CZ280004B6 - Farmaceutický preparát s obsahem proteinu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu farmaceutických preparátů s antinociceptivním účinkem. Tyto farmaceutické preparáty jsou vhodné pro aplikaci při bolestivých stavech, které jsou vyvolávány akutními nebo chronickými zánětlivými procesy (revmatická arthritida, myositida, gastritida, kolitida, záněty v urogenitálním traktu).ŕ

Description

Použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu farmaceutických preparátů

Oblast techniky

Vynález se týká použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu farmaceutických preparátů s antinociceptivním účinkem.

Dosavadní stav techniky

Protein C je glykoprotein, závislý na vitaminu K, který se syntetizuje v játrech a cirkuluje v plazmě v koncentraci 4 μg/ml jako inaktivní zymogen. Převádí se na povrchu stěn cév /endothel/ pomocí komplexu trombin-trombomodulin na aktivní esrinproteázu /aktivovaný protein C/. Je známé, že aktivovaný protein C má profibrinolytické vlastnosti. Působí také antikoagulatoricky, neboť proteolyticky odbourává faktor Va, totiž kofaktor pro faktor Xa, indukující protrombinovou aktivitu /tvorba trombinu/, a faktor Vlila, totiž kofaktor pro faktor IXa, indukující aktivaci faktoru X.

Aktivace proteinu C in vivo způsobuje negativní feedback reakci regenerace trombinu. Aby se rozvíjela optimální biologická aktivita, je potřebný kofaktor /protein S/.

V rakouské patentové přihlášce A 1551/89 je popsán farmaceutický preparát, obsahující protein C, který může být použit při, popřípadě pro potlačování trombózy a trombolytických komplikací.

Vzhledem k tomu, že jak protein C, tak také aktivovaný protein C, jsou považovány za proteiny tělu vlastní, mají farmaceutické preparáty na bázi těchto proteinů velkou výhodu v tom, že je možno je aplikovat prakticky bez vedlejších účinků.

Podstata vynálezu

Předložený vynález tedy řeší úkol zvětšit terapeutickou oblast použití proteinu C, popřípadě aktivovaného proteinu C.

Uvedený úkol byl vyřešen použitím proteinu C, popřípadě aktivovaného proteinu C pro výrobu farmaceutických preparátů s antinociceptivním účinkem.

Podstata vynálezu je založena na poznatku, že pomocí proteinu C nebo pomocí aktivovaného proteinu C může být potlačeno zvýšené vnímání bolesti. Zahrnuje tedy také použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu preparátů pro aplikaci při bolestivých stavech, způsobených akutními nebo chronickými zánětlivými procesy, přičemž tyto bolestivé stavy mohou být také vyvolány posttraumatickými, postoperačními nebo také primárními nebo sekundárními maligními onemocněními.

Protein C nebo aktivovaný protein C se může obzvláště použít pro výrobu preparátů, které jsou vhodné pro aplikaci při bolestivých stavech, způsobených rematoidní artritidou, myositidou, gastritidou, kolitidou nebo záněty v urogenitálním traktu, nebo

-1CZ 280004 B6 které se vyskytují v rámci akutního nebo chronického transplantačního šoku.

Dále se ukázalo, že protein C nebo aktivovaný protein C je schopen snižovat adhezi leukocytů na cévní stěny a potlačovat pronikání leukocytů přes cévní stěny. Oba proteiny zamezují aktivaci leukocytů a potlačují komplementární aktivaci. Předložený vynález se tedy také týká použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu ' farmaceutických preparátů pro aplikaci při akutních nebo chronických zánětlivých onemocněních. Tato zánětlivá onemocnění se mohou vyskytovat posttraumaticky, postoperativně nebo v rámci primárních nebo sekundárních maligních onemocněních.

Farmaceutické preparáty podle předloženého vynálezu jsou vhodné obzvláště pro aplikaci při revmatické artritidě, myositidě, gastritidě nebo kolitidě, pro aplikaci při zánětech v urogenitálním traktu, jakož i pro aplikaci při zánětlivých procesech, které se vyskytují v rámci akutního nebo chronického transplantačního šoku.

Předložený vynález se také týká použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu farmaceutického kombinovaného preparátu s alespoň jedním antiflogistikem nebo alespoň jedním analgetikem. Ukázalo se, že takovéto kombinační preparáty vykazují synergický efekt.

Dále se předložený vynález týká použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu preparátů pro normalizaci stoupající permeability cév, pro snížení poškození permeability stěn cév a pro stimulaci beta-adrenoreceptorů.

Získávání proteinu C a aktivovaného proteinu C, jakož i zkoušení jejich antinociceptivního účinku je popsáno v následujících příkladech provedení.

Příklady provedení vynálezu

Získávání proteinu C

Vysoce čistý protein C se získá ze surové frakce proteinu C, která se vyrobí z komerčně dostupného koncentrátu protrombinového komplexu. Čištění se provádí pomocí afinitní chromatografie prostřednictvím monoklonálních protilátek. Monoklonální anti-protein C - protilátka se vyrobí následujícím způsobem:

Myši BALB/C se imunizují 10 ^g lidského proteinu C ve dvoutýdenních odstupech intraperitoneální injekcí. Po šesti týdnech se injikuje ještě jednou 50 μη lidského proteinu Ca o tři dny později se provede fúze. Myelomová buněčná linie /P3-X-63-AG8-653,

1,5 χ 10⁷ buněk/ se smísí s 1,7 χ 10⁸ slezinných buněk a fúze se provede podle modifikované Kóhlerovy a Milesteinovy metody za použití PEG 1500 /Kóhler G., Milestein C., Nátuře 256 /1975/ 495 - 497/.

Pozitivní klony, otestované pomocí ELISA, byly dvakrát subklonovány. Ascitická produkce probíhá injekci 5 x 10 hybridomových buněk pro myši BALB/C dva týdny po pristanním zpracování.

-2.-

Imunoglobulin se z ascitické tekutiny izoluje precipitací síranem amonným a čistí se následující chromatografií pomocí sephadexu QAE a potom chromatografií na sephadexu G200. Aby se snížilo riziko přenosu aktivních viru, podrobí se protilátka před imobilizací ještě jednomu viry inaktivujícímu kroku. Takto získaná monoklonální protilátka proti proteinu C se naváže na CNBR-sepharosu 4B /Pharmacia/. Pro čištění proteinu C pomocí afinitní chromatografie se použiji následující pufry:

Absorpční pufr: 20 mmol Tris, 2 mmol kyseliny etylendiamintetraoctové, 0,25 mol chloridu sodného a 5 mmol benzamidinu;

promývací pufr: 20 mmol Tris, 1 mol chloridu sodného, 2 mmol benzamidinu a 2 mmol kyseliny etylendiamintetraoctové; hodnota pH činí 7,4;

eluční pufr: 3 mol NaSCN, 20 mmol Tris, 1 mol chloridu sodného, 0,5 mmol benzamidinu a 2 mmol kyseliny etylendiamintetraoctové.

Koncentrát protrombinovaného komplexu se rozpustí v absorpčním pufru, přičemž pro použití přichází v úvahu asi 10 g koncentrátu protrombinovaného komplexu pro 20 ml sloupce monoklonální protilátky. Potom se rozpuštěný koncentrát protrombinového komplexu filtruje, po dobu 15 minut se odstředúje při 20.000 min“¹ a přes koncentrát filtruje, centrifuguje při 20.000 min^-1 po dobu 15 minut a sterilně filtruje přes 0,8 μιη filtr.

Sterilně přefiltrovaný a rozpuštěný koncentrát protrombinového komplexu se nanese na sloupec při hodnotě průtoku 10 ml/h. Potom se sloupec promyje promývacím pufrem až do dosažení bezbílkovinné frakce a nakonec se navázaný protein C eluuje pomocí elučního pufru při hodnotě průtoku 5 ml/g za jímání frakcí.

Eluovaný protein C se dialyzuje proti pufru /0,2 mol 1 Tris, 0,15 mol glicinu a 1 mmol kyseliny etylendiamintetraoctové; pH = 8,3/. Obsah proteinu C se stanoví antigenometricky pomocí metody podle Laurella a podle aktivity pomocí protac-aktivace.

Získaný eluát proteinu C se následujícím způsobem upraví na farmaceuticky aplikovatelný preparát:

Eluát se nejprve podrobí ultrafiltračnímu a diafiltračnímu kroku. Pro diafiltraci se použije pufr s hodnotou pH 7,4, který na jeden litr obsahuje 150 mmol chloridu sodného a 15 mmol dihydrátu citrátu trojsodného. Získaný filtrát se mrazově vysuší a virově se inaktivuje jednohodinovým zpracováním párou při teplotě 80 °C ± 5 °C a tlaku 137,5 i 3,5 kPa.

Lyofilizovaný virově inaktivovaný materiál se potom rozpustí ve sterilním izotonickém roztoku chloridu sodného a pomocí iontoměničové chromatografie na Q-sepharose se odstraní případně přítomné protilátky, popřípadě sérový amyloid P. Uvedeným způsobem vyčištěný roztok se pomocí dalšího ultrafiltračniho a diafiltračniho kroku zkoncentruje.

Potom se k získanému roztoku přidá na jeden litr 10 g albuminu, 150 mmol chloridu sodného a 15 mmol citrátu trojsodného.

-3CZ 280004 B6

Hodnota pH roztoku činí 7,5. Myší imunoglobulin, jakož i faktory II, VII, IX a X již nebyly dokázány. Nakonec se roztok sterilně zfiltruje, rozplní a lyofilizuje.

Specifická aktivita činí 14 jednotek proteinu C na miligram. Jednotka aktivity proteinu C je definována jako aktivita proteinu C v 1 ml normální plazmy a je kalibrována proti prvnímu mezinárodnímu standardu proteinu C. Jako test aktivity se použije amidolytický test, přičemž se protein C aktivuje pomocí Protacu /fa. Pentapharm/.

Získání aktivovaného proteinu C

Aktivování vyčištěného proteinu C se provádí tak, že se naváže 70 ml trombinu /500 NIH jednotek/ml, což odpovídá asi 2000 NIH jednotkám/mg proteinu/, na CNBR sepharosu 4B /Pharmacia/, načež se protein C smísí s trombinovým gelem v poměru asi 6 jednotek proteinu C na jednu jednotku trombinu při teplotě 37 ’C a ponechá se reagovat po dobu 3 hodin za kontinuálního třepání. Aktivita proteinu C se potom stanoví pomocí chromogenniho substrátu /S 2366/. Aktivovaný protein C se nakonec sterilně filtruje a po rozplnění a lyofilizaci se získá farmaceutický preparát.

Antinociceptivní účinek

Antinociceptivní účinek se stanovuje na zanícené krysí tlapce zjišťováním vlny bolesti za aplikace a bez aplikace proteinu C nebo aktivovaného proteinu C.

Vlna bolesti se zjišťuje analogicky, jako je popsáno u metody Randalla a Selitto /Randall Lo a Selitto JJ : A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue, Arch. Int. Pharmacodyn. 111, 409 - 1957/. K tomu je určen rtuťový manometr s desetimililitrovou injekční stříkačkou, jejíž píst je opatřen krátkým, zašpičatělým čepem. Touto špičkou se vyvíjí vzrůstající tlak na krysí tlapku /2.666 kPa/s - 20 mm Hg/s/. Vlna bolesti je dána jako tlak v mm Hg, který je nutný k tomu, aby se zaznamenala účinková reakce tlapky.

Pro pokusy byly použity samice krys Sprague-Dawley o hmotnosti 250 až 300 g. Zánět byl způsoben intraplanetární injekcí 3 mg carrageenanu (Sigma, C-1013), rozpuštěného ve 100 μΐ izotonického roztoku chloridu sodného, do krysí tlapky.

Vlny bolesti byly měřeny před injekcí /kontrolní hodnota/ a po hodině až do 6 hodin po injekci carrageenanu. Vlna bolesti, která byla měřena po injekci carrageenanu, se vyjadřuje v procentech kontrolní hodnoty.

Protein C a nebo aktivovaný protein C se injikuje intravenó.zně do ocasní žíly bezprostředně po injekci carrageenanu. Objem injekce činí 2 ml/kg.

Výsledky jsou znázorněny na přiloženém obrázku ve formě diagramu, přičemž na ose y jsou naneseny v procentech kontrolní hodnoty prahy bolesti a na ose x jsou logaritmicky naneseny dávky proteinu C /jednotky na kg/. Křivky /a/ a /b/ odpovídají prahům bolesti, které byly změřeny bez, popřípadě za vlivu carrageenanu.

-4CZ 280004 B6

Křivka /c/ ukazuje, že práh bolesti, redukovaný vlivem carrageenanu, se dávkou proteinu C zvýší /antinociceptivní efekt/. Křivka /c/ udává dále rozptylovou oblast antinociceptivního účinku, která se získá dávkami proteinu C 8 E/kg /10 zvířat/, 25 E/kg /15 zvířat/, 80 E/kg /20 zvířat/, 250 E/kg /20 zvířat/ a 800 E/kg /15 zvířat/. Antinociceptivní efekt proteinu C je tedy závislý na dávce a signifikantní /p < 0,01 pro 80 jednotek/kg; p < 0,001 pro 250 a 800 jednotek/kg/.

Také subkutánně se dá tento efekt pro protein C dokázat.

Dále může být dokázáno, že také aktivovaný protein C vykazuje v dávce 250 E/kg dvě hodiny po intraplantární injekci carrageenanu antinociceptivní účinek. Aktivovaný protein C v dávce 250 E/kg intravenózně 10 minut před vyvoláním zánětu působením carrageenanu vykazuje rovněž antinociceptivní efekt, trvající po dobu 2 hodin. Antinociceptivní efekt aktivovaného proteinu C je rovněž závislý na dávce.

Histologické zkoušky krysích tlapek, které byly zpracovány proteinem C nebo aktivovaným proteinem C, vykazují snížený počet perivaskulárních leukocytú ve srovnání s nezpracovanými zvířaty.

Dále se ukázalo, že propanolol, neselektivně blokující beta-adrenoreceptory, ruší antinociceptivní účinek proteinu C /800 E/kg/. Antagonistický účinek propanololu na protein C může být prokázán v rozmezí dávky od 0,03 až 1 mg/kg i.v. /'viz tabulka 1/.

Tabulka 1

Propanolol /výsledky carrageenanu do krysí v % prahu bolesti, měřeno 3 h po aplikaci tlapky, jak bylo výše popsáno/ carrageenan samotný carrageenan + protein C carrageenan + protein C /800 E/kg/ + propanolol /1 mg/kg/ počet

21	-L	3	%	15
60		6	%	15
28	+	5	%	10

Tento antagonismus však není omezen pouze na také jiné beta-blokující substance antagonizují dávce účinek proteinu C, jak je uvedeno v tabulce propanolol, ale v závislosti na 2 pro pindolol.

Tabulka 2

Pindolol /výsledky v % prahu bolesti, měřeno 3 h po aplikaci carrageenanu do krysí tlapky, jak bylo výše popsáno/ carrageenan samotný carrageenan + protein C carrageenan + protein C /800 E/kg/ + pindolol /0.3 mg/kg/ počet ± 1.3 %10 ± 2.0 %10 ± 2.0 %5

Po vyřazení sympatického nervového systému chemickou sympahektomií reserpinem /7.5 mg/kg i.p., 18 až 24 hodin/ a alfa-metyl-p-tyrosinem /250 mg/kg i.p., 5 hodin/ je protein C silně antinociceptivně účinný. Ale také na těchto sympahektomizovaných

-5CZ 280004 B6 zvířatech antagonizuje pindolol úplně efekt proteinu C /tabulka 3/. Tím se může vyloučit účast presynaptického sympatika na účinku proteinu C. Efekt proteinu C je tedy způsoben přímým účinkem na postasynaptické beta-receptory.

Tabulka 3

Reserpin a alfa-metyl-p-tyrosin /výsledky v % prahu bolesti, měřeno 3 hodiny po aplikaci carrageenanu do krysí tlapky, jak bylo výše popsáno/ výchozí hodnoty /20/ při: 5.1995 ± 0.16 kPa počet

NaCl kontrola 61.0 ± 6.8 %5 carrageenan samotný 34.0 ± 10.3 %5 carrageenan + protein C /800 E/kg/ 106.7 ± 18.1 %5 carrageenan + protein C + pindolol 33.3 ± 4.6 %5 /1 mg/kg i.v./

Efekt proteinu C je napodoben beta-parasympatomimeticky. Fenoterol, buď v dávce 5 mg/kg na počátku pokusu, nebo v dávce 3 mg/kg v čase 3 h i.v. injikovaný, způsobuje značnou antinocicepci. Vede tedy stimulace postsynaptických beta-adrenoreceptorů k antinociceptivnímu účinku.

Biochemický účinek beta-sympatomimetického efektu proteinu C je vyvoláván vazbou na adrenergní beta-receptory a stimulací enzymu adenylcyklázy, vázané na membránu, která katalyzuje intracelulárni tvorbu cAPM z ATP. cAPM aktivuje protein-fosfokinázy, které fosforylací převádějí inaktivní enzymy v aktivní. Tímto způsobem se například beta-sympatomimeticky zvyšuje lipolýza a glukogenolýza.

Fyziologické účinky proteinu C jsou na základě jeho beta-sympatomimetického působení různé. Zvýšení cAMP v trombocytech vede k potlačení funkce trombocytů a k potlačení tvorby trombinu na povrchu trombocytů. Proto může být použit protein C, aby se potlačila tvorba krevní sraženiny, obzvláště v tepenném cévním systému, vázáním na trombocytární beta-adrenoreceptory. Beta-adrenoreceptor-pozitivní účinek proteinu C má na srdce pozitivní inotropní efekt a působí na hladké svalstvo /například na bronchioly/ ve smyslu ochabnutí. Na základě beta-sympatomimetického působení na cévní systém může být protein C terapeuticky použit při poruchách periferního prokrvení.

Ukázalo se také, že intrakoronární dávka aktivovaného proteinu C u psů vede ke zvýšení koronárního krevního tlaku na základě vasodilatačního působení. Vasodilatační účinek proteinu C může být využit pro aplikaci při vysokém tlaku. Beta-sympatomimetickému účinku proteinu C může být připisováno také protizánétlivé působení. Beta-sympatomimetický účinek proteinu C vede k potlačení uvolňování histaminu ve slezině. Vzhledem k beta-sympatomimetickému účinku proteinu C může tento také nalézt použití jako tokolytikum.

Claims (7)

1. Použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu farmaceutických preparátů s antinociceptivním účinkem.

2. Použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu farmaceutických preparátů pro aplikaci při akutních nebo chronických zánětlivých onemocněních, obzvláště pro aplikaci při bolestivých stavech, vyvolaných těmito procesy.

3. Použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu farmaceutických preparátů pro aplikaci při zánětlivých procesech, které se vyskytují při post-traumatických, post-operativních stavech nebo v rámci primárních a sekundárních maligních onemocnění, obzvláště pro aplikaci při bolestivých stavech, vyvolaných těmito procesy.

4. Použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu farmaceutických preparátů pro aplikaci při akutních nebo chronických zánětlivých onemocněních, která se vyskytují v souvislosti s revmatickou artritidou, myositidou, gastritidou nebo kolitidou, nebo při zánětech v urogenitálním traktu, obzvláště pro aplikaci při bolestivých stavech, vyvolaných těmito procesy.

5. Použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu farmaceutických preparátů pro aplikaci při akutních nebo chronických zánětlivých onemocněních, která se vyskytují v rámci akutního nebo chronického transplantačního šoku, obzvláště pro aplikaci při bolestivých stavech, vyvolaných těmito procesy.

6. Použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu preparátů pro normalizaci zvýšené permeability cév a pro potlačení poškození permeability cévních stěn.

7. Použití proteinu C nebo aktivovaného proteinu C pro výrobu preparátů pro stimulaci B-adrenoreceptorů.