UA71536C2 - Isolated dna molecule coding protoporphyrinogen oxidase, modified variants thereof and a method for use thereof - Google Patents

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к манипулированию ферментативной активностью, ответственной за 2 превращение протопорфириногена ІХ в протопорфирин ІХ в процессе биосинтеза, общего для всех зукариот.

Один из предметов изобретения относится к развитию устойчивости к гербицидам у растений, тканей растений и семян. Другой предмет изобретения относится к разработке методов диагностики и лечения дефицита зтой ферментативной активности у животньх, в частности у людей.

Процессьі биосинтеза, приводящие к производству хлорофилла и гема, включают ряд общих стадий. 70 Хлорофилл представляєт собой поглоцающий свет о пигмент, присутствующий во всех зеленьх фотосинтезирующих организмах. Гем представляет собой кофактор гемоглобина, цитохромов, Р450-оксигеназ со смешанной функцией, пероксидаз и каталаз (см., например, у І еппіпдег, Віоспетівігу, МУогій Рибіїзпегв, Мем

Могк (1975)) и, следовательно, является необходимь!м компонентом всех азробньїх организмов.

Последней общей стадией биосинтеза хлорофилла и гема является окисление протопорфириногена ІХ в 12 протопорфирин ІХ. Протопорфириноген-оксидаза (обозначенная в данном описаний как "протоке") представляет собой фермент, которьій катализирует зту последнюю стадию окисления (Маїгіпде и др., Віоспет. 9. 260: 231 (1989)).

Фермент протоке бьіл очищен полностью или частично из многочисленньїх организмов, включающих дрожжи зЗасспагогаусез сегемізіае (І арбе-Воїз и І арре, Віозупіпезів ої Нете апа СпПіогорпуїІ, Е.Н.Оаїйеу, ред. МсОгам

Нії: Мем Могк, стр.235-285 (1990)), зтиопласть! ячменя (дасобе и дасорв, Віоспет.9. 244: 219 (1987)) и печень мьіши (Оаїйеу и Каїт, Віоспет. 26: 2697 (1987)). Геньії, кюодирующие протоке, бьіли вьіделеньї из двух прокариот:

Евспегіспіа соїї (Зазаптап и др., Сап. .).Місгоріої. 39: 1155 (1993)) и Васійив зибрійв (Оайеу и др.,

У.Віої. Спет. 269: 813 (1994)). Зти геньі не обладают сходной последовательностью; кодируемье ими протеиновье продукть! не имеют каких-либо идентичньїх аминокислотньїх последовательностей. Протейин Е.сої с имеет массу приблизительно 21кДа и связан с клеточной мембраной. Протеин В.зиБійз имеет массу бїїХДАи (39 является растворимьїм, активнь/м в цитоплазме.

В настоящее время слишком мало известно о ферменте протоксе, чтобь! получить возможность вьіделить кодирующие протоке геньі из вьісших зукариот (те. животньїх, растений и всех других многоклеточньх, имеющих ядро организмов, отличньїх от низших зукариотических микроорганизмов, таких, как дрожжи, о одноклеточнье водоросли, простейшие и т.д.), используя известнье подходь. со

В частности многие стандартнье методь вьделения новьх протеийнов и сгенов базируются на предположенийи, что они обладают значительньім сходством по первичной структуре (т.е. по аминокислотной о последовательности и последовательности ДНК) с )известньми опротеинами и генами, обладающими -жче аналогичной функцией. Такие стандартнье методьй включают гибридизацию нуклеийновьх кислот и амплификацию путем полимеразно-цепьевой реакции с использованиєм олигонуклеотидньїх праймеров, - соответствующих мотивам консервативной аминокислотной последовательности. Не следует ожидать, что зти методьї будут пригоднь! для вьіделения генов протокса зукариот при использованиий современной информации о структуре, которая ограничена данньїми о генах протокса прокариот, поскольку не существуєт значительного /-«Ф структурного сходства даже между известньіми генами и протеинами протокса прокариот. З 70 Другой подход, которьй бьл применен для вьіделения генов биосинтеза в других метаболических процессах с из вьісших зукариот, представляет собой комплементацию в микробньїх мутантах дефицита представляющей з» интерес активности. Для зтого подхода библиотеку кКДНК из вьісших зукариот клонируют в векторе, которьй может управлять зкспрессией кКДНК в хозяине-микроорганизме. Затем вектор трансформируют или каким-либо иньім образом вводят в мутантньій микроорганизм и отбирают колонии, которье фенотипически больше не являются мутантами. 7 Зту стратегию применяли для вьіделения генов из вьсших зукариот, вовлеченньх в несколько - метаболических процессов, включая биосинтез гистидина (см., например, патент США 5290926 и УУО 94/026909 на имя УмМага и др., полностью включенньїх в настоящее описание в качестве ссьілки), биосинтез лизина (см., і-й например, Егізп и др., МоЇ. Сеп. Сепеї. 228: 287 (1991)), биосинтез пурина (см., например, Аїті и др., со 20 ),Віої. Спет. 265: 9011 (1990)) и биосинтез триптофана (см., например, Міусді и др., Ріапі Сей! 5: 1011 (1993)). Однако, несмотря на доступность микробньїх мутантов, у которьїх, вероятно, недостаточна активность щи протокса (например, Е.соїї (Зазагптап и др., У.Сбеп. Місгоріої. 113: 297 (1979)), ЗаІтопейїа їурпітигішт (Хи и др., уУ.Васіегіої. 174: 3953 (1992)) и Засспаготусевз сегемізвіде (Сатайдго и др., Віоспет. Віорпуз. Кев. Сотт. 106: 724 (1982)), применение зтого метода для вьіделения КДНК, кодирующих ферментативную активность 25 протокса у зукариот. на основе доступной информации в основном непредсказуема.

ГФ) Для зтого есть несколько причин. Во-первьїх, последовательность КДНК протокса зукариот может не зкспрессироваться с адекватньіми уровнями в мутантньїх микроорганизмах, например, вследствие применения о кодона, несовместимого с обьічно предпочтительньіми кодонами для хозяина-микроорганизма. Во-вторьх, первичньій продукт трансляции из клонированной кодирующей последовательности зукариот может не 60 производить функциональньійй полипептид, например, если для пост-трансляционной модификации, такой, как гликозилирование, необходима активность, которой микроорганизм не обладает. В-третьих, протеин зукариот может оказаться неспособньім принимать свою активную конформацию в хозяине-микроорганизме, например, если протеийн в норме ориентирован к мембранной системе конкретной органелль!, которой микробньй хозяин лишен. Зта последняя возможность особенно вероятна для фермента протокса растений, которьій связан в 62 клетке растения с органеллами, отсутствующим у микробньх хозяеєв, применяємьх в методе комплементации. В частности фермент протоке растений связан как с оболочкой хлоропласта, так и с тилакоидньми мембранами (Маїгіпде и др., У.Віої. Спет. 267: 4646 (1992)) и, вероятно, достигает указанньїх мембранньїх систем в результате пост-трансляционного механизма оориентации, включающего как М-концевую транзитную последовательность, так и внутренние свойства зрелого полипептида (см., например, у Копогп и Тобіп, Ріапі

Сеї! 1: 159 (1989); Гі и др., Ріапі Сеї| 3: 709 (1991); Ії и др., У.Віоії. Спет. 267: 18999 (1992).

Мзвестно, что фермент протоке играет определенную роль при некоторьїхх болезненньїх состояниях человека. Пациентьї, страдающие от смешанной порфирии, аутосомного доминантного расстройства, характеризующегося как нейропсихическими симптомами, так и повреждениями кожи, имеют пониженнье 7/0 уровни активности протокса (Вгеппег и Віоотег, Мем/ Епо!. У.Меа. 302: 765 (1980)). Вследствие отсутствия данньїх о ферменте протоксе человека и соответствующем ему гене возможности для диагностики и лечения зтого расстройства в настоящее время весьма ограничень.

Применение гербицидов для борьбь! с нежелательной растительностью, такой, как сорняки или растения в сельскохозяйственньіїх культурах, стало почти повсеместной практикой. Соответствующий рьінок превьішает /5 Миллиард долларов ежегодно. Несмотря на такое широкое применение, борьба с сорняками остается для фермеров важной и дорогой проблемой.

Для зффективного применения гербицидов необходим достаточно жесткий контроль. Например, время и способ обработки и стадия развития сорного растения являются важньм фактором для получения хороших результатов при борьбе с сорняками с помощью гербицидов. Поскольку различнье видь! сорняков устойчивь! к гербицидам, важность получения зффективньїх гербицидов существенно возрастаєет.

К сожалению, гербицидьї, проявляющие более вьісокую зффективность, предназначеннье для более широкого спектра сорняков и обладающие ускоренньм разложением в почве, могут также обладать большей фитотоксичностью для культурньїх растений. Одним из решений зтой проблемь! бьіла разработка культурньйх растений, устойчивьїх или толерантньїх к гербицидам. Гибридь! или сорта культурньїх растений, устойчивье к с об Гербицидам, позволяют применять гербицидь! без сопутствующего риска повредить культурное растение.

Развитие устойчивости может дать возможность обрабатьшать гербицидом культурное растение, где его і) применение ранее бьіло исключено или ограничено (например, применение для предвсходовой обработки) вследствие чувствительности полезньїх растений к гербициду. Например, патент США 4761373 на имя Ападеггоп и др. относится к устойчивости растений к различньм гербицидам из классов имидазолинона или «о зо бульфонамида. Устойчивость обусловлена изменением фермента синтазьі ацетооксикислоть (АНА5). В патенте

США 4975374 на имя Сосдтап и др. описань! растительнье клетки и растения, содержащие ген, кодирующий о мутантную глутамин-синтетазу (55), устойчивую к ингибированию гербицидами, для которьїх известна ю способность ингибировать 5, например, к фосфинотрицину и к метионинсуль-фоксимину. В патенте США 5013659 на имя ВедргоокК и др. описаньії растения, зкспрессирующие мутантную ацетолактат-синтазу, что -- з5 делает растения устойчивьмми к ингибированию гербицидами из класса сульфонилмочевиньі. В патенте США ку 5162602 на имя Зотегз и др. описаньі растения, толерантнье к ингибированию гербицидами циклогександионом и арилоксифеноксипропановой кислотой. Зта толерантность обусловлена изменением ацетил-СоА-карбоксилазь! (АКкКазьї).

Фермент протокс служит в качестве мишени для различньїх гербицидньїх соединений. Гербицидь, которье « ингибируют протоке, включают многие различнье по структуре классь! молекул (ОиКе и др., М/еей Зсі. 39: 465 тв) с (1991); Мапайнаййй и др., Ревііїсіде Віоспет. РПАузіої. 43: 193 (1992); Майіпде и др., РЕВ5 ей. 245: 35 (1989); Мапазе и Ападой, Резвіїсіде Віоспет. РНузіоІї. 35: 70 (1989)). Зти гербициднье соединения включают ;» дифениловье зфирь Інапример, адифлуорфен, 5-(2-хлор-4--трифторметил)фенокси|-2-нитробензойная кислота; ее метиловьій зфир; или оксифлуорфен, 2-хлор-1-(3-зтокси-4-нитрофенокси)-4-(трифторбензол)), оксидиазоль! (например, оксидиазон, 3-(2,4-дихлор-5-(1-метилатокси) -І фенилі/д|-5-(1,1-диметилотил)-1,3,4-оксадиазол-2-(ЗН)-он), циклические имидЬі (например, -23142,

М-(4-хлор-2-фтор-5-пропаргалоксифенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид; хлорфталим, - М-(4-хлорфенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид), фенилпиразоль! (например, ТНПП-зтил, с зтил-2-(І1-(2,3,4-трихлорфенил)-4-нитропиразолил-5-окси|пропионат; МеВ 39279), производнье пиридина 5р (например, ІЗ 82-556) и фенопилат и его О-фенилпирролидино- ий пиперидинкарбаматнье аналоги. Многие из о зтих соединений конкурентно ингибируют нормальную реакцию, катализируемую ферментом, вероятно,

Ф вьіступая в качестве аналогов субстрата.

Вероятньій механизм действия ингибирующих протоке гербицидов включает накопление в хлоропласте протопорфириногена ЇХ. Зто накоплениєе, вероятно, приводит к проникновению протопорфириногена ІХ в в цИТОЗОЛЬ, где он окисляется с Помощью пероксидаздой активности в протопорфирин ІХ. При зкспозиции светом протопорфирин ІХ может вьізвать образование в цитозоле атомарного кислорода. Зтот атомарньій кислород в (Ф, свою очередь может привести к образованию других реактивньїх видов кислорода, которьіе могут вьізвать ка переокисление липидов и разрушение мембрань, что приводит к бьістрой гибели клетки (І ее и др., Ріапі Рпузіо|. 102: 881 (1993)). 60 Не все ферментьї протоксьї чувствительньї к гербицидам, которье ингибируют ферменть! протоксь растений. Ферменть! протоксьї, кодируемьсе генами, вьіделенньїми как из ЕзспПегіснпіа соїї (Зазагтап и др., Сап. у).

Місгоріої. 39: 1155 (1993)) так и из Васійшв зибБійв (Оайеу и др. 9.Віої. Спет. 269: 813 (1994), устойчивьі к зтим гербицидньм ингибиторам. Кроме того, біли описаньі мутантьї одноклеточной водоросли

Спіатудотопазг геїіпнагайі, устойчивье к фенилимидному гербициду 5-23142 (КаїаокКа и др., уУ.Резіїсіде Зсі. 15: 65 449 (1990); епірага и др. Кезеагсй іп РпНоіозупійевів, том ШШ, М. Мигаїа, ред. Кішмег: МеїПегіапавз, стр.567-570 (1992)). По крайней мере, один из зтих мутантов, как полагают, имеет измененную активность протокса, которьій устойчив не только к гербицидному ингибитору, по которому проходил отбор зтого мутанта, но также и к другим классам ингибиторов протокса (ОвПпіо и др., 7. Майшпогесп. 48с: 339 (1993); аю и др.,

АСВ Бутровішт оп РогрПугіс Резіісідез, 5. бике, ред. АС5 Ргезв: М/азпіпдіоюоп, О.С. (1994)). Также есть даннье о лом, что мутантная линия клеток табака обладаєт устойчивостью к ингибитору 5-21432 (Спе и др., 7.

Майшпогзгсі. 48с: 350 (1993)).

Настоящее изобретение относится Кк вьіделенной молекуле ДНК, кодирующей фермент протопорфириноген-оксидазу (протоке) из зукариота, которьій предпочтительно представляет собой вьісший зукариот. В частности настоящее изобретение относится к вьіделенньмм молекулам ДНК, кодирующим фермент 7/0 протопорфириноген-оксидазу (протоке), источником которого явлется растение или человек.

В соответствии с изобретением предпочтительньми являются вьіделеннье молекуль! ДНК, кодирующие фермент протопорфириноген-оксидазу (протоке) из двудольньїх растений, однако особенно предпочтительнь! таковне из растений р.Агабрідорзіз, такие, как представленнье в последовательностях ЗЕО ІЮО МО: 1, Зи 9.

Также предпочтительньми являются вьіделеннье молекуль ДНК, кодирующие фермент 7/5 протопорфириноген-оксидазу (протоке) из однодольньїх растений, и найболее предпочтительно из растений кукурузьі, такие, как представленнье в последовательностях ЗЕО ІЮ МО: 5 и 7. Особенно предпочтительной согласно изобретению является вьіделенная молекула ДНК, кодирующая протеийн фермента протопорфириноген-оксидазьі (протокса) из двудольньх растений, где указанньй протеин имеет аминокислотную последовательность, вьібранную из группьї, состоящей из последовательностей ЗЕО ІЮ МО: 2, 4 и 10. Также предпочтительной является вьіделенная молекула ДНК, кодирующая протеин фермента протопорфириноген-оксидазьі (протокса) из однодольньїх растений, где указанньй протейн имеет аминокислотную последовательность, вьібранную из группьі, состоящей из последовательностей ЗЕО ІЮ МО: 6 и 8.

Используя информацию, предоставленную настоящим изобретеним, кодирующая последовательность ДНК с для фермента протопорфириноген-оксидазьі (протокса) из любого зукариота может бьть получена с использованием стандартньїх методов. Таким образом, еще один предмет настоящего изобретения относится к і) зондам, способньім к специфичной гибридизации с зукариотической последовательностью ДНК, кодирующей протопорфириноген-оксидазную активность, или с соответствующей мРНК, и способам обнаружения указанньїх последовательностей ДНК в зукариотах с использованием зондов по изобретению. «о зо Настоящее изобретение, кроме того, включаєт полигеннье зкспрессирующие кластерь! и рекомбинантнье векторьї, содержащие зти полигеннье зкспрессирующие кластерь, которье главньм образом содержат і, промотор, а именно, промотор, активньій в растений, действенньм образом сцепленньй с молекулой ДНК, ( кодирующей фермент протопорфириноген-оксидазу (протоке) из зукариота по изобретению. Полигенньй зкспрессирующий кластер по изобретению может в дополнениє к зтому также включать сигнальную (787 з5 последовательность, действенньм образом сцепленную с молекулой ДНК, причем зта сигнальная ча последовательность способна направлять протеин, кодируемьй молекулой ДНК, в хлоропласт или в митохондрию.

Кроме того, настоящее изобретение относится к растениям, клеткам растений, тканям растений и семенам растений с измененной активностью протокса, которье устойчивьі или, по крайней мере, толерантнь! к «

Мнгибированию концентрациями гербицида, которьіе в норме ингибируют естественную активность протокса в. 0/7) с растений. В частности одними из вариантов осуществления изобретения являются растения, у которьх измененная активность протокса обусловлена сверхзкспрессией фермента протокса дикого типа или ;» зкспрессией молекульї ДНК, кодирующей толерантньй к гербициду фермент протоке. Зтот толерантньй к гербициду фермент протоке может представлять собой модифицированную форму фермента протокса, которая в естественньїх условиях встречается в зукариоте или прокариоте; или модифицированную форму фермента -І протокса, которая в естественньїх условиях встречаєется в растении; или толерантньй к гербициду фермент протоке может в естественньїх условиях встречаться в прокариоте. Растения, подпадающие под обьем - настоящего изобретения, включают однодольнье и двудольнье растения, но, прежде всего гибриднье с растения. Предпочтительньми являются такие растения, которье могут представлять собой потенциальнье Мишени для ингибирующих протоке гербицидов, в частности такие важнье сельскохозяйственньсе культурь, как о кукуруза и другие зерновье культурь), такие, как пшеница, овес, рожь, сорго, рис, ячнень, просо, густой

Ф травяной покров (дерн или газонньюе травь), кормовье травь и т.п., а также хлопчатник, табак, сахарньй тростник, сахарная свекла, масличньй рапс и соя.

Кроме того, настоящее изобретение включает материал для размножения растений в соответствий с ов МЗзобретением, предпочтительно семена растений, обработаннье защитньм покрьтием и, прежде всего защитньм покрьітием, содержащим препарат, вьібранньїй из группьі, состоящей из гербицидов, инсектицидов, (Ф, фунгицидов, бактерицидов, нематоцидов, моллюскицидов или их смесей. ка Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам получения растений, клеток растений, тканей растений и семян растений и их трансгенного потомства, которье содержат фермент протоке, устойчивьй или бо толерантньй к ингибированию гербицидом в концентрации, которая ингибируют естественную активность протокса. Зта устойчивость или толерантность может бьіть получена путем зкспрессии в трансгенньїх растениях любой молекульь ДНК, которая кодирует модифицированную форму фермента протокса, которая в естественньїх условиях встречается в зукариоте, или модифицированную форму фермента протокса, которая в естественньїх условиях встречается в растений, или фермент протоке, которьій может в естественньїх условиях 65 Встречаться в прокариоте, или фермент протоке, которьій представляет собой модифицированную форму протейина, которьйй в естественньїх условиях встречается в прокариоте.

Конкретньій вариант осуществления изобретения относится к получению трансгенньїх растений кукурузь, ткани кукурузьь или семени кукурузь и их трансгенного потомства, которье стабильно трансформировань! рекомбинантной молекулой ДНК, включающей пригодньій промотор, функционирующий в растениях, действенньм образом сцепленньй со структурньім геном, коюддирующим немодифицированньій фермент протоке прокариота, которьій устойчив к гербициду.

Кроме того, изобретение относится к получению трансгенньїх растений, клеток растений, тканей растений и семян растений и их трансгенного потомства, которье бьіли стабильно трансформировань! рекомбинантной молекулой ДНК, включающей пригодньій промотор, функционирующий в растениях, действенньм образом 7/0 сцепленньй со структурньм геном, кодирующим немодифицированньй фермент протоке зукариота. Зто приводит к сверхзкспрессии немодифицированного протокса в растений в количестве, достаточном для преодоления ингибирования фермента гербицидом.

Настоящее изобретение также включает получение растений, которье зкспрессируют измененньй фермент протоке, толерантньій к ингибированию гербицидом в концентрации, которая в нормальньїх условиях 7/5 Мнгибирует активность неизмененного протокса дикого типа. В зтом варианте осуществления растение может бьіть стабильно трансформировано рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей структурньїйй ген, кюдирующий устойчивость протокса, или получено методами направленной селекции, с помощью которьїх устойчивье к гербициду линии вьіделяют, характеризуют и совершенствуют.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу борьбь! с ростом нежелательной растительности, 2о Включающему обработку популяции растения с измененной активностью протокса, устойчивой к ингибированию гербицидом в концентрациях, которніе обьічно ингибируют встречающуюся в естественньїх условиях активность протокса в зтом растений, зффективньм количеством ингибирующего протоке гербицида. Растения, подлежащие защите описанньмм способом, прежде всего представляют собой таковье, которье могут бьть потенциальньми мишенями для ингибирующих протоке гербицидов, в частности такие важнье с г сельскохозяйственньсе культурьі, как, например, кукуруза и другие зерновне культурьі, такие, как пшеница, овес, рожь, сорго, рис, ячмень, просо, густой травяной покров (дерн или газонньсе травьї), кормовье травни т.п., а і) также хлопчатник, сахарньй тростник, сахарная свекла, масличньй рапс и соя. Гербицидь, которье относятся к ингибиторам протокса, представляют собой таковье, вьібраннье из группьі, состоящей из арилурацила, дифенилового зфира, оксидиазола, имида, фенилпиразола, производного пиридина, фенопилата и («о

О-фенилпирролидин- и пиперидинкарбаматньйх аналогов зтого фенопилата.

Настоящее изобретение также относится к получению фермента протокса рекомбинантньм путем и і, способам применения полученного рекомбинантньм путем протокса. Таким образом, изобретение ю дополнительно включает клетки-хозяева и прежде всего клетки, вьібраннье из группьі, состоящей из клеток растений, клеток животньїх, бактериальньх клеток, дрожжевьх клеток и клеток насекомьх, стабильно (87 з5 трансформированньїх рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей пригодньій промотор, функционирующий в.р соответствующей клетке-хозяине, действенньім образом сцепленньй со структурньм геном, кодирующим

Амодифицированньій или модифицированньй фермент протоке зукариота, причем клетка-хозяин обладает способностью зкспрессировать зту молекулу ДНК.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам применения очищенного протокса для скрининга « новьіх гербицидов, которне воздействуют на активность протокса, и для идентификации мутантов протокса, с устойчивьїх к гербициду.

В частности изобретение относится к способу тестирования химического соединения на его способность ;» ингибировать активность фермента протокса из растения, включающему (а) обьеединение фермента протокса и протопорфириногена ІХ в первой реакционной смеси в условиях, при

Которьїх фермент протоке обладаєт способностью катализировать превращение протопорфириногена ІХ в -І протопорфирин ІхХ; (б) обьединение химического соединения, фермента протокса и протопорфириногена ІХ во второй - реакционной смеси в тех же условиях, что и для первой реакционной смеси; с (в) возбуждение первой и второй реакционньїх смесей волнами длиной от приблизительно 395 до приблизительно 41Онм; о (7) сравнение флуоресценции первой и второй реакционньїх смесей при длинах волн от приблизительно 622

Ф до приблизительно 6б35нм; причем химическое соединение обладает способностью ингибировать активность фермента протокса, если флуоресценция второй реакционной смеси существенно меньше, чем флуоресценция первой реакционной СсМесиИ.

Кроме того, в изобретений предложен способ идентификации модифицированного фермента протокса, (Ф, устойчивого к ингибитору протокса, присутствующего в популяции клеток, включающий следующие стадий ка (а) культивирование популяции в присутствий ингибитора протокса в количествах, которье ингибируют

Амодифицированную форму фермента протокса; 60 (б) отбор клеток, полученньх на стадии (а), рост которьїх не бьл ингибирован; и (в) вьіделение и идентификацию фермента протокса, присутствующего в клетках, отобранньх на стадии (б).

Геньі, коюодирующие измененньй протоке, могут применяться в качестве селектируемьх маркеров в методах трансформации растительной клетки. Таким образом, настоящее изобретение также включает способ селекции растений, тканей растения или клеток растения, трансформированньїх представляющим интерес трансгеном из 65 Нетрансформированньх растений, включающий стадии: (а) трансформацию растения, ткани растения или клетки растения представляющим интерес трансгеном,

способньім зкспрессироваться растением, и геном, кодирующим измененньй протоке, устойчивьй к ингибитору протокса; (6) перенос трансформированньїх таким образом растений или растительньїх клеток в питательную среду, бсодержащую ингибитор протокса; и (в) отбор растений или растительньїхх клеток, виіживших в питательной среде.

Кроме того, настоящее изобретение относится к зондам и способам обнаружения присутствия и вьіявления формь! гена протокса и количественной оценки уровней транскриптов протокса в организме. Зти способь! могут применяться для диагностики болезненньїх состояний, связанньїх с измененной формой фермента протокса или 7/0 с измененньми уровнями зкспрессии фермента протокса.

Один из предметов настоящего изобретения относится к вьіделеной молекуле ДНК, которая кодирует зукариотическую форму протопорфириноген-оксидазь!ї (обозначенную в настоящем описаний как "протоке"), т.е. фермента, которьій катализирует окисление протопорфириногена ІХ в протопорфирин ІХ. Кодирующие последовательности ДНК и соответствующие аминокислотнье последовательности для ферментов протокса из 7/5 Агарідорзіз (Ппайапа представленьй в виде последовательностей ЗЕО ІО МО: 1-4 и 9-10. Кодирующие последовательности ДНК и соответствующие аминокислотнье последовательности для ферментов протокса кукурузьі представлень! в виде последовательностей ЗЕО ІЮ МО: 5-8.

Любая требуемая зукариотическая ДНК, кодирующая фермент протоке, может бьть вьіделена в соответствии с изобретением. Один способ, касающийся вьіделения последовательности, кодирующей протоке Зукариота, представлен в примере 1. В зтом способе клоньї КДНК, кодирующей фермент протоке, определяют из библиотеки клонов кКДНК, имеющей происхождение из представляющего интерес зукариота, основьіваясь на их способности придавать ферментативную активность протокса мутантному организму-хозяину, имеющего дефицит зтой активности. Пригодньіми организмами-хозяевами для применения в зтом способе являются таковье, которне могут бьіть использовань! для скрининга библиотек зкспрессии кКДНК и для которьїх мутанть! с с дефицитом активности протокса либо доступнь, либо могут бьіть полученьї традиционньми способами. Такие организмьі-хозяева включают, но не ограничень ими, Е.соїї (Зазапгтап и др., У.Сбеп. Місгобіо!ї. 113: 297 (1979)), і)

ЗаІтопеїа (Урпітигішт (Хи и др., У.Васіегіої. 174: 3953 (1992)) и Засспаготусез сегемізіде (Сатайдго и др.,

Віоспет. Віорпуз. Кевз. Сотт. 106: 724 (1982)).

В другом варианте последовательности, кодирующие протоке зукариота, могут бьть вьделень в (9 зо Соответствий с хорошо известньми способами, основанньми на гомологий их последовательности. с кодирующими протоке последовательностями по настоящему изобретению из Агарідорзіз (наійапа (ЗЕО ІЮ МО: о 1, З и 9) и из 7еа тауз (ЗЕО ІЮ МО: 5 и 7). В зтих способах всю или часть известной кодирующей протоке у последовательности применяют в качестве зонда, которьій селективно гибридизируется с другими кодирующими протоке последовательностями, присутствующими в популяции клонированньїх фрагментов -- геномной ДНК или фрагментов кКДНК (т.е. библиотек геномной или кДНК) из вьібранного организма. Такие ї- способь! включают скрининг на основе гибридизации посеянньїх на пластинке библиотек ДНК (либо бляшек, либо колоний; см., например, у Затрбгоок и др., ред., МоіІесшаг Сіопіпд, Соїд Зргіпд Нагброг І арогаїогу Ргезв, (1989)) и ПЦР-амплификацию с использованием олигонуклеотидньїх праймеров, соответствующих доменам последовательности, сохранившимся среди известньїх аминокислотньїх последовательностей протокса (см., « Например, у Іппів и др., ред. РСК Ргоїосоїв, А Сціде Ю Меїйподз апа Арріїсайоп5, Асадетіс Ргезв (1990)). с Зти способьї найболее пригодньї для вьіделения кодирующих протоке последовательностей из организмов,

Й родственньїх организму, из которого имеет происхождение последовательность зонда. Например, следует а ожидать, что применение зтих способов с использованием в качестве зонда кодирующей последовательности из Агарідорзів (Шпайапа или из 7еа тауз будет особенно пригодно для вьіделения кодирующих протоке последовательностей из других видов растений. -І Вьіделеннье последовательности протокса зукариота по настоящему изобретению могут подвергаться манипуляциям в соответствии со стандартньми методами генной инженерии для достижения любой - поставленной цели. Например, полная последовательность протокса или ее части могут применяться в с качестве зондов, способньїх к специфической гибридизации с последовательностями, кодирующими протоке, и с матричньми РНК. Для достижения специфической гибридизации в различньйх условиях такие зондь! включают о последовательности, которье являются уникальньми среди кодирующих протоке последовательностей, и

Ф предпочтительно имеют длину, по крайней мере, 10 нуклеотидов и найболее предпочтительно, по крайней мере, 20 нуклеотидов. Такие зондь! могут применяться для амплификации и анализа, кодирующих протоке последовательностей из вьібранного организма путем хорошо известного процесса полимеразно-цепьевой ов реакции (ПЦР). Зтот метод может бьть пригоден для вьіделения дополнительньїх кодирующих протоке последовательностей из требуемого организма или в качестве диагностического метода для определения (Ф, присутствия в организме кодирующих протоке последовательностей и для вьіявления взаймосвязи измененньмх ка кодирующих последовательностей с определенньми вредньми условиями, такими, как аутосомное доминантное нарушение у имеющих пониженнье уровни активности протокса людей, что характеризуется как во нейропсихическими симптомами, так и повреждениями кожи (Вгеппег и Віоотег, Мем/ Епаі. У.Меа. 302: 765 (1980)).

Специфичнье для протокса зондьії гибридизации также могут бьть использованьії для картирования положения нативного(ньїх) гена(ов) протокса зукариота в геноме вьібранного организма с использованием стандартньїх методов, основанньїх на селективной гибридизации зонда с геномньми последовательностями 65 протокса. Зти методь! включают, но не ограничень! ими, идентификацию полиморфизмов ДНК, вьіявленньх или содержащихся внутри последовательности зонда для протокса, и применение таких полиморфизмов для последующего отщепления гена протокса от других маркеров с известньім положением на карте в картируемой популяции, полученной в результате самооплодотворения гибрида двух полиморфньх родительских линий (см., например, у Неїепіагіз и др., Ріапі. Мої. ВіоІї. 5: 109 (1985); Боттег и др., Віоїесппідоез 12: 82 (1992); р'Омідіо и др., Ріапі. Мої. Віої. 15: 169 (1990)). Хотя можно ожидать, что любая последовательность протокса зукариота будет пригодна в качестве зонда для картирования генов протокса из любого зукариота, предпочтительньми зондами являются такие последовательности протокса из организмов, которне найболее близкородственньі к вьібранному организму, и найболее предпочтительньмми зондами являются таковье последовательности протокса из вьібранного организма. Можно ожидать, что картирование, таким образом, 7/0 генов протокса будет найболее целесообразньм для целей селекции растений. Например, на основе знания о положении на генетической карте мутантного гена протокса, которьій обусловливает устойчивость к гербицидам, могут бьіть идентифицированьї фланкирующие маркерь! ДНК из соответствующей генетической карть! (см., например, у НеїепЦагіз, Тгепаз Сепеї. 3: 217 (1987)). При интрогрессии признака устойчивости к гербицидам в новую селектируемую линию зти маркерь! могут бьіть, затем применень! для мониторинга длинь 7/5 сцепленной с протоксом фланкирующей хромосомной ДНК, еще присутствующей в родительской форме, с которой гибрид скрещивают вновь после каждого круга обратного скрещивания.

Специфичнье для протокса зондьії гибридизации также могут применяться для количественной оценки уровней мРНК протокса в организме с использованием стандартньїх методов, таких, как назерн-блоттинг. Зтот метод может бьїіть пригоден в качестве способа диагностики для обнаружения измененньїх уровней зкспрессийи протокса, что может бьіть связано с определенньіми вредньіми условиями, такими, как аутосомное доминантное нарушение у людей, характеризующееся как нейропсихическими симптомами, так и повреждениями кожи, имеющих пониженньсєе уровни активности протокса (Вгеппег и Віосотег, Мем Епаї. 9У.Меа. 302: 765 (1980)).

Для рекомбинантного получения фермента в организме хозяина кодирующая протоке последовательность может бьіть встроена в полигенньій зкспрессирующий кластер, сконструированньій для вьібранного хозяина и с о Мнтродуцированньй в хозяина, где его получают рекомбинантньм образом. Вьбор специфических регуляторньїх последовательностей, таких, как промотор, сигнальная последовательность, 5- и і) 3'і-нетранслируемье последовательности и знхансер, может бьіть осуществлен специалистом в данной области техники. Полученная молекула, содержащая отдельнье злементьі, сцепленнье в соответствующей рамке считьівания, может бьїіть встроена в вектор, способньій к трансформации в клетке-хозяине. Пригодньсе для зтой «о зо цели вектрьі зкспрессии и способьі рекомбинантного получения протейна хорошо известнь: для организмов-хозяев, таких, как Е.соїї (см., например, у Зі(цадіег и МойМай, 9.Мої. Віої. 189: 113 (1986); о

Вгозіиз, ОМА, 8: 759 (989)), дрожжи (см., например, у Зсппеїдег и Сцагепів, Ме. Епгутої. 194: 373 (1991) и клетки насекомьх (см., например, у ГисКом и Зиттегв, Віо/Гесппоії. 6: 47 (1988)). Конкретнье примерь! включают такие плазмидь), как Віцезсгірі (фирма бЗігаїадепе, а доМйа, СА), рЕГАС (фирма Іпіегпайопа! (8-7

ВіоїесппоЇозіев, Іпс., Мемж/ Намеп, СТ), рТгсНіз (фирма Іпмйгодеп, Га доПа, СА) и бакуловируснье векторь ї- зкспрессии, например, имеющие происхождение из генома вируса ядерного полиздроза Аціодгарпіса саЇйогпіса (АСсММРМУ). Предпочтительной системой бакулови-рус/насекомое являются клетки рмі11392/5121 (фирма

Іпмігодеп, І а дова, СА).

Полученньій рекомбинантньм путем зукариотический фермент протоке пригоден для различньїх целей. « Например, он может применяться для обеспечения ферментативной активности протокса іп міо. Он также в с может применяться в анализе іп міо для скрининга новьїх соединений с гербицидной активностью, мишень для которьїх ранее не бьіла вьіявлена, с целью определения, могут ли они ингибировать протоке. Такой анализ іп ;» мійго также может бьть применен в качестве более общего скрининга для идентификации химических соединений, ингибирующих активность протокса, и, следовательно, являющихся потенциальньми гербицидами.

В другом варианте полученньй рекомбинантньм путем фермент протоке может применяться для дальнейшей -І характеризации его связи с о известньми о ингибиторами, чтобьії рационально сконструировать нове ингибирующие гербицидь, а также толерантнье к гербицидам формь! фермента. - Обьічно ингибирующее действие в отношений протокса определяют путем измерения флуоресценции при с длинах волн от приблизительно 622 до б35нм после возбуждения длинами волн от приблизительно 395 до 5о Онм (см., например, у дасор5 и дасор5, Епгуте 28: 206 (1982); Зпегптап и др., Ріапі Рпузіої. 97: 280 о (1991)). Зтот анализ основан на том факте, что протопорфирин ЇХ представляет собой флуоресцирующий

Ф пигмент, а протопорфириноген ІХ является нефлуоресцирующим. Зкстракть! протеина получают из вьібранньйх субклеточньїх фракций, например, из зтиопластов, митохондрий, микросом или плазматических мембран путем дифференциального центрифугирования (см., например, ГІ ее и др., Ріапі Рпузіої. 102: 881 (1993); Ргадо и др.,

Ріапі РПузіої. 65: 956 (1979); ЧасКвоп и Мооге в Ріапі ОгдапеїЇез, Кеїдй ред., стр.1-12; Часорв и дасорв,

Ріапі РПузіої., 101: 1181 (1993)). Протопорфириноген получают путем восстановления протопорфирина

Ф) амальгамой натрия, как описано у дасобз и дасорз (1982). Реакционнье смеси обьічно состоят из 100ММ НЕРЕБ5 ка (М-2-гидроксизтилпиперазин-М'-2-зтансульфоновая кислота) (рН7,5), 5МмМ ЗДТК, 2МмМ ДТТ (дитиотреитол), приблизительно 2М протопорфириногена ЇХ и приблизительно мг/мл зкстракта протеина. До начала бо ферментативной реакции к зкстракту фермента добавляют растворь! ингибитора в различньїх концентрациях, например, в їмМ, 10ОмкМ, 1ОмкМ, їмкМ, 10ОнМ, 1ОонНМ, нм, 100пМ. После добавления зкстракта протеина в течение нескольких минут регистрируют флуоресценцию и в области линейного изменения вьічисляют тангенс угла наклона кривой (скорость реакции). Значение ІСбсо определяют путем сравнения тангенса угла наклона реакции в условиях ингибирования с таковьїм в контрольной реакции. 65 Другой вариант осуществления настоящего изобретения включаєт применение протокса в анализе по вьявлению устойчивьїх к ингибитору мутантов протокса. Типичньйй анализ включает следующие стадии:

(а) инкубирование первого образца протокса и его субстрата, т.е. протопорфириногена ІХ, в присутствий второго образца, содержащего ингибитор протокса; (6) измерение ферментативной активности протокса из стадии (а); (в) инкубирование первого образца мутированного протокса и его субстрата в присутствии второго образца, содержащего тот же самьй ингибитор протокса; (г) измерение ферментативной активности мутированного протокса из стадии (в); и (д) сравнение ферментативной активности мутированного протокса с отаковой, обеспечиваемой немутированньім протоксом. 70 Реакционная смесь и условия реакции являются теми же, что и для анализа по вбіявлению ингибиторов протокса (ингибиторньій анализ) со следующими модификациями. Во-первьїх, мутант протокса, полученньй аналогично описанному вьіше, заменяют в одной из реакционньїх смесей на протоке дикого типа в ингибиторном анализе. Во-вторьїх, ингибитор протокса дикого типа присутствует в обеих реакционньїх смесях. В-третьих, мутированную активность (ферментативная активность в присутствиий ингибитора и мутированного протокса) и /5 немутированную активность (ферментативная активность в присутствии ингибитора и протокса дикого типа) сравнивают для определения, наблюдается ли существенное увеличениег ферментативной активности в мутированной активности по отношению к немутированной активности. Мутированная активность представляет собой любую меру ферментативной активности мутированного фермента протокса в присутствии пригодного субстрата и ингибитора. Немутированная активность представляет собой любую меру ферментативной 2о активности фермента протокса дикого типа в присутствии пригодного субстрата и ингибитора. За достоверное увеличение принимают увеличение ферментативной активности, превнішающее предел погрешности техники измерения, предпочтительно приблизительно двукратное увеличение по сравнению с активностью фермента дикого типа в присутствий ингибитора, более предпочтительно приблизительно пятикратное увеличение, найболее предпочтительно увеличение более чем приблизительно в десять раз. с

Гербицидь, которне ингибируют протоке, включают многие различнье по структуре классьі молекул (Юике и др., Меей Зсі. 39: 465 (1991); Мапаїнаїййй и др., Ревіїсіде Віоспет. РАузіої. 43: 193 (1992); Магіпде и др., і)

ЕРЕВ5 Гей. 245: 35 (1989); Мапазе и Ападоп, Резіїсіде Віоспет. РПузіої. 35: 70 (1989)), включая дифениловье зфирьі например, ацифлуорфен, 5-(2-хлор-4--«трифторме-тил)фенокси|-2-нитробензойная кислота; ее метиловьій зфир; или оксифлуорфен, 2-хлор-1-(3-зтокси-4-нитрофенокси)-4-(трифторбензол)), оксидиазоль! Ге зо (например, оксидиазон, 3-(2,4-дихлор-5-(1-метилзтокси)фенил)-5-(1,1-диметилзтил)-1,3,4-оксадиазол-2-(ЗН)-он), циклические имидь (например, 5-23142, М-(4-хлор-2-фтор-5-пропаргилоксифенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид, о хлорфталим, М-(4-хлорфенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид), фенилгшразоль! (например, ТНПП-зтил, (З зтил-2-(І1-(2,3,4-трихлорфенил)-4-нитропиразолил-5-окси|пропионат; МеВ 39279), производнье пиридина (например, І 5 82-556) и фенопилат и его О-фенилпирролидино- и пиперидинкарбаматньсе аналоги. --

Наиболее важнье дифениловье зфирь!ї представляют собой таковне общей формуль! ча се у, (Формула І) где К обозначает -СООМа (формула ІІ), -СОМНЗО»СН» (формула ІІ) или -СООСНЬСООС»НЬБ (формула ІМ; « дю см. у Маїдгої и др., Вгідноп Стор Ргоїесіоп Сопіегепсе-У/ееав: 47-51 (1989). з

Дополнительньми, представляющими интерес дифениловьми зфирами являются таковье, где Кк с обозначает ; » коснсоосна

ССС, (формула Ма; см. у Науазвнпі и др., Вгідніоп Стор Ргоїесіоп Сопіегепсе-У/еедв: 53-58 (1989)). -І Дополнительньм, представляющим интерес дифениловьі!м зфиром является таковой формуль!:

З

- (ую 1 сі (формула ІМБ; бифенокс, см. Юеві и др., Ргос. Могіпеаві УУееа Зсі. Сопії. 27:31 (1973)). о Также важньм является класс гербицидов, известньїх как амидьї, имеющие общую формулу

Ф й

І (Формула М) 59 где 0 обозначаєт о Я од й ю Со Се» Ж то щі і нео о или - или о или о 60 (Формула МІ) (Формула ІІ) (Формула МІ11) (бормула ІХ) сі сі шо ГУ осня

Мері Месеві сн ст или или 65 (Формула ІХа) (Формула ІХь)

(см. у Нетрег и др., (1995) в "Ргосеедіпудз ої (Ше Еїднпій Іпіегпайопа! Сопдгезз ої Ревіїсіде Спетізігу",

Кадазаіє и др., ред., Атег. Спет. ос, МУУазпіпдюп, О.С., стр.42-48 (1994)), и Ку обозначает Н, СІ или Е, Ко обозначает СІ и Кз обозначает необязательно замещенньй простой зфир, тиозфир, сложньй зфир, амино- или алкильную группу. В другом варианте Ко и Кз вместе могут образовьвать 5- или б-членное гетероциклическое кольцо. Примерами имидньїх гербицидов, представляющих особьй интерес, являются сао уки р,

СНОМ. (бормула Х) сь

СР им шо щ соосН(СНІ» в ж о а (Формула ХІ)

Е сі с

ММ" ТОСНЕ. несооссно н 2 сне «Формула ХІІ! (см. у Міга ий др., Вгіріпоп Стор Ргогестіоп Сопіегелсе- с

Мееде: 35-40 1993)» " (8)

Ге) кА м-ї Й -9- Те

ЗСТЬСООСтЬ (Формула ХІТІ) со (см. у Мішга и де Стор Ргоїесіоп Сопіегепсе-У/еедв: 35-40 (1993)), ю

СІ «-

Го)

Зо М. -

Е несгооссНьО цооснга

СНз (Формула ХІ) « (см. у Мішга и др., Вгідййоп Сгор Ргоїтесйоп Сопгегелсе- З с Уеедв: 35-40 (1993), 2» о «А

С Е

- -5у- - ЗстьсоосЬ (Формула ХІТІ) 1 о 50 42)

Ф) іме) 60 б5

О в о осНубоОсен (Формула ХІМ) о є о о-снсСеСН сн (Формула ХУ)

О в сон» о

НСеео-СНь о (Формула ХМ)

Гербицидная активность вьішеуказанньїх соединений описана в Ргосеєдіподз ої 1991 Вгідніоп Стор Ргоїесійоп

Сопіегепсе, МУеедз (Вгйіївй Стор Ргоїесіоп Соипсі) (формульй Х и ХМІ), Ргосеедіпдз ої 1993 Вгідноп Стор

Ргоїесіоп Сопіегепсе, МУееаз (Вгйізпй Стор Ргоїесіоп Соипсі!) (формуль! ХІЇ и Хі), в патенте США 4746352 (формула ХІ) и в Арзігасів ої (пе УУеей Зсіепсе босівїу ої Атегіса, том.33, стр.9 (1993) (формула ХІМ). с

Найиболее предпочтительньми имидньми гербицидами являются таковье, классифицированнье как г) арилурациль! и имеющие общую формулу сн

Св М з

Го їй о | |. со сі соов (Формула ХУ1І) о где К обозначает группу (Со-Свалкенилокси)карбонил-С.і-С;,алкил, как описано в патенте США 5183492, «- включенном в настоящее описание в качестве ссьІлки. м

Также важньіми являются гербицидьї, имеющие общую формулу: о. Е во ом ме тю «

М ре в. - с ; з» «(формула ХУ ПІ; тиадиазимин) (см. у Мейег и др., Вгірйіоп Стор Ргоїесіоп - Сопіегепсе-Жеей5: 29-34 (1993)); -і с Е сі і) - снасноо «А

ТО СМм-сне, іні о Кн сю 70 сна (формула ХІХ; карфентразон) що (см. у Мап 5Зацп и др., Вгірйіоп Стор Ргоїєсбоп

Сопіегепсе-Уеейв: 19-22 (19935);

М -замешеннне пиразоль: общей формуль: о пул іме) ух бо НЕ в (формула ХХ) (см. публикации международньх заявок МО 94/08999,

МО 93/10100 и патент США 5405829, переданньй ве фирме 5свВегіпе);

М-Фенил пиразоль, такиє, как

(см. у МУМейег и др., Вгідпюоп Стор Ргогесіоп Сопіегепсе-У/еедв: 29-34 (1993)); о. Е

ЖК,

Й ре в)

М

(формула ХУ; тиадиазимин) 70 «см. у МецЦег и др., Вгівбіоп Стор Ргоїесіоп - Сопіегепсе- Меедв: 29-34 (1993)); с Е сі 8) сСнзсноо ХХ ї М-АСНЕ» о М-й

СН

(формула ХІХ; карфентразон) (см. у Уап Зацпп и др., Вгівйіоп Стор Ргоїесйоп

Сопіегепсе-еедв: 19-22 (1993));

М -замешеннье пиразоль: общей формульс:

Во, В вич с

Ав Не Ге) (формула ХХ) (см. публикацни международньх заявок ТО 94/08999,

МО 93/10100 и патент США 5405829, переданньий (Те) зо фирме Зсбегіпр); іч со

М-фенил пиразоль, такие, как (см. у Мап Зашп и др., Вгідпоп Стор Ргоїесіоп Сопіегепсе-У/ееав: 19-22 (1993); й

М-замещеннье пиразоль! общей формуль!: «- в. - с . ит -І -й 1 (95) 42) ко 60 б5 в) Е

Ж. й р я й ри в. (формула ХУ ЇЇ; тиадиазимин) (см. у Менйег и др., Втівйноп Стор Рготестіоп - Сопіегепсе-Жеед5: 29-34 (19933); б Е сі 6) 12 снзсньО Ж

М М-СНЕ» сна (формула ХІХ; карфентразон) (см. у Мап Бацп и др., Вгіввіоп Стор Реотесйоп

Сопіегепсе-Меейв: 19-22 (19935);

М -замешенньє пиразоль: обідей формули: с

В

2 Ав (о) ну я (Се) в 6 п.

З со (формула ХХ) ю (см. публикадни международньх заявок МО 94/08999, «-

МО 93/10100 и патент США 5405829, переданньй ч- фирме 5сВегіпр);,

М-Ффенил пиразоль, такие, как (см. публикацию международньїх заявок МУО 94/08999, МО 93/10100 и патент США 5405829, переданньй « фирме зспегіпо); з с М-фенил пиразольі, такие, как

МО» . "г

М МН» й сі ш- сі - 1 Сгз о 70 І (формула ХХІ; нипираклофен)

Ф (см. стр. 621 в "ТВе Резйсіде Мапуа!", 9-е изд., ред.

СК. Могіціпе, Вгій5а Стор Ргоїесноп Сопасії, зштеу «1991)); (см. стр.621 в "Те Резіїсіде Мапиаї!", 9-е изд., ред. С.К.ЛМогіпіпо, Вгйізп Стор Ргоїесіоп Соишпсії, Зигеу (1991)); о и З-замещеннье-2-арил-4,5,6,7-тетрагадроиндазольі (Гуда и др., Ревіїсіде осі. 42: 29-36 (1994)).

Уровни гербицида, которьіе обьічно являются достаточньми для ингибирования активности протокса, іме) соответствуют нормам расхода, известньм в данной области техники и частично зависящим от внешних факторов, таких, как окружающая среда, время и способ обработки. Например, в случае имидньїх гербицидов, 60 представленньхх формулами М-ІХ, ив частности таковьїх, представленньїх формулами Х-ХМІІЇ, интервал норм расхода составляет от 0,0001 до 1Окг/га предпочтительно от 0,005 до 2кг/га. Зта норма расхода или концентрация гербицида может различаться в зависимости от требуемого действия и конкретного используемого соединения и может бьіть определена способами, известньіми в данной области техники.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к растениям, ткани растения и семенам растения, б5 толерантньм к гербицидам, которье ингибируют активность протокса, встречающуюся в зтих растениях в естественньїх условиях, причем толерантность обусловлена измененной ферментативной активностью протокса. Характернье растения включают любье растения, которье обрабатьшают зтими гербицидами в соответствии с их обьічньмм предназначением. Предпочтительньмми являются важнье сельскохозяйственнье культурь, т.е. важнье представители покрьітосемянньїх и голосемянньїх растений, такие, как хлопчатник, соя, рапс, сахарная свекла, кукуруза, рис, пшеница, ячмень, овес, рожь, сорго, просо, густой травяной покров (дерн или газонньсе травьї), кормовье травьі, дернообразующие злаки и т.п.

Под "измененной ферментативной активностью протокса" понимают ферментативную активность протокса, отличную от таковой, которая встречаеєтся в растений в естественньїх условиях (т.е. активность протокса, которая встречается в естественньїх условиях в отсутствий прямого или косвенного воздействия человека на /о зту активность), устойчивую к гербицидам, которне ингибируют активность, встречающуюся в естественньх условиях. Измененная ферментативная активность протокса может бьіть придана растению по изобретению путем увеличения зкспрессии протокса дикого типа, чувствительного к гербицидам, зкспрессии в растений измененного, толерантного к гербицидам зукариотического фермента протокса, зкспрессии в растений немодифицированной или модифицированной бактериальной формь! фермента протокса, которая является /5 устойчивой к гербицидам, или комбинацией зтих способов.

Получение измененной активности фермента протокса путем увеличения зкспрессиий приводит к достижению уровня протокса в клетке растения, по крайней мере, достаточного для преодоления ингибирования роста, вьізьіваемого гербицидом. Уровень зкспрессируемого протокса обьічно, по крайней мере, в два раза, предпочтительно в пять раз, более предпочтительно, по крайней мере, в десять раз превьішает

Количество, зкспрессируемое в естественньїх условиях. Увеличенная зкспрессия может бьть обусловлена множественньми копиями гена протокса дикого типа; множественньмм распространениегем кодирующей протоке последовательности внутри гена протокса (те. амплификацией гена) или мутацией в некодирующей регуляторной последовательности зндогенного гена протокса в клетке растения. Растения, обладающие такой измененной ферментативной активностью, могут бьіть полученьі направленной селекцией в растениях. Зтот с способ известен в данной области техники. См., например, патент США 5162602 на имя ботегз и др., патент

США 4761373 на имя Ападегзоп и др. и указаннье в них ссьілки. Зти растения также могут бьіть получень с і) помощью методов генной инженерии, известньїх в данной области техники.

Увеличенная зкспрессия чувствительного к гербицидам протокса также может бьть получена путем стабильной трансформации клетки растения рекомбинантной или химерной молекулой ДНК, содержащей «о зо промотор, способньй стимулировать зкспрессию связанного структурного гена в клетке растения, сцепленного с гомологичньм или гетерологичньм структурньмм геном, кодирующим протоке. Понятие "гомологичность" і, подразумеваеєт, что ген протокса вьіделяют из организма, таксономически идентичного клетке ю растения-мишени. Понятие "гетерологичность" подразумевает, что ген протокса вьіделяют из организма, таксономически отличного от клетки растения-мишени. Гомологичньсе гень! протокса могут бьіть полученььпутем (87 з5 Комплементации бактериального или дрожжевого ауксотрофного мутанта библиотекой зкспрессий КДНК из В. растения-мишени. См., например, пример 1 и у Зпивіай и др., Сепеїйїсв 120: 1111-1114 (1988) (глутамин-синтаза кукурузь!); У ЮОеІаіїтеу и др., Мої. (зепеї. 221: 299-305 (1990) (пирролин-5-карбоксилатредуктаза сои); у Егівсп и др., Мої. Сепеї. 228: 287-293 (1991) (дигидродипиколинат-синтаза кукурузь!); У ЕПег и др., Ріапі Мої. Віо)/. 18: 557-566 (1992) (З-изопропилмалат-дигидрогеназа хлоропласта рапса); в Ргос. Майї). Асай. Зсі.,, ОБА 88: « 40. 1731-1735 (1991); у Міпеї и др., Ріапі 9. 2: 417-422 (1992) (дигидрооротат-дегидрогеназа) и ссьілки, указанньюе пе) с в зтих публикациях. Другие известнье способьі включают скрининг библиотек геномной или кКДНК вьісших

Й растений, например, в отношений последовательностей, которье перекрестно гибридизируются с зондами а специфичньїх нуклеийновьїх кислот, или скрининг библиотек зкспрессий для получения ферментов протокса, которье вступают в перекрестную реакцию со специфичньми зондами-антителами. Предпочтительньй способ

Включает комплементацию ауксотрофного мутанта пет Е. сої библиотекой кКДНК кукурузь! или Агарідорзіз -І ІНнаїапа.

Примерь! промоторов, способньїхх функционировать в растениях или в клетках растений, т.е. таковьх, - способньїх стимулировать зкспрессию связанньїх структурньїх генов, таких, как протокса, в растительньх с клетках, включают промоторьї 195 или 355 вируса мозайки цветной капустьї (СаММ) и двойнье промоторь 5р Саму; промоторь! нопалин-синтазь!; промоторь! протеина, связанного с патогенезом (РК); промоторь малой о субьединицьі! рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазьі (ззиИКкОВІЗСО) и т.п. Предпочтительньіми являются

Ф промотор актина риса (МсЕїЇгоу и др., Мої. (еп. Сепеї. 231:150 (1991)), промотор убикитина кукурузь! (ЕР 0342926; Тауог и др. Ріапі СеїЇ Кер. 12: 491 (1993)) и промотор Рі-1 из табака, Агарідорзіз или кукурузь (см. международную заявку РСТ/ІВ95/00002 на имя Куаїв и др., полностью включенную в данное описание в дв Качестве ссьілки). Также предпочтительньіми являются промотор 355 й усиленньій или двойной промотор 355, такой, как описанньій у Кау и др., Зсіепсе 236: 1299-1302 (1987), и двойной промотор 355, клонированньй в (Ф) роСоМа2113, депонированньій под номером АТСС 40587, которне описань! в европейской заявке ЕР-А 0392225, ка соответствующие данньсе из которой, относящиеся к настоящему изобретению, полностью включень! в данное описание в качестве ссьілки. Сами промоторь! могут бьііть модифицировань! в соответствии с известньіми в бр данной области техники методиками таким образом, чтобь! манипулировать длиной промотора для повьішения зкспрессии протокса.

Сигнальнье или транзитнье пептидь! могут бьіть слитьї с последовательностью, кодирующей протоке, в химерньїх конструкциях ДНК по изобретению, чтобьї направить транспорт зкспрессируемого фермента протокса в требуемое место действия. Примерь! сигнальньїх пептидов включают таковье, сцепленнье в естественньх б5 условиях с протеинами, связанньми с патогенезом, например, РА-1, РК-2 и тлп. См., например, Раупе и др.,

Ріапі Мої. Віої. 11: 89-94 (1988). Примерь! транзитньїх пептидов включают транзитнье пептидь! хлоропласта,

такие, как описанньюе у моп Неї|пе и др., Ріапі Мої. Вісі. 9: 104-126 (1991); Магиг и др., Ріапі Рпузіої. 85: 1110 (1987); Могеї и др., Сепе 65: 59 (1988), и транзитнье пептидь! митохондрий, такие, как описаннье у Вошігу и др., Маїшге 328: 340-342 (1987). Предполагают, что транзитнье пептидьі хлоропласта и митохондрий будут найболее приемлемь для настоящего изобретения, так как ферментативная активность протокса обьічно содержится в митохондриях и хлоропласте. Найболее предпочтительньмми для применения являются транзитнье пептидьі хлоропласта, поскольку существует предположение, что ингибирование ферментативной активности протокса в хлоропластах является первичной основой действия ингибирующих протоке гербицидов (МУйкомувКі и Наїйпо, Ріапі РПузіої. 87: 632 (1988); Гейпеп и др., Ревіїс. Віоспет. РПувіої. 37: 239 (1990); 70 ОиКе и др., МУеей Зсі. 39: 465 (1991)). Сюда также включень! последовательности, которье приводят к локализации кодируемого протеина в различньїх клеточньїх компартментах, таких, как вакуоли. См., например, у

Меийпацйз и др., Ргос. Май. Асад. сі. ОБА 88: 10362-10366 (1991) и СНгізрееіз, Апп. Кеу. Ріапі РПузіої!. Ріапі

Мої. ВіоІї. 42: 21-53 (1991). Соответствующие даннье из зтих публикаций, относящиеся к настоящему изобретению, полностью включень в данное описание в качестве ссьлки.

Химерная(не) конструкция(и) ДНК по изобретению может (гут) содержать множественнье копии промотора или множественнье копии структурньїх генов протокса. Кроме того, конструкция(и) может (гут) включать кодирующие последовательности для маркеров и кодирующие последовательности для других пептидов, таких, как сигнальнье или транзитнье пептидь, каждьй в соответствующей рамке считьмвания с другими функциональньми злементами в молекуле ДНК. Получение таких конструкций соответствует оббічному уровню го техники в данной области.

Пригоднье маркерьї включают пептидьі, обусловливающие устойчивость к гербициду, антибиотику или лекарству, такие, как обусловливающие, например, устойчивость к сгигромицину, канамицину, (0418, гентамицину, линкомицину, метотрексату, глифосфату, фосфинотрицину или т.п. Зти маркерь! могут применяться для отделения клеток, трансформированньїх химерньіми конструкциями ДНК по изобретению, от с г "трансформированньх клеток. Другими пригодньіми маркерами являются пептиднье ферменть, которьіе можно легко обнаружить с помощью реакции визуально, например, с помощью цветной реакции, в их число входят і) луцифераза, В-глюкуронидаза или В-галактозидаза.

Измененную активность фермента протокса можно также получить путем генерирования или идентификации модифицированньїх форм вьіделенной зукариотической кодирующей протоке последовательности, имеющей, («й зо по крайней мере, одно аминокислотное замещение, дополнение или делецию, которне кодируют измененньй фермент протоке, устойчивьій к гербициду и ингибирующий неизмененную, встречающуюся в естественньїх і, условиях форму (те. формьі, встречающиеся в естественньїх условиях в зукариоте, не подвергавшиеся ю манипуляциям со стороньі человека либо непосредственно с помощью методологии рекомбинантной ДНК, либо косвенньім путем с помощью избирательной селекции и т.д.). Геньї, кодирующиеє такие ферменть!, могут бьіть (7 з5 полученьі с помощью различньїх стратегий, известньїх в данной области техники. Первая общая стратегия ча включает технику прямого или непрямого мутагенеза микроорганизмов. Например, пригодньїй для генетических манипулиций микроорганизм, такой, как Е.соїї или З.сегемізвіае, может бьіть подвергнут неспецифическому мутагенезу іп мімо с помощью, например, УФ-излучения или зтил- или метилметансульфоната. Методь! мутагенеза описаньі, например, у Мійег, Ехрегітепіз іп Моіесціаг Сепеїйісв, Соїй Зргіпд Нагброг І арогайогу, « боїй Зргіпу Нагрог, МУ (1972); Оаміз и др., Адмапсей Васіегіа! Сепейсв, Соїй Зргіпо Нагрог Гарогагу, Соїй У с Зргіпд Нагрог, МУ (1980); Зпегптап и др., Меїйодвз іп Меавзі Сепеїйісв, Со Зргіпд Нагрог Іарогайогу, Соїа

Зргіпд Нагрог, МУ (1983); и в патенте США 4975374 (на имя Соодтап и др.). Микроорганизм, вьібранньй для ;» мутагенеза, содержит зукариотический ген протокса с нормальной чувствительностью к гербицидам и зависит от активности протокса, обусловленной зтим геном. Подвергнутье мутагенезу клетки вьращивают в присутствий гербицида в концентрациях, которне ингибируют немодифицированньй фермент протоке. Колоний -І подвергнутого мутагенезу микроорганизма, которье в присутствий ингибитора растут лучше, чем неподвергнутьій мутагенезу микрорганизм (те. проявляющие устойчивость к ингибитору), отбирают для - дальнейшего анализа. Геньі протокса из зтих колоний вьіделяют либо путем клонирования, либо с помощью с амплификации с использованием полимеразно-цепьевой реакции и определяют их последовательности. Последовательности, кодирующие измененньй фермент протоке, затем клонируют вновь в микроорганизме для о подтверждения их способности обусловливать устойчивость к ингибитору.

Ф Второй метод получения мутантньїх, несущих устойчивость к гербициду аллелей зукариотического фермента протокса, включает прямую селекцию в растениях. Например, воздействие ингибитора протокса, такого, как описан вьіше, на подавление роста растений, таких, как Агарідорзіз, соя или кукуруза, может бьть Вніявлено путем помещения семян, стерилизованньїх с использованием известньїх в данной области техники методов, на чашки в простую минимальную солевую среду, содержащую возрастающие концентрации (Ф) ингибитора. Такие концентрации составляют 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0.1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 110, 300, 1000 и ка З000 частей на миллион (част.//млн). Самую низкую дозу, при которой можно наблюдать воспроизводимое существенное ингибирование роста, применяют для последующих зкспериментов. 60 Мутагенез растительного материала может бьть использован для увеличения частотьІ, с которой устойчивье аллели встречаются в вьібранной популяции. Подвергнутьйй мутагенезу семенной материал может бьіть получен из различньїх источников, включая химический или физический мутагенез семян или химический или физический мутагенез пьільцьі (см. Мешйег, в Маїге їог Віоіодіса! Кезеагсп, Зпегідап, изд. Опім. Ргезв,

Сгапа Рогк5, МО., стр.61-64 (1982)), которую затем применяют для оплодотворения растений, после чего 65 собирают полученнье мутантнье семена Мі. Обьічно для Агабідорзіз семена М» (фирма І епіе Зееаз, Тизсоп,

А), т.е. потомство семян растений, виіращенньїх из семян, подвергнутьїх мутагенезу с помощью химических соединений, таких, как зтилметансульфонат, или физических агентов, таких, как гамма-излучение или бьістрье нейтронь!ї, вьісевают в чашки с плотностью до 10000 семян/чашку (диаметром 10см) на минимальную солевую среду, содержащую соответствующую концентрацию ингибитора для селекции на устойчивость. Проростки,

Которне продолжают расти, и остаются зеленьіми в течение 7-20 дней после вьісевания, пересаживают в почву и вьращивают до созревания и получения семян. Потомство зтих семян тестируют на устойчивость к гербициду. Если признак устойчивости является доминантнь!м, растения, семена которьїх расщепляются в соотношений 3:1 (устойчивне:чувствительнье), вероятно, являются гетерозиготньіми по гену устойчивости в поколений Мо. Растения, все семена которьїх обладают устойчивостью, вероятно, являются гомозиготнь!мМи по 7/0 гену устойчивости в поколении М». Такой мутагенез интактньїх семян и скрининг семян их поколения М 2 также может бьїть осуществлен на других видах, например, на сое (см., например, патент США 5084082 (на имя

Зебравзііап)). Мутантнье семена, которье будут подвергнутьі скринингу на толерантность к гербициду, также могут бьть полученьї в результате оплодотворения пьільцой, подвергнутой мутагенезу химическим или физическим агентами.

Для подтверждения того, что генетической основой устойчивости является измененньй ген протокса, могут бьїть использованьі два подхода. Во-первьїх, аллели гена протокса из растений, проявивших устойчивость к ингибитору, могут бьть вьіделеньі с помощью ПЦР с праймерами, основанньми либо на консервативньх областях в последовательностях кДНК протокса у Агарідорзіз и кукурузьі, приведенньїх ниже в 5ЕО ІЮ МО: 1 3, 5, 7, либо более предпочтительно на основе неизмененньїх последовательностей гена протокса из растения, 2о Мспользованного для получения устойчивьх аллелей. После секвенирования аллелей для определения присутствия мутаций в кодирующей последовательности аллели могут бьіть тестированьі на их способность обусловливать устойчивость к ингибитору в растениях, в которьїх біли трансформированьї предполагаемье, обусловливающие устойчивость аллели. Зти растения могут представлять собой либо растения р.Агарідорзвів, либо любое другое растение, рост которого чувствителен к ингибиторам. Во-вторьх, геньі протокса могут бьіть с ов Картировань! на основе известньїх полиморфизмов длин рестрикционньїх фрагментов (ПДРФ) (см., например, У

Спапд и др., Ргос. Май. Аса. Зсі. ОБА 85: 6856-6860 (1988); Мат и др., Ріапі СеїЇ 1: 699-705 (1989)). і)

Признак устойчивости может бьть картирован независимо с использованием тех же маркеров. Если устойчивость является следствием мутации в гене протокса, признак устойчивости будет расположен на карте в положении, неотличимом от положения гена протокса. «о зо Третий способ получения устойчивьхх к гербициду аллелей протокса представляет собой селекцию в культурах растительной клетки. Зксплантать! растительной ткани, например, змбрион, листовье диски и т.д., і, или активно растущий каллюс, или суспензию культур растения, представляющего интерес, виращивают на ю определенной среде с отсутствием гема в присутствий возрастающей концентрации ингибирующего гербицида или аналогов ингибитора, пригодньїх для применения в лабораторньїх условиях. В различньїх культурах -- з5 получают различную интенсивность роста. В определенньх культурах получают бьістрорастущие варианть! М колоний, которне продолжают расти даже в присутствий концентраций ингибитора, вьізьвающих в норме подавление роста. Частота, с которой появляются такие бьістрорастущие варианть!, может бьіть увеличена путем обработки химическим или физическим мутагеном до воздействия на ткани или клетки гербицидом.

Предполагаемье аллели гена протокса, придающие резистентность, вьіделяют и тестируют аналогично « описанному в предшествующих абзацах. Аллели, которне идентифицированьі как обусловливающие /--) с устойчивость ок гербициду, затем могут бьть сконструированьь для оптимальной зкспрессий и трансформировань в растений. В другом варианте растения могут бьіть регенерировань из тканевьх или ;» клеточньїх культур, содержащих зти аллели.

Четвертьїй способ включает мутагенез чувствительньїх к гербициду генов протокса дикого типа в бактериях

Мли дрожжах с последующим культивированием микроорганизма в среде, лишенной гема, но содержащей -І ингибирующие концентрации ингибитора, и затем с отбором тех колоний, которье растут в присутствий ингибитора. Более конкретно кДНК растения, такую, как КДНК, кодирующую протоке Агарідорзіз или кукурузь, - клонируют в микроорганизме, у которого первоначально отсутствует активность протокса. Примерь! таких с микроорганизмов включают ауксотрофньїх мутантов Е.соїї, 5ЛУурпітигіцт и 5.сегемівіае, в том числе штамм Е.соїї 5ор ЗАЗХЗВ (Зазагтап и др., ).еп. Місгобріо!., 113: 297 (1979), штамм ЗУрпітигійт ТЕ2483 или Т713680 (Хи и др., о У.Васіегіо!., 174: 3953 (1992)) и мутант дрожжей пет14-1 (Сатаайдго и др., Віоспет. Віорпуз. Кев. Сотт., 106:

Ф 724 (1982)). Трансформированньій микроорганизм затем подвергают мутагенезу іп мімо, такому, как описанньй непосредственно вьше, или мутагенезу іп мйго с помощью любого из нескольких химических или ферментативньїх методов, известньїх в данной области техники, например, с помощью бисульфита натрия ов (Зпопе и др., Меїподз Епгугао!і. 100: 457-468 (1983); метоксиламина (Кадопада и др., Мисієвїс Асідв Кев., 13; 1733-1745 (1985); насьіщенного сайтнаправленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов (Ниїспіпзоп

Ф) и др., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 83: 710-714 (1986); или с помощью различньїх стратегий, основанньїх на ка ошибке включения полимеразь (см., например, Зпогпе и др., Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОА, 79: 1588-1592 (1982);

ЗПігаівпі и др., Сепе, 64: 313-319 (1988); и у Гешпд и др., Тесппідое, 1: 11-15 (1989)). Колонии, которье бр растут в присутствим концентраций ингибитора, подавляющих в нормальньх условиях рост, отбирают и очищают путем повторньїх посевов штрихом. Их плазмидьі очищают и тестируют на способность придавать устойчивость к ингибитору путем ретрансформации их в лишенном протокса микроорганизме. Затем определяют последовательности ДНК протокса кДНК-вставок из плазмид, прошедших зтот тест.

Когда аллель устойчивого к гербициду протокса идентифицирован, он может бьть сконструирован с 65 помощью методов геннной инженерии для оптимальной зкспрессии в культурном растений. Зта методика может включать изменение кодирующей последовательности устойчивого аллеля для оптимальной зкспрессиий в представляющем интерес виде культурного растения. Способьі модификации /кодирующих последовательностей для достижения оптимальной зкспрессии в конкретньїх видах культурньїх растений хорошо известньі (см., например, у Репак и др., Ргос. Май). Асай. Зсі. ОБА, 88: 3324 (1991); Колієї и др.,

Віо/Теспгпої. 11: 194 (1993)). Генетическое конструирование аллеля протокса для оптимальной зкспрессии может также включать сцепление действенньм образом соответствующих регуляторньїх последовательностей (т.е. промотора, сигнальной последовательности, терминатора транскрипции). Предпочтительньмми промоторами будут те, которне обусловливают вьісокий уровень конститутивной зкспрессии, или более предпочтительно те, которье обусловливают вьісокий специфический уровень зкспрессии в тканях, чувствительньїх к повреждению /о гербицидом.

Рекомбинантнье молекульь ДНК могут бьїть интродуцированьі в растительную клетку многочисленньіми известньіїми в данной области техники путями. Для специалиста в данной области техники, очевидно, что вьібор метода может зависеть от типа растения, предназначенного для трансформации, т.е. однольного или двудольного. Пригоднье методьі трансформации растительньїх клеток включают микроиньекцию (Стозвмау и 7/5 др. ВіоТесппіднез 4: 320-334 (1986)), злектропорацию (Кідов и др., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОА, 83: 5602-5606 (1986); трансформацию, медиируемую Аадгобасіегішт (Ніпспее и др., Віоїесппоіоду 6: 915-921 (1988), прямой перенос гена (Раз2КкомувКі и др., ЕМВО 3). 3: 2717-2722 (1984)) и баллистическую бомбардировку частицами с использованием приспособлений, поставляемьїх фирмами Адгасейиз, Іпс., Мадізоп, МУізсопвіп и Юиропі, Іпс.

УМітіпдіоп, Оеєеіажаге (см., например, у Запіога и др., патент США 4945050; и МсСабе и др., Віоїесппоіоду 6: 2о 923-926 (1988)). См. также у МУУеїззіпдег и др. Аппиа! Кему. Сепеї. 22: 421-477 (1988); Заптога и др.,

Рапісшаєе Зсіепсе апа Тесппоіоду 5: 27-37 (1987) (лук); СПпгівои и др., Ріапі РПузіої. 87: 671-674 (1988) (соя); МсСаре и др., Віо/есппоіоду 6: 923-926 (1988) (соя); Юаца и др., Віо/Лесппоіоду 8: 736-740 (1990) (рис); Кіевіп и др., Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА, 85: 4305-4309 (1988) (кукуруза); Ківіїп и др., Віо/ТесппоЇоду 6: 559-563 (1988) (кукуруза); Кіеіп и др., Ріапі РНузіої. 91: 440-444 (1988) (кукуруза) Еготт и др., сч Віо/Тесппоіоду 8: 833-839 (1990); и богаоп-Катт и др., Ріапі Сеї! 2: 603-618 (1990) (кукуруза).

Под обьем настоящего изобретения также подпадают трансгеннье растения, в частности трансгеннье і) фертильнье растения, трансформированнье с помощью вьшеуказанньїх способов, и их бесполое и/или половое потомство, которое сохраняет устойчивость или, по крайней мере, толерантность к ингибированию гербицидом в концентрациях, которье в норме ингибируют встречающуюся в естественньїх условиях активность (ду зо протокса в растений. Найболее предпочтительньми являются гибриднье растения, которне устойчивь или, по крайней мере толерантньь к ингибированию гербицидом в концентрациях, которье в норме ингибируют і, встречающуюся в естественньїх условиях активность протокса в растений. ю

Трансгенное растение опо изобретению может бьть двудольньм или ооднодольньм растением.

Предпочтительньї однодольнье растения семейства злаковьїх (Ссгатіпасеае), включающие растения р.р.І оїїшга, -- 7еа, Тійісит, Титйісаіе, ЗХогапит, засспагит, Вготив, Огугае, Амепа, Ногдешт, 5есаїе и 5егїагіа. ї-

Найиболее предпочтительньми являются трансгеннье кукуруза, пшеница, ячмень, сорго, рожь, овес, дернообразующие травь! и рис.

Среди двудольньїх растений найболее предпочтительньми в контексте настоящего изобретения являются соя, хлопчатник, табак, сахарная свекла, масличньй рапс и подсолнечник. «

Термин "потомство" включает потомство трансгенньїх растений, полученное как "беспольім", таки "половьм" пла) с путем. Под зто понятие также подпадают все мутанть! и сорта, получаемье с помощью известньїх способов, таких, как, например, слияние клеток или селекция мутантов, и которше еще проявляют характернье свойства ;» исходного трансформированного растения наряду со всеми продуктами скрещивания и слияния трансформированного растительного материала.

Еще один предмет изобретения относится к пролиферационному материалу трансгенньїх растений. -І Под пролиферационньім материалом трансгенньїх растений в контексте настоящего изобретения понимают любой растительньй материал, которьій может бьіть размножен половьім или беспольм путем іп мімо или іп - міго. Наийболее предпочтительньмми согласно настоящему изобретению являются протопласть, клетки, с каллюсь, ткани, органьії, семена, змбрионь, пьільца, яйцеклетки и зиготь! наряду с любьім другим материалом для размножения, полученньїм из трансгенньх растений. о Части растений, такие, как, например, цветки, стебли, плодьі, листья, корни, развившиеся у трансгенньїх

Ф растений или у их потомства, ранее трансформированньїх с помощью оспособа по изобретению и, следовательно, состоящие, по крайней мере, частично из трансгенньїх клеток, также являются предметом настоящего изобретения. 5Б До поступления в продажу материала для размножения растений (плодьі, клубни, зерна, семенной материал), прежде всего семенного материала, в качестве коммерческого продукта его обьічно обрабатьзвают (Ф, защитнькм покрьтием, содержащим гербицидь), инсектицидь), фунгицидьі, бактерицидь, нематоцидь, ка моллюскицидь! или смеси нескольких зтих препаратов, при необходимости вместе с дополнительньми носителями, поверхностно-активньмми веществами или способствующими нанесению адьювантами, обьічно бо применяемьми в технике получения препаративньх форм для обеспечения защить от повреждения, вьізванного бактериями, грибами или насекомьми-вредителями.

Для обработки семенного материала защитное покрьїтие может бьіть нанесено на семенной материал либо путем пропитки клубней или зерен жидким составом, либо покрьтием их сложной влажной или сухой композицией. Кроме того, в особьіїх случаях возможно использование других способов обработки растений, 65 например, путем направленной обработки почек или плода.

Семенной материал растения по изобретению, содержащий последовательность ДНК, кодирующую протеин из зукариота, обладающего активностью протопорфириноген-оксидазь! (протоке) по изобретению, может бьть обработан защищающим семенной материал покрьтием, содержащим соединение для обработки семенного материала, такоє, как, например, каптан, карбоксин, тирам (ТМТОЗУ), металаксил (АргопУ) и пиримифос-метил (Асівїс?), а также другие соединения, которніе обьічно применяют для обработки семенного материала.

Таким образом, еще один предмет настоящего изобретения относится к материалу для размножения растений, предназначенному для культивируемьїх растений, и прежде всего к семенному материалу растения, которое обрабатьвают защищающим семенной материал покрьтием, обьічно применяемьм для обработки семенного материала.

Если устойчивьй к гербициду аллель протокса получают путем прямой селекции в культурном растений или в культуре растительной клетки, из которой может бьіть регенерировано культурное растение, он может бьіть перенесен в коммерческие сорта с использованием традиционньх способов селекции для получения толерантной к гербициду культурьі без необходимости генетического конструирования аллеля и его трансформации в растений. В другом варианте аллель устойчивости к гербициду может бьть вьіделен, 75 подвергнут генетическому конструированию для оптимальной зкспрессии и затем трансформирован в требуемом сорте.

Геньії, кодирующие измененньій протоке, устойчивьй к ингибитору протокса, также могут применяться в качестве селектируемьх маркеров в способах трансформации растительной клетки. Например, растение, растительная ткань или растительнье клетки, трансформированнье трансгеном, могут также бьть трансформировань! геном, кодирующим измененньй протоке, способньій бьіть зкспрессированньім растением.

Трансформированнье таким образом клетки переносят в содержащую ингибитор протокса среду, в которой будут вьїживать только трансформированнье клетки. Ингибиторь! протокса, которье, вероятно, должнь! бьть найболее приемлемь! в качестве селектирующих агентов, представляют собой дифениловье зфирь Інапример, ацифлуорфен, 5-(2-хлор-4--трифторметил)фенокси|-2-нитробензойная кислота; ее метиловьй зфир; или с оксифлуорфен, 2-хлор-1-(3-зтокси-4-нитрофенокси)-4-«трифторбензол)), оксидиазоль! (например, оксидиазон, о 3-(2,4-дихлор-5-(1-метилотокси)фенил|)|-5-(1,1-диметилозтил)-1,3,4-оксадиазол-2-(3Н)-он), циклические /иИмидь (например, 5-23142, М-(4-хлор-2-фтор-5-пропаргилоксифенил)-3,4,5,6-тетрагадрофталимид; хлорфталим,

М-(4-хлорфенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид), фенилпиразоль! (например, ІНПП-зтил, зтил-2-(І1-(2,3,4-трихлорфенил)-4-нитропиразолил-5-окси|пропионат; МеВ 39279), производнье пиридина «(0 (например, 5 82-556) и фенопилат и его О-фенлпиролидино- и пиперидинкарбаматнье аналоги. Способ применим к любой растительной клетке, способной бьіть трансформированной измененньїм геном, коюодирующим о протоке, и может бьіть применен для любого представляющего интерес трансгена. Зкспрессия трансгена игена протокса может стимулироваться одним и тем же промотором, функционирующим в растительньх клетках, или - различньми промоторами.

Ниже изобретение более подробно поясняется на примерах. Зти примерь приведень! только для - иллюстрации и не ограничивают обьем изобретения, если не указано иное.

Депонирование

Следующие молекульй векторов для целей процедурь! патентования бьіли депонировань в коллекции « культур Службь! сельскохозяйственньїх исследований (МККІ), Северньій региональньй исследовательский центр (Моїйегп Кедіопа! Кезеагсіп Сепіег, 1815 Мой пімегейу Зігееї, Реогіа, Шіпоїз 61604, ОА) в - с указанное ниже время. а Ргоїох-1, в векторе рВішезсгірі ЗК, бьіл депонирован 5 апреля 1994г. под обозначениегм рУУ/ОС-2 (МАК. ,» МоВ-21238).

Ргоюх-2, в векторе рр 61, бьіл депонирован 5 апреля 1994г. под обозначением ру/ОС-1 (МАК. МоВ-21237).

МаРгоїох-1, в векторе рВішезсгірі ЗК, бьіл депонирован 20 мая 1994 г. под обозначением рУУОС-4 (МКК. -| МоВ-21260) и представлен в последовательности ЗЕО ІО МО: 5. - МаРгойох-1, в векторе рВішпезстгірі ЗК, бьіл повторено депонирован 11 июля 1994г. под обозначением руУУОС-4 (МАК. МоВ-21260М) и представлен в последовательности ЗЕО ІЮ МО: 5. 1 МаРгоїох-2, в векторе рВіцезсгірі ЗК, бьіл депонирован 20 мая 1994г. под обозначением рУу/ОС-3 (МКК. с 50 МоВ-21259) и представлен в последовательности ЗЕО ІЮО МО: 7.

Ргоїюх-3, в векторе рр 61, бьіл депонирован 10 июня 1994г. под обозначением руУУОС-5 (МКК. МоВ-21280). 4) рМ2с-ІМаї, в векторе рВішезсгірі ЗК, бьіл депонирован ЗО сентября 1994г. под обозначением рУУЮС-8 и получил каталожньій номер МКК. Мо21340. рАгасС-2Суз, в векторе рЕ! 61, биіл депонирован 14 ноября 1994 г. под обозначением рРУ/УЮС-7 и получил каталожньій номер МКК. Мо21339М.

Примерь! о Стандартнье рекомбинантнье ДНК и способьї молекулярного клонирования, применяемье в настоящем іме) исследований, хорошо известньі в данной области техники и описаньі у Т.Мапіаїйів, Е.Р.Ргіїзсп и 9У.Затбгоок в

Моїіесцшіаг Сіопіпд: А Іарогаїогу тапиа!), Соїй Зргіпд Нагрог І арогаїогу, Соїй Зргіпд Нагрог, ММ (1982), и у бо Т.).5Ійаму, МХ. Вептап и ІМ/.Епдиіві, Ехрегітепів м/йпй Сепе Ривіоп5в, Соїд Зргіпд Нагброг І арогайгу, Соїа

Зргіпд Нагброг, МУ (1984).

Пример 1: Вьіделение кДНК Агабідорзіз, кодирующих геньії протокса путем функциональной комплементации мутанта Е.соїї.

Получали и амплифицировали библиотеку кДНК Агабрідорзіз (Найапа (фирма Іапазрег9у) в плазмидном 65 векторе рЕ!/ 61 (Міпеї и др., Ріапі 9. 2: 417-422 (1992)). Приобретали вторую библиотеку кКДНК Агабрідорзів (фирма Соіштбріа) в векторе лямбда Опілар (фирма Зігаїадепе) и амплифицировали в качестве плазмид рВінезстірі путем массового исключения іп мімо исходного фага. Получали мутант петО штамма Е.соїї БЗАЗХЗВ8 (Зазаптап и др., У.Сеп. Місгобріо!. 113: 297 (1979)) и поддерживали на І-среде, содержащей 20мг/мл гематина (фирма Опіе(й Зіафїез Віоспетісаів) Плазмиднье библиотеки трансформировали в БЗАБХЗ8 путем зпектропорации с использованием прибора Віо-Кай Сепе Риїзег в условиях, рекомендованньїх производителем.

Клетки вьсевали на І-агар, содержащий 1ООмг/мл ампициллина, с плотностью приблизительно 500000 трансформантов/чашку диаметром 1Осм. Клетки инкубировали при 37"С в течение 40 часов при слабой освещенности и отбирали на основе способности расти без добавления зкзогенного гема. Гем-прототрофов вьіделяли из библиотеки рЕЇ 61 с частотой 400/107 и из библиотеки рВінезстірі с частотой 2/107. ДНК плазмидь 70 Ввіделяли из 24 колоний для анализа последовательности. Каждую из 24 колоний повторно трансформировали в ЗАЗХЗ8 для проверки способности к комплементации.

Анализ последовательности вьіявил наличие двух классов предполагаемьх клонов протокса. Девять из них относились к типу, обозначенному "Ргоїох-1". Каждьій имел происхождение из одного и того же гена, а два представляли собой полноразмернье клоньі. кКДНК имеет длину 1719 пар оснований и кодирует протеин с 75 молекулярной массой 57,7кКДа. М-концевая пептидная последовательность имеет признаки, характернье для транзитного пептида хлоропласта, состоящего из приблизительно 60 аминокислот. Исследование базьї данньйх с помощью программьі ЗАР (Юемегаих и др., Мисівіїс Асідв Кев. 12: 387-395 (1984) вьявило гомологию с протеином Пет (протоке) В. зиЇибБійїв (Напззоп и Недегвівді 1992, ЮОайеу и др., 9У.Віої. Спет. 269: 813 (1994)). Два протеина бьіли подобньі на 5395 и идентичньі на 3195 с областями вьісокой гомологии, включая предполагаемьй домен связьівания динуклеотида протеина пет" (Оаїеу и др., У.Віої. Спет. 269: 813 (1994)).

Другие 15 клонов кКДНК относились к типу, обозначенному "Ргоїох-2". По-видимому, они также происходят от одного гена. Вероятно, полноразмерная кДНК имеет длину 1738 пар оснований и кодирует протеин с молекулярной массой 55,бкДа. Конец, содержащий аминогруппу, в определенной мере характерен для митохондриального транзитного пептида. Протеин Ргоїох-2 имеет ограниченную гомологию с Ргоїох-І (подобие су на 5395, идентичность на 2895) и с протоксом В.зиБбійїв (подобие на 5095, идентичность на 2796).

Ргоїох-1, в векторе рВішезсгірі ЗК, бьіл депонирован 5 апреля 1994г. под обозначениегм рУУ/ОС-2 (МАК. і9)

МоВ-21238).

Ргоюх-2, в векторе рр 61, бьіл депонирован 5 апреля 1994г. под обозначением ру/ОС-1 (МАК. МоВ-21237).

КДНК Агабідорзіз, кодирующие Ргоїох-І, содержащийся в руУУОС-2, и Ргоїох-2, содержащийся в рууОс-Ї, (Те) приведеньї ниже в последовательностях ЗЕО ІЮО МО: 1 и З соответственно.

Пример 2: Вьіделение кДНК кукурузьі, кодирующих геньі протокса, путем функциональной комплементации о мутанта Е.соїї. ю

У фирмьї бігаїадепе приобретали библиотеку кДНК кукурузьі 7еа тауз (имбредная линия В7З) в векторе лямбда піар и превращали в библиотеку рВіцезсгірі путем массового исключения іп мімо. Вторую библиотеку --

КДНК, сделанную по заказу в векторе Опілар, приобретали у фирмь! Сіопіесй и аналогичньм образом превращали в плазмидь! рВіцезсгірі. Вьібор функциональньх генов протокса из кукурузьі осуществляли аналогично описанному вьіше в примере 1 для библиотек Агабрідорвів.

Из библиотеки фирмь! Зігаїадепе вьіделяли два гем-прототрофа в 10 трансформантах, обладающих « способностью к рекомплементации, и секвенировали. Зти кКДНК бьіли идентичньїми и оказались гомологичньіми

Ргоїюх-1 Агарідорзів. Зтот клон кукурузьі, обозначенньій как МаРгоїюх-1, является неполньім. КДНК имеет длину - с 1698 пар оснований и окодирует только предполагаемьй зрельй фермент опротоке; в ней нет й последовательности транзитного пептида и нет кодона инициации метионина. Ген идентичен на 68905 гену "» Ргоїох-1 Агарідорзіз на нуклеотидном уровне и идентичен на 7895 (подобие на 8795) на аминокислотном уровне (см. таблицу 1).

Из библиотеки фирмь Сіопіеєсп вьіделяли один гем-прототроф в 10 трансформантах, обладающий -| способностью к рекомплементации, и секвенировали. кКДНК, по-видимому, является полной, имеет длину 2061 - пар оснований и кодирует протеин с молекулярной массой 59кДа. Зтот клон является характерньм для кукурузь! гомологом Ргоїох-2 Агарідорзіз, и его обозначили как МаРгоїох-2. Ген идентичен на 5895 гену Ргоїох-2 1 Агарідорзіз на нуклеотидном уровне и идентичен на 5895 (подобие на 7695) на аминокислотном уровне (см. о 50 таблицу 2). Клон из кукурузьі имеет М-концевую последовательность, которая на ЗО аминокислот длиннее, чем таковая в клоне Агарідорзіз. Так же, как и для клонов Агабідорзів, гомология между двумя генами протокса 4) кукурузь! довольно низка, идентичность между последовательностями двух протеинов составляет только 3190.

МаРгоїох-1, в векторе рВішезсгірі ЗК, депонированньій 20 мая 1994г. под обозначением руУЮсС-4 (МКК.

МоВ-21260), представлен в последовательности ЗБЕО ІЮ МО: 5.

МаРгойох-1, в векторе рВіцезсгірі ЗК, повторно депонированньй 11 июля 1994г. под обозначением рУУЮС-4 (МАК. МоВ-21260М), представлен в последовательности ЗЕО ІЮО МО: 5. о МаРгоїох-2, в векторе рВіцезсгірі ЗК, депонирован 20 мая 1994г. под обозначением рУУ/ОС-3 (МАК. ко МоВ-21259), представлен в последовательности ЗЕО ІЮ МО: 7.

Пример 3: Вьіделениег дополнительньх генов протокса на основе гомологий последовательности с бо известньіми последовательностями, кодирующими протоке

Библиотеку фага или плазмидьі вьісевают с плотностью приблизительно 10000 бляшек на чашки Петри диаметром 10см и после вьіращивания растений в течение ночи при 37"С осуществляют сьем бляшек при помощи фильтра. Сьемьї! бляшек зондируют с помощью одной из кКДНК, представленньїх в ЗЕ. ІЮ МО: 1,3,5 или 7, меченной по З2Р-дЦТФ методом рассеянной затравки с использованиеєм набора РгітеТіте (фирма б5 Іпіегпайопа! Віоїесппоіодіев, пс. Мем Намеп, СТ). Применяют следующие условия гибридизации: 795-ньй додецилсульфат натрия (ДСН), 0,5М МаРо, с рН7,0, їмМ ЗДТК при 50"С. После гибридизации в течение ночи фильтрьі промьшвают 2х55С, 195-ньм ДСН. С помощью авторадиографии вьявляют положительно гибридизирующиеся бляшки. После очистки до получения отдельньїх бляшек вьіделяют вставки кДНК и их последовательность определяют с о помощью метода терминации о цепи с о использованием дидезокси-терминаторов, меченньїх флуоресцентньми красителями (Арріїед Віозузіетв, Іпс., Ровіег СПУ, СА).

Стандартньій протокол зксперимента, описанньій вьіше, может бьіть использован специалистом в данной области техники для получения генов протокса с последовательностями, гомологичньМми известньм последовательностям, кодирующим протоке, из любого другого зукариота, в частности из других видов вьІСшШИх растений. 70 Упорядоченное расположение предсказанньх аминокислотньїх последовательностей соответствующих протеинов, кодируемьїх последовательностями, представленньми в ЗЕО ІЮО МО: 2 и 6, приведено в таблице 1.

Упорядоченное расположение предсказанньїх аминокислотньїх последовательностей соответствующих протейинов, кодируемьїх последовательностями, представленньіми в 5ЕО ІЮ МО: 4 и 8, приведено в таблице 2.

З

Сравнение аминокислотньх последовательностей Ргоїох-1 Агарідорвів (ЗЕО ІО МО: 2) и кукурузьі (ЗЕО І МО: 6)

Процент подобия: 87,137. Процент идентичности: 78,008.

Ргоїох-1.Рер х МаРгоїох-1.Рер 51 ССТТІТТОСУТУСОСІ5ЗСІСТАОАБАТКНРОДАРМЬІУТЕАКРЕУССОМІТ 100 ««МІТ:ТТІ ЕТ ОТ ТЕТ сю сх І: 1. ТО 1 ...-М5БАРСУМУУСОСІЗСІСТАОАБАТВН. СУСОУБУТЕАВАВРСОСМІТ 44 101 т..ВЕЕМСЕІМЕЕСРМЗКОРБОРМІТМУУОЗСЬКРОБУБСОРТАРВЕМІМ 148

ОБ: ТТ ВТНЗ ТУТ ВІТ ТІ УТ КІ, 45 ТУЕВРЕЕСУГМЕКСРМІЗЕОРБОРУСТМАМОЗСЬКОРІЛЕСОРМАРВЕМУТЯ 94 с 149 МСКЬВРУРЗКІТОПРЕЕОІМ5ІССКІВАСЕСАЦСІВРОРРОВЕЕЗУЕВЕУ 198 «ІІТ «ІІ Е.Л НА: ЕТ АУТ ТАВТТ ИТ Го) 95 БОКІВРУРЗКРАОЬРЕЕРІМ5ІРОКІВАСЬСАСБСТЕРРРРОВЕЕЗУЕЕКМ 144 199 ВВМІСОЕУРЕВЬІЕРЕСЗСУХАСОРЗКІЬОМКААКСКУИКЬЕОМОСЗТІсс 248

ГОТОВЕ СТ ТТ ТИ: ВІ: . ЕТ 145 ВАМІСАЕУРЕВОІЕРЕСЗСУУАСОРОКІЗМКААКСКУЧВОКЕЕТОС5ІЇСС 194 249 ТЕКАІОЕВКМАРКАЕВОРВІРКРОСОТУСЗЕВКСЬВМОРЕАІЗАВІСЯКУ 298 |се) 121.11... ТЗІ. ІІ БІТ Е.О ТІ 195 ТІКТІОЕВ5КМРКРРАОАВЬРКРКСОТУАЗЕВКСПАМІРМНАЇТ55165КУ 214 со 299 КІБИКІБСІТКЬЕ5ССУМІТХЕТРОСЬУЗМО5К5УУМТУРЗНУАВЗСІЬАР. 348 кедр ниш и Я ПИЛА В ЛИЛеЛИН, ЧАТИ І в) 245 КІЬБЯКЬТ5ІТК5ОВКСУМБЕХУЕТРЕСУУЗУОАКОМІМТІРБЗУУАЄМІТВР. 294 ! - 349 Б5ЕБЛАМАБЗКІХУРРУААУБІЗУРКЕАТВТЕСТІРСВІКСЕСОСНЕВТО 398 11.12: ТІ ТЕТ ТІ ІТ ЕТ ТУ ІТ Я ТО ТІ Я ГІ УСІ 295 ЬББОВАОАТЗВЕУХУРРУААУТУ5УРКЕАТАКЕСТІОСЕСОСЕСОБИРВБО 344 - 399 СМЕТІСТІХ5551ЕРМВАРРОВІБІЦЬМУІОО5ТМТСІ5КЗЕСЕБУБАМУО 448

ГІПЕР О ЕЕ: 1. 1: ТТ 345 СУЕТІСТІУ555ДЕРМКАРОСВМІСМУІССАТМТОТУЗКТЕЗЕГУКАМО 394 449 КОБВКМПІКРИБТОРЬКЬСУВУИРОАЗІРОГЬУСНЕРІБОТАКОбІТО5СсУ 498 «

ІІІ... ІІТ ЗІ У ІТТ І: 41:11... 395 ВОБАКМІІМОТАУВРІУБСУВУЙРОАІРОКБУСНЬОББЕААКАЛІОВОСУ 444 499 ЕСБЕБОСМУУАСУАСЬСВСМЕСАХЕТАІЕУКМЕМОВУАУКХ 538 но) с ТЕКІІІТЕТІОТІТ ІТТ ТЕЕТ.Е ст:.:1:.: ТІ,

А4У ОСЬЕТОСМУМАСУАЛІСВСУЕСАУЕБАСОЇ5ОЕГТКУАУК" 484 . а

Идентичнье остатки обозначеньії с помощью вертикальньїх черточек между двумя последовательностями. 15 Упорядочивание осуществляют с помощью программь! САР, описанной у Юемегаих и др., Мисівїс Асідз Кез. 12: 387-395 (1984). - і шо Таблица 2

Сравнение аминокислотньх 1 последовательностей Ргоїох-2 Агарідорвів о 50 (ЗЕО І МО: 4) и кукурузьі (ЗЕО ІР МО: 8)

Процент подобия: 75,889. Процент идентичности: 57,905.

Ф Ргоїох-2.Рер х МаРгоїох-2.Рер ко бо б5

1 птн юю «МАБСАМАО НОТЕАУБСКЕУАХУ 21 1 МІЛІТАВАЗОАЗЗНРУКНАЗАНТЕВРВІВАМТАНАС БОР ВААРАКЕТМІ 50 22 УБАСУЗСЬКААУКІКЗВСІВУТУКЕАрСВУССКІ ВО УМОМОМВІЧОВОАМТ 71 51 УБАСУЗБІАЛАУВІКО ЗЛІ ТУЕААРНАСЕКІВТИЄЕССЕУНОВСАН 100 12 МТЕАЕРЕУС5ІПООБСЬКЕКООЕРІБОКЕВУІУВМСУРУМЬРТМРІЕТУТ 121

ПИ АНА ЛЕ КК ПАВПЛЛе ШЛАКИ ЛА АДЕЛЬ 101 МТЕСЕНЕАЗВБІОРЬСГІОРКООУРМЗОНКЕУІУКОСАРАБІРОЗОРІЗІМК 150 122 555Б57Т0О5КЕОТІШЕРЕШНКК.. .К55КУЗОАБЗАБЕЗУЗЕКЕОВНЕСОЕ 167 0 151 ЗБУІЗТККІМІЕРЕРРІТККАМ ТАН СКУ ЕЕНЕСЕБУСОРСЕВНЕСЯЕ 200 168 УМОУБІОРЕУбСТЗААОРОЗЬЗМКНЗЕРОГИЯМУЕКОЕОЗІТУСАІВТКЕА 217

ГЕТЕ: ЕІ: 111 2:41: 201 ММОУЕМОРЕМАСТ5ЗАСОРЕЗІЗІВНАЕРАТЯМІЦЕВКУСЗУІУСАЇЬОКІЦА 250 218 АКОСК5ВОТКЗ5РСТККСЗВОБЕ5ЗЕКСОМОІБРОТЬСКОІЗНОБІНЬОЗК 267 251 АКБОРУКТАНОВССКАВН ВУ ЯРМО ТИАТЯМЕИСО МУКА 300 т 268 МЬБЬб5..ХМ5б5БОЕМЯБЬОСУЗНМЕТОВО... МРНУОАМІМТАРЬСМУК 312 зо1 ЕІАСТЕОСІРАІЕКИ ТОК СО КтАНОТР ОА ТМТАРІЄНАИК 350 313 ЕМКУМКОСОРЕОБМЕБРЕІЇМУМРІ,ЗУСІТТЕТКЕКУКАРЬЕСЕСУБІРЗК 362 11. 11.1. 211: ро: 1 сс: Р. 1.1: ІТТ ТРІО 351 ВМКЕТКОСАРУМІ»ОКОРКМОУБРІЬЗІМУТАЕККОРУККРІЕСЕСМТІРУК 400 363 Е.ОКНСЕКТІСТОЕЗ5ММЕРОВ5РООУВСУТТРІССБ5АМОЕТАКАЄТОКІ 411

І ПИТ: ЕЕ ЕТ ТТ. 1. ТЕТ ЕЕ: І РІ: 1.11 1.1У І 401 ЕООКНСЬКТІСТІЕ55ММЕРОВАРОРОХУТТРУСО5НМВОБАСАРТ5УІІ, 450 412 КОМУТ50БОВЦЬСУЕСЕРУБУМНУХИЯВКАЕРЦІХО55ХО5УМЕАІЮКМЕМО 461 451, КОАТУУ КСО ТУКА НОМЕРІ СНО УС ЛЕАТЕКМЕКИ. 500 462 БРОБЕХАСМНАССЬ5УСКОІАБЗССКААРІМІЗУБЕБСОМОККРМОБЗЬХ 509 с

ІІІ зе... ПЕТЛІ ТИВ сю: 501 ПРОЕКЕБКУАОМЗКРСТАМСЗМУІАБЗСЗКААРІАТЗУБЕБНТКНММОНХ... 545 (Фо.

Пример 4: Вьіделение загрязненного дрожжами клона Ргоїох из библиотеки кКДНК Агабрідорзів

Для идентификации любьх редких кКДНК, обладающих активностью протокса, осуществляли второй скрининг с библиотеки Агарідорзіз в векторе рЕ/б61 таким же образом, как зто описано вьше, получая вновь сотни комплементирующих клонов. Приблизительно 600 из них помещали индивидуально на сетчатье пластинки и. инкубировали при 28"С в течение 18 часов. Осуществляли двукратнье сьемь! с фильтра на мембрань! для ю скрининга колоний/бляшек (фирма МЕМ) в соответствий с инструкциями производителя. кКДНК Ргоїох-1 и Ргоїох-2 удаляли из их векторов путем разложения с помощью Есокі/Хпої и Мої! соответственно. Вставки разделяли с «-- з5 ПЛомМощью гель-злектрофореза в 1,096-ной легкоплавкой агарозе ЗеаРіадое СТО (фирма ЕМО), внрезали и чн метили по Р путем рассеянной затравки (Ге Тесппоіодіев). Один набор сьемов гибридизировали с каждьм зондом. Условия гибридизации и промьівки соответствовали таковьім, описанньім у Спигсй и сіїЇрен, 1984.

Колонии (-20), которне не проявили вьіраженную гибридизацию с Ргоїох-1 или с Ргоїох-2, амплифицировали в жидкой культуре и получали ДНК плазмидь». ДНК разлагали с помощью Мої, два зкземпляра образцов « 70 разгоняли на 196-ном агарозном геле и подвергали саузерн-блоттингу на фильтре типа Сепе Зсгееп Різ |рирма ш-в

МЕМ (Мемж Епадіапа Мисіеаг)). Зондь! двух известньїх генов Ргоїох метили и гибридизировали по описанной вьіше с методике. Бьіло обнаружено два идентичньїх клона, которье не представляли собой ни Ргоїох-1, ни Ргоїох-2. :з» Бьіло установлено, что такой клон рекомплементирует мутант ЗАБХЗ8, хотя он растет очень медленно, и он бьлл обозначен как Ргоїох-3.

Ргоїох-3 в векторе рР! 61 бьіл депонирован 10 июня 1994г. под обозначением рРУУЮОС-5 (МКК. МоВ-21280). -1 Бьіло установлено, что зта кодирующая последовательность должна иметь происхождение из ДНК дрожжей, которье присутствуют в качестве побочного загрязнителя в библиотеке кКДНК Агарідорзіз. ДНК дрожжей, -й кодирующая Ргоїох-3, входящая в РУУОС-5, представлена ниже в виде 5ЕО ІЮ МО: 9. сл Пример 5: Демонстрация чувствительности клона протокса растения к ингибирующим протоке гербицидам в бактериальной системе о Жидкие культурь! Ргоїох-1/5А8Х38, Ргоїох-2/ЗА5ХЗ38 и рВіцезсгірух! І-Віче вьиращивали в среде І атр'сб,

Ф Аликвотьі обьемом сто микролитров каждой культурьі вьісевали в среду Ї атр'бО, содержащую различнье концентрации (1,0нМ-10мМ) ингибитора протокса, а именно, гербицида из класса арилурацила формуль! ХМІЇ.

Двойньсе наборьї чашек инкубировали в течение 18 часов при 377С либо при слабом освещениий, либо в полной

Темноте.

Штамм Е.соїї протоке" ХіІ-Віде не проявил чувствительности к гербициду при любой изученной о концентрации, что согласуется с опубликованньми данньми об устойчивости нативного бактериального іме) фермента к аналогичньім гербицидам. Ргоїох-1/75А5ХЗ38 проявил вьтіраженную чувствительность к гербициду, причем "газон" бактериий почти полностью уничтожался концентрациями ингибитора ниже Л1Онм. 60 /Ргоїох-2/5А5ХЗ8 таюке оказался чувствительньім, но только к более вьісокой концентрации (10мММ) гербицида.

Воздействие гербицида на оба штамма протокса из растений бьіло более сильньім при слабой освещенности, но также проявлялось на чашках, содержавшихся в полной темноте. Токсичность гербицида полностью злиминировалась при добавлений в чашки 20мг/мл гематина.

Различная толерантность к гербициду между двумя штаммами протокса из растений, вероятно, является б5 скорее результатом различной зкспрессии из зтих двух плазмид, чем любьм присущим ему различием в чувствительности фермента. Ргоїох-1/5А5Х38 растет существенно медленнее, чем Ргоїох-2/ЗАЗХЗ5 в любой среде с дефицитом гема. Кроме того, штамм МеРгоїох-2/5А5Х38, сравнимьй опо скорости роста с

Ргоїюх-1/5А5Х38 Агарідорзіз, также является очень чувствительньім к более низким концентрациям гербицида (10-100нМ). Первичная характеризация клона Ргоїох-3 дрожжей показала, что он также чувствителен к гербициду.

Пример 6: Селекция на устойчивость генов протокса растений к гербицидам-ингибиторам протокса в системе зкспрессии Е.соїї

Ингибирование ферментов протоксов растений в бактериальной системе пригодно для крупномасштабного скрининга мутаций, обусловливающих устойчивость к гербициду в генах растений. Первичнье зксперименть! по 7/0 Вніявлению зависимости доза-реакция, сделаннье путем вьісевания жидких культур, дали появление вьісокой частоть! "устойчивьїх" колоний даже к вьсоким концентрациям гербицида. Зта устойчивость не бьла обусловлена плазмидой, как показал анализ ретрансформации/чувствительности к гербициду. Плазмидь,, трансформирующие протоке в мутанте ЗА5ХЗ8 и вьісеяннье непосредственно на чашки, содержащие гербицид, почти полностью устраняли зту фоновую проблему.

Плазмидьй с протоксом растительного происхождения мутируют различньми способами, используя опубликованнье методь! химического мутагенеза |например, с помощью бисульфита натрия (Зпопе и др.,

Меїйодвз Епгутої. 100: 457-468 (1983))) метоксиламина (Кадопада и др., Мисіеіс Асідз Кевз. 13: 1733-1745 (1985)); насьщщенного сайт-специфического мутагенеза (Ниїспіпзоп и др., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 83: 710-714 (1986)); или различньїх стратегий, основанньїх на ошибке включения полимеразь (см., например, у

Зпогпе и др., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 79: 1588-1592 (1982); ЗПігаівпі и др., Сепе 64: 313-319 (1988); и у Гешпа и др., Тесппідце 1: 11-15 (1989))). Ожидаемье позитивнье мутанть! промотора вследствие мутагенеза всей плазмидь! исключают путем повторного клонирования кодирующей последовательности в векторе дикого типа и повторного тестирования. Если предполагается, что более вьісокая зкспрессия приведет к лучшему росту в отсутствий гербицида, то возможен также визуальньй скрининг кодирующей последовательности с ов Мутантов.

Любнье геньї протокса растений, зкспрессирующие устойчивость к гербициду в бактериальной системе, могут і) бьїть сконструированьь для оптимальной зкспрессиий и трансформированьй в растениях с применением стандартньїх методов, приведенньїх в данном описаний. Затем полученнье растения могут бьіть обработань гербицидом для подтверждения и количественной оценки уровня устойчивости, обусловливаемого введенньім «о зо Геном протокса.

Пример 7: Конструкции для зкспрессии в растениях устойчивого(вьіїх) к гербициду гена(ов) протокса о микроорганизма ю

Кодирующие последовательности для гена протокса В зибійв пету (Напззоп и Недегвзіедії, У.Васіегіо!. 174: 8081 (1992); Оаїйеу и др., У.Віої. Спет., 269: 813 (1994)) и для гена протокса Е.соїї ПпетОо (Зазагтап и др., --

Сап. 9У.Місгобіо!. 39: 1155 (1993)) вьіделяли из лабораторньїх штаммов путем ПЦР-амплификации с применением ї- стандартньїх //условий и фланкирующих праймеров, сконструированньх из опубликованньх последовательностей. Известно, что зти геньї кодируют устойчивье к гербициду формь! фермента протокса.

Применяя стандартнье методики перекрьівающего ПЦР-слияния (А!Їйгзивеї и др., Сигтепі Ргоїосоїв іп МоіІесшаг

Віооду, удопйп УМпПеу 85 Бопв, Іпс. (1994)) оба бактериальньх гена сливали с двумя различньми « последовательностями транзитного пептида хлоропласта Агарідорзів (СТР). Первьй представлял собой СТР из пл) с синтазьї ацетоксикислотьії (АНА5З, Малгиг и др., Ріапі Рпузіої. 85: 1110 (1987)), которьій должен обеспечивать импорт в строму хлоропласта. Второй имел проийсхождение из гена пластоцианина Агабрідорзів (Могзі и др., Сепе ;» 65: 59 (1988)), которьій имеет состоящий из двух частей транзитньій пептид. Аминоконцевая часть зтого СТР ориентирует протеин в хлоропласт, где конец с карбоксильной группой направляет его в мембрань! тилакоида.

Все четьре гибридньїх гена клонировали за промотором 2Х355 в бинарном векторе зкспрессии, -І сконструированном для получения трансгенньїх растений путем трансформации агробактерии.

После вьіделения кКДНК протокса Агарідорзіз и кукурузьї транзитньій пептид хлоропласта из Ргоїох-1 или - МаРгоїох-1 также может бьїіть слит с двумя бактериальньми протеинами протокса способом, описанньїм вьіше. с Векторьї, описаннье вьше, могут бьїть, затем трансформировань в требуемьмх видах растений, а 5о полученнье трансформантьй могут бьть проанализировань в отношений увеличенной устойчивости. к о гербициду.

Ф Пример 8: Смена домена генов Агарідорзіз/В.зиБійїз для получения химерного, устойчивого к гербициду протокса

Одним из способов, которьій может бьть использован для получения гена протокса, как обладающего в устойчивостью к гербициду, так и способного обеспечивать зффективную ферментативную активность протокса в растений, является слияние части(ей) бактериального и растительного генов протокса. Полученнье химернье (Ф, гень! могут бьіть, затем подвергнуть! скринингу для вьіделения тех, которне способньі! обеспечить активность ка устойчивого к гербициду протокса в клетке растения. Например, последовательности пептида протокса

Агарідорзіз и В.зиБбійз (пет) в достаточной степени колинеарньї с областями вьісокой гомологии. Кодирующую бо последовательность пету клонируют в рВіцезсгірі и тестируют на ее способность зкспрессировать активность устойчивого к гербициду протокса в ЗАБХЗ8. Химернье геньі Ргоїох-1/лету конструируют с применением методики слияния на основе ПЦР с последующим обратньм лигированием в вектор рВішезсгірі. Исходньй обмен осуществляют приблизительно в середине протеинов. Зти гибридьі тестируют на функционирование протокса путем комплементации и затем анализируют в отношений устойчивости к гербициду путем вьісевания 65 В среду с гербицидом, применяя интактньсе Ргоїох-1 и пету в качестве контроля.

Пример 9: Получение толерантньїх к гербициду растений с помощью сверхзкспрессии генов протокса растения

Для зкспрессии протеина Агарідорзіз или кукурузьіь в трансгенньхх растениях соответствующую полноразмерную кДНК встраивали в вектор зкспресий рСОМ1761ЕМХ, имеющий происхождение из рСОМ1761, следующим образом. рСОМ1761 разлагали в его уникальном сайте ЕсоК!І и лигировали с фрагментом двухцепочечной ДНК, включающим два олигонуклеотида, имеющих последовательности 5-ААТ ТАТ ЗАС СТА

АСО ТАС САА ТТА Со СС СОС ТСТ СА ОТ-3 (5ЕБО ІЮ МО: 11) и 5-ААТ ТАО ТСО АСА СО ОСС Со ААТ

ТОСС ТАС ОТ АСО ТСА Т-3 (5ЕБО ІЮО МО: 11). Полученная плазмида рСОМ1761ЄЕМХ содержала уникльнье сайть! ЕсоКіІ, Мої! и Хпої, расположеннье между дублированньм промотором 355 из вируса мозаийки цветной /о Капустьі (Кау и др., Зсієпсе 236: 1299-1302 (1987) и З'-нетранслируемьми последовательностями гена (ті

Адгорасіегішт (Шптеїтасіеп5. Зту плазмиду разлагают и лигируют с фрагментом, образованньм в результате разложения рестриктазой одной из плазмид, несущей кДНК протокса, так, чтобьі она несла полную КкКДНК протокса. Из зтой плазмидь! вьірезают фрагмент Хвраї, содержащий кДНК протокса Агарідорзіз, фланкируемую дублированньмм промотором 355 и 3'-нетранслируемьми последовательностями гена іті А. (шптегїасіепв. Зтот 7/5 Фрагмент Хвраї! встрайвают в бинарньій вектор рСІВ200 в его уникальном сайте Хвраї, расположенном между пограничньми последовательностями Т-ДНК. Полученную плазмиду, обозначенную как рСіІВ2ООргоїох, трансформируют в штамм А. Штегасіепз СІВ542. См., например, у ОКпезз и др., Ріапі Сеї|, 5: 159-169 (1993).

Листовье диски Місойапа (арасит су. Хапійі-пс заражают штаммом А. ішптеїасіепе СІВ542, несущим рРСІВ2О0ІОРО, как описано у Ноегзсй и др., Зсіепсе, 227: 1229, (1985). Устойчивье к канамицину проростки из 15 го независимьх листовьх дисков переносят в среду для вьіращивания, затем пересаживают в почву и полученнье растения виіращивают в теплице до созревания. Семена от зтих растений собирают и проращивают в агаровой среде М5, содержащей канамицин. Большое количество проростков, устойчивьїх к канамицину от каждого независимого первичного трансформанта вьуращивают в теплице до созревания и затем собирают их семена.

Зти семена проращивают в агаровой среде М5, содержащей канамицин. с

Линий растения, дающие проростки, обладающие исключительной устойчивостью к канамицину, являются гомозиготньіми по встроенному гену и их подвергают дальнейшему исследованию. Листовье диски каждой из 15 і) независимьїх трансгенньїх линий вьірезают с помощью бумажного пуансона и помещают на агаровую среду М5, содержащую различнье увеличивающиеся концентрации гербицида, ингибирующего протоке.

Через три недели два набора из 10 дисков от каждой линии взвешивали и регистрировали результать. (д зо Трансгеннье линии, более устойчивне к действию ингибитора, чем нетрансформированнье растения дикого типа, отбирают для дальнейшего анализа. і,

Из листьев каждой из зтих линий зкстрагируют РНК. Общую ДНК из каждой независимой гомозиготной линии (У и из нетрансгенньїх контрольньїх растений разделяют с помощью злектрофореза на агарозном геле в присутствимй формальдегида (А!йзире! и др., Ситепі Ргоїосоіїв іп МоІесшаг Віоїоду, ММйеу 5 Зопв, Мем/ Мого -- (1987)). Гель наносят на найлоновую мембрану (А!йзибеї и др., вьиіше) и гибридизируют с радисактивно меченной ї-

КДНК протокса Агарідорзіз. Условия гибридизации и смьіва являются теми же, которье описаньі у Спигсп и

Сіїрегі, Ргос. Май. Асай. осі. ОБА, 81: 1991-1995 (1984). Остаток на фильтре подвергают авторадиографии и определяют интенсивнье полосьі! РНК, соответствующие трансгену протокса, во всех толерантньїх к гербициду линиях трансгенньїх растений. «

Для дальнейшей оценки устойчивости линий со сверхзкспрессией протокса растения виращивают в теплице пт») с и обрабатьввают различньіми концентрациями ингибирующего протоке гербицида.

Пример 10: Вьіращивание суспензионньїх культур клеток табака з Среда

МХІ1: Зта среда состоит из средьі Мигазпіда и ЗКосд ("М5", Т.Мигазпіда и др., Рпузіо!. Ріапі. 15: 473-497, 1962), содержащей основнье соли, побочнье соли и Ре-ЗДТК (фирма Сірсо Мо500-1117; 4,Зг/л), 10Омг/л -І мисинозитола, мг/л никотиновой кислотьІ, мг/л пиридоксина-НСІ, 1Омг/л тиамина-НСІ1, 2-Зг/л сахарозь,,

О,4мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотьі и 0,04мг/л ккинетина, рН5,8. Среду сстерилизуют путем - автоклавирования. с Мб: Зта среда включает макрозлементьї, микрозлементь! и Ге-ЗДТК, как описано у С-С. Спи и др., Зсіепійа 5о Зіпіса, 18: 659 (1975), и следующие органические соединения: пиридоксин-НСІ (0,5мг/л), тиамин-НСГ. (0,Тмг/л), о никотиновую кислоту (0,5мг/л), глицин (2,О0мг/л) и сахарозу (З30О,Омг/л). Раствор автоклавируют. Окончательное

Ф значение рН равно 5,6.

Примечание: макрозлементь! готовят в виде маточного раствора 10-кратной концентрации, а микрозлементь в виде маточного раствора 1000-кратной концентрации. Маточньій раствор витамина обьчно готовят в 100-кратной концентрации.

Суспензию культивируемьїх клеток линии 53 Місойапа (арбасит (Наптз и ОіМаїйо, 9У.Ріапі Рпузіої, 137:

Ф) 513-519, 1991) вніращивают в жидкой среде для культивирования МХ1. 25мл средьі! МХ1, содержащейся в ка 100мл колбах Зрленмейера, инокулируют 1Омл культурьі клеток, предварительно вьіращенньїх в течение 7 дней. Клетки инкубируют при 25"С в темноте на вращающемся шейкере при 100об/мин (с амплитудой 2см). бор Клетки пересевают с 7-дневньіми интервалами путем инокулирования аликвотного образца в свежую среду с помощью декантирования или пипетирования приблизительно 9095 суспензии клеток с последующим пополнением свежей средой для получения требуемого обьема суспензии. В течение 10 дней роста после инокуляции 250-35Омг клеток получают 5-8г сьірой массь клеток.

Пример 11: Получение культур клеток табака, толерантньїх к гербицидньм ингибиторам протокса, путем 65 Вніращивания клеток на отвердевшей среде для селекции

Клетки предварительно вьращивают аналогично описанному в примере 10. Клетки собирают путем седиментации или путем кратковременного центрифугирования при 500хд и удаляют использованную среду.

Затем клетки разбавляют свежей средой для культивирования для получения плотности клеток, достаточной для вьісевания клеток на чашках и составляющей приблизительно 10000 колонигобразующих единиц на мл.

Для вьсевания клетки в малом обьеме средь! (приблизительно їмл) равномерно распределяют по верхней поверхности отвердевшей средьй для культивирования (МХ1, 0,895 агара), содержащей необходимую концентрацию ингибитора. Используют приблизительно 20-ЗОмл средьй на чашку Петри диаметром 10см.

Пригодную концентрацию ингибитора определяют на основе кривой доза-реакция (пример 14), и она является по крайней мере в два раза вьіше, чем ІСвко для чувствительньх клеток дикого типа. 70 Чашки с культурой, содержащие клетки, распределеннье на среде для селекции, инкубируют при нормальньїх условиях для роста при 25-287"С в темноте до образования колоний. Образовавшиеся колоний клеток переносят в свежую среду, содержащую ингибитор в необходимой концентрации.

В предпочтительной модификации описанного метода предварительно вьращенную суспензию культивируемьїх клеток сначала распределяют в малом обьеме жидкой средьй по верхней поверхности отвердевшей средь. Добавляют равное количество теплой жидкой агаровой средь (1,2-1,69о5 агара), вьідерживавшейся в расплавленном состояний при приблизительно 40"С, и чашку сразу же осторожно приводят во вращение, чтобьї равномерно распределить клетки по поверхности средьй и смешать клетки и агаровую среду до того, как среда отвердеет.

В другом варианте клетки смешивают с расплавленной агаровой средой до распределения по поверхности 2о бредь для селекции. Зтот метод имеет то преимущество, что клетки внедряются и иммобилизируются в тонком слое отвердевшей средьї на верхней поверхности средь! для селекции. Зто дает возможность лучшей азрации клеток по сравнению с клетками, внедренньіми в весь обьем, составляющий 20-3Омл.

Пример 12: Получение культур клеток табака, толерантньїх к гербицидному ингибитору протокса, путем вьіращивания клеток в жидкой среде для селекции с

Клетки, вніращеннье аналогично описанному в примере 10, инокулируют в пригодной концентрации клеток в жидкую среду МХ1, содержащую необходимую концентрацию гербицидного ингибитора протокса. Клетки і) инкубируют и вьіращивают по описанной в примере 10 методике. Через 7-10 дней клетки пересевают соответствующим образом в зависимости от скорости роста, применяя, свежую среду, содержащую необходимую концентрацию ингибитора. «о зо В зависимости от концентрации ингибитора рост клеток может бьіть менее интенсивнь!м, чем при отсутствий ингибитора. о

Пример 13: Получение культур клеток табака с повьішенньіми уровнями фермента протокса ю

Для получения культур клеток или каллюса с повьішенньми уровнями фермента протокса суспензионнье культурь! клеток или каллюс позтапно переносят в среду со все более вьісокими концентрациями гербицидного (87 з5 Мнгибитора протокса. В частности осуществляют следующие зтапь!. ча

Колоний клеток, образовавшихся из вьісеянньїх клеток в соответствии с примером 11, переносят в жидкую среду МХІ, содержащую такую же концентрацию ингибитора протокса, которая бьла использована при селекции в соответствии с примером 11, чтобьі образовать суспензионнье культурьі В другом варианте отобраннье суспензионнье культурь! клеток, полученнье в соответствии с примером 12, пересевают в жидкую « среду МХ1, содержащую такую же концентрацию ингибитора протокса, которая бьіла использована для в с селекции в соответствии с примером 12. . Культурь! пересевают 1-20 раз с недельньіми интервалами и затем пересевают в среду МХ1, содержащую а следующую более вьісокую концентрацию гербицида. Клетки вніращивают для получения 1-10 пассажей в среде, содержащей зту более вьісокую концентрацию гербицида. Затем клетки переносят в среду МХ1, содержащую следующую более вьісокую концентрацию гербицида. -І В другом варианте кусочки отобранного каллюса в соответствии с примером 11 переносят в отвердевшую среду МХІ, дополненную до необходимой концентрации гербицида. Перенос в среду с более вьісокой - концентрацией осуществляют в соответствии с методикой, описанной в предьідущем абзаце, за исключением с того, что используют отвердевшую среду.

Пример 14: Измерение роста клеток в зависимости от дозь! в суспензионньїх культурах о Для получения кривой доза-реакция определяют рост клеток при различньїх концентрациях гербицида.

Ф Суспензионнье культурь! чувствительньїх к гербицидному ингибитору протокса клеток 53 табака дикого типа и толерантньїх к гербициду селектированньх или трансгенньх клеток 53 и толерантньїх к гербициду селектированньїх или трансгенньїх клеток предварительно вьіращивают в жидкой среде, как описано в примере дБ 11, до вьісокой плотности клеток в течение 2-4 дней. Клетки отмьівают от использованной средь! и добавляют свежую среду без гербицида для получения необходимой плотности клеток (приблизительно 150мг сьірого веса

Ф) (СВ) клеток на мл суспензии). Затем образец суспензии клеток обьемом 2,5мл, содержащий приблизительно ка 250-300мг СВ клеток, инокулируют в приблизительно ЗОмл жидкой средьй с необходимой концентрацией гербицида, содержащейся в колбе Зрленмейера обьемом 100мл. Предпринимают соответствующие мерньї, бо /чтобьі инокулировать одинаковое количество клеток в каждую колбу. Каждая колба содержит одинаковьій обьем средьі. На одну концентрацию гербицида инокулируют 3-6 колб-дубликатов. Концентрацию гербицида вьібирают из следующего ряда: ноль (контроль), 0О,1част./млрд, О,Зчаст./млрд, Ічаст./млрд, Зчаст./млрд, 1Очаст./млрд,

ЗОчаст./млрд, 100част./млрд, ЗООчаст./млрд, 100Очаст./млрд, З0О0Очаст/млрд и 1000Очаст/млрд. В момент инокуляции отбирают несколько образцов инокулированньх клеток для определения массь! клеток, 65 Мнокулированньх в одну колбу.

Затем клетки инкубируют для роста в контролируемьїх условиях при 28"С в темноте в течение 10 дней.

Клетки собирают путем сливания. содержимого каждой колбьі на диск из фильтровальной бумаги, присоединенньй к всасьівающему устройству для удаления всей жидкости и получения массьї достаточно сухих свежих клеток. Определяют массу свежих клеток. Сухую массу образца можно определить после вьісушивания.

Определяют рост клеток, вьіражают в виде прироста клеток за 10 дней, а также в виде процента по отношению к росту клеток при отсутствии гербицида в соответствии со следующей формулой: (конечная масса клеток, вьіращенньїх с присутствием гербицида, минус масса инокулята х100, деленная на конечную массу клеток, вьуращенньїх без гербицида, минус масса инокулята). Значения ІС во определяют из графика, построенного по зтим данньїм (относительная масса клеток по отношению к концентрации гербицида). Значение 70 ІСво представляєт собой концентрацию гербицида, при которой рост клеток составляет 50905 от роста клеток в контроле (клетки, виіращенньсе в отсутствие гербицида).

В модификации зтого метода несколько кусочков каллюса, полученньїх из культурь! клеток, устойчивьсх к гербициду, как описано в примерах 11 и 13, переносят на отвердевшую среду для культивирования каллюса, содержащую различнье концентрации гербицида. Относительньй рост определяют после 2-6б-недельного 7/5 Культивирования путем взвешивания кусочков каллюса и сравнения с ростом культурь! в контроле в среде без гербицида. Однако метод с использованием суспензий более предпочтителен вследствие его более вьісокой точности.

Пример 15: Определение перекрестной толерантности

Для определения степени, в которой клетки проявляют толерантность по отношению к аналогичньім или другим гербицидам, повторяют описанную в примере 14 методику по вьиіращиванию клеток во все возрастающих концентрациях вьібранньїх гербицидов. Для цели сравнения для каждого гербицида определяют относительньй рост клеток и его значение ІСво.

Пример 16: Определение стабильности фенотипа толерантности к гербициду с течением времени

Для определения, сохраняется ли со временем фенотип толерантности к гербициду культурь! клеток, клетки с переносят из средьї, содержащей гербицид, в среду без гербицида. Клетки виіращивают по описанной в примере 10 методике в отсутствие гербицида в течение З месяцев, применяя регулярньій пересев Через о соответствующие интерваль! времени (7-10 дней для суспензионньїх культур; 3-6 недель для культур каллюса).

Затем определеннье количества клеток переносят обратно в среду, содержащую гербицид, и культивируют в течение 10 дней (суспензионнье культурь) или 4 недель (культурьі каллюса). Относительньій рост определяют «(о согласно описанному в примере 14.

Пример 17: Индукция и культивирование змбриогенного каллюса из ткани щитка кукурузь! о

Початки растений самоопьіляющейся кукурузьь инбредной линии Рипк 2717 собирают через 12-14 дней ю после опьіления. Удаляют листовую обертку, и початки стерилизуют в течение 15 минут при встряхиваний в 2096-ном растворе коммерчески доступного отбеливателя Спіогох с добавлением нескольких капель детергента (77 для лучшего смачивания. Затем початки промьівают несколько раз стерильной водой. Все дальнейшиеє стадий че осуществляют в асептических условиях в стерильном вьітяжном шкафу с потоком воздуха. Змбрионьії длиной 1,5-2,5мм удаляют из зерен с помощью шпателя и помещают, направляя ось змбриона вниз, в среду для культивирования М5, содержащую 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) в концентрации 2мг/л и Здо-ную « сахарозу, отверджденную с помощью 0,2496-ного Сеїпйе?.,

Змбриогенньїйй каллюс образуется на ткани щитка змбрионов в течение 2-4 недель роста культурь при 287С 00 ШО с в темноте. Каллюс удаляют из зксплантата и переносят в свежую отвердевшую среду М5, содержащую 2,4-Д в ц концентрации 2мг/л. Пересев змбриогенного каллюса повторяют с недельньми интервалами. Пересевают "» только части каллюса, имеющие змбрионогенную морфологию.

Пример 18: Селекция культур клеток кукурузьі, толерантньїх к гербицидньїм ингибиторам протокса а) Селекция с применением змбрионогенного каллюса -І Змбрионогенньій каллюс, полученньй по методике из примера 17, переносят в среду для поддержания -з каллюса, состоящую из средьі Мб, содержащей 2,А-Д в концентрации 2мг/л, Здо-ную сахарозу и ингибитор протокса в концентрации, достаточной для замедления роста, но которая не оказьівает вредного воздействия 1 на змбрионогенность культурьі, и отверждают с помощью Сеїпіе?,. Для увеличения частоть! мутаций, сю 50 толерантньїх по отношению к гербициду, культурьі предварительно обрабатьвают до селекции химическим мутагеном, например, зтилметансульфонатом, или физическим мутагеном, например, УФ-излучением, в 4; концентрации, немного ниже той, для которой проявляется ингибирование роста, как описано в примере 14.

Культурьї инкубируют в темноте при 28"С. Через 14 дней роста каллюс переносят в свежую среду такого же состава. Пересевают только культурьї, имеющие необходимую змбрионогенную морфологию, известную как морфология типа ІІ хрупкого змбрионогенного каллюса. Культурьї размножают путем пересева с недельньіми о интервалами, пересевая от двух до десяти раз в свежую среду, причем пересевают только найболее бьістро растущие культурьі. Затем бьістро растущий каллюс переносят в среду для поддержания каллюса. содержащую іме) ингибирующий протоке гербицид в требуемой концентрации, как описано в примере 11. Если каллюс растет хорошо при зтой концентрации, обьічно после приблизительно пятидесяти еженедельньїх пересевов каллюс бо переносят в среду для поддержания каллюса, содержащую в три раза более вьісокую концентрацию ингибитора, и продолжают пересевание до получения хорошо растущей культурьі. Зто процесс повторяют, применяя среду, содержащую ингибитор протокса в концентрации, в 10 раз превьиішающей начальную пригодную концентрацию, а затем средьі, содержащие в 20 и в 40 раз более вьісокие концентрации.

Когда получено достаточное количество каллюса, его переносят в среду для регенерации, пригодную для б5 созревания змбриона и регенерации растения. Змбрионогенньй каллюс, растущий при каждой из исследованньїх концентраций гербицида, переносят в среду для регенерации.

б) Селекция с применением змбрионогенньїх суспензионньхх культур

Змбрионогеннье суспензионнье культурь инбредной линии 2717 кукурузьь ЕБипК создают аналогично методике из примера 24 и поддерживают путем пересева с недельньмми интервалами в свежую жидкую среду

Мб, содержащую 2,4-Д в концентрации 2мг/л. Для увеличения частоть! мутаций, толерантньїх к гербициду, культурьі в зто время могут бьїть обработаньі химическим мутагеном, например, зтилметансульфонатом в концентрации, немного ниже той, при которой проявляется ингибирование роста, как зто указано в примере 14.

Для селекции культурьі переносят в жидкую среду Мб, содержащую 2,4-Д в концентрации 2мг/л и ингибитор протокса в концентрации, достаточной для замедления роста, но которая не оказьівает вредного воздействия уо чна змбрионогенность культурьі. Культурьі вьіращивают на шейкере при 120об/мин при 287"С в темноте. С недельньми интервалами среду удаляют и добавляют свежую. Культурьі разбавляют средой для культивирования в соответствии с их ростом так, чтобьї поддерживать концентрацию, равную приблизительно 10мл обьема упакованньїх клеток в 5ХОмл средьі. При каждом пересеиванийи культурьі обследуют и сохраняют для дальнейшего культивирования только бьістро растущие культурь! с необходимой рьїхлой змбрионогенной 7/5 Морфологией. После двух-десяти пересевов в среду, содержащую Мб, культурьі увеличиваются в обьеме, по крайней мере, в два-три раза после каждого еженедельного пересева.

Затем культурьі переносят в среду Мб, содержащую 2,4-Д в концентрации 2мг/л и дозу ингибитора, в три раза более вьісокую, чем та, которая применялась первоначально. Растущие культурь! повторно пересевают в зту среду еще два-десять раз, как описано вьіше. Для дальнейшего пересева отбирают бьістро растущие

Культурь! с необходимой рьїхлой змбрионогенной морфологией. Затем бьстро растущие культурь! переносят в среду Мб, содержащую 2,4-Д в концентрации 2мг/л и дозу ингибитора, в десять раз более вьісокую, чем та, которая применялась превоначально, и процесс пересева растущих культур с требуемой рьхлой змбрионогенной морфологией повторяют от двух до десяти раз до тех пор, пока не будут получень! бьістро растущие культурьі. Затем зти культурьі переносят в среду Мб, содержащую 2,4-Д в концентрации 2мг/л и дозу сч МНнгибитора, в тридцать раз более вьісокую, чем та, которая применялась первоначально.

Для регенерации растений из каждой из змбрионогенньх суспензионньїх культур, селектированньх і) определенньім уровнем концентрации гербицида, культурьі сначала переносят в среду Мб, отвержденную с помощью Сеїпе? и содержащую 2,4-Д в концентрации 2 мг/л и необязательно ингибитор в концентрации, при которой вьіращивали культурьі, для получения змбрионогенного каллюса. Змбрионогенньй каллюс пересевают (о зо в свежую среду для поддержания каллюса до тех пор, пока не будет получено необходимое для регенерации количество каллюса. Пересевают только культурь! с требуемой рьїхлой змбрионогенной морфологией. о

Пример 19: Регенерация растений кукурузьі из селектированньїх каллюсньїх или суспензионньх культур ю

Растения регенерируют из селектированньїх культур змбрионогенного каллюса, полученньїх аналогично примеру 13, путем переноса в свежую среду для регенерации. Применяемьми средами для регенерации - являются: среда МбО, состоящая из средьі Мб, в которой отсутствуеєт 2,4-Д, либо М61. состоящая из средь Мб, - содержащей 2,4-Д в концентрации 0,25мг/л и кинетин (б6-Фурфуриламинопурин) в концентрации 1Омг/л, либо

М62, состоящая из средьі Мб, содержащей 2,4-Д в концентрации 0,1мг/л и кинетин в концентрации мг/л, все отверждаємье с помощью 0,2495-ного СеїгіеЗ. Культурьї виращивают при 282С на свету (освещение бельіми « флуоресцентньми лампами, дающими 10-100 мкзйнштейнов/м с в течение 16 часов в день). Культурь пересевают в свежую среду каждье две недели. Проростки образуются на 3-8 неделях. Проростки вьісотой, по /- с крайней мере, 2см отделяют из прилипшего каллюса и переносят в среду, стимулирующую рост корней. а Используют различнье стимулирующие рост корней средьі. Среда состоит из средьі Мб или М5, в которой ,» отсутствуют витаминьі и в которой содержится либо обьічная концентрация солей, либо концентрация солей уменьшена наполовину, концентрация сахарозьі уменьшена до г/л и, кроме того, могут либо отсутствовать рострегулирующие соединения либо содержаться о-нафталинуксусная кислота в концентрации 0,1мг/л. Когда -і корни разовьются в достаточной мере, проростки переносят в смесь для горшечньїх культур, состоящую из - вермикулита, мохового торфа и садовой почвьі. При трансплантации весь оставшийся каллюс удаляют, весь агар смьшвают, и листья обрезают наполовину. Проростки вьращивают в теплице сначала закрьітьми на 1 несколько дней перевернутьми пластмассовьми чашками для сохранения влажности и вьіращивания в сю 50 условиях затенения. После акклиматизации растения пересаживают в цветочнье горшки и вьіращивают до созревания. Применяют удобрение Реїегз 20-20-20 (фирма ОСгасе Зіега) для развития здоровьїх растений. 4; После зацветания растения опьіляют, предпочтительно путем самоопьіления.

Пример 20: Конструирование векторов трансформации растения

Для трансформации растения пригоднь! многие векторь! трансформации, а геньі по изобретению могут бьіть использованьі в сочетаний с любьм из таких векторов. Вьібор вектора для применения будет зависеть от о предпочтительного способа трансформации и вида-мишени для трансформации. Для определенньх видов-мишеней могут бьть предпочтительньї различнье антибиотические или селективнье в отношений іме) гербицида маркерьії. Маркерь! селекции, обьічно применяемье при трансформации, включают ген пріїйЇ, которьй придаєт устойчивость к канамицину и родственньм антибиотикам (Меззіпд й: Міегта, Сепе, 19: 259-268 6о (1982); Вемап и др., Маїшге 304: 184-187 (1983)), ген Баг, которьій придаєт устойчивость к гербициду фосфинтрицину (М/Упіе и др., Мисі. Асідз Кев., 18: 1062 (1990), Брепсег и др., Тпеог. Аррі. Сепеї, 79: 625-631 (1990)), ген прі, которьій придаєт устойчивость к антибиотику гигромицину (Віоспіпдег 5 Оіддеітапп, Мої. СеїЇ

Віоі., 4: 2929-2931) и ген ант, которьій придаєт устойчивость к метотрексату (Воийгоціз и др., ЕМВО )3., 2(7): 1099-1104 (1983)). 65 (1) Конструирование векторов, пригодньїх для трансформации Адгорасіегіит

Для трансформации с применением Адгобасіегішт (шптегасіепз пригоднь!і многие векторьі. Они обьічно несут,

по крайней мере, одну пограничную последовательность Т-ДНК и включают такие векторьї, как рВІМ19 (Вемап,

Мисі. Асіаз Кез., (1984)). Ниже описано конструирование двух типичньїх векторов.

Конструирование векторов рСІВ200 и рСІВ2001

Бинарнье векторьї рСІВ20О0 и рСІВ2001 используют для конструирования рекомбинантньїх векторов с применением Аадгобасіегішт и их конструировали следующим образом. рту575Кап создавали путем разложения ртуз75 (Зсптідпнацйзег 4. Неїїпекі, у. ВасіегіоЇ.,, 164: 446-455 (1985)) с помощью Маїгі, позволяющей вьірезать ген устойчивости к тетрациклину, с последующей инсерцией фрагмента Ассі из руОС4К, несущей МРТІЇ (Мезвіпд 5: Міета, Сепе, 19: 259-268 (1982); Вемап и др., Маїшге, 304: 184-187 (1983); МеВгідде и др., Ріапі 7/0 Моїесшаг Віоіоду, 14: 266-276, (1990)). Линкерьі Хпо! лидировали с ЕсокМ-фрагментом плазмидь! реіВ7, содержащим левую и правую границьі Т-ДНК, селектируемьй в растений химерньй ген поз/прій и полилинкер рис (Коїйзівїп и др., Сепе, 53: 153-161 (1987)) и клонировали фрагмент, разложенньй с помощью ХпПоЇї, в ртуз75, разложенном с помощью заїЇ, для создания рСІВ200 (см. также европейскую заявку ЕР 0332104. пример 19 (13381). рСІВ200 содержит следующие уникальнье полилинкернье сайть! рестрикции: Есокі, 581, 7/5 Крпі, Воїї, Храї и заїЇ. рСІВ2001 представляет собой производное от рСІВ200, которое создано путем встраивания в полилинкер дополнительньїх сайтов рестрикции. Уникальньми сайтами рестрикции в полилинкере рСІВ2001 являются ЕсокКіІ, ві, Крпі, Ва, ХбБаї. ЗаїІї, МіІшШ, ВвіІ, АмгіїЇ, Араї, НраЇ и (ШІ. В дополнение к тому, что рСІВ2001 содержит зти уникальньсе сайть! рестрикции, он также имеет избирательность по отношению к канамицину в растениях и бактериях, левую и правую границь Т-ДНК для трансформации, обусловленной Адгобрасіегійт, функцию (ТА, имеющую происхождение из КК2, для мобилизации между Е.сої и другими хозяевами, и функции Огії и Огім, также имеющие происхождение из КК2. Полилинкер рСІВ2001 пригоден для клонирования полигенньх зкспрессирующих кластеров, содержащих их собственнье регуляторнье сигналь..

Конструирование рСІВ10 и ее производньїх на основе селекции гигромицином сч

Бинарньй вектор рСІВ10 содержит ген, кодирующий устойчивость к канамицину для селекции в растениях, правую и левую пограничнье последовательности Т-ДНК и включает последовательности из плазмидьі рКК252 і) с широким спектром хозяев, что позволяет осуществлять репликацию как в Е.соїї, так и в Адгорасіегішт. Его конструкция описана у Коїйвівїпй и др., Сепе, 53: 153-161, (1987)), Бьіли сконструированьі различнье производнье рСІВ1О, которье включают ген устойчивости к гигромицин-В-фосфотрансферазе, описаннье у Ге зо Зп и др., Сепе, 25: 179-188, (1983)). Зти производнье дают возможность осуществлять селекцию клеток трансгенньїх растений либо только по устойчивости к гигромицину, либо по устойчивости к гигромицину и і, канамицину (рСІВ715, рСІВ717) (Коїйзіевїп и др., Сепе, 53: 153-161, (1987)). ю (2) Конструирование векторов, пригодньїх для трансформации без использования Аадгобрасіегійт.

Трансформация без использования Адгорасіегіцт дает возможность обойти требование наличия -- з5 последовательностей Т-ДНК в вьібранном векторе трансформации, и, следовательно, векторь, в которьїх р. отсутствуют зти последовательности, могут бьіть использовань! в дополнение к векторам, таким, как описаннье вьше и которье содержат последовательности Т-ДНК. Способьї трансформации, которье не основаньі на использовании Адгобасіегічт, включают трансформацию с помощью бомбардировки частицами, поглощение протопласта (например, с помощью ПЗГ и злектропорации) и микроиньекцию. Вьібор вектора в значительной « степени зависит от предпочтительного вьібора трансформируемьх видов. Ниже описаньй конструкции (7-3 с некоторьїх типичньїх векторов. . Конструирование рСІВ3064 и?» рсСів3064 представляет собой вектор, имеющий происхождение из рус и пригодньій для методов прямого переноса гена в сочетаний с селекцией гербицидом базіа (или фосфинотрицином). Плазмида рСІВ246 включает промотор 355 Саму, действенньїм образом слитьїй с геном 5ИЗ5 Е соїї, и терминатор транскрипции 355 Самм, и -І она описана в заявке УМУО 93/07278. Промотор 355 зтого вектора содержит два кодона АТО 5 последовательности в сайте инициации. Зти сайтьі подвергали мутации с использованием стандартньх - ПЦР-методик таким образом, чтобьі удалить кодоньії АТО и образовать сайть! рестрикции 5ері и Рмиц. Новье с сайть! рестрикции находились на расстояний 96 и 37 пар оснований от уникального сайта заї! и на расстояний 5р 101 и 42 пар оснований от действительного сайта инициации. Полученное производное рСІВ246 обозначили как о рСІВЗ3025. Затем ген 55 вьірезали из рСІВ3025 путем разложения с помощью гаї и Зай, концьі "затупляли" и

Ф повторно лигировали для образования плазмидьі рСІВ3060. Плазмида р.Л/182 бьіла получена из дойп Іппез

Сепіег, Могпмісп, и из нее вьірезали фрагмент та! длиной 400 пар оснований, содержащий ген Баг из

Зігеріотусез мігідоспготодепез, и встрайвали в сайт Нра! плазмидь! рСІВЗОбО (Тпотрзоп и др., ЕМВО .., 6: дво 2919-2523, (1987)). Зто позволяло получить плазмиду рСІВ3ЗО64, содержащую ген баг, находящийся под контролем промотора 355 СатМм и терминатора для селекции гербицидом, ген їго устойчивости к ампициллину

Ф) (для селекции в Е.соїї) и полилинкер с уникальньми сайтами Зрпї, Рзїї, НіпаїїїЇ и ВатнНі. Зтот вектор пригоден ка для клонирования полигенньх зкспрессирующих кластеров растения, содержащих их собственнье регуляторнье сигналь.. во Конструирование РЗОС19 и 050535 рзОО35 представляет собой вектор трансформации, которьій использует дигидрофолат-редуктазу (ОНЕК)

Е.соїї в качестве селектируемого маркера, придающего устойчивость к метотрексату. Применяли ПЦР для амплификации промотора 355 (7800 пар оснований), интрона 6 из гена кукурузьі АЯап (-550 пар оснований) (І оси и др., Ріапі .)., 3: 393-403, 1993; ЮОеппіз и др., Мисі. Асідз Кев., 12: 3983-4000, 1984) и 18 пар оснований 65 нетранслируемой лидерной последовательности 505 из плазмидьї р5ОС10. Фрагмент длиной 250 пар оснований, кодирующий ген дигидрофолат-редуктазь типа ІІ из Е.соїї, также амплифицировали с помощью ПЦР и зти два ПЦР-фрагмента соединяли с фрагментом Засі-Раї! из рВІ221 (фирма Сіопіесі)), содержащим основной вектор рисС19 и терминатор нопалин-синтазьі. Сборка зтих фрагментов давала плазмиду рОС19, содержащую промотор 355, слитьій с последовательностью интрона б, лидером 5И5, геном ОНЕК и терминатором нопалин-синтазь. Замена лидера 55 в рОс19 на лидерную последовательность из вируса хлоротической пятнистости кукурузьї (МСММУ) давала вектор реОс35. реОс19 и рБОС35 несут ген руОС резистентности к ампициллину и имеют сайть! Ніпаїй, ЗриІ, Ре и ЕсокКІ!І, пригоднье для клонирования чужеродньх последовательностей. рзос10 70 Данньїй вектор зкспрессии В-глюкуронидазь! (305) получали из плазмидь! рВІ121, поставляемой фирмой

Сіопейбесі! І арогайгієв, Раїо А, Саїїйогпіа. Интрон 6 гена ант кукурузьь амплифицировали с помощью ПЦР из плазмидьі рВ428, описанной у Веітеїгеп и др., Ргос. Май). Асад. сі. ОБА, 81: 4125-4128, (1987), с применением олигонуклеотидньїх праймеров ЗОМО00ОЗ и БОМООО4: 5ОМО003: 5-СТСОСАТССАССАСАТТСОААСААОСТАСАО-3, 5ОМО004: 5-АСООСАТССААСТТССТАССТОАДААААТОСО-3/.

Продукт ПЦР-реакции разлагали с помощью рестрикционной зндонуклеазьї ВатНі, расщепляющей сайт

Ватні, добавленньій на 5'-конце каждого ПЦР-праймера. Полученньй фрагмент ДНК очищали на агарозном геле и лигировали в сайте Ватні плазмидь! рВіІ121, которьій находится между промотором Самуз55 и геном вИ5. Лигированную ДНК трансформировали в Е.соїї и путем рестрикционного разложения идентифицировали

Клонь с интроном 6 АНІ в той же ориентации, что и ген БИ. рзос19

Данньій вектор зкспрессии дигидрофолат-редуктазьї (ОНЕК) получали путем слияния промотора 355 и интрона 6 гена Адап1 плазмидьі реОс10 с геном ОНЕК из плазмидьі рНСО, описанной у Вошгоціз и дату, ЕМВО у., 2: 1099-1104, (1983). Промотор 355 и интрон 6 гена Дай получали путем ПЦР-амплификации фрагмента из сч ов плазмидьї рзоОс10 с использованием праймеров ЗОМО0О31 и 5БОМО010: 5ОМО031: 5-САТОАООСАСТОАССАСССООООАТОС-3, і) 5ОМО010: 5-АССОСАТААСААТТТСАСАСАСОА-3'.

Полученнье фрагментьі разлагали с помощью рестрикционньїх зндонуклеаз Рей и ВернНі и очищали на агарозном геле. «о зо Кодирующие области ОНЕК получали с помощью ПЦР-амплификации рНСО с использованием праймеров 5ОМОО16 и БОМОО017; і, 5ОМО016: 5-ССТАССАТООССАСАТАСААСАСС-3, ю 5ОМО017: 5-СВАСАОСТСОСАСТТСААССТТО-3.

Полученньій фрагмент разлагали с помощью рестрикционньх зндонуклеаз МеоЇ и Зай и очищали на (77 з5 агарозном геле. ча

Два описанньїх вьіше фрагмента лигировали в фрагменте вектора, полученного из плазмидь! рВІ121 путем разложения с помощью рестрикционньїх зндонуклеаз Рвї! и Засі и очистки на агарозном геле фрагмента длиной

З т.п.н., содержащего область терминатора Моз и область рОС19 плазмидь рВі121. Зто тройное лигирование позволило слить промотор 355, интрон 6 Аант, ген ОСЕК и терминатор Моз в правильном порядке и ориентации « для функциональной зкспрессии в растениях. в с РЗОС20 . Данньій вектор зкспресии БИ получали из рБОС10 путем инсерции лидера вируса хлоротической и?» пятнистости кукурузьї (МСМУ), описанного у І отітеї и др., Мігоїосду, 181: 382-385 (1991), в нетранслируемую лидерную последовательность гена 355-505 с помощью тройного лигирования.

Синтезировали и отжигали обе цепочки лидерной последовательности капсидного протеина МСММ длиной -І 17 пар оснований плюс соответствующие сайть! зндонуклеазной рестрикции. Полученньій двухцепочечньй фрагмент разлагали с помощью Ватні и Мсої! и очищали на акриламидном геле. - Кодирующую область гена 35 амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров ЗОМО039 с и БОМО041 и плазмидь рВІі121 в качестве матриць!: 5ОМО039:5-СВАСАТОСТАСОТССТОТАСАААСССАСА-У, о 5ОМО041: 5-АТСОСААСАССОССААСАСОАТТО-3.

Ф Зти праймерь добавляли сайт Мсо! к 5'-концу ЗИ и сайт Засі к 3-концу 305. Полученньій фрагмент разлагали с помощью рестрикционньїх зндонуклеаз Мсої! и Засі и очищали на агарозном геле.

Ген 505 удаляли из плазмидь! реОс10 путем разложения рестрикционной зндонуклеазой Засі и частичного разпожения рестрикционной зндонуклеазой Ватні. Полученньй вектор, которьй имел сайт Ватні и сайт Засі, в которьій повторно встрайвают кодирующую область за промотором З355-интроном б Ааптп, очищали на (Ф, агарозном геле. ка Описаннье вьіше три фрагмента лигаровали путем тройного лигирования для получения гибридного гена, имеющего структуру: промотор 355-интрон 6 Аап1-лидерная последовательность МСММ-5И5-терминатор Моз, бо все на основе вектора рист9. рзос35 рОогК-селектируемьй вектор-маркер идентичен руисСт19, за исключением того, что МСММ-лидера встрайвают в нетранслируемьй лидер гена ОСЕК для усиления трансляции. Зту операцию осуществляли в две стадии.

Сначала кодирующую область гена бИЗ в рОс32, векторе, идентичном реОсз0, за исключением того, что он 65 чаще содержит модифицированньй промотор Аа, чем 355, замещали кодирующей областью ОСЕК из риС19 путем зксцизий БИ5 с помощью Мсої и Засі и лигирования в ОСЕК в виде МсоІ-Засі-фрагмента. Зто привело к получению вектора рБО(33, которьій имеет генную структуру: промотор Аап-интрон 6 Аап1-лидерная последовательность МСММ-кодирующая область ОСЕК-терминатор Моз с сайтом ВОНІ между промотором и интроном и с сайтом Засі между кодирующей областью и терминатором. Фрагмент МесоІ-Засі вьіделяли с помощью разложения рестрикционной зндонуклеазой и очистки на агарозном геле и лигаровали в сайть! Ватні и ЗасіІ вектора ршОС30, замещая гибридную структуру интрон б Аапт-лидерная последовательность

МОММ-кодирующая область 55 вектора рОС30 на структуру интрон 6 Аап1т-лидерная последовательность

МОММ-кодирующая область ОСЕК вектора реОос33.

Пример 21: Конструирование полигенньїх зкспрессирующих кластеров растений 70 Генньіе последовательности, предназначеннье для зкспрессии в трансгенньїх растениях, сначала обьединяют в полигеннье зкспрессирующие кластерь! за пригодньім промотором и в обратном направлений по отношению к пригодному терминатору транскрипции. Зти полигенньюе зкспрессирующие кластенрь! затем легко могут бьіть перенесень в векторьї трансформации растений, описанньсе вьіше в примере 19.

Вьібор промотора

Вьбор о промотора, используемого в полигенньхх зкспрессирующих кластерах, будет определять пространственную и временную схему зкспрессии трансгена в трансгенном растений. Вьібраннье промоторь будет зкспрессировать трансгеньі в определенньїх типах клеток (таких, как зпидермальнье клетки листа, мезофильньсе клетки, клетки корьі корня) или в определенньх тканях или органах (например, в корнях, листьях или цветках), и зтот внібор должен отражать требуемую локализацию зкспрессии трансгена. В другом варианте 2о Вьібранньій промотор может стимулировать зкспрессию гена под воздействием индуцируемого светом или регулируемого другими временньіми параметрами промотора. Еще одним альтернативньм вариантом является таковой, когда вьібранньій промотор представляет собой промотор, регулируемьй химическими агентами. Зто будет обеспечивать возможность индуцировать зкспрессию трансгена только тогда, когда требуется, и вьізьівать ее путем обработки химическим индуцирующим агентом. с

Терминаторь!ї транскрипции

Широкое разнообразие терминаторов транскрипции доступно для применения в полигенньх і) зкспрессирующих кластерах. Они ответственньь за прекращение транскрипции позади трансгена и его правильное полиаденилирование. Соответствующие терминаторь! транскрипции и те, которьге, как известно, обладают способностью функционировать в растениях, включают терминатор 355 Саму, терминатор (т!', Ге зо Терминатор нопалин-синтаза, терминатор Е9 гроз гороха. Они могут применяться как в однодольньх, таки в двудольньх растениях. і,

Последовательности для усиления или регулирования зкспрессий ю

Бьіли обнаружень! многочисленнье последовательности, усиливающие зкспрессию гена внутри единицьї транскрипции, и зти последовательности могут применяться в сочетании с генами по изобретению для -- з5 усиления их зкспрессии в трансгенньїх растениях. ча

Бьіло установлено, что различнье интроннье последовательности усиливают зкспрессию, в частности в клетках однодольньїх растений. Например, обнаружено, что интроньй гена Аапі кукурузьі значительно усиливают зкспрессию гена дикого типа под воздействием родственного промотора при введений в клетки кукурузьі. Бьіло установлено, что интрон 1 является особенно зффективньм и усиливаєт зкспрессию в « гибридньїх конструкциях с геном хлорамфеникол-ацетилтрансферазь! (Саїїїв и др., Сепез ЮОемеор. 1: 1183-1200 тв) с (1987)). В зтой же зкспериментальной системе интрон гена Бгоп2е! кукурузьї обладал подобньім действием в отношений усиления зкспрессии (Саїййв и др., см. вьіше). В соответствии с принятой практикой интроннье ;» последовательности включали в векторьї трансформации растения обьічно внутри нетранслируемой лидерной последовательности.

Также известньї многочисленнье нетранслируемье лидернье последовательности, усиливающие -І зкспрессию и имеющие происхождение из вирусов, и они являются особенно зффективньми в клетках двудольньїх растений. В частности, бьіло подтверждено, что лидернье последовательности из вируса мозаики - табака (ТММ, "М/У-последовательность"), из вируса хлоротической пятнистости кукурузьї (МСММ) и из вируса с мозаийки люцерньї (АММ) зффективнь! для усиления зкспрессии (см. например, у СаїШе и др. Мисі. Асіаз Кев. 15: 8693-8711 (1987); ЗКигезкКі и др., Ріапі Моїес. Віо!. 15: 65-79 (1990)). о Ориентация генного продукта внутри клетки

Ф Известньії различнье существующие в растениях механизмь для ориентации генньїх продуктов, а последовательности, контролирующие функционирование зтих механизмов, охарактеризовань! достаточно подробно. Например, ориентация генньїх продуктов к хлоропласту контролируется с помощью сигнальной в последовательности, которая обнаружена на содержащем аминогруппу конце различньїх протеинов и которую отщепляют во время импорта в хлоропласт, получая зрельй протейн (см., например, у Сотаї и др., 9У.ВіоЇ. Спет.

Ф) 263: 15104-15109 (1988)). Зти сигнальнье последовательности могут бьіть слить! с гетерологичньіми генньіми ка продуктами для осуществления импорта гетерологичньїх продуктов в хлоропласт (мап деп ВгоескК и др., Майшиге 313: 358-363 1985)). ДНК, кодирующая соответствующие сигнальнье последовательности, может бьїть бо Вьіделена из 5-конца КДНК, кодирующих протеин КОВІЗСО, протеин САВ, фермент ЕРЗР-синтазу, протеин 552 и цельїй ряд других протеинов, для которьїх известно, что они локализовань в хлоропласте.

Другие генньіе продукть! локализованьі в других органеллах, таких, как митохондрия и пероксисома (см., например, у Опдег и др., Ріапі Моїес. Віої. 13: 411-418 (1989)). КДНК, кодирующие зти продуктьі, также могут бьїть подвергнутьїь манипуляциям для осуществления ориентации гетерологичньїх генньїх продуктов в зти 65 органелльі. Примерами таких последовательностей являются кодируемьсе в ядре АТФазь! и специфичньсе для митохондрий изоформь! аспартатамино-трансферазь. Ориентация к клеточньмм протеийновьм тельцам бьла описана у Кодегз и др., в Ргос. Маї). Асай Зсі. ОБА 82: 6512-6516 (1985)).

Кроме того, бьіли охарактеризованьі, последовательности, приводящие к ориентации генньіїх продуктов к другим клеточньмм компартментам. Последовательности с концевой аминогруппой ответственньі за ориентацию

Кк зндоплазматическому ретикулюму (ЗР), апопласту, и за зкстраклеточную секрецию из алейронньїх клеток (Коепіег 45 Но, Ріапі СеїІ 2: 769-783 (1990)). Кроме того, последовательности с концевой аминогруппой в сочетаний с последовательностями с концевой карбоксильной группой ответственньі за ориентацию генньх продуктов к вакуолям (ЗпПіпепі и др., Ріапі Моїес. Віої. 14: 357-368 (1990)).

Путем слияния описанньїх вьше соответствующих ориентирующих последовательностей с /о представляющими интерес трансгенньіми последовательностями возможно направлять трансгенньй продукт к любой органелле или к любому компартменту клетки. Для ориентации, например, в хлоропласт сигнальную последовательность хлоропласта из гена КОВІ5СО. гена САВ, гена ЕРБР-синтазьї или гена 552 сливают в рамке с аминоконцевьм колоном АТО трансгена. Вьібранная сигнальная последовательность должна включать известньій сайт расщепления, а при конструирований гибридов следует учитьівать любье аминокислоть! после /5 сайта расщепления, которне необходимь! для расщепления. В некоторьх случаях зто требование может бьть удовлетворено путем добавления небольшого количества аминокислот между сайтом расщепления и АТО трансгена или в альтернативном варианте путем замещения нескольких аминокислот внутри трансгенной последовательности. Гибридьі, сконструированнье для импорта в хлоропласт, могут бьть оцененьі на зффективность поглощения хлоропластом путем трансляции іп міго транскрибируемьїх іп міго конструкций с го последующем поглощением іп мйго хлоропластом с использованием методов, описанньх у Вагпенк и др. (Едеітапп и др. (ред.) Меїйодз іп Спіогоріазі Моіесшціаг Віоіоду, ЕІвеміег. стр.1081-1091 (1982)); МУазтапп и др. (Мої. Сеп. Сепеї. 205: 446-453 (1986)). Зти методьі! конструирования хорошо известньі в данной области техники и одинаково пригодньії и для митохондрий, и для пероксисом. Вьібор ориентации, которая может требоваться для зкспрессии трансгенов, будет зависеть от клеточной локализации предшественника, с ов необходимого в качестве исходной точки для данного процесса. Зта локализация обьічно бьівает цитозольной или хлоропластной, хотя в некоторьїх случаях может бьіть митохондриальной или пероксомальной. Обьічно не і) требуется, чтобьії продукть! зкспрессии трансгена бьіли ориентировань к ЗР, апопласту или вакуоли.

Вьішеописаннье механизмь! для клеточной ориентации могут бьіть использовань не только в сочетаний с их родственньмми промоторами, но таюке в сочетаний с гетерологичньми промоторами так, чтобьі обеспечивать (о зо специфическую клеточную ориентацию к месту назначения под регуляцией транскрипции промотором, которьй имеет схему зкспресии, отличную от таковой у промотора, которьій стимулирует ориентацию сигнала. і,

Пример 22: Трансформация двудольньх растений ю

Методьї трансформации для двудольньїх растений хорошо известнь! в данной области техники и включают как таковье, основаннье на применений Адгобасіегішт, так и методь, для которьїх не требуется использовать --

Адгорасіегішт. Методь, для которьїх не требуются Адгорасіегіцт, включают поглощение зкзогенного ї- генетического материала непосредственно протопластами или клетками. Зто может осуществляться с помощью

ПЗГ или медиируемого злектропорацией поглощения, доставки, медиируемой бомардировкой частицами, или путем микроиньекции. Примерь! зтих методов описаньї у Раз2КомузКі и др., ЕМВО 3. 3:2717-2722 (1984), Роїгукив и др., Мої. Сеп. Сепеї. 199: 169-177 (1985), Кеїсп и др., Віоїесппоіїоду 4: 1001-1004 (1986) и у Ківїп и др., « Маїшге 327: 70-73 (1987). В каждом случає трансформированньюе клетки регенерируют до цельх растений, пу с используя стандартнье методь, известнье в данной области техники. . Трансформация, медиируемая Адгобасіегішт, является предпочтительньмм методом для трансформации а двудольньїх вследствие вьісокой зффективности зтой трансформации и ее широкой применимости для различньїх многочисленньїх видов. Многие культурньюе видь!, которье обьічно могут трансформироваться с помощью Адгобасіегіт, включают табак, томатьі, подсолнечник, хлопчатник, масличньй рапс, картофель, сою, -І люцерну и тополь (ЕР 0317511 (хлопчатник), ЕР 0249432 (томать,, на имя фирмь! СаЇІдепе), УМО 87/07299 (Вгаззіса, на имя фирмь СаїЇдепе), патент США 4795855 (тополь)). Трансформация с использованием - Адгорасіегічт обьічно включает перенос бинарного вектора, несущего чужеродную, представляющую интерес с ДНК (например, рСІВ200 или рсСІВ2001), в соответствующий штамм Аадгобасіегішт, которьій может зависеть от 5р Комплемента генов міг, которне несет штамм-хозяин Адгобрасіегіт, либо на ко-резидентной Ті-плазмиде, либо о хромосомально (например, в штамм СІВ542 для рСІВ200 и рСІВ2001) (ОКпез и др., Ріапі Сеї! 5: 159-169 (1993)).

Ф Перенос рекомбинантного бинарного вектора в Адгорасіегішт осуществляют методом трехпарентального (трехродительского) скрещивания с использованием Е.соїї, несущей рекомбинантньй бинарньй вектор, штамм-хелпер Е.соїї, которьій несет такую плазмиду, как рЕК2013, и которьій способен передавать ов рекомбинантньй бинарньй вектор в штамм-мишень Адгорасіегішт. В другом варианте рекомбинантньй бинарньій вектор может бьть перенесен в Адгорасіегіт путем трансформации ДНК (Нбідеп 5 УМіІІптіїгег, (Ф, Мисі. Асіа. Кев. 16: 9877 (1988)). ка Трансформация видов растений-мишений рекомбинантной Аадгорасіегіцт обьчно включаєт совместное культивирование Адгобасіегішт с зксплантатами из растения и осуществляется в соответствии с протоколами, бо Хорошо известньми в данной области техники. Трансформированную ткань регенирируют на селектируемой среде, несущей маркер устойчивости к антибиотику или гербициду, находящийся между границами бинарной плазмидь! Т-ДНК.

Пример 23: Трансформация однодольньїх растений

Трансформация большинства видов однодольньїх растений в настоящее время также стала традиционной. 65 Предпочтительнье методь! включают непосредственньй перенос гена в протопласть! с использованием ПЗГ или злектропорацию и бомбардировку частицами ткани каллюса. Трансформации могут бьіть осуществлень с одиночньіми видами ДНК или со множественньіми видами ДНК (т.е. путем котрансформации), и оба зти метода пригодньії для использования по настоящему изобретению. Котрансформация может иметь то преимущество, что она позволяет избежать необходимости применения сложной векторной конструкции и дает возможность Генерировать трансгеннье растения с несцепленньми локусами для представляющего интерес гена и селектируемого маркера, давая возможность удалить селектируемьй маркер в последующих поколениях, если зто считается необходимьм. Однако недостатком при применениий котрансформации является частота, составляющая менее 10095, с которой отдельнье видьі ДНК интегрируются в геном (Зспоспег и др.

Віосїесппоіоду 4: 1093-1096 (1986)). 70 В описаниях европейских заявок ЕР 0292435 (на имя фирмь! Сіра-сеїду), ЕР 0392225 (на имя фирмь!

Сіра-Сеїду) и УМО 93/072778 (на имя фирмьї Сіра-Сеїду) приведень!ї способьї получения каллюса и протопластов из злитной инбредной линии кукурузьї, трансформации протопластов с использованием ПОГ или злектропорации и регенерации растений кукурузь! из трансформированньїх протопластов. Согдоп-Катт и др. в

Ріапі Се 2: 603-618 (1990) и Бготт и др. в Віоїесппоїоду 8: 833-839 (1990)) опубликовали способь /5 трансформации линии кукурузь, имеющей происхождение из А188, с использованием бомбардировки частицами. Кроме того, в международной заявке УМО 93/07278 (на имя фирмь! Сіра-Сеїду) и у Колієї и др. в

ВіоїесппоІоду 11: 194-200 (1993)) описаньі способьї трансформации злитньїх инбредньїх линий кукурузь! путем бомбардировки частицами. Зтот способ включает использование незрельх змбрионов кукурузьі длиной 1,5-2,5мм, вьірезанньїх из початка через 14-15 дней после опьіления, и устройств для бомбардировки типа го РОЗ-Д1000Не Віоїївіісв.

Трансформация риса также может бьть осуществлена с использованием методов непосредственного переноса гена с применением протопластов или бомбардировки частицами. Медиируемая протопластом трансформация описана для японских и индийских типов риса (7Ппапа и др., Ріапі СеїЇ Кер. 7: 379-384 (1988);

Зпітатоїо и др., Маїшге 338: 274-277 (1989); Обама и др., ВіоїесппоІоду 8: 736-740 (1990)). Оба типа также сч г трансформируют стандартньми методами с использованием бомбардировки частицами (Спів! и др.,

Віосїесппоіоду 9: 957-962 (1991). і)

В европейской заявке ЕР 0332581 (на имя фирмь! Сіра-сеїду) описань! методьі получения, трансформации и регенерации протопластов растений семейства мятликовьїх (Роосідеае). Зти методьй дают возможность трансформировать ежу (Оасціїз зрр.) и пшеницу. Кроме того, трансформация пшениць! описана у МазіїЇ и др., Ге зо Віоїесппоюду 10: 667-674 (1992), с использованием бомбардировки частицами в клетках типа С каллюса с продолжительнь!м временем регенерации, а также у МавіїЇ и др., Віоїесппоіоду 11: 1553-1558 (1993) и у МУ/еекв и о др., в Ріапі РАузіої. 102: 1077-1084 (1993) с использованием бомбардировки частицами незрельїх змбрионов и ю незрелого каллюса змбрионального происхождения. Однако предпочтительньій метод для трансформации пшениць включаєт трансформацию пшениць путем бомбардировки частицами незрельїх змбрионов и включаєт (8-7 з5 либо стадию вьісокого содержания сахарозь! или вьісокого содержания мальтозьі, предшествующую доставке ча гена. До бомбардировки любое количество змбрионов (длиной 0,75-1мм) помещают в М5-среду с добавлением

Зоо-ной сахарозь! (Мигазпіде 5 5Коод, РНузіоіодіа Ріапіагит 15: 473-497 (1962)) и Змг/л 2,4-Д для индукции соматических змбрионов, что дает им возможность развиваться в темноте. В вьібранньійй день бомбардировки змбрионь! удаляют из средьі для индукции и помещают в осмотикум (т.е. в среду для индукции с добавлением « 40 сазарозьі или мальтозьі в требуемой концентрации, обьічно 1590-ной). Змбрионам дают возможность пройти 2-3 с плазмолиз в течение 2-3-ч и затем подвергают бомбардировке. В одной чашке-мишени обьічно используют по змбрионов, хотя зто количество не имеет решающего значения. Соответствующую несущую ген плазмиду ;» (такую, как рРСІВ3064 или р5Ос35) осаждают на золотье частицьі размером порядка микрометра, используя стандартную методику. Каждую чашку с змбрионами обстреливают с помощью устройства Віоїїзіїсв на основе

Гелия фирмь! ОиРопі с использованием давления залпа -100Офунтов/кв. дюйм и стандартного зкрана с -І размером пор ВОмеш. После бомбардировки змбрионьї помещают обратно в темноту для восстановления в течение приблизительно 24ч (все еще в осмотикуме). Через 24ч змбрионьі! удаляют из осмотикума и помещают - назад в среду для индукции, где они остаются в течение приблизительно месяца до регенерации. с Приблизительно через один месяц зксплантать! змбрионов с развитьм змбриогенньмм каллюсом переносят в 5о бреду для регенерации (М5-їмг/л МАА ( о-нафтилуксусная кислота), змг/л ЗА), содержащую, кроме того, о соответствующий селектирующий агент (1Омг/л бастьі в случае рСІВ3064 и 2мг/л метотрексата в случає

Ф рзОО35). Через приблизительно один месяц развившиеся ростки переносят в более крупнье стерильнье контейнерь!, известньюе, как "ЗА", содержащие М5 с половинной крепостью, 290-ную сахарозу и такую же концентрацию селектирующего агента. В заявке на патент 08/147161 приведеньі методь! трансформации пшениць, и зта заявка включена в настоящее описание в качестве ссьІлки.

Пример 24: Селекция генов протокса растений на устойчивость к ингибирующим протоке гербицидам в іФ) системе зкспрессии Е.соїї ко Плазмиду руУУОС-4, кодирующую хлоропластами фермент протоке кукурузьї, трансформируют в подвергнутом неспецифическому мутагенезу штамме ХІІ І-Кей (фирма 5іга(едепе, Іа доПа, Са). Трансформант бо Ввісевают в І-среду, содержащую 50г/мл ампициллина, и инкубируют в течение 48 часов при 37"С. Газонь трансформированньіїх клеток зкспортируют из чашек и получают ДНК плазмидь), используя набор УМігага

Медаргер (фирма Рготеда, Мадізоп, МІ). ДНК плазмидь, вьіделенную из зтого штамма-мутатора, вероятно, содержит приблизительно одно случайньм образом измененное основание на 2000 нуклеотидов (см. Сгеепег и др., Зігагецієз 7(2): 32-34 (1994)). 65 Мутированную плазмидную ДНК переносят в мутант лето 5АБХЗ8 (Зазаптап и др., У.Сбеп. Місгобіої. 113: 297 (1979) и вьісевают в І-среду, содержащую 1О00г/мл ампициллина, и в такую же среду, содержащую различнье концентрации ингибирующего протоке гербицида. Чашки инкубируют в течение 2-3 дней при 377С.

ДНК плазмидь вьделяют из всех колоний, растущих в присутствий концентраций гербицида, которье зффективно вьізьвают гибель штамма дикого типа. Затем вьіделенную ДНК переносят в 5А5ХЗ38 и вновь

Вьсевают в среду с гербицидом для гарантии того, что зта устойчивость обусловлена плазмидой.

Мутированную ДНК плазмидь ру/ОсС-4 вновь вьіделяют из устойчивьїх колоний и вьірезают кодирующую протоке последовательность путем разложения с помощью ЕсоКі и ХпоЇ. Затем вьірезанную кодирующую протоке последовательность повторно клонируют в неподвергаутом мутагенезу векторе рВіцезсгірі и повторно тестируют на устойчивость к ингибирующему протоке гербициду таким же образом, как описано вьіше. 70 Зтот процесс удаляет мутации некодирующей последовательности, которне обусловливают устойчивость, например, положительньїх мутантов (те. мутантов, устойчивость которьїх является следствием мутаций, вьізьїшвающих повьішенную зкспрессию немодифицированного протокса), и оставляет только тех мутантов, устойчивость которьїх является следствием мутаций в кодирующей последовательности протокса. Определяют последовательность ДНК, идентифицированную с помощью зтого процесса, для всех вероятньїх толерантньх к 7/5 Гербициду генов протокса и вьіявляют мутации путем сравнения с последовательностью протокса дикого типа в руУос-4,

С использованием описанной овьше методики бьли идентифицированьй мутации устойчивости, превращающие С в Т на нуклеотиде в положении 498 в последовательности в руУУЮОС-4 (5ЕО ІЮО МО: 5).

Плазмиду, несущую зту мутацию, обозначили как рмМ2сС-1Маї. Зто изменение превращаєт кодон ОСТ аланина в 2о аминокислоте в положений 166 (ЗЕО ІО МО: 6) в кодон СТТ валина и приводит к получению фермента протокса, которьйй по крайней мере в 10 раз более устойчив к ингибирующему протоке гербициду в бактериальном тесте.

Плазмида рМ2С-1Маї в векторе рВішпезсгірі ЗК для целей процедурь! патентования бьіла депонирована 30 сентября 1994г. под обозначением руУУЮОС-8 в коллекции культур Службь! сельскохозяйственньїх исследований, и она получила каталожньій номер МКК. Мо21340. с

Такую же стратегию применяли для скрининга устойчивьїх к гербициду форм гена Ргоїох 1 Агарідорзіз в различньїх векторах. Одна из модифицированньїх мутаций представляет собой замену С на Т в нуклеотиде в і) положении 689 в последовательности руУОсС-2 (ЗЕ І МО: 1); зту плазмиду обозначили как рАгасС-1Маї. Зто идентично таковому в указанном вьішше мутанте рМ2сС-1Маї, что ведет к превращению кодона ОСТ аланина в аминокислоте в положений 220 (ЗЕО ІО МО; 2) в кодон ТТ валина в соответствующем положений в (о зо последовательности протеина протокса Агабідорвів.

Второй ген устойчивости включаєт замену А на З в нуклеотиде в положениий 1307 в последовательности о

РУУОС-2 (ЗЕО ІО МО: 1); зту плазмиду обозначили как рАгаС-2Суз. Зто изменение превращает кодон ТАС ю тирозина в аминокислоте в положении 426 (ЗЕО ІЮ МО: 2) в кодон ТОС цистеина. Соответствующий кодон тирозина в последовательности ргоїох 1 кукурузьь в нуклеотиде в положении 1115-1117 (ЗБОЮ МО: 5; -

Ззб5 аминокислота в положений 372 последовательности ЗЕ ІЮО МО: б) может бьть мутирован аналогичньім ї- образом для получения устойчивой к гербициду формь! зтого фермента.

Третий ген устойчивости имеет замену С на А в нуклеотиде в положений 691 в последовательности РУУЮОС-2 (ЗЕО ІО МО: 1); зту плазмиду обозначили как рАгаС-З3бег. Зто изменение превращает кодон ОТ глицина в аминокислоте в положений 221 (ЗЕО ІЮО МО: 2) в кодон АСТ серина в положенийи кодона, соседнем к мутации в « рАгас-1. Соответствующий кодон глицина в последовательности ргоїох 1 кукурузьі в нуклеотиде в положеним 7-3) с 497-499 (5ЕБЕО ІО МО: 5; аминокислота в положении 167 последовательности ЗЕО ІЮ МО: 6) может бьть мутирован аналогичньїм образом для получения устойчивой к гербициду формь! зтого фермента. ;» Все описаннье вьіше мутации приводят к получению фермента протокса, которьй, по крайней мере, в 10 раз более устойчив к ингибирующему протоке гербициду в бактериальном тесте.

Плазмида рАгасС-2Суз в векторе рЕ! 61 для целей процедурь! патентования бьіла депонирована 14 ноября -І 1994г. под обозначением рУУЮС-7 в коллекции культур Службь! сельскохозяйственньіїх исследований, и она получила каталожньій номер МКК. Мо21339М. - Пример 25: Дополнительнье замещения устойчивого к гербициду кодона в положениях, вьіявленньїх путем с случайного скрининга

Аминокислоть, вьіявленнье в качестве сайтов устойчивости к гербициду путем случайного скрининга, о замещают другими аминокислотами и тестируют на функциональность и на толерантность к гербициду в

Ф бактериальной системе. Сайт-специфический мутагенез с о использованием олигонуклеотидов последовательности Ргоїох-1 Агарідорзіз осуществляют, применяя набор Тгапзіогтег 5Зі(е-Оігесіей Миїадепезів

КИ (фирма Сіопіеспй, Раю Ай, СА). После подтверждения аминокислотньїх изменений путем анализа последовательности мутантнье плазмидьй переносят в штамм 5АБЗХЗ8 и вьісевают в среду І-атр 100 для тестирования на функционирование и в различнье концентрации ингибирующего протоке гербицида для о тестирования на толерантность. ко Зту методику применяли к кодону аланина в нуклеотидах 688-690 и к кодону тирозина в нуклеотидах 1306-1308 последовательности протокса Агарідорзів (ЗЕО ІЮ МО: 1). Зти результать! показьівают, что кодон бо аланина в нуклеотидах 688-690 может бьіть заменен на кодон валина, треонина, лейцина или цистеина, чтобь получить устойчивьій к гербициду фермент протоке, которьій сохраняет свою функцию. Кроме того, зти результать! показьівают, что кодон тирозина в нуклеотидах 1306-1308 может бьіть заменен на кодон цистеина, изолейцина, лейцина, валина или треонина с той целью, чтобьї получить устойчивьй к гербициду ферменит протоке, которьій сохраняет свою функцию. 65 Пример 26: Демонстрация перекрестной толерантности мутаций устойчивости к различньім соединениям, ингибирующим протокс

Устойчивье мутантнье плазмидьі), прошедшие селекцию на устойчивость к одному гербициду, тестируют в отношений спектра других ингибирующих протоке соединений. Штамм ЗАЗХЗ8, содержащий плазмиду дикого типа, помещают в среду, содержащую определенньй интервал концентраций каждого соединения для определения летальной концентрации каждого из них. Устойчивье мутантнье плазмидь! в ЗАЗХЗ8 вьісевают и определяют способность вьіживать при концентрации каждого соединения, которая, по крайней мере, в 10 раз превьішает концентрацию, являющуюся летальной для штамма ЗАБЗХЗ8, содержащего плазмиду дикого типа.

Результатьії, полученнье при определении перекрестной толерантности, показьвают, что каждая из определенньїх мутаций обусловливаєт толерантность к различньмм ингибирующим протокс соединениям. В /о частности результать! показьвают, что: 1) мутация АгасС-1Маї обусловливаєт устойчивость к ингибиторам протокса, включающим соединения формул ІМ, ХІ, ХІЇЇ, ХІМ, ХМ и ХМІЇ, но не обязательно ограниченньмх ими; 2) мутация АгаС-2Сув обусловливает устойчивость к ингибиторам протокса, включающим соединения формул ХІ,

ХІІ, ХМ и ХМІЇ, но не обязательно ограниченньїх ими; 3) мутация М2С-1Ма! обусловливаєт устойчивость к ингибиторам протокса, включающим соединения формул ХІ, ХІІ, ХІІ, ХІМ, ХУ, ХМІ и ХМІЇ, но не обязательно /5 ограниченньх ими; 4) мутация рАгаС-ззег обусловливает устойчивость к ингибиторам протокса, включающим бифенокс и соединения формул ІМ, ХІЇ, ХІЇЇ, ХІМ, ХМ и ХМІЇ, но не обязательно ограниченньх ими.

Пример 27: Получение толерантньхх к гербицидам растений путем сверхакспрессии генов протокса растений

Последовательности, кодирующие Ргоїох-1 Агарідорзіз как дикого типа, так и из устойчивьїх мутантньїх генов

Агас-1Маї, внірезают путем частичного разложения с помощью Есокі и Хпої! и клонируют в плазмиде зкспрессийи 2о растения рСОМ1761ЕМХ. Полигеннье зкспрессирующие кластерьі, содержащие гибридьі 2Х355-генН. Ргошх, вьірезают путем разложения с помощью ХраІ и клонируют в бинарном векторе рСІВ200. Зти бинарнье плазмидь! с протоксом трансформируют путем злектропорации в Адгобрасіегішт и затем в Агарідорзів, используя метод вакуумной инфильтрации (Веспіоїа и др., 1993). Трансформантов селектируют канамицином и получают семенной материал 12 из многочисленньїх независимьїх линий. Зтот семенной материал помещают в среду СОМ, с о содержащую различнье концентрации ингабирующего протоке гербицида, и оценивают прорастание и вьживание. Полигеннье трансгеннье линии, обладающие способностью к сверхазкспрессии либо дикого типа, і) либо устойчивого мутанта протокса дают значительное количество зеленьїх проростков на концентрации гербицида, которая является летальной для пустого контрольного вектора.

Различнье представленнье в настоящем описаний модификации изобретения должнь! бьїть очевиднь! для «о зо специалистов в данной области техники. Подразумеваеєтся, что такие модификации подпадают под обьем прилагаемой формуль! изобретения. і,

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ю (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ: (І) ЗАЯВИТЕЛЬ: -- (А) НАИМЕНОВАНИЕ: СІВА-СЕ|ЇСУ ДО ча (В) УЛИЦА: Кіурескзіг. 141 (С) ГОРОД: Базель (Е) СТРАНА: Швейцария (Р) ПОЧТОВЬЙ КОД (2ІР): 4002 « (б) ТЕЛЕФОН: 41 61 69 11 11 в с (Н) ТЕЛЕФАКС: т41 61 696 79 76

Й (І) ТЕЛЕКС: 962 991 и?» (ії) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Манипулирование ферментативной активностью протопорфириноген-оксидазь.у зукариот (її) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 20 -І (ІМ) ФОРМА ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ДЛЯ КОМПЬЮТЕРА: (А) ТИП НОСИТЕЛЯ: флоппи-диск - (В) КОМПЬЮТЕР: ІВМ РС, совместимьй с (С) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РО-БО5/М5-БО5 (Б) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Раїепііп Кеїеазе 241.0, версия 41.25 (ЕРО) о (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 1:

Ф () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 1719 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (Ф, (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: кКДдНнК ка (її) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (м) АНТИСМЬІСЛ: нет 60 (їХ) ПРИЗНАК: (А) ИМЯ/КЛЮЧ: СО5 (В) ПОЛОЖЕНИЕ: 31...1644 (0) ПРОЧАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /поїе-"кКДНК Ргоїох-1 Агарідорзів; последовательность из РУУЮОС-2" (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІЮО МО: 1: б5

ТОСАСААААТТ СОСААТТСТС ТОССАТТТОС АТС САС ТТА ТСТ СТР СТО сот соб 54

Мес біс Іец бек Те Іеч Ака Рго 1 5

АС АСТ САА ТОб СТІ СТТ СОС ТОб ТТТ ТОб ААС СОС ААТ СТО ССА ТА 102

Так Тс біп бег Темп Ієи Рго бек Рпе бЗег ув Рхо Ап Іеп Ако Гей

АКТ СТТ ТАТ ААС ССТ СТТ АСА СТО ОСТ ТС ТСА СТО СОС ОСТ ОбА ССА 150

Авзп омаі! Тук уз Рго Гей Агд Тем Асуд Суз бек Маї Аза біу б1у РКО - 30 35 40

ДОС СТО ОСА ТСТ ТСА ААА АТС САЛА ОСС ОБА СА бос Лос Лос АТС Со 198

Так маі Сіу бек бег уз 11е б)2ш б1іу біу б1у біу Твг Так Те Тог 45 50 55 10 АСО САТ ТСтТ СТО АТТ СТО ОС ОБА СОТ АТТ АСТ ОСТ СТ ТОС АТО ОСТ 246

Тік Авр Суз Ма1! І1їе Маї біу біу б1у І16 бек біу Івма Су5 І1е Ма 60 65 70

САС бОС СТТ ОСТ АСТ АС САТ ОСТ САТ ОСТ ОСТ ССб ААТ ТТА АТТ СТО 294 сСіп А1а тез Аїа Тс Туз Нів Рго Азр Аза Мза Рго Авп Тем ІЗ1е Уаї 715 80 85

АСС ОСА ОСТ ВАС САТ ОСТ СТІ ОбА СОС ААС АТТ АТС АСТ СОТ САА САС 342 15 Тпк біо Аза їуз Авр Аку ма! Сс1у б1у Авп т1е 112 ТВк Агд б3м БІ 90 95 100

ЛАТ ССТ ТТТ СТ ТОСб бАА САЛА ОСТ СОС ААТ АСТ ТТТ САЛА СО ТСТ САТ 390

Азп біу Рпе Іеи Тгр бій бій бу Рго Азп бех Ре біп Рко бек Ар 105 по 5 120

ОСТ АТО СТО АСТ АТО СТО СТА САТ АСТ ОСТ ТТО АЛО САТ САТ ТТо Сто 438

Рко Мекс Тем Тс Мес Маї МУаї А5р бек С1у Тец Гуз Азр Авр Тез Уаї 20 125 130 135 7 ТО БА САТ ОСТ АСТ СОС ССА АОС ТТТ СТО ТТ ТОб ЗАТ Сб АВА То 486

Іец біу Азр Рго Тік Аза Рго Агуд Рпе Уа! Іей Ткр Азп Сіу Гув Тей 140 145 150

Абс ССб СТТ ОСА ТОБ ААС СТА АСА САС ТТА СОС ТТ ТТ САТ ОТТО АТ 534

Вк Рго Маї Рго 5ег Був Тем Тпг Авр Тец Ро Ре Рпе А5р ей Мес се 155 160 165 25

АСТ АТТ ОСТ боб ААб АТТ АСА ССТ ОСТ ТТТ СсОТ ОСА СТТ СОС АТТ ССА 582 Ге)

Зек І1е біу С1у Цув І1е Асу Аза Сіу Ре Сіу А!а Івєи біу ї1е Ах9 170 175 180

ССО ТСА ССТ ССА ОСТ ОСТ САЛА САА ТСТ СТО САС САС ТТТ СТА СОС ССсТ 6530

Рго бек Рто Рго біу Аку С10 біш бег Ма! Сіш Сі Рве Маї Агд Агд й 185 190 195 200 І«о)

ААС СТО ОСТ САТ САС СТТ ТТТ САС СОС СТО АТІ САА ССС ТТ ТТ ТсА 678

А5п ей біу Азр бі Уа! Рре бій Агд Тем І1е бі» Рко Рне Суз 5ег со 205 210 215

ОСТ СТТ ТАТ ОСТ ОСТ бАТ ССТОТСА ДАХ СТО АСС АТО АЛА ОСА ССО ТТ 776 ІС біу Ма! Тук Ма Сіу Авр Рго бег Гуз ей бех Мес Гуз Аза А1а Рре 220 225 230 ч-

Об ААС СТТ ТОС ВАА СТА САС САЛА ААТ ССТ ОСА АСС АТА АТА ССТ сСт 774 б1у цуз Маї Тгр Цуз ем Сію біп Авп біу б1у бес І1е Пе біу бу

З5 235 240 245 -

АСТ ТР АВС ОСА АТТ САС САС АБО ВАХ ВАС ОСТ ССС АМС ОСА САА СОА 822

Тв Ре Тув Аза Т1е б1п Сів Агд Буз Азп Аза Рто Тув Аза Сіп зу 250 255 260

САС СО СОС СТО ССА ААА ОСА САС СОС САВА АСА СТТ ОТ ТСТ ТС доб 870 «

Авр Рго Акд Гей Рго Цув Рго біп С1іу біп ТвВг Уа! С1у бек Ре Агу 265 270 215 280 ш-в

АВС ООСА СТІ ССА АТО ТО ССА САА СА АТА ТСТ ОСА АСА ТТА ОСТ АОС 918 с Туз біу Іец Аку Меб Тео Рго бір Аїа І)е бег Ала Ацу ЇІєю біу Зех 285 290 295 . а АААОСТТ ААС ОТТО ТСТ ОТО ААС СТО ТСА ОТ АТО АСТ ААб СТО САС АОС з66 їуз УМаї Тув їей Беї Тер уз ї2у Бек б1у Т11е Тік був тей біз 5ег 300 05 310

ОСА ОСА ТАС ААСОТТА АСА ТАТ САС АСТ ОСА САТ ССТ ТТА СІТІ ТОС сто 1014 с1у біу Тук Азп Теги Тахо Тух бій Тк Рго Азр С1у Тео Уа1 Зех Уаї -І 315 320 325

САС АБС АВА АСТ ОТТ СТА АТС АСо СТО ССА ТСТ САТ СТІ ОСА ст ост 1062 шк біп бек ув бехг Маї Маї Мебс Тк Ма! Рго 5ех Ніз Ма)! Аза бек С1у 330 335 340 1 СТО То СОС ССТ СТІ ТСТ САД ТСТ ОСТ ССА ААТ ОСА СТО ТСА ААА СТА 1ло іп 1ез Вкд Рго Іем бег Сі) бек Аза Аза А5п АДіа Тец бек Гуз Тем о 20 345 350 355 збо

ТАТ ТАС ССА ССА СТТ ОСА ОСА СТА ТСТ АТС ТОб ТАС СОС АЛЛА САА ССА 1158

ФО Тук Тук Рко Рго Уаї Ма Аа Уа1 бек І1е бе Тук Ро Цуз біз Аа 365 37 375

АТС ССА АСА САА ТСТ ТТ АТА САТ ОСТ САА СТА ААС ОСТ ТТ Об САА 1206

І1е Агу Так бі Сув реч Тіе Авр Сіу бій Тез Туз б)у Рйе С1у Сіп 380 385 390 25 й

ТТО САТ ОСА СОС АС САА ОСА ОТТО САА АСА ТТА СОА АСТ АТС ТАС АОС 1254 іеи Ніз Рго Аг Тпк біп Сіу Ма! біо Твг Тем С)у ТЬх І) Тук бег .

ГФ) 395 400 405 60 бо

ТСС ТСА СТО ТТТ ССА ААТ СОС ССА СОб ССС ОбА АСА АтТтТ ОТТО СТО ТІ 1302

Зек бек еп Рпе Рко Авп Агу Аїа Рго Рго біу Акд І1е Тем Тем Теи 410 415 420 -

ВААС ТАС АТТ СОС СОС ТСТ АСА ВАС ОАСС СОА АТТ СТО ТОС ААСОТСТ САА 1350

Азп о Туг І1еє біу біу бех ТВг Ап Тпг біу І1е ей бек Туз бек бій 425 430 435 440

ОСТ САС ТТА СТО САА ОСА СТТ САС ДСА САТ ТІС АБС АВА АТО СТА АТТ 1398 біу бій Гей Маї бій А1а Ма) Бр Аку Авр Гей Акд Буз Меє Тем Пе 445 450 455

ААС ССТ ААТ ТОС АСС САТ ССА СТІ ААА ТТА ССА СТТ Або СТА тоб ОСТ 1446

Буз Рко Азп бек ТП А5р Рго Ін Гуз Тей біу Маі Акд Маї Тгр Рго и 460 465 470

САА ССС АТТ ССТ САС ТТІ СТА СТІ ОСТ САС ОТТТ САТ АТС СТІ САС АС 1494 біп А1а І1е Рко біп Ре Тем Уаї Сіу Ніз Рпе Азр І1е Тей Ар Тіг 415 480 485

ОСТ ДАЛА ТСА ТСТ СТА АСС ТСТ ТОб СОС ТАС САА боб СТА ТТТ ТТ СОТ 1542

А1а ув бег бег Теш Тіг бек бет біу Тух бім С1у Тем Ре їеч б1у 490 495 500

СОС ААТ ТАС СТО ОСТ ОЇ СТА СОС ТТА ОС СО ТСТ СТА САА ОБО ОСА 1590 біу Азп Тук Ма! А1а біу Уа1 Аза Тео б1у Акд Суз Маї сі С1у Аза 05 510 215 520

ТАТ СА АСС ОбСО АТТ САб СТО ААСОААСОТІС АТО ТСА СбО ТАС ОССТ ТАС 1638

Тук біб Трг Аїа 116 бій Ма1ї Азп Азп Ре Мебс бек Аку Тух Аза Тух 525 530 535

ААС ТАВАТСТААА АСАТТАААТС ТОССАССТТО ССТОАСТТТТ АТТАААТАТТ 1691

Туз

ТІСАСАТАТС САДАДЛАААДА ВАААААДА 1719 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЗЕО ІО МО: 2: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: сч (А) ДЛИНА: 537 аминокислот (В) ТИП: аминокислота Ге) (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: протеин (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ІО МО: 2: с

Меє біп еп бек Ге (ей Ага Рко Тк Так обіп бех ей Ге Рго бег 1 5 10 15 со

Рпе бет Гув Рго АБп Тем Акд Тез Азп о Маі Тухк Туз Рко Тез Акд Гей 29 25 30 ю

Аг Суз Бек Ма! Аїа біу 51у Рго Тк Уа! біу 5Зег Зек Був ї11е бі 10 45 ч- 35 сіу сіу Сіу біу Тк Тіг І1іе тТлк Тік Авр Сув Ма! 118 Уаїі 1у б1Уу ч- 50 5 50 со1у Пе бек С1у Іеч Сув т1е А1їа сіп АїТа Тем Аа Тпг Був Нів Рго 65 70 75 80

Азр Аї1а Аїаз Рко АБп їй Г1е Маїі Тпх бі Аза був Авр Аху Ма1 б1у « 85 90 95 в1 - у А5п І1є І1е Тк Акд бій бій Абп біу Рйе еп Ттр б)мш бій б1у с 100 105 о ч Рго Абп бек Ре Сіп Ргто бег Авр Рго Меї Іво Тік Меб Уа1ї Маї Авр и » 115 129 125

Бек біу Тез Гуз Азр Азр ем Уа) Теп біу Азр Рго Ті: Аза Рго Аго 130 135 140 -І Рпе Уаї Тен Ткр Азп б)1у Гуз їй Ак Рхо Маї Рго Зех Іуз тей ТК

У: 145 150 155 160 -й

Ввр ей Рго Рпе Рре АБр Пец Мет бех 11е сіу С1у Туз Ї1е Агд Аза 165 170 1715 1 б1у Рпе Ссіу Аза Іеп С1у І1зе Акд Рко бех Рго Рго б)у АхаЯ4 бій бій

ОО 180 185 190

Ф Бек Ммаї бім сіо Рпе Ма) Аху Ако Авп Те С1у АБр бі уаї Рпе 10 195 200 205

Ага Гео І1е бі) Рго Рпе Суб бег біу Маї Тух Аїа біу Ар Рго бег 210 215 225 59 Цув Тео бек Ме уз А1а Аїа Рне Сіу уз Ма1 ТЕр Цуз Темп біо» біл 225 230 235 240

Ап Сіу біу Зек І1е І)е біу біу Тік Рве цу Аза І1е біп Сіш Акд ке 285 250 255

Туз Азп Аза Рко Туз Аїа бій Аго Ар Рго Аху Тез Рко Їду5 Рко біп 260 265 27 60 біу біп Тих Маї Сіу бек Рпе Аго Пух Сіу Івм Акд Меб Гей Рко бій 215 280 285 бо діа 11е бек Аїа Ага Гей біу бек уз Уаі Був Іво бек Ттр Буз Іеи 290 295 300

Бек біу І1є Тпг руз ем біцш бег Сіу Сіу Тук Азп Геч Тиг Тук бій 305 310 315 320 2 Тік Ро Азр с1іу ей уаї Бех маї біп Зек (уз Зек Ма1 Чаї Меє ТЬБг 325 330 335

Маї Рко Бек Ніз Уві Віа бег біу Гей Івц Акад Рго Ім бех бій Зек - 340 345 350 діа Аза АБп Аа Тех бет Буз Тем Туг Туг Рго Рго Маї Аза Аза МУаї 10 355 360 365 бек Іїе бек Тук Рко ув бім Аїа І1е Агу ТВ бій Суз Гео Те Ар 370 315 380 сіу бій тем Буз б1у Рре С1у біп Ієш Нів Рго Ак ТВх біп біу Уаї 385 390 395 400 15 бій Твг Іва б1у Твг 112 Тук бек беу бек Геи Рпе Рго Азп Аху діа 405 410 415

Рко Рко біу Акд І1е Гл Тез Гео Азп Туг І1є б1у біу бек Твх Азп а20 425 430

Тпх біу ї1е т2и Зек Туз Бек б)іш б1у Сіш Тем Ма1 бі Аїа Ма1ї Азр 435 440 445 20

Ага Азр Тем Аку Туз Мес Іео Те Гуз Рко Азп Зек ТіПх Авр Рго Іеип 450 455 460

Гуз їеа сіу Ма! Акд Маї Ткр Рго біп Аза Іїе Рко Сіп Ріе Ієп МУаї 465 470 475 480 біу Ні Ре Азр І1е Ів Азр Тк Аїа Туз бек бег Івй Тс бех бех с 25 485 490 495 (5)

Сіу Тухк бів б1у Теш Рпе Іеи Сіу Сіу Азп Туг уаї Аїа Сіу Маї Аа 500 505 10

Івча біу Аг Сув Маі 0310 біу Аза Тух Сі) Тпг Аза І13е сій Уаї Ап 515 2 920 525 (се) 30 Ап Рре Мес бек Аго Тук Аза Тут Гуз 530 535 і, (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 3: ю () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 1738 пар оснований -- 35 (В) ТИП: нуклеиновая кислота ї- (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: кКДНнК (ії) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет « 40 (м) АНТИСМЬІСЛ: нет з с (їх) ПРИЗНАК: (А) ИМЯ/КЛЮЧ: СО . и? (В) ПОЛОЖЕНИЕ: 70...1596 (0) ПРОЧАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /поїе-"кКДНК Ргоїох-2 Агарідорзів; последовательность из РУУЮОС-1" 45 (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 3: -І ТТТТТТАСТІ АТТТСОСТСА СТОСТТТОСА СТОСТСАСАС АТТТТСАСТС ТСААТТСТІЄ бо

САСАТАССА АТС ОС ТСТ ОСА ОСА СТА ОСА САТ САТ САА АТТ САЛА Сб 108 шо Мес Аїа бек біу Аза Маї Аїа Азр Ніз біп Пе біз діа 1 5 10 1 СТТ ТСА ОСА ААА АСА СТС ОСА СТО СТА ОСТ ОСА ОСТ СТА АСТ ОСА СТТ 156 маї бек біу їуз Агу Маї Аїа Уаї Уаї Сіу Аї1а біу Маї бек Сіу тез 50 15 20 25 (95) сСб сСс ОСТ ТАС ААС ТТ ААА ТОС АС ОСТ ТТ ДАТ СТО АСТ Сто ТТ 204

Ф А1а Аза Аза Тук їуз Тем Цуз бБег Аго Сіу Іви Азп Уа1 Тпх Маї Бе 30 35 40 45

САА ОСТ САТ ОСА АСА СТА ОСТ Сбб АС ТТС АСА АСТ СТТ АТО САЛА ЛАТ 252 біз Аза Авр С1іу Ах Маї біу біу Був Тез Вс Бех Маї Меб біп Азп 50 55 60 55

ССТ ТІС АТТ ТОб САТ САА ОА ОСА ААСОАСС АТО АСТ САС СТ САб ССА зо0 с1у Тем І1в Тер Авр біш б1у Аїа Ап Тк Меє Тк біш Аза бів Рхо (Ф; 65 7о 75 ке САА СТТ ОБО АСТ ТТА СТТ САТ САТ СТІ СОС СТІ ОСТ САС ААА САВА САА 348 бій Маї б1у бег Іо Іеи Авр Азр їеп Сіу Гей Агу бій уз біп біп 80 85 90 60 ТТТ ОСА АТТОТСА САС АКА ВААС СОС ТАТ АТТ СТО ССО ААТ ОСТ СТА ОСТ - 396

Рпе Ркго ІЗзе бег біп уз Цуз Акд Тух Пе Маї ху Азп С1у Ма1 Рго 100 105 б5

СТО АТО СТА ССТ АСС ААТ СОС АТА САС СТО СТО АСА АСТ АСТ СТО СТ 444 уаї Меб тей Рго Тпх Ап Рго Ге бій Те Уа! Тпх бек бек Маї ей 110 115 120 125

ТСТ АС САЛА ТСТ ААС ТІТ САА АТС ОТТО ТО СЛА ССА ТТТ ТТА ТОб АС 4929

Зек Тих біп бех Муз Рпе біп І)1е Гем Тем бМи Ркго Ре Ге» Тср Гуз 130 135 140

ВАДА АМО ТСС ТСА ААА СТО ТСА САТ ССА ТСТ ОСТ САА САА АСТ СТА ОС 540 пуз уз Бек Зек цуз ма1! Зег Авр Аіа бек Аза бій бій Зег Уа! Зек 145 150 155

САб ТІС ТІТ САЛА СОС САТ ТТТ ОСА САА САС СТТ СТІ САС ТАТ СТО АТО 588

Сі Рпе Рпе біп Акд Ніз Рпе біу Сіп бій Ма) Маї Азр Тук Іеи Те 160 165 170 70 сасоостоттт стт ОСТ ОСА АСА АСТ ОСТ СО САС ОСТ САТ ТОС СТІ ТСА 636

Азр Рго Рпе Уа! біу б1іу Тіг бек Аіа Ата Азр Рто Ар Бех Івц бек 115 180 185

АТО АВС САТ ТСТ ТІС ОСА САТ СТО ТОб ААТ СТА САС ААА СТ ОТІТ СОС 684

Мес ту Ні5 Бех Ре рРко Авр Тем Тер Авп Уа! Сім Був бек Ре б1у 150 195 200 205

ТСТ АТІ АТА БІС СОТ ОСА АТС АСА АСА ААСОТТТ ОСТ ОСТ ААА ОСТ сот 732

Зех їіе Ііє Уаї біу А1а І1е Агу Тах Буз Рре А1а Аза Гуз біу Сіу 210 215 220

ААА ВМОЗТ АСА САС ОАСА ААСОАСТ ТСТ СОТ СОС АСА ААА дАС о ссСтТ тоб Ост 780 цуз бек Аку Ар Тіг цуз бес бек Ро біу ТПх Гуз уз Сіу бек Акад 225 230 235

СБС ТСА ТТС ТСТ ТТТ ААС Обб ОА АТО САС АТТ СТІ ОСТ САТ АСо ТТ 828

СІ1у Бег Рпе бек Ре цу біу біу Меє біп І1е Тез Рго Авр Тіг І1ей 240 245 250

ТОС ААА АСТ СТО ТСА САТ САТ САС АТС ААТ ТТА САС ОТОС ААб СТА Ст 876

Суз цу бек Пес бег Нів Авр біш І1е АБп Тец АБр бек Гуз Маії Тем 255 260 265

ТСТІ ТТо ТСТ ТАС ВАТ ІСТ ОСА ТСА АСА САС САС ААС ОТО ТСА ТТА ТСТ 924 бек Ієиц бек Тух Азп бек біу Зек Аку біп Сіц Азп Тгр Зег Ів! бек сем 270 215 280 285

ТСТІ СТІ ТО САТ ААТ САА АС САС АСА САЛА ОДАС СОС САТ ТАТ САТ ОСТ 972 Ге)

Суз Маї Бек Ні Ап Сі Трг біп Аку біп Ап Рго Нів Тук Ар А12а 290 295 00

СТА АТІ АТО АС ОСТ ОСТ СТО ТОС ААТ СТО ААб САС АТО ААб ОСТ АТО 1020 маї Те Мес Тьг А1а Ро Ім Суз Азп Маї Гуз бій Мебс Гуз Уаї Меє 305 Зо 315 й Ге) зо ААА ССА ССА САД СОС ТТ САС СТА ААСОТТТ СТО ССС баб АТТ ААТ ТАС 1068 цуз біу біу біп Рко Рпе біл ем Азп Рйе Пеш Рго біш 11е АП Тут Гео) 320 325 330

АтТЄ СОС Сто тоб СТТ ТТА АТС АОС АСА ТС АСА ДА САС ЛАА СТА ДАС 1116 ІС

Мек Рго Гей бек ма1і їв 11 ТпгоТйг Рре ТВгоБуз С1и Буз Маї уз 335 380 345 ч-

АСА ССТ СТТ САА СОС ТТТ боб СТА СТ АТТ ССА ТСТ АВС САС САА ААС 1164

Ак Рго їєп бі Сіу Ре біу Ма! їси Її Бго бек Гус Сію біп Бу 39 з5о 355 зво 365 -

САТ ОСТ ТІС ААА АСТ СТА СОТ АСА СТІ ТТТ ТСА ТСА АТО АТО ТТТ ОСА 1212

Нів біу Ре Гу Тіт їез С1іу Тих Тео Ре бек бек Меї Меї Ре Рхо 370 315 380

САТ ССТ ТОС ОСТ АСТ БАС ОСТІ САТ СТА ТАТ АСА АСТ ТІТ АТІ бот 55 1260 «

АБО Ву бек Рго бег Азо Маї Ні5 Іеи Тук Тс Так Рре І1е біу біу з85 390 395 З7З

АСТ Або ААС САС САА СТА СОС ААА ССТ ТОС АСТ САС САА ТТА АВА СА 1308 с бек Агд Азп б1п біц Гео Аза Гуз Ада бег ТВг АБр б10 Те Гув бій 400 405 410 "з СТТ СІС АСТ ТСТ САС СТІ САС ОССА СТО ТТ Об5 СІТІ САА СОТ БАХА ССС 1356 и Уаї Маї ТВк Зек Азр Пе біп Ахо Тем Тео б1у Уаї біз б1у бім Рхо 415 420 425

СРО ТСТ СТО АВС САТ ТАС ТАТ ОТОб Або АЛА ОСА ОТТО ССО ТТО ТАТ САС 1504

Ма) бек Ма! Аєл Нів Тук Тук Ттр Аху Туз Аза Рію Рго Ією Тут Авр

І 430 435 440 445

АБС ОВОС ТАТ САС ТСА СТО АТО САА ОСА АТТ САС ВААС АТО САС ААТ САТ 1452 3 Бек Бек Туг Авр бег Ма! Меєб б)1и Аіа Те Авр Гуз Меб Си Азп Ар 450 455 460 (9) СТА ССтТ об ТС ТІС ТАТ ОСА ОСТ ВАТ САТ ОСОБА Об 55 СТО СТ СТІ 1500

Гео Рто біу Рпе Рпе Туг Аза Сіу А5п Ні Акуд біу Сіу Тем бег Маї 465 470 475 се 70

СОС АЛА ТСА АТА ОСА ТСА СОТ ТОС АМА ОСА ОСТ САС СРТ СТО АТС ТСА 1548 с1у цу 5ег т11є Кіа 5ек біу Суз уз Аїа Аза дер Тем Маї Це 5ег о 480 435 490

ТАС СТО САС ТСТ ТОС ТСА ААТ САС ААС ААА ССА ААТ САС АСС ТТА ТААСАТТСТС

1603

Туг їеи бій Зехт Суз Бек Авл АБО 1у5 Гуз Рго Азп АБр Бех Іей 495 590 5ОЗ 25

ААССТООСТС ССТТТТТАТС АСТТАСТТТС ТАААСТІСТА АААТОСААСА АСССОСОСТО 1663

ГФ) ОСАТТАСССА ВСААСТСАОС ААААСССАСА ТІСТСАТААС ССТСАСТААТ ТОСАСААТАА 1123 І ко АСТАТТТАТО ТАВАА іт3в (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 4: 60 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 508 аминокислот (В) ТИП: аминокислота (Б) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: протеин б5 (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 4:

Мек.А1з бек б1у Аза Уаї Аза Авр Ні Сіп І1е С1й Аза Маї бек ЗУ 1 5 10 15 уз Агуд Маї Аза Ма! Уаї Сбіу А1а с1у Ма1 бек біу теп Аза Аза ліз 29 25 30 с Тут ув Теми уз Бех Акд С1іу Тео АБп Уа) Тс Уа! Рбе біп Аза Ар 35 40 45 біу Ака Ма1ї Сіу б1у Пуз Пец Аку беж Уаї Мес біп Абп біу тей І1Є 0 53 60

Тер Азр бій біу Аа Азп Так Меє Тахо б) Аза біо Рго Сі Маї с1у 65 70 75 80

Бек цен Івми Авр Азр Гей Сіу Іво Акад біз Був біп біп Ре Рхо І1е 85 з0 95 бек біп Гуз Муз Лтд Тук І1е Маї аку Азп біу Уаі Ркго Ма! Меє Ів 0 105 110

Рго Тпх Авп о Рхо Це бій Тем Маї ТПх бек бек Уаї Іс бек Тах б1іп 115 120 125 бек Бу Рре біп І1е Іеп Тец біш Рго Рпе Тец Тгр Гуз Туз Гуз бег 130 135 140

Зек уз Ма1ї бЗек Ар Аїа Бек Ала бій бій Бег Ма! бег бій Рпе Рпе 145 150 155 160 біп Айку Нівз Рпе біу бій бій уаї Ма! Авр Туг їеи Т1Іе Азр Рго Рбе 165 170 115

Маї біу б1у Тйг бег Аа Аїа Авр Рко Авр бек 16) бек Мес Гуз Ні 185 185 150

Бек Рпе Рко Азр їси Тер Авп маї біб Туз бег Ре Сіу бек І1є Пе с 195 200 205 Го) чаї біу Аа Ії Асу Тс Гуз Ре Аза Аза Туз біу Сіу Гуз Зех АгФ 210 215 220

Авр Тпг о Пуз Бег бек Рко біу Тйх Буз Гуз біу бек Акад С1у бех Ріє 225 230 235 240 (Се) бек Рпе Був біу біу Мес біп 116 Гецп Рго Абр Тк Іво Суб Був бег со 245 250 255

Іечп бек Ніз Азр бій І1е Ап Іеш Ар Зег Буз Маї Їїви Бех Тец Зег ів) 250 265 210 ч

Тукг А5п Бек біу бег Агд біп бі Азп Тгр 5ег Тем бек Суз Уві бек 215 280 285 о

Ніз Азп біз ТБ біп Аку бід Азо Рго Ні Тус Азр Аза Чаї ІТ1є Мес 290 295 оо

Тис Аза Рго Теа Суз Азп Ма1 Гуз Сі Ме Цуз Уаії Ме; їув 03у С1у 305 зю 315 320 « біп Рко Рбе біп Тем Авп Рре їв Рхо Сійш І1е Авп Тух Меї Рко Гей 325 330 335 - с Бек уУаї Тем Ізе Тих Тих Ре Тік ув бій ув Маї Гуз Ату Рко вх 340 345 350 ;» п сі біу Рпе біу Уаї Іви І1е Рко бек Гуз біп біп Пу5 Ніз біу Ре 355 360 365

Туз ТВі Тем Сіу Тіг Ією Рле бЗех бек Мес Мес Рпе Рхо Авр Аго Зех 370 375 зво -

Рго бег Авр Ма1 Ніз їєш Туг Трг Тіг Рре І11е С1у біу бег Агу Азп - 385 390 395 400 біп бій ей Аза буз Аза бег Тс Азр біш Гей Був біп Маї Уаї Твх 1 405 410 415 с 50 бек Авр єм Сій Ако Ім Тем біу Ма! бій Сіу біз Рго Маї бег Уаї 420 425 430 4») Ап Ні Тух Тук Тур Акд Цуз Аза Ре Рго Те Тух Азр бес бек Туг 435 420 445

Авр Бех Ма! Мек бій Аза І1е Азр Гуз Меб б) Авп Авр Теч Рхо б1у 450 455 460 й

Рре Рпе Туп Аїа біу А5п Ні5 Агу Сіу С1іу Теги бек Уа! С1у Туз бек

ГФ! 455 470 475 480 ке І1е А1а бек біу Суз уз А1з А1а Азр Тец Ма! 112 бег Тук ївц бі 485 430 425 во Зек Суз Зек Азп Азр Гуз Гуз Ркго Азп Азр бег Те 00 505 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 5: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 1698 пар оснований в (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная

(6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: кКДдаНнК (її) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (м) АНТИСМЬІСЛ: нет (іх) ПРИЗНАК: (А) ИМЯ/КЛЮЧ: СО (В) ПОЛОЖЕНИЕ: 2...1453 (0) ПРОЧАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /поїе-"кКДНК Ргоїох-1 кукурузьі (неполноразмерная); последовательность из у) ВУЮС-4" (хїЇ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО ІО МО: 5: б ААТ ТОб СО САС ТОС СТО СТО СТ СОС бСА СОС АТС АСТ СОС СТ 46

Азоп бек Аза Ар Суз Маї Уа1 Ма1і С1у біу С1у І1е бек Б1у Іви 1 5 10 15

ТОоС АСС боб САС бСб СТО СОС АСС СО5 САС СОС сто боб САС ото СТІ 94

Суз Тпг Аза біп Аза Іво А1а Тпх Агуд Ніз біу Уаї Сбіу Авр Уві Ге) 715 20 25 зо

СТО АС САС СОС СОС бос СОС ОСС ОС БОС ААС АТТ АСС АСС СТ сво 142

Уа! Тік бій Аза Аку Аза Аку Рко С1у б1у Авп ІЗе Тпг Тк Ма1ї біш 35 40 45

СОС ССС САС САА боб ТАС СТО ТОб САС САб ОСТ СОС ВАС АС ТС САб 190

Ак Рго бій бій б1у Тух Іво Тхр біб бі біу Рго Авп бех Ріе Ссіп 50 55 бо й

СОС ТОС САС СОС СТІ СТО АСС АТО СОС СТО САС АС бСА СТО ААС САТ 238

Рго Бек Азр Рго Ма! Тем Тйг Мес Аза Маї А5р бек біу Тез Гуз АБр 65 79 75

САС ТТС СТТ ТТТ Сбб бАС ССА ААС ССС соб ост тт сто Сто тоб бАб 286

А5рією маї Рпе Сіу Азр Рко Азп А1а Ркго Вгд Рпе Ма) їей Тер біч 80 85 90 95 соб АВС СТО АСб СОС сто ССА ТОС ААб СОС БОС БАС СТО СС ТС ТС 334

Сіу цуз Тем Агд Рго Ма! Рго Зех ПЦуз Рго Ма Авр Тем Ркго Рбе Рпе Ге) 100 105 110

САТ СТО АТС СС АТС ОСА боб ААС СТ Або ОСС бот СТА бос бо СТІ 382

Авр Іеий Мес бЗег І1е Рхо С1у Цуз Тем Ако Аіа Сіу Іеи Сіу Аїа їец 115 120 125

ОС АТС СОС ОС ОСТ ОСТ ССА ОС СОС САА САС ТСА СТО САС САС ТЕС 430 (се) сіу Т1е Агу Рго Рго Рко Рго Сіу Агу бій бій бек Ма! бі біш РБе 130 135 140 с ст СОС СОС АВС Сто ОСТ СТ СА СТО ТТ САС СОС СТО АТТОСАС ОСТ 478 уаї Аха Вгу АБп Тез Сіу Аїа бій Маї Ре Сіп Акд Тец Тіе бій Рго юю 185 150 155

ТС ТОС ТСА ОСТ СТО ТАТ ОСТ ОСТ САТ ОСТ ТСТ ААС СТС АСС АТС дАС 526 ч-

Рпе Суз бек біу Уа1 Тух Аа біу Азр Рко бег Буз Іїеп бег Ме ув 160 165 ї70 315 -

ССТ ОСА ТТТ СО ААб ОСТІ тоб СОС ТІ СА САА АСТ ОБА ОСТ АСТ АТТ 574

А1їа Аза Рпе біу уз Ма! Тгр Агд Те бій біш Тагоб1іу С1у бех І1е 180 185 190

АТТ ОСТ ОБА ДСС АТС ААб АСА АТТ САС САС АОС АСС ААСОААТ ССА АВА 622

І1їе б1у біу Тах І1е Пуз Тйг ІТ1е біп біш Агу бег Гу Авп Рго Муз « 195 200 205

ССА СОб ДСО САТ СОС СОС СТТ ССО АЛ ССА ААА боб САС АСА СТІ ССА 670 -

Рго Рго Агу Ар Аїа Акд Іеш Рго Гуз Ркго Туз С1у С1іп Ті: Ма1 А1а с 210 215 220 щ ТСТ ТІС АБО АЛ ОСТ СТІ ССС АТО СТІ ОСА ААТ ОСС АТТ АСА ТОС АС 718 и - бег Ре Аг Цув біу Тем А!а Меб Тен Рго Авп Аіа ІЗе Твг Бех бег 225 230 235

ТІб СОТ АСТ ААА СТО ААА СТА ТСА ТО ААА СТО АСС АС АТТ ВСА АВА 766 іеи С1у Бек Пуз Маї Був ІТеи бег Тгр Туз еп Тк бех І1е Тих цуз -1 240 245 250 255

ТСА АТ САС ААб ОСА ТАТ СТТ ТТО САС ТАТ САА АСО ССА Ав боб СТТ 814

Бек Азр Авр Цуз б)1у Тук Маії еп біц Туг бій Тпх Рго бій біу Уа1ї - 260 265 270 сл СТІ ТОБ Сто САС ОСТ ААА АСТ СТТ АТС АТО АСТ АТТ ССА ТСА ТАТ СТТ 862 уаі Бек ума! біп А1а Пуз бек Ма! І1е Мес ТБ І1є Рго бек Тук МУаї 275 280 285 . 25 60 бо

ОСТ АбС ВАС АТТ ОТТО СОТ ССА СТІ ТСА МОС САТ ОСТ ОСА САТ ОСТ СТА з

Вів бег Абп І1е Тем Агу Ро Тез Бех бег Авр Аза Ав Азр Ал Тем 290 295 оо

ЯТСА АОА ТС ТАТ ТАТ ОСА СОС СТТ ОСТ ОСТ СТА АСТ ОСТІ ТОб ТАТ СОК 958 бег Акд Ріс Тух Тух Рго Рко Ма! Аза Віа чаї Так Уа)! бес Тух Рго 305 310 315

ААб САА ОСА АТТ АСА АЛА САА ТОС ТТА АТТ САТ ССО САВА СТО САС СОС 1006

Буз бій А1а І1е Агуд Туз 010 Суз Тез І1е Авр С1у біх ви б1п с1у 320 325 330 335 ттт ОС САС ТТО САТ ССА ССТ АСТ САЛА ССА СТІ САС АСА ТТА ССА АСА 1054

Рве С1іу Сіп Тез Ні Рго Ак бек біп б1у Ма! бій Тр Тем б1у Тог 340 345 350

АТА ТАС АСТ ТОС ТСА СТО ТТТ ОСА ААТ ОСТ ОСТ ССТ САС Обі Або сто 1102

І1е Туг бЗег бег бек Тем Ре Рго Азп Аку Ма Рго Ар біу Ак Маї 355 зо 365

ТТА СТТ СТА ВАС ТАС АТА ОСА СОТ ОСТ АСА ВАС ОАСА ОСА АТТ СІ ТС 1150

Іво Тем Ів Ап Тук І1е С1у Сіу Аїа Трх Доп Тако біу Те Уаії бек з7т0 375 зво

АВ АСТ БАХА АСТ САС СТО СТО САА ОСА СТІ САС ОССТ САС СТО ОСА ААА м98

ШЦуз Твк Со бек бін Тео Уаї бум Аза Уві Авр Аку Авр Іем Агу Був 385 390 395

ВТО СТТ АТА ВАТ ТСТ АСА ОСА СТО САС ССТ ТІА ТС СТТ СОТ СТТ ССА 1246

Мес Іеч І1е Авп бек Тпх А1їа Уа1 Авр Рго Ісч Уа! Пецш біу Маї Акад 400 205 410 415

СТІ ТОБ ССА САВА СОС АТА ОСТ САС ТС СТО СТА ССА САТ СТТ САТ СТТ 1284

Уа! ТЕр Рго біп Аа І1е Рхго Сіп Рпе еп уаї С1у Нів Іею Авр 1 «20 425 430

СТО САЛА ОС ССА КАК ОСТ ОСС СТО САС ОСА ОСТ ОС ТАС САТ боб СТО 1382

Тєй біз Аїа Аза Бруз Аа Аїа Гео Авр Агу Сіу С1іу Тух АБр б1у 120 435 2440 415

ТТС СТА ОСА Сбб ААС ТАТ СТТ ОСА ОСА СТтТ СОС СТО бОС АСА Тос ст 1390

РМе їецп біу б1іу Азп Туг Ма! Аза С1у Ма1ї діа тео С1у Агд Суз Уаї 450 455 460 с ,бАС ОС Со ТАТ САВА АСТ СОС ТОб САА АТА ТСТ САС ТТ ОТТО АСС ДА 1438 Го) біз біу Аїа Туг бійц бег Аїа бег біп І1е 5ег Авр Рпе Гей Тнг Туз 465 470 475

ТАТ СОС ТАС ААС ТСАТСАВАСА АСТОСАССОС ТАСТТСТТАА ТОСТТТАТСТ 1190

Туг Аза Тук Гуз 480 га М

ТОСАТАСАТО АССТОССТОС ССССАААЛАМА ААССТТОААТ АСТАТТТТТТ АТТСТТАТТТ 1550 со

ТСТАДАТТОС АТТТСТСТТС ТТТТТТСТАТ САСТАЛТТАС ТТАТАТТТТА СТІСТСТАЄС 1610 ю

АСАТІСТІСТ СТІСАСТОСС СТТСААДАСА ААТТТТАТІТ ТТСАТІСТІТ ТАТСАСАССТ 1670

СТОСТАСТТА ААААЛААААА АВАДАВАА 1698 ьо (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 6: ї- () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 483 аминокислоть (В) ТИП: аминокислота (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная « (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: протеин з с (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 6:

Азп о бех Аза Азр Суз УМаії Уа! Уа! біу біу б1іу Це бек 01у Ген Суз п 1 5 10 15 ит

Так діа біп А1а ей Аза Тпсодхо Ні б1іу ма! б1у АБр Уаї Бе Уаї 20 25 30

Так біз А1їа Агд Аза Агу Рго біу б1іу Азп Т1е ТНг Тв Уа) бій Асд -| 35 40 45 - Рко біз біз біу Тух Ти Тер бід бі Сіу Рго Авп о бег Рпе біп Рхо 60 1 Зех дзр Рго Уві є Тих Мес Аза Уаї Авр Зег б1у Тем Гуз Авр Ар 65 70 75 80 с 50 -

Тео уаї Рпе біу Авр Рко Азп діа Рко Ахд Рбе Уаї Тез ТІр Сіл 01у

Ф 85 90 95

Цу5 Твен Ако Рго Ма! Рго Зек Гуз Рго АТа АБр Те Рко Ріе Рре Ар 100 105 110 55 їєюм Мес бек І1е Рго біу уз Тем Акад А1а біу Тем Сіу Аа Іо біу 115 120 125

ГФ) І1їе Агд Рко Рго Рко Рко біу Аг Сій бі) 5ех Уаї1ї біз біо Рбе Маї 130 135 140

Ага Адо Вп Тен б1у Аїа 10 Ма! Рпе 010 Агд Тем 116 б1ї Рко Ре 135 150 155 160 60 Суз Зес біу маі тТук Аза біу Ар Рко бек цу5 Тец Бех Мес цу А18 165 170 175 б5 діа Ре біу Цуз Маї Ттр Вху Те біз біз Тпх б1у біу Бех Пе Пе 180 185 190 біу біу Тс І1їе Цу5 Тк Це сіп бій аку бег о Буз Азп Рго Гуз Рго 195 200 205

Рго Агу АБр Віа Агд Те Рго ув Рго уз б1у бів ТК чаї Аїа бек 210 215 220

Рпе Агу Пуз Сіу тем Аза Мес Тео Рхо Ап Аза І1е Тк бег Зех Темп 225 Й 230 235 240 сіу Бег ув Маі Іуз со бек Тур Пуз Бей Тк бек Г1е ТПг Гуз Бех 7170 245 250 255

Авр Ар Пуз Сіу Тук Маї Бе бі Тук бій Тйх Рго біп біу Маї Уах. 250 265 270 бех Уаї Сіп А1а Іуб бек УМаї І1е Мес Тк Її1е Рго бЗех Тук Ма! Ав 215 280 285 бек АБп І3)е Іем Аку Рго Іем бег Зек Авр Аа Аза Азр Аїа Іею бек 290 295 300

Акса Рпе Тук Туг Рго Рго Ма1 А!а Аїа Уа) Тйх Уа! бех Тук Рко Ту5 305 3зю 315 320 бі Аїа Т1іе Ахуд Був б10 Суз Тео І1е Азр б1у бій Івю біп біу Рбе 325 330 335 : . біу біп теп Ніз Рго Згд Зек біп біу Уаії бій Трг тем б1у ТБх Те 340 345 350

Тук Бек Бек бек Те Ре Рго Азп Аку Аза Рго Ар біу Акуд Маї ей 355 зво 365

Те Тем Авп Тух Т1е С1у б1у Аза Тбт Абп Трх Сс1у І1е Уа)! бек уз с зт 315 380 о

ТВг біо бек бій Гец Ма) С1й Аза Уаї Абр Агу Авр Течй Ак Туз Меє 385 390 395 500

Іви І1е Авп Зек Тік Аїа Ма) Авр Рго Тео Маі їси біу маі Ако Уаї 405 410 415 (Се)

Тер Рко біп А1а І1е Рго біп Рбе їец Уа) Сіу Ні Бей Авр Івч Гей 420 425 430 і) бій Аза Ав. Із АМіа А1а їв Азр Агу Сіу біу Тук Авр С1у Ів Ре ІС 435 440 445

Іев біу біу Авп Ту Ма! А!а Сіу Уа) Аїа їей С1іу Агуд Сув Маї бій ч- 450 455 460 сіу діа Туг біц бек Аза Зекх біп І1е бек Азр Ре Іеи Тіх Буз Туг - 465 470 475 480

А1їа Тук був (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 7: « () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: - (А) ДЛИНА: 2061 пара оснований с (В) ТИП: нуклеийновая кислота "» (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная " (Ф) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: кКДНнК (ії) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет ш- (м) АНТИСМЬСЛ: нет - (іх) ПРИЗНАК: (А) ИМЯ/КЛЮЧ: СО о (В) ПОЛОЖЕНИЕ: 64...1698 2) 20 (0) ПРОЧАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /поїе-"кДНК Ргоїох-2 кукурузьі; последовательность из РУУЮОС-3" (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 7: 42) СТСТОСТАСС ТОСАССТОСА СБАСАДСААС САЛАТОСОСА ТОСАСТТОСА ААСССТААСТ бо

САА АТО СТО ОСТ ТІб АСТ БОС ТСА СОС ТСА ТОС ОСТ ТОС ТОС САТ ССТ 108

Мег Гей А1їа ій Тпх іа Бег А1а бек бек Аїа бех бек Нів Рго 1 5 10 15 55

ТАТ СОС САС ССС ТОС бо САС АСТ ССТ СОС СОС СОС СТА сст соб сте 156

Тук Акд Ніз Аїа 5ех Аа Ні5 Тпг Агу Агу Рго Ага Іво Акд Аза МУаї

ГФ) 20 25 зо ке СТО боб АТО Об СОС ТОС БАС САС СОС ОСТ ССА ССО СОС СС АСА тоб 204

Тез Аза Мес Аїа Сіу Зег Азр Азр Рсо Агу А1а Аза Рго Аіа Агд бек 35 40 45 во сто бос сто сте сбс бос боб сто ос боб сто боб особ Сб ТАС АС 252

Ммаї Аїа Уаї Маї б1у А1а 51іу Ма! бек С1іу Гей Аїа Аіїа Аза Туг Агд 35 650 б5 -д42-

СТС АСА САС АОС СОС СТО ААС СТА АСС СТО ТТС САА боб СС САС АОб 00 іо Агд біп бек біу Ма! Азп Ма! Тіас Ма! Рпе Січ Аіз Аза Авр Аа 65 то 75

СОС ОСА ОСА ААб АТА СОб ДСС ААТ ТОС САС СОС боб ТТ сто Тео САТ зав діа біу біу цуз Іе Акд Тік Авп бек бі б1іу Сіу Ре Уві Ткр Авр 80 85 90 95

САА ОБА ОСТ ВАС АОС АТО АСА САА ОСТ Ав ТО САС бСС АСТ СА СТО зоб бій біу Аїа Ап Тйх Меб Тпг бій біу бій Тгр біз Аа бек Акад еп 100 105 110

АТТ САТ САТ СТР ОСТ СТА САА САС ААА САС САС ТАТ ОСТ ВАС ОТОС СА 444

І1е А5р Азр їеч біу Теч Сіпй Азр Туз біп біп Тук Рго АБп 5ех біп 115 120 125

САС АВС ССТ ТАС АТТ СТО ААА САТ ОСА ОСА ССА ОСА СТО АТТ ССТ тоб 492

Ніз уз Ак Тух Пе Уа! уз Авр біу діа Рхо А1їа тей І1е Рко бек 130 135 140

САТ СОС АТІ ТОБ СТА АТО АЛА АОС АСТ СТІ СТІ ТОЗ МАСА АДА ТСА ВАС з40

Авр Рго І1е бек їей Мес уз бек бек Уа! Іеп бек Тік Гуз бек Був 145 150 155

АТТ бос ТТА ТТТ ТТТ САА ССА ТТТ СТО ТАС ААС ААА ОСТ АВС ВСА АСА 588

І1е Віа Ієх Рпе Ріе бі Рго Рпе Іец Тук Цуз буз Ма Азп Так Аха 160 165 170 175

ДАС ТСТ ОСА ААА СТО ТСТ САС САС САС ТІ АСТ САС АСТ стТт соб АСС 636

Азп бек біу Пуз Ма1 бек б1и б10 Ніз Ів Зек бій Зег Ма! Сіу бек 180 185 190

ТС ТОТ бАА СБС САС ТТТ ОСА ДСА САВА СТІ СТТ САС ТАТ ТІТ ОТТО САТ 684

Рре Суб бій Акд Ні5 Ре б1у Аку біз Уа! Ма! Авр Туг Ре Маї Ар 195 200 205

ССА ТТІ СТА ОСТ ОСА АСА АСТ ОСА ОСА САТ ССА САС ТСА СТА ТСТ АТХ 132

Рхо Рпе Ма! Аїа сіу ТП; бек А1іа Сб1іу Авр Рго бій бех Ієїй бех Це 210 215 220

ОСТ САТ ОСА ТС ССА ОСА ТС ТОС ААТ ОТТО САА ДСА АВС ТАТ ССТ ТСА 780 Ге

Аха Ніз Аза Рпе Рго Аза Тей Тер Ап Іїеи Сі Абу Туз Тух біу Зег 225 230 235

СТІ АТТ СТІ ОСТ ОС АТС ТО ТСТ ААб СТА ССА ОСТ ААВА ОСТ САТ ОСА 828

Уаі І1е Уаї б1у Аза І1е тей бег Гуз Ів Аза Аза 1у5 б1у Авр Ро 253 745 250 255

СТА ААС АСА АСА САТ САТ ТСА ТСА СОС АЛА АСА АСС ЛАТ АСА ССА СТО 876

МУаі! Пуз Ток Агу Ніз Азр бег бек б1у Туз Агу Ага Ап Ахд Ага Маї («е) 260 265 270 й

ТОб ТтТтТ ТСА ТТТ САТ ОСТ ОСА АТО САб ТСА СТА АТА ААТ ОСА СТІ САС 924 со

Фет Рпе Зех Рпе Ніз Сі1у б1у Мес Сіп бек Іеип І1е Азп Аіа їеи Ні5 275 280 285 ю

ААТ САЛА СТТ ОСА САТ САТ ААТ СТО ВАС ОСТТ ОСТ АСА САЛА Сто ТТ ТСА 972

Авп бій Ма1ї біу Азр Ар Ап Ма! Туз Тец Сіу Тк бій Ма) Тез Бех 290 295 збо с

ТТО ОСА ТСТ АСА ТТ САТ ОСА СТТ ОСТ ОСА СТА СОС ВОС ТОб ТСА АТТ 1020 рч-

Зо Тем Аїа Суз Тк Рпе Азр біу Ма! Рго А1а Іги С1у АкЧ4 Тер бек І1е 305 310 315

ТСТ ТТ САТ ТО АМС САТ АОС ОСТ САС ДАС САС ОСТІ ОСТ АСТ ААС САА 1068

Бек Маії Авр бех Пув Авр бек Сіу АБр Гуз Ар Тео Аза бек Ап біп 320 325 330 335 «

ДОС ТТТ САТ ОСТ СТТ АТА АТО АСА ОСТ ССА ТТ ТСА ААТ СІС Со до 116

Тк Рпе Азр А1а Уа! І1е Мес Тйг Аза Рго Ієи» бек А5п Ма1 Агу Вк в зо 345 350 с АТО ААБ ТТС АСС АВА ОСТ ОСА ОСТ ССО СТІ СТІ СТІ САС ОТ СТІ ССТ 1164

Мес Ппуз Рре Тік Туз б1у С1у Аїа Рго Ма! Маі Іес Азр Рпе Ігєп Рхго в! з» 355 360 365 п

ААС АТО САТ ТАТ СТА ССА СТА ТСТ СТО АТО СТ АСТ ОСТ ТТ ААО ВАб 1212

Туз Мес Азр Туг ей Рго Тео бек Ієм Мес уаї Ті: Аїа Ре Туз ув 370 375 80

САТ САТ СТО ААС АЛА ССТ СТО САА СА ТТТ 005 СТО ТТА АТА ССТ ТАС 1260 -і Азр Ар Маї Цуз Гуз Рхо Гей біп б1у Рпе біу Ма! Тей Те Рго Туг 385 390 395 -й

ААБ БАА САС САА ААА САТ ОСТ СТО АЛЛА АСС ОСТІ боб АСТ СТО ТТ ТОС 1308

Буз бій біп біп Тув Ні б1у Ієп Гуз Твпгоїез біу ТВт Тей Ре бег 1 400 405 410 415

ТСА АТО АТО ТС ОСА САТ ОСА ОСТ ОСТ САТ САС ОСАА ТАТ ТТА ТАТ СА 1356

Ге) Зек Меє Меє Ре Рго Авр Аг А1а Рго Авр Азр Сіп Тук Іей Тук ТВг 420 425 430 42) АСА ТТТ СТТ ОСб ОСТ СС САС ДАТ АСА САТ СТТ ОСТ ОБА ССТ ССА СС 1404

Тік Ре Маї біу Сіу Бех Ніз Ап Акд Ар Тем Аа біу А1а Рто Тк 435 440 445

ТСТ АТІ СТО ААА САА СТІ СТО ДОС СТ САС СТТ ААА ВАА СТО то СОС 1452

Зек Пе Те Гуз біп Іги Маії Тих бек Азр ем Гуз Туз ей Ів С1У 450 455 460

ГФ) СТА САб боб САА ССА АСТ ТТТ СТО ААб САТ СТА ТАС ОТОб ОСА ААТ ССТ 1500 мах бій біу біп Рсо Тпг Рпе Ма! цуз Піз Ма! Туг Ткр С1іу Азп Віза

ГІ 465 470 415 о 60 бо

ТТТ ССТ ТТб ТАТ 9 САТ САТ ТАТ АСТ ОТСТ СТА ТТО САА ОСТ АТА СА 1548

Рпе Рго Теп Тук біу Віз А5р Туг бек Бек Ма! ей бій Аіз І1їе б3ий 480 185 450 495 :

ААС АТО САС ААА ААСОСТТ ССА боб ТС ТІС ТАС СА СбА ВАТ АБС Адо 1596

Ццуз Ме бі Туз Ахп Тем Рго біу Рйе Рпе Тут Аїа б1іу Азп бек Цув 500 505 510

САТ бос СТТ ОСТ СТІ ОСА АСТ СТІ АТА ОСТ ТСА СА АБС ААб СТ ОСТ 1644

Азор сіу ем Аїа Маї біу бек Маї 116 Аїа бег б1іу Бек цуз діа Аа 515 520 525

САС СТТ СА АТС ОТСА ТАТ СТТОСАА ТСТ САС АСС ААС САТ ААТ ДАТ ТСА 1692

Азрієм Аїа І1е бек Тук Ієо бід бЗег Нів Тпг Гуз Ніз Авп Авп бег - 530 535 540

САТ ТСАВАСТОТС ТСАССТАТОС ТСТАОСАСТТ СТОСАСАААТ ТТСТОСАЄТ 1745 нів 515

САТСТАСАЗІ АСАААСОСАТ СССТТОСАОТ ТТСАСАВСАТ СТТСАСТІСТ ТСАСАТАТТА 1805

АСОСТТОСТТ СААСАТОСАС САСААМОСТА СТСАСАТСТО ТААСТОССАА АКТОАСОГТА, 1865

ААМАСТАТТА ТОСОООСССА ААТСТТОСТІ ТТТОТТТТОС ТСАСААСТОС ССТАОБАСАС 1925

ТІСАТСТІСо АААТАСАТТТ АААТТІСТІС ВАТТСТІТСА СААСАСАТОС СТОАССТСОТА 1985

АТАТТТСОСТ АТТСТСАТТІ ТАССАСТАСТ СТТОСОСАСА ТТАТОСТТТА ССОСТТТААА 02045

ААРАААААВА АЛААВА 2061 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 8: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 544 аминокислоть (В) ТИП: аминокислота (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ: протеин с (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 8: г)

Мес Ієц Аза Те Тс Аза бег А1а бек бЗег Аза ет Зесг Ніх Рхо Тухг 1 5 10 15

Агд Ніз А1а бек А1а Ніз ТЬх Агу Акд Рго Аго Ієм Аку А12 Ма1 Гей 20 25 3: (Се)

Аіа мес Аза біу бек Азр Азр Рго Агуд діа Аза Рко Аза Ако бег Ма1

Гео)

Аїа маї маї біу Аза біу Ма! бек біу Геш Аіа Аза Кіа Тук Ага єм ою за 55 50

Ак біп бЗег біу Маї А5п Уаї Тпг Ма1 Рпе біш Аза Аза Азр Ахд Ма чи 65 70 75 80 35 Ф1у 01у Туз 112 Аку Тк Азп Бек бій біу біу Рбе Уа1 Тур Ар 61 - 85 90 з5 біу А1їа Аза ТвгоМеє Тйг біо бі1у 0) Трр біз Аза бег Аку 1620 І16 ши) 105 110 «

Азр Взр іє біу Те біп Ар Ту біп біп Туг Ркго Азп бек біп Нів 115 120 125 -о 40 с цуз Акад о Тук Ше Уаї уз Авр бІу Аза Ркго Аїа їжи І1е Рко беї Ар 130 135 140 :з» Рго І1е баг їеп Мес Ту бек Бех Маї ги бек Твг Бує бек Туз Пе 145 150 155 160

Аза тез Ре Рпе біл Рго Рбе Іеш Туг Був Буз Аза Авп Тв Ага А5п 45 165 у 115

Ш- Бек біу Цуз Ма! бек 014 сш Ні5 їеш бе біц бек Уа! біу бек Рпе 180 185 190 -й

Суз сім Вку нів Рпе біу йхо біз Ма1ї Ма1і Авр Тук Рпе Маї АБр Рко сл 195 200 205

Рпе уаї Аза біу Трх бег Аїа с1у Дер Рго бій бек Івю бех Ше Ага (95) 210 215 220

Я») Нів Аа Рпе Рго Аза Кеш Тур Азп Тез бій Асу Буз Тут С1у бег Уві 225 230 235 240

Іїе Маї біу Аа І1е Тем Зег туз Те) Аїа Аза Іу5 біу д5р Рко Уаї. 245 250 755 25 :

Гуз Трх Агу Нів Азр Бех бег біу ГБув Ако Ага АБп Ак Ак Ма) бет

ГФ! 260 265 270

Рпе бех Рре Нів Сіу Сіу Мес біп бЗех Іо І1е Ап Аза Те» Нів Азп ко 215 280 285 біш маї б1у Азр Азр Азп Ма! уз Пец біу Тйх бій уаї тей бек Іво 290 295 00 60 іа Суз Трг Рпе Ар біу Уа1 Рго Аїз їеи С1у Аху Тур бек І1е бек 305 310 315 320 бо маї Авр бек Буз Азр бех біу Азр Гуз Азр Теч Аіа бег Авп біп Трах 325 330 335

Рпе Ар Аїа Маї І1е Мес ТВх А1а Рго Гей бек Азп Ма) Акд Акд Мес 340 345 350

Туз Рпе ТПг Гуз б1у б1у вза Рго Уаї Маї Тем АБр РБе тео Рко Цуз 355 360 365

Мес АБр Тук Іви Рго Іем Зег Тео Мес Ма! ТПг Аза Рбе уз був Ар 370 375 зво

Авр Маї Буз Буз Рго Ім бімш Сіу Ре Сіу чаї Тео І1е Рго Тук ув 385. 390 395 400 бій біп біп Гуз Ніз б1іу Ієц Цуз ТВ Тем б1у Тбг Тез Ре бек бех 405 410 415

Ме Мес рпе Рго дер Аку Аїа Рго Азр Ар біп Тук Іем Тух Тс Тіг 420 425 430

Рпе маї біу біу бек Ніз Азп Акд Азр Теп Аза біу А1а Рхо ТЬг бег 435 440 445

Іїе Тез Гуз біл Ге Уа! Так обег Авр Ієй Пуз цу Гем Гео б1іу Маї 450 455 4650 біз біу біп Рко Тах Ре Уа) Цуб Ніє Маї Тук Ткр С1у АБп Віа Рре 465 470 475 480

Рко Пец Тухг Сіу Ні5 А5р Тух бег Бек Уаї Те бід Аза Ге бій Буз 485 аз0 495

Мекс біс Гуз Азп їви Рго біу Рбе РБе Тук Ага б1у Азп бек Буз Авр 500 505 510 біу Тео Віа Маї Сіу бег Ма! І1є А1а бек б1у бех Шуз Аза Аїа Ар се 515 520 525 7 о

Тез А1а І1їе бек Тут Іви 0) бек Ніз Тіт Гуз Ніб5 Ап Азп бек Ні 530 535 540 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 9: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (Се) (А) ДЛИНА: 1697 пар оснований . со (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная ІФ) (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная - (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: кКДНнК (ії) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет ї- (м) АНТИСМЬІСЛ: нет (іх) ПРИЗНАК: (А) ИМЯ/КЛЮЧ: СО « (В) ПОЛОЖЕНИЕ: 29...1501 (0) ПРОЧАЯ ИНФОРМАЦИЯ: /поїе-"кКДНК Ргоїох-3 дрожжей; последовательность из РУУЮОС-5" - с (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 9:

ТТСССАТТТО ССТІСААССА АСААТТСТ АТО ТСА АТТ ССА АТТ ТС ОСА ОСА 52 ч » Ме бек І1е Аїа Пе Сув біу б1у п 1 5

ССТ АТА ССТ Об СТТ АСТ АСА ОСА ТТТ ТАТ СТІ ОСТ АБА ТО АТТ ОСА 100 с1у І1е Аїа біу єм Зех Тіг А1а РБе Тух Гей Аза Аку Тем І1е Ро 10 15 20 -і ААА ТСТ АСТ АТТ САТ ТІС ТАС САА ААА ОСТ ССТ ОСТ ТТА ОСТ ОБбА ТО 148

Туз Сув Тпх 116 А5р Тез Тух бі був б1у Рго Акад їей б1у б1у Тр - 25 Зо 35 40

СТ САС ТОБ СТО АВА АТС СОС ТСТ ОСА САТ ТСТ ССА АСА СбА Со СТ 196 1 Іеч біп Бег Ма! Цув І1е Рго Суз А1а Ар бех Рко Тйх біу Трг Ма1ї 45 0 55 о 20 ТТС ТІТ САС САА СОТ ОСТ АСА АСТ СТТ ОСТ ССТ ОСТ бос стт бст бос 248

Іеа Рпе бі Сіл б1у Ркго Агд Тпг Тем Агу Рго А1іа б1у Маї Аза сіу

Ф 60 55 70

ТТА ОСА ААС ОТТА САТ ТТА АТТ АС ЛА ТТо СОС АТС САА САС КАС То 292

Тец А1а Аза Іечп Азр Тез І1е бек уз Те С1у І1е бій Ар Був Іей 75 во 85

ТТА АОС АТТ ТОб АСС ААТ ТСТ СОС АСС ОСА ААА ААС ОСА ТАТ АТТ ТАТ 340 іїез Акд І1е Бех Зек Азп бег Рго бек А1а Гуз Авп Акд Тухо І1е Туг 90 95 100

Ф, ТАС ССА САТ СОС ТТА ААТ СВА АТТ ОСТ ТСА АБС АТТ ТТА боб АСТ АТА 388

Тук Рго Азр Акд Теч Азп біш І1е Рго бег бек І1е Гео біу бек Пе ко 105 110 115 120

АВС ТОб ВТТ АТО САС ССТ ОСТ ТТ СбТ соб АТО ОСТ ОТТО ОСТ АТО АТО 436 во Муз Бек І1е Мес біп Рго А1а Тем Ак Рго Мес Рко ІТеи Аїа Мес Меє 125 130 135 б5

СТ САБО СОС ТТ ОСТ ААА ЛОТ АМО ССА САТ ТОО ЛСА САТ САА АСС СТО 484

Тем бі Рко Ріпе Ако Цуз бег Туз Аку Ар Зек Тк Азр Сій бек Уаї 110 145 150

ОСТ ТСА ТТТ АТО АСА АСА АСА ТТТ СОТ ААА ААС ОСТІ АСО САТ АСА СТІ 532 сіу бек Рбе Мес Агд Ах Аку Ре Сіу Туз Азп Маї Тік Азр Акд Уаї 155 160 165

АТО АСТ ОСА АТО АТА ДАТ ССТ ВАТТ ТАТ ССТ ОСТ САТ ТРОС ААТ САТ ТІ 580

Мес Бек Аза Мес Ії Ахп б1іу І1е Тух Аза біу Азр Тей Азп Азр Тем 170 175 180

ТСТ АТО САТ ТСТ АбС АТО ТТТ ОСА ТІЇ ТТА Об ВААС АТІ САА АВА ААб 628

Зек Ме Нів бег бек Мес Рпе С1у Ре Івц Аїа Був І1е біш уз уз 185 190 195 200

ТАТ ОСА ААС АТТ АСТ ТТО ОБА ТТА АТТ МСА ОСТ СТІ СТТ ОСА ОСТ ЄМА 616

Тук Б1у Азп ІЗе ТВх Іги С1у Іст Ізе Аку Аїа Ів їси Аза Ахд Сі 205 210 215

АТА ТТА ТСТ ОСТ ОСТ САС ДАХ ОСТ ТТ САА ДСС АСС АСТ АСТ СОС АСА 724

Іїе Тез бех Рко Ма Сі Туз Айа Тем бій бек бег Тіт Тах Ага Асо 220 225 230

СОС ААА ДАС АБС АСА ОСТ СТО ВА! САС ТАТ САА АТС САС АВС ТАТ СТІ 712

Віа цуз АБп о бегт Ако Аіа Маї Цуз біп Тух бі І1е Ар Гуз Тух Чаї 235 240 245

ОСТ ТТС ААб САА СО АТТ САб АСТ АТТ АСА ТТО ТСА АТА ОСА САТ СА 820

Аза Рпе Гуз біч б1у Це бій ТПх Пе Тпх Темп Бех Ше А1а Ар БІ 250 255 260

ТІА ААА ААА АТС СОС ААТ СТО ААб АТА САТ СТА АВС ОААА СОС БОС САД 868

Іеа Цуз Був Мес Рго Азп Маї Іуз І1е Ні5 Темп Азп Гуз Рго Аза 611 265 210 215 280

АСТ ТТ СТТ ССА САТ АЛА АСТ САС ТСТ ОСТТ СТА САС СТО ААТ ССТ САД 916

Тк їем Маїі Рго Ні5 Туз ТП біп бек Тен Маї Ар Уа1! Азп Сіу бій 285 290 295

ОСТ ТАС САС ТАТ СТТ СТО ТТТ ОСА ААСОТСТ ТСТ СОС ДАТ ТТА САС ВАТ 964

Аза Тут б1» Тук маї Уа! Рре Аїаз Ап бег бек Агд Ап Тем Сі Авл 00 305 310 Ге

СТА АТА ТСТ ТСТ ССТ АВА АТС САД АСТ СОС Лос ТОС АСТ СТТ ТАТ СТО міг о

Тем І1е бег Сув Рго Туз Меє бі Тік Рко Тк бек бек Маї Тук Уа1 315 320 325

СТС ААС СТІ ТАТ ТАТ ААС САС ССТ ВАТ СТ СТІ ССА АТС ССТ ОСТ ТТ 1060

Уаї Взп Маї Туг Тукг Муз АБо Рго Авп Ма) Іви Рко І1е Агу біу Ре 330 335 340 обо СТ ТО АТТ ССА ТСА ТОС АСТ ОСА ААТ ААТ ССО ААТ САТ СТІ СТІ 08

С1іу Пез ївец ІЗ1е Рго бек Суз ТЕ Рго Азп Азп Рго Азп Нів Уаї ей со 345 350 355 360 -

ОСТ АТС СТІ ТІТ САТ АСТ САС САА ААСОААС ССТ САА ВАТ ОСА АВС ААб 1156 іт) біу 112 Уа! Рне Ар Зек бій біп Ап Азп Рго бій Авп біу бек Був 365 370 315 че

СТО АСТ СТО АТО АТО БА 05 СТ ОСТ ТАТ АСА ААА ААТ АСТ ОТСТ ТТ 1204 ма1 Тр Маії Мес Меє б1у С1іу бег Аза Тух Тік Пуз Азп Тбх Зек Івеп у 380 385 390

ДТТ ССА АОС ЛАС СОС САА САЛА СОС СТІ ААСОААТ ОСТ СТО АВА ост то 1252

І1е Рхо ТВі Авп Рго біш бій Аза Маї Авп Азп діа Тем цув Аза Івгй 395 400 405

САС САТ АСТ ТТА АДА АТА ТОСОАСТ ААС ССА АСА СТО ДСС ОААТ ОСА АСА 1300 « біп Ні Тйх Іеч цуз І1е бек бех Цув Рго ТВг Тем ТП Аєп Аза Тих 410 415 420 - с ТІА САА ССА ДАТ ТОС АТС ССТ САА ТАТ ССТ СТТ ббб САТ САА САТ ААТ 1348

Теи біп Рго АбпоСуз І1е Рко біп Тух Аку Ма) б1у Ніз біп Ар Азп ч 425 430 435 440 "» СТІ ВАТ ТСТ ТТ АДА ТСТ ТОО АГТТ САС ААА ААТ АТО СБА Сб ОБА АТТ 1396

Іво Ази Зег Тез Був бек Тгр І1є біш Гуз Азп Ме б1у біу Акд Т1є 445 450 455

СТІ СТА АСТ СОА АСТ ТОС ТАТ ДАТ ОСТ СТІ АСТІ АТТ боб САТ СТ АТТ 1444 -І Тем Іви Трх біу бек Тер Тук Авп Сіу Уа! бег ї1е Сіу Авр Сув Те 460 465 470 ря ч АТО ААТ ССА САТ ТСА АСА ОСТ ОСА АВА СТА ССА ТСА ТТО АТО ВАТ ТСТ 1592 мес Азп біу Ніз бек Тк Аіа Аку Гуз Тез Аїа бек Гей Меб А5п бек 475 480 485

ТСТ ТСТ ТОАСОСТІТА ТАААТСТТСА ТАТААААТТА СТАТАТАСТТ ССТІТСАТТА 1548

Бег бек (95) 490 4») ТІТТАТСАСТ ТОААААТОСС АСТІСТОДАА ТААТІТТОСА САВОСОСТІТ ТАТТАСАСАС 1608

СТАТАТОССА СОАСАТТОСА САВАССТТТО ААЛАТТААЛАВ ТСАТАТОССТ ТТТАССТІВА 1668

САСАТСААСС ТСАТСЛАТАА ТЛАЛАТТТТ 1697 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 10:

ГФ) () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 490 аминокислот ді (В) ТИП: аминокислота (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная 6о (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: протеин (хі) ОПИСАНИЄ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 10: б5

Мес бек І1е Аіа 112 Су біу біу б1іу 116 Аза С1у Ім бек Тих Аа 1 З 10 15

Ре Тук Іец Аїа Агд Тей Г1е Рго Гуз Су5 Тпг І1е Авр Те Туг Січ 20 25 30

Туз Сіу Рго Ахуд Тез біу б)у Тер Тез біп бек Маіїі Буз Це Рхо Суз 35 40 45

Аіа А5р бек Рго Тк біу Тс Уаї Іеп Ре б1іш біп б1іу Рго Акд Тв за 55 60

Іеп Агд Рго Аза Сіу Ма) Аза С1іу Тем Аза Азп їеш А5р Тел ЇТ1е бег 55 70 75 89 цув ем бі Те бій Ар Цув їеу Іви Акад ї1е бех беп Авп беб Рго 85 90 95

Зек А1а Туз Авп Агуд Туг Ге Тух Тут Рго Азр Аг Іеи Авп бій І1е 100 105 по

Рхо бек Бех І1е Тем біу бех І1е Гуз Бех І1е Мес сіп Рго Аза їви 115 120 125

Ага Рго Мек Рро Дец Аіїа Мес Меб Те б10 Рго Ріе АкЯ Гуз бех Ту5 130 135 150

Ага Азр бек Тіт Азр біо бек Ма! біу Зег Ре Меї Агд Агу Ага Ре 145 150 155 160 біу пу Авп Ма! Так Ар Ато Уа! Мес бек Аза Меє І1е Ави С1у Те 165 170 75

Туг Аза біу А5р їєш АБп АБр Тем бек Мес Ні бек бек Меї Рпе б1у 180 185 159

Рпе реч Аіїа Пуз Ї1е біб цуз Цуз Тук б1у Взп К1е Тіг Іви б1у Іеч с 195 200 205 о тіе Ак Аїа ІТец без Аза Ага бій І1є Гео бек Рго Аза Сіш Був Аа 210 215 220 їем біо Бех бег Так ТНК Аго Ако А1і3 Буб Ап бех Аку Аза маї ув 225 230 235 240 (Се) біп Туг біш Іїе АЛер Гув Тух Ма! ва Рйе ПЦуз білі Біу Це біо Так 245 250 255 ме)

І1а Тпх Тез Зег ї16е Аїа Авр сіш Геш Гуз Туз Мес Рго Азп Ма! Гуз ІС 250 265 20

І1е Нів Іец Авп уз Рго Аїа біл Таг Тем ма) Рко Ніз Гу Тк Сіл -- 215 280 285 о

Бесг Ієц Маї Азр Маї Азп біу біп А1а Тук біо Тус Уа! Ма1 Рпе А1а 290 295 зо0

Авп о бег бЗех Агу Азп ГПєм бій Аза їв Те бег Суз Рко Гу Меї біч 305 310 315 320 «

ТвЬг о Рго Тг бег Зек Уаї Туг Ма) УМаї Азп Ма! Тук Тук Іув А5р Рго 325 330 335 - с Авп маї 12» Рко І16 Аку С1у Рйе С1у со Іеч І1е Рко Зег Сув Тк 340 345 350 ;» щі Вко Ап АзпоРко Азп о Ніз Уаії Тей біу І1е Уаї Рце Авр бек біз біп 355 360 365

АБп Авп Рко бій Ава б1іу бек Пуз ма1! Так Маї Меб Мес біу б1у бек 370 375 З80 -

Аза Тук ТПгоГув Аєп Тптх о бЗеготечз 11е Рго Тбг о Азп Рго бі 0) Аза р. У 385 390 395 200 с Уаі Азп АБп Аза Іву їу5 Аза їем біл Нів ТБк о Теи Гу І16 бек бех 405 410 415

ОО 20 цуз Рго ТП оТец ТпгоАзп А1а Твх Те) біп Рго Азп Сув І1е Рго Сіпй 420 425 430 0 Тук Ах Ма)! бі1іу Ні5 біп Азр Авп тей Абп о бех їм Гуз бек Тур К1е 435 440 42445 бій Бу АвпоМеб біу Сіу Аку 116 Іей їемй Тйгобіу Бех Тер Тук А5п 450 455 460 біу Ма! бек І1е Сіу Азр Суз Те Мес Азп Сіу Ніз бек Тах Аза Агу

ГФ) 465 470 415 4во ке Був їец Аїа бек Іви Мес доп бех бек бек 485 490 60 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 11: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 41 пара оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная бо (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная -Д7-

(ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеийновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: олигонуклеотид, применяемьйй для конструирования рСОМ1761ЕМХ (ії ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (м) АНТИСМЬІСЛ: нет (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 11:

ААТТАТОАСО ТААСОТАОСА АТТАОСООСС СОСТСТСОАО т (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 12: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 70 (А) ДЛИНА: 40 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеийновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: олигонуклеотид, применяемьйй для конструирования рСОМ1761ЕМХ (ії ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (м) АНТИСМЬІСЛ: нет (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО І МО:12:

ААТТАСТСООА САДОСОСССОС СААТТССТАС СТТАСОТСАТ

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 13: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 31 пара оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная сч (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеийновая кислота і) (А) ОПИСАНИЕ: праймер 5ОМО003, применяемьй для конструирования реОс10 (її) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (м) АНТИСМЬІСЛ: нет «о зо (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 13:

СТСОБАТССАССАСАТТСОАДАСААОСТАСАО і, (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 14: ю () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 31 пара оснований -- (В) ТИП: нуклеиновая кислота ї- (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеийновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: праймер 5ОМО004, применяемьй для конструирования реОс10 « (ії ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет в с (м) АНТИСМЬІСЛ: нет

Й (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 14: и? АСОСОСАТССААСТТССТАОСТОАААААТОСО (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 15: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: -І (А) ДЛИНА: 26 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота - (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная с (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеийновая кислота о (А) ОПИСАНИЕ: праймер 5ОМО0031, применяемьй для конструирования рОос19

Ф (її) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (м) АНТИСМЬІСЛ: нет (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 15: 5Б САТОАСОСАСТОАССАСССОСОСБАТС (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЗЕО ІО МО: 16: (Ф, () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ка (А) ДЛИНА: 24 парьї оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота во (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеийновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: праймер 5ОМО0010, применяемьй для конструирования рОос19 (ії ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет 65 (м) АНТИСМЬІСЛ: нет (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 16:

АССОСАТААСААТТТСАСАСАСОСА

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 17: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 24 парьї оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеийновая кислота 70 (А) ОПИСАНИЕ: праймер 5ОМО016, применяемьй для конструирования рОос19 (її) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (м) АНТИСМЬІСЛ: нет (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 17:

ССТАССАТООСССАСАТАСААСАСС

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЗЕО ІО МО: 18: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 23 парьї оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеийновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: праймер 5ОМО0017, применяемьй для конструирования рос19 (її) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет (м) АНТИСМЬІСЛ: нет с (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 18:

СОАСАОСТСОСАСТТСААССТТО і) (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 19: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 28 пар оснований «о зо (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная о (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная ю (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеийновая кислота (А) ОПИСАНИЕ: праймер 50ОМ0039, применяемьй для конструирования реОс30 -- (її) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет ча (м) АНТИСМЬІСЛ: нет (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО: 19:

СОАСАТОСТАСОТССТОТАСАААСССАСА

(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 5ЕО ІО МО: 20: « () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: в с (А) ДЛИНА: 24 парьї оснований . (В) ТИП: нуклеиновая кислота и?» (С) ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕПИ: одноцепочечная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ї) ТИП МОЛЕКУЛЬ!: другая нуклеийновая кислота -І (А) ОПИСАНИЕ: праймер 50М0041, применяемьй для конструирования реОс30 (її) ГИПОТЕТИЧНОСТЬ: нет - (м) АНТИСМЬІСЛ: нет с (хі) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІЮ МО: 20: с 50 АТСОСААСАССООСААСАСОСАТТС що

Claims (1)

1. Формула винаходу

   1. Вьіделенная молекула ДНК, которая кодирует протопорфириногеноксидазу, аминокислотная последовательность которой вьібрана из группьї, включающей 5ЕО ІО МО: 2,4,6, в и 10. (Ф) 2. Вьвіделенная молекула ДНК, которая кодирует протопорфириногеноксидазу, аминокислотная ГІ последовательность которой представлена в ЗЕО ІЮ МО: 2, где: а) аланин в положений 220 заменен на аминокислоту, вьібранную из группьї, включающей валин, треонин, во лейцин и цистейин; и/или б) глицин в положений 221 заменен на серин; и/или в) тирозин в положениий 426 заменен на аминокислоту, вьібранную из группьї, включающей цистеийн, изолейцин, лейцин, валин и треонин.

   З. Вьіделенная молекула ДНК по пункту 2, где аланин в положений 220 5ЕО ІО МО: 2 заменен на валин. 65 4. Вьіделенная молекула ДНК по пункту 2, где тирозин в положений 426 5ЕО ІО МО: 2 заменен на цистеин.

   5. Вьіделенная молекула ДНК, которая кодирует протопорфириногеноксидазу, аминокислотная последовательность которой представленная в ЗЕО ІЮО МО: 6, где: а) аланин в положений 166 5ЕО ІЮ МО: 6 заменен на валин; и/или б) г'лицин в положений 167 ЗЕО ІЮО МО: 6 заменен на серин; и/или в) тирозин в положений 372 ЗЕО ІО МО: 6 заменен на цистеин.

   6. Зкспрессионная кассета, которая содержит промотор, функционально связанньй с вьіделенной молекулой ДНК по любому из пунктов 1-5.

   7. Рекомбинантньй вектор, которьій содержит зкспрессионную кассету по пункту 6.

   8. Клетка-хозяин, стабильно трансформированная при помощи вектора по пункту 7, где указанная 7/0 клетка-хозяин способна зкспрессировать указанную молекулу ДНК.

   9. Растительная клетка, трансформированная молекулой ДНК по любому из пунктов 1-5, где указанная молекула ДНК способна зкспрессироваться в растительной клетке и придает растительной клетке устойчивость к гербициду в количествах, которне ингибируют встречающуюся в естественньїх условиях активность протокса.

   10. Растение, которое содержит клетку по пункту 9.

   11. Способ ополучения растения, устойчивого Кк гербицидам, которье ингибируют протопорфириногеноксидазу, которьій включает: а) получение зкспрессионной кассетьі, содержащей промотор, которьй активньйй в растений, функционально связанньій с последовательностью ДНК, которая кодирует протопорфириногеноксидазу, вьібранную из группь, включающей 5ЕО ІЮО МО: 2, 4, 6, 8 и 10 или молекулами ДНК, которне являются гомологичньіми им и селективно гибридизуются данньіми молекулами ДНК; б) трансформирование растительного материала зкспрессионной кассетой; и в) регенерацию растения из указанного растительного материала.

   12. Способ борьбьі с ростом нежелательной растительности, которьій включаєет обработку популяции растений по пункту 10 или полученньїх способом по пункту 11, и нежелательной растительности зффективньм с Количеством гербицида, которьій ингибирует протопорфириногеноксидазу.

   13. Применение последовательности ДНК, которая кодирует протопорфириногеноксидазу, вьібранную из і) группьї, включающей ЗЕ ІЮО МО: 2, 4, 6, 8 и 10 или молекул ДНК, которье являются гомологичнь!ми им и селективно гибридизуются данньми молекулами ДНК, для получения растений, устойчивьїх к гербицидам, которье ингибируют протопорфириногеноксидазу. «о ШИ | | | с со Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2004, М 12, 15.12.2004. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і ю науки України. «- і -

   - . и? -і - 1 (95) 4) іме) 60 б5 -БО0-