CZ282235B6 - Očkovací prostředek, jeho použití k výrobě vakcíny, způsob léčby patogenních infekcí tímto prostředkem a způsob jeho výroby - Google Patents

Abstract

Toto řešení předkládá očkovací prostředky s obsahem 3-De-O-acylovaného monofosforillipidu A a QS21. Tyto očkovací prostředky jsou silnými induktory odpovědi, zprostředkovatelné CTL a interferonem-gama. Dále se týká použití prostředku k výrobě vakcíny a způsobu výroby očkovacího prostředku. ŕ

Description

(54) Název vynálezu:

Očkovací prostředek, způsob jeho výroby a jeho použití

CD (57) Anotace:

Očkovací prostředek obsahuje antigen a/nebo antígenní prostředek, QS21 a 3-De-O-acylovaný monofosforillipid A (3D-MPL) při hmotnostním poměru QS21 a 3D-MPL v rozmezí 1:10 až 10:1. Součástí řešení je také způsob výroby tohoto očkovacího prostředku a Jeho použití k výrobě vakcíny proti virovým, bakteriálním nebo parazltlckým infekcím nebo k léčení rakoviny, přičemž způsob výroby spočívá v tom. že se nejprve smísí antigen a 3D-MPL a pak se přidá QS21, přičemž pH se udržuje v rozmezí 6,5 0,5.

CZ 282 23

Očkovací prostředek, způsob jeho výroby a jeho použití

Oblast techniky

Vynález se týká nových očkovacích prostředků, způsobu jejich výroby ajejich medicínského využití. Zvláště se vy nález tyká očkovacích látek s obsahem QS21. netoxické frakce čištěné pomocí HPLC (vysoce účinné kapalinové chromatografie), získané z kůry Quillaja Saponaria Molina, a 3-De-O-acy lovaného monofosforyllipidu A (3D-MPL).

Dosavadní stav techniky

3-De-O-acylovaný monofosforyllipid Aje známý z patentu GB 2220 211 (Ribi). Chemicky se jedná o směs 3-deacy lovaného monofosforyllipidu A se 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci aje vyráběn firmou Ribi Immunochem Montana.

QS21 je pomocí HPLC čištěná netoxická frakce saponinu z kůry jihoamerického stromu Quillaja Saponaria Molina a způsob její výroby popisuje (jako QA21) US patent čísla 5 057 540.

Základem předkládaného vynálezu je překvapivý objev, že prostředky, obsahující kombinace QS21 a 3D-MPL, synergickv zvy šují imunitní odpovědi na podaný antigen.

Například očkovací prostředek s malarickým antigenem, RTS,S. vyvolává v kombinaci s3DMPL aQS21 ve slezině mohutnou synergickou indukci odpovědi cytotoxických T lymfocytů (CTL), specifických vůči bílkovině CS.

RTS je hybridní bílkovina, obsahující v podstatě celou část C-konce cirkumsporozoitní (CS) bílkoviny P. falciparum. spojenou prostřednictvím čtyř aminokyselin části pře S₂ povrchového antigenu hepatitidy B s povrchovým (S) antigenem viru hepatitidy B. Její úplná struktura je popsána v současně projednávané Mezinárodní patentové přihlášce č. PCT EP92/02591, zveřejněné pod číslem WO 93/10151. nárokující prioritu z britské patentové přihlášky č. 9124390.7. Po expresi v kvasinkách je RTS produkována jako lipoproteinová částice a pokud dochází ke společné expresi s antigenem S viru hepatitidy B (HBV). vznikají směsné částice, známé jako RTS.S.

Zjištění, že je možné indukovat silnou cytolytickou odpověď T lymfocytů, je významné, u některých živočišných modelů byla prokázána indukce ochrany vůči onemocněni.

Tvůrci předkládaného patentu prokázali, že kombinace dvou adjuvantních látek QS21 a 3D-MPL s rekombinantním antigenem RTS.S v podobě částice vyvolává ve slezině mohutnou indukci CTL. specifických vůči bílkovině CS. Také samotná frakce QS21 zvyšuje, na rozdíl od 3D-MPL, produkci CTL. Lze říci, že jejich kombinace působí synergicky, neboť výsledný pozorovaný účinek je větší než součet jednotlivých účinků každé adjuvantní látky. Synergie těchto dvou adjuvantních látek vzhledem k indukci CTL je překvapivým zjištěním, majícím důležitý význam pro použití rekombinantních molekul jako očkovacích látek k indukci imunity, zprostředkované CTL.

Indukce CTL je snáze viditelná, pokud je cílový antigen syntetisován vnitrobuněčné (např. při virových infekcích, u vnitrobunéčných bakterií nebo u tumorů), neboť peptidy. vytvářené proteolytickou destrukcí antigenu, mohou projít vhodným postupem úpravy (procesováním), vedoucím k jejich presentaci (vystavení), ve spojení s molekulami třídy I. na buněčné membráně. Obecně ovšem přeformovaný rozpustný antigen této úpravy a presentace nedosáhne a nevy provokuje CTL. restrikčni vůči třídě 1. Proto běžné neživé očkovací látky při vyvolání

- 1 CZ 282235 B6 odpovědi, zprostředkované protilátkami a pomocnými T lymfocyty, obecně neindukují imunitu, zprostředkovanou CTL. Kombinace dvou adjuvantních látek QS21 a 3D-MPL může překonat toto vážné omezení očkovacích látek, tvořených rekombinantními bílkovinami, a indukovat širší spektrum ty pů imunitní odpovědi.

CTL. specifické pro bílkovinu CS. prokázaly v myším modelovém systému schopnost ochrany vůči malárii (Romero se spoluautory . Nátuře 341. 323. 1989). Indukce CTL. specifických pro epitopv CS, byla prokázána při pokusech na lidech, při nichž by li dobrovolníci imunisováni za použití ozářených sporozoitů P. falciparum a projevila se u nich ochrana vůči následné malarické provokaci (Malík se spoluautory; Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88. 3300. 1991).

Schopnost indukce CTL, specifických pro antigen. podávaný ve formě rekombinantních molekul, souvisí s vývojem očkovací látky vůči malárii, protože používání ozářených sporozoitů by mohlo být nepraktické, pokud se týká vyvolání a povahy imunitní odpovědi.

Kromě očkovacích látek proti malárii se schopnost indukovat odpověď CTL uplatni i v případě očkovacích látek vůči viru Herpes simplex, cytomegaloviru, viru lidské imunitní nedostatečnosti a obecně ve všech případech, kdy patogeny procházejí stádiem vnitrobunéčného vývoje.

Podobně by mohly být CTL. specifické pro známé antigeny tumorů, indukovány kombinaci rekombinantního tumorového antigenu a dvou adjuvantních látek. To by umožnilo vývoj protirakovinných očkovacích látek.

V určitých systémech byla kombinace 3D-MPL aQS21 schopna synergicky zvyšovat produkci interferonu gama (IFN-gama). Tvůrci tohoto patentu prokázali synergický potenciál 3D-MPL a QS21 použitím antigenu Herpes simplex, známého jako gD₂t.gD₂t je rozpustný glykoprotein D. oddělený z HSV-2 a je produkován v buňkách CHO podle metodiky Bermana a spolupracovníků. Science 222. 524-52%

Sekrece IFN-gama je spojena s obranou odpovědí vůči vnitrobuněčným patogenům. včetně parasitů, bakterií a virů. Aktivace makrofágu účinkem IFN-gama zvyšuje vnitrobuněčné usmrcování mikrobů a zvyšuje expresi Fc receptorů. Muže vzniknout rovněž přímá cytotoxicita. zvláště v synergii s lymfotoxinem (jiným produktem buněk TH1). IFN-gama je také induktorem i produktem NK buněk (buňky, nazývané přirození zabíječi”). které jsou hlavními přirozenými nositeli ochrany . Odpověď ty pu TH1, zprostředkovaná jak IFN-gama, tak i jiným mechanismem, posky tuje přednostní pomoc pro isotypy imunoglobulinu IgG₂.

Glykoprotein D je lokalisován v obálce viru a nachází se i v cytoplasmě infikovaných buněk (R.

J. Eisenberg se spoluautory, J. of Virol. 35, 428-435, 1980). Obsahuje 393 aminokyselin včetně signálního peptidů a má molekulovou hmotnost přibližně 60 kDa. Ze všech glykoproteinů obálky HSV je pravděpodobně tím nejlépe charakterisovaným (Cohen se spoluautory. J. Virology 60. 157-166). Je známo, že in vivo hraje ústřední roli při přichycení viru na buněčné membrány. Nadto bylo prokázáno, že glykoprotein D je schopen in vivo vyvolat tvorbu neutralizujících protilátek (Eing se spoluautory , J. Med. Virology 127, 59-65). Latentní virus HSV2 však stále může být reaktivován a může indukovat opakování choroby i přes přítomnost vy sokého titru neutralisujících protilátek v séru pacienta. Je tedy zřejmé, že schopnost indukce neutralisujících protilátek je sama o sobě nedostatečná k přiměřené kontrole onemocnění.

K prevenci takového návratu onemocnění bude kterákoli očkovací látka muset stimulovat nejen neutralizující protilátky, ale i buněčnou imunitu, zprostředkovanou T-buňkami. zejména cytotoxickými T-buňkami.

gD_;t je v takovém případě HSV glykoprotein D o 308 aminokyselinách, který obsahuje aminokyseliny 1 až 306 přirozeně se vyskytujícího glykoproteinu s přidaným asparaginem a glutaminem na C-konci oddělené bílkoviny. Tato forma bílkoviny obsahuje signální bílkovinu, která je štěpena za vzniku zralé bílkoviny o 283 aminokyselinách. Tvorba takové bílkoviny v buňkách vaječníku čínského křečka byla popsána v evropském patentu EP-B-139 417 (Genetech).

Zralý oddělený glykoprotein D (rgD2t) nebo odpovídající bílkoviny, vylučované savčími buňkami, jsou s výhodou použity v očkovacím prostředku podle tohoto vynálezu.

Podstata vynálezu

Prostředky podle tohoto vynálezu jsou velmi účinné v indukci ochranné imunity u modelu genitálního herpesu morčat. I s velmi malými dávkami antigenu (například jen 5 ug rgD2t) chrání tyto prostředky morče vůči primární infekci a stimulují i odpověď specifických neutralizujících protilátek. Tvůrci vynálezu také při použití prostředku podle předkládaného vy nálezu prokázali u myší vznik odpovědi typu TH1. zprostředkované efektorovými buňkami.

Podstatu vynálezu tvoří očkovací prostředek, který obsahuje antigen a/nebo antigenní prostředek. QS21 a 3-De-O-acy lovaný monofosforyllipid A (3D-MPL) při hmotnostním poměru QS21 a 3DMPL v rozmezí 1 : 10 až 10 : 1.

Očkovací prostředek bude s výhodou obsahovat antigen nebo antigenový přípravek, schopný vyvolat imunitní odpověď vůči lidskému nebo zvířecímu patogenu, a tento antigen nebo antigenový přípravek je odvozen od kteréhokoliv z lidských nebo zvířecích herpes virů, jako je gD nebo jeho deriváty , nebo od virů hepatitidy. jako je virus hepatitidy B. například povrchový antigen hepatitidy B nebo jeho derivát, virus hepatitidy A. hepatitidy C a hepatitidy E.

Prostředek může rovněž obsahovat protinádorový (antitumorový) antigen a být užitečný k imunoterapeutické léčbě rakoviny .

Prostředek může být také užitečný k použití s lehkými herpetickými částicemi, jak je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/GB92 00824 a v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/GB92/00179.

Deriváty povrchového antigenu hepatitidy B jsou v oboru dobře známé a zahrnují, kromě jiného, také preSi, preS₂, které jsou popsány v evropských patentových přihláškách EP-A-414 374. EPA-0304 578 a EP-198 474.

Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby očkovacího prostředku, při němž se nejprve smísí antigen a 3D-MPL a pak se přidá QS21. přičemž pH se udržuje v rozmezí 6,5 ± 0.5.

Součást podstaty vy nálezu tvoří také použití prostředku k výrobě vakcíny k profylaktické léčbě virových bakteriálních nebo parasitických infekcí k imunoterapeutické léčbě virových, bakteriálních, parasitických infekcí nebo rakoviny.

Poměr QS2I a3D-MPL bude typicky v řádu 1 : 10 až 10 : 1; s výhodou 1 : 5 až 5 : 1 a často v podstatě 1:1. Výhodné rozmezí pro optimální synergii je 2,5 : 1 až 1 : 1 3D-MPL : QS21. Pro podávání lidem bude typická přítomnost QS21 a 3D-MPL v očkovací látce v rozmezí od 1 pg do 100 pg a lépe od 10 ug do 50 pg na 1 dávku. Očkovací látka často nebude vyžadovat žádný specifický nosič a bude formulována ve vodném nebo jiném farmaceuticky přijatelném pufru. V některých případech může byt výhodou, že očkovací látka podle tohoto vynálezu bude dále obsahovat hliník anebo bude předkládána v emulsi oleje ve vodě či v jiném vhodném vehikulu (na nosiči), jako například v liposomech, mikrokuličkách nebo enkapsulovaných částicích antigenu.

Příprava očkovací látky je obecné popsána v knize New Trends and Developments in Vaccines. ed. Voliér se spolupracovníky, vydané University Park Press. Baltimore. Maryland. USA. v roce 1978. Enkapsulace do liposomů je popsána například Fullertonem v US patentu 4 235 877. Sdružování (konjugace) bílkovin do makromolekul je popsána například Likhitem v L S patentu 4 372 945 a Armorem se spoluautory v US patentu 4 474 757.

Množství bílkoviny v každé dávce očkovací látky je zvoleno jako množství, které indukuje imunoprotektivní odpověď bez významných negativních vedlejších účinků v ty pických očkovacích látkách. Takové množství bude kolísat v závislosti na druhu použitého specifického imunogenu a na tom. jak je předkládán. Obecně se očekává, že bude každá dávka obsahovat 15 1-1000 gg bílkoviny, s výhodou 2-100 μg, nejlépe 4-40 μg. Optimální množství pro konkrétní očkovací látku lze zjistit standardními studiemi, zahrnujícími sledováni vhodné imunitní odpovědi subjektu. Po úvodním očkování může subjekt podstoupit jednu nebo více zesilujících imunisací, příslušně rozvržených.

Prostředek podle předkládaného vynálezu může být použit jak k profylaktickým. tak k terapeutickým účelům.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Synergie mezi 3D-MPL a QS21 pro indukci sekrece interferonu gama.

K otestování schopnosti adjuvantního prostředku, založeného na 3D-MPL aQS2l. indukovat imunitní odpověď, zprostředkovanou efektorovými buňkami, byly očkovány skupiny myší Balb/c a jejich odsáté buňky lymfatických uzlin byly testovány vzhledem k sekreci IFN-gama. jak je popsáno níže.

1.1 Prostředky s rgD2t

V tomto pokusu byly srovnávány tři adjuvantní prostředky:

i) rgD2t v 3D-MPL ii) rgD2tvQS21 iii) rgD2t v3D-MPL/QS21

Tyto prostředky byly připraveny následovně. rgD2t byl produkován buňkami CHO a odpovídá 45 aminokyselinám 1 až 283 zralého viru HSV-2gD. Je získáván podle metodiky Bermana (viz výše) a EP 0139417.

*rgD2t/3D-MPL μ? rgD2t na dávku se inkubuje 1 hodinu za míchání při laboratorní teplotě a poté se smísí se 5o suspensí 3D-MPL (25 ug na dávku). Objem se upraví na 70 μΙ/dávku pomocí roztoku chloridu sodného (5 M, pH 6.5x0.5) a vody pro injekce tak. aby se získala výsledná koncentrace chloridu sodného 0,15 M. Hodnota pH se udržuje na 6.5x0.5.

*rgD2t/QS21 pg rgD2t na dávku se inkubuje 1 hodinu za míchání při laboratorní teplotě. Objem se upraví na 70 μΐ pomocí roztoku chloridu sodného (5 M, pH 6.5±0,5) a vody pro injekce. Poté se přidá QS21 (10 μg/dávku). Hodnota pH se udržuje na 6.5±0.5 a výsledná koncentrace chloridu sodného je rovna 0.15 M.

* rgD2t/3D-MPL/QS21 pg rgD2t na dávku se inkubuje 1 hodinu za míchání při laboratorní teplotě. 3D-MPL (25 pg/dávku) se přidá ve formě vodné suspense. Výsledného objemu 70 μΐ je dosaženo přidáním vodného roztoku QS21 (10 pg/dávku) a pH se udržuje na 6,5±0.5. Výsledná koncentrace chloridu sodného je rovna 0,15 M.

1.2. Imunisace

Myším bylo injekčně aplikováno 35 μΐ prostředku do každého zobou chodidlových polštářků zadních nohou. Každé zvíře tak dostalo 70 μΐ prostředku. Imunisace byla provedena ve dnech 0 a 14. Zvířata byla zabita v den 21.

1.3. Stanovení interferonu-gama

Buňky z podkoleních lymfatických uzlin imunisovaných myší byly in vitro stimulovány pomocí rgD2t v množství 10.1, 0.1 aO μg/ml. V mikrotitračních destičkách o 96 jamkách s kulatým dnem byly za použití 2 x 10’ reagujících (responder) buněk a 2 x 10^? předem ozářených (3000 rad) intaktních synchronních slezinných buněk trojitě připraveny kultury (objem 200 μΐ). Kultivačním médiem bylo RPMI 1640 s 10% fetálním telecím sérem. Alikvoty po 100 μΙ kultivačního média byly odebírány z každé kultury a spojovány ke stanovením interferonu-gama. Kultury' byly testovány po 72 hodin. Ke všem stanovením byla zahrnuta i kontrolní skupina, využívající konkanavalin A (Con A, Boehringer Mannheim) v množství 5 pg/ml. Tato skupina byla stále positivní.

Sekrece IFN-gama byla stanovena za pomoci komerčního testu EL1SA. vyráběného firmou Holland Biotechnologv (distributor Gibco). Stanovení bylo prováděno ve 100 μΙ spojeného supernatantu ze tří souběžně zpracovávaných jamek.

Sekrece IFN-gama. převyšující pozadí stanovení ve výši 50 pg/μΐ, byla prokázána u všech tří skupin, obsahujících prostředek (viz tabulka). Kromě toho bylo pozorováno synergické působení QS21 a3D-MPL. Zatímco každá adjuvantní látka sama osobě indukovala buňky, schopné vylučovat IFN-gama v odpovědi na rgD2t. jejich kombinace indukovala více než dvojnásobek sumy individuálních odpovědí.

1.4. Výsledky

Synergie QS21 a 3D-MPL při indukci sekrece IFN-gama

imunisace:	QS21/3D- MPL rgD2t	QS2I rgD2t	3D-MPL rgD2t
in vitro 10.0	1351	1 105	515
stimulace 1,0	914	116	192
(pg'ml gD2t): 0.1	335	<50	143
0,0	101	<50	139

IFN-gama je vyjádřen v pg/ml.

Tabulka jasné ukazuje, že kombinovaná očkovací látka indukuje sekreci IFN-gama synergicky.

Příklad 2

Synergie 3D-MPL a QS2I při indukci CTL

K testování schopnosti částic RTS.S, obsažených v adjuvantních prostředcích na bázi 3D-MPL aQS2l. indukovat CTL, byly imunisovány skupiny myší B10.BR. jejich slezinné buňky byly stimulovány in vitro a testovány v testech cytotoxicity na L buňkách, schopných exprese CS bílkoviny.

2.1 Prostředky s částicemi RTS.S

RTS.S částice byly zpracovány do tří odlišných prostředků:

1. částice RTS.S (10 pg) s QS21 (10 pg) a 3D-MPL (25 pg);

2. částice RTS.S (10 ug) s QS21(10 pg);

3. částice RTS.S (10 pg) s 3D-MPL (25 pg);

Prostředky byly vytvořeny následovně:

* RTS.S/3D-MPL pg částic RTS.S/dávku bylo za míchání inkubováno při laboratorní teplotě a poté smíseno s vodnou suspensí 3D-MPL (25 pg/dávku). Objem byl upraven na 70 pl/dávku pomocí vody pro injekce a roztoku chloridu sodného (5 M, pH 6,5±0,5) k dosažení výsledné koncentrace chloridu sodného 0,15 M (pH se udržuje na 6,5±0,5).

* RTS.S/QS21 pg částic RTS.S/dávku bylo za míchání inkubováno 1 hodinu při laboratorní teplotě. Objem se upraví pomocí roztoku chloridu sodného (5 M, pH 6.5±0.5) a vody pro injekce a doplní na 70 pl přidáním vodného roztoku QS21 (10 pg/dávku). pH se udržuje na 6,5±0.5 a výsledná koncentrace chloridu sodného je rovna 0,15 M.

2.2 Imunisace myší částicemi RTS.S

Samice myší kmene B10.BR(H-2^k) ve věku od 4 do 6 týdnů by ly získány od firmy 1FFA CREDO (Francie). Skupiny 3 zvířat byly imunisovány injikací 35 pl antigenového přípravku do polštářku každé zobou zadních tlapek. Reakce zvířat byla zvýšena aplikací další stejné dávky antigenu o dva týdny později.

2.3. In vitro stimulace anti CS CTL

Dva týdny po opakované imunisaci (zesílení) byly odebrány slezinné buňky a in vitro stimulovány za použití syngeneických (současně vzniklých) fibroblastů, transferovaných cirkumsporozoitním bílkovinným genem (klon 7G8) P. falciparum. Tyto CS-transtektní buňky byly popsány v práci S. Kumara a spoluautorů. Nátuře 334. 258-260. 1988.

- 6 CZ 282235 B6

Kultury byly založeny v médiu RPMI 1640, doplněném 10% tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem a obvyklými přídavnými látkami (aditivy), za podmínek, dobře známých odborníkům v tomto oboru.

Reagující buňky byly kultivovány v koncentraci 10⁶ buněk/ml za přítomnosti 10' CStransfektních buněk na mililitr. K zabránění proliferace CS-transfektních buněk byly tyto buňky předem ozářeny dávkou 2 x 10⁴ rad (dávka absorbované radiace, radiation absorbed dose). Kultury byly vyživovány náhradou 1/2 kultivačního média ve dnech 3 a 6 a v den 7 byly testovány vzhledem k cytolytické aktivitě.

to

2.4 Stanovení cytotoxicity anti-CS CTL

Kultury reagujících buněk byly odebrány, promyty a smíseny v poměrech od 100 : 1 do 0.3 : 1 s konstantním množstvím 2000 cílových buněk, v objemu 200 μΐ média v mikrotitračních 15 destičkách o 96 jamkách se špičatým dnem. Cílovými buňkami byly buňky syngeneických fibroblastů. označené isotopem ³¹Cr.

Byly použity dva typy cílových buněk:

1. L buňky

2. CS transfektované L buňky

Ty jsou popsány S. Kumarem a spoluautory', Nátuře 334, 258-260. 1988.

Stanovení bylo inkubováno 6 hodin při 37 °C a pak bylo určeno množství radioaktivity, uvolněné do supernatantu lysí cílových buněk. Cytolytická aktivita je vyjádřena jako % specifické lyse:

Výsledky:

% specifické lyse prostředkem:

cílové buňky	poměr efektor: cíl. bky	l.RTS,S/ QS21/ 3D-MPL	2.RTS.S/ QS21	3.RTS.S/ 3D-MPL
CS transfektované L buňky	100 30 10 3 1 0,3	58 53 47 27 11 2	17 10 5 1 0 2	1 0 1 0 0 -1
L buňky	100 30 10 3 1 0,3	3 _2 0 0 -1 3	1 -1 •Ί 3 4 1	5 4 T 4 2

Imunisace myší B10:BR pomocí RTS,S, jehož adjuvantnost zajišťovaly látky QS2 i a3D-MPL (prostředek #1), indukovala ve slezině vysokou hladinu CTL. specifických pro cirkumsporozoitní složku RTS.S. Imunisace částicemi RTS.S sadjuvantní látkou QS2I (prostředek #2) rovněž indukovala CTL ve slezině, ale pouze ve výši asi 1/30 hladin, indukovaných prostředkem -1. 35 RTS.S s 3D-MPL (prostředek #3) CTL neindukoval.

- 7 CZ 282235 B6

Protože cílové buňky, používané v tomto stanovení, nejsou schopné exprese molekul MHC třídy

II. mohou být efektorové buňky považovány za CD8‘, CTL restrikční pro třídu I.

3. Další prostředky

Povrchový antigen hepatitidy B. Alum 3D-MPL a QS21.

Příprava povrchového antigenu hepatitidy B (HBsAg) je dobře popsána. Viz například Harťord se spoluautory, Develop. Biol. Standard 54. 125, 1983; Gregg se spoluautory, Biotechnoiogy 5, ίο 479, 1987; EP-A-0 226 846 a EP-A-299 108 a v nich uvedené odkazy.

Látka 3D-MPL byla získána od firmy Ribi Immunochem. látka QS21 od firmy Cambridge Biotech a hydroxid hlinitý od firmy Superfos (Alhydrogel).

Pro studie buněčně zprostředkované imunity u myší a pro studie na opicích makak Rhesus by lo připraveno množství odlišných prostředků.

3.1 Prostředek byl připraven do fosfátového pufru (pH 6,8) a v dávce 60 μΐ obsahoval následující:

20	20 pg	HBsAg
	30 pg	A1(OH)3
	30 pg	3D-MPL
	10 Pg	QS21
	10 mM	PO?
25	0.15 M	NaCl

Prostředek byl připraven následujícím způsobem. 20 μg HBsAg/dávku bylo inkubováno sAI(OH)₃ 1 hodinu při laboratorní teplotě a za mírného protřepávání. Látka 3D-MPL byla přidána ve formě vodné suspense. prostředek byl doplněn přídavkem QS21. fosfátového pufru 30 a chloridu sodného a inkubován 1 hodinu při laboratorní teplotě. Výsledný prostředek vykazoval pH mezi 6,5 a 7 a byl použit pro studie, kdy se myším aplikuje do chodidlového polštářku zadní nohy.

3.2 Prostředek 2 byl připraven do fosfátového pufru (pH 6,8) a v dávce 200 μΙ obsahoval 35 následující:

μg HBsAg

100 μg AI(OH)₃ pg 3D-MPL

20 μg QS21 mM PO?

0,15 M NaCl

Prostředek byl připraven následujícím způsobem. HBsAg a A1(OH)₃ byly společně inkubovány 45 po 1 hodinu při laboratorní teplotě a za mírného protřepávání. Prostředek by l doplněn přídavkem

A1(OH)₃. 3D-MPL ve formě vodné suspense, QS21, fosfátovým pufrem a roztokem chloridu sodného a byl inkubován dalších 30 minut. pH prostředku bylo udržováno mezi 6,5 a 7.0 a prostředek byl použit pro studium humorální imunity u myší.

3.3 Prostředek 3 byl připraven podobným způsobem, ve fosfátovém pufru (pH 6,5 až ^-.0) a obsahoval v dávce I ml následující:

- 8 CZ 282235 B6

500 pg pg pg

HBsAg

A1(OH)₃

3D-MPL

QS21

Prostředek byl použit ke studiím na opicích.

4. Závěr

Kombinace dvou adjuvantních látek QS21 a3D-MPL s rekombinantním částicovým antigenem RTS.S vyvolala ve slezině mohutnou indukci CTL, specifických pro bílkovinu CS. Lze říci, že kombinace působí synergicky, neboť její účinek převyšuje součet jednotlivých účinků obou adjuvantních látek. Synergie mezi těmito dvěma adjuvantními látkami vůči indukci CTL je . překvapivým zjištěním, které podporuje naše pozorování.synergického účinku v případě QS21 a3D-MPL vůči indukci T buněk, schopných vylučovat IFN-gama v odpovědi na stimulaci rozpustnou rekombinantní bílkovinou gD2t. Tento nález má důležitý význam pro používání rekombinantních molekul jako očkovacích látek k indukci imunity, zprostředkované CTL. neboť kombinace dvou adjuvantních látek QS21 a 3D-MPL může překonat vážné omezení očkovacích látek na bázi rekombinantních bílkovin a indukovat širší spektrum typů imunitní odpovědi než dosud.

Data, týkající se myší buněčně zprostředkované imunogenity ukazují, že prostředky rgD2t. založené na bázi QS21. indukují významnou (signifikantní) synergickou odpověď T buněk typu TH1 (sekreci IFN-gama).

Bylo prokázáno, že takovéto T buňky typu TH1 se účastní indukce reakce opožděného typu zvýšené přecitlivělosti u myší. Naše vlastní údaje, týkající se profylaxe onemocnění HSV ukazují, že průvodní indukce titrů neutralizujících protilátek a antigenně specifických odpovědí DTH posky tuje nej lepší ochranu proti onemocnění Herpes simplex.

Posuzovány společně, naznačují tyto údaje, že prostředky QS21 s obsahem rgD2t mohou být účinné v indukci ochranné reakce vůči onemocnění HSV. Předložené údaje vykazují neočekávané synergické působení 3D-monofosforyllipidu AaQS21 při indukci antigenně specifických T buněk, vy lučujících IFN-gama. Taková synergie se může přeměnit ve zvýšenou 35 schopnost indukce obranné odpovědi vůči onemocnění HSV a skutečně tyto prostředky projevují účinek při ochraně vůči tomuto onemocněni u morčat.

Dodatek příkladů

Protilátková odpověď vůči HBsAg v kombinaci s ALUM. QS21 a/nebo 3D-MPL

Pokusné uspořádání:

Prostředky byly označeny tak jako v příkladech.

Myši Balb/c byly naočkovány 70 pl příslušného prostředku dvakrát s prodlevou 14 dnů. Séra byla shromažďována 14 dní po druhém očkování a byla testována na celkové specifické protilátky anti IgG.

-9CZ 282235 B6

Výsledky

Výsledky jsou znázorněny na přiložených obrázcích. Je z nich zřejmé, že po přídavku 25 μΙ 3DMPL k rozdílným množstvím QS21 lze vidět jasné svnergické zvýšení titrů protilátek ve srovnání s QS21 anebo 3D-MPL samotnými.

Na ose x je vždy uvedena přidávaná látka, na ose y je vždy vynesena geometrická střední hodnota titru (GMT).

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   15 1. Očkovací prostředek, vyznačující se tím. že obsahuje antigen a/nebo antigenní prostředek. QS21 a 3-De-O-acylovaný monofosforyllipid A. 3D-MPL. při hmotnostním poměru QS21 a 3D-MPL v rozmezí 1 : 10 až 10 : 1.
2. 2. Očkovací prostředek podle nároku 1. vyznačující se tím, že poměr 20 QS21 : 3D-MPLje 1 : 1 až 1 : 2.5.
3. 3. Očkovací prostředek podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že antigen je nádorovým, tumorovým, antigenem.

   25
4. 4. Očkovací prostředek podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se tím. že obsahuje glvkoprotein nebo antigen viru herpes simplex, vyvolávající imunitní odpověď proti hepatitidě B nebo malarii.
5. 5. Způsob výroby očkovacího prostředku podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se

   30 tím, že se nejprve smísí antigen a3D-MPL a pak se přidá QS21, přičemž pH se udržuje v rozmezí 6,5 ± 0,5.
6. 6. Použití prostředku podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, k výrobě vakcíny k profyTaktické léčbě virových bakteriálních nebo parasitických infekcí.
7. 7. Použití prostředku podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2 k výrobě vakcíny k imunoterapeutické léčbě virových, bakteriálních, parasitických infekcí nebo rakoviny.