.: 69), ODN 1841 (SEQ ID NO.: 84)). ODN 1826 koji sadrži dva optimalna mišja CpG motiva (5' GACGTT 3') (SEQ ID NO.: 1143) je imala najvišu aktivnost za 5 i 6 merenih završnih tačaka. Osim ODN 1628, svi ODN su pokazali generalno sličan obrasac aktivnosti (NK ćelijski-posredovana liza, proliferacija B ćelija, IL- 12, IL-6, TNF-a, IFN-y). Treba zapaziti da je ODN 1628, koji je bio jedinstven u ovoj grupi zbog toga što sadrži dva G-bogata regiona, pokazao preferencijalnu indukciju sinteze IFN-y, ali relativno nisku stimulaciju ostalih aktivnosti.

Identifikacijain vitroanaliza koja koreliše sain vivoaktivnošću adjuvanta:

S obzirom da je aktivnost adjuvantain vivozavršna tačka, bili smo zainteresovani da identifikujemoin vitroanalize koje će predvideti aktivnost adjuvanta CpG ODNin vivo.Zbog toga su testirani isti ODN koji su upotrebljeni zain vitrozavršne tačke u odnosu na njihovu aktivnost kao adjuvanta da imunizuju miševe na HBsAg. Ovo je izvedeno i sa samim ODN i sa ODN koji je spojen sa stipsom, s obzirom da su ranije studije pokazale snažan sinergizam CpG ODN i stipse kao adjuvanta (PCT Published Patent Application VVO98/40100).

BALB/c miševi imunizovani sa HBsAg bez adjuvanta su postigli samo niske titre anti-HBs posle 4 nedelje, a na ovo nije uticalo dodavanje kontrolnog ODN. Nasuprot tome, dodavanje CpG ODN je podiglo anti-HBs titre za 5 do 40 puta, u zavisnosti od upotrebljene sekvence. Kada je dodata stipsa, titri anti HBs su bili približno 6 puta viši od onog sa samo HBsAg. Specifično, kontrolni ODN nije imao nikakav efekat i različiti CpG ODN su povećali ove titre 2 do 36 puta. Rezultati dobijeni sa različitim samim ODN su bili u visokoj korelaciji (r=0.96) sa onima koji su dobijeni upotrebom istih ODN sa stipsom. Kada je izvedena linearna regresija, pronađen je veoma visok stepen korelacije između izvesnihin vitroanaliza iin vivopovećanja anti-HBs titara. Od svih ispitivanihin vitrozavršnih tačaka, indukcija NK litičke aktivnosti je pokazala nabolju korelaciju sain vivoaktivnošću adjuvanta (bez stipse, r=0.98; sa stipsom, r=0.95; p < 0.0001). Dobra korelacija koja se odnosi na aktivnost adjuvanta je takođe dobijena za stimulaciju B ćelija (r=0.84 i 0.7), kao i za lučenje TNF-a (r=0.9 i 0.88), IL-12 (r=0.88 i 0.86) i IL-6 (r=0.85 i 0.91). Jednain vitroanaliza koja nije bila u dobroj korelaciji sain vivorezultatima je bila lučenje IFN-y (r=0.57 i 0.68). Ovi podaci pokazuju dain vitroanalize za NK litičku aktivnost, aktivnost B ćelija i proizvodnju TNF-a, IL-6 i IL-12 daju vrednu informacijuin vitroda bi se predvidela aktivnost adjuvanta datog ODNin vivo.

Skrining fosforotioatne grupe ODN da aktivira humane NK ćelije:

U prethodnim studijama smo pronašli da je sinteza inflamatornih citokina od strane humanih PBMC indukovana sa ekstremno niskim količinama endotoksina (indukovano lučenje TNF-a se može detektovati sa samo 6 pg/ml endotoksina, 2 log senzitivnije od imunih ćelija miša). Nasuprot tome, aktivacija humanih B ćelija i indukcija humane NK litičke aktivnosti sa endotoksinom je niska čak i na visokim koncentracijama endotoksina. Na osnovu ovih rezultata izabrali smo aktivaciju NK ćelija (litička aktivnost i CD69 ekspresija) i B ćelija (proliferacija i CD86 ekspresija) kao najspecifičnije i ponovljive analize sa niskom inter-subjekatskom varijabilnošću i upotrebili ove analize zain vitroskrining pula ODN.

Prvo smo proučavali efekat fosforotioatnog ODN koji sadrži različite kombinacije i permutacije CpG motiva na NK ćelijski posredovanu ližu target ćelij a. Radi jasnoće i lakoće prikazivanja, jedino su prikazani podaci sa izabranim reprezentativnim CpG i kontrolnim ODN. Humani PBMC su inkubirani sa različitim fosforotioatnim ODN (6 |ig/ml) 24 sata i testirani na njihovu sposobnost da liziraju<51>Cr-obeležene K562 ćelije. ODN sa dva 6-merna CpG motiva (ili 5' GACGTT 3' (SEQ ID NO.: 1143) ili 5" GTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1144)) u kombinaciji sa TpC na 5' kraju ODN (ODN 1840 5' TCCATGTCGTTCCTGTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 83), ODN 1851 5" TCCTGACGTTCCTGACGTT 3' (SEQ ID NO.: 94) ili sa najmanje tri 6-merna motiva bez TpC na 5' kraju (ODN 2013 (SEQ ID NO.: 253) pokazuju srednju aktivnost.

Visoka aktivnost je nađena kada se 5' TpC nalazi neposredno pre 6 -mernog humanog CpG motiva (5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1145)) iza kojeg se nalaze dva 6-merna motiva (ODN 2005 (SEQ ID NO.: 245), ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) i ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247)). Najbolji rezultati su dobijeni kada su 6-merni CpG motivi odvojeni jedan od drugog i od 5' 8-mernog CpG motiva sa TpT (ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246)).

Ekspresija aktivacionog markera CD69 je brzo ushodno regulisana na površini NK ćelija posle stimulacije. Da bi potvrdili rezultate iz analize NK ćelijske lize, PBMC su inkubirani 18 sati sa ODN (2 ug/ml). CD69 ekspresija je proučavana na CD56 pozitivnim NK ćelijama (CD3, CD14 i CD19 negativni), lako je indukcija CD69 ekspresije bila manje ograničena sekvencom nego stimulacijom NK ćelijske funkcionalne aktivnosti, kontrolni ODN (ODN 1982, ODN 2116, ODN 2117, ODN 2010) su pokazali samo nisku aktivnost sličnu osnovnim nivoima. ODN sa dva humana CpG motiva razdvojena sa 5' TTTT 3' (ODN 1965 (SEQ ID NO.: 208)) ili četiri humana CpG motiva bez razdvajanja (ODN 2013 (SEQ ID NO.: 253)) su relativno aktivniji u indukovanju CD69 ekspresije nego u stimulisanju NK ćelijske litičke aktivnosti. Optimalna NK ćelijska funkcionalna aktivnost, kao i CD69 ekspresija, je dobijena sa ODN koji sadrže TpC dinukleotid koji prethodi humanom CpG motivu i dodatnim humanim motivima unutar sekvence (ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247)).

Aktivnost fosforotioatnog ODN za stimulisanje humanih B ćelija:

U preliminarnim eksperimentima smo pronašli da je procenat proliferišućih B ćelija (CFSE analiza, pogledati deo o metodama) bio u korelaciji sa površinskom ekspresijom ko-stimulatornog CD86 na B ćelijama, kao što je izmereno protočnom citometrijom. Stoga smo koristili CD86 ekspresiju na B ćelijama da bi se izvršio skrining grupe ODN u odnosu na njihovu imunostimulatorsku aktivnost. PBMC su inkubirani sa 0.6pg/mlODN. Ekspresija CD86 (srednji intezitet fluorescencije, MFI) je ispitivana na CD19 pozitivne B ćelije. A poli C ODN (ODN 2017 (SEQ ID NO: 257)) ili ODN bez CpG dinukleotida (ODN 1982 (SEQ ID NO.: 225)) nisu uspeli da stimulišu humane B ćelije pod ovim eksperimentalnim uslovima. Fosforotioatni ODN (ODN 2116 (SEQ ID NO.: 256)) sa optimalnim humanim CpG motivom kome je prethodio TpC (5' TCGTCGTT 3' (SEQ ID NO.: 1145)) imao je nisku aktivnost. Prisustvo jednog humanog 6-mernog CpG motiva (5<*>GTCGTT 3' (SEQ ID NO: 1144)) nije imalo aktivirajući efekat. Dva od ovih CpG motiva u okviru sekvence nisu pokazali nikakvu (ODN 1960 (SEQ ID NO.: 203), ODN 2016 <SEQ ID NO.: 256)) ili srednju (ODN 1965 (SEQ ID NO.: 208)) aktivnost zavisnu od konteksta sekvence. Ako je ODN sastavljen od tri ili četiri kopije ovog motiva (ODN 2012 (SEQ ID NO.: 252), ODN 2013 (SEQ ID NO.: 253), ODN 2014 (SEQ ID NO.: 254)), može se detektovati srednja aktivnost na B ćelijama. Kombinacija humanog 8-mernog motiva na 5' kraju ODN sa dva 6-merna CpG motiva (ODN 2005 (SEQ ID NO.: 245), ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246), ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247), ODN 2102 (SEQ ID NO.: 343), ODN 2103 (SEQ ID NO.: 344)) vodi ka značajnom povećanju sposobnosti ODN da stimuliše B ćelije. Razdvajanje između pojedinačnih motiva je bilo kritično. Odvajanje CpG motiva sa TpT je bilo požljeno (ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246)) u poređenju sa nerazdvojenim CpG motivima (ODN 2005 (SEQ ID NO.: ); takođe uporediti ODN 1965 (SEQ ID NO.: 208) sa ODN 1960 (SEQ ID NO.: 203)). Humani 6-merni CpG motiv (5' GTCGTT 3') je dao bolje rezultate od optimalnog mišjeg 6-memog CpG motiva (5- GACGTT 3' (SEQ ID NO.: 246)) kada je spojen sa humanim 8-mernim CpG motivom na 5' kraju (ODN 2006 naspram ODN 2102 (SEQ ID NO.: 343) i ODN 2103 (SEQ ID NO.: 344)). A (TCG)p0|jODN je bio inaktivan ili samo slabo aktivan, kao i ODN koji sadrže CpG dinukieotide ograničane sa obe strane sa guaninima ili drugim CpG dinukleotidima (ODN 2010 (SEQ ID NO.: 250)). Uzeti zajedno, ovi nalazi za NK ćelije i B ćelije su dosledno pokazali da od testiranih ODN, ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) ima najveću imunostimulatorsku aktivnost na humane imune ćelije.

Komparativne analize potencije CpG fosforotioatnih ODN kod različitih primata:

Različiti CpG motivi su optimalni za aktiviraciju mišjih i humanih imunih ćelija. Dalje, broj i položaj CpG motiva unutar aktivnog fosforotioatnog ODN je različit kod miševa i kod ljudi. Interesovalo nas je da li CpG fosforotioatni ODN pokazuju sličnu aktivnost među različitim vrstama primata. Upoređivali smo grupu CpG ODN u odnosu na njihovu sposobnost da indukuju proliferaciju B ćelija kod ljudi, šimpanza i re zus ili makaki majmuna. Sposobnost ODN da stimulišu proliferaciju humanih B ćelija (Tab ela J) je u dobroj korelaciji sa njihovom sposobnošću da indukuju CD86 ekspresiju na B ćelijama. ODN 2006 {SEQ ID NO.: 246), koji je pokazao najveću aktivnost u humanim b ćelijama i NK ćelijama, takođe je bio najaktivniji u stimulisanju proliferacije B ćelija šimpanza i rezus majmuna (Tabela J). ODN 1968 (SEQ ID NO.: 211) i ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) su dali najvišu aktivaciju B ćelija makaki majmunain vitro(SI 25 i 29 respektivno na 6 u.g ODN/ml). Iznenađujuće, CpG ODN 2007 (SEQ ID NO.: 247), koji je pokazao slično visoku aktivnost kao optimalan OD N 2006 (SEQ ID NO.: 246) u humanim ćelija, nije stimulisao proliferaciju B ćelija rezus majmuna ili šimpanze, a ODN 1968 (SEQ ID NO.: 211) je pokazao nisku aktivnost. CpG ODN koji je originalno identifikovan sa visokom aktivnošću kod miševa (ODN 1760 (SEQ ID NO.: 3), ODN 1826 (SEQ ID NO.: 69)) je pokazao malo aktivnosti kod majmuna (Tabela J).

PBMC su pripremljeni iz periferne krvi i inkubirani su sa ODN (0.6 uo,/ml) kao što je naznačeno pet dana. Proliferacija je merena preko preuzimanja<3>H/timidina (cpm/1000) tokom poslednjih 18 časova. Više od 95% proliferišućih ćelija su bile B ćelije što je određeno korišćenjem CFSE analize. Testirani su četiri humana subjekta, šest šimpanzi i dva rezus majmuna.

In vivoaktivnost adjuvanta CpG ODN kod šimpanzi i makaki (M. cvnomolgus) majmuna: Da bi procenili da li CpG ODN sa jakimin vivostimulatomim efektima na ćelije primata imaju detektabilnu aktivnost adjuvantain vivo,makaki majmuni i šimpanze su imunizovani sa Engerix B, koji sadrži HBsAg adsorbovan za stipsu, sam ili kome je dodat ODN 1968 (500 u.g ) ili ODN 2006 (SEQ ID NO.: 246) (1 mg) respektivno. U poređenju sa kontrolama koje nisu primile CpG

ODN, anti-HBs titri 4 nedelje posle prve i 2 nedelje posle naknadne imunizacije su bile 66- i 16-puta više respektivno kod majmuna, a 15- i 3- puta više kod šimpanzi (Tabela K). Ovim je uočen jasan efekat adjuvanta CpG ODN, što je posebno upečatljivo posle pojedinačne imunizacije.

<3>Životinje su imunizovane sa IM injekcijom Engerix B koja sadrži 10 ug HBsAg adsorbovan za stipsu, sam ili sa dodatim CpG ODN. Makaki majmuni su naknadno imunizovani posle 10 nedelja, a šimpanze su naknadno imunizovane 4 nedelje posle prve imunizacije. Anti-HBs je određen pomođu ELISA analize; vrednosti za majmune su GMT ± SEM (n=5) budući da su date individualne vrednosti za dve šimpanze u svakoj grupi.

Claims

1. Py-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina, koja je T-bogata nukleinska kiselina, čiji je sadržaj T veći od 60% i sadrži CpG dinukelotide, za upotrebu u postupku stimulacije imunog odgovora, koji obuhvata primenu imunostimulatorne nukleinske kiseline ne-glodarskom subjektu u količini koja je efikasna za izazivanje imunog odgovora kod ne-glodarskog subjekta.

2. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 1, naznačena time, što je T-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina, poli T nukleinska kiselina koja sadrži

3. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 2,naznačena time, što a) poli T nukleinska kiselina sadrži gde su X,, X2, X3i X4nukleotidi, i/ili b) T-bogata nukleinska kiselina sadrži višestruke poli T nukleinske kiselinske motive.

4. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 3, naznačena time, što su XiX2izabrani iz grupe koju čine TT, TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA i GC, i poželjno TT, i/ili X3X4, je odabran iz grupe koju čine TT, TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA i GC, i požljeno je TT.

5. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 1, naznačena time, što T-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina obuhvata nukleotidnu kompoziciju od više od 80% T.

6. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 1, gde imunostimulatorna nukleinska kiselina a) sadrži najmanje 20 ili namanje 24 nukleotida. b) ima nukleotidnu okosnicu koja obuhvata najmanje jednu modifikaciju okosnice po izboru fosforotioatnu modifikaciju, i/ili gde je nukelotidna okosnica himerna i/ili modifikovana c) nema metilovane GpG dinukleotide; d) nema poli-C sekvence; e) obuhvata poli-A sekvencu; f) obuhvata poli-G sekvencu; g) sadrži nukleotidnu kompoziciju od više od 25% C; h) sadrži nukleotidnu kompoziciju od više od 25% A; i) je primenjena oralno; j) je primenjena lokalno; k) je primenjena u formulaciji za produženo delovanje; I) je primenjena mukozno na površinu sluzokože; m) sadrži i TG motiv; n) obuhvata najmanje dve poli C sekvence od najmanje 3 uzastopna C nukleotidna ostatka; i/ili o) nema dve poli A sekvence od najmanje 3 uzastopna A nukleotidna ostatka.

7) Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 6, naznačena time, što je primenjena mukozno na površinu sluzokože izabrana iz grupe koja se sastoji od oralne, nazalne, rektalne, vaginalne i okularne površine.

8. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 6, naznačena time, što je primenjena mukozno na površinu sluzokože, gde je imuni odgovor, mukozni imuni odgovor ili sistemski imuni odgovor.

9. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 1, naznačena time, što je subjekt izložen antigenu i gde je imuni odgovor, antigen-specifičan imuni odgovor.

10. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 9, naznačena time, što je antigen, peptidni antigen.

11. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 9, naznačena time, što je subjektu administriran vektor nukleinske kiseline koji kodira antigen i gde je vektor nukleinske kiseline odvojen od imunostimulatorne nukleinske kiseline.

12.Ex vivopostupak aktiviranja izolovane imune ćelije koji obuhvata kontakt imune ćelije sa količinom imunostimulatorne nukleinske kiseline, odabrane iz grupe koju čine Py-bogate nukleinske kiseline i TG nukleinske kiseline, koja je efikasna za aktivaciju imune ćelije .

13. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time, što je imuna ćelija, leukocit ili dendritska ćelija

14. Postupak prema zahtevu 13, naznačen time, što obuhvata i kontakt imune ćelije sa antigenom.

15. Postupak prema zahtevu 14, naznačen time, što je antigen izabran iz grupe koja se sastoji od tumor antigena, viralnog antigena, bakterijskog antigena i parazitskog antigena.

16. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 1, naznačena time, što subjekat ima ili je u riziku da razvije astmu, za upotebu u lečenju ili prevenciji astme kod subjekta.

17. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 1, naznačena time, što subjekat ima ili je u riziku da razvije alergiju, za upotrebu u lečenju ili prevenciji alergije.

18. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 1, naznačena time, što subjekat ima kancer, za upotrebu u postupku lečenja kancera.

19. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 18, naznačena time, što je kancer izabran iz grupe koja obuhvata kancer žučnog kanala, kancer mozga; kancer dojke; kancer grlića materice; horiokarcinom; CNS kancer; kancer vezivnog tkiva; kancer endometrijuma; kancer oka; gastrični kancer; intraepitelijalne neoplazme; kancer grkljana, limfomi; Hodgkin-ov limfom, kancer jetre; kancer pluća (npr. kancer malih ćelija i ne-malih ćelija); melanom; neuroblastomi; oralni kancer; kancer oralne šupljine, kancer jajnika; kancer pankreasa; kancer prostate; kancer rektuma; sarkomi; kaNcer tiroidne žlezde; i kancer bubrega, kao i ostali karcinomi i sarkomi.

20 Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 18, naznačena time, stoje takođe administrirana i anti-kancer terapija.

21. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 20, naznačena time, što je anti-kancer terapija antitelo, hemoterapuetski aegns, imunoterapeutski agens ili kancer vakcine.

22. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 18, naznačena time, što je subjekat čovek, pas, mačka i konj.

23. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 1, naznačena time, što je takođe primenjeno antitelo specifično za antigen površine ćelije i gde imuni odgovor rezultuje u antigen zavisnoj ćelijskoj citotoksičnosti (ADCC).

24. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 1, naznačena time, što subjekat ima ili je pod rizikom da razvije infektivnu bolest i gde je postupak postupak za lečenje ili prevenciju infektivne bolesti.

25. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 23 ili 24, naznačena time, što je subjekat čovek, pas, mačka, konj, krava, svinja, ovca, koza, pile, majmun ili riba.

26. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 23 ili 24, naznačena time, što je na subjekta primenjen i antigen.

27. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 26, naznačena time, što je antigen izabran iz grupe koja se sastoji od bakterijskog antigena, viralnog antigena, parazitskog antigena i gljivičnog antigena ili je dati antigen dobijen iz mikroorganizma izabranog iz grupe koja se sastoji od herpesviridae, retroviridae, orthomvroviridae, toxoplasma, haemophilus, campvlobacter, clostridium, E. coli i staphvlococcus.

28. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 6, naznačena time, što TG nukleinska kiselina sadrži 5'N1X1TGX2N2 3'. gde je N-inukleinsko kiselinska sekvenca koja se sastoji od određenog broja nukleotida u opsegu od (11-N2) do (21-N2); N2nukleinsko kiselinska sekvenca koja se sastoji od određenog broja nukleotida u opsegu od (1do (21-Ni) i X2je po izboru timidin.

29. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 6, naznačena time, što TG nukleinska kiselina sadrži 5' N1X1X2TGX3X4N23'. gde je N, nukleinska kiselinska sekvenca koja se sastoji od određenog broja nukleotida u opsegu od (9-N2) do (19-N2); N2nukleinska kiselinska sekvenca koja se sastoji od određenog broja nukleotida u opsegu od (9-N,) do (19-Nt), gde je X3timidin, X^2nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA i TT i XsX4nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA i CA ili iz grupe koja se sastoji od TT, TC, TA i TG.

30. Imunostimulatorna nukleinska kiselina izabrana iz grupe koju čine T-bogate nukleinske kiseline, čiji je sadržaj T veći od 60% i sadrži CpG dinukelotid, i TG nukleinske kiseline bez CpG dinukleotida, za upotrebu u postupku prevencije bolesti kod subjekta, koji obuhvata regularnu administraciju subjektu imunostimulatorne nukleinske kiseline u cilju prevencije bolesti kod subjekta.

31. Imunostimulatorna nukleinska kiselina izabrana iz grupe koju čine T-bogate nukleinske kiseline, čiji je sadržaj T veći od 60% i sadrži CpG dinukelotid i TG nukleinske kiseline bez CpG dinukleotida, za upotrebu u postupku indukovanja nespecifičnog imunog odgovora, koji obuhvata adminsitraciju subjektu imunostimulatorne nukleinske kiseline u količini koja je efikasna za aktivaciju nespecifičnog imunog odgovora.

32. Kompozicija koja sadrži formulaciju sa kontinualnim oslobađanjem koji obuhvata imunostimulatornu nukleinsku kiselinu izabrana iz grupe koju čine T-bogate nukleinske kiseline i TG nukleinsku kiselinu, gde je imunostimulatorna nukleinska kiselina bez metilovanih CpG motiva i po izboru ima fosfodiestarsku okosnicu.

33. Kompozcija nutritivnog suplementa koji sadrži imunostimulatornu nukleinsku kiselinu izabranu iz grupe koju čine T-bogate nukleinske kiseline, i TG nukleinsku kiselinu u formulaciji za distribuciju izabranoj iz grupe koju čine kapsule, pilule i lingvalete, pri čemu je imunostimulatorna nukleinska kiselina bez nemetilovanih CpG motiva i po izboru, ima fosforotioatnu okosnicu.

34. Kompozicija koja sadrži imunostimulatornu nukleinsku kiselinu i antigen, gde je imunostimulatorna nukleinska kiselina bez nemetilovnih CpG motiva i izabrana je iz grupe koja se sastoji od T-bogate nukleinske kiseline 5'N1X1X2TGX3X4N23' gde X1X2 je odabrano iz grupe koju čine GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA i TT i X3X4, je odabrano iz grupe koju čine TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA i CA, i Py-bogata imunostimulatorna nukleinska kiselina sadrži sekvencu 5'X1X2TTTTX3X43' gde XtX2je odabrano iz grupe koju čine TA, TG, TC, AA, AG, AC, CC, CA, GG, GA i GC i X3X4je odabrano iz grupe koju čine AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA i GC.

35. Kompozicija koja sadrži imunostimulatornu nukleinsku kiselinu i anti-mikrobni agens, gde je imunostimulatorna nukleinska kiselina bez nemetilovanih CpG motiva i izabrana je iz grupe koja se sastoji od T-bogate nukleinske kiseline i TG nukleinske kiseline.

36. Kompozicija prema zahtevu 35, naznačena time, što je anti-mikrobijalni agens izabran iz grupe koja se sastoji od anti-viralnog agensa, anti-gljivičnog agensa, anti-parazitskog agensa i anti-bakterijskog agensa.

37. Imunostimulatorna nukleinska kiselina prema zahtevu 3, naznačena time, što a) imunostimulatorna nukleinska kiselina sadrži najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, ili najmanje 8 poli T motiva; b) najmanje 2 od višestrukih poli T motiva sadrže najmanje tri uzastopna T nukleotidna ostatka; c) najmanje dva od poli T motiva sadrže najmanje četiri uzastopna T nukleotidna ostatka; d) više poli T motiva je najmanje 3 poli motiva i gde najmanje svaki od 3 poli motiva sadrži najmanje 3 uzastopna T nukleotidna ostatka; e) više poli T motiva je najmanje 4 poli motiva i gde najmanje svaki od 4 poli motiva sadrži najmanje 3 uzastopna T nukleotidna ostatka f) najmanje jedan od višestrukih poli T motiva sadrži najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, ili najmanje 8 uzastopnih T nukleotidnih ostataka, i/ili g) nukleinska. kiselina dodatno sadrži višestruke CpG motive i gde više(struko) označava najmanje 3 motiva, ili najmanje 4 motiva i gde najmanje svaki od 4 motiva sadrži najmanje 3 uzastopna T nukleotidna ostatka i više CpG motiva i više poli T motivi su poželjno razbacani.

38. Farmaceutska kompozicija koja sadrži efikasnu količinu za stimulisanje imunog odgovora izolovanom imunostimulatornom nukleinskom kiselinom prema jednom od zahteva 1-6, 12,13, 28, 29, i 37 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

39. Kompozicija materija, koja sadrži izolovanu imunostimulatornu nukleinsku kiselinu prema jdnom od zahteva 1-6,12,13, 28, 29, i 37 i farmaceutski prihvatljiv nosač

40. Kompozicija, koja sadrži imunostimulatornu nukleinsku kiselinu i anti-kancer terapiju, formulisanu u farmaceutski prihvatljivom nosaču, u efikasnoj količini za lečenje kancera ili za smanjivanje rizika za razvoj kancera, gde je imunostimulatorna nukleinska kiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od T-bogate nukleinske kiseline sa više od 60%T i sadrži CpG dinikteotid i TG nukleinsku kiselinu bez CpG dinukleotida.

41. Kompozicija, koja sadrži imunostimulatornu nukleinsku kiselinu i lek za astmu/alergiju, formulisanu u farmaceutski prihvatljivom nosaču, u efikasnoj količini za prevenciju ili lečenje imunog odgovora povezanog sa izlaganjem posredniku astme ili alergije, gde je imunostimulatorna nukleinska kiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od T-bogate nukleinske kiseline sa više od 60%T i sadrži CpG dinukleotid i TG nukleinsku kiselinu bez CpG dinukelotida.

42. Kompozicija koja sadrži imunostimulatornu nukleinsku kiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 95-119, SEQ ID NO: 121-136, SEQ ID NO: 138-152, SEQ ID NO: 154-210, SEQ ID NO: 212-222, SEQ ID NO: 224-244, SEQ ID NO: 247-260, SEQ ID NO: 263-272, SEQ ID NO: 274-299, SEQ ID NO; 301, SEQ ID NO: 303-409, SEQ ID NO: 414-420, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 427-758, SEQ ID NO: 760-947, SEQ ID NO: 959-963, SEQ ID NO: 968-1022 and SEQ ID NO: 1024-1093 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

43. Kompozicija koja sadrži imunostimulatornu nukleinsku kiselinu koja se u suštini sastoji od: gde je najmanje jedan C nemetilovan, gde je Minukleinska kiselina koja ima najmanje jedan nukleotid, gde je M2nukleinska kiselina koja ima između 0 i 50 nukleotida i gde imunostimulatorna nukleinska kiselina ima manje od 100 nukleotida.

44. Farmaceutska kompozicija koja sadrži imunostimulatornu nukleinsku kiselinu koja sadrži: gde je najmanje jedan C nemetilovan, gde imunostimulatorna nukleinska kiselina ima manje od 100 nukleotida i fosfodiestarsku okosnicu i formulaciju sa kontunualnim oslobađanjem, poželjno mikropartikulu.

45. TG imunostimulatorna nuklelinska kiselina koja je bez CpG dinekuleotida za upotrebu u postupku stimulacije imunog odgovora, kojio obuhvata administriranje TG imunostimulatorne nukelinske kiseline ne-glodarskom subjektu u količini koja je efikasna za indukciju imunog odgovora kod subjekta.

46. Kompozicija koja sadrži oligonukleotide sa sekvencom nukelinskih kiselina : TCG TCG TTT TGA CGT TTT GTC GTT (SEQ ID NO.:343).

47. Kompozicija, prema zahtevu 46 za upotrebu u postupku lečenja alergije ili astme koji obuhvata aministriranje kompozicije ne-glodarskom subjektu , u količini koja je efikasna za lečenje ili prevenciju alergije ili astme.

48. TG imunostimulatorna nuikelinska kiselina koja sadrži sekvencu gde su X^ X2 nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA i TT X3X4nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA i CA i nukleinska kiselina nema CpG dinukleotide, ili Py-bogata imunostimulatorna nukelinska kiselina sa sekvencom gde je XiX2izabran iz grupe koja se sastoji od TA, TG, TC, AA, AG, AC, CC, CA, GG, GA i GC, gde je X3X4izabran iz grupe koju čine: AT,AA,AG,AC,CT,CC,CA,GT,GG,GA i GC i nukelinska kiselina je bez CpG dinukelotida, za upotrebu u postupku lečenje imune reakcije, koji obuhvata administriranje TG imunostimulatorne amino kiseline ili Py-bogate nukleinske kiselina ne-glodarskom subjekut u količini koja je efikasna da indukuje imuni odogovor kod subjekta.

49. Imunostimulatorna nukelinska kiselina prema zahtevu 45, naznačena time, što je T-bogata nukelinska kiselina i preferentno sadrži nukleotidnu kompoziciju od više od 25% T, više od 35% T, više od 40% T, više od 50% T, ili od više od 60% T.

50. Py-bogata imunostimulatorna nukelinska kiselina koja je T-bogata nukleinska kiselina i koja je bez nemetilovanih CpG dinukleotida, za upotrebu u postupku stimulacije antigen nespecifičnog urođenog imunog odgovora, koji obuhvata administriranje imunostimulatorne nukleinske kiseline ne-glodarskom subjektu u količini koja je efikasna za indukovanje antigen ne-specifičnog urođenog imunog odgovora kod ne-glodarskog subjekta.

51. Py-bogata imunostimulatorna nukelinska kiselina koja je T-bogata nukleinska kiselina i koja je bez nemetilovanog CpG dinukleotida, za upotrebu u postupku preusmeravanja Th2 imunog odgovora na Th1 imuni odgovor, koji obuhvata administriranje imunostimulatorne nukleinske kiseline ne-glodarskom subjektu u količini koja je efikasna za preusmeravanje Th2 imunog odogovora na Th1 imuni odgovor.

52. Upotreba Py-bogata imunostimulatorne nukelinske kiseline koja je T-bogata nukleinska kiselina čiji je sadržaj T veći od 60% i sadrži CpG dinukelotid, za proizvodnju leka za administraciju ne-glodarskom subjektu u količini efikasnoj za indukovanje imunog odgovora kod ne-glodarskog subjekta.

53. Upotreba prema zahtevu 52, naznačena time, što je imunostimulatorna nuklinska kiselina definisana prema jednom od zahteva 2 do 5 i 37.

54. Upotreba prema zahtevu 52, naznačena time, što imunostimulatorna nukelinska kiselina: (a) sadrži najmanje 20 ili najmanjet24 nukleotida (b) ima nukleotidnu okosnicu koja obuhvata najmanje jednu modifikaciju okosnice, po izboru fosforotioatnu modifikaciju, i/ili je nukleotidna okoksnica himerna i/ili u celosti modifikovana. (c) nema metilovane CpG dinukleotide; (d) nema poli-C sekvence; (e) sadrži poli-A sekvence; (f) sadrži poli-G sekvence; (g) obuhvata nukleotidnu kompoziciju sa više od 25% C; (h) obuhvata nukelotidnu kompoziciju sa više od 25% A; (i) dalje sadrži TG motiv; (j) sadrži bar dve poli C sekvence od najmanje 3 uzastopna A nukleotidna ostatka; i/ili (k) nema poli A sekvence od najmanje 3 uzastopna A nukleotidna ostatka.

55. Upotreba prema zahtevu 52, naznačena time, što je lek administriran oralno; lokalno; u formulaciji sa produženim dejstvom i/ili mukozno na mukoznu površinu.

56. Upotreba prema zahtevu 55, naznačena time, što je lek administriran mukozno na mukoznu površinu, i gde je data mukozna površina odabrana iz grupe koju čine oralna, nazalna, rektalna, vaginalna i okularna površina.

57. Upotreba prema zahtevu 55, naznačena time, što je dati lek administriran na mukoznu površinu i pri čemu je imuni odgovor mukozni imuni odgovor ili sistemski imuni odgovor.

58. Upotreba prema zahtevu 52, naznačena time, što je dati lek za administraciju sa antigenom i pri čemu je imuni odgovor, antigen-specifični imuni odgovor.

59. Upotreba prema zahtevu 58, naznačena time, što je antigen, peptidni antigen.

60. Upotreba prema zahtevu 58, naznačena time, što je antigen dat vektorom nukleinske kiseline koji kodira antigen i gde je nukleinska kiselinski vektor odvojen od imunostimulatorne nukleinske kiseline.

61. Upotreba prema zahtevu 52, naznačen time, što je lek za lečenje ili prevenciju astme kod ne-glodarskih subjekata i dati ne-glodarski subjekat ima ili je pod rizikom od razvoja astme.

62. upotreba prema zahtevu 52, naznačena time, što je lek za lečenje ili prevenciju alergije kod ne-glodarskih subjekata i dati ne-glodarski subjekat ima ili je pod rizikom od razvoja alergije.

63. Upotreba prema zahtevu 52, naznačena time, što je lek za lečenje ili prevenciju kancera kod ne-glodarskog subjekta i dati ne-glodarski subjekt ima ili je pod rizikom od razvoja kancera.

64. Upotreba prema zahtevu 63, naznačena time, što je kancer odabran iz grupe koju čine kancer žučnog kanala, kancer mozga; kancer dojke; kancer grlića materice; horiokarcinom; CNS kancer; kancer vezivnog tkiva; kancer endometrijuma; kancer oka; gastrični kancer; intraepitelijalne neoplazme; kancer grkljana, limfomi; Hodgkin-ov limfom, kancer jetre; kancer pluća (npr. male ćelije i ne-male ćelije); melanom; neuroblastomi; oralni kancer; kancer oralne šupljine, kancer jajnika; kancer pankreasa; kancer prostate; kancer rektuma; sarkomi; kacer tiroidne žlezde; i kancer bubrega, kao i ostali karcinomi i sarkomi.

65. Upotreba prema zahtevu 63, naznačen time, što je dati lek za administraciju u kombinaciji sa anti-kancer terapijom.

66. Upotreba prema zahtevu 65, naznačena time, što data anti-kancer terapija je odabrana iz grupe koju čine: antitelo, hemoterapeutski agens, antimunoterapeutski agens ili kancer vakcina.

67. Upotreba prema zahtevu 63, naznačena time, što je subjekt, čovek, pas, mačka ili konj.

68. Upotreba prema zahtevu 52, naznačen time, što se dati lek administrira u kombinaciji sa antitelom specifičnim za antigen površine ćelija i pri čemu imuni odgovor rezultuje u antigen zavisnoj ćelijskoj citotoksičnosti (ADCC).

69. Upotreba prema zahtevu 52, naznačena time, što je lek za lečenje ili prevenciju infektivnih bolesti kod ne-glodarskih subjekata, dati ne-glodarsk subjekt ima Hi je pod rizikom od razvoja infektivne bolesti.

70. Upotreba prema zahtevu 68 ili zahtevu 69, naznačena time, što je subjekat čovek, pas, mačka, konj, krava, svinja, koza, jarac, piie, majmun Ni riba.

71. Upotreba prema zahtevu 68 ili zahtevu 69, naznačena time, što je dati lek za administraciju sa antigenom.

72. Upotreba prema zahtevu 71, naznačena time, što je antigen odabran iz grupe koju čine: bakterijski antigen, viralni antigen, parazitski antigen ili fungalni antigen ili sati antigen je izveden od mikroorganizma odabranog iz grupe koju čine: herpesviridae, retroviridae, orthomvroviridae, toxoplasma, haemophilus, campvlobacter, clostridium, E. coli i staphvlococcus.

73. Upotreba prema zahtevu 71, naznačena time, što TG nukleinska kiselina obuvhata gdeU,je po izboru, nukleinsko kiselinska sekvenca koja se sastoji od određenog broja nukleotida u opsegu od (11-N2) do (21-N2), N2 je po izboru nukleinsko kiselinska sekvenca koja se sastoji od određenog broja nukleotida u opsegu od (11-N,) do (21-NO i X2je po izboru timidin.

74. Upotreba prema zahtevu 54, naznačena time, što TG nukleinska kiselina obuvhata gde Nije po izboru nukleinsko kiselinska sekvenca koja se sastoji od određenog broja nukleotida u opsegu od (9-N2) do (19-N2), N2je po izboru nukleinsko kiselinska sekvenca koja se sastoji od određenog broja nukleotida u opsegu od (9-Ni) do (19-Nh), X3 je po izboru timidin, XiX2su po izboru nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA i TT,a X3X4su po izboru nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA i CA ili iz grupe koja se sastoji od TT, TC, TA i TG.

75. Upotreba imunostimulatorkse nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine T-bogate nukleinske kiseline , čiji je sadržaj veći od 60%T i sadrži CpG dinukelotid i TG nukleinsku kiselini koja je bez CpG dinukelotida za proizvodnju leka za redovnu administraciju subjektu u cilju: prevencije bolesti kod subjekta.

76. Upotreba imunostimulatorne nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine T-bogate nukleinske kiselina, čiji je sadržaj veći od 60%T i sadrži CpG dinukelotid i TG nukleinsku kiselinu koja je bez CpG dinukelotida za proizvodnju leka za administraciju subjektu u količini koja je efikasna za aktivaciju urođenog imunog odgovora.

77. Upotreba prema zahtevu 52, naznačena time, što dati lek obuhvata kompoziciju kao što je definisano u jednom od zahteva 32 do 36 i 38 do 44.

78. Upotreba TG imunostimulatorne nukleinske kiseline koja nema CpG dinukleotide za proizvodnju leka za administraciju ne-glodarskom subjektu u količini koja je efikasna za indukciju imunog odgovora kod subjekta.

79. Upotreba prema zahtevu 46 za proizvodnju leka za lečenje ili prevenciju alergije ili astme, za administraciju ne-glodarskom subjektu u količini koja je efikasna za prevenciju alergije ili astme.

80. Upotreba TG imunostimulatorne nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu gde suX^ X2nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od GT, GG, GA, AA, AT, AG, CT, CA, CG, TA i TT, XaX4nukleotidi izabrani iz grupe koja se sastoji od TT, CT, AT, AG, CG, TC, AC, CC, TA, AA i CA i nukleinsku kiselinu bez CpG dinukleotida ili Py-bogata imunostimulatorna nukelinska kiselina sadrži sekvencu gde je XnX2izabran iz grupe koja se sastoji od TA, TG, TC, AT, AA, AG, AC, CT, CC, CA, GT, GG, GA i GC, gde jeXy<Aizabran iz grupe koju čine: AT,AA,AG,AC,CT,CC,CA,GT,GG,GA i GC i nukelinska kiselina je bez CpG dinukelotida, za proizvodnju leka za administraciju ne-glodarskom subjektu u količini koja je efikasna da indukuje imuni odgovor kod subejkta.

81. Upotreba prema zahtevu 80, naznačena time, što data TG imunostimulatorna nukleinska kiselina je T-bogata nukelinska kiselina i poželjno sadrži nukelotidnu kompoziciju sa više od 25%T više od 35%T, više od 40%T, više od 50%T ili više od 60%T,

82. Upotreba Py-bogate imunostimulatorne nukleinske kiseline, koja je T-bogata nukleinska kiselina i nema nemetilovane CpG dinukleotide za proizvodnju leka za administraciju ne-glodarskom subjektu u količini koja je efikasna za indukciju antigen ne-specifičnog urođenog imunog odgovora kod ne-glodarskog subjekta.

83. Upotreba Py-bogate imunostimulatorne nukleinske kiseline, koja je T-bogata nukleinska kiselina i nema nemetilovane CpG dinukleotide za proizvodnju leka za administraciju ne-glodarskom subjektu u količini koja je efikasna da preusmeri Th2 imuni odogovor u Th1 imuni odgovor.