CZ291372B6 - Rekombinantní adenovirový vektor a jeho použití - Google Patents
Rekombinantní adenovirový vektor a jeho použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ291372B6 CZ291372B6 CZ19961143A CZ114396A CZ291372B6 CZ 291372 B6 CZ291372 B6 CZ 291372B6 CZ 19961143 A CZ19961143 A CZ 19961143A CZ 114396 A CZ114396 A CZ 114396A CZ 291372 B6 CZ291372 B6 CZ 291372B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- tumor
- vector
- protein
- gene
- cells
- Prior art date
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 109
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 84
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 154
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 191
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 118
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 39
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 39
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 32
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 30
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 27
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 101710155188 Hexon-interlacing protein Proteins 0.000 claims description 25
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 claims description 25
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 claims description 25
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 24
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 24
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 claims description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 15
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 claims description 14
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 claims description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 239000000225 tumor suppressor protein Substances 0.000 claims description 12
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 9
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 9
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 7
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 7
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 claims description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- GOILPRCCOREWQE-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-7h-purine Chemical compound COC1=NC=NC2=C1NC=N2 GOILPRCCOREWQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 239000002215 arabinonucleoside Substances 0.000 claims description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 claims 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 claims 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 230000003307 reticuloendothelial effect Effects 0.000 claims 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 145
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 70
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 50
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 description 31
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 30
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 28
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 25
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 25
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 25
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 25
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 21
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 21
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 21
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 19
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 18
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 16
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 15
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 13
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 11
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 11
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 8
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 4
- 102000005352 centromere protein F Human genes 0.000 description 4
- 108010031377 centromere protein F Proteins 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000011717 athymic nude mouse Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 3
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 101000892448 Neisseria gonorrhoeae Type II restriction enzyme NgoMIV Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 229940087451 cytovene Drugs 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 210000002767 hepatic artery Anatomy 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- NJZHEQOUHLZCOX-ZENOOKHLSA-N (3aR,4R,9bS)-golgicide A Chemical compound C1([C@@H]2NC3=C(F)C=C(C=C3[C@H]3C=CC[C@H]32)F)=CC=CN=C1 NJZHEQOUHLZCOX-ZENOOKHLSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 1
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 description 1
- XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N Aflatoxin G Chemical compound O=C1OCCC2=C1C(=O)OC1=C2C(OC)=CC2=C1C1C=COC1O2 XWIYFDMXXLINPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000796533 Arna Species 0.000 description 1
- 206010004446 Benign prostatic hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022548 Beta-hexosaminidase subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 201000011057 Breast sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101100008044 Caenorhabditis elegans cut-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 229940123150 Chelating agent Drugs 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000972324 Cynodon dactylon Leaf protein Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 102400001301 Gasdermin-B, C-terminal Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- 208000003807 Graves Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000944380 Homo sapiens Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001038337 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase LMTK1 Proteins 0.000 description 1
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101150032643 IVa2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011062 Li-Fraumeni syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000004403 Prostatic Hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 description 1
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100040293 Serine/threonine-protein kinase LMTK1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022292 Tay-Sachs disease Diseases 0.000 description 1
- 206010050283 Tumour ulceration Diseases 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N Vidarabine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-UHTZMRCNSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- -1 h-NUC Proteins 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 101150088856 pix gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000009396 radiation induced apoptosis Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000028617 response to DNA damage stimulus Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000008957 viral persistence Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Rekombinantní adenovirový expresní vektor, zahrnující a) inzert exogenní DNA, zahrnující gen kódující cizí protein, a b) adenovirovou DNA, v níž byly vypuštěny všechny kódující sekvence E1a, E1b a proteinu IX a alespoň část E3, farmaceutický přípravek na bázi tohoto vektoru a použití tohoto vektoru k přípravě farmaceutického prostředku.ŕ
Description
Předložený vynález se týká rekombinantního adenovirového vektoru a jeho použití.
Dosavadní stav techniky
V tomto popisu jsou různé publikace uváděny citacemi v závorkách a v seznamu literatury, který je uveden před patentovými nároky. Tyto publikace jsou zde zahrnuty do popisu, aby byl plně popsán stav techniky v oboru, kterého se předložený vynález týká.
Produkce rekombinantních adenovirů vhodných pro genovou terapii vyžaduje použití buněčné linie, schopné nahrazení v transgenových produktech virových El regionu, které jsou v těchto rekombinantních virech deletovány. V současnosti je použitelnou dostupnou buněčnou linií pouze 293 buněčná linie původně popsaná Grahamem a spol. 1977. Buňky 293 obsahují zleva přibližně 12 % (4,3 kb) genomu adenovirů typu 5 (Aiello (1979) a Spector (1983).
Adenovirové vektory v současné době testované pro aplikace v genové terapii jsou typicky zbaveny Ad2 nebo Ad5 DNA zasahující přibližně od 400 páru bází od 5' konce virového genomu do přibližně 3,3 kb od 5' konce, pro celkovou El deleci 2,9 kb. Existuje zde tak omezená oblast homologie přibližně 1 kb mezi DNA sekvencí rekombinantního viru a Ad5 DNA v buněčné linii. Tato homologie definuje oblast potenciální rekombinace mezi virovými a buněčnými adenovirovými sekvencemi. Taková rekombinace vede kfenotypově standardnímu typu viru, nesoucímu Ad5 El region z 293 buněk. Tato rekombinace je přičítána převážně časté detekci standardního typu adenovirů v přípravcích rekombinantního viru a bylo přímo demonstrováno, že vyvolává standardní typ kontaminace Ad2 na bázi rekombinantního viru Ad2/CFTR-1 (Rich a spol. (1973)).
Díky vysokému stupni homologie s typem C adenovirové podskupiny se tato rekombinace pravděpodobně objevuje, jeli vektor na bázi jakékoliv skupiny C adenovirů (typy 1, 2, 5, 6).
V produkci rekombinantních adenovirů v malém měřítku, generování kontaminace virem standardního typu může být dosaženo screeningovým procesem, který odkládá ty preparáty viru, které byly shledány kontaminovanými. Se vzrůstáním měřítka virové produkce pro splnění požadavků genové terapie, bude pravděpodobnost jakéhokoliv podílu, kontaminovaného standardním typem viru, také stoupat a stejně tak obtížnost poskytnutí nekontaminovaných přípravků.
V tomto roce bude diagnostikován více než jeden milion nových případů rakoviny, a polovina z tohoto počtu je spojena s úmrtím (Američan Cancer Society, 1993). p53 mutace jsou nejčastější genetickou změnou spojenou s lidskými rakovinami, objevující se v 50-60 % lidských rakovin (Hollstein a spol. (1991); Bartek a spol. (1991); Levine (1993). Cílem genové terapie v léčbě p53 defícientních tumorů je, například, reinstalace normální, funkční kopie standardního p53 genu, takže se obnoví řízení buněčné proliferace. p53 hraje podstatnou roli v progresi buněčného cyklu, znemožnění růstu tak, že se může objevit oprava nebo apoptosis v odpovědi na DNA poškození. Standardní typ p53 byl v současnosti identifikován jako nezbytná složka pro apoptosis indukovanou ozářením nebo ošetřením některými chemoterapeutickými činidly (Lowe a spol. (1993) A a B). Vzhledem k vysokému rozšíření p53 mutací v lidských tumorech je možné, že tumory, které byly odolné k chemoterapeutické a ozařovací léčbě, se tak mohou chovat proto, že postrádají standardní typ p53. Při dodání funkčního p53 do těchto tumorů se tyto stávají náchylnými k apoptosis normálně spojené s DNA poškozením vyvolaným ozářením a chemoterapií.
-1 CZ 291372 B6
Jedním z kritických bodů v úspěšné humánní tumorové supresorové genové terapii je schopnost ovlivňovat významnou frakci rakovinových buněk. Použití retrovirálních vektorů bylo rozsáhle vyzkoušeno na mnoha tumorových modelech. Například u léčby jatemích malignancí byly použity retrovirové vektory s malým úspěchem, protože tyto vektory nejsou schopny dosáhnout vysoké hladiny genového transferu vyžadovaného pro in vivo genovou terapii (Huber B.E. a spol., 1991, Caruso M. a spol., 1993).
Pro dosažení trvalejšího zdroje virové produkce se výzkumníci snažili překonat problém spojený s nízkou hladinou genového transferu přímou injekcí retrovirových obalových („packaging“) buněčných linií do pevných tumorů (Caruso M. a spol., 1993, Ezzidine Z.D. a spol., Culver K.W. a spol., 1992). Tyto metody jsou však nevhodné pro použití u lidských pacientů,protože tato metoda je obtížná a vyvolává u pacientů zánětlivou odpověď na obalovou buněčnou linii. Další nevýhodou retrovirových vektorů je, že vyžadují rozdělení buněk do účinného integrátu a expresi rekombinantního genu (Huber Β. E., 1991). Stálá integrace do základního hostitelského genu může vést k vývoji nebo dědění patogenních chorobných stavů.
Rekombinantní adenoviry mají významné výhody vůči metodám retrovirového a jiného genového doručování (přehled viz Siegfried (1993). Adenoviry nebyly nikdy prokázány jako vyvolávající tumory u lidí a byly bezpečně užívány jako živé vakcíny (Straus (1984)). Replikace defícientních rekombinantních adenovirů může být produkována nahrazením El oblasti nezbytné pro replikaci s cílovým genem. Adenovirus neintegruje do lidského genomu jako normální následek infekce, čímž se většinou redukuje riziko inzerční mutageneze možné s retrovirovými nebo adenospojenými virovými (AAV) vektory. Ztráta stabilní integrace také vede k dalšímu bezpečnému rysu tím, že účinek transferovaného genu bude přechodný, přitom, jak se extrachromozomální bude postupně ztrácet s kontinuálním dělením normálních buněk. Stabilně může být vysoký titr rekombinantního adenovirů produkován v hladinách nedosažitelných s retrovirem nebo AAV, což umožňuje, aby byl produkovaný materiál použit pro ošetření velkého množství populace pacientů. Navíc jsou adenovirové vektory schopny vysoké účinnosti in vivo genového transferu do širokého rozsahu typů tkání a tumorových buněk. Například bylo prokázáno, že adenovirové zprostředkované genové doručování má silný potenciál pro genovou terapii pro choroby jako je cystická fíbroza (Rosenfeld a spol. (1992), Rich a spol. (1993)). a a ]- antitrypsinovou nedostatečnost (Lemarchand a spol. (1992)). I když v současné době jsou využívány i jiné alternativy genového doručování, jako jsou komplexy kationický liposom/DNA, nikdo dosud neobjevil, jak účinně tak adenovirové zprostředkované genové doručování.
Jako u léčby p53 defícientních tumorů je cílem genové terapie u jiných tumorů obnovení řízení buněčné proliferace. V případě p53 zavedení funkčního genu obnovuje kontrolu buněčného cyklu umožněním apoptické buněčné smrti indukované terapeutickými činidly. Podobně je stejně tak genová terapie aplikovatelná na jiné tumor potlačující geny, které mohou být použity bud samotné nebo v kombinaci s terapeutickými činidly pro kontrolu progrese buněčného cyklu tumorových buněk a/nebo indukci buněčné smrti.
Navíc mohou být použity v genově terapeutických postupech geny, které nekódují regulátorové proteiny buněčného cyklu, ale přímo indukují buněčnou smrt, jako jsou sebevražedné geny nebo geny, které jsou přímo toxické pro buňky, pro přímé odstranění progrese buněčného cyklu tumorových buněk.
Bez ohledu na to, který gen se použije pro reinstalaci řízení progrese buněčného cyklu, je racionální a praktická použitelnost tohoto přiblížení identická. Totiž dosažení vysokých účinností genového transferu k expresi terapeutických množství rekombinantního produktu. Volba toho, který vektor se použije k umožnění vysoké účinnosti genového transferu s minimálním rizikem pro pacienta, je proto důležitá pro úroveň úspěchu ošetření genovou terapií.
-2CZ 291372 B6
Existuje zde tedy potřeba vektorů a metod, které poskytují vysokou hladinu účinností genového transferu a proteinové exprese, které poskytují bezpečná a účinná ošetření genovou terapií. Předložený vynález naplňuje tuto potřebu a poskytuje s tím spojené výhody.
Podstata vynálezu
Předložený vynález poskytuje rekombinantní adenovirový expresní vektor, charakterizovaný parciální nebo úplnou delecí adenovirové protein IX DNA a mající gen, kódující cizí protein nebo funkční fragment nebo jeho mutant.
Předmětem vynálezu je rekombinantní adenovirový expresní vektor, zahrnující
a) inzert exogenní DNA, zahrnující gen kódující cizí protein, a
b) adenovirovou DNA, v níž byly vypuštěny všechny kódující sekvence Ela, Elb a proteinu IX a alespoň část E3.
Dále vynález zahrnuje farmaceutický přípravek na bázi tohoto vektoru a použití tohoto vektoru k přípravě farmaceutického prostředku.
Adenovirový vektor podle vynálezu může například obsahovat cizí gen pro expresi cyklu, jako je p53, Rb nebo mitosin, nebo v indukci buněčné smrti jako je podmiňovací sebevražedný gen thymidin kinázy. (Posledně uvedený musí být, aby byl účinný, použit ve spojení s metabolitem thymidin kinázy).
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr.l představuje rekombinantní adenovirový vektor podle předloženého vynálezu. Tento konstrukt byl sestaven jak je ukázáno na obr. 1. Výsledný vir nese 5 delecí adenovirových sekvencí rozkládající se od nukleotidu 356 do 4020 a eliminuje Ela a Elb geny, jakož i celou protein IX kódující sekvenci s ponecháním polyadenylačního místa stříhaného u Elb a pIX genů intaktního pro použití v terminační transkripci jakéhokoliv požadovaného genu.
Obr. 2 představuje aminokyselinovou sekvencí pl 10RB.
Obr. 3 představuje DNA sekvenci, kódující retinoblastomový tumor potlačující protein.
Obr. 4 představuje schematicky rekombinantní p53/adenovirus konstrukty v rozsahu tohoto vynálezu. p53 rekombinanty jsou založeny na Ad 5 a mají hlavu El regionu nukleotidů 360-3325 nahrazenou 1,4 kb plné délky p53 cDNA řízenou Ad 2 mlP (A/M/53) nebo lidskými CMV (A/C/53) promotory následovanou Ad 2 tripartitní leader cDNA. Kontrolní virus A/M má stejné Ad5 delece jako A/M/53 virus, ale postrádá 1,4 kf p53 cDNA inzert. Zbývající Elb sekvence (705 nukleotidů) byla deletována pro vytvoření protein IX deletovaných konstruktů A/M/N/53 a A/C/N/53. Tyto konstrukty také mají 1,9 kb Xba I deleci v adenovirus typ 5 regionu E3.
Obr. 5A a 5B představují p53 proteinovou expresi v nádorových buňkách infikovaných s A/M/53 a A/C/53. Obr. 5A) Saos-2 (osteosarkom) buňky byly infikovány uvedenými násobky infekce (MOI) bud s A/M/53 nebo A/C/53 čištěný virus a sklizeny o 24 hodin později. p53 protilátka pAb 1801 byla použita k vybarvení imunoblotů vzorků o stejných celkových koncentracích proteinů. Extrakty o stejné proteinové koncentraci nadměrně exprimující mutantní p53 protein, byly použity jako markér pro velikost p53. „O“ pod A/C/53 záhlavím indikuje falešnou infekci, obsahující neošetřený Saos-2 lyzát. Obr. 5B) Hep 3B (hepatobuněčný karcinom) buňky byly
-3CZ 291372 B6 indikovány s A/M/53 nebo A/C/53 virem při uvedené MOI a analyzovány jako v části A). Šipka označuje polohu p53 proteinu.
Obr. 6A až 6C ukazuje p53 závislou Saos-2 morfologickou změnu. Subkonfluentní (1*10 buněk/10 cm plotna) Saos-2 buňky buď nebyly infikovány (A), byly infikovány při MOI = 50 s (B) kontrolním A/M virem nebo (C) A/C/53 virem. Buňky byly fotografovány 72 hodin po infekci.
Obr. 7 představuje p53 závislou inhibici DNA syntézy v lidské nádorové buněčné linii u A/M/N/53 a A/C/N/53. Devět různých buněčných linií bylo infikováno bud kontrolním adenovirem (A/M(-x-x-), nebo p53 exprimujícím Α/Μ/Ν/53/-Δ-Δ -), nebo A/C/N/53 (-O-Q-) virem při zvyšujících se MOI jak je uvedeno. Typ nádoru a p53 status je poznamenán u každé buněčné linie (wt = standardní typ, nula = neexprimován žádný protein, mut = exprimován mutantní protein). Syntéza DNA byla měřena 72 h po infekci jak je popsáno dále v pokusu č. II. Výsledky jsou ze trojnásobných měření v každé dávce (průměr +/- SD, a jsou graficky vyjádřeny jako % média kontroly versus MOI. H69 buňky byly testovány pouze s AIM a A/M/N/53 virem.
Obr. 8 ukazuje tumorigenicitu p53 infikovaných Saos-2 buněk u holé myši. Saos-2 buňky byly infektovány bud s kontrolním A/M virem nebo p53 rekombinantním A/M/N/53 pří MOI = 30. Ošetřené buňky byly injektovány subkutánně do boků holých myší a rozměry nádoru byly měřeny (jak popsáno v pokusu č. II) dvakrát za týden po 8 týdnů. Výsledky jsou graficky vyjádřeny jako velikosti nádorů proti dnům po implantaci nádorových buněk jak pro kontrolní A/M (-X-X-) tak A/M/N/53 (-Δ-Δ-) ošetřené buňky. Čáry pro chybu představují průměrnou velikost nádoru = /-SEM pro každou skupinu 4 zvířat v každém časovém bodě.
Obr. 9 je exprese rAd/p53 RNA v ustavených nádorech. H69 (SCLC) buňky byly injektovány subkutánně do holé myši a tumory byly ponechány vyvinout po 32 dnů do dosažení velikosti přibližně 25-50 m3. Myši byly náhodně rozděleny a injektovány peritumorálně s 2 x 10 pfu bud kontrolního A/C/β- gal nebo A/C/53 viru. Nádory byly vyříznuty 2. a 7. den po injekci a póly ARNA byla připravena z každého nádorového vzorku. RT-PCR byla provedena za použití stejných RNA koncentrací a primerů specifických pro rekombinantní p53 mediátor. PCR amplikace byla 30 cyklů při 94 °C I min, 55 °C 1,5 min, 72 °C 2 min a 10 min 72 °C konečná prodlužovací perioda v Omnigen termálním cyklovači (Hybaid). Byly použity PCR primery 5'tripartitní leader cDNA (5'-CGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTC-3')a 3’ p53 primer (5-TTCTGGGAAGGGACAGAAGA-3'). Dráhy 1,2,4 a 5 jsou p53 ošetřené vzorky vyříznuté 2. den nebo 7 den jak je uvedeno. Dráhy 3 a 6 jsou z β-gal ošetřených nádorů. Dráhy 7,8 a 9 jsou repliky drah 4,5 a 6, amplifíkované aktin primery pro ověření stejné vsádky. Dráha 10 je pozitivní kontrola používající tripartitní/p53 obsahující plazmid.
Obr. 10A a 10B znázorňují in vivo nádorové potlačení a zvýšení v časech přežití s A/M/N/53. H69 (SCLC) nádorové buňky byly injektovány subkutánně do holé myši a ponechány 2 týdny vyvíjet. Peritumorální injekce buď samotného pufru---), kontroly A/M adenoviru (-x-x-) nebo
A/M/N/ (-Δ-Δ), obou virů (2x10 pfu/injekce) byly podávány dvakrát týdně po celkem 8 dávkách. Rozměry nádorů byly měřeny dvakrát týdně a objemy nádorů byly hodnoceny jak je popsáno v experimentu č. IIA). Velikost nádoru se graficky vynese pro každý virus proti času (dny) po inokulaci H69 buněk. Úsečky chyb označují průměrnou velikost nádoru (+/-SEM pro každou skupinu 5 zvířat). Šipky označují dny po virové injekci. B) Myši byly sledovány na přežití a graficky je vynesen podíl myší přežívajících ve skupině proti času po inokulaci pufrem samotným (- —), kontrola A/M (.........) nebo A/M/N/53 ( ) virem ošetřenými H69 buňkami.
Obr. 11A až 11C představují mapy rekombinantních plazmidových konstrukcí. Plazmidy byly konstruovány jak je podrobně popsáno dále. Tučné čáry v konstruktech označují zájmové geny, zatímco tučná písmena označují restrikční místa použitá ke generování fragmentů, které se budou vzájemně ligovat za vzniku následného plazmidu, jak je označeno šipkami. Na obr.JlA byl
-4CZ 291372 B6 plazmid pACNTK konstruován subklonováním HSV-TK genu z pMLBKTK (ATCC č. 39369) do polylinkeru klonovacího vektoru s následující izolací TK genu s požadovanými konci pro klonování do pACN vektoru. pACN vektor obsahuje adenovirové sekvence nutné pro in vivo rekombinaci ktomu, aby se vytvořil rekombinantní adenovirus (viz obr. 12). Na obr. 11B je uvedena konstrukce plazmidu pAANTK začínající sPCR amplifikovanými fragmenty, kódujícími &-fetoprotein enhancerovou (AFP-E) a promotorovou (APP-P) oblast subklonované několika stupni do konečného plazmidu, kde AFP enhancer a promotor jsou proti směru HSV-TK genu následovány adenovirus typ 2 sekvencemi nezbytnými pro in vivo rekombinaci k dosažení vzniku rekombinantního adenoviru. Na obr. 11C je uvedena konstrukce plazmidu pAANCAT začínající s izolací chloramfenikol-acetyltransferázového (CAT) genu z komerčně dostupného plazmidu a jeho subklonováním do pAAN plazmidu (viz výše), za vzniku konečného plazmidu pAANCAT, kde AFP enhancer/promotor řídí transkripci CAT genu v adenovirus sekvenčním základu.
Obr. 12 je schematická mapa rekombinantních adenoviru ACNTK, AANTK a AANCAT. Ke konstrukci rekombinantních adenovirů a plazmidů popsaných na obr. 11, se linearizují 4 díly (20 pg) velkého fragmentu Cil štěpeného rekombinantního adenovirů (rACp-gal), obsahujícího deleci E3 regionu (Wils a kol., 1994). Ve výsledných virech jsou Ad5 nukleotidy 360-4021 nahrazeny buď CMV promotorem a tripartitní leader cDNA (TPL) nebo a -fetoprotein enhancerem a promotorem (AFP) řídícím expresi HSV-1 TK) nebo CAT genu jak uvedeno. Výsledné rekombinantní adenoviry jsou označeny ACNTK, AANTK a AANCAT.
Obr. 13 představuje promotorovou specifitu CAT exprese v rekombinantních adenovirových vektorech. Dva (2)*106 označených buněčných linií se infikuje při MOI = 30 nebo 100 rekombinantního adenoviru AANCAT jak označeno nebo nalevo neinfikováno (UN). Hep G2 a Hep 3B buňky exprimují α-fetoprotein zatímco jiné buněčné linie ne. Po třech dnech se buňky sklidní, extraktové objemy se upraví na stejné proteinové koncentrace a měří se CAT aktivita, jak je popsáno dále v sekci Metody. Stejný počet neinfikovaných buněk slouží jako jednotlivé kontroly pro základní CAT aktivitu, zatímco I4C značený chloramfenikol (14C-pouze) a extrakt ze stabilní buněčné linie (B21), exprimující CAT aktivitu, slouží jako negativní a pozitivní kontroly. Procento konverze acetyl CoA je uvedeno, což demonstruje, že CAT exprese je omezena na ty buňky, které exprimují a -fetoprotein.
Obr. 14 představuje účinky TK/GCV ošetření na hepatocelulámí karcinomovou buněčnou linii a účinky promotorové specifity. Hep-G2 (AFP-pozitivní) a HLF (AFP negativní) buněčné linie byly infikovány přes noc pomocí ACNTK (-Δ-/, AANTK (-Δ-) nebo kontrolním ACN (--) virem v infekční multiplicitě 30 a následně ošetřeny jedinou dávkou gancicloviru v uvedených koncentracích. Buněčná proliferace byla hodnocena přídavkem 3H-thymidinu k buňkám přibližně 18 ho před sklizením. Inkorporace 3H-thymidinu do buněčné nukleové kyseliny byla měřena 72 hodin po infekci (Top Count, Packard) a vyjádřeny jako procenta (průměr +/- S.D.) neošetřené kontroly. Výsledky ukazují neselektivní dávkově závislou inhibici proliferace sCMV řízeným konstruktem, zatímco AFP řízený TK selektivně inhibuje Hep-G2.
Obr. 15 představuje cytotoxicitu ACNTK plus gancicloviru v HCC. HLF buňky byly infikovány při MOI 30 buď ACNTK (-·-) nebo kontrolní virus ACN (-□-) a ošetřeny ganciclovirem v uvedených dávkách. Sedmdesát dva (72) hodin po ošetření ganciclovirem se měří množství laktát-dehydrogenázy (LDH) uvolněné do buněčného supematantů kolorimetricky a vynese se do grafu (průměr +/- SEM) proti koncentraci gancicloviru pro dvě viry ošetřené skupiny.
Obr. 16A a 16B představují vliv ACNTK plus gancicloviru na ustavený hepatocelulámí karcinomové (HCC) tumoiy u holých myší. Jeden (l)x 107 Hep 3B buněk bylo injektováno subkutámě do boku samice holé myši a ponecháno růst 27 dní. Myši pak dostaly intratumorální a peritumorální injekce buď ACNTK (-·-) nebo kontrolního ACN (-□-) viru (1x10 m.j. ve 100 μΐ objemu) každý další den v celkem třech dávkách (označeno šipkami). Injekce gancicloviru (100 mg/kg) začaly 24 hodin po počáteční virové dávce a pokračovaly celkem 10 dnů. Na obr.
-5CZ 291372 B6
16A jsou graficky vyneseny velikosti tumorů proti každému viru proti dnům po infekci (průměr +/- SEM). Na obr. 16B je vynesena tělesná hmotnost pro každou virem ošetřenou skupinu zvířat jako průměr +/- SEM proti dnům po infekci.
Podrobný popis vynálezu
Pro snížení četnosti kontaminace standardním typem adenoviru je žádoucí zlepšit bud’ virovou nebo buněčnou linii pro snížení pravděpodobnosti rekombinace. Například adenovirus ze skupiny s nízkou homologii ke skupině C virů by mohl být použit k vytvoření rekombinantních virů s malým sklonem krekombinaci sAd5 sekvencemi ve 293 buňkách. Nicméně alternativně snadnějším prostředkem k redukci je zvýšení velikosti delece v rekombinantním viru a tím redukce rozsahu podílu sekvence mezi ní a Ad5 geny ve 293 buňkách.
Delece, které zasahují po 3,5 kb od 5' konce adenovirového genomu napodobují gen pro adenovirální protein a nejsou považovány za žádoucí v adenovirálních vektorech (viz dále).
Protein IX gen adenoviru kóduje minoritní složku vnějšího adenovirového kapsidu, který stabilizuje skupinu devíti hexonů, které tvoří majoritu virového kapsidu (Stewart (1993)). Podle studie adenovirus delečních mutantů, protein IX byl na začátku považován za nepodstatnou složku adenoviru, ačkoliv jeho nepřítomnost byla spojena s větší tepelnou labilitou, než byla pozorována se standardním typem viru (Colby a Shenk (1991)). V nedávné době bylo objeveno, že protein IX je podstatný pro uzavření plné délky virové DNA do kapsidu a že v nepřítomnosti proteinu IX by pouze genomy o alespoň 1 kb menší než standardního typu mohly být propagovány jako rekombinantní viry (Ghosh-Choudhury a spol. (1987)). Vzhledem k tomuto uzavíracímu omezení protein IX delece záměrně nebyly uvažovány ve vytváření adenovirálních vektorů.
V tomto popisu je odkazováno na standardní učebnice molekulární biologie, které obsahují definice, metody a prostředky pro provedení základních technik, zahrnutých v předloženém vynálezu. Viz např. Sambrook a spol. (1989) a různé tam citované odkazy. Tyto odkazy a citované publikace jsou úmyslně zahrnuty v tomto popisu odkazem.
Na rozdíl od známého stavu techniky nárokuje předložený vynález použití rekombinantních adenovirů, nesoucích delece protein IX genu jako prostředek pro snížení rizika kontaminace standardním typem adenovirů ve virových přípravcích pro použití v diagnostických a terapeutických aplikacích jako je genová terapie. Jak je zde použito, je výraz „rekombinant“ míněn jako potomstvo vytvořené jako výsledek genového inženýrství. Tyto delece mohou odstranit dalších 500 až 700 párů bází DNA sekvence, která je přítomna v konvenčních El deletovaných virech (menší, méně žádoucí, delece částí pIX genu jsou možné a jsou zahrnuty v rozsahu tohoto vynálezu) a je dostupná pro rekombinaci s Ad5 sekvencemi integrovanými ve 293 buňkách. Rekombinantní adenoviry založené na jakékoliv skupině C viru, serotyp 1,2,5 a 6 jsou zahrnuty v tomto vynálezu. Také je v tomto vynálezu zahrnut hybrid Ad2/Ad5 na bázi rekombinantního viru, exprimujícího lidskou p53 cDNA zadenovir. typ 2 hlavního pozdního promotoru. Tento konstrukt je sestaven jak je uvedeno na obr. 1. Výsledný virus nese 5Δ deleci adenovirové sekvence rozkládající se od asi nukleotidu 357 do 4020 a eliminující Ela a Elb geny jakož i celý protein IX kódující sekvenci, činící polyadenylační místo podílející se na Elb a protein IX genech intaktní pro použití v terminační transkripci jakékoliv požadovaného genu. Provedení je znázorněno na obrázku 4. Alternativně může být delece rozšířena na dalších 30 až 40 párů bází bez ovlivnění sousedního genu pro protein IVa2, i když v tomto případě je exogenní polyadenylační signál poskytnut pro ukončení transkriptu genu inzertovaného do rekombinantního viru. Počáteční virus konstruovaný s těmito delecemi je snadno propagován ve 293 buňkách s řádnou zřejmou kontaminací standardního typu a řídí robustní p53 expresi z transkripční jednotky inzertované na místo delece.
-6CZ 291372 B6
Inzertní kapacita rekombinantních virů, nesoucích protein IX deleci popsanou výše, je přibližně 2,6 kb. Toto je dostačující pro mnoho genů, obsahujících p53 cDNA. Inzertní kapacita může být zvýšena zavedením jiných deleci do adenovirálního řetězce, například deleci v časných regionech 3 nebo 4 (viz Graham a Prevec (1991)). Například použití adenovirového řetězce, obsahujícího 1,9 kb deleci nepodstatné sekvence včasném regionu 3. S touto další deleci je inzertní kapacita vektoru zvýšena o přibližně 4,5 kb, což je dosti velké i pro mnoho větších cDNA včetně těch z retinoblastomového tumor supresorového genu.
Rekombinantní adenovirus expresní vektor charakterizovaný parciální nebo celkovou deleci adenovirové proteinové IX DNA a mající gen kódující cizí protein, nebo jeho funkční fragment nebo mutant, je poskytnut předloženým vynálezem. Tyto vektory jsou použitelné pro bezpečnou rekombinantní produkci diagnostických a terapeutických polypeptidů a proteinů a, co je důležitější, pro zavedení genů v genové terapii. Tak, například, může adenovirální vektor podle tohoto vynálezu obsahovat cizí gen pro expresi proteinu účinného v regulaci buněčného cyklu, jako je p53, Rb nebo mitosin nebo v indukci buněčné smrti jako je podmínění sebevražedný gen thymidin kinázy. (Posledně uvedený musí být použit ve spojení sthymidin kinázovým metabolitem proto, aby byl účinný). Jakákoliv expresní kazeta může být použita ve vektorech podle vynálezu. „Expresní kazeta“ znamená DNA molekulu, mající transkripční promotor/enhancer jako je CMV promotor enhancer, atd., cizí gen, a v některých dále definovaných provedeních, polyadenylační signál. Výraz „cizí gen“ zde používaný, označuje DNA molekulu nepřítomnou v exaktní orientaci a poloze jako partnera DNA molekuly nalezené ve standardním typu adenoviru. Cizí gen je DNA molekula s až 4,5 kilobázemi. „Expresní vektor“ znamená vektor, který vede k expresi inzertovaných DNA sekvencí, je-li propagován ve vhodné hostitelské buňce, tj. protein nebo polypeptid kódovaný DNA je syntetizován hostitelským systémem. Rekombinantní adenovirus expresní vektor může obsahovat část genu, kódujícího adenovirus protein IX, s podmínkou, že biologicky aktivní protein IX nebo jeho fragment není produkován. Příkladem takového vektoru je expresní vektor, mající restrikční enzymovou mapu na obr. 1 nebo 4.
V adenovirovém vektoru podle tohoto vynálezu mohou být také použity indukovatelné promotory. Tyto promotory budou iniciovat transkripci pouze za přítomnosti další molekuly. Příklady indukovatelných promotorů zahrnují ty, které jsou připravitelné z β-interferon genu, genu tepelného šoku, metallothioninový gen nebo ty geny, které jsou získatelné z genů, odpovídajících na steroidní hormony. Tkáňově specifická exprese byla dobře charakterizována v oblasti genové exprese a tkáňově specifické a indukovatelné promotory, jako jsou tyto, jsou v oboru dobře známé. Tyto geny jsou použity pro regulaci exprese cizího genu poté, co byl zaveden do cílové buňky.
Tento vynález také poskytuje rekombinantní adenovirus expresní vektor, jak je popsán výše, mající méně rozsáhlé delece protein IX genové sekvence, rozkládající se od 3500 bp od 5' virálního konce do přibližně 4000 bp, v jednom provedení. Ve zvláštním provedení může mít rekombinantní adenovirus expresní vektor další deleci nepodstatné DNA sekvence v adenovirovém časovém regionu 3 a/nebo 4 a/nebo deleci DNA sekvencí označených adenovirus Ela a Elb. V tomto provedení je cizí gen DNA molekula velikosti až 4,5 kilobází.
Další provedení má deleci až čtyřiceti nukleotidů umístěných 3’ k Ela a Elb deleci a pIX a cizí DNA molekulu kódující polyadenylační signál inzertovaný do rekombinantního vektoru v poloze vztažené k cizímu genu k regulaci exprese cizího genu.
Pro účely tohoto vynálezu může být rekombinantní adenovirus expresní vektor odvozen od standardní skupiny adenoviru, serotyp 1, 2, 5 nebo 6.
V jednom provedení má rekombinantní adenovirus expresní vektor cizí gen, kódující funkční nádorově supresorový protein, nebo jeho biologicky aktivní fragment. Jak je zde použito, výraz „funkční“ pokud je vztažen k nádorově supresorovému genu, označuje nádorově supresorové
-7CZ 291372 B6 geny, které účinně inhibují buňky od toho, aby se chovaly jako nádorové buňky. Funkční geny mohou například zahrnovat standardní typ normálního genu a modifikace normálních genů, které si uchovávají jejich schopnost kódovat účinné nádorové supresorové proteiny a jiné protinádorové geny jako je podmíněný sebevražedný protein nebo toxin.
Podobně „nefunkční“ jak je zde použito, je synonymem s „neaktivovaný“. Nefunkční nebo defektní geny mohou působit mnoho dějů, zahrnujících například bodové mutace, delece, methylace a jiné známé odborníkům v oboru.
„Aktivní fragment“ genu, jak je zde užíváno, zahrnuje menší části genu, které si udržují schopnost kódovat proteiny, mající nádor potlačující aktivitu, p 56^ popsaný podrobněji dále je ale jedním z příkladů aktivního fragmentu funkčního nádorového supresor genu. Modifikace nádorových supresor genů jsou také zahrnuty pod označení aktivní fragment, ať se jedná o adice, delece nebo substituce, pokud je zachována funkční aktivita nemodifikovaného genu.
Další příklad nádorového - supresor genu je retinoblastom (RB). Kompletní RB cDNA nukleotidové sekvence a předpovězené aminokyselinové sekvence výsledného RB proteinu (označení p HO8®) jsou uvedeny v práci Lee-a a spol. (1987) a na obr. 3. Vhodná pro expresi retinoblastom nádorového supresor proteinu je také DNA molekula, kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 2 nebo mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 3. Vhodná je také zkrácená verze p 110RB nazvaná p 56^. Sekvence p 56RB viz Huang a spol. (1991). Další nádorové supresor geny mohou být použity ve vektorech podle tohoto vynálezu. Pouze pro ilustraci, může jimi být p!6 protein (Kamb a spol. (1994)/, p21 protein, WT1 protein Wilmova nádoru, mitosin, h-NUC, nebo DCC protein karcinomu kolonu. Mitosin je popsán v X.Lhu a W-H Lee, US přihláška č. 08/141239, podaná 22. října 1993, a v jejím pokračování od stejných autorů, značka autorů P-CJ 1191, podaném 24. října 1994, obě práce jsou zde zahrnuty jako odkazy. Podobně je h-NUC popsán v práci W-H Lee a P-L Chen, US přihláška č. 08/170586, podaná 20. prosince 1993, zahrnuté zde jako odkaz.
Jak je známo odborníkům v oboru, výraz „protein“ znamená lineární polymer aminokyselin spojených do specifické sekvence peptidovými vazbami. Jak je zde použit, znamená výraz „aminokyselina“ buď D nebo L stereoizomemí farmen aminokyseliny, pokud není specificky označena. V rozsahu tohoto vynálezu jsou ekvivalentní proteiny nebo ekvivalentní peptidy, např. mající biologickou aktivitu čištěného standardního typu nádorového supresor proteinu. „Ekvivalentní proteiny“ a „ekvivalentní polypeptidy“ označují sloučeniny, které se odlišují od lineární sekvence přirozeně se vyskytujících proteinů nebo polypeptidů, ale které mají aminokyselinové substituce, které nemění jejich biologickou aktivitu. Tyto ekvivalenty se mohou lišit od nativních sekvencí nahrazením jedné nebo více aminokyselin příbuznými aminokyselinami, například podobně nabitými aminokyselinami nebo substituci nebo modifikací vedlejších řetězců nebo funkčních skupin.
V definici funkčního nádorového supresor proteinu je zahrnut jakýkoliv protein, jehož přítomnost redukuje tumorigenicitu, malignantnost nebo hyperproliferativní fenotyp hostitelské buňky. Příklady nádorových supresor proteinů v této definici zahrnují, ale nejsou tak omezeny pl 10RB, p56RB, mitosin, h-NUC a p53. „Tumorigenicita“ je míněna jako prostředek, mající schopnost tvořit nádory nebo být schopen vyvolat tvorbu nádoru a je synonymem neoplastického růstu. „Malignantnost“ je míněna jako popisující tumorigenicitu buňky, mající schopnost metastázovat a ohrožovat život hostitelského organizmu. „Hyperproliferativní fenotyp“ je zamýšlen k popsání buněčného růstu a dělení při rychlosti za normálními mezemi růstu pro tento buněčný typ. „Neoplastický“ také zahrnuje buňky, postrádající endogenní funkční nádorový supresor protein nebo neschopnost buňky exprimovat endogenní nukleokyselinu, kódující funkční nádorový supresor protein.
-8CZ 291372 B6
Příkladem vektoru podle tohoto vynálezu je rekombinantní adenovirus expresní vektor, mající cizí gen, kódující p53 protein nebo jeho aktivní protein, poskytnutý tímto vynálezem. Kódující sekvence p53 genu je uvedena dále v tabulce I.
TABULKA 1
V*SHR PGSR* LLGSG DTLRS GWERA FHDGD TLPWI GSQTA FRVTA MEEPQ
100
SDPSV EPPLS QETFS DLWKL LPENN VLSPL PSQAM DDLML SPDDI EQWFT
150
EDPGP DEAPR MPEAA PPVAP ΑΡΑΑΡ ΤΡΆΑΡ APAPS WPLSS SVPSQ KTYQG 200
SYGFR LGFLH SGTAK SVTCT YSPAL NKMFC QLAKT CPVQL WVDST PPPGT
250
RVRAM AIYKQ SQHMT EWRR CPHHE RCSDS DGLAP PQHLI RVEGN LRVEY
300
LDDRN TFRHS VWPY EPPEV GSDCT TIHYN YMCNS SCMGG MNRRP ILTII
350
TLEDS SGNLL GRNSF EVRVC ACPGR DRRTE EENLR KKGEP HHELP PGSTK
400
RALPN NTSSS PQPKK KPLDG EYFTL QIRGR ERFEM FRELN EALEL KDAQA
GKEPG GSRAH SSHLK SKKGQ STSRH KKLMF KTEGP DSD* *Stop kodon
Jakékoliv ze zde popsaných vektorů jsou vhodné jako kompozice pro diagnózu nebo terapii.Vektory mohou být použity pro screening, které z mnoha nádorových supresor genů by mohly být použitelné v genové terapii. Například vzorek buněk, považovaných za neoplastické, může být odstraněn ze subjektu a savce. Buňky mohou pak být kontaktovány za vhodných podmínek a s účinným množstvím rekombinantního vektoru podle tohoto vynálezu, majícího 10 v sobě inzertovaný cizí gen, kódující jeden z některých funkčních nádorových supresor genů. Jak bude zavedení tohoto genu obracet maligní fenotyp, může být měřeno tvorbou kolonií v měkkém agaru nebo tvorbou nádorů u holé myši. Je-li obrácen maligní fenotyp, je potom cizí gen uznán jako pozitivní kandidát pro úspěšnou genovou terapii pro subjekt nebo savce. Jsou-li užity farmaceuticky, mohou být kombinovány s jedním nebo více farmaceutickými nosiči. Farmaceu15 tické nosiče jsou v oboru dobře známé a zahrnují vodné roztoky jako jsou fyziologické pufrované solné roztoky nebo jiná rozpouštědla nebo vehikula jako jsou glykoly, glycerin, rostlinné oleje
-9CZ 291372 B6 (např. olivový olej) nebo injektovatelné organické estery. Farmaceuticky přijatelný nosič může být použit pro podání instantní kompozice k buňce in vitro nebo subjektu in vivo.
Farmaceuticky přijatelný nosič může obsahovat fyziologicky přijatelnou sloučeninu, která působí, například, stabilizaci kompozice nebo zvýšení nebo snížení absorpce činidla. Fyziologicky přijatelná sloučenina může zahrnovat, například, cukry jako je glukóza, sacharóza, nebo dextrany, antioxidanty, jako je kyselina askorbová nebo glutathion, chelatační činidla, proteiny s nízkou molekulovou hmotností nebo jiné stabilizátory nebo přísady. Jiné fyziologicky přijatelné sloučeniny zahrnují smáčecí činidla, emulgační činidla, dispergační činidla nebo chránící činidla, která jsou zvláště vhodná pro prevenci růstu nebo působení mikroorganizmů. Různé chránící látky jsou dobře známé a například zahrnují fenol a kyselinu askorbovou. Odborníkovi v oboru je zřejmé, že volba farmaceuticky přijatelného nosiče, zahrnujícího fyziologicky přijatelnou sloučeninu, závisí například na způsobu podání polypeptidu a konkrétních fyzikálně -chemických charakteristikách specifického polypeptidu. Například je fyziologicky přijatelná sloučenina, jako je monostearát hlinitý nebo želatina, zvláště vhodná jako zpožďující činidlo, které prodlužuje rychlost absorpce farmaceutické kompozice podávané subjektu. Další příklady nosičů, stabilizátorů nebo přísad, mohou být nalezeny v Martin, Remingtoďs Pharm. Sci., 15. vyd. (Mack, Co., Easton, 1975), zahrnutém zde jako odkaz. Farmaceutická kompozice může být také inkorporována, je-li to žádoucí, do liposomů, mikrosfér nebo jiných polymemích matric (Gregoriadis, Liposome Technology, Sv. 1 (CBC Press, Boča Raton, Florida 1984), zahrnuto zde jako odkaz). Liposomy, například, které tvoří fosfolipidy nebo jiné lipidy, jsou netoxické, fyziologicky přijatelné a metabolizovatelné nosiče, které je velmi snadné vyrobit a podávat.
„Farmaceutická kompozice“ jak je zde užíváno, označuje jakékoliv kompozice látky zde popsané v kombinaci s jedním nebo více z výše uvedených farmaceuticky přijatelných nosičů. Kompozice mohou být podávány terapeuticky nebo profylakticky. Mohou být kontaktovány s hostitelskou buňkou in vivo, ex vivo, nebo in vitro, v účinném množství. Podmínky kontaktování in vitro a ex vivo hostitelských buněk jsou uvedeny dále. Pracuje-li se in vivo, metody podávání léčiva, obsahujícího vektor podle předloženého vynálezu, jsou dobře známé v oboru a zahrnují, ale nejsou tak omezeny, podání orální, intratumorální, intravenózní, intramuskulární nebo intraperitoneální. Podání může být prováděno kontinuálně nebo přerušovaně a bude se měnit podle léčebného subjektu a podmínek, např. jako v případě jiných terapeutických kompozic (Laudmann a spol. (1992), Aulitzky a spol. (1991), Lantz a spol., (1990), Supersaxo a spol. (1988), Demetri a spol. (1989) a Le Maistre a spol. (1991).
Tento vynález dále poskytuje transformovanou prokaryotickou nebo eukaryotickou hostitelskou buňku, například živočišnou buňku nebo savčí buňku, mající inzertovaný rekombinantní adenovirus expresní vektor popsaný výše. Vhodné prokaryotické buňky zahrnují, ale nejsou tak omezeny, bakteriální buňky jako jsou E.coli buňky. Způsoby transformace hostitelských buněk retrovirálními vektory jsou v oboru známé, viz Sambrook a spol. (1989) a zahrnují, ale nejsou omezeny, transfekcí, elektroporaci a mikroinjektaci.
V tomto vynálezu je výraz živočich míněn jako synonymum k výrazu savec a zahrnuje, ale není tak omezen, hovězí dobytek, vepře, kočky, opice, psy, koně, myši, krysy a lidi. Další hostitelské buňky zahrnují, ale nejsou tak omezeny, jakékoliv neoplastické nebo nádorové buňky jako je osteosarkom, karcinom vaječníků, rakovina prsu, melanom, hepatokarcinom, rakovina plic, rakovina mozku, kolorektální rakovina, hematopoietická buňka, rakovina prostaty, cervikální rakovina, retinoblastom, rakovina esofágu, rakovina měchýře, neuroblastom nebo renální rakovina.
Dále je jako hostitel pro tento vektor vhodná jakákoliv eukaryotická buněčná linie, exprimující Ela a Elb nebo Ela, Elb a pí. V jednom provedení je vhodnou eukaryotickou hostitelskou linií 293 buněčná linie dostupná z Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20231.
-10CZ 291372 B6
Jakékoliv z transformovaných hostitelských buněk zde popsaných jsou vhodné jako kompozice pro diagnózu nebo terapii. Při farmaceutickém použití jsou kombinovány s různými farmaceutický' přijatelnými nosiči. Vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče jsou známé v oboru odborníkům a jsou například popsány výše. Kompozice může pak být podávána terapeuticky nebo profylakticky, v účinných množstvích, která jsou podrobněji popsána dále.
Předložený vynález také poskytuje způsob transformace hostitelské buňky. Tento způsob poskytuje kontaktování hostitelské buňky, tj. prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky, s jakýmkoliv z expresních vektorů zde popsaných a za vhodných podmínek. Hostitelské buňky transformované touto metodou jsou rovněž nárokovány v rozsahu tohoto vynálezu. Kontaktování může být provedeno in vitro, in vivo nebo ex vivo za použití metod dobře známých v oboru (Sambrook a spol. (1989)) a za použití účinných množství expresních vektorů. Tento vynález také poskytuje způsob produkce rekombinantního proteinu nebo polypeptidů při růstu transformované hostitelské buňky za vhodných podmínek pro transkripci a translaci inzertovaného cizího genu. Metody rekombinantní exprese v různých hostitelských buňkách, jako jsou savčí, kvasinkové, hmyzí nebo bakteriální buňky jsou dobře známé a zahrnují ty, které jsou popsány v práci Sambrooka a spol., supra. Translatovaný cizí gen může být pak izolován běžnými způsoby, jako je čistění na sloupci nebo čistění za použití antiproteinové protilátky. Izolovaný protein nebo polypeptid rovněž spadá do rozsahu tohoto vynálezu. Čištěný nebo izolovaný (jak je zde použito) znamená v podstatě prostý nativních proteinů nebo nukleových kyselin normálně spojených s proteinem nebo polypeptidem v nativním prostředí nebo v prostředí hostitelské buňky.
Tento vynález také poskytuje živočichy, kterými nejsou lidé, mající v sobě inzertované vektory nebo transformované hostitelské buňky podle vynálezu. Tito „transgeničtí“ živočichové byli připraveni použitím metod dobře známých v oboru odborníkům, například jak je popsáno v US patentu č. 5 175 384 nebo běžně ex vivo terapeutickými technikami, jak popsal Culver a spol. (1991).
Jak je podrobněji popsáno dále, rekombinantní adenoviry exprimující nádorově supresorový standardní typ p53, jak je popsáno výše, mohou účinně inhibovat DNA syntézu a potlačovat růst širokého rozmezí typů lidských nádorových buněk, zahrnujících klinické cíle. Dále mohou rekombinantní adenoviry exprimovat nádorově supresorové geny jako je p53 v in vivo se vyskytujícím nádoru bez provedení přímého injektování do nádoru nebo před ex vivo ošetřením rakovinových buněk. Exprimovaný p53 je funkční a účinně potlačuje růst nádoru in vivo a významně zvyšuje dobu přežití u modelu lidské plicní rakoviny holé myši.
Vektory podle vynálezu jsou zvláště vhodné pro genovou terapii. V souladu s tím jsou metody genové terapie, používající tyto vektoiy v rozsahu tohoto vynálezu. Vektor se čistí a pak se podává účinné množství in vivo nebo ex vivo do subjektu. Způsoby genové terapie jsou dobře známé v oboru, viz např. Larrick J.W. a Burek K.L. (1991) a Kreigler M. (1990). „Subjektem“ je míněn jakýkoliv živočich, savec, krysa, myš, hovězí dobytek, vepř, kůň, králík, kočka nebo lidský pacient. Jestliže cizí gen kóduje nádorově supresorový gen nebo jiný protinádorový protein, používá se vektor pro ošetření nebo redukci hyperproliferativních buněk v subjektu, pro inhibici nádorové proliferace v subjektu nebo ke zmírnění určité stím spojené patologie. Patologické hyperproliferativní buňky jsou charakteristické pro následující chorobné stavy, thyroidní hyperplasii-Graveova choroba, psoriasis, benigní prostatická hypertrofie, Li-Fraumeni syndrom, zahrnující rakovinu prsu, sarkomy a jiné neoplazmy, rakovinu měchýře, rakovinu kolonu, rakovinu plic, různé leukemie a lymfomy. Příklady nepatologických hyperproliferativních buněk je možno například nalézt v savčích duktálních epitel iálních buňkách během vývoje laktace a také v buňkách spojených s hojením ran. Patologické hyperproliferativní buňky charakteristicky vykazují ztrátu kontaktní inhibice a úbytek své schopnosti selektivně adherovat, což zahrnuje změnu v povrchových vlastnostech buňky a další průlom v intercelulámí komunikaci. Tyto změny zahrnují stimulaci k rozdělení a schopnosti sekretovat proteolytické enzymy.
-11 CZ 291372 B6
Navíc se předložený vynález týká způsobu deplece vhodného vzorku patologických savčích hyperproliferativních buněk, kontaminujících heraatopoietické prekurzory během rekonstituce kostní dřeně přes zavedení standardního typu nádorového supresor genu do buněčného přípravku za použití vektoru podle tohoto vynálezu (získaného z autologní krve nebo kostní dřeně). Jak je zde použit, „vhodný vzorek“ je definován jako heterogenní buněčný přípravek získaný z pacienta, např. směsná populace buněk, obsahujících jak fenotypicky normální, tak patogenní buňky. „Podání“ zahrnuje, ale není omezeno, zavedení do buňky nebo subjektu intravenózně, přímou injekcí do nádoru, intranádorovou injekcí, intraperitoneálním podáním, aerosolovým podáním do plic nebo topicky. Takové podání může být spojeno s farmaceuticky přijatelným nosičem popsaným výše.
Výrazem „redukovaná tumorigenicita“ je míněno to, že nádorové buňky byly převedeny na méně tumorigenní nebo netumorigenní buňky. Buňky s redukovanou tumorigenicitou bud netvoří nádory in vivo nebo mají prodlouženou lag dobu týdny až měsíce před objevením se in vivo nádorového růstu a/nebo zpomalení růstu trojrozměrné nádorové hmoty ve srovnání s nádory, majícími plně inaktivovaný nebo nefunkčně nádorově supresorový gen.
Jak je zde použit znamená výraz „účinné množství“ množství vektoru nebo protirakovinového proteinu, kterým se dosáhne pozitivní kontroly buněčné proliferace. Například jedna dávka obsahuje od asi 108 do asi 10 3 infekčních jednotek. Typický průběh léčení by měl zahrnovat jednu takovou dávku denně po pět dnů. Účinné množství se bude měnit podle patologie nebo léčeného stavu, pacienta a jeho stavu a jiných faktorů, dobře známých odborníkům v oboru. Účinná množství odborník v oboru snadno stanoví.
V rozsahu tohoto vynálezu je způsob zmírnění patologie vyznačené hyperproliferativními buňkami nebo genetickým defektem u subjektu podáním subjektu účinného množství vektoru popsaného výše, obsahujícího cizí gen, kódující genový produkt, mající schopnost zmírňovat patologii, za vhodných podmínek. Jak je zde použito, výraz „genetický defekt“ znamená jakoukoliv chorobu nebo abnormalitu, která vzniká z inheritních faktorů, jako je anemie srpkovitých buněk nebo Tay-Sachsova choroba.
Tento vynález také poskytuje metodu pro redukci proliferace nádorových buněk v subjektu zavedením účinného množství adenovirálního, expresního vektoru, obsahujícího protinádorový gen jiný než nádorový supresor gen, do hmoty nádoru. Protinádorový gen může kódovat například thymidin kinázu (TK). Subjektu se pak podává účinné množství terapeutického činidla, které je za přítomnosti protinádorového genu toxické k buňce. Ve specifickém případě thymidin kinázy je terapeutickým činidlem metabolit thymidin kinázy jako je ganciclovir (GCV), 6-methoxypurin arabinonukleosid (araM) nebo jejich funkční ekvivalent. Jak thymidin kinázový gen tak thymidin kinázový metabolit musí být použity současně proto, aby byly pro hostitelskou buňku toxické. Nicméně v jejich přítomnosti je GCV fosforylován a stává se potentním inhibitorem DNA syntézy zatímco araM se konvertuje na cytotoxický anabolit araATP. Jiné protinádorové geny mohou být použity i v kombinaci s odpovídajícím terapeutickým činidlem pro snížení proliferace nádorových buněk. Takové kombinace jiného genu a terapeutického činidla jsou známé odborníkům v oboru. Dalším příkladem by mohl být vektor podle vynálezu, exprimující enzym cytosin deaminázu. Takový vektor by mohl být použit ve spojení s podáním léčiva 5-fluoracilu (Austin a Huber, 1993) nebo v poslední době popsaný E.Coli Deo A gen v kombinaci se 6-methyl-purin-2'-<leosribonukleosidem (Sorscher a spol. 1994).
Jako u použití nádorových supresor genů popsaných dříve, použití jiných protinádorových genů, buď samotných nebo v kombinaci s vhodným terapeutickým činidlem, poskytuje léčení nekontrolovaného buněčného růstu nebo proliferace charakteristických pro nádory a malignance. Vynález tak poskytuje terapii pro ukončení nekontrolovaného buněčného růstu u pacienta a tím odstranění symptomů choroby nebo kachecie přítomné u pacienta. Účinek tohoto léčení zahrnuje, ale není tak omezen, prodlouženou dobu přežití pacienta, redukci nádorové hmoty nebo obtíží,
-12CZ 291372 B6 apoptosis nádorových buněk nebo redukci počtu cirkulujících nádorových buněk. Prostředky ke kvantifikaci přínosných účinků této terapie jsou dobře známé odborníkům v oboru.
Vynález poskytuje rekombinantní adenovirui expresní vektor, charakterizovaný částečnou nebo úplnou delecí adenovirální protein IX DNA a mající cizí gen, kódující cizí protein, kde cizím genem je sebevražedný gen nebo jeho funkční ekvivalent. Protirakovinový gen TK popsaný výše je příkladem sebevražedného genu, protože, je-li exprimován, genový produkt je, nebo se může stát, letálním k buňce. U TX je letabilita indukována přítomností GCV. TK gen je odvozen z herpes simplex viru metodami dobře známými odborníkům v oboru. Plazmid pMLBKTK vE.coli HB101 (z ATCC č. 39369) je zdrojem herpes simplex virus (HSV-1) thymidin kinázového (TK) genu pro použití v tomto vynálezu. Avšak existuje i mnoho jiných zdrojů.
TK gen může být zaveden do nádorové hmoty kombinací adenovirálního expresního vektoru s vhodným farmaceuticky přijatelným nosičem. Zavedení může být například provedeno přímou injekcí rekombinantního adenoviru do nádorové hmoty. Ve specifickém případu rakoviny jako je hepatocelulámí rakovina (HCC), může být použita pro doručení přímá injekce do hepatické arterie, protože většina HCC odvozuje svoji cirkulaci z této arterie. Pro kontrolu proliferace nádoru je buněčná smrt indukována ošetřením pacientů s TK metabolitera jako je ganciclovir k dosažení redukce nádorové hmoty. TK metabolit může být podáván například systémově, místní inokulaci do nádoru nebo ve specifickém případě HCC, injekcí do hepatické arterie. TK metabolit je výhodně podáván alespoň jednou denně, ale může to být vícekrát denně nebo méněkrát podle potřeby. TK metabolit může být podáván současně nebo následně k podání TK obsahujícího vektoru. Odborníkům v oboru bude známé nebo mohou stanovit dávku a trvání, které je terapeuticky účinné.
Způsob nádorově specifického doručení nádorově supresor genu se provádí kontaktováním cílové tkáně živočicha účinným množstvím rekombinantního adenovirálního expresního vektoru podle tohoto vynálezu. Gen je zamýšlen ke kódování protinádorového činidla jako je funkční nádorově supresorový gen nebo sebevražedný gen. „Kontaktováním“ je míněna jakákoliv doručovací metoda pro účinný transfer vektoru, jako je intranádorová injekce.
Použití adenovirálního vektoru podle tohoto vynálezu pro přípravu léčiv pro léčení choroby nebo pro terapii poskytuje dále tento vynález.
Následující příklady jsou míněny k ilustrování, ne k omezení rozsahu tohoto vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Pokus č.1
Plazmid pAd/MLP/p53/Elb byl použit jako výchozí materiál pro tyto manipulace. Tento plazmid je založen na pBR322 derivátu pML2 (pBR322 deletovaný v bázových párech 1 140 až 2 490) a obsahuje adenovirus typ 5 sekvence, zasahující od bázového páru 1 k bázovému páru 5 788 s tím rozdílem, že jsou deletovaný bázové páry 357 až 3 327 adenovirus typu 5. Na místě Ad5 357/3327 dalece je inzertovana transkripční jednotka, která zahrnuje adenovirus typ 2 hlavní pozdní promotor, adenovirus typ 2 tripartitní leader c DNA a lidskou p53 cDNA. Typický El náhradový vektor je deletován u Ad5 Ela a Elb genů, ale obsahuje Ad5 protein IX gen (přehled adenovirových vektorů viz: Graham a Prevec (1992). Ad2 DNA byla získána od Gibco BRL. Restrikční endonukleázy a T4 DNA ligázy byly získány od New England Biolabs. E.coli DH5a kompetentní buňky byly zakoupeny u Gibco BRL a 293 buňky byly získány od Američan Type Culture Collection (ATCC). Prep-A-Gene DNA čistící pryskyřice byla získána od BioRad. LB půdní bakteriální růstové médium bylo získáno od Difco. Quiagen DNA Čistící kolony byly
-13CZ 291372 B6 získány od Quiagen lne. Ad5 d!327 byly získány od R. J. Schneidera, NYU.MBS DNA transfekční kit byl získán od Stratagene.
Jeden (1) pg p Ad/MLP/p53/Elb - byl štěpen se 20 jednotkami každého z restrikčních enzymů 5 Ecl 136II a NgoMI podle doporučení výrobce. Restrikční štěpení byla vložena do oddělených drah na 0,8 % agarózovém gelu a elektroforezována 2 hodiny při 100 voltech. 4 268 bp restrikční fragment z Pad/MLP/p53/Elb-vzorku a 6 437 bp fragment z Ad2 vzorku byly izolovány z gelu za použití Prep-A-gene DNA extrakční pryskyřice podle specifikací výrobce. Restrikční fragmenty byly smíšeny a zpracovány sT4 DNA ligázou v celkovém objemu 50μ1 při 16 °C po 16 hodin ío podle návodu výrobce. Po ligaci 5μ1 reakční směsi bylo použito ke transformování E.coli DH5a buněk k ampicilinové rezistenci podle postupu výrobce. Šest bakteriálních kolonií vzniklých z tohoto postupu bylo použito k inokulaci 2 ml kultur LB růstového media a inkubováno přes noc při 37 °C za třepáni. DNA byla připravena z každé bakteriální kultury za použití standardních postupů (Sambrook a spol.(1989)). Čtvrtina plazmidové DNA z každého izolátů byla štěpena 15 20 jednotkami restrikční endonukleázy Xhol ke screeningu správného rekombinantu, obsahujícího Xhol restrikční fragmenty 3627, 3167, 2466 a 1445 bázových párů. Pět ze šesti screenovaných izolátů obsahuje správný plazmid. Jeden z nich byl použit k inokulaci 1 litru kultury LB média pro izolaci velkých množství plazmidové DNA. Po inkubaci přes noc byla plazmidová DNA izolována z 1 litru kultury za použití Qiagen DNA čisticích kolon podle 20 doporučení výrobce. Výsledný plazmid byl označen Pad/MLP/p53/PIX- Vzorky tohoto plazmidů jsou uloženy v Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, 12301, 22. října 1993. Uložení bylo provedeno podle podmínek Budapeštské smlouvy o mezinárodním ukládání mikroorganismů pro účely patentového řízení. Uložení dostalo přírůstkové číslo ATCC č. 75576.
Pro konstrukci rekombinantního adenoviru bylo 10 fig Pad/MLP/p53/PIX-zpracováno se 40jednotkami restrikční endonukleázy EcoRI pro linearizaci plazmidů. Adenovirus typ 5 dl327 DNA (Thimmappaya (1982)) byl štěpen s restrikční endonukleázon Clal a velký fragment (přibližně 33 kilobázových párů) byl čištěn odstředováním se sacharózovým gradientem. Deset 30 (10) pg EcoRI zpracovaného Pad/MLP/p53/Elb-a 2,5 pg Clal zpracovaného Ad5 dl327 bylo smíšeno a použito k transfekci kitu podle doporučení dodavatele. Osm (8) dnů po transfekci byly 293 buňky seříznuty 1 až 3 do čerstvého media a dva dny poté byl zřejmý adenovirem indukovaný cytopatický účinek na transfektované buňky. 13. den po transfekci se připraví DNA z infikovaných buněk za použití standardních postupů (Graham a Prevec (1991)) a analyzuje se 35 restrikčním štěpením restrikční endonukleázou Xhol. Virem řízená exprese p53 byla ověřena po infekci SaoS2 osteosarkomových buněk virálním lyzátem a imunoblottingem santi-p53 monoklonální protilátkou označenou 1801 Novocasta Lab., Ltd., U.K.).
Pokus č. II
Materiály a metody
Buněčné linie
Rekombinantní adenoviry byly ponechány růst a rozmnožovat se v lidské embryonální ledvinové buněčné linii 293 (ATCC CRL 1573) udržované v DME médiu, obsahujícím 10% definované, doplněné telecí sérum (Hyclone). Saos-2 buňky byly udržovány v Kaighnově médiu doplněném 15 % fatálního telecího séra. HeLa a Hep 3B buňky byly udržovány v DME médiu doplněném 50 10 % telecího fatálního séra. Všechny buněčné linie rostly v Kaighnově médiu doplněném 10% fetálním telecím sérem. Saos-2 buňky byly laskavě poskytnuty Dr. Ericem Stanbridgem. Všechny ostatní buněčné linie byly získány z ATCC.
-14CZ 291372 B6
Konstrukce rekombinantního adenoviru
Pro konstrukci Ad5 p53 virů byl 1,4 kb HindlII-Smal fragment, obsahující plnou délku cDNA pro p53 (tabulka I) izolován z pGEMl-p53-B-T (dodán laskavě Dr. Wen Hwa Lee-em) a inzertován do vícenásobného klonovacího místa expresního vektoru pSP72 (Promega) za použití standardních klonovacích postupů (Sambrook a spol. (1989)). p53 inzert byl získán z tohoto vektoru po štěpení sXhoI-BglII a gelovou elektroforézou. p53 kódující sekvence byla pak inzertována buď do pNLBCMV adenovirus genových transfer vektorů (laskavě poskytnuty Dr. Robertem Schneiderem), který obsahuje Ad5 5' invertované terminální opakování a virální obalové signály a Ela enhancer ve směru proti bud Ad2 hlavnímu pozdnímu promotoru (MLP-major latě promotér) nebo lidskému cytomegalovirus bezprostřednímu časnému genovému promotoru (CMV), následovaného tripartitní leader cDNA a Ad5 sekvencí 3 325-5 525 bp v PPML2 základu. Tyto nové konstrukty nahrazují El region (bp 360-3 325) Ad5 s p53 řízeným buď Ad2 mlP (A/M/53) nebo lidským CMV promotorem (A/C/53), oba následované tripartitní leader CDNA (viz obr. 4). p53 inzerty užívají zbývající Elb polyadenylační po směru exprese umístěné místo. Byly vytvořeny další mlP a CMV řízené p53 rekombinanty (A/M/N/53), které měly další 705 nukleotidovou deleci Ad5 sekvence pro odstranění protein IX (PIX) kódujícího regionu. Jako kontrola byl vyvinut rekombinantní adenovirus z rodičovského PNL3C plazmidu bez p53 inzertu (A/M). Druhou kontrolu tvoří rekombinantní adenovirus, kódující beta-galaktosidázový gen pod kontrolou CMV promotoru (A/C/p-gal). Plazmidy byly linearizovány buď Nrul nebo EcoRI a kotransfektovány s velkým fragmentem Cli štěpených Ad5 d!309 nebo d!327 mutantů (Jones a Shenk (1979)) za použití Ca/PO4 transfekčního kitu (Stratagene). Virální plaky byly izolovány a rekombinanty identifikovány jak analýzou restrikčním štěpením tak PCR za použití rekombinantních specifických primerů proti tripartitní leader CDNA sekvenci ve směru p53 CDNA sekvence. Rekombinantní virus byl dále čištěn limitním ředěním a virové částice byly čištěny a titrovány standardními metodami (Graham a van der Erb (1973), Graham a Prevec (1991)).
Detekce p53 proteinu
Saos-2 nebo Hep 3B buňky (5x10Λ) byly infikovány uvedenými rekombinantními adenoviry po dobu 24 h při zvyšujících se multiplicitách infekce (multiplicity of infection(MOI)) plakotvomých jednotek virus/buňka. Buňky pak byly jednou promyty s PBC a sklizeny v lýzovém pufru (50mM Tris-HCl pH 7,5. 250 m NaCl, 0,01% NpyO, 50mM Naf, 5mM EDTA, 10 pg/ml aprotininu, 10 (μ/ml leupeptinu a 1 mM PMSF). Buněčné proteiny (přibližně 30 pg) byly odděleny 10% SDS-PAGE a přeneseny na nitrocelulózu. Membrány byly inkubovány s a —p53 protilátkou PAb 1801 (Novocastro) a pak konjugovány s ovčím anti-myším IgG s křenovou peroxidázou. p53 protein byl vizualizován chemiluminiscenci (ECL kit, Amersham) na Kodak XAR-5 filmu.
Měření rychlosti syntézy DNA
Buňky (5xl03/jamka) byly umístěny na 96-jamkové titrační plotny (Costar) a ponechány přilnout přes noc (37 °C, 7 % CO2). Buňky pak byly infikovány 24 hodin s čištěnými rekombinantními virovými částicemi při MOI v rozmezí 0,3 až 100 jak uvedeno. Média byla vyměněna 24 hodin po infekci a v inkubaci se pokračovalo celkem 24 hodin. 3H-thymidin (Amersham, 1 pCi/jamka) byl přidán 18 hodin před sklizením. Buňky byly sklizeny na filtry ze skleněných vláken a byly měřeny hladiny inkorporované radioaktivity na beta scintilačním čítači. Inkorporace 3H-thymidinu byla vyjádřena jako průměrná % (+/- SD) media kontroly a graficky vynesena proti MOI.
Tumorigenicita u holé myši
Přibližně 2,4*I08 Saos-2 buněk, umístěných v T225 baňkách, bylo zpracováno v suspenzi pufru (1% sacharóza v PBS), obsahující buď A/M/N/53 nebo A/M čištěný virus při MOI 3 nebo 30. Po
-15CZ 291372 B6 infekci přes noc byly buňky injektovány subkutánně do levých a pravých boků BALB/c athymické holé myši (4 myši na skupinu). Jeden bok byl injektován s A/M/N/53 ošetřenými buňkami, zatímco kolaterální bok byl injektován s kontrolními A/M ošetřenými buňkami, každá myš slouží jako svá vlastní kontrola. Zvířata, která dostala bilaterální injekci pufrem zpracovaných buněk slouží jako další kontroly. Rozměry nádoru (délka, šířka a výška) a tělesné hmotnosti zvířat byly pak měřeny dvakrát týdně během 8 týdnů. Objemy nádorů byly hodnoceny pro každé zvíře s předpokladem sférické geometrie průměru naměřených nádorových rozměrů.
Intranádorová RNA analýza
BALB/c athymické holé myši (přibližně 5 týdnů staré) byly subkutánně injektovány s 1*107 H69 buňkami malobuněčného plicního karcinomu (SCLC) do pravých boků. Nádory byly ponechány se rozvinout po 32 dnů do přibližně 25-50 m3. Myši dostaly peritumorální injekci buď A/C/53 nebo Α/Ο/β-gal rekombinantních adenovirových (2* 109 plakotvomých jednotek (plaque forming units (pfu)) do subkutánního prostoru pod nádorovou hmotou. Nádory byly vyříznuty ze zvířat 2. a 7. den po ošetření adenovirem a PBS. Vzorky nádorů byly homogenizovány, a celková RNA byla izolována za použití TriReagent kitu (Molecular Research Center lne.). PolyA RNA byla izolována za použití PolyATract mRNA Isolation Systém (Promega) a přibližně 2pg vzorek byl použit pro RT-PCR stanovení rekombinantní p53 MRNA exprese (Wang a spol. (1989)). Byly připraveny primery pro amplifikaci sekvence mezi adenovirus tripartitní leader CDNA a p53 CDNA po směru exprese, zajišťující, že by měl být amplifikován pouze jeden rekombinant a ne endogenní p53.
p53 genová terapie ustavených nádorů v holé myši
Přibližně 1χ107 H69 (SCLC) nádorových buněk ve 200 μ! objemech bylo injektováno subkutánně do samic BALB/c athymické holé myši. Nádory byly ponechány 2 týdny vyvíjet a pak byla u zvířat náhodně stanovena velikost nádoru (N=5/skupina). Dvakrát týdně byly podávány peritumorální injekce, celkem 8 dávek/skupina. Rozměry nádoru a tělesné hmotnosti byly měřeny dvakrát týdně a objemy nádorů byly hodnoceny jak popsáno dříve. Zvířata pak byla pozorována na vliv ošetření na přežití myši.
Výsledky
Konstrukce rekombinantního p53-adenoviru p53 adenoviry byly konstruovány nahrazením části Ela a Elb regionu adenoviru typ 5 s p53 CDNA pod kontrolou buď Ad2 mlP (A/M/53) nebo CMV (A/C/53) promotoru (schematicky na obr. 4). Tato El substituce těžce zhoršuje schopnost rekombinantních adenoviru se replikovat, omezením jejich propagace na 293 buňky, což převádí Ad5 El genové produkty na trans (Graham a spol. (1977)). Po identifikaci p53 rekombinantního adenoviru jak restrikčním štěpením, tak PCR analýzou byla celá p53 CDNA sekvence z jednoho z rekombinantních adenoviru (A/M/53) sekvenována pro ověření, že je prostá mutací. Potom byly použity čištěné přípravky p53 rekombinantů k infekci HeLa buněk pro zkoušení přítomnosti fenotypově standardního adenoviru. HeLa buňky, které nejsou permisivní pro replikaci El-deletovaného adenoviru, byly infikovány s 1-4χ 109 infekčních jednotek rekombinantního adenoviru, kultivovány 4 týdny a pozorovány na objevení se cytopatického efektu (CPE).Použitím této zkoušky nebyla zaznamenána replikace rekombinantního adenoviru nebo kontaminace standardním typem, zřejmé u CPE pozorovaného v kontrolních buňkách infikovaných standardním typem adenoviru v hladině citlivosti přibližně 1 v 109.
p53 proteinová exprese u rekombinantního adenoviru
Pro stanoveni, zda p53 rekombinantní adenoviry exprimují p53 protein, byly infikovány nádorové buněčné linie, které neexprimují protein p53. Lidské nádorové buněčné linie
-16CZ 291372 B6
Saos-2(osteosarkom) a Hep 3B (hepatocelulámí karcinom) byly infikovány po 24 hodin s p53 rekombinantními adenoviry A/M/53 nebo A/C/53 při MOI v rozmezí 0,1 až 200 pfu/buňku. Western analýzy lyzátů připravených z infikovaných buněk demonstrují dávkově závislou p53 proteinovou expresi v obou buněčných typech (obr. 5). Obě buněčné linie exprimují vyšší hladiny p53 proteinu po infekci s A/C/53 než s A/M/53 (obr. 3).
Žádný p53 protein nebyl detekován u neinfíkovaných buněk. Hladiny endogenního standardního typu p53 jsou normálně příliš nízké a nejsou detekovatelné Western analýzou buněčných extraktů (Bartek a spol. (1991)). Je nicméně jasné, že hladiny standardního typu p53 proteinu jsou snadno detekovatelné po infekci s buď A/M/53 nebo A/C/53 při nižších MOI (obr. 5), což naznačuje, že i nízké dávky p53 rekombinantních adenoviru mohou produkovat účinné hladiny p53.
p53 závislé morfologické změny
Znovuzavedení standardního typu p53 do p53 negativní osteosarkomové buněčné linie, Saos-2, vede k charakteristickému prodloužení a zploštění těchto normálně vřetenovitě tvarovaných buněk (Chen a spol. (1990)). Nesouvislé Saos-2 buňky (l*105 buňky/10 cm plotna) byly infikovány při MOI 50 buď s A/C/53 nebo kontrolním A/M virem a inkubovány při 37 °C po 72 hodin až jsou neinfíkované kontrolní plotny konfluentní. V tomto bodě byla očekávána morfologická změna zřejmá u A/C/53 ošetřené plotny (obr. 6 panel C), ale ne u neinfíkované (obr. 6, panel B). Tento účinek nebyl funkci buněčné hustoty, protože kontrolní plotna na počátku naočkovaná v nižší hustotě, si udržuje normální morfologii 72 hodin, kdy je jej i konfluence přibližně taková, jako u A/C/53 ošetřené plotny. Dřívej si výsledky demonstrovaly vyšší hladinu p53 proteinové exprese při MOI 50 v Saos-2 buňkách (obr. 5 A) a z těchto výsledků je zřejmé, že p53 protein exprimovaný těmito rekombinantními adenoviry byl biologicky aktivní.
p53 inhibice buněčné DNA syntézy
Pro další test aktivity p53 rekombinantních adenovirů byla hodnocena jejich schopnost inhibovat proliferaci lidských nádorových buněk měřením příjmu 3H-thymidinu. Dříve již bylo uvedeno, že zavedení standardního typu p53 do buněk, které neexprimují endogenní standardní typ p53 může zastavit buňky na přechodu G|/S, vést k inhibici příjmu značeného thymidinu do nově syntetizované DNA (Baker a spol. (1990), Mercer a spol. (1990), Diller a spol. (1990)). Různé p53-defícientní nádorové buněčné linie byly infikovány buď A/M/N/53, A/C/N/53 nebo p53 neexprimujícím kontrolním rekombinantním adenovirem (A/M). Byla pozorována silná, dávkově závislá inhibice DNA syntézy jak u A/M/N/53, tak A/C/N/53 rekombinantů v 7 z 9 různých nádorových testovaných linií (obr. 7). Oba konstrukty jsou schopny inhibovat DNA syntézu v těchto lidských nádorových buňkách, bez ohledu na to, zda jsou exprimovaný mutantem p53 nebo neexprimují p53 protein. Bylo také nalezeno v této studii, že A/C/N/53 konstrukt byl mnohem potentnější než A/M/N/53. V Saos-2 (osteosarkom) a MDA-MB468 (rakovina prsu) buňkách, bylo dosaženo téměř 100% inhibice DNA syntézy s A/C/N/53 konstruktem při tak nízké MOI jako 10. V dávkách, kde inhibice kontrolním adenovirem je pouze 10-30%, byla pozorována 50-100% redukce DNA syntézy za použití p53 rekombinantního adenovirů. Naopak nebyl žádný významný efekt pozorován za použiti konstruktu ve srovnáni s kontrolním virem v HEP g2 buňkách (hepatokarcinomová buněčná linie exprimující endogenní standardní typ p53, Bressac a spol. (1990)), ani v K.562 (p53 nula) leukemické buněčné linii.
Tumorigenicita u holé myši
V přísnějším testu funkce p53 rekombinantních adenovirů, byly nádorové buňky infikovány ex vivo a pak injektovány do holé myši k vyhodnocení schopnosti rekombinantů potlačovat růst nádoru in vivo. Saos-2 buňky infikované A/M/N/53 nebo kontrolním A/M virem při MOI 3 nebo 30, byly injektovány do protilehlých boků holé myši. Velikosti nádorů byly měřeny dvakrát za týden během 8týdenní periody. Při MOI 30 nebyl pozorován růst nádorů v p53-ošetřených bocích u jakékoliv ze zvířat, zatímco kontrolou ošetřené nádory pokračovaly v růstu (obr. 8).
- 17CZ 291372 B6
Progresivní zvětšení kontrolním virem ošetřených nádorů byla podobná jako byla pozorována u pufrem ošetřených kontrolních zvířat. Jasný je rozdíl v růstu nádoru mezi kontrolním adenovirem a p53 rekombinantem při MOI 3, ačkoliv nádory ze 2 ze 4 p53-ošetřených myší ukazovaly na startu stejný růst po přibližně 6 týdnech. Tak je A/M/N/53 rekombinantní adenovirus schopen zprostředkovat p53-specifícké nádorové potlačení v in vivo prostředí.
In vivo exprese Ad/p53
Ačkoliv ex vivo ošetření rakovinových buněk a následná injekce do zvířat poskytuje podstatný test nádorového potlačení, je klinicky relevantnějším experimentem stanovit, zda p53 rekombinantní adenovirus by mohl infikovat a exprimovat p53 v ustavených nádorech in vivo. Proto byly H69 (SCLC, p53nula) buňky injektovány subkutánně do holé myši a nádory byly ponechány 32 dnů vyvíjet. Po této době byla jediná injekce 2* 107 pfu buď A/C/53 nebo A/C/53-gal adenoviru injektována do peritumorálního prostoru, obklopujícího nádor. Nádory byly pak vyříznuty buď 2. nebo 7. den po injekci adenoviru a z každého nádoru byla izolována polyA RNA. RT-PCR za použití rekombinant-p53 specifických primerů pak byla použita k detekování p53 MRNA v p53 ošetřených nádorech (obr. 9, dráhy 1,2,4,5). Nebyl zřejmý žádný p53 signál z nádorů vyříznutých z β-gal ošetřených zvířat (obr. 9, dráhy 3 a 6). Amplifikace aktin příměry slouží jako kontrola pro RT-PCR reakci (obr. 9, dráhy 7-9), zatímco plazmid obsahující rekombinant p53 sekvence slouží jako pozitivní kontrola pro rekombinant-p53 specifický práh (obr. 9, dráha 10). Tento experiment demonstruje, že p53 rekombinantní adenovirus může specificky řídit expresi p53 mRNA s ustavenými nádory s následující jedinou injekcí do peritumorálního prostoru. Je také uvedena in vivo virální perzistence po alespoň jeden týden po infekci s p53 rekombinantním adenovirem.
Účinnost in vivo
K usnadnění genové terapie ustavených nádorů byl použit model nahé myši nesoucí nádor. H69 buňky byly injektovány do subkutánního prostoru do pravého boku myši a nádory byly ponechány růst dva týdny. Myši pak dostaly peritumorální injekce pufru nebo rekombinantního viru dvakrát týdně v celkem 8 dávkách. U myši ošetřené pufrem nebo kontrolním A/M virem pokračují nádory v rychlém růstu po celé ošetření, zatímco ty, které byly ošetřeny s A/M/N/53 virem rostly mnohem pomalejší lychlostí (obr. 10A). Poté, co se přestalo s injekcemi, kontrolní ošetřené nádory pokračují v růstu, zatímco p53 ošetřené nádory vykazují malý nebo žádný růst po alespoň jednom týdnu za nepřítomnosti jakéhokoliv dalšího doplňku exogenního p53 (obr. 10A). I když kontrolní zvířata ošetřená samotným pufrem měla urychlený růst nádoru ve srovnáni se skupinou ošetřenou virem, nebyl nalezen žádný podstatný rozdíl v tělesné hmotnosti mezi třemi skupinami během periody ošetření. Ulcerace nádoru u některých zvířat omezuje relevantnost měření velikosti nádoru ve 42. den. Nicméně pokračuje sledování zvířat pro stanovení doby přežití demonstrující výhodu přežívání u p53-ošetřených zvířat (obr. 10B). Poslední z kontrolních adenovirem ošetřených zvířat uhynulo 83. den, zatímco samotným pufrem ošetřená zvířata uhynula všechna 56. den. Naopak všech 5 zvířat ošetřených s A/M/N/53 dále přežívá (130. den po buněčné inokulaci). Tyto údaje společně představují p53-specifícký účinek jak na růst nádoru, tak na dobu přežití u zvířat s ustavenými p53-deficientními nádory.
Adenovirové vektory exprimující p53
Byly konstruovány rekombinantní adenovirové vektory, které jsou schopné exprimovat vysoké hladiny standardního typu p53 proteinu v dávkově závislém způsobu. Každý vektor obsahuje delece v Ela a Elb regionech, které činí virovou replikaci deficientní (Challberg a Kelly (1979), Horowitz (1991)). Dalším významem těchto delecí je, že tyto sekvence kódují Elb 19 a 55 kd protein. 15 kd protein je uváděn jako inhibující apoptosis (White a spol. (1992), Rao a spol. (1992), zatímco 55 kd protein je schopen vázat standardní typ p53 proteinu (Sarnow a spol. (1982), Heuwell a spol. (1990)). Při deleci těchto adenovirových sekvencí byly odstraněny potenciální inhibitory p53 funkce přímou vazbou kp53 nebo potenciální inhibici p53
-18CZ 291372 B6 zprostředkované apoptosis. Další konstrukty byly vyrobeny, mající zbývající 3'Elb sekvenci, zahrnující celý protein IX kódující sekvenci, rovněž deletovanou. I když bylo uváděno, že redukce obalové velikosti kapacity adenovirů na přibližně o 3 kb méně než u standardního typu viru (Ghosh-Choudhury a spol. (1987)), tyto konstrukty jsou také deletovány v E3 regionu tak, že A/M/N/53 a A/C/N/53 konstrukty jsou v tomto rozmezí velikostí. Při deleci pIX regionu jsou adenovirální sekvence homologní k sekvencím obsaženým ve 293 buňkách redukovány na přibližně 300 bázových párů, snižujících šanci regenerace replikačně schopného, adenovirů standardního typu rekombinací. Konstrukty, postrádající pIX kódující sekvenci se jeví být stejně účinné jako ty s pIX.
p53/adenovirus účinnost in vitro
V souladu se silnou dávkou závislosti pro expresi p53 proteinu v infikovaných buňkách, byla demonstrována p53-specifická inhibice růstu nádorových buněk. Buněčné dělení bylo inhibováno a demonstrováno inhibici DNA syntézy v širokém rozsahu typů nádorových buněk, o kterých je známo, že postrádají standardní typ p53 proteinové exprese. Barchetti a Graham (1993) v poslední době uvádějí p53 specifickou inhibici DNA syntézy v buněčné linii buněk karcinomu vaječníku SKOV-3 p53 rekombinantním adenovirem v podobných pokusech. Navíc ke karcinomu vaječníku byly demonstrovány další lidské nádorové buněčné linie představující klinicky důležité lidské rakoviny a zahrnující linie nadměrně exprimující mutant p53 protein, jako být inhibovány p53 rekombinanty podle tohoto vynálezu. Při MOI, kde je A/C/N/53 rekombinant z 9 až 100% účinný při inhibici DNA syntézy v nádorech těchto typuje kontrolní adenovirem zprostředkované potlačení menší než 20%.
I když Feinstein a spol. (1992) uvádějí, že znovu zavedení standardního p53 by mohlo vyvolat diferenciaci a zvýšení podílu buněk v Gi versus S+G2 pro leukemické K562 buňky, žádný p53 specifický účinek nebyl v této linii nalezen. Horvath a Weber (1988) uvedli, že lymfocyty lidské periferní krve jsou vysoce nepermisivní v adenovirové infekci. V separátních pokusech rekombinant významně infikuje neodpovídající K562 buňky s rekombinantním A/C/p-gal adenovirem, zatímco ostatní buněčné linie, zahrnující kontrolní Hep G2 linii a ty, které vykazují silný p53 efekt, byly snadno infektovatelné. Tak alespoň část variability účinnosti by se mohla objevit díky variabilitě infekce, i když může obsahovat i jiné faktory.
Výsledky pozorované s A/M/N/53 virem na obr. 5 demonstrují, že je možné kompletní potlačení v in vivo prostředí. Obnovený růst nádorů ve 2 ze 4 u p53 ošetřených zvířat při nižších MOI nejpravděpodobněji vzniká z malého procenta buněk na počátku neinfíkovaných p53 rekombinantem v této dávce. Kompletní potlačení viditelné s A/M/N/53 ve vyšší dávce nicméně ukazuje, že schopnost růstu nádoru se obnovit může být překonána.
p53/adenovirus in vivo účinnost
Zde předložená práce a práce jiných skupin (Chen a spol. (1990), Takahoshi a spol. (1992), ukázaly, že lidské nádorové buňky postrádající expresi standardního typu p53 mohou být ošetřeny ex vivo s p53 a vést k potlačení nádorového růstu, jsou-li ošetřené buňky transferovány do zvířecího modelu. Přihlašovatelé předkládají první zmínku o nádorové supresor genové terapii in vivo ustaveného nádoru, vedoucí jak k potlačení nádorového růstu, tak ke zvýšení doby přežití.
V přihlašovatelově systému doručení do nádorových buněk není založeno na přímé injekci do nádorové hmoty. Spíše byl p53 rekombinantní adenovirus injektován do peritumorálního prostoru a v nádoru byla detekována p53 mRNA exprese. p53 exprimovaný rekombinanty byl funkční a silně potlačuje růst nádoru ve srovnání s kontrolními, p53-neexprimujícím adenovirem ošetřenými nádory. Nicméně jak p53 tak kontrolním virem ošetřené nádorové skupiny ukazují nádorové potlačení ve srovnání s pufrem ošetřenými kontrolami. Bylo demonstrováno, že místní exprese faktoru nádorové nekrózy (TNF), interferonu-y, interleukinu (IL)-2, IL-4 nebo IL-7 může vést k T-buněčně nezávislému přechodovému nádorovému potlačení u holé myši (Hoch a spol. (1992)). Vystavení monocytů adenovirovým virionům jsou také slabými induktoiy IFN-a
-19CZ 291372 B6 /β (přehled v práci Gooding a Wold (1990)). Proto není překvapující, že určité nádorové potlačení u holé myši bylo pozorováno i s kontrolním adenovirem. Toto virem zprostředkované nádorové potlačení nebylo pozorováno v ex vivo kontrolních virem ošetřených Saos-2 nádorových buňkách popsaných dříve. p53-specifické in vivo nádorové potlačení bylo silně demonstrováno pokračováním sledování zvířat na obr. 10. Doba přežití p53-ošetřené myši byla výrazně zvýšena, 5 z 5 zvířat přežívalo ještě více než 130 dnů od buněčné inokulace ve srovnání s O z 5 kontrolních zvířat ošetřených adenovirem. Přežívající zvířata ještě vykazují rostoucí nádory, které mohou působit buňky na počátku neinfikované s p53 rekombinantním adenovirem. Vyšší nebo častější režim dávkování je může odstranit. Dále promotorové odříznutí (Palmer aspol. (1991)) nebo další mutace mohou učinit tyto buňky rezistentní kp53 rekombinantnímu adenovirovému ošetření. Například mutace v poslední době popsaném WAF1 genu, genu indukovanému standardním typem p53, které následně inhibují progresi buněčného cyklu do S fáze /El-Deiry a spol. (1993), Hunter (1993) by mohly vést k p53-rezistentnímu nádoru.
Pokus č. III
Tento příklad ukazuje použití sebevražedných genů a tkáňově specifickou expresi takových genů v metodách genové terapie, zde popsaných. Hepatocelulámí karcinom byl zvolen jako cíl, protože je jednou z nejčastějších lidských malignancí postihujících člověka a vyvolávajících ročně ve světě 1 250 000 úmrtí. Výskyt této rakoviny je velmi vysoký v jihovýchodní Asii a Africe, kde je spojen s infekcí hepatitidou B a C a vystavením aflatoxinu. Chirurgie je v současnosti jedinou léčbou, která umožňuje potenciální uzdravení z HCC, i když je méně než 20 % pacientů považováno za kandidáty na resekci (Ravoet C a spol. 1993). Nicméně nádory jiné než hepatocelulámí karcinom jsou rovněž použitelné pro metody redukce jejich proliferace, které jsou zde popsány.
Buněčně linie
Všechny buněčné linie mimo HLF buněčné linie byly získány z Američan Type Tissue Culture Collection (ATCC) 12301 Parluawa Drove. Rockville Maryland. ATCC přírůstková čísla jsou uvedena v závorkách. Lidská embryonální ledvinová buněčná linie 293/CRL 1573) byla použita ke generování a rozmnožení rekombinantních adenovirů zde popsaných. Tyto byly udržovány v DME médiu, obsahujícím 10% definované doplněné telecí sérum (Hyclone). Hepatocelulámí rakovinové buněčné linie Hep 3B (HB 8064), Hep G2 (HB 8065) a HLF byly udržovány vDME/F12 médiu doplněném 10% fetálním hovězím sérem, a stejně tak buněčné linie MDA-MB 468(HTB 132) a BT-549 (HTB 122) rakoviny prsu. Chang jatemí buňky (CCL 13) rostly v MEM médiu doplněném 10% fetálním hovězím sérem. HLF buněčná linie byla získána od dr. T. Morsaki a Dr. H. Kitsuku z Kyushu University School of Medicine in Japan.
Konstrukce rekombinantního viru
Dva adenovirové expresní vektory označené zde jako ACNTK a AANTK a postrádající protein funkci (znázorněno na obr. 11) jsou schopné řízení exprese TK sebevražedného genu v nádorových buňkách. Třetí adenovirus expresní vektor označený AANCAT byl zkonstruován pro další demonstrování snadnosti exprese specificky cíleného genu ke specifickým buněčným typům za použití adenovirálních vektorů. Tyto adenovirální konstrukty byly sestaveny jak je znázorněno na obr. 11 a 12 a jsou deriváty těch, které byly dříve popsány pro expresi nádorových supresor genů.
Pro expresi cizího genu byly inzertovány expresní kazety, které využívají buď lidský cytomegalovirus bezprostřední časný promotor/enhancer (CMV) (Boshart M. a spol., 1985), nebo lidský alfa-fetoprotein (AFP) enhancer/promotor (Watanable K. a spol., 1987), Nakabayashi H. aspol., 1989) pro řízení transkripce TK genu nebo chloramfenikol acetyltransferázového genu (CAT). CMV enhancer promotor je schopen řízení robustní genové exprese v mnoha různých
-20CZ 291372 B6 buněčných typech, zatímco AFP enhancer/promotor konstrukt omezuje expresi k hepatocelulámím rakovinovým buňkám (HCC), které exprimují AFP uasi 70-80% populace HCC pacientů. Do konstruktu využívajícího CMV promotor/enhancer, byla také inzertována adenovirus typ 2 tripartitní leader sekvence. Ke zvýšení translace TK transkriptů (Berkner K.L. a Sharp. 1985). Navíc kEl deleci, jsou oba adenovirus vektory dále deletovány o 1,9 kilobází (kb) DNA ve virálním E3 regionu. DNA deletovaná v E3 regionu není podstatná pro rozmnožování viru a její delece zvyšuje inzertní kapacitu rekombinantního viru pro cizí DNA v ekvivalentním množství (1,9 kb) (Graham a Prevec, 1991).
K demonstrování specifíty AFP promotoru/enhancer, byl také konstruován virus AANCAT, kde je markér gen chloramfenikol acetyltransferázy (CAT) pod kontrolou AFP enhancer/promotoru. V ACNTK virovém konstruktu byla Ad2 tripartitní leader sekvence umístěna mezi CMV promotor/enhancer a TK gen. Tripartitní leader byl uváděn jako zvyšující translaci připojených genů. El substituce zhoršuje schopnost rekombinantních virů k replikaci, omezuje jejich pomnožení k293 buňkám, které doplňují Ad5 El genové produkty do trans (Graham a spol., 1977).
Adenovirální vektor ACNTK: Plazmid pMLBKTK vE.coli HB101 (z ATCC č. 39369) se použije jako zdroj herpes simplex virus (HSV-1) thymidin kinázového (TK) genu. TK se vyřízne zplazmidu jako 1,7 kb genový fragment štěpením s restrikčními enzymy Bgl II a pVU II a subklonuje se do kompatibilního Bam HI, EcoR V restrikčních míst plazmidu pSP72 (Promega) za použití standardních technik klonování (Sambrook a spol., 1989). TK inzert se pak izoluje jako 1,7 kg fragment z tohoto vektoru štěpením s Xba I a Bgl II a klonuje do Xba I, BamHI štěpeného plazmidu pACN (Wills a spol., 1994). Dvacet (20) pg tohoto plazmidu označeného pACNTK se linearizuje s Eco Rl a kontransfektuje do 293 buněk (ATCC CRL 1573) s 5 pg Cla 1 štěpeného ACBGL (Wills a spol., 1994 supra) za použití CaPO4 transfekčního kitu (Stratagene, Saň Diego, Kalifornie). Virální plaky byly izolovány a rekombinanty, označené ACNTK byly identifikovány restrikční štěpnou analýzou izolované DNA pomocí Xho I a Bsi WI. Pozitivní rekombinanty byly dále čištěny omezujícím ředěním a expandovány a titrovány standardními metodami (Graham a Prevec, 1991).
Adenovirový vektor AANTK: α-Fetoprotein promotor (AFP-P) a enhancer (AFP-E) byly klonovány z lidské genomické cDNA (Clontech) za použití PCR amplifikace sprintery, obsahujícími restrikční místa na svých koncích. Primery použité k izolaci 210 bp AFP-E obsahujícímu Nhe I restrikční místo na 5' primerů a Xba I, Xho I, Κηρ I linker na 3'primeru. 5'-příměrová sekvence byla 5'-CGC GCT AGC TCT GCC CCA AAG AGC T-31. 5' příměrová sekvence byla 5'-CGC GGT ACC CTC GAG TCT AGA TAT TGC CAG TGG TGG AAG - 3'. Primery použité k izolaci 1763 bp AFE fragmentu obsahující Not I restrikční místo na 5' primerů a Xba I místo na 3' primerů. 5? příměrová sekvence byla 5'-CGC TCT AGA GAG ACC AGT TÁG GAA GTT TTC GCA - 3'. Pro PCR amplifikaci DNA byla denaturována při 97 °C 7 minut, s následujícími 5 cykly amplifikace při 97 °C, 1 min, 53 °C, 1 min, 72 °C, 2 min a nakonec 72 °C, 10 minut prodlužování. Amplifikovaný AFE byl štěpen sNot I a Xba I a inzertován do Not I, Xba I místo plazmidového vektoru (pA/lTR/B), obsahujícího adenovirus typ 5 sekvence 1-350 a 3330-5790 oddělené polylinkerem, obsahujícím Not I, Xho I, Xba I, Hind III, Κρη I, Bam HI, Nco I, Srna I, a Bgl II místa. Amplifikovaný AFP-E byl štěpen s Nhe I a Κρη I a inzertován do AFP-E obsahujícího konstruktu popsaného výše, který byl štěpen s Xba I a Κρη I. Tento nový konstrukt byl pak dále štěpen x Xba I a Ngo Mi pro odstranění adenovirálních sekvencí 3330-5780, které byly následně nahrazeny s Xba I, NgoMI restrikčním fragmentem plazmidu pACN, obsahujícím nukleotidy 4021-10457 adenovirů typu 2 pro konstrukci plazmidu pAAN, obsahujícího jak α-fetoproteinový enhancer, tak promotor. Tento konstrukt byl pak štěpen sEco Rl a Xba I k izolaci 2,3 kb fragmentu, obsahujícího Ad5 invertované koncové opakování, AFP-E a AFP-P, které bylo následně ligováno s 8,55 kb fragmentem Eco Rl, Xba I štěpeného pACNTK popsaného výše pro přípravu pAANTK,kde TKgen je řízen a -fetoprotein enhancerem a promotorem v adenovirovém základu. Tento
-21 CZ 291372 B6 plazmid byl pak linearizován s Eco RI a kotransfektován s velkým fragmentem Cla I štěpeného ALBGL jako výše a byly izolovány a čištěny rekombinanty označené AANTK jak popsáno výše.
Adenovirální vektor AANCAT: chloramfenikol acetyltransferázový (CAT) gen byl izolován z pCAT-Basic Vektor (Promega Corporation) štěpením Xba I, Bam HI. Tento 1,64 kb fragment byl ligován do Xba I, Bam HI, štěpeného pAAN (popsán výše) pro vytvoření pAANCAT. Tento plazmid byl pak linearizován s Eco RI a kotransfektován s velkým fragmentem Cla I štěpeným ra/C/p-gal k vytvoření AANCAT.
Exprese reportér genu: β-Galaktosidázová exprese
Buňky byly umístěny v množství lxlO5 buněk jamka na 24-jamkovou tkáňovou kultivační plotnu (Costar) a ponechány přes noc adherovat (37 °C, 7 % O2) · Infekce přes noc ACBGL byly provedeny při multiplicitě infekce (MOI) 30. Po 24 hodinách se buňky fixují se 3,7% formaldehydeim, PBS a vybarvují s 1 mg/ml Xgal činidla (USB). Data byla hodnocena (+,++,+++) vyhodnocením procent pozitivně vybarvených buněk při každé MOI (+ = 1-33 %, + + = 33-67 % a + + + = > 67 %).
Exprese reportér genu: CAT exprese
Dva (2)χ 106 buněk (hep G2, Hep 3B, HLF, Chang a MDA-MB468) bylo vyseto na 10 cm plotny (trojmo) a inkubováno přes noc (37 °C, 7 % CO2).Každá plotna pak byla infikována bud s AANCAT při MOI=30 nebo 100 nebo neinfikována a ponechána inkubovat 3 dny. Buňky byly pak tryptinizovány a promyty PBS a resuspendovány ve 100 μΐ 0,25 M Tris pH 7,8. Vzorky byly zmrazený a 3x ponechány roztát a supematant byl přenesen do nových zkumavek a inkubován při 60 °C 10 minut. Vzory pak byly rozvířeny při 4 °C po 5 minut a suspemanty sledovány na koncentraci proteinu použitím Bradfordovy eseje (Bio-Rad Protein Assay Kit). Vzorky byly upraveny na stejné koncentrace proteinu v konečném objemu 75 μΐ za použití 0,25 M Tris, 25 μΐ 4 mM acetyl CoA a 1 α 1 l4C-chloramfenikolu a inkubovány přes noc při 37 °C. Ke každému vzorku bylo přidáno 500 μΐ ethylacetátu a mícháno vortexováním s následujícím odstřeďováním po 5 minut při teplotě místnosti. Horní fáze se pak přenese do nové zkumavky a ethylacetát se odpaří odstřeďováním za vakua. Reakční produkty se pak znovu rozpustí ve 25 μΐ ethylacetátu a nanesou na desku pro chromatografií na tenké vrstvě (TLC) a deska se pak umístí do TLC komory předem ekvilibrováné (95 % chloroform, 5 % methanol). Rozpouštědlo se nechá migrovat na konec desky a deska se pak suší a vystaví rentgenovému filmu.
Buněčná proliferace: Inkorporace 3H- thyroidinu
Buňky se umístí v množství 5 χ 103 buněk/jamka na 96-jamkovou mikrotitrační plotnu (Costar) a nechají se inkubovat přes noc (37 °C, 7 % CO2). Sériově ředěný ACN,ACNTK nebo AATK virus vDMEM, 15% FBS, 1% glutamin se použije pro transfektování buněk při multiciplitě infekce 30 přes noc, pak se k buňkám dávkuje (trojmo) ganciclovir (Cytovene) v log intervalech mezi 0,001 a 100 mM (mikromolární). Do každé jamky se 12-18 h před sklizením přidá lpCi 3H-thymidinu (Amersham). 72 hodin po infekci se buňky sklidí na filtry ze skleněných vláken a inkorporováný 3H-thymidin byl spočten za použití kapalinové scintilace (Top Count, Packard). Výsledky jsou graficky vyjádřeny jako procenta proliferace neošetřené kontroly a vyjádřeny tabelárně jako účinná dávka (ED5Q+SD) pro 50procentní redukci proliferace vzhledem ke kontrolnímu médiu. ED5Q hodnoty byly hodnoceny použitím logistické rovnice pro hodnoty závislosti na dávce.
Cytotoxicita: Uvolnění LDH
Buňky (HLF, lidský HCC) byly umístěny na plotnu, infikovány s ACN nebo ACNTK a ošetřeny s ganciclovirem jak je popsáno pro proliferační esej. 72 hodin po podání gancicloviru byly buňky rozvířeny, supematant byl odstraněn. Hladiny laktát dehydrogenázy byly naměřeny kolori
-22CZ 291372 B6 metricky (Promega, Cytotox 96%™). Průměrné uvolnění LDH (+/- S.D.) je graficky vyneseno proti M.O.I.
Lidské hepatocelulámí karcinomové buňky (Hep 3B) byly injektovány do deseti samic (10) athymické nu/nu myši (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA). Každé zvíře dostalo přibližně 1 * 107 buněk do levého boku. Nádory byly ponechány růst po 27 dnů před náhodným hodnocením myši na velikost nádoru. Myši byly ošetřeny intratumorálními a peritumorálními injekcemi ACNTK nebo kontrolního viru ACN (1 χ 109 iu ve 100 μΐ) každý další den v celkem třech dávkách. Za 24 hodin po počáteční dávce adenoviru bylo započato intraperitoneálním dávkováním io gancicloviru myši (Cytovene 100 mg/kg) denně po celkem 10 dnů. Myši byly sledovány na velikost nádoru a tělesnou hmotnost dvakrát týdně. Měření nádorů byla prováděna trojrozměrně za použití noniových hmatadel a objemy byly vypočteny použitím vzorce 4/3 πΓ3, kde r je polovina průměru rozměru nádoru.
Výsledky:
Rekombinantní adenoviiy byly použity k infikování tří HCC buněčných linií (HLF, Hep 3B a Hep-G2). Jedna lidská jaterní buněčná linie (Chang) a dvě buněčné linie rakoviny prsu (MDAMB 468 a BT 549) byly použity jako kontroly. K demonstrování specifity AFP 20 promotor/enhancer byl konstruován AANCAT. Tento virus byl použit pro infekci buněk, které buď exprimují (Hep 3B, Hep G2) nebo neexprimují (HLE, Chang, MDAMB 468) HCC nádorový markér a -fetoprotein (AFP). Jak je uvedeno na obr. 13, AANCAT řídí expresi CAT markér genu pouze v těch HCC buňkách, které jsou schopné exprese AFP (obr. 13).
Účinnost ACNTK a AANTK pro léčení HCC byla hodnocena za použití 3H-thymidin inkorporační eseje pro měření účinku kombinace HSV-TK exprese a ošetření ganciclovirem po buněčné proliferaci. Buněčné linie byly infikovány buď ACNTK nebo AANTK nebo kontrolním virem ACN (Wills a spol., 1994, supra), který neřídí expresi HSV-TK a pak ošetřeny s ACNTK nebo AANTK nebo kontrolním virem ACN (Wills a spol., 1994, supra), který neřídí expresi
HSV-TK a pak ošetřeny se stoupajícími koncentracemi gancicloviru. Účinek tohoto ošetření byl hodnocen jako funkce zvyšujících se koncentrací gancicloviru a byla stanovena koncentrace gancicloviru vyžadovaná pro inhibici 3H-thymidinu inkorporovaného z 50 % (ED 50). Dále relativní míra adenovirus-zprostředkovaného genového transferu a exprese každé buněčné linie byla stanovena za použití kontrolního viru, který řídí expresi markér genu beta-galaktosidázy.
Data na obr. 14 a v tabulce 1 dále ukazují, že ACNTK virus/ganciclovir kombinační léčba byla schopná inhibovat buněčnou proliferaci ve všech buněčných zkoušených liniích ve srovnání s kontrolním adenovirem ACN v kombinaci s ganciclovirem. Naopak AANTK virální vektor byl účinný pouze v těch HCC buněčných linií, které byly demonstrovány jako exprimující a -fetoprotein. Dále byla kombinace AANTK/GCV mnohem účinnější, když byly buňky 40 umístěny na plotny ve vysokých hustotách.
Tabulka č. 1
Buněčná linie aFP β-gal ACN ED50 AANTK exprese ACNTK
| MDAMB468 | - | + + + | > 100 | 2 | > 100 |
| BT549 | — | + + + | > 100 | >0,3 | > 100 |
| HLF | - | + + + | > 100 | 0,8 | > 100 |
| CHANG | — | + + + | > 100 | 22 | > 100 |
| HEP-3B | - | + | 80 | 8 | 8 |
| HEP-G2 LOW | + | + + | 90 | 2 | 35 |
| HEP-G2 HIGH | + | + + | 89 | 0,5 | 4 |
-23CZ 291372 B6
Holé myši nesoucí Hep 3B nádory (N=5/skupina) byly ošetřeny intratumorálně a peritumorálně s ekvivalentními dávkami ACNTK nebo ACN kontroly. Dvacet čtyři hodin po prvním podání rekombinantního adenoviru se započalo u všech myší s denním ošetřováním ganciclovirem. Dvakrát týdně byly u všech myší měřeny rozměry nádoru pomocí hmatadel a průměrné velikosti nádorů jsou graficky znázorněny na obr. 16. Průměrná velikost nádoru 58. den byla menší než u ACNTK-ošetřených zvířat, ale rozdíl nebyl statisticky významný (p < 0,09, nepárovaný - test). Tato data podporují specifický účinek ACNTK na růst nádoru in vivo. Mezi skupinami nebyly pozorovány žádné významné rozdíly v průměrné tělesné hmotnosti.
I když vynález byl popsán s ohledem na výše uvedená provedení, je třeba chápat, že jsou možné různé jeho modifikace, aniž by byla narušena myšlenka vynálezu. V souladu s tím je vynález omezen následujícími nároky.
Odkazy:
AIELLO, L. et al. (1979) Virology 94:460-469.
AMERIČAN CANCER SOCIETY. (1993) Cancer Facts and Figures.
AULITZKY et al. (1991) Eur. J. Cancer 27 (4):462^167.
AUSTIN, E. A. and HUBER, B.E. (1993) Mol. Pharmaceutical 43:380-387.
BACCHETTI, S. AND GRAHAM, F. (1993) Intemational Joumal of Oncology 3:781-788.
BAKER S. J., MARKOWITZ, S., FEARON E.R., WILLSON, J.K.V., AND VOGELSTEIN, B. (1990) Science 249:912-915.
BARTEK, J., BARTKOVA, J., VOJTESEK, B„ STAŠKOVA, Z., LUKÁŠ, J., REJTHAR, A., KOVAŘÍK, J., MIDGLEY, C. A., GANNON, J.V., A LANÉ, D. P. (1991) Oncogene 6:1699-1703.
BERKNER, K.L. a: SHARP (1985) Nucleic Acids Res 13:841-857.
BOSHART, M. et al. (1985) Cell 41:521-530.
BRESSAC, B., GALVIN, K.M., LIANG, T.J., ISSELBACHER, K.J., WANDS, J.R., AND OZTURK, M. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:1973-1977.
CARUSO M. et al. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:7024-7028.
CHALLBERG, M. D., KELLY, T. J. (1979) Biochemistry 76:655-659.
CHEN P.L., CHEN Y., BOOKSTEIN R., AND LEE W.H. (1991) Science 250:1576-1580.
CHEN, Y., CHEN, P. L., ARNAIZ, N., GOODRICH, D„ AI LEE, W.H. (1991) Oncogene 6:1799-1805.
CHENG, JL, YEE, J. K., YEARGIN, J., FRIEDMANN, T., A( HAAS, M. (1992) Cancer Research 52:222-226.
COLBY, W. W. AI SHENK, T. J. (1981) Virology 39:977-980.
CULVERET AL. (1991) P.N.A.S. (U.S.A.) 88:3155-3159.
-24CZ 291372 B6
CULVER, K.W. et al. (1992) Science 256:1550-1552.
DEMETR1 et al. (1989) J. Clin. Oncoi. 7 (10):1545-1553.
DILLER, L., etal. (1990) Mol. Cell. Biology 10:5772-5781.
EL-DEIRY, W.S., et al. (1993) Cell 75:817-825.
EZZIDINE, Z.D. et al. (1991) The New Biologist 3:608-614.
FEINSTEIN, E., GALE, R. P„ REED, J., A ’ CANAANI. E. (1992) Oncogene 7:1853-1857.
GHOSH-CHOUDHURY, G., HAJ-AHMAD, Y.. K. GRAHAM, F. L. (1987) EMBO Joumal 6:1733-1739.
GOODING, L.R., A WOLD, W.S.M. (1990) Crit. Rev. Immunol. 10:53-71.
GRAHAM F. L., P. VAN DER ERB A.J. (1973) Virolog} 52:456-467.
GRAHAM, F. L. A PREVEC, L. (1992) Vaccines: New Approaches to Immunoloaical Problems. R. W. Ellis (ed), Butterworth-Heinemann, Boston. 363-390.
GRAHAM, F. L., SMILEY, J., RUSSELL, W.C. A NAIRN, R. (1977) J. Gen. Virol. 36:59-74.
GRAHAM F.L. A PREVEC L. (1991) Manipulation of acienovirus vectors. In: Methocis in Molecular Biology. Vol 7: Gene Transfer anci Expression Protocols. Murray E.J. (ed.) The Humana Press lne., Clifton N.J., Vol 7:109-128.
HEUVEL, S. J. L., LAAR, T., KAST, W. M., MELIEF, C. J. Μ., ZANTEMA, A., A VAN DER EB, A. J. (1990) EMBO Journal 9:2621-2629.
HOCK, K., DORSCH, M., KUZENDORF, U., QIN, Z., DIAMANTSTEIN, T., A. BLANKENSTEIN, T. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:2774-2778.
HOLLSTEIN, M., SIDRANSKY, D., VOGELSTE1N, B., A. HARRIS, C. (1991) Science 253:49-53.
HOROWITZ, M. S. (1991) Adenoviridae and their replication. In Fields Virology. Β. N. Fields, ed. (Raven Press, New York). 1679-1721.
HORVATh, J., A. WEBER, J.M. (1988) J. Virol. 62:341-345.
HUANG et al. (1991) Nátuře 350:160-162.
HUBER, B.E. et al. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:8039-8043.
HUNTER, T. (1993) Cell 75:839-841.
JONES, N. A. SHENK, T. (1979) Cell 17:683-689.
KAMB et al. (1994) Science 264:436-440.
KEURBITZ, S. J., PLUNKETT, B. S., WALSH, W. V., AI KAŠTAN, Μ. B. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 7491-7495.
-25 CZ 291372 B6
KREIGLER, M. Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1990).
LANDMANN et al. (1992) J. Interferon Res. 12 (2).-103-111.
LANÉ, D. P. (1992) Nátuře 358:15-16.
LANTZ et al. (1990) Cytokine 2 (6) :402-406.
LARRICK, J.W. a:. BURCK, K.L. Gene Therapy; Application.of Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc. New York, New York (1991).
LEE et al. (1987) Science 235:1394-1399.
LEMAISTRE et al. (1991) Lancet 337:1124-1125.
LEMARCHAND, P., et al. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:6482-6486.
LEVINE, A.J. (1993) The Tumor Suppressor Genes. Annu. Rev. Biochem. 1993. 62:623-651.
LOWE S. W., SCHMITT, E.M., SMITH, S. W., OSBORNE, B. A., Ai JACKS, J. (1993) Nátuře 362:847-852.
LOWE, S.W., RULEY, H.E., JACKS, T„ A. HOUSMAN, D. E. (1993) Cell 74:957-967.
MARTIN (1975) In: Remingtonů Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton).
MERCER, W.E., et al. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:6166-6170.
NAKABAYASHI, H. et al. (1989) The Joumal of Biological Chemistry 264:266-271.
PALMER, T. D., ROSMAN, G. J., OSBORNE, W. R., A. MILLER, A.D. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci USA 88:1330-1334.
RAO, L., DEBBAS, M., SABBATINI, P., HOCKENBERY, D., KORSMEYER, S„ A WHITE, E. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:7742-7746.
RAVOET C. et al. (1993) Joumal of Surgical Oncology Supplement 3:104-111.
RICH, D.P., et al. (1993) Human Gene Therapy 4:460-476.
ROSENFELD, M.A., et al. (1992) Cell 68:143-155.
SAMBROOK J., FRITSCH E. F., A. MANIATIS T. (1989). Molecular Clonina; A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).
SARNOW, P., HO, Y. S., W1LLIAMS, J., A. LEVINE, A. J. (1982) Cell 28:387-394.
SHAW, P„ BOVEY, R., TARDY, S„ SÁHLI, R., SORDAT, B„ A. COSTA, J. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:4495-4499.
SIEGFRIED, W. (1993) Exp. Clin. Endocrinol. 101:7-11.
SORSCHER, E. J. et al. (1994) Gene Therapy 1:233-238.
-26CZ 291372 B6
SPECTOR, D.J. (1983) Virology 130:533-538.
STEWART, P.L. et al. (1993) EMBO Journal 12:2589-2599.
STRAUS. S.E. (1984) Adenovirus infections in humans. In: The Adenoviruses, Ginsberg HS, ed. Nexv York: Plenům Press, 451—496.
SUPERSAXO et al. (1988) Pharm. Res. 5 (8):472-476.
TAKAHASHI, T., et al. (1989) Science 246: 491-494.
TAKAHASHI, T., et al. (1992) Cancer Research 52:2340-2343.
TH1MMAPPAYA, B. et al. (1982) Cell 31:543-551.
WANG, A. M., DOYLE, Μ. V., A MARK, D.F. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci USA 86:9717-9721.
WATANABLE, K. et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry 262:4812-4818.
WHITE, E., et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:2570-2580.
WILLS, K.N. et al. (1994) Hum. Gen. Ther. 5:1079-1088.
YONISH-ROUACH, E., et al. (1991) Nátuře 352:345-347.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (21)
1. Rekombinantní adenovirový expresní vektor, zahrnující
a. inzert exogenní DNA, zahrnující gen kódující cizí protein, a
b. adenovirovou DNA, v níž byly vypuštěny všechny kódující sekvence Ela, Elb a proteinu IX a alespoň část E3.
2. Vektor podle nároku 1, kde adenovirová DNA dále zahrnuje deleci neesenciální sekvence DNA v časné oblasti 3 a/nebo časné oblasti 4 adenoviru.
3. Vektor podle nároku 1 nebo 2, kde adenovirová DNA dále zahrnuje deleci až čtyřiceti nukleotidů ve směru 3' vzhledem k deleci Ela a Elb a proteinu IX, přičemž exogenní DNA dále zahrnuje polyadenylační signál.
4. Vektor podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, kde adenovirová DNA je DNA adenoviru skupiny C, vybraného ze sérotypu 1, 2, 5 nebo 6.
5. Vektor podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde genem kódujícím cizí protein je molekula DNA s až 2,6 kilobázemi.
6. Vektor podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde genem kódujícím cizí protein je molekula DNA s až 4,5 kilobázemi.
-27CZ 291372 B6
7. Vektor podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde gen kódující cizí protein kóduje cizí funkční protein nebo jeho biologicky aktivní fragment.
8. Vektor podle nároku 7, kde cizím funkčním proteinem je tumor supresorový protein nebo jeho biologicky aktivní fragment.
9. Vektor podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde gen kódující cizí protein kóduje sebevražedný protein nebo jeho funkční ekvivalent.
10. Vektor podle nároku 9, kde sebevražedným proteinem je thymidin kináza herpes simplex I.
11. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
12. Použití vektoru podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického přípravku pro genovou terapií.
13. Použití vektoru podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického přípravku pro transformaci hyperproliferativní savčí buňky.
14. Použití vektoru podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčbu rakoviny.
15. Použití podle nároku 14, kde vektor zahrnuje gen kódující cizí funkční protein, kterým je tumor supresorový protein, a kde rakovina je spojena s nedostatkem endogenního standardního tumor supresorového proteinu.
16. Použití podle nároku 15, kde rakovinou je nemalobuněčná rakovina plic, malobuněčná rakovina plic, hepatokarcinom, melanom, retinoblastom, nádor prsu, kolorektální karcinom, leukemie, lymfom, mozkový nádor, cervikální karcinom, sarkom, nádor prostaty, nádor močového měchýře, nádor retikuloendotelových tkání, Wilmův nádor, astrocytom, glioblastom, neuroblastom, ovariální karcinom, osteosarkom a renální rakovina.
17. Použití vektoru podle nároku 1, kde genem kódujícím cizí protein je protinádorový gen, pro přípravu farmaceutického přípravku pro podávání účinného množství terapeutického činidla, které je v přítomnosti protinádorového genu toxické pro buňku, pro redukci proliferace nádorových buněk u subjektu.
18. Použití vektoru podle nároku 1 pro přípravu farmaceutického přípravku pro inhibici proliferace nádoru u živočicha.
19. Použití vektoru podle nároku 1, kde gen kódující cizí protein kóduje thymidin kinázu, pro přípravu farmaceutického přípravku pro podávání účinného množství metabolitu thymidin kinázy nebo jeho funkčního ekvivalentu pro redukci proliferace nádorových buněk u subjektu.
20. Použití podle nároku 19, kde metabolitem thymidin kinázy je ganciklovir nebo 6-methoxypurin arabinonukleosid nebo jeho funkční ekvivalent.
21. Použití podle nároku 19, kde nádorové buňky představuje hepatocelulámí karcinom.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14266993A | 1993-10-25 | 1993-10-25 | |
| US24600694A | 1994-05-19 | 1994-05-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ114396A3 CZ114396A3 (en) | 1996-11-13 |
| CZ291372B6 true CZ291372B6 (cs) | 2003-02-12 |
Family
ID=26840311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19961143A CZ291372B6 (cs) | 1993-10-25 | 1994-10-25 | Rekombinantní adenovirový vektor a jeho použití |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US20080182807A1 (cs) |
| EP (3) | EP1637608B1 (cs) |
| JP (1) | JP3875990B2 (cs) |
| CN (1) | CN1263864C (cs) |
| AT (2) | ATE314482T1 (cs) |
| AU (1) | AU687117B2 (cs) |
| BR (1) | BR9407956A (cs) |
| CA (1) | CA2173975C (cs) |
| CZ (1) | CZ291372B6 (cs) |
| DE (2) | DE69434594T2 (cs) |
| DK (1) | DK0797676T3 (cs) |
| ES (2) | ES2256842T4 (cs) |
| FI (1) | FI961755A7 (cs) |
| HU (1) | HU223733B1 (cs) |
| NO (1) | NO961639L (cs) |
| NZ (1) | NZ275956A (cs) |
| PL (1) | PL186073B1 (cs) |
| PT (1) | PT797676E (cs) |
| RU (1) | RU2162342C2 (cs) |
| SK (1) | SK283703B6 (cs) |
| WO (1) | WO1995011984A2 (cs) |
Families Citing this family (406)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6410010B1 (en) | 1992-10-13 | 2002-06-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant P53 adenovirus compositions |
| US5747469A (en) | 1991-03-06 | 1998-05-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53 |
| CA2108144A1 (en) | 1991-03-06 | 1992-09-07 | Jack A. Roth | Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression |
| ES2256842T4 (es) * | 1993-10-25 | 2007-02-01 | Canji, Inc. | Vector de adenovirus recombinante y metodos de uso. |
| US5698443A (en) * | 1995-06-27 | 1997-12-16 | Calydon, Inc. | Tissue specific viral vectors |
| US6638762B1 (en) | 1994-11-28 | 2003-10-28 | Genetic Therapy, Inc. | Tissue-vectors specific replication and gene expression |
| US5998205A (en) | 1994-11-28 | 1999-12-07 | Genetic Therapy, Inc. | Vectors for tissue-specific replication |
| JPH10509879A (ja) * | 1994-11-28 | 1998-09-29 | ジェネティック セラピー， インコーポレイテッド | 複製欠陥ベクターを用いる、組織特異的処置、診断方法、および組成物 |
| DK0843731T3 (da) * | 1995-03-24 | 2008-06-09 | Genzyme Corp | Adenovirusvektorer til genterapi |
| US5707618A (en) * | 1995-03-24 | 1998-01-13 | Genzyme Corporation | Adenovirus vectors for gene therapy |
| US20030026789A1 (en) * | 1995-05-03 | 2003-02-06 | Richard J. Gregory | Gene therapy using replication competent targeted adenoviral vectors |
| US7011976B1 (en) | 1997-03-03 | 2006-03-14 | Calydon, Inc. | Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof |
| US6197293B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-03-06 | Calydon, Inc. | Adenovirus vectors specific for cells expressing androgen receptor and methods of use thereof |
| US6254862B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-07-03 | Calydon, Inc. | Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof |
| US6676935B2 (en) | 1995-06-27 | 2004-01-13 | Cell Genesys, Inc. | Tissue specific adenoviral vectors |
| US5801030A (en) * | 1995-09-01 | 1998-09-01 | Genvec, Inc. | Methods and vectors for site-specific recombination |
| US5789244A (en) * | 1996-01-08 | 1998-08-04 | Canji, Inc. | Compositions and methods for the treatment of cancer using recombinant viral vector delivery systems |
| US6392069B2 (en) | 1996-01-08 | 2002-05-21 | Canji, Inc. | Compositions for enhancing delivery of nucleic acids to cells |
| US7002027B1 (en) | 1996-01-08 | 2006-02-21 | Canji, Inc. | Compositions and methods for therapeutic use |
| US6132989A (en) * | 1996-06-03 | 2000-10-17 | University Of Washington | Methods and compositions for enhanced stability of non-adenoviral DNA |
| US5869037A (en) * | 1996-06-26 | 1999-02-09 | Cornell Research Foundation, Inc. | Adenoviral-mediated gene transfer to adipocytes |
| US7232899B2 (en) | 1996-09-25 | 2007-06-19 | The Scripps Research Institute | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use |
| JP4350800B2 (ja) * | 1996-09-25 | 2009-10-21 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 高キャパシティーアデノウイルスベクターの開発の促進に使用するためのパッケージング細胞系 |
| PL332856A1 (en) * | 1996-10-18 | 1999-10-25 | Canji | Methods of and compositions for delivery and expression of nucleic acids as needed by interferon |
| US6544523B1 (en) | 1996-11-13 | 2003-04-08 | Chiron Corporation | Mutant forms of Fas ligand and uses thereof |
| EP0943004A2 (en) * | 1996-11-18 | 1999-09-22 | McGill University | Post-mitotic neurons containing adenovirus vectors that modulate apoptosis and growth |
| US6544769B1 (en) | 1996-12-13 | 2003-04-08 | Schering Corporation | Compostions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations |
| ATE353956T1 (de) | 1996-12-13 | 2007-03-15 | Schering Corp | Methoden zur virus-reinigung |
| US6261823B1 (en) | 1996-12-13 | 2001-07-17 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
| WO1998032860A1 (en) * | 1997-01-28 | 1998-07-30 | Baxter International Inc. | Methods for highly efficient generation of adenoviral vectors |
| US6168944B1 (en) | 1997-01-31 | 2001-01-02 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
| US6146891A (en) * | 1997-01-31 | 2000-11-14 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
| US6403370B1 (en) | 1997-02-10 | 2002-06-11 | Genstar Therapeutics Corporation | Oncolytic/immunogenic complementary-adenoviral vector system |
| US20030060434A1 (en) | 1997-02-18 | 2003-03-27 | Loretta Nielsen | Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms |
| US6200799B1 (en) * | 1997-06-03 | 2001-03-13 | University Of Lausanne | Somatic gene therapy to suppress secondary cataract formation following eye surgery |
| CA2308606A1 (en) | 1997-11-06 | 1999-05-20 | Chiron S.P.A. | Neisserial antigens |
| ATE446368T1 (de) | 1998-01-14 | 2009-11-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Antigene aus neisseria meningitidis |
| DE69936948T2 (de) | 1998-02-17 | 2008-05-15 | Schering Corporation | Virusenthaltende Zusammensetzungen und Methoden zur Konzentration von Viruspräparaten |
| EP2261345A3 (en) | 1998-05-01 | 2012-01-11 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
| WO1999058156A1 (en) * | 1998-05-12 | 1999-11-18 | Baylor College Of Medicine | Cancer prevention by selective delivery methods |
| US6900049B2 (en) | 1998-09-10 | 2005-05-31 | Cell Genesys, Inc. | Adenovirus vectors containing cell status-specific response elements and methods of use thereof |
| WO2000022124A2 (en) * | 1998-10-15 | 2000-04-20 | Canji, Inc. | Methods and compositions to induce antitumor response |
| US6649158B1 (en) | 1998-10-15 | 2003-11-18 | Canji, Inc. | Methods and compositions to induce antitumor response |
| AU2145300A (en) * | 1998-11-18 | 2000-06-05 | Canji, Inc. | Adenoviral vectors |
| US6495130B1 (en) | 1998-12-30 | 2002-12-17 | Calydon, Inc. | Target cell-specific adenoviral vectors containing E3 and methods of use thereof |
| US7625859B1 (en) | 2000-02-16 | 2009-12-01 | Oregon Health & Science University | HER-2 binding antagonists |
| RU2245366C2 (ru) | 1999-04-30 | 2005-01-27 | Чирон С.Р.Л. | Антиген neisseria, кодирующая его нуклеиновая кислота, их использование |
| GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| PT2275552E (pt) | 1999-10-29 | 2015-12-07 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Péptidos antigénicos de neisseria |
| AU1922101A (en) | 1999-11-18 | 2001-05-30 | Chiron Corporation | Human fgf-21 gene and gene expression products |
| ES2588917T3 (es) | 2000-01-17 | 2016-11-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vacuna de VME suplementada contra meningococo |
| EP1854476A3 (en) | 2000-02-09 | 2008-05-07 | Bas Medical, Inc. | Use of relaxin to treat diseases related to vasoconstriction |
| WO2004093810A2 (en) | 2003-04-21 | 2004-11-04 | Epeius Biotechnologies, Inc. | Methods and compositions for treating disorders |
| JP2003531583A (ja) | 2000-03-08 | 2003-10-28 | カイロン コーポレイション | ヒトｆｇｆ−２３遺伝子および遺伝子発現産物 |
| WO2001090392A1 (en) | 2000-05-26 | 2001-11-29 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Novel recombinant adenovirus vector with relieved side effects |
| US7700359B2 (en) | 2000-06-02 | 2010-04-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Gene products differentially expressed in cancerous cells |
| EP1370684B1 (en) | 2000-06-15 | 2008-05-28 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Polynucleotides related to colon cancer |
| DE10045687B4 (de) * | 2000-09-15 | 2006-07-06 | MICROMUN Privates Institut für Mikrobiologische Forschung GmbH Biotechnikum Greifswald | Expressionskassetten und Adenovirusvektoren |
| MXPA03003690A (es) | 2000-10-27 | 2004-05-05 | Chiron Spa | Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos. |
| EP1415005B1 (en) | 2000-12-07 | 2012-11-21 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Endogenous retroviruses up-regulated in prostate cancer |
| GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
| GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
| AU2002305151A1 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-21 | Georgetown University | Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| WO2002081642A2 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-17 | Georgetown University | Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| WO2002081639A2 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-17 | Georgetown University | Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| ATE466020T1 (de) | 2001-11-09 | 2010-05-15 | Univ Georgetown | Neue isoform des gefässendothelzell wachstumshemmers (vegi) |
| ES2312649T3 (es) | 2001-12-12 | 2009-03-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Inmunizacion frente a chlamydia trachomatis. |
| ATE427363T1 (de) | 2002-01-08 | 2009-04-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | In kanzerísen mammazellen differentiell exprimierte genprodukte und ihre verwendungsverfahren |
| US7615229B2 (en) | 2002-03-15 | 2009-11-10 | Wyeth Holdings Corporation | Mutants of the P4 protein of nontypable Haemophilus influenzae with reduced enzymatic activity |
| CA2479730A1 (en) | 2002-03-21 | 2003-10-02 | Sagres Discovery, Inc. | Novel compositions and methods in cancer |
| US7244565B2 (en) | 2002-04-10 | 2007-07-17 | Georgetown University | Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US7138512B2 (en) | 2002-04-10 | 2006-11-21 | Georgetown University | Gene SHINC-2 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| ATE545651T1 (de) | 2002-06-13 | 2012-03-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Vektoren zur expression von hml-2-polypeptiden |
| AU2003243307B2 (en) * | 2002-06-21 | 2010-04-01 | Wellstat Biologics Corporation | Administration of therapeutic viruses |
| AU2003304238A1 (en) | 2002-10-08 | 2005-01-13 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating post-surgical pain by administering an anti-nerve growth factor antagonist antibody and compositions containing the same |
| PL211654B1 (pl) | 2002-10-08 | 2012-06-29 | Rinat Neuroscience Corp | Przeciwciało skierowane przeciwko NGF do zastosowania w leczeniu bólu pooperacyjnego, zastosowanie tego przeciwciała do wytwarzania leku do leczenia bólu pooperacyjnego i kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało skierowane przeciwko NGF do zastosowania w leczeniu bólu pooperacyjnego |
| UA80447C2 (en) | 2002-10-08 | 2007-09-25 | Methods for treating pain by administering nerve growth factor antagonist and opioid analgesic | |
| US7569364B2 (en) | 2002-12-24 | 2009-08-04 | Pfizer Inc. | Anti-NGF antibodies and methods using same |
| US9498530B2 (en) | 2002-12-24 | 2016-11-22 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same |
| SI1575517T1 (sl) | 2002-12-24 | 2012-06-29 | Rinat Neuroscience Corp | Protitelesa proti ĺ˝iväśnemu rastnemu dejavniku in metode njihove uporabe |
| US20070149449A1 (en) | 2003-02-14 | 2007-06-28 | Morris David W | Therapeutic targets in cancer |
| US7767387B2 (en) | 2003-06-13 | 2010-08-03 | Sagres Discovery, Inc. | Therapeutic targets in cancer |
| DE602004030535D1 (de) | 2003-02-19 | 2011-01-27 | Rinat Neuroscience Corp | Verfahren zur behandlung von schmerzen durch verabreichung eines nervenwachstumsfaktor-antagonisten und eines nsaid und diese enthaltende zusammensetzung |
| GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
| CN100429220C (zh) | 2003-06-04 | 2008-10-29 | 坎基股份有限公司 | 用于干扰素治疗的方法和组合物 |
| US20070009496A1 (en) * | 2003-11-21 | 2007-01-11 | Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. | Method of growing myocardial cells |
| KR20070001932A (ko) | 2003-12-23 | 2007-01-04 | 리나트 뉴로사이언스 코퍼레이션 | 작용물질 항 티알케이씨 항체 및 그의 사용 방법 |
| WO2005093064A1 (ja) | 2004-03-29 | 2005-10-06 | Galpharma Co., Ltd. | 新規ガレクチン９改変体タンパク質及びその用途 |
| EP1732949B1 (en) | 2004-04-07 | 2010-01-27 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating bone cancer pain by administering a nerve growth factor antagonist |
| PT1789593T (pt) | 2004-07-09 | 2017-04-24 | Henry M Jackson Found Advancement Military Medicine Inc | Formas solúveis de glicoproteína g de vírus hendra |
| US20060024677A1 (en) | 2004-07-20 | 2006-02-02 | Morris David W | Novel therapeutic targets in cancer |
| CA2575663C (en) | 2004-07-30 | 2013-04-23 | Rinat Neuroscience Corp. | Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same |
| JP5269412B2 (ja) | 2004-10-07 | 2013-08-21 | アルゴス セラピューティクス，インコーポレイティド | 成熟樹状細胞組成物およびその培養方法 |
| DK1858919T3 (da) | 2005-02-18 | 2012-07-16 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunogener fra uropathogen Escherichia coli |
| AU2006235258A1 (en) | 2005-04-07 | 2006-10-19 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Cancer-related genes |
| EP1865981A2 (en) | 2005-04-07 | 2007-12-19 | Chiron Corporation | Cacna1e in cancer diagnosis, detection and treatment |
| PL1879623T3 (pl) | 2005-05-02 | 2013-03-29 | Genzyme Corp | Terapia genowa zaburzeń rdzenia kręgowego |
| PL1879624T3 (pl) | 2005-05-02 | 2012-02-29 | Genzyme Corp | Terapia genowa dla zaburzeń neurometabolicznych |
| JP4997239B2 (ja) | 2005-07-22 | 2012-08-08 | ワイズ・エー・シー株式会社 | 抗ｃｄ２６抗体およびその使用方法 |
| SI3045182T1 (en) | 2005-11-14 | 2018-08-31 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | An antibody to a peptide-associated peptide antagonist to calcitonin for treating a headache in aggregates |
| US7935342B2 (en) | 2006-02-02 | 2011-05-03 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating obesity by administering a trkB antagonist |
| HUE041928T2 (hu) | 2006-02-08 | 2019-06-28 | Genzyme Corp | Génterápia A-típusú Niemann-Pick-betegségre |
| EP2044120B1 (en) | 2006-06-07 | 2019-01-30 | BioAlliance C.V. | Antibodies recognizing a carbohydrate containing epitope on cd-43 and cea expressed on cancer cells and methods using same |
| PL2029742T3 (pl) | 2006-06-07 | 2017-08-31 | Genzyme Corporation | Terapia genowa w stwardnieniu zanikowym bocznym i innych zaburzeniach rdzenia kręgowego |
| WO2008020335A2 (en) | 2006-06-09 | 2008-02-21 | Novartis Ag | Immunogenic compositions for streptococcus agalactiae |
| EP2064230A2 (en) | 2006-08-16 | 2009-06-03 | Novartis AG | Immunogens from uropathogenic escherichia coli |
| CN105770910A (zh) | 2006-10-03 | 2016-07-20 | 建新公司 | 肌萎缩性侧索硬化症和其它脊髓病症的基因治疗 |
| WO2008124176A2 (en) | 2007-04-10 | 2008-10-16 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Soluble and membrane-anchored forms of lassa virus subunit proteins |
| DK2158319T3 (da) | 2007-05-11 | 2012-03-19 | Enobia Pharma Inc | Knoglemålrettet alkalisk fosfatase, kits og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| CN101754682B (zh) | 2007-05-16 | 2014-11-12 | 布里格姆妇女医院 | 突触核蛋白病的治疗 |
| ES2635726T3 (es) | 2007-06-06 | 2017-10-04 | Genzyme Corporation | Terapia génica para enfermedades de almacenamiento lisosómico |
| GB0714963D0 (en) | 2007-08-01 | 2007-09-12 | Novartis Ag | Compositions comprising antigens |
| CN102335424B (zh) * | 2007-08-22 | 2013-12-04 | 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 | 利用ix蛋白展示狂犬病病毒保护性抗原的犬ii型腺病毒活载体重组疫苗 |
| US8153590B2 (en) | 2007-09-28 | 2012-04-10 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor Xa inhibitors and methods of using the same |
| WO2009062001A1 (en) | 2007-11-08 | 2009-05-14 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Stimulation of anti-tumor immunity using dendritic cell/tumor cell fusions and anti-cd3/cd28 |
| CA2709135C (en) | 2007-12-17 | 2018-06-05 | Pfizer Limited | Treatment of interstitial cystitis |
| ES2550757T3 (es) | 2007-12-18 | 2015-11-12 | Bioalliance C.V. | Anticuerpos que reconocen un epítopo que contiene carbohidratos en CD43 y ACE expresados en células cancerosas y métodos de uso de los mismos |
| EP2274437B1 (en) | 2008-04-10 | 2015-12-23 | Cell Signaling Technology, Inc. | Compositions and methods for detecting egfr mutations in cancer |
| WO2009150623A1 (en) | 2008-06-13 | 2009-12-17 | Pfizer Inc | Treatment of chronic prostatitis |
| TWI516501B (zh) | 2008-09-12 | 2016-01-11 | 禮納特神經系統科學公司 | Ｐｃｓｋ９拮抗劑類 |
| US20100180082A1 (en) * | 2009-01-12 | 2010-07-15 | Viasat, Inc. | Methods and systems for implementing url masking |
| WO2010086828A2 (en) | 2009-02-02 | 2010-08-05 | Rinat Neuroscience Corporation | Agonist anti-trkb monoclonal antibodies |
| US8568732B2 (en) | 2009-03-06 | 2013-10-29 | Novartis Ag | Chlamydia antigens |
| US20120114618A1 (en) | 2009-03-26 | 2012-05-10 | The Regents Of The University Of California | Mesenchymal Stem Cells Producing Inhibitory RNA for Disease Modification |
| FI3604510T3 (fi) | 2009-03-30 | 2025-06-26 | Alexion Pharma Inc | Vastalääkkeitä tekijä xa:n estäjille ja menetelmiä niiden käyttämiseksi |
| US20100297127A1 (en) | 2009-04-08 | 2010-11-25 | Ghilardi Nico P | Use of il-27 antagonists to treat lupus |
| DK2510947T3 (en) | 2009-04-14 | 2016-03-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Compositions for Immunization against Staphylococcus aureus. |
| CN101560521B (zh) * | 2009-06-01 | 2011-05-04 | 陕西师范大学 | 表达小干扰rna的va1缺失的腺病毒载体的构建方法 |
| WO2010146511A1 (en) | 2009-06-17 | 2010-12-23 | Pfizer Limited | Treatment of overactive bladder |
| US20120283136A1 (en) | 2009-06-24 | 2012-11-08 | The University Of Southern California | Compositions and methods for the rapid biosynthesis and in vivo screening of biologically relevant peptides |
| ES2605801T3 (es) | 2009-07-15 | 2017-03-16 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Formulación de dosis unitaria de antídoto para inhibidores del factor Xa para su uso en la prevención de la hemorragia |
| HRP20141270T1 (xx) | 2009-07-16 | 2015-03-13 | Novartis Ag | Detoksificirani imunogeni escherichie coli |
| RU2443779C2 (ru) * | 2009-10-09 | 2012-02-27 | Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН (ИМГ РАН) | Способ получения препарата рекомбинантного аденовируса, характеризующегося сниженным коэффициентом соотношения физических и инфекционных вирусных частиц, и генно-терапевтический лекарственный препарат, полученный таким способом |
| GB0919690D0 (en) | 2009-11-10 | 2009-12-23 | Guy S And St Thomas S Nhs Foun | compositions for immunising against staphylococcus aureus |
| AR080291A1 (es) | 2010-02-24 | 2012-03-28 | Rinat Neuroscience Corp | Anticuerpos antagonistas anti receptor de il-7 y procedimientos |
| GB201003333D0 (en) | 2010-02-26 | 2010-04-14 | Novartis Ag | Immunogenic proteins and compositions |
| CN105218674A (zh) | 2010-03-11 | 2016-01-06 | 瑞纳神经科学公司 | 呈pH依赖性抗原结合的抗体 |
| GB201005625D0 (en) | 2010-04-01 | 2010-05-19 | Novartis Ag | Immunogenic proteins and compositions |
| WO2011133931A1 (en) | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Genentech, Inc. | Use of il-27 antagonists for treating inflammatory bowel disease |
| EP2563907B1 (en) | 2010-04-28 | 2019-06-19 | The J. David Gladstone Institutes | Methods for generating cardiomyocytes |
| WO2011143124A2 (en) | 2010-05-10 | 2011-11-17 | The Regents Of The University Of California | Endoribonuclease compositions and methods of use thereof |
| WO2011154553A2 (en) | 2010-06-11 | 2011-12-15 | Cellartis Ab | Novel micrornas for the detection and isolaton of human embryonic stem cell-derived cardiac cell types |
| WO2012015758A2 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | Saint Louis University | Methods of treating pain |
| US9198975B2 (en) | 2010-12-01 | 2015-12-01 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for targeting sites of neovascular growth |
| WO2012072769A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-07 | Novartis Ag | Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations |
| US20130071375A1 (en) | 2011-08-22 | 2013-03-21 | Saint Louis University | Compositions and methods for treating inflammation |
| WO2013028527A1 (en) | 2011-08-23 | 2013-02-28 | Indiana University Research And Technology Corporation | Compositions and methods for treating cancer |
| WO2013033636A2 (en) | 2011-09-01 | 2013-03-07 | University Of Southern California | Methods for preparing high throughput peptidomimetics, orally bioavailable drugs and compositions containing same |
| CN104053672A (zh) | 2011-11-11 | 2014-09-17 | 瑞纳神经科学公司 | Trop-2特异性抗体及其用途 |
| WO2013090356A2 (en) | 2011-12-16 | 2013-06-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Opsin polypeptides and methods of use thereof |
| WO2013093693A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Rinat Neuroscience Corp. | Staphylococcus aureus specific antibodies and uses thereof |
| AU2012356206A1 (en) | 2011-12-22 | 2014-06-26 | Rinat Neuroscience Corp. | Human growth hormone receptor antagonist antibodies and methods of use thereof |
| SG10201809817UA (en) | 2012-05-25 | 2018-12-28 | Univ California | Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription |
| WO2013184209A1 (en) | 2012-06-04 | 2013-12-12 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Mif for use in methods of treating subjects with a neurodegenerative disorder |
| JP6578206B2 (ja) | 2012-07-19 | 2019-09-18 | レッドウッド バイオサイエンス， インコーポレイテッド | Ｃｄ２２に特異的な抗体およびその使用方法 |
| US8603470B1 (en) | 2012-08-07 | 2013-12-10 | National Cheng Kung University | Use of IL-20 antagonists for treating liver diseases |
| NZ630542A (en) | 2012-08-16 | 2017-06-30 | Ipierian Inc | Methods of treating a tauopathy |
| CA2888193A1 (en) | 2012-10-17 | 2014-04-24 | Eyal Breitbart | Treatment methods using adenovirus |
| JP6538561B2 (ja) | 2012-10-25 | 2019-07-03 | バイオベラティブ・ユーエスエイ・インコーポレイテッド | 抗補体Ｃ１ｓ抗体とそれらの用途 |
| CN116063483A (zh) | 2012-11-02 | 2023-05-05 | 美国比奥维拉迪维股份有限公司 | 抗补体C1s抗体和其用途 |
| WO2014071282A1 (en) | 2012-11-05 | 2014-05-08 | Genzyme Corporation | Compositions and methods for treating proteinopathies |
| WO2014072876A1 (en) | 2012-11-09 | 2014-05-15 | Pfizer Inc. | Platelet-derived growth factor b specific antibodies and compositions and uses thereof |
| WO2014127148A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | The J. David Gladstone Institutes | Compositions and methods of use thereof for identifying anti-viral agents |
| JP6450690B2 (ja) | 2013-02-15 | 2019-01-09 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | キメラ抗原受容体及びその使用方法 |
| HUE067575T2 (hu) | 2013-03-14 | 2024-10-28 | Genvivo Inc | Javított timidin-kináz gén |
| US20160039877A1 (en) | 2013-03-15 | 2016-02-11 | Shenzhen Hightide Biopharmaceutical, Ltd. | Compositions and methods of using islet neogenesis peptides and analogs thereof |
| CN118406688A (zh) | 2013-03-15 | 2024-07-30 | 武田药品工业株式会社 | 抗血浆激肽释放酶抗体 |
| AU2014264295A1 (en) | 2013-05-07 | 2015-10-29 | Rinat Neuroscience Corp. | Anti-glucagon receptor antibodies and methods of use thereof |
| EA039554B1 (ru) | 2013-06-10 | 2022-02-09 | АйПИЕРИАН, ИНК. | Способ снижения уровней a40 и/или a42 в нервной клетке и/или во внеклеточной жидкости |
| AU2014302038B2 (en) | 2013-06-25 | 2019-11-14 | Epiaxis Therapeutics Pty Ltd | Methods and compositions for modulating cancer stem cells |
| EP3044314B1 (en) | 2013-07-12 | 2019-04-10 | SeNa Research, Inc. | Methods and compositions for interference with dna polymerase and dna synthesis |
| US10208125B2 (en) | 2013-07-15 | 2019-02-19 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof |
| HUE046944T2 (hu) | 2013-07-18 | 2020-03-30 | Xalud Therapeutics Inc | Készítmény gyulladásos ízületi betegség kezelésére |
| CN113683695A (zh) | 2013-08-02 | 2021-11-23 | 辉瑞公司 | 抗cxcr4抗体及抗体-药物缀合物 |
| JP6998657B2 (ja) | 2013-09-18 | 2022-02-04 | エピアクシス セラピューティクス プロプライエタリー リミテッド | 幹細胞調節ｉｉ |
| RU2708140C1 (ru) | 2013-11-13 | 2019-12-04 | Пфайзер Инк. | Антитела, специфичные в отношении лиганда 1А, подобного фактору некроза опухолей, и их композиции и применения |
| EP3760719A1 (en) | 2013-11-18 | 2021-01-06 | CRISPR Therapeutics AG | Crispr-cas system materials and methods |
| WO2015087187A1 (en) | 2013-12-10 | 2015-06-18 | Rinat Neuroscience Corp. | Anti-sclerostin antibodies |
| US9994831B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-06-12 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid |
| WO2015109212A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-07-23 | Pfizer Inc. | Anti-il-2 antibodies and compositions and uses thereof |
| HUE065397T2 (hu) | 2014-03-21 | 2024-06-28 | Teva Pharmaceuticals Int Gmbh | Kalcitonin génekkel kapcsolatos peptid elleni antagonista antitestek és azokat alkalmazó eljárások |
| AU2015235967B2 (en) | 2014-03-27 | 2020-10-22 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Compositions and methods for treatment of diabetic macular edema |
| EP3139955B1 (en) | 2014-04-30 | 2024-03-20 | President and Fellows of Harvard College | Fusion proteins for treating cancer and related methods |
| US10329556B2 (en) | 2014-05-13 | 2019-06-25 | Bioatla, Llc | Conditionally active biological proteins |
| DK3480213T3 (da) | 2014-06-18 | 2020-02-17 | Albert Einstein College Medicine | Syntac-polypeptider og anvendelser deraf |
| US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
| PL3177640T3 (pl) | 2014-08-08 | 2020-11-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Charakteryzujące się wysokim powinowactwem środki terapeutyczne naśladujące PD-11 i sposoby ich wykorzystania |
| JP2017528452A (ja) | 2014-08-25 | 2017-09-28 | ユニバーシティ・オブ・キャンベラＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｎｂｅｒｒａ | がん幹細胞を調節するための組成物およびその使用 |
| US11111288B2 (en) | 2014-08-28 | 2021-09-07 | Bioatla, Inc. | Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells |
| ES3034398T3 (en) | 2014-08-28 | 2025-08-18 | Bioatla Inc | Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells |
| US10513699B2 (en) | 2014-09-03 | 2019-12-24 | Bioatla, Llc | Discovering and producing conditionally active biologic proteins in the same eukaryotic cell production hosts |
| EA201790534A1 (ru) | 2014-09-07 | 2017-07-31 | Селекта Байосайенсиз, Инк. | Способы и композиции для ослабления иммунных ответов против вирусного вектора для переноса, предназначенного для генной терапии |
| MX2017003062A (es) | 2014-09-09 | 2017-12-14 | Unum Therapeutics | Receptores quimericos y usos de los mismos en terapia inmune. |
| GB201417042D0 (en) * | 2014-09-29 | 2014-11-12 | Fkd Therapies Oy | Method |
| RU2708068C2 (ru) | 2014-12-05 | 2019-12-04 | Алексион Фармасьютикалз, Инк. | Лечение судорог с использованием рекомбинантной щелочной фосфатазы |
| TWI595006B (zh) | 2014-12-09 | 2017-08-11 | 禮納特神經系統科學公司 | 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法 |
| EP4670785A3 (en) | 2015-01-02 | 2026-04-01 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Bispecific antibodies against plasma kallikrein and factor xii |
| EP3858992A1 (en) | 2015-03-13 | 2021-08-04 | The Jackson Laboratory | A three-component crispr/cas complex system and uses thereof |
| WO2016160973A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
| WO2016160968A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating acute myeloid leukemia |
| US20180071340A1 (en) | 2015-03-30 | 2018-03-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating multiple myeloma |
| WO2016160966A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating renal cell cancer |
| US20180085398A1 (en) | 2015-03-30 | 2018-03-29 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
| IL318523A (en) | 2015-04-06 | 2025-03-01 | Bioverativ Usa Inc | Human anti-C1S antibodies and methods of using them |
| US9758575B2 (en) | 2015-04-06 | 2017-09-12 | Yung Shin Pharmaceutical Industrial Co. Ltd. | Antibodies which specifically bind to canine vascular endothelial growth factor and uses thereof |
| AU2016246655B2 (en) | 2015-04-07 | 2021-07-22 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Methods for inducing cell division of postmitotic cells |
| PT3283106T (pt) | 2015-04-13 | 2022-02-02 | Pfizer | Anticorpos terapêuticos e as suas utilizações |
| AU2016256895B2 (en) | 2015-05-07 | 2022-05-26 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Glucocerebrosidase gene therapy for parkinson's disease |
| US10392607B2 (en) | 2015-06-03 | 2019-08-27 | The Regents Of The University Of California | Cas9 variants and methods of use thereof |
| WO2017004579A1 (en) | 2015-07-01 | 2017-01-05 | O'connor Colleen M | Artificial antigen presenting cells for adoptive cell therapy against cancer |
| WO2017011275A1 (en) | 2015-07-10 | 2017-01-19 | Nersissian Aram M | Factor viii protein compositions and methods of treating hemophilia a |
| US10877045B2 (en) | 2015-07-21 | 2020-12-29 | Saint Louis University | Compositions and methods for diagnosing and treating endometriosis-related infertility |
| KR20250054123A (ko) | 2015-07-21 | 2025-04-22 | 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 | Xiia 인자의 단일클론 항체 저해제 |
| WO2017015619A1 (en) | 2015-07-23 | 2017-01-26 | The Regents Of The University Of California | Antibodies to coagulation factor xia and uses thereof |
| EP3328429B1 (en) | 2015-07-31 | 2025-07-16 | The Research Institute at Nationwide Children's Hospital | Peptides and antibodies for the removal of biofilms |
| EP3331536A4 (en) | 2015-08-03 | 2019-03-27 | The Regents of The University of California | COMPOSITIONS AND METHODS OF MODULATING THE ABHD2 ACTIVITY |
| AU2016307967C9 (en) | 2015-08-19 | 2025-02-20 | Pfizer Inc. | Tissue factor pathway inhibitor antibodies and uses thereof |
| PL3344654T3 (pl) | 2015-09-02 | 2021-05-17 | Immutep S.A.S. | Przeciwciała anty-lag-3 |
| WO2017049011A1 (en) | 2015-09-15 | 2017-03-23 | Scholar Rock, Inc. | Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof |
| EP3353297A1 (en) | 2015-09-24 | 2018-08-01 | Crispr Therapeutics AG | Novel family of rna-programmable endonucleases and their uses in genome editing and other applications |
| EP3365027B1 (en) | 2015-10-14 | 2022-03-30 | Research Institute at Nationwide Children's Hospital | Hu specific antibodies and their use in inhibiting biofilm |
| WO2017066760A1 (en) | 2015-10-16 | 2017-04-20 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Compositions and methods for inhibition of lineage specific antigens |
| US10138298B2 (en) | 2015-10-23 | 2018-11-27 | The Regents Of The University Of California | Anti-IL-2 antibodies and compositions and uses thereof |
| WO2017075037A1 (en) | 2015-10-27 | 2017-05-04 | Scholar Rock, Inc. | Primed growth factors and uses thereof |
| CN106699889A (zh) | 2015-11-18 | 2017-05-24 | 礼进生物医药科技（上海）有限公司 | 抗pd-1抗体及其治疗用途 |
| CN108697762A (zh) | 2015-11-20 | 2018-10-23 | 丹娜法伯癌症研究院 | 治疗癌症的组合物和方法 |
| SG11201805420SA (en) | 2015-12-30 | 2018-07-30 | Kodiak Sciences Inc | Antibodies and conjugates thereof |
| CN109310727B (zh) | 2016-01-08 | 2022-09-27 | 加利福尼亚大学董事会 | 有条件活性的异二聚体多肽及其使用方法 |
| JP2019506398A (ja) | 2016-01-21 | 2019-03-07 | ファイザー・インク | 上皮増殖因子受容体変異体ｉｉｉおよびｃｄ３の単一および二重特異性抗体およびそれらの使用 |
| CN109414498A (zh) | 2016-03-03 | 2019-03-01 | Cue生物制药公司 | T细胞调节性多聚体多肽及其使用方法 |
| US12128102B2 (en) | 2016-03-08 | 2024-10-29 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Constrained conditionally activated binding proteins |
| US11325948B2 (en) | 2016-03-19 | 2022-05-10 | Exuma Biotech Corp. | Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL |
| US11111505B2 (en) | 2016-03-19 | 2021-09-07 | Exuma Biotech, Corp. | Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof |
| WO2020047527A2 (en) | 2018-09-02 | 2020-03-05 | F1 Bioventures, Llc | Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes in blood or in enriched pbmcs |
| US10596274B2 (en) | 2016-03-19 | 2020-03-24 | Exuma Biotech Corp. | Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulated expansion thereof |
| US20190125848A1 (en) | 2016-03-30 | 2019-05-02 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Dendritic cell-extracellular vesicle fusions and methods of using same |
| CN116790614A (zh) | 2016-04-04 | 2023-09-22 | 比奥贝拉蒂美国公司 | 抗补体因子bb抗体以及其用途 |
| HUE055862T2 (hu) | 2016-04-20 | 2021-12-28 | Centro De Investig Energeticas | Készítmények és eljárások PKLR fokozott génexpressziójára |
| LT3455261T (lt) | 2016-05-13 | 2022-11-10 | Bioatla, Inc. | Antikūnai prieš ror2, antikūnų fragmentai, jų imunokonjugatai ir panaudojimas |
| BR112018073606A2 (pt) | 2016-05-18 | 2019-02-26 | Cue Biopharma, Inc. | polipeptídeos multiméricos moduladores de células t e métodos de uso dos mesmos |
| EP3458095A4 (en) | 2016-05-18 | 2019-11-27 | Albert Einstein College of Medicine | VARIANT PD-L1 POLYPEPTIDE, T-CELL MODULATING MULTIPLE POLYPEPTIDE AND METHOD OF USE THEREOF |
| CA3030003A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | F1 Oncology, Inc. | Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof |
| US20190218261A1 (en) | 2016-09-13 | 2019-07-18 | The Jackson Laboratory | Targeted enhanced dna demethylation |
| US10578610B2 (en) | 2016-09-20 | 2020-03-03 | Washington University | Peptide regulators of mitochondrial fusion and methods of use |
| JP7069138B2 (ja) | 2016-10-12 | 2022-05-17 | バイオベラティブ・ユーエスエイ・インコーポレイテッド | 抗Ｃ１ｓ抗体およびその使用方法 |
| WO2018075559A1 (en) | 2016-10-17 | 2018-04-26 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Signature-based human immunodeficiency virus (hiv) envelope (env) trimer vaccines and methods of using the same |
| WO2018080573A1 (en) | 2016-10-28 | 2018-05-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Crispr/cas global regulator screening platform |
| CA3042944A1 (en) | 2016-11-14 | 2018-05-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
| CA3042945A1 (en) | 2016-11-14 | 2018-05-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
| US11332713B2 (en) | 2016-11-16 | 2022-05-17 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
| CN110325205B (zh) | 2016-12-22 | 2023-08-15 | 库尔生物制药有限公司 | T细胞调节性多聚体多肽及其使用方法 |
| WO2018129092A1 (en) | 2017-01-04 | 2018-07-12 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Antibody fragments for the treatment of biofilm-related disorders |
| KR20190104194A (ko) | 2017-01-07 | 2019-09-06 | 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. | 합성 나노담체에 커플링된 면역억제제의 패턴화된 투여 |
| WO2018129474A1 (en) | 2017-01-09 | 2018-07-12 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
| US12187801B2 (en) | 2017-01-18 | 2025-01-07 | Exuma Biotech Corp. | Chimeric antigen receptors against AXL or ROR2 and methods of use thereof |
| EP3571294A1 (en) | 2017-01-18 | 2019-11-27 | F1 Oncology, Inc. | Methods of transducing and expanding immune cells and uses thereof |
| WO2018148246A1 (en) | 2017-02-07 | 2018-08-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for rna-guided genetic circuits |
| EP3579877A4 (en) | 2017-02-09 | 2020-12-09 | The Regents of The University of California | CHEMERIC T-LYMPHOCYTE ANTIGENIC RECEPTORS AND METHODS OF USE |
| BR112019018288A2 (pt) | 2017-03-03 | 2020-03-31 | F1 Oncology, Inc. | Métodos e composições para transduzir e expandir linfócitos e regular a atividade dos mesmos |
| BR112019017500A2 (pt) | 2017-03-03 | 2020-04-14 | Rinat Neuroscience Corp | anticorpos anti-gitr e métodos de uso dos mesmos |
| JP7177076B2 (ja) | 2017-03-16 | 2022-11-22 | ファイザー・インク | チロシン原栄養性 |
| US11827705B2 (en) | 2017-03-28 | 2023-11-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods to protect transplanted tissue from rejection |
| DK3601367T3 (da) | 2017-03-30 | 2025-01-13 | Univ Queensland | Kimære molekyler og anvendelse deraf |
| WO2018191548A2 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Kodiak Sciences Inc. | Complement factor d antagonist antibodies and conjugates thereof |
| US11279755B2 (en) | 2017-04-25 | 2022-03-22 | Lbl Biotechnology, Inc. | Use of IL-20 antagonists for treating eye diseases |
| BR112019025243A2 (pt) | 2017-06-02 | 2020-07-14 | Pfizer Inc. | anticorpos específicos para flt3 e usos dos mesmos |
| US11430545B2 (en) | 2017-06-13 | 2022-08-30 | Bostongene Corporation | Systems and methods for generating, visualizing and classifying molecular functional profiles |
| US12331103B2 (en) | 2017-06-16 | 2025-06-17 | Protelica, Inc. | Fibronectin binding domain chimeric antigen receptors and methods of use thereof |
| WO2019016784A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Universidade De Coimbra | ANTI-NUCLEOLIN ANTIBODIES |
| KR102609021B1 (ko) | 2017-07-25 | 2023-12-06 | 옥스포드 제네틱스 리미티드 | 아데노바이러스 벡터 |
| US12076369B2 (en) | 2017-09-01 | 2024-09-03 | The Frances Crick Institute Limited | Immunoregulatory molecules and uses therefor |
| CN111315768A (zh) | 2017-09-07 | 2020-06-19 | 库尔生物制药有限公司 | 具有缀合位点的t细胞调节性多聚体多肽及其使用方法 |
| JP2020534811A (ja) | 2017-09-08 | 2020-12-03 | マベリック セラピューティクス， インコーポレイテッドＭａｖｅｒｉｃｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． | Ｆｃ領域を含有する条件的に活性化された結合部分 |
| EP3679067A2 (en) | 2017-09-08 | 2020-07-15 | Maverick Therapeutics, Inc. | Constrained conditionally activated binding proteins |
| EP3684421A4 (en) | 2017-09-18 | 2021-08-04 | Children's Hospital Medical Center | STRONG INSULATOR AND ITS USES IN GENE ADMINISTRATION |
| AU2018344859A1 (en) | 2017-10-04 | 2020-04-30 | Hesperix SA | Articles and methods directed to personalized therapy of cancer |
| WO2019075220A1 (en) | 2017-10-11 | 2019-04-18 | Bioverativ Usa Inc. | METHODS FOR INDUCING COMPLEMENT ACTIVITY |
| MX2020003838A (es) | 2017-10-13 | 2020-08-06 | Selecta Biosciences Inc | Metodos y composiciones para atenuar las respuestas de inmunoglobulina m del vector de transferencia antiviral. |
| MX2020003954A (es) | 2017-10-16 | 2020-10-05 | Consorcio Centro De Investig Biomedica En Red M P | Vectores lentivirales para suministro de pklr para el tratamiento de deficiencia de piruvato quinasa. |
| US11266743B2 (en) | 2017-10-25 | 2022-03-08 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Peptide compositions and methods of use thereof |
| SG11202003652QA (en) | 2017-10-27 | 2020-05-28 | Univ New York | Anti-galectin-9 antibodies and uses thereof |
| WO2019118935A1 (en) | 2017-12-14 | 2019-06-20 | Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership | Novel rna-programmable endonuclease systems and their use in genome editing and other applications |
| WO2019139896A1 (en) | 2018-01-09 | 2019-07-18 | Cue Biopharma, Inc. | Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof |
| EP3746483A1 (en) | 2018-02-01 | 2020-12-09 | Pfizer Inc | Chimeric antigen receptors targeting cd70 |
| WO2019152705A1 (en) | 2018-02-01 | 2019-08-08 | Pfizer Inc. | Antibodies specific for cd70 and their uses |
| US11667949B2 (en) | 2018-02-15 | 2023-06-06 | The Trustees Of Princeton University | Reporter construct and biosensor for interferon second messenger 2-5A |
| AU2019225251A1 (en) | 2018-02-26 | 2020-10-15 | AnTolRx, Inc. | Tolerogenic liposomes and methods of use thereof |
| CN112513070A (zh) | 2018-02-28 | 2021-03-16 | 辉瑞公司 | Il-15变体及其用途 |
| CA3092588A1 (en) | 2018-03-02 | 2019-09-06 | Kodiak Sciences Inc. | Il-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof |
| AU2019234926B2 (en) | 2018-03-15 | 2026-02-05 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
| US20190284553A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-09-19 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
| CA3092497A1 (en) | 2018-03-19 | 2019-09-26 | Crispr Therapeutics Ag | Novel rna-programmable endonuclease systems and uses thereof |
| US11447769B2 (en) | 2018-03-27 | 2022-09-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modified immune cells having enhanced function and methods for screening for same |
| WO2019195596A1 (en) | 2018-04-06 | 2019-10-10 | The Regents Of The University Of California | Methods of treating glioblastomas |
| US12144826B2 (en) | 2018-04-06 | 2024-11-19 | The Regents Of The University Of California | Methods of treating EGFRvIII expressing glioblastomas |
| SG11202008400SA (en) | 2018-04-11 | 2020-09-29 | Rocket Pharmaceuticals Ltd | Compositions and methods for stem cell transplant |
| AU2019269601A1 (en) | 2018-05-17 | 2020-11-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Drug-resistant immune cells and methods of use thereof |
| US12497608B2 (en) | 2018-05-22 | 2025-12-16 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Gene therapy for Alzheimer's disease |
| CA3100829A1 (en) | 2018-05-23 | 2019-11-28 | Pfizer Inc. | Antibodies specific for gucy2c and uses thereof |
| ES2984950T3 (es) | 2018-05-23 | 2024-10-31 | Pfizer | Anticuerpos específicos para CD3 y sus usos |
| AU2019299439C1 (en) | 2018-07-03 | 2025-06-26 | Sotio Biotech, Inc. | Chimeric receptors in combination with trans metabolism molecules enhancing glucose import and therapeutic uses thereof |
| CN113039276A (zh) | 2018-07-16 | 2021-06-25 | 密歇根大学董事会 | 核酸酶介导的核酸修饰 |
| CN112672790A (zh) | 2018-08-09 | 2021-04-16 | 马弗里克治疗公司 | 条件性活化的结合蛋白的共表达和纯化方法 |
| MX2021001771A (es) | 2018-08-14 | 2021-07-16 | Sotio Llc | Polipéptidos del receptor de antígeno quimérico en combinación con moléculas del metabolismo trans que modulan el ciclo de krebs y usos terapéuticos de los mismos. |
| SG11202101421RA (en) * | 2018-08-16 | 2021-03-30 | Spacecraft Seven Llc | Production methods for viral vectors |
| WO2020041456A1 (en) | 2018-08-22 | 2020-02-27 | The Regents Of The University Of California | Variant type v crispr/cas effector polypeptides and methods of use thereof |
| AU2019333104B2 (en) | 2018-08-28 | 2026-03-19 | Vor Biopharma Inc. | Genetically engineered hematopoietic stem cells and uses thereof |
| SG11202102058UA (en) | 2018-08-30 | 2021-03-30 | Tenaya Therapeutics Inc | Cardiac cell reprogramming with myocardin and ascl1 |
| CA3114925A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Compositions and methods for enzymatic disruption of bacterial biofilms |
| EP3827016B1 (en) | 2018-10-15 | 2025-12-03 | Elixiron Immunotherapeutics (Hong Kong) Limited | Antibodies to granulocyte-macrophage colony stimulating factor and uses thereof |
| WO2020097445A1 (en) | 2018-11-09 | 2020-05-14 | Inari Agriculture, Inc. | Rna-guided nucleases and dna binding proteins |
| JP7564102B2 (ja) | 2018-11-28 | 2024-10-08 | クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト | ＬＮＰでの使用に最適化された、ＣＡＳ９をコードするｍＲＮＡ |
| TWI856047B (zh) | 2018-12-19 | 2024-09-21 | 美商信號生物製藥公司 | 多聚體ｔ細胞調節多肽及其使用方法 |
| AU2019401647A1 (en) | 2018-12-21 | 2021-07-08 | Multitude Inc. | Antibodies specific to MUC18 |
| EP4434541A3 (en) | 2019-01-23 | 2025-02-26 | New York University | Antibodies specific to delta 1 chain of t cell receptor |
| CN114390938B (zh) | 2019-03-05 | 2025-03-21 | 武田药品工业有限公司 | 受约束的条件性活化的结合蛋白 |
| WO2020181145A1 (en) | 2019-03-05 | 2020-09-10 | Maverick Therapeutics, Inc. | Conditionally activated binding proteins containing fc regions and moieties targeting tumor antigens |
| EP3935079A4 (en) | 2019-03-06 | 2023-03-22 | Cue Biopharma, Inc. | T-CELL MODULATING ANTIGEN PRESENT POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE THEREOF |
| JP2022522405A (ja) | 2019-03-06 | 2022-04-19 | キュー バイオファーマ， インコーポレイテッド | Ｔ細胞調節多量体ポリペプチド及びその使用方法 |
| DE212020000516U1 (de) | 2019-03-07 | 2022-01-17 | The Regents of the University of California | CRISPR-CAS-Effektorpolypeptide |
| EP3937963B1 (en) | 2019-03-12 | 2025-05-07 | CRISPR Therapeutics AG | Novel high fidelity rna-programmable endonuclease systems and uses thereof |
| JP7630176B2 (ja) | 2019-04-01 | 2025-02-17 | テナヤ セラピューティクス， インコーポレイテッド | 操作されたカプシドを有するアデノ随伴ウイルス |
| EP3946626A1 (en) | 2019-04-02 | 2022-02-09 | Kenjockety Biotechnology, Inc. | Efflux pump-cancer antigen multi-specific antibodies and compositions, reagents, kits and methods related thereto |
| WO2020223205A1 (en) | 2019-04-28 | 2020-11-05 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods for treatment of subjects with preexisting immunity to viral transfer vectors |
| WO2020242892A1 (en) | 2019-05-24 | 2020-12-03 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Gene therapy for alzheimer's disease |
| CA3141863A1 (en) | 2019-05-28 | 2020-12-03 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuated anti-viral transfer vector immune response |
| US12205675B2 (en) | 2019-07-03 | 2025-01-21 | Bostongene Corporation | Techniques for bias correction in sequence data |
| CN114401986B (zh) | 2019-07-08 | 2024-11-08 | 国家儿童医院研究所 | 破坏生物膜的抗体组合物 |
| WO2021007515A1 (en) | 2019-07-11 | 2021-01-14 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors |
| US12214218B2 (en) | 2019-07-31 | 2025-02-04 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Perfusion modulated tumor dose sculpting with single dose radiotherapy |
| WO2021071830A1 (en) | 2019-10-07 | 2021-04-15 | University Of Virginia Patent Foundation | Modulating lymphatic vessels in neurological disease |
| AU2020364071A1 (en) | 2019-10-10 | 2022-05-26 | Kodiak Sciences Inc. | Methods of treating an eye disorder |
| CA3152623A1 (en) | 2019-10-11 | 2021-04-15 | Richard D. Cummings | Anti-tn antibodies and uses thereof |
| EP4034170B1 (en) | 2019-10-23 | 2026-02-11 | Cue Biopharma, Inc. | Tgf-beta polypeptides |
| CN115298310A (zh) | 2019-11-29 | 2022-11-04 | 帕罗斯生物公司 | 神经退化病症的基因疗法 |
| WO2021113736A1 (en) | 2019-12-05 | 2021-06-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Single-domain antibody to chloramphenicol |
| WO2021151079A1 (en) | 2020-01-24 | 2021-07-29 | University Of Virginia Patent Foundation | Modulating lymphatic vessels in neurological disease |
| BR112022017551A2 (pt) | 2020-03-02 | 2022-11-16 | Tenaya Therapeutics Inc | Controle de vetor genético por micrornas expressos por cardiomiócito |
| AU2021236669A1 (en) | 2020-03-18 | 2022-11-10 | Ceramedix Holding, Llc | Anti-ceramide antibodies |
| WO2021205325A1 (en) | 2020-04-08 | 2021-10-14 | Pfizer Inc. | Anti-gucy2c antibodies and uses thereof |
| WO2021224850A1 (en) | 2020-05-06 | 2021-11-11 | Crispr Therapeutics Ag | Mask peptides and masked anti-ptk7 antibodies comprising such |
| CA3182969A1 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Kenjockety Biotechnology, Inc. | Abcg2 efflux pump-cancer antigen multi-specific antibodies and compositions, reagents, kits and methods related thereto |
| WO2021257512A1 (en) | 2020-06-15 | 2021-12-23 | Academia Sinica | Humanized ace2-fc fusion protein for treatment and prevention of sars-cov-2 infection |
| CN116323668A (zh) | 2020-07-17 | 2023-06-23 | 辉瑞公司 | 治疗性抗体及其用途 |
| EP4182353A1 (en) | 2020-07-17 | 2023-05-24 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-idiotypic antibodies against anti-klk2 antibodies |
| US20230287455A1 (en) | 2020-07-30 | 2023-09-14 | Pfizer Inc. | Cells Having Gene Duplications and Uses Thereof |
| EP4176058A1 (en) | 2020-08-07 | 2023-05-10 | The Jackson Laboratory | Targeted sequence insertion compositions and methods |
| US12145965B2 (en) | 2020-09-03 | 2024-11-19 | Dalan Animal Health, Inc. | Use of vitellogenin for defining and testing novel immunogens in insects |
| WO2022076648A1 (en) | 2020-10-09 | 2022-04-14 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions |
| US11781156B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-10-10 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions |
| US20240029829A1 (en) | 2020-12-04 | 2024-01-25 | Bostongene Corporation | Hierarchical machine learning techniques for identifying molecular categories from expression data |
| CN116981697A (zh) | 2021-01-14 | 2023-10-31 | 森迪生物科学公司 | 可分泌有效载荷调节 |
| WO2022187289A1 (en) | 2021-03-01 | 2022-09-09 | Exuma Biotech Corp. | Methods and compositions for the delivery of retroviral particles |
| EP4330969A1 (en) | 2021-04-29 | 2024-03-06 | BostonGene Corporation | Machine learning techniques for estimating tumor cell expression in complex tumor tissue |
| MX2023014793A (es) | 2021-06-10 | 2024-03-25 | Janssen Biotech Inc | Codificacion de acido nucleico para la proteína de fusión klk2-gpi, células recombinantes y usos de estos. |
| EP4101928A1 (en) | 2021-06-11 | 2022-12-14 | Bayer AG | Type v rna programmable endonuclease systems |
| US20240141312A1 (en) | 2021-06-11 | 2024-05-02 | Bayer Aktiengesellschaft | Type v rna programmable endonuclease systems |
| US20240327496A1 (en) | 2021-08-02 | 2024-10-03 | Pfizer Inc. | Improved Expression Vectors and Uses Thereof |
| WO2023021494A1 (en) | 2021-08-20 | 2023-02-23 | Rudd Christopher E | Compositions and methods for anti-virus chimeric antigen receptor |
| EP4144841A1 (en) | 2021-09-07 | 2023-03-08 | Bayer AG | Novel small rna programmable endonuclease systems with impoved pam specificity and uses thereof |
| AU2022349103A1 (en) | 2021-09-27 | 2024-03-28 | Sotio Biotech Inc. | Chimeric receptor polypeptides in combination with trans metabolism molecules that re-direct glucose metabolites out of the glycolysis pathway and therapeutic uses thereof |
| US20230141563A1 (en) | 2021-10-12 | 2023-05-11 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses |
| EP4433515A1 (en) | 2021-11-16 | 2024-09-25 | SOTIO Biotech Inc. | Treatment of myxoid/round cell liposarcoma patients |
| EP4433512A4 (en) | 2021-11-19 | 2025-12-31 | Univ Pennsylvania | Genetically modified pan-leukocyte-specific CD45 antigen to facilitate T-lymphocyte therapy |
| MX2024006506A (es) | 2021-11-30 | 2024-08-14 | Sanofi Pasteur Inc | Vacunas basadas en vectores virales de metapneumovirus humano. |
| EP4448007A1 (en) | 2021-12-13 | 2024-10-23 | William Robert Arathoon Living Trust Dated August 29, 2016 | Anti-abcb1 antibodies |
| CA3243301A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | Bayer Aktiengesellschaft | NEW SMALL PROGRAMMABLE TYPE V RNA ENDONUCLEASE SYSTEMS |
| CA3249858A1 (en) | 2022-01-31 | 2023-08-03 | Bostongene Corporation | MACHINE LEARNING TECHNIQUES FOR CYTOMETRY |
| KR20240139082A (ko) | 2022-02-02 | 2024-09-20 | 화이자 인코포레이티드 | 시스테인 프로토트로피 |
| WO2023159220A1 (en) | 2022-02-18 | 2023-08-24 | Kenjockety Biotechnology, Inc. | Anti-cd47 antibodies |
| EP4469586A1 (en) | 2022-03-01 | 2024-12-04 | Exuma Biotech Corp. | Viral particles with membrane-bound hyaluronidase |
| US20230357437A1 (en) | 2022-03-09 | 2023-11-09 | Selecta Biosciences, Inc. | Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing |
| AU2023284048A1 (en) | 2022-06-10 | 2024-11-14 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel small type v rna programmable endonuclease systems |
| EP4299733A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-03 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
| WO2024005864A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
| EP4299739A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-03 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
| WO2024005863A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
| EP4555107B1 (en) | 2022-07-15 | 2026-03-11 | BostonGene Corporation | Techniques for detecting homologous recombination deficiency (hrd) |
| EP4572787A1 (en) | 2022-08-19 | 2025-06-25 | SOTIO Biotech Inc. | Genetically engineered immune cells with chimeric receptor polypeptides in combination with multiple trans metabolism molecules and therapeutic uses thereof |
| WO2024040207A1 (en) | 2022-08-19 | 2024-02-22 | Sotio Biotech Inc. | Genetically engineered natural killer (nk) cells with chimeric receptor polypeptides in combination with trans metabolism molecules and therapeutic uses thereof |
| WO2024044659A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | Tectonic Therapeutic, Inc. | Constitutively active g protein-coupled receptor compositions and methods of use thereof |
| WO2024068996A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (C.H.U.V.) | Anti-sars-cov-2 antibodies and use thereof in the treatment of sars-cov-2 infection |
| WO2024102942A1 (en) | 2022-11-09 | 2024-05-16 | The Regents Of The University Of California | High-throughput discovery of multi-partite crispr-based editors |
| WO2024105633A1 (en) | 2022-11-18 | 2024-05-23 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Compositions for mitophagy induction and uses thereof |
| AU2023398007A1 (en) | 2022-12-13 | 2025-06-19 | Bayer Aktiengesellschaft | Engineered type v rna programmable endonucleases and their uses |
| TW202449160A (zh) | 2023-02-06 | 2024-12-16 | 美商藍岩醫療公司 | 降解決定子(degron)融合蛋白及其生產及使用方法 |
| WO2024178397A2 (en) | 2023-02-24 | 2024-08-29 | Elevatebio Technologies, Inc. | Modified immune effector cells and methods of use |
| KR20250164239A (ko) | 2023-03-15 | 2025-11-24 | 교토후고리츠다이가쿠호진 | 펩티드 발현 구축물 및 그의 용도 |
| WO2024215989A1 (en) | 2023-04-14 | 2024-10-17 | Sotio Biotech Inc. | ENGINEERED IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-2/IL-15 RECEPTOR βγ AGONISTS |
| WO2024215987A1 (en) | 2023-04-14 | 2024-10-17 | Sotio Biotech Inc. | IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-15/IL-15Rα CONJUGATES |
| GB202307563D0 (en) | 2023-05-19 | 2023-07-05 | Univ King Abdullah Sci & Tech | Methods and compositions |
| AU2024277678A1 (en) | 2023-05-25 | 2025-11-27 | Dispatch Biotherapeutics, Inc. | Synthetic cancer antigens as targets for treating cancers |
| KR20260033032A (ko) | 2023-06-29 | 2026-03-10 | 디스패치 바이오테라퓨틱스, 인크. | 합성 시토카인 수용체 |
| WO2025030010A1 (en) | 2023-08-01 | 2025-02-06 | Vor Biopharma Inc. | Compositions comprising genetically engineered hematopoietic stem cells and methods of use thereof |
| AU2024324215A1 (en) | 2023-08-11 | 2026-02-26 | Abalytics Oncology, Inc. | Anti-ctla-4 antibodies and related binding molecules and methods and uses thereof |
| WO2025076291A1 (en) | 2023-10-06 | 2025-04-10 | Bluerock Therapeutics Lp | Engineered type v rna programmable endonucleases and their uses |
| WO2025096811A1 (en) | 2023-10-31 | 2025-05-08 | Bostongene Corporation | Machine learning technique for identifying ici responders and non-responders |
| WO2025111402A1 (en) | 2023-11-21 | 2025-05-30 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Anti-amyloid beta antibodies and related compositions and methods thereof |
| US20250230251A1 (en) | 2023-12-20 | 2025-07-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibodies targeting il-18 receptor beta (il-18rb) and related methods |
| WO2025165590A1 (en) | 2024-02-02 | 2025-08-07 | Seven Bridges Genomics Inc. | Techniques for improved tumor mutational burden (tmb) determination using a population-specific genomic reference |
| WO2025171388A1 (en) | 2024-02-09 | 2025-08-14 | Dispatch Biotherapeutics, Inc. | Engineered cancer antigens with modified domains and related methods and uses |
| WO2025171383A2 (en) | 2024-02-09 | 2025-08-14 | Dispatch Biotherapeutics, Inc. | Engineered cancer antigens and related methods and uses |
| WO2025199352A2 (en) | 2024-03-20 | 2025-09-25 | Juno Therapeutics, Inc. | Antibodies specific for solute carrier family 34 member 2 (slc34a2) |
| WO2025240670A2 (en) | 2024-05-15 | 2025-11-20 | Abalytics Oncology, Inc. | Anti-pd-1 antibodies and related binding molecules and methods and uses thereof |
| WO2026006767A1 (en) | 2024-06-28 | 2026-01-02 | Dispatch Biotherapeutics, Inc. | Tethered il-9/il-9r and related engineered cells and methods |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4567253A (en) * | 1984-02-03 | 1986-01-28 | Tony Durst | 2-Substituted derivatives of podophyllotoxin and etoposide |
| US5175384A (en) | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
| CA2108144A1 (en) * | 1991-03-06 | 1992-09-07 | Jack A. Roth | Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression |
| US6410010B1 (en) * | 1992-10-13 | 2002-06-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Recombinant P53 adenovirus compositions |
| US5747469A (en) * | 1991-03-06 | 1998-05-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53 |
| FR2688514A1 (fr) * | 1992-03-16 | 1993-09-17 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant. |
| EP0746625B1 (en) * | 1992-11-09 | 2004-03-31 | THE UNITED STATES GOVERNMENT as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Targetable vector particles |
| FR2704234B1 (fr) * | 1993-04-22 | 1995-07-21 | Centre Nat Rech Scient | Virus recombinants, preparation et utilisation en therapie genique. |
| WO1994027612A1 (en) * | 1993-05-20 | 1994-12-08 | Baylor College Of Medicine | Genetic therapy for cardiovascular disease |
| US20050031590A9 (en) * | 1993-10-25 | 2005-02-10 | Richard Gregory | Adenoviral vectors having a protein IX deletion |
| US20010006629A1 (en) * | 1993-10-25 | 2001-07-05 | Richard J. Gregory | Recombinant adenoviral vector and methods of use |
| US6210939B1 (en) * | 1993-10-25 | 2001-04-03 | Canji, Inc. | Recombinant adenoviral vector and methods of use |
| ES2256842T4 (es) * | 1993-10-25 | 2007-02-01 | Canji, Inc. | Vector de adenovirus recombinante y metodos de uso. |
| TW442569B (en) * | 1993-10-25 | 2001-06-23 | Canji Inc | Recombinant adenoviral vector |
| ATE292983T1 (de) * | 1996-11-19 | 2005-04-15 | Univ Alabama Birmingham Res Fo | Chimäres retrovirus/adenovirus system |
| US20030064949A1 (en) * | 1998-02-17 | 2003-04-03 | Loretta Nielsen | Combined tumor suppressor gene therapy and chemotherapy in the treatment of neoplasms |
| JP2001515493A (ja) * | 1997-03-14 | 2001-09-18 | セレクティブ ジェネティックス，インコーポレイテッド | 改変された親和性を有するアデノウイルスベクター |
-
1994
- 1994-10-25 ES ES95900422T patent/ES2256842T4/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 DE DE69434594T patent/DE69434594T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 JP JP51278395A patent/JP3875990B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-25 CA CA002173975A patent/CA2173975C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-25 EP EP05020924A patent/EP1637608B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 AT AT95900422T patent/ATE314482T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 CN CNB941939197A patent/CN1263864C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-10-25 EP EP95900422A patent/EP0797676B9/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 AU AU81250/94A patent/AU687117B2/en not_active Ceased
- 1994-10-25 DE DE69435223T patent/DE69435223D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 SK SK510-96A patent/SK283703B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 HU HU9601073A patent/HU223733B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 ES ES05020924T patent/ES2328585T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-10-25 NZ NZ275956A patent/NZ275956A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 WO PCT/US1994/012235 patent/WO1995011984A2/en not_active Ceased
- 1994-10-25 BR BR9407956A patent/BR9407956A/pt not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 FI FI961755A patent/FI961755A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1994-10-25 PL PL94314239A patent/PL186073B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 AT AT05020924T patent/ATE437232T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 CZ CZ19961143A patent/CZ291372B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-10-25 PT PT95900422T patent/PT797676E/pt unknown
- 1994-10-25 EP EP09009448A patent/EP2113569A1/en not_active Withdrawn
- 1994-10-25 DK DK95900422T patent/DK0797676T3/da active
- 1994-10-25 RU RU96112150/14A patent/RU2162342C2/ru not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-04-24 NO NO961639A patent/NO961639L/no not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-11-20 US US11/603,279 patent/US20080182807A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-04-25 US US11/739,963 patent/US20080175818A1/en not_active Abandoned
- 2007-05-02 US US11/800,036 patent/US20090082289A1/en not_active Abandoned
- 2007-06-14 US US11/818,907 patent/US20080299083A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-05-27 US US12/127,756 patent/US20090088398A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2173975C (en) | Recombinant adenoviral vector and methods of use | |
| US6210939B1 (en) | Recombinant adenoviral vector and methods of use | |
| US5932210A (en) | Recombinant adenoviral vector and methods of use | |
| US20070253932A1 (en) | Recombinant adenoviral vectors and methods of use | |
| US20050031590A9 (en) | Adenoviral vectors having a protein IX deletion | |
| US20070259429A9 (en) | Adenoviral vectors having a protein IX deletion | |
| US20060099187A1 (en) | Adenoviral vectors having a protein IX deletion | |
| JP2005336199A (ja) | 組換えアデノウイルスベクターおよび使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20091025 |