CZ296023B6

CZ296023B6 - Transgenní rostlina se změněnou aktivitou protoporfyrinogenové oxygenázy (protox), která je tolerantní k herbicidu, semena a potomstvo rostliny a způsob přípravy takové rostliny

Info

Publication number: CZ296023B6
Application number: CZ2002620A
Authority: CZ
Inventors: Eric Russel Ward; Sandra Volrath
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-08
Publication date: 2005-12-14
Also published as: US6177245B1; ES2239757T3; AU2453895A; US5767373A; SK161096A3; JP3673925B2; FI964958A7; HU9603175D0; DE69534247D1; MX237061B; PL317759A1; BR9508030A; JPH10502524A; CN1309184A; RO121886B1; SK284895B6; BG64394B1; CZ295884B6; US6288306B1; PL183091B1

Abstract

Řešení poskytuje rostlinné buňky a rostliny tolerantní k herbicidu. Rostliny podle vynálezu (např. kukuřice, pšenice, čirok, žito, oves, trávy a rýže) jsou transformovány prokaryontními sekvencemi kódujícími protox divokého typu nebo modifikovanými sekvencemi kódujícími protox, která je tolerantní k herbicidu. Dále se týká způsobu kontroly růstu nežádoucí vegetace a způsobu selekce transformovaných rostlin.

Description

Transgenní rostlina se změněnou aktivitou protoporfyrinogenové oxygenázy (protox), která je tolerantní k herbicidu, semena a potomstvo rostliny a způsob přípravy takové rostliny

Oblast techniky

Vynález se týká rostlinných buněk a rostlin tolerantních k herbicidu. Rostliny podle vynálezu (např. kukuřice, pšenice, čirok, žito, oves, trávy a rýže) jsou transformovány prokaryontními sekvencemi kódujícími protox divokého typu nebo modifikovanými sekvencemi kódujícími protox, která je tolerantní k herbicidu. Dále se vynález týká způsobu kontroly růstu nežádoucí vegetace a způsobu selekce transformovaných rostlin.

Dosavadní stav techniky

Biosyntetické cesty, které vedou k produkci chlorofylu a hernu mají řadu společných kroků. Chlorofyl je pigment, který dokáže využívat světlo a je přítomný ve všech zelených fytosyntetických organizmech. Hem je kofaktor hemoglobinu, cytochromů, P450 více funkčních oxygenáz, peroxidáz a kataláz (např. Lehninger, Biochemistry. Worth Publishers, New York (1975)) a je proto nezbytným komponentem pro všechny aerobní organizmy.

Poslední společný krok při biosyntéze chlorofylu a hernu je oxidace protoporfyrinogenu IX na protoporfyrin IX. Protoporfyrinogenová oxidáza (dále jen „protox“) je enzym, který katalyzuje tento poslední oxidační krok. (Matringe et al., Biochem. J. 260:231 (1989)).

Enzym protox byl purifíkovaný buď částečně nebo zcela z řady organizmů, k nimž patří kvasinka Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois and Labbe, in Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E. H. Dailey, ed. McGraw Hill: New York, pp.235-285 (1990)), zetioplastů ječmene (Jakobs and Jakobs, Biochem. J. 244:219 (1987)), a z myších jater (Dailey and Karr, Biochem. 26:2697 (1987)). Geny, které kódují protox, byly izolovány ze dvou prokaryotických organizmů Escherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) a Bacillus substilis (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Tyto geny nemají podobné sekvence; ani nezpůsobují, že z nich odvozené proteiny mají společné sekvence aminokyselin. Molekulová hmotnost proteinu z E. coli je přibližně 21 kDa a nachází se v buněčné membráně. Molekulová hmotnost proteinu z B. subtilis je 51 kDa, je rozpustný a má cytoplazmatickou aktivitu.

V současné době není dostupných mnoho informací o enzymu protox, které by umožňovaly použít známé metody pro izolaci protox genů z vyšších eukaryontních organizmů (tj. zvířata, rostliny a všechny další vícebuněčné jaderné organizmy, které se odlišují od nižších eukaryontních organizmů jako jsou kvasinky, jednobuněčné řasy, protozoa atd).

Rada standardních metod pro izolaci nových proteinů a genů je založena na domněnce, že jestliže nové proteiny a geny mají primární strukturu (tj. aminokyselinu a DNK sekvence) významně podobnou se strukturou známých proteinů a genů, pak jejich funkce jsou stejné. Takové standardní metody jsou hybridizace nukleových kyselin a amplifikace polymerázovou řetězovou reakcí za použití oligonukleotidových primerů, které odpovídají motivům konzervativní sekvence aminokyselin. Tyto metody se nezdály býti použitelné pro izolaci eukaryontních protox genů vzhledem současně dostupné strukturální informaci, protože neexistuje podstatná strukturální podobnost dokonce ani mezi známými prokaryotickými protox geny a proteiny.

Další způsob užívaný pro izolaci bíosyntetických genů z vyšších eukaryontů u jiných metabolických cest je komplementace mikrobiálních mutantů, které mají nedostatečnou aktivitu, o níž je zájem. Za tímto účelem, knihovna cDNK z vyšších eukaryontů je klonována do vektoru, který může přímo vyjádřit cDNK v mikrobiálním hostiteli. Vektor je pak transformován nebo jinak vnesen do mutantního mikrobu a je možno selektovat kolonie, které už nemají fenotyp mutanta.

-1 CZ 296023 B6

Tato strategie funguje pro izolaci genů z vyšších eukaryontů, které se vyskytují v několika metabolických cestách jako jsou biosyntéza histidinu (např. patent US 5290926 a WO 94/026909, Ward et al., zde jako reference), biosyntéza lyzinu (např. Frish et al., zde jako reference), biosyntéza lyzinu (např. Frish et al., Mol. Gen. Genet. 228: 287 (1991)), biosyntéza purinu (např. Aimi et al., J. Biol. Chem. 265:9011 (1990)) a biosyntéza tryptofanu (např. Niyogi et al., Plant Cell 5:1011 (1993)). Přestože mikrobiální mutanty, které mají nedostatečnou protox aktivitu, jsou dostupné (např. E. coli (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) a Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106.724 (1982)), použití tohoto postupu pro izolaci cDNK kódující eukaryontní protox enzymatickou aktivitu je založeno na dostupné informaci.

Je pro to několik důvodů. První důvod, eukaryontní protox sekvence cDNK nemusí být vyjádřeny v mutantním mikrobu v dostatečné míře, například proto, že je použit kodon, který neodpovídá preferencím mikrobiálního hostitele. Druhý důvod, primární translační produkt odvozený z eukaryontních kódujících sekvencí nemusí produkovat funkční polypeptid, protože například k vytvoření polypeptidu s příslušnou aktivitou je třeba posttranslační modifikace, jako je glykozylace, a ta v mikrobech neprobíhá. Třetí důvod, eukaryontní protein nemá v mikrobiálním hostiteli předpokládanou aktivní konformaci, například protein je směrován do organelového membránového systému, který mikrobiální hostitel nemá. Tato poslední možnost je zvláště pravděpodobná u protox enzymu rostlin, který se vyskytuje v organelách rostlinných buněk, jež nejsou přítomny v mikrobiálním hostiteli. Zejména u rostlinných protox enzymů, které jsou spojovány s obalem chloroplastu a thylakoidovými membránami (Matringe et al., J. Biol. Chem. 267: 4646 (1992)), u nichž se předpokládá, že membránových systémů dosahují na základě posttranslačního mechanizmu, který zahrnuje tranzitní sekvence N-konce a intrinsické vlastnosti zralého peptidu (např. Kohorn and Tobin, Plant Cell 1:159 (1989), Li et al., Plant Cell 3:709 (1991), Li et al., J. Biol. Chem. 267:18999 (1992)).

Protox enzym hraje roli u jistých lidských onemocnění. Pacienti trpící nemocí, s vrozenou autozomálně dominantní dědičností, porphyria variegata, která je charakterizována neuropsychiatrickými symptomy a kožními lézemi, mají sníženou protox aktivitu (Brenner and Bloomer, New Engl., J. Med. 302:765 (1980)). Vzhledem ktomu, že neexistuje dostatek informací o lidském protox enzymu a jeho genu, diagnostika a léčba této nemoci je velmi limitována.

Univerzální praxí se stalo použití herbicidů k ničení nežádoucí vegetace jako je plevel. Vynaložené náklady přesahují ročně částku jedné miliardy dolarů. Přesto plevel stále zůstává podstatným finančním problémem farmářů.

Účinné používání herbicidů vyžaduje dobré řízení. Například doba a metoda aplikace herbicidů a vývojová fáze plevelu jsou podstatná kritéria pro úspěšnou kontrolu plevelnosti plodin. Vzhledem k tomu, že různé druhy plevelných rostlin jsou rezistentní k herbicidům, produkce účinných herbicidů je stále důležitější.

Bohužel, herbicidy, které vykazují vyšší potenci, působí na širší spektrum plevelných rostlin a jsou v půdě rychleji degradovány, mohou také mít vyšší toxicitu k žádaným plodinám. Jedno řešení tohoto problému je vyvinout rostlinu, která je rezistentní nebo tolerantní k herbicidům. Hybridy plodin nebo různé varianty rezistentní k herbicidům umožňují jejich použití bez nebezpečí poškození plodiny. Vývoj rezistence může umožnit aplikaci herbicidu na plodinu, kde dříve jeho použití bylo nemožné nebo limitované díky její senzitivitě k herbicidu. Například U.S. Patent č. 4,761,373 Anderson et al., se týká rezistence rostlin k různým imidazolinonovým nebo sulfonamidovým herbicidům. Enzym pozměněné syntetázy acetohydroxykyseliny (AHAS) způsobuje tuto rezistenci. Patent US 4 975 374 Goodman et al., se týká rostlinných buněk a rostlin obsahující gen kódující mutantní glutaminovou syntetázu (GS). Tyto rostliny jsou rezistentní k herbicidům, které inhibují GS, například fosfinothricin a methionin sulfoximin. Patent US 5 013 659 Bedbrook et al., se týká rostlin, které exprimují mutantní acetolaktátovou synte

-2CZ 296023 B6 tážu, která propůjčuje rostlinám rezistenci k herbicidům, jejichž aktivní látka je sulfonylmočovina. Patent US 5 162 602 Somers et al., dokládá toleranci rostlin k herbicidům, jejichž účinek je postaven na působení látek cyclohexanedion a aryloxyfenoxypropanová kyselina. Tolerance je způsobena funkcí pozměněné acetyl koenzym A karboxylázou (ACCáza).

Protox enzym se jeví jako cílová sloučenina pro řadu herbicidních sloučenin. Herbicidy, které inhibují protox enzym zahrnují molekuly různých strukturálních tříd (Duke et al., Weed Sci 39:465 (1991), Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 (1992), Matringe et al., FEBS Lett. 245:35 (1989), Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35:70 (1989)). Tyto sloučeniny s herbicidním účinkem zahrnují difenylethery {např. acifluorfen, 5-[2-chloro-4-(trifluoromethyl)fenoxy]-2-nitrobenzoová kyselina; její methylester; nebo oxyfluorfen, 2-chlorol-(3-ethoxy-4-nitrofenoxy)-4-(trifluorobenzen)}, oxadiazoly, (např. oxidiazon, 3-[2,4dichloro-5-( 1 -methylethoxy)fenyl]-5-) 1, l-dimethylethyl)-l ,3,4-oxadiazol-2-(3H)-on), cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyfenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid; chlorofthalimin, N-(4-chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid), fenyl pyrazoly (např. TNPP-ethyl, ethyl 2-[l-(2,3,4-trichlorfenyl)^f-nitropyrazolyl-5-oxy]propionat; M&B 39279), deriváty pyridinu (např. LS 82-556) a fenopylatu a jeho O-fenylpyrrolidino- a piperidinokarbamatové analogy. Rada těchto sloučenin inhibuje enzymy katalyzované reakce nebo funguje jako substrátové analogy.

Inhibiční účinek protox inhibujících herbicidů je vysvětlován akumulací protoporfyrinogenu IX v chloroplastu, což vede průniku protoporfyrinogenu IX do cytozolu, kde je oxidován peroxidázovou aktivitou na protopyrfyrin IX. Po světelné expozici protoporfyrin IX může způsobit v cytozolu vytvoření formace singletového kyslíku. Tento singletový kyslík může vytvářet další reaktivní kyslíkové formace, které mohou způsobovat peroxidaci lipidů a rozrušení membrán, což vede k rychlému usmrcení buněk (Lee et al., Plant Physiol. 102:881 (1993)).

Ne všechny protox enzymy jsou citlivé na herbicidy, které inhibují jejich rostlinné druhy. Protox enzymy, které jsou kódovány geny izolovanými zEscherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39:1155 (1993)) a zBacillus subtilis (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269:813 (1994)), jsou rezistentní k těmto herbicidům. Navíc, byly popsány mutanty jednobuněčné řasy Chlemydomonas reinhardtii, které jsou rezistentní fenylimidovému herbicidu S-23142 (Kataoka et al., J. Pesticide Sci. 15:449 (1990); Shibata et al., v Research in Photosynthesis, vol. III, N. Murata, ed. Kluver: Netherlands, pp. 567-570 (1992)). Nejméně jeden z těchto mutantů má pozměněnou protox aktivitu, což vede k rezistenci ne pouze na herbicidní inhibitor, jehož pomocí byl mutant selektován, ale také na další třídy protox inhibitorů (Oshio et al., Z. Naturforsch. 48c:339 (1993); Sáto et al., v ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C. (1994)). Dále byl popsán mutant buňky tabáku, který je rezistentní k inhibitoru S-21432 (Che et al., Z. Naturforsch. 48c:350 (1993).

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká chimérického genu, který obsahuje molekulu DNK kódující enzym protoporfyrinogenové oxidázy (protox) z prokaryontního organizmu.

Vzhledem k informacím, které tento vynález poskytuje, DNK kódující sekvence enzymu protoporfyrinogenové oxidázy (protox) z prokaryontního organizmu mohou být získány použitím standardní metody.

Vynález dále popisuje rekombinantní vektory obsahující zmíněné chimérické geny. Tyto rekombinantní vektory obsahují chimérický gen, který obsahuje promotor, výhodně promotor aktivní v rostlině, který je operabilně vázán k molekule DNK kódující enzym protopyrfyrinogenové oxidázy (protox), izolované z prokaryontního organizmu. Rekombinantní vektor může dále obsahovat signální sekvenci, která je operabilně vázána k řečené molekule DNK. Tato signální sek-3CZ 296023 B6 vence je schopná směrovat protein, kódovaný DNK molekulou, do chloroplastu nebo mitochondria.

Tento vynález dále poskytuje rostliny, rostlinné buňky, rostlinnou tkáň a rostlinná semena s pozměněnou protox aktivitou, které jsou rezistentní nebo při nejmenším tolerantní k působení herbicidů, jenž jsou za normálních podmínek přirozenými inhibitory protox aktivity v rostlinách. Předmětem vynálezu jsou rostliny, u kterých pozměněná protox aktivita je způsobena nadměrnou expresí protox enzymu divokého typu nebo expresí molekuly DNK, kódující protox enzym tolerantní k herbicidu. Zmíněný protox enzym tolerantní k herbicidu může být modifikovaná forma protox enzymu, který se přirozeně vyskytuje v prokaryontech. Rostliny, které jsou ve vynálezu zdůrazňovány, zahrnují jednoděložné, dvouděložné rostliny a zvláště pak hybridní rostliny. Preferovány jsou ty rostliny, jež jsou potenciálním cílem pro protox inhibující herbicidy, jde o agronomicky důležité plodiny takové jako kukuřice a další obilniny, jako jsou pšenice, oves, žito, čirok, rýže, ječmen, proso, turfové a krmné traviny, stejně jako bavlna, tabák, cukrová třtina, cukrová řepa, řepka olejná a sója.

Vynález dále zahrnuje rostlinný množící materiál; semena ošetřená ochranným povlakem, který je tvořen přípravkem ze skupiny herbicidů, insekticidů, fungicidů, baktericidů, molluscicidů nebo jejich směsí.

Vynález popisuje metody produkce rostlin, rostlinných buněk, rostlinných tkání a semen jejich transgenického potomstva, které obsahuje enzym protox rezistentní nebo tolerantní k herbicidu v koncentraci, která inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu. Zmíněná rezistence nebo tolerance může být získána v transgenických rostlinách exprimující se molekuly DNK kódující modifikovanou formu protox enzymu, který se přirozeně vyskytuje v eukaryontu, v rostlině, v prokaryontech nebo protox enzymu, který je modifikovanou formou proteinu přirozeně se vyskytující prokaryontech.

Vynález popisuje přípravu transgenické rostliny kukuřice, kukuřičné tkáně a semen a jejich transgenického potomstva, které byly stabilně transformovány rekombinantní molekulou DNK, jenž obsahuje vhodný promotor, je funkční v rostlinách, operabilně svázaný se strukturním genem kódujícím nemodifikovaný prokaryontní protox enzym rezistentní k herbicidu.

Vynález se týká produkce rostlin, které exprimují pozměněný protox enzym, jenž je tolerantní k inhibici herbicidu v koncentraci inhibující aktivitu divokého typu nezměněného protox enzymu. Rostlina může být stabilně transformována rekombinantní molekulou DNK, která obsahuje strukturní gen kódující rezistentní protox nebo může být vytvořena přímou selekční metodou, kterou je izolována, charakterizována a vyvinuta linie rostlin rezistentní k herbicidu.

Dále vynález popisuje metodu pro kontrolu růstu nežádoucích rostlin. Jde o aplikaci účinného množství protox-inhibujícího herbicidu na populaci rostlin s pozměněnou protox aktivitou, která je rezistentní k herbicidu v koncentraci jenž inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu v rostlině. Touto cestou jsou především chráněny rostliny, které jsou potencionálním cílem protox-inhibujících herbicidů, zvláště pak agronomicky významné plodiny, například kukuřice a obilniny, mezi něž patří pšenice, oves, žito, čirok, rýže, ječmen, proso, a dále jde o turfové a krmné traviny, bavlna, tabák, cukrová třtina, cukrová řepa, řepka olejná a sója. Mezi herbicidy s protox inhibiční aktivitou patří aryluracil, difenylether, oxidiazol, imid, fenyl pyrazol, derivát pyridinu, fenopylat a O-fenylpyrrolidino- a piperidinokarbamatový analog fenopylatu.

Vynález také zahrnuje rekombinantní produkci protox enzymu a metody použití rekombinantně produkovaného protoxu. Dále popisuje hostitelské buňky, zvláště buňky selektované ze skupiny rostlinných, zvířecích, bakteriálních, kvasinkových a hmyzích buněk, které jsou stabilně transformovány rekombinantní molekulou DNK, obsahující vhodný promotor. Promotor by měl být funkční v hostitelské buňce a měl by být operabilně vázán ke strukturnímu genu, který kóduje

-4CZ 296023 B6 nemodifikovaný nebo modifikovaný eukaryontní protox enzym, zmíněný hostitel je schopný exprimovat molekulu DNK.

Vynález poskytuje metody použití purifikovaného protoxu pro zjištění protox-inhibující aktivity u nových herbicidů a pro identifikaci protox mutantů, které jsou rezistentní na daný herbicid.

Vynález popisuje metodu na testování chemikálii z hlediska její schopnosti v rostlině inhibovat aktivitu protox enzymu, metoda spočívá v (a) kombinaci zmíněného protox enzymu a protoporfyrinogenu IX v první reakční směsi, za takových podmínek, že protox enzym je schopný katalyzovat konverzi protoporfyrinogenu IX na protoporfyrin IX;

(b) kombinaci zmíněné chemikálie, protox enzymu a protoporfyrinogenu IX v druhé reakční směsi za stejných podmínek jako probíhá první reakce;

(c) excitování první a druhé reakční směsi v přibližném rozmezí 395 až 410 nM;

(d) porovnání fluorescence zmíněné první a druhé reakční směsi v přibližném rozmezí 622 až 635 nM;

jestliže fluorescence druhé reakční směsi je podstatně nižší než u první reakční směsi, znamená to, že zmíněná chemikálie je schopna inhibovat aktivitu popsaného protox enzymu.

Dalším se vynález týká metody umožňující identifikaci modifikovaného protox enzymu rezistentního k protox inhibitoru, který je přítomný v populaci buněk. Metoda se sestává z těchto kroků (a) kultivace populace buněk v přítomnosti protox inhibitoru v koncentraci, která inhibuje nemodifikovanou formu řečeného protox enzymu;

(b) selekce buněk (definovaných odst. (a)), jejichž růst není inhibován;

(c) izolace a identifikace protox enzymu přítomného v buňkách selektovaných z bodu (b).

Geny kódující pozměněný protox mohou být použity jako selekční markry při transformaci rostlinných buněk. Vynález dále poskytuje metodu selekce rostlin, rostlinné tkáně nebo rostlinných buněk transformovaných transgenem pocházející z netransformovaných rostlin. Tato metoda se sestává z těchto kroků (a) transformace rostliny, rostlinné tkáně nebo rostlinné buňky transgenem, který je schopný býti exprimován rostlinou, a genem kódujícím pozměněný protox rezistentní k protox inhibitoru;

(b) přenesení takto transformovaných rostlin nebo rostlinných buněk do média, které obsahuje protox inhibitor;

(c) selekce rostlin nebo rostlinných buněk, které v médiu přežijí.

Vynález dále popisuje sondy a metody pro detekci přítomnosti a formy protox genu a kvantifikace síly transkripce protoxu v organizmu. Tyto metody mohou být používány pro diagnostiku onemocnění, které jsou spojeny s pozměněnou formou protox enzymu nebo s pozměněnou silou jeho exprese.

Tento vynález souvisí s izolovanou molekulou DNK, která kóduje eukaryontní formu protoporfyrinogenové oxidázy (zde označenou jako „protox“), což je enzym, který katalyzuje oxidaci protporfyrinogenu IX na protoporfyrin IX. DNK kódující sekvence a korespondující sekvence aminokyseliny protox enzymu zArabidopsis thaliana jsou popsány v SEQ IDč. 1-4 a 9-10. DNK kódující sekvence a korespondující sekvence aminokyseliny kukuřičného protox enzymu jsou popsány v SEQ ID č. 5-8.

Podle tohoto vynálezu může být izolována libovolná eukaryontní DNK kódující protox enzym. Jedna metoda používaná pro izolaci eukaryontních protox kódujících sekvencí je popsána v příkladu 1. Použitím této metody jsou identifikovány klony cDNK, kódující protox enzym, z knihovny cDNK klonů odvozených z eukaryontů. Metoda je založena na schopnosti těchto klonů propůjčit protox enzymatickou aktivitu mutantnímu hostitelskému organizmu, kde tato aktivita je nedostatečná Vhodné hostitelské organizmy jsou takové, které mohou být použity pro screening exprese cDNK knihoven a jejichž mutanty, kterým chybí protox aktivita, jsou dostupné nebo mohou být jednoduše vytvořeny. Mezi takové hostitelské organizmy patří E. coli (Sasrman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., 174:3953 (1992)) a Saccharomyces cerevisiae (Comadro et al., Biochem. Res. Comn. 106:724 (1982)).

V jiném případě eukaryontní protox kódující sekvence mohou být izolovány dobře známými postupy, založenými na homologii zmíněné sekvence se sekvencemi protox enzymu z Arabidopsis thaliana (SEQ ID č 1,3 a 9) Zea mays (SEQ ID č. 5 a 7). U těchto postupů je používána celá nebo část známé protox kódující sekvence jako sonda pro selektivní hybridizace s dalšími protox kódujícími sekvencemi, které jsou přítomny ve skupině klonovaných fragmentů genomické DNK nebo fragmentů cDNK (např. genomická nebo cDNK knihovna) pocházejících ze zvoleného organizmu. Tyto postupy zahrnují hybridizaci s DNK knihovnami kultivovanými na plotnách (buď plaky nebo kolonie; např. Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) a PCR amplifikaci za použití oligonukleotidových primerů, které korespondují s konzervativními oblastmi sekvencí protox aminokyselin (např. Innis et al., PCR Protocos, a Guide to Methods and Applications eds., Academie Press (1990)). Tyto metody jsou zvláště vhodné k izolaci protox kódujících sekvencí z organizmů, které jsou příbuzné z organizmy, z nichž je odvozena sekvence sondy. Například sonda, která je tvořena sekvencemi z Arabidopsis thaliana a z Zea mays je pravděpodobně vhodná pro izolaci protox kódujících sekvencí zjiných rostlinných druhů. Izolované eukaryontní protox sekvence, popsané v tomto vynálezu, mohou být manipulovány použitím standardních postupů genového inženýrství a tak jsou vhodné pro použití k libovolnému účelu. Například celá protox sekvence nebo její části mohou být použity jako sondy, které jsou schopny specificky hybridizovat s protox kódujícími sekvencemi a mRNK. Za účelem dosažení specifické hybridizace za různých podmínek, tyto sondy zahrnují sekvence, které jsou jedinečné mezi protox kódujícími sekvencemi. Jejich délka je nejméně 10 nukleotidů, preferují se sondy o délce 20 nukleotidů. Takové sondy mohou být používány pro amplifikaci a analýzu protox kódujících sekvencí ze zvoleného organizmu pomocí dobře známé metody, kterou je polymerázová řetězová reakce (PCR). Tato metoda je použitelná pro izolaci dalších protox kódujících sekvencí za žádaných organizmů nebo jako diagnostický test pro určení přítomnosti protox kódujících sekvencí v organizmu a dále pro odhalení souvislosti výskytu pozměněných kódujících sekvencí s určitým nepříznivým stavem, jako je u lidí autozomální dominantní onemocnění, které je charakterizované neuropsychiatrickými symptomy a kožními lézemi. U tohoto onemocnění je snížena úroveň protox aktivity (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302:765 (1980)).

Protox specifické hybridizační sondy mohou být také používány k mapování umístění přirozeného eukaryontního protox genu(ů) v genomu vybraného organizmu. K tomuto účelu jsou vhodné standardní postupy založené na selektivní hybridizaci sondy k genomovým protox sekvencím. Tyto postupy se stávají z identifikace DNK polymorfizmů, které jsou obsaženy v sekvenci protox sondy, a z využití takového polymorfizmů k následné segregaci protox genu vztaženého k dalším markrům, jejichž pozice je známa při mapování populace, která je odvozená ze samooplodnění hybridu dvou polymorfních parentálních linií (např. Helentjaris et al., Plant

-6CZ 296023 B6

Mol. Biol. 5:109 (1985), Sommer et al., Biotechniques 12:82 (1992), DOvidio et al., Plant Mol. Biol. 15:169 (1990). Zatímco libovolná eukaryontní protox sekvence je použitelná jako sonda pro mapování protox genů eukaryontního organizmu, mezi preferované sondy patří ty protox sekvence, které jsou získány z organizmů příbuzných k zvolenému organizmu. Nejvíce preferované sondy jsou ty protox sekvence, které jsou ze samotného zvoleného organizmu. Mapování protox genů tímto způsobem je využitelné při šlechtění rostlin. Například tím, že je známa pozice mutantního protox genu v genetické mapě, který nese rezistenci k herbicidu, lemovací DNK markry mohou být identifikovány z referenční genetické mapy (např. Helentjaris, Trend Genet. 3:217 (1987)). Během introgrese herbicidní rezistence do nové šlechtěné linie, mohou být tyto markry použité k monitorování rozsahu k protoxu vázané lemovací chromozomální DNK, která je stále přítomna v opakujícím se původci po každém kole back-crossing.

Northen blot analýza, využívající protox specifické hybridizační sondy, může být použita ke kvantifikaci množství protox mRNK v organizmu. Tato metoda je vhodná pro diagnostický test k určení změny síly protox exprese, což může být spojeno s určitým nepříznivým stavem, jako je u lidí autozomální dominantní onemocnění, které je charakterizované neuropsychiatrickými symptomy a kožními lézemi. U tohoto onemocnění je snížena úroveň protox aktivity (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302:765 (1980)).

Za účelem rekombinantní produkce enzymu v hostitelském organizmu, protox kódující sekvence je vložena do expresivní kazety, která je navržena pro zvoleného hostitele, a je vnesena do hostitele, kde je exprimována. Volba specifických regulačních sekvencí jako je promotor, signální sekvence, 5' a 3' nepřekládané sekvence a zesilovač transkripce je závislá na schopnostech odborníka. Výsledná molekula, obsahující jednotlivé elementy vázané k vhodnému čtecímu rámci, může být vložena do vektoru, který je schopen být transformován do hostitelské buňky. Vhodné expresivní vektory a metody pro rekombinantní produkci proteinů jsou charakterizovány pro hostitelské organizmy jako jsou E. coli (např. Studier and Moffatt, J. Mol. Biol. 189:113 (1986), Brosius, DNK 8:759 (1989)), kvasinky (např. Schneider and Guarente, Meth. Enzymol. 194:373 (1991)) a hmyzí buňky (např. Luckow and Summers, Bio/Technol. 6:47 (1988)). Mezi ně patří plazmidy jako pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (International Biotechnologies, lne., New Haven, CT), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, CA) a expresivní vektory pro baculoviry, například ty, které jsou odvozeny z genomu jaderného polyedrického viru Autographica califomica (AcMNPV). Preferovaný baculovirus/hmyzí systém jsou pVIl 1392/SÍ21 buňky (Invitrogen, La Jolla, CA).

Rekombinantně produkovaný eukaryontní protox enzym je použitelný pro různé účely. Například dodává protox enzymatickou aktivitu in vitro. Dále může být použit pro testování herbicidních chemikálií in vitro, jejichž cíl působení není znám, přičemž lze určit jejich protox inhibiční aktivitu. Podobný test in vitro může být použit k identifikaci chemikálií, které inhibují protox aktivitu a které jsou proto považovány za kandidáty herbicidů. V jiném případě, rekombinantně produkovaný protox enzym může sloužit k hlubší charakterizaci jeho vztahu k známým inhibitorům, což vede k vytvoření nových herbicidů stejně jako k vytvoření enzymu, jenž je tolerantní k herbicidu.

Účinek inhibice na protox enzym se určuje měřením fluorescence při vlnové délce okolo 622 až 635 nm po excitaci při 395 až 410 nM (např. Jacobs and Jacobs, Enzyme 28:206 (1982)); Sherman et al., Plant. Physiol. 97:280 (1991)). Tento test je založen na principu, že protoporfyrin IX, na rozdíl od protoporfyrinogenu, je fluorescenční pigment. Proteinové extrakty jsou připravovány diferenciální centrifugací z vybraných subcelulámích frakcí, například etioplasty, mitochondria, mikrozomy nebo plazmatické membrány (např. Lee et al., Plant Physiol. 102:881 (1993); Prado et al., Plant Physiol. 65:956 (1979); Jakson and Moore, in Plant Organelles. Reid, ed., pp. 1-12; Jacobs and Jacobs, Plant Physiol. 101:1181 (1993)). Protoporfyrinogen je připravován redukcí protoporfyrinu amalgamem sodným jak popisuje Jacobs and Jacobs (1982). Reakční směsi obsahují 100 mM Hepes (pH 7,5), 5 mM EDTA, 2mMDTT, přibližně 2 M protoporfyrinogen IX a přibližně 1 mg/ml proteinového extraktu. Před iniciací enzymové reakce jsou k enzymovému extraktu přidány roztoky inhibitoru v různých koncentracích například 1

-7 CZ 296023 B6 mM, 100 μΜ, 10 μΜ, 1 μΜ, 100 ηΜ, 10 ηΜ, 1 ηΜ, 100 ρΜ. Po přidání extraktu je měřena fluorescence po dobu několika minut a je vypočítána směrnice křivky (reakční rychlost) z lineární oblasti. Porovnáním směrnic inhibiční reakce a kontrolní reakce je určena IC50·

Vynález dále popisuje použití protox enzymu v testu pro identifikaci protox mutantů, které jsou rezistentní na inhibitor. Test probíhá následovně:

(a) inkubace prvního vzorku protoxu a jeho substrátu, protoporfyrinogenu IX, v přítomnosti druhého vzorku, který obsahuje protox inhibitor;

(b) měření enzymatické aktivity protoxu z bodu (a);

(c) inkubace prvního vzorku mutovaného protoxu a jeho substrátu v přítomnosti druhého vzorku, který obsahuje stejný protox inhibitor;

(d) měření enzymatické aktivity mutovaného protoxu zbodu (c); a (e) srovnání enzymatické aktivity obou protoxů.

Reakční směs a reakční podmínky jsou podobné jako u testu pro identifikaci protox inhibitorů (inhibitorový test). Modifikace jsou následující; První, protox mutant, získaný jak bylo dříve opsáno, je v jedné reakční směsi inhibitorového testu nahrazen protoxem divokého typu. Druhá, inhibitor protoxu divokého typuje přítomen v oboru reakčních směsích. Třetí, za účelem zjištění, zda došlo k vzrůstu nemutované aktivity, jsou porovnány mutovaná aktivita (aktivita enzymu v přítomnosti inhibitoru a mutovaného protoxu) a nemutovaná aktivita (aktivita enzymu v přítomnosti inhibitoru a protoxu divokého typu). Mutovaná aktivita je libovolné měření enzymatické aktivity mutovaného protox enzymu v přítomnosti vhodného substrátu a inhibitoru. Nemutovaná aktivita je libovolné měření enzymatické aktivity protox enzymu divokého typu v přítomnosti vhodného substrátu a inhibitoru. Podstatný vzrůst je definován jako zvýšení enzymatické aktivity, které je vyšší než je chyba měření. Preferuje se dvojnásobný vzrůst aktivity enzymu divokého typu v přítomnosti inhibitoru. Více preferovaný je 5-ti násobný vzrůst a nejžádanější je 10-ti a více násobný.

Herbicidy, které inhibují protox, zahrnují molekuly mnoha různých strukturálních tříd (Duke et al., Weed Sci. 39:465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245:35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35:70 (1989)). K těmto molekulám patří difenylethery {např. acifluorifen, 5-[2-chloro-4-(trifluoromethyl)fenoxy]-2-nitrobenzoová kyselina; její methylester; nebo oxyfluorfen,

2- chloro-l-(3-ethoxy-4-nitrofenoxy)-4-(trifluorobenzen)}, oxidiazoly (např. axidiazon,

3- [2,4-dichloro-5-( l-methylethoxy)fenyl]-5-( 1, l-dimethylethyl)-l ,3,4-oxadiazol-2-(3H)on), cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyfenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid; chlorofthalim, N-(4-chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid), fenyl pyrazoly (např. TNPP-ethyl, ethyl 2-(1-(2,3,4-trichlorfenyl)-4-nitropyrazolyl-5-oxy]propionat; M&B 39279), deriváty pyridinu (např. LS 82-556) a fenopylatu a jeho O-fenylpyrrolidinoa piperidinokarbamatové analogy.

-8CZ 296023 B6

Podstatné difenylethery jsou ty, které mají tento obecný vzorec

NOj

Vzorec Iy kde

R je -COONa (Vzorec II), -CONHSO₂CH₃ (Vzorec III) nebo -COOCH₂COOC₂H₅ (Vzorec IV; Maigrot et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 47-51 (1989)).

Další vhodné difenylethery jsou ty, kde R je

NOCH₂COOCH₃

CCH₂OCH₃ (Vzorec IVa; Hayashi et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 53-58 (1989)).

Další vhodné difenylethery mají vzorec:

(Vzorec IVb; bifenox, Dest et al., Proč. Northeast Weed Sci. Conf. 27:31 (1973)). Podstatná je také třída herbicidů známá jako imidy, které mají obecný vzorec

(Vzorec V)

-9CZ 296023 B6 kde Qjsou

O

O o

N—

O

N~—

HF₂C 1

O (Vzorec VI) (Vzorec VII) (Vzorec VIII) (Vzorec IX)

(Vzorec IXa) (Vzorec IXb) (Hemper et al., (1995) in „Proceedings of the Eighth Intemational Congress of Pesticide Chemistry,“ Regdale et al., eds., Amer. Chem. Soc., Washington, D.C., pp. 42-48 (1994)).

A R] jsou H, Cl nebo F, R₂ je Cl, R₃ je optimálně substituovaný ether, thioether, ester, amino nebo alkyl skupina. V jiném případě R₂ a R₃ mohou dohromady tvořit 5-ti nebo 6-ti členný heterocyklický kruh. Příklady imidových herbicidů jsou

-10CZ 296023 B6

A_N'^CHF*

CHjSO₂NH

N 'N

(Vzorec X)

CHj

(Vzorec XI)

(Vzorec XII)

Miuara et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds:35-40 (1993))

(Vzorec XIII)

-11 CZ 296023 B6

(Vzorec XIV)

(Vzorec XV)

(Vzorec XVI)

Herbicidní aktivity výše uvedených látek jsou popsány v Proceedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (Vzorce X a XVI), Proceedings of the 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) 5 (Vzorce XII a XIII), Patent US 4 746 352 (Vzorec XI) a Abstracts of the Weed Science Society of America vol. 33, pg.9 (1993) (Vzorec XIV).

-12CZ 296023 B6

Mezi preferované imidové herbicidy patří aryluracily, mají obecný vzorec

(Vzorec XVII) kde R znázorňuje skupinu (C₂_₆-alkenyloxy)karbonyl-C₁_₄-alkyl, jak je doloženo v patentu US 5 183 492, který je zde začleněn jako reference.

Významné jsou také herbicidy mající obecný vzorec:

(Vzorec XVIII; thiadiazimin) (Weiler et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, pp.:29-34 (1993));

(Vzorec XIX; karfentrazon) (Van Saun et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, pp.: 19-22 (1993));

-13CZ 296023 B6

N-substituované pyrazoly s obecným vzorcem:

(Vzorec XX) (Mezinárodní patent WO 94/08999, WO 93/10100 a U.S. Patent č. 5,405,829 Schering)

N-fenylpyrazoly, takové jako:

cf₃ (Vzorec XXI; nipyraklofen) (str. 621 „The Pesticide Manual,“ 9^th ed., ed. C. R. Worthing, British Crop Protection Council, Surrey (1991));

a 3-substituované-2-aryl-4,5,6,7-tetrahydroindazoly (Lyga et al., Pesticide Sci. 42:29-36 (1994)).

Aplikační rozmezí dávky herbicidu, které inhibuje aktivitu protox enzymu, částečně závisí na vnějších faktorech jako jsou prostředí, doba a metoda aplikace. V případě imidových herbicidů, které jsou reprezentovány vzorci V až IX, a zvláště těch, jenž mají vzorce X až XVII, je rozmezí aplikační dávky 0,0001 až 10 kg/ha, preferováno je rozmezí 0,005 až 2 kg/ha. Tato dávka a koncentrace herbicidu mohou být rozdílné, závisí to na působení a na použité látce. Obě tyto veličiny lze určit dobře známými metodami.

Vynález dále prezentuje rostliny, rostlinnou tkáň a rostlinná semena, která jsou tolerantní k herbicidům, jež inhibují přirozeně se vyskytující protox aktivitu v těchto rostlinách, kde tolerance je způsobena pozměněnou aktivitou protox enzymu. Jsou preferovány agronomicky důležité plodiny, tj. krytosemenné a nahosemenné rostliny jako jsou bavlna, sója, řepka, cukrová řepa, kukuřice, rýže, pšenice, ječmen, oves, žito, čirok, proso, krmné a turfové traviny a podobně.

„Pozměněnou aktivitou protox enzymu“ je míněna protox enzymatická aktivita, která je odlišná od té přirozeně se vyskytující v rostlině (tj. protox aktivita, která se vyskytuje přirozeně nezávisle na přímém či nepřímém zásahu člověka), jenž je rezistentní k herbicidům inhibujícím přirozeně se vyskytující aktivitu. Pozměněná protox enzymatická aktivita může být rostlině udělena, podle vynálezu, zvýšením exprese na herbicid citlivého protoxu divokého typu, expresí pozměněného herbicid-tolerantního eukaryontního protox enzymu v rostlině, expresí nemodifikované nebo

-14CZ 296023 B6 modifikované bakteriální formy protox enzymu, který je k herbicidu v rostlinách rezistentní nebo kombinací těchto postupů.

Dosažení pozměněné protox enzymatické aktivity pomocí zvýšené exprese vede ktomu, že v rostlině je takové množství protox enzymu, které je přinejmenším dostatečné k překonání inhibice růstu způsobené herbicidem. Hladina exprimovaného protoxu obecně dosahuje nejméně dvojnásobku, lépe pětinásobku a v nejlepším případě více jak desetinásobku množství přirozeně exprimovaného. Silnější exprese může být způsobena tím, že se protox gen divokého typu vyskytuje ve více kopiích; může být dále zapříčiněna vícenásobným výskytem protox kódujících sekvence v protox genu (tj. amplifikace genu) nebo mutací nekódující, regulační sekvence endogenního protox genu v rostlině. Rostliny obsahující takovou pozměněnou protox enzymatickou aktivitu mohou být získány přímou selekcí. Tato metoda je v oboru známa (Somers et al., v US 5 162 602 a Anderson et al., v US 4 761 373). Tyto rostliny mohou být získány metodami genového inženýrství. Zvýšená exprese na herbicid citlivého protoxu může také být provedena stabilní transformací rostlinné buňky molekulou rekombinantní nebo chimérické DNK, která obsahuje promotor schopný řídit expresi příbuzného strukturního genu v rostlinné buňce a je vázaná k homolognímu nebo heterolognímu strukturnímu genu kódujícímu protox. „Homologním“ je míněn ten protox gen, který je izolován z organizmu taxonomicky identického s cílovou rostlinou buňkou, „heterologní“ je ten protox gen, který je získán z organizmu, jenž je taxonomicky odlišný od cílové rostlinné buňky. Homologní protox geny mohu být získány komplementací bakteriálního nebo kvasinkového auxotrofního mutantu cDNK expresní knihovnou získané z cílové rostliny. Například příklad 1 a Snustad et al., Genetics 120:1111-1114 (1988) (kukuřičná glutaminová syntetáza); Delauney et al., Mol. Genet. 221:299-305 (1990) sójová pyrrolin-5karboxylatová reduktáza); Frisch et al., Mol. Gen. Genet. 228:287-293 (1991) (kukuřičná dihydrodipicolinatová syntetáza); Eller et al., Plant Mol. Biol. 18:557-566 (1992) (3-izopropylmalatová dehydrogenáza chloroplastu řepky); Proč. Nati. Acad. Sci., USA 88:1731-1735 (1991); Minet et al., Plant J. 2:417-422 (1992) (dihydroorotatová dehydrogenáza) a další reference umístěné na jiném místě. Další známé metody zahrnují testování genomové nebo cDNK knihovny, například na sekvence, které cross-hybridizují se specifickými NK sondami nebo testování expresních knihoven na produkci protox enzymů, které cross-reagují se specifickými protilátkovými sondami. Preferovaná metoda zahrnuje komplementací E. coli hemG auxotrofního mutantu cDNK knihovnou z kukuřice nebo Arabidopsis thaliana.

Mezi promotory funkční v rostlinách nebo v rostlinných buňkách, tj. ty, které jsou schopny řídit expresi příbuzných strukturálních genů, takových jako je protox, v rostlinách, patří 19S nebo 35S promotory květákového mozaikového viru (CaMV) a CaMV zdvojený promotor, promotory nopalinové syntetázy, promotory k patogenezi-vztaženého proteinu (PR), promotory malé podjednotky ribulozové bifosfátové karboxylázy (ssuRBISCO) a podobně. Preferovány jsou promotor rýžového aktinu (McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231:150 (1991)), promotor kukuřičného ubiquitinu (EP 0 342 925; Taylor et al., Plant Cell Rep. 12:491 (1993)), a Pr-1 promotor z tabáku, Arabidopsis nebo z kukuřice (mezinárodní patentová přihláška PCT/IB95/00002 Rayls et al., reference na jiném místě). Dále jsou preferovány 35S promotor a zesílený nebo zdvojený 35S promotor, takový jako popisuje Kay et al., Science 236:1299-1302 (1987) a zdvojený 35S promotor klonovaný do pCGN2113, uložený jako ATCC 40587, který je doložen v EP-A 0 392 225, reference na jiném místě. Samy promotory mohou být modifikovány za účelem pozměnění jejich síly, což může zvýšit expresi protoxu. Z důvodu řízeného transportu exprimovaného protox enzymu do místa působení, mohou být signální nebo transportní peptidy fúzovány s protox kódující sekvencí za vzniku chimérické DNK konstrukce. Příklady signálních peptidů zahrnují ty, které jsou přirozeně vázány k rostlinným k patogenezi-vztaženým proteinům, např., PR-1, PR-2 a podobně (Payne et al., Plant. Mol. Biol. 11:89-94 (1988). Příklady tranzitních peptidů zahrnují tranzitní peptidy chloroplastu jak popisuje Von Heijne et al., Plant. Mol. Biol. Rep. 9:104-126 (1991); Mazur et al., Plant Physiol. 85:1110 (1987); Vorst et al., Gene 65:59 (1988) a mitochondriální tranzitní peptidy, které popisuje Bountry et al., Nátuře 328:340-342 (1987). Chloroplastové a mitochondriální tranzitní peptidy jsou v tomto vynálezu použitelné jako protox enzymatická aktivita, typicky se objevující v mitochondriu a v chloroplastu. Nejvíce preferované

-15 CZ 296023 B6 jsou chloroplastové tranzitní peptidy. Jsou považovány za primární báze pro působení protox inhibujících herbicidů (Witkowski and Halling, Plant Physiol. 87:632 (1988); Lehnen et al., Pestic. Biochem. Physiol. 37:239 (1990); Duke et al., Weed Sci 39:465 (1991)). Také jsou zahrnuty sekvence, které ovlivňují lokalizaci kódovaného proteinu do různých buněčných částí jako jsou vakuoly. Například Neuhaus et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:10362-10366 (1991) a Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 42:21-53 (1991). Relevantní doložení této publikace je formou reference.

Konstrukce chimérické DNK podle vynálezu obsahují vícenásobné kopie promotoru nebo protox strukturních genů. Konstrukce mohou zahrnovat v každém otevřeném čtecím rámci, spolu s dalšími funkčními elementy, kódující sekvence pro markry a jiné peptidy, takové jako jsou signální a tranzitní peptidy. Příprava takových konstrukcí patří do základních dovedností odborníka.

Použitelné markry zahrnují peptidy poskytující rezistenci na herbicidy, antibiotika nebo léky, například rezistenci na hygromycin, kanamycin, G418, gentamycin, linkomycin, methotrexat, fosfínotricin a podobně. Tyto markry mohou být použity pro selekci buněk transformovaných konstrukcemi chimérické DNK. Dalšími použitelnými markry jsou peptidické enzymy, které mohou být jednoduše detekovány viditelnou reakcí, například, barevnou reakcí jako je luciferáza, β-glukuronidáza nebo β-galaktozidáza.

Pozměněná aktivita protox enzymu může být dosažena vytvořením nebo identifikací modifikovaných forem izolované eukaryontní protoxové kódující sekvence, která má nejméně jednu substituci aminokyseliny, adicí nebo delecí, která kóduje pozměněnou rezistenci protox enzymu k herbicidu, jenž inhibuje nepozměněnou, přirozeně se vyskytující formu (tj. formy, které se vyskytují přirozeně v eukaryontním organizmu a nejsou manipulovány buď přímo metodami rekombinace DNK nebo nepřímo selekčním šlechtěním atd.). Geny kódující takové enzymy mohou být získány řadou metod. První obecná strategie zahrnuje přímou a nepřímou mutagenezi mikrobů. Například genově manipulovatelné mikroby jako jsou E. coli nebo S. cerevisiae mohou být předmětem náhodné mutageneze in vivo, která může být provedena například UV světlem, ethyl nebo methyl methan sulfonátem. Metody mutageneze jsou popsány vMiller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972); Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983); a Patent US 4 975 374 (Goodman et al.). Mikroorganizmus po mutagenezi obsahuje eukaryontní protox gen citlivý na herbicid a jeho protox aktivita je nesena právě tímto genem. Buňky pozměněné mutagenezi jsou kultivovány v přítomnosti herbicidu v koncentracích, které inhibují nemodifikovaný protox enzym. Kolonie mutagenizovaného mikrobu, které rostou v přítomnosti inhibitoru lépe než kolonie nemutagenizovaného mikrobu (tj. vykazují rezistenci k inhibitoru), jsou selektovány pro další analýzu. Z těchto kolonií jsou buď klonováním nebo amplifíkací polymerázovou řetězovou reakcí izolovány protox geny a jsou objasněny jejich sekvence. Sekvence kódující pozměněnou protox enzymatickou aktivitu jsou pak klonovány do mikrobu, kam vnáší rezistenci na inhibitor.

Druhá metoda, kterou lze získat mutantní na herbicid rezistentní alely eukaryontního protox enzymu zahrnuje přímou selekci v rostlině. Účinek protox inhibitoru, který už byl uveden, na růst rostlin jako jsou Arabidopsis, sója nebo kukuřice může být určen kultivací sterilizovaných semen na plotnách na jednoduchém médiu, které obsahuje minimální množství solí, se vzrůstající koncentrací inhibitoru. Vhodné koncentrace se pohybují v rozmezí 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 110, 300, 1000 a 3000 ppm. Nejnižší dávky, jejichž inhibice růstu může být reprodukovatelně detekovaná se používá v dalších pokusech.

Mutageneze rostlinného materiálu může být použita ke zvýšení frekvence výskytu rezistentních alel v selektované populaci. Mutagenizovaný osivový materiál je odvozen z různých zdrojů, které zahrnují chemickou nebo fyzikální mutagenezi semen, chemickou nebo fyzikální mutagenezi

-16CZ 296023 B6 pylu (Neuffer, v Maize for Biological Research. Sheridan, ed. Univ. Press, Grand Forks, ND., pp. 61-64 (1982)), jenž je použit pro oplodnění a pak jsou shromážděna Mi mutantní semena. V případě Arabidopsis, M₂ semena (Lehleovi semena, Tucson, AZ), tj. semena potomstva rostlin vyrostlá ze semen, která byla mutagenizována chemikáliemi jako je ethyl methan sulfonát nebo fyzikální cestou za použití gamma záření nebo rychlých neutronů, jsou kultivovány na plotně v hustotě 10 000 semen /plotnu (10 cm v průměru) na médiu s minimálním množstvím solí s příslušnou koncentrací inhibitoru, který slouží k selekci rezistence. Semenáče, které rostou a zůstávají zelené po dobu 7 až 21 dní jsou přesazeny do půdy, pokračují v růstu až do vytvoření semen. Potomstvo těchto semen je testováno, zdaje rezistentní k herbicidu. Jestliže rezistence je dominantní, předpokládá se, že rostliny, jejichž semeno se dělí 3:l=rezistentní:citlivý, jsou heterozygotní v generaci M₂. Rostliny, které produkují všechna semena rezistentní, jsou považovány za homozygotní v generaci M₂. Mutageneze intaktních semen a testování jejich M₂ dceřinných semen může také probíhat v jiných rostlinných druzích, například v sóje (patent US 5 084 082 (Sebastian)). Další způsob získání semen s tolerancí na herbicid je oplodnění chemickou nebo fyzikální cestou mutagenizovým pylem.

Potvrzení, že rezistence je založena na pozměněném protox genu, je možné dvěma způsoby. První způsob, alely protox genu z rostlin, vykazující rezistenci k inhibitoru, mohou být izolovány použitím PCR. Při této metodě jsou použity příměry sestaveny na základě konzervativních oblastí protox cDNK sekvence Aradopsis a kukuřice, uvedeny v SEQ ID č.:1,3,5,7 nebo upřednostněny jsou primery, založeny na sekvencích nepozměněného protox genu z rostliny, která se používá pro vytvoření rezistentních alel. Po sekvenování, za účelem zjištění přítomnosti mutací v kódující sekvenci, alely mohou být testovány, zda jsou schopny přenést rezistenci na inhibitor na rostlinu, která je jimi transformována. Tyto rostliny mohou být buď Arabidopsis nebo libovolná rostlina, jejíž růst je ovlivněn inhibitorem. Druhý způsob, protox geny mohou být mapovány za účelem zjištění polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP) (např. Chang et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:6856-6860 (1988); nam et al., Plant Cell 1: 699-705 (1989). Rezistence může být mapována nezávisle použitím stejných markrů. Jestliže je rezistence způsobena mutací protox genu, stopa rezistence povede do pozice, která je nerozlišitelná od pozice protox genu.

Třetí způsob je selekce v kultuře rostlinných buněk. Explanty rostlinné tkáně, například embrya, listové disky atd., aktivně rostoucí kalus nebo rostlinné suspenzní kultury jsou kultivovány na definovaném médiu bez hernu za přítomnosti zvyšující se koncentrace herbicidu nebo podobného inhibitoru, který je vhodný pro použití v laboratorních podmínkách. U různých kultur jsou referovány různé stupně růstu. Jisté kultury, jde o rychle rostoucí druhy kolonií, rostou dokonce v přítomnosti normálně inhibující koncentrace inhibitoru. Četnost výskytu těchto rychle rostoucích druhů kolonií lze zvýšit působením chemického nebo fyzikálního mutagenu před vystavením tkání nebo buněk působení herbicidu. Putativní rezistenci přenášející alely protox genu jsou izolovány a testovány, jak je popsáno v následujících paragrafech. Tyto alely, nesoucí rezistenci na herbicid, mohu pak být manipulovány za účelem dosažení optimální exprese a jsou transformovány do rostliny. V jiném případě rostliny mohou být vytvořeny z tkáně nebo buněčných kultur, které obsahují tyto alely.

Čtvrtý způsob zahrnuje mutagenezi na herbicid citlivých protox genů divokého typu v bakterii a kvasince, což je následováno kultivací mikroba v médiu bez hernu, ale s inhibující koncentrací inhibitoru, a selekcí těch kolonií, které rostou v přítomnosti inhibitoru. Rostlinná cDNK, jako je Aradopsis nebo kukuřičná cDNK, kódující protox je klonována do mikrobu, kterému jinak chybí protox aktivita. Takovými mikroby mohou být například E. coli, S.typhimurium a S. cerevisiae autotrofní mutanty zahrnující kmen E. coli SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)), kmeny S. typhimurium TE2483 nebo TT13680 (Xu et al., J. Bacteriol. 174:3953 (1992)) a kvasinkový mutant hem 14-1 (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106:724 (1982)). Transformovaný mikrob je pak předmětem in vivo mutageneze, jak bylo právě popsáno, nebo in vitro mutageneze pomocí libovolných chemických nebo fyzikálních metod, například použitím bissulfítu sodného (Shortle et al., Methods Enzymol. 100:457-468 (1983)); methoxylaminu (Kadonaga et al., Nucleic Acid Res. 13: 1733-1745 (1985)); na oligonukleotidy směro

-17CZ 296023 B6 váná saturační mutageneze (Hutchinson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83:710-714 (1986)); nebo různé strategie chybné polymerázové inkorporace (např. Shortle et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79:1588-1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64:313-319 (1988); a Leung et al., Technique 1:11-15 (1989)). Kolonie, které rostou v přítomnosti normálně inhibující koncentrace inhibitoru, jsou izolovány a purifikovány opakovanou selektivní kultivací. Jejich plazmidy jsou purifikovány a retransformací do mikrobu, který nemá protox aktivitu, je testována schopnost přenášet rezistenci na inhibitor. Pak jsou určeny DNK sekvence protox cDNK plazmidových inzertů, které prošly tímto testem.

Po té co je rezistentní protox alela identifikována, může být genově manipulována za účelem optimální exprese v rostlině. Ta může obsahovat pozměněnou kódující sekvenci pro optimální expresi alely nesoucí rezistenci v rostlině. Metody vhodné pro modifikaci kódujících sekvencí za účelem dosažení optimální exprese v daných druzích plodin jsou dobře popsány, (např. Perlak et al., Proč. Nati. Acad. Sci. Usa 88:3324 (1991); Koziel et al., Bio/technol. 11:194 (1993)). Genově manipulovaná protox alela pro optimální expresi může také zahrnovat operabilně vázanou příslušnou regulační sekvenci (tj. promotor, signální sekvence, terminátory transkripce). Preferované protmotory jsou ty, které umožňují silnou konstituční expresi nebo ty, jenž umožňují specifickou silnou expresi v tkáních, které jsou náchylné k poškození působením herbicidu.

Existuje mnoho způsobů, které jsou použitelné pro vnesení rekombinantních DNK molekul do rostlinné buňky. Volba metody závisí na typu transformované rostliny, tj. zda je jedno- nebo dvouděložná. Vhodné metody pro transformaci rostlinných buněk jsou mikroinjektáž (Crossway et al., Bio Technique 4:320-334 (1986), elektroporace (Riggs et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986)), transformace zprostředkovaná Agrobacterium (Hinche et al., Biotechnology 6:915-921 (1988)), přímý transfer genu (Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984)) a akcelerace balistické částice za použití přístroje od firmy Agracetus, lne., Madison, Wisconsin a Dupont, lne., Wilmington, Delaware (např. Sanford et al., patent US 4 945 050; a McCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988)). Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5:27-37 (1987) (cibule); Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988) (sója); McCaba et al., Bio/Technology 6:923-926 (1988) (sója); Datta et al., Bio/Technology 8:736-740 (1990) (rýže); Klein et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309 (1988) (kukuřice); Klein et al., Bio/Technology 6:559-563 (1988) (kukuřice); Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444 (1988) (kukuřice); Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839 (1990); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618(1990) (kukuřice).

Dále vynález popisuje transgenické rostliny, zejména transgenické plodné rostliny ve smyslu dříve popsaných procesů a jejich asexuální a/nebo sexuální potomstvo, které jsou stále rezistentní nebo nejméně tolerantní k inhibici herbicidem v koncentraci, která inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu v rostlinách. Preferované jsou hybridy rostlin, které jsou rezistentní nebo přinejmenším tolerantní k inhibici herbicidem, v koncentracích, jenž inhibují v rostlině se přirozeně vyskytující protox aktivitu.

Transgenická rostlina podle vynálezu může být dvouděložní nebo jednoděložní. Preferovány jsou jednoděložní rostliny Graminaceae, knimž patří Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzea, Avena, Hordeum, Secale a Setaria.

Zvláště preferované jsou transgenické rostliny kukuřice, pšenice, ječmene, čiroku, žita, ovsa, turfových travin a rýže.

Z dvouděložních rostlin jsou preferovány sója, bavlna, tabák, cukrová třtina, řepka olejná a slunečnice.

Expresivním potomstvem se rozumí asexuálně i sexuálně vytvořené potomstvo transgenických rostlin. Tato definice také zahrnuje všechny mutanty a variace získatelné známými metodami,

-18CZ 296023 B6 jako je např., buněčná fúze a selekce mutantu, a které stále vykazují charakteristické vlastnosti počáteční transformované rostliny, dohromady se všemi produkty, vzniklými křížením a fúzí transformovaného rostlinného materiálu.

Dalším předmětem vynálezu je proliferační materiál transgenických rostlin.

Proliferační materiál transgenických rostlin je definovaný podle vynálezu jako libovolný materiál, který se může množit sexuálně nebo asexuálně in vivo nebo in vitro. Zvláště preferovány jsou protoplasty, buňky, kalí, tkáň, orgány, semena, embrya, pil, vaječné buňky a zygoty spolu s dalším libovolným propagačním materiálem, který se dá získat ztransgenických rostlin.

Dále vynález popisuje části rostlin, jako jsou například květy, stonky, plody, listy a kořeny, které pocházejí z transgenických rostlin nebo jejich potomstva, jenž byly transformovány ve smyslu procesu popsaném ve vynálezu a proto obsahují část transgenických buněk.

Dříve než je množící materiál (plody, hlízy, obilí, semeno), zvláště semeno, prodáván jako komerční produkt, je ošetřen ochranným povlakem, který obsahuje herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy molluscicidy nebo jejich směsi. Tyto látky se mohou vyskytovat dohromady s dalšími nosiči, povrchově aktivními látkami nebo aplikaci umožňujícími adjuvans, které ovlivňují vlastnosti přípravku v smyslu poskytnutí ochrany proti poškození způsobeném bakteriálními, plísňovými a zvířecími škůdci.

Za účelem ochrany osiva, ochranný povlak může být aplikován na osivo buď impregnací hlíz nebo obilí kapalným přípravkem nebo jejich potažením kombinovaným mokrým nebo suchým přípravkem. Ve speciálních případech je možné použít další metody aplikace, například ošetření pupenů nebo plodů.

Rostlinné osivo podle vynálezu obsahující DNK sekvenci, která kóduje eukaryontní protein mající protoporfyrinogen oxidázovou aktivitu (protox), může být ošetřeno ochranným povlakem, jenž obsahuje ochrannou látku jako je kaptan, karboxin, thiram (TMTD®), methalaxyl (Apron®) a pirimifosmethyl (Actellic®) a další látky, které se běžně užívají pro tento účel.

Dalším předmětem vynálezu rostlinný propagační materiál pro kultivaci rostlin, ale zvláště pak rostlinné osivo, které je ošetřeno ochranným povlakem, který je v širokém měřítku užíván pro tento účel.

K herbicidu rezistentní protox alela je získána přímou selekcí rostliny nebo rostlinné buněčné kultury, ze které může být rostlina vytvořena. Použitím tradičních šlechtických metod může být vyvinuta na herbicid tolerantní plodina, kde není potřeba genově manipulovaná alela a její transformace do rostliny. V jiném případě může být izolována na herbicid rezistentní alela, která je genově manipulována za účelem optimální exprese a pak je transformována do požadované rostliny.

Geny kódující pozměněnou protox rezistenci na protox inhibitor mohou být použity i jako selekční markry u metod rostlinné buněčné transformace. Například rostliny, rostlinná tkáň nebo rostlinné buňky transformované transgeny mohou být také transformovány genem kódujícím pozměněný protox, který je schopný exprese v rostlině. Tímto způsobem transformované buňky jsou přeneseny do média obsahující protox inhibitor. Za těchto podmínek přežívají pouze transformované buňky. Jako selekční agents se mohou použít protox inhibitory difenylethery {např. acifluorfen, 5-[2-chloro-4-(trifluoromethyl)fenoxy]-2-nitrobenzoová kyselina; její methylester; nebo oxyfluorfen, 2-chloro-l-(3-ethoxy-4-nitrofenoxy)-4-(trifluorobenzen)}, oxidiazoly, (např. oxid iazon, 3-[2,4-dichloro-5-( l-methylethoxy)fenyl]-5-) 1,1 -dimethylethyl)-1,3,4— oxadiazol-2-(3H)-on), cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyfenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid; chlorofthalim, N-(4-chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid), fenyl pyrazoly (např. TNPP-ethyl, ethyl 2-(1-(2,3,4-trichlorfenyl)-4-nitropyrazolyl-5

-19CZ 296023 B6 oxyjpropionat; M&B 39279), deriváty pyridinu (např. LS 82-556) a fenopylatu a jeho O-fenylpyrrolidino- a piperidinokarbamatové analogy. Tato metoda je aplikovatelná na libovolnou rostlinnou buňku, která je schopna být transformována pozměněným protox kódujícím genem, a může být použita spolu s libovolným transgenem. Exprese transgenů a protox genu běží ze stejného promotoru, který je funkční v rostlinných buňkách nebo z oddělených promotorů. Vynález bude podrobněji popsán v příkladech. Tyto příklady jsou uvedeny pouze pro ilustraci, nejsou limitující ani jinak specifikující.

Uložení

Následující molekuly vektoru jsou uloženy v Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northem Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA. Datum uložení je dále uvedeno.

Protox-1, ve vektoru pBluescript SK byl uložen 5. 4. 1994 jako pWDC-2(#B-21238).

Protox-2, ve vektoru pFL61 byl uložen 5. 4. 1994 jako pWDC-1 (NRRL #B-21237).

MzProtox-1, ve vektoru pBluescript SK byl uložen 20. 5. 1994 jako pWDC-4 sNRRL(#B21260), sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č: 5.

MzProtox-1, ve vektoru pBluescript SK byl znovu uložen 11. 7. 1994 jako pWDC-4 s NRRL(#B-21260N), sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č.: 5.

MzProtox-2, ve vektoru pBluescript SK byl uložen 20. 5. 1994 jako pWDC-3 sNRRL(#B21259), sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č.: 7.

Protox-3, ve vektoru pFL61 byl uložen 10. 7. 1994 jako pWDC-5 s (NRRL#B-21280).

PMzC-1 Val, ve vektoru pBluescript SK byl uložen 30. 9. 1994 jako pWDC-8 pod přístupovým označením NRRL#21340.

PAraC-2Cys ve vektoru pFL61 byl uložen 14. 11. 1994 jako pWDC-7 pod přístupovým označením NRRL#2133 9N.

Příklady provedení vynálezu

Standardní metody DNK rekombinace a molekulárního klonování, zde používané, jsou dobře známy v oboru a jsou popsány v T. Maniatis, E. F. Fritsch a J. Sambrook, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982) a T. J. Šilhavý, M. L. Berman a L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).

Příklad 1

Izolace Arabidopsis cDNK kódující protox geny funkční komplementací E. coli mutantu.

Byla získána a amplifíkována cDNK knihovna v plazmidovém vektoru pFL61 (Minet et al., Plant J. 2:417-422 (1992)) v Arabidopsis thaliana (Landsberg). Druhá Arabidopsis (Colombia cDNK knihovna ve vektoru UniZap lambda (Stratagene) byla získána a amplifíkována jako pBluescript plazmidy pomocí in vivo excize fágového materiálu. E. coli hemG mutant SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)) byl získán a udržován na L médiu obsahující 20 mg/ml

-20CZ 296023 B6 hematinu (United States Biochemicals). Plazmidové knihovny byly transformovány do SASX38 elektroporací za použití přístroje Bio-Rad Gene Pulser za podmínek doporučených výrobcem. Buňky byly naneseny na L agar obsahující lOOmg/ml ampicilinu . v hustotě přibližně 500 000 transformantů/10 cm plotny. Buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu 40 hodin v šeru a byly selektovány pro schopnost růst bez přítomnosti exogenního hernu. Hemové prototrofy byly získány z FL61 knihovny v hustotě 400/10⁷ a zpBluescript knihovny v hustotě 2/10⁷. Plazmidová DNK byla izolována ze 24 kolonií za účelem sekvenční analýzy. Každá z těchto 24 DNK byla retransformována do SASX38 za účelem potvrzení schopnosti komplementovat.

Sekvenční analýza odhalila dvě třídy putativních protox klonů. Devět z nich bylo označeno „Protox-1“. Každý byl odvozen ze stejného genu a dva byly klony plné délky. CDNK je velká 1719 bp a kóduje protein o molekulární váze 57,7 kDa. N-konec peptidové sekvence má rysy charakteristické pro chloroplastový tranzitní peptid o velikosti 60-ti aminokyselin. Databázový průzkum za použití GAP programu (devaraux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1984) odhalil homologii s B. subtilis hemY (protox) proteinem (Hansson an Hederstedt 1992, Dailey et al., J. Biol. Chem. 269:813 (1994)). Tyto dva proteiny jsou z 53 % podobný a 31 % identický s oblastmi vysoké homologie, obsahující navrženou dinukleotidovou vazebnou oblast hemY proteinu (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269:813 (1994)).

Dalších 15 cDNK klonů bylo označeno „Protox-2“. Tyto klony také vznikly z jednoho genu. cDNK o plné délky má 1738 bp a kóduje protein o molekulární váze 55,6 kDa. N-konec je trochu podobný mitochondriálnímu transitnímu peptidů. Protein Protox-2 je částečně homologní s Protox-1 (53% podobnost, 28% identity) a s protox z B. subtilis (50% podobnost a 27% identity).

Protox-1 ve vektoru pBluescript SK byl uložen 5. 4. 1994 jako pWDC-2 (NRRL#B-21238).

Protox-2 ve vektoru pFL61 byl uložen 5.4. 1994 jako pWDC-1 (NRRL#B-21237).

Arabidopsis cDNK kódující protox-1 obsažený v pWDC-2 a protox-2 obsažený v pWDC-1 jsou uvedeny v SEQ ID č.: 1 a 3.

Příklad 2

Izolace kukuřičných cDNK kódujících protox geny funkční komplementací mutantu E. coli.

Zea Mays (B73 inbrední) cDNK knihovna ve vektoru lambda UniZap byla získána od firmy Stratagene a konvertována na pBluescript knihovnu pomocí in vivo excize. Další kukuřičná cDNK knihovna ve vektoru UniZap byla získána od firmy Clontech a podobně byla konvertována do pBluescript plazmidů. Selekce funkčních kukuřičných protox genů byla právě popsána pro případ Arabidopsis knihovny v příkladu 1.

Byly izolovány dva hemové prototrofy z knihovny od Stratagene v množství 10⁷ transformantů, dále byly rekomplentovány a sekvenovány. Tyto cDNK byly identické a potvrdila se homologie s Arabidopsis Protox-1. Tento kukuřičný klon označený MzProtox-1 není kompletní. cDNK má 1698 bp a kóduje pouze putativní zralý protox enzym; cDNK nemá sekvenci tranzitního peptidů a nemá ani iniciační methionininový kodon. Gen je ze 68 % identický jako Arab Protox-1 na úrovni nukleotidů a ze 78 % identický (87% podobnost) na úrovni aminokyselin (uvedeno vTab. 1).

Jeden hemový prototrof byl získán z knihovny od firmy Clontech v množství 10⁷ transformantů, byl dále rekomplementován a sekvenován. cDNK se jeví být kompletní, má 2061 bp a kóduje protein o molekulární váze 59kDa. Tento klon je kukuřičný homolog Arabidopsis Protox-2 a je označen MzProtox-2. Gen je z 58 % identický jako Arab Protox-2 na úrovni nukleotidů a z 58 %

-21 CZ 296023 B6 identický (76% podobnost) na úrovni aminokyselin (uvedeno v Tab.2). Kukuřičný klon má sekvence N-konce o 30 aminokyselin delší ve srovnání s Arabidopsis klonem. Stejně jako u Arabidopsis klonů, homologie mezí dvěma kukuřičnými protox geny je poměrně nízká; dvě protinové sekvence jsou z 31 % identické.

MzProtox-1 ve vektoru pBluescript SK byl uložený 20. 5. 1994 jako pWDC-4 sNRRL(#B21260), sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č.: 5.

MzProtox-1, ve vektoru pBluescript SK byl znovu uložen 11. 7. 1994 jako pWDC-4 ío s NRRL(#B-21260N), sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č.: 5.

Příklad 3

Izolace dalších protox genů založená na sekvenční homologii známých protox kódujících sekvencí.

Fágová nebo plazmidová knihovna je nanesena na plotnu vdensitě přibližně 10 000 plaků na 10 cm Petriho misky. Filtrační membrána s plaky je kultivován a přes noc při teplotě 37 °C. Filtrační membrána splaky je pak hybridizo vána s jednou z cDNK, které jsou uvedeny v SEQ ID č.: 1,3,5 nebo 7. Sonda je značená 32P-dCTP pomocí metody „random priming“ a PrimeTime kitu 25 (Intemational Biotechnologies, lne., New Haven, CT). Podmínky hybridizace jsou 7% sodium dodecyl sulfát (SDS), 0,5 M NaPO₄ pH 7,0, lmM EDTA, teplota 50 °C. Hybridizace trvá přibližně přes noc, pak je filtr promyt 2X SSC, 1% SDS. Pozitivně hybridizující plaky jsou detekovány autoradiografií. Byl získán jeden plak, z něhož byly izolovány cDNK inzerty. Sekvence těchto inzertů byly určeny pomocí metody řetězové terminace za použití dideoxy terminátorů 30 značených fluorescenčním barvivém (Applied Biosystems, lne., Foster City, CA).

Tento standardní protokol může být použit odborníkům pro získání protox genů, sekvenčně homologních se známými protox sekvencemi, z dalších eukaryontů, zvláště pak z vyšších rostlin.

Odvozené sekvence aminokyselin proteinu, který je kódován sekvencemi ukázanými v SEQ ID č.: 2 a 6 jsou uvedeny v Tab. 1. Odvozené sekvence aminokyselin proteinu, který je kódován sekvencemi ukázanými v SEQ ID č.: 4 a 8 jsou uvedeny v Tab. 2.

Tabulka 1

Srovnání Protox-1 sekvencí aminokyselin Arabidopsis (SEQ ID č.: 2) a kukuřice (SEQ IDč.: 6) procento podobnosti: 87,13 procento identity: 78,008

Protox-1 .Pep x Mzprotox-1 .Pep

Identická rezidua jsou znázorněny vertikálními čarami, které spojují sekvence. Sekvence jsou uvedeny pomocí programu GAP, který je popsán vDeveraux et al., Nucleic Acids Res. 12:387-395 (1984).

-22CZ 296023 B6

GGTTITTDCVIVGGGISGLCIAQALATKHPDAAPNLIVTEAKDRVGGNII 100 ..ΙΙΗΙΙΙΙΙΙΜΙ.ΙΙΗΙΙ:) I I I I : . 1 . | | | | .

....NSADCVVVGGGISGLCTAQALATRH..GVGDVLVTEARARPGGNIT 44

101 T. .REENGFLWEEGPNSFQPSDPMjLTMWDSGLKDDLVLGDPTAPRFVLW 148 I I·I:1:11I1IIII1IIIII:III -1 I I 1 i i I I I I : 111.1 I 11 11 I

TVERPEEGYLWEEGPNSFQPSDPVLTMAVDSGLKDDLVFGDPNAPRFVLW 94

149 NGKLRPVPSKLTDLPFFDLMSIGGKIRAGFGALGIRPSPPGREESVEEFV 198 :111111111 . I I I 1 I I I I I I . I I : I I I : Η I ! I 1 I - I I I I I I I I I I 1 I

EGKLRPVPSKPADLPFFDLMSIPGKLRAGLGALGIRPPPPGREESVEEFV 144

199 RRNLGDEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWKLEQNGGSIIGG 248 I I I I I · 1 I I 1 I I I I I I I I II1II11IIIII11 i I I I I I : 1 1 I I 1 I I I 1

145 RRNLGAlEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWRLEETGGSIIGG 194

249 TFKAIQERKNAPKAERDPRLPKPQGQTVGSFRKGLRMLPEAISARLGSKV 298 I:I>IIII ... II:·I i:II1II - I II I : I I II 1 I I I I; I I ... I I I I |

195 TIKTIQERSKNPKPPRDARLPKPKGQTVASFRKGLAMLPNAITSSLGSKV 244

99 ΚΙδΜΚΙδΘΧΤΚΕΕδσσϊΝΙ,ΤΥΕΤΡΟΟίνενβεκεννΜΤνΡΕΗνΑΒΟΕΙΡΡ 348 111111.:111 :. II 1 · I i I I : 1 :1 I I I . I 1 I : I I : II . I I I . : I I I

245 KLSWKLTSITKSDDKGYVLEYETPEGWSVQAKSVIMTIPSYVASNILRP 294

349 LSESAANALSKLYYPPVAAVSISYPKEAIRTECLIDGELKGFGQLHPRTQ 398 I I .. I I : I I I :: I I I I I II 1 ·: I I I I I I I I . I I I I I I I I . I I I I II|1.|

295 LSSDAADALSRFYYPPVAAVTVSYPKEAIRKECLIDGELQGFGQLHPRSQ 344

399 GVETLGTIYSSSLFPNRAPPGRILLLNYIGGSTNTGILSKSEGELVEAVD 448 IIII1111III11IIIIIIIl:IIII I I II . I I I I I: II. I: I I U I 11

345 GVETLGTIYSSSLFPNRAPDGRVLLLNYIGGATNTGIVSKTESELVEAVD 394

449 RDLRKMLIKPNSTDPLKLGVRVWPQAIPQFLVGHFDILDTAKSSLTSSGY 498 llllllll.....Hl I I I I I I I I I I I I I 11 I I : I : I : · 1 I .. I ..: 11

395 RDLRKMLINSTAVDPLVLGVRVWPQAIPQFLVGHLDLLEAAKAALDRGGY 444

499 EGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYETAIEVNNFMSRYAYK* 538 : 1 I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I I . í : : . : I : . : I Η I I

445 DGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYESASQISDFLTKYAYK* 484

Tabulka 2

Srovnáni Protox-2 sekvencí aminokyselin Arabidopsis (SEQ ID č.: 4) a kukuřice (SEQ ID č.: 8) procento podobnosti: 75,889 ío procento identity: 57,905

Protox-2.Pep x Mzprotox-2.Pep

-23CZ 296023 B6

............-...............MASGAVAD . HQ1EAVSGKRVAV 21 •I |:|: .: 1-.::.1 ||

MLALTASASSASSHPYRHASAHTRRPRLRAVLAMAGSDDPRAAPARSVAV 50

VGAGVSGLAAAYKLKSRGLNVTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT 71 I 1 I I I I I I I I 1 I : I : - i : I I I I I I I . : 1 - I I I : I . :.1::(111111

VGAGVSGLAAAYRLRQSGVNVTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDEGANT 100

MTEAEPEVGSLLDDLGLREKQQFPISQKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121 111:1 1-:.1:11111.:111:1 II.IIIII: : 1 . I . : : I .: | .

101 MTEGEWEASRLIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPALIPSDPISLMK 150

122 SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK....KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167 I I I I I I . I I : ·: : : I I I I : I I . I : 1 1 I : . .111:.1 :||||.|

151 SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGRE 200

168 WDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGArRTKFA 217 I I I I : : I I I I : I I I I : I I : I I I : : 1 . I I . I I I : I : . : I I : I I I I I . I : |

201 VVDYFVDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA 250

218 AKGGKSRDTKSSPGTKKGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSHDEINLDSK 267 lil:· : · ..(.1.::..1.1(11.1111 1 : . I ..::.(::.1:..

251 AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALHNEVGDDNVKLGTE 300

268 VLSLS..YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ...NPHYDAVIMTAPLCNVK 312 lili. :: : · . :. I I : I . I : I . : I 1 I 1 I I I I I : | 1 :

301 VLSLACTFDGVPALGRWSISVDSKDSGDKDLASNQTFDAVIMTAPLSNVR 350

313 EMKVMKGGQPFQLNFLPEINYMPLSVLITTFTKEKVKRPLEGFGVLIPSK 362 I I - I I I . I · I : I 11 . ::I:III:::I.I - I:. |I:Η II Η I I | | |

351 RMKFTKGGAPVVLDFLPKMDYLPLSLMVTAFKKDDVKKPLEGFGVLIPYK 400

363 E.QKHGFKTLGTLFSSMMFPDRSPSDVHLYTTFXGGSRNQELAKASTDEL 411 I I I I I : I I I I I I I I I I I I I I I 1 I . Η I I I : I I I : I . : | | | . | . 1

401 EQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPDDQYLYTTFVGGSHNRDLAGAPTSIL 450

412 KQVVTSDLQRLLGVEGEPVSVNHYYWRKAFPLYDSSYDSVMEAIDKMEND 461 I I:III II.:1IIIII:I. I - I II .11111: . I . I I: I I I: I I I . :

451 KQLVTSDLKKLLGVEGQPTFVKHVYWGNAFPLYGHDYSŠVLEAIEKMEKN 500

462 LPGFFYAGNHRGGLSVGKSIASGCKAADLVISYLESCSNDKKPNDSL* 509

IIIIIIII1 ::11.11. 1111:11111.111111 ......:

501 LPGFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAADLAISYLESHTKHNNSH*... 545

Příklad 4

Izolace kontaminujícího kvasinkového protox klonu z Arabidopsis cDNK knihovny.

Za účelem identifikace řídce se vyskytující cDNK s protox aktivitou proběhlo druhé testování

Arabidopsis knihovny ve vektoru pFL61. Výsledkem byly opět stovky komplementujících klonů, ío Přibližně 600 jich bylo jednotlivě inokulováno na mřížkované plotny a ty byly kultivovány při teplotě 28 °C po dobu 18 hod. Byla připravena kopie této plotny na kolonie/plaky testovací membránu (NEN) podle instrukcí výrobce. Protox-1 a Protox-2 cDNK byly vystřiženy z jejich vektorů štěpením endonukleázami EcoRI/Xhol a Notl. Inzerty byly separovány elektroforézou na 1% SeaPlaque GTG (FMC) agaróze, excizovány a značeny ³²P metodou „random priming“ (Life

-24CZ 296023 B6

Technologies). Jedna sada testovacích membrán byla hybridizována s každou sondou. Byly dodrženy podmínky hybridizace a promývání jak je popisují Church a Gilbert, 1984.

Kolonie (~20), které neprokázaly jasnou hybridizaci s Protox-1 nebo Protox-2 byly pomnoženy v kapalném médiu a byla z nich izolována plazmidová DNK. DNK byly štěpeny restriktázou Notl, duplikátní vzorky byly naneseny do 1% agarózového gelu a pak byly přeneseny na Gene Screen Plus (NEN) membránu (New England Nuclear). Sondy dvou známých protox genů byly označeny a použity k hybridizaci, jak již bylo popsáno. Byly nalezeny dva identické klony, které neodpovídaly Protox-1 ani Protox-2. Bylo ukázáno, že tento klon rekomplementuje SASX38 mutanta, ačkoliv roste velmi pomalu, byl označen Protox-3.

Protox-3 ve vektoru pFL61 byl uložen 8. 6. 1994 jako pWDC-5 (NRRL#B-21280). Zjistilo se, že tato kódující sekvence je odvozena z kvasinkové DNK, která byla přítomna jako hlavní kontaminant v Arabidopsis cDNK knihovně. Kvasinková DNK kódující protox-3 obsažená v pWDC-5 je uvedena v SEQ ID č.: 9.

Příklad 5

Demonstrace citlivosti klonu rostlinného protoxu k protox inhibujícímu herbicidu v bakteriálním systému.

Kultury Protox-1/SASX38, Protox-2/SASX38 a pBluescript/XLl-Blue byly kultivovány v L médiu za přítomnosti amp¹⁰⁰. 100 μΐ každé kultury bylo naneseno na plotnu na L amp¹⁰⁰médium, obsahující různé koncentrace (1,0 nM až 10 mM) protox inhibujícího aryluracilového herbicidu (vzorec XVII). Duplikátní sada ploten byla inkubována při teplotě 37 °C po dobu 18 hod. v šeru nebo v úplné tmě.

Protox⁺ E. coli kmen XLl-Blue není citlivý k herbicidu v libovolné koncentraci, což souvisí s referovanou rezistencí přirozeného bakteriálního enzymu na podobné herbicidy. Protox-1/SASX38 byl jasně citlivý, došlo k skoro úplné eliminaci porostu bakterií inhibitorem v koncentraci již 10 nM. Protox-2/SASX38 byl také citlivý, ale pouze při vyšších koncentracích (10M) herbicidu. Účinek herbicidu na oba kmeny s rostlinným protoxem byl výraznější při kultivaci v šeru, zjevný však byl i v případě, kdy plotny byly drženy v úplné tmě. Toxicita herbicidu byla úplně eliminována přidáním hematinu v koncentraci 20 mg/ml.

Rozdílná tolerance dvou kmenů s rostlinným protoxem je způsobena spíše různě silnou expresí uvedených plazmidů než rozdílnou citlivostí enzymu. Protox-1/SASX38 roste daleko pomaleji než Protox-2/SASX38 v libovolném médiu bez přítomnosti hernu. Navíc, kmen MzProtox2/SASX38 s růstovou rychlostí srovnatelnou s Arab Protox-1/SASX38, je také velmi citlivý na herbicid už v koncentračním rozmezí 10-100 nM. Počáteční charakterizace kvasinkového Protox-3 klonu indikuje, že klon je také citlivý na herbicid.

Příklad 6

Selekce rostlinných protox genů rezistentních na protox inhibující herbicidy v E. coli expresivním systému.

Inhibice rostlinných protox enzymů v bakteriálním systému je použitelná na testování na herbicid rezistentních mutací v rostlinných genech ve velkém měřítku. Počáteční na dávku odpovídající pokusy, provedené nanesením kapalné kultury na plotnu, daly vznik rezistentním koloniím, které se objevují ve vysoké frekvenci dokonce i při vysokých koncentracích herbicidu. Tato rezistence není odvozena z plazmidů, je založena na retransformaci/test citlivosti na herbicid. Tento pro

-25CZ 296023 B6 biem se dá prakticky obejít transformací protox plazmidů do SASX38 mutantu a jeho přímým nanesením na plotnu, která obsahuje herbicid.

Rostlinné protox plazmidy jsou mutagenizovány různými způsoby. Například použitím publikovaných postupů pro chemikálie (např. sodium bisulfit (Shortle et al., Methods Enzymol. 100:457-468 (1983); methoxylamin (Kadonaga et al., Nucleic Acids Res. 13:1733-1745 (1985); na oligonukleotidy směrovaná saturační mutageneze (Hutchinson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83:710-714 (1986) nebo různé strategie chybné polymerázové inkorporace (např. Shortle et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79:1588-1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64:313-319 (1988); a Leung et al., Technique 1:11-15 (1989)). Očekávané „up-promotor“ mutanty, vzniklé při mutagenezi celého plazmidu, jsou eliminovány reklonováním kódující sekvence do vektoru divokého typu a jeho testováním. Výsledkem je pravděpodobná vyšší exprese, což vede k lepšímu růstu v nepřítomnosti herbicidu. Je také možné vizuální rozpoznání mutantů nesoucích kódující sekvence.

Libovolný rostlinný protox gen exprimující rezistenci na herbicid v bakteriálním systému může být manipulován za účelem optimální exprese a může být transformován do rostlin za použití standardních metod, jak je zde popsáno. Výsledné rostliny mohu pak být ošetřeny herbicidem za účelem potvrzení a kvantifikace úrovně rezistence, která byla vnesena pomocí protox genu.

Příklad 7

Konstrukce za účelem exprese na herbicid rezistentních mikrobiálních protox genu(ů) v rostlinách.

Kódující sekvence hemY protox genu z B. subtilis (Hansson an Hederstedt 1992, Deiley et al., J. Biol. Chem. 269:813 (1994)) a hemG protox genu zE. coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) byly izolovány z laboratorních kmenů pomocí PCR amplifikace za standardních podmínek. Primery byly navrženy podle publikovaných dat. Tyto geny jsou známy, že kódují na herbicid rezistentní formy protox enzymu.

Použitím standardních metod překrývající se PCR fúze (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, lne. (1994)), oba bakteriální geny byly fúzovány s dvěmi rozdílnými chloroplastovými sekvencemi tranzitního peptidu (CTP) z Arabidopsis. První byl CTP ze syntetázy acetohydroxylové kyseliny (AHAS, Mazur et al., Plant Physiol. 85:1110 (1987)), který umožňuje import do stroma chloroplastu. Druhý byl gen plastocyaninu z Arabidopsis (Vorst et al., Gene 65:59 (1988)), který kóduje bipartitní tranzitní peptid. Oblast N-konce tohoto CTP směruje proteiny do chloroplastu, zatímco C-konec do thylakoidové membrány. Všechny čtyři fúze byly klonovány za 2X35S protmotor do binárního expresivního vektoru, který byl navržen pro produkci transgenických rostlin transformací za pomoci agrobacterium.

Následující protox cDNK z Arabidopsis a kukuřice, chloroplastový tranzitní peptid zProtox-1 nebo MzProtox-1 mohou být také fúzovány ke dvěma bakteriálním protox proteinům stejným způsobem jak je výše uvedeno.

Vektory shora popsané mohou pak být transformovány do žádaných rostlinných druhů a výsledné transformanty jsou testovány, zda byla zvýšena jejich rezistence na herbicid.

-26CZ 296023 B6

Příklad 8

Oblast umožňující přepínání mezi Arabidopsis/B. subtilis geny, za účelem produkce chimérického, na herbicid rezistentního protoxu.

Jeden z přístupů jak vytvořit protox gen, který je rezistentní na herbicid a zároveň v rostlině vykazuje účinnou protox enzymatickou aktivitu, je fúze části(í) bakteriálního a rostlinného genu. Z výsledných chimérických genů jsou pak vybrány ty, které jsou schopny v rostlině poskytnout na herbicid rezistentní protox aktivitu. Například Protox peptidové sekvence z Arabidopsis a B. subtilis (hemY) jsou významně kolineární s oblastí vysoké homologie. Sekvence kódující hemY byla klonována do pBluescript a byla testována její schopnost exprimovat na herbicid rezistentní protox aktivitu v SASX38. Chimérické geny Protox-1/hemY jsou konstruovány za použití fúzní PCR metody, pak následuje jejich ligace zpět do vektoru pBluescript. Přechod je přibližně uprostřed proteinů. Komplementací je testována protox funkce těchto fúzí. Jejich kultivací za přítomnosti herbicidu, kde intaktní Protox-1 a hemY slouží jako kontroly, je testována jejich rezistence na herbicid.

Příklad 9

Produkce k herbicidu tolerantních rostlin pomocí nadměrné exprese rostlinných protox genů.

Za účelem exprese proteinu Arabidopsis nebo kukuřice v transgenických rostlinách, příslušná cDNK v plné délce byla vložena do rostlinného expresivního vektoru pCGN1761ENX, který byl odvozen z pCGN1761, popis následuje. pCGN1761 byl štěpen v jeho jediném EcoRI restrikčním místě, a lígován do fragmentu dvouřetězové DNK, který zahrnuje dva oligonukleotidy o sekvenci 5ΆΑΤ TAT GAC GTA ACG TAG GAA TTA GCG GCCC GCT CTC GAG T 3' (SEQ ID č.:l 1) a 5'AAT TAC TCG AGA GCG GCC GCG AAT TCC TAC GTT ACG TCA T 3' (SEQ ID č.:12). Výsledný plazmid pCGN1761ENX obsahuje jediná restrikční místa EcoRI, Notl, a Xhol, která leží mezi zdvojeným 35S promotorem, který pochází z květákového mozaikového viru (Kay et al., Science 236:1299-1302 (1987)), a 3'-koncem nepřekládaných sekvencí tmi genu Agrobacterium tumefaciens. Tento plazmid je štěpen a ligován do fragmentu obsahujícího kompletní protox cDNK, který je výsledkem restrikčního štěpení plazmidů nesoucích protox cDNK. Z tohoto plazmidu je vystřižen Xbal fragment, který obsahuje Arabidopsis protox cDNK, jenž je lemována zdvojeným 35S promotorem a 3'-koncem nepřekládaných sekvencí tmi genu z A. tumefaciens. Tento Xbal fragment je vložen do binárního vektoru pCIB200, do jeho Xbal restrikčního místa, které leží mezi T-DNK hraničními sekvencemi. Výsledný plazmid označený pCIB200protox je transformován do kmene A. tumefaciens CIB542. (např. Uknes et al., Plant Cell 5:159-169 (1993).

Listové disky rostliny Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc jsou infikovány kmenem A. tumefaciens CIB542, který nese pCIB200IGPD jak popsal Horsh et al., Science 227:1229 (1985). Výhonky rezistentní na kanamycin z 15-ti nezávislých listových disků byly přeneseny do kořenového média, pak přesazeny do půdy a vzniklé rostliny byly dále pěstovány ve skleníku do stádia zralosti. Semena těchto rostlin byla shromážděna a nechala se vyklíčit na MS agarovém médiu, které obsahovalo kanamycin. Z každého nezávislého primárního transformanta bylo, ve skleníku, pěstováno více jednotlivých, na kanamycin rezistentních, semenáčů do jejich stádia zralosti a pak byly shromážděny jejich semena. Tato semena byla naklíčena na MS agaru, jenž obsahoval kanamycin.

Rostlinné linie, které daly vznik semenáčům s kanamycinovou rezistencí, jsou homozygotní z hlediska vloženého genu a staly se předmětem dalšího zkoumání. Děrovačkou papíru byly nastříhány listové disky každé z 15-ti nezávislých transgenických linií a byly umístěny na MS agar, který obsahuje různé vzrůstající koncentrace protox inhibujícího herbicidu.

-27CZ 296023 B6

Po třech týdnech dvě sady 10-ti disků z každé linie byly váženy. Transgenické linie, které jsou více rezistentní k inhibitoru než netransformované rostliny divokého typu byly selektovány k další analýze.

Z každé této linie byla extrahována RNK z listů. Celková RNK z každé nezávislé homozygotní linie a z netransgenických rostlin, která je užívána jako kontrola, byla separována elektroforézou na agarózovém gelu s formaldehydem (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York (1987)). Gel byl blotován na nylonovou membránu (Ausubel et al., supra.) a hybridizován s radioaktivně značenou protox cDNK z Arabidopsis. Hybridizační a promývací podmínky byly stejné jako popisuje Church and Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:1991-1995 (1984). Membrána je hodnocena autoradiografem a intenzitní RNK pruhy odpovídající protox transgenům byly detekovány ve všech k herbicidu tolerantních transgenických rostlinných liniích.

Aby bylo možné dále určit sílu rezistence linie s nadměrnou expresí protoxu, rostliny pěstované ve skleníku byly ošetřeny různými koncentrovanými protox inhibujícím herbicidem.

Příklad 10

Růst suspenzní kultury tabákových buněk.

Média:

MX1: Toto médium se skládá z Murashigeových a Skoogových („MS“, T. Murashige et al., Physiol. Plant. 15:473-497, 1962) hlavních solí, vedlejších solí a Fe-EDTA (Gibco #500-1117; 4,3 g/1), 100 mg/1 myo-inositol, 1 mg/1 kyseliny nikotinové, 1 mg/1 pyridoxinu-HCl, 10 mg/1 thiaminu-HCl, 2-3 g/1 sacharózy, 0,4 mg/1 kyseliny 2,4-dichlorofenoxyoctové a 0,04 mg/1 kinetinu, pH 5,8. Médium je sterilizováno autoklávováním.

N6: Toto médium obsahuje makroelementy, mikroelementy a Fe-EDTA jak popisuje C-C.Chu et al., Scientia Sinica 18:659 (1975), a následující organické sloučeniny: pyridoxin-HCl (0,5 mg/1, thiamin-HCl (0,1 mg/1), kyselinu nikotinovou (0,5 mg/1), glycin (2,0 mg/1) a sacharózu (30,0 g/1). Roztok je autoklávován. Konečné pH je 5,6.

Poznámka: Makroelementy jsou připraveny jako lOx koncentrovaný zásobní roztok a mikroelementy jako lOOx koncentrovaný zásobní roztok. Zásobní roztok vitaminů je připraven lOOx koncentrovaný.

Suspenze buněk Nicotiana tabacum linie S3 (Harms and DiMaio, J. Plant. Physiol. 137:513-519, (1991)) jsou kultivovány v kapalném médiu MX1. Erlenmeyerovy lahve o objemu lOOml, obsahující 25 ml média MX1, byly inokulovány 10 ml sedmidenní kultury buněk. Buňky byly kultivovány při teplotě 25 °C, ve tmě na orbitální míchačce při 100 rpm (s výkyvem 2 cm). Buňky jsou subkultivovány v sedmi denních intervalech inokulaci alikvotních vzorků do čerstvého média, což je provedeno následovně: asi 90 % buněčné suspenze je slito nebo odpipetováno a doplněno čerstvým médiem do žádaného objemu suspenze. Za 10 dní z 250-350 mg buněk inokula naroste 5-8 gramů čerstvé buněčné biomasy.

Příklad 11

Produkce tabákové buněčné kultury, která toleruje herbicidní protox inhibitory, kultivací buněk na pevném selekčním médiu.

-28CZ 296023 B6

Buňky jsou předkultivovány, jak je uvedeno v příkladu 10. Buňky jsou od média odděleny sedimentací a následnou centrifugám' při 500 x g. Buňky jsou pak ředěny čerstvým médiem, aby se dosáhlo vhodné hustoty pro nanesení na plotny, což je okolo 10 000 jednotek tvořících kolonie na ml (CFU/ml). Buňky v malém objemu média (přibližně 1 ml) jsou rozetřeny na povrch pevného média (MX1, 0,8% agar), které obsahuje požadovanou koncentraci inhibitoru. Na jednu Petriho misku je použito 20 až 30 ml média. Vhodná koncentrace je určena z křivky, která znázorňuje odezvu na jednotlivé dávky inhibitoru (příklad 14), a je nejméně dvakrát vyšší než je hodnota IC₅₀ pro citlivé buňky divokého typu.

Plotny z buňkami na selekčním médiu jsou inkubovány za normálních růstových podmínek při 25 až 28 °C, ve tmě až do doby, kdy se vytvoří kolonie. Vybrané buněčné kolonie jsou přeneseny do čerstvého média, které obsahuje žádanou koncentraci inhibitoru.

U preferované modifikaci popsané metody je nejprve rozetřen malý objem předkultivované suspenze buněk v tekutém médiu na povrch pevného média. Na plotnu je přidán stejný objem teplého tekutého média (1,2 až 1,6% agar), který je držen v tekutém stavu při teplotě 40 °C, pohybem plotny dojde k promíchání buněk s médiem a k rozptýlení buněk po celé ploše plotny, před tím, než médium ztuhne.

V jiném případě mohou být buňky smíchány s roztaveným agarem před nanesením na povrch selekčního média. Tato metoda má výhodu, že buňky jsou uloženy a imobilizovány v tenké vrstvě tuhnoucího média na povrchu selekčního média. Tento způsob umožňuje lepší aeraci buněk ve srovnání s buňkami, které jsou přidány do celého objemu média, což je 20 až 30 ml.

Příklad 12

Produkce tabákové buněčné kultury, která toleruje herbicidní protox inhibitory, kultivací buněk v tekutém selekčním médiu.

Buňky, které jsou kultivovány stejným způsobem, jak je uvedeno v příkladu 10, jsou vneseny ve vhodné hustotě do média MX1, jenž obsahuje požadovanou koncentraci herbicidního protox inhibitoru. Buňky rostou za stejných podmínek, jak je popsáno v příkladu 10. Buňky jsou po 7 až 10-ti dnech subkultivovány, což závisí na rychlosti růstu, v čerstvém médiu, které obsahuje příslušnou koncentraci inhibitoru.

Buňky rostou pravděpodobně pomaleji v závislosti na koncentraci inhibitoru, než buňky rostoucí v médiu bez inhibitoru.

Příklad 13

Produkce tabákových buněk se zvýšenou hladinou protox enzymu.

Za účelem získání buněčné kultury nebo kalusu se zvýšenou hladinou protox enzymu, suspenze buněk nebo kalusu je přenášena do médií s postupně se zvyšující koncentrací herbicidního protox inhibitoru. Zvláště následující krok je důležitý.

Kolonie buněk selektované z těch, které vyrostly na plotnách, jak je popsáno v příkladu 11, jsou přeneseny do MX1 média, jenž obsahuje stejnou koncentraci protox inhibitoru, jako je užívána v příkladu 11 k vytvoření suspenzní kultury. V jiném případě vybrané kultury buněčných suspenzí z příkladu 12, jsou subkultivovány v kapalném médiu MX1, které obsahuje stejnou koncentraci protox inhibitoru, jako je užívána k selekci podle příkladu 12.

-29CZ 296023 B6

Kultury jsou subkultivovány až 20x v týdenních intervalech v MX1 médiu, které obsahuje vždy vyšší koncentraci herbicidu. Buňky jsou kultivovány až v 10-ti subkulturách v médiu, které obsahuje danou vyšší koncentraci herbicidu. Pak jsou přeneseny do MX1 média, jenž obsahuje další vyšší koncentraci herbicidu.

V jiném případě kousky selektovaného kalusu z příkladu 11 jsou přeneseny do tuhnoucího MX1 média, které obsahuje požadovanou koncentraci herbicidu. Následuje přenos do média s vyšší koncentrací herbicidu, stejně jak je uvedeno v předchozím odstavci, s výjimkou, že se používá pevné médium.

Příklad 14

Měření růstu buněk v suspenzní kultuře v závislosti na dávce herbicidu.

Za účelem získání křivky závislosti růstu na dávce herbicidu, je určován růst buněk při různých koncentracích herbicidu. V suspenzi kultivované buňky tabáku S3 divokého typu, citlivé na herbicidní protox inhibitor, a buňky selektované pro toleranci na herbicid nebo transgenické buňky jsou po dobu 2-4 dny ve vysoké hustotě předkultivovány v kapalném médiu stejným způsobem jako v příkladu 11. Použité médium je odstraněno, buňky jsou promyty a je přidáno čerstvé médium bez herbicidu, v takovém množství, aby byla dosažena požadovaná hustota buněk (okolo 150 mg FW buněk na ml suspenze). 2,5 ml buněčné suspenze, obsahující přibližně 250-300 mg FW buněk, je pak inokulováno do přibližně 30 ml kapalného média s požadovanou koncentrací herbicidu, které je obsažené ve 100 ml Erlenmeyerových lahvích. Je důležité každou láhev inokulovat stejným množstvím buněk. Je inokulováno 3 až 6 lahví pro jednu koncentraci herbicidu. Koncentrace herbicidu se pohybuje v rozmezí 0 (=kontrola), 0,1 ppb, 0,3 ppb, 1 ppb, 3 ppb, 10 ppb, 30 ppb, 100 ppb, 300 ppb, 1 000 ppb, 3 000 ppb a 10 000 ppb. Několik vzorků inokulované kultury je odebráno v čase inokulace k určení biomasy buněk v inokulované láhvi.

Buňky jsou pak inkubovány při teplotě 28 °C, ve tmě, po dobu 10-ti dnů. Buňky jsou separovány vakuovou filtrací a vážením je určena biomasa buněk. Vážením po usušení lze získat hodnotu suché biomasy.

Růst buněk je určen jako výtěžek z 10-ti denní kultivace a je vyjádřen jako procento vztažené k růstu buněk v médiu bez herbicidu podle vzorce: (konečná biomasa buněk rostlých za přítomnosti herbicidu minus biomasa inokula krát 100 děleno celkovou biomasou buněk rostlých bez herbicidu minus biomasa inokula). Hodnoty IC₅₀ jsou určeny z grafu závislosti (relativní buněčná biomasa na koncentraci herbicidu). IC50 udává koncentraci herbicidu, při které růst buněk dosahuje 50 % hodnoty růstu kontrolního pokusu (buňky jsou kultivovány bez herbicidu).

U modifikované metody několik kousků kalusu, získaných z na rezistentní buněčné kultury způsobem stejným jako v příkladech 11 a 13, je přeneseno do tuhnoucího média vhodného pro kultivaci kalusu, která obsahuje různé koncentrace herbicidu. Relativní růst je určen po 2 až 6-ti týdenní kultivaci vážením kousků kalusu a porovnáním s růstem kontrolní kultury v médiu bez herbicidu. Metoda růstu v suspenzi je preferována pro svou přesnost.

Příklad 15

Určení křížové tolerance.

Za účelem určení rozsahu, ve kterém buňky vykazují toleranci k analogickým nebo jiným herbicidům, je podle příkladu 14 provedena kultivace buněk ve stoupající koncentraci vybraných herbicidů. Relativní růst buněk a jejich hodnota IC₅₀ je určena pro každý herbicid. Tyto hodnoty jsou pak porovnány.

-30CZ 296023 B6

Příklad 16

Určování stability k herbicidu tolerantního fenotypu.

Za účelem stanovení, zda na herbicid tolerantní fenotyp buněčné kultury je stabilní po určitý časový úsek, buňky jsou přeneseny z média obsahující herbicid do média bez herbicidu. Buňky jsou kultivovány jak popisuje příklad 10, v médiu bez herbicidu po dobu tří měsíců, subkultivací ve vhodných intervalech (7-10 dnů v případě suspenzní kultury: 3 až 6 týdnů v případě kultivace kalusu). Známé množství buněk je pak zpět přenesena do média, které obsahuje herbicid a kultivována po dobu 10-ti dnů (suspenzní kultury) nebo po dobu 4 týdnů (kultivace kalusu). Relativní růst je určen stejným způsobem jako v příkladu 14.

Příklad 17

Indukce a kultivace embryogenního kalusu z tkáně kukuřičného štítku.

až 14 dnů po opylení jsou sebrány klasy z samoopylujících se rostlin kukuřice inbrední linie Funk 2717. Po odstranění slupek jsou klasy sterilizovány po dobu 15 minut v 20% roztoku komerčního bělidla Chlorox s několika kapkami detergentů, který je přidán z důvodu lepšího smáčení. Klasy jsou pak několikrát omyty sterilní vodou. Všechny další kroky jsou prováděny asepticky v digestoři. Embrya o délce 1,5 až 2,5 mm jsou vyjmuta z jádra spatulou a jsou umístěna embryonální osou směrem dolů na MS médium, které obsahuje 2 mg/1 kyseliny 2,4-dichlorofenoxyoctové (2,4-D) a 3% sacharózu a je ztuženo 0,24% Gelrite®.

Po 2 až 4 týdenní kultivaci při teplotě 28 °C ve tmě se tvoří embryonální kalus na štítkových tkáních embryí. Kalus je vyjmut z axplantátu a je přenesen do čerstvého ztuženého MS média, které obsahuje 2 mg/1 2,4-D. Subkultivace je opakována v intervalu jednoho týdne. Jsou subkultivovány pouze ty části kalusu, které mají embryogenní morfologii.

Příklad 18

Selekce kultur buněk kukuřice, které jsou tolerantní kherbicidním protox inhibitorům.

a) Selekce použitím embryogenního kalusu: embryogenní kalus, jehož vznik je popsán v příkladu 17 je přenesen do média pro udržování kalusu, které se skládá z N6 média obsahující 2 mg/1 2,4-D 3% sacharózu a protox inhibitor o koncentraci, jenž je dostatečná k potlačení růstu, ale neovlivňuje embryogenezi kultury, a je ztužené 0,24% Gelrite®. Aby došlo ke zvýšení frekvence výskytu k herbicidu tolerantním mutantům, kultura může být před selekcí ošetřena chemickým mutagenem, například ethylmetan sulfonát nebo fyzikálním mutagenem, například UV světlem, v koncentraci, která je nižší než je ta, která inhibuje růst (příklad 14). Kultury jsou kultivovány při 28 °C ve tmě. Kalus po 14-ti denní kultivaci je přenesen do čerstvého média stejného složení. Subkultivovány jsou pouze kultury, které mají požadovanou embryogenní morfologii známou jako drobivý embryogenní kalus typu II. Kultury jsou pomnožovány subkultivací v týdenních intervalech ve dvou až deseti subkultivačních v čerstvém médiu. V tomto médiu jsou subkultivovány pouze nejrychleji rostoucí kultury. Rychle rostoucí kalus je pak přenesen do média pro jeho udržování, které obsahuje protox inhibující herbicid ve vhodné koncentraci jak je definováno v příkladu 11. V případě, že kalus dobře roste v přítomnosti herbicidu dané koncentrace, obvykle po pěti až deseti týdenních subkultivacích, kalus je přenesen do média, které obsahuje třikrát vyšší koncentraci inhibitoru a je subkultivován až do doby, kdy je získána dobře rostoucí kultura. Tento proces je opakován za použití média, které obsahuje protox inhibitor v koncentraci,

-31 CZ 296023 B6 jenž je desetkrát vyšší než je původní vhodná koncentrace a dále média obsahující 20x a 40x vyšší koncentrace.

Když je vyprodukován dostatečný kalus je přenesen na regenerační médium, které je vhodné pro dozrání embrya a regeneraci rostliny. Embryogenní kalus rostoucí v přítomnosti každé z použitých koncentrací herbicidu je přenesen do regeneračního média.

b) Selekce použitím embryogenních suspenzních kultur: Embryogenní suspenzní kultury imbrední linie kukuřice Funk 2717, která vznikla podle příkladu 24 a je udržována subkultivací v týdenních intervalech v čerstvém kapalném médiu N6, které obsahuje 2 mg/1 2,4-D. Aby došlo ke zvýšení frekvence výskytu k herbicidu tolerantním mutantům, kultura může být před selekcí ošetřena chemickým mutagenem, například ethylmetan sulfonát nebo fyzikálním mutagenem, například UV světlem, v koncentraci, která je nižší než je ta, která inhibuje růst (příklad 14). Kultuty jsou kultivovány na míchačce při 120 rpm při teplotě 28 °C ve tmě. Médium je vyměňováno v týdenních intervalech. Kultury jsou ředěny médiem podle jejich růstu. Snahou je udržet koncentraci buněk okolo 10 ml buněk na 50 ml média. Rychlost růstu každé subkultury je kontrolována a pouze rychle rostoucí kultury s požadovanou drolivou embryogenní morfologií se uchovává pro další subkulturu. Po dvou až deseti subkultivacích v médiu, jehož složkou je N6 médium, vzrůstá růstová rychlost nejméně dvakrát až třikrát během týdenní subkultivace. Kultury jsou pak přeneseny do N6 média, které obsahuje 2 mg/1 2,4-D a třikrát vyšší dávku inhibitoru než je původní. Rostoucí kultury jsou opakovaně subkultivovány v tomto médiu a vznikají dvě až deset subkultur, jak je výše popsáno. Pro další subkultivaci jsou vybrány rychle rostoucí kultury s požadovanou drolivou embryogenní morfologii. Tyto kultury jsou přeneseny do N6 média, které obsahuje 2 mg 2,4-D a desetkrát vyšší koncentraci inhibitoru než je původní. Postup subkultivace rostoucích kultur s požadovanou drobivou embryogenní morfologií je opakován až do doby, kdy jsou získány rychle rostoucí kultury. Tyto kultury jsou pak přeneseny do N6 média, které obsahuje 2 mg/1 2,4-D a 30-ti násobně vyšší koncentraci inhibitoru než je ta původní.

Za účelem regenerace rostlin z každé embryogenní suspenzní kultury selektované pro každou zmíněnou koncentraci herbicidu, jsou kultury nejprve přeneseny do N6 média ztuženého 0,24% Gelrite® a obsahujícího 2 mg/1 2,4-D a koncentraci inhibitoru, ve které byla kultura kultivována pro produkci embryogenního kalusu. Embryogenní kalus je subkultivován v čerstvém médiu až do doby, kdy je získáno dostatečné množství kalusu pro regeneraci. Jsou subkultivovány pouze kultury s požadovanou embryogenní morfologií.

Příklad 19

Regenerace rostlin kukuřice získaných ze selektovaného kalusu nebo suspenzní kultury.

Rostliny jsou regenerovány ze selektovaných embryogenních kultur kalusu z příkladu 13 přenesením do čerstvého regeneračního média. Užívaná regenerační média jsou: 0N6 médium, které se skládá z N6 média bez 2,4-3 nebo N61 skládající se z N6 média obsahujícího 0,25 mg/1 2,4-D a 10 mg/1 kinetinu (6-furfurylaminopurin) nebo N62, jehož složkou je N6 médium s obsahem 2,4D o koncentraci 0,1 mg/1 a kinetinu o koncentraci 1 mg/1. Všechna média jsou ztužena 0,24% Gelrite®. Kultury jsou kultivovány při teplotě 28 °C za přístupu světla (10-100pEinstein/m²sec, 16 hod. denně, z bílých fluorescenčních lamp). Kultury jsou subkultivovány v čerstvém médiu každé dva týdny. Rostlinky se vyvinou během 3 až 8 týdnů. Rostlinky nejméně 2 cm vysoké jsou vyjmuty z kalusu a jsou přeneseny do média, které podporuje tvorbu kořenů. Používají se různá média tohoto druhu. Médium, jehož složkou je buď N6 nebo MS médium neobsahuje vitaminy ani obvyklé množství solí nebo jeho obsah solí je redukován na polovinu, obsah sacharózy je redukován na lg/1 a dále buď vůbec neobsahuje růst regulující sloučeniny nebo obsahuje 0,1 mg/1 kyseliny a-naftalenoctové. Poté, co se dostatečně vyvinou kořeny, rostlinky jsou přesazeny do květináčové směsi, která obsahuje vermikulit, rašelinu a zahradní půdu. Po přesazení je odstraněn

-32CZ 296023 B6 celý zbývající kalus a agar je smyt a listy jsou přestřihnuty na polovinu. Rostlinky rostou ve skleníku. Ze začátku jsou kryty průhledným plastovým kelímkem z důvodu udržení vlhkosti a ochrany před přímým světlem. Po aklimatizaci jsou přesazeny a rostou do dosažení zralosti. Hnojivo Peters 20-20-20 (Grace Sierra) je používáno pro zdravý vývoj rostliny. Kvetoucí rostliny jsou opylovány, preferuje se samoopylení.

Příklad 20

Konstrukce vektorů pro transformaci rostlin.

Rada transformačních vektorů je dostupná pro transformaci rostlin. Geny popsané v tomto vynálezu mohou být konjugovány s libovolným z těchto vektorů. Volba vektoru záleží na preferované metodě transformace a druhu rostliny, do kterého je transformace směrována. Pro různé cílové druhy rostlin jsou preferovány různé antibiotikové nebo herbicidní selekční markéry. Rutině používané selekční markry pro transformaci zahrnují nptll gen, který nese rezistenci na kanamycin a příbuzná antibiotika (Messing & Vierra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nátuře 304:184187 (1983)), bar gen, který konferuje rezistenci na herbicid fosfínotricin (White et al., Nucl. Acids. Res. 18:1062 (1990, Spencer et al., Theor. Appl. Gent. 79:625-631 (1990)), hph gen, který nese rezistenci na antibiotikum hygromycin (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4:2929-2931), a dhfr gen, který konferuje rezistenci na methotrexat (Bourouis et al., EMBO J. 2(7):1099-1104(1983)).

(1) Konstrukce vektorů vhodných pro transformaci pomocí Agrobacterium

Rada vektorů je použitelná pro transformaci pomocí Agrobacterium tumefaciens. Tyto vektory většinou nesou nejméně jednu T-DNK hraniční sekvenci a zahrnují vektory jako je pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). Dále je popsána konstrukce dvou typických vektorů.

Konstrukce pCIB200 a pCIB2001

Binární vektory pCIB200 a pCIB2001 jsou užívány pro konstrukci rekombinantních vektorů použitelných spolu s Agrobacterium a byly konstruovány následujícím způsobem. PTJS75kan byl vytvořen štěpením Narl pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164:446-455 (1985)), což umožňuje excizi genu nesoucí rezistenci na tetracyklin. Pak následuje inzerce AccI fragmentu zplazmidu pUC4K, který nese NPTII (Messing & Vierra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nátuře 304:184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266-276 (1990)). Xhol linkry byly ligovány k EcoRV fragmentu, který obsahuje pravou a levou T-DNK hraniční sekvence, rostlinný selektovatelný nos/nptll chimérický gen a pUC polylinker (Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987)), a restriktázou Xhol štěpený fragment byl klonován do Sáli štěpeného pTJS75kan za účelem vytvoření pCIB200 (EP 0 332 104, příklad 19 [1338]). pCIB200 obsahuje vpolylinkru následující restrikční místa: EcoRI, Sstl, KpnI, BglII, Xbal a Sáli. pCIB2001 je odvozen od pCIB200, je vytvořen inzercí dalších restrikčních míst do polylinkru. Vyskytují se v něm tyto restrikční místa: EcoRi, Sstl, KpnI, BglII, Xbal, Sáli, MLUI, Bell, AvrlI, Apal, Hpal a Stul. PCIB2001 také obsahuje rostlinnou a bakteriální selekci na kanamycin, levou a pravou T-DNK hraniční sekvenci pro transformaci zprostředkovanou Agrobakterium, trfA odvozený zRK2 pro mobilizaci mezi E. coli a dalšími hostiteli a OriT a OriV funkce také odvozené z RK2. Polylinker pCIB2001 je vhodný pro klonování rostlinných expresivních kazet, které obsahují jejich vlastní regulační signály.

Konstrukce pCIBlO a jeho na hygromycin selekčních derivátů

Binární vektor pCIBlO obsahuje gen kódující rezistenci na kanamycin pro selekci v rostlinách, pravou a levou T-DNK hraniční sekvence a inkorporované sekvence z plazmidu pRK252, který je použitelný v širokém rozmezí hostitelů. Tyto sekvence umožňují replikaci v E. coli

-33CZ 296023 B6 i v Agrobacterium. Jeho konstrukce je popsána Rothsteinem et al., Gene 53:153-161 (1987)). Byly konstruovány různé deriváty odvozené od pCIBlO, které mají inkorporovaný gen pro hygromycin B fosfotransferázu (Grity et al., Gene 25:179-188 (1983)). Tyto deriváty umožňují selekci buněk transgenických rostlin pouze na hygromycin (pCIB743) nebo na hygromycin a kanamycin (pCIB715, pCIB717) (Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987).

(2) Konstrukce vektorů vhodných pro transformaci bez použití Agrobacterium

Transformace bez použití Agrobacterium tumefaciens obchází požadavek na T-DNK sekvence ve vybraném transformačním vektoru a proto vektory, kterým tyto sekvence chybí mohou být využívány vedle vektorů, takových jako je ten co byl výše popsán a co obsahuje T-DNK sekvence. Transformační metody, které nevyužívají Agrobacterium, zahrnují transformace pomocí ostřelování částicemi, příjem do protoplastu (např. PEG a elektroporace) a mikroinjektáž. Volba vektoru závisí většinou na preferované selekci vhodné pro druhy, které jsou transformovány. Dále je popsána konstrukce některých vektorů.

Konstrukce pCIB3064 pCIB3064 je vektor odvozený z vektoru pUC, vhodný pro metody přímého transferu genu v kombinaci se selekcí na herbicid basta (nebo fosfínotricin). Plazmid pCIB246 obsahuje CaMV 35S promotor v operační fúzi s genem GUS z E. coli a CaMV 35S terminátor transkripce a je popsán v PCT přihlášce WO 93/07278. 35S promotor tohoto vektoru obsahuje dvě ATG sekvence 5'-konc startovacího místa. Tyto místa byla mutována za použití standardní PCR metody takovým způsobem, jako je odstranění ATG a vytvoření SspI a PvuII restrikčních míst. Nová restrikční místa byla 96 a 37 bp daleko od jediného Sáli místa a 101 a 42 bp daleko od skutečného startovacího místa. Výsledný derivát pCIB246 byl označen pCIB3025. GUS gen byl pak vystřižen štěpením pCIB3025 restrikčními enzymy Sáli a Sací. Konce byly zarovnány a gen byl znovu ligován za účelem vytvoření plazmidu pCIB3060. Plazmid pJIT82 byl získán z John Innes Centre, Norwich a 400 bp fragment, obsahující bar gen z Streptomyces virichromogenes byl vystřižen a vnesen do Hpal místa vektoru pCIB3060 (Thompson et al., EMBO J.6:2519-2523 (1987)). Takto vznikl pCIB3064, který obsahuje bar gen, jenž je kontrolován CaMV 35S promotorem, a terminátor pro selekci na herbicid, gen nesoucí rezistenci na ampicilin (pro selekci v E. coli) a polylinker s restrikčními místy Sphl, Pstl, HindlII a BamHI. Tento vektor je vhodný pro klonování rostlinných expresivních kazet, které obsahují jejich vlastní regulační signály.

Konstrukce pSOG19 a pSOG35 pSOG35 je transformační vektor, který využívá jako selekční markér gen dihydrofolatové reduktázy (DHFR). Tento gen propůjčuje rezistenci na methotrexat. Pomocí PCR byl amplifíkován promotor 35S (~800 bp), intron 6, který pochází z Adhl genu kukuřice (~550 bp) [Lou et al., Plant J. 3:393-403, 1993; Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12:3983-4000, 1984] a 18 bp nepřekládané vedoucí sekvence genu GUS zpSOGlO. Dále byl amplifikován PCR 250 bp velký fragment, který kóduje gen dihydrofolátové reduktázy typu II z E. coli. Tyto dva fragmenty byly spojeny s Sacl-Pstl fragmentem z pBI221 (Clontech), který obsahuje základní řetězec z vektoru pUC19 a terminátor nopalinové syntetázy. Spojením těchto fragmentů vznikl pSOG19, který obsahuje 35S promotor ve fůzi s intronem 6, s vedoucími sekvencemi GUS genu, s genem DHFR a terminátorem nopalinové syntetázy. Záměnou vedoucí sekvence GUS genu vpSOG19 za vedoucí sekvenci viru chloritické skvrnitosti kukuřice (MCMV) vznikl vektor pSOG35. pSOG19 a pSOG35 nesou pUC gen kódující rezistenci na ampicilin a mají HindlII, Sphl, Pstl a EcoRI restrikční místa, která jsou vhodná pro klonování cizích sekvencí.

pSOG 10

Tento vektor exprimující β-glucuronidázu (GUS) byl odvozen z plazmidu pBI121, získaný z Clontech Laboratories, Palo Alto, Califomia. Z plazmidu pB428 byl amplifikován pomocí PCR

-34CZ 296023 B6 intron 6 kukuřičného Adhl genu, jak popisuje Bennetzen et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA 81:4125-4128 (1987). Při této amplifikaci byly použity primery SON0003 a SON0004.

SON0003: 5'-CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG-3'

SOŇO 004: 5'-ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG-3'

Produkt PCR byl štěpen restrikční endonukleázou BamHI, BamHI místo se nachází na 5'-konci každého PCR primerů. Výsledný fragment DNK byl purifíkován na agarózovém gelu a ligován do BamHI místa pBI121, které se nachází mezi promotorem CaMV35S a GUS genem.Ligovaná DNK byla transformovaná do E. coli a klony s Adhl intronem 6, který má stejnou orientaci jako GUS gen, byly identifikovány restrikční analýzou.

pSOG19

Tento vektor exprimující dihydrofolatovou reduktázu (DHFR) vznikl fúzí promotoru 35S a Adhl intronu 6 z vektoru pSOGlO s genem DHFR, který pochází z plazmidu pHCO, popsaný v Bourouis a Jarry, EMBO J. 2:1099-1104 (1983). Promotor 35S a Adhl intron 6 byl vytvořen amplifikaci PCR fragmentu pocházející z vektoru pSOGlO, byly použity primery SON0031 a SON0010.

SON0031: 5'-CATGAGGGACTGACCACCCGGGATC-3'

SON0010: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'

Výsledný fragment byl štěpen restrikčními endonukleázami Pstl a BspHI a byl purifíkován na agarózovém gelu.

Oblast kódující DHFR byla vytvořena PCR amplifikaci pHCO za použití primerů SON0016 aSON0017.

SOŇO016: 5'-GCTACCATGGCCACATAGAACACC-3'

SON0017: 5'CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3'

Výsledný fragment byl štěpen restrikčními endonukleázami Nsol a Sací a purifíkován na agarózovém gelu.

Oba fragmenty výše popsané byly ligovány do fragmentu vektoru vytvořeného štěpením vektoru pBI121 restrikčními endonukleázami Pstl a Sací. Takto vzniklý fragment je 3 kb velký a obsahuje oblast Nos terminátoru a oblast pUC19 z vektoru pBI121 a byl purifíkován na agarózovém gelu. Tato třícestná ligace spojila 35S promotor-Adhl intron 6-DHFR gen-Nos termina tor ve správném pořadí a se správnou orientací, což zaručuje funkční expresi v rostlinách.

pSOG30

Tento vektor exprimující GUS byl odvozen z pSOGlO inzercí vedoucí sekvence viru chloritické skvrnitosti kukuřice (MCMV), popsáno vLommel et al., Virology 181:382-385 (1991), třícestnou ligací do nepřekládané vedoucí sekvence 35S-GUS genu.

Syntetizované řetězce 17 bp velké vedoucí sekvence MCMV kapsidového proteinu plus příslušná restrikční místa byly spojeny. Výsledný dvouřetězcový fragment byl štěpen endonukleázami BamHI a Ncol a purifíkován na akrylamidovém gelu.

-35CZ 296023 B6

Oblast kódující GUS gen byla amplifíkována pomocí PCR za použití primerů SON0039 a SON0041 a vektor pBI 121 byl použit jako templat.

SON0039: 5'-CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA~3

SON0041': 5'-ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3'

Tyto primery přičlenily Ncol restrikční místo k 5'-konci genu GUS a Sací místo k 3'-konci genu GUS. Výsledný fragment byl štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a Sací a byl purifikován na agarózovém gelu.

GUS gen byl vyjmut z plazmidu pSOGlO štěpením restrikční endonukleázou Sací a částečným štěpením s endonukleázou BamHI. Výsledný vektor, který má BamHI a Sací místa, kde je inzert kódující oblasti za 35S promotorem-Adhl intronem 6, byl purifikován na agarózovém gelu.

Tyto tři fragmenty výše popsané byly ligovány třícestnou ligací ke genovou fúzí vytvořené struktuře: 35S promotor-Adhl intron 6-MCMV vedoucí sekvence-Nos terminátor, vše se vyskytuje v základním řetězci z vektoru pUC19.

pSOG35

Vektor nesoucí DHFR selekční markér je identický jako pSOG19, s výjimkou, že MCMV vedoucí sekvence je vložena do nepřekládané vedoucí sekvence DHFR genu za účelem zesílení translace. Tato struktura byla vytvořena ve dvou krocích. Nejdříve oblast kódující GUS ve vektoru pSOG32, což je stejný vektor jako je pSOG30 s výjimkou, že obsahuje spíše modifikovaný Adh promotor než 35S, byla nahrazena oblastí kódující DHFR z vektoru pSOG19, excizí GUS genu pomocí restrikčních endonukleáz Ncol a Sací a ligací do DHFR genu jako NcoI-SacI fragment. Výsledek je vektor pSOG33, který nese genovou strukturu Adh promotor-Adhl intron 6vedoucí sekvence MCMV-DHFR kódující oblast-Nos terminátor. Tato struktura má BglII místo mezi promotorem a intronem a Sací místo mezi kódující oblastí a terminátorem. BglII-SacI fragment byl izolován štěpením pomocí restrikčních endonukleáz a byl purifikován na agarózovém gelu a ligován do BamHI a Sací míst vektoru pSOG30, místo Adhl intron 6-MCMV vedoucí sekvence-DHFR kódující oblasti vektoru pSOG33.

Příklad 21

Konstrukce rostlinných expresivních kazet.

Genové sekvence zamýšlené pro expresi v transgenických rostlinách jsou nejdříve spojeny do expresivních kazet, tak, že před nimi leží vhodný promotor a za nimi vhodný terminátor transkripce. Tyto expresivní kazety mohou být jednoduše přeneseny do rostlinných transformačních vektorů jak je popsáno v příkladu 19.

Výběr promotoru

Výběr promotoru užívaného v expresivních kazetách je určen prostorovým a časovým expresivním patemem transgenu v transgenických rostlinách. Selektované promotory exprimují transgeny ve specifických buněčných typech (jako jsou listové epidermální buňky, mezofylové buňky, buňky kořenového kortexu) nebo ve specifických tkáních a orgánech (např. kořeny, listy nebo květy) a tento výběr bude záviset na požadované lokaci exprese transgenu. V jiném případě vybraný promotor může regulovat expresi genu, který je pod světlem indukovaným nebo jinak regulovaným promotorem. Další alternativa je, že vybraný promotor je chemicky regulován, což umožňuje indukovat expresi transgenu pouze po ošetření chemickým induktorem.

-36CZ 296023 B6

Terminátory transkripce

Rada terminátorů transkripce je dostupná pro použití v expresních kazetách. Tyto terminátory jsou zodpovědné za ukončení transkripce transgenu a jeho správnou polyadenilaci. Příslušné transkripční terminátory a ty, o nichž je známo, že fungují v rostlinách, zahrnují CaMV 35S terminátor, tmi terminátor, terminátor nopalinové syntezázy a rbcS E9 terminátor hrášku. Tyto terminátory mohou být použity jak vjednoděložních tak i v dvouděložních rostlinách.

Sekvence pro regulaci nebo zvýšení exprese

O řadě sekvencí je známo, že zesilují expresi genu z transkripční jednotky. Tyto sekvence mohou být použity v konjugaci s geny tohoto vynálezu za účelem zvýšení síly jejich exprese v transgenických rostlinách.

Různé intronové sekvence zesilují expresi, zvláště v jednoděložních rostlinách. Například introny kukuřičného genu Adhl, jsou-li vneseny do buněk kukuřice, podstatně zvyšují expresi genu divokého typu, která je regulována jeho promotorem. Intron 1 je zvláště účinný. Zesiluje expresi, je-li v konstrukcích spojen s genem chloramfenikolové acetyltransferázy (Callis et al., Genes Develop.l:1183-1200 (1987)). Intron z kukuřičného genu bronze 1 podobně zesiluje expresi ve stejném pokusném systému (Callis et al., supra). Sekvence intronu jsou rutinně vkládány do rostlinných transformačních vektorů, většinou do nepřekládané vedoucí sekvence.

Rada nepřekládaných vedoucích sekvencí pocházející z virů také zesiluje expresi. Tyto sekvence jsou zvláště účinné v buňkách dvouděložních rostlin. Vedoucí sekvence z tabákového mozaikového viru (TMV, „W-sekvence“), viru chloritické skvrnitosti kukuřice (MCMV) a mozaikového viru vojtěšky (AMV) jsou účinné při zesílení exprese (např. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15:8693-8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15:65—79 (1990)).

Směrování genových produktů do buněk

V rostlinách existují různé mechanizmy pro směrování genových produktů. Sekvence, které řídí tyto mechanizmy, jsou zde charakterizovány v některých detailech. Například, směrování genových produktů do chloroplastu je řízeno signální sekvencí, která se nachází v N-konci různých proteinů a která je štěpena během chloroplastového importu, jenž umožňuje dozrání proteinu (např. Comai et al., J. Biol. Chem. 263:15104-15109 (1988)). Tyto signální sekvence mohou být fúzovány k produktům heterogenních genů a mohu ovlivnit import heterogenních produktů do chloroplastu (van den Brock et al., Nátuře 313:358-363 (1985)). DNK, kódující příslušné signální sekvence, může být izolována z 5'-konce cDNK, jenž kódují RUBISCO protein, CAB protein, EPSP syntetázový enzym, GS2 protein a mnoho dalších proteinů, jenž jsou lokalizovány v chloroplastu.

Další genové produkty mohou být směrovány do jiných organel jako jsou mitochondrion aperoxisom (např. Unger et al., Plant Molec. Biol. 13:411-418 (1989)). cDNK kódující tyto produkty mohou být manipulovány za účelem směrování produktů heterogenních genů do zmíněných organel. Příklady takových sekvencí jsou v jádru kódované ATPázy a specifické izoformy aspartátové aminotransferázy určené pro mitochondrie. Směrování buněčných proteinů popisuje Rogers et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:6512-6516 (1985)).

Dále byly charakterizovány sekvence, které způsobují směrování genových produktů do dalších buněčných částí. Sekvence N-konce jsou zodpovědné za směrování do ER, do apoplastu a za extracelulámí sekreci z buněk lepku (Koehler & Ho, Plant Cell 2:769-783 (1990)). Sekvence N-konce konjugované se sekvencemi c-konce odpovídají za směrování genových produktů do vakuol (Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 14:357—368 (1990)).

-37CZ 296023 B6

Fúzí příslušných výše popsaných sekvencí se sekvencemi transgenů je možné směrovat produkt transgenů do libovolné organely nebo buněčné části. Za účelem směrování do chloroplastu je příslušná chloroplastová signální sekvence z genu RUBISCO a CAB genu, z genu EPSP syntetázy nebo z GS2 genu fúzována do rámce s ATG N-konce transgenů. Selektovaná signální sekvence by měla zahrnovat známé štěpící místo a vytvořená fúze by měla brát v úvahu libovolnou aminokyselinu za místem štěpení, která je pro štěpení nutná. V některých případech tento požadavek může být zajištěn vnesením malého množství aminokyselin mezi štěpící místo a ATG transgenů nebo v jiném případě záměnou některých aminokyselin v sekvencích transgenů. Účinnost fúzí konstruovaných pro import do chloroplastu může být testována in vitro translací přepisovaných konstrukcí in vitro, což je následováno in vitro příjmem chloroplastu za použití metod popsaných (Bartlett et al., v: Edelmann et al (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier. Pp 1081-1091 (1982); Wasmann et al., Mol. Gen. Genet. 205:446-453 (1986)). Tyto dobře známé konstrukční metody jsou stejně aplikovatelné jak v mitochondriu tak i peroxizomech. Volba směrování, která může být žádána pro expresi transgenů, závisí na buněčné lokalizaci prekurzoru. Tento prekurzor je nutný jako počáteční místo pro danou cestu. Jedná se obvykle o cytosolický nebo chloroplastový, ačkoliv může být v některých případech i mitochondriální nebo peroxizomální. Produkty exprese transgenů normálně nevyžadují směrování do ER, apoplastu nebo vakuol.

Výše popsaný mechanizmus buněčného směrování může být využíván ne pouze v konjugaci s jejich podobným promotorem, ale také v konjugaci s heterolognímy promotory, které ovlivňují specifické buněčné směrování za podmínek transkripční regulace promotoru, jehož expresní patem je odlišný od paternu promotoru, od něhož je směrovací signál odvozen.

Příklad 22

Transformace dvouděložních rostlin

Metody transformace dvouděložných rostlin jsou dobře známy a zahrnují metody zprostředkované Agrobacterium a metody, které nepotřebují Agrobacterium. U metody bez účasti Agrobacterium dochází k příjmu exogenního genetického materiálu přímo protoplasty nebo buňkami. Toto může být uskutečněno pomocí PEG nebo elektroporací, ostřelováním částicemi nebo mikroinjektáží. Příklady těchto metod jsou popsány Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4:1001-1004 (1986) a Klein et al., Nátuře 327:70-73 (1987). V každém případě transformované buňky použitím standardních metod dorůstají v celé rostliny.

Transformace zprostředkovaná Agrobacterium je preferována v případech transformací dvouděložních rostlin, protože je vysoce účinná a je široce využitelná pro mnoho různých druhů rostlin. Rada různých plodin zahrnující tabák, rajčata, slunečnice, bavlnu, řepku olejnou, brambory, sóju, vojtěšku a topoly (EP 0 317 511 (bavlna), EP 0 249 432 (rajčata, Calgene), WO 87/07299 (Brassice, Calgene), US 4 795 855 (topol)) jsou rutinně transformovány pomocí Agrobacterium. Tento způsob transformace typicky zahrnuje přenos binárního vektoru nesoucího cizorodou DNK (např. pCIB200 nebo pCIB2001) do příslušného kmene Agrobacterium, jehož volba závisí na komplementu vir genů nesených hostitelským kmenem Agrobacterium buď na plazmidu Ti nebo na chromozomu (např. kmen CIB542 pro pCIB200 a pCIB2001 (Uknes et al., Plant Cell 5:159— 169 (1993)). Přenos rekombinantního binárního vektoru do Agrobacterium je uskutečněn triparentálním kopulačním způsobem za použití E. coli nesoucího rekombinantní binární vektor a pomocného kmene E. coli, který nese plazmid jako je pRK2013 a který je schopný mobilizovat rekombinantní binární vektor do cílového kmene Agrobakterium. V jiném případě rekombinantní binární vektor může být přenesen do Agrobacterium transformací DNK (Hófgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16:9877 (1988)).

-38CZ 296023 B6

Transformace cílových rostlinných druhů pomocí rekombinantního Agrobacterium obvykle zahrnuje kultivaci Agrobacterium s explanty pocházející z rostliny a dále se postupuje podle dobře známých protokolů. Transformovaná tkáň, která obsahuje na herbicid nebo antibiotikum rezistentní markér mezi T-DNK hraničními sekvencemi na binárním plazmidu, je regenerovaná na selekčním médiu.

Příklad 23

Transformace jednoděložných rostlin

Transformace většiny monoděložních druhů se také stává rutinou. Preferovanou metodou je přímý transfer genu do protoplastů za použití PEG nebo elektroporace a do tkáně kalusu ostřelováním částicemi. Transformace mohou probíhat s DNK jednoho druhu nebo s DNK více druhů (tj. kotransformace). Obě tyto metody jsou vhodné pro použití v tomto vynálezu. Ko-transformace má tu výhodu, že lze obejít komplexní konstrukci vektoru a lze vytvořit transgenické rostliny s nespojenými loky pro gen a selekční markér a lze v následujících generacích odstranit selekční markér, jestli je to požadováno. Nevýhodou použití ko-transformace je nižší frekvence než 100%, se kterou je separovaná DNK integrovaná do genomu (Schocher et al., Biotechnology 4:1093-1096(1986)).

Patentové přihlášky EP 0 292 435 (Ciba-Geigy), EP 0 392 225 (Ciba-Geigy) a WO 93/07278 (Ciba-Geigy) popisují metody přípravy kalusu a protoplastů z elitní imbrední linie kukuřice, transformaci protoplastů použitím PEG nebo elektroporace a regeneraci rostlin kukuřice z transformovaných protoplastů. Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990)) a Fromm et al., Biotechnology 8:833-839 (1990) publikovali metody pro transformaci A188 odvozené kukuřičné linie za použití ostřelování částicemi. Přihláška WO 93/07278 (Ciba-Geigy) a Koziel et al., Biotechnology 11:194-200 (1993)) popisuje transformaci elitních imbredních linií kukuřice pomocí metody ostřelování částicemi. Tato metoda využívá nezralá embrya kukuřice o délce 1,5 až 2,5 mm excizovaná z kukuřičného klasu 14 až 15 dnů po opylení. Pro ostřelování byl použit přístroj PDS-lOOOHe Biolistics.

Transformace rýže může probíhat metodami přímého přenosu genu za využití protoplastů a ostřelování částicemi. Transformace zprostředkovaná protoplasty byla popsána pro rýži typu Japonica a Indica (Zhang et al., Plant Cell Rep. 7:379-384 (1988); Shimamoto et al., Nátuře 338:274-277 (1989); Datta et al., Biotechnology 8:736-740 (1990)). Oba typy jsou rutinně transformovatelné použitím metody ostřelování částicemi (Christou et al., Biotechnology 9:957-962 (1991)).

Patentová přihláška EP 0 332 581 (Ciba-Geigy) popisuje metody pro generaci, transformaci a regeneraci Pooideae protoplastů. Tyto metody umožňují transformaci Dactylis a pšenice. Transformace pšenice do buněk typu C dlouhodobě regenerovatelného kalusu byla popsána Vasil et al., Biotechnology 10:667—674 (1992)) za použití metody ostřelování částicemi. Také (Vasil et al., Biotechnology 11:1553-1558 (1993) a Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993)) popisuje ostřelování částicemi nezralých embryí a kalusu z nezralých embryí. Pro transformaci pšenice je preferovaná metoda, kde nezralá embrya jsou ostřelována částicemi spolu s krokem, kdy embrya před příjmem genu jsou vystavena vysoké koncentraci sacharózy nebo maltózy. Před ostřelováním libovolné množství embryí (o délce 0,75-1 mm) je naneseno na plotnu s MS médiem s 3% sacharózou (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum 15:473-497 (1962)) a 3 mg/1 2,4-D za účelem indukce somatických embryí, které takto přežívají ve tmě. V den ostřelování jsou embrya odebrána z indukčního média a jsou umístěna na osmoticum (tj. indukční médium se sacharózou nebo maltózou v požadované koncentraci, většinou 15 %). Embrya plazmolyzují 2 až 3 hodiny a pak jsou ostřelovány. Většinou se dává 20 embryí na cílovou plotnu, není to však kritický počet. Příslušný plazmid nesoucí gen (jako je pCIB3064 nebo pSG35) je standardní metodou precipitován na zlatých mikrometrových částicích. Každá plotna s embryi je

-39CZ 296023 B6 ostřelována DuPont Biolistics'heliovým přístrojem za použití průrazného tlaku -1000 psi a standardního síta s 80-ti oky. Po ostřelování jsou embrya umístěna zpět do tmy a nechají se vzpamatovat asi 24 hodin (stále na osmo tikům). Po 24 hodinách jsou embrya vyjmuta z osmotika a umístěna zpět na indukční médium, kde zůstanou po dobu asi jednoho měsíce před regenerací. Přibližně o měsíc později jsou embryonální explanty s vyvíjejícím se embryogením kalusem přeneseny do regeneračního média (MS+1 mg/1 NAA, 5mg/l GA), které dále obsahuje příslušné selekční agents (10 mg/1 basta v případě pCIB3064 a 2 mg/1 methotrexatu v případě pSOG35). Po přibližně jednom měsíci vyvinuté pupeny jsou přeneseny do velkých sterilních nádob, známých jako „GA7“, které obsahují na polovinu ředěné médium MS, 2% sacharózu a stejnou koncentraci selekčního agents. Patentová přihláška 08/147,161 popisuje metody transformace pšenice a je zde vložena jako reference.

Příklad 24

Plazmid pWDC-4 kódující chloroplastevý protox enzym kukuřice je transformován do náhodně mutagenizovaného kmene XLl-Red (Stratagene, Lo Jolla, CA). Transformanty jsou naneseny na plotnu s L médiem, které obsahuje 50 mg/1 ampicilinu a jsou inkubovány 48 hodin při 37 °C. Porost transformovaných buněk je seškrábnut z ploten a je připravena plazmidová DNK pomocí Wizard Megaprep sady (Promega, Madison, WI). Plazmidová DNK izolovaná z tohoto mutovaného kmene pravděpodobně obsahuje přibližně jednu nahodile zaměněnou bázi na 2000 nukleotidů (green et al., Stratagies 7(2):32-34 (1994)).

Mutovaná plazmidová DNK je přenesena do hemG mutantu SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)) a ten je nanesen na plotnu obsahující L médium s 100 g/ml ampicilinu a dále na plotny, které obsahují různé koncentrace protox inhibujícího herbicidu. Plotny jsou inkubovány 2 až 3 dny při teplotě 37 °C. Plazmidová DNK je izolována ze všech kolonií, které rostou v přítomnosti koncentrací herbicidu, jenž účinně zabíjejí kmen divokého typu. Izolovaná DNK je pak transformována do SASX38 a je nanesena na plotnu s herbicidem za účelem potvrzení rezistence nesené na plazmidů.

Mutovaná DNK plazmidů pWDC-4 je opět izolována z rezistentních kolonií a protox kódující sekvence je vystřižena štěpením EcoRI a Xhol. Excizovaná protox kódující sekvence je pak znovu klonována do nemutogenizovaného vektoru pBluescript a znovu testována na rezistenci na protox inhibující herbicid stejným způsobem jak je shora popsáno.

Tento proces eliminuje mutace nekódujících sekvencí, které propůjčují rezistence, takové jako „up-promotor“ mutanty (tj. mutanty, jejichž rezistence je způsobena mutacemi, jejichž následkem zesílila exprese nemodifikovaného protoxu) a zůstávají pouze mutanty, jejichž rezistence je způsobena mutacemi v sekvenci kódující protox. Je určena DNK sekvence pro všechny putativní na herbicid tolerantní protox geny identifikovaná pomocí popsaného procesu a mutace jsou odhaleny srovnáním mutované sekvence se pWDC-4 protox sekvencí divokého typu.

Použitím shora popsané metody byla identifikována rezistence způsobená mutací, která konvertuje C na T nukleotidu 498 v pWDC-4 sekvenci (SEQ ID č.: 5). Plazmid nesoucí tuto mutaci byl označen pMzC-1 Val. Tato záměna konvertuje GCT kodon pro alanin v aminokyselině 166 (SEQ ID č.: 6) na GTT kodon pro valin. Výsledkem je protox enzym, který je v bakteriálním testu nejméně lOx více rezistentní na protox inhibující herbicid.

PMzC-Val ve vektoru pBluescript byl uložen 30. 9. 1994 pod označením pWDC-8 v Agricultural Research Culture Collection a přístupové označení je NRRL#21340.

-40CZ 296023 B6

Stejná strategie byla použita pro vyhledávání na herbicid rezistentních forem Arabidopsis Protox-1 genu v různých vektorech. Byla identifikována jedna rezistenci způsobující mutace. Jde o záměnu C na T v nukleotidu 689 v sekvenci vpWDC-2 (SEQ IDč.: 1); tento plazmid byl označen pAraC-lVal. Tato záměna je identická jako vmutantu pMzC-lVal, konvertuje GCT kodon pro alanin v aminokyselině 220 (SEQ ID č.: 2) na GTT kodon pro valin v pozici, která koresponduje s pozicí v Arabidopsis protox proteinové sekvenci.

Druhý gen nesoucí rezistenci obsahuje záměnu A na G v nukleotidu 1307 v sekvenci pWDC-2 (SEQ ID č.:l); tento plazmid je označen pAraC-2Cys. Tato záměna konvertuje TAC kodon pro tyrosin v aminokyselině 426 (SEQ ID č.:2) na TGC kodon pro cystein. Korespondující kodon pro tyrosin v protox-1 sekvenci kukuřice v nukleotidová pozici 1115-1117 (SEQ IDč.:5; pozice aminokyseliny 372 SEQ ID č.:6) může být podobně mutován za účelem vytvoření na herbicid rezistentní formy tohoto enzymu.

Třetí rezistentní mutant má zaměněný G za A v nukleotidové pozici 691 v sekvenci pWDC-2 (SEQ ID č.:l); tento plazmid byl označen pAraC-3Ser. Tato mutace konvertuje GGT kodon pro glycin v aminokyselině 221 (SEQ ID č.:2) na AGT kodon pro serin v pozici kodonu přilehlé k mutaci vpAraC-1. Korespondující kodon pro glycin v protox-1 sekvenci kukuřice v pozici nukleotidu 497-499 (SEQ ID č.:5; pozice aminokyseliny 167 SEQ ID č.:6) může být podobně mutován za účelem vytvoření na herbicid rezistentní formy tohoto enzymu.

Výsledkem všech výše popsaných mutací je protox enzym, který je v bakteriálním testu nejméně lOx více rezistentní na protox inhibující herbicid.

PAraC-2Cys ve vektoru pFL61 byl uložen 14. 11. 1994 pod označením pWDC-7 v Agricultural Research Culture Collection a přístupové označení je NRRL#21339N.

Příklad 25

Dodatečné substituce v na herbicid rezistentním kodonu v pozicích identifikovaných náhodným výběrem

Aminokyseliny, které jsou náhodným výběrem identifikovány jako místa herbicidní rezistence, jsou zaměněny za jiné aminokyseliny. Pak je testována jejich funkce a tolerance k herbicidu v bakteriálním systému. Je provedena na oligonukleotid směrovaná mutageneze Arabidopsis Protox-1 sekvence za použití Transformer Site-Directed Mutagenesis sady (Clontech, Palo Alto, CA). Výměny aminokyselin jsou potvrzeny sekvenční analýzou. Mutované plazmidy jsou přeneseny do SASX38 a mutanty jsou naneseny na L-amp¹⁰⁰ médium za účelem testování funkce a na médium z různými koncentracemi protox inhibujícího herbicidu za účelem testování jejich tolerance na herbicid.

Tento postup byl aplikován na kodon pro alanin na nukleotidy 688-690 a na kodon pro tyrosin na nukleotidy 1306-1308 Arabidopsis protox sekvence (SEQ ID č.:l). Výsledky ukazují, že kodon pro alanin v nukleotidech 688-690 může být změněn na kodon pro valin, threonin, leucin nebo cystein, což vede ke vzniku na herbicid rezistentnímu protox enzymu, který udrží svoji funkci. Výsledky dále demonstrují, že kodon pro tyrozin v nukleotidech 1306-1308 může být změněn na kodon pro cystein, izoleucin, valin nebo threonin, což vede ke vzniku na herbicid rezistentnímu protox enzymu, který udrží svoji funkci.

-41 CZ 296023 B6

Příklad 26

Demonstrace rezistentní mutační křížové tolerance k různým protox inhibujícím látkám

Rezistentní mutované plazmidy, selektované na rezistenci na jediný herbicid, jsou testovány s řadou dalších protox inhibujících látek. Kmen SASX38, který obsahuje plazmid divokého typu, je nanesen na plotnu s koncentrační škálou pro každou látku za účelem určení letální koncentrace těchto látek. Rezistentní mutantní plazmidy v SASX38 jsou naneseny na plotnu a je hodnocena jejich schopnost přežít působení každé látky v koncentraci, která je nejméně 10 krát vyšší než je koncentrace, která je letální pro kmen SASX38 obsahující plazmid divokého typu.

Výsledky testování křížové tolerance ukazují, že každá z identifikovaných mutací, propůjčuje toleranci k různým protox inhibujícím látkám. Výsledky zvláště ukazují, $

1) AraCl-Val mutace propůjčuje rezistenci na protox inhibitory, které zahrnují, nejsou však limitovány, ty, jenž mají vzorce IV, XI, XIII, XIV, XV a XVII;

2) AraC-2Cys mutace propůjčuje rezistenci na protox inhibitory, které zahrnují, nejsou však limitovány, ty, které mají vzorec XI, XIII, XV a XVII;

3) MzC-lVal mutace propůjčuje rezistenci na protox inhibitory, které zahrnují, nejsou však limitovány, ty, které mají vzorce XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI a XVII;

4) AraC-3Ser mutace propůjčuje rezistenci na protox inhibitory, které zahrnují, nejsou však limitovány, ty, které mají vzorce IV, XII, XIII, XIV, XV a XVII.

Příklad 27

Produkce rostlin tolerantních k herbicidu nadměrnou expresí rostlinných protox genů

Arabidopsis Protox-1 kódující sekvence z divokého typu a z mutantních genů AraC-lVal nesoucích rezistenci jsou vystřiženy částečným štěpením endonukleázami EcoRI a Xhol a jsou klonovány do rostlinného expresivního plazmidu pCGN1761ENX. Expresivni kazety obsahující fúze 2x35S-Protox gen byly vystřiženy restrikční endonukleázou Xbal a klonovány do binárního vektoru pCIB200. Tyto binární protox plazmidy jsou přeneseny elektroporací do Agrobacterium a pak do Arabidopsis za použití metody vakuové infiltrace (Bechtold etal., 1993). Transformanty jsou selektovány na kanamycin a z řady nezávislých linií vzniklo semeno označené T2. Tato semena jsou nanesena na plotnu na GM médium, které obsahuje různé koncentrace protox inhibujícího herbicidu a je hodnoceno jejich klíčení a schopnost přežít. Řada transgenických linií, které mají nadměrnou produkci buď protoxu divokého typu nebo rezistentního mutovaného protoxu, produkuje podstatné množství zelených semenáčů v přítomnosti herbicidu o koncentraci, jenž je letální pro kontrolní rostlinu nesoucí prázdný vektor.

-42CZ 296023 B6

SEZNAM SEKVENCÍ (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel:

(A) jméno: Ciba-Geigy (B) ulice: Klybeckstr. 141 (C) město: Basilej (E) země: Švýcarsko (F) pošt. směr. č. (ZIP): 4002 (G) telefon: +41 61 69 11 11 (H) telefax +41 61 696 79 76 (I) telex: 962 991 (ii) Název vynálezu: Izolovaná molekula DNK kódující protoporfyrinogenovou oxidázu v eukaryontech, způsob její manipulace a její farmaceutické použití, vektor a hostitel.

(iii) Počet sekvencí: 20 (iv) Počítačem čitelná forma:

(A) typ média: floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) software: Patentln Relesase #1.0, verze #1.25 (EPO) (2) Informace o SEQ ID č.: 1:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 1719 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (v) Rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 31 1644 (C) další informace: /poznámka= „Arabidopsis protox-1 cDNK;sekvence z pWDC-2“

-43CZ 296023 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 1:

TGACAAAATT CCGAATTCTC TGCGATTTCC ATG GAG TTA TCT CTT CTC CGT CCG 54

Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro

5

ACG ACT CAA TCG CTT CTT CCG TCG TTT TCG AAG CCC AAT CTC CGA TTA

102

Thr Thr Gin Ser Leu 10

Leu

Pro Ser Phe Ser Lys 15

Pro Asn Leu Arg Leu 20

AAT

GTT

TAT

AAG

CCT

CTT

AGA

CTC

CGT

TGT

TCA

GTG

GCC

GCT

GGA

CCA

150

Asn

Val

Tyr

Lys

Pro

Leu

Arg

Leu

Arg Cys

Ser

Val

Ala

Gly Gly

Pro

25

30

35

40

ACC

GTC

GGA

TCT

TCA

AAA

ATC

GAA GGC

GGA

GGC

ACC

ATC

ACG

198

Thr

Val

Gly

Ser

Lys

Ile

Glu Gly

Gly

Thr

Ile

Thr

45

50

55

ACG

GAT

TGT

GTG

ATT

GTC

GGC

GGA

GGT

ATT

AGT

GGT

CTT

TGC

ATC

GCT

246

Thr

Asp Cys

Val

Ile

Val

Gly

Gly Gly

Ilé

Ser

Gly

Leu

Cys

Ile

Ala

60

65

70

CAG

GCG

CTT

GCT

ACT

AAG

CAT

CCT

GAT

GCT

CCG

AAT

TTA

ATT

GTG

294

Gin

Ala

Leu

Ala

Thr

Lys

His

Pro

Asp

Ala

Pro

Asn

Leu

Ile

Val

75

80

85

ACC

GAG

GCT

AAG

GAT

CGT

GTT

GGA

GGC

AAC

ATT

ATC

ACT

CGT

GAA

GAG

342

Thr

Glu

Ala

Lys

Asp

Arg

Val

Gly Gly

Asn

Ile

Thr

Arg

Glu

G1U

90

95

100

AAT

GGT

TTT

CTC

TGG

GAA

GGT

CCC

AAT

AGT

TTT

CAA

CCG

TCT

GAT

390

Asn

Gly

Phe

Leu

Trp

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gin

Pro

Ser

Asp

105

110

115

120

CCT

ATG

CTC

ACT

ATG

GTG

GTA

GAT

AGT

GGT

TTG

AAG

GAT

TTG

GTG

438

Pro

Met

Leu

Thr

Met

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys Asp Asp

Leů

Val

125

130

135

TTG

GGA

GAT

CCT

ACT

GCG

CCA

AGG

TTT

GTG

TTG

TGG

AAT

GGG

AAA

TTG

486

Leu

Gly

Asp

Pro

Thr

Ala

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Trp

Asn

Gly Lys

Leu

140

145

150

AGG

CCG

GTT

CCA

TCG

AAG

CTA

ACA

GAC

TTA

CCG

TTC

TTT

GAT

TTG

ATG

534

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Leu

Thr

Asp

Leu

Pro

Phe

Asp

Leu

Met

155

160

165

AGT

ATT

GGT

GGG

AAG

ATT

AGA

GCT

GGT

TTT

GGT

GCA

CTT

GGC

ATT

CGA

582

Ser

ile

Gly Gly

Lys

Ile

Arg

Ala

Gly

Phe

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg

170

175

180

CCG

TCA

CCT CCA

GGT

CGT

GAA

TCT <

GTG i

GAG :

GAG

TTT ^!

GTA

CGG <

CGT

630

Pro

Ser

Pro

Gly

Arg

Glu

Ser '

Val ’

Glu i

Glu

Phe

val

Arg Arg

185 190 195 200

-44CZ 296023 B6

AAC

CTC

GGT GAT

GAG

GTT

TTT

GAG

CGC

CTG

ATT

GAA

CCG

TTT

TGT TCA

678

Asn

Leu

Gly Asp

Glu

val

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys Ser

205

210

215

GGT

GTT

TAT

GCT

GGT

GAT

CCT

TCA

AAA

CTG

AGC

ATG

AAA

GCA

GCG TTT

726

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Ala Phe

220

225

230

GGG

AAG

GTT

TGG

AAA.

CTA

GAG

CAA

AAT

GGT

GGA

AGC

ATA

GCST GGT

774

Gly

Lys

Val

Trp Lys

Leu

Glu

Gin

Asn

Gly Gly

Ser

Ile

Ile Gly Gly

235

240

245

ACT

TTT

AAG

GCA ATT

CAG

GAG

AGG

AAA

AAC

GCT

CCC

AAG

GCA GAA CGA

822

Thr

Phe

Lys

Ala

Ile

Gin

Glu

Arg

Lys

Asn

Ala

Pro

Lys

Ala

Glu Arg

250

255

260

GAC

CCG

CGC

CTG

CCA

AAA

CCA

CAG

GGC

CAA

ACA

GTT

GGT

TCT

TTC AGG

870

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Lys

Pro

Gin

Gly

Gin

Thr

Val

Gly

Ser

Phe Arg

265

270

275

280

AAG

GGA

CTT

CGA

ATG

TTG

CCA

GAA

GCA

ATA

TCT

GCA

AGA

TTA

GGT AGC

918

Lys

Gly

Leu

Arg

Met

Leu

Pro

Glu

Ala

Ile

Ser

Ala

Arg

Leu

Gly Ser

285

290

295

AAA

GTT

AAG

TTG

TCT

TGG

AAG

CTC

TCA

GGT

ATC

ACT

AAG

CTG

GAG AGC

966

Lys

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu

Ser

Gly

Ile

Thr

Lys

Leu

Glu Ser

300

305

310

GGA

TAC

AAC

TTA

ACA

TAT

GAG

ACT

CCA

GAT

GGT

TTA

GTT

TCC GTG

1014

Gly

Gly Tyr

Asn

Leu

Thr

Tyr

Glu

Thr

Pro

Asp Gly

Leu

Val

Ser Val

315

320

325

CAG

AGC

AAA

AGT

GTT

GTA

ATG

ACG

GTG

CCA TCT

GAT

GTT

GCA

AGT GGT

1062

Gin

Ser

Lys

Ser

Val

Met

Thr

Val

Pro

Ser

His

Val

Ala

Ser Gly

330

335

340

CTC

TTG

CGC

CCT

CTT

TCT

GAA TCT

GCT

GCA

AAT

GCA

CTC

TCA

AAA CTA

1110

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Glu

Ser

Ala

Asn

Ala

Leu

Ser

Lyš Leu

345

350

355

360

TAT TAC

CCA

GTT

GCA

GTA

TCT

ATC

TCG

TAC CCG

AAA

GAA GCA

1158

Tyr Tyr

Pro

Val

Ala

Val

Ser

Ile

Ser

Tyr Pro

Lys

Glu Ala

365

370

375

ATC

CGA

ACA

GAA

TGT

TTG

ATA

GAT

GGT

GAA

CTA

AAG GGT

TTT

GGG CAA

1206

Ile

Arg

Thr

Glu

cys

Leu

Ile

Asp

Gly

Glu

Leu

Lys Gly

Phe

Gly Gin

380

385

390

TTG

CAT

CCA

CGC

ACG

CAA

GGA

GTT

GAA

ACA

TTA

GGA ACT

ATC

TAC AGC

1254

Leu

His

Pro

Arg

Thr

Gin

Gly

Val

Glu

Thr

Leu

Gly Thr

ile

Tyr Ser

395 400 405

-45CZ 296023 B6

TCC TCA CTC Ser Ser Leu

TTT CCA AAT

CGC GCA CCG

CCC GGA AGA ATT TTG CTG TTG

1302

Phe

Pro Asn

Arg 415

Ala

Pro

Gly Arg Ile 420

Leu

410

AAC

TAC

ATT

GGC

GGG

TCT

ACA

AAC

ACC

GGA

ATT

CTG

TCC

AAG

TCT

GAA

1350

tón

Tyr

Ile

Gly Gly

Ser

Thr

Asn

Thr

Gly

ile

Leu

Ser

Lys

Ser

Glu

425

430

435

440

GGT

GAG

TTA

GTG

GAA

GCA

GTT

GAC

AGA

GAT

TTG

AGG

AAA

ATG

CTA

ATT

1398

Gly

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp Arg Asp

Leu

Arg

Lys

Met

Leu

Ile

445

450

455

AAG

CCT

AAT

TCG

ACC

GAT

CCA

CTT

AAA

TTA

GGA

GTT

AGG

GTA

TGG

CCT

1446

Lys

Pro

Asn

Ser

Thr

Asp

Pro

Leu

Lys

Leu

Gly

Val

Arg

Val

Trp

Pro

460

465

470

CAA

GCC

ATT

CCT

CAG

TTT

CTA GTT

GCT

CAC

TTT

GAT

ATC

CTT

GAC

ACG

1494

Gin

Ala

Ile

Pro

Gin,Phe

Leu

Val

Gly

His

Phe

Asp

Ile

Leu

Asp

Thr

475

480

485

GCT

AAA

TCA

TCT

CTA

ACG

TCT

TCG

GGC

TAC

GAA

GGG

CTA

TTT

TTG

GGT

1542

Ala

Lys

Ser

Leu

Thr

Ser

Gly Tyr

Glu

Gly

Leu

Phe

Leu

Gly

490

495

500

GGC

AAT

TAC

GTC

GCT

GGT

CTA

GCC

TTA

GGC

CGG

TCT

CTA

GAA

GGC

GCA

1590

Gly

Asn

oyr

Val

Ala

Gly

Val

Ala

Leu

Gly Arg Cys

Val

Glu

Gly

Ala

505

510

515

520

TAT

GAA

ACC

GCG

ATT

GAG

GTC

AAC

TTC

ATG

TCA

CGG

TAC

GCT

TAC

1638

Tyr

Glu

Thr

Ala

Ile

Glu

Val

Asn

Phe

Met

Ser

Arg Tyr

Ala

Tyr

525

530

535

AAG TAAATGTAAA ACATTAAATC TCCCAGCTTG CGTGAGTTTT ATTAAATATT 1691

Lys

TTGAGATATC CAAAAAAAAA AAAAAAAA

1719 (2) Informace o SEQ ID č.: 2:

(i) Charakteristika sekvencí:

(A) délka: 537 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

-46CZ 296023 B6 (iii) Popis sekvence: SEQ ID č.: 2:

Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gin Ser Leu Leu Pro Ser

1

5

10

15

Phe

Ser

Lys

Pro

Asn

Leu

Arg

Leu

Asn

Val

-Tyr

Lys

Pro

Leu

Arg

Leu

20

25

30

Arg

Cys

Ser

Val

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Gly

Ser

Lys

Ile

Glu

35

40

45

Gly

Thr

Ile

Thr

Asp

Cys

Val

Ile

val

Gly

50

55

60

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu

cys

Ile

Ala

Gin

Ala

Leu

Ala

Thr

Lys

His

Pro

65

70

75

80

Asp

Ala

Pro

Asn

Leu

Ile

Val

Thr

Glu

Ala

Lys

Asp

Arg

Val

Gly

85

90

95

Gly

Asn

Ile

Thr

Arg

Glu

Asn

Gly

Phe

Leu

Trp

Glu

Gly

100 105 110

Pro

Asn

Ser

Phe

Gin

Pro

Ser

Asp

Pro

Met

Leu Thr Met

Val

Asp

115

120

125

Ser

Gly

Leu

Lys Asp Asp

Leu

Val

Leu

Gly

Asn Pro Thr

Ala

Pro

Arg

130

135

140

Phe

Val

Leu

Trp

Asn

Gly Lys

Leu

Arg

Pro

Val Pro Ser

Lys

Leu

Thr

145

150

155

160

Asp

Leu

Pro

Phe

Asp

Leu

Met

Ser

ile

Gly Gly Lys

Ile

Arg Ala

165

170

175

Gly

Phe

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg

Pro

Ser

Pro Pro Gly Arg

Glu

180

185

190

Ser

Val

Glu

Phe

val

Arg Arg

Asn

Leu Gly Asp Glu. Val

Phe

Glu

195

200

205

Arg Leu

Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser

215 220

210

-47CZ 296023 B6

Lys 225

Leu Ser

Met

Lys

Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys

Leu Glu Gin 240

230

235

Asn

Gly Gly

Ser

Ile 245

Ile

Gly Gly Thr

Phe 250

Lys

Ala

Ile

Gin

Glu 255

Arg

Lys

Asn Ala

Pro 260

Lys

Ala

Glu Arg Aso 265

Pro

Arg

Leu

Pro

Lys 270

Pro

Gin

Gly

Gin Thr 275

Val

Gly

Ser

Phe Arg Lys 280

Gly

Leu

Arg

Met 285

Leu

Pro

Glu

Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu

290 295 300

Ser Gly Ile Thr Lys Leu Glu Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Thr Tyr Glu

305 310 315 320

Thr

Pro

Asp Gly

Leu

Val

Ser

Val

Gin

Ser

Lys

Ser

Val

Val Met Thr

325

330

335

Val

Pro

Ser His

Val

Ala

Ser

Gly

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser Glu Ser

340

345

350

Ala

Asn Ala

Leu

Ser

Lys

Leu

Tyr Tyr

Pro

Val

Ala Ala Val

355

360

365

Ser

Ile

Ser Tyr

Pro

Lys

Glu

Ala

Ile

Arg

Thr

Glu

Cys

Leu Ile Asp

370

375

380

Gly

Glu

Leu Lys

Gly

Phe

Gly

Gin

Leu

His

Pro

Arg

Thr

Gin Gly Val

385

390

395

400

Glu

Thr

Leu Gly

Thr

Ile

Tyr

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn Arg Ala

405

410

415

Pro

Gly Arg

Ile

Leu

Asn

Tyr

ile

Gly Gly

Ser Thr Asn

420

425

430

Thr

Gly

Ile Leu

Ser

Lys

Ser

Glu

Gly

Glu

Leu

Val

Glu

Ala Val Asp

435

440

445

Arg Asp

Leu Arg Lys

Met

Leu

Ile

Lys

Pro

Asn

Ser

Thr

Asp Pro Leu

450

455

460

Lys

Leu

Gly Val

Arg

Val

Trp

Pro

Gin

Ala

Ile

Pro

Gin

Phe Leu Val

465

470

475

480

Gly

Bis

Phe Asp

Ile

Leu

Asp

Thr

Ala

Lys

Ser

Leu

Thr Ser Ser

485

490

495

Gly Tyr

Glu Gly

Leu

Phe

Leu

Gly Gly

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly Val Ala

500

505

510

Leu Gly Arg Cys

Val

Glu

Gly Ala Tyr

Glu

Thr

Ala

Ile

Glu Val Asn

515

520

525

Asn

Phe

Met Ser

Arg Tyr

Ala Tyr Lys

530

535

-48CZ 296023 B6 (2) Informace o SEQ ID č.: 3:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 1738 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (v) Rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 70..1596 (C) další informace: /poznámka^ „Arabidopsis protox-2 cDNK; sekvence z pWDC-1“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 3:

TTTTTTACTT ATTTCCGTCA CTGCTTTCGA CTGCTCAGAG ATTTTGACTC TGAATTGTTG 60

CAGATAGCA ATG GCG TCT GGA GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT GAA GCG 108

Met Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp fíis Gin Ile Glu Ala

5 10

GTT TCA GGA AAA AGA

GTC Val

GGA GTC GTA GGT' GCA GCT GTA AGT GGA CTT

156

Val Ser Gly 15

Lys Arg

Ala 20

Val Val Gly

Ala Gly Val Ser 25

Gly Leu

GCG

GCT

TAC

AAG

TTG

AAA

TCG

AGG

GCT

TTG

AAT

GTG

ACT

CTG

TTT

204

Ala

Tyr

Lys

Leu

Lys

Ser

Arg Gly

Leu

Asn

Val

Thr

Val

Phe

30

35

40

45

GAA

GCT

GAT

GGA

AGA

GTA

GCT

GGG

AAG

TTG

AGA

ACT

CTT

ATG

CAA AAT

252

Glu

Ala

Asp Gly Arg

Val

Gly Gly Lys

Leu

Arg

Ser

Val

Met

Gin

Asn

50

55

60

GGT

TTG

ATT

TGG GAT

GAA

GGA

GCA

AAC

ACC

ATG

ACT

GAG

GCT

GAG

CCA

300

Gly

Leu

Ile

Trp Asp

Glu

Gly

Ala

Asn

Thr

Met

Thr

Glu

Ala

Glu

Pro

65

70

75

GAA GTT

GGG

AGT

TTA

CTT

GAT

CTT

GGG

CTT

CGT

GAG

AAA

CAA

348

Glu

Val

Gly

Ser

Leu

Asp

Leu

Gly

Leu

Arg

Glu

Lys

Gin

80

85

90

TTT

CCA

ATT

TCA

GAG

AAA

AAG

CGG

TAT

ATT

GTG

CGG

AAT

GGT

CTA

CCT

396

Phe

Pro

Ile

Ser

Gin

Lys

Arg

Tyr

ile

Val

Arg

Asn

Gly

Val

Pro

95

100

105

-49CZ 296023 B6

GTC ATC CTA CCT

ACC Thr

AAT CCC ATA GAG CTC GTC ACA ACT ACT GTC CTC

444

val 110

Met Leu Pro

Asn Pro 115

Ile

Glu

Leu Val Thr Ser Ser Val Leu

120

125

TCT

ACC

CAA

TCT

AAG

TTT

CAA

ATC

TTC

GAA

CCA

TTT

TTA TGG

AAG

492

Ser

Thr

Gin

Ser

Lys 130

Phe

Gin

Ile

Leu

Leu 135

Glu

Pro

Phe

Leu Trp 140

Lys

AAA

AAG

TCC

TCA

AAA

CTC

TCA

GAT

GCA

TCT

GCT

GAA

ACT GTA

AGC

540

Lys

Ser

Ser 145

Lys

Val

Ser

Asp

Ala 150

Ser

Ala

Glu

Ser Val 155

Ser

GAG

TTC

TTT

CAA

CGC

CAT

TTT

GGA

CAA

GAG

GTT

CTT

GAC

TAT CTC

ATC

588

Glu

Phe

Phe 160

Gin

Arg

His

Phe

Gly 165

Gin

Glu

Val

Asp 170

Tyr Leu

Ile

GAC

CCT

TTT GTT

GGT

GGA

ACA

ACT

GCT

GCG

GAC

CCT

GAT

TCC CTT

TCA

636

Asp

Pro 175

Phe

Val

Gly

Thr 180

Ser

Ala

Asp

Pro 185

Asp

Ser Leu

Ser

ATC

AAG

CAT

TCT

TTC

CCA

GAT

CTC

TCG

AAT

CTA

GAG

AAA

ACT TTT

GGC

684

Met 190

Lys

His

Ser

Phe

Pro 195

Asp

Leu

Trp

Asn

Val 200

Glu

Lys

Ser Phe

Gly 205

TCT

ATT

ATA

CTC

GCT

GCA ATC

AGA

ACA

AAG

TTT

GCT

AAA GCT

GCT

732

Ser

Ile

Val

Gly 210

Ala

Ile

Arg

Thr

Lys 215

Phe

Ala

Lys Gly Gly 220

AAA

ACT

AGA

GAC

ACA

AAG

ACT

TCT

CCT

GGC

ACA

AAA

AAG

GCT TCG

CCT

780

Lys

Ser

Arg

Asp 225

Thr

Lys

Ser

Pro 230

Gly

Thr

Lys

Gly Ser 235

Arg

GGG

TCA

TTC

TCT

TTT

AAG

GGG

GGA ATG

CAG

ATT

CTT

CCT

GAT ACG

TTC

828

Gly

Ser

Phe 240

Ser

Phe

Lys

Gly

Gly 245

Met

Gin

Ile

Leu

Pro 250

Asp Thr

Leu

TCC

AAA

ACT

CTC

TCA

CAT

GAT

GAG

ATC

AAT

TTA

GAC

TCC

AAG CTA

CTC

876

Cys

Lys 255

Ser

Leu

Ser

His

Asp 260

Glu

Ile

Asn

Leu

Asp 265

Ser

Lys Val

Leu

TCT

TTG

TCT

TAC

AAT

TCT

GGA

TCA

AGA

CAG

GAG

AAC

TCG

TCA TTA

TCT

924

Ser 270

Leu

Ser

Tyr

Asn

Ser 275

Gly

Ser

Arg

Gin

Glu 280

Asn

Trp

Ser Leu

Ser 285

TCT

CTT

TCG

CAT

AAT

GAA

ACG

CAG

AGA

CAA

AAC

CCC

CAT

TAT GAT

GCT

972

cys

Val

Ser

His

Asn 290

Glu

Thr

Gin

Arg

Gin 295

Asn

Pro

His

Tyr Asp 300

Ala

CTA

ATT

ATG

ACG

GCT

CCT

CTC

TGC

AAT

GTC

AAG

GAG

ATC

AAG GTT

ATC

1020

Val

Ile

Met

Thr 305

Ala

Pro

Leu

Cys

Asn 310

Val

Lys

Glu ,

Met

Lys Val 315

Met

-50CZ 296023 B6

AAA GGA GGA CAA CCC

TTT CAG Phe Gin

CTA AAC TTT CTC CCC GAG

ATT AAT

TAC Tyr

1068

Lys

Gly

Gly Gin Pro 320

Leu Asn Phe 325

Leu

Pro

Glu 330

lle

Asn

ATG

CCC

CTC

TCG

GTT

TTA

ATC

ACC

ACA

TTC

ACA

AAG

GAG

AAA

GTA

AAG

1116

Met

Pro

Leu

Ser

Val

Leu

lle

Thr

Phe

Thr

Lys

Glu

Lys

Val

Lys

335

340

345

AGA

CCT

CTT

GAA

GGC

TTT

GGG

GTA

CTC

ATT

CCA

TCT

AAG

GAG

CAA

AAG

1164

Arg

Pro

Leu

Glu

Gly

Phe

Gly

Val

Leu

lle

Pro

Ser

Lys

Glu

Gin

Lys

350

355

360

365

CAT

GGT

TTC

AAA

ACT

CTA

GGT

ACA

CTT

TTT

TCA

ATG

TTT

CCA

1212

His

Gly

Phe

Lys

Thr

Leu

Gly Thr

Leu

Phe

Ser

Met

Phe

Pro

370

375

380

GAT

CGT

TCC

CCT

AGT

GAC

GTT

CAT

CTA

TAT

ACA

ACT

TTT

ATT

GGT

GGG

1260

Asp

Arg

Ser

Pro

Ser

Asp

Val

His

Leu

Tyr

Thr

Phe

Ue

Gly Gly

385

390

395

AGT

AGG

AAC

CAG GAA

CTA

GCC

AAA

GCT

TCC

ACT

GAC

GAA

TTA

AAA

CAA

1308

Ser

Arg

Asn

Gin

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Ser

Thr

Asp

Glu

Leu

Lys

Gin

400

405

410

GTT

GTG

ACT

TCT

GAC

CTT

CAG

CGA

CTG

TTG

GGG

GTT

GAA

GGT

GAA

CCC

1356

Val

Thr

Ser

Asp

Leu

Gin

Arg

Leu

Gly

Val

Glu

Gly

Glu

Pro

415

420

425

GTG

TCT

GTC

AAC

CAT

TAC

TAT

TGG

AGG

AAA

GCA

TTC

CCG

TTG

TAT

GAC

1404

Val

Ser

Val

Asn

His

Tyr

Trp

Arg

Lys

Ala

Phe

Pro

Leu

Tyr

Asp

430

435

440

445

AGC

TAT

GAC

TCA

GTC

ATG

GAA

GCA

ATT

GAC

AAG

ATG GAG

AAT

GAT

1452

Ser

Tyr Asp

Ser

Val

Met

Glu

Ala

lle

Asp

Lys

Met

Glu

Asn

Asp

450

455

460

CTA

CCT

GGG

TTC

TAT

GCA

GGT

AAT

CAT

CGA

GGG

CTC

TCT

GTT

1500

Leu

Pro

Gly

Phe

Tyr

Ala

Gly

Asn

His

Arg

Gly

Leu

Ser

Val

465

470

475

GGG

AAA

TCA

ATA

GCA

TCA

GGT

TGC

AAA

GCA

GCT

GAC

CTT

GTG

ATC

TCA

1548

Gly

Lys

Ser

lle

Ala

Ser

Gly Cys

Lys

Ala

Asp

Leu

Val

lle

Ser

480

485

490

TAC

CTG

GAG

TCT

TGC

TCA

AAT

GAC

AAG

AAA

CCA

AAT

GAC

AGC

TTA

TAACATTGTC

1603

Tyr

Leu

Glu

Ser

cys

Ser

Asn Asp

Lys

Pro

Asn

Asp

Ser

Leu

495 500 505

AAGGTTCGTC CCTTTTTATC ACTTACTTTG TAAACTTGTA AAATGCAACA AGCCGCCGTG 1663

CGATTAGCCA ACAACTCAGC AAAACCCAGA TTCTCATAAG GCTCACTAAT TCCAGAATAA 1723

ACTATTTATG TAAAA (2) Informace o SEQ ID č.: 4:

(i) Charakteristika sekvencí:

(A) délka: 508 aminokyselin

1738

-51 CZ 296023 B6 (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Popis sekvence: SEQ ID č.: 4:

Met

Ala

Ser

Gly

Ala

Val

Ala

Asp

His

Gin

Ile

Glu

Ala

Val

Ser

Gly

I

5

10

15

Lys

Arg

Val

Ala

Val

Gly

Ala

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Ala

20

25

30

Tyr

Lys

Leu

Lys

Ser

Arg

Gly

Leu

Asn

Val

Thr

Val

Phe

Glu

Ala

Asp

35

40

45

Gly

Arg

Val

Gly

Giy

Lys

Leu

Arg

Ser

Val

Met

Gin

Asn

Gly

Leu

Ile

50

55

60

Trp

Asp

Glu

Gly

Ala

Asn

Thr

Met

Thr

Glu

Ala

Glu

Pro

Glu

Val

Gly

65

70

75

80

Ser

Leu

Asp

Leu

Gly

Leu

Arg

Glu

Lys

Gin

Phe

Pro

ile

85

90

95

Ser

Gin

Lys

Arg

Tyr

Ile

Val

Arg

Asn

Gly

Val

Pro

Val

Met

Leu

100

105

110

Pro

Thr

Asn

Pro

Ile

Glu

Leu

Val

Thr

Ser

Val

Leu

Ser

Thr

Gin

115

120

125

Ser

Lys

Phe

Gin

Ile

Leu

Glu

Pro

Phe

Leu

Trp

Lys

Ser

130

135

140

Ser

Lys

Val

Ser

Asp

Ala

Ser

Ala

Glu

Ser

Val

Ser

Glu

Phe

145

150

155

160

Gin

Arg

His

Phe

Gly

Gin

Glu

Val

Asp

Tyr

Leu

Ile

Asp

Pro

Phe

165

170

175

Val

Gly

Thr

Ser

Ala

Asp

Pro

Asp

Ser

Leu

Ser

Met

Lys

His

180

185

190

Ser

Phe

Pro

Asp

Leu

Trp

Asn

Val

Glu

Lys

Ser

Phe

Gly

Ser

Ile

-52CZ 296023 B6

195

200

205

Val

Gly

Ala

Ile

Arg

Thr

Lys

Phe

Ala Ala Lys

Gly Gly Lys

Ser

Arg

210

215

220

Asp

Thr

Lys Ser

Ser

Pro

Gly

Thr

Lys Lys Gly

Ser

Arg Gly

Ser

Phe

225

230

235

240

Ser

Phe

Lys Gly Gly

Met

Gin

Ile

Leu Pro

Asp

Thr

Leu Cys Lys

Ser

245

250

255

Leu

Ser

His

Asp

Glu

Ile

Asn

Leu

Asp Ser

Lys

Val

Leu Ser

Leu

Ser

260

265

270

Tyr

Asn

Ser

Gly

Ser

Arg

Gin

Glu

Asn Trp

Ser

Leu

Ser Cys

Val

Ser

275

280

285

His

Asn

Glu

Thr

Gin

Arg

Gin

Asn

Pro His

Tyr

Asp

Ala Val

Ile

Met

290

295

300

Thr

Ala

Pro

Leu

Cys

Asn

Val

Lys

Glu Met

Lys

Val

Met Lys

Gly Gly

305

310

315

320

Gin

Pro

Phe

Gin

Leu

Asn

Phe

Leu

Pro Glu

Ile

Asn

Tyr Met

Pro

Leu

325

330

335

Ser

Val

Leu

Ile

Thr

Phe

Thr

Lys Glu

Lys

Val

Lys Arg

Pro

Leu

340

345

350

Glu

Gly

Phe

Gly

Val

Leu

Ile

Pro

Ser Lys

Glu

Gin

Lys His

Gly

Phe

355

360

365

Lys

Thr

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser

Ser Met

Met

Phe

Pro Asp Arg

Ser

370

375

380

Pro

Ser

Asp

Val

His

Leu

Tyr

Thr

Thr Phe

Ile

Gly

Gly Ser

Arg

Asn

385

390

395

400

Gin

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Ser

Thr

Asp Glu

Leu

Lys

Gin Val

Val

Thr

405

410

415

Ser

Asp

Leu

Gin

Arg

Leu

Gly

Val Glu

Gly

Glu

Pro Val

Ser

Val

420

425

430

Asn

His

Tyr Tyr Trp Arg Lys

Ala

Phe Pro

Leu

Tyr

Asp Ser

Ser

Tyr

435

440

445

Asp

Ser

Val

Met

Glu

Ala

Ile

Asp

Lys Met

Glu

Asn

Asp Leu

Pro

Gly

450

455

460

Phe

Tyr

Ala

Gly

Asn

His .

Arg Gly Gly

Leu

Ser

Val Gly Lys

Ser

465

470

475

480

Ile

Ala

Ser

Gly Cys

Lys

Ala

Asp Leu

Val

Ile

Ser Tyr Leu

Glu

485

490

495

Ser

Cys

Ser

Asn Asp Lys

Lys

Pro

Asn Asp

Ser

Leu

500 505

-53 CZ 296023 B6 (2) Informace o SEQ ID č.: 5:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 1698 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (v) Rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 2 1453 (C) další informace: /poznámka= „Arabidopsis protox-1 cDNK (ne v plné délce); sekvence z pWDC-4“

-54CZ 296023 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 5:

G AAT TCG GCG GAC TGC GTC GTG GTG GGC GGA GGC ATC AGT GGC CTC 46

Asn Ser Ala Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu

1

5

10

15

TGC

' ACC

GCG

; CAG

; GCG

; ctg

GCC ACG

CGG

^: CAC

GGC

GTC

GGG GAC

GTG

CTT

94

Cys

Thr

Ala

. Gin

. Ala

, Leu

Ala Thr

Arg

His

Giy

Val

Gly Asp

Val

Leu

20

25

30

GTC

ACG

GAG

GCC

CGC

GCC

CGC CCC

GGC

AAC

ATT

ACC

GTC

GAG

142

Val

Thr

Glu

Ala

Arg

Ala

Ařg Pro

Gly Gly

Asn

Ile

Thr

Val

Glu

35

40

45

CGC

CCC

GAG

GAA

GGG

TAC

CTC TGG

GAG

GGT

CCC

AAC

AGC

TTC

CAG

190

Arg

Pro

Glu

Gly Tyr

Leu Trp

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gin

50

55

60

CCC

TCC

GAC

CCC

GTT

CTC

ACC ATG

GCC

GTG

GAC

AGC

GGA

CTG

AAG

GAT

238

Pro

Ser

Asp

Pro

Val

Leu

Thr Met

Ala

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Asp

65

70

75

GAC

TTG

GTT

TTT

GGG

GAC

CCA AAC

GCG

CCG

CGT

TTC

GTG

CTG

TGG

GAG

286

Asp

Leu

Val

Phe

Gly Asp

Pro Asn

Ala

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Trp

Glu

80

85

90

95

GGG

AAG

CTG

AGG

CCC

GTG

CCA TCC

AAG

CCC

GCC

GAC

CTC

CCG

TTC

334

Gly

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

Pro Ser

Lys

Pro

Ala

Asp

Leu

Pro

Phe

100

105

110

GAT

CTC

ATG

AGC

ATC

CCA

GGG AAG

CTC

AGG

GCC

GGT

CTA

GGC

GCG

CTT

382

Asp

Leu

Met

Ser

Ile

Pro

Gly Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Leu

Gly

Ala

Leu

115

120

125

GGC

ATC

CGC

CCG

CCT

CCA GGCCGC

GAA

GAG

TCA

GTG

GAG

TTC

430

Gly

ile

Arg

Pro

Pro Gly Arg

Glu

Ser

Val

Glu

Phe

130

135

140

GTG

CGC

AAC

CTC

GGT

GCT GAG

GTC

TTT

GAG

CGC

CTC

ATT

GAG

CCT

478

Val

Arg

Asn

Leu

Gly' Ala Glu

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

145

150

155

TTC

TGC

TCA GGT

GTC

TAT GCT GGT

GAT

CCT

TCT

AAG

CTC

AGC

ATG

AAG

526

Phe

Cys

Ser

Gly

val

Tyr Ala Gly Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

160

165

170

175

GCT

GCA

TTT

GGG

AAG

GTT

TGG CGG

TTG

GAA

ACT

GGA

GGT

AGT

ATT

574

Ala

Phe

Gly Lys

Val

Trp Arg

Leu

Glu

Thr

Glv Gly

Ser

Ile

180

185

190

ATT

GGT

GGA

ACC .

ATC

AAG

ACA ATT

CAG

GAG

AGG

AGC

AAG AAT

CCA AAA

622

Ile

Gly Gly

Thr

Ile

Lys

Thr Ile

Gin

Glu

Arg

Ser

Lys Asn Pro Lys

195 200 205

-55 CZ 296023 B6

CCA CCG AGG Pro Pro Arg

GAT Asp

GCC. CGC CTT CCG-AAG

CCA AAA GGG CAG ACA GTT GCA

670

Ala

Arg Leu

Pro 215

Lys

Pro

Lys

Gly

Gin Thr Val Ala 220

210

TCT

TTC

AGG

AAG

GGT

CTT

GCC

ATG

CTT

CCA

AAT

GCC

ATT

ACA TCC AGC

718

Ser

Phe

Arg

Lys Gly

Leu

Ala

Met

Leu

Pro

Asn

Ala

lle

Thr

Ser

225

230

235

TTG

GGT

AGT

AAA

GTC

AAA

CTA

TCA

TGG

AAA

CTC

ACG

AGC

ATT

ACA

AAA

766

Leu

Gly

Ser

Lys

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu

Thr

Ser

lle

Thr

Lys

240

245

250

255

TCA

GAT

GAC

AAG

GGA

TAT

GTT

TTG

GAG

TAT

GAA

ACG

CCA

GAA

GGG

GTT

814

Ser

Asp

Asp Lys

Gly

Tyr

Val

Leu

Glu

Tyr

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Val

260

265

270

GTT

TCG

GTG CAG

GCT

AAA

AGT

GTT

ATC

ATG

ACT

ATT

CCA

TCA

TAT

GTT

862

Val

Ser

Val

Gin

Ala

Lys

Ser

Val

lle

Met

Thr

lle

Pro

Ser

Tyr

Val

275

280

285

GCT Ala

AGC AAC ATT TTG

CGT CCA Arg Pro

CTT TCA AGC GAT GCT GCA GAT GCT CTA

910

Ser

Asn lle 290

Leu

Leu 295

Ser

Ser Asp Ala

Ala Asp Ala 300

Leu

TCA

AGA

TTC

TAT

CCA

CCG

GTT

GCT

GTA

ACT

GTT

TCG

TAT

CCA

958

Ser

Arg

Phe

Tyr

Pro

Val

Ala

Val

Thr

Val

Ser

Tyr

Pro

305

310

315

AAG

GAA

GCA

ATT

AGA

AAA

GAA

TGC

TTA

ATT

GAT

GGG

GAA

CTC

CAG

GGC

1006

Lys

Glu

Ala

lle

Arg Lys

Glu

Cys

Leu

lle

Asp

Gly

Glu

Leu

Gin

Gly

320

325

330

335

ΊΤΤ

GGC

CAG

TTG

CAT

CCA

CGT

AGT

CAA

GGA

GTT

GAG

ACA

TTA

GGA

ACA

1054

Phe

Gly

Gin

Leu

His

Pro

Arg

Ser

Gin

Gly

Val

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr

340

345

350

ATA

TAC

AGT

TCC

TCA

CTC

TTT

CCA AAT

CGT

GCT

CCT

GAC

GGT

AGG

GTG

1102

lle

Tyr

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn.

Arg

Ala

Pro

Asp Gly

Arg

Val

355

360

365

TTA

CTT

CTA

AAC

TAC

ATA

GGA GGT

GCT

ACA

AAC

ACA

GGA

ATT

GTT

TCC

1150

Leu

Asn

Tyr

lle

Gly Gly

Ala

Thr

Asn

Thr

Gly

lle

Val

Ser

370

375

380

AAG

ACT

GAA

AGT

GAG

CTG

GTC

GAA

GCA

GTT

GAC

CGT

GAC

CTC

CGA

AAA

1198

Lys

Thr

Glu

Ser

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp Arg Asp

Leu

Arg

Lys

385

390

395

ATG

CTT

ATA

AAT

TCT

ACA

GCA

GTG

GAC

CCT

TTA

GTC CTT

GGT

GTT

CGA

1246

Met

Leu

lle

Asn

Ser

Thr Ala

Val

Asp

Pro

Leu

Val Leu

Gly Val Arg

400

405

410

415

-56CZ 296023 B6

GIT TGG CCA CAA GCC ΆΤΑ CCT CAG TTC CTG GTA GGA CAT CTT GAT CTT1294

Val Trp Pro Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu

420 425430

CTG GAA GCC GCA AAA GCT GCC CTG GAC CGA GGT GGC TAC GAT GGG CTG1342

Leu Glu Ala Ala Lys Ala Ala Leu Asp Arg Gly Gly Tyr Asp. Gly Leu

435 440445

TTC CTA GGA GGG AAC TAT GTT GCA GGA GTT GCC CTG GGC AGA TGC GTT1390

Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val

450 455460

GAG GGC GCG TAT GAA AGT GCC TCG CAA ATA TCT GAC TTC TTG ACC AAG1438

Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gin Ile Ser Asp Phe Leu Thr Lys

465 470475

TAT GCC TAC AAG TGATGAAAGA AGTGGAGCGC TACTTGTTAA TCGTTTATGT1490

Tyr Ala Tyr Lys

480

TGCATAGATG AGGTGCCTCC GGGGAAAAAA AAGCTTGAAT AGTATTTTTT ATTCTTATTT1550

TGTAAATTGC ATTTCTGTTC TTTTTTCTAT CAGTAATTAG TTATATTTTA GTTCTGTAGG1610

AGATTGTTCT GTTCACTGCC CTTCAAAAGA AATTTTATTT TTCATTCITT TATGAGAGCT1670

GTGCTACTTA ΑΑΑΆΑΑΑΑΑΑ ΑΑΆΑΑΑΑΑ1698 (2) Informace o SEQ ID č.: 6:

(i) Charakteristika sekvencí:

(A) délka: 483 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: protein

-57CZ 296023 B6 (iii) Popis sekvence: SEQ ID č.: 6:

Asn

Ser

Ala

Asp

Cys

Val

val

Val

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu

Cys

1

5

10

15

Thr

Ala

Gin

Ala

Leu

Ala

Thr

Arg

His

Gly

Val

Gly

Asp

val

Leu

Val

20

25

30

Thr

Glu

Ala

Arg

Ala

Arg

Pro

Gly

Asn

Ile

Thr

Val

Glu

Arg

35

40

45

Pro

Glu

Gly

Tyr

Leu

Trp

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gin

Pro

50

55

60

Ser

Asp

Pro

Val

Leu

Thr

Met

Ala

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp

65

70

75

80

Leu

Val

Phe

Gly

Asp

Pro

Asn

Ala

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Trp

Glu

Gly

85

90

95

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Pro

Ala

Asp

Leu

Pro

Phe

Phé

Asp

100

105

110

Leu

Met

Ser

Ile

Pro

Gly

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Leu

Gly

Ala

Leu

Gly

115

120

125

Ile

Arg

Pro

Gly

Arg

Glu

Ser

Val

Glu

Phe

Val

130

135

140

Arg

Asn

Leu

Gly

Ala

Glu

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

145

150

155

160

Cys

Ser

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

165

170

175

-58CZ 296023 B6

Ala Phe Gly	Lys Val	Trp Arg	Leu Glu 185	Glu Thr Gly	Gly Ser	Ile Ile
		180		190
Gly Gly	Thr 195	Ile Lys	Thr	Ile	Gin 200	Glu	Arg Ser Lys	Asn Pro 205	Lys	Pro
Pro Arg 210	Asp	Ala Arg	Leu	Pro 215	Lys	Pro	Lys Gly Gin 220	Thr Val	Ala	Ser
Phe Arg Lys 225	Gly Leu	Ala 230	Met	Leu	Pro	Asn Ala Ile 235	Thr Ser	Ser	Leu 240
Gly Ser	Lys	Val Lys 245	Leu	Ser	Trp Lys	Leu Thr Ser 250	Ile Thr	Lys 255	Ser
Asp Asp	Lys	Gly Tyr 260	Val	Leu	Glu	Tyr 265	Glu Thr Pro	Glu Gly 270	Val	Val
Ser Val	Gin 275	Ala Lys	Ser	Val	Ile 280	Met	Thr Ile Pro	Ser Tyr 285	Val	Ala
Ser Asn 290	Ile	Leu Arg	Pro	Leu 295	Ser	Ser	Asp Ala Ala 300	Asp Ala	Leu	Ser
Arg Phe 305	Tyr	Tyr Pro	Pro 310	Val	Ala	Ala	Val Thr Val 315	Ser Tyr	Pro	Lys 320
Glu Ala	Ile	Arg Lys 325	Glu	Cys	Leu	Ile	Asp Gly Glu 330	Leu Gin	Gly 335	Phe
Gly Gin	Leu	His Pro 340	Arg	Ser	Gin	Gly 345	Val Glu Thr	Leu Gly 350	Thr	Ile
Tyr Ser	Ser 355	Ser Leu	Phe	Pro	Asn 360	Arg	Ala Pro Asp	Gly Arg 365	Val	Leu
Leu Leu 370	Asn	Tyr Ile	Gly	Gly 375	Ala	Thr	Asn Thr Gly 380	Ile Val	Ser	Lys
Thr Glu 385	Ser	Glu Leu	val 390	Glu	Ala	Val	Asp Arg Asp 395	Leu Arg Lys	Met 400
Leu Ile	Asn	Ser Thr 405	Ala	Val	Asp	Pro	Leu Val Leu 410	Gly Val	Arg 415	Val
Trp Pro	Gin	Ala Ile 420	Pro	Gin	Phe	Leu 425	Val Gly His	Leu Asp 430	Leu	Leu
Glu Ala	Ala 435	Lys Ala	Ala	Leu	Asp Arg 440	Gly Gly Tyr Asp Gly 445	Leu	Phe

Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu 450 455 460

Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gin Ile Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr

465 470 475 480

Ala Tyr Lys

-59CZ 296023 B6 (2) Informace o SEQ ID č.: 7:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 2061 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (v) Rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 64 1698 (C) další informace: /poznámka^ „protox-2 cDNK z kukuřice; sekvence zpWDC-3“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 7:

CTCTCCTACC TCCACCTCCA CGACAACAAG CAAATCCCCA TCCAGTTCCA AACCCTAACT 60

CAA ATG Met

CTC Leu

GCT TTG ACT GCC TCA GCC TCA TCC GCT TCG TCC CAT CCT

108

Ala Leu

Thr 5

Ala

Ser Ala

Ser

Ser 10

Ala Ser

Ser His Pro 15

1

TAT

CGC

CAC

GCC

TCC

GCG

CAC

ACT

CGT

CGC

CCC

CGC

CTA

CGT

GCG

GTC'

156

Tyr Arg

His

Ala

Ser 20

Ala

His

Thr

Arg

Arg 25

Pro

Arg

Leu

Arg

Ala 30

Val

CTC

GCG

ATG

GCG GGC

TCC

GAC

CCC

CGT

GCA

GCG

CCC

GCC

AGA

TCG

204

Leu

Ala

Met

Ala 35

Gly

Ser

Asp

Pro 40

Arg

Ala

Pro

Ala 45

Arg

Ser

GTC

GCC

GTC

GGC

GCC

GGG

GTC

AGC

GGG

CTC

GCG

TAC

AGG

252

Val

Ala

Val 50

Val

Gly

Ala

Gly

Val 55

Ser

Gly

Leu

Ala

Ala 60

Ala

Tyr Arg

-60CZ 296023 B6

CTC

AGA

CAG

AGC

GGC

GTG

AAC

GTA

ACG

GTG

TTC

GAA

GCG

GCC GAC

AGG

300

Leu

Arg

Gin

Ser

Gly

Val

Asn

Val

Thr

Val

Phe

Glu

Ala

Ala Asp

Arg

65

70

75

GCC

GGA

AAG

ATA

CGG

ACC

AAT

TCC

GAG

GGC

GGG

TTT

GTC Ί&3

GAT

348

Ala

Gly

Lys

Ile

Arg

Thr

Asn

Ser

Glu

Gly

Phe

Val Trp Asp

80

85

90

95

GAA

GGA

GCT

AAC

ACC

ATG

ACA

GAA

GGT

GAA

TGG

GAG

GCC

ACT AGA

CTG

396

Glu

Gly

Ala

Asn

Thr

Met

Thr

Glu

Gly

Glu

Trp

Glu

Ala

Ser Arg

Leu

100

105

110

ATT

GAT

CTT

GGT

CTA

CAA

GAC

AAA

CAG

TAT

CCT

AAC TCC

CAA

444

Ile

Asp Asp

Leu

Gly

Leu

Gin

Asp Lys

Gin

Tyr

Pro

Asn Ser

Gin

115

120

125

CAC

AAG

CGT

TAC

ATT

GTC

AAA

GAT

GGA

GCA

CCA

GCA

CTG

ATT CCT

TCG

492

His

Lys Arg Tyr

Ile

Val

Lys

Asp Gly

Ala

Pro

Ala

Leu

Ile Pro

Ser

130

135

140

GAT

CCC

ATT

TCG

CTA

ATG

AAA

AGC

AGT

GTT

CTT

TCG

ACA

AAA TCA AAG

540

Asp

Pro

Ile

Ser

Leu

Met

Lys

Ser

Val

Leu

Ser

Thr

Lys Ser

Lys

145

150

155

ATT

GCG

TTA

TTT

GAA

CCA

TTT

CTC

TAC

AAG

AAA

GCT

AAC ACA AGA

588

Ile

Ala

Leu

Phe

Glu

Pro

Phe

Leu

Tyr

Lys

Lvs

Ala

Asn Thr

Arg

160

165

170

175

AAC

TCT

GGA

AAA

GTG

TCT

GAG

CAC

TTG

AGT

GAG

AGT

GTT GGG

AGC

636

Asn

Ser

Gly

Lys

Val

Ser

Glu

His

Leu

Ser

Glu

Ser

Val Gly

Ser

180

185

190

TTC

TGT

GAA

CGC

CAC

TTT

GGA

AGA

GAA

GTT

GAC

TAT

TTT GTT

GAT

684

Phe

Cys

Glu

Arg

His

Phe

Gly Arg

Glu

Val

Asp

Tyr

Phe Val

Asp

195

200

205

CCA

TTT

GTA

GCT

GGA

ACA

AGT

GCA

GGA

GAT

CCA

GAG

TCA

CTA TCT

ATT

732

Pro

Phe

val

Ala

Gly

Thr

Ser

Ala

Gly Asp

Pro

Glu

Ser

Leu Ser

Ile

210

215

220

CGT

CAT

GCA

TTC

CCA

GCA

TTG

TGG

AAT

TTG

GAA

AGA

AAG

TAT GCT

TCA

780

Arg

His

Ala

Phe

Pro

Ala

Leu

Trp

Asn

Leu

Glu

Arg

Lys

Tyr Gly

Ser

225

230

235

GTT

ATT

GTT

GGT

GCC

ATC

TTG

TCT

AAG

CTA

GCA

GCT

AAA

GCT GAT

CCA

828

val

Ile

val

Gly

Ala

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

Ala

Lys Gly Asp

Pro

240

245

250

255

GTA

AAG

ACA

AGA

CAT

GAT

TCA

GGG

AAA

AGA

AGG

AAT AGA CGA

CTG

876

Val

Lys

Thr

Arg

His

Asp

Ser

Gly

Lys

Arg Arg Asn Arg Arg

Val

260

265

270

-61 CZ 296023 B6

TCG TTT TCA TTT CAT GGT GGA ATG CAG TCA CTA ATA AAT GCA CTT CAC

924

Ser

Phe Ser

Phe His Gly Gly 275

Met Gin Ser 280

Leu Ile Asn

Ala Leu His 285

AAT

GAA

GTT

GGA

GAT

AAT

GTG

AAG

CTT

GGT

ACA

GAA

GTG

TTG TCA

972

Asn

Glu

val 290

Gly

Asp Asp

Asn

Val 295

Lys

Leu

Gly

Thr

Glu 300

Val

Leu Ser

TTG

GCA

TGT

ACA

TTT

GAT

GGA

GTT

CCT

GCA

CTA

GGC

AGG

TGG

TCA ATT

1020

Leu

Ala 305

Cys

Thr

Phe

Asp

Gly 310

Val

Pro

Ala

Leu

Gly 315

Arg Trp

Ser Ile

TCT

GTT

GAT

TCG

AAG

GAT

AGC

GGT

GAC

AAG

GAC

CTT

GCT

AGT

AAC CAA

1068

Ser 320

Val

Asp

Ser

Lys

Asp 325

Ser

Gly Asp

Lys

Asp 330

Leu

Ala

Ser

Asn Gin 335

ACC

TTT

GAT

GCT

GTT

ATA

ATG

ACA

GCT

CCA

TTG

TCA

AAT

GTC

CGG AGG

1116

Thr

Phe

Asp

Ala

val 3'40

Ile

Met

Thr

Ala

Pro 345

Leu

Ser

Asn

Val

Arg Arg 350

ATG

AAG

TTC

ACC

AAA

GGT

GGA GCT

CCG

GTT

CTT

GAC

TTT

CTT CCT

1164

Met

Lys

Phe

Thr 355

Lys

Gly Gly

Ala

Pro 360

Val

Leu

Asp

Phe 365

Leu Pro

AAG

ATG

GAT

TAT

CTA

CCA

CTA

TCT

CTC

ATG

GTG

ACT

GCT

TTT

AAG AAG

1212

Lys

Met

Asp Tyr 370

Leu

Pro

Leu

Ser 375

Leu

Met

Val

Thr

Ala 380

Phe

Lys Lys

GAT

GTC

AAG

AAA

CCT

CTG

GAA

GGA

TTT

GGG

GTC

TTA

ATA

CCT TAC

1260

Asp

Asp 385

Val

Lys

Pro

Leu 390

Glu

Gly

Phe

Gly

Val 395

Leu

Ile

Pro Tyr

AAG

GAA

CAG

CAA

AAA

CAT

GGT

CTG

AAA

ACC

CTT

GGG

ACT

CTC

TTT TCC

1308

Lys 400

Glu

Gin

Lys

His 405

Gly

Leu

Lys

Thr

Leu 410

Gly

Thr

Leu

Phe Ser 415

TCA

ATG

TTC

CCA

GAT

CGA

GCT

CCT

GAT

GAC

CAA

TAT

TTA

TAT ACA

1356

Ser

Met

Phe

Pro 420

Asp Arg

Ala

Pro

Asp Asp 425

Gin

Tyr

Leu

Tyr Thr 430

ACA

TTT

GTT

GGG

GGT

AGC

CAC

AAT

AGA

GAT

CTT

GCT

GGA

GCT

CCA ACG

1404

Thr

Phe

Val

Gly Gly 435

Ser

HÍ5

Asn

Arq 440

Asp

Leu

Ala

Gly

Ala 445

Pro Thr

TCT

ATT

CTG

AAA

CAA

CTT

GTG

ACC

TCT

GAC

CTT

AAA

CTC

TTG GGC

1452

Ser

Ile

Leu 450

Lys

Gin

Leu

Val

Thr 455

Ser

Asp

Leu

Lys

Lys 460

Leu

Leu Gly

GTA

GAG

GGG

CAA

CCA

ACT

TTT

GTC

AAG

CAT

GTA

TAC

TGG

GGA .

AAT GCT

1500

Val

Glu 465

Gly

Gin

Pro

Thr

Phe 470

Val

Lys

His

Val

Tyr 475

Trp Gly

Asn Ala

-62CZ 296023 B6

TTT CCT Phe Pro 480

TTG TAT GGC

CAT GAT TAT AGT TCT GTA TTG GAA GCT ATA GAA

Leu

Tyr Gly

His Asp 485

Tyr

Ser

Ser Val 490

Leu

Glu

Ala

Ile Glu 495

AAG

ATG

GAG

AAA

AAC

CTT

CCA

GGG

TTC

TAC

GCA

GGA

AAT

AGC

AAG

Lys

Met

Glu

Lys

Asn

Leu

Pro

Gly

Phe

Tyr

Ala

Gly

Asn

Ser Lys

500

505

510

GAT

GGG

CTT

GCT

GTT

GGA AGT

GTT

ATA

GCT

TCA

GGA

AGC

AAG

GCT

Asp

Gly

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Val

Ile

Ala

Ser

Gly

Ser

Lys

Ala

515

520

525

GAC

CTT

GCA

ATC

TCA

TAT

CTT

GAA

TCT

CAC

ACC

AAG

CAT

AAT

TCA

ASp

Leu

Ala

Ile

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

His

Thr

Lys

His

Asn

Ser

530

535

540

CAT TGAAAGTGTC TGACCTATCC TCTAGCAGTT GTCGACAAAT TTCTCCAGTT

His

545

CATGTACAGT AGAAACCGAT GCGTTGCAGT TTCAGAACAT CTTCACTTCT TCAGATATTA ACCCTTCGTT GAACATCCAC CAGAAAGGTA GTCACATGTG TAAGTGGGAA AATGAGGTTA AAAACTATTA TGGCGGCCGA AATGTTCCTT TTTGTTTTCC TCACAAGTGG CCTACGACAC TTGATGTTGG AAATACATTT AAATTTGTTG AATTGTTTGA GftACACATGC GTGACGTGTA ATATTTGCCT ATTGTGATTT TAGCAGTACT CTTGGCCAGA TTATGCTTTA CGCCTTTAAA aaaaaaaaaa aaaaaa

1548

1596

1644

1692

1745

1805

1865

1925

1985

2045

2061 (2) Informace o SEQ ID č.: 8:

(i) Charakteristika sekvencí:

(A) délka: 544 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární io (ii) Typ molekuly: protein

-63CZ 296023 B6

(iii) Popis sekvence: SEQ ID č.:

8:

Met

Leu Ala

i Leu

i Thr

Ala

. Ser

: Ala

. Ser

Ser

‘ Ala

. Ser

Ser

: His

Pro

' Tyr.

1

5

10

15

Arg

His Ala

Ser

' Ala

His

Thr

: Arg Arg

Pro

¹ Arg

' Leu

. Arg

• Ala

Val

Leu

20

25

30

Ala

Met Ala

Gly

Ser

Asp Asp

Pro

Arg

Ala

Pro

Ala

Arg

Ser

Val

35

40

45

Ala

Val Val

Gly

Ala

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Ala

Tyr

Arg

Leu

50

55

60

Arg

Gin Ser

Gly

Val

Asn

Val

Thr

Val

Phe

Glu

Ala

Asp Arg

Ala

65

70

75

80

Gly Gly Lys

Ile

Arg

Thr

Asn

Ser

Glu

Gly Gly

Phe

Val

Trp

Asp

Glu

85

90

95

Gly Ala Asn

Thr

Met

Thr

Glu

Gly

Glu

Trp

Glu

Ala

Se'r

Arg

Leu

Ile

100

105

110

Asp Asp Leu

Gly

Leu

Gin

Asp Lys

Gin

oyr

Pro

Asn

Ser

Gin

His

115

120

125

Lys

Arg Tyr

Ile

Val

Lys Asp Gly

Ala

Pro

Ala

Leu

Ile

Pro

Ser

Asp

130

135

140

Pro

Ile Ser

Leu

Met

Lys

Ser

Val

Leu

Ser

Thr

Lys

Ser

Lys

Ile

145

150

155

160

Ala

Leu Phe

Phe

Glu

Pro

Phe

Leu

Tyr Lys

Lys

Ala

Asn

Thr

Arg

Asn

165

170

175

Ser

Gly Lys

Val

Ser

Glu

His

Leu

Ser

Glu

Ser

Val

Giy

Ser

Phe

180

185

190

cys

Glu Arg

His

Phe

Gly Arg

Glu

Val

Asp Tyr

Phe

Val

Asp

Pro

195

200

205

Phe

Val Ala

Gly

Thr

Ser Ala

Gly Asp

Pro

Glu

Ser

Leu

Ser

Ile

Arg

210 215 220

-64CZ 296023 B6

His Ala Phe 225	Pro Ala Leu 230	Trp Asn Leu Glu Arg Lys 235	Tyr Gly Ser Val 240
Ile Val Gly	Ala Ile Leu	Ser Lys Leu Ala Ala Lys	Gly Asp Pro Val
	245	250	255
Lys Thr Arg	His Asp Ser	Ser Gly Lys Arg Arg Asn	Arg Arg Val Ser
	260	265	270
Phe Ser Phe	His Gly Gly	Met Gin Ser Leu Ile Asn	Ala Leu His Asn
275		280	285
Glu Val Gly Asp Asp Asn	Val Lys Leu Gly Thr Glu	Val Leu Ser Leu
290		295 300
Ala Cys Thr	Phe Asp Gly	Val Pro Ala Leu Gly Arg	Trp Ser Ile Ser
305	310	315	320
Val Asp Ser	Lys Asp Ser	Gly Asp Lys Asp Leu Ala	Ser Asn Gin Thr
	325	330	335
Phe Asp Ala	Val Ile Met	Thr Ala Pro Leu Ser Asn	Val Arg Arg Met
	340	345	350
Lys Phe Thr	Lys Gly Gly	Ala Pro Val Val Leu Asp	Phe Leu Pro Lys
355		360	365
Met Asp Tyr	Leu Pro Leu	Ser Leu Met Val Thr Ala	Phe Lys Lys Asp
370		375 380
Asp Val Lys	Lys Pro Leu	Glu Gly Phe Gly Val Leu	Ile Pro Tyr Lys
385	390	395	400
Glu Gin Gin	Lys His Gly	Leu Lys Thr Leu Gly Thr	Leu Phe Ser Ser
	405	410	415
Met Met Phe	Pro Asp Arg	Ala Pro Asp Asp Gin Tyr	Leu Tyr Thr Thr
	420	425	430
Phe Val Gly	Gly Ser His	Asn Arg Asp Leu Ala Gly	Ala Pro Thr Ser
435		440	445
Ile Leu Lys	Gin Leu Val	Thr Ser As o Leu Lys Lys	Leu Leu. Gly Val
450		455 460
Glu Gly Gin	Pro Thr Phe	Val Lys His Val Tyr Trp	Gly Asn Ala Phe
465	470	475	480
Pro Leu Tyr	Gly His Asp	Tyr Ser Ser Val Leu Glu	Ala Ile Glu Lys
	485	490	495
Met Glu Lys	Asn Leu Pro	Gly Phe Phe Tyr Ala Gly	Asn Ser Lys Asp
	500	505	510
Gly Leu Ala	Val Gly Ser	Val Ile Ala Ser Gly Ser	Lys Ala Ala Asp
515		520	525
Leu Ala Ile	Ser Tyr Leu	Glu Ser His Thr Lys His	Asn Asn Ser His

530 535 540

-65CZ 296023 B6 (2) Informace o SEQ ID č.: 9:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 1697 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (v) Rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 29 1501 (C) další informace: /poznámka^ “protox-3 cDNK z kvasinky; sekvence z pWDC-5“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 9:

TTGGCATTTC CCTTGAACCA ACAATTCT ATG TCA ΑΊΤ GCA ATT TGT GGA GGA 52

Met Ser Ile Ala Ile Cys Gly Gly

5

GGT ATA

GCT GGT CTT AGT

ACA GCA TTT TAT CTT GCT AGA TTG ATT CCA

100

Gly

Ile 10

Ala Gly

Leu

Ser

Thr 15

Ala

Phe Tyr

Leu Ala Arg 20

Leu Ile Pro

AAA

TGT

ACT

ATT

GAT

TTG

TAC

GAA

AAA

GGT

CCT

CGT

TTA

GGT

GGA TGG

148

Lys

Cys

Thr

Ile

Asp

Leu

Tyr

Glu

Lys Gly

Pro

Arg

Leu

Gly Gly Trp

25

30

35

40

CTT

CAG

TCG

GTC

AAA

ATC

CCG

TGT

GCA- GAT

TCT

CCA

ACA

GGAACG

GTT

196

Leu

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Pro

Cys

Ala

Asp

Ser

Pro

Thr

Gly

Thr

Val

45

50

55

TTG

TTT

GAG

CAA

GGT

CCT

AGA

ACT

CTT

CGT

CCT

GCT

GGG GTT

GCT

GGC

244

Leu

Phe

Glu

Gin

Gly

Pro

Arg

Thr

Leu

Arg

Pro

Ala

Gly

Val

Ala

Gly

60

65

70

TTA

GCA

AAC

TTA

GAT

TTA

ATT

AGC

AAG

TTG

GGC

ATC

GAA

GAC

AAG

TTG

292

Leu

Ala

Asn

Leu

Asp

Leu

Ile

Ser

Lys

Leu

Gly

Ile

Glu

Asp

Lys

Leu

75

80

85

-66CZ 296023 B6

TTA AGG ATT TCG AGC AAT TCT CCC AGC GCA AAA AAC CGA TAT ATT TAT

340

Leu

Arg Ile 90

Ser Ser Asn Ser 95

Pro

Ser

Ala

Lys Asn 100

Arg

Tyr Ile Tyr

TAC

CCA

GAT

CGC

TTA

AAT

GAA

ATT

CCT

TCA

AGC

ATT

TTA

GGG

AGT

ATA

388

Tyr

Pro

Asp

Arg

Leu

Asn

Glu

Ile

Pro

Ser

Ile

Leu

Gly

Ser

Ile

105

110

115

120

AAG

TCG

ATT

ATG

CAG

CCT

GCT

TTG

CGT

CCG

ATG

CCT

TTG

GCT

ATG

436

Lys

Ser

Ile

Met

Gin

Pro

Ala

Leu

Arg

Pro

Met

Pro

Leu

Ala

Met

125

130

135

CTT Leu

GAG CCC TTT CGT AAA

ACT AAG CGA GAT TCG ACA GAT GAA AGC GTG

484

Glu

Pro

Phe Arg Lys 140

Ser Lys Arg 145

Asp Ser Thr

Asp Glu Ser 150

Val

GGT

TCA

TTT

ATG

AGA

TTT

GCT

AAA

AAC

CTT

ACG

GAT

AGA

GTT

532

Gly

Ser

Phe 155

Met

Arg

Phe 160

Gly

Lys

Asn

Val

Thr 165

Asp

Arg

Val

ATG

ACT

GCA

ATG

ATA

AAT

GCT

ATT

TAT

GCT

GGT

GAT

TTG

AAT

GAT

TTG

580

Met

Ser 170

Ala

Met

Ile

Asn

Gly 175

Ile

Tyr

Ala

Gly

Asp 180

Leu

Asn

Asp

Leu

TCT

ATG

CAT

TCT

AGC

ATG

TCT

GGA

TTT

TTA

GCG

AAG

ATT

GAA

AAA

AAG

628

Ser 185

Met

His

Ser

Met 190

Phe

Gly

Phe

Leu

Ala 195

Lys

Ile

Glu

Lys

Lys 200

TAT

GGA

AAC

ATT

ACT

TTG

GGA

TTA

ATT

AGA

GCT

CTT

GCA

CCT

GAA

676

Tyr

Gly

Asn

Ile

Thr 205

Leu

Gly

Leu

Ile

Arg 210

Ala

Leu

Ala

Arg 215

Glu

ATA

TTA

TCT

CCT

GCT

GAG

AAA

GCT

TTG

GAA

AGC

ACT

CGC

AGA

724

Ile

Leu

Ser

Pro 220

Ala

Glu

Lys

Ala

Leu 225

Glu

Ser

Thr

Thr 230

Arg

GCC

AAA

AAC

AGC

AGA

GCT

GTC

AAA

CAG

TAT

GAA' ATC

GAC

AAG

TAT

CTT

772

Ala

Lys

Asn 235

Ser

Arg

Ala

Val

Lys 240

Gin

Tyr

Glu

Ile

Asp 245

Lys

Tyr

Val

GCT

TTC

AAG

GAA

GGG

ATT

GAG

ACT

ATT

ACA

TTG

TCA ATA

GCA

GAT

GAA

820

Ala

Phe 250

Lys

Glu

Gly

Ile

Glu 255

Thr

Ile

Thr

Leu

Ser 260

Ile

Ala

Asp

Glu

TTA

AAA

ATG

CCG

AAT

GTC

AAG

ATA

CAT

CTA

AAC

AAA

CCG

GCC

CAA

868

Leu 265

Lys

Met

Pro

Asn 270

Val

Lys

Ile

His

Leu 275

Asn

Lys

Pro

Ala

Gin 280

ACT

TTG

GTT

CCA

CAT

AAA ACT

CAG

TCT

CTT

CTA

GAC

CTC

AAT

GCT CAA

916

Thr

Leu

Val

Pro

His 285

Lys

Thr

Gin

Ser

Leu 290

Val

Asp

Val

Asn

Gly Gin 295

67CZ 296023 B6

GCT Ala

TAC GAG TAT

GTT GTG TTT GCA AAC TCT TCT CGC AAT

TTA GAG

AAT Asn

964

Tyr

Glu Tyr 300

Val Val Phe

Ala

Asn Ser 305

Ser

Arg

Asn

Leu 310

Glu

CTA

ATA

TCT

TGT

CCT

AAA

ATG

GAA

ACT

CCG

ACG

TCG

AGT

GTT

TAT

GTC

1012

Leu

Ile

Ser

Cys

Pro

Lys

Met

Glu

Thr

Pro

Thr

Ser

Val

Tyr

Val

315

320

325

GTC

AAC

GTT

TAT

AAG

GAC

CCT

AAT

GTT

CTT

CCA

ATC

CGT

GGT

TTT

1060

Val

Asn

Val

Tyr Tyr

Lys

Asp

Pro

Asn

Val

Leu

Pro

Ile

Arg

Gly

Phe

330

335

340

GGG

CTT

TTG

ATT

CCA

TCA

TGC

ACT

CCA

AAT

CCG

AAT

CAT

GTT

CTT

1108

Gly

Leu

Ile

Pro

Ser

Cys

Thr

Pro

Asn

Pro

Asn

His

Val

Leu

345

350

355

360

GGT

ATC

GTT

TTT

GAT

AGT

GAG

CAA

AAC

CCT

GAA

AAT

GGA AGC

AAG

1156

Gly

Ile

Val

Phe

Asp

Ser

Glu

Gin

Asn

Pro

Glu

Asn

Gly

Ser

Lys

365

370

375

GTC

ACT

GTC

ATG

GGA

GGG

TCT

GCT

TAT

ACA

AAA

AAT

ACT

TCT

TTG

1204

Val

Thr

val

Met

Gly

Ser

Ala

Tyr

Thr

Lys

Asn

Thr

Ser

Leu

380

385

390

AM

CCA

ACC

AAC

CCC

GAA

GCC

GTT

AAC

AAT

GCT

CTC

AAA

GCT

TTG

1252

Ile

Pro

Thr

Asn

Pro

Glu

Ala

Val

Asn

Ala

Leu

Lys

Ala

Leu

395

400

405

CAG

CAT

ACT

TTA

AAA

ATA

TCC

AGT

AAG

CCA

ACA

CTC

ACG

AAT

GCA ACA

1300

Gin

His

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Lys

Pro

Thr

Leu

Thr

Asn

Ala

Thr

410

415

420

TTA

CAA

CCA

AAT

TGC

ATC

CCT

CAA

TAT

CGT

GTT

GGG

CAT

CAA

GAT

AAT

1348

Leu

Gin

Pro

Asn

Cys

Ile

Pro

Gin

Tyr Arg

Val

Gly

HÍS

Gin

Asp

Asn

425

430

435

440

CTT

AAT

TCT

TTG

AAA

TCT

TGG

ATT

GAG

AAA

AAT

ATG

GGA

GGG

CGA

ATT

1396

Leu

Asn

Ser

Leu

Lys

Ser

Trp

Ile

Glu

Lys

Asn

Met

Gly Gly Arg

Ile

445

450

455

CTT

CTA

ACT

GGA

AGT

TGG

TAT

AAT

GGT

GTT

AGT

ATT

GGG GAT TGT

ATT

1444

Leu

Thr

Gly

Ser

Trp Tyr

Asn

Gly

Val

Ser

Ile

Gly Asp Cys

Ile

460

465

470

ATG

AAT

GGA

CAT

TCA

ACA GCT

CGA

AAA

CTA GCA

TCA

TTG

ATG AAT

TCT

1492

Met

Asn

siy

His

Ser

Thr Ala

Arg

Lys

Leu Ala

Ser

Leu

Met Asn

Ser

475

480

485

TCT TCT TGAGCGTTTA TAAATGTTGA TATAAAATTA GTATATAGTT CCTTTGATTA 1548

Ser Ser

490

TTTTATGAGT TGAAAATGCC ACTTGTGAAA TAATTTTGCA CAAGCCCTTT TATTACAGAC

GTATATGCGA GGACATTCGA CAAACGTTTG AAATTAAAAA TCATATGCCT TTTAGCTTAA

GACATCAAGG TCATGAATAA TAAAATTTT

1608

1668

1697

-68CZ 296023 B6 (2) Informace o SEQ ID č.: 10:

(i) Charakteristika sekvencí:

(A) délka: 490 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Popis sekvence: SEQ ID č.: 10:

Met Ser Ile Ala Ile

Cys Gly

Gly Gly Ile Ala Gly Leu Ser Thr

Ala

1

5

10

15

Phe

Tyr

Leu

Ala

Arg

Leu Ile

Pro

Lys

Cys

Thr

Ile

Asp

Leu

Tyr

Glu

20

25

30

Lys

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly Gly

Trp

Leu

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Pro

cys

35

40

45

Ala

Asp

Ser

Pro

Thr

Gly Thr

Val

Leu

Phe

Glu

Gin

Gly

Pro

Arg

Thr

50

55

60

Leu

Arg

Pro

Ala

Gly

Val Ala

Gly

Leu

Ala

Asn

Leu

Asp

Leu

Ile

Ser

65

70

75

80

Lys

Leu

Gly

Ile

Glu

Asp Lys

Leu

Arg

Ile

Ser

Ser Asn

Ser

Pro

85

90

95

Ser

Ala

Lys

Asn

Arg

Tyr Ile

Tyr Tyr

Pro

Asp Arg

Leu

Asn

Glu

Ile

100

105

110

Pro

Ser

Ile

Leu

Gly Ser

Ile

Lys

Ser

Ile

Met

Gin

Pro

Ala

Leu

115

120

125

Arg

Pro

Met

Pro

Leu

Ala Met

Met

Leu

Glu

Pro

Phe

Arg Lys

Ser

Lys

130

135

140

Arg

Asp

Ser

Thr

Asp

Glu Ser

Val

Gly

Ser

Phe

Met

Arg Arg Arg

Phe

145

150

155

160

Gly

Lys

Asn

Val

Thr

Asp Arg

val

Met

Ser

Ala

Met

Ile

Asn

Gly

Ile

165

170

175

Tyr

Ala

Gly Asp

Leu

Asn Asp

Leu

Ser

Met

His

Ser

Met

Phe

Gly

180

185

190

Phe

Leu

Ala Lys

Ile

Glu Lys

Lys Tyr Gly

Asn

Ile

Thr

Leu

Gly

Leu

195 200 205

-69CZ 296023 B6

Ile

: Arg Ala

i Leu

i Ala

Arg

Glu

1 Ile

Leu

: Ser

Pro

Ala

Glu

Lys

Ala

210

215

220

Leu

Glu

i Ser

Ser

• Thr

Thr

Arg

Ala

Lys

Asn

Ser

Arg

Ala

Val

Lys

225

230

235

240

Gin

Tyr

Glu

Ile

Asp

Lys

Tyr

val

Ala

Phe

Lys

Glu

Gly

Ile

Glu

Thr

245

250

255

Ile

Thr

Leu

Ser

Ile

Ala

Asp

Glu

Leu

Lys

Met

Pro

Asn

Val

Lys

260

265

270

Ile

His

Leu

Asn

Lys

Pro

Ala

Gin

Thr

Leu

Val

Pro

His

Lys

Thr

Gin

275

280

285

Ser

Leu

Val

Asp

Val

Asn

Gly

Gin

Ala

Tyr

Glu

Tyr

Val

val

Phe

Ala

290

295

300

Asn

Ser

Arg

Asn

Leu

Glu

Asn

Leu

Ile

Ser

Cys

Pro

Lys

Met

Glu

305

310

315

320

Thr

Pro

Thr

Ser

Val

Tyr

Val

Asn

Val

Tyr

Tyr Lys Asp

Pro

325

330

335

Asn

Val

Leu

Pro

Ile

Arg Gly

Phe

Gly

Leu

Ile

Pro

Ser

Cys

Thr

340

345

350

Pro

Asn

Pro

Asn

His

Val

Leu

Gly

Ile

Val

Phe

Asp

Ser

Glu

Gin

355

360

365

Asn

Pro

Glu

Asn

Gly

Ser

Lys

Val

Thr

Val

Met

Gly Gly

Ser

370

375

380

Ala

Tyr

Thr

Lys

Asn

Thr

Ser

Leu

Ile

Pro

Thr

Asn

Pro

Glu

Ala

385

390

395

400

Val

Asn

Ala

Leu

Lys

Ala

Leu

Gin

His

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

405 410 415

Lys Pro Thr Leu Thr Asn Ala Thr Leu Gin Pro Asn Cys Ile Pro Gin 420 425430

Tyr Arg Val Gly His Gin Asp Asn Leu Asn Ser Leu Lys Ser Trp Ile 435 440445

Glu Lys Asn Met Gly Gly Arg Ile Leu Leu Thr Gly Ser Trp Tyr Asn 450 455460

Gly Val Ser Ile Gly Asp Cys Ile Met Asn Gly His Ser Thr Ala Arg

465	470 475	480
Lys Leu Ala Ser Leu	Met Asn Ser Ser Ser
485	490

-70CZ 296023 B6 (2) Informace o SEQ ID č.: 11:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 41 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: oligonukleotidy užívané pro konstrukci pCGN1761ENX (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (v) Popis sekvence: SEQ ID č.: 11:

AATTATGACG TAACGTAGGA ATTAGCGGCC CGCTCTCGAG T 41 (2) Informace o SEQ ID č.: 12:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 40 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: oligonukleotidy užívané pro konstrukci pCGN1761ENX (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 12:

AATTACTCGA GAGCGGCCGC GAATTCCTAC GTTACGTCAT 40 (2) Informace o SEQ ID č.: 13:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0003 užívaný pro konstrukci pSOGlO (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne

-71 CZ 296023 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 13:

CTCGGATCCAGCAGATTCAAGAAGGTACAG 31 (2) Informace o SEQ ID č.: 14:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 31 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: j iná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0004 užívaný pro konstrukci pSOGlO (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 14:

ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG 31 (2) Informace o SEQ ID č.: 15:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 26 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0004 užívaný pro konstrukci pSOG19 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 15:

CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC 26 (2) Informace o SEQ ID č.: 16:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0010 užívaný pro konstrukci pSOG19

-72CZ 296023 B6 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 16:

AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 24 (2) Informace o SEQ ID č.: 17:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0016 užívaný pro konstrukci pSOG19 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 17:

GCTACCATGGCCACAATAGAACACC 24 (2) Informace o SEQ ID č.: 18:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 23 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0017 užívaný pro konstrukci pSOG19 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 18:

CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG 23 (2) Informace o SEQ ID č.: 19:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 28 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární

-73CZ 296023 B6 (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0039 užívaný pro konstrukci Psog30 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 19:

CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA 28 (2) Informace o SEQ ID č.: 20:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0041 užívaný pro konstrukci pSOG30 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-senze: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 20:

ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC 2 4

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Rostlina a její potomstvo, včetně jejich částí, mající změněnou aktivitu protoporfyrinogenové oxygenázy (protox), přičemž tato změněná aktivita protox propůjčuje rostlině a jejímu potomstvu toleranci k herbicidu v takovém množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu, a změněná aktivita protox je rostlině propůjčena expresí molekuly DNK, která kóduje enzym protox tolerantní k herbicidu, přičemž tento enzym protox tolerantní k herbicidu se přirozeně vyskytuje u prokaryont.
2. Rostlina podle nároku 1, kde prokaryont je vybrán ze skupiny obsahující E. coli, B. subtilis a S. typhimurium.
3. Rostlina podle nároku 1, kde molekula DNK obsahuje gen hemG z E. coli.
4. Rostlina podle nároku 1, kde molekula DNK obsahuje gen hemYz B. subtilis.
5. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, která je dvouděložná rostlina.
6. Rostlina podle nároku 5, kde rostlina je vybrána ze skupiny obsahujíc sóju, bavlnu, tabák, cukrovou řepu a řepku olejnou.

-74CZ 296023 B6
7. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, která je jednoděložná rostlina.
8. Rostlina podle nároku 7, kde rostlina je vybrána ze skupiny obsahující kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, turfové trávy a rýži.
9. Semeno rostliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8.
10. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, která je hybridní rostlina.
11. Rozmnožovací materiál rostliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, který je ošetřen ochranným povlakem.
12. Rozmnožovací materiál podle nároku 11, který obsahuje přípravek vybraný ze skupiny obsahující herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, molluscicidy nebo jejich směsi.
13. Rozmnožovací materiál podle nároku 11 nebo 12, který obsahuje semena.
14. Způsob kontroly růstu nežádoucí vegetace vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se na populaci rostlin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 aplikuje účinné množství herbicidu inhibujícího protox.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že rostlina je vybrána ze skupiny obsahující sóju, bavlnu, tabák, cukrovou řepu, řepku olejnou, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, turfové trávy a rýži.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že herbicid inhibující protox je vybrán ze skupiny obsahující aryluracil, difenylether, oxidiazol, imid, fenylpyrazol, derivát pyridinu, 3-substituovaný-2-aryl-4,5,6,7-tetrahydroindazol, fenopylat a O-fenylpyrrolidin- apiperidinkarbamátové analogy fenopylatu.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že herbicid inhibující protox je imid vzorce

Q (Vzorec V), kde Q je

-75CZ 296023 B6 nebo (Vzorec VI) (Vzorec IXa) nebo nebo (Vzorec VII) (Vzorec VIII) (Vzorec IX) nebo (Vzorec IXb), a kde Ri je H, Cl, nebo F, R₂ je Cl a R₃ je optimálně substituovaná etherová, thioetherová, esterová skupina, aminoskupina nebo alkylová skupina, přičemž R₂ a R₃ mohou společně tvořit 5-ti nebo 6-ti členný heterocyklický kruh.
18. Způsob podle nároku 17, vyznačuj ící se tím, že imid je vybrán ze skupiny obsahující ^N CHj

C14jSO₂NH (Vzorec X)_; (Vzorec XI);

-76CZ 296023 B6

Cl----. /c /' Η_δΰ₂ΟΟΟΟΗ₂0 xrt ^XN OCHF₂1 ch₃ (Vzorec XII); 0 b —Cl X SC^COOCFb (Vzorec XIII};

O

F (Vzorec XIV);

OCFfeCOOCsHn (Vzorec XV);

-77 CZ 296023 B6 (Vzorec XVI) a (Vzorec XVII) kde R je alkenyloxykarbonylalkylová skupina, kde alkenylová skupina obsahuje 2 až 6 atomů uhlíku a alkylová skupina obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku.

5
19. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že herbicid inhibující protox má vzorec vybraný ze skupiny obsahující:

(Vzorec XVIII),

-78CZ 296023 B6 (Vzorec XIX), (Vzorec XX) a (Vzorec XXI) ,
20 Způsob přípravy hostitelské buňky, které obsahuje izolovanou molekulu DNK kódující prokaryontní protein mající aktivitu protoporfyrinogenové oxidázy (protox), vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy se hostitelská buňka transformuje molekulou DNA kódující 5 enzym protox tolerantní k herbicidu, kterýžto enzym protox tolerantní k herbicidu se přirozeně vyskytuje v prokaryontech.
21. Způsob přípravy rostlinné buňky, která obsahuje izolovanou molekulu DNK kódující prokaryontní protein mající aktivitu protoporfyrinogenové oxidázy (protox), vyznačující se ío t í m , že zahrnuje krok, kdy se rostlinná buňka transformuje molekulou DNA kódující enzym protox tolerantní k herbicidu, kterýžto enzym protox tolerantní k herbicidu se přirozeně vyskytuje v prokaryontech.