PL186073B1 - Preparat farmaceutyczny, zwłaszcza do terapii genowej - Google Patents

Abstract

1. Preparat farmaceutyczny, zwlaszcza do terapii genowej, zasadniczo zawierajacy co najmniej jeden farmaceutycznie akceptowalny nosnik oraz zrekombinowany adenowiruso- wy wektor ekspresyjny, który z kolei zasadniczo zawiera wstawke egzogennego DNA z ge- nem kodujacym obce bialko oraz adenowirus DNA z delecja wszystkich kodujacych sekwencji E la, E lb i bialka IX, a takze z najmniej czesciowaE3. 2. Preparat wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze delecje sekwencji genowej bialka IX stanowi przedzial od okolo 3500 do okolo 4000 par zasad z 5’ wirusowego konca. 3. Preparat wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze delecja obejmuje takze nieistotna sek- wencje DNA we wczesnych adenowirusowych regionach 3 i/lub 4. 6. Preparat wedlug zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, ze delecja obejmuje takze nie wie- cej niz czterdziesci nukleotydów, zlokalizowanych w pozycji 3’ wzgledem E la i E lb oraz bialko IX i obca czasteczke DNA, kodujaca sygnal poliadenylacji. 7. Preparat wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze zrekombinowany adenowirusowy we- ktor ekspresyjny jest pozbawiony miejsca poliadenylacji bialka IX. 8. Preparat wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze adenowirus DNA jest adenowirusem z grupy C, wybranym ze serotypu 1, 2, 5 lub 6. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest preparat farmaceutyczny, zwłaszcza do terapii genowej różnych rodzajów i odmian nowotworów.

Wiadomym jest, że dla uzyskania rekombinowanych adenowirusów do terapii genowej wymagane jest użycie linii komórek zdolnych do dostarczania „w trans” genowych produktów regionu El, usuwanych w tych rekombinowanych wirusach. Obecnie, jedyną użyteczną linią przyswajalną jest linia komórkowa 293, pierwotnie opisana przez Grahama i in. w 1977 r. Komórki 293 zawierają w przybliżeniu - po lewej stronie -12% (4.3 kb) genomu adenowirusa typu 5 [Aiello (1979) i Spector (1983)].

Znane adenowirusowe wektory, badane obecnie pod kątem zastosowania w preparatach do terapii genowej, są typowo usuwane na Ad2 lub Ad5 DNA, w przedziale od około 400 par zasad na końcu 5’ genomu wirusowego do około 3,3 kb na końcu 5’, dla całkowitej delecji El 2,9 kb. Zatem, istnieje ograniczony region homologii - około 1 kb - pomiędzy sekwencją DNA wirusa rekombinowanego i Ad5 DNA w linii komórek. Ta homologia wyznacza region potencjalnej rekombinacji między sekwencjami - wirusową a komórkową adenowirusa. W takiej rekombinacji uzyskuje się fenotypowy wirus dziki, posiadający ADS regionu El z komórek 293.

Ten przypadek rekombinacji, prawdopodobnie umożliwiający częste wykrywanie typu adenowirusa dzikiego podczas preparowania rekombinowanych wirusów, był wprost demonstrowany jako przyczyna zanieczyszczenia Ad2 dzikim typem opartym na rekombinowanym wirusie Ad2/CFTR-1 (Rich i in. (1993).

Z powodu wysokiego stopnia homologii sekwencji w typie C podgrupy adenowirusów nowotworu, rekombinacja jest prawdopodobna jeśli wektor jest oparty na każdej grupie C adenowirusów (typy 1, 2, 5, 6).

W produkcji rekombinowanych wirusów na małą skalę, pokolenia wirusów zanieczyszczonych dzikim typem mogą być sterowane przez program skriningowy, który odrzuca preparaty mogące być zamęczyszczone. W miarę wzrostu skali produkcji dla zaspokojenia potrzeb terapii genowej, wzrasta możliwość zanieczyszczenia typem dzikim, podobnie jak zwiększa się trudność dostarczenia nie skażonych rekombinowanych preparatów.

Istnieje duże prawdopodobieństwo milionów nowych przypadków nowotworu rocznie, przy czym potowa z tej liczby to zejścia śmiertelne. (American Cancer Society, 1993). Mutacje p53 są najbardziej powszechnymi zmianami genetycznymi związanymi z rakiem u ludzi, występującymi w 50-60% przypadków nowotworu ludzkiego (Hollstein i in. (1991); Bartek i in. (1991); Levine (1993)]. Celem terapii genowej w traktowaniu guzów wykazujących wady w p53, jest przykładowo przywrócenie normalnej, czynnej kopii genu p53 dzikiego typu wirusa, tak aby kontrola proliferacji komórek była odnowiona. p53 odgrywając główną rolę w progresji cyklu komórkowego, wstrzymuje wzrost, tak że naprawienie lub apoptoza mogą wystąpić w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Typ dziki p53 był ostatnio stwierdzony jako konieczny składnik do apoptozy wywołanej napromieniowaniem lub czynnikami chemioterapeutycznymi (Lowe in. (1993) A i B). Z uwagi na wysoką przewagę (rozpo4

186 073 wszechnienie) mutacji p53 w nowotworach ludzkich, jest możliwe, że guzy, które stają się oporne na chemioterapię i naświetlanie, mogą nie zawierać typu dzikiego p53. Przez ponowne dostarczenie czynnego p53 do tych guzów zasadnym jest oczekiwać, że są one zdolne do normalnej apoptozy, związanej z uszkodzeniem DNA - wywołanym przez promieniowanie i chemioterapię.

Jednym z krytycznych punktów w skutecznej terapii genowej człowieka jest możliwość oddziaływania na znaczącą część komórek nowotworowych. Zastosowanie do tego celu wektorów retrowirusowych było ostatnio szeroko badane na różnych rodzajach modeli nowotworów. Np. w leczeniu złośliwych nowotworów wątroby stwierdzono małą skuteczność wektorów retrowirusowych, ponieważ nie są one w stanie osiągnąćwysokiego poziomu transferu niezbędnego w terapii genowej in vivo [Huber, B.E. i in. (1991); Caruso M. i in. (1993)].

Dla otrzymania bardziej trwałych źródeł produkcji wirusów, próbowano rozwiązać problem, związany z niskim poziomem transferu genów, poprzez bezpośrednie iniekcje do guzów linii komórkowych przenoszących retrowirusa [Caruso, M i in. (1993); Ezzidine, Z.D. i in. (1991); Culver, K.W. i in. (1992)]. Jednak metoda ta jest niezadowalająca w stosowaniu na ludziach, ponieważ jest kłopotliwa w stosowaniu i wywołuje stany zapalne u pacjenta w odpowiedzi na linie przenoszące. Inną niedogodnością wektorów wirusowych jest to, że wymagają one dzielących się komórek do skutecznego integrowania i przekazania rekombinowanego genu [Huber, B.E. (1991)]. Trwała integracja w podstawowym genie gospodarza, może prowadzić do rozwoju lub dziedziczenia stanów chorobowych.

Istotę wynalazku stanowi skład preparatu farmaceutycznego, który zasadniczo zawiera co najmniej jeden farmaceutycznie akceptowalny nośnik oraz zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny, który z kolei zasadniczo zawiera wstawkę egzogennego DNA z genem kodującym obce białko oraz adenowirus DNA z delecją wszystkich kodujących sekwencji Ela, Elb i białka IX, a także z najmniej częściowąE3.

Ponadto, precyzując istotę preparatu według wynalazku, korzystnym jest gdy:

• delecję sekwencji genowej białka IX stanowi przedział od około 3500 do około 4000 par zasad z 5’ wirusowego końca;

• delecja obejmuje także nieistotną sekwencję DNA we wczesnych adenowirusowych regionach 3 i/lub 4;

• delecja obejmuje także sekwencję DNA określonąjako adenowirus Ela i Elb;

• delecja obejmuje także wczesny region 3 i/lub 4 sekwencji DNA określonej jako adenowirus Ela i Elb;

• delecja obejmuje także nie więcej niż czterdzieści nukleotydów, zlokalizowanych w pozycji 3’ względem Ela i Elb oraz białko IX i obcą cząsteczkę DNA, kodującą sygnał poliadenylacji;

• zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny jest pozbawiony miejsca poliadenylacji białka IX;

• adenowirus DNA jest adenowirusem z grupy C, wybranym ze serotypu 1, 2, 5 lub 6;

• wstawka egzogennego DNA ma do 2,6 kilozasad (KB);

• wstawka egzogennego DNA ma do 4,5 kilozasad (KB);

• obce białko jest białkiem funkcjonalnym lub jego biologicznie aktywnym fragmentem;

• obce oiałko jest białkiem supresora nowotworu bib jego biologicznie aktywa nym fragmentem;

• białkiem supresora nowotworu jest p53;

• białkiem supresora nowotworu jest RB56;

• obce białko jest białkiem samobójczym lub jego funkcjonalnym równoważnikiem;

• zawiera metabolit kinazy tymidynowej lub jej funkcjonalny równoważnik;

186 073 • metabolit kinazy tymidynowej stanowi ganciclovir lub 6-metoksypuryna arabinukleozydu lub ich funkcjonalny równoważnik;

• gen kodujący obce białko jest poddany ekspresji pod kontrolą cytomegalowirusowego promotora CMV;

• promotor CMV jest najbliższym wczesnym promotorem CMV;

• gen kodujący obce białko jest poddany ekspresji pod kontrolą adenowirusowego promotora;

• adenowirusowy promotor jest głównym późnym promotorem adenowirusa typu 2;

• egzogenne DNA stanowi ponadto miejsca poliadenylacji;

• zrekombłnowany adenowirusowy wektor ekspresyjny stanowi A/C/N/53;

• zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny stanowi A/M/N/53;

• ponadto zawiera komórkę gospodarza transformowaną za pośrednictwem adenowirusowego wektora;

• farmaceutycznie akceptowalny nośnik zawiera fizjologicznie akceptowalny związek.

Zastosowanie zrekombinowanego adenowirusowego wektora ekspresyjnego w składzie preparatu farmaceutycznego do terapii genowej zapewnia wysoki poziom skuteczności transferu genów i ekspresji białek, a te zapewniają bezpieczne i skuteczne leczenie terapią genową. Prezentowany wynalazek odpowiada tym potrzebom i zapewnia także związane z tym korzyści.

Rekombinowane adenowirusy mają wyraźną przewagę nad metodami dostarczającymi retrowirusy lub metodami dostarczania genu [przegląd - patrz Siegfried (1993)]. Adenowirusy były bezpieczne stosowane jako żywe szczepionki i nigdy dotąd nie stwierdzono, aby wywoływały one powstawanie nowotworów u człowieka [Straus (1984)].

Wadliwa replikacja rekombinowanych adenowirusów może być spowodowana przez zastąpienie regionu El, koniecznego do replikacji z genem celowym. Adenowirus nie może być integrowany do genomu ludzkiego jako normalna konsekwencja infekcji, dlatego znacznie zmniejsza się ryzyko mutagenezy przez insercje, możliwej w przypadku retrowirusów lub wektorów adeno-pochodnych wirusów. Brak trwałej integracji prowadzi także do dodatkowej korzystnej sytuacji, w której wpływ transferowanego genu będzie krótkotrwały, gdyż ekstrachromosomalny DNA będzie stopniowo zanikać, w miarę trwających podziałów komórek. Trwały, wysoki poziom aktywnego rekombinowanego adenowirusa może być produkowany na poziomie nieosiągalnym dla retrowirusa lub AAV, zapewniającym wystarczająco dużą produkcję materiału do traktowania dużej liczby pacjentów. Dodatkowo, wektory adenowirusa są zdolne do wysoko wydajnego transferu genów in vivo w szerokim spektrum tkanek i komórek nowotworowych. Na przykład wykazano, że adenowirusy pośredniczące w przenoszeniu genów mają duży potencjał w terapii genowej chorób, takich jak muskowiscydoza [Rosenfeld i in. (1992); Rich I in. (1993)] i niedoboru α,-tmtytrypsyny [Lemarchand i in. (1992)]. Chociaż badane są inne możliwości przenoszenia genów, takie jak kompleksy kationowych liposomów i DNA, żadna z nich nie okazała się dotąd tak skuteczna jak adenowirusowy czynnik regulacji wprowadzania genów.

Tak jak w leczeniu nowotworów z niedoborem p53, celem terapii genowej w przypadku innych nowotworów jest przywrócenie kontroli proliferacji komórek. W przypadku p53, wprowadzenie funkcjonalnego genu przywraca kontrolę cyklu komórkowego poprzez śmierć komórek przez apoptozę wywołaną czynnikami terapeutycznymi. Podobnie terapia genowa w równej mierze jest wykorzystywana do innych supresorowych genów, które mogą być stosowane pojedynczo lub w mieszaninie z innymi czynnikami terapeutycznymi do kontroli przebiegu cyklu komórkowego i/lub do indukowania śmierci komórek. Co więcej geny, które nie kodują białek regulatorowych w cyklu komórkowym, ale bezpośrednio wywołują śmierć komórki np. geny samobójcze lub geny, które są bezpośrednio toksyczne dla komórki, mogą być użyte w procedurze terapii genowej do bezpośredniego usuwania progresji cyklu komórek guza.

186 073

Niezależnie od tego, który gen jest zastosowany do kontroli progresji cyklu komórkowego, podstawy i praktyczne zastosowanie tej metody jest identyczne.

Mianowicie, aby osiągnąć wysoką skuteczność transferu genów, należy przenieść terapeutyczną wielkość rekombinowanego produktu. Wybór wektora, który będzie zastosowany dla osiągnięcia wysokiej skuteczności transferu genu przy minimalnym ryzyku dla pacjenta jest zatem ważnym dla poziomu sukcesu leczeniu terapią genową.

Przedmiot wynalazku zobrazowano w kolejnych przykładach oraz na rysunku, którego poszczególne figury przedstawiają:

Figura 1 - rekombinowany adenowirusowy wektor; powstały wirus posiada 5’ sekwencję adenowirusowego usuwania rozciągające się od nukleotydów 356 do 4020 i eliminuje geny Ela i Elb, a także całą sekwencję kodującą białko IX, pozostawiając region poliadenylacji uwspólniony przez geny Elb i p IX nietknięte dla wykorzystania w terminacji transkrypcji dla każdego pożądanego genu;

Figura 2 - sekwencję aminokwasów pl 10 R13;

Figura 3 - sekwencję DNA kodującą białko supresorowe guza retinoblastomy;

Figura 4 - schemat rekombinanta p53/adenowirusa, który jest oparte na AD5, a jego region El nukleotydów 360-3325 jest zastąpiony przez 1,4 kb pełnej długości p53 cDNA, kierowany przez Ad2 MLP (A/M/53) lub ludzki CMV (A/C/53) promotor, po którym następuje Ad2 trójdzielny lider cDNA; wirus centralny A/M ma taką samą AD5 delecje jak wirus A/M/53 ale brak jest wstawki 1,4 kb p53 cDNA; pozostała sekwencja Elb (705 nukleotydów) usunięto w celu stworzenia białka IX deletowanych konstruktów A/M/N/53 i A/C/N53; konstrukty te mają także 19 kb Xba I delecję wewnątrz regionu E3 adenowirusa typu 5;

Figura 5A i 5B - ekspresję w komórkach guza infekowanych A/M/53 i A/C/53;

Figura 5A - komórki Saos-2 (osteosarcosoma) infekowane we wskazanych wielokrotnych infekcjach (MOI) zarówno AM53 jak i A/C/53 oczyszczonym wirusem i zbierane po 24 godzinach; gen p53 przeciwciała przeciw pAb 1801 użyto do barwienia immunoblotów próbek dodawanych w równych, całkowitych stężeniach białka przy czym jednakowe stężenia białka z ekstraktu komórek SW480, który nadal produkował białko mutanta p53, było użyte jako marker dia określenia miejsca p53. „O” poniżej nagłówka A/C/53, oznaczając pozorną infekcję zawierającą nietraktowany lizat Saos-2;

Figura 5B - komórki Hep 313 (hepatocellular carcinoma) infekowane wirusem A/M/53 lub A/C/53 w oznaczonej wielkości infekcji (MOI) i analizowane jak w części A); strzałka oznacza pozycję białka p53;

Figura 6A do 6C - zmiany morfologiczne Saos-2 zależne od p53;

Figura A - komórki Saos-2 podziewające się (lxl0⁵ komórek/IOcm płytka) były nieinfekowane;

Figura B - infekowane przy M01=50 (13), wirusem kontrolnym A/M;

Figura C - infekowane wirusem A/C/53; przy czym zdjęcia komórek wykonywano po upływie 72 godzin od infekcji;

Figura 7 przedstawia inhibicję syntezy DNA zależną od p53 w liniach komórek guza ludzkiego przez A/M/N/53 i A/C/N/53. Dziewięć różnych linii komórek guza było infekowanych kontrolnym wirusem A/M (-x-x-) lub p53 ekspresujący A/M/N/53 (-Δ-Δ-) lub wirusem A/C/N/53 (-O-O-) przy wzrastającej wartości MOI jak zaznaczono. Typ guza i charakter p53 były zapisywane dla każdej linii komórek (wt = typ dziki, zero = brak ekspresji białka, mut = wytwarzane białko mutanta). Synteza DNA była mierzona po 72 godzinach od infekcji jak opisano poniżej w przykładzie nr II. Wyniki pochodzą z trzech pomiarów w każdej dawce ( średnia ± SD), i są wykreślone jako % średnich wartości z kontroli względem MOI. * Komórki H69 były testowane tylko z wirusami A/M i A/M/N/53.

Figura 8 przedstawia tumorogenność p53 po zainfekowaniu komórek Saos-2 u nagich myszy/. Komórki Saos -2 były infekowane zarówno przez wirusy kontrolne A/M jak i przez rekombinanta p53 A/M/N/53 przy wartości MO1=30. Traktowane komórki były wstrzykiwane podskórnie do łojówki, w bok nagich myszy i mierzono rozmiary guza (jak opisano

186 073 w przykładzie nr II) dwa razy w tygodniu przez okres 8 tygodni. Wyniki przedstawiono jako zależność wielkość guza do czasu (dni) po implantacji guza dla kontroli (-x-x-) i A/M/N/53 (-Δ-Δ-) w traktowanych komórkach. Przedziały błędu repezentują średni rozmiar guza =/- SEM dla każdej grupy zwierząt w każdym punkcie czasu.

Figura 9 wyraża ekspresję RNA w rAd/p53 w ustalonych guzach. Komórki H69 (SCLC) były wstrzykiwane podskórnie nagim myszom i pozostawiane dla rozwoju guza przez 32 dni aż jego wielkość wynosiła około 25-50 mm³. Myszy wybierano do badań losowo i wstrzykiwano im peritumorally 2xl0⁹ pfu wirusa kontrolnego A/C/p-gal oraz A/C/53. Guzy były wycinane 2 i 7 dni po iniekcji i z każdej próbki guza preparowano polyA RNA. RT-PCR przeprowadzono przy użyciu równych stężeń RNA i specyficznych primerów dla przenoszenia rekombinanta p53. Amplifikacja PCR była 30 cykli w 94°C-1 min, 55 °C- 1.5 min, 72°C-2 min, i 10 min, 72°C okres końcowego rozwinęcia w Omnigen termpcyklerze (Hybaid). Użyte primery PCR były 5’ trójdzielnym liderowym cDNA (5' -CGCCACCGaGgGACCTGAGCGAGTC - 3’) i 3’ primerem p53 (5’ -TTCTGGGAAGGGACAGAAA - 3’). Ścieżki 1,2,4 i 5 sąp53 traktowanymi próbami usuniętymi w 2 lub 7 dniu jak zaznaczono. Ścieżki 3 i 6 to guzy traktowane β-gal. Ścieżki 7, 8 i 9 to odpowiednio powtórzenia ścieżek 4, 5 i 6, amplifikowane z primerem aktyny dla sprawdzenia równego obciążenia. Ścieżka 10 jest pozytywną kontrolą używającą plazmidu z trójdzielnego p53.

Figura 10A i 10B przedstawiają supresję guza in vivo i zwiększony czas przeżycia z A/M/N/53. Komórki guza H69 (SCLC) były wstrzykiwane podskórnie nagim myszom i pozostawione do rozwoju przez 2 tygodnie. Peritumoralne wstrzykiwanie samego buforu (—), kontrolnego adenowirusa (-x-x-), lub A/M/N/53 (-Δ-Δ), obydwoma wirusami (2x10⁹ pfu/iniekcję) były stosowane dwa razy w tygodniu dla ogółem 8 dawek. Rozmiary guza były mierzone 2 razy w tygodniu a objętość guza ustalano jak poprzednio (przykład nr 2). A) Wielkość guza jest wykreślona w stosunku do czasu (dni) po inokulacji komórek H69. W słupkach przedziały błędu oznaczają średni rozmiar guza ± SEM dla każdej grupy 5 zwierząt. Strzałki oznaczją dni iniekcji wirusa. B) Sprawdzano przeżywalność myszy i część myszy przeżywająca w grupie eksperyment w czasie po inokulacji buforem (—), kontrolne Am (.........) lub komórkami H69 traktowanymi wirusem A/M/N/53 (—) była nanoszona na wykres.

Figury 11A do 11C przedstawiają mapy konstruktów rekombinowanych plazmidów. Plazmidy konstruowano jak wyszczegółowiono poniżej. Ciągłe linie w konstruktach oznaczają omawiane geny podczas gdy druk wytłuszczony oznacza miejsce restrykcyjne używane do generowania fragmentów, które muszą być powiązane ze sobą aby uformować dalszy plazmid, jak oznaczono strzałkami. Na figurze 11 A, plazmid pACNTK skonstruowano przez podklonowanie genu HSV-TK z pMLBKTK (ATCC nr 39369) w polilinker wektora klonującego, po którym następuje izolacja genu TK z pożądanymi końcami dla klonowania w wektor pACN. Wektor pACN zawiera sekwencje adenowirusa konieczne dla rekombinacji in vivo aby otrzymać formę rekombinanta adenowirusowego (patrz figura 12). Na figurze 11B, konstrukcja plazmidu pAANTK jest pokazana poczynając od fragmentów wzmocnionych PCR kodujących a-fetoprotein enhancer (AFP-E) i regiony promotora (AFP-P) podklonowane przez kilka stopni do końcowego plazmidu gdzie AFP enhancer i promotor są w górę od genu HSV-TK, po którym następują sekwencje adenowirusa typu 2 konieczne do rekombinacji in vivo aby otrzymać formę rekombinanta wirusowego. Na figurze 11C konstrukcja plazmidu pAANCAT jest pokazana poczynając od izolacji genu acetyltransferazy chloramfenikolowej (CAT) z dostępnego w handlu plazmidu i jego podklonowanie w plazmid pAAN (patrz wyżej), generujące plazmid końcowy pAANCAT gdzie enhancer/promotor AFP kieruje transkrypcjągenu CAT w podstawowej sekwencji adenowirusa.

Figura 12 jest schematyczną mapą rekombinantów wirusowych ACNTK, AANTK i AANCAT. Dla skonstruowania rekombinantów wirusowych z plazmidów opisanych w figurze 11, 4 części (20 pg), którego bądź plazmidu pACNTK, pAANTK lub pAANCAT były wydłużane z Eco R1 i współtransfekowane z 1 częścią (5 |ig) dużego fragmentu rekombinan8

186 073 tów adenowirusowych (rAC3-gal) zawierający region delecji E3 (Wills et al.,1994). W otrzymanych wirusach, Ad5 nukleotydy 360-4021 są zastąpione przez CMV promotor i trójdzielny lider cDNA (TPL) lub przez enhancer a-fetoprotein i promotor (AFP), kierujące ekspresją HSV-1 TK lub gen CAT jak zaznaczono. Otrzymane rekombinanty adenowirusowe są oznaczone odpowiednio ACNTK, AANTK i AANCAT.

Figura 13 przedstawia specyficzność promotora ekpresji CAT w wektorach rekombinantów wirusowych. 2xl0⁶ wyznaczonych linii komórkowych było infekowanych M01’s=30 lub 100 rekombinantem wirusowym AANCAT jak zaznaczono lub pozostały nieinfekowane (UN). Komórki Hep G2 i Hep3B produkowały a-fetoprotein podczs gdy inne linie komórek nie. Po trzech dniach, komórki były zbierane, a objętości ekstraktów były regulowane do równych ogólnych stężeń białka, mierzono aktywność CAT jak opisano poniżej w sekcji Metody. Równa liczba nieinfekowanych komórek służyła jako indywidualna kontrola dla podstawowej aktywności CAT, kiedy ¹⁴C znakowany chloramfenikol (tylko - ^UC) i ekstrakt ze stabilnej linii komórkowej (B21) ujawniającej aktywność CAT służył odpowiednio jako negatywna i pozytywna kontrola. Procent konwersji acetylo Coa jest zaznaczony, i przedstawia, że ekspresja jest limitowana do komórek produkujących a-fetoproteiny.

Figura 14 przedstawia efekt traktowania TK/GVC linii komórkowych raka wątroby i efekt specyficzności promotora. Linie komórkowe Hep-G2 (pozytywny AFP) i HLF (negatywny AFP) infekowano przez noc z ACNTK [-Δ-] AANTK [-Δ-] lub kontrolą [-□-] wirusa przy trzydziestokrotnej infekcji i następnie traktowanych z pojedynczą dawką gancyklowiru we wskazanym stężeniu. Proliferacja komórek była oszacowana przez dodanie ³H-tymidyny do komórek około 18 godzin przed zebraniem. Wprowadzenie 3H-tymidyny do komórkowego kwasu nukleinowego było mierzone 72 godziny po infekcji (Top Count, Packard i przedstawione jako procent (średniej +/- S.D.) nie traktowanej kontroli. Wyniki przedstawiają selektywną, zależną od dawki inhibicję proliferacji z konstruktem kierowanym przez CMV, kiedy AFP selektywnie regulowany selektywnie hamował Hep-G2

Figura 15 przedstawia cytotoksyczność ACNTK z gancyklowirem w HCC. Komórki HLF infekowano przy MOI 30 zarówno ACNTK [-0-] lub kontrolnym [-□-] i traktowano z gancyklowirem w zaznaczonych dawkach. Siedemdziesiąt dwie godziny (72) po traktowaniu gancyklowirem poziom dehydrogenazy mleczanowej (LDH) uwolnionej do supematantu komórkowego był mierzony kolorometrycznie i wykreślany (średnia +/- SEM) w odniesieniu do stężenia gancyklowiru dla dwóch grup traktowanych wirusem.

Figury 16A i 16B - pokazują efekt ACNTK i gancyklowiru na ustalonych guzów raka wątroby w nagich myszach. Jeden (1) x 10’ Hep 3B komórek wstrzykiwano podskórnie do boku nagiej samicy myszy i pozwalano im rosnąć przez 27 dni. Myszy wtedy otrzymywały wewnątrz guzowy i wokół guzowy (peritumoral) zastrzyk zarówno ACNTK [-0-] lub kontroli ACN [-0-] wirusa (1 x 10⁹ iu w 100 pi objętości) każdego dnia do trzech dawek całkowicie (zaznaczono strzałką). Wstrzykiwanie gencyklowiru (100 mg/kg ip) rozpoczęto 24 godziny po inicjalnej dawce wirusa i kontynuowano przez 10 dni. Na figurze 6A, wykreślono rozmiary guza jako średnia +/- SEM w odniesieniu do dni po infekcji. Na figurze 6B, wykreślono ciężar ciała zwierzęcia traktowanego każdym wirusem jako średnią +/- SEM w stosunku do dni po infekcji.

Dla zredukowania częstych zanieczyszczeń dzikim typem adenowirusa, jest pożądane polepszenie wirusa lub linii komórkowej, tak aby zmniejszyć prawdopodobieństwo rekombinacji. Na przykład, adenowirusa z grupy z niską homologią do grupy C wirusów stosuje się do uzyskiwania rekombinacyjnych wirusów z małą skłonnością do rekombinacji z Ad5 sekwencją w komórkach 293. Jednakże, alternatywnie, prostszym sposobem redukcji rekombinacji pomiędzy wirusową i komórkową sekwencją jest wzrost rozmiaru delecji w rekombinowanym wirusie i przez to redukcja nadmiaru wspólnej sekwencji pomiędzy genami Ad5 w komórkach 293. Delecje, które są poza 3,5 kb z końca 5’ genomu adenowirusa oddziaływuj ą na adenowiruse białko IX i nie były korzystne w wektorach adenowirusowych (patrz poniżej).

186 073

Gen białka IX adenowirusa koduje druoorzędowy składnik zewnętrznego kapsydu wirusa, który stabilizuje grupę dziewięciu hexonów, wchodzących w skład większości kapsydów wirusowych (Sterwart (1993)). Bazując na badaniach mutanów delecji adenowirusowych, białko IX początkowo nie uważano za zasadniczy składnik adenowirusa, chociaż jego brak był związany z większą nietrwałością termiczną niż obserwowane u typu dzikiego wirusa (Colby i 1981). Ostatnio odkryto, że białko IX jest niezbędne do upakowania pełnej długości wirusowego DNA w kapsyd, i że przy braku tego białka, tylko genomy co najmniej o 1 kb mniejsze niż typ dziki, mogą być przekazywane jako rekombinowane wirusy [Ghosh - Choundry i in. (1987)]. Mając to ograniczenie w pakowaniu, delecje białka IX świadomie nie mogą być brane pod uwagę przy projektowaniu wektorów adenowirusów.

W tym zgłoszeniu, odnośnik jest sporządzony do standardowych podręczników szkolnych biologii molekularnej, które zawierają definicje, metody, i sposób do przeprowadzenia podstawowych technik zawartych w niniejszym wynalazku. Patrz dla przykładu w Sambrook et al. (1989) i różnych referencjach tutaj cytowanych. Te referencje i cytowane publikacje są celowo włączone poprzez referencje do tego odkrycia.

Przeciwnie do tego co jest znane fachowcom, ten wynalazek, żąda użycia rekumbinuwanych adenowirusów noszących delecje genu białka IX, jako sposób redukcji ryzyka zanieczyszczenia adenowirusem typu dzikiego w przygotowaniach wirusa do użycia w diagnostycznych i terapeutycznych zastosowaniach takich jak terapia genowa. Jak użyto tutaj, termin „rekombinowany” jest przeznaczony dla oznaczenia potomstwa utworzonego jako rezultat inżynierii genetycznej. Te delecje mogą usuwać dodatkowo 500 do 700 par zasad sekwencji DNA, która jest obecna w tradycyjnych El wirusach z delecją (niniejsze, mniej pożądane delecje części genu pIX są możliwe i są włączone w zakres tego wynalazku) i są osiągalne dla rekombinacji z Ad5 sekwencjami zcalonymi z komórkami 293. Rekombinowane adenowirusy oparte na jakimkolwiek wirusie grupy C, serotyp 1, 2, 5 i 6, są włączone w ten wynalazek. Również objęty przez ten wynalazek jest hybryd Ad2/Ad5 oparty na rekombinowanym wirusie zdolnym do ekspresji ludzkiego p53 cDNA zadenowirusa typu 2, większego ostatniego promotora. Ta konstrukcja była złożona jak pokazano na fig. 1. Powstały wirus nosi 5’ delecję adenowirusowej sekwencji rozciągającą się od około 357 nukleotydu do 4020 i usuwa geny Ela i Elb jak również sekwencję kodującą całe białko IX, pozostawiając miejsce aoliadenylacji wspólne dla genu Elb i genu białka IX, nietknięte dla użycia w terminacji transkrypcji jakiegokolwiek pożądanego białka. Odrębne zastosowanie jest pokazane na fig. 4. Alternatywnie, delecja może być rozciągnięta dodatkowo o 30 do 40 par zasad bez naruszenia przyległego genu dla białka IVa2, chociaż w tym przypadku egzogenny sygnał poliadenylacji jest dostarczony w celu zakończenia transkrypcji genów umieszczonych w rekombinowanym wirusie. Wyjściowy wirus zbudowany z tą delecją jest łatwo przekazany do komórek 293 z brakiem dowodu zanieczyszczenia wirusem dzikiego typu i kieruje wydajną ekspresją p53 od transkrypcyjnej części wstawionej w miejscu delecji.

Pojemność wstawki rekombinowanych wirusów noszących delecje białka IX opisaną powyżej jest w przybliżeniu 2.6 kb. To jest wystarczające dla wielu genów włączając p53 cDNA. Pojemność wstawki może być zwiększona przez wprowadzenie innych delecji do adenowiruszwegu kręgosłupa, na przykład delecje we wczesnych regionach 3 lub 4 (dla przeglądu patrz: Graham i Prevec (1991)). Na przykład zastosowanie adenowirusowego szkieletu zawierającego delecje 1.9 kb nieistotnej sekwencji we wczesnym regionie 3. Z tą dodatkową delecją, pojemność wstawki wektora jest zwiększona do w przybliżeniu 4.5 kb, wystarczająco dużo dla wielu większych cDNAs, włączając gen supresorowy nowotworu retinoWastoma.

Rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny opisany przez całkowitą lub częściową delecję DNA adenowirusowego białka IX i posiadający gen kodujący obce białko lub funkcjonalny fragment lub jego mutant jest przedstawiony przez ten wynalazek. Te wektory są użyteczne dla bezpiecznej rekombinowanej produkcji diagnostycznych i terapeutycznych aoliaeatydów i białek, i co istotniejsze, w celu wprowadzenia genów w terapii genowej.

186 073

W ten sposób, na przykład, adenowirusowy wektor tego wynalazku może zawierać obcy gen dla ekspresji białka efektywnego w regulacji cyklu komórkowego, takiego jak p53, Rb lub mitozyny lub w indukowaniu śmierci komórki, takiego jak gen warunkowego samobójstwa kinazy tymidynowej. (Ten ostatni musi być użyty w połączeniu z metabolitem kinazy tymidynowej w celu bycia skutecznym). Każda kaseta ekspresyjna może być użyta z wektorem tego wynalazku. „Kaseta ekspresyjna” oznacza cząsteczkę dNa posiadającą promotor/enhancer (wzmacniacz) transkrypcji taki jak CMV promotor enhancer, etc., obcy gen i w pewnych wypadkach zdefiniowany poniżej sygnał poliadenylacji. Jak użyto tutaj, termin „obcy gen” jest użyty do oznaczenia cząsteczki DNA nie obecnej w dokładnej orientacji i pozycji w odpowiedniej cząsteczce DNA znalezionej w adenowirusie dzikiego typu. Obcy gen jest cząsteczką DNA do 4.5 kb. „Wektor ekspresji” oznacza wektor, który daje w wyniku ekspresję wstawionej sekwencji DNA gdy przeniesiony do stosownej komórki gospodarza, białko lub polipeptyd kodowany przez ten DNA jest syntezowane przez system gospodarza. Rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny może zawierać część genu kodującego adenowirusowe białko DC, pod warunkiem, że biologicznie aktywnie białko IX lub jego fragment nie jest produkowany. Przykładem tego wektora jest wektor ekspresji mający mapę enzymu restrykcyjnego fig. 1 lub 4.

Indukowane promotory również mogą być użyte w adenowirusowym wektorze tego wynalazku. Te promotory będą inicjowały transkrypcję tylko w obecności dodatkowych cząsteczek. Przykłady indukowanych promotorów obejmują te osiągalne z genu (i-i^t<uirferonu, genu szoku termicznego, genu metallotioniny lub te osiągalne z genów steroidowych hormono-wrażliwych. Ekspresja tkankowo specyficzna jest dobrze opisana w dziedzinie ekspresji genowej i tkankowej specyficzności i indukowane promotory takie jak te są bardzo dobrze znane ekspertom. Geny te są używane do regulacji ekspresji obcego białka po wprowadzeniu do docelowej komórki.

Również dostarczony przez ten wynalazek jest rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny, jak opisano powyżej, posiadający mniej rozległe delecje sekwencji genu białka IX rozciągające się od 3500 bp od wirusowego końca 5’do w przybliżeniu 4000 bp w jednym zastosowaniu. W odrębnym zastosowaniu rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny może mieć ponadto delecje nieistotnej sekwencji DNA w adenowirusowym wczesnym regionie 3 i/lub 4 i/lub delecje sekwencji DNA oznaczonych adenowirusowy Ela i Elb. W tym zastosowaniu, obcym genem jest cząsteczka DNA wielkości do 4.5 kb.

Poza tym zastosowanie ma delecja do czterdziestu nukleotydów usytuowana po stronie 3’ do delecji Ela i Elb i pIX i obcej cząsteczki DNA kodującej sygnał poliadenylacji wprowadzonej do rekombinowanego wektora w pozycji odpowiadającej obcemu genowi w celu regulacji ekspresji obcego genu.

Dla celów tego wynalazku rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny może być wyprowadzony z grupy adenowirusów dzikiego typu, serotyp 1, 2, 5 lub 6.

W jednym zastosowaniu rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny posiada gen kodujący funkcjonalne guz-supresorowe białko lub biologicznie aktywny jego fragment. Jak użyto tutaj, termin „funkcjonalny” kiedy odnosi się to do guz-supresorowego genu, nawiązuje do guz-supresorowych genów, które kodują guz-supresorowe białka, które skutecznie hamują zachowanie komórki, podobne do zachowania komórki guzowej. Funkcjonalne geny mogą zawierać, na przykład, dziki typ normalnych genów i modyfikacje normalnych genów, które zachowują swoją zdolność do, kodowania skutecznych guz-supresorowych białek i inne antyguzowe geny taicie jak gen białka warunkującego samobójstwo lub toksyny.

Podobnie „nie-funkcjonalny”, jak użyto tutaj jest równoznaczny z „nieaktywny”. Niefunkcjonalne lub wadliwe geny mogą być spowodowane przez bogactwo przyczyn, włączając na przykład punktowe mutacje, delecje, metylacje i inne znane specjalistom przyczyny.

186 073

Jak użyto tutaj „aktywny fragment” genu, zawiera mniejsze porcje genu, które zachowują zdolność do kodowania białek posiadających guz-supresującą aktywność. p56R^J, opisane pełniej poniżej, jest jednym przykładem aktywnego fragmentu funkcjonalnego guz-supresorowego genu. Modyfikacje guz-supresorowych genów są również rozważane w znaczeniu aktywnego fragmentu, takie jak addycje, delecje lub substytucje, tak długo jak funkcjonalna aktywność niemodyfikowanego genu jest zachowana.

Innym przykładem guz-supresorowego genu jest retinoblastoma (RB). Pełne nukleotydowe sekwencje RB cDNA i przewidywane sekwencje aminokwasowe wynikającego Rb białka (oznaczonego p 1101®) są pokazane w Lee et al. (1987) i na fig. 3. Również użyteczna w celu ekspresji retinoblastoma guz-supresorowego białka jest cząsteczka DNA kodująca sekwencję aminokwasową pokazaną na fig. 2 lub posiadającą sekwencję DNA pokazaną na fig. 3. Skrócona wersja pllO®, nazywana p56^R® jest również użyteczna. Dla sekwencji p5ó®® zobacz Huang et al. (1991). Dodatkowe guz-supresorowe geny mogą być używane w wektorach tego wynalazku. Tylko dla celów ilustracji tylko mogą to być białko p21 (Kamb et al. (1994)), białko p21, białko WT1 Wilm’s tumor WT1 protein, mitozyna, h-NUC, lub białko grubego jelita karcinoma DCC. Mitozyna jest opisana w X. Zhu i W- H Lee, U.S. numer seryjny aplikacji 08/141,239, oddany do rejestru w 22 października 1993 r. i następnie w części kontynuacja przez tych samych wynalazców numer rejestru prawnego P-CJ 1191, oddany do rejestru październik 24, 1994, obie z nich są tutaj włączone przez cytowanie literatury. Podobnie, h-NUC jest opisane przez W-H Lee i P-L Chen, U.S. numer seryjny aplikacji 08/170,586, oddany do rejestru 20 grudnia 1993, tutaj włączony przez cytowanie literatury.

Jak jest znane ekspertom, termin „białko” oznacza liniowy polimer aminokwasów połączonych w specyficzną sekwencję poprzez wiązania peptydowe. Jak użyto tutaj, termin „aminokwas” odnosi się do obu D lub L stereoizomerowych form aminokwasu, chyba, że z innych powodów konkretnie oznaczono. Również objęte w zakres tego wynalazku są ekwiwalent białek i ekwiwalent polipeptydów, dla przykładu mające aktywność biologiczną oczyszczone dzikiego typu białka guz-supresorowe. „Ekwiwalent białek” i „ekwiwalent polipeptydów” odnoszą się do związków, które odbiegają od liniowej sekwencji naturalnie występujących białek lub polipeptydów, ale które mają aminokwasowe zastępstwa, które nie zmieniają ich biologicznej aktywności. Te ekwiwalenty mogą różnić się od natywnych sekwencji zastąpieniem jednego lub więcej aminokwasów pokrewnymi aminokwasami, na przykład, podobnie naładowanymi aminokwasami lub zastąpieniem lub modyfikacją bocznych łańcuchów lub grup funkcjonalnych.

Również objęte definicją funkcjonalne guz-supresorowe białko jest każde białko, którego obecność redukuje guzotwórczość, złośliwość lub hiperproliferacyjny fenotyp komórki gospodarza. Przykłady guz-supresorowych białek wg tej definicji obejmują, ale nie są ograniczone do pllO¹*⁰, p56R*, mitozyny, h-NUC i p53. Termin „guzotwórczość jest przeznaczony do oznaczenia posiadania zdolności do tworzenia guzów lub zdolności powodowania tworzenia guza i jest równoznaczny z neoplastycznym rozwojem. Termin „złośliwość” jest przeznaczony do opisu gózotwórczej komórki posiadającej zdolność do metastazowania i zagrażającej życiu organizmu gospodarza. „Hiperproliferacyjny fenotyp” jest przeznaczony do opisu rosnącej komórki i dzielącej się z szybkością powyżej normalnych ograniczeń wzrostu dla komórek tego typu. „Neoplastyczny” również jest przeznaczony do włączenia komórek nie posiadających endogennego funkcjonalnego guz-supresorowego białka lub niezdolność komórki do ekspresji endogennych kwasów nukleinowych kodujących funkcjonalne guz-supresorowe białko.

Przykładem wektora z tego wynalazku jest rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny posiadający obcy gen kodujący białko p53 lub aktywny jego fragment jest przedstawiony przez ten wynalazek. Sekwencja kodująca gen p53 jest przedstawiona poniżej w tabeli 1.

186 073

Tabela 1

V*SHR PGSR* LLGSG DTLRS GWERA FHDGD TLPEIGSQTA FRVTA MEEPQ SDPSY EPPLS QETFS DLWKL LPENN VLSPL PSQAM DDLML SPDDI EQWFT EDPGP DEAPR MPEAA PPVAP APAAP TPAAP APAPS WPLSS SVPSQ KTYQG SYGFR LGFLH SGTAK SVTCT YSPAL NKMFC QLAKT CPVQL WVDST PPPGT RVRAM AIYKQ SQHMT EWRR CPHHE RCSDS DGLAP PQHLI RVEGN LRVEY LDDRN TFRHS VVVPY EPPEV GSDCT TIHYN YMCNS SCMGG MNRRP ILTII TLEDS SGNLL GRNSF EVRVC ACPGR DRRTE EENLR KKGEP HHELP PGSTK RALPN NTSSS PQPKK KPLDG EYFTL QIRGR ERFEM FRELN EALEL KDAQA GKEPG GSRAH SSHLK SKKGQ STSRH KKLMF KTEGP DSD* *= kodon stop

Każdy z wektorów ekspresyjnych opisanych tutaj jest użyteczny jako układy dla diagnozy lub terapii. Wektory mogą być użyte do skriningu, który z wielu guz-supresorowych genów byłby użyteczny w terapii genowej. Na przykład, próba komórek podejrzewanych o neoplastyczność może być usunięta z obiektu i ssaka. Komórki mogą następnie być połączone, w odpowiednich warunkach z efektywną ilością rekombinowanego wektora tego wynalazku posiadającego wstawiony obcy gen kodujący jeden z kilku funkcjonalnych guzsupresorowych genów. Czy wprowadzenie tego genu będzie odwracać złośliwy fenotyp może być mierzone przy pomocy tworzenia kolonii na miękkim agarze lub tworzenia guza u gołych myszy. Jeśli złośliwy fenotyp jest odwrotny wówczas obcy gen jest określony jako pozytywny kandydat dla udanej terapii genowej dla obiektu lub ssaka. Gdy używane do celów farmaceutycznych, one mogą być połączone z jednym lub większą ilością farmaceutycznie możliwych do przyjęcia nośników. Farmaceutycznie możliwe do przyjęcia nośniki są dobrze znane ekspertom i obejmują wodne roztwory takie jak buforowana sól fizjologiczna lub inne roztwory lub środki takie jak glikole, gliceryna, oleje roślinne (na przykład olej z oliwek) lub dające się wstrzyknąć organiczne estry. Farmaceutycznie możliwy do przyjęcia nośnik może być użyty do podania bieżących mieszanin do komórki in vitro lub do osobnika in vivo.

Farmaceutycznie możliwy do przyjęcia nośnik może zawierać fizjologicznie akceptowany związek, który powoduje, na przykład, stabilizowanie mieszaniny lub zwiększanie albo zmniejszanie absorbcji czynnika. Fizjologicznie możliwy do przyjęcia związek może obejmować, na przykład, węglowodany, takie jak glukoza, sukroza lub dekstrany, antyoksydanty, takie jak kwas askorbinowy lub glutation, czynniki chelatujące, białka o niskiej masie cząsteczkowej lub inne stabilizatory lub obojętne dodatki. Inne fizjologicznie akceptowalne związki obejmują czynniki zwilżające, czynniki emulgujące, czynniki rozpraszające lub środki konserwujące, które są szczególnie użyteczne w celu powstrzymywania wzrostu i działania mikroorganizmów. Różne środki konserwujące są znane i obejmują np. fenol i kwas askorbinowy. Każdy ekspert wiedziałby, że wybór farmaceutycznie możliwego do przyjęcia nośnika, zawierającego fizjologicznie akceptowalny związek, zależy, np. od drogi podawania polipeptydu i od szczególnych właściwości fizyko-chemicznych specyficznego polipeptydu. Na przykład, fizjologicznie akceptowalny związek taki jak monosterynian glinu lub żelatyna jest szczególnie użyteczna jako czynnik opóźniający, który przedłuża szybkość absorbcji farmaceutycznej mieszaniny podanej obiektowi. Dalsze przykłady nośników, stabilizatorów lub pomocników mogą być znalezione w Martin, Remington’s Pharm. Sci. 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton, 1975), włączone tutaj przez cytowanie literatury. Farmaceutyczna mieszanina również może być włączona, jeśli jest to pożądane do liposomów, mikrosfer lub innych matryc polimerowych (Gregoriadis, Liposome Technology, Vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, Florida 1984) włączone tutaj przez cytowanie literatury). Liposomy, np., które składają się z fosfolipidów lub innych lipidów, są nietoksyczne, fizjologicznie akceptowalne i ulegają metabolizmowi nośniki, które są stosunkowo łatwe do otrzymania i podania.

186 073

Jak użyto tutaj, „fermaceutyczna mieszanina” odnosi się do jakichkolwiek mieszanin substancji opisanych tutaj w kombinacji z jednym lub więcej wspomnianym powyżej farmaceutycznie akceptowalnymi nośnikami. Mieszaniny mogą być następnie podawane terapeutycznie lub profilaktycznie. Mogą one być zetknięte z komórką gospodarza in vivo, ex vivo lub in vitro, w efektywnych ilościach. In vitro i ex vivo sposób zetknięcia z komórkami gospodarza są podane poniżej. Gdy praktykowane in vivo, metody podawania farmaceutyku zawierającego wektor tego wynalazku, są dobrze znane specjalistom i obejmują, ale nie są ograniczone, do podawania doustnego, doguzowego, dożylniego, domięśniowego lub dootrzewnego. Podawanie może być dokonane w sposób ciągły lub nieciągły i będzie zmieniać się w zależności od osobnika i stosowanych warunków, np. jak w przypadku innych terapeutycznych mieszanin (Landmann et al. (1992); Aulitzky et al. (1991); Lantz et al. (1990); Supersaxo et al. (1988); Demetri et al. (1989); i LeMaistre et al. (1991)).

Dalej ten wynalazek przedstawia transformowaną prokariotyczną lub eukariotyczną komórkę gospodarza, na przykład zwierzęcą komórkę lub ssaczą komórkę, posiadającą wstawiony rekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny opisany powyżej. Odpowiednie komórki prokariotyczne obejmują, ale nie są ograniczone, do bakteryjnych komórek takich jak komórki E. coli.. Metody transformowania komórek gospodarza retrowirusowmi wektoprami są znane ekspertom, patrz Sambrook et al. (1989) i obejmują ale nie są ograniczone do transfekcji, elektroporacji i mikroiniekcji.

Jak użyto od początku do końca tego podania termin zwierzęcy jest równoznaczny z terminem ssaczy i obejmuje, ale nie jest ograniczony do wołowy, wieprzowy, koci, małpi, psi, koński, gryzonia, szczurzy i ludzki. Dodatkowe komórki gospodarza obejmują ale nie są ograniczone do neoplastycznej i guzowej komórki, takiej jak mięsak kości, rak jajników, rak piersi, czerniak, rak wątroby, rak płuc, rak mózgu, colorectal rak, hematopoietyczna komórka, rak prostaty, rak karku, retinoblastoma, rak przełyku, rak pęcherza, neuroblastoma, lub rak nerek.

Dodatkowo, każda eukariotyczna linia komórkowa zdolna do ekspresji Ela i Elb lub Ela, Elb i pIX jest stosownym gospodarzem dla tego wektora. W jednym zastosowaniu stosowną eukariotyczną komórką gospodarza jest linia komórkowa 293 dostępna od American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U.S.A. 20231.

Wszystkie transformowane komórki gospodarza opisane tutaj są użyteczne jako układy dla diagnozy lub terapii. Gdy użyte farmaceutycznie, one mogą być połączone z różnymi farmaceutycznie akceptowalnymi nośnikami. Dogodne farmaceutycznie akceptowane nośniki są dobrze znane specjalistom i np. są opisane powyżej. Mieszaniny mogą następnie być podawane terapeutycznie lub profilaktycznie, w efektywnych ilościach, co opisano w większych detalach poniżej.

Metoda transformacji komórki gospodarza jest również dostarczona przez ten wynalazek. Ta metoda dostarcza sposób kontaktu komórki gospodarza np. prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza, z jakimikolwiek wektorami ekspresji opisanymi tutaj i w dogodnych warunkach. Komórki gospodarza transformowane przy pomocy tej metody również są ujęte w zakres tego wynalazku. Zetknięcie może być wykonane in vitro, in vivo, lub ex vivo, używając metody dobrze znanej ekspertom (Sambrook et al. (1989)) i używając efektywne ilości wektorów ekspresyjnych. Również dostarczona w tym wynalazku jest metoda produkcji rekombinowanych białek lub polipeptydów przez hodowlę transformowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach faworyzujących transkrypcję i translację wprowadzonego obcego genu. Metody ekspresji rekombinanta w różnych komórkach gospodarza, takich jak ssaczych, drożdżowych, owadzich lub bakteryjnych komórkach są szeroko znane, włączając te opisane w Sambrook et al., supra. Produkt translacji obcego genu może być następnie wyizolowany w standardowy sposób, taki jak oczyszczanie kolumnowe lub oczyszczanie używając przeciwciało anty-białkowe. Wyizolowane białko lub polipeptyd również jest ujęte w zakres tego wynalazku. Jak użyto tutaj, oczyszczone lub wyizolowane oznacza faktycznie uwolnione od natywnych białek lub aminokwasów normalnie zasocjowane z białkami lub polipeptydami w natywnym lub komórki gospodarza środowisku.

186 073

Również dostarczone przez ten wynalazek są nie-ludzkie zwierzęta posiadające wprowadzone do wnętrza wektory ekspresji lub transformowane komórki gospodarza tego wynalazku. Te „transgeniczne” zwierzęta są wyprodukowane używając metod dobrze znanych ekspertom, np. opisanych w U.S. Patent No. 5,175,384 lub przez standardowe ex vivo terapeutyczne techniki, jaki opisano w Culver et al. (1991).

Jak pokazano w szczegółowo poniżej, ekspresja rekombinowanych adenowirusów guzdzikiego typu p53, jak opisano powyżej, może wydajnie inhibować syntezę DNA i zatrzymywać wzrost szerokiej grupy ludzkich guzowych komórek, wliczając kliniczne cele. Ponadto, rekombinowane adenowirusy mogą prowadzić do ekspresji guz-supresorowych genów takich jak p53 w in vivo utworzonym guzie bez polegania na bezpośrednim wstrzyknięciu do guza lub wcześniejszym traktowaniu ex vivo komórek rakowych. Białko p53, wynik ekspresji, jest funkcjonalne i efektywnie zatrzymuje wzrost guza in vivo i znacznie powiększa czas przeżycia modelowej nagiej myszy z ludzkim rakiem płuca.

Tak więc wynalazki oparte na wektorach są szczególnie stosowane do terapi genowej. Zgodnie z tym metody terapi genowych wykorzystujące te wektory znajdują się w obrębie tego wynalazku. Oczyszczony wektor podawany jest następnie w odpowiedniej ilości in vivo lub ex vivo do obiektu. Metody terapii genowej znane są doskonale w sztuce, patrz np. Larrick, J. W. i Burek, K.L. (1991) i Kreigler, M. (1990). Termin „obiekt” odnosi się do każdego zwierzęcego, ssaczego, szczurzego, gryzonia, wołowego, wieprzowego, końskiego, psiego, kociego, lub ludzkiego pacjenta. Gdy obcy gen koduje gen hamujący guz lub inne białko anty-guzowe, wektory stanowią użyteczne narzędzie leczenia lub redukcji szybko namnażających się komórek w obiekcie, inhibując proliferację guza lub poprawiając ten szczególny rodzaj patologii. Patologiczne hiperproliferujące komórki charakteryzują następujące stany chorobowe: przerost tarczycy - choroba Grave’sa, łuszczyca, przerost gruczołu krokowego, choroba Lifraumeni w tym rak piersi, mięsaki i inne nowotwory, rak pęcherza, rak jelita, rak płuc, wiele białaczek i chłoniaków. Przykłady niepatogennych hiperproliferujących komórek znaleziono : w komórkach epitelialnych przewodów mlecznych w czasie laktacji jak również w komórkach związanych z procesem gojenia ran. Patologicznie hiperproliferujące komórki wykazują charakterystyczny brak zahamowania kontaktowego zgodnie z ich zdolnością do selektywnej adhezji, która wywołuje zmianę właściwości powierzchniowych komórki i dalszą degradację łączności międzykomórkowej. Do zmian tych zaliczyć można również stymulację do podziałów i zdolność wydzielania enzymów proteolitycznych.

Co więcej obecny wynalazek wiąże się z metodą usuwania odpowiednich próbek ludzkich komórek hiperproliferujących zakażających prekursory komórek krwiotwórczych podczas rekonstrukcji szpiku kostnego poprzez wprowadzenie odmiany dzikiej genu supresorowego guza do preparatu komórkowego z użyciem wynalezionego wektora (wprowadzanego bądź z autologowych komórek peryferalnych krwi lub szpiku kostnego). Tak jak określono w tej pracy „stosowne próbki” zdefiniowano jako heterogenne preparaty komórkowe pobrane od pacjenta np: zmieszaną populację komórek zawierającą zarówno fenotypowo normalne jak i patogenne komórki. Termin „podawanie” zawiera, ale nie ogranicza się do wprowadzania do komórki lub obiektu dożylnie, poprzez bezpośrednią iniekcję do guza, śródguzową iniekcję, podawanie wewnątrzotrzewnowe, podawanie w areozolu do płuc lub miejscowo. Podawanie tego typu może być połączone z farmakologicznie zaakceptowanym nośnikiem, opisanym powyżej.

Termin „zredukowana tumorogenność” oznacza komórki, które zostały przekształcone na mniej guzotwórcze lub nie guzotwórcze. Komórki o zredukowanej guzowatości albo nie wytwarzają guza in vitro albo wykazują opóźnienie od tygodni do miesięcy przed pojawieniem się in vivo wzrost guza i/lub słabszy wzrost masy guza w porównaniu do guzów majach w pełni nie aktywny lub nie funkcjonalny gen supresorowy guza.

Jak użyto tutaj, terminem „efektywna ilość” określa się ilość wektora lub antyrakowego białka, które daje pozytywny efekt kontroli wzrostu komórki. Na przykład: jedna dawka zawiera od 10⁸ do 10¹³ jednostek iniekcyjnych. Typowym przebiegiem podawania może być

186 073 jedna taka dawka dziennie powtarzana przez okres pięciu dni. Efektywna ilość może się zmieniać w zależności od rodzaju nieprawidłowości lub warunków, pacjenta i jego stanu, i inych czynników dobrze znanych biegłym w sztuce. Efektywna ilość jest łatwa do określenia dla biegłych w sztuce.

Również w zakres tego wynalazku włączono metodę polepszającą scharakteryzowanie patologii hiperproliferujących komórkek lub defektu genetycznego w obiekcie przez podawanie do obiektu efektywnej liczby wektora opisanego powyżej zawierającego obcy gen kodujący produkt genu posiadający zdolność polepszania patologi w odpowiednich warunkach. W znaczeniu użytym tytaj „defekt genetyczny” oznacza każdą chorobę lub odstępstwo do stanu normalnego dającego efekt czynnika dziedzicznego, takiego jak anemia sierpowata czy choroba Tay-Sacha.

Wynalazek ten dostarcza również metodę redukcji proliferacji komórek guza w obiekcie przez wprowadzenie do masy guza efektywnej ilości adenowirusowego wektora ekspresyjnego zawierającego gen antyguzowy inny niż gen supresorowy guza. Gen antyguzowy może kodować np. kinazę tymidynową (TK). Efektywna ilość czynnika terapetycznego jest następnie wprowadzana do obiektu, który w obecności genu antyguzowego jest toksyczny dla komórki. W specyficznym przykładzie kinazy tymidynowej czynnikiem terapeutycznym jest metabolit kinazyn tymidynowej taki jak gancyklowir (GCV), arabinonukleozyd 6-metoksypurynowy (araM) lub jego funkcjonalny ekwiwalent. Zrówno gen kinazy tymidynowej jak i metabolit kinazy tymidynowej użyte muszą być jednocześnie aby być toksyczne dla komórki gospodarza. Jednakże w jego obecności GCV jest fosforylowany i staje się potencjalnym inhibitorem syntezy DNA gdzie araM przekształca się do cytotoksycznego anabolitu araATP. Inne geny antyguzowe mogą być używane równie dobrze w kombinacji z odowiednim czynnikiem terapeutycznym do redukcji proliferacji komórek guza. Tego typu kombinacje innych genów i czynników terapeutycznych są doskonale znane specjalistom. Innym przykładem mógłby być wektor z tego wynalazku ekspresujący enzym deaminazę cytozynową. Taki wektor może być użyty w połączeniu lekiem ó-fluorouracylu (Austin i Huber, 1993) lub niedawno opisanym A gen z E. coli Deo w kombinacji z 6-metylo-puryno-2’-deuksyrybunuklozydem (Sorscher et al. 1994).

Tak jak w przypadku użycia genu suareszroweou guza opisanego wcześniej użycie innych genów antyguzowych zarówno pojedynczo jak i w kombinacji z właściwym czynnikiem terapeutycznym wprowadza traktowanie dla niekontrolowanego wzrostu komórki i proliferacji charakterystycznej dla guzów i nowotworów złośliwych. Choć ten wynalazek dostarcza terapię powstrzymującą niekontrolowany wzrost komórkowy u pacjenta przez złagodzenie symptomów choroby lub jej zniszczenie u pacjenta. Efekt takiego traktowania zawiera ale nie jest ograniczony do przedłużenia czasu przeżycia pacjenta, redukcji masy albo ciężaru guza, apoptozy komórek guza lub ograniczenia liczby krążących komórek guza. Znaczenia ważności korzystnego efektu tej terapii są dobrze znane specjalistom.

Wynalazek przedstawia wektory ekspresyjne rekombinowanych adenowirusów charakteryzujących się częściową lub całkowitą delecją adenowirusowego DNA białka IX i zawierającego obcy gen kodujący obce białko, gdzie obce białko jest genem samobójczym lub jego funkcjonalnym ekwiwalentem. Gen anty-rakowy TK, opisany powyżej, jest przykładem genu samobójczego, ponieważ podczas ekspresji produkt tego genu jest lub może zostać wytworzony jako gen letalny dla komórki. Dla TK letalność jest indukowana obecnością GCV. Gen TK pochodzi z wirusa opryszczki i jest znany doskonale biegłym w sztuce. Plazmid pMLBKTK z E.coli (ATTC #39369) jest źródłem genu kinazy tymidynowej (TK) wirusa opryszczki (HSV-1) wykorzystanym w tym wynalazku. Jakkolwiek wiele innych źródeł również istnieje.

Gen TK może być wprowadzany do masy guza przez połączenie wektora ekspresyjnego adenowirusa z odpowiednim farmakologicznie zaakceptowanym nośnikiem. Wprowadzenie może być dokonane poprzez np.: bezpośrednie wstrzyknięcie rekombinzwaneoo adenowirusa do masy guza. W szczególnym przypadku raka takiego jak rak wątroby (HCC), bezpośrednie wstrzyknięcie do przewodów wątrobowych może być wykorzystane do rozprowadzenia

186 073 ponieważ większość HCC pochodzi z tych arterii. Do kontroli proliferacji guza indukowana jest śmierć komórki przez traktowanie pacjenta metabolitem TK takim jak gancyklowir osiągając zmniejszenie masy guza. TK metabolit może być podawany np.: systematycznie przez lokalne inokulacje w obrębie guza lub w szczególnym przypadku jak HCC, przez wstrzyknięcie do przewodu wątrobowego. Metabolit TK jest podawany co najmniej raz dziennie lecz może być zwiększany lub zmniejszany zależnie od potrzeb. Metabolit TK może być podawany jednocześnie bądź niezależnie od podawania TK zawierającego wektor. Biegli w sztuce znają lub mogą określać dawkę i czas podawania, który jest efektywny terapeutycznie.

Metoda guzo - specyficznego dostarczania genu supresorowego do guza realizowana jest przez kontakt docelowej komórki zwierzęcia z efektywną ilością wynalezionych rekombinowanych adenowirusowych wektorów ekspresyjnych. Zadaniem genu jest kodowanie czynnika anty-guzowego, takiego jak funkcjonalny gen supresorowy guza lub gen samobójczy. Termin „kontaktowanie” zawiera każdą metodę prowadzącą do skutecznego przenoszenia wektora, taką jak wstrzykiwanie wewnątrzguzowe.

Użycie wektora adenowirusowego z tego wynalazku do przygotowania lekarstw, leczenia chorób i w terapii jest przedstawiane w dalszej kolejności przez ten wynalazek. Do ilustracji użyto następujących przykładów, nie ograniczając zakresu tego wynalazku.

Przykład 1

Plazmid pAd/MLP/p53/Elb został użyty do manipulacji jako materiał startowy. Plazmid ten opiera się na pBR322 pochodnej pML2 (dęlecji pBR322 dla par zasad 1140 do 2490) zawiera sekwencje adenowirusa typu 5 rozciągającj się od pary zasad numer 1 do pary zasad 5788 oprócz dęlecji dla adenowirusa typu 5 od pary zasad 357 do 3327. Od strony Ad5 357/3327 delecji wprowadzona jest jednostka transkrypcyjna zawierająca późny promotor adenowirusa typu 2, potrójny lider cDNA adenowirusa typu 2 i ludzki p53 cDNA. Jest to typowe podstawienie El wektora usuniętego dla Ad5 Ela i Elb genu ale zawierającego gen białka IX Ad5 (patrz przegląd wektorów adenowirusowych. Graham i Prevec (1992)). Ad2 DNA pozyskano z Gibco BRL. Restrykcyjne endonukleazy i T4 DNA ligazę otrzymano z Gibco BRL i komórki 293 z American Type Culture Collection (ATCC). Prep-A-gen DNA żywicę do oczyszczania pozyskano z BioRad. Bulion LB wzrostowy bakterii otrzymano z Difco. Kolumny Qiagen do oczyszczania DNA pochodziły z Oiagen Inc. Ad5 dl 327 pozyskano od RJ. Schneider, NYU. MBS DNA kit transfekcyjny zakupiono od Stratagene.

Jeden (1) ng pAd/MLP/p53/EQlb- trawiono z 20 jednostkami każdego z enzymów restrykcyjnych Ecl 136II i NgoMI zgodnie z zaleceniami producenta. Pięć (5) (ig Ad2 DNA trawiono 20 jednostkami każdej z restrykcyjnych endonukleaz Dral i NgoMI zgodnie z zaleceniem producenta. Trawione fragmenty restrykcyjne nakładano na osobne ścieżki 0,8 % żelu agarozowego i wykonano elektroforezę przy 100 woltach przez 2 godziny. Fragment restrykcyjny 4268 bp z próbki Pad/MLP/p53/EQlb oraz fragment 6437 bp próbki Ad2 rozdzielano na żelu z użyciem Prep-A-gen DNA żywicy ekstrakcyjnej zgodnie ze specyfikacją dostarczoną przez producenta. Fragmenty restrykcyjne zmieszano i traktowano T4 DNA ligazą w całkowitej objętości 50 μ1 w 16°C przez 16 godzin zgodnie z zaleceniami producenta. Po ligacji 5 |il mieszaniny reakcynej użyto do transformacji komórek DH5a E. coli odpornością na ampicylinę zgodnie z procedurą producenta. Sześć kolonii bakteryjnych otrzymanych poprzez tą procedurę użyto do zaszczepienia oddzielnych 2 ml kultur wzrostowych LB i inkubowano przez noc w 37°C wytrząsając. DNA przygotowane było z każdej kultury bakteryjnej używając standardowej procedury (Sambrook et al. (1989)). Jedną czwartą plazmidu DNA z każdej izolacji trawiono 20 jednostkami endonukleazy XhoI w celu wyszukania właściwych rekombinantów zawierające fragmenty restrykcyjne wielkości 3627, 3167, 2466 i 1445 par zasad. Pięć z sześciu przeszukanych izolantów zawierało właściwy plazmid. Jeden z nich został użyty następnie do inokulacji 1 litra medium LB w celu izolacji większej ilości plazmidu DNA. Po całonocnej inkubacji plazmid DNA izolowano z 1 litra kultury przy użyciu kolumienek do oczyszczania DNA Qiagen, zgodnie z zaleceniami producenta. Otrzymany plazmid oznaczono jako Pad/MLP/p53/PIX-. Próbki tego plazmidu zdeponowano w American Type Culture

Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U.S.A., 12301, 22 października 1993. Depozyt został zrobiony na zasadach Traktatu Budapesztańskiego Międzynarodowych Depozytów Mikroorganizmów dla celów procedury patentowej. Depozyt ma numer rejestru ATCC No 75576.

Do konstrukcji rekombinowanego adenowirusa użyto 10 |_jg Pad/MLP/p53/PIX, które traktowano 40 jednostkami restrykcyjnej endonukleazy EcoRI do liniowego wydłużenia plazmidu. Adenowirus typu 5 dl327 DNA (Thimmappaya (1982)) trawiono endonukleazą Ciał i duży fragment (około 33 kilo par zasad)oczyszczano przez wirowanie w gradiencie sacharozy. Dziesięć (10) fig EcoRI traktowane Pad/MLP/p53/Elb i 2,5 pg Ciał traktowane Ad5 dl 327 zmieszano i użyto do transfekcji około 10⁶ komórek 293 używając MBS ssaczy kit transfekcyjny jak zaleca dostawca. Osiem (8) dni po transekcji komórki 293 rozdzielono 1 do 3 na świeże podłoże i dwa dni później efekt cytopatyczny adenowirusa stał się widoczny na transfekowane komórki. W 13 dniu przygotowano potransfekcyjne DNA z zainfekowanych komórek używając standardowych procedur (Grahm i Prevec (1991)) i analizowano poprzez trawienia restrykcyjne używając endonukleazy Xhol. Bezpośrednią ekspresję wirusa p35 weryfikowano po infekcji komórek raka kości SaoS2 lizatem wirusowym i immunoblotingu z przeciwciałami monoklonalnymi anty-p53 opisanymi jako 1801 (Novocasta Lab. Ltd., U.K.).

Przykład 2

Materiały i metody

Linie komórkowe

Rekombinowane adenowirusy były hodowane i propagowane w linii komórkowej 293 (ATCC CRL 1579) komórek embrionalnych nerki ludzkiej utrzymywane w podłożu DME zawierającym 10% zdefiniowaną surowicę cielęcą (Hyclone). Komórki Saos-2 utrzymywano w podłożu Kaighin’a z dodatkiem 15% zarodkowej surowicy cielęcej. Wszystkie inne linie komórkowe rosły na podłożu Kaighin’a z dodatkiem 15⁰% zarodkowej surowicy cielęcej. Komórki Saos-2 zostały uprzejmie dostarczone przez Dr. Erie Stanbridge. Wszystkie inne linie komórkowe uzyskano z ATCC.

Konstrukcja rekombinowanych adenowirusów

Do konstrukcji wirusów Ad5/p53 użyto 1,4 kb fragment Hindlll-Smal zawierającego pełnej długości cDNA dla p53 izolowano z pGEMl-p53-B-T (uprzejmie dostarczony przez Dr. Wen Hwa Lee) i wprowadzony do miejsca wielokrotnego klonowania wektora ekspresyjnego psP72 (Promega) używając standardowych procedur klonowania (Sambrook et al 1989). Insert p53 został odzyskany z tego wektora po trawieniu z XhoI-BglII i elektroforezie żelowej. Sekwencję kodującą p53 następnie wprowadzono do pNL3C lub pNL3CMV wektorów adenowirusa genów transferowych (dostarczonych przez Dr. Robert Schneider) zawierające Ad5 5’ odwrócone końcowe powtórzenia, wirusowe sygnały pakujące i Ela wzbogacenia w górę albo od Ad2 późnego promotora (MLP) albo bezpośredniego wczesnego genu promotorowego cytomegalowirusa ludzkiego (CMV), po której następowała trój częściowa liderowa cDNA i Ad5 sekwencja 3325-5525 bp osadzona w PMLZ. Ten nowy konstrukt zastąpił region El (bp 360 - 3325) z Ad 5, wprowadzony albo z Ad2 MLP (A/M/53) albo z ludzkiego promotora (A/C/53), po których występował trójczęściowy liderowy cDNA (patrz figura 4). Inserty p53 wykorzystały pozostałego w dół Elb miejsca poliadenylacji. Dodatkowo generowano MLP i CMV wprowadzone z rekombinantów p53 (a/M.N/53, A/C/N/53), które posiadały dalszą 705 nukleotydową delecję sekwencji Ad5 do usunięcia regionu kodującego białko IX (PIX). Jako kontrolę utworzono rekombinowanego adenowirusa z plazmidu ojcowskiego PNL3C bez insertu p53 (A/M). Druga kontrola składała się z rekombinowanego adenowirusa kodującego gen β galaktozydazy pod kontrolą promotora CMV (A/C/13-gal). Plazmidy wydłużano albo z Nru I albo Eco RI i kotransfekowano z dużym fragmentem Ciał trawionym Ad 5 mutantami dl309 lub dl327 (Jones i Shenk (1979)) z użyciem Ca/PO4 kitu transfekcyjnego (Stratagene). Płytki wiralne izolowano i identyfikowano rekombinanty przez jednoczesną analizę trawień restrykcyjnych i PCR z użyciem primerów specyficznych rekombinantom przeciwko potrójnej sekwencji liderowej CDNA z sekwencją w dół p53

186 073

CDNA. Rekombinowane adenowirusy poddane były dalszemu oczyszczaniu przez ograniczone rozpuszczanie i cząstki wirusa oczyszczono i miareczkowano (aktywność) standardowymi metodami (Graham i van der Erb 1973; Graham i Prevec 1991).

Wykrywanie białka P53

Komórki Saos-2 lub Hep 3B (5x10⁵) infekowano oznaczonymi rekombinantami adenowirusowymi przez okres 24 godzin przy wzrastających wielokrotnościach infekcji (MOI) jednostek tworzących płytki wirusowe/komórkę. Komórki były następnie jednorazowo wymywane PBS i zbierane buforem lizującym buforem (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 0,1% NP4O, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 10 pg/ml aprotinina, 10 ug/ml leueptina, i 1 mM PMSF). Białka komórkowe (około 10 pg) rozdzielano na 10 % PAGE-SDS i przenoszono na nitrocelulozę. Membrany inkubowano z a-p53 przeciwciałem Pab 1801 (Novocastro) po której następowała koniugacja owczej anty-mysiej IgG z peroksydazą chrzanową. Białko p53 wizualizowano przez chemiluminescencję (ECL kit, Amersham) na filmie XAR-5 Kodaka.

Pomiar szybkości syntezy DNA

Komórki (5x103) umieszczono na płytce immunologicznej i pozwolono na związanie przez noc (37°C, 7% C0₂). Komórki były następnie infekowane przez 24 godziny częściami oczyszczonych rekombinantów wirusowych w zakresie MOI od 0,3 do 100. Podłoże było zmieniane 24 godziny po infekcji i dalej kontynuowano inkubacje do całkowitego czasu 72 godziny. 3H-tymidyna (Amersham, lp Ci/próbę) dodana w 18 godzin przed zbiorem. Komórki zbierano na filtrach z włókna szklanego i poziom wprowadzanej radioaktywności mierzono w liczniku scyntylacyjnym beta. Wprowadzana 3H- tymidyna wyrażana była jako średni % (+/- SD) podłoża kontrolnego i określana w stosunku do MOI.

Rakotwórczość u nagich myszy

Około 2,4x10⁸ komórek Saos -2 umieszczonych w kolbach T225 traktowano buforem do suspendowania (1% sacharoza w PBS) zawierającym albo A/M/N/53 albo A/m oczyszczone wirusy przy MOI 3 lub 30. Po całonocnej infekcji komórki wprowadzano podskórnie do lewego lub prawego boku BALB/c athymic nagich myszy (4 myszy na grupę). Jeden bok wstrzykiwany był A/M/N/53 traktowanymi komórkami, podczs gdy przeciwny bok zaszczepiany był kontrolnymi komórkami A/M, każda mysz służyła jako swoja własna próba kontrolna.

Zwierzęta otrzymujące obustronne zastrzyki z komórek traktowanych buforem służyły jako kontrole dodatkowe. Rozmiar guza (długość, szerokość, wysokość) i ciężar ciała były następnie mierzone dwa razy w tygodniu przez okres 8 tygodni. Objętość guza oszacowano dla każdego zwierzęcia na podstawie geometri kulistej z promieniem równym jednej drugiej przeciętnej miary wielkości guza.

Wewnątrz-guzowa analiza RNA

BALB/c athymic nagie myszy (w wieku około 5 tygodni) były nastrzykiwane 1x10⁷ małymi komórkami raka płuc (SCLC) w prawe boki. Guzom pozwalano rosnąć przez 32 dni aż do osiągnięcia około 25-50 mm3. Myszy otrzymywały okołoguzowe zastrzyki z albo A/C/53 bądź A/C/B-gal rekombinowanych wirusów (2x10⁹ (pfu)) w przestrzenie podskórne poniżej masy guza. Guzy wycinano od zwierząt 2 i 7 dniowych po traktowaniu adenowirusem i przemywano PBS. Próbki guza były homogenizowane i izolowano totalny RNA używając Trireagent Kit (Molecular Research Center, Inc.). PolyA RNA izolowano używając PolyATract system izolacyjny RNA (Promega) i około 10 ng próbki użyto do reakcji RT-PCR określenie ekspresji mRNA rekombinantów p53 (Wang et al. (1989). Oznaczono primery do amplifikacji sekwencji pomiędzy potrójnym adenowirusowym liderem CDNA i regionem w dół p53 CDNA, upewniając się, że tylko rekombinant a nie endogenne p53 może być amplifikowane.

Terapia genowa P53 ustabilizowanych guzów nagich myszy

Około 1x107 komórek guzowych H69 (SCLC) wstrzykiwano podskórnie samicom BALB/c athymic nagich myszy. Pozwalano rozwijać się guzom przez okres 2 tygodni w których poszczególne zwierzęta były z uśrednioną wielkością guza (N=5/grupę). Okołoguzowe

186 073 wstrzyknięcia albo A/M/N/53 albo kontrolnego adenowirusa A/M (2xl09pfu/iniekcję) lub samym buforem (1% sacharoza w PBS) wprowadzano dwa razy w tygodniu w ilości całkowitej 8 dawek/grupę. Wielkość guza i ciężar ciała mierzono dwa razy na tydzień przez 7 tygodni, a objętość guza oszacowano tak jak opisano wcześniej. Zwierzęta były następnie obserwowane pod kontem efektu dawkowania i przeżywalności.

Rezultaty

Konstrukcja p53 rekombinowanego adenowirusa

Konstrukcja adenowirusa p53 polegała na zamianie części regionu Ela i Elb adenowirusa typu 5, p53 CDNA znajdującego się pod kontrolą bądź promotora Ad2 MLP (A/M/53) lub CMV (A/C/53) (schemat w fig. 4). Taka podstawienie El poważnie osłabia zdolność rekombinowanych adenowirusów do replikacji, ograniczając ich propagację do komórek 293, które dostarczają produkty genu Ad5 El w trans (Graham et al. (1977)). Po identyfikacji rekombinowanego adenowirusa p53 przez zarówno trawienia restrykcyjne jak i analię PCR kompletną sekwencję p53 cDNA jednego z rekombinowanych adenowirusów sekwencjonowano w celu weryfikacji braku (w niej) mutacji. Następnie oczyszczone preparaty rekombinantów p53 użyto do infekcji komórek HeLa w doświadczeniu na obecność fenotypowo dzikiego typu adenowirusa.

Komórki HeLa, które nie są dostępne dla replikacji delecji El adenowirusów zostały zainfekowane 1-4x109 jednostkami infekcyjnymi rekombinowanego adenowirusa, hodowanego przez 3 tygodnie i obserwowanego na pojawienie się efektu cytopatycznego (CPE). Używając tego testu replikacja rekombinowanego adenowirusa lub zanieczyszczeniem szczepem dzikim nie było wykrywane, łatwo natomiast stwierdzane przez obserwację CPE w komórkach kontrolnych infekowanych dzikim typem adenowirusa na poziomie czułości około lw 109.

Ekspresja P53 zrekombinowanego adenowirusa

Dla oznaczenia czy p53 rekombinowane adenowirusy produkują białko p53, guzowate linie komórkowe, które nie produkowały endogennego białka p53, były infekowane. Ludzkie guzowate linie komórkowe Saos -2 (rak kości) i Hep 3b (rak wątroby) (hepatocellular carcinoma) infekowano przez 24 godziny p53 rekombinowanym adenowirusem A/M/53 lub A/C/53 przy przedziale MOI 0,1 -200 pfu/komórkę. Analiza Western lizatów otrzymanych z infekowanych komórek pokazuje dawkowo-zależną ekspresję białka p53 w obydwu typach komórek (figura 5). Obie linie komórkowe produkujące wyższy poziom białka p53 po infekcji A/C/53 niż z A/M/53 (figura 3). Nie wykryto żadnego białka p53 w nie infekowanych komórkach. Poziomy endogennych p53 typu dzikiego są w warunkach normalnych niskie i prawie nie wykrywalne przez analizę Western ekstraktów komórkowych (Bartek et al. (1991)). Jest jednakże jasne, że poziomy białka p53 typu dzikiego są łatwo wykrywalne po infekcji każdym A/M/53 lub A/C/53 w niskim MOI (figura 5), sugerując że nawet niska dawka p53 rekombinowanego adenowirusa może produkować potencjalnie skuteczny poziom p53.

Powtórne wprowadzenie dzikiego szczepu p53 do ujemnych linii komórkowych p53 osteosarcomy, Saos-2, spowodowało charakterystyczne powiększenie i spłaszczenie tych prawidłowo wrzecionowato ukształtowanych komórek (Chen et al. (1990)). Sub-zlewające się komórki Saos-2 (lxl0⁵ komórek/10 cm płytki) zostały zainfekowane MOI 50 z drugim A/C/53 lub kontrolowanym wirusem A/M i inkubowane w 37°C przez 72 godziny aż do momentu gdy nie zarażone płytki kontrolne zlewały się. W tym punkcie oczekiwana zmiana morfologiczna była ewidentna na płytce poddanej działaniu A/C/53 (fig. 6, panel C), ale nie w niezainfekowanej (fig. 6, panel A) lub płytkach kontrolowanego zarażenia wirusem (fig. 6, panel B). Ten efekt nie był funkcją gęstości komórek dlatego, że płytki kontrolne były wstępnie obsiane niższej gęstości komórkami normalnymi morfologicznie na 72 godziny, kiedy ich płynność zbliżyła się do płytek potraktowanych A/C/53. Wcześniejsze wyniki demonstrowały wysoki poziom ekspresji p53 na MOI 50 w komórkach Saos-2 (fig. 5A) i wyniki te dostarczyły ewidentnych danych, że białko p53 ekspresowane przez te rekombinowane adenowirusy było biologicznie aktywne.

186 073

Inhibicja p53 syntezy komórkowej DNA

Dla pełniejszego testowania aktywności rekombinowanych adenowirusów p53, ich zdolność do inhibicji proliferacji ludzkich komórek nowotworowych była analizowana jako pomiar wbudowania 3H-tymidyny. Wcześniej zostało pokazane, że wprowadzenie dzikiego szczepu p53 do komórek, które nie ekspresują endogenicznego dzikiego szczepu p53 może wstrzymywać komórki w przejściu (tranzycie) Gl/S, prowadząc do inhibicji wbudowania oznakowanej tymidyny do nowo zsyntezowanego DNA (Baker et al. (1990)). Różnorodność wadliwych (niekompletnych) nowotworowych linii komórkowych p53 była zainfekowana innym A/M/N/53, A/C/N/53 lub nie-p53 ekspresującym kontrolnym rekombinowanym adenowirusem (A/M). Silna, zależna od dawki inhibicja syntezy DNA przez oba A/M/N/53 i A/C/N/53 rekombinanty w 7 z 9 nowotworowych linii komórkowych (fig. 7) była zaobserwowana. Obie konstrukcje były zdolne do inhibicji syntezy DNA w tych ludzkich komórkach nowotworowych, niezależnie czy one ekspresowały mutant p53 lub wykazywały brak ekspresji białka. Zostało także odkryte, że w tej analizie konstrukcja A/C/N/53 została bardziej skuteczna niż A/M/N/53. W komórkach Saos-2 (osteosarcoma) i MDA-MB468 (rak piersi), blisko 100% inhibicji syntezy DNA zostało osiągnięte przez konstrukcję A/C/N/53 przy MOI tak niskim jak

10. W dawkach, gdzie zaszła iifinbicca przez adenowirus tylko w 10-30%,

50-100% redukcji zostało zaobserwowane w syntezie DNA używając również rekombinowany adenowirus p53. Dla kontrastu, istotny specyficzny efekt p53 nie został zaobserwowany w żadnej konstrukcji jako porównanie do kontroli wirusa w komórkach HEP G2 (linia komórkowa hepatocarcinoma ekspresująca endogeniczny dziki szczep p53, Bressac et al. (1990)), jak i w białaczkowych liniach komórkowych K562 (bez p53).

Tumorogeniczność u nagich myszy

W bardziej przekonujących testach funkcji rekombinowanych adenowirusów, komórki nowotworowe zostały zainfekowane ex vivo i następnie komórki zostały wstrzyknięte nagim myszom dla oszacowania zdolności rekombinantów do powstrzymania wzrostu nowotworu in vivo. Komórki Saos-2 zainfekowane A/M/N/53 lub kontrolowanym wirusem A/M w MOI 3 lub 30, zostały wstrzyknięte do przeciwnych pachwin nagich myszy. Rozmiary nowotworu były mierzone dwa razy w tygodniu przez 8 tygodni. W MOI 30, nie został zaobserwowany żaden wzrost nowotworu w traktowanych p53 pachwinach żadnego ze zwierząt, podczas gdy w próbach kontrolnych obserwowano dalej wzrost nowotworów (fig. 8). Stopniowy wzrost kontrolowanego nowotworu traktowanego wirusem były podobne do tego obserwowanego u kontrolnych zwierząt traktowanych buforem. Wyraźna różnica we wzroście nowotworu pomiędzy kontrolowanym adenowirusem i rekombinowanym p53 w MOI 3, pomimo dwóch nowotworów z czterech traktowanych p53 myszy zaczęły wykazywać pewien wzrost w przybliżeniu po 6 tygodniach. W ten sposób rekombinant A/M/N/53 adenowirusa jest zdolny do pośrednictwa w supresji specyficznego nowotworu p53 w środowisku in vivo.

Ekspresja in vivo Ad/p53

Pomimo traktowania ex vivo komórek nowotworowych i późniejszego wstrzykiwania ich zwierzętom umożliwiającego krytyczny test supresji nowotworu, bardziej istotnym klinicznie eksperymentem jest ustalenie czy wstrzyknięty rekombinant adenowirusa p53 może infekować i ekspresować p53 w ustalonych nowotworach in vivo. Dla wyjaśnienia tego, komórki H69 (SCLC, p53 nuli) były wstrzykiwane podskórnie nagim myszom i nowotwory mogły się rozwijać przez 32 dni. W tym czasie pojedynczy zastrzyk 2xl0⁹pfu A/C/53 lub A/C/beta-gal adenowirusa został wstrzyknięty w przestrzeń otaczającą nowotwór. Następnie nowotwory były usuwane drugiego lub siódmego dnia po wstrzyknięciu adenowirusa i z każdego nowotworu izolowany był polyA RNA RT-PCR, specyficzne primery rekombinantów p53, były następnie używane do detekcji p53 MRNA w traktowanych nowotworach p53 (fig. 9, ścieżka 1, 2, 4, 5). Żaden sygnał p53 nie był widoczny w usuniętych nowotworach z traktowanych beta-gal'em zwierząt (fig. 9, ścieżka 3 i 6). Amplifikacja z primerami aktyny służy jako kontrola reakcji RT-PCR (fig. 9, ścieżka 7-9), gdy plazmid zawierający sekwencję rekombinantu p53 służącą jako pozytywna kontrola dla specyficznego wiązania rekombinantu p53

186 073 (fig. 9, ścieżka 10). Ten eksperyment pokazuje, że rekombinant p53 adenowirusa może specyficznie kierować ekspresją p53 mRNA wewnątrz ustabilizowanych nowotworów po pojedynczym wstrzyknięciu do przestrzeni okzłznowotworowej. Wykazano także trwałość wirusa in vivo po tygodniu od zainfekowania rekombinantem p53 adenowirusa.

Skuteczność in vivo

Do zaadresowania możliwości przeprowadzenia terapii genowej ustabilizowanych nowotworowych, był używany wytrzymały nowotworowe model nagich myszy. Komórki H69 były wstrzykiwane w przestrzeń podskórną prawej pachwiny myszy i nowotwór wzrastał przez 2 tygodnie. Następnie myszy przyjęły iniekcje buforu lub rekombinowanego wirusa dwa razy w tygodniu, łącznie 8 dawek. W myszach traktowanych buforem lub kontrolowanym wirusem A/M, nowotwór dalej szybko wzrastał w trakcie prac, podczas gdy te traktowane wirusem A/M/N/53 wzrastały w bardzo ograniczonym tempie (Fig. 10A). Po przerwaniu zastrzyków kontrolowane, traktowane nowotwory kontynuowały swój wzrost podczas gdy traktowane p53 nowotwory wykazywały niewielki lub brak wzrostu przez tydzień w obecności związków zastępczych egzogenicznego p53 (Fig. 10A). Pomimo traktowania zwierząt kontrolnych samym buforem przyspieszającym wzrost nowotworu w porównaniu do innych traktowanych grup wirusa, nie zostały znalezione żadne istotne zmiany w wadze ciała pomiędzy trzema grupami w czasie okresu traktowania. Owrzodzenie nowotworowe u niektórych zwierząt limitowało związki pomiaru wielkości nowotworu po 42 dniach. Jakkolwiek kontynuując obserwację (monitorowanie) zwierząt by ustalić czas przeżycia dowiedziono przewagę przeżycia dla zwierząt traktowanych p53 (fig. 10B). W końcu zwierzęta kontrolne traktowane adenowirusem zdechły 83 dnia, w czasie gdy traktowane były samym buforem wszystkie zdechły 56 dnia. Dla kontrastu, wszystkie 5 zwierząt traktowanych A/M/N/53 dalej żyły (130 dni po zaszczepieniu) (fig. 10B). Razem te dane ustaliły specyficzny efekt p53 zarówno dla wzrostu nowotworu, jak i czasu przeżycia z ustalonym nowotworem pozbawionym p53.

Wektory adenowirusa ekspresujące p53

Skonstruowano rekombinowane ludzkie wektory adenowirusa, które są zdolne do eksprełzwania wysokich poziomów białka p53 dzikich szczepów w sposób zależny od dawek. Każdy wektor zawiera usunięcia (delecje) w regionach El A i E1B, które zwracają niecałkowitą replikację wirusa (Challberg and Kelly (1979); Harowitz, (1991)). Następnie ważne jest to, że te delecje obejmują opuszczenie tych sekwencji, które kodują Elb 19 i białko 55kd. Białko 19 kd omówione jako włączone w inhibicję apoptozy (White et al. (1992); Rao et al. (1992)), podczas gdy białko 55kd jest zdolne do wiązania białka p53 dzikiego szczepu (Sarnów et al. (1982); Heuvel et al. (1990)). Przez usunięcie tych sekwencji adenowirusa, potencjalne inhibitory funkcji p53 zostały usunięte przez bezpośrednie wiązanie z p53 lub potencjalną inhibicję p53 pośredniczącą w apoptozie. Dalsze konstrukcje, które zostały stworzone miały pozostałość 3’ sekwencji Elb, włączając całą kodującą sekwencję białka IX, którą również usunięto. Pomimo że było to donoszone dla zredukowania pojemności upakowania adenowirusa w przybliżeniu do 3kb mniej niż dziki szczep wirusa (Ghosh-Choudkury et al. (1987)), te konstrukty są usunięte w regionie E3 tak, że konstrukty A/M/N/53 i A/C/N/53 są ujęte w tym przedziale wielkości. Przez usunięcie regionu pIX, sekwencja adenowirusa homologiczna do tych zawierających komórki 293 są zredukowane do w przybliżeniu 300 par zasad, obniżając szansę regeneracji konkurencyjnej replikacji, dzikiego szczepu adenowirusa przez rekombinację. Konstrukty z brakującą pIX kodującą sekwencją okazują się równie wydajne jak te z pIX.

Skuteczność adenowirusa p53 in vitro

W zgodzie z zależną od silnej dawki ekspresją białka p53 w zainfekowanych komórkach, została przedstawiona zależna od dawki inhibicja wzrostu komórek nowotworowych. Podział komórkowy był inhibowany i przedstawiany przez inhibicję syntezy DNA, w szerokiej różnorodności typów komórek nowotworowych znanych z braku ekspresji białka p53 dzikiego szczepu. Bacchetti i Graham (1993) ostatnio donosili o specyficznej inhibicji p53 syntezy DNA w liniach komórkowych raka jajników SKOV-3 przez rekombinant adenowirusa

186 073 p53 w podobnych eksperymentach. Ponadto oprócz raka jajników, dodatkowo ludzkie nowotworowe linie komórkowe zostały przedstawione, reprezentatywnie ważnych klinicznie ludzkich nowotworów i włączając ścieżki nad-ekspresujące mutantu białka p53, może także być wzrost inhibowany przez rekombinanty p53 tego wynalazku. W MOIs gdzie rekombinant A/C/N/53 jest efektywny w 90-100% w inhibicji syntezy DNA w tych typach nowotworu, kontrolowana supresja adenowirusa jest mniejsza niż 20%.

Pomimo, że Feinstein et al. (1992) donosił, że reintrodukcja dzikiego szczepu p53 może wywołać (spowodować) różnicowanie i wzrost proporcji komórek w G1 kontra S+G2 dla komórek leukemicznych K562, żadnego specyficznego efektu p53 nie znaleziono na tej drodze. Horvath i Weber (1988) donieśli, że limfocyty ludzkiej krwi obwodowej są wysoce niedozwolone w infekcji adenowirusa. W oddzielnych eksperymentach, rekombinanty istotnie infekowały nie reagujące komórki K562 z rekombinantem A/C/beta-gal adenowirusa, w czasie gdy inne linie komórkowe, włączając kontrolne linie komórkowe i te wykazujące silny efekt p53, łatwo było zainfekować. W ten sposób przynajmniej część zmiennej skuteczności okazała się właściwa do zmienności infekcji, pomimo, że inne parametry mogą być również zaangażowane.

Obserwowane wyniki z wirusem A/M/N/53 w fig. 8 przedstawiają, że kompletna supresja jest możliwa w środowisku in vivo. Wznowienie wzrostu nowotworu w dwóch na cztery zwierząt traktowanych p53 przy niższym MOI najprawdopodobniej wynikała z małego procentu komórek wstępnie nie zainfekowanych rekombinantem p53 w tej dawce. Kompletna supresja zaobserwowana z A/M/N/53 w wyższej dawce, pokazuje, że zdolność nowotworu do odrostu może być opanowana.

Skuteczność adenowirusa p53 in vivo

Przedstawiona tu praca i innych grup (Chen et al. (1990); Takahashi et al. (1992) pokazuje, że ludzkie komórki nowotworowe wykazujące brak ekspresji dzikiego szczepu p53 mogą być traktowane ex vivo z p53 i wynikiem jest supresja wzrostu nowotworu kiedy traktowane komórki są przeniesione do modelu zwierzęcego. Zgłaszający zaprezentowali pierwszy oczywisty dowód terapii genowej „poskramiacza” nowotworu w ustalonym nowotworze in vivo, dający w wyniku zarówno supresję wzrostu guza jak i wydłużony okres przeżycia. W systemie zgłaszających, dostarczenie do komórek nowotworu nie polegało na bezpośrednim wstrzyknięciu do masy nowotworu. Raczej, rekombinant adenowirusa p53 był wstrzykiwany do przestrzeni okołonowotworowej, a ekspresja p53 mRNA została odkryta w nowotworze. Ekspresja p53 przez rekombinanty była funkcjonalna i silnie tłumiła wzrost nowotworu porównywalny do tego kontrolowanego, guza traktowanego adenowirusem na ekspresującym p53. Jakkolwiek oba p53 i kontrolowany wirus traktujący grupy nowotworowe wykazał supresję nowotworu w porównaniu do prób traktowanych buforem. Zostało zademonstrowane, że lokalna ekspresja nowotworowego faktora necrosis (TNF), interferonu-gama, interleucyny (EL)-2, IL-4 lub EL-7 mogą prowadzić do komórek-T niezależnej supresji nowotworu w nagich myszach (Hoch et al. (1992)). Wystawienie monocytów na wiriony adenowirusa, wykazały, że są one też słabymi induktorami IFN-alfa/beta (omówione w Gooding and Wold (1990)).

Dlatego, nie zaskakuje, że supresja niektórych nowotworów u nagich myszy była obserwowana nawet w kontrolowanych adenowirusach. Pośrednictwo tego wirusa w supresji tego nowotworu nie zostało zaobserwowane w ex vivo kontrolowanym wirusie traktującym komórki nowotworowe Saos-2 opisanych wcześniej. Specyficzne p53 in vivo supresja nowotworu było przedstawione przez kontynuację monitorowania zwierząt w fig. 10. Czas przeżycia traktowanych p53 myszy istotnie wzrastał, z pięciu na pięć zwierząt ciągle żyło więcej niż 130 dni po zaszczepieniu komórek porównane do zera na pięć traktowanych adenowirusem zwierząt kontrolnych. Przeżywające zwierzęta nadal miały wzrastające nowotwory, które mogą odzwierciedlać komórki początkowo nie zainfekowane przez rekombinanty adenowirusa p53. Wyższe lub częstsze dozowanie wykaże możliwość odnotowania tego. W dodatku odizolowanie promotora (Palmer et al. (1991)) lub dodatkowe mutacje mogą zwrócić komórki

186 073 odporne do traktowania rekombinantem adenowirusa p53. Na przykład, mutacje w ostatnio opisanym genie WAF1, genie wzbudzonym przez dziki szczep p53, który następnie inhibuje progresję cyklu komórkowego do S fazy, (El-Deiry et al. (1993); Hunter (1993)) mogą spowodować odpomość-p53 nowotworową.

Przykład 3

Ten przykład pokazuje wykorzystanie genów samobójczych i specyficznej ekspresji tkanek takich genów metodach terapii genowej tu opisanych. Nowotwór wątroby został wybrany jako cel jest to jeden z najbardziej popularnych ludzkich nowotworów złośliwych dotykających mężczyzn, przyczyniających się szacunkowo do 1.250.000 śmierci rocznie na świecie. Zasięg tego raka jest bardzo duży w Południowowschodniej Azji i Afryce, gdzie jest połączony z infekcją Hepatitis B i C i ekspozycją na aflatoksyny. Jedynym sposobem leczenia HCC dające szansę wyleczenia jest obecnie tylko operacja. Mniej niż 20% pacjentów to kandydaci do podjęcia przemyślanej decyzji wycięcia nowotworu (Ravoet C. et al., 1993). Jakkolwiek, nowotwory inne niż nowotwór wątroby są tak samo odpowiednie do metod redukujących ich proliferację w sposób tu opisany.

Linie komórkowe

Wszystkie linie komórkowe ale dla linii komórkowych HLF, były otrzymane z American Type Tissue Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland. Numery rejestru ATCC są zapisywane w nawiasach. Ludzkie linie komórkowe embrionalne nerek 293 (CRL 1573) zostały użyte do wywołania i rozmnożenia opisanych tu rekombinantów adenowirusa. Były one utrzymywane w medium DME zawierającym zdefiniowane, uzupełniające serum cielęce (Hyclone). Linie komórkowe hepatocellular carcinoma Hep 3B (HB 8064), Hep G2 (HB 8065), i HLF zostały zachowane w medium DME/F12 uzupełnionym 10% zarodkowego wołowego serum, linie komórkowe raka piersi MDA-MB468 (HTB 132) i BT-549 (HTB 122). Zmienione komórki wątroby (CCL 13) rosły w medium MeM uzupełnionym zarodkowym wołowym serum. Linie komórkowe HLF zostały uzyskane od dr T. Morsaki i H. Kitsuki z Kyushu University School of Medicine w Japonii.

Rekombinowana konstrukcja wirusa

Dwa wektory ekspresji adenowirusa zostały tu oznaczone jako ACNTK i AANTK i pozbawione białka funkcyjnego IX (przedstawione na fig. 11) są zdolne do kierowania ekspresją samobójczych genów TK w komórkach nowotworowych. Trzeci oznaczony wektor ekspresji adenowirusa AANCAT był skonstruowany do dalszego zademonstrowania możliwości przeprowadzenia wyraźnej ekspresji genu celowego do specyficznych typów komórek używających wektory adenowirusa. Te konstrukcje adenowirusa zostały zebrane, opisane w fig. 11 i 12 i są pochodnymi tych wcześniej opisanych dla ekspresji genów tłumiących nowotwór.

Dla ekspresji obcego genu, kaseta ekspresji została wprowadzona wykorzystując ludzki cytomegalovirus bezpośrednio za wczesnym promotorem/wzmacniaczem (CMV) (Boshart, M. et al., 1985) lub przez system ludzkiej fetoproteiny (AFP) wzmacniacz/promotor (Watanable, K. et al., 1987; Nakabayashi, H. et al., 1989) do przeprowadzenia transkrypcji genu TK lub genu chloroamphenicol acetyltransferazy (CAT). CMV wzmacniacz promotor jest zdolny do przeprowadzenia silnej ekspresji genu w szerokiej różnorodności typów komórek, podczas gdy konstrukt AFP wzmacniacz/promotor ogranicza ekspresję do komórek nowotworu wątroby (HCC), które ekspresują AFP w około 70-80% populacji pacjentów HCC. W konstrukcie wykorzystuje się CMV promotor/wzmacniacz, typ adenowirusa z potrójną sekwencją liderową, która także była wbudowana dla wzmocnienia translacji transkryptu TK (Berkner, K. L. and Sharp, 1985). W dodatku do usunięcia El oba wektory adenowirusa są dodatkowo usunięte dla 1.9 kb DNA w regionie E3 wirusa. Usunięte DNA w regionie E3 jest nieistotne dla rozmnażania wirusa, a jego usunięcie zwiększa zdolność wbudowywania rekombinantu wirusa dla obcych DNA przez równoważne ilości (1.9 kb) (Graham and Prevec, 1991).

186 073

Dla zaprezentowania specyficzności AFP promotor/wzmacniacz, wirus AANCAT został także skonstruowany gdzie marker genu acetylotransferazy chloramfenikonowej (CAT) jest pod kontrolą AFP wzmacniacz/promotor. W konstrukcie wirusa ACNTK, sekwencja liderowa została umieszczona pomiędzy CMV promotor/wzmacniacz i genem TK. Donoszono, że potrójna sekwencja liderowa wzmacnia translację powiązanych genów. Substytucja El osłabia zdolność zrekombinowanych wirusów do replikacji, ogranicza ich rozmnażanie do komórek 293, który dostarcza produkty genu Ad5 El w układzie trans (Graham et al., 1977).

Wektor adenowirusa ACNTK: plazmid pMLBKTK w E.Coli HB101 (z ATCC #39369) był użyty jako źródło kinazy tymidynowej (TK) z wirusa opryszczki. TK był usunięty z tego plazmidu jako fragment genu 1.7 kb przez trawienie z enzymami Bgl II i Pvu II i subklonowane do Bam HI, EcoR V miejsc restrykcyjnych plazmidu pSP72 (Promega) używając standardowych technik klonowania (Sambrook et al., 1989). Wprowadzone TK było następnie wyizolowane jako fragment 1.7 kb z tego wektora przez trawienie z Xba I i Bgl II i sklonowane do Xba I, BamHI trawionego plazmidu pACN (Wills et al., 1994). 20 mikrogramów tego plazmidu oznaczonego pACNTK była wydłużana liniowo z Eco RI i kotransfektowana do komórek 293 (ATCC CRL 1573) z 5 mikrog Cla I trawionych ACBGL (Wills et al.,1994 supra) z zastosowaniem zestawu transfekcyjnego CaP04 (Stratagene, San Diego, Califomia). Łysinki wirusowe były izolowane i rekombinanty, oznaczone ACNTK, były identyfikowane i analizowane przez restrykcyjne trawienie izolowanego DNA z Xho I i BsiWI. Pozytywne rekombinanty były dalej oczyszczane przez rozpuszczenie, rozwiniecie i określenie aktywności standardowymi metodami (Graham and Prevec, 1991).

Wektor adenowirusa AANTK: promotor alfa-fetoproteiny (AFP-P) i wzmacniacz (AFP-E) były klonowane z ludzkiego genomu DNA (Clontech) używając wzmocnienia PCR z primerami zawierającymi miejsca restrykcyjne na ich końcach. Primery używane do izolowania 210 bp AFP-E zawierały Nhe I miejsca restrykcyjne na primerze 5’ i Xba I, Xho I, Kpn I połączony z primerem 3’. Sekwencja primeru 5’ była 5’-CGC GCT AGC TCT GCC CCA AAG AGC T-3. Sekwencja primeru 5’ była 5’-CGC GGT ACC CTC GAG TCT AGA TAT TGC CAG TGG TGG AAG-3’. Primery używane do izolowania fragmentu 1763 bp AFE zawiera Not I miejsca restrykcyjne na primerze 5’ i XBAI położenie na primerze 3’. Sekwencja primeru 5’ była 5’ -CGT GCG GCC GCT GGA GGA CTT TGA GGA TGT CTG TC-3’. Sekwencja primeru 3’ była: 5’-CGC TCT AGA GAG ACC AGT TAG GAA GTT TTC GCA-3’. Dla reakcji amplifikacji PCR, DNA było denaturowane w 97° przez 7 minut, poprzedzone 5 cyklami wzmacniania w 97°, 1 minuta, 53°, 1 minuta, 12°, 2 minuty, i wreszcie 72°, 10 minut dla rozwinięcia. Amplifikowany AFE był trawiony z Not I i Xba I i wbudowany do miejsc wektora plazmidu Not I, Xba I (pA/ITRŻB) zawierających adenowirus typ 5 sekwencje 1- 350 i 3330-5790 oddzielone przez polilinker zawierający miejsca Not I, Xho I, Xba I, Hind III, Kpn I, Bam HI, Nco I, Sma I, i Bgl II. Amplifikacja AFP-E była trawiona z Nhe I i Kpn I i wbudowana w AFP-E zawierająca konstrukt opisany powyżej, który był trawiony z Xba I i Kpn I. Ten nowy konstrukt został następnie trawiony z Xba I i NgoMI by usunąć sekwencję adenowirusa 3330-5780, które były następnie zastępowane Xba I, NgoMI przez restrykcyjny fragment plazmidu pACN zawierający nukleotydy 4021-10457 adenowirusa typu 2 do skonstruowania plazmidu pAAN zawierającego oba wzmacniacz alfa-fetoproteinę i promotor. Ten konstrukt został następnie trawiony z Eco RI i Xba I by wyizolować fragment 2.3 kb zawierający Ad5 inwertowane powtórzenie terminalne, AFP-E i AFP-P, które następnie były ligowane z fragmentem 8.55 kb Eco RI, Xba I trawiony opisany powyżej pACNTK by wytworzyć pAANTK, gdzie gen TK jest kierowany przez wzmacniacz alfa-fetoproteiny i promotor w podstawie adenowirusa. Plazmid ten jest następnie wydłużany liniowo z Eco RI i kotransfektowany z dużym fragmentem Cla I przyswajającym ALBGL jak wyżej i rekombinanty, oznaczone AANTK, były izolowane i oczyszczane jak zostało opisane powyżej.

186 073

Wektor adenowirusa AANCAT: gen acetylotransferazy chloramfenikolowej (CAT) był izolowany z pCAT-wektora podstawowego (Promega Corporation) przez trawienie Xba I, Bam HI. Ten fragment 1.64 kb był ligowany do Xba I, Barn HI trawiącego pAAN (opisany powyżej) do stworzenia pAANCAT. Plazmid ten został następnie wydłużony liniowo z Eco RI i kotransfektowany z dużym fragmentem Cla I trawiącym rA/C/beta-gal by stworzyć AANCAT.

Ekspresja genu reporterowego: ekspresja (3-galaktozydazy:

Komórki nałożono w ilości 1x10⁵ komórek na test w płytkach w 24 (pozycjach) testowych i spowodowano związanie przez noc (37°C, 7% CO₂). Całonocna infekcja ACbGl była dokonana przy wielokrotnej infekcji (MOI) 30. Po 24 godzinach komórki były utrwalone 3.7% Formaldehydem; PBS; i wybarwione z 1 mg/ml reagentem Xgal (USB). Dane były oceniane (+, ++, +++) przez procentowe oszacowanie pozytywnego wybawienia komórek w każdym MOI. [+ - 1- 33%, ++ = 33 - 67%, +++ = 67%].

Ekspresja genu reporterowego: ekspresja cat:

Dwa (2) x 10⁴ komórek (Hep G2, Hep 3B, HLF, Chang i MDA-MB468) było posianych na potrójnych 10 cm płytkach inkubowanych całą noc (37°C, 7% CO2). Każda płytka była zakażana AANCAT w MOI = 30 lub 100 lub nie zakażana i inkubowana przez 3 dni. Komórki były trypsynizowane i przemywane z PBS rozpuszczane w 100 μ1 0,25 M Tris pH 7,8. Próby były zamrożone i rozmrażane 3 krotnic i supematant był przeniesiony do nowych probówek i inkubowany 10 minut w 60°C. Próby były wirowane przez 5 minut w 4°C i oznaczano w supematantach stężenia białka używając testu Bradforda (Bio-Rad Protein Assay Kit). Próby były doprowadzone do jednakowej koncentracji białka do końcowej objętości 75 fil używając 0,25 M Tris, 25 (il 4 mM acetylo CoA i 1 fil ¹⁴C-Chloramfenikol i inkubowane przez noc w 37°C. Do każdej próbki dodano 500 f.1 octanu etylu i mieszano vortexem a następnie poprzez 5 minut wirowano w temperaturze pokojowej. Górna faza jest przeniesiona do nowej probówki i octan etylu jest odparowywany przez żwirowanie pod próżnią. Produkty reakcji są powtórnie rozpuszczone w 25 (j.1 octanu etylu i punktowo nakładane na płytkę chromatografii cienkowarstwowej (TLC), płytka następnie jest umiejscowiona w wewnątrz pola zrównoważonej komory TLC (95% chloroformu, 5% metanolu). Rozpuszczalnik migruje do szczytu płytki, płytka jest wysuszona i naświetlano film promieniowaniem X.

Proliferacja komórkowa: wbudowywanie -H-tymldyny.

5x103 komórek naniesiono na płytkę immunologiczną 96 pozycjach testowych i inkubowano całą noc (37°C, 7% CO?). Seryjnie rozcieńczone ACN, aCnTK lub AATK wirus w DMEM; 15% FBS; 1% glutamina była użyta do transfekcji komórek w wielokrotnej 30-krotnej infekcji 30 trwającej całą noc, po której komórki były dawkowane potrójnie z ganciklovirem (Cytovene) w logarytmicznym odstępie 0.001 i 100 mM (micro molar). IjaCi ³H-tymidyny (Amersham) było dodawane do każdego testu 12-18 godzin przed zbieranie 72 godziny po infekcji komórki były zbierane na filtrach z bibuły szklanej i znakowana 3H tymidyna była liczona używając płynnego scyntylatora (TopCount, Packard). Rezultaty są naniesione jako procentowa niekontrolowana kontrola proliferacji i zestawione jako skuteczna dawka (ED5₀±SD) dla 50 procent obniżenia w proliferacji powyżej średnich kontroli. Wartość ED5₀ była oceniana przez odpowiednie logistyczne równanie do dawki dającej odpowiedź.

Cytotoksyczność: uwalnianie LDH

Komórki (HLF, ludzkie HCC) były pokrywane, infekowane ACN lub ACNTK i traktowane gancyklowirem jak opisano dla testu proliferacji. 72 godziny po podaniu gancyklowiru, komórki były wirowane, supematant był usunięty. Poziomy dehydrogenazy laktonowej mierzono kolorymetrycznie (Promega, Cytotox 96™). Średnia (+/-S.D) uwolnionego LDH jest wykreślona względem M.O.I.

Terapia in vivo

Komórki ludzkiego nowotworu wątroby (Hep 3B) były wstrzykiwane podskórnie 10 samicom (10) athymic nu/nu myszy (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA). Każde zwierze otrzymywało w przybliżeniu 1x10⁷ komórek w lewy bok. Guzowi pozwolono rosnąć przez 27 dni

186 073 przed pogrupowaniem myszy wg. średniego rozmiaru guza. Myszy były traktowane wewnątrzguzowymi i wokół-guzowymi wstrzyknięciami ACNTK lub kontrolnym wirusem ACN (1x10⁹ iu w 100 μ1) co drugi dzień łącznie trzy dawki. Rozpoczynając 24 godzinny cykl po inicjującej dawce adenovirusa myszom dawkowano dootrzewnowo gancyklowir (Cytovene 100 mg/kg) dziennie, razem przez 10 dni. Myszy były kontrolowane pod kątem rozmiaru guza i ciężaru ciała dwa razy w tygodniu. Pomiary guza były robione w trzech wymiarach używając noniusza cyrkla i objętości były kalkulowane przy użyciu równania 4/3itr3, gdzie r jest 1/2 średniego rozmiaru guza.

Wyniki

Rekombinowane adenowirusy były użyte do infekcji trzech linii komórek HCC (HLF, Hep3B i Hep-G2). Jedna linia ludzkich komórek wątroby (Chang) i dwie linie komórek nowotworu piersi były użyte jako kontrole (MDAMB468 i BT549). Do pokazania specyficzności AFP promotor, był konstruowany wirus AANCAT. Ten wirus był użyty do infekcji komórek, że obie ekspresj onowały (Hep 3B, HepG2) lub nie ekspresj onowały (HLE, Chang, MDAMB468) HCC markera guza alfa-fetoproteiny (AFP). Jak pokazano na figurze 13, AANCAT kieruje ekspresją genu markera CAT tylko w tych komórkach HCC, które są zdolne do ekspresji AFP (fig. 13).

Skuteczność ACNTK i AANTK dla leczenia HCC była mierzona przez test wbudowania 3H-tymidyny do pomiaru efektu połączenia ekspresji HSV-TK, i traktowania podawanym gancyklowirem podczs proliferacji komórkowej. Linie komórek były infekowane obydwoma ACNTK lub AANTK lub dla kontroli wirusa ACN (Wills et al,. 1994 supra), która nie kieruje ekspresją HSV-TK, i leczona była wzrastającymi stężeniami gancyklowira. Efekt tego leczenia był mierzony jako funkcja wzrostu stężenia gancyklowira, do takiego stężenia gancyklowira które powodowało inhibicję 50% inkorporacji 3H-tymidyny (ED50). Dodatkowo, względny pomiar adenowirusa regulującego transfer genu i ekspresje każdej linii komórek był określony przez użycie kontrolnego wirusa, który określa ekspresję markeru genu p-galaktozydazy. Dane prezentowane na figurze 14 i tabeli I poniżej pokazują, że podawana kombinacja wirus ACNTK/gancyklowir była zdolna do zahamowania proliferacji komórkowej we wszystkich badanych liniach komórek w porównaniu z linią kontrolną adenowirusa ACN w kombinacji z gancykiowirem. W przeciwieństwie, wirusowy wektor AANTK był skuteczny tylko w tych liniach komórek HCC, w których wykazano ekspresję a-fetoproteiny. W dodatku kombinacja AANTK/GCV była bardziej efektywna, kiedy komórki były nakładane w dużej gęstości.

Tabela 1

Komórki linii	aFP	Ekspresja β-gal	ACN	EDjo ACNTK	AANTK
MDAMB468	-	+++	> 100	2	> 100
BT549	-	+++	> 100	<0.3	> 100
HLF	-	+++	> 100	0.8	> 100
CHANG	-	+++	> 100	22	>100
HEP-3B	-	+	80	8	8
HEP-2G niski	+	++	90	2	35
HEP-G2 wysoki	+	++	89	0.5	4

„Nagie” (nude) myszy zakażone nowotworem Hep3B (N=5/grupa) były leczone doguzowo i wokół-guzowo w równoważnych dawkach ACNTK lub ACN kontroli. Dwadzieścia cztery godziny po pierwszym dawkowaniu rekombinanta adenowirusa, rozpoczynano dzienne podawanie gancyklowira u wszystkich myszy. Pomiary guza u każdego zwierzęcia były mierzone dwa razy w tygodniu cyrklami, średnie rozmiary guza przedstawiono na fig. 16. Średni rozmiar guza w 58 dniu był mniejszy w leczeniu zwierząt ACNTK ale różnice nie były

186 073 wysoko znaczące (p < 0.09, nieparzysty t-test). Te dane utrzymują specyficzny efekt ACNTK na wzrost guza in vivo. Nie wykryto znaczących różnic statystycznych w średniej masie ciała pomiędzy grupami.

BIBLIOGRAFIA

AIELLO, L. et al. (1979) Virology 94:460-469.

AMERICAN CANCER SOCIETY. (1993) Cancer Facts and Figures.

AULITZKY et al. (1991) Eur. J. Cancer 27(4):462-467.

AUSTIN, E.A. and HUBER, B.E. (1993) Mol. Pharmaceutical 43:380-387.

BACCHETTI, S. AND GRAHAM, F. (1993) International Journal of Oncology 3:781-788. BAKER S.J., MARKOWITZ, S FEARON E.R., WILLSON, J.K.V.,

AND VOGELSTEIN, B. (1990) Science 249:912-915.

BARTEK, J., BARTKOVA, J., VOJTESEK, B„ STASKOVA, Z, LUKAS, J., REJTHAR,

A., KOVARIK, J., MIDGLEY, C.A., GANNON, J.V., AND LANE, D.P. (1991) Oncogene 6:1699-1703.

BERKNER, K.L. and SHARP (1985) Nucleic Acids Res 13:84115 857.

BOSHART, M. et al. (1985) Celi 41:521-530.

BRESSAC, B., GALVIN, K.M., LIANG, T.J., ISSELBACHER, K.J., WANDS, J.R.,

AND OZTURK, M. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1973-1977.

CARUSO M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:70247028.

CHALLBERG, M.D., KELLY, TJ. (1979) Biochemistry 76:655-659.

CHEN P.L., CHEN Y., BOOKSTEIN R., AND LEE W.H. (1990) 25 Science 250:1576-1580. CHEN, Y., CHEN, P.L., ARNAIZ, N., GOODRICH, D„ AND LEE,

W.H. (1991) Oncogene 6:1799-1805.

CHENG, JL, YEE, J.K., YEARGIN, J., FRIEDMANN, T„ AND HAAAS, M. (1992)

Cancer Research 52:222-226.

COLBY, W.W. AND SHENK, T. J. (1981) Yirology 39:977-980. CULVER ET AL.

(1991) P.N.A.S. (U.S.A.) 88:3155-3159. CULVER, K.W. et al. (1992) Science 256:1550-1552. DEMETRI et al. (1989) J. Clin. Oncol. 7(10): 1545-1553. DILLER, L., et al. (1990) Mol.

Cell Biology 10:5772-5781.

EL-DEIRY, W.S., et al. (1993) Cell 75:817-825.

EZZIDINE, Z.D. et al. (1991) The New Biologist 3:608-614.

FEINSTEIN, E„ GALE, R.P., REED, J., AND CANAANI, E. (1992) Oncogene 7:1853-1857. GHOSH-CHOUDHURY, G., RAJ-AHMAD, Y„ AND GRAHAM, F.L. (1987) EMBO Journal 6:1733-1739.

GOODING, L.R., AND WOLD, W.S.M. (1990) Crit. Rev. Immunol. 10:53-71.

GRAHAM F.L., AND VAN DER ERB AJ. (1973) Virology 52:456-467.

GRAHAM, F.L. AND PREVEC, L. (1992) Vaccines: New Approaches to Immunological Problems. R.W. Ellis (ed), Butterworth-Heinemann, Boston, pp. 363-390.

GRAHAM, F.L., SMILEY, J., RUSSELL, W.C. AND NAIRN, R. (1977) J. Gen. Virol. 36:59-74. GRAHAM F.L. AND PREVEC L. (1991) Manipulation of adenovirus vectors. In: Methods in Molecular Biology. Vol 5 .7: Gene Transfer and Expression Protocols. Murray E. J. (ed.) The Humana Press Inc., Clifton N.j., Vol 7:109-128.

HEUVEL, S.J.L , LAAR, T„ KAST, W.M, MELIEF, C.J.M., ZANTEMA, A., AND VAN DEREB, AJ. (1990) EMBO Journal 9:2621-2629.

HOCK, H., DORSCH, M, KUZENDORF, U„ QIN, Z, DIAMANTSTEIN, T„ AND BLANKENSTEIN, T. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:2774-2778.

HOLLSTEIN, M., SIDRANSKY, D., VOGELSTEIN, B., AND IS,C. (1991) Science 253:49-53.

186 073

HOROWITZ, M.S. (1991) Adenoviridae and their replication. In Fields Virology B.N. Fields, ed. (Raven Press, New York) pp. 1679-1721.

HORVATH, J., AND WEBER, J.M. (1988) J. Virol. 62:341-345.

HUANG et al. (1991) Nature 350:160-162.

HUBER, B.E. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8039-8043.

HUNTER, T. (1993) Cell 75:839-841.

JONES, N. AND SHENK, T. (1979) Cell 17:683-689.

KAMB et al. (1994) Science 264:436-440.

KEURBITZ, S.J., PLUNKETT, B.S., WALSH, W.V., AND KASTAN, M.B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 7491-7495.

KREIGLER, M. Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual. W.H. Freeman and Company, New York (1990).

LANDMANN et al. (1992) J. Interferon Res. 12(2): 103-111. LANE, D.P. (1992) Nature 358:15-16.

LANTZ et al. (1990) Cytokine 2(6):402-406.

LARRICK, J.W. and BURCK, K.L. Gen Therapy Application of Molecular Biology.

Elsevier Science Publishing Co., Inc. 10 New York, New York (1991).

LEE et al. (1987) Science 235:1394-1399.

LEMAISTRE et al. (1991) Lancet 337:1124-1125.

LEMARC P. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:6482-6486.

LEVINE, A.J. (1993) The Tumor Suppressor Genes. Annu. Rev. Biochem. (1993) 62:623-651. LOWE S.W., SCHMITT, E.M., SMITH, S.W., OSBORNE, B.A., AND JACKS, J. (1993) Nature 362:847-852.

LOWE, S.W., RULEY, H.E., JACKS, T„ AND HOUSMAN, D.E.

(1993) Cell 74:957-967.

MARTIN (1975) In: Remington’s Pharm. Sei.. 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton).

MERCER, W.E., et: al. (1990) Ptoc. Natl. Acad. Sei. USA 87:6166-6170.

NAKABAYASHI, H. et: al. (1989) The Journal of Biological Chemistry 264:266-271. PALMER, T.D., ROSMAN, G.J., OSBORNE, W.R., AND MELLER, A.D. (1991) Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 88:1330-1334.

RAO, L., DEBBAS, M., SABBATINI, P., HOCKENBERY, D., KORSMEYER, S., AND WHITE, E. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:7742-7746.

RAVOET C. et al. (1993) Journal of Surgical oncology Supplement 3:104-111.

RICH, D.P., et al. (1993) Human Gene Therapy 4:460-476.

ROSENFELD, M. A, et al. (1992) Cell 68:143-155.

SAMBROOK J., FRITSCH E.F., AND MANIATIS T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

SARNOW, P., HO, Y.S., WILLIAMS, J., AND LEVINE, A.J. (1982) Cell 28:387-394. SHAW, P., BOVEY, R., TARDY, S , SAHLI, R., SORDAT, B„ AND COSTA, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4495-4499.

SIEGFRIED, W. (1993) Exp. Clin. Endocrinol. 101:7-11.

SORSCHER, EJ. et al. (1994) Gene Therapy 1:233-238.

SPECTOR, D.J. (1983) Virology 130:533-538.

STEWART, P.L. et al. (1993) EMBO Journal 12:2589-2599.

STRAUS. S.E. (1984) Adenovirus infections in humans. In: The Adenoviruses - Ginsberg HS, ed. New York: Plenum Press, 451-496.

SUPERSAXO et al. (1988) Pharm. Res. 5(8) :472-476.

TAKARASHI, T., et al. (1989) Science 246: 491-494.

TAKAHASHI, T., et al.’(1992) Cancer Research 52:2340-2343.

THIMMAPPAYA, B. et al. (1982) Cell 31:543-551.

WANG, A.M., DOYLE, M.V., AND MARK, D.F. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:9717-9721,

186 073

WATANABLE, K. et: al. (1987) The Journal of Biolog^al Chemistry 262:4812-4818. WHITE, E., et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:2570-2580.

WILLS, K.N. et al. (1994) Hum. Gen. Ther. 5:1079-1088.

YONISH-ROUACH, E., et al. (1991) Nature 352:345-347.

186 073

NgoMI

a

LD

ΣΕ

Q

O

O ki o

E σ

o σ

CD

186 073

e\J Μ O 'T OJ ω ττ o

CO in

3:

o o

oo m

o o

ou-i

O o

oo o

o

Cr m

O

O oo o

o.

o m

ΡΊ /

/ /

/ /

/ /

/ /

/ /

/ /

/ /

/ /

/ /

/ /

/ /

/ /

/ /

/ /

/

7= /

/ /

/ /

/ /

CO

LII

Wycięte Ad5 pary zasad 357 do 4020 . _D

Wstawka MPL/p53 cDNA riU. Id

186 073

Met 1

Pro

Pro

Lys

Thr 5

Pro

Arg

Lys

Thr

Ala 10

Ala

Thr

Ala

Ala

Ala 15

Ala

Ala

Ala

Glu

Pro 20

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro 25

Pro

Pro

Pro

Pro

Glu 30

Glu

Asp

Pro

Glu

Gln 35

Asp

Ser

Gly

Pro

Glu 40

Asp

Leu

Pro

Leu

val 45

Arg

Leu

Glu

Phe

Glu 50

Glu

Thr

Glu

Glu

Pro 55

Asp

Phe

Thr

Ala

Leu 60

cys

Gln

Lys

Leu

Lyg 65

Ile

Pro

Asp

His

Val 70

Arg

Glu

Arg

Ala

Trp 75

Leu

Thr

Trp

GlU

Lye 80

Val

Ser

ser

Val

Asp 85

Gly

Val

Leu

Gly

Gly 90

Tyr

Ile

Gln

Lys

Lys 95

Lye

Glu

Leu

Trp

Gly 100

Ile

Cys

Ile

Phe

Ile 105

Ala

Ala

Val

Asp

Leu 110

A3p

Glu

Met

Ser

Phe 115

Thr

Phe

Thr

Glu

Leu 120

Gln

Lys

Asn

Ile

Glu 125

Ile

Ser

Val

His

Lys 130

Phe

Phe

Asn

Leu

Leu 135

Lys

Glu

Ile

Asp

Thr 140

ser

Thr

Lys

Val

Aap 145

Asn

Ala

Met

ser

Arg 150

Leu

Leu

Lys

Lys

Tyr 155

Asp

Val

Leu

Phe

Ala 160

Leu

Phe

ser

Lys

Leu 165

Glu

Arg

Thr

cys

Glu 170

Leu

Ile

Tyr

Leu

Thr 175

Gln

Pro

Ser

Ser

Ser 180

Ile

Ser

Thr

Glu

Ile 185

Asn

ser

Ala

Leu

Val 190

Leu

Ly3

Val

Ser

Trp 195

Ile

Thr

Phe

Leu

Leu 200

Ala

Lys

Gly

Glu

val 205

Leu

Gln

Met

Glu

Asp 210

Asp

Leu

Val

Ile

ser 215

Phe

Gln

Leu

Met

Leu 220

cys

val

Leu

Asp

Tyr 225

Phe

ile

Lys

Leu

Ser 230

Pro

Pro

Met

Leu

Leu 235

Lys

Glu

Pro

Tyr

Lys 240

Thr

Ala

Val

Ile

Pro 245

Ile

Asn

Gly

Ser

Pro 250

Arg

Thr

Pro

Arg

Arg 255

Gly

FIG. 2A

186 073

Gln

Asn Arg ser 260

Ala

Arg

Ile Ala

Ly3 Gln Leu Glu Asn Asp Thr Arg

265

270

Ile

Ile

Glu

val

Leu

cys

Lys

Glu

His

Glu

cys

Asn

ile

Asp

Glu

Val

275

280

285

Lys

Asn

Val

Tyr

Phe

Lys

Asn

Phe

Ile

Pro

Phe

Met

Asn

ser

Leu

Gly

290

295

300

Leu

val

Thr

Ser

Asn

Gly

Leu

Pro

Glu

Val

Glu

Asn

Leu

ser

Lys

Arg

305

310

315

320

Tyr

Glu

Glu

Ile

Tyr

Leu

Lys

Asn

Lys

Asp

Leu

Asp

Ala

Arg

Leu

Phe

325

330

335

Leu

Asp

His

Asp

Lys

Thr

Leu

Gln

Thr

Asp

Ser

Ile

Asp

ser

Phe

Glu

340

345

350

Thr

Gln

Arg

Thr

Pro

Arg

Lys

Ser

Asn

Leu

Asp

Glu

Glu

Val

Asn

Val

355

360

365

Ile

Pro

pro

His

Thr

Pro

val

Arg

Thr

Val

Met

Asn

Thr

ile

Gln

Gln

370

375

380

Leu

Met

Met

Ile

Leu

Asn

Ser

Ala

ser

Asp

Gln

pro

ser

GlU

Asn

Leu

385

390

395

400

Ile

ser

Tyr

Phe

Asn

Asn

cys

Thr

val

Asn

Pro

Lys

Glu

Ser

Ile

Leu

405

410

415

Lys

Arg

val

Lye

Asp

ile

Gly

Tyr

ile

Phe

Lys

Glu

Lys

Phe

Ala

Lys

420

425

430

Ala

Val

Gly

Gln

Gly

cys

Val

GlU

Ile

Gly

Ser

Gln

Arg

Tyr

Lys

Leu

435

440

445

Gly

Val

Arg

Leu

Tyr

Tyr

Arg

Val

Met

Glu

ser

Met

Leu

Lys

ser

Glu

450

455

460

Glu

GlU

Arg

Leu

ser

Ile

Gln

Asn

Phe

Ser

Lys

Leu

Leu

Asn

Asp

Asn

465

470

475

480

Ile

Phe

His

Met

ser

Leu

Leu

Ala

cys

Ala

Leu

Glu

Val

Val

Met

Ala

485

490

495

Thr

Tyr

ser

Arg

ser

Thr

Ser

Gln

Asn

Leu

Asp

ser

Gly

Thr

Asp

Leu

500

505

510

FIG. 2B

186 073

ser

Phe Pro 515

Trp

Ile Leu Asn Val Leu Asn 520

Leu Lys

Ala Phe 525

Asp Phe

Tyr

Ly3

val

Ile

Glu

ser

Phe

Ile

Lys

Ala

Glu

Gly

Asn

Leu

Thr

Arg

530

535

540

Glu

Met

Ile

Lys

His

Leu

Glu

Arg

cys

Glu

His

Arg

Ile

Met

Glu

ser

545

550

555

560

Leu

Ala

Trp

Leu

Ser

Asp

Ser

Pro

Leu

Phe

Asp

Leu

Ile

Lys

Gln

Ser

565

570

575

Lys

Asp

Arg

Glu

Gly

Pro

Thr

Asp

His

Leu

Glu

ser

Ala

cys

Pro

Leu

580

585

590

Asn

Leu

Pro

Leu

Gln

Asn

Asn

His

Thr

Ala

Ala

ASO

Met

Tyr

Leu

Ser

595

600

605

Pro

Val

Arg

Ser

Pro

Lys

Lys

Lys

Gly

Ser

Thr

Thr

Arg

val

Asn

ser

610

615

620

Thr

Ala

Asn

Ala

Glu

Thr

Gln

Ala

Thr

ser

Ala

Phe

Gln

Thr

Gln

Lys

625

630

635

640

Pro

Leu

Lys

ser

Thr

Ser

Leu

Ser

Leu

Phe

Tyr

Lys

Lys

val

Tyr

Arg

645

650

655

Leu

Ala

Tyr

Leu

Arg

Leu

Asn

Thr

Leu

cys

Glu

Arg

Leu

Leu

Ser

Glu

660

665

670

His

Pro

Glu

Leu

Glu

His

ile

Ile

Trp

Thr

Leu

Phe

Gln

His

Thr

Leu

675

680

685

Gln

Asn

Glu

Tyr

Glu

Leu

Met

Arg

Asp

Arg

His

Leu

Asp

Gln

Ile

Met

690

695

700

Met

Cys

Ser

Met

Tyr

Gly

Ile

cys

Lys

val

Lys

Asn

Ile

Asp

Leu

Lys

705

710

715

720

Phe

Lys

Ile

Ile

val

Thr

Ala

Tyr

Lys

Asp

Leu

Pro

His

Ala

val

Gln

725

730

735

GlU

Thr

Phe

Ly3

Arg

Val

Leu

Ile

Lys

Glu

Glu

Glu

Tyr

Asp

ser

Ile

740

745

750

Ile

i Val

Phe

Tyr

Asn

ser

Val

Phe

Met

Gln

Arg

Leu

Lys

Thr

Asn

Ile

755

760

765

FIG. 2C

186 073

Leu

Gln 770

Tyr

Ala

ser

Thr

Arg 775

Pro

Pro

Thr

Leu

Ser 780

Pro

Ile

Pro

His

Ile 785

Pro

Arg

ser

Pro

Tyr 790

Lys

Phe

Pro

ser

ser 795

Pro

Leu

Arg

Ile

Pro 800

Gly

Gly

Asn

Ile

Tyr 805

Ile

Ser

Pro

Leu

Lys 810

ser

Pro

Tyr

Lys

Ile 815

Ser

Glu

Gly

Leu

Pro 820

Thr

Pro

Thr

Lys

Met 825

Thr

Pro

Arg

ser

Arg 830

Ile

Leu

Val

ser

ile 835

Gly

Glu

ser

Phe

Gly 840

Thr

ser

Glu

Lys

Phe 845

Gln

Lys

Ile

Asn

Gln 850

Met

Val

Cys

Asn

ser 855

Asp

Arg

Val

Leu

Lys 860

Arg

ser

Ala

Glu

Gly 865

ser

Asn

Pro

Pro

Lys 870

Pro

Leu

Lys

Lys

Leu 875

Arg

Phe

Asp

Ile

GlU 880

Gly

ser

Asp

Glu

Ala 885

Asp

Gly

ser

Lys

His 890

Leu

Pro

Gly

GlU

Ser 895

Lys

Phe

Gln

Gln

Lys 900

Leu

Ala

Glu

Met

Thr 905

ser

Thr

Arg

Thr

Arg 910

Met

Gln

Lys

Gln

Lys

Met

Asn

Asp

Ser

Met

Asp

Thr

ser

Asn

Lys

Glu

Glu

Lys

915 920 925

FIG. 2D

186 073

TTCCGGTTTT TCTCAGGGGA CGTTGAAATT ATTTTTGTAA CGGGAGTCGG GAGAGGACGG 60

GGCGTGCCCC GCGTGCGCGC GCGTCGTCCT CCCCGGCGCT CCTCCACAGC TCGCTGGCTC 120

CCGCCGCGGA AAGGCGTC ATG	CCG Pro	CCC AAA ACC	CCC Pro	CGA AAA	ACG GCC Thr Ala 10	GCC Ala	171
	Met 1	Pro	Lys	Thr 5	Arg	Lys
ACC GCC	GCC GCT GCC GCC	GCG	GAA	CCC	CCG	GCA	CCG	CCG	CCG CCG	CCC	219
Thr Ala	Ala Ala Ala Ala 15	Ala	Glu	Pro 20	Pro	Ala	Pro	Pro	Pro Pro 25	Pro
CCT CCT	GAG GAG GAC CCA	GAG	CAG	GAC	AGC	GGC	CCG	GAG	GAC CTG	CCT	267
Pro Pro	Glu Glu Asp Pro 30	GlU	Gln 35	Asp	Ser	Gly	Pro	Glu 40	Asp Leu	Pro
CTC GTC	AGG CTT GAG TTT	GAA	GAA	ACA	GAA	GAA	CCT	GAT	TTT ACT	GCA	315
Leu Val 45	Arg Leu Glu Phe	Glu 50	Glu	Thr	Glu	Glu	Pro 55	Asp	Phe Thr	Ala
TTA TGT	CAG AAA TTA AAG	ATA	CCA	GAT	CAT	GTC	AGA	GAG	AGA GCT	TGG	363
Leu Cys 60	Gln Ly3 Leu Lys 65	Ile	Pro	Asp	His	Val 70	Arg	Glu	Arg Ala	Trp 75
TTA ACT	TGG GAG AAA GTT	TCA	TCT	GTG	GAT	GGA	GTA	TTG	GGA GGT	TAT	411
Leu Thr	Trp Glu Lys Val 80	Ser	Ser	Val	Asp 85	Gly	Val	Leu	Gly Gly 90	Tyr
ATT CAA	AAG AAA AAG GAA	CTG	TGG	GGA	ATC	TGT	ATC	TTT	ATT GCA	GCA	459
Ile Gln	Lys Lys Lys Glu 95	Leu	Trp	Gly 100	Ile	cys	Ile	Phe	Ile Ala 105	Ala
GTT GAC	CTA GAT GAG ATG	TCG	TTC	ACT	TTT	ACT	GAG	CTA	CAG AAA	AAC	507
Val Asp	Leu Asp Glu Met 110	ser	Phe 115	Thr	Phe	Thr	Glu	Leu 120	Gln Lys	Asn
ATA GAA	ATC AGT GTC CAT	AAA	TTC	TTT	AAC	TTA	CTA	AAA	GAA ATT	GAT	555
Ile Glu 125	Ile ser val His	Lys 130	Phe	Phe	Asn	Leu	Leu 135	Lya	Glu Ile	Asp
ACC AGT	ACC AAA GTT GAT	AAT	GCT	ATG	TCA	AGA	CTG	TTG	AAG AAG	TAT	603
Thr ser 140	Thr Lys val Asp 145	Asn	Ala	Met	Ser	Arg 150	Leu	Leu	Lys Lys	Tyr 155
GAT GTA	TTG TTT GCA CTC	TTC	AGC	AAA	TTG	GAA	AGG	ACA	TGT GAA	CTT	651
Asp Val	Leu Phe Ala Leu 160	Phe	ser	Lys	Leu 165	Glu	Arg	Thr	Cys Glu 170	Leu
ATA TAT	TTG ACA CAA CCC	AGC	AGT	TCG	ATA	TCT	ACT	GAA	ATA AAT	TCT	699
Ile Tyr	Leu Thr Gln Pro 175	Ser	Ser	Ser 180	Ile	Ser	Thr	Glu	Ile Asn 185	ser
GCA TTG	GTG CTA AAA GTT	TCT	TGG	ATC	ACA	TTT	TTA	TTA	GCT AAA	GGG	747
Ala Leu	Val Leu Lys Val 190	Ser	Trp 195	Ile	Thr	Phe	Leu	Leu 200	Ala Lys	Gly
GAA GTA	. TTA CAA ATG GAA	GAT	GAT	CTG	GTG	ATT	TCA	TTT	CAG TTA	ATG	795
Glu Val	Leu Gln Met Glu	Asp	Asp	Leu	Val	Ile	ser	Phe	Gln Leu	Met

205 210 215

FIG. 3A

186 073

CTA TGT GTC

Leu

GAC TAT

TTT ATT

AAA Lya

CTC TCA

CCT Pro

CCC ATG

TTG Leu

CTC Leu 235

843

Leu 220

cya

Val

Aap

Tyr 225

Phe

Ile

Leu

ser 230

Pro

Met

AAA

GAA

CCA

TAT

AAA

ACA

GCT

GTT

ATA

CCC

ATT

AAT

GGT

TCA

CCT

CGA

891

Lya

Glu

Pro

Tyr

Ly3 240

Thr

Ala

Val

Ile

Pro 245

Ile

Asn

Gly

ser

Pro 250

Arg

ACA

CCC

AGG

CGA

GGT

CAG

AAC

AGG

AGT

GCA

CGG

ATA

GCA

AAA

CAA

CTA

939

Thr

Pro

Arg

Ara 255

Gly

Gln

Aan

Arg

ser 260

Ala

Arg

Ile

Ala

Lys 265

Gln

Leu

GAA

AAT

GAT

ACA

AGA

ATT

ATT

GAA

GTT

CTC

TGT

AAA

GAA

CAT

GAA

TGT

987

Glu

Aan

Asp 270

Thr

Arg

Ile

Ile

GlU 275

Val

Leu

Cys

Lys

Glu 280

His

Glu

cys

AAT

ATA

GAT

GAG

GTG

AAA

AAT

GTT

TAT

TTC

AAA

AAT

TTT

ATA

CCT

TTT

1035

Asn

Ile 285

Aap

Glu

Val

Lya

Aan 290

Val

Tyr

Phe

Lys

Aan 295

Phe

Ile

Pro

Phe

ATG

AAT

TCT

CTT

GGA

CTT

GTA

ACA

TCT

AAT

GGA

CTT

CCA

GAG

GTT

GAA

1083

Met 300

Asn

Ser

Leu

Gly

Leu 305

Val

Thr

ser

Asn

Gly 310

Leu

Pro

Glu

Val

GlU 315

AAT

CTT

TCT

AAA

CGA

TAC

GAA

GAA

ATT

TAT

CTT

AAA

AAT

AAA

GAT

CTA

1131

Aan

Leu

ser

Lya

Arg 320

Tyr

Glu

Glu

Ile

Tyr 325

Leu

Lys

Asn

Lye

Asp 330

Leu

GAT

GCA

AGA

TTA

TTT

TTG

GAT

CAT

GAT

AAA

ACT

CTT

CAG

ACT

GAT

TCT

1179

Aap

Ala

Arg

Leu 335

Phe

Leu

Asp

His

Aap 340

Lys

Thr

Leu

Gln

Thr 345

Asp

ser

ATA

GAC

AGT

TTT

GAA

ACA

CAG

AGA

ACA

CCA

CGA

AAA

AGT

AAC

CTT

GAT

1227

Ile

Asp

Ser 350

Phe

Glu

Thr

Gln

Arg 355

Thr

Pro

Arg

Lys

Ser 360

Asn

Leu

A3D

GAA

GAG

GTG

AAT

GTA

ATT

CCT

CCA

CAC

ACT

CCA

GTT

AGG

ACT

GTT

ATG

1275

Glu

Glu 365

Val

Α3Π

Val

Ile

pro 370

Pro

His

Thr

Pro

Val 375

Arg

Thr

Val

Met

AAC

ACT

ATC

CAA

CAA

TTA

ATG

ATG

ATT

TTA

AAT

TCA

GCA

AGT

GAT

CAA

1323

Asn 380

Thr

Ile

Gln

Gln

Leu 385

Met

Met

Ile

Leu

Asn 390

Ser

Ala

Ser

Asp

Gln 395

CCT

TCA

GAA

AAT

CTG

ATT

TCC

TAT

TTT

AAC

AAC

TGC

ACA

GTG

AAT

CCA

1371

Pro

Ser

GlU

Asn

Leu 400

Ile

ser

Tyr

Phe

Asn 405

Asn

Cys

Thr

Val

Asn 410

Pro

AAA

GAA

AGT

ATA

CTG

AAA

AGA

GTG

AAG

GAT

ATA

GGA

TAC

ATC

TTT

AAA

1419

Lya

GlU

Ser

Ile 415

Leu

Lya

Arg

Val

Lya 420

Asp

Ile

Gly

Tyr

Ile 425

Phe

Lys

GAG

AAA

TTT

GCT

AAA

GCT

GTG

GGA

CAG

GGT

TGT

GTC

GAA

ATT

GGA

TCA

1467

Glu

Lya

Phe 430

Ala

Lya

Ala

val

Gly 435

Gln

Gly

cys

Val

Glu 440

Ile

Gly

ser

CAG

CGA

TAC

AAA

CTT

GGA

GTT

CGC

TTG

TAT

TAC

CGA

GTA

ATG

GAA

TCC

1515

Gln

Arg 445

Tyr

Lys

Leu

Gly

val 450

Arg

Leu

Tyr

Tyr

Arg 455

Val

Met

Glu

ser

FIG. 3B

186 073

ATG

CTT AAA

TCA

GAA

GAA

GAA

CGA

TTA

TCC

ATT

CAA

AAT

TTT

AGC

AAA

1563

Mat 460

Leu Lya

Ser

Glu

GlU 465

Glu

Arg

Leu

Ser

Ile 470

Gln

Asn

Phe

Ser

Lys 475

CTT

CTG AAT

GAC

AAC

ATT

TTT

CAT

ATG

TCT

TTA

TTG

GCG

TGC

GCT

CTT

1611

Leu

Leu Asn

ASO

Asn 480

Ile

Phe

His

Met

ser 485

Leu

Leu

Ala

cya

Ala 490

Leu

GAG

GTT GTA

ATG

GCC

ACA

TAT

AGC

AGA

AGT

ACA

TCT

CAG

AAT

CTT

GAT

1659

Glu

val Val

Met 495

Ala

Thr

Tyr

ser

Arg 500

Ser

Thr

ser

Gln

Aan 505

Leu

Asp

TCT

GGA ACA

GAT

TTG

TCT

TTC

CCA

TGG

ATT

CTG

AAT

GTG

CTT

AAT

TTA

1707

Ser

Gly Thr 510

Asp

Leu

Ser

Phe

Pro 515

Trp

Ile

Leu

Aan

val 520

Leu

Aan

Leu

AAA

GCC TTT

GAT

TTT

TAC

AAA

GTG

ATC

GAA

AGT

TTT

ATC

AAA

GCA

GAA

1755

Lys

Ala Phe 525

ASD

Phe

Tyr

Lya 530

Val

Ile

Glu

ser

Phe 535

Ile

Lya

Ala

Glu

GGC

AAC TTG

ACA

AGA

GAA

ATG

ATA

AAA

CAT

TTA

GAA

CGA

TGT

GAA

CAT

1803

Gly 540

Aan Leu

Thr

Arg

Glu 545

Met

Ile

Lya

Hia

Leu 550

Glu

Arg

cya

GlU

His 555

CGA

ATC ATG

GAA

TCC

CTT

GCA

TGG

CTC

TCA

GAT

TCA

CCT

TTA

TTT

GAT

1851

Arg

Ile Met

GlU

Ser 560

Leu

Ala

Trp

Leu

ser 565

Asp

Ser

Pro

Leu

Phe 570

ASp

CTT

ATT AAA

CAA

TCA

AAG

GAC

CGA

GAA

GGA

CCA

ACT

GAT

CAC

CTT

GAA

1899

Leu

Ile Lya

Gln 575

Ser

Lya

Aap

Arg

Glu 5B0

Gly

Pro

Thr

Aap

Hia 585

Leu

Glu

TCT

GCT TGT

CCT

CTT

AAT

CTT

CCT

CTC

CAG

AAT

AAT

CAC

ACT

GCA

GCA

1947

Ser

Ala cya 590

pro

Leu

Aan

Leu

Pro 595

Leu

Gln

Aan

Aan

Hia 600

Thr

Ala

Ala

GAT

ATG TAT

CTT

TCT

CCT

GTA

AGA

TCT

CCA

AAG

AAA

AAA

GGT

TCA

ACT

1995

Asp

Met Tyr 605

Leu

ser

pro

Val 610

Arg

ser

Pro

Lye

Lys 615

Lya

Gly

ser

Thr

ACG

CGT GTA

AAT

TCT

ACT

GCA

AAT

GCA

GAG

ACA

CAA

GCA

ACC

TCA

GCC

2043

Thr 620

Arg val

Asn

ser

Thr 625

Ala

Aan

Ala

GlU

Thr 630

Gln

Ala

Thr

ser

Ala 635

TTC

CAG ACC

CAG

AAG

CCA

TTG

AAA

TCT

ACC

TCT

CTT

TCA

CTG

TTT

TAT

2091

Phe

Gln Thr

Gln

Lys 640

Pro

Leu

Lya

ser

Thr 645

ser

Leu

Ser

Leu

Phe 650

Tyr

AAA

AAA GTG

TAT

CGG

CTA

GCC

TAT

CTC

CGG

CTA

AAT

ACA

CTT

TGT

GAA

2139

Lya

Lya Val

Tyr 655

Arg

Leu

Ala

Tyr

Leu 660

Arg

Leu

Aan

Thr

Leu 665

cya

Glu

CGC

CTT CTG

TCT

GAG

CAC

CCA

GAA

TTA

GAA

CAT

ATC

ATC

TGG

ACC

CTT

2187

Arg

Leu Leu 670

ser

Glu

Hia

Pro

Glu 675

Leu

Glu

His

Ile

Ile 680

Trp

Thr

Leu

TTC

: CAG CAC

ACC

CTG

CAG

AAT

GAG

TAT

GAA

CTC

ATG

AGA

GAC

AGG

CAT

2235

Phe

i Gln Hia 605

Thr

Leu

Gln

Aan 690

Glu

Tyr

Glu

Leu

Met 695

Arg

Aap

Arg

His

FIG. 3C

186 073

TTG GAC Leu Asp 700

CAA Gln

ATT ATG ATG

TGT cys

TCC ATG

TAT Tyr

GGC Gly 710

ATA Ile

TGC AAA GTG AAG

2283

Ile

Met

Met 705

Ser

Met

Cys

Lys

Val

Lys 715

AAT

ATA

GAC

CTT

AAA

TTC

AAA

ATC

ATT

GTA

ACA

GCA

TAC

AAG

GAT

CTT

2331

Asn

Ile

Asp

Leu

Lys

Phe

Lys

Ile

Ile

Val

Thr

Ala

Tyr

Lys

Asp

Leu

720

725

730

CCT

CAT

GCT

GTT

CAG

GAG

ACA

TTC

AAA

CGT

GTT

TTG

ATC

AAA

GAA

GAG

2379

Pro

His

Ala

Val

Gln

Glu

Thr

Phe

Lys

Arg

val

Leu

Ile

Lys

Glu

Glu

735

740

745

GAG

TAT

GAT

TCT

ATT

ATA

GTA

TTC

TAT

AAC

TCG

GTC

TTC

ATG

CAG

AGA

2427

Glu

Tyr

Asp

Ser

Ile

Ile

Val

Phe

Tyr

Asn

ser

Val

Phe

Met

Gln

Arg

750

755

760

CTG

AAA

ACA

AAT

ATT

TTG

CAG

TAT

GCT

TCC

ACC

AGG

CCC

CCT

ACC

TTG

2475

Leu

Lys

Thr

Asn

Ile

Leu

Gln

Tyr

Ala

Ser

Thr

Arg

Pro

Pro

Thr

Leu

765

770

775

TCA

CCA

ATA

CCT

CAC

ATT

CCT

CGA

AGC

CCT

TAC

AAG

TTT

CCT

AGT

TCA

2523

Ser

pro

Ile

Pro

Hi3

Ile

Pro

Arg

ser

Pro

Tyr

Lys

Phe

Pro

Ser

ser

780

785

790

795

CCC

TTA

CGG

ATT

CCT

GGA

GGG

AAC

ATC

TAT

ATT

TCA

CCC

CTG

AAG

AGT

2571

Pro

Leu

Arg

Ile

Pro

Gly

Gly

Asn

Ile

Tyr

Ile

Ser

pro

Leu

Lys

Ser

800

805

810

CCA

TAT

AAA

ATT

TCA

GAA

GGT

CTG

CCA

ACA

CCA

ACA

AAA

ATG

ACT

CCA

2619

Pro

Tyr

Lys

Ile

ser

Glu

Gly

Leu

Pro

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Thr

Pro

815

820

825

AGA

TCA

AGA

ATC

TTA

GTA

TCA

ATT

GGT

GAA

TCA

TTC

GGG

ACT

TCT

GAG

2667

Arg

ser

Arg

Ile

Leu

Val

Ser

Ile

Gly

Glu

ser

Phe

Gly

Thr

Ser

Glu

830

835

840

AAG

TTC

CAG

AAA

ATA

AAT

CAG

ATG

GTA

TGT

AAC

AGC

GAC

CGT

GTG

CTC

2715

Lya

phe

Gln

Lys

Ile

Asn

Gln

Met

val

cys

Asn

ser

Asp

Arg

Val

Leu

845

850

855

AAA

AGA

AGT

GCT

GAA

GGA

AGC

AAC

CCT

CCT

AAA

CCA

CTG

AAA

AAA

CTA

2763

Lys

Arg

Ser

Ala

GlU

Gly

Ser

Asn

Pro

Pro

Lys

Pro

Leu

Lys

Lys

Leu

860

865

870

875

CGC

TTT

GAT

ATT

GAA

GGA

TCA

GAT

GAA

GCA

GAT

GGA

AGT

AAA

CAT

CTC

2811

Arg

Phe

Asp

Ile

Glu

Gly

Ser

Asp

Glu

Ala

Asp

Gly

ser

Lya

His

Leu

880

885

890

CCA

GGA

GAG

TCC

AAA

TTT

CAG

CAG

AAA

CTG

GCA

GAA

ATG

ACT

TCT

ACT

2859

Pro

Gly

Glu

ser

Lys

Phe

Gln

Gln

Lys

Leu

Ala

Glu

Met

Thr

Ser

Thr

895

900

905

CGA

ACA

CGA

ATG

CAA

AAG

CAG

AAA

ATG

AAT

GAT

AGC

ATG

GAT

ACC

TCA

2907

Arg

Thr

Arg

Met

Gln

Lys

Gln

Lys

Met

Asn

Asp

Ser

Met

Asp

Thr

ser

910

915

920

AAC AAG GAA GAG AAA TGAGGATCTC AGGACCTTGG TGGACACTGT GTACACCTCT 2962 Asn Ly9 Glu Glu Lys

925

GGATTCATTG TCTCTCACAG ATGTGACTGA TAT 2995

FIG. 3D

186 073

Główna opóźniona transkryocja

Ad 5

CMV

MLP

FIG. 4

186 073 rAd/MLP/p53 rAd/CMV/p53 g p^- I j i

FIG. 5A rAd/MLP/p53 rAd/CMV/p53

FIG. 5B

186 073

FIG. 6A

FIG. 6B

FIG. 6C

186 073 % średniej kontroli % średniej kontroli % średniej kontroli

FIG. 7B

FIG. 7A

186 073

FIG. 7E

186 073

186 073

FIG. 8

186 073

Dzień 2

Dzień 7

2 3B 4 5 6 7 8 9 I 10

P53 Primery Aktyna

FIG. 9

FIG. 1OA

Dni po zaszczepieniu

FIG. 10B

186 073

Xba

Bgl ll/Bam Hl Xba

I pSP72-TK lpSP72-TK IPvu ll/Eco RV

Bgl II

Ligacja

FIG. 11A

Xba

Trawienie

Bgl II

186 073

186 073

FIG. 11C

186 073

Główna późna transkrypcja

El

E3 Deleflon ^ΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖ^ΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΖΓΣΥΖΖΖΖΖΖΖΖΔ Ad5

E2

E4

Ad5 1-4100 v rm

Ela

Elb ' ........► ------Wyłączenie E1a,E1 b and plX plX

ITR Promotor ^ZZZZZZ~~zzz

HSV-1 Tbymidlne Klnase

ACNTK

CMV

TPL

rm	Promotor	HSV-1 Thymfdlne Klnase
ΓΖ77//Γ'		. u A A NTK
	AFP
ITR	Promotor	CAT
ΪΖΖΖΖΖΣΖΣ.		AANCAT
	AFP	---;>

FIG. 12

186 073

100 Un 30 100 Un 30 100 Un :MOI

186 073 % średniej kontroli średniej kontroli

CGCV)

FIG. 14A

FIG. 14B

186 073

Absorbancja przy 490 mm

FIG. 15

186 073

FIG. 16A

Wielkość guza (mni

O IO 20 30 40 50 60

Dni po zaszczepieniu

FIG. 16B

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (26)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Preparat farmaceutyczny, zwłaszcza do terapii genowej, zasadniczo zawierający co najmniej jeden farmaceutycznie akceptowalny nośnik oraz zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny, który z kolei zasadniczo zawiera wstawkę egzogennego DNA z genem kodującym obce białko oraz adenowirus DNA z delecją wszystkich kodujących sekwencji Ela, Elb i białka IX, a także z najmniej częściową E3.
2. 2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że delecję sekwencji genowej białka Di stanowi przedział od około 3500 do około 4000 par zasad z 5’ wirusowego końca.
3. 3. Preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że delecja obejmuje także nieistotną sekwencję DNA we wczesnych adenowirusowych regionach 3 i/lub 4.
4. 4. Preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że delecja obejmuje także sekwencję DNA określonąjako adenowirus Ela i Elb.
5. 5. Preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że delecja obejmuje także wczesny region 3 i/lub 4 sekwencji DNA określonej jako adenowirus Ela i Elb.
6. 6. Preparat według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że delecja obejmuje także nie więcej niż czterdzieści nukleotydów, zlokalizowanych w pozycji 3’ względem Ela i Elb oraz białko IX i obcą cząsteczkę DNA, kodującą sygnał poliadenylacji.
7. 7. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny jest pozbawiony miejsca poliadenylacji białka DC.
8. 8. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że adenowirus DNA jest adenowirusem z grupy C, wybranym ze serotypu 12,5 lub 6.
9. 9. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że wstawka egzogennego DNA ma do

   2,6 kilozasad (KB).
10. 10. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że wstawka egzogennego DNA ma do 4,5 kilozasad (KB).
11. 11. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że obce białko jest białkiem funkcjonalnym lub jego biologicznie aktywnym fragmentem.
12. 12. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że obce białko jest białkiem supresora nowotworu lub jego biologicznie aktywnym fragmentem.
13. 13. Preparat według zastrz. 12, znamienny tym, że białkiem supresora nowotworu jest p53.
14. 14. Preparat według zastrz. 12, znamienny tym, że białkiem supresora nowotworu jest RB56.
15. 15. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że obce białko jest białkiem samobójczym lub jego funkcjonalnym równoważnikiem.
16. 16. Preparat według zastrz. 1 albo 15, znamienny tym, że zawiera dodatkowo metabolit kinazy tymidynowej lub jej funkcjonalny równoważnik.
17. 17. Preparat według zastrz. 16, znamienny tym, że metabolitkinazy tymidynowej stanowi ganciclovir lub 6-metoksypuryna arabinukleozydu lub ich funkcjonalny równoważnik.
18. 18. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że gen kodujące obce białko jest poddany ekspresji pod kontrolą cytomegalowirusowego promotora CMV.
19. 19. Preparat według zastrz. 18, znamienny tym, że promotor CMV jest najbliższym wczesnym promotorem CMV.
20. 20. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że gen kodujące obce białko jest poddany ekspresji pod kontrolą adenowirusowego promotora.
21. 21 Preparat według zastrz. 20, znamienny tym, że adenowirusowy promotor jest głównym późnym promotorem adenowirusa typu 2.

    186 073
22. 22. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że egzogenne DNA stanowi ponadto miejsca poliadenylacji.
23. 23. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny stanowi A/C/N/53.
24. 24. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że zrekombinowany adenowirusowy wektor ekspresyjny stanowi A/M/N/53.
25. 25. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto zawiera komórkę gospodarza transformowaną za pośrednictwem adenowirusowego wektora.
26. 26. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że farmaceutycznie akceptowalny nośnik zawiera fizjologicznie akceptowalny związek.