CZ25499A3

CZ25499A3 - Mražený cukrářský produkt

Info

Publication number: CZ25499A3
Application number: CZ99254A
Authority: CZ
Inventors: Donald Frank Darling; Richard Anthony Fenn; Peter John Lillford; Andrew John Mcarthur; Louise Jane Byass; Charlotte Juliette Doucet; David Needham; Christopher Sidebottom; Keith Smallwood; Margaret Felicia Smallwood
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-04
Publication date: 1999-07-14
Also published as: CN1084598C; WO1998004148A2; GB2315753A; NO990319D0; US6096867A; CA2261930A1; JP4175520B2; TR199900144T2; PA8434801A1; CN1231580A; ES2281106T3; EP0959689A2; IT1293770B1; BR9710589B1; AU719506B2; AU3621397A; CA2261930C; FR2751513A1; DE19732136A1; KR20000029561A

Description

(57) Anotace:

Rostlinné nemrznoucí proteiny mohou být začleněny do mražených cukrářských produktů pro jejich schopnost omezovat růst ledových krystalů. Mražené cukrářské produkty za\ hrnují jeden nebo více nemrznoucích polyco peptidů odvozených z prostlin, přičemž tyto nemrznoucí polypeptidy ve vodné směsi zajišťují číselný průměr velikosti ledových krystalů po rychlém zmrazení na - 40°C nebo méně, následovaném skladování po dobu 1 hodiny při teplotě -6°C, menší než 15 .mi.m.

254-99 ·'·· ·· ·· • · · » ’ • · · ♦ fefe·· fe ······ fefefe ··· • fefe fefe • fe fe fefe fefe * Mražený cukrářský produkt

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká mražených cukrářských produktů obsahujících AFP.

Dosavadní stav techniky

Nemrznoucí proteiny již byly popsány v literatuře, viz například Marilyn Griffith a K. Vanya Ewart v Biotechnology Advances, svazek 13, č. 3, strany 375 - 402,

1995. Nemrznoucí vlastnosti obecně naplňují jednu nebo více z následujících vlastností: termální hystereze, inhibice^ rekrystalizace ledu, řízení tvaru ledových krystalů a interakce s ledovými zárodky.

Termální hystereze je nejlépe známá vlastnost AFP, přičemž tato vlastnost je obvykle využívána pro testování přítomnosti AFP. Termální hystereze má za následek snižování zmrazovací teploty roztoku obsahující AFP s aktivní termální hysterezí, aniž by byla ovlivněna teplota tání. Identifikace zdrojů AFP prostřednictvím testů termální hystereze je široce popsána v literatuře, viz například John G. Dumán v Cryobilogy 30, 322-328 (1993).

Inhibice rekrystalizace ledu je další vlastností AFP.

, Tato vlastnost je rovněž nazývána jako potlačení růstu ledových krystalů. Tato vlastnost může být testována prostřednictvím porovnání v určitém časovém okamžiku velikosti ledových krystalů za přítomností AF a za nepřítomnosti AFP. Aplikace tohoto postupu při testování rybích AFP je popsána v US patentu č. 5,118,792 (DNA Plant

Technology Corporation).

• · · · 0 - V • 9 9 9 9 9 9 * · • · 0 0 000» 0 ·0* 000 * 0 0 0 0 0 ····· 9 9 9 9 9 9 9 * Třetí vlastností AFP je jejich schopnost ovlivnit tvar ledových krystalů. Tato vlastnost pramení ze selektivního vázání AFPk určitým stranám .ledového krystalu, čímž je zároveň omezován růst krystalů v určitých směrech.

' Přítomnost ledových krystalů majících hexagonální dvoujehlanový tvar je potom považována za příznak přítomnosti AFP. Tento způsob je například popsán pro testování aktivity AFP extracelulárního ozimého žita v patentové přihlášce WO 92/22581 (University of Waterloo).

θ Čtvrtou vlastností AFP je jejich schopnost zamezit aktivitě ledových zárodečných substancí. Tato interakce mezi AFP a ledovými'zárodky může mít například za následek zvýšenou termální hysterezi. Tato vlastnost je například testovány v patentové přihlášce WO 96/40973 (University of

Notre Dáme du Lac).

AFP byly navrženy pro zlepšení tolerance produktu k zmrazování.. V této souvislosti již bylo navrženo mnoho aplikací.

q Například byly AFP navrženy pro zlepšení konzervace biologických materiálů mrazením (patentová přihláška WO 91/12718-, Agouron Pharmaceuticals, patentová přihláška WO 91/10361, The Regents of University of California). AFP byly rovněž navrženy pro zamezení unikání lipozómů, například v kosmetických nebo farmaceutických prostředcích (viz patentová přihláška WO 96/20695). Dalším možným použitím je' zvýšení tolerance rostlin k zmrazování prostřednictvím začlenění AFP do těchto rostlin (nebo prostřednictvím transgenického vytvoření AFP v těchto rostlinách)⁷ (viz J. Cell, Biochem.

q Suppl., svazek 14e', 1990, strana 303 XP 002030248, Lee a kol, abstrakt R228). Rovněž byly navržený rybí. AFP pro použití v » «II» • φφφ* φ φ φ φ φ φ φ φφφ · ·· potravinářských produktech, například v mraženém jogurtu nebo smetanové zmrzlině, (patentový spis US č. 5,620,732, Pillsbury, a patentová přihláška WO 96/11586, HSC Research and Development Limited Partnership).

Až doposud ale nebylo použiti AFP aplikováno v komerčním měřítku. Přihlašovatelé vynálezu jsou toho názoru, že jedním z důvodů pro neexistencí komerčního využití je to, že, ačkoliv již bylo popsáno mnoho AFP, v praxi realizace ve vlastním komerčním produktu s sebou vždy nese značné problémy.

Přihlašovatelé vynálezu zjistili, že jedním z klíčových důvodů pro tyto problémy je to, že z tohoto velkého počtu AFP, které byly odsud popsány v literatuře, může být pouze omezená sada z AFP vhodně použita pro každou aplikaci. Přihlašovatelé vynálezu rovněž zjistili, že tento výběr vhodných AFP je závislý na požadovaném použití a/nebo vlastnostech produktu, kterých má být dosaženo.

Obvzláště žádoucím zdrojem AFP je rostlinný materiál. Rostlinné materiál mohou být relativně snadno získány v relativně velkých, množstvích a pro získání koncentrátu, obsahujícího AFP, může být využito relativně jednoduchých procedur izolace. Navíc lze předpokládat, že použití AFP z rostlinného materiálu je upřednostňováno spotřebiteli, kteří mají sklon preferovat přírodní rostlinné zdroje oproti, například rybím AFP.

Marilyn Griffith a K. Vanya Ewart v Biotechnology Advances, svazek 13, č. 3, strany 375-402, 1995 uvedly seznam 27 vyšších rostlinných druhů, u kterých je zjištěna aktivita • ·· I • 4 • 44*4

4 4

4 4 4

444 444 * 4 4 * 44 4 4 proti zmrazování. Tento článek rovněž navrhuje široký rozsah možných aplikací AFP.

Přihlašovatelé vynálezu zjistili, že, pokud je zvolena specifická aplikace pro použití rostlinných AFP, vzniká potřeba na vytvoření specifického testu pro výběr omezené skupiny AFP, které mohou být výhodně použity při této aplikaci.

Cílem předkládaného vynálezu je tedy zajistit ty rostlinné AFP, které mohou být výhodně použity v mražených cukrářských produktech.

Překvapivě bylo zjištěno, že bez ohledu na skutečnost, že velké množství rostlin obsahuje AFP, pouze omezená skupina rostlin obsahuje AFP, které jsou schopné

2.5 zajistit dobrou texturu mražených cukrářských produktů.

Překvapivě bylo rovněž zjištěno, že pro výběr těchto vhodných AFP může být použito relativně jednoduchého testovacího postupu.

Podstata vynálezu

Podle prvního aspektu se tedy předkládaný vynález týká mražených cukrářských produktů zahrnujících jeden nebo ' více AFP odvozených z rostlin, přičemž tyto AFP ve vodě mají velikost ledových krystalů po rychlém zmrazení na teplotu -40°C, následovaném skladováním po dobu 1 hodiny při teplotě -6’C (měřeno podle popisu uvedeného níže), menší než 15 pm.

Množství článků v literatuře již navrhlo, že AFP by mohly být potenciálně použity jako vhodné ovlivnění texturních vlastností mražených cukrářských produktů, jako je smetanová zmrzlina. Ovšem většina těchto dokumentů • 4 * 4 4 • · · ·

4 4 »·Μ • 4 4

4 4 •44 44« neposkytuje žádný návod.k tomu, jak tyto výhodné vlastnosti by bylo vlastně možné dosáhnout v praxi.

Další množství dokumentů popisuje použití rybích AFP.

Patentová přihláška WO 96/11586 popisuje aplikaci rybích nemrznoucích polypeptidů v mražených zakysaných potravinářských produktech. Tento dokument nepopisuje použití specifických AFP, odvozených z rostlin, v těchto produktech.

Patentová přihláška WO 96/39878 popisuje aplikaci AFP ve smetanové zmrzlině. Vhodné AFP pro tuto aplikaci mohou být odvozeny z krve a svalové tkáně antarktických ryb, arktických ryb, žížal a hmyzů. Opět zde není zmínka o tom, že by mohlo být použito rostlinných AFP.

Patentový spis US 4,118,792 popisuje v .příkladu 3B inhibici rekrystalizace prostřednictvím čištěného taveného proteinu A-Saf5 ve směsi mraženého krému. Tento dokument opět neposkytuje žádnou zmínku o použití AFP odvozených z rostlin.

Patentová přihláška WO 92/22581 popisuje množství polypeptidů odvozených z extracelulárních prostorů ozimého žita. Obecně je v tomto dokumentu popsáno několik možných aplikací těchto polypeptidů, přičemž mezi těmito aplikacemi je i smetanová zmrzlina. Ovšem není zde uvedena zmínka o tom, které z polypeptidů by měly být vybrány pro získání dobré kvality smetanové zmrzliny. Přihlašovatelé vynálezu zjistili, že pouze specifické proteiny z ozimého žita jsou vhodné pro použití ve smetanové zmrzlině (viz příklady).

Přihlašovatelé vynálezu zjistili, že velké- množství rostlin, které až doposud nebyly vyjmenovány jako takové, obsahuje značná množství AFP. Na druhou stranu byla ale také • · « 9 « ·· « · «

« zjištěno, že ne všechny rostliny, obsahující AFP, poskytují správný typ AFP pro výhodné ovlivnění textury mražených cukrářských produktů. Přihlašovatelé vynálezu si tedy kladou za cíl navrhnout nový výběr rostlinných zdrojů, který překvapivě zajistí na jedné straně dobré vlastnosti AFP a na druhé straně AFP schopné výhodně ovlivňovat texturní vlastnosti smetanové zmrzliny.

Zejména bylo zjištěno, že vhodné AFP mohou být vybrány prostřednictvím zředění směsi, zahrnující AFP, ve vodném roztoku, rychlým zmrazením této směsi na -40 °C nebo méně, následovaným skladováním po dobu 1 hodiny při- teplotě -6°C. Vhodné AFP mají za následek velikost krystalů po skladování po dobu. 1 hodiny za těchto podmínek menší než 15' pm, zvláště výhodně 5 až 14 pm, obzvláště výhodně 8 až 12 pm. Teplota rychlého zmrazování je výhodně -40 až -100°C, zvláště výhodně -80°C.

Detailní popis vhodného testu pro stanovení . těchto' vlastností je uveden v příkladu I.

Obecně tento test může být aplikován na jakoukoliv vhodnou směs zahrnující AFP a vodu. Obecně není množství AFP v těchto testovaných směsích nějak zvlášť kritické a může být. například od 0,0001 do 0,5 % hmotnostního, výhodně od 0,0005' do 0,1 % hmotnostního, zvláště výhodně od 0,001 do 0,05 % hmotnostního, například 0,01 % hmotnostního. Množství vody ve vodné směsí je výhodně 30 % hmotnostních nebo více, například 50 % hmotnostních až 99,9999 % hmotnostních.

Jakákoliv vhodná směs zahrnující AFP a vodu může být použita pro provedení tohoto testu. Pokud je to-žádoucí, mohou být.přítomné příměsi, například sacharóza nebo

4

444 444 • a · · «

4 pufrovací činidla. Obecně ale nebude nutné získat AFP v čištěné formě. Pro praktické aplikace by obvykle mělo postačovat připravení kapalného extraktu nebo šťávy z rostlinného materiálu, přičemž tento extrakt nebo šťáva potom mohou být testovány. Vho*dný způsob pro vytvoření vhodných kapalných směsí je uveden v příkladu II.

Obvykle byly rostliny, určené k testování na vhodné AFP, podrobeny chladu. Například mohou být testovány rostliny, které rostou v chladných klimatech, například antarktické rostliny. Alternativně mohou být rostliny sklízeny v průběhu zimního období, výhodně od prosince do března, zvláště výhodně od ledna do února, obzvláště výhodně v lednu (severní polokoule, nebo od června do září, zvláště výhodně od července do srpna, obzvláště výhodně v červenci (jižní polokoule).

Přihlašovatelé vynálezu podrobili velké množství· rostlin shora zmiňovanému testu. Výsledky jsou uvedeny v příkladech III a IV.

Výhodné zdroje AFP jsou odvozeny z Polystichum, mohriodes, Ranunculus biternatus, Nothofagus antartica, Cerastium fontánům, Colobanthus quitensis, Rumex acetosella, Salíx gragilis, Calluna vulgaris, Aceana magellanica, Pisum satívum, Acer saccheraroides, Oxalis, Geranium, Daucus carota (karotka) , Vinca minor (brčál), Vinca major, Polemonium, Buddleia, Forsythia, Sambucus nigra, Juncus squarrosus, Carex aquatilis, Agrostis tenuis, Deschampsia antartica, Festuca contracta, Festuca rubra, Parodiochloa flabellata, Phleum alpinum, Poa ann.ua (pýr plazivý), Poa pratensis (Kentucky blue grass), Rostkovia-magellanica, Bambosoideae, Chorisodontium aciphyllum, Drepanocladus uncinatus, • ft * · • ftft • ftftftft

I · ft ř ♦ ft ftftft «

Isothenícium myosuriodes, Polytrichum alpestre, Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris,

Hypogymnia physodes, Parmelía subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica,

Usnea subfloridana, Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis a Festuca contracta.

Přihlašovatelé jsou toho názoru, že na základě návodů uvedených v tomto popisu předkládaného vynálezu bude osoba, v oboru znalá schopna vybrat další AFP, které mohou být vhodně θ odvozeny z rostlin. Použití těchto AFP je rovněž zahrnuto do rozsahu předkládaného vynálezu.

V jednom provedení zejména výhodném pro aplikaci v potravinářských produktech jsou vybrány ty rostlinné AFP, které splňují shora definovaný test velikosti krystalů a 5 které jsou odvozeny z netoxíckých nebo málo toxických rostlin. V této souvislosti jsou obzvláště výhodné AFP odvozené z karotky, trav, bambusu a podobně.

Dalším výhodným výběrem ze shora uvedených zdrojů q jsou AFP odvozené z čeledi Lichen, zejména z Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia.lugubris,

Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica,

Usnea subfloridana. Tyto AFP vykazují obzvláště dobré vlastností v mražených cukrářských produktech,

Další AFP, které vykazují obzvláště dobrou aktivitu, jsou odvozené z Juncus squarrosus nebo z Geranium.

Pro některé aplikace jsou vybrány ty AFP, které udržují svojí schopnost omezovat růst ledových krystalů {jak θ bylo prokázáno shora zmiňovaným testem) dokonce i po tepelné

4 4 4 ·

44«»« 4

· • 44 4 4 4 4 úpravě nad teplotou 60 °C, zvláště výhodně od 80 do 105’C, v časové periodě alespoň 30 sekund, . zvláště výhodně, větší než 1 minuta, 10 minut nebo dokonce větší než 1 hodina. Vhodnými

I rostlinnými zdroji, které jsou tepelně stabilní jsou.

například Acer saccharoides, Bamboo, Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Hblcus lanatus, Bromus Sterilis, Psrodiochloa flabellata,

Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis a Agrostis tenuis, Festuca contracta a Poa annua.

Vedle rostlin zmiňovaných výše testovali přihlašovatelé vynálezu AFP ze Secale cereale (ozimé žito). Několik AFP z ozimého žita již bylo popsáno v patentové přihlášce,WO 92/22581. Přihlašovatelé vynálezu překvapivě zjistili, že bílkovina o molekulové hmotnosti 32000, odvozenáz ozimého žita, splňuje shora uváděný test velikosti krystalů, zatímco jiné bílkoviny'z ozimého žita tento test nesplňují (viz příklad IX). Pro účely předkládaného vynálezu tedy, pokud je použito AFP odvozených z ozimého žita, je

0’ aplikována výhodně bílkovina o molekulové hmotnosti 32000.

Další výhodné provedení předkládaného vynálezu se týká použití rostlinných AFP, které splňují shora zmiňovaný test a které nejsou odvozeny z ozimého žita, mražených cukrářských produktech.

Mražené produkty podle předkládaného vynálezu zahrnují alespoň jeden AFP, který může být odvozen z rostlinných zdrojů.

AFP mohou být’získány z rostlinných zdrojů jakýmkoliv shodným postupem, například izolačním postupem, jak je • · ♦ φ φ φφφφ • φφφφ φφφφ • · · φ φφφφ φ φφ* φφφ • φφφ φ φ • ·· · φφ φ φφ · φ popsáno ve shora zmiňovaných dokumentech. Alternativně mohou být AFP extrahovány z rostlin, například prostřednictvím vytvoření rostlinného extraktu z (částí) rostlinný, po kterém následuje případný krok koncentrace. Příklady vhodných 5 postupů pro získání uvedených extraktů jsou uvedeny v příkladech v popisu níže.

Rovněž mohou být geneticky modifikovány mikroorganismy nebo rostliny pro expresi AFP a tyto AFP potom mohou'být izolovány a použity podle předkládaného vynálezu.

Techniky genetické manipulace mohou být použity pro získání AFP majících alespoň 80%, zvláště výhodně větší než 95% a obzvláště výhodně 100% homologii s AFP přímo získanými z přírodních zdrojů, které přirozeně obsahují AFP. Pro účely předkládaného vynálezu jsou AFP mající tuto vysokou úroveň homologie rovněž zahrnuty pod termín AFP odvozené z rostlin. Pro účely předkládaného vynálezu termín AFP odvozené z rostlin výhodně nezahrnuje AFP, které se přirozeně vyskytují v nerostlinných zdrojích, například rybách, a které jsou transgenickými technikami vytvářeny prostřednictvím rostlin.

Technik genetické manipulace může být použito následovně: Vhodná hostitelská buňka nebo hostitelský organismus by byl transformován genovou konstrukcí, která obsahuje kódovou oblast pro požadovaný polypeptid.

Kódová nukleotidová sekvence pro tento polypeptid může být uložena do vhodného vektoru pro expresi. Tento vektor obsahuje nezbytné prvky pro transkripci a translaci, a tak, že dojde k expresi za vhodných podmínek (například při

44

4·4· * 4 4 · ·

444· 4 • 4 4

4 «

444

4 správné orientaci a správném čtecím rámci a s vhodnou sekvencí pro cílení a expresi).

Postupy požadované pro vytvoření těchto vektorů pro expresi jsou velmi dobře známé osobám v oboru znalým.

Množství různých systémů pro expresi může být využito pro expresi kódové sekvence pro polypeptid. Tyto systémy zahrnují, ale nejsou omezeny na, bakterie, kvasinky, systémy hmyzích buněk, živné systémy rostlinných buněk a rostliny, přičemž všechny tyto systémy jsou transformovány vhodnými vektory pro expresi.

AFP, které je možno získat ze shora zmiňovaných zdrojů, mohou být použity v jakémkoliv vhodném mraženém cukrářském produktu. Pro účely předkládaného vynálezu zahrnuje termín mražený cukrářský produkt mléko obsahující mražené cukrářské výrobky, jako je smetanová .zmrzlina, mražený jogurt, šerbet, ledové mléko a mražený pudink, ovocné zmrzliny, granity a mražené ovocné dřeně a podobně. Pro některé aplikace je použití AFP v mražených zakysaných potravinářských produktech méně výhodné.

Výhodně je množství AFP v mraženém cukrářském produktu od 0,0001 do 0,5 % hmotnostních, odvozeno z finálního produktu, zvláště výhodně od 0,0005 do 0,3 % hmotnostních, obzvláště výhodně od 0,001 do 0,2 % hmotnostních.

Výhodně je množství pevných látek v mraženém cukrářském produktu (například cukr, tuk, příchutě a podobně) větší než 2 % hmotnostní, zvláště výhodně od 4 do 70 % hmotnostních.

• *· fefe • » • · * • ··♦· • · • · · · * 4 9 9

494 494

Pokud je to žádoucí, mohou být mražené cukrářské produkty podle předkládaného vynálezu provzdušněny, například na zvětšení objemu od 50 do 500 %.

Způsob výroby mraženého cukrářského produktu podle předkládaného vynálezu může být vybrán z jakéhokoliv vhodného postupu pro výrobu. AFP mohou být obecně přidávány v různých fázích výroby, například mohou být přidávány do prvního premixu ingrediencí nebo mohou být později přidávány v průběhu pozdější fáze výrobního procesu. Pro některé aplikace je někdy výhodné přidávat AFP v relativně pozdní fázi výrobního procesu, například po (částečném) před zmrazení produktu.

Zmrazovací postup pro mražené cukrářské produkty může být zvolen z jakéhokoliv vhodného zmrazovacího procesu a může případně zahrnovat krok provzdušnění, například na zvětšení objemu od 50 do 300 %. Pro některé účely je výhodné, aby zmrazovací proces zahrnoval ztužovací krok za studená, například při teplotě -30° Fahrenheita (-34,4°C) nebo nižší.

Pro některé aplikace může být výhodné začlenit do mraženého cukrářského produktu směs dvou nebo více různých AFP. Jedním důvodem pro to může být, například, to, že rostlinný zdroj pro AFP, který má být použit, obsahuje více než jeden AFP a je mnohem výhodnější přidat tyto AFP, například proto, že jsou všechny přítomné v rostlinném extraktu, kterého má být použito. Alternativně může být někdy žádoucí přidat více než jeden AFP z různých zdrojů.

Předkládaný vynález bude nyní ilustrován prostřednictvím následujících příkladů. .

• 4 ♦ · • 4 · 4

444 444

444

Příklady provedení .vynálezu

Příklad I test pro určování velikosti částic ledových krystalů po rychlém ochlazení, následovaném skladováním pří teplotě -6°C po dobu 1 hodiny.

Výhodný postup je následující:

Ia: Byla měřena aktivita proti zmrazování s použitím modifikovaného plochého testu (Knight a kol, 1988). 2,5 pl roztoku, který je testován, v 30 % hmotnostních sachárózy bylo přeneseno na čisté, vhodně označené', kruhové krycí sklíčko o průměru 16 mm. Druhé krycí sklíčko bylo uloženo na vršek kapíčky roztoku a tato sestava byla stlačena dohromady mezi ukazováčkem a placem. Sestava sklíček byla ponořena do lázně hexanu, držené na teplotě -80°C v krabici se suchým ledem. Když byly připraveny všechny sestavy sklíček, byly tyto sestavy přeneseny z hexanové lázně s teplotou -80°C do pozorovací komory obsahující hexan držený na teplotě -6°C s použitím chemických kleští předem ochlazených v suchém ledu.. Po přenesení do prostředí s teplotou -6°C mohla být pozorována změna u sestav sklíček z průhledného na opakní vzhled. Byly zaznamenány obrazy prostřednictvím videokamery, které byly přeneseny do systému obrazové analýzy (LUCIA, Nikon), s použitím 20 násobného objektivu. Obrazy každé plošky byly zaznamenány v okamžiku t = 0. a opět po 60 minutách.

Alternativně (méně výhodně) mohou být vlastnosti měřeny následovně':

P p

',1b: Vzorek produktu, obsahujícího AFP, obsahující vodu je nastaven na úroveň sacharózy 30 % hmotnostních (Pokud «· • · φ φ * • «φφφ φ · » φ Φ Φ • · φ' φ φφφ · · φ • φ «φ ·· je počáteční množství sacharózy ve^vzorku větší než 30 % hmotnostních, je to provedeno zředěním, pokud je počáteční množství sacharózy ve vzorku menší než 30 % hmotnostních, je to provedeno přidáním sacharózy na požadovanou úroveň 30% hmotnostních.)

Kapička vzorku o velikosti 3 pL je položena na krycí sklíčko o průměru 22 mm. Potom je na vršek položeno krycí sklíčko o průměru 16 mm a na tento vzorek je položeno 200 gramové závaží pro zajištění jednotné tloušťky vzorku. Hrany krycího sklíčka jsou utěsněny bezbarvým lakem na nehty.

Sklíčko je uloženo na blok mikroskopu Linkham THM 600 s řízenou teplotou. Blok je potom rychle ochlazen (50°C za minutu) na teplotu -40°C pro vytvoření velké populace malých krystalů. Teplota bloku je potom rychle zvýšena (50°C za minutu) na -6°C a je udržována na této teplotě.

Ledová fáze je' sledována při teplotě -6°C s použitím mikroskopu Leica Aristoplan. Polarizované světelné podmínky ve spojení s lambda destičkou byly použity pro zvýšení kontrastu'ledových krystalů. Stav ledové fáze (velikost ledových krystalů) je zaznamenán prostřednictvím 35 mm mikrofotografíe při T=0 a T=1 hodina. Průměrná velikost částic (vizuální určení, číselný průměr) pod 15 pm přitom indikuje výhodné AFP pro použití v mražených cukrářských produktech.

Příklad II ' «

Způsoby získání směsí obsahujících AFP a vodu.

. A. Čerstvá tkáň rostlinných částí, například kořenů, stvolů, puků nebo listů, může být mleta tloukem a moždířem

A A A AAAA

A A A · AAAA

A A « «AA* A AAA AAA

A * A A ·

AA A ·« *· (ochlazeným na teplotu 4°C) ve stejném objemu pufru A (10 mM EDTA, 20 mM kyseliny askorbové, pufrovaném prostředkem Tris na pH 7,4) uloženém na ledu. Homogenní směsi jsou filtrovány skrz jednu nebo více vrstev mušelínu a skladovány na ledu před dalším použitím.

Tento postup může být obecně aplikován na většinu rostlin a zajišťuje čerstvou rostlinnou šťávu obsahující AFP. Obecně může být pro tento účel použita celá rostlina, ačkoliv z praktických důvodů mohou být někdy použity jenom části (například listy z dřevin, kořeny z kořenové zeleniny a stvoly z travních rostlin).

B. Způsob extrakce AFP ze zdrojů, které jsou schopné vydržet teplo, jako jsou trávy. Tento postup je ilustrován na .příkladu s použitím směsi trav. Ovšem mělo by být zcela zřejmé, že tento postup je stejně tak použitelný pro jiné tepelně stabilní druhy.

Smíchaná trávová tkáň (obsahující Poa trivialis, Lolíum perenne, Holcus lanatus a Bromus sterilis) byla posekána v lednu (průměrná teplota v tomto měsíci byla 3,5°C, což zajišťovalo vhodnou aklimatizaci rostlin na chlad). Trávová tkáň byla rychle převezena do laboratoře pro další zpracování a promyta vodou pro odstranění nečistot.

500 g trávových odřezků bylo vloženo do mikrovlně trouby o výkonu 650 Wattů a ohříváno při plném výkonu po dobu 5 minut, čímž byla teplota zvýšena na 85 až 100°C. Trávové odřezky byly potom ochlazeny na teplotu okolí.

Po tomto ohřívacím kroku byla z odřezků prostřednictvím filtrace oddělena šťáva bohatá na AFP. Hmota byla kontinuálně míchana po dobu 5 minut za přítomnosti φφ • Φ Φ •

♦ • φφφφ • Φ φ φ Φ φ φφφ* ** «φ φ · * « • · · φ • ·♦· φφφ • φ • Φ φφ stejného objemu vody a potom protlačována skrz 3 vrstvy mušelínu.

Přiklad III

Třídění různých rostlin. Neantarktické rostliny byly sklizeny v lednu (uprostřed zimy). Antarktické rostliny byly sklízeny v mírném jaru (únor až březen).,

Pokud není uvedeno jinak, byly pro přípravu šťávy, obsahující AFP, podle způsobu popsaného v příkladu Ila ‘použity kořeny.

Vzorky byly podrobeny testu podle příkladu Ia. Vhodné AFP pro aplikaci v mražených cukrářských produktech jsou

I označeny kladným znaménkem (+).

Přídavně byly měřeny vlastnosti termální hystereze šťáv následujícím způsobem: Termální hystereze vzorku produktu, obsahujícího AFP byla stanovena uložením roztaveného produktu na mikrosklíčko (Camlab Cambridge, délka dráhy 0,1 mm). Konce mikrosklíčka jsou utěsněny žlutou vazelínou. Do vzorku je přiveden led s použitím aerosolového zmrazovacího spreje.' Sklíčko potom bylo ponořeno v etanolem teplotně regulované lázni na teplotu -O,1°C. Po -5 minutovém vyvážení byl vzorek zkontrolován. Pokud se led zcela roztavil byla teplota lázně snižována v 0,l°C krocích následovaných vyvážením. Tyto kroky byly opakovány, dokud nebylo dosaženo teploty, při které ve vzorku existovalo malé množství ledových krystalů. Po vyvážení při této teplotě byla teplota lázně snižována v krocích 0,01°C za minutu. Teplota tuhnutí vzorku je zaznamenána jako teplota, při které.začíná šíření ledu od vyvážených krystalů. Potom je stanovena teplota tání « 0 • 0 • 0 ·

0 040

0« «0 4 • * « 0 * 0 0 0 «00 00« 0 0 ·· 00 vzorku prostřednictvím zvyšování teploty počínajíc od teploty tuhnutí v krocích 0,01°C za minutu, dokud se neroztaví všechny ledové krystaly. Tato teplota je teplotou tání vzorku. Termální hystereze vzorku je rozdíl mezi teplotou tání a teplotou tuhnutí. AFP se značným stupněm termální hystereze jsou označeny kladným znaménkem (+). Byly získány následující výsledky:

Název rostliny	Termální hystereze	Inhibice rekrystalizace (Př. I)
Equisitum hymenale	+	-
Picea glauca	+	-
Dicentra cucularia	+	-
Viola sp.	+	-
Brassica oleracea		-
Brassica rapa	+	-
Brassica napus	+	-
Daucus carota	+	+
Vinca minor	+
Solanum tuberosum	+	-
Poa annua	+	-
Poa pratensis	+	-
Secale cereale ·	+	*}
Petrošelinum crispum	+	-
Salvia officinales	+	-

*) Poznámka: aktivní ale pouze protein s molekulovou hmotností 29000 až 32000

4 4 4 4

44 44

44 a · 4

Tyto výsledky ukazují, že ačkoliv velké množství rostlin vykazuje vlastností termální hystereze, pouze malý podíl z nich splňuje test na rekrystalizaci.

Příklad IV

Třídění různých rostlin. Neantarktické rostliny byly sklízeny v lednu (uprostřed zimy). Antarktické rostliny byly sklízeny v mírném jaru (únor až březen).

Pokud není uvedeno jinak, byly pro přípravu šťávy, obsahující AFP, podle způsobu popsaného v příkladu Ha použity kořeny.

Vzorky byly podrobeny testu podle příkladu la. Vhodné AFP pro aplikaci v mražených cukrářských produktech jsou označeny kladným znaménkem (+).

Název rostliny	RI test
Water horsetail	-
Asplenium scolopendrium	-
Polystichum mohriodes	' +
Pinus sylvestris	-
Picea glauca	-
Cupress sp.	-
Laurus	-
Ranunculus biternatus	+
Dicentra	-
Planatus orientalis	-
Uřtica	-

• ·4 4« · »· ·« • · · · 0 0 · 0 4-9 * · 0040 4β«0 * · · · 0 090« 9 00« «94 • · 0 0 0 0 0

009 0900 «0 0 ·0 0«

Pterocarya fraxinifolia	-
Nothofagus antarctica	+
Nothofagus oblique	-
Betula pendula	-
Beta vulgaris	-
Cerastium fontánům	+
Colobantus quitensis (pearlwort)	+' ^řl
Rumex acetosella	+
Paeonia	-
Hypericum	-
Alcea	-
Viola	-
Populus alba	-
Salix alba Brltzensis	-
Salix daphnoides	-
Salix fragilis	+
Sorbus aria	-
Prassica napus	-
Erysimum	-
Caluna vulgaris	+
Primula	-
Hydrangea
Sédum	—
Acaena magellanica	+

*·· ♦ *·· • 9 · ··*« » · • · » *

• ··· • 9

99

Crategus monogyna	-
Cotoneaster spp x2	-
Fragaria x ananassa	-
Alchemilla	-
Cytisus	-
Pisum sativum
Vicia faba	-
Medicago sativa '	-
Daphne	-
Eukalyptus	-
Aucuba	-
Ilex	-
Acer saccharoides	+
Rhus	-
Oxalis	+
Geranium	+
Hedera	-
Daucus carota	+
Pastinaca sativa	-
Vinca	+
Polemonium	+
Rosmarinus
Buddleia	+
Forsythia	+
Fraxinus ornus	-

• · • 4 • · ••4···· • 4 · • · 4 • » · 4 • 4 44·· • · ·

4* « • · · 4 • · · ♦ • ··· 4·· • · • 4 ·Γ;

Lonicera pileata	-
Sambucus nigra	+
Lactuca satíva	-
Tragopodon porrifolius	-
Helianthus tuberosus
Juncus squarrosus	+
Carex aquatilis	+
Agrostis tenuis	+
Deschampsia antarctica	+
Festuca contracta	+
Festuca rubra
Parodichloa flabellata	+
Phleum alpinum	++
Poa annua	+
Poa pratensis	+
Rostkovia megallanica (grass)
Bambosoideae sp.	+
Muscari armenicum	-
Allium ampeloprasum cv Alaska	-
Allium cepa	-
Corisodontium aciphyllum	+
Drepanoclaudus uncinatus	+
Isothecium myosuroides í	+
Neckera^jcomplanata	-
Polystichum alpestre	4·

• φ · · « · · φ · · · « φ · · >»·*·· φφφ φφφ φ φ φ · φ · · ·«· «φφφ φφ φ φφ ··

Polytrichum commune	-
Polytrichum formosum	-
Racometríum lanuginosum	-
Sphagnum capillofolium	-
Sphagnum palustre	-
Alectoria nigricans	+
Caloplaca regalis	+
Himantormia lugubris	+
Hypogymnia physodes	+
Parmelia subrudecta	+
Ramalina farinaceae	+
Stereocaulon glabrum
Umbilicaria antarctica	+
Usnea subfloridana	+

Příklad V

Mixováním byl vytvořen premix pro výrobu smetanové zmrzliny:

Ingredience

Sušené odstředěné mléko 25

Sacharóza

Maltodextrin (MD40) % hmotnostní

11,39

3,41

0,072

Karubová guma Kukuřičný sirup 63DE

20,705

9

9 9 9

999 999

9 9 9 < 99 99

9 9 9 9 • 9 9 9 9

99999 9

Guarová guma	0,048
Genulakta L100	0,02
Máslo	9,015
Avicel RC581	0,24
želatina	0,14
Monoglycerid (paímitát)	0,45
vanilín	0,01
AFP (podle příkladu I*)	0,01 nebo žádný
	(kontrolní)
voda	zbytek do 100 %

* Poznámka - AFP je přidán jako koncentrovaný roztok s použitím určitého množství přidané vody jako ředícího prostředku; procentní množství označuje množství AFP.

Tato směs byla vhodně pasterizována při teplotě 85°C po dobu 15 sekund a uskladněna chlazená v nádobě.

2Q Tato směs mohla být použita při výrobě smetanové zmrzliny prostřednictvím šlehání běžným domácích mixérem na zvětšení objemu přibližně 100%, načež následovalo statické zmrazování v domácím zmrazovači.

Směs podle předkládaného vynálezu měla znatelně lepší texturu než kontrolní vzorek.

Podobné výsledky mohly být dosaženy s použitím následujících rostlinných zdrojů: Acer saccharoides, Bamboo,

Buddleia, Isothecium myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa trivialis, Lolium 30 perenne, Holcus lanatus, Bromus sterilis, Parodiochloa

4 flabellata, Deschampsia antartica, Cárex aquatilis, colobanthus quintensis a Agrostis tenuis, Festuca contracta, Poa annua.

Příklad VI

Mixováním byl vytvořen smetanové zmrzliny:

Ingredience sušené odstředěné mléko sacharóza maltodextrin (MD40) karubová guma mléčný tuk monoglycerid (palmitát) vanilín

AFP (podle příkladu II*) voda kapalný premix pro výrobu % hmotnostní

0,14

0,3

0,01

0,01 nebo žádný (kontrolní) zbytek do 100 % * Poznámka - AFP je přidán jako koncentrovaný roztok v určitém množství vody; procentní množství označuje množství AFP.

Ingredience byly smíchány při teplotě okolí, načež následovala pasterizace po dobu 60 sekund při teplotě 89°C.

Směs byla asepticky plněna do balení o obsahu 500 ml, utěsněna a skladována při teplotě okolí.

• · · • fe • · «

Tato směs mohla být použita při výrobě smetanové zmrzliny prostřednictvím šlehání běžným domácích mixérem na zvětšení objemu přibližně 70%, načež následovalo statické zmrazování v domácím zmrazovací. Po dvou měsíčním skladování měla směs pddle předkládaného vynálezu znatelně lepší texturu než kontrolní vzorek.

Příklad VII

-|_q Tento příklad popisuje izolaci a analýzu sekvence AFP z karotky. Podobné postupy mohou být použity pro AFP .z jiných rostlin.

Karotková kořenová' tkáň z karotek aklimatizovaných na chlad byla homogenizována v třech objemech pufru (20 mM kyselina askorbová, 10 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7,2) v předem ochlazeném tlouku a moždíři a filtrována skrz jednu vrstvu mušelínu. Filtrát byl odstřeďován při 6000 g, po dobu 10 minut při teplotě 4°C; část plovoucí na povrchu byla shromážděna a odstřeďována při lOOOOOg po dobu 1 hodiny při teplotě 4°C. Část plovoucí na povrchu po odstředění při 100000 g je označována jako rozpustná frakce, peleta je označována jako mikrosomální frakce.

Část plovoucí na povrchu byla položena na sloupec Q

Sepharose (Pharmacia} s obsahem 30 ml a s rychlým průtokem, který byl předem uveden do rovnovážného stavu v Tris/HCl, pH

7,4 s průtokovou rychlostí 5 ml/min, přiváděným čerpadlem HiLoad P-50, řízeným nízkotlakým chromatografickým systémem Gradifrac při teplotě 4°C. Eluát byl monitorován na optické hustotě OD 280 prostřednictvím UV monitoru (Monitor UV1,

Pharmacia) se záznamem na grafickém záznamovém přístroji (REC

102, Pharmacia), přičemž byly shromažďovány 5 ml frakce. Sloupec byl promyt 50 mM Tris/HCl, pH 7,4 se stejnou průtokovou rychlostí, doku. se optická hustota OD 280 nevrátila k nule. Pak byl přiveden 150 ml gradient 0 - 0,4 M

NaCl v Tris/HCl, pH 7,4, načež následovalo promytí sloupce s 2 M NaCl. Frakce eluátu byly podrobeny plochému testu, jako v příkladu I.

Frakce, obsahující aktivitu proti zmrazování, byly slity a koncentrovány s použitím polyethylenglykolu θ následujícím postupem: frakce byly přeneseny do trubice pro dialýzu, oddělující látky ód molekulové hmotnosti 10000, (Sigma), která, byla promyta vodou z vodovodu, vařena v 50 nM EDTA, pH 75, po dobu 10 minut a opláchnuta ve vodě milli Q. Trubice pro dialýzu, obsahující vzorek určený ke koncentraci, $ byla zakryta pevným polyetylenglykolem s molekulovou' hmotností 15000 až 20000 (Sigma) a inkubována při teplotě 4°C po dobu až 4 hodin nebo dokud se objem vzorku uvnitř trubice pro dialýzu nezmenšil až. 10 krát.

Slitý koncentrát ze sloupce Q sepharosy byl uložen ' buď do sloupce fenylsepharosy, sloupce pro filtraci na gelu

Smart Superdex 75, nebo do sloupce pro filtraci na gelu FPLC Superdex 75.

Nemrznoucí proteiny karotkových kořenů byly čištěny filtrací na gelu následujícím způsobem:

μΐ části vzorku byly uloženy do sloupce Smart

Superdex 75 (Pharmacia), předem uvedeného do rovnovážného stavu v 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, obsahujícím 0,15 M NaCl (pufr

Ε), s průtokovou rychlostí 40 μΙ/min, a komponenty byly separovány filtrací na gelu se stejnou průtokovou rychlostí «00 0 » · * 0 • 0 · 0«0 0 ve vyvažovacím pufru. Eluát byl monitorován na optické hustotě OD 280 a OD 215. 80 μΐ frakce byly shromažďovány mezi 0,85 a 0,89 ml, 40 μΐ frakce byly shromažďovány mezi 0,89 a 1,24 ml, a 100 μΐ frakce byly shromažďovány mezi 1,24 a 3,0 ml. Prázdný objem (Vo) sloupce byl 0,91 ml, jak bylo zjištěno prostřednictvím retenčního objemu roztoku Blue Dextran. Sloupec Superdex byl kalibrován aplikací 10 μΐ roztoku obsahujícího 5 mg/1 BSA (molekulová hmotnost 66000, retence (Ve)=1,02 ml), 3 mg/ml anhydrásy uhličité (molekulová hmotnost 29000, Ve=l,22 ml), 2mg/ml cytochromu C (molekulová * hmotnost 12400, Ve=l,41 ml)·, a· 2 mg/ml apronitinu (molekulové hmotnost 6500, Ve=l,59 ml), byla vynesena standardní křivka poměru Ve/Vo proti logaritmu molekulové hmotnosti. Frakce obsahující nemrznoucí aktivitu byly identifikovány plochým . testem podle příkladu I s vrcholem účinnosti, který naznačoval retenční objem 1,16 ml· a zdánlivou'molekulovou hmotnost 40000. Tato měření potvrdila, že pás s molekulovou hmotností 38000 z karotek, aklimatizovaných na chlad, byl nemrznoucí peptid.

Byl proveden SDS-PAGE podle Laemliho (1970) s použitím minisystému Biorad. Vzorky určené k analýze prostřednictvím SDS-PAGE byly rozpuštěny v pufru SDS-PAGE (Laemli 1970), ohřívány po dobu 5 minut pří teplotě 100^QC na horkovzdušném bloku (Techne) a odstřeďovány po dobu 3 minut při 10000 g při teplotě místnosti. Vzorky (10 až 50 μΐ) byly uloženy na minigely (Biorad, 0,75; 1,0 nebo 1,5 mm tloušťka, 10, 12, 15% akrylamid nebo gradient 10-20% akrylamidu (předem vylit- z Biorad)) a separovány elektroforézou. Oddělené polypeptidy byly fixovány a barveny v gelu buď modří Coomassie (0,1 % objemového briliantové modří coomassie ve

4 * · 4 4 44 • · 4 4 4 * · 4 * • 4 4 4 4 * · 4 · • * · · 4444 · »44 <44

4 · · ·

444 44 4 44 44 směsi kyselina octová/methanol/voda mílii Q (5:4:31 poměr objemový)), nebo stříbrnou barvou s použitím stříbrné barvy Biorad podle instrukcí výrobce. Gely byly sušeny mezi dvěma vrstvami celofánu Gelair. v sušícím zařízení pro gel

Biorad podle instrukcí výrobce. Látky pro označení vysoké anízké molekulové hmotnosti (Sigma) byly použity podle instrukcí výrobce pro určení zdánlivé molekulové hmotností na SDS-PAGE.

Byla provedena chromatografie na iontoměniči s kořeny θ karotky aklimatizované na chlad a s kořeny karotky neaklimatizované na chlad. Výsledně gely SDS-PAGE ukázaly přítomnost pásu o molekulové hmotnosti přibližně 38000 ve vzorku aklimatizovaném na chlad. Tento pás byl mnohem méně zjevný v kořenech karotky neaklimatizované na chlad. Tento' ' ' pás s molekulovou hmotností (přibližně) 38000 byl tudíž přiřazen k nemrznoucí aktivitě.

Pro analýzu sekvencí proteinů byl čištěn protein kořenu karotky o molekulové hmotnosti přibližně 38000 podle popisu v předcházejícím příkladu a potom, pro zajištění dalšího čištění vzorku určeného k analýze sekvence, byl vyříznut z gelu SDS-PAGE a potom byl proteolyticky štěpen na místě ve vrstvě polyakrylamidového gelu.

Vzorky relativně čistého proteinu s molekulovou 5 ' . hmotností přibližně 38000, které -ještě měly určité minoritní znečišťující proteiny, byly uloženy na 12% polyakrylamidový gel. Tři řady, každá s 2 pg proteinu, byly uloženy a podrobeny elektroforéze v gelu, dokud čelo barviva nedosáhlo dna gelu.* Gel-byl potom obarven v 0,2%’briliantové modři q coomassie (v procentech.objemových), 30% methanolu, 11% kyselině octové po dobu 20 minut a potom odbarven 30% methanolem, až mohly být vizualizovány proteinové pásy. Pás s molekulovou hmotností 38000 byl identifikován prostřednictvím porovnání s látkami pro označení molekulové hmotnosti, které byly uloženy do sousedních řad a pás z každé řady byl vyříznut skalpelem tak, aby se vyloučily znečišťující pásy.

Vrstvy gelu byly přeneseny do čisté trubice Eppendorf a dvakrát promyty 0,5 ml 50% acetonitrilu (v procentech objemových), 10 mM Tris/CL, pH 8,5. Promytí odstranilo určitou část zbarvení modři coomassie a rovněž částečně dehydratovalo vrstvy gelu. Vrstvy gelu byly potom vyjmuty z trubice a byly podrobeny sušení na vzduchu na laboratorní polici, dokud se podstatně nesrazily a nezačaly se vlnit.

Potom byly přeneseny zpět do trubice Eppendorf a rehydratovány nejprve s 10 pl 100 mM Tris/Cl·, ph 8,5, obsahujícího 1 pg endoproteinázy Lys C (Boehringer Mannheim). To je proteináza, která specificky štěpí polypeptidové řetězce na karboxyterminální straně lysinových zbytků. Dále byl ke gelovým vrstvám přidáván Tris pufr, dokud plně nerehydratovaly, a potom byly inkubovány při teplotě 37“C po dobu 16 hodin.

Po inkubaci byl do trubice přidán 1 pl kyseliny trifluoroctové pro zastavení reakce a potom byly vrstvy gelu dvakrát promyty s 0,3 ml 60% Acetonitrilu (v procentech objemových), 0,1% TFA (v procentech objemových) při teplotě 30°C po dobu 30 minut. To opět částečně dehydratovalo vrstvy gelu a způsobilo to, že vrstvy gelu se srazily a vytvořil se . eluát peptidů, které byly generovány. Část plující na povrchu byla přenesena do další čisté trubice Eppendorf a potom sušena v odstředivém odpařovacím přístroji po dobu 2 hodin, ·« · » · * · · · · · φ · · » · · · · · • « · ♦··· · ··· ··· « · * * • ·» · ·♦ · · dokud vzorek nebyl téměř zcela vysušen, a opětovně suspendována na objem 0,1 ml s 0,1% TFA.

Potom byly separovány peptidy prostřednictvím HPLC v reverzní fázi na mikročistícím systému Smart (Pharmacia).

Rozštěpený peptid byl vložen na sloupce C18 (21 x 100 mm), uvedený do rovnovážného stavu v’0,1% TFA (Rozpouštědlo A) při rychlosti průtoku 0,1 ml/min. Sloupec byl potom vymýván s .gradientem 0 - 70% Rozpouštědla B (90% acetonitril (procenta objemová), 0,085% TFA (procenta objemová}) po dobu 70 minut ¹⁰ se stejnou průtokovou rychlostí. Byla monitorována optická hustota při 214 nm á byly shromažďovány jédnotTivé peptidové vrcholy Ve sběrači frakcí pro manuální stupňovité uspořádání. Byla provedena analýza sekvencí polypeptidů prostřednictvím vložení na automatický analyzátor bílkovin Perkin Elmer model ‘

492, s použitím chemických cyklu kapalné fáze, jak je doporučeno výrobcem.

Bylo analyzováno několik polypeptidových fragmentů (A až E) v pásu o molekulové hmotnosti 38000, které měly sekvence v podstatě homologní k:

' (A) LEU-PRO-ASN-LEU-PHE-GLY-LYS (B) ILE-PRO-GLU-GLU-ILE-SER-ALA-LEU-LYS (C) LEU-THR-X-LEU-ASP-LEU-SER-PHE-ASN-LYS • (D) SER-LEU-ARG-LEU-SER-SER-THR-SER-LEU-SER-GLYPRO-.VAL-PRO-LEU-PHE-PHÉ-PRP-GLN-LEU-X-LYS (E)' X-X-GLU-VAL-ILE-PRO-X-GLN-LEU-SER-THR-LEUPRO-ASN-LEU-LYS

Buněčné kultury pro vytváření nemrznoucích proteinů byly vyrobeny následovně:

φ φ « « · · · • · ···· • φ · ·· · φ · · • · · • · « • · « «

Byly inicializovány nové buněčné kultury na základě postupů popsaných v Gamborg and Wetter 1975, Torres 1989. Dodds a Roberts 1985.

r*

Karotka aklimatizovaná na chlad (Autumn King): povrch uskladněných kořenů byl sterilizován nejprve omytím 10% detergentem Teepol, načež následovalo drhnutí pod tekoucí vodou a potom oplachování pod tekoucí vodou po dobu 15 minut. Pokud to bylo praktické (na základě velikosti), byly kořeny oloupány. Kořeny potom byly asepticky řezána na 0,5 cm plátky, které byly vloženy do 70% (objemových) ethanolu po dobu 10 minut za protřepávání, načež následovalo^uložení do 10% (objemových) Domestosu + 2 kapky Tween 20 (Sigma) na dobu 25 minut rovněž s protřepáváním. Plátky byly potom třikrát opláchnuty sterilní destilovanou vodou. Válečky o průměru přibližně 0,5 cm byly vyříznuty skrz plátky s použitím sterilního skalpelu, a zbytek byl řezán na 2 až 3 mm délky.' Tyto kotouče tkáně (explanty) byly asepticky přeneseny na tuhé médium MS, obsahující 30 g/1 sacharózy, 10 mg/1 kyseliny indoloctové (IAA), 0,1 mg/1 kinetinu a 8 g/1 technického agaru, které bylo obsaženo v 60 ml kontejnerech Sterilin, Explanty byly inkubovány v temnu při teplotě 20°C.

Bylo-li to nezbytné, byly výsledné kalusy rozděleny na menší úseky, které byly uloženy na čerstvé médium. Z aktivně rostoucího kalusu byly potom iniciovány suspenzní kultury.

Přídavně byly získány řady (NOR a 0X6) karotkových buněčných suspenzníčh kultur od Department of Biochemistry and Molekular Biology, University of Leeds. 10 ml těchto kultur bylo každých sedm dnů vloženo do 90 ml čerstvého média Murashige and Skoog (Sigma), obsahujícího 25 g/1 sacharózy a « i

4 4

4 444 4 4 mg/1 2,4-D. Kultury byly inkubovány v inkubátoru s orbitálním protřepáváním s rychlostí 150 otáček za minutu při teplotě 25°c v temnu.

Kultura NOR byla upravena za studená následujícím způsobem:

x 5 ml 7 dnů staré kultury NOR bylo přidáno do 18 x 100 ml baněk Erlenmeyer, obsahujících 45 ml karotkového . média MS. Kultury byly inkubovány při teplotě 25°C, jak bylo popsáno v předcházejícím popisu, po dobu 4 dnů, přičemž potom byla teplota inkubátoru snížena na.4^ůC, Dvě baňky byly vyjmuty okamžitě a byly sebrány buňky a médium, jak bylo popsáno v předcházejícím popisu, jako okamžik t = 0.

Zbývající baňky byly vybrány vždy po dvou v okamžicích t = 8 hod, 1 den (d), 2 d, 4 d, 7 d, 9 d, 11 d a 14 d.

Úprava aklimatizací na chlad byla opakována s použitím rozsáhlejších kultur jak NOR tak i 0X6, které byly přeneseny do teploty 4°C po 4 denním a 7 denním růstu při teplotě 25°C. Kultury byly sebrány v okamžicích t = 0, t=7dat=14d. V každém časovém okamžiku bylo vedle sebrání kultury stanoveno také PCV pro každou kulturu.

Buňky kultury NOR, aklimatizované na chlad, byly připraveny pro plochou analýzu, jak bylo popsáno v příkladu I, následujícím způsobem. Rychle zmrazené buňky byly mlety na jemný prášek v kapalném dusíku s použitím tlouku a moždíře. Práškové vzorky byly opětovně suspendovány ve dvojnásobném objemu 10 mM EDTA + 20 mM kyseliny askorbové, vířením míchány po dobu 30 sekund a potom odstředěny při 10000 g po dobu 10 minut. 10 μΐ vzorky částí plovoucích na povrchu byly podrobeny plochému testu s použitím kontrolního pufru, jako φφφΦΦΦ4 · 1 * ·ι φ φ φ φφφ· ··' φφ' > Φ Φ φ ► Φ Φ Φ • ΦΦ φφφ • Φ φ φ Φ· negativního kontrolního vzorku. RI-aktivita mohla být zjištěna v buňkách a médiu, které byly aklimatizovány na chlad, ale ne ve vzorcích, které nebyly aklimatizované na chlad.

Vzorky médií ze suspenze NOR byly analyzovány následujícím způsobem. Karotkové médium NOR bylo pufrováno přidáním 100 μΐ 1M Tris/HCl, pH 7,4. Celek byl potom vložen do 1 ml sloupce Q Sefarózy (Pharmacia) s rychlostí průtoku 1 ml/min a vázané molekuly byly propláchnuty s 3 ml částmi 50 mM Tris/HCl, pH 7,4, obsahujícími koncentrace 0,5 M NaCl. Byly shromažďovány 1 ml frakce/' ' * '

I

Tento způsob aniontové výměny byl rovněž použit pro frakcionaci vzorků v okamžicích t = 0, 2d, 4d, 7d, lid, aklimatizovaných na chlad, a t = 7d, neaklimatizovaných na chlad. Frakce byly testováný na aktivitu plochým testem, jak byl popsán v příkladu I.

Aktivita proti zmrazování v médiu kultury byla zjišťována prostřednictvím filtrace na gelu, následujícím způsobem. 14 denní eluát 0,5 mM NaCl, aklimatizovaný nachlaď, ze sloupce Q Sepharózy (frakce 2), jak bylo popsáno výše, byl vysrážen acetonem a peleta byla opětovně ί

suspendována v 50 μΐ 50 mM Tris/HCl + 0,15 M NaCl, pH 7,2.

μΐ frakce byly shromažďovány a podrobeny plochému testu. Tento postup byl opakován s použitím eluátu 0,5 m NaCl z okamžiku t = 14 d, neaklimatizovaného na chlad, ze sloupce Q Sepharózy a čerstvého média.

Další izolace aktivních proteinů může.být provedena analýzou SDS'PAGE, jak je popsáno výše.

• « • A ·

A AAAA

AA A A · • · ·

Á AA#

A A AAA

AAAAAAA .· A « * A Á A

Ai A A A

AAA AAA A A • A A·

Příklad VIII

Byl připraven extrakt z karotkových kořenů, aklimatizovaných na chlad, prostřednictvím oškrábání čerstvě vytažených karotek, aklimatizovaných na chlad, ve studené vodě. Byly odstraněny vršky a byla extrahována šťáva s použitím domácího odšťavovače (Russell Hobbs, mode č. 9915). Štáva byla zmrazená,do 1 litrových bloků a uskladněna při teplotě -20 °C před shromážděním před použitím v testech se zmrzlinou.

Karotková šťáva, obsahující AFP, byla přidána do následující směsi pro zmrzlinu:

Ingredience sušené odstředěné mléko sacharóza

MD40 karubová guma

Genulakta L100

MGP mléčný tuk vanilín voda

Karotkový extrakt (z karotky, aklimatizované na chlad, obsahující 1 až 10 mg AFP na .0 /

Zmrazením shora uvedené zvětšení objemu byla připravena díly hmotnostní ¹³ +

0,144

0,016

0,3

0,012

64,528

4,472 kg) směsi a provzdušněním’ na 106% smetanová zmrzlina.

9 99 |« · 9 9*99

999 9 99 9

9 99999 9 .9 99 *99

9 9 9 9

99 99

Byla provedena měření na čerstvém vzorku a na vzorcích, které byly skladovány při teplotě -10°C po časovou periodu 10 dnů.

Jako kontrolní vzorek byl stejným způsobem testován 5 vzorek bez karotkového extraktu. Měření byla provedena následujícím způsobem;

Vzorky byly vyváženy při teplotě -18°C ve skříni Prolan s řízeným prostředím po dobu přibližně 12 hodin. Tři vzorky byly zvoleny jako reprezentativní z každé dávky smetanové zmrzliny a z každého bylo připraveno mikroskopické sklíčko-ve skříni s řízenou kryostatickou teplotou rozetřením tenké vrstvy smetanové zmrzliny ze středu každého bloku na mikroskopické sklíčko. Jedna kapka technického benzínu byla nanesena na sklíčko a pak bylo aplikováno krycí sklíčko.

Každé sklíčko bylo dále přeneseno do mikroskopického bloku s řízenou teplotou (Leit, Laborlux Ξ, Leica 10-násobný objektiv, při teplotě -18°C), Byly shromážděny obrazy ledových krystalů (kolem 400 ledových monokrystalů).a přenášeny prostřednictvím video kamery (Sanyo CCD) do systému pro uchovávání a analýzu, obrazů (Leica Q520MC).

Uložené obrazy ledových krystalů byly ručně vyznačeny prostřednictvím obtažení obvodu, což potom vyznačilo· celý krystal. Obrazy vyznačených krystalů byly potom měřeny s použitím softwarového vybavení pro obrazovou analýzu, které vypočítalo počet obrazových bodů nutných pro dokončení nejdelší přímky (délka), nejkratší přímky (šířka), a stranového poměru (délka/šířce). Data pro každý ledový monokrystal dávky smetanové zmrzliny byla importována do tabulkového procesoru, kde byla provedena analýza datového souboru pro nalezení střední a směrodatné odchylky.

» tlil ftftft ···· • « ftftftft ft ftftft • ftftftft ftftftft · ftftft· ftftft • ft ft ftft . · ft ftftftft··· ftft · ftft

Byla provedena měřeni tvrdosti smetanové zmrzliny s použitím přístroje Hounsfíeld HlOKM Universal Tester, Hounsfield 100N Load Cell a 10 cm válcové sondy z nerezové oseli. Vzorky smetanové zmrzliny byly připraveny prostřednictvím inkubace po dobu 16 hodin 486 ml bloků smetanové zmrzliny ve skříni Prolan s řízenou teplotou, nastavenou na teplotu -18°C.

Ze skříně Prolan s řízenou teplotou byl vyjmut blok smetanové zmrzliny a tento blok byl vložen do přístroje ⁰ Hounsfield HlOKM Universal Tester. 10 cm válcová sonda byla vtlačována do bloku smetanové zmrzliny s konstantní' rychlostí 400 mm/min do hloubky 20 mm. Maximální síla zaznamenaná v průběhu stlačováni byla použita a označena jako tvrdost smetanové zmrzliny. Pokud byla vysledována lomivost nebo křehkost vzorku, byla tato skutečnost vyznačena v pravém sloupci tabulky níže.

Byly získány následující výsledky:

	Parametry velikosti krystalů	Vlastnosti materiálu
Vzorek	střední	střední	střední	střední	tvrdost	křehkost
	délka	šířka	tvarový	stranový	/ N	n
	krystalu	krystalu	faktor	poměr
	/ pm	/ pm	krystalu	krystalu
			/ -	/ -
čerstvý s	26,79 ±	19,00 ±	1,15 +	1,43 ±	40,8	ano
karotk.AFP	1,3	0,9	0,013	0,024
uleželý s	33,48 ±	24,61 +	1,13 +	1,37 ±	59,9	ano
karotk.AFP	1,3	0,9	0,013	0,020

37’ * 4 • 444· ·· · 44 44

4 4 4 4 « • 4 4 4 4 4 4

44444 4 444 >44

4« 44 • 4 4 44 44

čerstvý kontorlní	33,67 1,1	+	24,79 ± 0,8	1,12 ± 0,008	1,38 ± 0,018	27,3	ne
odleželý	61,77	±	46,54 ±	1,11 ±	1,37 +	32,7	ne
kontrolní	2,7		2,0	0,010	0,020

Mohou být vyvozeny následující závěry:

a) počáteční velikost ledových krystalů je menší ve smetanovézmrzlině obsahující karotkový AFP, tudíž AFP inhibuje rekrystali.zaci.

b) Ledové krystaly ve smetanové zmrzlině obsahující AFP jsou retardovány v jejich rekrystalizačních procesech.

c) ' Tvary ledových krystalů ve smetanových zmrzlinách . obsahujících AFP- nejsou podstatně odlišné od tvarů krystalů, které se vyskytuji u běžných smetanových zmrzlin.

d) Materiálové vlastnosti smetanové zmrzliny obsahující karotkový AFP jsou modifikovány od materiálových vlastností pozorovaných u běžné smetanové zmrzliny. Zejména bylo zjištěno, že smetanové zmrzliny obsahující karotkový AFP jsou tvrdší než běžné smetanové zmrzliny, ale stále ještě měkčí než smetanové zmrzliny obsahující, například, rybí AFP. Za druhé byla smetanová zmrzlina obsahující karotkový AFP shledána lomivou.

Podobně velmi dobré výsledky mohou být získány s použitím Gerania nebo Juncus squarrosus.

φφ φφ φ · φ φ · φφφφ φ φφφφφ φφφφ __Λ φ φφφ φφφφ·'· φφφ φφφ φφφ·· · · φφφ φφφ» φφ · ·· ··

Příklad IX

Tento příklad popisuje izolaci různých proteinů z ozimého žita a jejich testování.

Listy z 30 denních rostlinek žita, aklimatizovaných na chlad, byly řezány na 3 cm délky a promyty destilovanou vodou pro odstranění jakéhokoliv buněčného obsahu. Kousky listů byly klepáním sušeny na papírovém ručníku a zcela ponořeny do extrakčního média z 5 mM EDTA, 10 mM kyseliny askorbové, 2 mM' kyseliny kapronové, 2 mM benzamídinu a 1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF). Kousky listů potom byly vakuově infiltrovány v baňce Buchner po dobu 60 minut, načež po této době byly listy vyjmuty a klepáním zcela vysušeny. Potom byly podélně uspořádány v oddělovacím válci plastové stříkačky a jemně odstředěny při 2000 X g po dobu 30 minut.

Apoplastický extrakt byl shromažďován v eppendorfově trubici pod stříkačkou.

Apoplastický extrakt byl koncentrován 7 krát s použitím ultrafiltru Amicon s membránou PM10. Počáteční pročištění bylo provedeno vložením 50 mikrolitrů koncentrovaného apoplastického extraktu na sloupec pro třídění velikosti Superdex 75 PC 3,2/3,0 (separační rozsah molekulových hmotností od 3000 do 70000) na separačním systému Smart, obojí od firmy Pharmacia. Pufrem byl 50 mM

Tris/HCl s pH 9,5. Separace byla provedena s průtokovou rychlostí 50 mikrolitrů za minutu a byly shromažďovány 50 mikrolitrové frakce až do objemu 2,5 ml a testovány na vlastnosti při rekrystalizací, jak je popsáno výše v .příkladu I.

00 00 V 00 00

0000 000 0000

0 0000 0000

0 0. 0 0 0000 0 ·0· ·· 0 0 0 0 0 0 0

0000000 00 0 00 00

Aktivní frakce byly vloženy na sloupec MonoQ FPLC pro silnou aniontovou výměnu (od firmy Pharmacia), který byl uveden do rovnovážného stavu v 50 mM Tris/HCl s pH 9,5, a bílkoviny byly vypláchnuty s použitím stejného pufru s lineárním gradientem na 0,5 M NaCl. Vyplachovací pufr byl přidáván na koncentraci 0,5 M NaCl po dobu 25 minut, držen na této koncentraci po dobu 10 minut a ubírán na koncentraci na 0 M v po dobu 15 minut. Byla provedena chromatografie s průtokovou rychlostí 1 ml za minutu a byly shromažďovány 1 ml frakce. Ty frakce, které byly positivní v testu podle .příkladu I, byly koncentrovány na odstředivém .koncentrátoru

Centrican PM10 s rychlostí 7000 otáček za sekundu, dokud nebyl objem snížen na 50 mikrolitrů, a byly vloženy podruhé do sloupce S75. Frakce, která splnila test podle příkladu I měla jeden vrchol na přibližně 150 mM soli.

Tato aktivní frakce byla oddělena na SDS PAGE (podobný postup jako v příkladu VII). To potvrdilo, že aktivní frakcí byla frakce a molekulovou hmotností 32000.

Frakce proteinu ozimého žita s molekulovou hmotností

32000 může být výhodně použita při výrobě mražených cukrářských produktů.

Zastupuje :

Φ φφ «φ φ φφ φφ φφ φφφ φφφφ φ φφφφ φφφ* φφφ φ φφφφ φ φφφ φφφ φ φφφ φ * φ φφφφ φφ φ φφ φφ

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Mražené cukrářské produkty zahrnující jeden nebo více nemrznoucích polypeptidů odvozených z rostlin, vyznačující se tím, že tyto nemrznoucí 5 polypeptidy ve vodné směsi mají Číselný průměr velikosti, ledových krystalů po rychlém zmrazení na -40°C nebo méně, následovaném skladováním po dobu 1 hodiny při teplotě -6°C, menší než 15 pm, s podmínkou, že nemrznoucí peptid- není nemrznoucí peptid z Vinca Minor, který je umístěn v extracelulárnich prostorech rostlinných buněk a má ' molekulovou hmotnost 36000, 30000, 24000, 220Ό0, 11000, 9Ό00 nebo 5000.

2. Mražený cukrářský produkt podle nároku ]_5 1, vyznačující se tím, že nemrznoucí polypeptidy jsou odvozeny z Polystichum mohriodes, Ranunculus biternatus, Nothofagus antartica, Cerastíum fontánům, Colobanthus quitensis, Rumex acetosella, Salix gragilis, Calluna vulgaris, Aceana magellanica, Pisum sativum, Acer

20 saccheraroides, Oxalis, Geranium, Daucus carota (karotka), Vinca minor (brčál), Vinca major, Polemonium, Buddleia, Forsythia, Sambucus nigra, Juncus squarrosus, Carex aquatilis, Agrostis tenuis, Deschampsia antartica, Festuca contracta, Festuca rubra, Parodiochloa flabellata, Phleum

25 alpinum, Poa annua (pýr plazivý), Poa pratensis (Kentucky blue grass), Rostkovia magellanica, Bambosoideae, Chorisodontium aciphyllum, Drepanocladus uncinatus, Isothenicium myosuriodes, Polytrichum alpestre, Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris,

30 Hypogymnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica, *· »· • · · » * · · · ·· ft»·

3. i Mražený cukrářský produkt podle, nároku

2, vyznačující se tím, že nemrznoucí polypeptidy jsou odvozeny z čeledi Líchen, zejména z Alectoria nigricans, Caloplaca regalis, Himantormia lugubris, Hypogýmnia physodes, Parmelia subrudecta, Ramalina farinaceae, Stereocaulon glabrum, Umbilicaria antartica,

Usnea subfloridana

4. Mražený cukrářský produkt podle nároku

2,vyznačující se tím, že nemrznoucí polypeptidy jsou odvozeny z Juncus aquarrosus nebo Geranium.

5. Mražený cukrářský produkt podle nároku

2,vyznačující se tím, že nemrznoucí polypeptidy udržují jejich schopnost omezit růst ledových krystalů po tepelné úpravě nad teplotu 60°C po časovou periodu alespoň 30 sekund, vzláště výhodně delší než 1 minutu.

6. Mražený cukrářský produkt podle nároku

5, vyznačující se tím, že nemrznoucí polypeptidy jsou odvozeny z Acer saccharoides, Bamboo, Buddleia, Isothecíum myosuroides, Ramalina farinaceae, Usnea subfloridana, Forsythia, Oxalis, Poa Trivialis, Lolium Perenne, Holcus lanatus, Bromus Sterilis, Parodiochloa flabellata, Deschampsia antartica, Carex aquatilis, Colobanthus quintensis a Agrostis tenuis, Festuca contracta a Poa annua.

4 44 ·4 « 44 4*

4444 <44 4444

4 4 · 4 4 4 «444

4 4 4 4 4 4444 4 444 44*

4 4 4 4 4 4 4

444 4*44 44 4 44 44

7. Mražený cukrářský produkt podle nároku

1, vyznačující se tím, že nemrznoucí polypeptidy jsou odvozeny z netoxických rostlin.

8. Mražený cukrářský produkt podle nároku ⁵

2, vyznačující se tím, že nemrznoucím polypeptidem je protein s molekulovou hmotností 32000, i odvozený z ozimého žita.

j

9. Mražený cukrářský produkt podle nároku

10 2, vyznačující se tím, že je v podstatě bez nemrznocích polypeptidu z ozimého žita.