PL184242B1 - Izolowana cząsteczka DNA kodująca białko z organizmu eukariota mające aktywność protoporfirynogenu (protoks), cząsteczka DNA kodująca zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), chimerowy gen, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, komórka roślinna włączając w to jej potomstwo, sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji, sposób testowania związku chemicznego na zdolność hamowania enzymu protoks z rośliny, sposób selekcji roślin, tkanek roślinnych lub komórek roślinnych, sposób wytwarzania komórki gospodarza, sposób wytwarzania komórki roślinnej oraz sposób wytwarzania potomstwa z rośliny rodzicielskiej - Google Patents

Abstract

1. Izolowana czasteczka DNA kodujaca bialko z organizmu eukariota majace aktyw- nosc oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to czasteczka DNA zawiera sekwencje nukleotydowa selektywnie hybrydyzujaca z sekwencja nukleotydowa wybrana z grupy obejmujacej SEK NR ID 1 i 3. 9. Chimerowy gen zawierajacy promotor zdolny do funkcjonowania w roslinie lub komórce roslinnej, dolaczony w sposób funkcjonalny do i) czasteczki heterologicznego DNA kodujacej bialko z wyzszego eukariota, maja- ce aktywnosc oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to czasteczka DNA zawiera sekwencje nukleotydowa selektywnie hybrydyzujaca z sekwencja nukleotydowa wybrana z grupy obejmujacej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) czasteczki DNA kodujacej zmodyfikowana oksydaze protoporfirynogenu (pro- toks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancje na herbicyd w ilosci, która hamuje protoks eukariotyczny zawierajacy sekwencje aminokwasowa okre- slona jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierajacej alanine w pozycji 220, gli- cyne w pozycji 221 oraz tyrozyne w pozycji 426 w SEK NR ID 2. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka DNA kodująca białko z organizmu eukanota mająca aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks) oraz cząsteczka DNA kodująca zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks) i produkty inżynierii genetycznej z udziałem tych cząsteczek: chimerowy gen, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza i komórka roślinna włączając w to jej potomstwo oraz sposoby inżynierii genetycznej z udziałem tych cząsteczek, a mianowicie: sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji, sposób testowania związku chemicznego na zdolność hamowania enzymu protoks z rośliny, sposób selekcji roślin, tkanek roślinnych lub komórek roślinnych, sposób wytwarzania komórki gospodarza, sposób wytwarzania komórki roślinnej oraz sposób wytwarzania potomstwa z rośliny rodzicielskiej.

Wynalazek stosuje się do manipulowania aktywnością enzymatyczną odpowiedzialną za przekształcenie protoporfirynogenu IX w protoporfrynę IX w szlaku biosyntetycznym wspólnym dla wszystkich organizmów eukariotycznych. W jednym z aspektów, wynalazek stosuje się do opracowania oporności na herbicydy roślin, tkanek roślinnych i nasion. W innym aspekcie: do opracowania diagnostyki i leczenia braku takiej aktywności u zwierząt i u ludzi.

Szlaki biosyntetyczne, które prowadzą do wytwarzania chlorofilu i hemu mają wiele wspólnych etapów. Chlorofil jest gromadzącym światło pigmentem obecnym u wszystkich zielonych organizmów prowadzących fotosyntezę. Hem jest kofaktorem hemoglobiny, cytochromów, oksygenaz P-450 o złożonym działaniu, peroksydaz oraz katalaz (patrz np. Lehninger, Biochemistry. Worth Publishers, New York (1975)), a zarazem jest niezbędnym składnikiem wszystkich organizmów aerobowych.

Ostatnim wspólnym etapem biosyntezy chlorofilu i hemu jest utlenienie protoporfirynogenu IX do protoporfiryny IX. Oksydaza protopor firynogenu (określana tu jako „protoks”) jest enzymem, który katalizuje ten ostatni etap utleniania (Matringe et al., Biochem. J. 260 : 231 (1989)).

Enzym protoks został częściowo lub całkowicie oczyszczony z dużej liczby organizmów, włączając w to drożdże Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois and Labbe, W Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E.H. Dailey, ed. McGraw Hill: New York, str. 235-285 (1990)), etioplasty owsa (Jacobs and Jacobs, Biochem. J. 244: 219 (1987)), i mysią wątrobę (Dailey and Karr, Biochem. 26: 2697 (1987)). Geny kodujące protoks zostały wyizolowane z dwóch organizmów prokariotycznych, Escherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39:1155 (1993)) i Bacillus subtilis (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Geny te nie wykazują podobieństwa sekwencji, jak również ich przewidywane produkty białkowe nie wykazują jakiegokolwiek podobieństwa sekwencji aminokwasowej. Białko E. coli ma wielkość około 21 kD i jest związane z błoną komórkową. Białko B. subtilis o wielkości około 51 kD ma aktywność rozpuszczalną, cytoplazmatyczną.

184 242

W chwili obecnej zbyt mało wiadomo o enzymie protoks, aby możliwe było izolowanie genów kodujących protoks z wyższych organizmów eukariotycznych (tj. zwierząt, roślin i wszystkich innych wielokomórkowych zawierających jądra organizmów, innych niż niższe mikroorganizmy eukariotyczne, takie jak drożdże, jednokomórkowe glony, pierwotniaki itd.) stosując znane podejścia.

W szczególności, wiele ze standardowych technik izolacji nowych białek i genów opiera się na założeniu, że ich struktura pierwszorzędowa (tj. sekwencja aminokwasów i DNA) będzie wykazywać znaczące podobieństwo do znanych białek i genów, które mają taką samą funkcję. Takie standardowe techniki obejmują hybrydyzację kwasów nukleinowych i powielanie w reakcji łańcuchowej polimerazy przy zastosowaniu starterów oligonukleotydowych odpowiadających konserwowanym motywom w sekwencji aminokwasowej. Nie można się spodziewać przydatności tych technik do izolowania eukariotycznych genów protoks przy zastosowaniu obecnie dostępnej informacji o strukturze, która ogranicza się jedynie do prokariotycznych genów protoks, ponieważ nie ma podobieństwa strukturalnego nawet pomiędzy znanymi prokariotycznymi genami i białkami.

Inne podejście, które było stosowane do izolowania genów biosyntetycznych z innych szlaków metabolicznych z wyższych eukariontów polega na komplementacji mutantów mikroorganizmów z brakiem aktywności będącej przedmiotem zainteresowania. W takim podejściu biblioteka cDNA z wyższego eukarionta jest klonowana w wektorze, który może kierować ekspresją cDNA w mikroorganizmie będącym gospodarzem. Wektor jest następnie transformowany lub wprowadzany w inny sposób do zmutowanego mikroorganizmu i izoluje się kolonie, które fenotypowo nie są już mutantami.

Stratega ta powiodła się przy izolacji genów z wyższych eukariontów, które są związane z kilkoma drogami metabolicznymi, włączając w to biosyntezę histydyny (np. patent USA Nr 5290926 i WO 94/026909 dla Ward i wsp., włączony tu w całości jako odnośnik), biosyntezę lizyny (np. Frisch et al., Mol. Gen. Genet. 228: 287 (1991)), biosyntezę puryn (np. Aimi et al., J. Biol. Chem. 265: 9011 (1990)), oraz biosyntezę tryptofanu (np. Niyogi et al., Plant Celi 5:1011 (1993)). Jednakże pomimo dostępności mutantów mikroorganizmów, które, jak się uważa, są defektywne pod względem aktywności protoks (np. E. coli (Sasarman et al.,

J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) i Saccharomyces cerevijiae (Camadro et al,. Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)), zastosowanie tej techniki do izolowania cDNA kodujących eukariotyczną aktywność enzymatyczną protoks jest na podstawie dostępnych informacji co najmniej nieprzewidywalne.

Istnieje wiele przyczyn tego faktu. Po pierwsze, poziom ekspresji sekwencji cDNA eukariotycznego protoks może nie być odpowiedni w zmutowanym mikroorganizmie, na przykład z powodu użycia kodonów, pozostającego w niezgodzie z preferencjami użycia w mikroorganizmie będącym gospodarzem. Po drugie, pierwotny produkt translacji sklonowanej eukariotycznej sekwencji kodującej może nie wytwarzać funkcjonalnego polipeptydu, na przykład, gdy aktywność wymaga posltransla^cyjnej modyfikacji, takiej jak glikozylacja, która nie jest przeprowadzana przez mikroorganizm. Po trzecie białko eukariotyczne może nie przyjmować aktywnej konformacji w mikroorganizmie będącym gospodarzem, np. gdy białko jest normalnie kierowane do specyficznego systemu błon organellamych, których nie posiada mikroorganizm będący gospodarzem. Ta ostatnia możliwość jest szczególnie prawdopodobna dla roślinnego enzymu protoks, który jest związany w komórce roślinnej z organellami nieobecnymi w mikroorganizmach, będących gospodarzami w teście komplementacji. W szczególności roślinny enzym protoks jest związany zarówno z błoną zewnętrzną chloroplastu, jak i błonami tylakoidu (Matringe et al., J. Biol. Chem. 267:4646 (1992) i prawdopodobnie dociera do tego systemu membran w rezultacie postfranslacyjnego mechanizmu transportu, obejmującego zarówno N-końcową sekwencję kierującą jak i własności samego dojrzałego polipeptydu (patrz np. Kohom and Tobin, Plant Celi 1:159 (1989); Li et al., Plant Celi 3: 709 (1991); Li et al., J. Biol. Chem. 267:18999 (1992)).

Wiadomo, że enzym protoks odgrywa rolę w pewnych przypadkach chorób ludzkich. Pacjenci cierpiący na różnorodne porfirię, autosomalną chorobę dominującą, charakteryzującą

184 242 się zarówno symptomami neuropsychiatrycznymi, jak i defektami skóry, uzależnioną od wzrostu poziomu aktywności protoks (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med 302: 765 (1980)). Wskutek braku wiedzy odnośnie ludzkiego enzymu protoks i odpowiadającego mu genu, możliwości diagnostyki i leczenia tej choroby są w chwili obecnej bardzo ograniczone.

Stosowanie herbicydów do kontrolowania niepożądanej wegetacji, takiej jak chwasty lub rośliny na zbiorach, stało się nieomalże powszechną praktyką. Związane z tym wydatki przekraczają rocznie bilion dolarów. Pomimo intensywnego stosowania, utrzymywanie pod kontrolą chwastów pozostaje znaczącym i kosztownym problemem dla rolników.

Skuteczne użycie herbicydów wymaga rozsądnego postępowania. Przykładowo, czas i sposób zastosowania oraz stadium rozwojowe chwastów są krytyczne dla uzyskania dobrej kontroli chwastów poprzez herbicydy. Ponieważ różne gatunki chwastów są oporne na herbicydy, wytwarzanie skutecznych herbicydów staje się coraz ważniejsze.

Niestety, herbicydy, które wykazują większą moc, szerszy zasięg działania wobec chwastów i szybszy rozpad w glebie, mogą mieć również większą fitotoksyczność dla upraw. Jednym z rozwiązań stosowanych w takim przypadku było wytworzenie roślin uprawnych, które są oporne lub tolerują herbicydy. Hybrydowe rośliny uprawne lub odmiany oporne na herbicydy umożliwiły użycie herbicydu w uprawach, w których jego użycie było uprzednio wykluczone lub ograniczone (np. do stosowania przed-zagrożeniowego) wskutek wrażliwości uprawy na herbicyd. Przykładowo Patent USA Nr 4,761,373 dla Anderson i wsp. odnosi się do roślin opornych na różnorodne herbicydy imidazolinonowe lub sulfonamidowe. Oporność jest uzyskiwana poprzez zmieniony enzym syntazę kwasu hydroksyoctowego (AHAS). Patent USA Nr 4,975,374 dla Goodmana i wsp. dotyczy komórek roślinnych i roślin zawierających gen kodujący zmutowaną syntetazę glutaminy (GS) oporną na hamowanie przez herbicydy, o których wiadomo, że hamują GS, np. fosfinotrycynę i sulfoksyminę metioniny. Patent USA Nr 5,013,659 dla Bedbrooka i wsp. dotyczy roślin, w których następuje ekspresja zmutowanej syntazy acetylomleczanowej, co czyni roślinę oporną na hamowanie przez herbicydy sulfonylomoczmkowe. Patent USA Nr 5,162,602 dla Somersa i wsp. opisuje rośliny wykazujące tolerancję wobec hamowania przez herbicydy: cykloheksanedion i kwas arylooksyfenoksypropionowy. Tolerancja jest wynikiem zmienionej karborsylazy acetylokoenzymu A (ACCazy).

Enzym protoks służy jako cel dla wielu związków będących herbicydami. Herbicydy, które hamują protoks obejmują wiele różniących się strukturalnie klas cząsteczek (Duke et al., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)). Herbicydy takie obejmują difenyloetery {np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluorometylo)fenoksy]-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfiuorfen, 2-chloro-1-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen)}, oksydiazole, (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(l-metyloetoksy)fenylo]-5-( 1,1 -dimetyloetylo)-1,3,4-oksadiazol-2-(3H)-on, cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargiloksyfenylo)-3,4,5,6-tetrahydroltalimid; chloroftalim, N-(4-chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), fenylopirazole (np. TNPP-etyl, 2-[l-(2,3,4-trichlorofenylo)-4-nitropirazolilo-5-oksy]propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydyny (np. LS 82-556) oraz fenopilan i jego analogi O-fenylopir-rolidynowe i piperydynokarbaminowe. Wiele z tych związków kompetytywnie hamuje normalną reakcję katalizowaną przez enzym, działając jako analogi substratów.

Przewidywany sposób działania herbicydów hamujących protoks obejmuje akumulację protoporfirynogenu IX w chloroplastach. Uważa się, że akumulacja ta prowadzi do wyciekania protoporfirynogenu do cytoplazmy, gdzie jest on utleniany przez aktywność peroksydazy do protoporfiryny IX. Gdy protoporfiryna IX jest wystawiona na działanie światła, może powodować wytwarzanie singletowego tlenu w cytozolu. Ten singletowy tlen może z kolei prowadzić do powstania innych aktywnych związków tlenu, które powodują peroksydację tłuszczy i uszkodzenie błony, prowadząc do gwałtownej śmierci komórki (Lee et al., Plant Physiol.102: 881 (1993).

Nie wszystkie enzymy protoks są wrażliwe na herbicydy, które hamują roślinne enzymy protoks. Zarówno enzymy proteks kodowane przez geny izolowane z Escherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39:1155 (1993), jak i Bacillus subtilis (Dailey et al., J. Biol.

184 242

Chem. 269: 813 (1994) są oporne na hamowanie przez herbicydy. Ponadto, opisano mutanty jednokomórkowych glonów Chlamydomonas reinhardtii oporne na fenyloimidowy herbicyd S-23142 (Kataoka et al., J. Pesticide Sci. 15: 449 (1990); Shibata et al., W Research in Photosynthesis, Vol.III; N. Murata, ed. Kluwer: Netherlands. str. 567-570 (1992)). Co najmniej jeden z takich mutantów okazał się mieć zmienioną aktywność protoks, która jest oporna nie tylko na herbicyd, na który mutant był wyselekcjonowany, ale również na inne klasy inhibitorów protoks (Oshio et al., Z. Naturforsch. 48c: 339 (1993); Sato et al., W ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C. (1994)). Opisano również linię komórkową mutanta tytoniu, która jest oporna na inhibitor S21432 (Che et al., Z. Naturforsch. 48c: 350 (1993).

Według wynalazku izolowana cząsteczka DNA koduje białko z organizmu eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks) i cząsteczka ta zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3.

Korzystnie według wynalazku eukariotą jest gatunek Arabidopsis, kodowane białko obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEK NR ID 2 i 4, a cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3.

Według wynalazku cząsteczka DNA koduje zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ED 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu, wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2.

Korzystnie według wynalazku alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę, glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę, a tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę.

Zgodnie z wynalazkiem chimerowy gen zawiera promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, który jest dołączony w sposób funkcjonalny do

i) cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota, mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2.

Korzystnie według wynalazku chimerowy gen zawiera promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3, przy czym korzystnie eukariotąjest gatunek Arabidopsis.

Równie korzystnie według wynalazku chimerowy gen zawiera promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220,

184 242 glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ED 2 z tym, że korzystnie alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę, glicyna w pozycji 221 jest korzystnie zastąpiona przez serynę, a tyrozyna w pozycji 426 jest korzystnie zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę.

Korzystnie chimerowy gen według wynalazku zawiera promotor, który jest aktywny w roślinie i korzystnie gen ten dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, zdolną do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do chloroplastu, albo zdolną do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do mitochondrium.

Korzystnie chimerowy gen według wynalazku jest częścią genomu roślinnego.

Zrekombinowany wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera chimerowy gen z promotorem zdolnym do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączonym w sposób funkcjonalny do

i) cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2.

Korzystnie zrekombinowany wektor według wynalazku ma promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3, a eukariotą korzystnie jest gatunek Arabidopsis.

Korzystnie zrekombinowany wektor według wynalazku ma promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2 z tym, że korzystnie alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę, glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę, a tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę.

Zrekombinowany wektor według wynalazku jest korzystnie zdolny do stabilnej transformacji w komórce roślinnej.

Komórka gospodarza według wynalazku zawiera chimerowy gen mający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do

i) cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK

184 242

NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR iD 2, z tym, że komórka gospodarza jest zdolna do ekspresji kodującej cząsteczki DNA.

Korzystnie komórka gospodarza ma promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), przy czym cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID li 3, zaś eukariotąjest korzystnie gatunek Arabidopsis.

Równie korzystnie komórka gospodarza według wynalazku ma promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR iD 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR iD 2 z tym, że alanina w pozycji 220 jest korzystnie zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę, glicyna w pozycji 221 jest korzystnie zastąpiona przez serynę, a tyrozyna w pozycji 426 jest korzystnie zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę.

Komórka gospodarza według wynalazku jest korzystnie wybrana z grupy obejmującej komórki roślinne, komórki bakteryjne, komórki drożdży i komórki owada.

Według wynalazku komórka roślinna włączając w to jej potomstwo zawiera chimerowy gen mający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do

i) cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID li 3 lub ii) cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR iD 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR iD 2, z tym, że kodująca cząsteczka DNA podlega ekspresji w roślinie i nadaje, odpowiednio roślinie i komórce roślinnej, tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje naturalnie występującą aktywność protoks.

Korzystnie komórka roślinna według wynalazku ma promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID li 3, przy czym korzystnie eukariotąjest gatunek Arabidopsis.

Komórka roślinna według wynalazku równie korzystnie ma promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki dNa, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową. określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2 z tym, że alanina w pozycji 220 jest korzystnie zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę,

184 242 leucynę, cysteinę i tyrozynę, glicyna w pozycji 221 jest korzystnie zastąpiona przez serynę, a tyrozyna w pozycji 426 jest korzystnie zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę.

Sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji według wynalazku charakteryzuje się tym, że stosuje się skuteczną ilość herbicydu hamującego protoks wobec populacji rośliny zawierającej chimerowy gen mający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do

i) cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1i 3 lub ii) cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ED 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że stosuje się cząsteczkę DNA podlegającą ekspresji w roślinie i nadającą, odpowiednio roślinie, tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje naturalnie występującą aktywność protoks, przy czym jako herbicyd hamujący protoks stosuje się herbicyd wybrany z grupy składającej się z arylouracylu, difenyloeteru, oksydiazolu, cyklicznego imidu, fenylopirazolu, pochodnych pirydynowych, podstawionego w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazolu, fenopilanu oraz O-fenylopirolidyno- i piperydynokarbanylowych analogów tego fenopilanu, N-podstawionych pirazoli, N-fenylopirazoli oraz związków o wzorach 18 i 19 i herbicyd ten, hamujący protoks, stosuje się w dawkach od 0,0001 do 10 kg/ha.

W sposobie kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji według wynalazku korzystnie stosuje się promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3, przy czym korzystnie jako organizm eukariota stosuje się gatunek Arabidopsis.

W sposobie kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji według wynalazku równie korzystnie stosuje się promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera eukariotyczny protoks z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu, wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozyny w pozycji 426 w SEK NR ID 2 z tym, że korzystnie alaninę w pozycji 220 zastępuje się przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę, glicynę w pozycji 221 korzystnie zastępuje się przez serynę, a tyrozynę w pozycji 426 zastępuje się przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę.

W sposobie kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji według wynalazku korzystnie stosuje się roślinę wybraną z grupy składającej się z soi, bawełny, tytoniu, buraka cukrowego, rzepaku, kukurydzy, pszenicy, sorgo, żyta, owsa, trawy darniowej i ryżu, a jako herbicyd hamujący protoks korzystnie stosuje się imid o wzorze 5, w którym Q oznacza wzór 6 lub 7, lub 8, lub 9, lub 9a, lub 9b i gdzie R, oznacza H, Cl lub F, R₂ oznacza Cl i R₃jest eterem, tioeterem, estrem, grupą aminową lub alkilową, przy czym R21 R₃ razem mogą tworzyć 5- lub 6składnikowy pierścień heterocykliczny.

W sposobie kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji według wynalazku równie korzystnie stosuje się imid wybrany z grupy składającej się ze związków o wzorze 10, 11, 12,

184 242

13, 14, 15, 16 i 17, w których R oznacza grupę (C₂-₆-alkenyloksy)k;u-bonylo-C_I.₄-alkiiową oraz związek o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory 18,19, 20 i 21.

Sposób testowania związku chemicznego na zdolność hamowania enzymu protoks z rośliny, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że (a) do pierwszej mieszaniny reakcyjnej dodaje się enzym protoks, zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEK nR ID 2 i 4 i protoporfirynogen IX w warunkach, w których enzym protoks ma zdolność do katalizowania przekształcenia protoporfirynogenu IX w protoporfirynę IX, (b) do drugiej mieszaniny reakcyjnej dodaje się testowany związek chemiczny, enzym protoks i protoporfirynogen IX w takich samych warunkach jak w przypadku pierwszej mieszaniny reakcyjnej, (c) wzbudza się pierwszą i drugą mieszaninę przy 395 do 410 nM;

(d) porównuje się fluorescencję pierwszej i drugiej mieszaniny reakcyjnej przy zakresie 622 do 635 nM i jeżeli fluorescencja drugiej mieszaniny reakcyjnej jest znacząco mniejsza od fluorescencji pierwszej mieszaniny reakcyjnej określa się, że związek chemiczny jest zdolny do hamowania aktywności enzymu protoks.

Sposób selekcji roślin, tkanek roślinnych lub komórek roślinnych stransformowanych transgenem będącym przedmiotem zainteresowania spośród roślin nie stransformowanych według wynalazku charakteryzuje się tym, że (a) transformuje się rośliny, tkanki roślinne lub komórki roślinne transgenem będącym przedmiotem zainteresowania, zdolnym do podlegania ekspresji w roślinach i genem chimerowym, zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej i dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, (b) przenosi się tak stransformowane rośliny lub komórki roślinne do pożywki zawierającej inhibitor protoks, gdzie herbicyd hamujący protoks jest wybrany z grupy składającej się z arylouracylu, difenyloeteru, oksydiazolu, cyklicznego imidu, fenylopirazolu, pochodnych pirydynowych, podstawionego w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazolu, fenopilanu oraz O-fenylopirolidyno- i piperydynokarbanylowych analogów tego fenopilanu, N-podstawionych pirazoli, N-fenylopirazoli, związków o wzorach 18 i 19, przy czym stężenie herbicydu hamującego protoks w pożywce wynosi 0,001 do 3000 części na milion, oraz (c) selekcjonuje się rośliny lub komórki roślinne, które przeżywają w pożywce.

Sposób wytwarzania komórki gospodarza zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA, kodującą białko z eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks) według wynalazku charakteryzuje się tym, że transformuje się komórkę gospodarza genem chimerowym zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie, dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że otrzymany wektor jest zdolny do stabilnej transformacji komórki gospodarza.

Sposób wytwarzania komórki roślinnej, zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks) według wynalazku charakteryzuje się tym, że transformuje się komórkę roślinną genem chimerowym zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie, dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki

184 242

DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny obejmujący sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że otrzymany wektor jest zdolny do stabilnej transformacji komórki gospodarza.

Sposób wytwarzania potomstwa z rośliny rodzicielskiej, zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), według wynalazku, charakteryzuje się tym, że transformuje się roślinę rodzicielską genem chimerowym zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie, dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny obejmujący sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że wprowadzany wektor jest zdolny do stabilnej transformacji komórki gospodarza i przeniesienia cechy tolerowania herbicydu na potomstwo takiej rodzicielskiej rośliny w znanych technikach hodowli roślin.

Wynalazek znajduje zastosowanie do wytwarzania sond i sposobów wykrywania obecności i postaci genu protoks i określania poziomu transkryptów genu protoks w organizmie. Sposoby te mogą być użyte do diagnozowania chorób, które są związane ze zmienioną formą enzymu protoks lub zmienionymi poziomami ekspresji enzymu protoks.

Izolowana cząsteczka DNA, która koduje eukariotyczną postać oksydazy protoporfirynogenu (określanego jako „protoks”), koduje enzym katalizujący utlenienie protoporfirynogenu IX do proroporfiryny lX. Kodujące sekwencje DNA i odpowiadające sekwencje aminokwasowe dla enzymu protoks z Arabidopsis thaliana są przedstawione jako SEK NR ID 1-4 i 9-10. Kodujące sekwencje DNA i odpowiadające sekwencje aminokwasowe dla enzymów protoks z kukurydzy są przedstawione jako SEK NR ID 5-8.

W oparciu o ujawnione niżej dane może zostać wyizolowany dowolny, pożądany eukariotyczny DNA kodujący enzym protoks. Konkretne przykłady sposobu izolowania sekwencji kodującej protoks eukariotyczny są dalej przedstawione w opisie. W tych sposobach klony cDNA kodujące protoks są identyfikowane w bibliotece klonów cDNA, pochodzących z odpowiedniego organizmu eukariotycznego, w oparciu o ich zdolność do dostarczania enzymatycznej aktywności protoks zmutowanemu organizmowi gospodarza, któremu brak tej aktywności. Organizmami odpowiednimi do zastosowania w tej metodzie są takie organizmy, które mogą być użyte do przeszukiwania ekspresyjnych bibliotek cDNA i dla których dostępne są lub mogą być rutynowo wytworzone mutanty defektywne pod względem aktywności protoks. Takie organizmy obejmują między innymi E. coli (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol.113: 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) i Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al. Biochem. Biophys. Res. Comm.106: 724 (1982)).

Alternatywnie, eukariotyczne sekwencje kodujące protoks mogą być izolowane według dobrze znanych technik opartych ohomologię ich sekwencji do sekwencji kodujących protoks z Arabidopsis thaliana (SEK NR ID: 1,3 i 9) iZea mays SEK NR ID: 5 i 7), przedstawianych w niniejszym wynalazku. W tych technikach cała znana sekwencja kodująca protoks lub jej część jest stosowana jako sonda, która selektywnie hybrydyzuje do innych sekwencji kodujących protoks, obecnych w populacji sklonowanych genomowych fragmentów DNA lub fragmentów cD -NA (tj. bibliotek genomowych lub cDNA) z wybranego organizmu. Takie techniki obejmują przeszukiwanie poprzez hybrydyzację wysianych bibliotek DNA (łysinek bądź kolonii; patrz Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) i powielanie poprzez PCR przy zastosowaniu starterów oligonukleotydowych, odpowiadających sekwencji domen konserwowanych w obrębie znanych sekwencji aminokwasowych protoks (patrz

184 242 np. Innis et al., PCR Protocols a Guide to Methods and Applications eds., Academic Press (1990)). Metody te są szczególnie odpowiednie do izolowania sekwencji kodujących protoks z organizmów pokrewnych z tymi, z których pochodziła sekwencja sondy. Przykładowo, można się spodziewać, że zastosowanie tych metod przy użyciu jako sond sekwencji kodujących z Arabidopsis będzie szczególnie odpowiednie do izolowania sekwencji kodującej protoks z innych gatunków roślin.

Izolowane eukariotyczne sekwencje protoks, przedstawione w niniejszym wynalazku mogą być poddawane manipulacjom według standardowych technik inżynierii genetycznej, odpowiednio do potrzeb. Przykładowo, cała sekwencja protoks lub jej część może być użyta jako sonda mająca zdolność do specyficznej hybrydyzacji z sekwencjami kodującymi protoks i informacyjnymi RNA. Aby uzyskać specyficzną hybrydyzację w różnych warunkach, takie sondy obejmują sekwencje, które są unikalne wśród sekwencji kodujących protoks i mają długość co najmniej 10 nukleotydów, a korzystniej długość 20 nukleotydów. Takie sondy mogą być użyte do powielania i analizowania sekwencji kodującej protoks z wybranych organizmów przy zastosowaniu dobrze znanego procesu - reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Technika ta może być użyteczna do powielania i analizy sekwencji kodujących protoks z żądanych organizmów lub jako test diagnostyczny do stwierdzania obecności sekwencji kodującej protoks w organizmie i do skorelowania zmienionych sekwencji kodujących z niepomyślnymi przypadkami, takimi jak autosomalna dominująca choroba u ludzi, charakteryzująca się zarówno objawami neuropsychiatrycznymi, jak i skórnymi, w której zmniejszony jest poziom aktywności protoks (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med 302: 765 (1980)).

Sondy do hybrydyzacji specyficzne dla protoks mogą być również użyte do ustalania lokalizacji natywnego eukariotycznego genu(genów) protoks w genomie wybranego organizmu przy zastosowaniu standardowych technik opartych o selektywną hybrydyzację sondy z genomowymi sekwencjami protoks. Techniki te obejmują między innymi identyfikację polimorfizmów DNA, zidentyfikowanych lub zawartych w obrębie sekwencji sondy protoks i zastosowanie takich polimorfizmów do śledzenia segregacji genu protoks w stosunku do innych markerów o znanej pozycji mapowej w pochodzącej z samozaplodnitenia hybrydy dwóch polimorficznych linii rodzicielskich (patrz Helentjaris et al., Plant Mol. Biol. 5:109 (1985). Sommer et al. Biotechniąues 1282 (1992); D'Ovidio et al., Plant Mol. Biol. 15: 169 (1990)). Jakkolwiek dowolna eukariotyczna sekwencja protoks może być brana pod uwagę jako użyteczna do zastosowania jako sonda do mapowania genów protoks z dowolnego organizmu eukariotycznego, korzystnymi sondami są sekwencje protoks z organizmów bliżej spokrewnionych z wybranym organizmem, a najkorzystniejszymi sondami są sekwencje protoks z wybranego organizmu. Mapowanie genów protoks w taki sposób uważa się za szczególnie użyteczne w przypadku roślin ze względów hodowlanych. Przykładowo, znając pozycję na mapie genetycznej zmutowanego genu protoks, warunkującego oporność na herbicyd, można zidentyfikować otaczające markery DNA ze znanej mapy genetycznej (patrz np. Helentjaris, Trends Genet. 3: 217 (1987)). Podczas wprowadzania cechy oporności na herbicyd do nowej linii hodowlanej, markery te mogą być stosowane do śledzenia zasięgu otaczającego chromosomalnego DNA sprzężonego z protoks, nadal obecnego we wstecznym pokoleniu rodzicielskim po każdej rundzie krzyżowania wstecznego.

Sondy specyficznie hybrydyzujące z protoks mogą być również używane do oznaczania poziomu mRNA dla protoks w organizmie przy zastosowaniu standardowych technik, takich jak analiza Northern. Taka technika może być stosowana jako test diagnostyczny do wykrywania zmienionych poziomów ekspresji, co może być związane z niektórymi przypadkami chorób, takimi jak autosomalna dominująca choroba u ludzi, charakteryzująca się zarówno objawami neuropsychiatrycznymi, jak i skórnymi, w której zmniejszony jest poziom aktywności protoks (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765 (1980)).

Celem wytworzenia zrekombinowanego enzymu w organizmie gospodarza, sekwencja kodująca protoks może być wstawiona do kasety ekspresyjnej, zaprojektowanej dla wybranego gospodarza i wprowadzonej do gospodarza, w którym protoks ma być wytworzony na drodze rekombinacji. Wybór specyficznych sekwencji regulacyjnych, takich jak promotor, sekwencja sygnałowa, sekwencje 5' i 3' nie podlegające translacji oraz sekwencje wzmacniające (ang. enhancer) pozostają w zakresie umiejętności biegłych w tej dziedzinie. Uzyskana

184 242 w rezultacie cząsteczka, zawierająca poszczególne elementy połączone w odpowiedniej ramce odczytu, może być włączona do wektora, którym można transformować komórki gospodarza. Odpowiednie wektory ekspresyjne i metody wytwarzania białek technikami rekombinowama DNA są dobrze znane dla organizmów gospodarzy, takich jak E. coli (patrz, np. Studier and Moffatt, J. Mol. Biol. 189:113 (1986); Brosius, DNA 8: 759 (1989)), drożdże (patrz np. Schneider and Guarente, Meth. Enzymol.194: 373 (1991)) i komórki owada (patrz np. Luckow and Summers, Biol. Technol. 6: 47 (1988)). Konkretne przykłady obejmują plazmidy, takie jak pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), pTrcHis (lnvitrogen, La Jolla, CA) oraz bakulowirusowe wektory ekspresyjne, np. takie, które pochodzą z genomu wirusa Auto-graphica califomica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). Korzystnym systemem bakulowirus/owad są komórki pVI11392/Sf21 (lnvitrogen, La Jolla, CA).

Eukariotyczny enzym protoks, wytworzony poprzez rekombinowanie DNA ma wiele zastosowań. Przykładowo, może być on użyty do dostarczania enzymatycznej aktywności protoks in vitro. Może być również stosowany w teście in vitro do przeszukiwania związków chemicznych będących herbicydami, których cel nie został zidentyfikowany, dla określenia czy hamują one protoks. Taki test in vitro może być również stosowany jako bardziej ogólna metoda poszukiwań celem zidentyfikowania związków chemicznych, które hamują aktywność protoks i które są zatem kandydatami na herbicydy. Alternatywnie, enzym protoks wytwarzany poprzez rekombinowanie DNA może być użyty do dalszej charakteryzacji jego powiązania ze znanymi inhibitorami celem racjonalnego projektowania nowych inhibitorówherbicydów, jak również form enzymu tolerujących herbicyd.

Typowo, hamujący wpływ na protoks jest określany poprzez pomiar fluorescencji przy około 395 do 410 nm (patrz np. Jacobs and Jacobs, Enyzme 28: 206 (1982); Sherman et al., Plant Physiol. 97: 280 (1991)). Test ten jest oparty na fakcie, że protoporfiryna IX jest pigmentem fluorescencyjnym, a protoporfirynogen jest niefluorescencyjny. Ekstrakty białkowe są przygotowywane z wybranych frakcji komórkowych np. etioplastów, mitochondriów, mikrosomów lub błony plazmatycznej poprzez różnicowe wirowanie (patrz np. Lee et al., Plant Physiol. 102:881 (1993); Prado et al, Plant Physiol. 65: 956 (1979); Jackson and Moore, w Plant Organelles. Reid, ed., str. 1-12; Jacobs and Jacobs, Plant Physiol. 101:1181 (1993)). Protoporfirynogen jest przygotowywany poprzez redukcję protoporfiryny amalgamatem sodu, jak opisano w Jacobs and Jacobs (1982). Mieszanina reakcyjna typowo zawiera 100 mM Hepes (pH 7.5), 5 mM EDTA, 2 mM DTT, około 2 M protoporfirynogen IX i około 1 mg/ml ekstraktu białkowego. Roztwory inhibitora w różnych stężeniach np.: 1 mM, 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM dodaje się do ekstraktu enzymatycznego przed rozpoczęciem reakcji enzymatycznej. Po dodaniu ekstraktu białkowego przez kilka minut śledzi się fluorescencję i oblicza się nachylenie krzywej (szybkość reakcji) z regionu liniowego. Określa się IC₅₍₎ poprzez porównanie krzywej w reakcji hamowanej z reakcją kontrolną.

Inne wykonanie niniejszego wynalazku obejmuje użycie enzymu protoks w teście do identyfikacji mutantów protoks opornych na inhibitor. Typowy test przedstawia się następująco:

(a) inkubowanie pierwszej próbki protoks i jego substratu, protoporfirynogenu IX, w obecności drugiej próbki zawierającej inhibitor protoks;

(b) pomiar aktywności enzymatycznej protoks z etapu (a);

(c) inkubowanie pierwszej próbki zmutowanego protoks i jego substratu w obecności drugiej próbki zawierającej ten sam inhibitor protoks;

(d) pomiar aktywności enzymatycznej zmutowanego protoks z etapu (c); oraz (e) porównanie enzymatycznej aktywności zmutowanego protoks z aktywnością niezmutowanego protoks.

Mieszanina reakcyjna i warunki reakcji są takie same, jak w teście dla identyfikacji inhibitorów protoks (test inhibitora), z następującymi modyfikacjami. Po pierwsze, zmutowany protoks, otrzymany jak opisano powyżej, jest zastąpiony w jednej z mieszanin reakcyjnych przez protoks typu dzikiego w teście inhibitora. Po drugie, inhibitor protoks typu dzikiego jest obecny w obu mieszaninach reakcyjnych. Po trzecie, aktywność zmutowana (aktywność enzymatyczna w obecności inhibitora i zmutowanego protoks) i aktywność niezmutowana

184 242 (aktywność enzymatyczna w obecności inhibitora i protoks typu dzikiego) są porównywane dla określenia, czy obserwuje się znaczące zwiększenie aktywności przy porównaniu aktywności zmutowanej i mezmutowanej. Aktywnością zmutowaną jest każdy pomiar aktywności enzymatycznej zmutowanego enzymu w obecności odpowiedniego substratu i inhibitora. Aktywnością niezmutowaną jest każdy pomiar aktywności enzymatycznej enzymu protoks typu dzikiego w obecności odpowiedniego substratu i inhibitora. Znaczący wzrost jest zdefiniowany jako zwiększenie aktywności enzymatycznej, która jest większa niż margines błędu właściwy dla techniki pomiarowej, korzystnie około dwukrotny wzrost aktywności enzymu typu dzikiego w obecności inhibitora, korzystniej wzrost około 5-krotny, jeszcze korzystniej wzrost większy niż dziesięciokrotny.

Herbicydy, które hamują protoks obejmują wiele różnych strukturalnych klas cząsteczek (Duke et al., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)). Herbicydy te obejmują difenyloetery {np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluorometylo)fenoksy]-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorfen, 2-chloro-l-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen)}, oksydiazole, (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(1 -metyloetoksy)fenylo]-5 -(1,1 -dimetyloetylo)-1,3,4-oksadiazol-2-(3H)on, cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargiloksyfenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid; chloroftalim, N-(4-chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), fenylopirazole (np. TNPP-etyl, 2-[1-(2,3,4-trichlorofenylo)-4-nitropirazolilo-5-oksy]propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydyny (np. LS 82-556) oraz fenopilan and jego analogi O-fenylopirrolidynowe i piperydynokarbaminowe.

Difenyloeterami o szczególnym znaczeniu są te o wzorze ogólnym 1, w którym R odpowiada -COONa (wzór 2), -C0NHS0₂CH₃ (wzór 3) lub -COOCH₂COOC₂H₅ (wzór 4; patrz Maigrot et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds:47-51 (1989)).

Kolejnymi difenyloeterami będącymi przedmiotem zainteresowania są takie, w których R oznacza związek o wzorze 4a. (Wzór 4a; patrz Hayashi et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 53-58 (1989)).

Kolejny difenyloeter będący przedmiotem zainteresowania ma wzór 4b. (Wzór 4b; bifenoks, patrz Dest et al., Proc. Northeast Weed Sci. Conf. 27:31 (1973)).

Znaczenie ma również klasa herbicydów, znana jako imidy, o wzorze ogólnym 5, gdzie Q oznacza wzór 6, 7, 8, 9 lub 9a lub 9b (patrz Hemper et al. (1995) w „Proceedings of the Eighth International Congress of Pesticide Chemistry”, Ragdale et al., ed Amer. Chem. Soc, Washington, D.C., str. 42-48 (1994)), a R, oznacza H, Cl lub F, R₂ oznacza Cl i R₃ jest optymalnie podstawionym eterem tioeterem, estrem, grupą aminową lub alkilową. Alternatywnie, R2 i R₃ razem mogą tworzyć 5- lub 6-składnikowy pierścień heterocykliczny. Przykładami herbicydów imidowych, będących przedmiotem szczególnego zainteresowania są imidy o wzorze 10, wzorze 11, wzorze 12 (patrz Miura et al., Brighton Crop Protection ConferenceWeeds: 35-40 (1993)), wzorze 13, wzorze 14, wzorze 15 i wzorze 16.

Działanie powyższych związków jako herbicydów jest opisane w Proceedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (wzór 10 i 16), Proceedings of the 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (wzór 12 i 13), Patent USA Nr 4,746,352 (wzór 11) oraz Abstracts of the Weed Science Society of America vol. 33, str. 9 (1993) (wzór 14).

Najbardziej korzystnymi herbicydami imidowymi są te zaklasyfikowane jako aryluracyle o wzorze ogólnym 17, gdzie R oznacza grupę Ch^-alkenyloksyjkarbonyIo-C^-alkilową, jak opisano w patencie USA Nr 5,183,492, włączonym tutaj jako odnośnik.

Znaczenie mają również herbicydy o wzorze ogólnym 18 (tiadiazimina; patrz Weiler et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, str. 29-34 (1993)); o wzorze 19 (karfentrazon, patrz Van Saun et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: pp. 19 - 22 (1993)); N-podstawione pirazole o wzorze ogólnym 20 (patrz międzynarodowe publikacje patentowe Wo 94/08999, wO 93/10100 oraz Patent USA Nr 5,405,829 uzyskany przez Schering); N-fenylopirazole, takie jak ten o wzorze 21 (nipiraklofen; patrz strona 621 w „The Pesticide Manual”, 9th ed., wyd. przez C.R. Worthing, British Crop Protection Council, Surrey

184 242 (1991)) oraz podstawione w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazole (Lyga et al. Pesticide Sci. 4229-36 (1994)).

Poziomy herbicydu, które normalnie hamują aktywność protoks, uwzględniają normy stosowania znane w tej dziedzinie, i zależą częściowo od czynników zewnętrznych, takich jak środowisko, czas i metoda stosowania. Przykładowo, w przypadku herbicydów imidowych, opisanych wzorami od 10 do 17, dawki mieszczą się w zakresie od 0,0001 do 10 kg/ha, korzystnie od 0,005 do 2 kg/ha. To dawkowanie lub stężenie herbicydu może różnić się, zależnie od pożądanego działania i konkretnego zastosowanego związku i może być ustalone znanymi w tej dziedzinie metodami.

Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto roślin, tkanek roślinnych i nasion roślin tolerujących herbicydy, które hamują naturalnie występującą aktywność protoks w tych roślinach, gdzie tolerancja jest związana ze zmienioną aktywnością enzymu protoks. Reprezentatywne rośliny obejmują dowolne rośliny, dla których te herbicydy stosuje się zgodnie z ich normalnym przeznaczeniem. Korzystne są ważne uprawy rolne np. roślin nagonasiennych i okrytonasiennych, takich jak bawełna, soja, buraki cukrowe, kukurydza, ryż, pszenica, jęczmień owies, żyto, sorgo, proso, trawy darniowe i paszowe i temu podobne.

„Zmieniona aktywność enzymu protoks” oznacza aktywność enzymatyczną protoks różniącą się od tej, która naturalnie występuje w roślinach (tj. aktywność protoks, która jest naturalnie obecna przy braku bezpośredniego lub pośredniego manipulowania taką aktywnością przez człowieka), wykazująca oporność na herbicydy, które hamują naturalnie występującą aktywność. Zmieniona aktywność enzymu protoks może być uzyskana w roślinie według wynalazku poprzez zwiększenie ekspresji protoks typu dzikiego, wrażliwego na herbicyd, ekspresji zmienionego, tolerującego herbicyd eukariotycznego enzymu protoks w roślinie, ekspresji niezmodyfikowanej lub zmodyfikowanej bakteryjnej postaci enzymu protoks, który jest oporny na herbicyd w roślinie lub poprzez kombinację tych technik.

Uzyskanie zmienionej aktywności enzymu protoks poprzez zwiększoną ekspresję jest rezultatem osiągnięcia poziomu protoks w komórkach roślinnych co najmniej wystarczającego dla przezwyciężenia hamowania wzrostu powodowanego przez herbicyd. Poziom ekspresji protoks jest co najmniej dwukrotnie, korzystniej pięciokrotnie, a jeszcze korzystniej co najmniej dziesięciokrotnie wyższy od poziomu natywnej ekspresji. Zwiększona ekspresja może być wynikiem wielu kopii dzikiego genu protoks, wielokrotnego występowania sekwencji kodującej protoks w obrębie genu protoks (tj. amplifikacji genu lub mutacji w niekodującej sekwencji regulacyjnej endogennego genu protoks w komórce roślinnej. Rośliny zawierające taką zmienioną aktywność enzymu protoks mogą być otrzymane poprzez bezpośrednią selekcję w roślinach. Metoda ta jest znana w tej dziedzinie. Patrz Somers et al., w patencie USA Nr 5,162,602, i Anderson et al., w patencie USA Nr 4,761,373 iodnośmki tam cytowane. Takie rośliny mogą być również uzyskane poprzez techniki inżynierii genetycznej znane w tej dziedzinie.

Zwiększona ekspresja protoks wrażliwego na herbicyd może być również uzyskana poprzez stabilną transformację komórki roślinnej zrekombinowaną lub chimerową cząsteczką DNA, zawierającą promotor zdolny do kierowania ekspresją związanego z nim genu struktury w komórce roślinnej DNA, połączony z homologicznym lub heterologicznym genem struktury kodującym protoks. „Homologiczny” oznacza, że gen protoks jest izolowany z organizmu, taksonomicznie identycznego z docelową komórką roślinną. „Heterologiczny” oznacza, że gen protoks jest otrzymany z organizmu taksonomicznie odrębnego od docelowej komórki roślinnej. Homologiczne geny protoks można otrzymać poprzez komplementację bakteryjnych lub drożdżowych mutantów auksotroficznych ekspresyjną biblioteką cDNA z docelowej rośliny. Patrz np. przykład 1 i Snustad et al, Genetics 120:1111-1114 (1988) (syntaza glutaminy z kukurydzy); Delauney et al., Mol. Genet. 221:299-305 (1990) (reduktaza pirolino-5-karboksylanu z soi); Frisch et al., Mol. Gen. Genet. 228:287-293(1991) (syntaza dihydrodipikolinianu z kukurydzy); Eller et al., Plant Mol. Biol. 1857-566 (1992) (chloroplastowa dehydrogenaza 3-izopropylojabłczanu z rzepaku); Proc. Natl. Acad Sci, USA 88:1731-1735 (1991); Minet et al., Plant J. 2:417-422 (1992) (dehydrogenaza dihydroorotanowa) i odnośniki tam cytowane. Inne znane metody obejmują przeszukiwanie bibliotek genomowych lub cDNA

184 242 wyższych roślin, na przykład pod kątem sekwencji, które hybrydyzują ze specyficznymi kwasami nukleinowymi-sondami lub poprzez przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych pod kątem wytwarzania enzymu protoks, który reaguje krzyżowo ze specyficznymi przeciwciałami. Korzystna metoda obejmuje komplementację auksotroficznych mutantów E. coli hemG przy użyciu biblioteki cDNA z kukurydzy lub Arabidopsis thaliana.

Przykłady promotorów zdolnych do funkcjonowania w roślinach lub komórkach roślinnych, tj. takich, które mają zdolność do kierowania ekspresją w komórkach roślinnych połączonych z nimi genów struktury, takich jak protoks, obejmują promotory 19S i 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) i podwójne promotory CaMV; promotory syntazy nopaliny; promotory białka związanego z patogenezą (PR); promotory małej pod-jednostki karboksylazy rybulozobifosforanu (ssuRUBISCO) i temu podobne. Korzystne są: promotor aktyny z ryżu (McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231:150 (1991)), promotor ubikwityny z kukurydzy (EP 0 342 926; Taylor et al., Plant Celi Rep. 12: 491 (1993)) oraz promotor Pr-1 z tytoniu, Arabidopsis lub kukurydzy (patrz Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe Nr PCT/IB9S/00002 dla Ryals et al., dołączone tu w całości jako odnośnik). Korzystny jest również promotor 35S i wzmacniacz lub podwójny promotor 35S, taki jak opisany wKay et al., Science 236: 1299-1302 (1987) i podwójny promotor 35S sklonowany wpCGN2II3, zdeponowany jako ATCC 40587, które są ujawnione w EP-A 0 392 225, a których odpowiedni opis jest tu w całości włączony jako odnośnik. Same promotory mogą być modyfikowane celem manipulowania siłą promotora dla zwiększenia ekspresji protoks, zgodnie ze sposobami znanymi w tej dziedzinie.

W chimerowych konstruktach DNA według wynalazku, do sekwencji kodującej protoks mogą być dołączone sygnałowe lub kierujące peptydy, celem kierowania transportem powstającego w wyniku ekspresji enzymu protoks do pożądanego miejsca działania. Przykłady sygnałowych peptydów obejmują takie, które są natywnie połączone z roślinnymi białkami związanymi z patogenezą, np. PR-1, PR-2 i temu podobne. Patrz Payne et al., Plant Mol. Biol. 11:89-94 (1988). Przykłady peptydów tranzytowych obejmują chloroplastowe peptydy tranzytowe, takie jak opisane w Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126 (1991); Mazur et al., Plant Physiol. 85:1110 (1987); Vorst et al., Gene 65: 59 (l988) i mitochondrialne peptydy tranzytowe, takie jak opisane w Boutry et al., Nature 328340-342 (1987). Chloroplastowe i mitochondrialne peptydy tranzytowe są uważane w niniejszym wynalazku za szczególnie użyteczne, ponieważ aktywność enzymatyczna protoks występuje typowo w mitochondriach i chloroplastach. Bardziej korzystne jest użycie chloroplastowych peptydów tranzytowych ponieważ uważa się że hamowanie aktywności enzymatycznej protoks w chloroplastach leży u podłoża działania herbicydów hamujących protoks (Witkowski and Halling, Plant Physiol. 87: 632 (1988); Lehnen et al., Pestic. Biochem. Physiol. 37 239 (1990); Duke et al., Weed Sei. 39: 465 (1991)). Uwzględnione są również sekwencje, które powodują lokalizację kodowanego białka w różnych przedziałach komórkowych, takich jak wakuole. Patrz na przykład Neuhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10362-10366 (1991) oraz Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 21-53 (1991). Odpowiednie publikacje są tu załączone w całości jako odnośniki.

Chimerowy konstrukt(y) DNA według wynalazku mogą zawierać wiele kopii promotora lub wiele kopii genów struktury protoks. Dodatkowo, konstrukt(y) mogą obejmować sekwencje kodujące dla markerów i sekwencje kodujące dla innych peptydów, takich jak peptydy sygnałowe lub tranzytowe, każdy w odpowiedniej ramce odczytu w stosunku do innych funkcjonalnych elementów w cząsteczce DNA. Przygotowanie takich konstruktów mieści się w zwykłym zakresie umiejętności w tej dziedzinie.

Użyteczne markery obejmują peptydy dające oporność na herbicyd, antybiotyk lub lek, jak na przykład oporność na hydromycynę, kanamycynę, G418, gentamycynę, linkomycynę, metotreksat, glifosat, fosfimtrycynę i temu podobne. Markery te mogą być stosowane do wyselekcjonowania komórek stransformowanych chimerowymi konstruktami DNA według wynalazku spośród komórek niestransformowanych. Innymi użytecznymi markerami są enzymy peptydowe, które mogą być łatwo wykrywane poprzez widoczną reakcję, na przykład reakcję barwną przykładowo lucyferaza, b-glukuronidaza lub b-galaktozydaza.

184 242

Zmienioną aktywność protoks można również uzyskać poprzez wytworzenie lub identyfikację zmienionej postaci wyizolowanej eukariotycznej sekwencji kodującej protoks, mającej co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe, wstawienie lub delecję, która koduje zmieniony enzym protoks oporny na herbicyd, który hamuje nie zmienioną naturalnie występującą postać (tj. postać, która naturalnie występuje w organizmie eukariotycznym nie poddanym manipulowaniu, bądź bezpośrednio na drodze rekombinowania DNA lub pośrednio poprzez selektywną hodowlę itd., przez człowieka). Geny kodujące takie enzymy można otrzymać stosując wiele strategii znanych w tej dziedzinie. Pierwsza ogólna strategia obejmuje pośrednie lub bezpośrednie sposoby mutagenezy w mikroorganizmach. Przykładowo, podatny na manipulacje genetyczne mikroorganizm, np. E. coli lub S. cerevisiae, może być poddany losowej mutagenezie in vivo, przy użyciu np. światła UV lub metanosulfonianu etylu lub metylu. Sposoby mutagenezy są opisane na przykład w Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972); Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); Sherman et al., Methods m Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983); i Patent USA Nr 4,975,374 (Goodman et al.). Mikroorganizm selekcjonowany pod kątem mutagenezy zawiera normalnie wrażliwy na herbicyd eukariotyczny gen protoks i jest zależny od aktywności protoks warunkowanej przez ten gen. Poddane mutagenezie komórki hoduje się w obecności herbicydu w stężeniach, które hamują niezmodyfikowany enzym protoks. Kolonie poddanego mutagenezie mikroorganizmu, które rosną w obecności inhibitora lepiej, niż mikroorganizm nie poddany mutagenezie, są wybrane do dalszej analizy. Geny protoks z tych kolonii są izolowane, bądź poprzez klonowanie, bądź poprzez powielanie w reakcji łańcuchowej polimerazy i ustala się ich sekwencje. Sekwencje kodujące zmieniony enzym protoks są następnie klonowane ponownie w mikroorganizmie celem potwierdzenia ich zdolności do nadawania oporności na inhibitor.

Druga metoda otrzymywania zmutowanych alleli eukariotycznego enzymu protoks opornych na herbicyd obejmuje bezpośrednią selekcję w roślinach. Przykładowo, wpływ inhibitora protoks, takiego jak te opisane powyżej na hamowanie wzrostu roślin, takich jak Arabidopsis, soja, lub kukurydza można określić poprzez wysiew nasion sterylizowanych metodami znanymi w tej dziedzinie ma płytki z prostą pożywką minimalną z soli mineralnych, zawierającą wzrastające stężenie inhibitora. Takie stężenia zawierają się w zakresie 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 110, 300, 1000 i 3000 części na milion (ppm). Najniższa dawka, przy której można powtarzalnie wykrywać znaczące zahamowanie wzrostu, jest stosowana do kolejnych eksperymentów.

Mutageneza materiału roślinnego może być stosowana do zwiększenia częstości, z którą w wybranej populacji pojawiają się oporne allele. Mutagenizowany materiał nasienny może pochodzić z różnych źródeł, włączając w to chemiczną lub fizyczną mutagenezę nasion lub chemiczną lub fizyczną mutagenezę pyłku (Neuffer, In Maize for Biologicai Research. Sheridan, ed. Univ. Press, Grand Forks, ND., str. 61-64 (1982)), który jest następnie używany do zapładniania roślin i gdzie zbiera się powstałe w rezultacie zmutowane nasiona M,. Typowo, dla Arabidopsis, nasiona M2 (Lehie Seeds, Tucson, AZ), tj. potomne nasiona roślin powstałych z nasion mutagenizowanych związkami chemicznymi, takimi jak metanosulfonian etylu lub czynnikami fizycznymi, takimi jak promienie gamma lub szybkie neutrony, są wysiewane, przy gęstości do 10000 nasion/płytkę (10 cm średnicy) na minimalną pożywkę mineralną zawierającą odpowiednie stężenie inhibitora, celem selekcji na oporność. Kiełki, które nadal rosną i pozostają zielone 7-21 dni po wysianiu, przenosi się do gleby i hoduje do dojrzałości i wydania nasion. Potomstwo z tych nasion jest testowane pod kątem oporności na herbicyd. Jeżeli cecha oporności jest dominująca, rośliny, których nasiona segregują 3:1:: oporne:wrażliwe, są uważane za heterozygotyczne pod względem oporności w pokoleniu M2. Rośliny, które dają wszystkie nasiona oporne, są uważane za homozygotyczne pod względem oporności w pokoleniu M2. Taka mutageneza na nienaruszonych nasionach i przeszukiwanie nasion z pokolenia M2 mogą być również prowadzone dla innych gatunków, na przykład soi (patrz np. Pat. USA Nr 5,084,082 (Sebastian)). Zmutowane nasiona, które mają być przeszukiwane pod

184 242 kątem tolerancji wobec herbicydów, można również otrzymać w wyniku zapłodnienia pyłkiem mutagenizowanym sposobami chemicznymi lub fizycznymi.

Można zastosować dwa podejścia dla potwierdzenia, że podstawą genetyczną oporności jest zmieniony gen protoks. Po pierwsze, allele genu protoks z roślin wykazujących oporność na inhibitor mogą być izolowane przy zastosowaniu starterów PCR w oparciu o konserwowane regiony w sekwencjach cDNA protoks Arabidopsis i kukurydzy, pokazanych poniżej w SEK ID NR : 1,3,5,7 lub, korzystniej, w oparciu o niezmienione sekwencje genu protoks z rośliny użytej do wytworzenia alleli opornych. Po sekwencjonowaniu alleli celem ustalenia obecności mutacji w sekwencji kodującej, allele mogą być testowane pod kątem ich zdolności do nadawania oporności roślinom, do których alelle przypuszczalnie nadające oporność zostały wtransformowane. Roślinami tymi może być bądź Arabidopsis lub inna dowolna roślina, której wzrost jest wrażliwy na inhibitory. Po drugie, geny protoks mogą być zmapowane względem znanych polimorfizmów długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) (patrz na przykład, Chang et al. Proc. Natl. Acad, Sci, USA 85:6856-6860 (1988); Nam et al., Plant Celi 1:699-705 (1989)). Cecha oporności może być niezależnie zmapowana przy zastosowaniu tych samych markerów. Jeżeli oporność jest powodowana mutacją w takim genie protoks, cecha oporności będzie mapować się w pozycji nieodróżnialnej od pozycji genu protoks.

Trzecia metoda otrzymywania alleli protoks opornych na herbicydy jest poprzez selekcję w kultury komórek roślinnych. Eksplanty tkanki roślinnej, np. zarodków, dysków liściowych itd. lub szybko rosnący kalus lub hodowla w zawiesinie z rośliny będącej przedmiotem zainteresowania, hoduje się na zdefiniowanej pożywce nie zawierającej hemu w obecności rosnących stężeń herbicydu o działaniu hamującym lub analogicznego inhibitora odpowiedniego do zastosowania w warunkach laboratoryjnych. Śledzi się zróżnicowanie stopnia wzrostu w różnych hodowlach. W niektórych hodowlach pojawiają się szybko rosnące odmiany kolonii, które kontynuują wzrost nawet w obecności stężeń inhibitora, które normalnie hamują wzrost. Częstość, z którą takie szybko rosnące warianty powstają, może być zwiększona poprzez traktowanie chemicznym lub fizycznym mutagenem przed poddaniem tkanek lub komórek działaniu herbicydu. Potencjalne allele genu protoks warunkujące oporność są izolowane i testowane tak, jak opisano w poprzednich paragrafach. Allele te, zidentyfikowane jako warunkujące oporność na herbicyd, mogą być następnie poddane zabiegom inżynierii genetycznej celem uzyskania maksymalnej ekspresji i transformowane do roślin. Alternatywnie, z tkanek i kultur komórkowych, zawierających te allele, mogą być regenerowane rośliny.

Czwarta metoda obejmuje mutagenezę genów protoks typu dzikiego, wrażliwych na herbicyd w bakterii lub drożdżach, a następnie hodowanie mikroorganizmu w pożywce nie zawierającym hemu, ale która zawiera hamujące stężenia inhibitora i selekcjonowanie takich kolonii, które rosną w obecności inhibitora. Bardziej konkretnie, roślinny cDNA, taki który koduje protoks z Arabidopsis lub kukurydzy jest klonowany w mikroorganizmie, który wykazuje brak aktywności protoks. Przykłady takich mikroorganizmów obejmują szczep E. coli SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979), szczep S. typhimurium TE2483 lub TT13680 (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) oraz mutanta drożdży heml41 (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)). Stransformowany mikroorganizm poddaje się mutagenezie in vivo, takiej jak opisano tuż powyżej lub mutagenezie in vitro dowolną z wielu chemicznych lub enzymatycznych metod znanych w tej dziedzinie, np. dwusiarczkiem sodu (Shortle et al., Methods Enzymol. 100:457-468 (1983); metoksylaminą (Kadonaga et al., Nucleic Acids Res. 13:1733-1745 (1985); mutagenezą saturacyjną z użyciem oligonukleotydów (Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 83:710-714 (1986) lub poprzez różne strategie z błędnym włączaniem przez polimerazę (patrz np. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1588-1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64.313-319 (1988); oraz Leung et al., Technique 1:11-15 (1989). Kolonie, które rosną w obecności stężeń inhibitora, normalnie wykazujących hamowanie, są zbierane i czyszczone poprzez powtarzanie posiewu redukcyjnego. Plazmidy są oczyszczane i testowane pod kątem ich zdolności do przenoszenia oporności na inhibitor poprzez ponowną transformację do mikroorganizmu me mającego aktywności protoks. Następnie ustala się sekwencje DNA wstawek cDNA dla protoks z plazmidów, które przechodzą pomyślnie taki test.

184 242

Gdy allel protoks oporny na herbicyd zostanie zidentyfikowany, może być poddany zabiegom inżynierii genetycznej celem uzyskania optymalnej ekspresji w roślinie uprawnej. Może to obejmować zmianę sekwencji kodującej allelu oporności dla optymalnej ekspresji w gatunku rośliny uprawnej będącej przedmiotem zainteresowania. Sposoby modyfikowania sekwencji kodujących dla osiągnięcia optymalnej ekspresji w konkretnym gatunku rośliny uprawnej są dobrze znane (patrz np. Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 3324 (1991); Cozily et al., Biotechnol. 11:194 (1993)). Zabiegi inżynierii genetycznej dla allelu protoks w celu uzyskania optymalnej ekspresji mogą również obejmować dołączone w sposób funkcjonalny odpowiednie sekwencje regulacyjne (tj. promotor, sekwencję sygnałową terminatory transkrypcji). Korzystnymi promotorami będą takie, które warunkują wysoki konstytutywny poziom ekspresji lub, korzystniej, takie, które warunkują wysoki specyficzny poziom ekspresji w tkankach podatnych na uszkodzenie przez herbicyd.

Cząsteczki zrekombinowanego DNA mogą być wprowadzane do komórki roślinnej wieloma sposobami znanymi w tej dziedzinie. Dla biegłych będzie jasne, że wybór metody będzie zależał od typu rośliny, tj. jednoliściennej czy dwuliściennej, będącej celem transformacji. Odpowiednie sposoby transformowania komórek roślinnych obejmują mikroinjekcję (Crossway et al., BioTechniques 4320-334 (1986)), elektroporacię (Riggs et al, Proc. Natl. Acad Sei. USA 83:5602-5606 (1986), transformację za pośrednictwem Agrobacterium (Hinchee et al., Biotechnology 6:915-921 (1988)), bezpośrednie przeniesienie genu (Paszkowski et al., EMBO J. 3.2717-2722 (1984)), oraz balistyczne przyspieszenie cząstek przy zastosowaniu urządzeń dostępnych z Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin and Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (patrz na przykład, Sanford et al, Patent USA 4,945,050; and McCabe et al., Biotechnology 6923-926 (1988)). Patrz także, Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5.27-37 (1987) (cebula); Christou et al., Plant Physiol. 87671-674 (1988) (soja); McCabe et al., Bio/Technology 6:923-926 (1988) (soja); Datta et al., Bio/Technology 8:736-740 (1990) (ryż); Klein et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA, 85:4305-4309 (1988) (kukurydza); Klein et al., BiolTechnology E559-563 (1988) (kukurydza); Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444 (1988) (kukurydza); Fromm et al., BiolTechnology 8833-839 (1990); oraz GordonKamm et al., Plant Celi 2:603-618 (1990) (kukurydza). ,

Ponadto, w zakres wynalazku wchodzą komórki roślinne i ich potomstwo, w szczególności komórki zmodyfikowanych genetycznie płodnych roślin stransformowanych przy stosowaniu wcześniej opisanych sposobów, powstałe na drodze bezpłciowej i płciowej, które nadal pozostają oporne lub co najmniej tolerują hamowanie przez herbicyd na poziomie, który ma działanie hamujące w stosunku do naturalnie występującej w roślinie aktywności protoks. Szczególnie korzystne jest stosowanie hybrydowych roślin, które są oporne lub co najmniej tolerują hamowanie przez herbicyd na poziomie, który ma działanie hamujące w stosunku do naturalnie występującej w roślinie aktywności protoks.

Komórką roślinną według wynalazku może być komórka pochodząca z rośliny dwuliściennej lub jedno liściennej. Korzystne jest stosowanie roślin jednoliściennych z rodziny Graminaceae, włączając w to Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Orjizae, Avena, Hordeum, Secale i Setaria. Szczególnie korzystne są tu rośliny: kukurydza, pszenica, jęczmień, sorgo, żyto, owies, trawy darniowe i ryż.

Wśród roślin dwuliściennych szczególnie preferowane są: soja, bawełna, tytoń, burak cukrowy, rzepak i słonecznik.

Stosowany dalej termin „potomstwo” obejmuje potomstwo komórek transgenicznych i roślin powstałe zarówno na drodze „bezpłciowej” jak i „płciowej”. Definicja ta dotyczy również wszystkich mutantów i wariantów, które można otrzymać za pośrednictwem znanych sposobów, takich jak na przykład fuzja komórek lub selekcja mutantów, które nadal wykazują charakterystyczne właściwości wyjściowej transformowanej rośliny, łącznie ze wszystkimi produktami krzyżowania i fuzji transformowanego materiału roślinnego.

Stosowany dalej termin „materiał do namnażania” jest zdefiniowany jako dowolny materiał, który może być namnażany na drodze płciowej lub bezpłciowej in vivo lub in vitro. Szczególnie korzystnym materiałem są protoplasty, komórki, kalus, tkanki, narządy, nasiona,

184 242 zarodki, pyłek, komórki jajowe, zygoty, łącznie z dowolnym innym materiałem rozrodczym otrzymanym z transgenicznych roślin.

Przed sprzedażą roślinnego materiału rozrodczego jako produktu handlowego (owoce, bulwy, ziarno, nasiona) jest on zwykle traktowany ochronnym materiałem powlekającym zawierającym herbicydy, insektycydy, fungicydy, środki przeciw bakteriom, nicieniom i ślimakom lub mieszaninę kilku tych preparatów, jeżeli trzeba, łącznie z kolejnymi nośnikami, środkami powierzchniowo czynnymi lub dodatkami ułatwiającymi stosowanie, zwykle używanymi w dziedzinie wytwarzania preparatów do uzyskiwania ochrony przed uszkodzeniami powodowanymi przez szkodniki bakteryjne, grzybowe lub zwierzęce.

Na nasionach, ziarnie i bulwach powłoka ochronna jest wytwarzana przez impregnację substancją płynną lub poprzez nanoszenie kombinacji mokrych i suchych związków. W specjalnych przypadkach, możliwe jest stosowanie innych metod, np. działanie skierowane na pączki lub owoce.

Nasiona roślin zawierające sekwencję DNA kodującą białko z organizmu eukariotycznego, wykazujące aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks) mogą być traktowane powłoką chroniąca nasiona, zawierającą związki stosowane do traktowania nasion, takie jak kapłan, karboksyna, tiram (TMTD®), metalaksyl (Apron®) i pirymifos-metyl (Actellćc®) oraz inne, które są zwykle używane przy traktowaniu nasion.

Gdy allel protoks oporny na herbicyd jest otrzymany poprzez bezpośrednią selekcję w roślinie uprawnej lub kulturze komórek roślinnych, z których roślina uprawna może być zregenerowana, może być ona przeniesiona do odmian handlowych przy zastosowaniu tradycyjnych technik hodowlanych dla wytworzenia rośliny uprawnej tolerującej herbicyd bez potrzeby poddawania allelu zabiegom inżynierii genetycznej i transformowania go do rośliny. Alternatywnie, allel oporny na herbicyd może być izolowany, poddany zabiegom inżynierii genetycznej dla uzyskania optymalnej ekspresji, a następnie transformowany do pożądanej odmiany.

Geny kodujące zmieniony protoks oporny na inhibitor protoks, mogą być stosowane jako marker selekcyjny w metodach transformacji komórek roślinnych. Przykładowo, rośliny, tkanki roślinne lub komórki roślinne transformowane transgenem mogą być również transformowane genem kodującym zmieniony protoks, mogący podlegać ekspresji w roślinie. Tak transformowane komórki są przenoszone do pożywki zawierającej inhibitor protoks, w której tylko komórki stransformowane przeżyją. Inhibitorami protoks, które uważa się za szczególnie użyteczne czynniki selektywne, są: difenyloetery {np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluorometylo)fenoksy]-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorfen, 2-chloro-1-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen)}, oksydiazole, (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-( 1 -metyloetoksy)fenylo]-5-( 1,1 -dimetyloetylo)-1,3,4-oksadiazol-2-(3H)-on, cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargiloksyfenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid; chloroftalim, N-(4-chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), fenylopirazole (np. TNPP-etyl, 2-[l-(2,3,4-trichloro>fenylo)-4-mtropirazolilo-5-oksy]propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydyny (np. LS 82-556) oraz fenopilan oraz jego analogi O-fenylopirrolidynowe i piperydynokarbaminowe. Metoda ma zastosowanie dla dowolnej komórki roślinnej mogącej podlegać transformacji zmienionym genem kodującym protoks i może być użyta dla dowolnego transgenu, będącego przedmiotem zainteresowania. Ekspresja transgenu i genu protoks może być kierowana przez ten sam promotor funkcjonalny w komórkach roślinnych lub przez odrębne promotory.

Depozyty

Następujące cząsteczki wektorów zostały zdeponowane w Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street. Peoria, Illinois 61604, USA w terminie wskazanym poniżej:

Protoks-1, w wektorze pBluescript SK, zdeponowano 5 kwietnia 1994 jako pWDC-2 (#B-21238).

Protoks-2, w wektorze pFL-61, zdeponowano 5 kwietnia 1994 jako pWDC-1 (NRRL #B21237).

MzProtoks-1, w wektorze pBluescript SK, zdeponowany 20 maja 1994 jako pWDC-4 pod nazwą NRRL (#B-21260), pokazany w SEK NR ID: 5.

184 242

M.zProtoks-1, w wektorze pBluescript SK, zdeponowany ponownie 11 lipca 1994 jako pWDC-4 pod nazwą NRRL (#B-21260N), pokazany w SEK ID NR: 5.

MzProtoks-2, w wektorze pBluescript SK, zdeponowany 20 maja 1994, jako pWDC-3 pod nazwą NRRL (#B-21259), pokazany w SEK NR ID:7.

Protoks-3, w wektorze pFL61, został zdeponowany 10 czerwca 1994, jako pWDC-5 (NRRL #B-21280).

pMzC-1 Val, w wektorze pBluescript SK, został zdeponowany 30 września 1994 pod nazwą pWDC-8 i depozyt oznaczono NRRL #21340.

pAraC-2Cys, w wektorze pFL61 wektor, zdeponowano 14 listopada 1994 pod nazwą pWDC-7 i depozyt oznaczono NRRL#21339N

Przykłady

Stosowane tutaj, standardowe techniki rekombinowania DNA i klonowania, są dobrze znane w tej dziedzinie i są opisane przez T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). T.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).

Przykład 1: Izolacja cDNA dla genów kodujących protoks z Arabidopsis poprzez funkcjonalną komplementację mutanta E.coli.

Otrzymano i powielono bibliotekę cDNA Arabidopsis thaliana (Landsberg) na plazmidowym wektorze pFL61 (Minet et al., Plant J. 2:417-422 (1992)). Drugą bibliotekę cDNA Arabidopsis (Columbia) w wektorze lambda UniZap (Stratagene) zakupiono i powielono jako plazmidy pBluescript poprzez masowe wycinanie in vivo z zawiesiny wyjściowej faga. Mutant E. coli hemG SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)) został otrzymany i był utrzymywany na pożywce L zawierającej 20 mg/ml hematyny (United States Biochemicals). Bibliotekę plazmidów transformowano do SASX38, stosując elektroporację przy użyciu Bio-Rad Gene Pulser i warunki polecane przez producenta. Komórki wysiewano na agar L zawierający 100 mg/ml ampicyliny, przy gęstości około 500000 transformantów/szalkę o średnicy 10 cm. Komórki hodowano w 37°C przez 40 godzin przy słabym świetle i selekcjonowano na zdolność do wzrostu bez dodawania egzogennego hemu. Prototrofy hemowe odzyskiwano z częstością 400/10⁷ biblioteki pFL61 i z częstością 2/107 z biblioteki pBluescript. DNA plazmidowy izolowano z 24 kolonii celem analizy sekwencji. Każdy z 24 był ponownie transformowany do SASX38 celem zweryfikowania zdolności do komplementacji.

Analiza sekwencji wykazała obecność dwóch klas przypuszczalnych genów protoks. Dziewięć było typu oznaczonego jako „Protoks-1”. Każdy z nich pochodził tego samego genu, a dwa były klonami pełnej długości. cDNA miało długość 1719 bp i kodowało białko o masie cząsteczkowej 57,7 kD. N-końcowa sekwencja peptydu miała cechy charakterystyczne dla chloroplastowego peptydu sygnałowego o długości około 60 aminokwasów. Przeszukanie bazy danych programem GAP (Deveraux et al., Nucleic Acids Res. 12:387-395 (1984) ujawniło homologię z białkiem hemY (protoks) zB. subtilis (Hansson and Hederstedt 1992, Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Te dwa białka wykazują 53% podobieństwa, 31% identyczności i mają regiony wysokiej homologii, włączając w to proponowaną domenę białka hemY wiążącą dinukleotyd (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)).

innych klonów cDNA należało do typu oznaczonego jako „Protoks-2”. One również okazały się pochodzić z pojedynczego genu. Uzyskany pełnej długości cDNA ma wielkość 1738 bp i koduje białko o masie cząsteczkowej 55,6 kD. Koniec aminowy jest charakterystyczny dla mitochondrialnego peptydu tranzytowego. Białko Protoks-2 ma ograniczoną homologię do Protoks-1 (53% podobieństwa, 28% identyczności) i do protoks z B. subtilis (50% podobieństwa, 27% identyczności).

Protoks-1, w wektorze pBluescript SK, został zdeponowany 5 kwietnia 1994, jako pWDC-2 (NRRL #B-21238).

Protoks-2, w wektorze pFL61, został zdeponowany 5 kwietnia 1994, jako pWDC-1 (NRRL #B21237).

184 242 cDNA kodujący protoks-1 z Arabidopsis, zawarty wpWDC-2, iprotoks-2, zawarty w pWDC-1, są przedstawione poniżej w SEK NR ID:1 i 3, odpowiednio.

Przykład 2: Izolacja cDNA dla genów kodujących protoks z kukurydzy poprzez funkcjonalną komplementację mutantów E. coli.

Bibliotekę cDNA z Zea Mays (odmiana B73) w wektorze lambda UniZap otrzymano ze Stratagene i przekształcono w bibliotekę na plazmidzie pBluescript poprzez masowe wycięcie in vivo. Drugą handlowo dostępną bibliotekę cDNA z kukurydzy na wektorze UniZ otrzymano z firmy Clontech i podobnie przekształcono w plazmidy pBluescript. Selekcję pod kątem funkcjonalnych genów protoks z kukurydzy przeprowadzono, jak opisano powyżej w przykładzie 1 dla bibliotek Arabidopsis.

Z bibboteki Stratagene spośród 10⁷transformantów wyizolowano dwa hemowe prototrofy, dla których wykazano ponowną komplementację i ustalono sekwencję. cDNA były identyczne i udowodniono, że są homologiczne z Protoks-1 z Arabidopsis. Ten klon kukurydzy, oznaczony jako MzProtoks-1, jest niekompletny. cDNA ma długość 1698 bp i koduje jedynie przypuszczalny dojrzały enzym protoks; brak jest sekwencji peptydu tranzytowego i inicjacyjnego kodonu metioninowego. Gen jest w 68% identyczny z genem Arab Protoks-1 na poziomie nukleotydów i w 78% identyczny (87% podobieństwa) na poziomie aminokwasów (pokazane w tabeli 1).

Z biblioteki Clontech spośród 10⁷ transformantów wyizolowano jednego hemowego prototrofa, dla którego wykazano ponowną komplementację i ustalono sekwencję. cDNA okazał się kompletny, ma długość 2061 bp i koduje białko o masie 59 kD. Klon ten koduje homolog Protoks-2 z Arabidopsis i jest oznaczony jako MzProtoks-2. Gen jest w 58% identyczny z genem Arab Protoks-1 na poziomie nukleotydów i 58% identyczny (76% podobieństwa) na poziomie aminokwasów (pokazane w tabeli 2). Klon kukurydzy ma N-końcową sekwencję, która jest o 30 aminokwasów dłuższa niż klon Arabidopsis. Tak jak w przypadku klonów Arabidopsis, homologią pomiędzy dwoma genami protoks z kukurydzy jest niska, wynosi jedyme 31% identyczności między dwiema sekwencjami białkowymi.

MzProtoks-1, w wektorze pBluescript SK, zdeponowany 20 maja 1994, jako pWDC-4 pod nazwą NRRL (#B-21260), pokazany w SEK NR ID:5.

MzProtoks-1, w pBluescript SK wektor, ponownie zdeponowany 11 lipca 1994, jako pWDC-4 pod nazwą NRRL (#B-21260N), pokazany w SEK NR ID:5.

MzProtoks-2, w wektorze pBluescript SK, zdeponowany 20 maja 1994, jako pWDC-3 pod nazwą NRRL (#B-21259), pokazany w SEK NR ID:7.

Przykład 3: Izolacja dalszych genów protoks w oparciu o homologię sekwencji ze znanymi sekwencjami kodującymi protoks.

Fagowa lub plazmidowa biblioteka została wysiana przy gęstości około 10000 łysinek na płytkę Petriego o średnicy 10 cm i łysinki przeniesiono na filtr po inkubacji płytek przez noc w 37°C. Przeniesione łysinki były przeszukiwane przy użyciu jednego z cDNA z zestawu SEK NR ID:1, 3, 5 lub 7, wyznakowanego ³²P-dCTP metodą losowych starterów, stosując PrimeTime kit (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT). Warunki hybrydyzacji były następujące: 7% sodowy siarczan dodecylu (SDS), 0,5 M ŃaPO₄ pH 7, 0,1 mM EDTA w 50°C. Po prowadzonej przez noc hybrydyzacji filtry były płukane w 2X SSC, 1% SDS. Pozytywnie hybrydyzujące łysinki wykrywano poprzez autoradiografię. Po oczyszczeniu do pojedynczej łysinki, izolowano wstawkę cDNA i oznaczano jej sekwencję metodą terminacji łańcucha, stosując terminatory dideoksy wyznakowane barwnikami fluorescencyjnymi (Applied Biosystems, Inc., FosterCity, CA).

Standardowy protokół doświadczalny opisany powyżej może być użyty przez biegłego w tej dziedzinie do otrzymania genów protoks homologicznych pod względem sekwencji do znanych sekwencji kodujących protoks z dowolnego innego organizmu eukariotycznego, a w szczególności z innych gatunków roślin wyższych. Wzajemne porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych odpowiednich białek, kodowanych przez sekwencje pokazane w SEK NR ID: 2 i 6, jest przedstawione wtabeb 1. Wzajemne porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych odpowiednich białek, kodowanych przez sekwencje pokazane w SEK NR ID: 4 i 8, jest przedstawione w tabeli 2.

184 242

Tabela 1

Porównanie sekwencji aminokwasowych Protoks-1 z Arabidopsis (SEK NR ID 2) i kukurydzy (SEK NR ID 6)

Procent podobieństwa: 87,137 Procent identyczności: 78,008

Protoks-I.Pep x Mzprotoks-I.Pep

GGTTITTDCVIVGGGISGLCIAQALATKHPDAAPNLIVTEAKDRVGGNII 100 • . III : I I I I I l l l I i l l l l l l : l ll l l l . l lll .

.. .. NSADCWWGGGISGLCTAQALATRH. .GVGDVLVTEARARPGGNIT 44

101 T.iREENGFLWEEGPNSFQPSDPMLTM\WDSGLKDDLVLGDPTAPRFVLW 148

I l - l : l : l l l II II II I I I I I : I I I . I I IIII IIII : II I . I I IM I I

TVERPEEGYLWEEGPNSFQPS^E^E^\^I^^r^^AVDSGLKDDLVFGDPNAPRFVI^W 94

149 NGKLRPVPSKLTDLPFFDL^^IGGKIRAGF^^:^(^:ERJPSPPGREESVEEFV 198 : ll l l l l l l l . l l l lllllll- II:IlI:lllll l l · l l l l l l l l l I I I 95 EGKL^VPSKPADLPFF^DIIS:[E^C^i^I^^GL^^]^i^:i^PPPGREESVEEFV 144

199 RRN LGDEVFERL IEPFCSGYYAGDPSKLSWKAAFGKyWK^NGGSIIGG 248

II I II - III II I l l l lllll l IllllllllIIII I III: II: - Il l ll I I

145 RRNLGAEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSLKAAFGKVWRLEETGGSIIGG 194

249 TFKAIQERKNAP KAERDPRLPKPQGQTVGSFRKGLRILPEAISAHIGSKy 298

I: I - l l l l · i - l I : - l l : l l l l l - l l l l : l II I I II I : I I · - · I Il I I 195 TIKTIQERSKNPKPPRDARLPKPKGQTVASFRKGLAMLPNAITSSLGSKV 244

299 KLSWI^I^^(^:iTKL]ESGGY^:^TY]STPDGLVSVQSKSW^T:^P£^t^^^SGLLRP 348 l l l l l l · : l l l : - II I - l lll : l : l l l l · l l l : l l : l l · l l I · : l l I

245 KLSWKLLTITKSDDKGYVLEYEEPEGVWSVQAKSVIL^,TIPSYVASNILRP 294

349 LSESAANALSKLYYPPV2AA/SISYPKEAIRTECLIDGELKGFGQLHPRTQ 398

II· · I I : I I I: : III III I I·:I I I IIIII.|II I III I-IIIIIIII.I 295 LSSDAADALSRFYYPPVAAVTVSYPKEAIRICCLIDGELQGFGCLHPRSQ 344

399 GVETLGTIYSSSLFPNRAPPGRIILLNYIGGSTNTGILSKSEGELVEAVD 448

III I IIIIIIII IIII III-II:I I IIII I I . I I I I I : I I . I : I l l l l l l

345 gvetigtiyssslfpnrapdgrviiinyiggatntgivskteseiveavd 394

449 RDLRKHKPNSTDPLKLGVRVWPQAIPQFLVGHFDILDTAKSS LTSSGY 498 llllI III.....l l l ll l I I l l I I l l l l I I l l : l:l:·II·· I · · : II

395 RDLRK^I^i:NSTAVDPLVLGVRVWi^P^/^IPQFLVGHLDLLE^A^KAAIiDRGGY 444

99 EGLFLGGNYVAGVALGR^'^^(^/^:^Y^T^_jA:IEVNNF^^RYAYK* 538 : III I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I : : - : I: - : I I l I I 445 DGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAAYSASQISDFLTKYAYK* 484

Identyczne reszty są oznaczone poprzez pionowe kreski pomiędzy dwiema sekwencjami. Porównamie sekwencji zostało wykonane przy zastosowaniu programu GAP opisanego w Deveraux et al., Nucleic Acids Res. 12387-395 (1984).

184 242

Tabela 2

Porównanie sekwencji aminokwasowych Protoks-2 z Arabidopsis (SEK NR ID 4) i kukurydzy (SEK NR ID 8)

Procent podobieństwa: 75.889 Procent identyccziości: 57.905 Protoks-2. Pep x Mzprotoks-2.Pep

............................MASGAVAD. HQIEAVSGIR<VAV 21 .1 I:I: .: |..::.

MLjA^'^.^^AS£^^i^:^I^]^:nHĄ^i^jHH^T^IU^RI^IAV^IAMAGiSDDP^^ARSVAV 50

VGAGVSGLAAAYKLKSRGLNVTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT 71 III II II III I I : I : . I : I III I II . : I . III: I . : . I : : II II II I

VGAGVSGLAAAYRLRQSGVNVTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDEGANT 100

M^1^,A^^EVGS LLDDLGLREKQQfFISQKKRYIVRNG\V?¹V>lLLTNPIELVT 121 III: I I. : - I : II III . : II I : I I 1 . I 1 I I I : : I . I . : : 1. : II- I : .

101 MTEGEWWASRLIDDLGLQDKQQQPNSVHKRHVGDDAAAAIISDPIVIMK 150

122 SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK....KSSKVSDASTE2ESVEEFQQRHFGQE 167 Ii II II . II : . : : : III I : II . I : III: . . II I : . 1 : I 1 I I . I

151 SSVLSTKSKIALFEEFLYKiKA\NTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGRE 200

168 W/DYLIDPFVGGTSAAD)EDSLSMKHSFEDLWJVGKSVFSIIVGAIITKFA 217 l l l l : : l l l l : l l l l : I I : l l l : : l . l l . l l l : l : . : l l : l l l l l -Ul 201 WDYFVDEFVAGTSAGDEESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA 250

218 AKGGKSϊR^TKSSEGTKKGSRGSFSFKGGMQILLDTLCKSLSHDEINLDVK 267 III:- : · . . I . I . : : . . I - I I I I . I I | I I : . | . . :: . 1 : : . I : . .

251 AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLIN2LHNEVGDDNVKLGTE 300

268 VLSŁS..YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ...NEHYDAVIMTAELCNVK 312 I III· : :: . . : . II : l . l l . : l l l l l l l l l : l l :

301 VLSLACTFDGVEALGRWSISVDSKDSGDKDLASNQTFDAVIMTAPLSNVR 350

313 EMCVGMGGQPFQLNFLPEINYYMELVGITTFTK£KVIK^:R^>LEGFGVGIPSK 362

II. Ill.|. M I I I .: : | : I I I : :: | . | . | : . I I i l I l I I l llll l

351 RMKFTKGGGAyWLDFLEKMDYLPLSLMyTAFKKDDyKKPLEGFGyLIEYK 400

363 E . QKHGFKTLGTLFSSMM'FDRIPSDGHLYTTFIGGSRNQELAKASTDEL 411 1 II1 I : II I 1 I II III II II I . l . l . II II l : II 1 : 1 . : II l . I - I 401 EQQKHGLKTLGTLFSIM1FFDHPDDQYYLYTTVGGSHHRILLAAPESIL 4 50

412 KQVVTSDLQRLLGVEGEPVSVNHYYWRi«A'FLYDSSYDSVMEAIDKMlEND 4 61

II : II II I . : II II l l : l . l·l ll -lllI I: :I. I I : I I I : I I I . :

51 KQLVTSDLKKLLGVEGQPTFVKHVYWWNNAFEYGHHYSSVLEAIEiMEKN 500

62 LEGFFYAGNHRGGGLVGKSIASGCCKAADLISYLESCSNDK]K>NDSL* 50 9

III II II I I :: II . II . II II : II II I . I I I II I ......:

501 LEGFFYAGNSKDGYAAGSVIASGSIKAA>YLISYYESHEKHNNSH*. . . 545

184 242

Przykład 4: Izolowanie będącego zanieczyszczeniem drożdżowego klonu protoks z biblioteki cDNA Arabidopsis.

W celu podjęcia próby identyfikacji rzadko występujących cDNA niosących aktywność protoks, dokonano ponownego przeszukania biblioteki Arabidopsis na wektorze pFL61, znowu uzyskując setki komplementujących klonów. Około 600 z nich wyszczepiono na osobne płytki szablonowe i hodowano w28°C przez 18 godzin. Wykonano dwie repliki kolonii na filtrach Colony/Plaque screen (NEN), zgodnie z instrukcjami producenta. cDNA Protoks-1 i Protoks-2 wycięto z wektorów poprzez trawienie odpowiednio, EcoRI/Xhol i Notl. Wstawki rozdzielano poprzez elektroforezę w 1,0% agarozie SeaPlaque gTg (FMC), wycinano i znakowano ³²P stosując losowe startery (Life Technologies). Jeden zestaw filtrów hybrydyzowano z każdą z sond. Hybrydyzacja i warunki płukania były jak opisane w Church and Gilbert, 1984.

Kolonie (-20), które nie hybrydyzowały wyraźnie z Protoks-1 lub Protoks-2, namnażano w płynnej hodowli i otrzymywano plazmidowy DNA. DNA trawiono Notl, powtórzone próbki poddawano elektroforezie w 1,0% żelu agarozowym, a następnie przenoszono metodą Southema na filtr Gene Screen Plus (NEN) [New England Nuclear]. Sondy dla dwóch znanych genów protoks znakowano i hybrydyzowano jak poprzednio. Dwa identyczne klony nie były ani Protoks-1 ani Protoks-2. Wykazano, że ten klon ponownie komplementuje mutanta SASX38, jakkolwiek rośnie bardzo wolno, i nazwano go Protoks-3.

Protoks-3, w wektorze pFL61, został zdeponowany 8 czerwca 1994 jako pWDC-5 (NRRL #B-21280). Stwierdzono, że ta sekwencja kodująca pochodzi z DNA drożdży, które było obecne jako niewielkie zanieczyszczenie biblioteki cDNA Arabidopsis. Drożdżowy DNA kodujący protoks-3, zawarty w pWDC-5, jest przedstawiony poniżej w SEK NR ED:9.

Przykład 5: Wykazanie wrażliwości roślinnego klonu protoks na herbicydy hamujące protoks w systemie bakteryjnym.

Płynne kultury Protoks-l/SASX38, Protoks-2/SASX38 i pBluescript/XLl-Blue były hodowane w L amp™. Próbki po sto mikrolitrów z każdej hodowli wysiewano na pożywkę L amp¹⁰⁰, zawierającą różne stężenia (1,0 nM-I 0 mM) arylouracylu-herbicydu hamującego protoks o wzorze 17. Powtórzoną serię płytek hodowano przez 18 godzin w 37°C przy słabym świetle lub w kompletnej ciemności.

Szczep E. coli XL1-Blue nie wykazywał wrażliwości na żadne stężenie herbicydu, co pozostaje w zgodzie z opisywaną opornością natywnego bakteryjnego enzymu na podobne herbicydy. Protoks-1/SASX3 8 był wyraźnie wrażliwy, z murawą bakterii prawie całkowicie wyeliminowaną przy tak małym stężeniu inhibitora, jak 10 nM. Protoks-2/SASX38 był również wrażliwy, ale jedynie przy wyższym stężeniu herbicydu (10 M). Wpływ herbicydu na oba szczepy z roślinnym protoks był bardziej dramatyczny przy słabym świetle, ale również widoczny na płytkach trzymanych w całkowitej ciemności. Toksyczność herbicydu była całkowicie wyeliminowana poprzez dodanie do płytek 20 mg/ml hematyny.

Różna tolerancja wobec herbicydu dwóch szczepów z roślinnym Protoks jest prawdopodobnie raczej wynikiem zróżnicowanej ekspresji z tych dwóch plazmidów niż jakąś swoistą różnicą we wrażliwości enzymu. Protoks-1/SASX3 8 rośnie znacznie szybciej niż Protoks2/SASX3B w każdej pożywce nie zawierającej hemu. Dodatkowo, szczep MzProtoks-2/SASX38, który rośnie porównywalnie z Arab Protoks-l/SASX38, jest również bardzo wrażliwy na herbicyd w niższych (10-100nM) stężeniach. Wstępna charakterystyka drożdżowego Protoks-3 wykazała, że jest on również wrażliwy na herbicyd.

Przykład 6: Selekcjonowanie roślinnych genów protoks opornych na herbicydy hamujące protoks w systemie ekspresji E. coli.

Hamowanie roślinnych enzymów protoks w systemie bakteryjnym jest użyteczne przy poszukiwaniach na dużą skalę mutacji opornych na herbicyd w genach roślinnych. Wyjściowe doświadczenia z odpowiedzią na dawkę, wykonane poprzez wysiew z hodowli płynnych, prowadziły do powstania z dużą częstością „opornych” kolonii nawet przy wysokich stężeniach herbicydu. Oporność ta nie była zależna od plazmidu, co stwierdzono w oparciu o ponowną transformację/test na wrażliwość na herbicyd. Transformacja plazmidów Protoks do mutanta SASX38 i bezpośrednie wysianie na płytki zawierające herbicyd, prawie całkowicie redukują ten problem tła.

184 242

Roślinne plazmidy protoks mutagenizuje się na wiele sposobów, stosując opublikowane procedury mutagenezy chemicznej (np. dwusiarczkiem sodowym (Shortle et al., Methods Enzymol. 100:457-468 (1983); metoksylaminą (Kadonaga et al., Nucleic Acids Res. 13:1733-1745 (1985); mutagenezę saturacyjną za pośrednictwem oligonukleotydów (Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 83:710-714 (1986); lub różne strategie oparte o błędne włączanie przez polimerazę (patrz, np. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1588-1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64313-319 (1988); and Leung et al., Technique 1:11-15 (1989)). Spodziewane mutanty o podwyższonej aktywności promotora po mutagenezie całego plazmidu są eliminowane poprzez ponowne klonowanie sekwencji kodującej do wektora typu dzikiego i powtórzenie testu. Zakładając, że wyższa ekspresja prawdopodobnie prowadzi do lepszego wzrostu w nieobecności herbicydu, możliwe jest również wizualne poszukiwanie mutantów w sekwencji kodującej.

Dowolny roślinny gen protoks, wywołujący oporność na herbicyd w systemie bakteryjnym, może być poddany zabiegom inżynierii genetycznej celem uzyskania optymalnej ekspresji i transformowany do roślin przy zastosowaniu opisanych tu standardowych technik. Otrzymane w rezultacie rośliny mogą być następnie traktowane herbicydem dla ilościowego potwierdzenia poziomu oporności warunkowanej przez wprowadzony gen protoks.

Przykład 7: Konstrukty do ekspresji opornego na herbicyd genu (ów) protoks z mikroorganizmów w roślinach.

Sekwencje kodujące genu protoks hem Y zB. subtilis (Hansson and Hederstedt, J. Bacteriol.174: 8081 (1992); Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)) i genu protoks hemG z E coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) zostały wyizolowane ze szczepów laboratoryjnych poprzez powielanie w reakcji PCR, stosując standardowe warunki i startery otaczające te geny, zaprojektowane na podstawie opublikowanych sekwencji. Wiadomo, że geny te kodują postaci enzymu protoks oporne na herbicyd.

Stosując standardowe techniki fuzji zachodzących na siebie produktów PCR (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. (1994)), oba bakteryjne geny zostały dołączone do dwóch różnych sekwencji chloroplastowych peptydów tranzytowych (CTP) z Arabidopsis. Pierwszym był CTP z syntetazy kwasu acetohydroksylowego, który powinien umożliwić import do stromy chloroplastów. Druga była z genu dla plastocyjaniny z Arabidopsis (Vorst et al., Gene 65: 59 (1988)), który ma dwuczęściowy peptyd tranzytowy. Aminokońcowa część tego CTP kieruje białko do chloroplastów, gdzie koniec karboksylowy wprowadza je do membran tylakoidu. Wszystkie cztery fuzje genowe zostały sklonowane za promotorem 2x35S w binarnym wektorze ekspresyjnym zaprojektowanym do wytwarzania transgenicznych roślin poprzez transformację z użyciem Agrobacterium.

Po wyizolowaniu cDNA dla protoks z Arabidopsis i kukurydzy, chloroplastowy peptyd tranzytowy z Protoks-1 lub MzProtoks-1 może być również połączony z dwoma bakteryjnymi białkami protoks w taki sam sposób jak wyżej.

Opisane powyżej wektory mogą być następnie transformowane do żądanych gatunków roślin i otrzymane transformanty testowane pod kątem wzrastającej oporności na herbicyd.

Przykład 8: Zamiana domen między genami Arabidopsis/B.subtilis, celem wytworzenia protoks chimerowego, opornego na herbicydy.

Jednym z podejść, które mogą być zastosowane do wytworzenia genu protoks, który jest zarówno oporny na herbicyd, jak i zdolny do dostarczania skutecznej aktywności enzymatycznej protoks w roślinie, jest łączenie części (jednej lub wielu) bakteryjnego i roślin-nego genu protoks. Powstałe w rezultacie chimerowe geny mogą być przeszukiwane pod kątem takich, które mają zdolność dostarczania komórce roślinnej opornej na herbicydy aktywności protoks. Przykładowo, sekwencje peptydu protoks z Arabidopsis i B. subtilis (hemY) są podobne, z regionami o wysokiej homologii. Sekwencję kodującą hemY klonuje się w plazmi-dzie pBluescript i testuje na zdolność do ekspresji w SASX38 aktywności protoks opornej na herbicydy. Chimerowe geny Protoks1/hem Y są konstruowane przy zastosowaniu technik fuzyjnej reakcji PCR, a następnie powtórną ligację do wektora pBluescript. Wyjściowa wymiana dotyczy środka białka. Fuzje te są testowane pod kątem funkcji protoks poprzez komplementację, a następnie testowane na oporność na herbicyd poprzez wysianie na herbicyd, z nienaruszonymi Protoks-1 i hemY jako kontrolą.

184 242

Przykład 9: Wytwarzanie roślin tolerujących herbicyd poprzez nadprodukcję roślinnych genów protoks.

Celem uzyskania ekspresji białka Arabidopsis lub kukurydzy w transgenicznych roślinach, odpowiednie pełnej długości cDNA wstawiono do roślinnego wektora ekspresyjnego pCGNI 761 ENX, który powstał zpCGNI761 jak następuje. PCGN1761 został strawiony w swoim unikalnym miejscu EcoRI i poddany ligacji z dwuniciowym fragmentem DNA, zawierającym dwie sekwencje oligonukleotydowe 5' AAT TAT GAC GTA ACG TAG GaA TTA GCG GCCC GCT CTC GAG T 3' (SEK NR ID: 11) i 5' AAT TAC TCG AGA GCG GCC GCG AAT TCC TAC GTT ACG TCA T 3' (SEK Nr ID: 12). Uzyskany w rezultacie plazmid, pCGNI761 ENX, zawiera unikalne miejsca EcoRI, Notl i XhoI, które leżą pomiędzy podwojonym promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiora (Kay et al., Science 236:1299-1302 (1987)) i nie podlegającymi translacji sekwencjami 3' genu tml z Agrobacterium tumefaciens. Plazmid ten jest trawiony i poddawany ligacji z fragmentem powstałym w wyniku trawienia enzymami restrykcyjnymi jednego z plazmidów niosących cDNA protoks, tak, że przenosi on kompletny cDNA protoks. Z takiego plazmidu wycinany jest fragment Xbal zawierający cDNA protoks z Arabidopsis, otoczony przez podwojony promotor 35S i nie podlegające translacji sekwencje 3' genu tml z A. tumefaciens. Ten fragment Xbal jest wstawiony do binarnego wektora pCIB200 w jego pojedyncze miejsce Xbal, które leży między sekwencjami granicznymi T-DNA. Otrzymany w rezultacie plazmid, oznaczony jako pCIB200 protoks jest transformowany do szczepu A. tumefaciens CIB542. Patrz np. Uknes et al., Plant Celi 5:159-169 (1993).

Dyski liściowe Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc są infekowane A. tumefaciens CIB542, niosącym pCIB2001GPD, tak, jak opisano wHorsch et al, Science 227:1229 (1985). Pędy oporne na kanamycynę z 15 niezależnych dysków liściowych przeniesiono do pożywki do ukorzeniania, a następnie przesadzano do gleby i uzyskane w rezultacie rośliny hodowano w szklarni do osiągnięcia dojrzałości. Nasiona z tych roślin zbierano i pozostawiano do skiełkowania na agarze MS zawierającym kanamycynę. Wiele indywidualnych kiełków opornych na kanamycynę z każdego niezależnego pierwotnego transformanta hodowano do dojrzałości w szklarni, a ich nasiona zbierano. Nasiona te kiełkowały na pożywce agarowej MS zawierającej kanamycynę.

Linie roślinne, które dawały wyłącznie kiełki oporne na kanamycynę są homozygotyczne dla wstawionego genu i są poddane dalszej analizie. Dyski liściowe z 15 niezależnych linii transgenicznych są wycinane z krążkiem papieru i umieszczane na agarze MS zawierającym różne wzrastające stężenia herbicydu hamującego protoks.

Po trzech tygodniach dwa zestawy po 10 dysków z każdej linii ważono i wyniki rejestrowano. Linie transgeniczne bardziej oporne na inhibitor niż nie transformowane rośliny dzikiego typu wybierano do dalszej analizy.

Z liści z każdej z tych linii izoluje się RNA. Totalny RNA z każdej niezależnej linii homozygotycznej i z nietransgenicznych roślin kontrolnych rozdziela się poprzez elektroforezę w żelu agarozowym w obecności formaldehydu (Ausubel et al., Current Protocols w Molecular Biology, Wiley & Sons, New York (1987)). Przeprowadza się transfer z żelu na filtr (Ausubel et al., supra.) i hybrydyzuje się z wyznakowanym radioaktywnie cDNA protoks z Arabidopsis. Hybrydyzacja i warunki płukania są takie, jak opisane przez Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995 (1984). Filtr jest poddawany autoradiografii; intensywne pasma RNA odpowiadające transgenowi protoks wykrywa się we wszystkich liniach roślin transgenicznych tolerujących herbicyd.

W celu dalszej oceny oporności linii nadprodukującej protoks, rośliny są hodowane w szklarni i poddane działaniu różnych stężeń herbicydu hamującego protoks.

Przykład 10: Wzrost komórek tytoniu w kulturze zawiesinowej.

Pożywki:

MX1: Pożywka ta składa się z roztworu soli podstawowych Murashige i Skoog („MS”, T. Murashige et al., Physiol. Plant. 15:·473-497,1962), soli dodatkowych iFe-EDTA (Gibco # 5001117; 4,3 g/l), 100 mg/l mioinositolu, 1 mg/l kwasu nikotynowego, 1 mg/l pirydoksyny-HCl,

184 242 mg/l tiaminy-HCl, 2-3 g/l sacharozy, 0,4 mg/l kwasu 2,4-dich.lorofenoksyoctowego oraz 0,04 mg/l kinetyny, pH 5,8. Pożywkę sterylizuje się poprzez autoklawowanie.

N6: Pożywka to zawiera makroelementy, mikroelementy oraz Fe-EDTA jak opisano przez C-C. Chu et al., Scientia Sinica 18659 (1975) i następujące związki organiczne : pirydoksynęHC1 (0,5 mg/l), tiaminę-HCl (0,1 mg/l), kwas nikotynowy (0,5 mg/l), glicynę (2,0 mg/l) oraz sacharozę (30,0 g/l). Roztwór jest autoklawowany. Końcowe pH wynosi 5,6.

Uwagi: Makroelementy są przygotowywane jako 10x stężony roztwór wyjściowy, a mikroelementy jako 1000x stężony roztwór wyjściowy. Roztwór wyjściowy witamin jest normalnie sporządzany jako 100x stężony.

Zawiesinę komórek Nicotiana tabacum, linii S3 (Harms and DiMaio, J. Plant Physiol 137, 513-519,1991) hoduje się w płynnej pożywce hodowlanej MX1. 100 ml kolby Erlenmeyera zawierające 25 ml pożywki MX1 zaszczepia się 10 ml kultury komórek hodowanych uprzednio przez 7 dni. Komórki inkubuje się w 25°C w ciemności w wytrząsarce orbitalnej przy 100 rpm (skok 2 cm). Komórki hoduje się dalej, co 7 dni przeszczepiając próbkę do świeżej pożywki, poprzez zlanie lub odpipetowanie 90% zawiesiny komórek, a następnie uzupełnienie świeżej pożywki, tak aby uzyskać żądaną objętość zawiesiny. 5-8 gramów świeżej masy komórkowej wytwarza się w ciągu 10 dni hodowli z inokulum 250-350 mg komórek.

Przykład 11: Wytwarzanie kultur komórek tytoniu tolerujących herbicydyinhibitory protoks poprzez wysiew komórek na zestaloną pożywkę selekcyjną.

Komórki są wstępnie hodowane tak, jak w przykładzie 10. Komórki zbiera się poprzez umożliwienie im sedymentacji lub poprzez krótkie wirowanie przy 500 x g, a pożywkę odrzuca się. Komórki rozcieńcza się następnie w świeżą pożywką hodowlaną celem uzyskania gęstości komórek odpowiedniej do wysiewu komórek, czyli około 10000 jednostek tworzących kolonie na ml. W celu wysiania, komórki w małej objętości pożywki (około lml) rozprowadza się równo na powierzchni zestalonej pożywki hodowlanej (MXI, 0,8% agar), zawierającej żądane stężenie inhibitora.

Stosowano około 20-30 ml pożywki na płytkę Petriego o średnicy 10 cm. Odpowiednie stężenie inhibitora określa się z krzywej odpowiedzi na dawkę (przykład 14) i jest ono co najmniej dwukrotnie wyższe niż IC₅₀ komórek wrażliwych typu dzikiego.

Płytki hodowlane zawierające komórki wysiane na pożywkę selekcyjną inkubuje się w normalnych warunkach wzrostu w 25-28°C w ciemności aż do utworzenia kolonii komórek. Pojawiające się kolonie komórek są przenoszone do świeżej pożywki zawierającej inhibitor o pożądanym stężeniu.

W korzystnej modyfikacji opisanej metody, hodowana wstępnie kultura zawiesinowa komórek jest najpierw wysiewana w małej ilości pożywki hodowlanej na powierzchnię zestalonego agaru. Dodaje się równą ilość ciepłej płynnej pożywki agarowej (1,2-1,6% agaru), trzymanego w formie upłynnionej w temp. około 40°C, i płytkę natychmiast przechyla się łagodnie, równo rozprowadzając komórki na powierzchni pożywki i mieszając komórki z pożywką agarową, zanim pożywka się zestali.

Alternatywnie, komórki miesza się z roztopioną pożywką agarową przed wysianiem na powierzchnię pożywki selekcyjnej. Sposób ten ma tą zaletę, że komórki są zagłębione i unieruchamiane w cienkiej warstwie zestalonej pożywki, na powierzchni pożywki selekcyjnej. Pozwala to na lepsze napowietrzanie komórek w porównaniu z komórkami zagłębionymi w całkowitej objętości 20-30 ml.

Przykład 12: Wytwarzanie kultur komórek tytoniu tolerujących herbicyd-inhibitor protoks poprzez hodowanie komórek w płynnej pożywce selekcyjnej.

Komórki hodowane tak, jak w przykładzie 10 są dodawane przy odpowiedniej gęstości kultury jako inokulum do pożywki płynnej MX1, zawierającej pożądane stężenie herbicyduinhibitora protoks. Komórki inkubuje się i hoduje tak, jak w przykładzie 10. Komórki są pasażowane po upływie 7-10 dni, z uwzględnieniem tempa wzrostu, przy zastosowaniu świeżej pożywki zawierającej pożądane stężenie inhibitora.

W zależności od zastosowanego stężenia inhibitora, wzrost komórek może być wolniejszy niż w przypadku braku inhibitora.

184 242

Przykład 13: Wytwarzanie komórek tytoniu o podwyższonym poziomie enzymu protoks.

Celem otrzymania kultury komórek lub kalusa o podwyższonym poziomie enzymu protoks, kultury płynne lub kalus przenoszone są sukcesywnie, do wzrastających skokowo stężeń herbicydu-inhibitora protoks. W szczególności przeprowadzone są następujące etapy:

W celu otrzymania kultury zawiesinowej, kolonie komórek, pojawiające się ponad wysianymi komórkami z przykładu 11, są przenoszone do płynnej pożywki ΜΧ1 zawierającej takie same stężenie inhibitora protoks, jak stosowane przy selekcji według przykładu 11. Alternatywnie, wybrane zawiesinowe kultury komórkowe z przykładu 12 są dalej kodowane w pożywce płynnej ΜΧ1 zawierającej takie same stężenie inhibitora protoks, jak stosowane przy selekcji według przykładu 12. Kultury sąpasażowane 1-20 razy w odstępach tygodniowych, a następnie przeniesione do pożywki ΜΧ1, zawierającej kolejne wyższe stężenie herbicydu. Komórki są następnie hodowane przez 1-10 pasaży w pożywce zawierającej to wyższe stężenie herbicydu. Komórki przenosi się następnie do pożywki Mxl zawierającej kolejne wyższe stężenie herbicydu.

Alternatywnie, kawałki wybranego kalusa z przykładu 11 przenosi się do zestalonej pożywki ΜΧ1, uzupełnionej pożądanym stężeniem herbicydu. Przeniesienie do wyższych stężeń herbicydu odbywa się według procedury omówionej w poprzednim paragrafie, z tym wyjątkiem, że stosowana jest zestalona pożywka.

Przykład 14: Pomiar wzrostu komórek w kulturach zawiesinowych, zależnego od dawki herbicydu.

W celu otrzymania krzywej odpowiedzi na dawkę oznaczono wzrost komórek przy różnych stężeniach herbicydu. Zawiesinową kulturę komórek S3 tytoniu typu dzikiego, wrażliwych na herbicyd-inhibitor protoks oraz wyselekcjonowanych lub transgenicznych komórek S3, tolerujących herbicyd hoduje się wstępnie na pożywce płynnej, tak jak w przykładzie 11, przy dużej gęstości, przez 2-4 dni. Komórki są przemywane, resztki pożywki odrzucane i dodawana jest świeża pożywka bez herbicydu do uzyskania pożądanej gęstości komórek (około 150 mg FW komórek na ml zawiesiny).

Próbkami po 2,5 ml zawiesiny komórek, zawierającymi około 250-300 mg FW komórek, zaszczepiano następnie około 30 ml pożywki płynnej o żądanym stężeniu herbicydu, zawartej w 100 ml kolbie Erlenmeyera. Dbano, aby każdą kolbę zaszczepić taką sama ilością komórek. Każda kolba zawierała taką samą objętość pożywki. Dla jednego stężenia herbicydu szczepiono 3-6 powtórzonych kolb. Dobrano stężenia herbicydu od zera (=kontrola), 0,1 ppb, 0,3 ppb, 1 ppb, 3 ppb, 10 ppb, 30 ppb, 100 ppb, 300 ppb, 1000 ppb, 3000 ppb, i 10000 ppb. W momencie zakładania hodowli pobierano również kilka próbek komórek stanowiących inokulum dla określenia masy komórkowej użytej jako inokulum na kolbę.

Komórki inkubuje się następnie w kontrolowanych warunkach w 28°C w ciemności przez 10 dni. Komórki są zbierane poprzez wylanie zawartości każdej kolby na krążki bibuły filtracyjnej, połączonej z próżniowym urządzeniem ssącym, celem usunięcia całego płynu i otrzymania masy stosunkowo suchych świeżych komórek. Świeża masa jest następnie ważona. Sucha masa próbek może być otrzymana po wysuszeniu.

Wzrost komórek jest określany i wyrażany jako komórki uzyskane wciągu 10 dni i przedstawiany w procentach względem komórek rosnących w nieobecności herbicydu, zgodnie ze wzorem: (końcowa masa komórek rosnących w obecności herbicydu minus masa x 100 podzielona przez końcową masę komórek rosnących bez herbicydu minus masa inokulum). Wartości IC₅₀ są określone na podstawie wykresów lub płotów (względna masa komórek wobec stężenia herbicydu). 1050 oznacza stężenie herbicydu, przy którym wzrost komórek stanowi 50% wzrostu kontrolnego (komórki rosnące w nieobecności herbicydu).

W modyfikacji metody, kilka kawałków kalusa pochodzącego z kultury komórek opornych na herbicyd, takich jak otrzymane w przykładach 11 i 13, przenosi się na zestaloną pożywkę do hodowli kalusa, zawierającą różne stężenia herbicydu. Względny wzrost określa się po okresie hodowli przez 2-6 tygodni poprzez ważenie kawałków kalusa i porównanie z kontrolną kulturą hodowaną na pożywce bez herbicydu. Jednakże metoda zawiesinowa jest korzystniejsza ze względu na większą dokładność.

184 242

Przykład 15: Określenie tolerancji krzyżowej

Celem określenia stopnia w jakim komórki wykazują tolerancję wobec analogicznych lub innych herbicydów, przykład 14 jest powtarzany poprzez hodowanie komórek przy wzrastających stężeniach wybranych herbicydów. Dla porównania, dla każdego herbicydu określony jest względny wzrost komórek i ich wartość IC₅₀.

Przykład 16: Określenie stabilności fenotypu tolerancji na herbicyd w czasie.

W celu określenia, czy fenotyp tolerancji na herbicyd kultury komórkowej jest utrzymywany w czasie, komórki przenosi się z pożywki zawierającej herbicyd do pożywki bez herbicydu. Komórki hoduje się tak, jak opisano w przykładzie 10, w nieobecności herbicydu przez okres 3 miesięcy, stosując regularne pasażowanie w odpowiednich odstępach czasu (7-10 dni dla kultur zawiesinowych; 3-6 tygodni dla kultury kalusowej). Znane ilości komórek przenosi się następnie z powrotem do pożywki zawierającej herbicyd i hoduje się przez 10 dni (hodowla zawiesinowa) lub 4 tygodnie (hodowla kalusowa). Względny wzrost określa się tak, jak w przykładzie 14.

Przykład 17: Indukcja i hodowla embrioidalnego kalusa z tkanki tarczki kukurydzy.

Kłosy są zbierane z samozapylonych roślin kukurydzy w osobnej linii Funk 2717 12-14 dni po zapyleniu. Łuski są usuwane i kłosy sterylizowane przez około 15 minut poprzez wytrząsanie w 20% roztworze handlowo dostępnego wybielacza Chlorox z kilkoma kroplami detergentu dodanego dla lepszego zwilżania. Kłosy płucze się następnie kilka razy sterylną wodą. Kolejne etapy przeprowadza się aseptycznie pod sterylnym wyciągiem. Zarodki o długości 1,5-2,5 mm usuwa się z ziaren szpatułką i umieszcza się, osią zarodkową skierowaną w dół, na pożywce hodowlanej MS zawierającej 2 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) i 3% sacharozę, utwardzonej 0,24% Gelritem®.

Embrioidalny kalus tworzy się w tkance tarczki zarodków w ciągu 2-4 tygodni hodowli w 28°C w ciemności. Kalus usuwa się z eksplantu i przenosi do świeżej zestalonej pożywki MS, zawierającej 2 mg/l 2,4-D. Pasażowanie embrioidalnego kalusa powtarza się co tydzień. Przeszczepia się jedynie części kalusa mające morfologię zarodkową.

Przykład 18: Selekcja kultur komórek kukurydzy tolerujących herbicydy inhibitory protoks

a) Selekcja przy zastosowaniu embrioidalnego kalusa : embrioidalny kalus z przykładu 17 jest przenoszony do pożywki utrzymującej kalus, składającej się z pożywki N6, zawierającej 2 mg/l 3 % sacharozę i inhibitor protoks w stężeniu wystarczającym dla opóźnienia wzrostu, ale który nie wpływa na stan zarodkowy kultury, zestalonej przy użyciu 0,24% Gelritu^R. Dla zwiększenia częstości mutacji tolerujących herbicyd, kultury mogą być przed selekcją wstępnie traktowane mutageniem chemicznym, np. sulfonianem etylometanu lub mutagenem fizycznym, np. światłem UV, w stężeniach tuż poniżej stężenia, przy którym wykrywane jest hamowanie wzrostu, tak jak się to określa w przykładzie 14. Kultury są hodowane w ciemności w 28°C. Po 14 dniach rosnący kalus jest przenoszony do świeżej pożywki o tym samym składzie. Dalszej hodowli poddaje się jedynie kultury o pożądanej zarodkowej morfologii, znanej jako luźny kalus embrioidalny o morfologii typu II. Kultury namnaża się poprzez 2-10 krotne pasażowamie kultury w odstępach tygodniowych do świeżej pożywki, dzięki czemu przeszczepiane sąjedynie najszybciej rosnące kultury. Szybko rosnące kalusy są następnie przenoszone do pożywki utrzymującej kalus, zawierającej herbicyd hamujący protoks w odpowiednim stężeniu, jak określono w przykładzie 11. Jeżeli kalus rośnie dobrze na takim stężeniu herbicydu, zwykle po około pięciu do dziesięciu co tygodniowych pasażach, kalus przenosi do pożywki utrzymującej kalus, zawierającej trzykrotnie wyższe stężenie inhibitora, i hoduje ponownie, dopóki nie otrzyma się dobrze rosnącej kultury. Proces ten jest powtarzany przy użyciu pożywki zawierającej inhibitor protoks w stężeniu dziesięciokrotnie wyższym niż odpowiednie stężenie wyjściowe, a następnie pożywki zawierającej 20-krotnie i 40-krotnie wyższe stężenia.

Po wytworzeniu odpowiedniego kalusa jest on przenoszony do pożywki regeneracyjnej, odpowiedniej dla dojrzewania zarodka i regeneracji rośliny. Embrioidalny kalus, rosnący na każdym z zastosowanych stężeń herbicydu, jest przenoszony do pożywki regeneracyjnej.

b) Selekcja przy zastosowaniu embrioidalnych kultur zawiesinowych: Embrioidalne kultury zawiesinowe w osobnej linii 2717 kukurydzy Funk są przygotowane według przykładu 24

184 242 i utrzymywane poprzez kolejne pasażowanie w odstępach tygodniowych do świeżej pożywki N6, zawierającej 2 mg/12,4-D. Dla zwiększenia częstości mutacji tolerujących herbicyd, kultury mogą być w tym czasie traktowane mutagenem chemicznym, np. sulfonianem etylometanu w stężeniu tuż poniżej stężenia, przy którym wykrywane jest hamowanie wzrostu, tak jak się to określa się w przykładzie 14. W celu selekcji, kultury przenosi się do płynnej pożywki N6 zawierającej 2 mg/l 2,4-D i stężenie inhibitora wystarczające do opóźnienia wzrostu, ale nie wpływające na stan embrioidalny kultury. Kultury hoduje się na wytrząsarce przy 120 rpm w 28°C w ciemności. W odstępach tygodniowych pożywkę usuwa się i dodaje świeżej pożywki. Kultury rozcieńcza się pożywką hodowlaną, biorąc pod uwagę ich tempo wzrostu, celem otrzymania około 10 ml upakowanych komórek z 50 ml pożywki. W każdym z kolejnych pasaży, kultury są badane i jedynie szybko rosnące kultury o pożądanej kruchej embrioidalnej morfologii są zachowywane do dalszych pasaży. Po dwóch do dziesięciu pasażach w pożywce N6 zawierającej.... tempo wzrostu kultury zwiększa się co najmniej dwu - trzykrotnie na tygodniowy pasaż. Kultury przenosi się następnie do płynnej pożywki N6, zawierającej 2 mg/l 2,4-D trzykrotnie wyższą dawkę inhibitora, niż stosowana oryginalnie. Rosnące kultury są pasażowane w tej pożywce dwa do dziesięciu razy tak, jak opisano powyżej. Szybko rosnące kultury o pożądanej luźnej, embrioidalnej morfologii wybiera się do dalszych pasaży. Szybko rosnące kultury przenosi się następnie do pożywki N6, zawierającej 2 mg/l 2,4-D i dziesięciokrotnie wyższą dawkę inhibitora, niż oryginalnie stosowana, i proces pasażowania rosnących kultur o pożądanej luźnej embrioidalnej morfologii jest powtarzany dwa do dziesięciu razy, aż do otrzymania szybko rosnących kultur. Kultury przenosi się następnie do pożywki N6, zawierającej 2 mg/l 2,4-D i 30-krotnie wyższą dawkę inhibitora, niż stosowana oryginalnie.

Dla wytworzenia embrioidalnego kalusa, w celu regeneracji roślin, kultury przenosi się najpierw z każdej zarodkowej kultury płynnej, wybranej dla wspomnianego poziomu stężenia herbicydu, na podłoże N6 zestalone 0,24% Geiriterr* i zawierające 2 mg/l 2,4-D oraz, ewentualnie stężenie inhibitora, przy którym hodowle rosły. Embrioidalny kalus przeszczepia się na świeżą pożywkę utrzymującą kalus, aż do uzyskania odpowiedniej ilości kalusa do regeneracji. Pasażuje się jedynie kultury o pożądanej zarodkowej morfologii.

Przykład 19: Regeneracja roślin kukurydzy z wybranego kalusa lub kultury zawiesinowej.

Rośliny regeneruje się z wybranych kultur embrioidalnego kalusa z przykładu 13 poprzez przeniesienie do świeżej pożywki regeneracyjnej. Stosowanymi pożywkami regeneracyjnymi są: pożywka ON6 zakładająca się z pożywki n6 bez 2,4-D, lub N61 składająca się z pożywki N6 zawierającej 0,25 mg/l 2,4-D i 10 mg/l kinetyny (6-furfuryloaminopuryny) lub N62 składającej się z pożywki N6 zawierającej 0,1 mg/l 2,4-D i 1 mg/l kinetyny, wszystkich zestalonych przy użyciu 0,24% GeirituR Kultury hoduje się w 28°C na świetle (16 godz. na dzień 10-100 mEinsteinów/m²sek z białych lamp fluorescencyjnych). Kultury pasażuje się co dwa tygodnie na świeżą pożywkę. Rośliny rozwijają się w ciągu 3 do 8 tygodni. Rośliny o wysokości co najmniej cm usuwa się z przyległego kalusa i przenosi do pożywki uko-rzeniającej.

Stosuje się różne pożywki ukorzeniające. Pożywka składa się z pożywki N6 lub MS bez witamin, bądź ze zwykłą ilością soli, bądź z solami zmniejszonymi do połowy, sacharozą zmniejszoną do 1g/l, a dalej, bądź bez związków regulujących wzrost, bądź zawierającej 0,1 mg/l kwasu a-naftalenooctowego. Kiedy tylko korzenie dostatecznie się rozwiną roślinki są prze-sadzane do mieszanki doniczkowej składającej się z wermikulitu, torfowca i ziemi ogrodniczej. W czasie przesadzania wszystkie pozostałe części kalusa są odcinane, cały agar odpłukany i liście przycinacie do połowy. Roślinki hoduje się w szklarni początkowo przez kilka dni przykryte odwróconym przezroczystym plastikowym kubkiem w celu utrzymania wilgotności, po czym hodowla jest zacieniana. Po aklimatyzacji rośliny są przesadzane i hodowane do osiągnięcia dojrzałości. Dla zapewnienia prawidłowego rozwoju roślin stosuje się nawóz Peters 20-20-20 (Grace Sierra). Po zakwitnięciu, rośliny są zapylane, najkorzystniej samozapylane.

Przykład 20: Konstrukcja wektorów do transformacji roślin.

Dostępnych jest wiele wektorów do transformacji roślin, a geny według wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z dowolnym z takich wektorów. Wybór wektora, który ma być zastosowany będzie zależał od korzystnej techniki transformacji i gatunku stanowiącego cel

184 242 transformacji. Dla niektórych gatunków docelowych, może być korzystny odmienny antybiotykowy lub herbicydowy marker do selekcji. Markery selekcyjne stosowane rutynowo przy transformacji obejmują gen nptII, który wywołuje oporność na kanamycynę i pokrewne antybiotyki (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184-187 (1983)), gen bar, który wywołuje oporność na herbicyd fosfmotrycynę (White et al., Nuci. Acids Res 18:1062 (1990), Spencer et al. Theor Appl Genet 79: 625-631 (1990)), gen hph, który wywołuje oporność na antybiotyk higromycynę (Blochinger & Diggelmann, Mol Celi Biol 4: 2929-2931) oraz gen dhfr, który wywołuje oporność na metotreksat (Bourouis et al., EMBO J. 2(7): 1099-1104 (1983)).

(1) Konstrukcja wektorów odpowiednich do transformacji z użyciem Agrobacterium

Dostępnych jest wiele wektorów do transformacji przy zastosowaniu Agrobacterium tumefaciens. Przenoszą one co najmniej jedną skrajną sekwencję T-DNA i obejmują takie wektory, jak pBIN19 (Bevan, Nuci. Acids Res. (1984)). Poniżej opisana jest konstrukcja dwóch typowych wektorów.

Konstrukcja pCIB200 i pCIB2001

Binarne wektory pCIB200 i pCIB2001 są użyte do konstrukcji zrekombinowanych wektorów celem zastosowania z Agrobacterium i zostały skonstruowane w następujący sposób. pTJS75kan został utworzony poprzez trawienie Narl plazmidu pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J Bacteriol.164: 446-455 (1985)), co umożliwiło wycięcie genu oporności na tetracyklinę, a następnie wstawienie fragmentu AccI zpUC4K niosącego NPTII (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Naturę 304:184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990)). Adaptery XhoI zostały dołączone w wyniku ligacji do fragmentu EcoRV plazmidu pCIB7, który zawiera lewy i oprawy brzeg T-DNA, roślinny marker selekcyjny-chimerowy gen nos/nptII i polilinker zpUC (Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987)), po czym fragment strawiony XhoI został sklonowany w plazmidzie pTJS75kan, strawionym Sali, z utworzeniem pCIB200 (patrz również EP O 332104, przykład 19 [1338]). pCIB200 zawiera następujące miejsca restrykcyjne w polilinkerze: EcoRI, Sstl, KpnI, Bglll, XbaI i Sali. pCI82001 jest pochodną pCIB200, która jest utworzona poprzez wstawienie do polilinkera dodatkowych miejsc restrykcyjnych. Pojedynczymi miejscami w polilinkerze pClB2001 są: EcoRI, Sstl, KpnI, Bglll, XbaI, Sali, Mlul, Bcll, AvrII, ApaI, Hpal i Stul. pCIB2001, oprócz tego, że zawiera te unikalne miejsca restrykcyjne, ma również roślinny i bakteryjny marker selekcyjny-kanamycynę, lewy i prawy brzeg T-DNA do transformacji za pośrednictwem Agrobacterium, pochodzącą od RK2 fiinkcję trfA do przekazywania pomiędzy E.coli i innymi gospodarzami oraz funkcje OriT i OrIV, również z RK2. Polilinker pCIB2001 nadaje się do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających swoje własne sygnały regulacyjne.

Konstrukcja pCIBlO i selekcja jego pochodnych na higromycynie

Binarny wektor pCIBlO zawiera gen kodujący oporność na kanamycynę do selekcji w roślinach, lewą i prawą sekwencję skrajną T-DNA i włączone sekwencje z plazmidu pRK252 o szerokim zakresie gospodarzy, umożliwiające jego replikację zarówno w E. coli, jak i Agrobacterium. Jego konstrukcja jest opisana przez Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987). Skonstruowano różne pochodne pCIBIO, w których dołączony jest gen dla fosfotransferazy higromycyny B, opisany przez Gritz et al., Gene 25:179-188 (1983)). Pochodne te umożliwiają selekcję transgenicznych roślin jedynie na higromycynie (pCIB743) lub higromycynie i kanamycynie (pCIB715, pCIB717) [Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987)].

(2) Konstrukcja wektorów odpowiednich do transformacji nie poprzez Agrobacterium.

Transformacja bez u życia Agrobacterium tumefaciens omija wymaganie sekwencji TDNA w wybranym wektorze do transformacji i w konsekwencji wektory, które nie mają tych sekwencji mogą być stosowane obok wektorów, takich jak opisane powyżej, które zawierają sekwencje T-dNa. Techniki transformacji, które nie są zależne od Agrobacterium, obejmują transformację poprzez bombardowanie cząstkami, pobieranie przez protoplasty (np. PEG lub elektroporacja) i mikroiniekcja. Wybór wektora zależy w dużej mierze od korzystnej selekcji dla gatunku, który jest transformowany. Poniżej jest opisana konstrukcja niektórych typowych wektorów.

184 242

Konstrukcja pCIB3064 pCEB3064 jest wektorem pochodnym pUC, nadającym się do stosowania technik bezpośredniego przeniesienia genu w kombinacji z selekcją przy użyciu herbicydu basta (lub fosfmorticyny). Plazmid pCIB246 zawiera promotor 35S z CaMV funkcjonalnie połączony z genem GUS zE. coli i terminatorem transkrypcji 35S z CaMV i jest opisany w opublikowanym zgłoszeniu PCT WO 93/07278. Promotor 35S tego wektora zawiera dwie sekwencje ATG położone 5' od miejsca startu. Miejsca te zostały zmutowane przy zastosowaniu standardowych technik PCR w taki sposób, aby usunąć miejsca ATG i utworzyć miejsce restrykcyjne Sspl i Pvul. Te nowe miejsca restrykcyjne znajdowały się 96 i 37 bp od pojedynczego miejsca Sali oraz 101 i 42 bp od miejsca startu. Uzyskana pochodna pCIB246 została nazwana pCIB3025. Gen GUS został następnie wycięty z pCIB3025 poprzez trawienie Sali and SacI, końce przekształcone w tępe i ponownie ligowane, z wytworzeniem pCIB3060. Plazmid pJIT82 został otrzymany z John Innes Centre, Norwich i fragment Smal o długości 400 bp, zawierający gen bar ze Streptomyces viridochromogenes, został wycięty i wstawiony w miejsce Hpał plazmidu pCIB3060 (Thompson et al. EMBO J 6: 2519-2523 (1987)). Powstał w ten sposób plazmid pCIB3064, który zawiera gen bar pod kontrolą promotora i terminatora 35S z CaMV, do selekcji na herbicyd, gen fro oporności na ampicylinę (do selekcji w E. coli) oraz polilinker z pojedynczymi miejscami cięcia SphI, PstI, Hindlll i BamHI. Wektor ten jest odpowiedni do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających swoje własne sygnały regulacyjne.

Konstrukcja plazmidów pSOG19 i pSOG35 pSOG35 jest wektorem do transformacji, który wykorzystuje gen dla reduktazy dihydrofolanu (DHFR) zE coli jako marker selekcyjny przenoszący oporność na metotreksat. Reakcja PCR była zastosowana do powielenia promotora 35S (-800 bp), intronu 6 z genu Adhl kukurydzy (-550 bp) [Lou et al, Plant J 3: 393-403,1993; Dennis et al, Nuci Acids Res 12: 3983- 4000,1984j oraz sekwencji nie podlegającego translacji lidera GUS o długości 18bp z plazmidu pSOGIO. Fragment 250 bp kodujący reduktazę dihydrofolanu typu II z E. coli był również powielany poprzez PCR i te dwa fragmenty PCR były łączone z fragmentem Sacl-Pstl z pB1221 (Clontech), który zawierał szkielet wektora pUC19 i terminator syntazy nopaliny. W wyniku połączenia tych fragmentów powstał plazmid pSOG19, który zawiera promotor 35S przyłączony do sekwencji intronu 6 lidera GUS, genu DHFR i terminatora syntazy nopaliny. Poprzez zamianę lidera GUS w pSOG19 na sekwencję liderową z wirusa Maize Chlorotic Mottie Virus (MCMV) powstał wektor pSOG35. Plazmidy pSOG19 i pSOG35 przenoszą gen oporności na ampicylinę z pUC i mają miejsca Hindlll, SphI, PstI i EcoRI do klonowania obcych sekwencji.

pSOG 10

Ten wektor ekspresyjny z β-glukuronidazą (GUS) pochodził od plazmidu pB1121, otrzymanego z Clonetech Laboratories; Pało Alto, Califomia. Intron 6 z genu Adhl kukurydzy został powielony poprzez PCR z plazmidu pB428, opisanego w Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 81:4125-4128 (1987), stosując startery oligonukleotydowe SON0003 i SON0004.

SON0003:5 -CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG-3'

SON0004: 5 -ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG-3'

Produkt reakcji PCR był trawiony endonukleazą restrykcyjną BamHI, przecinając miejsce BamHI, dodane na końcu 5' każdego ze starterów. Uzyskany w rezultacie fragment DNA był oczyszczany w żelu agarorozowym i włączany w wyniku ligacji w miejsce BamHI plazmidu pBl 121, które znajduje się pomiędzy promotorem

35S z CaMV i genem GUS. Połączony w wyniku ligacji DNA był transformowany do E. coli i klony z intronem 6 Adhl w tej samej orientacji, co gen GUS, były identyfikowane poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi.

pSOG 19

Ten wektor ekspresyjny z reduktazą dihydrofolianu (DHFR) powstał poprzez połączenie promotora 35S i intronu 6 Adhl z plazmidu pSOGI 0 do genu DHFR z plazmidu plazmid pHCO, opisanego w Bourouis i Jarry, EMBO J. 2:1099-1104 (1983). Promotor 35S i intron 6

184 242

Adhl wytworzono poprzez powielenie w reakcji PCR fragmentu z pSOGI 0, stosując startery SON0031 i SON0010.

SONOO31: 5 -CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC-3'

S0N001O: 5' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'

Otrzymany w rezultacie fragment był trawiony Pstl i BspHI i oczyszczony w żelu agarozowym.

Region kodujący DHFR został wytworzony poprzez powielenie w reakcji PCR z pHCO przy zastosowaniu starterów SON0016 i SON0017.

SONOO 16:5 '-GCTACCATGGCCACATAGAAC ACC-3'

S0N0017: 5 '-CGAGAGCTCGCACTTCAACC'TTG-3'

Otrzymany w rezultacie fragment był trawiony Ncol i SacI i oczyszczony w żelu agarozowym.

Dwa fragmenty opisane powyżej zostały połączone w wyniku ligacji z fragmentem wektora, otrzymanym zpB1121, poprzez trawienie nukleazami restrykcyjnymi PstI i SacI i oczyszczenie fragmentu o wielkości 3 kb zawierającego region terminatora N i region pUC19 z pB1121 w żelu agarozowym. W wyniku takiej trójetapowej ligacji nastąpiło połączenie: promotor 35S-intron 6 Adhl-gen DHFR- terminator Nos we właściwym porządku i orientacji dla funkcjonalnej ekspresji w roślinach.

pSOG 30

Wektor ekspresyjny GUS powstał z pSOG 10 poprzez wstawienie lidera z wirusa Maize Chlorotic Mottie Virus (MCMV), opisanego w Lommel et al., Virology 181: 382-385 (1991), do nie ulegającego translacji lidera genu 35S-GUS w trzyetapowej ligacji.

Obie nici sekwencji lidera białka kapsydu MCMV o długości 17 bp plus odpowiednie miejsca dla enzymów restrykcyjnych zostały zsyntetyzowane i połączone. Otrzymany dwuniciowy fragment był trawiony BamHI i NcoI i oczyszczony w żelu akryloamidowym.

Region kodujący genu GUS został powielony poprzez PCR przy użyciu starterów: SON0039 i SON0041 oraz pBl 121 jako matrycy.

SON0039:5 -CGACATGGTACGTCCTGTAGAAAC CCACA-3'

SON0041: 5 -ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3'

Startery te dodały miejsce Ncol na końcu 5' GUS i miejsce Sad na końcu 3' GUS. Uzyskany w rezultacie fragment był trawiony endonukleazami Ncol i SacI i oczyszczony w żelu agarozowym.

Gen GUS został usunięty z plazmidu pSOG 10 poprzez trawienie endonukleazą restrykcyjną SacI i częściowe trawienie endonukleazą restrykcyjną BamHI. Uzyskany w rezultacie wektor, który ma miejsce BamHI i miejsce SacI do ponownego wstawienia regionu kodującego za promotorem 35S-intronem 6Adh1, był oczyszczony w żelu agarozowym.

Trzy fragmenty opisane powyżej były łączone w wyniku trójetapowej ligacji z wytworzeniem fiizji genowej o strukturze: promotor 35S-intron 6 Adhl-lider MCMV-GUS-terminator Nos, wszystko w szkielecie wektora pUC19.

pSOG 35

Wektor z markerem selekcyjnym DHFR jest identyczny, jak pSOG19 z tą różnicą, że lider MCMV jest wstawiony do nie podlegającego translacji lidera genu DHFR dla zwiększenia translacji. Został on utworzony w dwóch etapach. Najpierw region kodujący GUS w pSOG32, wektorze identycznym jak pSOG30 z tą różnicą że zawiera zmodyfikowany promotor Adh zamiast 35S, został zastąpiony regionem kodującym DHFR z pSOGI9 poprzez wycięcie GUS przez Ncol i SacI i włączenie w wyniku ligacji do DHFR jako fragment NcolSacI Uzyskano w rezultacie wektor pSOG33, który ma następującą strukturą: promotor Adhintron 6Adhl-lider MCMV-region kodujący DHFR-terminator Nos, z miejscem BgllI pomiędzy promotorem i intronem oraz miejscem Sad pomiędzy regionem kodującym i terminatorem. Fragment BgllI-SacI został wyizolowany poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi i oczyszczenie w żelu agarozowym i włączony w wyniku ligacji w miejsca BamHI i SacI pSOG30, zastępując intron 6 Adh1-lider MCMV-region kodujący GUS zpSOGSO przez intron 6 Adh1-lider MCMV-region kodujący DHFR zpSOG33.

184 242

Przykład 21: Konstrukcja roślinnych kaset ekspresyjnych

Sekwencje genów, które mają podlegać ekspresji w transgenicznych roślinach, są najpierw wstawione do kaset ekspresyjnych za odpowiednim promotorem i przed odpowiednim terminatorem transkrypcji. Takie kasety ekspresyjne mogą być następnie łatwo przenoszone do wektorów do transformacji roślin, opisanych powyżej w przykładzie 19.

Wybór promotora

Wybór promotora stosowanego w kasetach ekspresyjnych będzie określał przestrzenny i czasowy wzór ekspresji transgenu w roślinach transgenicznych. Wybrane promotory będą kierować ekspresją transgenów w specyficznych typach komórek (takich jak komórki epidermalne liścia, komórki mezofilu, komórki skóry korzenia) lub w specyficznych tkankach czy organach (na przykład korzeniach, liściach lub kwiatach) i ten wybór będzie odzwierciedlać pożądaną lokalizację ekspresji w transgenie. Alternatywnie, wybrany promotor może kierować ekspresją genu pod promotorem indukowanym przez światło lub promotorem regulowanym czasowo w inny sposób. Dalszą alternatywę stanowi regulacja chemiczna wybranego promotora. Dostarcza to możliwości indukowania ekspresji transgenu jedynie wtedy, gdy to jest pożądane, poprzez działanie induktora chemicznego.

Terminatory transkrypcji

Dostępnych jest wiele terminatorów transkrypcji do zastosowania w kasetach ekspresyjnych. Są one odpowiedzialne za terminację transkrypcji za transgenem i jego prawidłową poliadenylację. Odpowiednie terminatory transkrypcji oraz te, o których wiadomo, że działają w roślinach, obejmują terminator 35S z CaMV, terminator tml, terminator syntezy nopaliny, terminator rbcS E9 z grochu. Mogą być one stosowane zarówno u roślin jednoliściennych, jak i dwuliściennych.

Sekwencje do zwiększenia lub regulowania ekspresji

Stwierdzono, że liczne sekwencje zwiększają ekspresję genu w obrębie jednostki transkrypcyjnej i sekwencje te mogą być użyte w połączeniu z genami z tego wynalazku do zwiększania ich ekspresji w roślinach tamsgenicznych.

Wykazano, że różnorodne sekwencje intronów zwiększają ekspresję, szczególnie w komórkach roślin jednoliściennych. Przykładowo, stwierdzono że introny genu Adhl z kukurydzy po wprowadzeniu do komórek kukurydzy znacząco zwiększają ekspresję genu typu dzikiego pod jego pokrewnym promotorem. Wykazano, że intron 1 jest szczególnie skuteczny i zwiększa ekspresję w połączeniu z genem dla acetylotransferazy chloramfenikolu (Callis et al.; Genes Develop.1:1183-1200 (1987)). W tym samym systemie eksperymentalnym, intron z genu bronze 1 z kukurydzy dawał podobny efekt zwiększania ekspresji (Callis et al., supra). Sekwencje intronowe są rutynowo włączane do wektorów do transformacji roślin, typowo w obrębie lidera nie podlegającego translacji.

Wiadomo, że wiele sekwencji liderowych nie podlegających translacji pochodzących z wirusów, również zwiększa ekspresję, i są one szczególnie efektywne w komórkach roślin dwuliściennych. W szczególności wykazano, że sekwencje liderowe z Wirusa Mozaiki Tytoniu (Tobacco Mozaic WVrus, TMV; „sekwencja-W”), Maize Chlorotic Mottle Virus (MCMV) oraz Alfalfa Mosaic Virus (AMV) efektywnie zwiększają ekspresję (np. Gallie et al. Nuci. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)).

Transport produktu genu wewnątrz komórki

Wiadomo, że istnieją różne mechanizmy transportu produktów genów w roślinach i scharakteryzowano do pewnego stopnia sekwencje kontrolujące funkcjonowanie tych mechanizmów. Przykładowo, transport produktów genów do chloroplastów jest kontrolowany przez sekwencję sygnałową znajdywaną na końcu aminowym różnych białek, która jest odcinana w czasie importu do chloroplastów, wskutek czego powstaje dojrzałe białko (np. Comai et al. J. Biol. Chem. 263:15104-15109 (1988)). Te sekwencje sygnałowe mogą być dołączane do produktów heterologicznych genów w celu uzyskania transportu produktów heterologicznych genów do chloroplastów (van den Broeck et al. Naturę 313: 358-363 (1985)). DNA kodujący odpowiednie sekwencje sygnałowe że być izolowany z końców 5' cDNA kodującego białko RUBISCO, białko CAB, enzym syntazę EPSP, białko GS2 i wiele innych białek, o których wiadomo, że są zlokalizowane w chloroplastach.

184 242

Inne produkty genów są zlokalizowane w innych organellach, takich jak mitochondria i peroksyzomy (np. Ungeret al. Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989)). cDNA kodujący te produkty może być również poddawany manipulacjom celem uzyskania transportu produktów genów heterologicznych do tych organelli. Przykładami takich sekwencji są kodowane w jądrze ATPazy i mitochondrialne izoformy aminotransferazy asparaginianu. Transport do komórkowych ciałek białkowych został opisany przez Rogers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-6516(1985).

Ponadto scharakteryzowano sekwencje, które powodują transport produktów genów do innych części komórki. Sekwencje na końcu aminowym są odpowiedzialne za transport do ER, apoplastu, i wydzielanie na zewnątrz z komórek bielma (Koehler & Ho, Plant Celi 2: 769-783 (1990)). Ponadto sekwencje na końcu aminowym, w połączeniu z sekwencjami na końcu karboksylowym, są odpowiedzialne za transport produktów genów do wakuoli (Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 14: 357-368(1990)).

Poprzez fuzje opisanych wyżej odpowiednich sekwencji sygnałowych z sekwencjami transgenu, będącymi przedmiotem zainteresowania, możliwe jest kierowanie produktu transgenu do dowolnego organellum lub części komórki. Na przykład dla transportu chloroplastów, sekwencję sygnałową chloroplastu z genu RUBISCO, genu CAB, genu syntazy EPSP lub genu GS2 przyłącza się w ramce odczytu do ATG na końcu aminowym transgenu. Wybrane sekwencje sygnałowe powinny zawierać znane miejsce cięcia i w skonstruowanych fuzjach należy uwzględnić obecność za miejscem cięcia dowolnego aminokwasu wymaganego do cięcia. W niektórych przypadkach to wymaganie może być zrealizowane poprzez dodanie niewielkiej liczby aminokwasów pomiędzy miejscem cięcia i ATG transgenu lub alternatywnie zamianę niektórych aminokwasów w obrębie transgenu. Fuzje skonstruowane do transportu do chloroplastów mogą być testowane pod kątem wydajności pobrania przez chloroplast poprzez translacją in vitro konstruktów transkrybowanych in vitro, a następnie pobieranie przez chloroplast in vitro, stosując techniki opisane przez (Bartlett et al. W: Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, str. 1081-1091 (1982); Wasmann et al. Mol. J Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)). Takie techniki konstrukcji są dobrze znane w tej dziedzinie i mają również zastosowanie do mitochondriów i peroksyzomów. Wybór lokalizacji, wymaganej do ekspresji transgenów, będzie zależał od komórkowej lokalizacji prekursora, będącego punktem wyjścia w danym szlaku. Będzie ona zwykle cytozolowa lub chloroplastowa, jakkolwiek w niektórych przypadkach może być mitochondrialna lub peroksyzomalna. Produkt ekspresji transgenu zwykle nie wymaga transportu do ER, apoplastu lub wakuoli.

Opisane powyżej mechanizmy transportu wewnątrzkomórkowego mogą być wykorzystane nie tylko w połączeniu z własnymi promotorami, ale również w połączeniu zheterologicznymi promotorami tak, aby uzyskać specyficzną lokalizację, a jednocześnie regulację transkrypcyjną promotora, którego wzór ekspresji jest odmienny od promotora, z którego pochodzi sygnał transportowy.

Przykład 22: Transformacja roślin dwuliściennych

Techniki transformacji roślin dwuliściennych są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują techniki oparte o Agrobacterium i techniki, które nie wymagają Agrobacterium. Techniki bez Agrobacterium obejmują pobieranie egzogennego materiału genetycznego bezpośrednio przez protoplasty lub komórki. Można to osiągnąć poprzez pobranie za pośrednictwem PEG lub elektroporacji, dostarczenie poprzez bombardowanie cząstkami lub mikroinjekcję. Przykłady tych technik są opisane przez Paszkowskiego et al., EMBO J 3: 2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986) oraz Klein et al., Naturę 327 70-73 (1987). W każdym przypadku transformowane komórki są regenerowane do całych roślin przy użyciu standardowych technik znanych w tej dziedzinie.

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium jest preferowana techniką transformacji roślin dwuliściennych ze względu na swoją wysoką wydajność transformacji i swoje szerokie zastosowanie dla wielu różnych gatunków. Liczne gatunki roślin uprawnych, które mogą rutynowo podlegać transformacji przez Agrobacterium obejmują: tytoń, pomidory, słonecznik, bawełnę, rzepak, ziemniaki, soję, lucernę i topolą ((EP 0 317 511) (bawełna), EP 0 249 432

184 242 (pomidor, Calgene), WO 87/07299 (kapusta, Calgene), US 4:795,855 (topola)). Transformacja Agrobacterium zwykle obejmuje przeniesienie binarnego wektora niosącego obcy DNA, będący przedmiotem zainteresowania (np. pCEB200 lub pCIB2001), do odpowiedniego szczepu Agrobacterium, które może zależeć od komplementacji genów vir, przenoszonych przez szczep gospodarza Agrobacterium bądź na współobecnym plazmidzie Ti, bądź na chromosomie (np. szczep CIB542 dla pCEB200 i pCIB2c01 (Uknes et al. Plant Celi 5:159-169 (1993)). Przeniesienie zrekombinowanego binarnego wektora do Agrobacterium osiąga się poprzez procedurę trójrodzicielskiego krzyżowania przy zastosowaniu E. coli niosącej zrekombinowany wektor binarny, pomocniczego szczepu E. coli, który przenosi plazmid, taki jak pRK2013 i który jest zdolny do mobilizowania zrekombinowanego wektora binarnego do wejścia do szczepu Agrobacterium. Alternatywnie, zrekombinowany wektor binarny może być przenoszony do Agrobacterium poprzez transformację DNA (Hofgen & Willmitzer, Nuci. Acids Res. 16: 9877(1988)).

Transformacja docelowego gatunku rośliny przez zrekombinowane Agrobacterium zwykle obejmuje równoczesne hodowanie Agrobacterium z eksplantami z roślin według protokołów dobrze znanych w tej dziedzinie. Transformowaną tkankę, niosącą marker odporności na antybiotyk lub herbicyd pomiędzy skrajnymi T-DNA w wektorze binarnym, regeneruje się na pożywce selekcyjnej.

Przykład 23: Transformacja roślin jednoliściennych

Transformacja większości gatunków roślin jednoliściennych stała się ostatnio czynnością rutynową. Korzystne techniki obejmują bezpośrednie przeniesienie genu do protoplastów przy zastosowaniu technik z użyciem PEG lub elektroporacji oraz bombardowanie cząstkami tkanki kalusa. Transformację można wykonywać przy użyciu pojedynczego rodzaju DNA lub wielu rodzajów DNA (np. kotransformacja) i obie te techniki są odpowiednie do użycia w tym wynalazku. Korzystną stroną kotransformacji jest możliwość uniknięcia skomplikowanych konstrukcji wektora i powstawanie roślin transgenicznych z niesprzężonymi loci dla genu będącego przedmiotem zainteresowania i markera selekcyjnego, umożliwiające usunięcie markera selekcyjnego w kolejnych pokoleniach, co może okazać się pożądane. Jednakże wadą stosowania kotransformacji jest mniej niż 100% częstość, z którą odrębne rodzaje DNA są integrowane do genomu (Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096 (1986)).

Zgłoszenie Patentowe EP 0 292 435 (Ciba-Geigy), EP 0 392 225 (Ciba-Geigy) i WO 93/07278 (Ciba-Geigy) opisują techniki przygotowania kalusa i protoplastów wsobnej linii elite kukurydzy, transformacie protoplastów przy użyciu PEG lub elektroporacji i regenerację roślin kukurydzy ze stransformowanych protoplastów. Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990)) i Fromm et al., Biotechnology 8: 833-839 (1990)) opublikowali techniki transformacji linii kukurydzy pochodzącej od A188 przy użyciu bombardowania cząstkami. Ponadto, zgłoszenie WO 93/07278 (Ciba-Geigy) i Kozieł et al., Biotechnology 11:194-200 (1993)) opisują techniki transformacji wsobnej linii kukurydzy elite poprzez zastosowanie bombardowania cząstkami. Technika ta stosuje niedojrzałe zarodki kukurydzy o długości 1,5-2,5 mm wycięte kłosów kukurydzy 14-15 dni po zapyleniu oraz urządzenie PDS-1000He Biolistics do bombardowania.

Transformacja ryżu może być także wykonana poprzez techniki bezpośredniego przenoszenia genu przy zastosowaniu protoplastów lub bombardowania cząstkami. Transformacja przy użyciu protoplastów została opisana dla typu Japonica i typu Indica (Zhang et al., Plant Celi Rep 7 379-384 (1988); Shimamoto et al. Nature 338: 274-277 (1989); Datta et al. Biotechnology 8: 736-740 (1990)). Oba typy są rutynowo transformowane przy zastosowaniu bombardowania cząstkami (Chnstou et al. Biotechnology 9: 957-962 (1991)).

Zgłoszenie Patentowe EP 0 332 581 (Ciba-Geigy) opisuje techniki wytwarzania, transformacji i regeneracji protoplastów Pooideae. Techniki te umożliwiają transformację Dactylis i pszenicy. Ponadto, transformacja pszenicy została opisana przez Vasil et al., Biotechnology 10: 667-674 (1992)) z zastosowaniem bombardowania cząstkami do komórek typu C kalusa długotrwale ulegającego regeneracji, a także przez Vasil et al., Biotechnology 11:1553-1558 (1993)) i Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084 (1993) z zastosowaniem bombardowania cząstkami niedojrzałych zarodków i niedojrzałych kalusów pochodzenia zarodkowego. Jednakże korzystna technika transformacji pszenicy, to transformacja pszenicy poprzez bombardowanie

184 242 cząstkami niedojrzałych zarodków, obejmująca etap z wysokim stężeniem sacharozy bądź maltozy przed dostarczeniem genu. Przed bombardowaniem, dowolna liczba zarodków (długości 0,75-1 mm) jest wysiewana na pożywkę MS zawierającą 3% sacharozę (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)) i 3 mg/l 2,4-D celem indukcji zarodków somatycznych, która odbywa się w czasie hodowania w ciemności. W wybranym dniu bombardowania, zarodki są usuwane z pożywki indukującej i umieszczane w środowisku osmotycznym (tj. pożywce indukującej z dodaną sacharozą lub maltozą w pożądanym stężeniu, zwykle 15°%). Zarodkom umożliwia się plazmolizę przez 2-3 godz. i następnie bombarduje. Zwykle na szalce jest dwadzieścia zarodków, chociaż nie jest to liczba bezwzględnie wymagana. Odpowiednie przenoszące gen plazmidy (takie jak pCEB3064 lub p5G35) są osadzane na cząstkach złota o wielkości mikrometra przy użyciu standardowej procedury. Do każdej płytki z zarodkami strzela się przy użyciu DuPont Biolistics, urządzenia z helem, stosując uderzenie ciśnienia -1000 psi stosując standarowy ekran 80 mesh. Po bombardowaniu zarodki są ponownie umieszczanie na 24 godz. w ciemności w celu regeneracji (stale w środowisku osmotycznym). Po 24 godz. zarodki są usuwane ze środowiska osmotycznego i umieszczane ponownie na pożywce indukcyjnej, gdzie pozostają przez około miesiąc przed regeneracją. W przybliżeniu jeden miesiąc później eksplanty zarodkowe z rozwijającym się kalusem embnoidalnym przenosi się do pożywki regeneracyjnej (MS + 1 mg/litr NAA, 5 mg/litr GA), zawierającej nadal odpowiedni czynnik selekcyjny (10 mg/l basta w przypadku pCIB3064 i 2 mg/l metotreksatu w przypadku pSOG35) Po upływie około jednego miesiąca, rozwijające się korzenie przenosi się do dużego, jałowego pojemnika, znanego jako „GA7s”, który zawiera o połowę mniej stężony MS, 2% sacharozę i to samo stężenie czynnika selekcyjnego. Zgłoszenie Patentowe 08/147,161 opisuje metody transformacji pszenicy i jest tu załączone jako odnośnik.

Przykład 24: Selekcja roślinnych genów protoks opornych na herbicydy-inhibitory protoks w systemie ekspresyjnym E. coli

Plazmid pWDC-4, kodujący chloroplastowy enzym protoks z kukurydzy jest transformowany do szczepu XL1-Red (Stratagene, La Jolla, CA), w którym uzyskuje się losową mutagenezę. Transformacja jest wysiewana na pożywkę L, zawierającą 50 g/ml ampicyliny i inkubowana przez 48 godzin w 37°C. Murawka stransformowanych komórek jest zdrapywana z szalek i DNA plazmidowy otrzymywany przy użyciu zestawu Wizard Megaprep (Promega, Madison, WI). Przewiduje się, że DNA plazmidowy izolowany ze szczepu mutatorowego zawiera około jedną losową zmianę na 2000 nukleotydów (patrz Greener et al., Strategies 7(2)32-34 (1994)).

Zmutowany plazmidowy DNA transformuje się do mutanta hemG SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 1113: 297 (1979) i wysiewa się na pożywkę L zawierającą 100 g/ml ampicyliny i na tą samą pożywkę zawierającą różne stężenia herbicydu hamującego protoks. Płytki są inkubowane przez 2-3 dni w 37°C. DNA plazmidowy jest izolowany ze wszystkich kolonii, które rosną w obecności stężeń herbicydu, które skutecznie zabijają szczep typu dzikiego. Izolowany DNA jest następnie transformowany do SASX38 i wysiewany ponownie na herbicyd dla upewnienia się, że oporność pochodzi od plazmidu.

Zmutowany DNA plazmidu pWDC-4 jest ponownie izolowany z opornych kolonii i sekwencja kodująca protoks jest wycinana poprzez trawienie EcoRI i Xholl. Wycięta sekwencja kodująca protoks jest następnie ponownie wklonowana do nie zmutagenizowanego wektora pBluescript i jeszcze raz testowana na oporność na herbicyd hamujący protoks w ten sam sposób, jak opisano powyżej.

Proces ten eliminuje mutacje w sekwencji niekodującej, które nadają oporność, takie jak mutanty z podwyższoną aktywnością promotora (to jest mutanty, których oporność jest skutkiem mutacji powodujących zwiększoną ekspresję niezmodyfikowanego protoks) i pozostawia jedynie mutanty, których oporność jest wynikiem mutacji w sekwencji kodującej genu protoks. Określa się sekwencję DNA dla wszystkich przypuszczalnych genów protoks tolerujących herbicyd zidentyfikowanych w taki sposób i identyfikuje się mutacje poprzez porównanie z sekwencją protoks typu dzikiego w plazmidzie pWDC-4.

184 242

Stosując procedurę opisaną powyżej, zidentyfikowano mutację oporności zmieniającą C do T w pozycji nukleotydowej 498 w sekwencji pWDC-4 (SEK NR ID 5). Plazmid niosący tą mutację został oznaczony jako pMzC-1 Val. Zmiana ta zmienia kodon GCT dla alaniny w pozycji aminokwasowej 166 (SEK NR ED 6) w kodon GIT dla waliny i powoduje powstanie enzymu protoks, który jest co najmniej I0x bardziej oporny na herbicyd hamujący protoks w teście bakteryjnym.

Plazmid pMzC-1 Val, w wektorze pBluescript SK został zdeponowany 30 września 1994 pod nazwą pWDC-8 w Agricultural Research Culture Collection i otrzymał oznaczenie depozytowe NRRl #21340.

Ta sama strategia była stosowana do poszukiwania form opornych na herbicydy z genem Protoks-1 z Arabidopsis w różnych wektorach. Jedną mutację oporności zidentyfikowano jako zmianę C do T w nukleotydzie 689 w sekwencji pWDC-2 (SEK NR ID 1); plazmid ten jest oznaczony jako pAraC-1 Val. Ta zmiana jest identyczna, jak w zmutowanym plazmidzie pMzC-1 Val powyżej, zmieniająca kodon GCT dla alaniny w pozycji aminokwasowej 220 (SEK NR ID 2) do kodonu GTT dla waliny w odpowiadającej pozycji sekwencji białka protoks z Arabidopsis.

Drugi gen oporności zawiera zmianę A do G w pozycji nukleotydowej 1307 w sekwencji pWDC-2 (SEK NR EDI); plazmid ten jest oznaczony jako pAraC-2Cys. Zmiana ta zamienia kodon TAC dla tyrozyny w pozycji aminokwasowej 426 (SEK NR ID 2) w kodon TGC dla cysteiny. Odpowiadający kodon tyrozynowy w sekwencji protoks-1 kukurydzy w pozycji nukleotydowej 1115-1117 (SEK NR ID 5; pozycja aminokwasowa 372 w SEK NR ID 6) może być zmutowana w podobny sposób celem wytworzenia postaci tego enzymu opornej na herbicyd.

Trzeci mutant oporności ma zmianę G do A w pozycji 691 sekwencji nukleotydowej pWDC-2 (SEK NR ID 1); ten plazmid jest oznaczony jako pAraC-3Ser. Mutacja ta zmienia kodon GGT dla glicyny w pozycji aminokwasowej 221 (SEK NR ED 2) do kodonu AGT dla seryny, sąsiadującego z mutacją w pAraC-1. Odpowiadający glicynie kodon w sekwencji protoks-1 kukurydzy w pozycji nukleotydowej 497-499 (SEK NR Id 5; pozycja aminokwasowa 167 w SEK Nr ID 6) może być podobnie zmutowana celem utworzenia postaci tego enzymu opornej na herbicyd.

W wyniku wszystkich mutacji opisanych powyżej, enzym protoks jest przynajmniej 10x bardziej oporny na herbicyd hamujący protoks w teście bakteryjnym.

pAraC-2Cys, w wektorze pFL61, został zdeponowany 14 listopada 1994 pod oznaczeniem pWDC-7 w Agricultural Research Culture Collection i otrzymał oznaczenie depozytowe NRRL #21339N.

Przykład 25: Dodatkowe, nadające oporność na herbicyd podstawienia w kodonach, identyfikowane poprzez przeszukiwanie losowe

Aminokwasy identyfikowane jako miejsca oporności na herbicyd w losowym przeszukiwaniu są zastępowane przez inne aminokwasy i testowane pod kątem funkcji i tolerancji na herbicyd w systemie bakteryjnym. Mutageneza sekwencji Protoks-1 z Arabidopsis z zastosowaniem oligonukleotydów jest wykonywana przy użyciu zestawu Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech, Palo Alto, CA). Później zamiany aminokwasu są potwierdzane poprzez analizę sekwencji, zmutowane plazmidy są transformowane do SASX38 i wysiewane na pożywkę L-amp¹⁰⁰, celem testowania funkcji, i na różne stężenia herbicydu hamującego protoks, celem badania tolerancji.

Procedura ta była zastosowana dla kodom alaniny w pozycji nukleotydowej 688-690 i kodonu tyrozyny w pozycji nukleotydowej 1306-1308 w sekwencji protoks z Arabidopsis (SEK NR ID 1). Wyniki wykazują, że kodon alaniny w pozycji nukleotydowej 688-690 może być zmieniony do kodonu waliny, treoniny, leucyny lub cysteiny, prowadząc do powstania enzymu protoks opornego na herbicyd, który zachowuje funkcjonalność. Wyniki wykazują ponadto, że kodon tyrozyny w pozycji nukleotydowej 1306-1308 może być zmieniony do cysteiny, izoleucyny, leucyny, waliny lub treoniny, prowadząc do powstania enzymu protoks opornego na herbicyd, który zachowuje funkcjonalność.

184 242

Przykład 26: Wykazanie tolerancji krzyżowej mutacji oporności na różne związki hamujące protoks.

Zmutowane plazmidy oporności, wyselekcjonowane na oporność wobec pojedynczego herbicydu, są testowane na szereg innych związków hamujących protoks. Szczep SASX38 zawierający plazmid typu dzikiego jest wysiewany na różne stężenia każdego ze związków dla określenia stężenia letalnego każdego z nich. Szczep SASX38 ze zmutowanymi plazmidami oporności jest wysiewany i testowany pod kątem zdolności przeżycia na stężeniu każdego ze związków, które jest co najmniej 10-krotnie wyższe od stężenia, które jest letalne dla szczepu SASX38, zawierającego plazmid typu dzikiego.

Wyniki testowania tolerancji krzyżowej pokazują, że każda ze zidentyfikowanych mutacji warunkuje tolerancję na różne związki hamujące protoks. Konkretnie, wyniki pokazują, że 1) mutacja AraCI-Val nadaje oporność na inhibitory protoks obejmujące między innymi związki o wzorach 4, 11, 13, 14, 15 i 17; 2) mutacja AraC-2Cys nadaje oporność na inhibitory protoks obejmujące między innymi związki o wzorach 11, 13, 15 i 17; 3) Mutacja MzC-I Val nadaje oporność na inhibitory protoks obejmujące między innymi związki o wzorach 11, 12, 13, 14, 15, 16 i 17; 4) Mutacja AraC-3Ser nadaje oporność na inhibitory protoks obejmujące między innymi bifenoks oraz związki o wzorach 4, 12, 13, 14, 15 i 17.

Przykład 27: Wytwarzanie roślin opornych na herbicyd poprzez nadprodukcję roślinnych genów protoks.

Sekwencje kodujące Protoks-1 z Arabidopsis, zarówno z genów typu dzikiego, jak i mutanta oporności AraC-1 Val, są wycięte poprzez częściowe trawienie EcoRI i Xhol i sklonowane w roślinnym wektorze ekspresyjnym pCGNI761ENX. Kasety ekspresyjne zawierające fuzje genowe 2X355-Protoks są wycinane przez Xbal i klonowane w binarnym wektorze pCEB200. Te binarne plazmidy protoks są transformowane poprzez elektroporację do Agrobacterium, a następnie do Arabidopsis, przy zastosowaniu metody infiltracji pod próżnią (Bechtold et al.,1993). Transformanty są transformowane na kanamycynę i z różnych niezależnych linii wytwarzane są nasiona T2. Nasiona te wysiewa się na pożywki GM zawierające różne stężenia herbicydu hamującego protoks i testowane pod kątem kiełkowania i przeżywania. Liczne linie transgeniczne nadprodukujące protoks, bądź typu dzikiego, bądź zmutowany-opomy, wytwarzają znaczną liczbę zielonych kiełków przy stężeniu herbicydu, który jest letalny dla kontroli z pustym wektorem.

Rozmaite modyfikacje opisanego tu wynalazku będą oczywiste dla biegłych w tej dziedzinie. Modyfikacje te mają pozostać w zakresie dołączonych zastrzeżeń. *

184 242

USTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: CIBA-GEIGY AG (B) ULICA: Klybeckstr. 141 (C) MIASTO: Bazyleja (E) PAŃSTWO: Szwajcaria (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 4002 (G) TELEFON: +41 61 69 11 11 (H) TELEFAX: +- 41 61 696 79 76 (I) TELEX:962 991 (ii) TUTUŁ WYNALAZKU: Manipulowanie aktywnością enzymatyczną oksy dazy protoporfirynogenu w organizmach eukariotycznych (iii) LICZBA SEKWENCJI: 20 (iv) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

(A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1719 par zasad (B) TYP: nukleotydową (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 31... 1644 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga = „Arabidopsis protox-1 cDNĄ sekwencja z pWDC-2” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 1:

184 242

TGACAAAATT CCGAATTCTC TGCGATTTCC ATG GAG TTA TCT CTT CTC CGT CCG 54

Mit Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro

ACG ACT Thr Thr 10	CAA TCG CTT	1 CTT COG TCG TTT TCG AAG CCC	5 AAT CTC CGA TTA Asn Leu Arg Leu	102
Gin	Ser Leu	Leu Pro 15	Ser	Phe	Ser Lys Pro 20
AAT GTT	TAT	AAG CCT	CTT AGA	CTC	CGT	TGT TCA GTG	GCC GGT GGA CCA	150
Asn Val 25	Tyr	Lys Pro	Leu Arg 30	Leu	Arg	Cys Ser Val 35	Ala Gly Gly Pro 40
ACC GTC	GGA	TCT TCA	AAA ATC	GAA	GGC	GGA GGA GGC	ACC ACC ATC ACG	198
Thr Val	Gly	Ser Ser 45	Lys Ile	Glu	Gly Gly Gly Gly 50	Thr Thr Ile Thr 55
ACG GAT	TGT	GTG ATT	GTC GGC	GGA	GGT	ATT AGT GGT	CTT TGC ATC GCT	246
Thr Asp	Cys	VćlL Ile 60	Val Gly Gly	Gly 65	Ilfe Ser Gly	Leu Cys Ile Ala 70
CAG GCG	CTT	GCT ACT	AAG CAT	CCT	GAT	GCT GCT CCG	AAT TTA ATT GTG	294
Gin Ma	Leu 75	Ma Thr	Lys H.s	Pro 80	Asp	Ma Ma Pro	Asn Leu Ile VM 85
ACC GAG	GCT	AAG GAT	CGT GTT	GGA	GGC	AAC ATT ATC	ACT CGT GAA GAG	342
Thr Glu 90	Ma	Lys Asp Arg Val 95	Gly	Gly	Asn Ile Ile 100	Thr Arg Glu Glu
AAT GGT	TTT	CTC TGG	GAA GAA	GGT	CCC	AAT AGT TTT	CAA CCG TCT GAT	390
Asn Gly 105	Phe	Leu Trp	Glu Glu 110	Gly	Pro	Asn Ser Phe 115	Gin Pro Ser Asp 120
CCT ATG	CTC	ACT ATG	GTG GTA	GAT	AGT	GGT TTG AAG	GAT GAT TTG GTG	438
Pro Mit	Leu	Thr Mit 125	Val Val	Asp	Ser	Gly Leu Lys Asp Asp Leu VM 130 135
TTG GGA	GAT	CCT ACT	GCG CCA	AGG	TTT	GTG TTG TGG	AAT GGG AAA TTG	486
Leu Gly	Asp	Pro Thr 140	Ma Pro	Arg	Phe 145	Val Leu Trp	Asn Gly Lys Leu 150
AGG CCG	GTT	CCA TCG	AAG CTA	ACA	GAC	TTA CCG TTC	TTT GAT TTG ATG	534
Arg Pro	VM 155	Pro Ser	Lys Leu	Thr 160	Asp	Leu Pro Phe	Phe Asp Leu Met 165
AGT ATT	GGT	GGG AAG	ATT AGA	GCT	GGT	TTT GGT GCA	CTT GGC ATT CGA	582
Ser He 170	Gly	Gly Lys	Ile Arg 175	Ma	Gly	Phe Gly Ma 180	Leu Gly Ile Arg
CCG TCA	CCT	CCA GGT	CGT GAA	GAA	TCT	GTG GAG GAG	TTT GTA CGG CGT	630
Pro Ser 185	Pro	Pro Gly Arg Glu 190	Glu	Ser	Val Glu Glu 195	Phe Val Arg Arg 200

184 242

AAC CTC

GGT GAT GAG GTT TTT GAG CGC CTG ATT GAA CCG TTT TGT TCA

678

Asn

Leu

Gly Asp Glu 205

Val

Ehe

Glu

Arg

Leu Ile 210

Glu

Ero

Ehe

Cys Ser 215

GGT

GTT

TAT GCT GGT

GAT

CCT

TCA

AAA

CTG AGC

ATG

AAA

GCA

GCG TTT

726

Gly

Val

Tyr Ala Gly Asp 220

Ero

Ser

Lys 225

Leu Ser

Met

Lys

ALa 230

Ala Ehe

GGG

AAG

GTT TGG AAA

CTA

GAG

CAA

AAT

GGT GGA

AGC

ATA

ATA

GGT GGT

774

Gly

Lys

Val Trp Lys 235

Leu

Glu

Gln 240

Asn

Gly Gly

Ser

Ile 245

Ile

Gly Gly

ACT

TTT

AAG GCA ATT

CAG

GAG

AGG

AAA

AAC GCT

CCC

AAG

GCA

GAA CGA

822

Thr

Ehe 250

Lys Ala Ile

Gln

Glu 255

Arg

Lys

Asn Ala

Ero 260

Lys

Ala

GLu Arg

GAC

CCG

CGC CTG CCA

AAA

CCA

CAG

GGC

CAA ACA

GTT

GGT

TCT

TTC AGG

870

Asp 265

Ero

Arg Leu Ero

Lys 270

Ero

Gln

Gly

Gln Thr 275

Val

Gly

Ser

rhe Arg 280

AAG

GGA

CTT CGA ATG

TTG

CCA

GAA

GCA

ATA TCT

GCA

AGA

TTA

GGT AGC

918

Lys

Gly

Leu Arg Mt 285

Leu

Ero

Glu

Ala

Ile Ser 290

Ala

Arg

Leu

Gly Ser 295

AAA

GTT

AAG TTG TCT

TGG

AAG

CTC

TCA

GGT ATC

ACT

AAG

CTG

GAG AGC

966

Lys

Val

Lys Leu Ser 300

Trp Lys

Leu

Ser 305

Gly Ile

Thr

Lys

Leu 310

Glu Ser

GGA

GGA

TAC AAC TTA

ACA

TAT

GAG

ACT

CCA GAT

GGT

TTA

GTT

TCC GTG

1014

Gly

Gly

Tyr Asn Leu 315

Thr

Tyr

Glu 320

Thr

Ero Asp Gly

Leu 325

Val

Ser Val

CAG

AGC

AAA AGT GTT

GTA

ATG

ACG

GTG

CCA TCT

CAT

GTT

GCA

AGT GGT

1062

Gln

Ser 330

Lys Ser Val

Val

Met 335

Thr

Val

Ero Ser

H.s 340

Val

Ala

Ser Gly

CTC

TTG

CGC CCT CTT

TCT

GAA

TCT

GCT

GCA AAT

GCA

CTC

TCA

AAA CTA

1110

Leu 345

Leu

Arg Ero Leu

Ser 350

Glu

Ser

Ala

Ala Asn 355

Ala

Leu

Ser

Lys Leu 360

TAT

TAC

CCA CCA GTT

GCA

GCA

GCA

TCT

ATC TCG

TAC

CCG

AAA

GAA GCA

1158

Tyr Tyr

Ero Ero Val 365

Ala

Ala

Vai

Ser

Ile Ser 370

Tyr

Ero

Lys

Glu ALa 375

ATC

CGA

ACA GAA TGT

TTG

ATA

GAT

GGT

GAA CTA

AAG

GGT

TTT

GGG CAA

1206

Ile

Arg

Thr Glu Cys 380

Leu

Ile

Asp Gly 385

Glu Leu

Lys

Gly

Ehe 390

Gly Gln

TTG

CAT

CCA CGC ACG

CAA

GGA

GTT

GAA

ACA TTA

GGA

ACT

ATC

TAC AGC

1254

Leu

His

Ero Arg Thr 395

Gln

Gly

Val 400

Glu

Thr Leu

Gly

Thr 405

Ile

Tyr Ser

184 242

TCC TCA CTC TTT CCA	AAT Asn	CGC Arg 415	GCA CCG CCC	GGA AGA ATT TTG CTG TTG	1302
Ser Ser Leu Phe	Pro	ALa	Pro	Pro	Gly Arg Ile 420	Leu Leu Leu
	410
AAC	TAC ATT GGC	GGG	TCT	ACA	AAC	ACC	GGA	ATT CTG TCC	AAG TCT GAA	1350
Asn 425	Tyr Ile Gly	Gly	Ser 430	Thr	Asn	Thr	Gly	He Leu Ser 435	Lys Ser Glu 440
GGT	GAG TTA GTG	GAA	GCA	GTT	GAC	AGA	GAT	TTG AGG AAA	ATG CTA ATT	1398
Gly	Glu Leu VaL	Glu 445	Ala	Val	Asp Arg Asp 450	Leu Arg Lys	Mit Leu Ile 455
AAG	CCT AAT TCG	ACC	GAT	CCA	CTT	AAA	TTA	GGA GTT AGG	GTA TGG CCT	1446
Lys	Pro Asn Ser 460	Thr	Asp	Pro	Leu	Lys 465	Leu	Gly VćlL Arg	VAL Trp Pro 470
CAA	GCC ATT CCT	CAG	TTT	CTA	GTT	GGT	CAC	TTT GAT ATC	CTT GAC ACG	1494
GLn	ALa Ile Pro 475	Gln	Phe	Leu	vaL 480	GLy	H.s	Phe Asp Ile 485	Leu Asp Thr
GCT	AAA TCA TCT	CTA	ACG	TCT	TCG	GGC	TAC	GAA GGG CTA	TTT TTG GGT	1542
Ala	Lys Ser Ser 490	Leu	Thr	Ser 495	Ser	Gly Tyr	Glu Gly Leu 500	Phe Leu Gly
GGC	AAT TAC GTC	GCT	GGT	GTA	GCC	TTA	GGC	CGG TGT GTA	GAA GGC GCA	1590
Gly 505	Asn Tyr Val	Ala	Gly 510	VaL	ALa	Leu	Gly Arg Cys VćlL 515	Glu Gly ALa 520
TAT	GAA ACC GCG	ATT	GAG	GTC	AAC	AAC	TTC	ATG TCA CGG	TAC GCT TAC	1638
Tyr	Glu Thr ALa	Ile	Glu	Val	Asn	Asn	Phe	Mit Ser Arg Tyr ALa Tyr

525 530 535

AAG TAAATGTAAA ACATTAAAT TCCAGCTK CGTGAiGTTT ATTAAATATT 1691

Lys

TTGAGATATC CAAAAAAA AAAAAAAA 1719 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 537 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 2

Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser

184 242

1	5	10	15
Phe Ser Lys	Pro Asn	Leu Arg Leu Asn Val Tyr Lys Pro	Leu Arg Leu
	20	25	30
Arg Cys Ser	Val ALa	Gly Gly Pro Thr Val Gly Ser Ser	Lys Ile Glu
35		40 45
Gly Gly Gly Gly Thr	Thr Ile Thr Thr Asp tys Val Ile	Val Gly Gly
50		55 60
Gly Ile Ser	Gly Leu	tys Ile ALa Gln ALa Leu Ala Thr	Lys His Pro
65		70 75	80
Asp Ala ALa	Pro Asn	Leu Ile Val Thr Glu ALa Lys Asp Arg Val Gly
	85	90	95
Gly Asn ILe	ILe Thr	Arg Glu Glu Asn Gly Phe Leu Trp	Glu Glu Gly
	100	105	110
Pro Asn Ser	Phe Gln	Pro Ser Asp Pro Mit Leu Thr Mit	Val VLL Asp
115		120 125
Ser Gly Leu	Lys Asp Asp Leu VAL Leu Gly Asp Pro Thr	ALa Pro Arg
130		135 140
Phe Val Leu	Trp Asn	Gly Lys Leu Arg Pro VAL Pro Ser	Lys Leu Thr
145		150 155	160
Asp Leu Pro	Phe Phe	Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys	Ile Arg Ala
	165	170	175
Gly Phe Gly	ALa Leu	Gly Ile Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu
	180	185	190
Ser VLL Glu	Glu Phe	VAL Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu
195		200 205
Arg Leu ILe	Glu Pro	Phe tys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser
210		215 220
Lys Leu Ser	Mit Lys	ALa ALa Phe Gly Lys VlL Trp Lys	Leu Glu Gln
225		230 235	240
Asn Gly Gly	Ser Ile	Ile Gly Gly Thr Phe Lys ALa Ile	Gln Glu Arg
	245	250	255
Lys Asn ALa	Pro Lys	Ala Glu Arg Asp Pro Arg Leu Pro	Lys Pro Gln
	260	265	270
Gly Gln Thr	Val Gly	Ser Phe Arg Lys Gly Leu Arg Mit	Leu Pro Glu
275		280 285

184 242

Ala He Ser Ala Arg Leu Gly	Ser Lys Val Lys	Leu Ser 300	Trp Lys	Leu
	290	295
Ser 305	Gly	Ile Thr Lys Leu Glu 310	Ser Gly Gly Tyr 315	Asn Leu	Thr Tyr	Glu 320
Thr	Pro	Asp Gly Leu VaL Ser 325	Val Gln Ser Lys 330	Ser VAL	Val Mit 335	Thr
Val	Pro	Ser H.s Val Ala Ser 340	Gly Leu Leu Arg 345	Pro Leu	Ser Glu 350	Ser
Ala	Ala	Asn Ala Leu Ser Lys 355	Leu Tyr Tyr Pro 360	Pro VćlL 365	ALa ALa	VaL
Ser	Ile 370	Ser Tyr Pro Lys Glu 375	Ala Ile Arg Thr	Glu Cys 380	Leu Ile	Asp
Gly 385	Glu	Leu Lys Gly Phe Gly 390	Gln Leu His Pro 395	Arg Thr	Gln Gly	Val 400
Glu	Thr	Leu GLy Thr Ile Tyr 405	Ser Ser Ser Leu 410	Phe Pro	Asn Arg 415	ALa
Pro	Pro	Gly Arg Ile Leu Leu 420	Leu Asn Tyr Ile 425	Gly Gly	Ser Thr 430	Asn
Thr	Gly	Ile Leu Ser Lys Ser 435	Glu Gly Glu Leu 440	Val Glu 445	ALa Val	Asp
Arg	Asp 450	Leu Arg Lys Met Leu 455	Ile Lys Pro Asn	Ser Thr 460	Asp Pro	Leu
Lys 465	Leu	Gly Val Arg Val Trp 470	Pro Gln Ala Ile 475	Pro Gln	Phe Leu	VaL 480
Gly	HLs	Phe Asp Ile Leu Asp 485	Thr Ala Lys Ser 490	Ser Leu	Thr Ser 495	Ser
Gly Tyr	Glu Gly Leu Phe Leu 500	GLy Gly Asn Tyr 505	Val ALa	Gly Val 510	ALa
Leu Gly Arg Cys VaL Glu Gly 515	Ala Tyr Glu Thr 520	Ala Ile 525	Glu Val	Asn

Asn Phe Mit Ser Arg Tyr Ala Tyr Lys 530 535

184 242 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 3;

(0 CHARAKTERYSTYK) SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1738 aminokwasów (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (B) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 70... 1596 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga = „Arabidopsis protox-2 cDNA;

sekwencja z pWDC-1” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 3

TTTTTTACTT ATTTCCGTCA CTGCTTTCGA CTGGTCAGAG ATTTTGACTC TGAATTGTTG 60

CAGATAGCA ATG GCG TCT GGA GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT GAA GCG 108

Mt ALa Ser Gly ALa Val Ala Asp His Gln Ile GLu Ala

10

GTT

TCA

G(G

AAA AG

GTC

(GG

CTC

CTA

CTG

CTA

CTG

CTA

ACT

GGA

CTT?

156

Val

Ser 05

Gly

Lyy Ar

VM

Ma 20

Vvl

Vv1

GGy

Ma

GGy 25

Vv1

£Sir

Gly

Ilu

GCG

GCG

GCG

TTA AAG

TTG AG

TTG

AGG

CTG

CTG

AAT

CTG

ΑΓ

GG

ICT

204

ALa 30

ALa

Ala

Ί’τ Lyy

Leu 35

Lyy

Ser

Mg

GGy

Ilu 40

Mn

Vv1

Thh

VM

PPh 45

GAA

GCT

GAG

TGG AG

CTA

CTG

CTG

AA5

ctg

AG AG?

(GT

AG

CAA

AA

252

Glu

ALa

Asp

GGy Mg 50

VaJ.

GGy GGy Lyy

Ilu 55

Mg

Sen:

Vv1

hfet

Gln 60

Mn

GGT

TTG

ΑΠ’

TTG (GA

GG

CTG

CTCA

AA

AG

AG

ACT

(GAG

CTC

GAG

<GA

300

Gly

Leu

Ile

Trp Mp 65

Glu

GGy

Mli

Mn 70

Thh

mt

Thh

GGu

Mli 75

Glu

Pro

GAA

GTT

GCG

GCG TTA

CTT

GGT

(GT

CCT

(GG

CCT

CCT

(GAG

AG

CA

CCG

348

Glu

Val

Gty 80

Seer Ilu

Leu

Mp Mp 85

Ilu

GGy

Ilu

Ag

GGu 90

Lyy

Gln

GGn

TTT

CCA

ACT

TTA CCG

AA

AA

(CG

TAA

ACT

CTG

CCT

AA

CTG

GTA

CCC

396

Phe

Pro

Ile

Ser GGn

Lys

Lyy

Mg

tyr

Ile

Vvi1

Ag

Mn

GGy

Val

Pro

100 105

184 242

GTG

ATG

CTA

CCT

ACC

AAT

CCC

ATA

GAG

CTG

GTC

ACA

AGT

AGT

GTG

CTC

444

Val II0

H

Leu

Pro

Thr

Asn II5

Pro

Ile

Glu

Leu

VaL I20

Thr

Ser

Ser

Val

Leu I25

TCT

ACC

CAA

TCT

AAG

TTT

CAA

ATC

TTG

TTG

GAA

CCA

TTT

TTA

TGG

AAG

492

Ser

Thr

Gln

Ser

Lys I30

Phe

Gln

Ile

Leu

Leu I35

Glu

Pro

Phe

Leu

Trp I40

Lys

AAA

AAG

TCC

TCA

AAA

GTC

TCA

GAT

GCA

TCT

GCT

GAA

GAA

AGT

GTA AGC

540

Lys

Lys

Ser

Ser 145

Lys

VaL

Ser

Asp

Ala I50

Ser

Ala.

Glu

Glu

Ser I55

VaL

Ser

GAG

TTC

TTT

CAA

CGC

CAT

TTT

GGA

CAA

GAG

GTT

GTT

GAC

TAT

CTC

ATC

588

Glu

Phe

Phe I60

Gln

Arg

His

Phe

Gly I65

Gln

Glu

VaL

Val

Asp I70

Tyr

Leu

Ile

GAC

CCT

TTT

GTT

GGT

GGA

ACA

AGT

GCT

GCG

GAC

CCT

GAT

TCC

CTT

TCA

636

Asp

Pro I75

Phe

vaL

Gly

Gly

Thr I80

Ser

Ala

Ala

Asp

Pro I85

Asp

Ser

Leu

Ser

ATG

AAG

CAT

TCT

TTC

CCA

GAT

CTC

TGG

AAT

GTA

GAG

AAA

AGT

TTT

GGC

684

I90

Lys

His

Ser

Phe

Pro I95

Asp

Leu

Trp

Asn

Val 200

Glu

Lys

Ser

Phe

Gly 205

TCT

ATT

ATA

GTC

GGT

GCA

ATC

AGA

ACA

AAG

TTT

GCT

GCT

AAA

GGT

GGT

732

Ser

Ile

Ile

VćlL

Gly 2I0

Ala

Ile

Arg

Thr

Lys 2I5

Phe

Ala

Ala

Lys

Gly Gly 220

AAA

AGT

AGA

GAC

ACA

AAG

AGT

TCT

CCT

GGC

ACA

AAA

AAG

GGT

TCG

CGT

780

Lys

Ser

Arg Asp 225

Thr

Lys

Ser

Ser

Pro 230

GLy

Thr

Lys

Lys

Gly 235

Ser

Arg

GGG

TCA

TTC

TCT

TTT

AAG

GGG

GGA

ATG

CAG

ATT

CTT

CCT

GAT

ACG

TTG

828

Gly

Ser

Phe 240

Ser

Phe

Lys

Gly Gly 245

It

GLn

Ile

Leu

Pro 250

Asp

Thr

Leu

TGC

AAA

AGT

CTC

TCA

CAT

GAT

GAG

ATC

AAT

TTA

GAC

TCC

AAG

GTA

CTC

876

Cys

Lys 255

Ser

Leu

Ser

His

Asp 260

GLu

Ile

Asn

Leu

Asp 265

Ser

Lys

Val

Leu

TCT

TTG

TCT

TAC

AAT

TCT

GGA

TCA

AGA

CAG

GAG

AAC

TGG

TCA

TTA

TCT

924

Ser 270

Leu

Ser

Tyr

Asn

Ser 275

Gly

Ser

Arg

Gln

Glu 280

Asn

Trp

Ser

Leu

Ser 285

TGT

GTT

TCG

CAT

AAT

GAA

ACG

CAG

AGA

CAA

AAC

CCC

CAT

TAT

GAT

GCT

972

Cys

Val

Ser

His

Asn 290

Glu

Thr

Gln

Arg

Gln 295

Asn

Pro

His

Tyr Asp 300

Ala

GTA

ATT

ATG

ACG

GCT

CCT

CTG

TGC

AAT

GTG

AAG

GAG

ATG

AAG

GTT

ATG

I020

Val

Ile

Iet

Thr

Ala

Pro

Leu

Cys

Asn

Val

Lys

Glu

Ust

Lys

Val

It

305 3I0 3I5

184 242

AAA GGA GGA Lys Gly Gly	CAA CCC TTT CAG CTA AAC TTT CTC CCC GAG ATT AAT TAC	1068
Gln	Pro	Phe	Gln	Leu Asn Phe Leu Pro Glu Ile Asn Tyr
	320	325	330
ATG CCC	CTC	TCG	GTT	TTA	ATC	ACC	ACA TTC ACA AAG GAG AAA GTA AAG	1116
Met Pro 335	Leu	Ser	Val	Leu	Ile 340	Thr	Thr Phe Thr Lys Glu Lys VłL Lys 345
AGA CCT	CTT	GAA	GGC	TTT	GGG	GTA	CTC ATT CCA TCT AAG GAG CAA AAG	1164
Arg Pro 350	Leu	Glu	Gly	Phe 355	Gly	VlL	Leu He Pro Ser Lys Gu Gln Lys 360 365
CAT GGT	TTC	AAA	ACT	CTA	GGT	ACA	CTT TTT TCA TCA ATG ATG TTT CCA	1212
H.s Gy	Phe	Lys	Thr 370	Leu	Gy	Thr	Leu Phe Ser Ser Mit Met Phe Pro 375 380
GAT CGT	TCC	CCT	AGT	GAC	GTT	CAT	CTA TAT ACA ACT TTT ATT GGT GGG	1260
Asp Arg	Ser	Pro 385	Ser	Asp	VlL	HLs	Leu Tyr Thr Thr Phe Ile Gy Gy 390 395
AGT AGG	AAC	CAG	GAA	CTA	GCC	AAA	GCT TCC ACT GAC GAA TTA AAA CAA	1308
Ser Arg	Asn 400	Gln	Glu	Leu	ALa	Lys 405	Ala Ser Thr Asp Gu Leu Lys Gln 410
GTT GTG	ACT	TCT	GAC	CTT	CAG	CGA	CTG TTG GGG GTT GAA GGT GAA CCC	1356
Val VlL 415	Thr	Ser	Asp	Leu	Gln 420	Arg	Leu Leu Gy Val Gu Gy Gu Pro 425
GTG TCT	GTC	AAC	CAT	TAC	TAT	TGG	AGG AAA GCA TTC CCG TTG TAT GAC	1404
Val Ser 430	VaL	Asn	H_s	Tyr 435	Tyr Trp Arg Lys ALa Phe Pro Leu Tyr Asp 440 445
AGC AGC	TAT	GAC	TCA	GTC	ATG	GAA	GCA ATT GAC AAG ATG GAG AAT GAT	1452
Ser Ser	Tyr Asp	Ser 450	Val	Met	Gu	ALa Ile Asp Lys Mit Gu Asn Asp 455 460
CTA CCT	GGG	TTC	TTC	TAT	GCA	GGT	AAT CAT CGA GGG GGG CTC TCT GTT	1500
Leu Pro	Gly	Phe 465	Phe	Tyr	ALa	Gy	Asn HLs Arg Gy Gy Leu Ser VAL 470 475
GGG AAA	TCA	ATA	GCA	TCA	GGT	TGC	AAA GCA GCT GAC CTT GTG ATC TCA	1548
Gly Lys	Ser 480	He	Ala	Ser	Gly	Cys 485	Lys ALa Ala Asp Leu Val Ile Ser 490
TAC CTG	GAG	TCT	TGC	TCA	AAT	GAC	AAG AAA CCA AAT GAC AGC TTA TAACATTGTC

1603

Tyr Leu Glu Ser Cys Ser Asn Asp Lys	Lys Pro Asn Asp Ser Leu
495	500	505

AAGGTTCGTC CCTTTTTATC ACTTACTTTG TAAACTTGTA AAATGCAACA AGCCGCCGTG 1663

CGATTAGCCA ACAACTCAGC AAAACCCAGA TTCTCATAAG GCTCACTAAT TCCAGAATAA 1723

ACTATTTATG TAAAA

1738

184 242 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 4:

(0 CHARAKTERYSTYK! SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 508 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 4

fet 1

ALa

Ser

Gly Ala 5

Val ALa

Asp

H.s

Gln 10

Ile

Glu

ALa

VaL

Ser 15

GLy

Lys

Arg

Val

Ala Val 20

Val GLy

Ala

GLy 25

Val

Ser

GLy

Leu

ALa 30

Ala

ALa

Tyr

Lys

Leu 35

Lys Ser

Arg Gly

Leu 40

Asn

Val

Thr

Val

Ehe 45

GLu

Ala

Asp

Gly Arg 50

Val

Gly Gly

Lys Leu 55

Arg

Ser

Val

Met

Gln 60

Asn

Gly

Leu

Ile

Trp 65

Asp

Glu

Gly Ala

Asn Thr 70

fet

Thr

Glu

ALa 75

Glu

Ero

Glu

Val

Gly 80

Ser

Leu

Leu

Asp Asp 85

Leu Gly

Leu

Arg

Glu 90

Lys

Gln

Gln

Ehe

Ero 95

Ile

Ser

Gln

Lys

Lys Arg Tyr Ile 100

m

Arg 105

Asn

Gly

vll

Ero

110

Mit

Leu

Ero

Thr

Asn 115

Ero Ile

GLu Leu

VaL 120

Thr

Ser

Ser

vll

Leu 125

Ser

Tir

Gln

Ser

Lys 130

Ehe

Gln Ile

Leu Leu 135

Glu

Ero

Ehe

Leu

Trp 140

Lys

Lys

Lys

Ser

Ser 145

Lys

Val

Ser Asp

ALa Ser 150

ALa

GLu

GLu

Ser 155

Val

Ser

Glu

Ehe

Ehe 160

Gln

Arg

His

Ehe Gly 165

Gln GLu

Val

Val

Asp 170

Tyr

Leu

Ile

Asp

Ero 175

Ehe

Val

Gly

Gly

Thr Ser 180

Ala ALa

Asp

Ero 185

Asp

Ser

Leu

Ser

Met 190

Lys

His

Ser Ehe Ero Asp Leu Trp Asn Val Glu Lys Ser Ehe Gly Ser Ile Ile

184 242

195 200 205

Val Gly ALa	Ile Arg Thr	Lys Phe ALa ALa Lys Gly Gly Lys Ser Arg
	210	215	220
Asp 225	Thr Lys	Ser Ser Pro 230	Gly Thr Lys	Lys Gly Ser Arg Gly Ser Phe 235 240
Ser	Phe Lys	Gly Gly Mit 245	Gln Ile Leu	Pro Asp Thr Leu Cys Lys Ser 250 255
Leu	Ser H.s	Asp Glu Ile 260	Asn Leu Asp 265	Ser Lys Val Leu Ser Leu Ser 270
Tyr	Asn Ser 275	Gly Ser Arg	Gln Glu Asn 280	Trp Ser Leu Ser Cys VłL Ser 285
H.s	Asn Glu 290	Thr Gln Arg	Gln Asn Pro 295	H.s Tyr Asp Ala VaL Ile Met 300
Thr 305	ALa Pro	Leu Cys Asn 310	Val Lys Glu	Met Lys Val Mit Lys GLy Gly 315 320
GLn	Pro Phe	Gln Leu Asn 325	Phe Leu Pro	GLu Ile Asn Tyr Met Pro Leu 330 335
Ser	Val Leu	He Thr Thr 340	Phe Thr Lys 345	GLu Lys Val Lys Arg Pro Leu 350
Glu	Gly Phe 355	Gly Val Leu	Ile Pro Ser 360	Lys Glu Gln Lys HLs Gly Phe 365
Lys	Thr Leu 370	Gly Thr Leu	Phe Ser Ser 375	Met Mit Phe Pro Asp Arg Ser 380
Pro 385	Ser Asp	VćlL His Leu 390	Tyr Thr Thr	Phe Ile Gly Gly Ser Arg Asn 395 400
Gln	Glu Leu	ALa Lys ALa 405	Ser Thr Asp	Glu Leu Lys GLn Val Val Thr 410 415
Ser	Asp Leu	Gln Arg Leu 420	Leu Gly VAL 425	Glu Gly Glu Pro Val Ser VaL 430
Asn	H.s Tyr 435	Tyr Trp Arg	Lys ALa Phe 440	Pro Leu Tyr Asp Ser Ser Tyr 445
Asp	Ser Val 450	Met Glu ALa	Ile Asp Lys 455	Met Glu Asn Asp Leu Pro Gly 460
Phe 465	Phe Tyr	ALa Gly Asn 470	His Arg Gly Gly Leu Ser V^l. Gly Lys Ser 475 480

184 242

Ile Ala Ser Gly Cys Lys Ala Ala Asp Leu Val Ile Ser Tyr Leu Glu 485 490 495

Ser Cys Ser Asn Asp Lys Lys Pro Asn Asp Ser Leu 500 505 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1698 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA 2... 1453 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga = „Maize protox-1 cDNA;

(nie pełna długość); sekwenq'a z pWDC-4 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 5

G AAT TCG GCG GAC TGC GTC GTG GTG GGC GGA GGC ATC AGT GGC CTC Asn Ser Ala Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu 15 10 15

TGC

ACC

GCG

CAG

GCG

CTG

GCC

ACG

CGG

CAC

GGC

GTC

GGG GAC

GTG

CTT

Cys

Thr

Ala

Gin

Ala 20

Leu

Ala

Thr

Arg

His 25

Gly

Val

Gly Asp

Val 30

Leu

GTC

ACG

GAG

GCC

CGC

GCC

CGC

CCC

GGC

GGC

AAC

ATT

ACC ACC

GTC

GAG

Val

Thr

Glu

Ala 35

Arg

Ala

Arg

Pro

Gly Gly 40

Asn

Ile

Thr Thr 45

Val

Glu

CGC

CCC

GAG

GAA

GGG

TAC

CTC

TGG

GAG

GAG

GGT

CCC

AAC AGC

TTC

CAG

Arg

Pro

Glu 50

Glu

Gly

Tyr

Leu

Trp 55

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn Ser 60

Phe

Gin

142

190

CCC TCC GAC CCC GTT CTC ACC ATG GCC GTG GAC AGC GGA CTG AAG GAT Pro Ser Asp Pro Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp

70 75

238

184 242

GAC TTG Asp Leu 80	GTT TTT GGG GAC CCA AAC GCG CCG CGT TTC GTG CTG TGG GAG	286
Val Phe	Gly	Asp 85	Pro	Asn	ALa Pro	Arg 90	Phe	Val Leu Trp Glu 95
GGG AAG	CTG AGG	CCC	GTG	CCA	TCC	AAG CCC	GCC	GAC	CTC CCG TTC TTC	334
Gly Lys	Leu Arg	Pro 100	Val	Pro	Ser	Lys Pro 105	ALa	Asp	Leu Pro Phe Phe 110
GAT CTC	ATG AGC	ATC	CCA	GGG	AAG	CTC AGG	GCC	GGT	CTA GGC GCG CTT	382
Asp Leu	Met Ser 115	Ile	Pro	Gly Lys	Leu Arg 120	ALa	Gly	Leu GLy ALa Leu 125
GGC ATC	CGC CCG	CCT	CCT	CCA	GGC	CGC GAA	GAG	TCA	GTG GAG GAG TTC	430
Gly ne	Arg Pro 130	Pro	Pro	Pro	GLy Arg GLu 135	GLu	Ser	VAL Glu GLu Phe 140
GTG CGC	CGC AAC	CTC	GGT	GCT	GAG	GTC TTT	GAG	CGC	CTC ATT GAG CCT	478
Val Arg Arg Asn 145	Leu	GLy	ALa 150	Glu	VLL Phe	Glu	Arg 155	Leu Ile Glu Pro
TTC TGC	TCA GGT	GTC	TAT	GCT	GGT	GAT CCT	TCT	AAG	CTC AGC ATG AAG	526
Phe Cys 160	Ser Gly	Val	Tyr 165	ALa	Gly Asp Pro	Ser 170	Lys	Leu Ser Mit Lys 175
GCT GCA	TTT GGG	AAG	GTT	TGG	CGG	TTG GAA	GAA	ACT	GGA GGT AGT ATT	574
ALa ALa	Phe Gly Lys 180	vll	Trp Arg	Leu GLu 185	Glu	Thr	Gly Gly Ser Ile 190
ATT GGT	GGA ACC	ATC	AAG	ACA	ATT	CAG GAG	AGG	AGC	AAG AAT CCA AAA	622
Ile Gly	Gly Thr 195	Ile	Lys	Thr	Ile	Gln Glu 200	Arg	Ser	Lys Asn Pro Lys 205
CCA CCG	AGG GAT	GCC	CGC	CTT	CCG	AAG CCA	AAA	GGG	CAG ACA GTT GCA	670
Pro Pro	Arg Asp 210	ALa	Arg	Leu	Pro 215	Lys Pro	Lys	Gly	Gln Thr VćlL ALa 220
TCT TTC	AGG AAG	GGT	CTT	GCC	ATG	CTT CCA	AAT	GCC	ATT ACA TCC AGC	718
Ser Phe 225	Arg Lys	Gly	Leu	ALa 230	Mit	Leu Pro	Asn	ALa 235	Ile Thr Ser Ser
TTG GGT	AGT AAA	GTC	AAA	CTA	TCA	TGG AAA	CTC	ACG	AGC ATT ACA AAA	766
Leu Gly 240	Ser Lys	vll	Lys 245	Leu	Ser	Trp Lys	Leu 250	Thr	Ser Ile Thr Lys 255
TCA GAT	GAC AAG	GGA	TAT	GTT	TTG	GAG TAT	GAA	ACG	CCA GAA GGG GTT	814
Ser Asp Asp Lys	Gly 260	Tyr	Val	Leu	Glu Tyr 265	Glu	Thr	Pro Glu Gly VAL 270
CTT TCG	GTG CAG	GCT	AAA	AGT	GTT	ATC ATG	ACT	ATT	CCA TCA TAT GTT	862
Val Ser	Val Gln	ALa	Lys	Ser	Val	Ile Mit	Thr	Ile	Pro Ser Tyr Val

275 280 285

184 242

GCT AGC AAC ATT TTG	CGT CCA CTT Arg Pro leu 295	TCA AGC GAT GCT GCA GAT	GCT ALa	CTA Leu	9I0
ALa	Ser	Asn Ile Leu 290	Ser	Ser	Asp	ALa ALa 300	Asp
TCA	AGA	TTC TAT TAT	CCA CCG GTT	GCT	GCT	GTA	ACT GTT	TCG	TAT	CCA	958
Ser	Arg 305	Phe Tyr Tyr	Pro Pro Val 3I0	ALa	ALa	Val	Thr Val 3I5	Ser	Tyr	Pro
AAG	GAA	GCA ATT AGA	AAA GAA TGC	TTA	ATT	GAT	GGG GAA	CTC	CAG	GGC	I006
lys 320	Glu	ALa Ile Arg	lys Glu Cys 325	Leu	Ile	Asp 330	Gly Glu	Leu	Gln	Gly 335
TTT	GGC	CAG TTG CAT	CCA CGT AGT	CAA	GGA	GTT	GAG ACA	TTA	GGA	ACA	I054
Phe	Gly	Gln leu His 340	Pro Arg Ser	Gln	GLy 345	vll	Glu Thr	Leu	GLy 350	Thr
ATA	TAC	AGT TCC TCA	CTC TTT CCA	AAT	CGT	GCT	CCT GAC	GGT	AGG	GTG	II02
Ile	Tyr	Ser Ser Ser 355	leu Phe Pro	Asn 360	Arg	ALa	Pro Asp	Gly Arg 365	vll
TTA	CTT	CTA AAC TAC	ATA GGA GGT	GCT	ACA	AAC	ACA GGA	ATT	GTT	TCC	II50
Leu	Leu	leu Asn Tyr 370	Ile Gly Gly 375	ALa	Thr	Asn	Thr Gly 380	Ile	Val	Ser
AAG	ACT	GAA AGT GAG	CTG GTC GAA	GCA	GTT	GAC	CGT GAC	CTC	CGA	AAA	II98
Lys	Thr 385	Glu Ser Glu	Leu VćlL Glu 390	ALa	Val	Asp Arg Asp 395	Leu	Arg	Lys
ATG	CTT	ATA AAT TCT	ACA GCA GTG	GAC	CCT	TTA	GTC CTT	GGT	GTT	CGA	I246
400	Leu	Ile Asn Ser	Thr ALa Val 405	Asp	Pro	Leu 4I0	Val Leu	Gly	Val	Arg 4I5
GTT	TGG	CCA CAA GCC	ATA CCT CAG	TTC	CTG	GTA	GGA CAT	CTT	GAT	CTT	I294
Val	Trp	Pro Gln ALa 420	Ile Pro Gln	Phe	leu 425	Val	Gly His	Leu	Asp 430	Leu
CTG	GAA	GCC GCA AAA	GCT GCC CTG	GAC	CGA	GGT	GGC TAC	GAT	GGG	CTG	I342
leu	Glu	ALa ALa Lys 435	ALa ALa leu	Asp Arg 440	Gly Gly Tyr	Asp Gly 445	Leu
TTC	CTA	GGA GGG AAC	TAT GTT GCA	GGA	GTT	GCC	CTG GGC	AGA	TGC	GTT	I390
Phe	leu	Gly Gly Asn 450	Tyr Val ALa 455	Gly	VlL	ALa	Leu Gly 460	Arg	Cys	Val
GAG	GGC	GCG TAT GAA	AGT GCC TCG	CAA	ATA	TCT	GAC TTC	TTG	ACC	AAG	I438
Glu	Gly 465	ALa Tyr Glu	Ser ALa Ser 470	Gln	ILe	Ser	Asp Phe 475	Leu	Thr	Lys

I490

TAT GCC TAC AAG TGATGAAAGA AGTGGAGCGC TACTTGTTAA TCGTTTATGT

Tyr ALa Tyr Lys

480

184 242

TGCATAGATG AGGTGCCTCC GGGGGAAAAAA AAGCTTGAAT AGTATTTTTT ATTCTTATTT

TGTAAATTGC ATTTCTGTTC TTTTTTCTAT CAGTAATTAG TTATATTTTA GTTCTGTAGG

AGATTGTTCT GTTCACTGCC CTTCAAAAGA AATTTTATTT TTCATTCTTT TATGAGAGCT

GTGCTACTTA AAAAAAAAAA AAAAAAAA (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 363 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 6

1550

1610

1670

1698

Asn Ser 1	Ala Asp	Cys Val UL VclL Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys
5	10	15
Thr ALa	Gln Ala 20	Leu	ALa Thr Arg His Gly Val Gly Asp Leu Val 25 30
Thr Glu	ALa Arg 35	Ala	Arg Ero Gly Gly Asn Ile Thr Thr 40 45	VłL Glu Arg
Ero Glu 50	Glu Gly Tyr	Leu Trp Glu Glu Gly Ero Asn Ser 55 60	Ehe Gln Ero
Ser Asp 65	Ero Val	Leu	Thr fet Ala VćlL Asp Ser Gly Leu 70 75	Lys Asp Asp 80
Leu Val	Ehe Gly Asp 85	Ero Asn ALa Ero Arg Ehe VAL Leu 90	Trp Glu Gly 95
Lys Leu	Arg Ero 100	Val	Ero Ser Lys Ero ALa Asp Leu Ero 105	Ehe Ehe Asp 110
Leu fet	Ser Ile 115	Ero	Gly Lys Leu Arg Ala Gly Leu Gly 120 125	Ala Leu Gly
Ile Arg 130	Ero Ero	Ero	Ero Gly Arg Glu Glu Ser V<aL Glu 135 140	Glu Ehe Val
Arg Arg 145	Asn Leu	Gly	ALa Glu Val Ehe Glu Arg Leu Ile 150 155	Glu Ero Ehe 160

Cys Ser Gly Val Tyr ALa Gly Asp Ero Ser Lys Leu Ser fet Lys ALa 165 170 175

184 242

Ala	Phe Gly	Lys Val 180	Trp Arg Leu Glu Glu Thr Gly Gly Ser Ile Ile
185	190
Gly Gly Thr 195	Ile Lys	Thr He Gln Glu 200	Arg Ser Lys Asn Pro Lys Pro 205
Pro	Arg Asp 210	Ala Arg	Leu Pro Lys Pro 215	Lys Gly Gln Thr VaL ALa Ser 220
Phe 225	Arg Lys	Gly Leu	ALa Met Leu Pro 230	Asn ALa Ile Thr Ser Ser Leu 235 240
Gly Ser Lys	Val Lys 245	Leu Ser Trp Lys	Leu Thr Ser Ile Thr Lys Ser 250 255
Asp Asp Lys GLy Tyr 260	Val Leu Glu Tyr 265	GLu Thr Pro Glu Gly VAL Val 270
Ser	Val GLn 275	Ala Lys	Ser VAL He Met 280	Thr Ile Pro Ser Tyr VćLL ALa 285
Ser	Asn Ile 290	Leu Arg	Pro Leu Ser Ser 295	Asp ALa ALa Asp ALa Leu Ser 300
Arg 305	Phe Tyr Tyr Pro	Pro Val ALa ALa 310	Val Thr VAL Ser Tyr Pro Lys 315 320
Glu	Ala He	Arg Lys 325	Glu Cys Leu H_e	Asp Gly Glu Leu GLn Gly Phe 330 335
Gly	Gln Leu	H.s Pro 340	Arg Ser GLn Gly 345	Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile 350
Tyr	Ser Ser 355	Ser Leu	Phe Pro Asn Arg 360	ALa Pro Asp GLy Arg VAL Leu 365
Leu	Leu Asn 370	Tyr He	Gly Gly ALa Thr 375	Asn Thr Gly Ile VćlL Ser Lys 380
Thr 385	Glu Ser	Glu Leu	VaL Glu ALa Val 390	Asp Arg Asp Leu Arg Lys Mit 395 400
Leu	Ile Asn	Ser Thr 405	ALa Val Asp Pro	Leu Val Leu Gly Val Arg Val 410 415
Trp	Pro Gln	ALa Lle 420	Pro Gln Phe Leu 425	Val Gly His Leu Asp Leu Leu 430
Glu	Ala Ala 435	Lys ALa	ALa Leu Asp Arg 440	Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe 445

184 242

Leu Gly Gly Asn Tyr Val ALa Gly Val ALa Leu Gly Arg Cys VaL Glu 450 455 460

Gly ALa Tyr Glu Ser ALa Ser Gin Ile Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr 465 470 475 480

Ala Tyr Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2061 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 64... 1698 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga = „Maize protox-2 cDNA;

sekwenqa z pWDC-3” (xó) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 7

CTCTCCTACC TCCACCTCCA CGACAACAAG CAAATCCCCA TCCAGTTCCA AACCCTAACT 60

CAA ATG

CTC

GCT

TTG

ACT

GCC TCA

GCC

TCA

TCC

GCT

TCG

TCC

CAT

CCT

108

Mit: 1

Leu

ALa

Leu

Thr 5

ALa Ser

ALa

Ser

Ser 10

ALa

Ser

Ser

H.s

Pro 15

TAT CGC

CAC

GCC

TCC

GCG

CAC ACT

CGT

CGC

CCC

CGC

CTA

CGT

GCG

GTC

156

Tyr Arg

His

ALa

Ser 20

Ala

His Thr

Arg Arg 25

Pro

Arg

Leu

Arg

ALa 30

val

CTC GCG

ATG

GCG

GGC

TCC

GAC GAC

CCC

CGT

GCA

GCG

CCC

GCC

AGA

TCG

204

Leu ALa

Met

Ala 35

Gly

Ser

Asp Asp

Pro 40

Arg

ALa

ALa

Pro

ALa 45

Arg

Ser

GTC GCC

GTC

GTC

GGC

GCC

GGG GTC

AGC

GGG

CTC

GCG

GCG

GCG

TAC

AGG

252

Val ALa

Val 50

Val

Gly

ALa

Gly Val 55

Ser

Gly

Leu

ALa

ALa 60

ALa

Tyr Arg

184 242

CTC AGA CAG AGC GGC

GTG Val

AAC CTA ACG GTG rrC GM GCG GCC GAC AGG

300

Leu

Arg 65

Gln

Ser Gly

Asn 70

Val

Thr

Val

Phe Glu 75

ALa

ALa Mp Arg

GG

GGA

GGA

AAG ATA

CGG

ACC

AAT

TCC

GAG

GC GGG

TTT

GTC TGG GAT

348

ALa 80

Gly

Gly

Lys Ile

Arg 85

Tir

Asn

Ser

Glu

Gly Gly 90

Phe

Val Trp Mp 95

GM

GGA

yτr

AAC ATT

ATG

ACA

GM

GGT

GM

TGG GAG

GCC

AG pyp CTG

396

Glu

Gly

ALa

Asn Thr 000

Met

Thr

GLu

Gly

Glu 005

Trp Glu

Ala

Ser Arg Leu H0

pτr

GAT

GAT

CTT GGA

CTA CAA GAC

AAA

CAG

CAG TAT

CCT

AAC TCC CAA

444

Ile

Mp Mp

Leu Gly 005

Leu

Gn

Mp Lys 020

GLn

Gn Tyr

Pro

Mn Ser Gn 025

CAC

pag

CGT

TAC ATT

GTC

AAA

GAT

GGA

GCA

CCA GCA

CTG

ATT CCT TCG

492

His

Lys

Arg 030

Tyr Ile

Val

Lys

Ap 035

Gly

Ala

Pro ALa

Leu M0

Ile Pro Ser

GAT

CCC

ATT

TCG CTA

prG

AAA

AGC

AGT

yττ

CTT TCG

ACA

AAA TCA PΑy

540

Asp

Pro 045

Ile

Ser Leu

Mit

Lys 050

Ser

Ser

VaL

Leu Ser 055

Thr

Lys Ser Lys

ATT

GCG

TTA

TTT ητ

GAA

CCA

TTT

CTC

TAC

AAG AM

GCT

MC ACA pyp

588

Ile 060

ALa

Leu

Phe Phe

GLu 065

Pro

Phe

Leu

Tyr Lys Lys 070

ALa

Mn Thr Arg 075

AAC

TCT

GGA

AM GCG

TCT

GAG

GAG

CAC

ttg

AGT GAG

AGT

GTT GGG AGC

636

Asn

Ser

Gly

Lys Val 080

Ser

Glu

GLu

H.s

Leu 085

Ser Glu

Ser

Val Gly Ser 090

TTC

TGT

GAA

CG CAC

TTT

GGA

AGA

GM

GTT

GTT GAC

TAT

TTT GTT GM

684

Phe

Cys

GLu

Arg His 095

Phe

GLy

Arg

Glu 200

VaL

Val Mp Tyr

Phe VćaL Asp 205

CCA

TTT

GTA

GCT GGA

ACM

AGT

GA

GA

GAT

CCA GAG

TCA

cta tct prτ

732

Pro

Phe

vil 200

ALa Gly

Thr

Ser

ALa 205

Gly Asp

Pro Glu

Ser 220

Leu Ser Ile

CGT

CAT

GCA

TTC CCA

GCA

TTG

TGG

AAT

TTG

GM AGA

MG

TAT GGT TCA

780

Arg

His 225

ALa

Phe Pro

ALa

Leu 230

Trp

Mn

Leu

Glu Arg 235

Lys

Ayr Gly Ser

GT

ATT

GTT

GGT GCC

ATC

TTG

TCT

MG

CTA

GCA GCT

AAA

GGA GAT CCA

828

VaL 240

Ile

VaL

Gly Ala

Ile 245

Leu

Ser

Lys

Leu

ALa Ala 250

Lys

GLy Mp Pro 255

GA

AAG

ACA

AGA CAT

GAT

TCA

TCA

GGG

AM

AGA AGG

AAT

AGA CGA GAG

876

Val

Lys

Thr

Arg His 260

Mp

Ser

Ser

Gly

Lys 265

Ag Arg

Mn

Arg Arg Val 270

184 242

TCG TTT TCA TTT CAT GGT GGA ATG CAG TCA Ser Phe Ser Phe His Gly Gly Met Gln Ser
	275	280
AAT GAA	GTT GGA	GAT GAT AAT GTG AAG CTT
Asn Glu	VaL Gy Asp Asp Asn Val Lys Leu 290 295
TTG GCA	TGT ACA	TTT GAT GGA GTT CCT GCA
Leu ALa 305	Cys Thr	Phe Asp Gy Val Pro Ala 310
TCT GTT	GAT TCG	AAG GAT AGC GGT GAC AAG
Ser VLL 320	Asp Ser	Lys Asp Ser Gy Asp Lys 325
ACC TTT	GAT GCT	GTT ATA ATG ACA GCT CCA
Thr Phe	Asp ALa	VaL Ile Met Thr Ma Pro 340 345
ATG AAG	TTC ACC	AAA GGT GGA GCT CCG GTT
Met Lys	Phe Thr 355	Lys Gly Gy ALa Pro Val 360
AAG ATG	GAT TAT	CTA CCA CTA TCT CTC ATG
Lys Mt	Asp Tyr 370	Leu Pro Leu Ser Leu Met 375
GAT GAT	GTC AAG	AAA CCT CTG GAA GGA TTT
Asp Asp 385	VhL Lys	Lys Pro Leu Glu Gy Phe 390
AAG GAA	CAG CAA	AAA CAT GGT CTG AAA ACC
Lys Glu 400	Gln Gln	Lys HLs Gly Leu Lys Thr 405
TCA ATG	ATG TTC	CCA GAT CGA GCT CCT GAT
Ser Mt	Met Phe	Pro Asp Arg Ala Pro Asp 420 425
ACA TTT	GTT GGG	GGT AGC CAC AAT AGA GAT
Thr Phe	Val Gy 435	Gy Ser His Asn Arg Asp 440
TCT ATT	CTG AAA	CAA CTT GTG ACC TCT GAC
Ser ILe	Leu Lys 450	Gn Leu Val Thr Ser Asp 455
GTA GAG	GGG CAA	CCA ACT TTT GTC AAG CAT
Val Glu 465	Gy Gln	Pro Thr Phe Val Lys His 470

CTA ATA AAT GCA CTT CAC 924

Leu Ile Asn Ma Leu HLs

285

GGT ACA GAA GTG TTG TCA 972

Gly Thr Glu VaLL Leu Ser

300

CTA GGC AGG TGG TCA ATT 1020

Leu Gy Arg Trp Ser Ile

315

GAC CTT GCT AGT AAC CAA 1068 Asp Leu ALa Ser Asn Gn 330 335

TTG TCA AAT GTC CGG AGG 1116 Leu Ser Asn VhL Arg Arg

350

GTT CTT GAC TTT CTT CCT 1164

Val Leu Asp Phe Leu Pro

365

GTG ACT GCT TTT AAG AAG 1212

Val Thr ALa Phe Lys Lys

380

GGG GTC TTA ATA CCT TAC 1260 Gly Val Leu Ile Pro Tyr

395

CTT GGG ACT CTC TTT TCC 1308

Leu Gy Thr Leu Phe Ser 410 415

GAC CAA TAT TTA TAT ACA 1356 Asp Gln Tyr Leu Tyr Thr

430

CTT GCT GGA GCT CCA ACG 1404 Leu Ma Gly ALa Pro Thr

445

CTT AAA AAA CTC TTG GGC 1452

Leu Lys Lys Leu Leu Gy

460

GTA TAC TGG GGA AAT GCT 1500

Val Tyr Trp Gly Asn Ma

475

184 242

TTT CCT TTG TAT GGC CAT GAT TAT AGT TCT GTA TTG GAA GCT ATA GAA 1548

Phe Pro Leu Tyr Gly His Asp Tyr Ser Ser Val Leu Glu ALa Ile Glu

480 485 490 495

AAG ATG GAG AAA AAC CTT CCA GGG TTC TTC TAC GCA GGA AAT AGC AAG 1596

Lys Met Glu Lys Asn Leu Pro Gly Phe Phe Tyr ALa Gly Asn Ser Lys

500 505 510

GAT GGG CTT GCT GTT GGA AGT GTT ATA GCT TCA GGA AGC AAG GCT GCT 1644

Asp Gly Leu Ala Val Gly Ser VslL Ile ALa Ser Gly Ser Lys ALa Ala

515 520 525

GAC CTT GCA ATC TCA TAT CTT GAA TCT CAC ACC AAG CAT AAT AAT TCA 1692

Asp Leu ALa Ile Ser Tyr Leu Glu Ser H.s Thr Lys HLs Asn Asn Ser

530 535 540

CAT TGAAAGTGTC TGACCTATCC TCTAGCAGTT GTCGACAAAT TTCTCCAGTT 1745

His

545

CATGTACAGT AGAAACCGAT GCGTTGCAGT TTCAGAACAT CTTCACTTCT TCAGATATTA 1805

ACCCTTCGTT GAACATCCAC CAGAAAGGTA GTCACATGTG TAAGTGGGAA AATGAGGTTA 1865

AAAACTATTA TGGCGGCCGA AATGTTCCTT TTTGTTTTCC TCACAAGTGG CCTACGACAC 1925

TTGATGTTGG AAATACATTT AAATTTGTTG AATTGTTTGA GAACACATGC GTGACGTGA 1985

ATATTTGCCT ATTGTGATTT TAGCAGTAGT CTTGGCCAGA TTATGCTTTA CGCCTTTAAA 2045

AAAAAAAAAA AAAAAA 2061 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 8:

(0 CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 544 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 8

Met Leu ALa Leu Thr ALa Ser ALa Ser Ser ALa Ser Ser His Pro Tyr 15 10 15

Arg H.s ALa Ser ALa HLs Thr Arg Arg Pro Arg Leu Arg Ala Val Leu

ALa M;t ALa Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala ALa Pro ALa Arg Ser Val 35 40 45

184 242

ALa Val Val	Gly ALa Gly	Val Ser Gly Leu ALa ALa ALa Tyr Arg Leu
	50	55	60
Arg 65	Gln Ser	Gly Val Asn 70	Val Thr	Val Phe Glu ALa ALa Asp Arg ALa 75 80
Gly	Gly Lys	lle Arg Thr 85	Asn Ser	Glu Gly Gly Phe VslL Trp Asp Glu 90 95
Gly	ALa Asn	Thr Thr I00	Glu GLy	GLu Trp Glu ALa Ser Arg Leu Ile I05 II0
Asp Asp leu II5	GLy Leu Gln	Asp Lys I20	GLn Gln Tyr Pro Asn Ser Gln His I25
Lys	Arg Tyr I30	Ile Val Lys Asp Gly ALa Pro Ala Leu Ile Pro Ser Asp I35 I40
Pro I45	Ile Ser	leu Ht Lys I50	Ser Ser	VćlL Leu Ser Thr lys Ser Lys Ile I55 I60
ALa	leu Phe	Phe Glu Pro I65	Phe Leu	Tyr Lys lys ALa Asn Thr Arg Asn I70 I75
Ser	Gly Lys	Val Ser Glu I80	Glu His	Leu Ser Glu Ser VhL Gly Ser Phe I85 I90
Cys	Glu Arg I95	His Phe Gly Arg Glu 200	Val VłL Asp Tyr Phe Val Asp Pro 205
Phe	Val ALa 2I0	Gly Thr Ser	Ala Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser Ile Arg 2I5 220
His 225	ALa Phe	Pro ALa Leu 230	Trp Asn	Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Ser Val 235 240
Ile	Val GLy	ALa Ile Leu 245	Ser Lys	Leu ALa ALa Lys GLy Asp Pro Val 250 255
Lys	Thr Arg	His Asp Ser 260	Ser Gly Lys Arg Arg Asn Arg Arg Val Ser 265 270
Phe	Ser Phe 275	His Gly Gly	It Gln 280	Ser Leu Ile Asn ALa Leu HLs Asn 285
Glu	Val Gly Asp Asp Asn 290	Val Lys 295	Leu GLy Thr Glu VaL Leu Ser Leu 300
ALa 305	Cys Thr	Phe Asp Gly 3I0	Val Pro	ALa Leu Gly Arg Trp Ser Ile Ser 3I5 320

184 242

Val

Asp

Ser

Lys

Asp Ser 325

Gly

Asp

Lys

Asp 330

Leu

ALa

Ser

Asn

Gln 335

Thr

Ehe

Asp

ALa

Val 340

Ile

Mit

Thr

Ala

Ero 345

Leu

Ser

Asn

Val

Arg 350

Arg

Met

Lys

Ehe

Thr 355

Lys

Gly Gly

Ala

Ero 360

Val

VaL

Leu

Asp

Ehe 365

Leu

Ero

Lys

Mit

Asp Tyr 370

Leu

Ero

Leu

Ser 375

Leu

Met

UL

Thr

Ala 380

Ehe

Lys

Lys

Asp

Asp 385

Vai

Lys

Lys

Ero

Leu 390

Glu

GLy

Ehe

GLy

Val 395

Leu

Ile

Ero

Tyr L/s 400

Glu

Gln

Gln

Lys

His 405

GLy

Leu

Lys

Thr

Leu 410

Gly

Thr

Lsu

Ehe

Ser 415

Ser

Mit;

fet

Ehe

Ero 420

Asp Arg

Ala

Ero

Asp Asp 425

Gln

Tyr

Leu

Tyr 430

Thr

Thr

Ehe

Val

Gly Gly 435

Ser

His

Asn

Arg Asp 440

Leu

Ala

GLy

Ala 445

Ero

Thr

Ser

lle

Leu 450

Lys

Gln

Leu

Thr 455

Ser

Asp

Leu

Lys

Lys 460

Leu

Leu

Gly

Val

Glu 465

Gly

Gln

Ero

Thr

Ehe 470

!·11

Lys

His

Val

Tyr 475

Trp

Gly

Asn

Ala

Ehe 480

Ero

Leu

Tyr

Gly

His 485

Asp Tyr

Ser

Ser

V<aL 490

Leu

Glu

Ala

lle

Glu 495

Lys

Met

Glu

Lys

Asn 500

Leu

Ero

Gly

Ehe

Ehe 505

tyr

ALa

Gly

Asn

Ser 510

Lys

Asp

Gly

Leu

ALa 515

VćlL

Gly

Ser

Val

Ile 520

Ala

Ser

Gly

Ser

Lys 525

ALa

Ala

Asp

Leu

Ala 530

Ile

Ser

Tyr

Leu

Glu 535

Ser

His

Thr

Lys

His 540

Asn

Asn

Ser

His

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1697 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa

184 242 (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 29... 1501 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga = „yeast protox-3 cDNA;

sekwencja z pWDC-5” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 9

TTGGCATTIG CCTTGAACCA ACAATTCT ATG TCA ATT GCA ATT TGT GGA GGA 52

Met Ser Ile Ala Ile Cys Gly GLy

5

GGT ATA GCT Gly Ile ALa	GGT CTT Gly Leu	AGT ACA GCA TTT TAT CTT GCT AGA TTG ATT CCA	100
Ser Thr 15	Ala Phe	Tyr Leu	ALa 20	Arg	Leu	Ile Pro
	10
AAA	TGT ACT	ATT GAT	TTG TAC	GAA AAA	GGT CCT	CGT	TTA	GGT	GGA TGG	148
Lys	Cys Thr	Ile Asp	Leu Tyr	Glu Lys	GLy Pro	Arg	Leu	GLy GLy Trp
25			30		35				40
CTT	CAG TCG	GTC AAA	ATC CCG	TGT GCA	GAT TCT	CCA	ACA	GGA	ACG GTT	196
Leu	Gln Ser	VlL Lys	Ile Pro	Cys ALa	Asp Ser	Pro	Thr	GLy	Thr VlL
		45			50				55
TTG	TTT GAG	CAA GGT	CCT AGA	ACT CTT	CGT CCT	GCT	GGG	GTT	GCT GGC	244
Leu	Phe Glu	GLn GLy	Pro Arg	Thr Leu	Arg Pro	ALa	Gly	VćlL	ALa Gly
		60		65				70
TTA	GCA AAC	TTA GAT	TTA ATT	AGC AAG	TTG GGC	ATC	GAA	GAC	AAG TTG	292
Leu	ALa Asn	Leu Asp	Leu Ile	Ser Lys	Leu Gly	Ile	Glu	Asp	Lys Leu
	75			80			85
TTA	AGG ATT	TCG AGC	AAT TCT	CCC AGC	GCA AAA	AAC	CGA	TAT	ATT TAT	340
Leu	Arg Ile	Ser Ser	Asn Ser	Pro Ser	ALa Lys	Asn	Arg Tyr	Ile Tyr
	90		95			100
TAC	CCA GAT	CGC TTA	AAT GAA	ATT CCT	TCA AGC	ATT	TTA	GGG	AGT ATA	388
Tyr	Pro Asp Arg Leu	Asn Glu	Ile Pro	Ser Ser	Ile	Leu	Gly	Ser Ile
105			110		115				120
AAG	TCG ATT	ATG CAG	CCT GCT	TTG CGT	CCG ATG	CCT	TTG	GCT	ATG ATG	436
Lys	Ser Ale	Met Gln	Pro ALa	Leu Arg	Pro Met	Pro	Leu	ALa	Met Met

184 242

125

CTT	GAG	CCC	TTT	CGT	AAA	AGT	AAG	CGA
Leu	Glu	Pro	Phe 140	Arg Lys	Ser	Lys Arg 145
GGT	TCA	TTT	ATG	AGA AGA	AGA	TTT	GGT
Gly	Ser	Phe 155	Met	Arg Arg	Arg	Phe 160	Gly
ATG	AGT	GCA	ATG	ATA	AAT	GGT	ATT	TAT
Met	Ser 170	Ala	Met	Ile	Mn	Gly 175	Ile	Tyr
TCT	ATG	CAT	TCT	AGC	ATG	TTT	GGA	TTT
Ser 185	Met	HLs	Ser	Ser	tet 190	Phe	Gly	Phe
TAT	GGA	AAC	ATT	ACT	TTG	GGA	TTA	ATT
Tyr Gly	Mn	Ile	Thr 205	Leu	Gly	Leu	Ile
ATA	TTA	TCT	CCT	GCT	GAG	AAA	GCT	TTG
Ile	Leu	Ser	Pro 220	ALa	Glu	Lys	Ala	Leu 225
GCC	AAA	AAC	AGC	AGA	GCT	GTC	AAA	CAG
Ma	Lys	Mn 235	Ser	Arg	ALa	Val	Lys 240	Gin
GCT	TTC	AAG	GAA	GGG	ATT	GAG	ACT	ATT
ALa	Phe 250	Lys	Glu	Gly	Ile	Glu 255	Thr	Ile
TTA	AAA	AAA	ATG	CCG	AAT	GTC	AAG	ATA
Leu 265	Lys	Lys	Me:	Pro	ten 270	VlL	Lys	Ile
ACT	TTG	GTT	CCA	CAT	AAA	ACT	CAG	TCT
Thr	Leu	Val	Pro	His 285	Lys	Thr	Gin	Ser
GCT	TAC	GAG	TAT	GTT	GTG	TTT	GCA	AAC
Ala	Tyr	Glu	Tyr 300	VlL	Val	Phe	ALa	Mn 305
CTA	ATA	TCT	TGT	CCT	AAA	ATG	GAA	ACT
Leu	Ile	Ser 315	Cys	Pro	Lys	Me:	Glu 320	Thr
GTC	AAC	GTT	TAT	TAT	AAG	GAC	CCT	AAT
Val	Asn	Val	Tyr	Tyr	Lys	Asp	Pro	Mn

130

135

GAT TCG ACA GAT GAA AGC GTG 484

Asp Ser Thr Asp Glu Ser Val

150

AAA AAC GTT ACG GAT AGA GTT 532

Lys Asn Val Thr Asp Arg Val

165

GCT GGT GAT TTG AAT GAT TTG 580

ALa Gly Asp Leu Asn Asp Leu

180

TTA GCG AAG ATT GAA AAA AAG 628

Leu ALa Lys Ile Glu Lys Lys

195 200

AGA GCT CTT CTT GCA CGT GAA 676

Mg Ala Leu Leu ALa Arg Glu 210 215

GAA AGC AGC ACT ACT CGC AGA 724

Glu Ser Ser Thr Thr Arg Arg

230

TAT GAA ATC GAC AAG TAT GTT 772

Tyr Glu Ile Asp Lys Tyr VjelL

245

ACA TTG TCA ATA GCA GAT GAA 820

Thr Leu Ser Ile ALa Asp GLu

260

CAT CTA AAC AAA CCG GCC CAA 868

H.s Leu Mn Lys Pro ALa Gin

275 280

CTT GTA GAC GTC AAT GGT CAA 916

Leu Val Asp Val Asn Gly Gin 290 295

TCT TCT CGC AAT TTA GAG AAT 964

Ser Ser Arg Mn Leu Glu Mn

310

CCG ACG TCG AGT GTT TAT GTC 1012

Pro Thr Ser Ser Val Tyr VM

325

GTT CTT CCA ATC CGT GGT TTT 1060

Val Leu Pro Ile Arg Gly Phe

184 242

330

335

340

GGG

CTT

TTG

ATT

CCA

TCA

TGC

ACT

CCA

AAT

AAT

CCG

AAT

CAT

GTT

CTT

1108

Gly 345

Leu

Leu

Ile

Pro

Ser 350

Cys

Thr

Pro

Asn

Asn 355

Pro

Asn

His

VLL

Leu 360

GGT

ATC

GTT

TTT

GAT

AGT

GAG

CAA

AAC

AAC

CCT

GAA

AAT

GGA

AGC

AAG

1156

Gly

Ile

Val

Phe

Asp 365

Ser

Glu

Gln

Asn

Asn 370

Pro

Glu

Asn

Gly

Ser 375

Lys

GTC

ACT

GTC

ATG

ATG

GGA

GGG

TCT

GCT

TAT

ACA

AAA

AAT

ACT

TCT

TTG

1204

VLL

Thr

Val

Mit 380

Mt

Gly

Gly

Ser

ALa 385

Tyr

Thr

Lys

Asn

Thr 390

Ser

Leu

ATT

CCA

ACC

AAC

CCC

GAA

GAA

GCC

GTT

AAC

AAT

GCT

CTC

AAA

GCT

TTG

1252

Ile

Pro

Thr 395

Asn

Pro

GLu

Glu

ALa 400

Val

Asn

Asn

ALa

Leu 405

Lys

ALa

Leu

CAG

CAT

ACT

TTA

AAA

ATA

TCC

AGT

AAG

CCA

ACA

CTC ACG

AAT

GCA ACA

1300

Gln

His 410

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser 415

Ser

Lys

Pro

Thr

Leu 420

Thr

Asn

ALa

Thr

TTA

CAA

CCA

AAT

TGC

ATC

CCT

CAA

TAT

CGT

GTT

GGG

CAT

CAA

GAT

AAT

1348

Leu 425

Gln

Pro

Asn

Cys

Ile 430

Pro

Gln

Tyr Arg

Val 435

Gly

His

GLn

Asp

Asn 440

CTT

AAT

TCT

TTG

AAA

TCT

TGG

ATT

GAG

AAA

AAT

ATG

GGA

GGG

CGA

ATT

1396

Leu

Asn

Ser

Leu

Lys 445

Ser

Trp

Ile

Glu

Lys 450

Asn

Mt

Gly

Gly Arg 455

Ile

CTT

CIA

ACT

GGA

AGT

TGG

TAT

AAT

GGT

GTT

AGT

ATT

GGG

GAT

TGT

ATT

1444

Leu

Liu

Thr

Gly 460

Ser

Trp

Tyr

Asn

Gly 465

Val

Ser

Ile

Gy Asp Cys 470

Ile

ATG

AAT

GGA

CAT

TCA

ACA

GCT

CGA

AAA

CTA

GCA

TCA

TTG

ATG AAT

TCT

1492

Met

Asn

Gly 475

His

Ser

Thr

ALa

Arg 480

Lys

Leu

ALa

Ser

Leu 485

Mt

Asn

Ser

TCT TCT TGAGCGTTTA TAAATGTTGA TATAAAATTA GTATATAGTT CCTTTGATTA 1548

Ser Ser

90

TTTTATGAGT TGAAAATGCC ACTTGTGAAA TAATTTTGCA CAAGCCCTTT TATTACAGAC 1608

GTATATGCGA GGACATTCGA CAAACGTTTG AAATTAAAAA TCATATGCCT TTTAGCTTAA 1668

GACATCAAGG TCATGAATAA TAAAATTTT 1697 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 10: (0 CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

184 242 (A) DŁUGOŚĆ: 490 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 10

Met Ser Ile ALa He	Cys Gly Gly Gly	Ile ALa Gly Leu Ser Thr ALa
1	5	10	15
Phe Tyr	Leu Ala Arg 20	Leu Ile Pro Lys Cys 25	Thr Ile Asp Leu Tyr Glu 30
Lys Gly	Pro Arg Leu 35	Gly Gy Trp Leu 40	Gln	Ser VćlL Lys Ile Pro Cys 45
ALa Asp 50	Ser Pro Thr	Gly Thr Val Leu 55	Phe	Glu Gln Gly Pro Arg Thr 60
Leu Arg 65	Pro ALa Gly	Val ALa Gly Leu 70	ALa	Asn Leu Asp Leu Ile Ser 75 80
Lys Leu	Gly He Glu 85	Asp Lys Leu Leu	Arg 90	Ile Ser Ser Asn Ser Pro 95
Ser ALa	Lys Asn Arg Tyr He Tyr Tyr 100 105	Pro	Asp Arg Leu Asn Glu Ile 110
Pro Ser	Ser Ile Leu 115	Gly Ser Ile Lys 120	Ser	Ile Met Gln Pro Ala Leu 125
Arg Pro 130	Met Pro Leu	ALa Mit Met Leu 135	Glu	Pro Phe Arg Lys Ser Lys 140
Arg Asp 145	Ser Thr Asp	Glu Ser Val Gly 150	Ser	Phe Mit Arg Arg Arg Phe 155 160
Gly Lys	Asn VAL Thr 165	Asp Arg Val Met	Ser 170	Ala Met Ile Asn Gly Ile 175
Tyr ALa	Gly Asp Leu 180	Asn Asp Leu Ser 185	Met	His Ser Ser Mit Phe Gly 190
Phe Leu	Ala Lys He 195	Glu Lys Lys Tyr Gly 200	Asn Ile Thr Leu Gly Leu 205
Ile Arg 210	ALa Leu Leu	ALa Arg Glu Ile 215	Leu	Ser Pro ALa Glu Lys ALa 220
Leu Glu 225	Ser Ser Thr	Thr Arg Arg ALa 230	Lys	Asn Ser Arg ALa VlL Lys 235 240

184 242

Gln Tyr Glu Ile Asp Lys Tyr Val	Ala Phe Lys Glu Gly Ile Glu Thr
	245	250	255
Ile Thr Leu	Ser Ile Ala Asp Glu 260	Leu Lys Lys Met 265	Pro Asn Val Lys 270
Ile His Leu 275	Asn Lys Pro Ala Gln 280	Thr Leu Val Pro	His Lys Thr Gln 285
Ser Leu Val 290	Asp Val Asn Gly Gln 295	Ala Tyr Glu Tyr 300	Val Val Phe Ala
Asn Ser Ser 305	Arg Asn Leu Glu Asn 310	Leu Ile Ser Cys 315	Pro Lys Met Glu 320
Thr Pro Thr	Ser Ser Val Tyr Val 325	Val Asn Val Tyr Tyr Lys Asp Pro 330 335
Asn Val Leu	Pro Ile Arg Gly Phe 340	Gly Leu Leu Ile 345	Pro Ser Cys Thr 350
Pro Asn Asn 355	Pro Asn His Val Leu 360	Gly Ile Val Phe	Asp Ser Glu Gln 365
Asn Asn Pro 370	Glu Asn Gly Ser Lys 375	Val Thr Val Met 380	Met Gly Gly Ser
Ala Tyr Thr 385	Lys Asn Thr Ser Leu 390	Ile Pro Thr Asn 395	Pro Glu Glu Ala 400
Val Asn Asn	Ala Leu Lys Ala Leu 405	Gln His Thr Leu 410	Lys Ile Ser Ser 415
Lys Pro Thr	Leu Thr Asn Ala Thr 420	Leu Gln Pro Asn 425	Cys Ile Pro Gln 430
Tyr Arg Val 435	Gly His Gln Asp Asn 440	Leu Asn Ser Leu	Lys Ser Trp Ile 445
Glu Lys Asn 450	Met Gly Gly Arg Ile 455	Leu Leu Thr Gly 460	Ser Trp Tyr Asn
Gly Val Ser	Ile Gly Asp Cys Ile	Met Asn Gly His	Ser Thr Ala Arg

465 470 475 480

Lys Leu Ala Ser Leu Met Asn Ser Ser Ser 485 490

184 242 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 11:

(0 CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 41 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: oligonukleotyd użyty do konstrukcji pCGN1761ENX (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNĄ: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 11 AATTATGACG TAACGTAGGA ATTAGCGGCC CGCTCTCGAG T (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: oligonukleotyd użyty do konstrukcji pCGN1761ENX (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNĄ: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 12 AATTACTCGA GAGCGGCCGC GAATTCCTAC GTTACGTCAT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 13:

(0 CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: starter SON0003 użyty do konstrukcji pSOGIO (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNĄ: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 13 CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG

184 242 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 14:

(0 CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: starter SON0004 użyty do konstrukcji pSOGIO (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 14 ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: starter SON0013 użyty do konstrukcji pSOG19 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 15 CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: starter SONOOIO użyty do konstrukcji pSOG19 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 16 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA

184 242 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 17:

(0 CHARAKTERYSTYK! SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: starter SON0016 użyty do konstrukcji pSOG19 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 17 GCTACCATGGCCACATAGAACACC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: starter SON0017 użyty do konsfrukcji pSOG19 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 18 CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: starter SON0039 użyty do konstrukq'i pSOG30 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 19 CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA

184 242 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: starter SON0041 użyty do konstrukcji pSOG30 (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 20 ATCGCAGACCGGCAAGATTC

184 242

	_ ,R
cf,-Z	° NQz
	Wzór I	C00CH3
NOCH2COOCH3 CCH2OCH3	ci— Cl	NOj
Wzór 4a	Wzór 4b

/=C	0
Q	CXz
B3-	II 0
Wzór 5	Wzór 6

Ο

Ν—

Wzór Ί

Wzór 8

184 242

I ’Ν— hf₂c ^NV ο

Wzór 9

Wzór 9a

_yCI o . /=< K_NCHF, ^αΛ ..4 'N ch,so₂nh

CHj

Wzór 10

CK, a

COOCH(Cł%)2 α

Wzór 11

184 242

Wzór !2

Wzór 03

Wzór 04

Wzór !5

Wzór !6

184 242

Wzór Γ9

^{Wzór 20} Wzór 2!

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (58)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Izolowana cząsteczka DNA kodująca białko z organizmu eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencją nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3.
2. 2. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że eukariotą jest gatunek Arabidopsis.
3. 3. Cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje białko obejmujące sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEK NR ID 2 i 4.
4. 4. Cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3.
5. 5. Cząsteczka DNA kodująca zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu, wybranego z grupy zawierającej alaninę, pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w sEk NR ID 2.
6. 6. Cząsteczka DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę.
7. 7. Cząsteczka DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę.
8. 8. Cząsteczka DNA według zastrz. 5, znamienna tym, że tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoieucynę, leucynę i treoninę.
9. 9. Chimerowy gen zawierający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do

   i) cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota, mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2.

   184 242
10. 10. Chimerowy gen według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3.
11. 11. Chimerowy gen według zastrz. 10, znamienny tym, że eukariotąjest gatunek Arabidopsis.
12. 12. Chimerowy gen według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2.
13. 13. Chimerowy gen według zastrz. 12, znamienny tym, że alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę.
14. 14. Chimerowy gen według zastrz. 12, znamienny tym, że glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę.
15. 15. Chimerowy gen według zastrz. 12, znamienny tym, że tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę.
16. 16. Chimerowy gen według zastrz. 9, znamienny tym, że jego promotor jest aktywny w roślinie.
17. 17. Chimerowy gen według zastrz. 9, znamienny tym, że dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do chloroplastu.
18. 18. Chimerowy gen według zastrz. 9, znamienny tym, że dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do mitochondrium.
19. 19. Chimerowy gen według zastrz. 9, znamienny tym, że jest częścią genomu roślinnego.
20. 20. Zrekombinowany wektor, znamienny tym, że zawiera chimerowy gen z promotorem zdolnym do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączonym w sposób funkcjonalny do

    i) cząsteczki heterologicznego DNA kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2.
21. 21. Zrekombinowany wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że promotor jest dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3.

    184 242
22. 22. Zrekombinowany wektor według zastrz. 21, znamienny tym, że eukariotąjest gatunek Arabidopsis.
23. 23. Zrekombinowany wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że promotor jest dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2.
24. 24. Zrekombinowany wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę.
25. 25. Zrekombinowany wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę.
26. 26. Zrekombinowany wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę.
27. 27. Zrekombinowany wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że jest zdolny do stabilnej transformacji w komórce roślinnej.
28. 28. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera chimerowy gen mający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do

    i) cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub ii) cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że komórka gospodarza jest zdolna do ekspresji kodującej cząsteczki DNA.
29. 29. Komórka gospodarza według zastrz. 28, znamienna tym, że promotor jest dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3.
30. 30. Komórka gospodarza według zastrz. 29, znamienna tym, że eukariotąjest gatunek Arabidopsis.
31. 31. Komórka gospodarza według zastrz. 28, znamienna tym, że promotor jest dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2.
32. 32. Komórka gospodarza według zastrz. 31, znamienna tym, że alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę.

    184 242
33. 33. Komórka gospodarza według zastrz. 31, znamienna tym, że glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę.
34. 34. Komórka gospodarza według zastrz. 31, znamienna tym, że tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę.
35. 35. Komórka gospodarza według zastrz. 28, znamienna tym, że jest wybrana z grupy obejmującej komórki roślinne, komórki bakteryjne, komórki drożdży i komórki owada.
36. 36. Komórka roślinna włączając w to jej potomstwo, znamienna tym, że zawiera chimerowy gen mający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do

    i) cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1i 3 lub ii) cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że kodująca cząsteczka DNA podlega ekspresji w roślinie i nadaje, odpowiednio roślinie i komórce roślinnej, tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje naturalnie występującą aktywność protoks.
37. 37. Komórka roślinna według zastrz. 36, znamienna tym, że promotor jest dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3.
38. 38. Komórka roślinna według zastrz. 37, znamienna tym, że eukariotą jest gatunek Arabidopsis.
39. 39. Komórka roślinna według zastrz. 36, znamienna tym, że promotor jest dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasową jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2.
40. 40. Komórka roślinna według zastrz. 39, znamienna tym, że alanina w pozycji 220 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę.
41. 41. Komórka roślinna według zastrz. 39, znamienna tym, że glicyna w pozycji 221 jest zastąpiona przez serynę.
42. 42. Komórka roślinna według zastrz. 39, znamienna tym, że tyrozyna w pozycji 426 jest zastąpiona przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę.
43. 43. Sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji, znamienny tym, że stosuje się skuteczną ilość herbicydu hamującego protoks wobec populacji rośliny zawierającej chimerowy gen mający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej, dołączony w sposób funkcjonalny do

    i) cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3 lub

    184 242 ii) cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że stosuje się cząsteczkę dNa podlegającą ekspresji w roślinie i nadającą, odpowiednio roślinie, tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje naturalnie występującą aktywność protoks, przy czym jako herbicyd hamujący protoks stosuje się herbicyd wybrany z grupy składającej się z arylouracylu, difenyloeteru, oksydiazolu, cyklicznego imidu, fenylopirazolu, pochodnych pirydynowych, podstawionego w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazolu, fenopilanu oraz O-fenylopirolidyno- i piperydynokarbanylowych analogów tego fenopilanu, N-podstawionych pirazoli, N-fenylopirazoli oraz związków o wzorach 18 i 19 i herbicyd ten, hamujący protoks, stosuje się w dawkach od 0,0001 do 10 kg/ha.
44. 44. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że stosuje się promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki heterologicznego DNA, kodującej białko z wyższego eukariota o aktywności oksydazy protoporfirynogenu (protoks), która to cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową selektywnie hybrydyzującą z sekwencją nukleotydową wybraną z grupy obejmującej SEK NR ID 1 i 3.
45. 45. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że jako organizm eukariota stosuje się gatunek Arabidopsis.
46. 46. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że stosuje się promotor dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera eukariotyczny protoks z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w sEk NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu, wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozyny w pozycji 426 w SEK NR ID 2.
47. 47. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że alaninę w pozycji 220 zastępuje się przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej walinę, treoninę, leucynę, cysteinę i tyrozynę.
48. 48. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że glicynę w pozycji 221 zastępuje się przez serynę.
49. 49. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że tyrozynę w pozycji 426 zastępuje się przez aminokwas wybrany z grupy zawierającej cysteinę, izoleucynę, leucynę i treoninę.
50. 50. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że stosuje się roślinę wybraną z grupy składającej się z soi, bawełny, tytoniu, buraka cukrowego, rzepaku, kukurydzy, pszenicy, sorgo, żyta, owsa, trawy darniowej i ryżu.
51. 51. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że jako herbicyd hamujący protoks stosuje się imid o wzorze 5, w którym Q oznacza wzór 6 lub 7, lub 8, lub 9, lub 9a, lub 9b i gdzie R, oznacza H, Cl lub F, R₂ oznacza Cl i R₃jest eterem, tioeterem, estrem, grupą aminową lub alkilową, przy czym R₂iR₃ razem mogą tworzyć 5- lub 6-składnikowy pierścień heterocykliczny.
52. 52. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że stosuje się imid wybrany z grupy składającej się ze związków o wzorze 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 i 17, w których R oznacza grupę (C2_₆-alkenyloksy)karbonylo-Ci.4-alkilową.
53. 53. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że jako herbicyd hamujący protoks stosuje się związek o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory 18,19, 20 i 2l.
54. 54. Sposób testowania związku chemicznego na zdolność hamowania enzymu protoks z rośliny, znamienny tym, że (a) do pierwszej mieszaniny reakcyjnej dodaje się enzym protoks, zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z SEK nR ID 2 i 4 i protoporfirynogen IX w warunkach, w których enzym protoks ma zdolność do katalizowania przekształcenia protoporfirynogenu IX w protoporfirynę IX,

    184 242 (b) do drugiej mieszaniny reakcyjnej dodaje się testowany związek chemiczny, enzym protoks i protoporfirynogen IX w takich samych warUnkach jak w przypadku pierwszej mieszaniny reakcyjnej, (c) wzbudza się pierwszą i drugą mieszaninę przy 395 do 410 nM;

    (d) porównuje się fluorescencję pierwszej i drugiej mieszaniny reakcyjnej przy zakresie 622 do 635 nM i jeżeli fluorescencja drugiej mieszaniny reakcyjnej jest znacząco mniejsza od fluorescencji pierwszej mieszaniny reakcyjnej określa się, że związek chemiczny jest zdolny do hamowania aktywności enzymu protoks.
55. 55. Sposób selekcji roślin, tkanek roślinnych lub komórek roślinnych stransformowanych transgenem będącym przedmiotem zainteresowania spośród roślin nie stransformowanych, znamienny tym, że (a) transformuje się rośliny, tkanki roślinne lub komórki roślinne transgenem będącym przedmiotem zainteresowania, zdolnym do podlegania ekspresji w roślinach i genem chimerowym, zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub komórce roślinnej i dołączony w sposób unkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, (b) przenosi się tak stransformowane rośliny lub komórki roślinne do pożywki zawierającej inhibitor protoks, gdzie herbicyd hamujący protoks jest wybrany z grupy składającej się z arylouracylu, difenyloeteru, oksydiazolu, cyklicznego imidu, fenylopirazolu, pochodnych pirydynowych, podstawionego w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazolu, fenopilanu oraz O-fenylopirolidyno- i piperydynokarbanylowych analogów tego fenopilanu, N-podstawionych pirazoli, N-fenylopirazoli, związków o wzorach 18 i 19, przy czym stężenie herbicydu hamującego protoks w pożywce wynosi 0,001 do 3000 części na milion, oraz (c) selekcjonuje się rośliny lub komórki roślinne, które przeżywają w pożywce.
56. 56. Sposób wytwarzania komórki gospodarza zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA, kodującą białko z eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), znamienny tym, że transformuje się komórkę gospodarza genem chimerowym zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie, dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny zawierający sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że otrzymany wektor jest zdolny do stabilnej transformacji komórki gospodarza.
57. 57. Sposób wytwarzania komórki roślinnej, zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), znamienny tym, że transformuje się komórkę roślinną genem chimerowym zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie, dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny obejmujący sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR ID 2, z tym, że otrzymany wektor jest zdolny do stabilnej transformacji komórki gospodarza.

    184 242
58. 58. Sposób wytwarzania potomstwa z rośliny rodzicielskiej, zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), znamienny tym, że transformuje się roślinę rodzicielską genem chimerowym zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie, dołączony w sposób funkcjonalny do cząsteczki DNA, kodującej zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protoks), która to oksydaza zawiera protoks eukariotyczny z co najmniej jedną modyfikacją aminokwasową i w której ten zmodyfikowany protoks wykazuje tolerancję na herbicyd w ilości, która hamuje protoks eukariotyczny obejmujący sekwencję aminokwasową określoną w SEK NR ID 2, przy czym ta co najmniej jedna modyfikacja aminokwasowa jest podstawieniem aminokwasu wybranego z grupy zawierającej alaninę w pozycji 220, glicynę w pozycji 221 oraz tyrozynę w pozycji 426 w SEK NR iD 2, z tym, że wprowadzany wektor jest zdolny do stabilnej transformacji komórki gospodarza i przeniesienia cechy tolerowania herbicydu na potomstwo takiej rodzicielskiej rośliny w znanych technikach hodowli roślin.