CZ20032940A3 - Fotosenzitizér a jeho způsob přípravy - Google Patents

Description

FOTOSENZITIZÉR A JEHO ZPŮSOB PŘÍPRAVY.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká medicíny, zvláště oblasti fotodynamické terapie (PDT) s použitím biologicky aktivních sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Fotosenzitizéry (PS) jsou používané jako terapeutická činidla při PDT a jako fluorescentní značkovače při fotodynamických diagnostikách (PDD).

Tetrasodná sůl mono-L-aspartilchlorinu e₆ „Npe6“ je známá jako PS (US patent č. 4 977

177):

Tento PS je účinný při PDT.

Jeho nevýhody jsou: náročnost výroby, příliš velká rychlost akumulace v nádoru a dynamika exkrece, která snižuje dobu účinné expozice nádoru a následně nízká akumulace v maligním útvaru (nádoru) kvůli vysoké hydrofilitě, což aktivuje jen několik možných způsobů ničení nádoru při PDT způsobu, jmenovitě jde jen o účinek na cévy.

Trisodná sůl lysilchlorinu pó „LCP“ je známá jako PS (US patent č. 5 330 741):

CONH

NaOOC

COONa

NaOOC

NaOOC ^CH₂

NaOOC

Tento PS je účinný při PDT.

Jeho nevýhody jsou: náročnost výroby a skutečnost, že se jedná o směs dvou monoamidů na pozici 13 a 15 v poměru 10:1, což může vést k nejasné biologické distribuci a vylučování.

Sodná sůl feoforbidu a je známá jako PS (US patent 5 378 835):

Tento PS je přednostně akumulován v nádorech a je účinný jako PDT.

Jeho nevýhoda je náklonnost k oxidaci (chemicky nestabilní) při skladování jako roztok, nedostatečná rozpustnost ve vodě po skladování ve formě pevné látky, hydrofobnost a následně pomalé vylučování z organizmu, což vede k prodloužené fotosensitivitě kůže.

Chlorin % deriváty jsou také známé jako PS (US patent č. 5 002 962):

kde R je hydrofobní uhlovodíkový substituent, nasycený nebo nenasycený, přímý nebo větvený, obsahující 4 až 25 atomů uhlíku.

PS, kde R je hexyl, je „tropič“ pro maligní nádory a je účinné činidlo pro PDT.

Jeho nevýhody jsou: náročnost výroby a čištění, vysoká hydrofobnost a následně pomalá akumulace v nádoru a nízká stálost vodného roztoku medicínských přípravků při skladování.

Je známý způsob přípravy PS, jmenovitě směs chlorinů jako solí alkalických kovů, určených pro medicínskou praxi. Tento způsob obsahuje následující kroky: rostlinná biomasa je extrahována směsi 2:1 až 8:1 uhlovodíku obsahujícího 6 až 12 atomů uhlíku a alkoholu obsahujícího 2 až 10 atomů uhlíku, výsledný chlorofylový roztok je odpařován při atmosférickém tlaku, je přidán alkohol s menším počtem atomů uhlíku než alkohol použitý pro extrakci, uhlovodík je úplně oddestilován za atmosférického tlaku, je pomalu (postupně) přidán zásaditý roztok alkoholu při teplotě varu alkoholu, ale menší než 120 °C, dokud pH je 11,5 až 11,8, směs je ochlazena, inkubována 4 hodiny, filtrována, extrahována uhlovodíkem obsahujícím 6 až 12 atomů uhlíku, alkoholová fáze obsahující hořečnaté komplexy chlorinů je oddělena, alkohol je odpařen za atmosférického tlaku, je přidána kyselina chlorovodíková pokud pH dosáhne 3,5, směs je inkubována do konce srážení chlorinů, precipitát je rozpuštěn v methanolu, je přidán alkalický roztok alkoholu na pH 8,5, PS roztok je filtrován vakuově odpařen (US patent č. 3 102 891).

Nevýhody tohoto způsobu jsou: použití vysoké teploty při odstranění rozpouštědla z extraktu, použití alkoholů, hlavně methanolu, což vede k alomerizaci E exocyklů a vzniku násobných oxidačních produktů feofytinů a feoforbidů (K. Hyvarinen, J. Helaja, P. Kurchen, I. Kipelainen, P.H. Hynninen. H-l a C-13 NMR spektra methanolových alomerizačních produktů 13(2)-(R)-chlorofylu a. Magnetic Resonance in Chemistry 33, 8, 646 až 656 (1996)), což vede ke komplexní směsi, jejíž složení je nedefinované a těžko reprodukovatelné.

• ·

Známý způsob výroby PS, jmenovitě sodné soli chlorinu eg, obsahuje následující kroky: N roztok NaOH je přidán k roztoku chlorin-e6-trimethyletheru v tetrahydrofuranu, směs je míchána dva dny při teplotě místnosti pod dusíkem, je přidána voda ke směsi, organické rozpouštědlo je extrahováno methylenchloridem, stopy methylenchloridu jsou odstraněné probubláváním dusíku roztokem soli chlorinu eg (US patent ě. 5 002 962).

Nevýhody tohoto způsobu jsou: nízká dostupnost dostatečného množství počátečního chlorin-e6-trimethyletheru, dlouhá doba výroby PS z důvodu chemické inertnosti esterového radikálu na 13. pozici tetrapyrrolového makrocyklu a nestabilita medicinální formy PS při skladování jako vodný roztok z důvodu neúplné saponifikaci esterové skupiny na 13. pozici makrocyklu.

Známý způsob přípravy PS, jmenovitě „LCP“ fotosenzitizéru pro fotodynamickou terapii (trisodná sůl lysylchlorinu pg) zahrnuje následující kroký‘biomasa je třikrát extrahována acetonem, filtrována nebo centrifugována, extrakt je odpařen, přidána kyselina pro odstranění hořeěnatých iontů z molekuly chlorofylu a pro hydrolýzu fytylové esterové skupiny je přidáván methanol za současné esterifikace, k reakční směsi je přidána voda, derivát feoforbidu a je extrahován methylenchloridem, extrakt je neutralizován, promyt vodou, odpařen, chromatograficky čištěn přes oxid hliníku, methylfeoforbid a vykrystalizovaný ze směsi methylenchlorid - methanol reaguje se silnou anorganickou bázi v přítomnosti kyslíku v pyridinu -diethyletheru - n-propanolu, k reakční směsi je přidána voda, vodná fáze je okyselena na pH 4“nestabilní chlorin“ je extrahován methylenchloridem, extrakt odpařen, „nestabilní chlorin“ je rozpuštěn v tetrahydrofuranu, roztok odpařen, postup je opakován, dokud se zastaví nárůst absorpce na 700 nm, výsledný purpurin 18 je rozpuštěn v tetrahydrofuranu, esterifikovaný diazomethanem, methylester purpurinu 18 je smíchán s vodným roztokem lysinu v methylenchloridu v přítomnosti pyridinu, směs je míchána 12 hodin při teplotě místnosti, rozpouštědlo je odstraněno za vysokého vakua, výsledný surový produkt je čištěn na reversní fázi pomocí HPLC, rozpouštědlo je odstraněno lyofylizací, PS je rozpuštěn v fosfátovém pufru za vzniku injekčního roztoku pro PDT, je přidán O,1N roztok NaOH, pH je upraveno na fyziologickou hodnotu 7,35 pomocí O,1N HCI a roztok je filtrován přes mikroporézní filtr (US patent ě. 5 330 741).

Nevýhody tohoto způsobu jsou: nízká reprodukovatelnost, náročnost (použití vysokého vakua, krystalizace, kolonová chromatografie a HPLC, dlouhá reakční doba s lysinem), použití vysoce toxických a hořlavých činidel (diazomethan, pyridin, methanol, tetrahydrofuran, diethylether). Tyto nevýhody činí způsob nevhodný pro farmaceutický průmysl. Mimoto je výsledný ve vodě rozpustný produkt stabilní jenom 24 hodin při 4 °C v temnu ve formě vodného

• ···· ··· • ·· · ···· • · · · · ·· ····· • · · · · · ·· · · ··· ·· · roztoku a v pevné formě je stabilní jenom 4 měsíce při 4 °C v temnu, zatímco podle farmakologických požadavků by měl být stabilní alespoň 6 měsíců. (Leach M.W., Higgins R.J., Boggan J.E., Lee S.-J., Autry S., Smith K.M. Effectiveness of a Lysylchlorin pó/Chlorin pg mixture in Photodynamic Therapy of the Subcutaneous 9L Glioma in the Rat. Cancer Research 1992, 52, 1235 až 1239). Dále z hlediska chemického složení tento PS představuje směs monoamidů na pozici 13 a 15 v přibližném poměru 10:1, což může vést k nejasnému biologickému rozdělení a vylučování z organismu.

Podstata vynálezu

Cílem předkládaného vynálezu je získat PS, který je charakterizován snadnou přípravou a čištěním, vyváženou hydrofilitou a hydrofóbnosti a následně optimální rychlosti akumulace v nádoru a vylučováním z nádoru a celého organismu, a také vysokou stabilitou medicínských vodných roztoků.

Cíl je dosažen výrobou PS, který obsahuje chlorin ve formě soli alkalického kovu, chlorin se skládá z chlorinu eg (13-karboxy-17-[2-karboxyethyl]-15-karboxymethyl-17,18-/raz25-dihydro-3-vinyl-8-ethyl-2,7,12,18-teramethylporfyrin)

(I) o obsahu 80 až 90 %, purpurinu 5 (13-karboxy-17-[2-karboxyethyl]-15-formyl-17,18/ra«s-dihydro-3-vinyl-8-ethyl-2,7,12,18-teramethylporfyrin)

(Π) ο obsahu 5 až 20 % a purpurinu 18- chlorinu p₆ (13-karboxy-17-[2-karboxyethyl]-15-karboxy-17,18-/rans-dihydro-3 -vinyl-8-ethyl-2,7,12,18-teramethylporfyrin)

(ΙΠ) do chybějícího zbytku, takže uvedené složky tvoří směs, sodík a draslík může být použity jako alkalický kov.

Cílem vynálezu je také dosáhnout vysoké reprodukce způsobu výroby PS, jeho jednoduchosti, chemické stability medicínské formy PS ne menší než 1 rok, stejně jako dosáhnout maxima fyzikálně chemických a biologických vlastností PS, které určují účinnost PS při PDT a také se vyhnout použití toxických činidel.

Podstata navrhovaného způsobu výroby PS je následující: Spirulina biomasa je zpracována s aceton dokud se nevyextrahuje všechen chlorofyl, biomasa je filtrována nebo centrifugována, • ·

-7• · • · · • ·· · · extrakt je zpracován s kyselinou, čímž se odstraní hořčík z molekuly chlorofylu, extrakt je neutralizován a vysrážený feoíytin a je zfiltrován, pak hydrolyzován ve směsi kyselina chlorovodíková-aceton-hexan, 6 až 16 ml acetonu, 0,6 až 6 ml hexanu a 5 až 10 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové je použito na 1 g surového feofytinu a, směs je zahřívána na 40 až 60 °C a míchána 20 minut až 1 hodinu, pak je přidán hexan (6 až 16 ml) a organická fáze je promyta směsi acetonu a kyseliny chlorovodíkové (2 až 10:1), vodná fáze je promyta hexanem, vodná fáze obsahující feoforbid a je neutralizována přebytkem vodného roztoku citrátu sodného (tri-, di-, mono-substituovaného), vysrážený feoforbid a je zfiltrován, promyt vodou, rekrystalizován ze směsi aceton-voda, sušen vzduchem do konstantní hmotnosti, pak rozpuštěn v acetonu, přidána silná anorganická báze ve formě vodného roztoku o koncentraci 0,005 až 1,0 %, roztok míchán při 30 až 60 °C po dobu 5 až 30 minut, přidán další objem silné anorganické báze za vzniku vodného roztoku o koncentraci 1 až 50 %, směs je zahřívána při 40 až 60 °C po dobu 20 až 90 minut, neutralizována zředěnou kyselinou chlorovodíkovou, sraženina chlorinu eó je odstraněna centrifugách promyta destilovanou vodou až zmizí kyselá reakce, je získán 55 až 80% chlorin eó, ten je rekrystalizován z acetonu proto, aby se oddělily tetrapyrroly, chlorin eó je zfiltrován a promyt destilovanou vodou, zahříván v utěsněné nádobě při teplotě 40 až 100 °C po dobu 1 hodiny až 30 dnů, ochlazen a je přidán silný roztok báze, dokud pH není v rozmezí 7,5 až 8,5, pak je roztok upraven apyrogenní vodou pro injekční použití za vzniku roztoku fotosenzitizéru o koncentraci 6,5 až 7,5 % hmotnostních.

Dále ve způsobu výroby PS po kroku přidání silného roztoku báze, dokud pH není v rozmezí 7,5 až 8,5, může být směs gelově filtrována za vzniku chlorinu θ obsahu 80 až 90 %, purpurinu 5 do 5 až 20 % a purinu 18 do zbytku, pak je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové dokud je fotosenzitizér vysrážený, roztok je upraven apyrogenní vodou pro injekční použití na koncentraci fotosenzitizéru 6,5 až 7,5 % hmotnostních, takže je získán „Kapalný extrakt chlorinů“.

Dále ve způsobu výroby PS po kroku gelově filtrace může být přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové dokud je fotosenzitizér vysrážený, pak je sraženina odfiltrována nebo centrifugována, jsou přidané pomocné látky povolené RF State Pharmacopeia dokud pH je 7,5 až 8,5, je přidána apyrogenní voda pro injekční použití tak, že koncentrace fotosenzitizéru je 0,1 až 1 % hmotnostní, pak jsou odfiltrované baktérie.

Dále ve způsobu výroby PS po kroku gelové filtrace může být přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové dokud je fotosenzitizér vysrážený, pak je sraženina odfiltrována nebo centrifugována, je přidána apyrogenní voda pro injekční použití tak, že koncentrace fotosenzitizéru je 6,5 až 7,5 % hmotnostní, „Kapalný extrakt chlorinů“ je dispergován v gelovém • ·

• · • · · • ·· · · substrátu podle následujícího poměru:0,5 až 12 % hmotnostních „Kapalný extrakt chlorinů“, 5 až 20 % hmotnostních dimethylsulfoxid, zbytek voda, pomocné látky schválené od RF State Pharmacopeia a gelový substrát.

Dále ve způsobu výroby PS po kroku gelové filtrace může být přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové dokud je fotosenzitizér vysrážený, pak je sraženina odfiltrována nebo centrifugována, je přidána apyrogenní voda pro injekční použití tak, že koncentrace fotosenzitizéru je 6,5 až 7,5 % hmotnostní, a výsledný „Kapalný extrakt chlorinů“ je rozpuštěn v dimethylsolfoxidu podle následujícího poměru: 0,5 až 12 % hmotnostních „Kapalný extrakt chlorinů“ a zbytek dimethylsulfoxid.

Tento způsob je proveden při použití standardního laboratorního vybavení: biomasa je zpracována v 10 až 50 1 hliníkových nádobách vybavených mechanickým míchadlem,biomasa je filtrována přes 5 až 20 1 „nutch“ filtry s olejovou vakuovou pumpou a vymrazovací pastí s kapalným dusíkem, biomasa je centrifugována v chlazené centrifuze s 4 1 kyvetami a rotační rychlostí 6 000 ot/min, extrakt je okyselen ve skleněných 20-ti litrových nádobách, vysrážený feofytin a je filtrován přes 5 až 20 1 „nutch“ filtry s olejovou vakuovou pumpou a vymrazovací pastí s kapalným dusíkem, pak je hydrolyzován v 0,1 až 0,5 1 baňce s kulatým dnem a třemi hrdly vybavené mí chadlem, zpětným chladičem a dávko vacím otvorem s uzávěrem, roztoky jsou promývány v 2 1 nálevkách, neutralizovány v 2 až 4 1 chemických baňkách, feoforbid a je filtrován přes 5 až 20 1 „nutch“ filtry s olejovou vakuovou pumpou a vymrazovací pastí s kapalným dusíkem, rekrystalizován v 0,25 až 1 1 chemických baňkách s plochým dnem, rozpuštěn v acetonu a podroben reakci se silnou anorganickou bázi v 0,5 až 2,0 1 baňkách s kulatým dnem a třemi hrdly vybavené míchadlem, zpětným chladičem a dávkovacím otvorem s uzávěrem, sraženina chlorinů e<5 je centrifugována v chlazené centrifuze s čtyřmi 0,5 1 kyvetami a rotační rychlostí 6 000 ot/min, chlorinů eg je rekrystalizován v 2 až 5 1 chemických baňkách s plochým dnem, filtrován přes 1 až 2 1 „nutch“ filtry s olejovou vakuovou pumpou a vymrazovací pastí s kapalným dusíkem, zahříván v 0,05 až 0,1 1 baňkách s kulatým dnem, podroben reakci se silnou anorganickou bázi a upraven v 0,1 až 1,0 1 chemických kádinkách s požitím standardního pH-metru a spektrofotometru, směs je gelově filtrována na koloně o průměru 50 až 10 mm a o výšce 100 až 150 mm, bakterie jsou odfiltrovány přes standardní 0,22 gm mikroporézní filtr typu Millipore, „Kapalný extrakt chlorinů“ je dispergován v gelovém substrátu za použití nožového nebo kulového homogenizátoru, dále jsou použity pro přípravu vzorků a roztoků 0,01 až 101 kónické baňky s uzávěrem, 0,005 až 2 1 válce, 0,05 až 2 1 kádinky, 20 1 láhve, váhy s rozsahem 1 až 1000 g a magnetické míchadla, 5 1 baňky s kulatým dnem • ·· ·· ·· · · · · ·· ··· • · · · · · · · ·

9· · ·· · · ·· ····· • · ··· ··· ··· ··»· ·· ··· ·· · s termometrem a přímým vodním chladičem jsou používány pro regeneraci acetonu a hexanu, rotační vakuová odparka je používána pro rychlé odstranění rozpouštědel pří nízké teplotě.

Podle způsobu výroby PS je koncentrovaný roztok kyseliny chlorovodíkové považován jako nasycený vodný roztok chlorovodíku při teplotě 20 °C, který obyčejně obsahuje 36 až 37 % chlorovodíku.

Při kroku přechodu feofytinu a na feoforbid a je rozsah objemu hexanu a acetonu (6 až 16 ml acetonu a 0,6 až 6 ml hexanu) vysvětlen tím, že při použití menších objemů není dosaženo úplného rozpuštění feofytinu a jestliže jsou objemy větší, roztok není dostatečně koncentrovaný pro rychlou hydrolýzu. Rozsah objemu kyseliny chlorovodíkové (5 až 10 ml) je vysvětlen tím, že při použití menších objemů klesá výtěžek feoforbidu a a jestliže je objem větší, reakční selektivita klesá z důvodu vzniku současného produktu pyrofeoforbidu a. Teplotní rozsah 40 až 60 °C je vysvětlen tím, že při menší teplotě klesá výtěžek feoforbidu a a jestliže je teplota větší, reakční selektivita klesá z důvodu vzniku současného produktu pyrofeoforbidu a. Reakční doba 20 min až 1 h je vysvětlena tím, že při menší době klesá výtěžek feoforbidu a a jestliže je reakční doba větší, reakční selektivita klesá z důvodu vzniku současného produktu pyrofeoforbidu a. Objem přidávaného hexanu (6 až 16 ml) je vysvětlen tím, že menší objem je nedostatečný pro oddělení fytolu z reakční směsi a použití většího množství hexanu není racionální.

Při kroku čištění feoforbidu a je organická fáze promyta směsí acetonu a koncentrované kyseliny chlorovodíkové v poměru 2:1 až 10:1. Jestliže je poměr menší než 2:1 tvoří se vločkovitá sraženina těžce odstranitelná z vodné fáze obsahující cílový feoforbid a. Jestliže je poměr větší než 10:1 vodná fáze se stává přesycenou acetonem a přechází do ní příměsi z hexanové fáze, obsahující cílový feoforbid a.

Při kroku přechodu feofytinu a na chlorin ββ je koncentrace silné báze v rozmezí 0,05 až 1,00%, nižší hodnota je minimum pro otevření cyklopentanonového kruhu feoforbidu a (kruh) a při vyšší koncentraci než 1% probíhá alomerizace (oxidace) E kruhu za vzniku „nestabilního chlorinu“ místo požadovaného chlorinu e6, a následným vznikem purpurinu 18 a dále chlorinu P6·

Podle způsobu se přidává další objem silné anorganické báze ve formě vodného roztoku o koncentraci 1 až 50%. Jestliže je koncentrace menší než 1%, dochází k nekompletní saponifíkací esterové skupiny na pozici 13 nebo 15. Jestliže je koncentrace větší než 50%, mohou se v některých případech otevřít tetrapyrrolové makrocykly.

Pak je reakční směs míchána při 30 až 60 °C po dobu 5 až 30 min, menší teplota podporuje alomerizační reakci na E kruhu a vyšší teplota dekompozici chlorinu ee na chlorin e₄. Při přídavku dalšího objemu silné anorganické báze v teplotním rozmezí 40 až 60 °Ca době 20 až 90

-10• © · © © © · • · · · · · © • · · • ·· © min, kratší doba a teplota neumožní hydrolýzu esteru v pozici 15 a při vyšší teplotě a delším času vzniká více chlorinu e₄.

Když chlorin přechází do „Kapalného extraktu chlorinů“, nastává oxidace a následný termolytický proces dehydratace a dekarboxylace PS s oxidací methylenové skupiny v pozici 15 vpurinu 5:

Když chlorin β6 přechází do „Kapalného extraktu chlorinů“, je použití teploty nižší než 40°C neekonomické. Použití teploty vyšší než 100°C vede ke zvýšení rozkladu.

Trvaní reakce menší něž 1 hodina vyžaduje teplotu nad 100 °C nebo vede k látce s nižší biologickou aktivitou.

Trvání reakce delší než 30 dní je doprovázeno ireverzibilní změnou (rozkladem) látky.

Optimální reakční teplota je 45 až 70 °C (Obr. 1).

Optimální reakční doba je 2 až 9 dní při 70 °C (Obr. 2) nebo 1 až 48 hodin při 100 °C (Obr. 3), vedoucí k 5 až 20 % purpurinu 5 v příměsi.

Směs obsahující 5 až 20 % purpurinu 5 a 80 až 95 % chlorinu ee v aktivním činidle (PS) je vhodná pro výrobu medicínské ve vodě rozpustné injekční formy. Jestliže směs obsahuje více než 20 % purpurinu 5, rozpustnost ve vodě je horší, nepříjemně ovlivňuje stabilitu medicínských forem při skladování a zhoršuje možnost filtrace přes mikroporézní filtry. Poslední vlastnost je nutná pro sterilizaci medicínských forem, protože tetrapyrrolové medicínské formy nemohou být sterilizované zahříváním nebo UV zářením kvůli nežádoucím chemickým změnám.

až 95 % chlorinu ve směsi je nutné pro udržení purpurinu 5 ve formě rozpustné ve vodě.

Rozsah pH vychází z toho, že jeho nižší hodnota - pH 7,5- je nižší limit rozpustnosti chlorinů ve vodě při koncentraci vhodné pro farmaceutické použití, bez přídavku rozpouštěcích činidel. Horní limit - pH 8,5 - je horní limit biologické tolerance hydroxidových iontů [OH ].

• ·* · • Φ · · φ · • · · · φ φφφφ φ φ · · φφφ φφφφ ··

- 11 φ φφ · φφ φφφ • φφφφ φφφφ φφφφ φ φφφ φφφ ·· φ

Rozsah koncentrace chlorinu β6 vychází z použití technologických způsobů centifůgace nebo filtrace při oddělení sraženiny chlorinu e₆, tyto způsoby získají produkt v tomto koncentračním rozmezí.

Vynález je představován obrázky, kde obr. 1 se týká způsobu a ukazuje tvorbu purpurmu 5 v závislosti na teplotě při inkubaci 30 dní, obr. 2 ukazuje závislost obsahu purpurům 2 na době inkubace při teplotě 70 °C, obr. 3 ukazuje závislost obsahu purpurům 5 na době inkubace při teplotě 100 °C, obr. 4 ukazuje farmakokinetiku “Kapalného extraktu chlorům” použitých jako medicínský přípravek “Radachlorin, 0,5% roztok pro injekční podání”(“Photochlorin”) na myších s nádorem při intravenózním podání při dávce 20 mg/kg, obr. 5a ukazuje přítomnost metabolitů chlorinu (vzorec I), jmenovitě purpurinu 5 (vzorec Π), v krvi a křivka označena jako „1“ odpovídá PS v 0,01M borátovém pufru o pH 9,18 a křivka označená jako „2“ odpovídá PS v krvi. obr. 5b potvrzuje metabolismus chlorinu β6 (vzorec I) na purpurinu 5 (vzorec H) v játrech, obr. 6 ukazuje PMR spektrum “Kapalného extraktu chlorinů” získaného v příkladu 2, obr 7. ukazuje hmotnostní spektrum “Kapalného extraktu chlorinů” získaného v příkladu 2, obr 8. ukazuje viditelné absorpční spektrum “Kapalného extraktu chlorinů” získaného v příkladu 2, spektrum bylo naměřeno v ethanolu při koncentraci 5 mkg/ml, obr. 9 ukazuje PMR spektrum chlorinu e^, obr. 10 ukazuje hmotnostní spektrum chlorinu obr. 11 ukazuje viditelné absorpční spektrum chlorinu et, spektrum bylo naměřeno v ethanolu při koncentraci chlorinu e₆15 mkg/ml (Sore pruh - 5 mkg/ml), obr. 12 ukazuje PMR spektrum purpurinu 5, obr. 13 ukazuje hmotnostní spektrum purpurinu 5, obr. 14 ukazuje viditelné absorpční spektrum purpurinu 5, spektrum bylo naměřeno v ethanolu při koncentraci purpurinu 5 15 mkg/ml (Sore pruh - 5 mkg/ml), obr. 15 ukazuje PMR spektrum dimethylesteru purpurinu 5, obr. 16 ukazuje hmotnostní spektrum dimethylesteru purpurinu 5, obr. 17 ukazuje viditelné absorpční spektrum dimethylesteru purpurinu 5, spektrum bylo naměřeno v ethanolu při koncentraci dimethylesteru purpurinu 5 15 mkg/ml („Sore“ pruh - 5 mkg/ml).

PS je znázorněn v příkladu 1, příklady provedení způsobů jsou uvedené v příkladu 2,3 speciální případy provedení jsou znázorněné v příkladech 4 až 9.

Chemicky PS obsahuje tři cyklické pyrroly přírodního chlorinu ( s hydrogenovaným D kruhem) - chlorin e6 (vzorec I), purpurin 5 (vzorec Π, příklad 10) a purpurin 18, který postupně se přeměňuje na chlorin p6 v alkalickém prostředí (při skladování) (vzorec ΙΠ).

Fyzikálně chemicky PS má schopnost absorbovat světlo ve viditelném spektru, což vede k PS fotoaktivaci a následné relaxaci excitovaného stavu s přeměnou energie na molekulární kyslík a organické substráty rozpuštěné v tkáních. Tento přenos vede k oxidaci a vzniku volných radikálů v biologických tkáních a jejich poškození a následné destrukci (nekrózy). Nejvíce

-12preferovaná excitační délka je dlouhovlnná délka (tab. 1), protože penetrační energie světla v biologických tkáních vzrůstá s rostoucí vlnovou délkou. Proto je PS schopný poškodit biologický objekt do hloubky 10 mm po excitaci světlem o vlnové délce 654 až 670 nm.

Farmaceuticky je PS „Kapalný extrakt chlorinů“ (extrakty jsou považované za kapalné, jestliže účinná koncentrace činidla je menší než 20 %). Daný přípravek je považovaný za extrakt proto, že je nutné jej extrahovat z biomasy za použití organických rozpouštědel.

Tabulka 1

Pozice absorpčních maxim a molekulární extinkce absorpčních hodnot pro dlouhovlnné světlo „Kapalného extraktu chlorinů“ v různých mediích.

PS	\nax, nm e, M^cm'1 (0,01M borátový pufr, pH9,18)	\naxí nm e, M^cm-1 (0,01M borátový pufr s 1% lidským sérovým albuminem, pH 7,2)	Xmax, nm e, M^cm1 (ethanol)
„Kapalný extrakt chlorinů“	654,5 (28270)	662 (34200)	662 (34230)

Sloučenina vzorce Π má schopnost se akumulovat selektivně v maligní neoplazmě a infekčních ohniskách, ale je slabě rozpustná ve vodě a sloučenina vzorce I spolu s uvedenou fotodynamickou účinností je rozpouštěcí činidlo pro sloučeninu vzorce Π.

Farmakologicky (Obr. 4, příklad 11) je dosaženo unikátních farmakokinetických parametrů tak, že v organismu se PS vzorce (I) pomalu mění na PS vzorce (H), tento proces drží koncentraci PS vzorce (Π) na konstantní hladině od okamžiku zavedení do organismu do momentu exkrece z nádoru, během doby dostatečné pro účinnou PDT. Po zavedení uvedeného PS do organismu myší s nádorem přechází do krevního řečiště, a kvůli krevnímu oběhu hlavně pro sloučeninu vzorce I je dosažena vysoká a stabilní PS koncentrace 0,27 až 0,32 μΜ, dostatečná pro účinnou PDT v rozmezí 0,5 až 4 hodiny, během prvních 3 hodin po podání v okolí nádoru. Během této doby je dosažen vysoký kontrast kvůli přítomnosti 5 až 20 % sloučeniny vzorce Π v přípravku, tato sloučenina má schopnost akumulace v nádoru s vysokým kontrastem, maximum akumulace spadá do okamžiku 3 hodin po PS zavedení do organismu zvířete (index kontrastuje 14,5 pro kůži a 2,9 pro svaly). Během této doby sloučenina vzorce I se mění na sloučeninu vzorce II v organismu, poskytující vysokou stabilní PS koncentraci v okolí nádoru v intervalu 3 až 5 hodin po injekčním podání, tato koncentrace se postupně zmenšuje,

-13zůstává terapeuticky účinná 18 hodin po injekčním podání. Pak sloučenina vzorce H disociuje v organismu na netoxické produkty, které jsou vyloučené játry.

Transformace chlorinu ee, vzorce I na purpurin 5 vzorce Π je potvrzena fluorescenčními spektry vzorků orgánů a tkání experimentálních zvířat, (obr. 5). Při přidání „Radachlorin, 0,5% roztok pro injekční podání“ („Photochlorin“) do krevního homogenátu (Obr. 5a, (1)) o koncentraci 10 μΜ s následnou spektrofotometrickou analýzou je pozorována změna fluorescenčního spektra ve formě 1,2-násobného rozšíření a maximum fluorescenční intenzity je posunuto do dlouhovlnné oblasti o 8 nm. Při přidání „Photochlorin“ v menší koncentraci (c = 1 μΜ), není pozorován posun ani rozšíření, což ukazuje na účinek dávky na metabolickou přeměnu (Obr. 5a, (2)).

Obr. 5a (3) ukazuje analýzu krevního homogenátu obdrženého 3 hodiny po podání „Photochlorin“ myším. Nejvíce významný parametr je l,5násobně rozšířené spektrum a posun maxima do dlouhovlnné oblasti o 4 nm, což indikuje směs „Photochlorin“ a metabolitu v analyzovaném krevním vzorku.

Po přidání „Photochlorin“ o koncentraci 10 μΜ do testovací zkumavky sjatemím homogenátem (Obr. 5b (1)) je změna spektrální charakteristiky vyjádřena hlavně v posunu maxima fluorescenční intenzity do dlouhovlnné oblasti o 9 nm. Rozšíření spektra není pozorováno.

Obdobný obrázek je pozorován při přidání „Photochlorin“ o menší koncentraci 1 μΜ (Obr. 5b (2)).

Když je jatemí homogenát získaný 3 hodiny po podání přípravku zvířatům analyzován, spektrofotometrický záznam vzorkuje podobný předchozím dvěma (Obr 5b, (3)).

Tedy získané data ukazují na přítomnost metabolitu „Photochlorin“ vjatemím homogenátu.

Akumulace purpurinu 5 v nádorech experimentálních zvířat, optimální pro fotodynamický účinek vzhledem k selektivitě je pozorována v časovém intervalu 3 až 18 hodin po intravenózním nebo intraperitonálním podání. V případě , kdy je nutné mít také chloriny v krevním oběhu, je ozařovací optimum v čase 0,5 až 4 hodiny po intravenózním podání. Obecně pro provedení PDT s „Kapalným extraktem chlorinů“ je interval mezi podáním přípravku a ozářením od 0,5 do 18 hodin.

Biologický účinek medicínské formy „Radachlorin, 0,5% roztok pro injekční podání“ („Photochlorin“) obsahující 0,5% bezvodý „Kapalný extrakt chlorinů“ je odhadován in vitro a in vivo.

« »

PS rovnováha vzhledem k amfifilicitě je potvrzena standardním experimentem in vitro (Kessel D. Biochemistry. 1977, 16, 3443 až 3449) (Tab. 2, Příklad 12) PS rozdělovači koeficient v 1-oktanol/fosfátový pufr, pH 7,4 (Cd) je 1,40. to znamená, že nárokovaný PS je dobře rozpustný ve vodné i lipofilní fázi a potvrzuje lipofilitu PS, která dovoluje této sloučenině být přenesena z vody do komplexů transportních proteinů a lipoproteinů, prochází rychle do buněk difúzí přes plazmatickou membránu. Po ozáření laserem sloučenina uložena touto cestou uvolňuje atomární kyslík uvnitř buňky a zabíjí ji.

PS protinádorový účinek vzhledem k různým typům rakovinových buněk je potvrzen výsledky získanými v in vitro experimentech ve kterých byly použity 3 linie nádorových buněk: potkaní feochromocytom PC 12, potkaní Gasserův ganglion neurinoma RGGN1 a potkaní hepatom 27 (Hep 27) (Tab. 2, příklad 13).

Následující způsoby jsou používány pro studium cytofototocického (po ozáření laserem) a biologického „tmavého“ účinku v závislosti na dávce:

1. MTT test dovoluje definovat přesně počet žijících buněk po jejich PS ošetření a laserovém ozáření pro počítám cytotoxických a cytofototoxických indexů PS. Ty samé testy dovolují odhadnout závislost cytotoxického a biologického „tmavého“ účinku PS (A.V. Reshetnickov, G. V. Ponomarev, A. V. Ivanov, O. Y. Abakumova, T. A. Tsvetkova, A. V. Karmenyan, A. G. Rebeko, R. P. Baum. Novel drug form of chlorin β6//Ιη Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy IX. T. J. Dougherty, ed., Vol. 3909, 124 až 129 (200)).

2. Stanovení počtu buněk po obarvení jedné vrstvy krystalovou violetí na konci pokusu. Tato metoda je méně náročná a levnější než MTT-test a také dovoluje počítat cytotoxické a cytofototoxické indexy PS (A.E. Medvedev et al, Biomed. Science, 1990, 1, 261), aleje méně přesná, protože krystalová violeť barví také mrtvé buňky.

3. Srovnávací genotoxický a genofototoxický účinek PS je odhadován podle stupně inhibice DNA syntézy vbuňkách.DNA syntéza je stanovená podle hladiny zabudování 14C thymidinu do DNA za použití standardních radiometrických metod (O.Y. Abakumova, et al, J. Neural. Transm. 3, 52, 87 (1998)).

Všechny tři studované linie buněk jsou vysoce citlivé k laserovému ozáření po PS podání (data MTT-testu). Podle citlivosti k laserovému ozáření je pořadí buněčných linií následující RGGNl>PC12>Hep27.

PC účinek v 5 μΜ koncentraci na buňky v temnotě byl 96,5 až 86,2 % pro PC-12, 103,7 až 93,0 % pro RGGN1 a 109,7 až 87,9 % pro Hep27 (MTT-test -krystalová violeť). Za stejných podmínek je syntéza DNA u PC-12 buněk beze změny a je redukována o 21,2 % a 22,2% • ·

-15v Hep27 a RGGN1 buňkách. Pozorovaný pokles počtu RGGN1 a Hep27 buněk při účinku 5 μΜ PS na buňky v temnu je pravděpodobně způsobený indukci buněčné proliferace pomocí PS. Obecně je za temna typičtější pro PS cytotoxický účinek než proliferační účinek.

Buněčná smrt je pozorována po ozáření laserem v buňkách ošetřených PS. Dávková závislost cytofototoxického účinku přípravku je detekována a dovoluje počítat EC50, tj. stanovit koncentraci PS způsobující smrt 50 % buněk. Tyto data jsou obsažené v tabulce 2. Je nutné poznamenat, že PS s EC50 menším než 20 μΜ je považován za dostatečný pro potlačení růstu nádoru.

DNA syntéza v PC-12 buňkách je silně snížena (96,5% pokles ve srovnání s kontrolou) při stanovení genofototoxicity po ošetření buněk 5μΜ PS a ozáření laserem. Stimulace DNA syntézy po ozáření laserem je pozorována při nízké koncentraci PS u Hep27 a RGGN1 buněk, tato syntéza je významně redukována v přítomnosti 5 μΜ RC. Pozorovaná stimulace DNA syntézy může být vysvětlena tím, že transformované jatemí a gliové buňky, které přežijí při nízké koncentraci PS mají vysokou schopnost syntetizovat DNA a regenerovat populaci.

PS je tedy vysoce cytofototoxický přípravek pro různé typy nádorových buněk. Při vysoké koncentraci (> 5 μΜ) je střední inhibitor nádorového růstu dokonce bez ozáření.

PS toxické vlastnosti byly studovány v in vivo pokusech (Příklad 14). Průměrná LD50 je 210,53 ± 22,2 mg/kg , hmotností koeficient je brán v úvahu, a dávka způsobující smrt 10 % experimentálních zvířat (LDi₀) je 169,87 mg/kg. Tyto pokusy dovolují považovat PS jako „Málo toxickou látku“.

PS biodistribuce byla studována v in vivo pokusu (příklad 11). Následující mechanismy distribuce sloučenin byly pozorovány, když se PS podal intraperitonálně myším sT39 embryokarcinomem naočkovaným na sval zadní nohy. Po injekčním podání se PS dostává do krve a pak je redistribuován do orgánů a tkání zvířat (Tab. 3).

Jak je patrné z tabulky 3, maximum akumulace v nádoru (0,70 μΜ) je dosaženo po pěti hodinách po intraperitonálním podání v dávce 40 mg/kg a je stálé po dlouhou dobu (18 až 24 hodin). Koncentrace v nádoru 18 hodin po podání je 0,48 μΜ, což je l,5krát méně než absolutní akumulační maximum při vysoké selektivitě akumulace. Poměr nádor/sval je 32 a nádor/kůže 44.

Akumulační maximum v nádoru (0,32 μΜ^ε dosaženo za půl hodiny po intravenózním podání dávky 20 mg/kg a je také stálé po dlouhou dobu (do pěti hodin). Maximální kontrast akumulace po intravenózním podání je dosažen zatři hodiny a tato hodnota činí 3 pro nádor/sval a 4 pro nádor/sval. PS je vyloučen organismem z 98 % za den.

- 16Tabulka 2

Lipofilní koeficient a in vitro účinek „Radachlorin, 0,5% roztok pro injekční podání“ („Photochlorin“).

Testy, buněčné linie	Cytotoxicita („temná“ toxicita), % ke kontrole při 5 μΜ	Fototoxicita, EC50, μΜ1	(Cd)
MTT test, PC-12	96,5	1,8
MTT test, RGGN1	103,7	1,8
MTT test, Hep27	109,7	3,9
Test s krystalovou violeti, PC-12	86,2	1,5
Test s krystalovou violeti, RGGN1	93,0	1,8	1,4
Test s krystalovou violeti, Hep27	87,9	4,7
Genotoxicita, PC-12	104,7	3,5 % ke kontrole při 5μΜ
Genotoxicita, RGGN1	77,8	133,2 % ke kontrole při 5μΜ
Genotoxicita, Hep27	78,8	100,7 % ke kontrole při 5μΜ

¹ Mimo genofototoxicitu

Výsledky účinku přípravku odhadnuté při PDT nádoru v in vivo pokusech na myších (příklad 15) dovolují říci, že „Radachlorin, 0,5% roztok pro injekční podání“ („Photochlorin“) a „Radachlorin, 0,05% gel) mají zvýšenou fotodynamickou aktivitu.

„Kapalný extrakt chlorinů“, medicínský přípravek obsahující sodné soli chlorinů (nebo soli chlorinů a jiných silných anorganických bází), je používán pro výrobu medicínských prostředků pomocí přídavků různých pomocných látek povolených RF statě Pharmacopoeia: uhličitan sodný, sacharóza, glukóza, škrob, stearát hořečnatý, polyvinylpyrrolidony, polyglukany, methylglukamin, izotonický roztok, dimethylsulfoxid, gelové a emulgační látky, atd. (příklady 4 až 9).

Masti, mazání, gely a olejové přípravky jsou používané pro vnější použití, tyto formy obsahují substráty povolené RF statě Pharmacopoeia, 5 až 20 % dimethylsulfoxidu a 0,5 až 12 % „Kapalného extraktu chlorinů“, nebo 0,8 až 14 % „Kapalného extrakt chlorinů“ a 86 až 99,2 % dimethylsulfoxidu (příklady 8,9).

Rozsah koncentrace dimethylsulfoxidu v kombinaci se substrátem je vysvětlován tak, že průnik látky do tkáně je nízký při koncentraci menší než 5%, a to snižuje PDT účinnost. Jestliže koncentrace dimethylsulfoxidu je vyšší než 20%, medicínské formy na jiných bázích ztrácejí stabilitu při uskladnění. Rozsah koncentrace látky je vysvětlován tak, že jestliže koncentrace účinné látky je menší než 0,5 %, koncentrace látky v tkáni je nedostatečná pro účinnou PDT. Jestliže koncentrace účinné látky je vyšší než 12 %, tkáň ztrácí propustnost pro světlo, vše je absorbováno ve vrchní vrstvě tkáně a vede ke spálení při nízké účinnost PDT procedury.

Tabulka 3. Hlavní farmakokinetické parametry

PS	Absolutní akumulační maximum, orgán- μΜ-hodina	Akumulační maximum v nádoru-μΜ- hodina	Poměr nádor/kůže při akumulačním maximum v nádoru	Poměr nádor/svaly při akumulačním maximum v nádoru
Fotochlorin, intravenózně, 20 mg/kg	tenké střevo - 4,0-0,5	0,32 - 0,5	6,4	1,6
Fotochlorin, intraperitoneálně, 20 mg/kg	krev - 5,2 - 0,5	0,70 - 5	3,9	3,0
PS	Akumulace v nádoru při kontrastním maximu, μΜ-hodina	Poměr nádor/kůže při kontrastním maximu	Poměr nádor/svaly při konstantním maximu	Vylučování, %-hodiny
Fotochlorin, intravenózně, 20 mg/kg	0,29 -3	14,5	2,9	98-24
Fotochlorin, intraperitoneálně, 20 mg/kg	0,48-18	44,0	32,0	98-24

Expozice látkou na kůži před ozářením je 0,5 až 24 hodin při externím použití. Látka nemá čas proniknout do tkáně v dostatečné hloubce v čase menším než 0,5 hodin. Jestliže časový • *

18· φ · · 4 4 4 · • · 4 ·· * interval je větší než 24 hodin, není již dosaženo absolutního akumulačního maxima vlivem redistribuce a vylučování. Mimoto dlouhodobé expozice externích medicínských přípravků na kůži jsou z klinického pohledu nevhodné.

Přípravek je používán pro intravenózní podávání ve formě 0,1 až 1% roztoku v jakémkoliv mediu povoleném podle RF State Pharmacopoeia (apyrogenní voda pro injekční podávání, dimethylsulfoxid, roztok solanky, atd.) Použití roztoku s koncentraci látky nižší než 0,1% je iracionální při pohledu na množství kapaliny zavedené do organismu, použití roztoku s koncentrací větší než 1% je nemožné z důvodu nízké filtrovatelnosti takového roztoku při sterilizaci přes antibakteriální filtr.

Polovodičový laserový diodový modul pro fotodynamickou terapii ML-62-62-SP vyrobený podle ZAO „MYLON“ (Saint Petersburg) a OOO „SIGM PLUS“ (Moskva) je použit při aktivaci PS „Kapalný extrakt chlorinů“. Tento modul má následující výchozí data (Certifikát ruského ministerstva zdravotnictví, Reg. č. 29/10-679-96):

-výkon 2,5 až 3 W v paprsku 200 mikronů s otvorem 0,22.

- vysoce intenzivní laserové diody společností „Polaroid“ (USA) a OOO „SIGM PLUS“ s maximální ozařovací vlnovou dálkou 662 ± 3 nm.

Moduly s nižším výkonem (s nižším počtem diod) s maximální ozařovací vlnovou délkou 662 ± 3 nm mohou být použity pro aktivaci PS látky, mohou být také použity pevné lasery s druhým harmonickým ytrium-hliníkovým krystalem YAG:Nd³⁺ s maximální ozařovací vlnovou délkou 670 nm.

Rozsah přijaté energie je od 30 do 3000 J. Při světelné dávce menší než 30J se PDT procedura stává značně dlouhá, protože skenování se může provádět jen na extrémně malé ploše aby se dosáhlo optimálního výsledku, při světelných dávkách vyšších než 3000 J a nejvíce se vyskytující velikosti nádoru v klinické praxi je pozorováno poškození zdravé tkáně a následné prodloužení regenerační periody.

Povrchová hustota přijímané energie se liší od 50 do 2500 J/cm². Při dávce nižší než 50 J/cm² není pozorován žádný účinek. Při dávce vyšší než 2500 J/cm² je pozorováno poškození zdravé tkáně a následné prodloužení regenerační periody.

Rozsah vlnových délek záření je spojen s technickou charakteristikou používaných laserů (662 ± 3 nm), posun preparačního absorpčního maxima závisí na polaritě média (654 až 662 nm) a obsahu purpurinu 5 v látce (5 až 20 %, polovina šířky dlouhovlnného absorpčního pásu při 663 až 670 nm)(tab. 1).

• · · • · · · ·

-19• · · · · ··· ··· ···· ·· ··· ·· *

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Popis fyzikálně chemických vlastností PS

PS představuje hustou černou hmotu, která získává zelený nádech v tenké vrstvě, se zápachem řas.

pro potvrzení autenticity PS vlastností „Kapalného extraktu chlorinů“ je 7,5% extrakt intenzívně míchán, část extraktu (1 mg) je rozpuštěna v 10 ml medicínském nebo nejčistším rektifíkovaném ethanolu, 95%, a optická hustota je měřena při 662 nm (D). Hodnota je 0,23. Molekulární extinkce e (M^cm'¹) je vypočítána podle vzorce e - D*597/(0,004). Výsledná hodnota by měla být v intervalu 33 300 až 35 100. Po substituci, é = 0,23*597/(0,004) = 34 328. Proto „Kapalný extrakt chlorinů“ obsahuje 7,5 % PS.

PS roztok v ethanolu má žlutozelenou barvu. Roztok získá rubínově-červenou barvu při průchodu paprsků s medicínské modré lampy MDS 220-75 (technické specifikace 16.535.37679) přes roztok v místě chráněném před světlem.

Pro kvantitativní stanovení „Kapalného extraktu chlorinů“ je tento intenzívně míchán, část extraktu (1 mg) je rozpuštěna v 10 ml medicínském nebo nejčistším rektifíkovaném ethanolu, 95%, a optická hustota je měřena při 662 nm (D). Hodnota je 2,15. Obsah PS je vypočítán podle vzorce c,% = (D*597*10*100)/(34230*5). Výsledná hodnota by měla odpovídat specifikované. Po dosazení, c,% = (2,15*597* 10* 100)/(34230*5) = 7, % (odpovídá specifikované).

Pro další analýzu je přidána do 100 mg „Kapalného extraktu chlorinů“ zředěná kyselina chlorovodíková, dokud se PS nevysráží. sraženina je zfiltrována, sušena ve vakuu přes oxid fosforečný po 12 hodin a PMR, hmotnostní spektrum a absorpční spektrum je změřeno ve vlnovém rozsahu 360 aiž 720 nm.

PS PMR spektrum (Obr. 6): (v DMSO-D6, koncentrovaný roztok): 9,64, 9,55, 9,52, 9,39, 8,90, 8,79 (s, meso-H chlorinu a purpurinu 5), 8,09, 8,04, 7,97, 7,92 (2d, CH=CH₂ chlorinu e₆ a purpurinu 5), 6,84 (s, γ-meso-CHO purpurinu 5), 6,37, 6,32, 6,13, 6,10 (2d, CH=CH₂), 5,43(2s, 7-meso-CH₂COOH), 4,60 (m, 7-H), 4,45 (m, 8-H), 3,80, 3,56 (qx2, 4-CH₂CH₃), 3,75, 3,64, 3,51, 3,46, 3,29, 3,23 (c, jaderný CH₃ chlorinu e₆ a purpurinu 5), 2,38, 2,32 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 2,71, 2,20 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 1,76 (d, 8-CH₃), 1,72 (t, 4-CH₂CH₃), -1,63, -1,91 (2s, 2NH) ppm.

PS hmotnostní spektrum (Obr. 7): tj., M⁺ (%), 596 (16,0), 566 (9,40), 508 (100,0), 494 (7,3), 447 (9,4), 435 (50,6), 421 (12,8), 405 (6,9), 254 (7,4).

PS viditelné absorpční spektrum λ (e) (ethanol), 386 (22 310), 406 (113 040), 506 (14 870), 536 (8 925), 608 (7 437), 662 (34 220).

Podle PMR spektra látka obsahuje 80 % chlorinu e6,15 % purpurinu 5 a 5 % purpurinu 18 (vedlejší signály na 9,25, 9,10, 8,71, 7,84, 3,55, 3,32, 3,04 ppm), což odpovídá patentované směsi. Podle hmotnostního spektra jsou obsažené píky molekulových iontů 596 chlorinu ee a 566 purpurinu 5. V absorpčním spektru je pás o 662 nm s absorpční hodnotou, která dobře odpovídá molekulární extinkci etalonu PS (34 230).

Proto studovaný vzorek je „Kapalný extrakt chlorinů“, 7,5%.

Příklad 2

Výroba PS jako „Kapalného extraktu chlorinů“, 6,5%.

Spirulina biomasa (2 kg) je zpracována s aceton (3x21) dokud se nevyextrahuje všechen chlorofyl, biomasa je filtrována, extrakt je zpracován s kyselinou chlorovodíkovou (30 ml), čímž se odstraní hořčík z molekuly chlorofylu, extrakt je neutralizován a vysrážený feofytin a (8 g) je zfiltrován, pak hydrolyzován ve směsi kyselina chlorovodíková-aceton-hexan, pro tento účel je feofytin a rozpuštěn ve směsi 50 ml acetonu, 5 ml hexanu a 40 ml kyseliny chlorovodíkové (37%), směs je zahřívána na 40 °C a míchána 1 hodinu, pak je přidán hexan (50 ml) a organická fáze je promyta směsi acetonu a kyseliny chlorovodíkové (2:1, 3x50 ml), vodná fáze je promyta hexanem (5x40 ml), vodná fáze obsahující feoforbid a je neutralizována přebytkem vodného roztoku citrátu sodného (tri-, di- nebo mono-substituovaného), vysrážený feoforbid a je zfiltrován, promyt vodou (3x50 ml), rekrystalizován ze směsi aceton-voda, sušen vzduchem do konstantní hmotnosti (výtěžek feoforbidu a je 4,2 g. 7,1 mM, 77%), pak je feoforbid a (2,7 g, 4,56 mM) rozpuštěn v acetonu (100 ml), je přidána silná anorganická báze ve formě vodného roztoku (0,05%, 25 ml), roztok míchán 60 °C po dobu 5 minut, přidán další objem silné anorganické báze ve formě vodného roztoku (20%, 25 ml), směs je zahřívána na 40 °C po dobu 90 minut, neutralizována zředěnou kyselinou chlorovodíkovou (2%, kolem 250 ml), sraženina chlorinu ee je odstraněna centrifugací, promyta destilovanou vodou(5x 10 ml) až zmizí kyselá reakce, je získáno 1,85 g (2,96 mM, 65%) chlorinu ee, ten je rekrystalizován z acetonu proto, aby se oddělily tetrapyrroly, chlorin Q(, je zfiltrován a promyt třikrát destilovanou vodou, zahříván v utěsněné nádobě při teplotě 40 °C po dobu 30 dnů, ochlazen a je přidán 1% roztok hydroxidu sodného, dokud pH není 7,5, výsledný PS obsahuje 15 % purpurinu 5, 80 % chlorinu e₆ a 5 % purpurinu 18 (chlorin pó), pak je roztok upraven destilovanou vodou za vzniku roztoku fotosenzitizéru o koncentraci 6,5 % hmotnostních, což je 14,2 g (50%) PS ve formě 6,5% „Kapalného extraktu chlorinů“.

« ·· ·· · ·» « ··· ♦ · ··· · ·· • · «·« «··· . · · · · · »» »···· . 91 - ·· ··· .·« ··· ···· ·· *·· «· *

Výsledné PMR spektrum „Kapalného extraktu chlorinů“ (Obr. 6): (v DMSO-D6, koncentrovaný roztok): 9,64, 9,55, 9,52, 9,39, 8,90, 8,79 (s, meso-H chlorinu e₆ a purpurinu 5), 8,09, 8,04, 7,97, 7,92 (2d, CH=CH₂ chlorinu ββ a purpurinu 5), 6,84 (s, γ-meso-CHO purpurinu 5), 6,37, 6,32, 6,13, 6,10 (2d, CH=CH₂), 5,43 (2s, 7-meso-CH₂COOH), 4,60 (m, 7-H), 4,45 (m, 8-H), 3,80, 3,56 (qx2, 4-CH₂CH₃), 3,75, 3,64, 3,51, 3,46, 3,29, 3,23 (c, jaderný CH3 chlorinu e^ a purpurinu 5), 2,38, 2,32 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 2,71, 2,20 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 1,76 (d, 8CH₃), 1,72 (t, 4-CH₂CH₃), -1,63, -1,91 (2s, 2NH) ppm.

Látka obsahuje 80 % chlorinu e6, 15 % purpurinu 5 a 5 % purpurinu 18 (chlorin Pó) (signály na 9,25, 9,10, 8,71, 7,84, 3,55, 3,32, 3,04 ppm).

Výsledné hmotnostní spektrum (Obr. 7): tj., M⁺ (%), 596 (16,0), 566 (9,40), 508 (100,0), 494 (7,3), 447 (9,4), 435 (50,6), 421 (12,8), 405 (6,9), 254 (7,4).

Viditelné absorpční spektrum (Obr. 8): λ (e) (ethanol), 386 (22 320), 406 (113 110), 506 (14 880), 536 (8 930), 608 (7 440), 662 (34 230).

Příklad 3

Výroba PS jako „Kapalného extraktu chlorinů“, 6,5%.

Spirulina biomasa (2 kg) je zpracována s aceton (3x21) dokud se nevyextrahuje všechen chlorofyl, biomasa je filtrována, extrakt je zpracován s kyselinou chlorovodíkovou (30 ml), čímž se odstraní hořčík z molekuly chlorofylu, extrakt je neutralizován a vysrážený feofytin a (8 g) je zfiltrován, pak hydrolyzován ve směsi kyselina chlorovodíková-aceton-hexan, pro tento účel je feofytin a rozpuštěn ve směsi 100 ml acetonu, 50 ml hexanu a 80 ml kyseliny chlorovodíkové (37%), směs je zahřívána na 60 °C a míchána 20 minut, pak je přidán hexan (100 ml) a organická fáze je promyta směsi acetonu a kyseliny chlorovodíkové (5:1, 3x50 ml), vodná fáze je promyta hexanem (5x40 ml), vodná fáze obsahující feoforbid a je neutralizována přebytkem vodného roztoku citrátu sodného (tri-, di- nebo mono-substituo váného), vysrážený feoforbid aje zfiltrován, promyt vodou (3x50 ml), rekrystalizován ze směsi aceton-voda, sušen vzduchem do konstantní hmotnosti (výtěžek je 3,8 g. 6,4 mM, 67%), pak je feoforbid a (2,7 g, 4,56 mM) rozpuštěn v acetonu (100 ml), je přidána silná anorganická báze ve formě vodného roztoku (1%, 25 ml), roztok míchán při 30 °C po dobu 30 minut, přidán další objem silné anorganické báze ve formě vodného roztoku (20%, 25 ml), směs je zahřívána na 60 °C po dobu 20 minut, neutralizována zředěnou kyselinou chlorovodíkovou (2%, kolem 250 ml), sraženina chlorinu eg je odstraněna centrifugací, promyta destilovanou vodou(5x 10 ml) až zmizí kyselá reakce, je získáno 1,67 g (2,67 mM, 55%) chlorinu ee, ten je rekrystalizován z acetonu proto, aby se oddělily tetrapyrroly, chlorin βό je zfiltrován a promyt třikrát destilovanou vodou, zahříván

-22• · · • ·· ·· *· · «· • · · · ♦ « · · · · • · · «· ?

v utěsněné nádobě při teplotě 100 °C po dobu 1 hodiny, ochlazen a je přidán 1% roztok hydroxidu draselného, dokud pH není 8,5, výsledný PS obsahuje 2 % purpurinu 5, 82 % chlorinu ee a 16 % purpurinu 18 (chlorin pó), pak je roztok upraven destilovanou vodou za vzniku roztoku fotosenzitizéru o koncentraci 7,5 % hmotnostních, což je 11,1 g (50%) PS ve formě 7,5% pasty.

Výsledné spektrum látky je podobné těm, jež se získaly v příkladu 2 a představují superpozici spekter chlorinu eó (obr. 9 až 11) a purpurinu 5 (obr. 12 až 14).

Příklad 4

Speciální případ výroby PS - výroba „Kapalného extraktu chlorinů“, 7,5%.

PS obsahující obsahuje 2 % purpurinu 5, 82 % chlorinu e₆ a 16 % purpurinu 18 (chlorin pó) ve formě 7,5% pasty popsané v předcházejícím příkladu je gelově filtrován na Sephadex G10 koloně o průměru 50 mm a výšce 100 mm za použití 1% roztoku hydroxidu draselného jako eluentu, dokud se dosáhne obsahu chlorinu ee 90 %, purpurinu 5 do 5 % a purpurinu 18 5 %. Pak je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové dokud je fotosenzitizér vysrážený, PS je upraven apyrogenní vodou pro injekční použití na koncentraci fotosenzitizéru 7,5 % hmotnostních, což dává 6,8g „Kapalného extraktu chlorinů“ 7,5%. Elektronové spektrum produktu viz obr. 8.

Příklad 5

Speciální případ výroby PS - výroba medicínské formy „Radachlorinu, 0,1% roztoku pro injekční podání“.

Po gelové filtraci je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové do roztoku PS popsaného v příkladu 4, dokud je PS vysrážený, sraženina je zfiltrována, je přidán koncentrovaný roztok hydroxidu sodného v apyrogenní vodě pro injekční podání, dokud pH není 7,5, PS je upraven apyrogenní vodou pro injekční použití na koncentraci fotosenzitizéru 0,1 % hmotnostních, a bakterie jsou zfiltrovány za použití antibakteriálního „Millipore“ mikroporézního filtru s 0,22 /tm póry. Výtěžek je 500 ml roztoku. Elektronové spektrum produktu viz. obr. 8.

Příklad 6

Speciální případ výroby PS - výroba medicínské formy „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podání“ („Photochlorin“).

Po gelové filtraci je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové do roztoku PS popsaného v příkladu 4, dokud je PS vysrážený, sraženina je zfiltrována, je přidán

-23koncentrovaný roztok hydroxidu draselného dokud není pH 7, pak je k roztoku přidán N-methyl-D-glukamin dokud není pH 8,5 pod kontrolou pH metru, PS je upraven apyrogenní vodou pro injekční použití na koncentraci fotosenzitizéru 0,5 % hmotnostních, a bakterie jsou zfiltrovány za použití antibakteriálního „Millipore“ mikroporézního filtru s 0,22 gm póry. Výtěžek je 100 ml roztoku. Elektronové spektrum produktu viz. obr. 8.

Příklad 7

Speciální případ výroby PS - výroba medicínské formy „Radachlorinu, 1% roztoku pro injekční podání“ („Photochlorin“).

Po gelové filtraci je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové do roztoku PS popsaného v příkladu 4, dokud je PS vysrážený, sraženina je zfiltrována, je přidán koncentrovaný roztok hydroxidu sodného dokud není pH 8,5, PS je upraven apyrogenní vodou pro injekční použití na koncentraci fotosenzitizéru 1,0 % hmotnostních, a bakterie jsou zfiltrovány za použití antibakteriálního „Millipore“ mikroporézního filtru s 0,22 gm póry. Výtěžek je 50 ml roztoku. Elektronové spektrum produktu viz. obr. 8.

Příklad 8

Speciální případ výroby PS - výroba medicínské formy „Radachlorinu, gelu“ („Photochlorin“).

Po gelové filtraci je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové do roztoku PS popsaného v příkladu 4, dokud je PS vysrážený, sraženina je centrifugována, je přidána apyrogenní vodou pro injekční použití na koncentraci fotosenzitizéru 6,5 % hmotnostních, a jsou provedené následující možnosti:

Varianta (a). 0,3g Pemulen TRI nebo Carbopol 2020 (BF Goodrich, UK) jsou přidáni do 75 ml vody a 5g dimethylsulfoxidu při teplotě místnosti a směs je míchána 15 minut až 8 hodin. Vodný alkalický roztok je přidán dokud není pH 5. Gel je resuspendován doplněním „Kapalného extraktu chlorinů“, 6,5% vodou za vzniku 0,05% koncentrace chlorinů e6 ve výsledném gelu, gel je vakuován 5 minut pod tlakem 10 až 50 mm Hg. Výtěžek je 100 g gelu.

Varianta (b). 5 g dimethylsulfoxidu a „Kapalný extrakt chlorinů“, 6,5% je přidán do 70 ml vody za vzniku 0,05% koncentrace chlorinů ve výsledném gelu, pak je přidáno 15 g Aculyn 33A (ISP, USA). Látka je míchána do homogenizace a je přidán vodný alkalický roztok dokud není pH 5. Gel je vakuován 5 minut pod tlakem 10 až 50 mm Hg. Výtěžek je 100 g gelu.

• · • 9 · · · ··♦· • · « · » · * * · ···*

- 74 - · · ··· · * ·

999999· ♦· · · · * · *

Po gelové filtraci je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové do roztoku PS popsaného v příkladu 4, dokud je PS vysrážený, sraženina je centrifugo vána, je přidána apyrogenní vodou pro injekční použití na koncentraci fotosenzitizéru 6,5 % hmotnostních, a jsou provedené následující možnosti:

Varianta (c). 0,7g Pemulen TRI nebo Carbopol 2020 (BF Goodrich, UK) jsou přidáni do 60 ml vody a 20g dimethylsulfoxidu při teplotě místnosti a směs je míchána 15 minut až 8 hodin. Vodný triethanolaminový roztok je přidán dokud není pH 8,5. Gel je resuspendován doplněním „Kapalného extraktu chlorinů“, 7,5% vodou za vzniku 1,0% koncentrace chlorinu e6 ve výsledném gelu, gel je vakuován 5 minut pod tlakem 10 až 50 mm Hg. Výtěžek je 100 g gelu.

Varianta (d). 20 g dimethylsulfoxidu a „Kapalný extrakt chlorinů“, 7,5% je přidán do 55 ml vody za vzniku 1,0% koncentrace chlorinu e₆ ve výsledném gelu, pak je přidáno 15 g Aculyn 33A (ISP, USA). Látka je míchána do homogenizace a je přidán vodný triethanolaminový roztok dokud není pH 8,5. Gel je vakuován 5 minut pod tlakem 10 až 50 mm Hg. Výtěžek je 100 g gelu.

Příklad 9

Speciální případ výroby PS - výroba medicínské formy „Radachlorinu, dimethylsulfoxidového roztoku pro vnější použití“.

Varianta (a). Po gelové filtraci v příkladu 4 je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové do roztoku dokud je PS vysrážený, sraženina je zfiltrována, je přidána apyrogenní vodou pro injekční použití na koncentraci fotosenzitizéru 7,5 % hmotnostních, a 14 g výsledného „Kapalného extraktu chlorinů“ je přidáno do 86 g dimethylsulfoxidu při teplotě místnosti za vzniku výsledného roztoku 1,0% chlorinu Gó, ten je míchán do homogenity. Výtěžek je 100 g roztoku.

Varianta (b). Po gelové filtraci v příkladu 4 je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové do roztoku dokud je PS vysrážený, sraženina je zfiltrována, je přidána apyrogenní vodou pro injekční použití na koncentraci fotosenzitizéru 7,5 % hmotnostních, a 0,8 g výsledného „Kapalného extraktu chlorinů“ je přidáno do 99,2 g dimethylsulfoxidu při teplotě místnosti za vzniku výsledného roztoku 0,05% chlorinu g^, a ten je míchán dokud je homogenní. Výtěžek je 100 g roztoku.

Příklad 10

Pro identifikaci purpurinu 5 je reakční směs z příkladu 2 gelově zfiltrována na koloně Sephadex G10 za použití 1% roztoku N-methyl-D-glukaminu jako eluentu za vzniku tří frakcí, první a druhá obsahují purpurin 5. Tyto frakce jsou neutralizovány, sraženina je zfiltrována, rozpuštěna ve směsi chloroform-methanol 1:1a esterifikována diazomethanem. Směs je promyta vodou, organická fáze je odstraněna, sušena přes bezvodý síran hořečnatý, koncentrována odpařením ve vakuu a chromatograficky čištěna na silikagelu Merck, Kieselgel, 0,04-0,063, poslední frakce(nejméně mobilní) je sebrána. Je-li to nutné, výsledný dimethylester purpurinu 5 (10,1% počítáno na suchou reakční hmotu po esterifikaci) je chromatograficky čištěn opakovaně.

PMR spektrum (Obr. 15): (DMSO-D6, koncentrovaný roztok): 9,64, 9,46, 8,82 (s, mesoH), 6,82 (s, γ-meso-CHO), 6,34, 6,31, 6,19, 6,16 (2d, -CH=CH₂), 4,54 (m, 7-H), 4,46 (m, 8-H), 3,61 (q, 4-CH₂CH₃), 4,20, 3,81, 3,57, 3,53, 3,47 (5s, -COOCH₃ a jaderný -CH₃), 2,38, 2,35 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 2,68, 1,85 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 1,73 (d, 8-CH3), 1,70 (t, 4-CH₂CH₃), ppm.

Hmotnostní spektrum (Obr. 16): tj., M⁺ (%), 594 (8,6), 566 (100), 505 (5,1), 491 (9,8), 475 (8,2), 463 (1,7), 447 (1,4), 433 (1,7), 262 (5,0).

Viditelné absorpční spektrum (Obr. 17): X(e) (ethanol), 408 (117 200), 501 (11 380), 542 (9 830), 617 (6 720), 668 (35 200).

Dimethylester purpurinu 5 je rozpuštěn v acetonu a je přidána koncentrované kyselina chlorovodíková (37%) v poměru 1:2. Směs je míchána 2 hodiny při 25 °C, neutralizována, purpurin 5 je zfiltrován, promyt vodou, rozpuštěn v 10% roztoku N-methyl-D-glukaminu a gelově zfiltrována na koloně Sephadex G10 za použití 1% roztoku N-methyl-D-glukaminu jako eluentu, druhá frakce je sebrána, neutralizována, sraženina je zfiltrována, promyta vodou, sušena přes oxid fosforečný do konstantní hmotnosti za vzniku purpurinu 5 (5,2 % v přepočtu na suchou reakční hmotu získanou po esterifikaci).

PMR spektrum (Obr. 12): (DMSO-D6, koncentrovaný roztok): 9,55, 9,39, 8,79 (s, mesoH), 8,09, 8,04, 7,97, 7,92 (2d, -CH=CH₂), 6,84 (s, γ-meso-CHO), 6,37, 6,33, 6,13, 6,10 (2d, -CH=CH₂), 4,60 (m, 7-H), 4,45 (m, 8-H), 3,55 (q, 4-CH₂CH₃), 3,75, 3,46, 3,23 (s, jaderný-CH₃), 2,38, 2,32 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 2,71, 2,20 (2m, 7-CH₂CH₂COOH), 1,76 (d, 8-CH3), 1,72 (t, 4-CH₂CH₃), ppm.

Hmotnostní spektrum (Obr. 13): tj., M⁺ (%), 566 (8,2), 494 (100,0), 447 (9,1), 435 (49,6),

421 (12,7), 405 (6,6), 254 (7,1).

Viditelné absorpční spektrum (Obr. 14): X(e) (ethanol), 408 (116 900), 501 (11 320), 540 (9 790), 615 (6 710), 665 (35 090).

Příklad 11 φφ

• φ • ♦ φ • φφφφ • ·· • Φ φ φ φ φ

-26- ϊ ♦* φφφ φφφφ

Studium farmakokinetiky a metabolismu medicínské formy „Kapalného extraktu chlorinů“ a „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podání“(„Photochlorin“).

769,2 mg/kg 0,65% „Kapalného extraktu chlorinů“ z příkladu 2 (50 mg/kg v přepočtu na bezvodé chloriny) bylo podáno intraperitoneálně myším linie Balb/c. Myši byly obětovány 3 hodiny po podání (každá skupina obsahovala 3 myši). Játra, ledviny, slezina, plíce, tenké střevo, nádor, okolní svalová tkáň, stejně jako krev, moč, výměšky z tlustého střeva (100 mg), vše bylo homogenizováno v skleněném homogenizátoru s přídavkem 4 ml roztoku solanky. Pro vyšetření biologických kapalin (krev, moč) bylo použito 0,1 ml každé tekutiny a přidáno k ní 4 ml roztoku solanky. Výsledný homogenát byl studován na „Perkin-Elmer spectrofluorimetru (MPF-44A model).

Studium medicínské formy „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podání“(„Photochlorin“) bylo provedeno podobně v homogenátu orgánů a tkání myší, kterým bylo podáno 50 mg/kg přípravku, myši byly obětovány 3 hodiny po podání.

V obou případech je vidět posun fluorescenčního maxima v tkáních jater, tenkého střeva, sleziny a ledvin na 670 nm (o 10 až 12 nm ve srovnání s 0,01M roztokem borátového pufru, pH 9,2, a 5 až 6 nm ve srovnání s roztokem 0,01M borátového pufru, pH 9,2, s 1% lidským sérovým albuminem), což indikuje metabolismus „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podání“(„Photochlorin“) (Obr. 5).

Ve fluorescenční spektru tento jev vypadá jinak než jednoduché rozšíření spektra a posun k delším vlnovým délkám kvůli účinku hydrofobity media (například po hydrofobních interakcích s proteiny, lipoproteiny). Posun maxima intenzity je pozorován bez neb s malým rozšířením pásu, což je typické pro tvorbu nové látky. Fluorescenční spektra purpurinu 5 v 0,01M borátovém pufru, pH 9,2, s 1% lidským sérovým albuminem jsou charakterizované přítomnosti pásu na 670 nm.

V krvi, plícní tkáni, stejně jako v kůži a nádoru je pozorováno rozšíření spektra 1,4 až 1,5 násobně při vlnové délce 669 nm, což indikuje přítomnost „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podání“(„Photochlorin“) (jeho komplex s proteiny) a metabolické směsi v homogenátu.

Jestliže je „Radachlorin, 0,5% roztok pro injekční podání“(„Photochlorin“) přidán přímo do zkumavek s homogenáty zvířecích tkání v koncentraci 0,5 až 1,0 μΜ, je v krvi, tenkém střevě, játrech a plících detekován metabolit „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podám“(„Photochlorin“) (posun do dlouhovlnné oblasti bez rozšíření spektra) a jenom v homogenátu kůže je malé, l,15krát zvýšení spektrální šířky, což indikuje přítomnost směsi metabolitů „Photochlorinu“ ve vzorku.

9

9 9

9999

9 •

• ·

-27♦ · · • 9999 ·9 9

Jestliže je koncentrace „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podání“(„Photochlorin“) v homogenátech orgánu zvýšena na 5 až 10 μΜ, je prakticky ve všech vzorcích nalezena přítomnost směsi chlorinu e6 a purpurinu 5 (posun do dlouhovlnné oblasti při 1,15 až 1,05 násobném zvýšení šířky spektra).

Je tedy možné považovat vznik metabolitů „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podání“(„Photochlorin“) po přidání do homogenátu závisí na koncentraci přípravku a účinku enzymů homogenizované tkáně.

Tyto pokusy jasně ukazují konversi chlorinu e6 na purpurin 5 v in vivo a ex vivo podmínkách. Tato konverse je podobná konversi chlorinu e6 na purpurin 5 při zahříváni.

Příklad 12

Rozdělovači koeficient mezi n-oktanol a fosfátový pufr, pH 7,4.

300 ml n-oktanolu a 300 ml fosfátového pufru, pH 7,4 bylo třepáno 20 sekund a centrifugováno 10 minut při 10 000 ot/min. 0,1 ml PS alikvotu s PS koncentraci 5 mg/ml bylo rozpuštěno v připraveném pufru (2 ml) a n-oktanolu (8 ml), absorpční maxima stanovená při 406 nm).

Byly získány hodnoty D°_c a D^ĎC, kde o je n-oktanol a b je fosfátový pufr, c je kontrola. Rovnováha rozdělení mezi n-oktanol a fosfátový pufr je dosažena třepáním 2 ml fosfátového pufru a 8 ml n-oktanolu s 0,1 ml PS po 20 sekund při 20 °C s následnou centrifugaci 10 minut při 10 000 ot/min. Optická hustota každé fáze je měřena při 406 nm a dává hodnoty Do a Db , kde oje n-oktanol a b je fosfátový pufr.

Cj je počítána podle rovnice:

Cd = (D° V° D°_c V°_c)/ (D^b V^b D^bc V^bc), kde V° je objem oktanolové fáze použity pro rovnovážné stanovení (8 ml), V°_c objem oktanolu nasycený vodou použity pro kontrolní stanovení alikvotní absorpce (8 ml), V* objem pufru použity pro rovnovážné stanovení (2 ml), N^bc objem pufru nasycený oktanolem použity pro kontrolní stanovení alikvotní absorpce (2 ml). Pokus byl proveden třikrát a získané výsledky Cd byly zprůměrovány.

Výsledná hodnota je 1,4 ± 0,3.

Příklad 13.

Stanovení in vitro fototoxicity (biologické aktivity) a cytotoxicity (buněčné toxicity) medicínské formy metabolitů „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podání“(„Photochlorin“).

-28• 9 9» · ·♦ * ·· ···· 9 · · « 9 · ♦ «999

99·· 999 · ···*

9 9 · 9 9 ·

9·99· ·· ··· ·♦ ·

Pro tuto práci byly použity laminámí box „Flow Lab“ (UK),C02 inkubátor „Flow Lab“ (UK), multisken „Bio-Tek Instruments“ (USA), media a séra „PanEco“ (Rusko).

Pro jeden pokus jsou buňky jedné linie přeneseny do misky se 48 komůrkami, jedny pro laserové ozařování, jedny pro“temný“ pokus. Další den je přípravek přidán a buňky na misce jsou termostatovány v černém papíře. Byla studována koncentrace přípravku 0,5, 2,0 a 5,0 μΜ. tři hodiny po podání přípravky byly buňky ozářené laserem, expoziční dávka 50 J/cm2, a za 39 hodin byl proveden MTT-test stejně jako inkubace s ¹⁴C-thymidinem pro stanovení DNA syntézy („temné“ misky byla také testovány). Ve všech případech je horní část misky použita pro MTT-test a spodní část pro měření DNA syntézy a počtu buněk po obarvení krystalovou violetí.

data presentována v tabulce 2 jsou průměrem 4 paralelních pokusů.

Příklad 14.

In vivo studie toxických vlastností medicínských forem „Kapalného extraktu chlorinů“ a „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podání“(„Photochlorin“).

Toxicita byla studována po intravenózním podání PS laboratorní bílé myši váhy 19 až 21 g (chované v Russian Academy of Medical Sciences, Krukovo). Zvířata byla držena pod standardními podmínkami ve viváriu a krmena podle nařízení ministerstva zdravotnictví SSSR zákon č. 1179 z 10. 10. 1983 „O povolení specifikací krmení pro laboratorní zvířata ve zdravotnických organizacích“. Toxicita je stanovená podle úmrtí zvířat jak letální dávka úhynu 50 % jedinců - LD50. Výpočet byl proveden podle statistických metod doporučených State Pharmacopoeia, edice XI (1,3). Na základě hodnoty LD50 je studovaná látka zařazena do odpovídající třídy toxicity podle Hodge a Stemer. Intoxikační reakce během experimentu jsou rovněž zaznamenané.

myši (6 samců a 6 samic) bylo použito pro každou testovanou dávku PS. Následující dávky byly použity pro stanovení PS LD50: 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 mg/kg. Roztok s koncentrací PS 5 mg/ml byl podán myším intravenózně, dávka závisela na podaném objemu roztoku PS.

Výsledná hodnota LD50 je 210,53 ± 22,2 mg/kg, LD10 je 169,87 mg/kg.

Příklad 15

In vivo biologická účinnost medicínské formy „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podání“ („Photochlorin“).

Fotodynamická aktivita „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podání“ („Photochlorin“) byla studována na myších linie Balb/c s T36 embryokarcinomem naočkovaným • ·· ·· · · • · • · • · ······· • ·' · • · • · • · · · ·· ··· • · · • ····

-29na sval zadní nohy. Myši vážily 20 až 21 g. Ozařovací procedura byla provedena pomocí diodového laseru ML-662-SP a to dva týdny po naočkování nádoru. Kůže v ozařované oblasti bylo oholena před procedurou.

Přípravek byl podán intraperitoneálně v dávce 40 mg/kg, což odpovídá dostatečné terapeutické dávce. Po provedení ozáření byly myši uspány etherem. Hmotnost nádoru v kontrolní a experimentální skupině v čase pokusu byla od 0,9 do 1 g. Ozáření bylo provedeno 5 až 6 hodin po podání PS. Každé zvíře, mimo kontrolu, bylo ozářeno jednou, pak bylo pozorováno měsíc o proceduře, plocha nekrózy nádoru a obecné fyziologické stavy byly zaznamenány.

Průměrná hustota expoziční dávky záření byla 150 až 300 J/cm²

Nejlepší výsledky ve formě celkové nekrózy nádoru, tvorby strupu v prvním týdnu po PDT a odloupnutí strupu za 1,5 měsíce po PDT byly pozorovány ve skupině, která obdržela dávku záření 300 J/cm².

Příklad 16

Léčení nádoru kůže basálních buněk za použití medicínské formy „Radachlorinu, 0,5% roztoku pro injekční podání“ („Photochlorin“).

Nádor kůže basálních buněk byl diagnozován pomocí cytologického vyšetření. Přípravek byl podán po kápkách intravenózně tak, aby byly podána dávka 0,7mg/kg pacientovy hmotnosti po zředění 100 ml 0,9% sterilního roztoku NaCl. Za 2 až 3 hodiny bylo provedeno ozáření nádoru pomocí diodového laseru ML-662-SP s vlnovou délkou 662 nm a dávkou 50 J/cm² bez anestézie, žádné nežádoucí nebyly registrovány během podání přípravku a laserového ozařování.Dvě hodiny po ozařování se vytvořilo temně hnědé ohnisko se zarudlým okrajem 1 až 2 cm v místě nádoru. Ke konci prvního dne se tvoří nekrózy v místě nádoru ve formě suchých hnědých krust (eschar). Za dva až tři týdny krusta odpadla a za další dva týdny se objevila celková epitelizace poškození kůže v místě nádoru s dobrým kosmetickým účinkem.

Příklad 17

Léčení nádoru kůže basálních buněk za použití medicínské formy „Radachlorinu, 0,05% gelu“.

Nádor kůže basálních buněk byl diagnozován pomocí cytologického vyšetření. Gel byl nanesen v tenké vrstvě na nádor, bylo-li to možné, zdravá kůže byla nedotčena.. Za 20 až 30 minut bylo provedeno ozáření nádoru pomocí diodového laseru ML-662-SP(„Mylon-Sigm Plus“,Rusko) s vlnovou délkou 662 nm. Hustota expoziční dávky činila 2500 J/cm². Dvě hodiny • · · po ozařování se vytvořilo temně hnědé ohnisko se zarudlým okrajem 1 až 2 cm v místě nádoru. Během prvního týdne se tvoří nekrózy v místě nádoru ve formě suchých hnědých krust (eschar). Za dva týdny krusta odpadla a za další dva týdny se objevila celková epitelizace poškození kůže v místě nádoru s dobrým kosmetickým účinkem.

Příklad 18

Odstranění tetování za použití medicínské formy „Radachlorinu, 0,5% roztoku v dimethylsulfoxidu pro vnější použití“.

Roztok byl aplikován na ubrousek a ten byl položen přes tetování, překryt černým papírem nebo tenkou hliníkovou folii a upevněn po dobu 30 minut. Přebytek roztoku byl odstraněn z povrchu pomocí vaty namočené v alkoholu. Procedura byla provedena pomocí diodového laseru ML-662-SP(„Mylon-Sigm Plus“,Rusko) s vlnovou délkou 662 nm., ozářeni bylo provedeno podél vzoru bez zasažení okolní tkáně. Hustota expoziční dávky činila 120 J/cm². Hodinu po ozařování kůže zrudla a v místě tetováni svědila. Na konci druhého dne se vytvořil temně hnědý obrázek se zarudlým okrajem 1 mm. Za dva týdny se vytvořila nekróza v místě tetování ve formě such tmavě hnědé krusty. O dva týdny později se odstranila krusta spolu s tetováním. . Při menší dávce světla postup je bez nekrózy , ale je v tomto případě nutné opakovat postup. Měkká růžová tkáň se tvoří v místě tetování za 6 týdnů jako výsledek PDT, tato tkáň se trochu liší od okolní kůže, je pozorován dobrý kosmetický účinek.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   44 4

   4 4

   1. Fotosenzitizér vyznačující se tím, že obsahuje chlorin ve formě soli alkalického kovu, který se skládá z chlorinů β6 (13-karboxy-17-[2-karboxyethyl]-15-karboxymethyl-17,18-/ra«5-dihydro-3-vinyl-8-ethyl-2,7,12,18-teramethylporfyrin) o obsahu 80 až 90 %, purpurinu 5 (13-karboxy-17-[2-karboxyethyl]-15-formyl-17,18-/ra«ó’-dihydro-3-vinyl-8-ethyl-2,7,12,18-teramethylporfyrin) o obsahu 5 až 20 % a purpurinu 18 - chlorinů p6 (13-karboxy-17-[2-karboxyethyl]-15-karboxy-17,18-/ra«s-dihydro-3 -vinyl-8-ethyl-2,7,12,18-teramethylporfyrin) do chybějícího zbytku, tak že uvedené složky tvoří směs.
2. 2. Fotosenzitizér podle nároku 1 vyznačující se tím, že sodík je použit jako alkalický kov.
3. 3. Fotosenzitizér podle nároku 1 vyznačující se tím, že draslík je použit jako alkalický kov.
4. 4. Způsob výroby fotosenzitizéru vyznačující se tím, že Spirulina biomasa je zpracována s acetonem dokud se nevyextrahuje všechen chlorofyl a, biomasa je filtrována nebo centrifugo vána, extrakt je zpracován s kyselinou, čímž se odstraní hořčík z molekuly chlorofylu a hydrolyzuje se fytylová esterová skupina a výsledný feoforbid a derivát reaguje se silnou anorganickou bázi, charakterizovaný tím, že po zpracování extraktu s kyselinou kvůli odstranění hořčíku z molekuly chlorofylu je extrakt neutralizován a vysrážený feofytin a je z filtrován, pak hydro lyžován ve směsi kyselina chlorovodíkováaceton-hexan, 6 až 16 ml acetonu, 0,6 až 6 ml hexanu a 5 až 10 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové je použito na 1 g surového feofytinu a, směs je zahřívána na 40 až 60 °C a míchána 20 minut až 1 hodinu, pak je přidán hexan (6 až 16 ml) a organická fáze je promyta směsi acetonu a kyseliny chlorovodíkové (2 až 10:1), vodná fáze je promyta hexanem, vodná fáze obsahující feoforbid o je neutralizována přebytkem vodného roztoku citrátu sodného (tri-, di-, mono-substituovaného), vysrážený feoforbid a je zfiltrován, promyt vodou, rekrystalizován ze směsi aceton-voda, sušen vzduchem do konstantní hmotnosti, pak rozpuštěn v acetonu, je přidána silná anorganická báze ve formě vodného roztoku o koncentraci 0,005 až 1,0 %, roztok míchán při 30 až 60 °C po dobu 5 až 30 minut, přidán další objem silné anorganické báze za vzniku vodného roztoku o koncentraci 1 až 50 %, směs je zahřívána při 40 až 60 °C po dobu 20 až 90 minut, neutralizována zředěnou kyselinou chlorovodíkovou, sraženina chlorinu e& je

   -33·· ·· • · ♦ · « · · • · · · • · · • *··· ·· • ·♦ t •« * · · • · · · · φφφ « φφφφ • φφφ φφφ φ > * odstraněna centrifugací, promyta destilovanou vodou až zmizí kyselá reakce, je získán 55 až 80% chlorin e6, ten je rekrystalizován z acetonu proto, aby se oddělily tetrapyrroly, chlorin e6 je zfíltrován a promyt destilovanou vodou, zahříván v utěsněné nádobě při teplotě 40 až 100 °C po dobu 1 hodiny až 30 dnů, ochlazen a je přidán silný roztok báze, dokud pH není v rozmezí 7,5 až 8,5, pak je roztok upraven apyrogenní vodou pro injekční použití za vzniku roztoku fotosenzitizéru o koncentraci 6,5 až 7,5 % hmotnostních.
5. 5. Způsob výroby fotosenzitizéru podle nároku 4 vyznačující se tím, že po kroku přidání silného roztoku báze, dokud pH není v rozmezí 7,5 až 8,5, je směs gelové filtrována za vzniku chlorinu e6 o obsahu 80 až 90 %, purpurinu 5 do 5 až 20 % a purinu 18 do zbytku, pak je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové dokud je fotosenzitizér vysrážený, roztok je upraven apyrogenní vodou pro injekční použití na koncentraci fotosenzitizéru 6,5 až 7,5 % hmotnostních, takže je získán „Kapalný extrakt chlorinů“.
6. 6. Způsob výroby fotosenzitizéru podle nároku 5 vyznačující se tím, že po kroku gelové filtrace je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové dokud je fotosenzitizér vysrážený, pak je sraženina odfiltrována nebo centrifugována, jsou přidané pomocné látky povolené RF State Pharmacopeia dokud pH je 7,5 až 8,5, je přidána apyrogenní voda pro injekční použití tak, že koncentrace fotosenzitizéru je 0,1 až 1 % hmotnostní, pak jsou odfiltrované baktérie.
7. 7. Způsob výroby fotosenzitizéru podle nároku 5 vyznačující se tím, že po kroku gelové filtrace je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové dokud je fotosenzitizér vysrážený, pak je sraženina odfiltrována nebo centrifugována, je přidána apyrogenní voda pro injekční použití tak, že koncentrace fotosenzitizéru je 6,5 až 7,5 % hmotnostní, „Kapalný extrakt chlorinů“ je dispergován vgelovém substrátu podle následujícího poměru: 0,5 až 12 % hmotnostních „Kapalný extrakt chlorinů“, 5 až 20 % hmotnostních dimethylsulfoxid, zbytek voda, pomocné látky schválené od RF State Pharmacopeia a gelový substrát.
8. 8. Způsob výroby fotosenzitizéru podle nároku 5 vyznačující se tím, že po kroku gelové filtrace je přidán zředěný roztok kyseliny chlorovodíkové dokud je fotosenzitizér vysrážený, pak je sraženina odfiltrována nebo centrifugována, je přidána apyrogenní voda pro injekční použití tak, že koncentrace fotosenzitizéru je 6,5 až 7,5 % hmotnostní, a výsledný „Kapalný extrakt chlorinů“ je rozpuštěn v dimethylsulfoxidu podle následujícího poměru: 0,5 až 12 % hmotnostních „Kapalný extrakt chlorinů“ a zbytek dimethylsulfoxid.