CZ367496A3

CZ367496A3 - Izolovaná molekula DNK kódující protoporphyrinogenovou oxidázu v eukaryontech, způsob její manipulace a její farmaceutické použití, vektor a hostitel

Info

Publication number: CZ367496A3
Application number: CZ963674A
Authority: CZ
Inventors: Eric Russel Ward; Sandra Volrath
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1994-06-16
Filing date: 1995-06-08
Publication date: 1998-03-18
Also published as: SK161096A3; JP3673925B2; SK284895B6; CN1309184A; CN1193096C; CN1150820A; DE69534247D1; RO122046B1; US6282837B1; RO121886B1; PL317759A1; AU706763B2; US6288306B1; CN100432229C; ATE296888T1; CN1263856C; JPH10502524A; AU5010199A; MX237061B; AU750445B2

Description

Vynález popisuje manipulaci -s

která je odpovědná za konverzi protoporfyrinogenu IX na protoporfyrin IX v biosyntetické cestě společné pro všechny eukaryontni organizmy. Vynález může být použit pro vývoj rezistence na herbicidy u rostlin, rostlinných tkáni a semen. Na základě tohoto vynálezu, může být dále vyvinuta metoda pro diagnostiku a léčbu deficience této enzymatické aktivity u zvířat a lidí.

Dosavadní stav techniky

Biosyntetické cesty, které vedou k produkci chlorofylu a hernu mají řadu společných kroků. Chlorofyl je pigment, který dokáže využívat světlo a je přítomný ve všech zelených fotosyntetických organizmech. Hem je kofaktor hemoglobinu, cytochromů, P450 více funkčních oxygenáz, peroxidáz a kataláz (např. Lehninger, Biochemistry. Worth Publishers, New Yourk (1975)) a je proto nezbytným komponentem pro všechny aerobní organizmy.

Poslední společný krok při biosyntéze chlorofylu a hernu je oxidace protoporfyrinogenu IX na protoporfyrin IX. Protoporfvrinogenová oxidáza (dále jen protox) je enzym, který katalyzuje tento poslední oxidační krok. (Matringe et al., Biochem. J. 260:231 (1989)).

Enzym protox byl purifikovaný buď částečně nebo zcela z řady organizmů, k nimž patří kvasinka Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois and Labbe, in Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E.K.Dailey, ed. McGraw Hill: New Yourk, pp.235285 (1990)), z etioplastů ječmene (Jakobs and Jakobs, Biochem. J. 244:219 (1987)), a z myššich jater (Dailey and Karr, Biochem. 26:2697 (1987)). Geny, které kódují protox, byly izolovány ze dvou prokaryotických organizmů Escherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbioi. 39: 1155 (1993)) a Bacillus substilis (Dailey et al., J. Biol. Chem.269: 813 (1994)). Tyto geny nemají podobné sekvence; ani nezpůsobují, že z nich odvozené proteiny mají společné sekvence aminokyselin. Molekulová váha protein z E. coli je přibližně 21 kDa a nachází se v buněčné membráně. Molekulová váha protein z B. subtilis je 51 kDa, je rozpustný a má cytoplazmatickou aktivitu.

V současné době, není dostupných mnoho informací o enzymu protox, které by umožňovaly použít známé metody pro izolaci protox genů z vyšších eukaryontních organizmů (t.j. zvířata, rostliny a všechny další vícebuněčné jaderné organizmy, které se odlišují od nižších eukaryontních organizmů jako jsou kvasinky, jednobuněčné řasy, protozoa atd) .

Řada standardních metod pro izolaci nových proteinů a genů je založena na doměnce, že jestliže nové proteiny a geny mají primární strukturu (t.j. aminokyselinu a DNK sekvence) významně podobnou se stukturou známých proteinů a genů, pak jejich funkce jsou stejné. Takové standardní metody jsou hybridizace nukleových kyselin a amplifikace polymerázovou řetězovou reakcí za použití oligonukleotidových primerů, které odpovídají motivům konzervativní sekvence aminokyselin. Tyto metody se nezdály býti použitelné pro izolaci eukaryontních protox genů vzhledem současně dostupné strukturální informaci, protože neexistuje podstatná strukturální podobnost dokonce ani mezi známými prokaryotickými protox geny a proteiny.

Další způsob užívaný pro izolaci biosyntetických genů z vyšších eukaryontů u jiných metabolických cest je komplementace mikrobiálních mutantů, které mají nedostatečnou aktivitu, o níž je zájem. Za tímto účelem, knihovna cDNK z vyšších eukaryontů je klonována do vektoru, který může přímo vyjádřit cDNK v mikrobiálním hostiteli. Vektor je pak transformován nebo jinak vnesen do mutantního mikrobu a aje možno selektovat kolonie, které už nemají fenotyp mutanta

Tato strategie funguje pro izolaci genů z vyšších eukaryontů, které se vyskytují v několika metabolických cestách jako jsou biosyntéza histidinu (např. U.S. patent č. 5290926 a WO 94/026909, Ward et al., zde jako reference), biosyntéza lyzinu (např. Frish et al., Mol. Gen. Genet. 228: 287 (1991)), biosyntéza purinu (např. Aimi et al., J. Biol. Chem. 265:9011 (1990)) a biosyntéza tryptofanu (např. Niyogi et al., Plant Cell 5:1011 (1993)). Přestože mikrobiálný mutanty, který mají nedostatečnou protox aktivitu, jsou dostupné (např. E. coli (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al. , J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) a Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106.724 (1982)), použití tohoto postupu pro izolaci cDNK kódující eukaryontní protox enzymatickou aktivitu je založeno na dostupné informaci.

Je pro to několik důvodů. První důvod, eukaryontní protox sekvence cDNK nemusí být vyjádřeny v mutantním mikrobu v dostatečné míře, například proto, že je použit kodon, který neodpovídá preferencím mikrobiálního hostitele. Druhý důvod, primární translační produkt odvozený z eukaryontních kódujících sekvencí nemusí produkovat funkční polypeptid, protože například k vytvoření polypeptidu s příslušnou aktivitou je třeba posttranslační modifikace, jako je glykozylace, a ta v mikrobech neprobíhá. Třetí důvod, eukaryontný protein nemá v mikrobiálním hostiteli předpokládanou aktivní konformaci, například protein je směrován do organelového membránového systému, který mikrobiální hostitel nemá. Tato poslední možnost je zvláště pravděpodobná u protox enzymu rostlin, který se vyskytuje v organelách rostlinných buněk, jenž nejsou přítomny v mikrobiálním hostiteli. Zejména u rostlinných protox enzymů, které jsou spojovány s obalem chloroplastu a thylakoidovými membránami (Matringe et al., J. Biol. Chem. 267: 4646 (1992)), u nichž se předpokládá, že membránových systémů dosahují na základě posttranslačního mechanizmu, který zahrnuje tranzitní sekvence N-konce a intrinsické vlastnosti zralého peptidu (např. Kohorn and Tobin, Plant Cell 1:159 (1989), Li et al., Plant Cell 3:709 (1991), Li et al., J. Biol. Chem. 267:18999 (1992)).

Protox enzym hraje roli u jistých lidských onemocnění. Pacienti trpící nemocí, s vrozenou autozomálně dominantní dědičností, porphyria variegata, která je charakterizována neuropsychyatrickými symptomy a kožními lézemi, mají sníženou protox aktivitu (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302:765 (1980)). Vzhledem k tomu, že neexistuje dostatek informací o lidském protox enzymu a jeho genu, diagnostika a léčba této nemoci je velmi limitována.

Univerzální praxí se stalo použití herbicidů k ničení nežádoucí vegetace jako je plevel. Vynaložené náklady přesahují ročně částku jedné miliardy dolarů. Přesto plevel stále zůstává podstatným finančním problémem farmářů.

Účinné používání herbicidů vyžaduje dobré řízení. Například doba a metoda aplikace herbicidů a vývojová fáze plevelu jsou podstatná kritéria pro úspěšnou kontrolu plevelnosti plodin. Vzhledem k tomu, že různé druhy plevelných rostlin jsou rezistentní k herbicidům, produkce účinných herbicidů je stále důležitější.

Bohužel, herbicidy, které vykazují vyšší potenci, působí na širší spektrum plevelných rostlin a jsou v půdě rychleji degradovány, mohou také mít vyšší toxicitu k žádaným plodinám. Jedno řešení tohoto problému je vyvinout rostlinu, která je rezistentní nebo tolerantní k herbicidům. Hybridy plodin nebo různé varianty rezistentní k herbicidům umožňují jejich použití bez nebezpečí poškození plodiny. Vývoj rezistence může umožnit aplikaci herbicidu na plodinu, kde dříve jeho použití bylo nemožné nebo limitované díky její senzitivitě k herbicidu. Například U.S. Patent č. 4,761,373 Anderson et al., se týká rezistence rostlin k různým imidazolinonovým nebo sulfonamidovým herbicidům. Enzym pozměněné syntetázy acetohydroxykyseliny (AHAS) způsobuje tuto rezistence. U.S. patent č. 4,975,374 Goodman et al., se týká rostlinných buněk a rostlin obsahující gen kódující mutantní glutaminovou syntetázu (GS) . Tyto rostliny jsou rezistentní k herbicidům, které inhibují GS, například fosfinothricin a methionin sulfoximin. U.S. patent 5,013,659 Bedbrook et al. , se týká rostlin, které exprimují mutantní acetolaktátovou syntetázu, která propůjčuje rostlinám herbicidům, jejichž aktivní látka je

U.S. patent č. 5,162,602 Somers et al., rezistenci k sulfonylmočovina dokládá toleranci rostlin k herbicidům, jejichž účinek je postaven na působení látek cyclonexanedion a aryloxyfenoxypropanocá kyselina. Tolerance je způsobena funkcí pozměněné acetyl koenzym A karboxylázou (ACCáza).

Protox enzym se jeví jako cílová sloučenina pro řadu herbicidních sloučenin. Herbicidy, které inhibují protox enzym zahrnují molekuly různých strukturálních tříd (Duke et al., Weed Sci 39:465 (1991), Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 (1992), Matringe et al., FEBS Lett. 245:35 (1989), Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35:70 (1989)). Tyto sloučeniny s herbicidnim účinkem zahrnuji difenylethery inapř. acifluorfen, 5-[2-chloro-4(trifluoromethyl)fenoxy]-2-nitrobenzoová kyselina; její methylester; nebo oxyfluorfen, 2-chloro-l-(3-ethoxy-4nitrofenoxy)-4-(trifluorobenzen) í^-, oxidiazoly, (např. oxidiazon, 3-[2 , 4-di chlor o-5- (1-met hýle thoxy) fenyl]-5-) 1,1dimethylethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-(3H)-on), cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyfenyl)3,4,5,6-tetrahydrofthalimid; chlorofthalim, N-(4chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid), fenyl pyrazoly (např. TNPP-ethyl, ethyl 2 —[1—(2,3,4-trichlorfenyl)-4nitropyrazolyl-5-oxy]propionat; M&B 39279), deriváty piridinu (např. LS 82-556) a fenopylatu a jeho O-fenylpyrrolidino- a piperidinokarbamatové analogy. Řada těchto sloučenin inhibují enzymy katalyzované reakce nebo fungují jako substrátové analogy.

Inhibiční účinek protox inhibujících herbicidů je vysvětlován akumulací protoporfyrinogenu IX v chloroplastu, což vede průniku protoporfyrinogenu IX do cytozolu, kde je oxidován peroxidázovou aktivitou na protoporfyrin IX. Po světelné expozici protoporfyrin IX může způsobit v cytozolu vytvoření formace singletového kyslíku. Tento singletový kyslík může vytvářet další reaktivní kyslíkové formace, které mohou způsobovat peroxidaci lipidů a rozrušení membrán, což vede k rychlému usmrcení buněk (Lee et al., Plant Physiol.

102:881 (1993)) .

Ne všechny protox enzymy jsou citlivé ne herbicidy, které inhibují jejich rostlinné druhy. Protox enzymy, které jsou kódovány geny izolovanými z Escherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39:1155 (1993)) a z Bacillus subtilis (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269:813 (1994)), jsou rezistentní k těmto herbicidům. Navíc, byly popsány mutanty jednobuněčné řasy Chlemydomonas reinhardtii, které jsou rezistentní fenylimidovému herbicidu S-23142 (Kataoka et al., J. Pesticide Sci. 15:449 (1990); Shibata et al., v Research in Photosynthesis, vol.III, N. Murata, ed. Kluver: Netherlands, pp. 567-570 (1992)). Nejméně jeden z těchto mutantů má pozměněnou protox aktivitu, což vede k rezistenci ne pouze na herbicidní inhibitor, jehož pomocí byl mutant selektován, ale také na další třídy protox inhibitorů (Oshio et al., Z. Naturf orsch. 48c:339 (1993); Sáto et al., v ACS

Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C. (1994)). Dále byl popsán mutant buňky tabáku, který je rezistentní k inhibitoru S-21432 (Che et al., Z. Naturforsch. 48c:350 (1993).

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje izolovanou molekulu DNK kódující enzym protoporfyrinogenové oxidázy (protox) z eukaryontního organizmu. V tomto případě je preferován vyšší eukaryontní organizmus. Zvláště pak se tento vynález týká izolované molekuly DNK, která kóduje rostlinný a lidský enzym protoporfyrinogenové oxidázy (protox).

V rozsahu tohoto vynálezu je preferována izolované molekuly DNK, kódující enzym protoporfyrinogenové oxidázy (protox) dvouděložných rostlin, zvláště pak Arabídopsis. Tyto molekuly DNK jsou popsány v SEQ ID č.: 1, 3, a 9.

Dále jsou preferovány molekuly DNK kódující enzym protoporfyrinogenové oxidázy (protox) jednoděložných rostlin, zvláště pak kukuřice. Tyto molekuly DNK jsou popsány v SEQ ID č. : 5 a 7. Zvláště preferovaná je molekula DNK kódující protein enzymu protoporfyrinogenové oxidázy (protox) dvouděložné rostliny. Aminokyselinové sekvence zmíněného proteinu jsou selektovány ze skupiny sestávající z SEQ ID č. 2, 4, a 10. Dále preferovaná je izolovaná molekula DNK kódující protein enzymu protoporfyrinogenové oxidázy (protox) jednoděložné rostliny. Aminokyselinové sekvence zmíněného proteinu jsou selektovány ze skupiny sestávající z SEQ ID č. 6 a 8.

Vzhledem k informacím, které tento vynález poskytuje, DNK kódující sekvence enzymu protoporfyrinogenové oxidázy (protox) z eukaryontního organizmu, mohou být získány použitím standardní metody. Dále vynález poskytuje sondy, které jsou schopny specificky hybridizovat s eukaryontními sekvencemi DNK kódujícími protoporfyrinogenovou oxidázovou aktivitu nebo respektive s mRNK. Dále poskytuje metody pro detekci zmíněných DNK sekvencí v eukaryontním organizmu, které používají sondy vytvořené v rámci tohoto vynálezu.

Vynález dále popisuje expresivní kazety a rekombinantní vektory obsahující zmíněné expresivní kazety. Tyto expresivní kazety se sestávají z promotoru, preferovaný je promotor aktivní v rostlině, který je operabilně vázán k molekula DNK kódující enzym protoporfyrinogenové oxidázy (protox), izolavané z eukaryontního organizmu. Expresivní kazeta může dále obsahovat signální sekvenci, která je operabilně vázána k řečenné molekule DNK. Tato signální sekvence je schopná směrovat protein, kódovaný DNK molekulou, do chloroplastu nebo mitochondria.

Tento vynález dále poskytuje rostliny, rostlinné buňky, rostlinnou tkáň a rostlinná semena s pozměněnou protox aktivitou, které jsou rezistentní nebo při nejmenším tolerantní k působení herbicidů, jenž jsou za normálních podmínek přirozenými inhibitory protox aktivity v rostlinách. Předmětem vynálezu jsou rostliny, u kterých pozměněná protox aktivita je způsobena . nadměrnou expresí protox enzymu divokého typu nebo expresí molekuly DNK, kódující protox enzym tolerantní k herbicidu. Zmíněný protox enzym tolerantní k herbicidu může být modifikovaná forma protox enzymu, který se přirozeně objevuje v eukaryontech nebo v prokaryontech. Rostliny, které jsou ve vynálezu zdůrazňovány, zahrnují jednoděložné, dvouděložné rostliny a zvláště pak hybridní rostliny. Preferovány jsou ty rostliny, jenž jsou potenciálním cílem pro protox inhibující herbicidy, jde o agronomicky důležité plodiny takové jako kukuřice a další obilniny, jako jsou pšenice, oves, žito, čirok, rýže, ječmen, proso, turfové a krmné traviny, stejně jako bavlna, tabák, cukrová třtina, cukrová řepa, řepka olejná a sója.

Vynález dále zahrnuje rostlinný množící materiál; semena ošetřená ochraným povlakem, který je tvořen přípravkem ze skupiny herbicidů, insekticidů, fungicidů, baktericidů, molluscicidů nebo jejich směsí.

Vynález popisuje metody produkce rostlin, rostlinných buněk, rostlinných tkání a semen a jejich transgenického potomstva, které obsahuje protox enzym rezistentní nebo tolerantní k herbicidu v koncentraci, která inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu. Zmíněná rezistence nebo tolerance může být získána v transgenických rostlinách exprimující se molekuly DNK kódující modifikovanou formu protox enzymu, který se přirozeně vyskytuje v eukaryontu, v rostlině, v prokaryontecn nebo protox enzymu, který je modifikovanou formou proteinu přirozeně se vyskytující prokaryontecn.

Vynález popisuje přípravu transgenické rostliny kukuřice, kukuřičné tkáně a semen a jejich transgenického potomstva, které byly stabilně transformován rekombinantní molekulou DNK, jenž obsahuje vhodný promotor, je funkční v rostlinách, operabilně svázaný se strukturním genem kódujícím nemodifikovaný prokaryontní protox enzym rezistentní k herbicidu.

Vynález se týká produkce rostlin, které exprimují pozměněný protox enzym, jenž je tolerantní k inhibici herbicidu v koncentraci inhibující aktivitu divokého typu nezměněného protox enzymu. Rostlina může být stabilně transformována rekombinantní molekulou DNK, která obsahuje strukturní gen kódující rezistentní protox nebo může být

vytvořena	přímou	selekční	metodou,	kterou	je izolována,
charakterizována a	vyvinuta	linie	rostlin	rezistentní k
herbicidu.
Da 1 e	vynález	popisuj e	metodu	pro	kontrolu růstu
nežádoucích	rostlin	. Jde o aplikaci účinného množství protox-

inhibujícího herbicidu na populaci rostlin s pozměněnou protox aktivitou, která je rezistentní k herbicidu v koncentraci jenž inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu v rostlině. Touto cestou jsou především chráněny rostliny, které jsou potencionálním cílem protox-inhibujících herbicidů, zvláště pak agronomicky významné plodiny, například kukuřice a obilniny, mezi než patří pšenice, oves, žito, čirok, rýže, ječmen, proso, a dále jde o turfové a krmné traviny, bavlna, tabák, cukrová třtina, cukrová řepa, řepka olejná a sója. Mezi herbicidy s protox inhibiční aktivitou ptří aryluracil, difenylether, oxidiazol, imid, fenyl pyrazol, derivát pyridinu, fenopylat a 0fenylpyrrolidino- a piperidinokarbamatový analog fenopylatu.

Vynález také zahrnuje rekombinantní produkci protox enzymu a metody použití rekombinantně produkovaného protoxu. Dále popisuje hostitelské buňky, zvláště buňky selektované ze skupiny rostlinných, zvířecích, bakteriálních, kvasinkových a hmyzích buněk, které jsou stabilně transformovány rekombinantní molekulou DNK, obsahující vhodný promotor. Promotor by měl být funkční v hostitelské buňce a měl by být operabilně vázán k strukturnímu genu, který kóduje nemodifikovaný nebo modifikovaný eukaryontní protox enzym, zmíněný hostitel je schopný exprimovat molekulu DNK.

Vynález poskytuje metody použití purifikovaného protoxu pro zjištění protox-inhibující aktivity u nových herbicidů a pro identifikaci protox mutantů, které jsou rezistentní na danný herbicid.

Vynález popisuje metodu na testování chemikálii zhlediska její schopnosti v rostlině inhibovat aktivitu protox enzymu, metoda spočívá v (a) kombinaci zmíněného protox enzymu a protoporfyrinogenu IX v první reakční směsi, za takových podmínek, že protox enzym je schopný katalyzovat konverzi protoporfyrinogenu IX na protoporfyrin IX;

(b) kombinaci zmíněné chemikálie, protox enzymu a protoporfyrinogenu IX v druhé reakční směsi za stejných podmínek jako probíhá první reakce;

(c) excitování první a druhé reakční směsi v přibližném rozmezí 395 až 410 nM;

(d) porovnání fluorescence zmíněné první a druhé reakční směsi v přibližném rozmezí 622 až 635 nM;

jestliže fluorescence druhé reakční směsi je podstatně nižší než u první reakční směsí, znamená to, že zmíněná chemikálie je schopna inhibovat aktivitu popsaného protox enzymu.

Dalším předmětem vynálezu je metoda umožňující identifikaci modifikovaného protox enzymu rezistentního k protox inhibitoru, který je přítomný v populaci buněk. Metoda se setává z těchto kroků (a) kultivace populace buněk v přítomnosti protox inhibitoru v koncentraci, která inhibuje nemodifikovanou formu řečeného protox enzymu;

(b) selekce buněk (definovaných odst. (a)), jejichž růst není inhibován;

(c) izolace a identifikace protox enzymu přítomného v buňkách selektovaných z bodu (b).

Geny kódující pozměněný protox mohou být použity jako selekční markry při transformaci rostlinných buněk. Vynález dále poskytuje metodu selekce rostlin, rostlinné tkáně nebo rostlinných buněk transformovaných transgenem pocházející z netransformovaných rostlin. Tato metoda se sestává z těchto kroků (a) transformace rostliny, rostlinné tkáně nebo rostlinné buňky transgenem, který je schopný býti exprimován rostlinou, a genem kódujícím pozměněný

protox rezistentní	k protox inhibitoru;
b) přenesení takto	transformovaných	rostlin nebo
rostlinných buněk	do media, které	obsahuje protox
inhibitor;
c) selekce rostlin	nebo rostlinných	buněk, které v
mediu přežijí.

Vynález dále popisuje sondy a metody pro detekci přítomnosti a formy protox genu a kvantifikace síly transkripce protoxu v organizmu. Tyto metody mohou být používány pro diagnostiku onemocnění, které jsou spojeny s pozměněnou formou protox enzymu nebo s pozměněnou sílou jeho exprese.

Tento vynález se týká izolavané molekuly DNK, která kóduje eukaryontní formu protoporfyrinogenové oxidázy (zde označenou jako protox), což je enzym, který katalyzuje oxidaci protoporfyrínogenu IX na protoporfyrin IX. DNK kódující sekvence a korespondující sekvence aminokyseliny protox enzymu z Arabidopsis thaliana jsou popsány v SEQ ID č. 1-4 a 9-10. DNK kódující sekvence a korespondující sekvence aminokyseliny kukuřičného protox enzymu jsou popsány v SEQ ID č. 5-8.

Podle tohoto vynálezu může být izolována libovolná eukaryontní DNK kódující protox enzym. Jedna metoda používaná pro izolaci eukaryontních protox kódujících sekvencí je popsána v příkladu 1. Použitím této metody jsou identifikovány klony cDNK, kódující protox enzym, z knihovny cDNK klonů odvozených z eukaryontů. Metoda je založena na schopnosti těchto klonů propůjčit protox enzymatickou aktivitu mutantnímu hostitelskému organizmu, kde tato aktivita je nedostatečná Vhodné hostitelské organizmy jsou takové, které mohou být použity pro screening exprese cDNK knihoven a jejichž mutanty, kterým chybí protox aktivita, jsou dostupné nebo mohou být jednoduše vytvořeny. Mezi takové hostitelské organizmy patří E. coli (Sasrman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., 174:3953 (1992)) a Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al., Biochem. Res. Comn. 106:724 (1982)).

V jiném případě eukaryontní protox kódující sekvence mohou být izolovány dobře známými postupy, založenými na homologii zmíněné sekvence se sekvencemi protox enzymu z Arabidopsis thaliana (SEQ ID č 1,3 a 9) Zea mays (SEQ ID č. 5 a 7). U těchto postupů je používána celá nebo část známé protox kódující sekvence jako sonda pro selektivní hybridízace s dalšími protox kódujícími sekvencemi, které jsou přítomny ve skupině klonovaných fragmentů genomické DNK nebo fragmentů cDNK (např. genomická nebo cDNK knihovna) pocházejících ze zvoleného organizmu. Tyto postupy zahrnují hybridizaci s DNK knihovnami kultivovanými na plotnách (buď plaky nebo kolonie; např. Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) a PCR amplifikaci za použití oligonukleotidových primerů, které korespondují s konzervativními oblastmi sekvencí protox aminokyselin (např. Innis et al., PCR Protocos, a Guide to Methods and Applications eds., Academie Press (1990)). Tyto metody jsou zvláště vhodné k izolaci protox kódujících sekvencí z organizmů, které jsou příbuzné z organizmy, z nichž je odvozena sekvence sondy. Například sonda, která je tvořena sekvencemi z Arabidopsis thaliana a z Zea mays je pravděpodobně vhodná pro izolaci protox kódujících sekvencí z jiných rostlinných druhů. Izolované eukaryontní protox sekvence, popsané v tomto vynálezu, mohou být manipulovány použitím standardních postupů genového inženýrství a tak jsou vhodné pro použití k libovolnému účelu. Například celá protox sekvence nebo její části mohou být použity jako sondy, které jsou schopny specificky hybridizovat s protox kódujícími sekvencemi a mRNK. Za účelem dosažení specifické hybridizace za různých podmínek, tyto sondy zahrnují sekvence, které jsou jedinečné mezi protox kódujícími sekvencemi. Jejich délka je nejméně 10 nukleotidů, preferují se sondy o délce 20 nukleotidů. Takové sondy mohou být používány pro amplifikaci a analýzu protox kódujících sekvencí ze zvoleného organizmu pomocí dobře známé metody, kterou je polymerázová řetězová reakce (PCR). Tato metoda je použitelná pro izolaci dalších protox kódujících sekvencí z žádaných organizmů nebo jako diagnostický test pro určení přítomnosti protox kódujících sekvencí v organizmu a dále pro odhalení souvislosti výskytu pozměněných kódujících sekvencí s určitým nepříznivým stavem, jako je u lidí autozomální dominantní onemocnění, které je charakterizované neuropsychiatrickými symptomy a kožními lézemi. U tohoto onemocnění je snížena úroveň protox aktivity (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302:765 (1980)).

Protox specifické hybrídízáční sondy mohou být také používány k mapování umístění přirozeného eukaryontního protox genu(ů) v genomu vybraného organizmu. K tomuto účelu jsou vhodné standardní postupy založené na selektivní hybridizaci sondy k genomovým protox sekvencím. Tyto postupy se setávají z identifikace DNK polymorfizmů, které jsou obsaženy v sekvenci protox sondy, a z využití takového polymorfizmu k následné segregaci protox genu vztaženého k dalším markrům, jejichž pozice je známa při mapování populace, která je odvozená ze samooplodnění hybridu dvou polymorfních parentálních linií (např. Helentjaris et al., Plant Mol. Biol. 5:109 (1985), Sommer et al. , Biotechniques 12:82 (1992), DOvidio et al., Plant Mol. Biol. 15:169 (1990)). Zatímco libovolná eukaryontní protox sekvence je použitelná jako sonda pro mapování protox genů eukaryontního organizmu, mezi preferované sondy patří ty protox sekvence, které jsou získány z organizmů příbuzných k zvolenému organizmu. Nejvíce preferované sondy jsou ty protox sekvence, které jsou ze samotného zvoleného organizmu.Mapování protox genů tímto způsobem je využitelné při šlechtění rostlin. Například tím. že je známa pozice mutantního protox genu v genetické mapě, který nese rezistenci k herbicidu, lemovací DNK markry mohou být identifikovány z referenční genetické mapy (např. Helentjaris, Trend Genet. 3:217 (1987)). Během introgrese herbicidní rezistence do nové šlechtěné linie, mohou byt tyto markry použité k monitorování rozsahu k protoxu vázáné lemovací chromozomální DNK, která je stále přítomna v opakujícím se původci po každém kole backcrossing.

Northen blot analýza, využívající protox specifické hybridizační sondy, může být použita ke kvantifikaci množství protox mRNK v organizmu. Tato metoda je vhodná pro diagnostický test k určení změny síly protox exprese, což může být spojeno s určitým nepříznivým stavem, jako je u lidí autozomální dominantní onemocnění, které je charakterizované neuropsychiatrickými symptomy a kožními lézemi. U tohoto onemocnění je snížena úroveň protox aktivity (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302:765 (1980)).

Za účelem rekombinantní produkce enzymu v hostitelském organizmu, protox kódující sekvence je vložena do expresivní kazety, která je navržena pro zvoleného hostitele, a je vnesena do hostitele , kde je exprimována. Volba specifických regulačních sekvencí jako je promotor, signální sekvence, 5'a 3'nepřekládané sekvence a zesilovač transkripce je závislá na schopnostech odborníka. Výsledná molekula, obsahující jednotlivé elementy vázané k vhodnému čtecímu rámci, může být vložena do vektoru, který je schopen být transformován do hostitelské buňky. Vhodné expresivní vektory a metody pro rekombinantní produkci proteinů jsou charakterizovány pro hostitelské organizmy jako jsou E. coli (např. Studier and Moffatt, J. Mol. Biol. 189:113 (1986), Brosius, DNK 8:759 (1989)), kvasinky (např. Schneider and Guarente, Meth. Enzymol. 194:373 (1991)) a hmyzí buňky (např. Luckow and Summers, Bio/Technol. 6:47 (1988)). Mezi ně patří plazmidy jako pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (International Biotechnologies, Inc., New Heven, CT), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, CA) a expresivní vektory pro baculoviry, například ty, které jsou odvozeny z genomu jaderného polyedrického viru Autographica californica (AcMNPV). Preferovaný baculovirus/hmyzí systém jsou pVI11392/Sf21 buňky (Invitrogen, La Jolla, CA).

Rekombinantně produkovaný eukaryontní protox enzym je použitelný pro různé účely. Například dodává protox enzymatickou aktivitu in vitro. Dále může být použit pro testování herbicidních chemikálií in vitro, jejichž cíl působení není znám, přičemž lze určit jejich protox inhibiční aktivitu. Podobný test in vitro může být použit k identifikaci chemikálií, které inhibují protox aktivitu a které jsou proto považovány za kandidáty herbicidů. V jiném případě, rekombinantně produkovaný protox enzym může sloužit k hlubší charakterizaci jeho vztahu k známým inhibitorům, což vede k vytvoření nových herbicidů stejně jako k vytvoření enzymu, jenž je tolerantní k herbicidu.

Účinek inhibice na protox enzym se určuje měřením fluorescenec při vlnové délce okolo 622 až 635 nm po excitaci při 395 až 410 nM (např. Jacobs and Jacobs, Enzyme 28:206 (1982)); Sherman et al., Plant. Physiol. 97:280 (1991)).

Tento test je založen na principu, že protoporf yrin IX, na protoporfyrinogenu, je fluorescenční pigment, extrakty jsou připravovány diferenciální centrifugací z vybraných subcelulárních frakcí, například etioplasty, mitochonadria, mikrozomy nebo plazmatické rozdíl od Proteinové membrány (např. Lee et al., Plant Physiol. 102:881 (1993); Prado et al., Plant Physiol. 65:956 (1979) ; Jakson and Moore, in Plant Organelles. Reid, ed., pp. 1-12; Jacobs and Jacobs, Plant Physiol. 101:1181 (1993)). Protoporfyrinogen je připravován redukcí protoporfyrinu amalgamem sodným jak popisuje Jacobs and Jacobs (1982). Reakční směsi obsahují 100 mM Hepes (pH 7.5), 5 mM EDTA, 2 mM DTT, přibližně 2 M protoporfyrinogen IX a přibližně 1 mg/ml proteinového extraktu. Před iniciací enzymové reakce jsou k enzymovému extraktu přidány roztoky inhibitoru v různých koncentracích například 1 mM, 100 μΜ, 10 μΜ, 1 μΜ, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM. Po přidání extraktu je měřena fluorescence po dobu několika minut a je vypočítána směrnice křivky (reakční rychlost) z lineární oblasti. Porovnáním směrnic inhibiční reakce a kontrolní reakce je určena IC50.

Vynález dále popisuje použití protox enzymu v testu pro identifikaci protox mutantů, které jsou rezistentní na inhibitor. Test probíhá následovně:

(a) inkubace prvního vzorku protoxu a jeho substrátu, protoporfyrynogenu IX, v přítomnosti druhého vzorku, který obsahuje protox inhibitor;

(b) měření enzymatické aktivity protoxu z bodu (a);

(c) inkubace prvního vzorku mutovaného protoxu a jeho substrátu v přítomnosti druhého vzorky, který obsahuje stejný protox inhibitor;

(d) měření enzymatické aktivity mutovanaého protoxu z bodu (c) ; a (e) srovnání enzymatické aktivity obou protoxů.

Reakční směs a reakční podmínky jsou podobné jako u testu pro identifikaci protox inhibitorů (inhibitirový test). Modifikace jsou následující; První, protox mutant, získaný jak bylo dříve popsáno, je v jedné reakční směsi inhibitorového testu nahrazen protoxem divokého typu. Druhá, inhibitor protoxu divokého typu je přítomen v oboch reakčních směsích. Třetí, za účelem zjištění, zda došlo k vzrůstu nemutované aktivity, jsou porovnány mutovaná aktivita (aktivita enzymu v přítomnosti inhibitoru a mutovaného protoxu) a nemutovaná aktivita (aktivita enzymu v přítomnosti inhibitoru a protoxu divokého typu). Mutovaná aktivita je libovolné měření enzymatické aktivity mutovaného protox enzymu v přítomnosti vhodného substrátu a inhibitoru. Nemutovaná aktivita je libovolné měření enzymatické aktivity protox enzymu divokého typu v přítomnosti vhodného substrátu a inhibitoru. Podstatný vzrůst je definován jako zvýšení enzymatické aktivity, které je vyšší než je chyba měření. Preferuje se dvojnásobný vzrůst aktivity enzymu divokého typu v přítomnosti inhibitoru. Více preferovaný je 5-ti násobný vzrůst a nejžádanější je 10-ti a více násobný.

Herbicidy, které inhibují protox, zahrnují molekuly mnoha různých strukturálních tříd (Duke et al., Weed Sci. 39:465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43:193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245:35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35:70 (1989)). K těmto molekulám patří difenylethery {např. acifluorifen, 5[2-chloro-4- (trifluoromethyl) fenoxy]-2-nitrobenzoová kyselina; její methylester; nebo oxyfluorfen, 2-chioro-l-(3-ethoxy-4nitrofenoxy)-4-(trifluorobenzen)}, oxidiazoly (např. axidiazon, 3-[2,4-di chlor o-5- (1-me thy let noxy) fenyl]-5- (1,1dimethylethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-(3H)-on), cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyfenyl)3,4,5,6-tetrahydrofthalimid; chlorofthalim, N-(4chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid), fenyl pyrazoly (např. TNPP-ethyl, ethyl 2 —[1—(2,3, 4-trichlorfenyl)-4nitropyrazolyl-5-oxy]propionat; M&B 39279), deriváty piridínu (např. LS 82-556) a fenopylatu a jeho O-fenylpyrrolidino- a piperidinokarbamatové analogy.

Podstatné difenylethery jsou ty, které mají tento obecný vzorec, kde

	Cl	R ^o_C/	NQ,	Vzorec I
cf₃-
R je -COONa	(Vzorec	II),	-C0NHSO2CH3	(Vzorec III) nebo -
COOCH₂COOC₂H₅	(Vzorec	iv;	Maigrot	et	al·., Brighton Crop
Protection Conference·	-Weeds	:47-51	(1989	) ) -

Další vhodné difenylethery jsou ty, kde R je

NOCH₂COOCH₃ li

CCH₂OCH₃ (Vzorec IVa; Hayashi et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds:53-58 (1989)).

Další vhodné difenylethery mají vzorec:

(Vzorec IVb; bifenox, Dest et al., Proč. Northeast Weed Sci. Conf. 27:31 (1973)) .

Podstatná je také třída herbicidů známá jako imidy, které mají obecný vzorec

R, r₂

Ra (Vzorec V) kde Q jsou

(Vzorec VI) (Vzorec VII (Vzorec VIII (Vzorec IX)

(Vzorec IXa) (Hemper et al., (1995) in International Congress of Pes al., eds., Amer. Chem. Soc., (Vzorec IXb)

Proceedings of the Eighth ticide Chemistry, Ragdale et

Washington, D.C., pp. 42-48 (1994) ) .

A Ri jsou H, Cl nebo F, R₂ je Cl, R₃ je optimálně substituovaný ether, thioether, ester, amino nebo alkyl skupina. V jiném případě R₂ a R3 mohou dohromady tvořit 5-ti nebo β-ti členný heterocyklický kruh. Příklady imidových herbicidů jsou

CH3SO2NH (Vzorec X)

(Vzorec XI)

Miuara (1993)) (Vzorec XII)

Brighton Crop Protection Conference-Weeds:35-40

(Vzorec XIII)

^N‘ ^Cl _o OCHjCODCsH,, (Vzorec XIV)

^N“V^“^CI

O

O-CHC=CH CHj (Vzorec XV)

O .^N_\.

HC=C-CHr, O (Vzorec XVI)

Herbicidní aktivity výše uvedených látek jsou popsány v

Proceedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference,

Weeds (British Crop Protection Council) (Vzorce X a XVI) ,

Proceedings of the 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (Vzorce XII a XIII) , U.S.Patent č. 4,746, 352 (Vzorec XI) a Abstracts of the Weed Science Society of America vol. 33, pg.9 (1993) (Vzorec XIV).

Mezi preferované imidové herbicidy patří aryluracily, mají obecný vzorec ci

COOR (Vzorec XVII) kde R znázorňuje skupinu (C2-s~alkenyloxy) karbonyl-Ci-4-alkyl, jak je doloženo v U.S. patentu č. 5,183,492, který je zde začleněn jako reference.

Významné jsou také herbicidy mající obecný vzorec :

(Vzorec XVIII; thiadiazimin) (Weiler et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, pp.:29-34 (1993));

(Van Saun pp.:19-22 (Vzorec XIX; karfentrazon) et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, (1993));

N-substituované pyrazoly s obecným vzorcem:

(Vzorec XX) (Mezinárodní patent WO 94/08999, WO 93/10100 a U.S. Patent č. 5,405,829 Schering)

N-fenylpyrazoly, takové jako:

(Vzorec XXI; nipyraklofen) (str.621 The Pesticide Manual, 9^th ed., ed. C.R. Worthing, British Crop Protection Council, Surrey (1991));

a 3-substituované-2-aryl-4,5,6,7-tetrahydroindazoly (Lyga et al., Pesticide Sci. 42:29-36 (1994)).

Aplikační rozmezí dávky herbicidu, které inhibuje aktivitu protox enzymu, částečně závisí na vnějších faktorech jako jsou prostředí, doba a metoda aplikace. V případě imidových herbicidů, které jsou reprezentovány vzorci V až IX, a zvláště těch, jenž mají vzorce X až XVII, je rozmezí aplikační dávky 0,0001 až 10 kg/ha, preferováno je rozmezí 0,005 až 2 kg/ha. Tato dávka a koncentrace herbicidu mohou být rozdílné, závisí to na působení a na použité látce. Obětyto veličiny lze určit dobře známými metodami.

Vynález dále prezentuje rostliny, rostlinnou tkáň a rostlinná semena, která jsou tolerantní k herbicidům, jenž inhibují přirozeně se vyskytující protox aktivitu v těchto rostlinách, kde tolerance je způsobena pozměněnou aktivitou protox enzymu. Jsou preferovány agronomicky důležité plodiny, t.j. krytosemenné a nahosemenné rostlínyjako jsou bavlna, sója, řepka, cukrová řepa, kukuřice, rýže, pšenice, ječmen, oves, žito, čirok, proso, krmné a turfové traviny a podobně.

Pozměněnou aktivitou protox enzymu je míněna protox enzymatická aktivita, která je odlišná od té přirozeně se vyskytující v rostlině (t.j. protox aktivita, která se vyskytuje přirozeně nezávisle na přímém či nepřímém zásahu člověka), jenž je rezistentní k herbicidům ínhíbujícím přirozeně se vyskytující aktivitu. Pozměněná protox enzymatická aktivita může být rostlině udělena, podle vynálezu, zvýšením exprese na herbicid citlivého protoxu divokého typu, expresí pozměněného herbicid-tolerantního eukaryontního protox enzymu v rostlině, expresí nemodifikované nebo modifikované bakteriální formy protox enzymu, který je k herbicidu v rostlinách rezistentní nebo kombinací těchto postupů.

Dosažení pozměněné protox enzymatické aktivity pomocí zvýšené exprese vede k tomu, že v rostlině je takové množství protox enzymu, které je přinejmenším dostatečné k překonání inhibice růstu způsobené herbicidem. Hladina exprimovaného protoxu obecně dosahuje nejméně dvojnásobku, lépe pětinásobku a v nejlepším případě více jak desetinásobku množství přirozeně exprimovaného. Silnější exprese může být způsobena tím, že se protox gen divokého typu vyskytuje ve více kopiích; může být dále zapříčiněna vícenásobným výskytem protox kódujících sekvence v protox genu (t.j. amplifikace genu) nebo mutací nekódující, regulační sekvence endogenního protox genu v rostlině. Rostliny obsahující takovou pozměněnou protox enzymatickou aktivitumohou být získány přímou selekcí. Tato metoda je v oboru známa (Somers et al., v U.S. 5,162,602 a Anderson etal., v U.S. 4,761,373). Tyto rostliny mohou být získány metodami genového inženýrství. Zvýšená exprese na herbicid citlivého protoxu může také byt provedena stabilní transformací rostlinné buňky molekulou rekombinantní nebo chimérické DNK, která obsahuje promotor schopný řídit expresi příbuzného strukturního genu v rostlinné buňce a je vázaný k homolognímu nebo heterolognímu strukturnímu genu kódujícímu protox. Homologním je míněn ten protox gen, který je izolován z organizmu taxonomicky identického s cílovou rostlinou buňkou, heterologní je ten protox gen, který je získán z organizmu, jenž je taxonomicky odlišný od cílové rostlinné buňky. Homologní protox geny mohou být získány komplementací bakteriálního nebo kvasinkového auxotrofního mutantu cDNK expresní knihovnou získané z cílové rostliny. Například příklad 1 a Snustad et al., Genetics 120:1111-1114 (1988) (kukuřičná glutaminová syntetáza); Delauney et al., Mol. Genet. 221:299-305 (1990) sojová pyrrolin-5-karboxylatová reduktáza); Frisch et al.,

Mol. Gen. Genet. 228:287-293 (1991) (kukuřičná dihydrodipicolinatová syntetáza); Eller et al., Plant Mol. Biol. 18:557-566 (1992) (3-isopropylmalatová dehydrogenaza chloroplastu řepky); Proč. Nati. Acad. Sci., USA 88:1731-1735 (1991); Minet et al., Plant J. 2:417-422 (1992) (dihydroorotatová dehydrogenáza) a další reference umístěné na jiném místě. Další známé metody zahrnují testování genomové nebo cDNK knihovny, například na sekvence, které cross-hybridízuj 1 se specifickými NK sondami nebo testování expresních knihoven na produkci protox enzymů, které crossreagují se specifickými protilátkovými sondami. Preferovaná metoda zahrnuje komplementaci E. coli hemG auxotrofního mutantu cDNK knihovnou z kukuřice nebo Arabidopsis thaliana.

Mezi promotory funkční v rostlinách nebo v rostlinných buňkách, t.j. ty, které jsou schopny řídit expresi příbuzných strukturálních genů, takových jako je protox, v rostlinách, patří 19S nebo 35S promotory květákového mozajkového viru (CaMV) a CaMV zdvojený promotor, promotory nopalinové syntetázy, promotory k patogenezi-vztaženého proteinu (PR) , promotory malé podjednotky ribulozové bifosfátové karboxylázy (ssuRBISCO) a podobně. Preferovány jsou promotor rýžového aktinu (McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231:150 (1991)), promotor kukuřičného ubiquitinu (EP 0 342 926; Taylor et al., Plant Cell Rep. 12:491 (1993)), a Pr-1 promotor z tabáku, Arabidopsis nebo z kukuřice (přihláška mezinárodního patentu č. PCT/IB95/00002 Ryals et al., reference na jiném místě). Dále jsou preferovány 35S promotor a zesílený nebo zdvojený 35S promotor, takový jako popisuje Kay et al., Science 236:1299-1302 (1987) a zdvojený 35S promotor klonovaný do pCGN2113, uložený jako ATCC 40587, který je doložen v EP-A 0 392 225, reference na jiném místě. Samy promotory mohou být modifikovány za účelem pozměnění jejich síly, což může zvýšit expresí protoxu. Z důvodu řízeného transportu exprimovaného protox enzymu do místa působení, mohou být signální nebo transportní peptidy fúzovány s protox kódující sekvencí za vzniku chimérické DNK konstrukce. Příklady signálních peptidů zahrnují ty, které jsou přirozeně vázány k rostliným k patogenezi-vztaženým proteinům, např., PR-1, PR-2 a podobně (Payne et al., Plant Mol. Biol. 11:89-94 (1988). Příklady tranzitních peptidů zahrnují tranzitní peptidy chloroplastu jak popisuje Von Heijne et al., Plant. Mol. Biol. Rep. 9:104126 (1991); Mazur et al., Plant Physiol. 85:1110 (1987); Vorst et al., Gene 65:59 (1988) a mitochondriální tranzitní peptidy, které popisuje Bountry et al., Nátuře 328:340-342 (1987). Chloroplastové a mitochondriální tranzitní peptidy jsou v tomto vynálezu použitelné jako protox enzymatická aktivita, typicky se objevující v mitochondriu a v chloroplastu. Nejvíce preferované jsou chloroplastové tranzitní peptidy. Jsou považovány za primární báze pro působení protox inhibujících herbicidů (Witkowski and Halling, Plant Physiol. 87:632 (1988); Lehnen et al., Pěstíc. Biochem. Physiol. 37:239 (1990); Duke et al., Weed Sci 39:465 (1991)). Také jsou zahrnuty sekvence, které ovlivňují lokalizaci kódovaného proteinu do různých buněčných částí jako jsou vakuoly. Například Neuhaus et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:10362-10366 (1991) a Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:21-53 (1991). Relevantní doložení této publikace je formou reference.

Konstrukce chimérické DNK podle vynálezu obsahují vícenásobné kopie promotoru nebo protox strukturních genů. Konstrukce mohou zahrnovat v každém otevřeném čtecím rámci, spolu s dalšími funkčními elementy, kódující sekvence pro markry a jiné peptidy, takové jako jsou signální a tranzitní peptidy. Příprava takových konstrukcí patří do základních dovedností odborníka.

Použitelné markry zahrnují peptidy poskytující rezistenci na herbicidy, antibiotika nebo léky, například rezistenci na hygromycin, kanamycin, G418, gentamycin, linkomycin, methotrexat, fosfinotricin a podobně. Tyto markry mohou být použity pro selekci buněk transformovaných konstrukcemi chimérické DNK. Dalšími použitelnými markry jsou peptidické enzymy, které mohou být jednoduše detekovány viditelnou reakcí, npříklad, barevnou reakcí jako je luciferáza, β-glukuronidáza nebo β-galaktozidáza.

Pozměněná aktivita protox enzymu může být dosažena vytvořením nebo identifikací modifikovaných forem izolované eukaryontní protoxové kódující sekvence, která má nejméně jednu substituci aminokyseliny, adici nebo deleci, která kóduje pozměněnou rezistenci protox enzymu k herbicidu, jenž inhibuje nepozměněnou, přirozeně se vyskytující formu (t.j. formy, které se vyskytují přirozeně v eukaryontním organizmu a nejsou manipulovány buď přímo metodami rekombinace DNK nebo nepřímo selekčním šlechtěním atd.). Geny kódující takové enzymy mohou být získány řadou metod. První obecná strategie zahrnuje přímou a nepřímou mutagenezi mikrobů. Například genově manipulovatelné mikroby jako jsou E. coli nebo S. cerevisiae mohou být předmětem náhodné mutageneze in vívo, která může být provedena například UV světlem, ethyl nebo methyl methan sulfonátem. Metody mutegeneze jsou popsány v Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972); Davis et al. , Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); Sherman et al. , Methods in

Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983); a U.S. Patent č. 4,975,374 (Goodman et al.). Mikroorganizmus po mutagenezí obsahuje eukaryontni protox gen citlivý na herbicid a a jeho protox aktiviata je nesena právě tínto genem. Buňky pozměněné mutagenezí jsou kultivovány v přítomnosti herbicidu v koncentracích, které inhibují nemodifikovaný protox enzym. Kolonie mutagenizovaného mikrobu, které rostou v přítomnosti inhibitoru lépe než kolonie nemutagenizovaného mikrobu (t.j. vykazují rezistenci k inhibitoru), jsou selektovány pro další analýzu. Z těchto kolonií jsou buď klonováním nebo amplifikací polymerázovou řetězovou reakcí izolovány protox geny a jsou objasněny jejci sekvence. Sekvence kódující pozměněnou protox enzymatickou aktivitu jsou pak klonovány do mikrobu, kam vnáší rezistenci na inhibitor.

Druhá metoda, kterou lze získat mutantní na herbicid rezistentní alely eukaryontního protox enzymu zahrnuje přímou selekci v rostlině. ''Účinek protox inhibitoru, které už byly uvedeny, na růst rostlin jako jsou Arabidopsis, sója nebo kukuřice může být určen kultivací sterilizovaných semen na plotnách na jednoduchém mediu, které obsahuje minimální množství solí, se vzrůstající koncentrací inhibitoru. Vhodné koncentrace se pohybují v rozmezí 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 110, 300, 1000 a 3000 ppm. Nejnižší dávky, jejichž inhibice růstu může být reprodukovatelně detekovaná se používá v dalších pokusech.

Mutageneze rostlinného materiálu může být použita ke zvýšení frekvence výskytu rezistentních alel v selektované populaci. Mutagenizovaná osivový materiál je odvozen z různých zdrojů, které zahrnují chemickou nebo fyzikální mutagenezí semen, chemickou nebo fyzikální mutagenezí pilu (Neuffer, v Maize for Biological Research. Sheridan, ed.

Univ. Press, Grand Forks, ND., pp. 61-64 (1982)), jenž je použit pro oplidnění a pak jsou shromážděny Mi mutantní semena. V případě Arabidopsis, M₂ semena (Lehleovi sememna, Tucson, AZ), t.j. semena potomstva rostlin vyrostlá ze semen, která byla mutagenizována chemikáliemi jako je ethyl methan sulfonát nebo fyzikální cestou za použití gamma záření nebo rychlých neutronů, jsou kultivovány na plotně v hustotě 10 000 semen /plotnu (10 cm v průměru) na mediu s minimálním množstvím solí s příslušnou koncentrací inhibitoru, který slouží k selekci rezistence. Semenáóe, které rostou a zůstávají zelené po dobu 7-21 dní jsou přesazeny do půdy, pokračují v růstu až do vytvoření semen. Potomstvo těchto semen je testováno, zda je rezistentní k herbicidu. Jestliže rezistence je dominantní, předpokládá se, že rostliny, jejichž semeno se dělí 3:l=rezistentní:citlivý, jsou heterozygotní v generaci M₂. Rostliny, které produkují všechna semena rezistentní, jsou považovány za nomozygotní v generaci M₂. Mutageneze intaktních semen a testování jejich M₂ dceřinných semen může také probíhat v jiných rostlinných druzích, například v sóje (U.S. patent č.5,084,082 (Sebastian)). Další způsob získání semen s tolerancí na herbicid je oplodnění chemickou nebo fyzikální cestou mutagenizovaným pilem.

Potvrzení, že rezistence je založena na pozměněném protox genu, je možné dvěma způsoby. První způsob, alely protox genu z rostlin, vykazující rezistenci k inhibitoru, mohou být izolovány použitím PCR. Při této metodě jsou použity primery sestaveny na základě konzervativních oblastí protox cDNK sekvence Aradopsis a kukuřice, uvedeny v SEQ ID č. :1,3,5,7 nebo upřednostněny jsou primery, založeny na sekvencích nepozměněného protox genu z rostliny, která se používá pro vytvoření rezistentních alei. Po sekvenování, za účelem zjištění přítomnosti mutací v kódující sekvenci, alely mohou být testovány, zda jsou schopny přenést rezistenci na inhibitor na rostlinu, která je jimi transformována. Tyto rostliny mohou být buď Arabidopsis nebo libovolná rostlina, jejíž růst je ovlivněn inhibitorem. Druhý způsob, protox geny mohou být mapovány za účelem zjištění polymorfizmu délky restrikčních fragmentů (RFLP) (např. Chang et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:6856-6860 (1988); nam et al. , Plant Cell 1: 699-705 (1989). Rezistence může být mapována nezávisle použitím stejných markrů. Jestliže je rezistence způsobena mutací protox genu, stopa rezistence povede do pozice, která je nerozlišitelná od pozice protox genu.

Třetí způsob je selekce v kultuře rostlinných buněk. Explanty rostlinné tkáně, například embrya, listové disky atd., aktivně rostoucí kalus nebo rostlinné suspenzní kultury jsou kultivovány na definivaném mediu bez hernu za přítomnosti zvyšující se koncentrace herbicidu nebo podobného inhibitoru, který je vhodný pro použití v laboratorních podmínkách. U různých kultur jsou referovány různé stupně růstu. Jisté kultury, jde o rychle rostoucí druhy kolonií, rostou dokonce v přítomnosti normálně inhibující koncentrace inhibitoru. Četnost výskytu těchto rychle rostoucích druhů kolonií lze zvýšit působením chemického nebo fyzikálního mutagenu před vystavením tkání nebo buněk působení herbicidu. Putativní rezistenci přenášející alely protox genu jsou izolovány a testovány, jak je popsáno v následujících paragrafech. Tyto alely, nesoucí rezistenci na herbicid, mohou pak být manipulovány za účelem dosažení optimální exprese a jsou transformovány do rostliny. V jiném případě rostliny mohou být vytvořeny z tkáně nebo buněčných kultur, které obsahují tyto alely.

Čtvrtý způsob zahrnuje mutagenezi na herbicid citlivých protox genů divokého typu v bakterii a kvasince, což je následováno kultivací mikroba v mediu bez hernu, ale s inhibující koncentrací inhibitoru, a selekcí těch kolonií, které rostou v přítomnosti inhibitoru. Rostlinná cDNK, jako je Aradopsis nebo kukuřičná cDNK, kódující protox je klonována do mikrobu, kterému jinak chybí protox aktivita. Takovými mikroby mohou být například E. coli, S.typhimurium a S. cerevisiae autotrofní mutanty zahrnující kmen E. coli SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Mícrobiol. 113:297 (1979)), kmeny S. typhimurium TE2483 nebo TT13680 (Xu et al. , J. Bacteriol. 174:3953 (1992)) a kvasinkový mutant hem 14-1 (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106:724 (1982)). Transformovaný mikrob je pak předmětem in vivo mutageneze, jak bylo právě popsáno, nebo in vitro mutageneze pomocí libovolných chemických nebo fyzikálních metod, například použitím bisulfitu sodného (Shortle et al., Methods Enzymol. 100:457-468 (1983)); methoxylaminu (Kadonaga et al. , Nucleic Acid Res. 13: 1733-1745 (1985)); na oligonukleotidy směrovaná saturační mutageneze (Hutchinson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83:710-714 (1986)); nebo různé strategie chybné polymerázové inkorporace (např. Shortle et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79:1588-1592 (1982);

Shiraishi et al., Gene 64:313-319 (1988); a Leung et al., Technique 1:11-15 (1989)). Kolonie, které rosrou v přítomnosti normálně inhibující koncentrace inhibitoru, jsou izolovány a purifikovány opakovanou selektivní kultivací. Jejich plazmidy jsou purifikovány a retransformací do mikrobu, který nemá protox aktivitu, je testována schopnost přenášet rezistenci na inhibitor. Pak jsou určeny DNK sekvence protox cDNK plazmidových inzertů, které prošly tímto testem.

Po té co je rezistentní protox alela identifikována, může být genově manipulována za účelem optimální exprese v rostlině. Ta může obsahovat pozměněnou kódující sekvenci pro optimální expresi alely nesoucí rezistenci v rostlině. Metody vhodné pro modifikaci kódujících sekvencí za účelem dosažení optimální exprese v daných druzích plodin jsou dobře popsány, (např. Perlak et al., Proč. Nati. Acad. Sci. Usa 88:3324 (1991); Koziel et al·., Bio/technol. 11:194 (1993)). Genově manipulovaná protox alela pro optimální expresi může také zahrnovat operabilně vázanou příslušnou regulační sekvenci (t.j. protmotor, signální sekvence, terminátory transkripce). Preferované protmotory jsou ty, které umožňují silnou konstituční expresi nebo ty, jenž umožňují specifickou silnou expresi v tkáních, které jsou náchylné k poškození působením herbicidu.

Existuje mnoho způsobů, které jsou použitelné pro vnesení rekombinantních DNK molekul do rostlinné buňky. Volba metody závisí na typu transformované rostliny, t.j. zda je jedno- nebo dvouděložná.Vhodné metody pro transformaci rostlinných buněk jsou mikroinjektáž (Crossway et al., Bio Technique 4:320-334 (1986), elektroporace (Riggs et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986)), transformace zprostředkovaná Agrobacterium (Hinchee et al., Biotechnology 6:915-921 (1988)), přímý transfer genu (Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984)) a akcelerace balistické částice za použití přístroje od firmy Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin a Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (např. Sanford et al., U.S. Patent 4,945,050; a McCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988)). Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and

Technology 5:27-37 (1987) (cibule); Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988) (sója); McCaba et al., Bio/Technology 6:923-926 (1988) (sója); Datta et al., Bio/Technology 8:736-740 (1990) (rýže); Klein et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85:4305-4309 (1988) (kukuřice); Klein et al., Bio/Technology 6:559-563 (1988) (kukuřice); Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444 (1988) (kukuřice); Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839 (1990); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990) (kukuřice).

Dále vynález popisuje transgenické rostliny, zejména transgenické plodné rostliny ve smyslu dříve popsaných procesů a jejich asexuální a/nebo sexuální potomstvo, které jsou stále rezistentní nebo nejméně tolerantní k inhibici herbicidem v koncentraci, která inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu v rostlinách. Preferované jsou hybridy rostlin, které jsou rezistentní nebo přinejmenším tolerantní k inhibici herbicidem, v koncentracích, jenž inhibují v rostlině se přirozeně vyskytující protox aktivitu.

Transgenická rostlina podle vynálezu může být dvouděložní nebo jednoděložní. Preferovány jsou jednoděložní rostliny Graminaceae, k nimž patří Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccnarum, Bromus, Oryzea, Avena, Hordeum, Secale a Setaria.

Zvláště preferované jsou transgenické rostliny kukuřice, pšenice, ječmene, čiroku, žita, ovsa, turfových travin a rýže.

Z dvouděložních rostlin jsou preferovány sója, bavlna, tabák, cukrová třtina, řepka olejná a slunečnice.

Expresivním potomstvem se rozumí asexuálně i sexuálně vytvořené potomstvo transgenických rostlin. Tato definice také zahrnuje všechny mutanty a variace získatelné známými metodami, jako je např., buněčná fůze a selekce mutantu, a které stále vykazují charakteristickeé vlastnosti počáteční transformované rostliny, dohromady se všemi produkty, vznklými křížením a fůzí transformovaného rostlinného materiálu.

Dalším předmětem vynálezu je proliferační materiál transgenických rostlin.

Proliferační materiál transgenických rostlin je definovaný podle vynálezu jako libovolný materiál, který se může množit sexuálně nebo asexuálně in vivo nebo in vitro. Zvláště preferovány jsou protoplasty, buňky, káli, tkáň, orgány, semena, embrya, pil, vaječné buňky a zygoty spolu s dalším libovolným propagačním materiálem, který se dá získat z transgenických rostlin.

Dále vynález popisuje části rostlin, jako jsou například květy, stonky, plody, listy a kořeny, které pocházejí z transgenických rostlin nebo jejich potomstva, jenž byly transformovány ve smyslu procesu popsaném ve vynálezu a proto obsahují část transgenických buněk.

Dříve než je množící materiál (plody, hlízy, obilí, semeno), zvláště semeno, prodáván jako komerční produkt, je ošetřen ochraným povlakem, který obsahuje herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy molluscicidy nebo jejich směsi. Tyto látky se mohou vyskytovat dohromady s dalšími nosiči, povrchově aktivními látkami nebo aplikaci umožňujícími adjuvans, které ovlivňují vlastnosti přípravku ve smyslu poskytnutí ochrany proti poškození způsobeném bakteriálními, plísňovými a zvířecími škůdci.

Za účelem ochrany osiva, ochraný povlak může být aplikován na osivo buď impregnací hlíz nebo obilí kapalným přípravkem nebo jejich potažením kombinovaným mokrým nebo suchým přípravkem. Ve speciálních případech je možné použít další metody aplikace, například ošetření pupenů nebo plodů.

Rostlinné osivo podle vynálezu obsahující DNK sekvenci, která kóduje eukaryontní protein mající protoporfyrinogen oxidázovou aktivitu (protox), může být ošetřeno ochraným povlakem, jenž obsahuje ochranou látku jako je kaptan, karboxin, thiram (TMTD®) , methalaxyl (Apron®) a pirimifosmethyl (Actellic®) a další látky, které se běžně užívají pro tento účel.

Dalším předmětem vynálezu rostlinný propagační materiál pro kultivaci rostlin, ale zvláště pak rostlinné osivo, které je ošetřeno ochraným povlakem, který je v širokém měřítku užíván pro tento účel.

K herbicidu rezistentní protox alela je získána přímou selekcí rostliny nebo rostlinné buněčné kultury, ze ktré může být rostlina vytvořena. Použitím tradičních šlechtících metod může být vyvinuta na herbicid tolerantní plodina, kde není potřeba genově manipulovaná alela a její transformace do rostliny. V jiném případě může být izolována na herbicid rezistentní alela, která je genově manipulována za účelem optimální exprese a pak je transformována do požadované rostliny.

Geny kódující pozměněnou protox rezistenci na protox inhibitor mohou být použity i jako selekční markry u metod rostlinné buněčné transformace. Například rostliny, rostlinná tkáň nebo rostlinné buňky transformované transgeny mohou být také transformovány genem kódujícím pozměněný protox, který je schopný exprese v rostlině. Tímto způsobem transformované buňky jsou přeneseny do media obsahující protox inhibitor. Za těchto podmínek přežívají pouze transformované buňky. Jako selekční agents se mohou použít protox inhibitory difenylethery (např. acifluorfen, 5-[2-chloro-443 (trifluoromethyl)f enoxy]-2-nitrobenzoová kyselina; její methylester; nebo oxyfluorfen, 2-chloro-l-(3-ethoxy-4nítrofenoxy)-4-(trifluorobenzen) f·, oxidiazoly, (např. oxidiazon, 3-[2, 4-dichloro-5- (1-methylethoxy) fenyl]-5-) 1,1dimethylethyl)-1,3,4-oxadiazol-2-(3H)-on), cyklické imidy (např. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargyloxyfenyl)3,4,5,6-tetrahydrofthalimid; chlorofthalim, N-(4chlorofenyl)-3,4,5,6-tetrahydrofthalimid), fenyl pyrazoly (např. TNPP-ethyl, ethyl 2 —[1-(2,3,4-trichlorfenyl)-4nitropyrazolyl-5-oxy]propionat; M&B 39279), deriváty piridinu (např. LS 82-556) a fenopylatu a jeho 0-fenylpyrrolidino- a piperidinokarbamatové analogy. Tato metoda je aplikovatelná na libovolnou rostlinou buňku, která je schopna být transformována pozměněným protox kódujícím genem, amůže být použita spolu s libovolným transgenem. Exprese transgenu a protox genu běží ze stejného promotoru, který je funkční v rostlinných buňkách nebo z oddělených promotorů. Vynález bude podrobněji popsán v příkladech. Tyto příklady jsou uvedeny pouze pro ilustraci, nejsou limitující ani jinak specifikuj ící.

Uložení

Následující molekuly vektoru jsou uloženy v Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA. Datum uložení je dále uvedeno.

Protox-1, ve vektoru pBluescript SK byl uložen 5.4.1994 jako pWDC-2(#B-21238).

Protox-2, ve vektoru pFL61 byl uložen 5.4.1994 jako pWDC-1 (NRRL #B-21237).

	MzProtox-1,	ve vektoru pBluescript	SK	byl	uložen
20	.5.1994 jako pWDC-4 s NRRL(#8-21260), sekvence	j sou	uvedeny
v	SEQ ID č: 5.
	MzProtox-1,	ve vektoru pBluescript SK	byl	znovu	uložen
11	.7.1994 jako	pWDC-4 s NRRL(#B-21260N)	, sekvence jsou
uvedeny v SEQ ID	č . : 5 .
	MzProtox-2,	ve vektoru pBluescript	SK	byl	uložen

20.5.1994 jako pWDC-3 s NRRL(#B-21259) , sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č.: 7.

Protox-3, ve vektoru pFL61 byl uložen 10.7.1994 jako pWDC-5 s (NRRL#B-21280).

PMzC-lVal, ve vektoru pBluescript SK byl uložen

30.9.1994 jako pWDC-8 pod přístupovým označením NRRL#21340.

PAraC-2Cys ve vektoru pFL61 byl uložen 14.11.1994 jako pWDC-7 pod přístupovým označením NRRL#21339N.

Příklady provedení vynálezu

Standardní metody DNK rekombinace a molekulárního klonování, zde používané, jsou dobře známy v oboru a jsou popsány v T.Maniatis, E.F.Fritsch a J.Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982) a T.J.Šilhavý, M.L.Berman a L.W.Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).

Příklad 1:

Izolace Arabidopsis cDNK kódující protox geny funkční komplementací E. coli mutantu.

Byla získána a amplifikována cDNK knihovna v plasmidovém vektoru pFL61 (Minet et al., Plant J. 2:417-422 (1992)) v

Arabidopsis thaliana (Landsberg). Druhá Arabidopsis (Colombia cDNK knihovna ve vektoru UniZap lambda (Stratagene) byla získána a amplifikována jako pBluescript plasmidy pomocí in vivo excize fágového materiálu. E. coli hemG mutant SASX38 (Sasarman et al. , J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)) byl získán a udržován na L mediu obsahující 20 mg/ml hematinu (United States Biochemicals). Plazmidové knihovny byly transformovány do SASX38 elektroporací za použití přístroje Bio-Rad Gene Pulser za podmínek doporučených výrobcem. Buňky byly naneseny na L agar obsahující 100 mg/ml ampicilinu v hustotě přibližně 500 000 transformantů/10 cm plotny. Buňky byly inkubovány při 37°C po dobu 40 hodin v šeru a byly selektovány pro schopnost růst bez přítomnosti exogenního hernu. Hemové prototrofy byly získány z pFL61 knihovny v hustotě 400/10⁷ a z pBluescript knihovny v hustotě 2/10⁷. Plazmidová DNK byla izolována ze 24 kolonií za účelem sekvenční analýzy. Každá z těchto 24 DNK byla retransformována do SASX38 za účelem potvrzení schopnosti komplementovat.

Sekvenční analýza odhalila dvě třídy putativních protox klonů. Devět z nich bylo označeno Protox-1. Každý byl odvozen ze stejného genua dva byly klony plné délky. CDNK je velká 1719 bp a kóduje protein o molekulární váze 57,7 kDa. N-konec peptidové sekvence má rysy charakteristické pro chloroplastový tranzitní peptid o velikosti 60-ti aminokyselin. Databázový průzkum za použití GAP programu (devaraux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1984) odhalil homologii s B. subtilis hemY (protox) proteinem (Hansson an Hederstedt 1992, Dailey et al., J. Biol. Chem. 269:813 (1994)). Tyto dva proteiny jsou z 53 % podobný a 31 % identický s oblastmi vysoké homologie, obsahující navrženou dinukleotidovou vazebnou oblast hemY proteinu (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269:813 (1994)).

Dalších 15 cDNK klonů bylo označeno Protox-2. Tyto klony také vznikly z jednoho genu. cDNK o plné délky má 1738 bp a kóduje protein o molekulární váze 55,6 kDa. N-konec je trochu podobný mitochondriálnímu transitnímu peptidů. Protein Protox-2 je částečně homologní s Protox-1 (53% podobnost, 28% identity) a s protox z B. subtilis (50% podobnost a 27% identity).

Protox-1 vev vektoru pBluescript SK byl uložen 5.4.1994 jako pWDC-2 (NRRL#B-21238).

Protox-2 ve vektoru pFL61 byl uložen 5.4.1994 jako pWDC1 (NRRL#B-21237).

Arabidopsis cDNK kódující protox-1 obsažený v pWDC-2 a protox-2 obsažený v pWDC-1 jsou uvedeny v SEQ ID č.: 1 a 3. Příklad 2:

Izolace kukuřičných cDNK kódujících protox geny funkční komplementací mutantu E. coli.

Zea Mays (B73 inbrední) cDNK knihovna ve vektoru lambda UniZap byla získána od firmy Stratagene a konvertována na pBluescript knihovnu pomocí in vivo excize. Další kukuřičná cDNK knihovna ve vektoru UniZap byla získána od firmy Clontech a podobně byla konvertována do pBluescript plazmidů. Selekce funkčních kukuřičných protox genů byla právě popsána pro případ Arabidopsis knihovny v příkladu 1.

Byly izolovány dva hemové prototrofy z knihovny od

Stratagene v množství 10⁷ transformantů, dále byly rekomplementovány a sekvenovány. Tyto cDNK byly identické a potvrdila se homologie s Arabidopsis Protox-1. Tento kukuřičný klon označený MzProtox-1 není kompletní. cDNK má 1698 bp a kóduje pouze putativní zralý protox enzym; cDNK nemá sekvenci tranzitního peptidu a nemá ani iniciační methionininový kodon. Gen je ze 68 % identický jako Arab Protox-1 na úrovni nukleotidů a ze 78 % identický (87% podobnost) na úrovni aminokyselin (uvedeno v Tab. 1).

Jeden hemový prototrof byl získán z knihovny od firmy Clontech v množství 10⁷ transformantů, byl dále rekomplementován a sekvenován. cDNK se jeví být kompletní, má 2061 bp a kóduje protein o molekulární váze 59kDa. Tento klon je kukuřičný homolog Arabidopsis Protox-2 a je označen MzProtox-2. Gen je z 58 % identický jako Arab Protox-2 na úrovni nukleotidů a z 58 % identický (76% podobnost) na úrovni aminokyselin (uvedeno v Tab.2). Kukuřičný klon má sekvence N-konce o 30 aminokyselin delší ve srovnání s Arabidopsis klonem. Stejně jako u Arabidopsis klonů, homologie mezi dvěma kukuřičnými protox geny je poměrně nízká; dvě protinové sekvence jsou z 31 % identické.

MzProtox-1 ve vektoru pBluescript SK byl uložený

20.5.1994 jako pWDC-4 s NRRL(#B-21260), sekvence jsou uvedeny v Seq ID č.: 5.

MzProtox-1, ve vektoru pBluescript SK byl znovu uložen

11.7.1994 jako pWDC-4 s NRRL(#B-21260N) , sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č.: 5.

MzProtox-2, ve vektoru pBluescript SK byl uložen

20.5.1994 jako pWDC-3 s NRRL(#B-21259) , sekvence jsou uvedeny v SEQ ID č.: 7.

Příklad 3:

Izolace dalších protox genů založená na sekvenční homologii známých protox kódujících sekvencí.

Fágová nebo plazmidová knihovna je nanesena na plotnu v densitě přibližně 10 000 plaků na 10 cm Petriho misky. Filtrační membrána s plaky je kultivován a přes noc při teplotě 37° C. Filtrační membrána s plaky je pak hybridizována s jednou z cDNK, které jsou uvedeny v SEQ ID č. : 1, 3, 5 nebo 7. Sonda je značená 32P-dCTP pomocí metody random priming a PrimeTime kitu (International Biotechnologies, lne., New Haven, CT) . Podmínky hybridizace jsou 7% sodium dodecyl sulfát (SDS), 0,5 M NaPO₄ pH 7,0, lmM EDTA, teplota 50° C. Hybridizace trvá přibližně přes noc, pak je filtr promyc 2X SSC, 1% SDS. Pozitivně hybridizující plaky jsou detekovány autoradiografií. Byl získán jeden plak, z něhož byly izolovány cDNK inzerty. Sekvence těchto inzertů byly určeny pomocí metody řetězové terminace za použití dideoxy terminátorů značených fluorescenčním barvivém (Applied Biosystems, lne., Foster City, CA).

Tento standardní protokol může být použit odborníkem pro získání protox genů, sekvenčně homologních se známými protox sekvencemi, z dalších eukaryontů, zvláště pak z vyšších rostlin.

Odvozené sekvence aminokyselin proteinu, který je kódován sekvencemi ukázanými v SEQ ID č.: 2 a 6 jsou uvedeny v Tab.l. Odvozené sekvence aminokyselin proteinu, který je kódován sekvencemi ukázanými v SEQ ID č.:4 a 8 jsou uvedeny v Tab.2.

Tabulka i

Srovnání Protox-1 sekvencí aminokyselin Arabídopsis (SEQ ID

č.: 2) a kukuřice (SEQ ID č.: 6) procento podobnosti: 87,13 procento identity: 78,008

Protox-1.Pep x Mzprotox-1.Pep

Identická rezidua jsou znázorněny vertikálními čarami, které spojují sekvence. Sekvence jsou uvedeny pomocí programu GAP, který je popsán v Deveraux et al., Nucleic Acids Res. 12:387395 (1984) .

GGTTITTDCVIVGGGISGLCIAQALATKHPDAAPNLIVTEAKDRVGGNII 100 .. I I I :I I I I I I I I I . I I I I I I : I I I I I :. I . I I I I .

....NSADCVVVGGGISGLCTAQALATRH..GVGDVLVTEARARPGGNIT 44

101 T. . REENGFLWEEGPNSFQPSDPMLTMWDSGLKDDLVLGDPTAPRFVLW 148 I i I ί II I I I I I I 1 I I I : I I I - 1 I I I I I I I I 1 : I I I - I I I I I I I

TVERPEEGYLWEEGPNSFQPSDPVLTMAVDSGLKDDLVFGDPNAPRFVLW 94

149 NGXLRPVPSKLTDLPFFDLMSIGGKIRAGFGALGIRPSPPGREESVEEFV 198 :111111111 . I I I I I I I I I I . I I : I I I : I I I I 1 I I - I I I I I I I I I I I I

EGXLRPVPSKPADLPFFDLMSIPGKLRAGLGALGIRPPPPGREESVEEFV 144

199 RRNLGDEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWKLEQNGGSIIGG 248 I I I I I . I I I I I I I I I I I I I I I I I I I i I I i I I I I I I I I I : I I : I I I I I I I

145 RRNLGAEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWRLEETGGSIIGG 194

249 TFKAIQERXNAPKAERDPRLPKPQGQTVGSFRKGLRMLPEAISARLGSKV 298 I : I . I I I I ... I I :. I I : I I I I I - I I I I : I I I I I I I I I : I I ... I I I I I

195 TIKTIQERSKNPKPPRDARLPKPKGQTVASFRKGLAMLPNAITSSLGSKV 244

299 KLSWKLSGITKLESGGYNLTYETPDGLVSVQSKSVVMTVPSHVASGLLRP 348 I I I I I I .: I I I : . II I - I I I I : I : I I I I . I I I : I I : I I . I I I - : I I I

245 KLSWKLTSITKSDDKGYVLEYETPEGVVSVQAKSVIMTIPSYVASNILRP 294

349 LSESAANALSKLYYPPVAAVSISYPKEAIRTECLIDGELKGFGQLHPRTQ 398 I I .. I I : I I I :: I I I I I I I I : I I I I I I I I .I I I I I I I I I I I I I I I I - I

295 LSSDAADALSRFYYPPVAAVTVSYPKEAIRKECLIDGELQGFGQLHPRSQ 344

399 GVETLGTIYSSSLFPNRAPPGRILLLNYIGGSTNTGILSKSEGELVEAVD 448

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I . I I : I I I ι ι ι ι ι . ι ι ι ι ι : ι ι . I : I I I I I I I 345 GVETLGTIYSSSLFPNRAPDGRVLLLNYIGGATNTGIVSKTESELVEAVD 394

449 RDLRKMLIKPNSTDPLKLGVRVWPQAIPQFLVGHFDILDTAKSSLTSSGY 498

I Η I I I ! I.....II! I I I I I l I I I I I I I I I I I : I : I : . I I . . I . . : | |

395 RDLRKMLINSTAVDPLVLGVRVWPQAIPQFLVGHLDLLEAAKAALDRGGY 444

499 EGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYETAIEVNNFMSRYAYK* 538 : I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I - I : : . : I : . : | | | | |

445 DGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYESASQISDFLTKYAYK* 484

Tabulka 2 Srovnání č. : 4) a procento procento Protox-2.

101

122

151

168

201

218

251

268

301

313

351

363

401

Protox-2 sekvencí aminokyselin Arabidopsis (SEQ ID kukuřice (SEQ ID č.: 8) podobnosti: 75,889 identity: 57,905

Pep x Mzprotox-2.Pep

............................MAS GAVAD.HQIΞAVSGXRVAV 21

I I : I : - : 1-.::.111

ML ALT AS AS SAS S HP YRH AS AHT RRP RLRAVLAMAGS D D P RAAP ARSVAV 5 0 vgagvsglaaayxlksrglnvtvfeadgrvggxlrsvmqngliwdegant 71

I ί I Η I I I I i I i : I : · I : I I I I I I I - : ! · I I I .· I - :.1::1111111 vgagvsgla_aayrlrqsgvnvtvfeaadraggxirtnseggfvwdegant 10 0

MTEAEPEVGSLLDDLGLREXQQFPISQKXRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121

II I : I | . : . | : | I | I I . : I I I : I I I . I I I I I : : I - I . : : I . : I I - I : .

MT EGEWEAS RLID D LGLQD KQQ YP NSQ H KRYlVXD GAP AL 1P S D ΡIS LMX 150

SSVLSTQSXFQILLEPFLWKK. . . . KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167

I I I I I I . I I : - : : : I I I I : I I . | : | | | : . . I I 1 : . I : I I I I . I

SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGRE 200

WDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGAIRTXFA 217 I I I I : : I I I I : I I I I : I I : I I I : : I . I I . I I I : I : . : I I : I I I I I . I : I

VVDYFVDPFVAGTSA.GDPESLS IRHA.FP ALWNLERKYGSVIVGAILSKLA. 250

AKGGKSRDTKSSPGTKXGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSKDEINLDSK 267 lil:. : . . . | . I . : : . . I . I I I I . I I I I I : . I . . : : . I : : . I : . .

AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALKNEVGDDNVKLGTE 300

VLSLS..YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ...NPHYDAVIMTAPLCNVK 312 lili. : : : . . : . I I : I - I : I . :ί I I I I ί I I I : I I :

VLSLACTFDGVPA.LGRWSISVDSKDSGDKDLASNQTFDA.VIMTAPLSNVR 350

EMKVMKGGQPFQLNFLPEINYMPLSVLITTFTKEKVKRPLEGFGVLIPSK 362

II. I | I . I . I : | 1 I . : : 1 : I I I : : : I - I - I : - I I : II I I I I I I I I I RMKETKGGAPVVLDELPKMDYLPLSLMVTAEKKDDVXXPLEGFGVLIPYX 400

E.QKHGFKTLGTLFSSMMFPDRSPSDVKLYTTFIGGSRNQELAKASTDEL 411 I I I I I : I I i I I I I I I I I I I I I I . I · I I I I I : II I : I · : I I I . I - I EQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPQDQYLYTTFVGGSHNRDLAGAPTSIL 450

412 KQVVTSDLQRLLGVEGEPVSVNHYYWRKAEPLYDSSYDSVMEAIDKMEND 461 I i : II I I I - ; I I I I I I : I - I · I II -lilii: . I . I I : I I I : I I I . :

451 KQLVTSDLKXLLGVEGQPTFVKHVYWGNAFPLYGHDYSŠVLEAIEKMEKN 500

462 LPGFFYAGNHRGGLSVGKSIASGCKAADLVISYLESCSNDKKPNDSL* 509 I I ! I I I I I I ::11.11. I I I I : I I I I I - I I I I I I ......:

501 LPGFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAADLAISYLESHTKHNNSH* . . . 545

Příklad 4:

Izolace kontaminujícího kvasinkového protox klonu z

Arabidopsis cDNK knihovny.

Za účelem identifikace řídce se vyskytující cDNK s protox aktivitou proběhlo knihovny ve vektoru pFL61.

druhé testování Arabidopsis Výsledkem byly opět stovky komplementujících klonů. Přibližně 600 jich bylo jednotlivě inokulováno na mřížkované plotny a ty byly kultivovány při teplotě 28° C po dobu 18 hod. Byla připravena kopie této plotny na kolonie/plaky testovací membránu (NEN) podle instrukcí výrobce. Protox-1 a Protox-2 cDNK byly vystřiženy z jejich vektorů štěpením endonukleázami EcoRI/Xhol a Notl. Inserty byly separovány elektroforézou na 1% SeaPlaque GTG

FMC) agaroze, excizovany a značeny

P metodou random priming (Life Technologies). Jedna sada testovacích membrán byla hybridizována s každou sondou. Byly dodrženy podmínky hybridizace a promývání jak 1984.

je popisují Church a Gilbert,

Kolonie (-20), které neprokázaly jasnou hybridizaci s Protox-1 nebo Protox-2 byly pomnoženy v kapalném mediu a byla z nich izolována plazmidová DNK. DNK byly štěpeny restriktázou Notl, duplikátní vzorky byly naneseny do 1% agarozového gelu a pak byly přeneseny na Gene Screen Plus (NEN) membránu (New England Nuclear) . Sondy dvou známých protox genů byly označeny a použity k hybridizaci, jak již bylo popsáno. Byly nalezeny dva identické klony, které neodpovádaly Protox-1 ani Protox-2. Bylo ukázáno, že tento klon rekomplementuje SASX38 mutanta, ačkoliv roste velmi pomalu, byl označen Protox-3.

Protox-3 ve vektoru pFL61 byl uložen 8.6.1994 jako pWDC5 (NRRL#B-21280) . Zjistilo se, že tato kódující sekvence je odvozena z kvasinkové DNK, která byla přítomna jako hlavní kontaminant v Arabidopsis cDNK knihovně. Kvasinková DNK kódující protox-3 obsažená v pWDC-5 je uvedena v SEQ ID č. :

9.

Příklad 5:

Demonstrace citlivosti klonu rostlinného protoxu k protox inhibujícímu herbicidu v baktriálním systému.

Kultury Protox-1/SASX38, Protox-2/SASX38 a pBluescript/XLl-Blue byly kultivovány v L mediu za přítomnosti amp¹⁰⁰. 100 μΐ každé kultury bylo naneseno na plotnu na L amp¹⁰⁰ medium, obsahující různé koncentrace (1,0 nM až 10 mM) protox inhibujicího aryluracilového herbicidu (vzorec XVII). Duplikátní sada ploten byla inkubována při teplotě 37°C po dobu 18 hod. v šeru nebo v úplné tmě.

Protox⁺ E. coli kmen XLl-31ue není citlivý k herbicidu v libovolné koncentraci, což souvisí s referovanou rezistencí přirozeného bakteriálního enzymu na podobné herbicidy. Protox-1/SASX38 byl jasně citlivý, došlo k skoro úplné eliminaci porostu bakterií inhibitorem v koncentraci již 10 nM. Protox-2/SASX38 byl také citlivý, ale pouze při vyšších koncentracích (10M) herbicidu. ''Účinek herbicidu na oba kmeny s rostlinným protoxem byl výraznější při kultivaci v šeru, zjevný však byl i v případě, kdy plotny byly drženy v úplné tmě. Toxicita herbicidu byla úplně eliminována přidáním hematinu v koncentraci 20 mg/ml.

Rozdílná tolerance dvou kmenů s rostlinným protoxem je způsobena spíše různě silnou expresí uvedených plazmidů než rozdílnou citlivostí enzymu. Protox-1/SASX38 roste daleko pomaleji než Protox-2/SASX38 v libovolném mediu bez přítomnosti hernu. Navíc, kmen MzProtox-2/SASX38 s růstovou rychlostí srovnatelnou s Arab Pro.tox-1/SASX38, je také velmi citlivý na herbicid už v koncentračním rozmezí 10-100 nM.Počáteční cherakterizace kvasinkového Protox-3 klonu indikuje, že klon je také citlivý na herbicid.

Příklad 6:

Selekce rostlinných protox genů rezistentních na protox inhibující herbicidy v E. coli expresivním systému.

Inhibice rostlinných protox enzymů v bakteriálním systému je použitelná na testování na herbicid rezistentních mutací v rostlinných genech ve velkém měřítku. Počáteční na dávku odpovídající pokusy, provedené nanesením kapalné kultury na plotnu, daly vznik rezistentním koloniím, které se objevují ve vysoké frekvenci dokonce i při vysokých koncentracích herbicidu. Tato rezistence není odvozena z plazmidu, je založena na retransformaci/test citlivosti na herbicid. Tento problém se dá prakticky obejít transformací protox plazmidů do SASX38 mutantu a jeho přímým nanesením na plotnu, která obsahuje herbicid.

Rostlinné protox plazmidy jsou mutagenizovány různými způsoby. Například použitím publikovaných postupů pro cehemikálie (např. sodium bisulfit (Shortle et al., Methods Enzymol. 100:457-468 (1983); methoxylamin (Kadonaga et al., Nucleic Acids Res. 13:1733-1745 (1985); na oligonukleotidy směrovaná saturační mutageneze (Hutchinson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 83:710-714 (1986) nebo různé strategie chybné polymerázové inkorporace (např. Shortle et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79:1588-1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64:313-319 (1988); a Leung et al., Technique 1:11-15 (1989)). Očekávané up-promotor mutanty, vzniklé při mutagenezi celého plazmidů, jsou eliminovány reklonováním kódující sekvence do vektoru divokého typu a jeho testováním. Výsledkem je pravděpodobná vyšší exprese, což vede k lepšímu růstu v nepřítomnosti herbicidu. Je také možný vizuální rozpoznání mutantů nesoucích kódující sekvence.

Libovolný rostlinný protox gen exprimující rezistenci na herbicid v bakteriálním systému může být manipulován za účelem optimální exprese a může být transformován do rostlin za použití standardních metod, jak je zde popsáno. Výsledné rostliny mohou pak být ošetřeny herbicidem za účelem potvrzení a kvantifikace úrovně rezistence, která byla vnesena pomocí protox genu.

Příklad 7:

Konstrukce za účelem exprese na herbicid rezistentních mikrobiálních protox genu(ů) v rostlinách.

Kódující sekvence hemY protox genu z B. subtilis (Hansson an Hederstedt 1992, Dailey et al., J. Biol. Chem. 269:813 (1994)) a hemG protox genu z E. coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) byly izolovány z laboratorních kmenů pomocí PCR amplifikace za standardních podmínek. Primery byly navrženy podle publikovaných dat. Tyto geny jsou známy, že kódují na herbicid rezistentní formy protox enzymu.

Použitím standardních metod překrývající se PCR fůze (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, lne. (1994)), oba bakteriální geny byly fúzovány s dvěmi rozdílnými chloroplastovými sekvencemi tranzitního peptidú (CTP) z Arabidopsis. První byl CTP ze syntetázy acetohydroxylové kyseliny (AHAS, Mazur et al.,

Plant Physiol. 85:1110 (1987)), který umožňuje import do stroma chloroplastu. Druhý byl gen plastocyaninu z Arabidopsis (Vorst et al·., Gene 65:59 (1988)), který kóduje bipartitní tranzitní peptid. Oblast N-konce tohoto CTP směruje proteiny do chloroplastu, zatímco C-konec do thylakoidové membrány. Všechny čtyři fůze byly klonovány za 2X35S protmotor do binárního expresivního vektoru, který byl navržen pro produkci transgenických rostlin transformací za pomoci agrobacterium.

Následující protox cDNK z Arabidopsis a kukuřice, chloroplastový tranzitní peptid z Protox-1 nebo MzProtox-1 mohou být také fúzovány ke dvěma bakteriálním protox proteinům stejným způsobem jak je výše uvedeno.

Vektory shora popsané mohou pak být transformovány do žádaných rostliných druhů a výsledné transformanty jsou testovány, zda byla zvýšena jejich rezistence na herbicid.

Příklad 8:

Oblast umožňující přepínání mezi Arabidopsis/B. subtilis geny, za účelem produkce chimérického, na herbicid rezistentního protoxu.

Jeden z přístupů jak vytvořit protox gen, který je rezistentní na herbicid a zároveň v rostlině vykazuje účinnou protox enzymatickou aktivitu, je fůze části(í) bakteriálního a rostlinného genu. Z výsledných chimérických genů jsou pak vybrány ty, které jsou schopny v rostlině poskytnout na herbicid rezistentní protox aktivitu. Například Protox peptidové sekvence z Arabidopsis a B. subtilis (hemY) jsou významně kolineární s oblastí vysoké homologie. Sekvence kódující hemY byla klonována do pBluescript a byla testována její schopnost exprimovat na herbicid rezistentní protox aktivitu v SASX38. Chimérické geny Protox-l/hemY jsou konstruovány za použití fůzní PCR metody, pak následuje jejich ligace zpět do vektoru pBluescript.Přechod je přibližně uprostřed proteinů. Komplementací je testována protox funkce těchto fůzí. Jejich kultivací za přítomnosti herbicidu, kde intaktní Protox-1 a hemY slouží jako kontroly, je testována jejich rezistence na herbicid.

Příklad 9: ’

Produkce k herbicidu tolerantních rostlin pomocí nadměrné exprese rostlinných protox genů.

Za účelem exprese proteinu Arabidopsis nebo kukuřice v transgenických rostlinách, příslušná cDNK v plné délce byla vložena do rostlinného expresivního vektoru pCGN1761ENX, který byl odvozen z pCGN1761, popis následuje. pCGN1761 byl štěpen v jeho jediném EcoRI restrikčním místě, a ligován do fragmentu dvouřetězové DNK, který zahrnuje dva

oligonukleoti	.dy o	sekvenci	5'AAT TAT GAC	GTA ACG TAG GAA	TTA
GCG GCCC GCT	CTC	GAG	T 3'	(SQE ID č.:11)	a 5'	'AAT	TAC	TCG	AGA
GCG GCC GCG	AAT	TCC	TAC	GTT ACG TCA T	3'	(SEQ	ID	č. :	12) .

Výsledný plazmid pCGN176lENX obsahuje jediná restrikční místa EcoRI, Notl, a Xhol, která leží mezi zdvojeným 35S promotorem, který pochází z květákového mozajkového viru (Kay et al., Science 236:1299-1302 (1987)), a 3'-koncem nepřekládaných sekvencí tmi genu Agrobacterium tumefaciens. Tento plazmid je štěpen a ligován do fragmentu obsahujícího kompletní protox cDNK, který je výsledkem restrikčního štěpení plazmidů nesoucích protox cDNK. Z tohoto plazmidu je vystřižen Xbal fragment, který obsahuje Arabidopsis protox cDNK, jenž je lemována zdvojeným 35S promotorem a 3'-koncem nepřekládaných sekvencí tmi genu z A. tumefaciens. Tento Xbal fragment je vložen do binárního vektoru pCIB200, do jeho Xbal restrikčního místa, které leží mezi T-DNK hraničními sekvencemi. Výsledný plazmid označený pCIB200protox je transformován do kmene A. tumefaciens CIB542. (např. Uknes et al., Plant Cell 5:159-169 (1993).

Listové disky rostliny Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc jsou infikovány kmenem A. tumefaciens CIB542, který nese pCIB200lGPD jak popsal Horsh et al., Science 227:1229 (1985). Výhonky rezistentní na kanamycin z 15-ti nezávyslých listových disků byly přeneseny do kořenového media, pak přesazeny do půdy a vzniklé rostliny byly dále pěstovány ve skleníku do stádia zralosti. Semena těchto rostlin byla shromážděna a nechala se vyklíčit na MS agarovém mediu, které obsahovalo kanamycin. Z každého nezávislého primárního transformanta bylo, ve skleníku, pěstováno více jednotlivých, na kanamycin rezistentních, semenáčů do jejich stádia zralosti a pak byly shromážděny jejich semena. Tyto semena byla naklíčena na MS agaru, jenž obsahoval kanamycin.

Rostlinné linie, které daly vznik semenáčům s kanamycinovou rezistencí, jsou homozygotní z hlediska vloženého genu a staly se předmětem dalšího zkoumání. Děrovačkou papíru byly nastříhány listové disky každé z 15-ti nezávislých transgenických linií a byly umístěny na MS agar, který obsahuje různé vzrůstající koncentrace protox inhibujícího herbicidu.

Po třech týdnech dvě sady 10-ti disků z každé linie byly váženy. Transgenické linie, které jsou více rezistentní k inhibitoru než netransformované rostliny divokého typu byly selektovány k další analýze.

Z každé této linie byla extrahována RNK z listů. Celková RNK z každé nezávislé homozygotní linie a z netransgenickýcn rostlin, která je užívána jako kontrola, byla separována elektroforézou na agarozovém gelu s formaldehydem (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York (1987)). Gel byl blotován na nylonovou membránu (Ausubel et al., supra.) a hybridizován s radioaktivně značenou protox cDNK z Arabidopsis. Hybridizační a promývací podmínky byly stejné jako popisuje Church and Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:1991-1995 (1984). Membrána je hodnocena autoradiografem a intenzivní RNK pruhy odpovídající protox transgenům byly detekovány ve všech k herbicidu tolerantních transgenických rostlinných liniích.

Aby bylo možné dále určit sílu rezistence linie s nadměrnou expresí protoxu, rostliny pěstováné ve skleníku byly ošetřeny různými koncentracemi protox inhibujícín herbicidem.

Příklad 10:

Růst suspenzní kultury tabákových buněk.

Media:

MX1: Toto medium se skládá z Murashigeových a Skoogových (MS, T.Murashige et al., Physiol. Plant. 15:473-497, 1962) hlavních solí, vedlejších solí a Fe-EDTA (Gibco #500-1117; 4,3 g/1), 100 mg/1 myo-inositol, 1 mg/1 kyseliny nikotinové, 1 mg/1 pyridoxinu-HCl, 10 mg/1 thiaminu-HCl, 2-3 g/1 sacharozy, 0,4 mg/1 kyseliny 2,4-dichlorofenoxyoctové a 0,04 mg/1 kinetinu, pH 5,8. Medium je sterilizováno autoklávováním.

N6: Toto medium obsahuje makroelementy, mikroelementy a FeEDTA jak popisuje C-C.Chu et al. , Scientia Sinica 18:659 (1975), a následující organické sloučeniny: pyridoxin-HCl (0,5 mg/1, thiamin-HCl (0,1 mg/1), kyselinu nikotinovou (0,5 mg/1), glycin (2,0 mg/1) a sacharozu (30,0 g/l). Roztok je autoklávován. Konečné pH je 5,6.

Poznámka: Makroelementy jsou připraveny jako lOx koncentrovaný zásobní roztok a mikroelementy jako lOOx koncentrovaný zásobní roztok. Zásobní roztok vitaminů je připraven lOOx koncentrovaný.

Suspenze buněk Nicotiana tabacum linie S3 (Harms and DiMaio, J. Plant. Physiol. 137:513-519, (1991)) jsou kultivovány v kapalném mediu MX1. Erlenmeyerovy lahve o objemu lOOml, obsahující 25 ml media MX1, byly inokulovány 10 ml sedmidenní kultury buněk. Buňky byly kultivovány při teplotě 25°C, ve tmě na orbitální míchačce při 100 rpm (s výkyvem 2 cm). Buňky jsou subkultivovány v sedmi denních intervalech inokulací alikvotních vzorků do čerstvého media, což je provedeno následovně: asi 90 % buněčné suspenze je slito nebo odpipetováno a doplněno čerstvým mediem do žádaného objemu suspenze. Za 10 dní z 250-350 mg buněk inokula naroste 5-8 gramů čerstvé buněčné biomasy.

Příklad 11:

Produkce tabákové buněčné kultury, která toleruje herbicidní protox inhibitory, kultivací buněk na pevném selekčním mediu.

Buňky jsou předkultivovány, jak je uvedeno v příkladu 10. Buňky jsou od media odděleny sedimentací a následnou centrifugací při 500 x g. Buňky jsou pak ředěny čerstvým mediem, aby se dosáhlo vhodné hustoty pro nanesení na plotny, což je okolo 10 000 jednotek tvořících kolonie na ml (CFU/ml). Buňky v malém objemu media (přibližně 1 ml) jsou rozetřeny na povrch pevného media (MX1, 0,8% agar), které obsahuje požadovanou koncentraci inhibitoru. Na jednu Petriho misku je použito 20 až 30 ml media. Vhodná koncentrace je určena z křivky, která znázorňuje odezvu na jednotlivé dávky inhibitoru (příklad 14) , a je nejméně dvakrát vyšší než je hodnota IC₅₀ pro citlivé buňky divokého typu.

Plotny z buňkami na selekčním mediu jsou inkubovány za normálních růstových podmínek při 25-28°C, ve tmě až do doby, kdy se vytvoří kolonie. Vybrané buněčné kolonie jsou přeneseny do čerstvého media, které obsahuje žádanou koncentraci inhibitoru.

U preferované modifikaci popsané metody je nejprve rozetřen malý objem předkultivované suspenze buněk v tekutém mediu na povrch pevného media. Na plotnu je přidán stejný objem teplého tekutého media (1,2-1,6% agar), který je držen v tekutém stavu při teplotě 40°C, pohybem plotny dojde k promýchání buněk s mediem a k rozptýlení buněk po celé ploše plotny, ptřed tím, než medium ztuhne.

V jiném případě mohou být buňky smíchány s roztaveným agarem před nanesením na povrch selekčního media. Tato metoda má výhodu, že buňky jsou uloženy a imobilizovány v tenké vrstvě tuhnoucího media na povrchu selekčního media. Tento způsob umožňuje lepší aeraci buněk ve srovnání s buňkami, které jsou přidány do celého objemu media, což je 20-30 ml.

Příklad 12:

Produkce tabákové buněčné kultury, která toleruje herbicidní protox inhibitory, kultivací buněk v tekutém selekčním mediu.

Buňky, které jsou kultivovány stejným způsobem, jak je uvedeno v příkladu 10, jsou vneseny ve vhodné hustotě do media MX1, jenž obsahuje požadovanou koncentrací herbícídního protox inhibitoru. Buňky rostou za stejných podmínek, jak je popsáno v příkladulO. Buňky jsou po 7 až 10-ti dnech subkultivovány, což závisí na rychlosti růstu, v čerstvém mediu, které obsahuje příslušnou koncentraci inhibitoru.

Buňky rostou pravděpodobně pomaleji v závislosti na koncentraci inhibitoru, než buňky rostoucí v mediu bez inhibitoru.

Příklad 13:

Produkce tabákových buněk se zvýšenou hladinou protox enzymu.

Za účelem získání buněčné kultury nebo kalusu se zvýšenou hladinou protox enzymu, susupenze buněk nebo kalusu je přenášena do medií s postupně se zvyšující koncentrací herbicidního protox inhibitoru. Zvláště následující krok je důležitý:

Kolonie buněk selektované z těch, které vyrostly na plotnách, jak je popsáno v příkladu 11, jsou přeneseny do MX1 media, jenž obsahuje stejnou koncentraci protox inhibitoru, jako je užívána v příkladu 11 k vytvoření suspenzní kultury. V jiném případě vybrané kultury buněčných suspenzí z příkladu 12, jsou subkultivovány v kapalném mediu MX1, které obsahuje stejnou koncentraci protox inhibitoru, jako je užívána k selekci podle příkladu 12.

Kultury jsou subkultivovány až 20x v týdenních intervalech v MX1 mediu, které obsahuje vždy vyšší koncentraci herbicidu. Buňky jsou kultivovány až v 10-ti subkulturách v mediu, které obsahuje danou vyšší koncentraci herbicidu. Pak jsou přeneseny do MX1 media, jenž obsahuje další vyšší koncentraci herbicidu.

V jiném případě kousky selektovaného kalusu z příkladu 11 jsou přeneseny do tuhnoucího MX1 media, které obsahuje požadovanou koncentraci herbicidu. Následuje přenos do media s vyšší koncentrací herbicidu, stejně jak je uvedeno v předchozím odatavci, s výjimkou, že se používá pevné medium.

Příklad 14:

Měření růstu buněk v suspenzní kultuře v závislosti na dávce herbicidu.

Za účelem získání křivky závislosti růstu na dávce herbicidu, je určován růst buněk při různých koncentracích herbicidu. V suspenzi kultivované buňky tabáku S3 divokého typu, citlivé na herbicidní protox inhibitor, a buňky selektované pro toleranci na herbicid nebo transgenické buňky jsou po dobu 2-4 dny ve vysoké hustotě předkultivovány v kapalném mediu stejným způsobem jako v příkladu 11. Použité medium je odstraněno, buňky jsou promyty a je přidáno čerstvé medium bez herbicidu, v takovém množství, aby byla dosažena požadovaná hustota buněk (okolo 150 mg FW buněk na ml suspenze). 2,5 ml buněčné suspenze, obsahující přibližně 250300 mg FW buněk, je pak inokulováno do přibližně 30 ml kapalného media s požadovanou koncentrací herbicidu, které je obsažené ve 100 ml Erlenmeyerových lahvích. Je důležité každou láhev inokulovat stejným množstvím buněk. Je inokulováno 3 až 6 lahvi pro jednu koncentraci herbicidu. Koncentrace herbicidu se pohybuje v rozmezí 0 (=kontrola), 0,1 ppb, 0,3 ppb, 1 ppb, 3 ppb, 10 ppb, 30 ppb, 100 ppb, 300 ppb, 1 000 ppb, 3 000 ppb a 10 000 ppb. Několik vzorků inokulované kultury je odebráno v čase inokulace k určení biomasy buněk v inokulované lahvi.

Buňky jsou pak inkubovány při teplotě 28°C , ve tmě, po dobu 10-ti dnů. Buňky jsou separovány vakuovou filtrací a vážením je určena bíomasa buněk. Vážením po usušení lze získat hodnotu suché biomasy.

Růst buněk je určen jako výtěžek z 10-ti denní kultivace a je vyjádřen jako procento vztažené k růstu buněk v mediu bez herbicidu podle vzorce: (konečná biomasa buněk rostlých za přítomnosti herbicidu minus biomasa inokula krát 100 děleno celkovou biomasou buněk rostlých bez herbicidu minus biomasa inokula). Hodnoty IC50 jsou určeny z grafu závislosti (relativní buněčná biomasa na koncentraci herbicidu). IC50 udává koncentraci herbicidu, při které růst buněk dosahuje 50 % hodnoty růstu kontrolního pokusu (buňky jsou kultivovány bez herbicidu).

U modifikované metody několik kousků kalusu, získaných z na herbicid rezistentní buněčné kultury způsobem stejným jako v příkladech 11 a 13, je přeneseno do tuhnoucího media vhodného pro kultivaco kalusu, které obsahuje různé koncentrace herbicidu. Relativní růst je určen po 2 až 6-ti týdenní kultivací vážením kousků kalusu a porovnáním s růstem kontrolní kultury v mediu bez herbicidu. Metoda růstu v suspenzi je preferována pro svou přesnost.

Příklad 15:

Určení křížové tolerance.

Za účelem určení rozsahu, ve kterém buňky vykazují toleranci k analogickým nebo jiným herbicidům, je podle příklad 14 provedena kultivace buněk ve stoupající koncentraci vybraných herbicidů. Relativní růst buněk a jejich hodnota IC₅o je určena pro každý herbicid. Tyto hodnoty jsou pak porovnány.

Příklad 16:

Určování stability k herbicidu tolerantního fenotypu.

Za účelem stanovení, zda na herbicid tolerantní fenotyp buněčné kultury je stabilní po určitý časový úsek, buňky jsou přeneseny z media obsahující herbicid do media bez herbicidu. Buňky jsou kultivovány jak popisuje příklad 10, v mediu bez herbicidu po dobu tří měsíců, subkiltivací ve vhodných intervalech (7-10 dnů v případě suspenzní kultury; 3 až 6 týdnů v případě kultivace kalusu). Známé množství buněk je pak zpět přenesena do media, které obsahuje herbicid a kultivována po dobu 10-ti dnů (suspenzní kultury) nebo po dobu 4 týdnů (kultivace kalusu) . Relativní růst je určen stejným způsobem jako v příkladu 14.

Příklad 17:

Indukce a kultivace embryogenního kalusu z tkáně kukuřičného štítku.

až 14 dnů po opilení jsou sebrány klasy ze samoopilujících se rostlin kukuřice inbrední linie Funk 2717.

Po odstranění slupek jsou klasy sterilizovány po dobu 15 minut v 20% roztoku komerčního bělidla Chlorox s několika kapkami detergentu, který je přidán zdůvodu lepšího smáčení. Klasy jsou pak několikrát omyty sterilní vodou. Všechny další kroky jsou prováděny asepticky v digestoři. Embrya o délce 1,5-2,5 mm jsou vyjmuty z jádra spatulou a jsou umístěny embryonální osou směrem dolů na MS medium, které obsahuje 2 mg/1 kyseliny 2,4-dichlorofenoxyoctové (2,4-D) a 3% sacharózu a je ztuženo 0,24% Gelrite^R.

Po 2-4 týdenní kultivaci při teplotě 28°C ve tmě se tvoří embryogenní kalus na štítkových tkáních embryí. Kalus je vyjmut z axplantátu a je přenesen do čerstvého ztuženého MS media, které obsahuje 2 mg/1 2,4-D. Subkultivace je opakována v intervalu jednoho týdne. Jsou subkultivovány pouze ty části kalusu, které mají embryogenní morfologii.

Příklad 18:

Selekce kultur buněk kukuřice, které jsou tolerantní k herbicidním protox inhibitorům.

a) Selekce použitím embryogenního kalusu: embryogenní kalus, jehož vznik je popsán v příkladu 17 je přenesen do media pro udržování kalusu, které se skládá z N6 media obsahující 2 mg/1 2,4-D, 3% sacharózu a protox inhibitor o koncentraci, jenž je dostatečná k potlačení růstu, ale neovlivňuje embryogenezi kultury, a je ztužené 0,24% Gelríte^R. Aby došlo ke zvýšení frekvence výskytu k herbicidu tolerantním mutantům, kultura může být před selekcí ošetřena chemickým mutagenem, například ethylmetan sulfonát nebo fyzikálním mutagenem, například UV světlem, v koncentraci, která je nižší než je ta, která inhibuje růst (příklad 14). Kultury jsou kultivovány při 28°C ve tmě. Kalus po 14-ti denní kultivaci je přenesen do čerstvého media stejného složení. Subkultivovány jsou pouze kultury, které mají požadovanou embryogenní morfologii známou jako drobivý embryogenní kalus typu II. Kultury jsou pomnožovány subkultivací v týdenních intervalech ve dvouch až deseti subkultivacích v čerstvém mediu. V tomto mediu jsou subkultivovány pouze nej rychleji rostoucí kultury. Rychle rostoucí kalus je pak přenesen do media pro jeho udržování, které obsahuje protox inhibující herbicid ve vhodné koncentraci jak je definováno v příkladu 11. V případě, že kalus dobře roste v přítomnosti herbicidu dané koncentrace, obvykle po pěti až deseti týdenních subkultivacích, kalus je přenesen do media, které obsahuje třikrát vyšší koncentraci inhibitoru a je subkultivován až do doby, kdy je získána dobře rostoucí kultura. Tento proces je opakován za použití media, které obsahuje protox inhibitor v koncentraci, jenž je desetkrát vyšší než je původní vhodná koncentrace a dále media obsahující 20x a 40x vyšší koncentrace.

Když je vyprodukován dostatečný kalus je přenesen na regenerační medium, které je vhodné pro dozrání embrya a regeneraci rostliny. Embryogenní kalus rostoucí v přítomnosti každé z použitých koncentrací herbicidu je přenesen do regeneračního media.

b) Selekce použitím embryogenních suspenzních kultur:

Embryogenní suspenzní kultury imbrední linie kukuřice Funk 2717, která vznikla podle příkladu 24 a je udržována subkultivací v týdenních intervalech v čerstvém kapalném mediu N6, které obsahuje 2 mg/1 2,4-D. Aby došlo ke zvýšení frekvence výskytu k herbicidu tolerantním mutantům, kultura může být před selekcí ošetřena chemickým mutagenem, například ethylmetan sulfonát nebo fyzikálním mutagenem, například UV světlem, v koncentraci, která je nižší než je ta, která inhibuje růst (příklad 14). Kultury jsou kultivovány na míchačce při 120 rpm při teplotě 28°C ve tmě. Medium je vyměňováno.v týdenních intervalech. Kultury jsou ředěny mediem podle jejich růstu. Snahou je udržet koncentraci buněk okolo 10 ml buněk na 50 ml media. Rychlost růstu každé subkultury je kontrolována a pouze rychle rostoucí kultury s požadovanou drolivou embryogenní morfologií se uchovává pro další subkulturu. Po dvou až deseti subkultivacích v mediu, jehož složkou je N6 medium, vzrůstá růstová rychlost nejméně dvakrát až třikrát během týdenní subkultivace. Kultury jsou pak přeneseny do N6 media, které obsahuje 2 mg/1 2,4-D a třikrát vyšší dávku inhibitoru než je původní. Rostoucí kultury jsou opakovaně subkultivovány v tomto mediu a vznikají dvě až deset subkultur, jak je výše popsáno.

jsou vybrány rychle rostoucí drolivou embryogenní morfologií. Tyto přeneseny do N6 media, které obsahuje 2 destkrát vyšší koncentraci inhibitoru než Postup subkultivace rostoucích kultur s drobivou embryogenní morfologií je opakován až do doby, kdy jsou získány rychle rostoucí kultury. Tyto kultury jsou pak přeneseny do N6 media, které obsahuje 2 mg/1 2,4D a 30-ti násobně vyšší koncentraci inhibitoru než je ta původní.

Pro další subkultivaci kultury s požadovanou kultury jsou mg 2,4-D a je původní, požadovanou

Za účelem regenerace rostlin z susupenzní kultury selektované pro každé embryogenní každou zmíněnou

ΊΟ koncentraci herbicidu, jsou kultury nejprve přeneseny do N6 media ztuženého 0,24% Gelrite* a obsahujícího 2 mg/1 2,4-D a koncentraci inhibitoru, ve které byla kultura kultivovaná pro produkci embryogenního kalusu. Embryogenní kalus je subkultivován v čerstvém mediu až do doby, kdy je získáno dostatečné množství kalusu pro regeneraci. Jsou subkultivovány pouze kultury s požadovanou embryogenní morfologií.

Příklad 19:

Regenerace rostlin kukuřice získaných ze selektovaného kalusu nebo suspenzní kultury.

Rostliny jsou regenerovány ze selektovaných embryogenních kultur kalusu z příkladu 13 přenesením do čerstvého regeneračního media. Užívaná regenerační media jsou: 0N6 medium, které se skládá z N6 media bez 2,4-3 nebo N61 skládající se z N6 media obsahujícího 0,25 mg/1 2,4-D a 10 mg/1 kinetinu (6-furfurylaminopurin) nebo N62, jehož složkou je N6 medium s obsahem 2,4-D o koncentraci 0,1 mg/1 a kinetinu o koncentraci 1 mg/1. Všechna media jsou ztužena 0,24%Gelrite^R. Kultury jsou kultivovány při teplotě 28°C za přístupu světla (10-100gEinstein/m²sec, 16 hod.denně, z bílých fluorescenčních lamp). Kultury jsou subkultivovány v čerstvém mediu každé dva týdny. Rostlinky se vyvinou během 3 až 8 týdnů. Rostlinky nejméně 2 cm vysoké jsou vyjmuty z kalusu a jsou přeneseny do media, které podporuje tvorbu kořenů. Používají se různá media tohoto druhu. Medium, jehož složkou je buď N6 nebo MS medium neobsahuje vitaminy ani obvyklé množství solí nebo jeho obsah solí je redukován na polovinu, obsah sacharozy je redukován na lg/1 a dále buď vůbec neobsahuje růst regulující sloučeniny nebo obsahuje 0,1 mg/1 kyseliny a-naftalenoctové. Po té, co se dostatečně vyvinou kořeny, rostlinky jsou přesazeny do květináčové směsi, která obsahuje vermikulit, rašelinu a zahradní půdu. Po přesazení je odstraněn celý zbývající kalus a agar je smyt a listy jsou přestřihnuty na polovinu. Rostlinky rostou ve skleníku. Ze začatku jsou kryty průhledným plastovým kelímkem z důvodu udržení vlhkosti a ochrany před přímým světlem. Po aklimatizací jsou přesazeny a rostou do dosažení zralosti. Hnojivo Peters 20-20-20 (Grace Sierra) je používáno pro zdravý vývoj rostliny. Kvetoucí rostliny jsou opylovány, preferuje se samoopylení.

Příklad 20:

Konstrukce vektorů pro transformaci rostlin.

Řada transformačních vektorů je dostupná pro transformaci rostlin. Geny popsané v tomto vynálezu mohou být konjugovány s libovolným z těchto vektorů. Volba vektoru záleží na na preferované metodě transformace a druhu rostliny, do kterého je transformace směrována. Pro různé cílové druhy rostlin jsou preferovány různé antibiotikové nebo herbicidní selekční markéry. Rutině používané selekční markry pro transformaci zahrnují nptll gen, který nesen rezistenci na kanamycin a příbuzná antibiotika (Messing & Vierra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nátuře 304:184187 (1983)), bar gen, který konferuje rezistenci na herbicid fosfinotricin (White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062 (1990,

Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631 (1990)), hph gen , který nese rezistenci na antibiotikum hygromycin (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell Biol. 4:2929-2931), a

dhfr gen, který et al., EMBO J.	konferuje rezistenci na 2(7):1099-1104 (1983) ) .	methotrexat (Bourouis
(1) Konstrukce	vektorů vhodných pro	transformací	pomocí
Agrobacterium
Řada vektorů	je použitelná pro	transformaci	pomocí

Agrobacterium tumefaciens. Tyto vektory většinou nesou nejméně jednu T-DNK hraniční sekvenci a zahrnují vektory jako je pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). Dále je popsána konstrukce dvou typických vektorů.

Konstrukce pCIB200 a pCIB2001

Binární vektory pCIB200 a pCIB2001 jsou užívány pro konstrukci rekombinantních vektorů použitelných spolu s Agrobacterium a byly konstruovány následujícím způsobem. PTJS75kan byl vytvořen štěpením Narl pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164:446-455 (1985)), což umožňuje excizi genu nesoucí rezistenci na tetracyklin. Pak následuje inzerce AccI fragmentu z plazmidu pUC4K, který nese NPTII (Messing & Vierra, Gene 19:259-268 (1982); Bevan et al., Nátuře 304:184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266-276 (1990)). Xhol linkry byly ligovány k EcoRV fragmentu, který obsahuje pravou a levou T-DNK hraniční sekvence, rostlinný selektovatelný nos/nptll chimérický gen a pUC polylinker (Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987)), a restriktázou Xhol štěpený fragment byl klonován do Sáli štěpeného pTJS75kan za účelem vytvoření pCIB200 (EP 0 332 104, příklad 19 [1338]). pCIB200 obsahuje v polylinkru následující restrikční místa: EcoRI, Sstl, KpnI, BglII, Xbal a Sáli. pCIB2001 je odvozen od pCIB200, je vytvořen inzercí dalších restrikčních míst do polylinkru. Vyskytují se v něm tyto restríkční místa: EcoRi, Sstl, KpnI, BglII, Xbal, Sall, MLUI, Bell, AvrlI, Apal, Hpal a Stul. PCIB2001 také obsahuje rostlinnou a bakteriální selekci na kanamycin, levou a pravou T-DNK hraniční sekvence pro transformaci zprostředkovanou Agrobakterium, trfA odvozený z RK2 pro mobilizaci mezi E. coli a dalšími hostiteli a OriT a OriV funkce také odvozené z RK2. Polylinker pCIB2001 je vhodný pro klonování rostlinných expresivních kazet, které obsahují jejich vlastní regulační signály.

Konstrukce pCIBlO a jeho na hygromycin selekčních derivátů

Binární vektor pCIBlO obsahuje gen kódující rezistenci na kanamycin pro selekci v rostlinách, pravou a levou T-DNK hraniční sekvence a inkorporované sekvence z plazmidu pRK252, který je použitelný v širokém rozmezí hostitelů. Tyto sekvence umožňují replikaci v E. coli i v Agrobacterium. Jeho konstrukce je popsána Rothsteinem et al., Gene 53:153-161 (1987)). Byly konstruovány různé deriváty odvozené od pCIBlO, které mají inkorporovaný gen pro hygromycin B fosfotransferázu (Grity et al., Gene 25:179-188 (1983)). Tyto deriváty umožňují selekci buněk transgenických rostlin pouze na hygromycin (pCIB743) nebo na hygromycin a kanamycin (pCIB715, pCIB717) (Rothstein et al., Gene 53:153-161 (1987) ) .

(2) Konstrukce vektorů vhodných pro transformaci bez použití Agrobacterium.

Transformace bez použití Agrobacterium tumefaciens obchází požadavek na T-DNK sekvence ve vybraném transformačním vektoru a proto vektory, kterým tyto sekvence chybí mohou být využívány vedle vektorů, takových jako je ten co byl výše popsán a co obsahuje T-DNK sekvence.Transformeční metody, které nevyužívají Agrobacterium, zahrnují transformace pomocí ostřelování částicemi, příjem do protoplastu ( např. PEG a elektroporace) a mikroinjektáž. Volba vektoru závisí většinou na preferované selekci vhodné pro druhy, které jsou transformovány. Dále je popsána konstrukce některých vektorů.

Konstrukce pCIB3064 pCIB3064 je vektor odvozený z vektoru pUC, vhodný pro metody přímého transferu genu v kombinaci se selekcí na herbicid basta (nebo fosfinotricin). Plazmid pCIB246 obsahuje CaMV 35S promotor v operační fůzi s genem GUS z E. coli a CaMV 35S terminátor transkripce a je popsán v PCT přihlášce WO 93/07278. 35S promotor tohoto vektoru obsahuje dvě ATG sekvence 5'-konce startovacího místa. Tyto místa byla mutována za použití standardní PCR metody takovým způsobem, jako je odstranění ATG a vytvoření SspI a PvuII restrikčních míst. Nová restrikční místa byly 96 a 37 bp daleko od jediného Sáli místa a 101 a 42 bp daleko od skutečného startovacího místa. Výsledný derivát pCIB246 byl označen pCIB3025. GUS gen byl pak vystřižen štěpením pCIB3025 restrikčními enzymy Sáli a Sací. Konce buly zarovnány a gen byl znovu ligován za účelem vytvoření plazmidu pCIB3060. Plazmid pJIT82 byl získán z John Innes Centre, Norwich a 400 bp fragment, obsahující bar gen z Streptomyces virichromogenes byl vystřižen a vnesen do Hpal místa vektoru pCIB3060 (Thompson et al., EMBO J.6:2519-2523 (1987)). Takto vznikl pCIB3064, který obsahuje bar gen, jenž je kontrolován CaMV 35S promotorem, a terminátor pro selekci na herbicid, gen nesoucí rezistenci na ampicilin (pro selekci v E. coli) a polylinker s restrikčními místy Sphl, Pstl, HindlII a BamHI.

Tento vektor je vhodný pro klonování rostlinných expresivních kazet, které obsahují jejich vlastní regulační signály.

Konstrukce pSOG19 a pSOG35 pSOG35 je transformační vektor, který využívá jako selekční markér gen dihydrofolatové reduktázy (DHFR). Tento gen propůjčuje rezistenci na methotrexat. Pomocí PCR byl amplifikován promotor 35S (-800 bp) , intron 6, který pochází z Adhl genu kukuřice (-550 bp) [Lou et al., Plant J. 3:393403, 1993; Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12:3983-4000, 1984] a 18 bp nepřekládané vedoucí sekvence genu GUS z pSOGlO. Dále byl amplifikován PCR 250 bp velký fragment, který kóduje gen dihydrofolátové reduktázy typu II z E. coli. Tyto dva fragmenty byly spojeny s Sacl-Pstl fragmentem z pBI22l (Clontech), který obsahuje základní řetězec z vektoru pUC19 a terminátor nopalinové syntetázy. Spojením těchto fragmentů vznikl pSOG19, který obsahuje 35S promotor ve fůzi s íntronem 6, s vedoucími sekvencemi GUS genu, s genem DHFR a terminátorem nopalinové syntetázy. Záměnou vedoucí sekvence GUS genu v pSOG19 za vedoucí sekvenci viru chloritické skvrnitosti kukuřice (MCMV) vznikl vektor pSOG35. pSOG19 a pSOG35 nesou pUC gen kódující rezistenci na ampicilin a mají Hindill, Sphl, Pstl a EcoRI restrikční místa, která jsou vhodná pro klonování cizích sekvencí.

pSOG 10

Tento vektor exprimující β-glucuronidázu (GUS) byl odvozen z plazmidu pBI121, získaný z Clontech Laboratories, Palo Alto, California. Z plazmidu pB428 byl amplifikován pomocí PCR intron 6 kukuřičného Adhl genu, jak popisuje Bennetzen et al. , Proč. Nati.Acad. Sci., USA 81:4125-4128 (1987). Pří této amplifikaci byly použity primery SON0003 a

SON0004.

30N0003: 5'-CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG-3'

SON0004: 5'-ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG-3'

Produkt PCR byl štěpen restrikční endonukleázou BamHI, BamHI místo se nachází na 5'-konci každého PCR primerů. Výsledný fragment DNK byl purifikován na agarózovém gelu a ligován do BamHI místa pBI121, které se nachází mezi promotorem CaMV35S a GUS genem.Ligovaná DNK byla transformovaná do E. coli a klony s Adhl intronem 6, který má stejnou orientaci jako GUS gen, byly identifikovány restrikční analýzou.

pSOG19

Tento vektor exprimující dihydrofolatovou reduktázu (DHFR) vznikl fůzí promotoru 35S a Adhl intronu 6 z vektoru pSOGlO s genem DHFR, který pochází z plazmidu pHCO, popsaný v Bourouis a Jarry, EMBO J. 2:1099-1104 (1983). Promotor 35S a Adhl intron 6 byl vytvořen amplifikaci PCR fragmentu pocházející z vektoru pSOGlO, byly použity primery SON0031 a SONOOIO.

SON0031: 5'-CATGAGGGACTGACCACCCGGGATC-3'

SONOOIO: 5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'

Výsledný fragment byl štěpen restrikčními endonukleázami Pstl a BspHI a byl purifikován na agarózovém gelu.

Oblast kódující DHFR byla vytvořena PCR amplifikaci pHCO za použití primerů SON0016 a SON0017.

SON0016: 5'-GCTACCATGGCCACATAGAACACC-3'

SON0017: 5'CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3'

Výsledný fragment byl štěpen restrikčními endonukleázami Nsol a Sací a purifikován na agarozovém gelu.

Oba fragmenty výše popsané byly ligovány do fragmentu vektoru vytvořeného štěpením vektoru pBI121 restrikčními endonukleázami Pstl a Sací. Takto vzniklý fragment je 3 kb velký a obsahuje oblast Nos terminátoru a oblast pUC19 z vektoru pBI121 a byl purifikován na agarozovém gelu. Tato třícestná ligace spojila 35S promotor-Adhl intron β-DHFR genNos terminátor ve správném pořadí a se správnou orientací, což zaručuje funkční expresi v rostlinách.

pSOG30

Tento vektor exprimující GUS byl odvozen z pSOGlO inzercí vedoucí sekvence viru chloritické skvrnitosti kukuřice (MCMV), popsáno v Lommel et al., Virology 181:382385 (1991) , třícestnou ligací do nepřekládané vedoucí sekvence 35S-GUS genu.

Syntetizované řetězce 17 bp velké vedoucí sekvence MCMV kapsidového proteinu plus příslušná restrikční místa byly spojeny. V7sledný dvouřetězovýfragment byl štěpen endonukleázami BamHI a Ncol a purifikován na akrylamidovém gelu.

Oblast kódující GUS gen byla amplifikována pomocí PCR za použití primerů SON0039 a SON0041 a vektor pBI121 byl použit jako templát.

SON0039: 5'-CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA-3 SON0041': 5'-ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3'

Tyto primery přičlenily Ncol restrikční místo k 5'-konci genu GUS a Sací místo k 3'-konci genu GUS. Výsledný fragment byl štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a Sací a byl purifikován na agarozovém gelu.

GUS gen byl vyjmut z plazmidu pSOGlO štěpením restrikční endonukleázou Sací a částečným štěpením s endonukleázou BamHI. Výsledný vektor, který má BamHI a Sací místa, kde je inzert kódující oblasti za 35S promotorem-Adhl intronem 6, byl purifikován na agarozovém gelu.

Tyto tři fragmenty výše popsané byly ligovány třícestnou ligací ke genovou fůzí vytvořené struktuře: 35S promotor-Adhl íntron 6-MCMV vedoucí sekvence-Nos terminátor, vše se vyskytuje v základním řetězci z vektoru pUC19.

pSOG35

Vektor nesoucí DHFR selekční markér je identický jako pSOG19, s výjimkou, že MCMV vedoucí sekvence je vložena do nepřekládané vedoucí sekvence DHFR genu za účelem zesílení translace. Tato struktura byla vytvořena ve dvou krocích. Nejdříve oblast kódující GUS ve vektoru pSOG32, což je stejný vektor jako je pSOG30 s výjimkou, že obsahuje spíše modifikovaný Adh promotor než 35S, byla nahrazena oblastí kódující DHFR z vektoru pSOG19, excizí GUS genu pomocí restrikčních endonukleáz Ncol a Sací a ligací do DHFR genu jako NcoI-SacI fragment. Výsledek je vektor pSOG33, který nese genovou strukturu Adh promotor-Adhl intron 6- vedoucí sekvence MCMV-DHFR kódující oblast-Nos terminátor. Tato struktura má BglII místo mezi promotorem a intronem a Sací místo mezi kódující oblastí a terminátorem. BglII-SacI fragment byl izolován štěpením pomocí restrikčních endonukleáz a byl purifikován na agarozovém gelu a ligován do

BamHI a Sací míst vektoru pSOG30, místo Adhl intron 6-MCMV vedoucí sekvence-DHFR kódující oblasti vektoru pSOG33.

Příklad 21:

Konstrukce rostlinných expresivních kazet.

Genové sekvence zamýšlené pro expresi v transgeníckých rostlinách jsou nejdříve spojeny do expresivních kazet, tak, že před nimi leží vhodný promotor a za nimi vhodný terminátor transkripce. Tyto expresivní kazety mohou být jednoduše přeneseny do rostlinných transformačních vektorů jak je popsáno v příkladu 19.

Výběr promotoru

Výběr promotoru užívaného v expresivních kazetách je určen prostorovým a časovým expresivním paternem transgenu v transgenických rostlinách. Selektované promotory exprimují transgeny ve specifických buněčných typech (jako jsou listové epidermální buňky, mezofylové buňky, buňky kořenového kortexu) nebo ve specifických tkáních a orgánech (např. kořeny, listy nebo květy) a tento výběr bude záviset na požadované lokaci exprese transgenu. V jiném případě vybraný promotor může regulovat expresi genu, který je pod světlem indukovaným nebo jinak regulovaným promotorem. Další alternativa je, že vybraný promotor je chemicky regulován, což umožňuje indukovat expresi transgenu pouze po ošetření chemickým induktorem.

Terminátory transkripce

Řada terminátorů transkripce jsou dostupné pro použití v expresních kazetách. Tyto terminátory jsou zodpovědné za ukončení transkripce transgenu a jeho správnou polyadenilaci. Příslušné transkripční terminátory a ty, o nichž je známo, že fungují v rostlinách, zahrnují CaMV 35S terminátor, tmi terminátor, terminátor nopalinové syntetázy a rbcS E9 terminátor hrášku. Tyto terminátory mohou být použity jak v jednoděložních tak i v dvouděložních rostlinách.

Sekvence pro regulaci nabo zvýšení exprese

O řadě sekvencí je známo, že zesilují expresi genu z transkripční jednotky. Tyto sekvence mohou být použity v konjugaci s geny tohoto vynálezu za účelem zvýšení síly jejich exprese v transgenických rostlinách.

Různé intronové sekvence zesilují expresi, zvláště v jednoděložních rostlinách. Například introny kukuřičného genu Adhl, jsou-li vneseny do buněk kukuřice, podstatně zvyšují expresi genu divokého typu, která je regulována jeho promotorem. Intron 1 je zvláště účinný. Zesiluje expresi, jeli v konstrukcích spojen s genem chloramfenikolové acetyltransferázy (Callis et al., Genes Develop.1:1183-1200 (1987)). Intron z kukuřičného genu bronze 1 podobně zesiluje expresi ve stejném pokusném systému (Callis et al., supra). Sekvence intronu jsou rutině vkládány do rostlinných transformačních vektorů, většinou do nepřekládané vedoucí sekvence.

Řada nepřekládaných vedoucích sekvencí pocházející z virů také zesiluje expresi. Tyto sekvence jsou zvláště účinné v buňkách dvouděložních rostlin. Vedoucí sekvence z tabákového mozajkového viru (TMV, W-sekvence) , viru chloritické skvrnitosti kukuřice (MCMV) a mozajkového viru vojtěšky (AMV) jsou účinné při zesílení exprese (např. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15:8693-8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15:65-79 (1990)).

Směrování genových produktů do buněk

V rostlinách existují různé mechanizmy pro směrování genových produktů. Sekvence, které řídí tyto mechanizmy, jsou zde charakterizovány v některých detailech. Například, směrování genových produktů do chloroplastu je řízeno signální skevenci, která se nachází v N-konci různých proteinů a která je štěpena během chloroplastového importu, jenž umožňuje dozrání proteinu (např. Comai et al., J. Biol. Chem. 263:15104-15109 (1988)). Tyto signální sekvence mohou být fúzovány k produktům heterogenních genů a mohou ovlivnit import heterogenních produktů do chloroplastu (van den Brock et al., Nátuře 313:358-363 (1985)). DNK, kódující příslušné signální sekvence, může být izolována z 5'-konce cDNK, jenž kódují RUBISCO protein, CAB protein, EPSP syntetázový enzym, GS2 protein a mnoho dalších proteinů, jenž jsou lokalizovány v chloroplastu.

Další genové produkty mohou být směrovány do jiných organel jako jsou mitochondrion a peroxisom (např. Unger et al., Plant Molec.Biol. 13:411-418 (1989)). cDNK kódující tyto produkty mohou být manipulovány za účelem směrování produktů heterogenních genů do zmíněných organel. Příklady takových sekvencí jsou v jádru kódované ATPázy a specifické izoformy aspartátové aminotransferázy určené pro mitochondrie. Směrování buněčných proteinů popisuje Rogers et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:6512-6516 (1985)).

Dále byly charakterizovány sekvence, které způsobují směrování genových produktů dodalších buněčných částí. Sekvence N-konce jsou zodpovědné za směrování do ER, do apoplastu a za extracelulární sekrecí z buněk lepku (Koehler & Ho, Plant Cell 2:769-783 (1990)). Sekvence N-konce konjugované se sekvencemi c-konce odpovídají za a směrování genových produktů do vakuol (Shinshi et al., Plant Molec.

Biol. 14:357-368 (1990)) .

Fůzí příslušných výše popsaných sekvencí se sekvencemi transgenu je možné směrovat produkt transgenu do libovolné organely nebo buněčné části. Za účelem směrování do chloroplastu je příslušná chloroplastovásignální sekvence z genu RUBISCO a CAB genu, z genu EPSP syntetázy nebo z GS2 genu fúzována do rámce s ATG N-konce transgenu. Selektovaná signální sekvence by měla zahrnovat známé štěpící místo a vytvořená fůze by měla brát v úvahu libovolnou aminokyselinu za místem štěpení, která je pro štěpení nutná. V některých případech tento požadavek může být zajištěn vnesením malého množství aminokyselin mezi štěpící místo a ATG transgenu nebo v jiném případě záměnou některých aminokyselin v sekvencích transgenu. Účinnost fůzí konstruovaných pro import do chloroplastu může být testována in vitro translací přepisovaných konstrukcí ín vitro, což je následováno in vitro příjmem chloroplastu za použití metod popsaných (Bartlett et al., v: Edelmann et al (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier. Pp 1081-1091 (1982); Wasmann et al., Mol. Gen. Genet. 205:446-453 (1986)). Tyto dobře známé konstrukční metody jsou stejně aplikovatelné jak v mitochondriu tak i peroxizomech. Volba směrování, která může být žádána pro expresi transgenů, závisí na buněční lokalizaci prekurzoru. Tento prekurzor je nutný jako počáteční místo pro danou cestu. Jedná se obvykle o cytosolický nebo chloroplastový, ačkoliv může být v některých případech i mitochondriální nebo peroxizomální. Produkty exprase transgenů normálně nevyžadují směrování do ER, apoplastu nebo vakuol.

Výše popsaný mechanizmus buněčného směrování může být využíván ne pouze v konjugaci s jejich podobným promotorem, ale také v konjugaci s heterolognímy promotory, které ovlivňují specifické buněčné směrování za podmínek transkribční regulace promotoru, jehož expresní patern je odlišný od paternu promotoru, od něhož je směrovací signál odvozen.

Příklad 22:

Transformace dvouděložných rostlin

Metody transformace dvouděložných rostlin jsou dobře známy a zahrnují metody zprostředkované Agrobacterium a metody, které nepotřebují Agrobacterium. U metody bez účasti Agrobecterium dochází k příjmu exogenního genetického materiálu přímo protoplasty nebo buňkami. Toto může byt uskutečněno pomocí PEG nebo elektroporací, ostřelováním částicemi nebo mikroinjektáží. Příklady těchto metod jsou popsány Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4:1001-1004 (1986) a Klein et al., Nátuře 327:70-73 (1987). V každém případě transformované buňky použitím standardních metod dorůstají v celé rostliny.

Transformace zprostředkovaná Agrbacterium je preferována v případech transformací dvouděložních rostlin, protože je vysoce účinná a je široce využitelná pro mnoho různých druhů rostlin. Řada různých plodin zahrnující tabák, rajčata, slunečnice, bavlnu, řepku olejnou, brambory, sóju, vojtěšku a topoly (EP 0 317 511 (bavlna), EP 0 249 432 (rajčata, Calgene), WO 87/07299 (Brassice, Calgene), US 4,795,855 (topol)) jsou rutině transformovány pomocí Agrobacterium. Tento způsob transformace typicky zahrnuje přenos binárního vektoru nesoucího cizorodou DNK (např. pCIB200 nebo pCIB2001) do příslušného kmene Agrobacterium, jehož volba závisí na komplementu vir genů nesených hostitelským kmenem Agrobacterium buď na plazmidů Ti nebo na chromozomu (např. kmen CIB542 pro pCIB200 a pCIB2001 (Uknes et al., Plant Cell 5:159-169 (1993)). Přenos rekombinantního binárního vektoru do Agrobacterium je uskutečněn triparentálním kopulačním způsobem za použití E. coli nesoucího rekombinantní binární vektor a pomocného kmene E. coli, který nese plazmid jako je pRK2013 a který je schopný mobilizovat rekombinantní binární vektor do cílového kmene Agrobakterium. V jiném případě rekombinantní binární vektor může být přenesen do Agrobacterium transformací DNK (Hdfgen & Willmitzer, Nuci. Acids Res. 16:9877 (1988)).

Transformace cílových rostlinných druhů pomocí rekombinantního Agrobacterium obvykle zahrnuje kultivaci Agrobacterium s explanty pocházející z rostliny a dále se postupuje podle dobře známých protokolů. Transformovaná tkáň, která obsahuje na herbicid nebo antibiotikum rezistentní markér mezi T-DNK hraničními sekvencemi na binárním plazmidů, je regenerovaná na selekčním mediu.

Příklad 23:

Transformace jednoděložných rostlin

Transformace většiny monoděložních druhů sa také stává rutinou. Preferovanou metodou je přímý transfer genu do protoplastů za použití PEG nebo elektroporace a do tkáně kalusu ostřelováním částicemi. Transformace mohou probíhat s

DNK jednoho kotransformace) druhu nebo s DNK více Obě tyto metody jsou vhodné tomto vynálezu. Ko-transformace má tu výhodu, druhů (t.j. pro použití v že lze obejít komplexní konstrukci vektoru a lze vytvořit transgenické rostliny s nespojenými loky pro gen a selekční markér a lze v následujících generacích odstranit selekční markér, jestli je to požadováno. Nevýhodou použití ko-transformace je nižší frekvence než 100%, se kterou je separovaná DNK integrovaná do genomu (Schocher et al., Biotechnology 4:1093-1096 (1986) ) .

Patentové přihlášky EP 0 292 435 (Ciba-Geigy), EP 0 392 225 (Ciba- Geigy) a WO 93/07278 (Ciba-Geigy) popisují metody přípravy kalusu a protoplastů z elitní imbrední linie kukuřice, transformaci protoplastů použitím PEG nebo elektroporace a regeneraci rostlin kukuřice z transformovaných protoplastů. Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990)) a Fromm et al., Biotechnology 8:833-839 (1990) publikovali metody pro transformaci A188 odvozené kukuřičné linie za použití ostřelování částicemi. Přihláška WO 93/07278 (Ciba-Geigy) a Koziel et al., Biotechnology 11:194-200 (1993)) popisuje transformaci elitních imbredních linií kukuřice pomocí metody ostřelování částicemi. Tato metoda využívá nezralá embrya kukuřice o délce 1,5 až 2,5 mm excizovaná z kukuřičného klasu 14 až 15 dnů po opylení. Pro ostřelování byl použit přístroj PDS-lOOOHe Biolistics.

Transformace rýže může probýhat metodami přímého přenosu genu za využití protoplastů a ostřelování částicemi. Transformace zprostředkovaná protoplasty byla popsána pro rýži typu Japonica a Indica (Zhang et al., Plant Cell Rep. 7: 379-384 (1988); Shimamoto et al., Nátuře 338:274-277 (1989); Datta et al., Biotechnology 8:736-740 (1990)). Oba typy jsou rutině transformovatelné použitím metody ostřelování částicemi (Christou et al., Biotechnology 9:957-962 (1991)).

Přihláška patentu EP 0 332 581 (Ciba-Geigy) popisuje metody pro generaci, transformaci a regeneraci Pooideae protoplastu. Tyto metodu umožňují transformaci Dactylis a pšenice. Transformace pšenice do buněk typu C dlouhodobě regenerovatelného kalusu byla popsána Vasil et al., Biotechnology 10:667-674 (1992)) za použití metody ostřelování částicemi. Také (Vasil et al., Biotechnology 11:1553-1558 (1993) a Weeks et al., Plant Physiol. 102:10771084 (1993)) popisuje ostřelování částicemi nezralých embryí a kalusu z nezralých embryí. Pro transformaci pšenice je preferovaná metoda, kde nezralá embrya jsou ostřelována částicemi spolu s krokem, kdy embrya před příjmem genu jsou vystavena vysoké koncentraci sacharozy nebo maltózy. Před ostřelováním libovolné množství embryí (o délce 0,75-1 mm) je naneseno na plotnu s MS mediem s 3% sacharozou (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum 15:473-497 (1962)) a 3 mg/1 2,4D za účelem indukce somatických embryí, které takto přežívají ve tmě. V den ostřelování jsou embrya odebrány z indukčního media a jsou umístěny na osmoticum (t.j. indukční medium se sacharozou nebo maltozou v požadované koncentraci, většinou 15 %) . Embrya plazmolyzují 2 až 3 hodiny a pak jsou ostřelovány. Většinou se dává 20 embryí na cílovou plotnu, není to však kritický počet. Příslušný plazmid nesoucí gen (jako je pCIB3064 nebo pSG35) je standardní metodou precipitován na zlatých mikrometrových částicích. Každá plotna s embryi je ostřelována DuPont Biolistics'heliovým přístrojem za použití průrazného tlaku -1000 psi a standardního síta s 80-ti oky. Po ostřelování jsou embrya umístěna zpět do tmy a nechají se zpamatovat asi 24 hodin (stále na osmotikum). Po 24 hodinách jsou embrya vyjmuta z osmotika a umístěna zpět na indukční medium, kde zůstanou po dobu asi jednoho měsíce před regenerací. Přibližně o měsíc později jsou embryonální explanty s vyvíjejícím se embryogenním kalusem přeneseny do regeneračního media (MS+1 mg/1 NAA, 5mg/l GA) , které dále obsahuje příslušné selekční agents (10 mg/1 basta v případě pCIB3064 a 2 mg/1 methotrexatu v případě pSOG35). Po přibližně jednom měsíci vyvinuté pupeny jsou přeneseny do velkých sterilních nádob, známých jako GA7které obsahují na polovinu ředěné medium MS, 2% sacharozu a stejnou koncentraci selekčního agents. Patentová přihláška 08/147,161 popisuje metody transformace pšenice a je zde vložena jako reference.

Příklad 24:

Plazmid pWDC-4 kódující chloroplastový protox enzym kukuřice je transformován do náhodně mutagenizovaného kmene XLl-Red (Stratagene, Lo Jolla, CA). Transformanty jsou naneseny na plotnu s L mediem, které obsahuje 50 mg/1 ampicilinu a jsou inkubovány 48 hodin při 37° C. Porost transformovaných buněk je seškrábnut z ploten a je připravena plazmidová DNK pomocí Wizard Megaprep sady (Promega, Madison, WI) . Plazmidová DNK izolovaná z tohoto mutovaného kmene pravděpodobně obsahuje přibližně jednu nahodile zaměněnou bázi na 2000 nukleotidů (green et al., Strategies 7(2):32-34 (1994)).

Mutovaná plazmidová DNK je přenesena do hemG mutantu SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)) a ten je nanesen na plotnu obsahující L medium s 100 g/ml ampicilinu a dále na plotny, které obsahují různé koncentrace protox inhibujícího herbicidu. Plotny jsou imkubovány 2 až 3 dny při teplotě 37°C. Plazmidová DNK je izolována ze všech kolonií, které rostou v přítomnosti koncentrací herbicidu, jenž účine zabíjejí kmen divokého typu. Izolovaná DNK je pak transformována do SASX38 a je nanesena na plotnu s herbicidem za účelem potvrzení rezistence nesené na plazmidu.

Mutovaná DNK plazmidu pWDC-4 je opět izolována z rezistentních kolonií a protox kódující sekvence je vystřižena štěpením EcoRi a Xhol. Excizovaná protox kódující sekvence je pak znovu klonována do nemutogenizovaného vektoru pBluescript a znovu testována na rezistenci na protox inhibující herbicid stejným způsobem jak je shora popsáno.

Tento proces eliminuje mutace nekódujících sekvencí, které propůjčují rezistence, takové jako up-promotor mutanty (t.j. mutanty, jejichž rezistence je způsobena mutacemi, jejichž následkem zesílila exprese nemodifikovaného protoxu) a zůstávají pouze mutanty, jejichž rezistence je způsobena mutacemi v sekvenci kódující protox. Je určena DNK sekvence pro všechny putativní na herbicid tolerantní protox geny identifikovaná pomocí popsaného procesu a mutace jsou odhaleny srovnáním mutované sekvence se pWDC-4 protox metody byla identifikována která konvertuje C na T (SEQ ID č. : 5) .

pMzC-lVal. Tato

Plazmid záměna (SEQ ID sekvencí divokého typu.

Použitím zhora popsané rezistence způsobená mutací, nukleotidu 498 v pWDC-4 sekvenci nesoucí tuto mutaci byloznačen konvertuje GCT kodon pro alanin v aminokyselině 166

č.:6) na GTT kodon pro valin. Výsledkem je protox enzym, který je v bakteriálním testu nejméně lOx více rezistentní na protox inhibující herbicid.

PMzC-Val ve vektoru pBluescript byl uložen 30.9.1994 pod označením pWDC-8 v Agricultural Research Culture Collection a přístupové označení je NRRL#21340.

Stejná strategie byla použita pro vyhledávání na herbicid rezistentních forem Arabidopsis Protox-1 genu v různých vektorech. Byla identifikována jedna rezistenci způsobující mutace. Jde o záměnu C na T v nukleotidu 689 v sekvenci v pWDC-2 (SEQ ID č.: 1); tento plazmid byl označen pAraC-lVal. Tato záměna je identická jako v mutantu pMzClVal, konvertuje GCT kodon pro alanin v aminokyselině 220 (SEQ ID č.: 2) na GTT kodon pro valin v pozici, která koresponduje s pozicí v Arabidopsis protox proteinové sekvenci.

Druhý gen nesoucí rezistenci obsahuje záměnu A na G v nukleotidu 1307 v sekvenci pWDC-2 (SEQ ID č.:1); tento plazmid je označen pAraC-2Cys. Tato záměna konvertuje TAC kodon pro tyrosin v aminokyselině 426 (SEQ ID č.:2) na TGC kodon pro cystein. Korespondující kodon pro tyrosin v protox1 sekvenci kukuřice v nukleotidové pozici 1115-1117 (SEQ ID č.:5; pozice aminokyseliny 372 SEQ ID č.:6) může být podobně mutován za účelem vytvoření na herbicid rezistentní formy tohoto enzymu.

Třetí rezistentní mutant má záměněný G za A v nukleotidové pozici 691 v sekvenci pWDC-2 (SEQ ID č.:l); tento plazmid byl označen pAraC-3Ser. Tato mutace konvertuje GGT kodon pro glycin v aminokyselině 221 (SEQ ID č.:2) na AGT kodon pro serin v pozici kodonu přilehlé k mutaci v pAraC-1. Korespondující kodon pro glycin v protox-1 sekvenci kukuřice v pozici nukleotidu 497-499 (SEQ ID č.:5; pozice aminokyseliny 167 SEQ ID č.:6) může být podobně mutován za účelem vytvoření na herbicid rezistentní formy tohoto enzymu.

Výsledkem všech výše popsaných mutací je protox enzym, který je v bakteriálním testu nejméně lOx více rezistentní na protox inhibující herbicid.

PAraC-2Cys ve vektoru pFL61 byl uložen 14.11.1994 pod označením pWDC-7 v Agricultural Research Culture Collection a přístupové označení je NRRL#21339N.

Příklad 25:

Dodatečné substituce v na herbicid rezistentním kodonu v pozicích identifikovaných náhodným výběrem

Mutagenesis sady aminokyselin jsou

Aminokyseliny, které jsou náhodným výběrem identifikovány jako místa herbicidní rezistence, jsou zaměněny za jiné aminokyseliny. Pak je testována jejich funkce a tolerance k herbicidu v bakteriálním systému. Je provedena na oligonukletid směrovaná mutageneze Arabidopsis Protox-1 sekvence za použití Transformer Site-Directed (Clontech, Palo Alto, CA). Výměny potvrzeny sekvenční analýzou. Mutované plazmidy jsou přeneseny do SASX38 a mutanty jsou naneseny na L-amp¹⁰⁰ medium za účelem testování funkce a na medium z různými koncentracemi protox inhibujícího herbiciduza účelem testování jejich tolerance na herbicid.

Tento postup byl aplikován na kodon pro alanin na nukleotidy 688-690 a na kodon pro tyrosin na nukleotidy 13061308 Arabidopsis protox sekvence (SEQ ID č.:l). Výsledky ukazují, že kodon pro alanin v nukleotidech 688-690 může být změněn na kodon pro valin, treoni, leucin nebo cystein, což vede ke vzniku na herbicid rezistentnímu protox enzymu, který udrží svoji funkci. Výsledky dále demonstrují, že kodon pro tyrozin v nukleotidech 1306-1308 může být změněn na kodon pro cystein, izoleucin, valin nebo threonin, což vede ke vzniku na herbicid rezistentnímu protox enzymu, který udrží svoji funkci.

Příklad 26:

Demonstrace rezistentní mutační křížová tolerance k různým protox inhibujícím látkám

Rezistentní mutované plazmidy, selektované na rezistenci na jediný herbicid, jsou testovány s řadou dalších protox inhibujících látek. Kmen SASX38, který obsahuje plazmid divokého typu, je nanesen na plotnu s koncentrační škálou pro každou látku za účelem určení letální koncentrace těchto látek. Rezistentní mutantní plazmidy v SASX38 jsou naneseny na plotnu a je hodnocena jejich schopnost přežít působení každé látky v koncentraci, která je nejméně 10 krát vyšší než je koncentrace, která je letální pro kmen SASX38 obsahující plazmid divokého typu.

Výsledky testování křížové tolerance ukazují, že každá z identifikovaných mutací, propůjčuje toleranci k různým protox inhibujícím látkám. Výsledky zvláště ukazují, že

1) AraCl-Val mutace propůjčuje rezistenci na protox inhibitory, které zahrnují, nejsou však limitovány, ty, jenž mají vzorce IV, XI, XIII, XIV, XV a XVII;

2) AraC-2Cys mutace propůjčuje rezistenci na protox inhibitory, které zahrnují, nejsou však limitovány, ty, které mají vzorec XI, XIII, XV a XVII;

3) MzC-lVal mutace propůjčuje rezistenci na protox inhibitory, které zahrnují, nejsou však limitovány, ty, které mají vzorce XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI a XVII;

4) AraC-3Ser mutace propůjčuje rezistenci na protox inhibitory, které zahrnují, nejsou však limitovány, ty, které mají vzorce IV, XII, XIII, XIV, XV a XVII.

Příklad 27:

Produkce rostlin tolerantních k herbicidu nadměrnou expresí rostlinných protox genů

Arabidopsis Protox-1 kódující sekvence z divokého typu a z mutantních genů AraC-lVal nesoucích rezistenci jsou vystřiženy částečným štěpením endonukleázami EcoRI a Xhol a jsou klonovány do rostlinného expresivního plazmidu pCGNl761ENX. Expresivní kazety obsahující fůze 2x35S-Protox gen byly vystřiženy restrikční endonukleázou Xbal a klonovány do binárního vektoru pCIB200. Tyto binární protox plazmidy jsou přeneseny elektroporací do Agrobacterium a pak do Arabidopsis za použití metody vakuové infiltrace (Bechtold et al., 1993). Transformanty jsou selektovány na kanamycin a z řady nezávislých linií vzniklo semeno označené T2. Tato semena jsou nanesena na plotnu na GM medium, které obsahuje různé koncentrace protox inhibujícího herbicidu a je hodnoceno jejich klíčení a schopnost přežít. Řada transgenických linií, které mají nadměrnou produkci buď protoxu divokého typu nebo rezistentního mutovaného protoxu, produkuje podstatné množství zelených semenáčů v přítomnosti herbicidu o koncentraci, jenž je letální pro kontrolní rostlinu nesoucí prázdný vektor.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel:

(A)	jméno: Ciba-Gei	gy
(B)	ulice: Klybecks	tr.	141
(C)	město: Basilej
(E)	země: Švýcarsko
(F)	pošt. směr. č.	(ZIP	) :	4002
(G)	telefon: +41 61	69	11	11
(H)	telefax +41 61	696	79	76
(I)	telex: 962 991

(ii) Název vynálezu: Izolovaná molekula DNK kódující protoporfyrinogenovou oxidázu v eukaryontech, způsob její manipulace a její farmaceutické použití, vektor a hostitel.

(iii) Počet sekvencí: 20 (iv) Počítačem čitelná forma:

(A) typ media: floppy disk (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) software: Patentln Release #1.0, verze #1.25 (EPO) (2) Informace o SEQ ID č.: 1:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 1719 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetšzovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ií) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 31 1644 (C) další informace: /poznámka= protox-1 cDNK;sekvence z pWDCArabidopsis n

(xi) Popis sekvence: SEQ ID č: 1:

TGACAAAATT CCGAATTCTC TGCGATTTCC ATG GAG TTA TCT CTT CTC CGT CCG 54

Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro

5

ACG ACT CAA TCG CTT CTT CCG TCG TTT TCG AAG CCC AAT CTC CGA TTA

102

Thr Thr Gin 10

Ser Leu

Leu

Pro 15

Ser Phe Ser Lys

Pro 20

Asn

Leu

Arg

Leu

AAT

GTT

TAT

A.AG

CCT

CTT

AGA

CTC

CGT

TGT

TCA

GTG

GCC

GGT

GGA

CCA

150

Asn

Val

Tyr

Lys

Pro

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

Ser

Val

Ala

Gly

Pro

25

30

35

40

ACC

GTC

GGA

TCT

TCA

AAA

ATC

GAA

GGC

GGA

GGC

ACC

ATC

ACG

198

Thr

Val

Gly

Ser

Lys

Ile

Glu

Gly Gly

Gly

Thr

Ile

Thr

45

50

55

ACG

GA.T

TGT

GTG

ATT

GTC

GGC

GGA

GGT

ATT

AGT

GGT

CTT

TGC

ATC

GCT

246

Thr

Asp

Cys

Val

Ile

Val

Gly

Ilé

Ser

Gly

Leu

Cys

Ile

Ala

60

65

70

CAG

GCG

CTT

C-CT

ACT

AAG

CAT

CCT

GA.T

GCT

CCG

AAT

TTA

ATT

GTG

294

Gin

Ala

Leu

řla

Thr

Lys

Kis

Pro

Asp

A.la

A-la

Pro

Asn

Leu

Ile

Val

75

80

85

ACC

GA.G

GCT

AAG

GAT

CGT

GTT

GGA

GGC

AAC

ATT

ATC

ACT

CGT

GAA

GAG

342

Thr

Glu

A-la

Lys

Asp

Arg

val

Gly

Asn

Ile

Thr

Arg

Glu

90

95

100

AAT

GGT

TTT

CTC

TGG

GAA

GGT

CCC

AAT

AGT

TTT

CAA

CCG

TCT

GAT

390

Asn

Gly

Phe

Leu

Trp

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gin

Pro

Ser

Asp

105

110

115

120

CCT

ATG

CTC

ACT

ATG

GTG

GTA

GAT

AGT

GGT

TTG

AAG

GA.T

GAT

TTG

GTG

438

Pro

Met

Leu

Thr

Met

Val

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp

Leu

Val

125

130

135

TTG

GGA

GAT

CCT

ACT

GCG

CCA

AGG

TTT

GTG

TTG

TGG

AAT

GGG

AAA

TTG

48 6

Leu

Gly

Asp

Pro

Thr

Ala

Pro

Arg

Phe

Val

Leu

Trp

Asn

Gly

Lys

Leu

140

145

150

AGG

CCG

GTT

CCA

TCG

AAG

CTA.

ACA

GAC

TTA

CCG

TTC

TTT

GAT

TTG

ATG

534

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Leu

Thr

Asp

Leu

Pro

Phe

Asp

Leu

Met

155

160

165

AGT

ATT

GGT

C-GG

A.AG

ATT

AGA.

GCT

GGT

TTT

GGT

GCA

CTT

GGC

ATT

CGA

582

Ser

Ile

Gly

Lys

Ile

Arg

AJa

Gly

Phe

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg

170

175

180

CCG

TCA

CCT

CCA

GGT

CGT

GAA

TCT

GTG

GA.G

TTT

GTA

CGG

CGT

630

Pro

Ser

Pro

Gly

Arg

Glu

Ser

Val

Glu

Phe

Val

Arg

185 190 195 200

AAC CTC GGT GAT GAG GTT TTT GAG CGC CTG ATT GAA CCG TTT TGT TCA

678

Asn

Leu

Gly

Asp

Glu 205

Val

Phe Glu

Arg Leu 210

Ile

Glu

Pro Phe

Cys 215

Ser

GGT

GTT

TAT

GCT

GGT

GAT

CCT

TCA

AAA

CTG

AGC

ATG

AAA

GCA

GCG

TTT

726

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

Lys

Leu

Ser

Met

Lys

Ala

Phe

220

225

230

GGG

AAG

GTT

TGG

AAA

CTA

GAG

CAA

AAT

GGT

GGA

AGC

ATA

GGT

774

Gly

Lys

Val

Trp

Lys

Leu

Glu

Gin

Asn

Gly

Ser

Ile

Gly Gly

235

240

245

ACT

TTT

AAG

GCA

ATT

CAG

GAG

AGG

AAA

AAC

GCT

CCC

AAG

GCA

GAA

CGA

822

Thr

Phe

Lys

Ala

Ile

Gin

Glu

Arg

Lys

Asn

Ala

Pro

Lys

Ala

Glu

Arg

250

255

260

GAC

CCG

CGC

CTG

CCA

AAA

CCA

CAG

GGC

CAA

ACA

GTT

GGT

TCT

TTC

AGG

870

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Lys

Pro

Gin

Gly

Gin

Thr

Val

Gly

Ser

Phe

Arg

265

270

275

280

AAG

GGA

CTT

CGA

ATG

TTG

CCA

GAA

GCA

ATA

TCT

GCA

ACA

TTA.

GGT

AGC

918

Lys

Gly

Leu

Arg

Met

Leu

Pro

Glu

Ala

Ile

Ser

Ala

Atct

Leu

Gly

Ser

285

290

295

AAA

GTT

AAG

TTG

TCT

TGG

AAG

CTC

TCA

GGT

ATC

ACT

AAG

CTG

CAG

AGC

966

Lys

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu

Ser

Gly

7

Thr

Lys

Leu

Glu

Ser

300

305

310

GGA

TAC

AAC

TTA

ACA

TAT

GAG

ACT

CCA

GA.T

GGT

TTA

GTT

TCC

GTG

1014

Gly

Tyr

Asn

Leu

Thr

Tyr

Glu

Thr

Pro

Asp

Gly

Leu

Val

Ser

Val

315

320

325

CAG

AGC

AAA

AGT

GTT

GTA

ATG

ACG

GTG

CCA

TCT

CAT

GTT

GCA

AGT

GGT

1062

Gin

Ser

Lys

Ser

Val

Met

Thr

Val

Pro

Ser

His

Val

Ala

Ser

Gly

330

335

340

CTC

TTG

CGC

CCT

CTT

TCT

GAA

TCT

GCT

GCA

AA.T

GCA

CTC

TCA

AAA

CTA

1110

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Glu

Ser

Ala

Asn

Ala

Leu

Ser

Lys

Leu

345

350

355

360

TAT Tyr

TAC CCA Tyr Pro

CCA GTT Pro Val 365

GCA GCA

GTA TCT ATC

TCG TAC CCG AAA CAA GCA

1158

Ala

Val

Ser

Ile 370

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu 375

Aia

ATC

CGA

ACA

GAA

TGT

TTG

ATA

GAT

GGT

CAA

CTA

AAG

GGT

TTT

GGG

CAA

1206

Ile

Arg

Thr

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp

Gly

Glu

Leu

Lys

Gly

Phe

Gly

Gin

380

385

390

TTG

CAT

CCA

CGC

ACG

CAA

GGA.

GTT

GAA

ACA

TTA

GGA.

ACT

ATC

TAC

AGC

1254

Leu

His

Pro

Arg

Thr

Gin

Gly

Val

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr

Ile

Tyr

Ser

395 400 405

TCC TCA CTC TTT CCA AAT

CGC Arg 415

GCA CCG CCC GGA AGA ATT TTG CTG TTG

1302

Ser

Ser 410

Leu

Phe

Pro

Asn

Ala

Pro

Gly

Arg 420

Ile Leu

Leu

AAC

TAC

ATT

GGC

GGG

TCT

ACA

AAC

ACC

GGA

ATT

CTG

TCC

AAG

TCT

GAA

1350

Asn

Tyr

Ile

Gly

Ser

Thr

Asn

Thr

Gly

Ile

Leu

Ser

Lys

Ser

Glu

425

430

435

440

GGT

GA.G

TTA

GTG

CAA

GCA

GTT

GAC

AGA

GAT

TTG

AGG

AAA

ATG

CTA

ATT

1398

Gly

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp

Arg

Asp

Leu

Arg

Lys

Met

Leu

Ile

445

450

455

AAG

CCT

AAT

TCG

ACC

GAT

CCA

CTT

AAA.

TTA

GGA

GTT

AGG

GTA

TGG

CCT

1446

Lys

Pro

Asn

Ser

Thr

Asp

Pro

Leu

Lys

Leu

Gly

Val

Arg

Val

Trp

Pro

460

465

470

CAA

GCC

ATT

CCT

CAG

TTT

CTA

GTT

GGT

CAC

TTT

GAT

ATC

CTT

GAC

ACG

1494

Gin

Ala

Ile

Pro

Gin

Phe

Leu

Val

Gly

His

Phe

Asp

Ile

Leu

Asp

Thr

475

480

485

GGT

AAA.

TCA

TCT

CTA

ACG

TCT

TCG

GGC

TAC

CAA

GGG

CTA

TTT

TTG

GGT

1542

Ala

Lys

Ser

Leu

Thr

Ser

Gly

Tyr

Glu

Glv

Leu

Phe

Leu

Gly

490

495

50Ó

GGC

AAT

TAC

GTC

GCT

GGT

GTA

GCC

TTA

GGC

CGG

TGT

GTA

GAA

GGC

GCA

1590

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly

Val

Ala

Leu

Gly

Arg

Cys

Val

Glu

Gly

Ma

505

510

515

520

TAT

GAA

ACC

GCG

ATT

GA.G

GTC

AAC

TTC

ATG

TCA

CGG

TAC

GCT

TAC

1638

Tyr

Glu

Thr

Ala

Ile

Glu

Val

Asn

Phe

Met

Ser

Arg Tyr

Ma

Tyr

525

530

535

AAG TAAATGTAAA ACATTAAAGC TCCCAGCTTG CGTGAGTTTT ATTAAATATT 1691

Lys

TTGAGATATC CAAAAPAAAA AAAAAAAA

1719 (2)Informace o SEQ ID č.: 2:

(i) Charakteristika sekvencí:

(A) délka: 537 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Popis sekvence: SEQ ID č.: 2:

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Leu ,

Arg ;

Pro '

Thr '

Thr i

Gin

Ser

Leu

Pro

Ser

1

5

10

15

Phe

Ser

Lys

Pro

Asn

Leu

Arg

Leu

Asn

Val

Tyr

Lys

Pro

Leu

Arg

Leu

20

25

30

Arg

Cys

Ser

Val

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Gly

Ser

Lys

Ile

Glu

35

40

45

Gly

Thr

Ile

Thr

Asp

Cys

Val

Ile

Val

Gly

50

55

60

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu

Cys

Ile

Ada

Gin

Ala

Leu

Ada

Thr

Lys

His

Pro

65

70

75

80

Asp

Ala

Pro

Asn

Leu

Ile

Val

Thr

Glu

Ala

Lys

Asp

Arg

Val

Gly

85

90

95

Gly

Asn

Ile

Thr

Arg

Glu

Asn

Gly

Phe

Leu

Trp

Glu

Gly

100

105

110

Pro

Asn

Ser

Phe

Gin

Pro

Ser

Aso

Pro

Met

Leu

Thr

Met

Val

Asp

115

120

125

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp

Leu

Val

Leu

Gly

Asp

Pro

Thr

Ada

Pro

Arg

130

135

140

Phe

Val

Leu

Trp

Asn

Gly

Lys

Leu

Arg

Pro

Val

Pro

Ser

Lys

Leu

Thr

145

150

155

160

Asp

Leu

Pro

Phe

Asp

Leu

Met

Ser

Ile

Gly

Lys

Ile

Arg

Ada

165

170

175

Gly

Phe

Gly

Ala

Leu

Gly

Ile

Arg

Pro

Ser

Pro

Gly

Arg

Glu

180

185

190

Ser

Val

Glu

Phe

Val

Arg

Asn

Leu

Gly

Asp

Glu

Val

Phe

Glu

195

200

205

Arg

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe

Cys

Ser

Gly

Val

Tyr

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser

210

215

220

-

Lys 225

Leu

Ser

Met

Lys

Ala 230

Ala

Phe

Gly

Lys

Val 235

Trp

Lys

Leu

Glu

Gin 240

Asn

Gly

Ser

Ile 245

Ile

Gly

Thr

Phe 250

Lys

Ala

Ile

Gin

Glu 255

Auro

Lys

Asn

Ala

Pro 260

Lys

Ala

Glu

Axg

Asp 265

Pro

Arg

Leu

Pro

Lys 270

Pro

Gin

Gly

Gin

Thr 275

Val

Gly

Ser

Phe

Auro 280

Lys

Gly

Leu

Arg

Met 285

Leu

Pro

Glu

Ala

Ile 290

Ser

Ala

Arg

Leu

Gly 295

Ser

Lys

val

Lys

Leu 300

Ser

Trp

Lys

Leu

Ser 305

Gly

Ile

Thr

Lys

Leu 310

Glu

Ser

Gly

Tyr 315

Asn

Leu

Thr

Tyr

Glu 320

Thr

Pro

Asp

Gly

Leu 325

Val

Ser

Val

Gin

Ser 330

Lys

Ser

Val

Met 335

Thr

Val

Pro

Ser

His 340

Val

Ala

Ser

Gly

Leu 345

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser 350

Glu

Ser

Ala

Asn 355

Ala

Leu

Ser

Lys

Leu 360

Tyr

Pro

Val 365

Ala

Val

Ser

Ile 370

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu 375

Ala

Ile

Arg

Thr

Glu 380

Cys

Leu

Ile

Asp

Gly 385

Glu

Leu

Lys

Gly

Phe 390

Gly

Gin

Leu

His

Pro 395

Arg

Thr

Gin

Gly

Val 400

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr 405

Ile

Tyr

Ser

Ser 410

Leu

Phe

Pro

Asn

Arg 415

Ala

Pro

Gly

Arg 420

Ile

Leu

Asn 425

Tyr

Ile

Gly

Ser 430

Thr

Asn

Thr

Gly

Ile 435

Leu

Ser

Lys

Ser

Glu 440

Gly

Glu

Leu

Val

Glu 445

Ala

Val

Asp

Arg

Asp 450

Leu

Arg

Lys

Met

Leu 455

Ile

Lys

Pro

Asn

Ser 460

Thr

Asp

Pro

Leu

Lys Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gin Ala Ile Pro Gin Phe Leu Val 465 470 475 480

100

Gly

His

Phe

Asp

Ile 485

Leu

Asp

Thr

Ala

Lys 490

Ser

Leu

Thr

Ser 495

Ser

Gly

Tyr

Glu

Gly 500

Leu

Phe

Leu

Gly Gly 505

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly 510

Val

Ala

Leu

Gly

Arg 515

Cys

Val

Glu

Gly

Ala 520

Tyr

Glu

Thr

Ala

Ile 525

Glu

Val

Asn

Phe 530

Met

Ser

Arg

Tyr

Ala 535

Tyr

Lys

101

2) Informace o SEQ ID č.: 3:

(i) Charakteristiky sekvencí:

A)	délka: 1738 párů baží
B)	typ: nukleová kyselina
C)	řetězovost: jeden řetězec
D)	topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 70..1596 (C) další informace: /poznámka= Arabidopsis protox-2 cDNK; sekvence z pWDC-l (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 3:

TTTTTTA.CTT ATTTCCGTCA CTGCTTTCGA CTGGTCACAG A.TTTTCACTC TGAATTGTTG

CAGATAGCA ATG GCG TCT GGA GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT CAA GCG Met Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp His Gin Ile Glu Ala

5 ' 10

GTT TCA Val Ser 15

GCA Gly

AAA. Lys

AGA GTC

GCA GTC GTA

GGT GCA GGT

GTA AGT

GGA CTT Gly Leu

Arg

Val

ACa 20

Val

Gly .Ala

Gly 25

Val

Ser

GCG

GCT

TA.C

AAG

TTG

AAA.

TCG

AGG

GGT

TTG

AAT

GTG

ACT

GTG

TTT

Ala

Tyr

Lys

Leu

Lys

Ser

Arg

Gly

Leu

Asn

Val

Thr

Val

Phe

30

35

40

45

CAA

GCT

GAT

GCA

AGA.

GTA

GGT

GGG

AAG

TTG

AGA.

AGT

GIT

ATG

CAA

AAT

Glu

Ala

Asp

Gly

Arg

Val

Gly

Lys

Leu

Arg

Ser

Val

Met

Gin

Asn

50

55

60

GGT

TTG

A.TT

TC-G

CAT

GAA.

GCA

AAC

ACC

ATG

ACT

GA.G

GCT

GAG

CCA

Gly

Leu

Ile

Trp

Asp

Glu

Gly

Ala

Asn

Thr

Met

Thr

Glu

ACa

Glu

Pro

65

70

75

GAA

GTT

GCG

AGT

TTA

CTT

GAT

CTT

GGG

CTT

CGT

GA.G

AAA

CAA

Glu

Val

Gly

Ser

Leu

Asp

Leu

Gly

Leu

TArg

Glu

Lys

Gin

80

85

90

TTT

CCA.

ATT

TCA

CAG

AAA

AAG

CGG

TAT

ATT

GTG

CGG

AAT

GGT

GTA

CCT

Phe

Pro

Ile

Ser

Gin

Lys

Arg

Tyr

Ile

Val

Ausg

Asn

Gly

Val

Pro

108

156

204

252

300

348

396

100 105

102

GTG ATG CTA

CCT ACC Pro Thr

AAT Asn 115

CCC ATA GA.G CTG GTC ACA AGT AGT GTG CTC

444

Val 110

Met Leu

Pro lle

Glu Leu

Val 120

Thr

Ser Ser

Val

Leu 125

TCT

ACC

CAA

TCT

AAG

TTT

CAA

ATC

TTG

GAA

CCA

TTT

TTA

TGG

AAG

492

Ser

Thr

Gin

Ser

Lys

Phe

Gin

lle

Leu

Glu

Pro

Phe

Leu

Trp

Lys

130

135

140

AAA

AAG

TCC

TCA

AAA

GTC

TCA

GAT

GCA

TCT

GCT

GAA

AGT

GTA

AGC

540

Lys

Ser

Lys

Val

Ser

Asp

Ala

Ser

Ala

Glu

Ser

Val

Ser

145

150

155

GAG

TTC

TTT

CAA

CGC

CAT

TTT

GGA

CAA

GAG

GTT

GAC

TAT

CTC

ATC

588

Glu

Phe

Gin

Arg

His

Phe

Gly

Gin

Glu

Val

Asp

Tyr

Leu

lle

160

165

17*0

GAC

CCT

TTT

GTT

GGT

GGA

ACA

AGT

GCT

GCG

GAC

CCT

GAT

TCC

CTT

TC?.

636

Asp

Pro

Phe

Val

Gly

Thr

Ser

Ala

Asp

Pro

Asp

Ser

Leu

Ser

175

180

185

ATG

AAG

CAT

TCT

TTC

CCA

GAT

CTC

TGG

AAT

GTA

GAG

AAA

AGT

TTT

GGC

634

Met

Lys

His

Ser

Phe

Pro

?Sp

Leu

Trp

Asn

Val

Glu

Lys

Ser

Phe

Gly

190

195

200

205

TCT

ATT

ATA

GTC

GGT

GCA

ATC

AGA

ACA

AAG

TTT

GCT

AAA

GGT

732

Ser

lle

Val

Gly

Ala

lle

Arg

Thr

Lys

Phe

Ala

Lys

Gly

210

215

220

AAA

AGT

AGA

GAC

ACA

AAG

AGT

TCT

CCT

GGC

ACA

AAA

AAG

GGT

TCG

CGT

780

Lys

Ser

Arg

Asp

Thr

Lys

Ser

Pro

Gly

Thr

Lys

Gly

Ser

Arg

225

230

235

GGG

TCA

TTC

TCT

TTT

AAG

GGG

GGA

ATG

CAG

ATT

CTT

CCT

GAT

ACG

TTG

828

Gly

Ser

Phe

Ser

Phe

Lys

Gly

Met

Gin

lle

Leu

Pro

Asp

Thr

Leu

240

245

250

TGC

AAA

AGT

CTC

TCA

CAT

GAT

GAG

ATC

AAT

TTA

GAC

TCC

AAG

GTA

CTC

876

Cys

Lys

Ser

Leu

Ser

His

Asp

Glu

lle

Asn

Leu

Asp

Ser

Lys

Val

Leu

255

260

265

TCT

TTG

TCT

TAC

AAT

TCT

GGA

TCA

AGA

CAG

GAG

AAC

TGG

TCA

TTA

TCT-

924

Ser

Leu

Ser

Tyr

Asn

Ser

Gly

Ser

Arg

Gin

Glu

Asn

Trp

Ser

Leu

Ser

270

275

280

285

TGT

GTT

TCG

CAT

AAT

GAA

ACG

CAG

AGA

CAA

AAC

CCC

CAT

TAT

GAT

GCT

972

Cys

Val

Ser

His

Asn

Glu

Thr

Gin

Arg

Gin

Asn

Pro

His

Tyr

Asp

Ala

290

295

300

GTA

ATT

ATG

ACG

GCT

CCT

CTG

TGC

AAT

GTG

AAG

GAG

ATG

AAG

GTT

ATG

1020

Val

lle

Met

Thr

Ala

Pro

Leu

Cys

Asn

Val

Lys

Glu

Met

Lys

Val

Met

305

310

315

103

AAA GGA. GGA. CAA CCC

TTT CAG CTA AAC TTT CTC CCC GAG ATT AAT TAC

1068

Lys

Gly

Gly Gin 320

Pro

Phe Gin

Leu Asn 325

Phe

Leu

Pro Glu 330

lle

Asn

Tyr

ATG

CCC

CTC

TCG

GTT

TTA

ATC

ACC

ACA

TTC

ACA

AAG

GAG

AAA

.GTA

AA.G

1116

Met

Pro

Leu

Ser

Val

Leu

lle

Thr

Phe

Thr

Lys

Glu

Lys

Val

Lys

335

340

345

AGA

CCT

CTT

GAA

GGC

TTT

GGG

GTA

CTC

ATT

CCA

TCT

AAG

GAG

CAA

AAG

1164

Arg

Pro

Leu

Glu

Gly

Phe

Gly

Val

Leu

lle

Pro

Ser

Lys

Glu

Gin

Lys

350

355

360

365

CAT

GGT

TTC

AAA

ACT

CTA

GGT

ACA

CTT

TTT

TCA

ATG

TTT

CCA

1212

His

Gly

Phe

Lys

Thr

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser

Met

Phe

Pro

370

375

380

GAT

CGT

TCC

CCT

AGT

GAC

GTT

CAT

CTA

TAT

AGA

ACT

TTT

ATT

GGT

GGG

1260

Aso

Arg

Ser

Pro

Ser

Asp

Val

His

Leu

Tyr

Thr

Phe

lle

Glv Gly

385

390

395

AGT

A.GG

AA.C

GAG

GAA

CTA

GCC

AAA.

GCT

TCC

ACT

GA.C

GAA

TTA

AAA

GAA

1308

Ser

Arg

Asn

Gin

Glu

Leu

Ala

Lys

A-la

Ser

Thr

Asp

Glu

Leu

Lys

Gin

400

405

410

GTT

GTG

ACT

TCT

GAC

CTT

GAG

CGA

CTG

TTG

GGG

GTT

GAA

GGT

GAA

CCC

1356

Val

Thr

Ser

Asp

Leu

Gin

Aurg

Leu

Gly

Val

Glu

Gly

Glu

Pro

415

420

425

GTG

TCT

GTC

AA.C

GAT

TAC

TAT

TGG

AC-G

AAA.

GGA

TTC

CCG

TTG

TAT

GAC

1404

Val

Ser

Val

Asn

His

Tyr

Trp

Arg

Lys

Ala

Phe

Pro

Leu

Tyr

Asp

430

435

440

445

AGC

TAT

GAC

TCA

GTC

ATG

GAA

GGA

ATT

GAC

AA.G

ATG

GAG

AAT

GAT

1452

Ser

Tyr

Asp

Ser

Val

Met

Glu

Ala

lle

Asp

Lys

Met

Glu

Asn

Asp

450

455

460

CTA

CCT

GGG

TTC

TAT

GCA

GGT

AAT

CAT

CGA

GGG

CTC

TCT

GTT

1500

Leu

Pro

Gly

Phe

Tyr

Ala

Gly

Asn

His

.Arg

Gly

Leu

Ser

Val

465

470

475

GGG

AAA

TGA

ATA

GCA

TCA

GGT

TGC

AAA

GCA

GCT

GAC

CTT

GTG

ATC

TCA

1548

Gly

Lys

Ser

lle

Ala

Ser

Gly

Cys

Lys

Ala

Asp

Leu

Val

lle

Ser

480

485

490

TAC

CTG

GAG

TCT

TGC

TGA

AAT

GAC

AAG

AAA

CGA

AAT

GAC

AGC

TTA

TAACATTGTC

1603

Tyr

Leu

Glu

Ser

Cys

Ser

Asn

Asp

Lys

Pro

Asn

Asp

Ser

Leu

495 500 505

AAGGTTCGTC CCTTTTTATC ACTTACTTTG TAAACTTGTA AAATGCAACA AGCCGCCGTG 1663

CGATTAGCCA ACAACTCAGC AAAACCCAGA TTCTCATAAG GCTCACTAAT TCCAGAATAA 1723

104

ACTATTTATG TAAAA

1738

105 (2) Informace o SEQ ID č.: 4:

(i) Charakteristika sekvencí:

(A) délka: 508 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

(

iii

)

opis sekve

:nce

: S.

EQ :

ID Č. :

4 :

Met

Ala

Ser

Gly

Ala

Val

Ma

Asp

His

Gin

Ile

Glu

Ma

Val

Ser

Gly

1

5

10

15

Lys

Arg

Val

Ma

Val

Gly

Ma

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Ala

Ma

20

25

30

Tyr

Lys

Leu

Lys

Ser

Arg

C-iy

Leu

Asn

Val

Thr

Val

Phs

Glu

Ma

Asp

35

40

45

Gly

Arg

Val

Gly

Lys

Leu

Arg

Ser

Val

Met

Gin

Asn

Gly

Leu

Ile

50

55

60

Trp

Asp

Glu

Gly

Ala

Asn

Thr

Glu

Ala

Glu

Pro

Glu

Val

Gly

65

70

75

80

Ser

Leu

Asp

Leu

Gly

Leu

Arg

Glu

Lys

Gin

Phe

Pro

Ile

85

90

95

Ser

Gin

Lys

Arg

Tyr

Ile

Val

Arg

Asn

Gly

Val

Pro

Val

Met

Leu

100

105

110

Pro

Thr

Asn

Pro

Ile

Glu

Leu

Val

Thr

Ser

Val

Leu

Ser

Thr

Gin

115

120

125

Ser

Lys

Phe

Gin

Ile

Leu

Glu

Pro

Phe

Leu

Trp

Lys

Ser

130

135

140

Ser

Lys

Val

Ser

Asp

Ala

Ser

Ma

Glu

Ser

Val

Ser

Glu

Phe

145

150

155

160

Gin

Arg

His

Phe

Gly

Gin

Glu

Val

Asp

Tyr

Leu

Ile

Asp

Pro

Phe

165

170

175

Val

Gly

Thr

Ser

Ma

Asp

Pro

Asp

Ser

Leu

Ser

Met

Lys

His

180

185

190

Ser Phe Pro Asp Leu Trp Asn Val Glu Lys Ser Phe Gly Ser Ile Ile

106

195 200 205

Val

Gly 210

Ala

lle

Arg

Thr

Lys 215

Phe

Ala

Lys

Gly 220

Gly

Lys

Ser

Arg

Asp 225

Thr

Lys

Ser

Pro 230

Gly

Thr

Lys

Gly 235

Ser

Arg

Gly

Ser

Phe 240

Ser

Phe

Lys

Gly

Gly 245

Met

Gin

lle

Leu

Pro 250

Asp

Thr

Leu

Cys

Lys 255

Ser

Leu

Ser

His

řsp 260

Glu

lle

Asn

Leu

Asp 265

Ser

Lys

Val

Leu

Ser 270

Leu

Ser

Tyr

Asn

Ser 275

Gly

Ser

Arg

Gin

Glu 280

Asn

Trp

Ser

Leu

Ser 285

Cys

Val

Ser

His

Asn 290

Glu

Thr

Gin

Arg

Gin 295

Asn

Pro

His

Tyr

Asp 300

Ala

Val

lle

Met

Thr 305

A_La

Pro

Leu

Cys

Asn 310

Val

Lys

Glu

Met

Lys 315

Val

Met

Lys

Gly Gly 320

Gin

Pro

Phe

Gin

Leu 325

Asn

Phe

Leu

Pro

Glu 330

lle

Asn

Tyr

Met

Pro 335

Leu

Ser

Val

Leu

lle 340

Thr

Phe

Thr

Lys 345

Glu

Lys

Val

Lys

Arg 350

Pro

Leu

Glu

Gly

Phe 355

Gly

Val

Leu

lle

Pro 360

Ser

Lys

Glu

Gin

Lys 365

His

Gly

Phe

Lys

Thr 370

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe 375

Ser

Met

Phe 380

Pro

Asp

Arg

Ser

Pro 385

Ser

Asp

Val

His

Leu 390

Tyr

Thr

Phe

lle 395

Gly

Ser

Arg

Asn 400

Gin

Glu

Leu

AJLa

Lys 405

Ala

Ser

Thr

Asp

Glu 410

Leu

Lys

Gin

Val

Val 415

Thr

Ser

Asp

Leu

Gin 420

Arg

Leu

Gly

Val 425

Glu

Gly

Glu

Pro

Val 430

Ser

Val

Asn

His

Tyr 435

Tyr

Trp

Arg

Lys

Ala 440

Phe

Pro

Leu

Tyr

Asp 445

Ser

Tyr

Asp

Val

Met

Glu

Ala

lle

Asp

Lys

Met

Glu

Asn

Asp

Leu

Pro

Gly

450 455 460

Phe Phe Tyr Ala Gly Asn His Arg Gly Gly Leu Ser Val Gly Lys Ser 465 470 475 480

107

Ile Ala Ser Gly Cys Lys Ala Ala Asp Leu Val Ile Ser Tyr Leu Glu 485 490 495

Ser Cys Ser Asn Asp Lys Lys Pro Asn Asp Ser Leu 500 505

108 (2) Informace o SEQ ID č.: 5:

(i) Charakteristiky sekvencí:

	(A)	délka: 1698 párů baží
	(B)	typ: nukleová kyselina
	(C)	řetězovost: jeden řetězec
	(D)	topologie: lineární
ii)	Typ	molekuly: cDNK
iii)	i Hypotetická: ne
iv)	Ant i	-sense: ne

(v) Rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 2 1453 (C) další informace: /poznámka=

Arabidopsis protox-1 cDNK (ne v plné délce); sekvence z pWDC-4

109 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 5:

G AAT TCG GGG GA.C TGC GTC GTG GTG GGC GGA GGC ATC AGT GGC CTC 46

Asn Ser Ala. Asn Cys Val Val Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu *5 10 15

TGC ACC GGG CAG GGG CTG GCC ACG CGG CAC GGC GTC GGG GAC GTG CTT

94

Cys

Thr Ala

Gin

Ala Leu 20

Ala

Thr

Aurg

His 25

Gly

Val

Gly

Asp

Val 30

Leu

GTC

ACG GA.G

GCC

CGC GCC

CGC

CCC

GGC

AAC

ATT

ACC

GTC

GAG

142

Val

Thr Glu

Ala 35

Arg Ala

Acrg

Pro

Gly Gly 40

Asn

Ile

Thr

Thr 45

Val

Glu

CGC

CCC GAG

GAA

GGG TAC

CTC

TGG

CAG

GAG

GGT

CCC

AA.C

AGC

TTC

CAG

190

Arg

Pro Glu 50

Glu

Glv Tyr

Leu

Trp 55

Glu

Gly

Pro

Asn 60

Ser

Phe

Gin

CCC

TCC GAC

CCC

GTT CTC

ACC

ATG

GCC

GTG

CAC

AGC

GGA

CTG

AAG

GAT

238

Pro

Ser Asp 65

Pro

Val Leu

Thr 70

Mec

A_La

Val

Asp

Ser 75

Gly

Leu

Lys

Asp

GAC

TTG GTT

TTT

GGG GAC

CCA

AAC

GCG

CCG

CGT

TTC

GTG

CTG

TGG

GAG

286

Asp 80

Leu Val

Phe

Gly Asp 85

Pro

Asn

Ala

Pro

Arg 90

Phe

Val

Leu

Trp

Glu 95

GGG

AAG CTG

AGG

CCC GTG

CCA

TCC

AAG

CCC

GCC

GAC

CTC

CCG

TTC

334

Gly

Lys Leu

Arg

Pro Val 100

Pro

Ser

Lys

Pro 105

Ala

Asp

Leu

Pro

Phe 110

Phe

GAT

CTC ATG

AGC

ATC CCA

GGG

AAG

CTC

AGG

GCC

GGT

CTA

GGC

GCG

CTT

382

Asp

Leu Met

Ser 115

Ile Pro

Gly

Lys

Leu 120

Arg

Ala

Gly

Leu

Gly 125

Ala

Leu

GGC

ATC CGC

CCG

CCT CCT

CCA

GGC

CGC

GAA

GAG

TCA

GTG

GAG

TTC

430

Gly

Ile Arg 130

Pro

Pro Pro

Pro

Gly Arg 135

Glu

Ser

Val 140

Glu

Phe

GTG

CGC CGC

AAC

CTC GGT

GCT

GAG

GTC

TTT

GAG

CGC

CTC

ATT

GAG

CCT

478

Val

Arg Arg 145

Asn

Leu Gly Ala 150

Glu

Val

Phe

Glu

Arg 155

Leu

Ile

Glu

Pro

TTC

TGC TCA

GGT

GTC TAT

GCT

GGT

GAT

CCT

TCT

AAG

CTC

AGC

ATG

AAG

526

Phe 160

Cys Ser

Gly

Val Tyr 165

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser 170

Lys

Leu

Ser

Met

Lvs 175

GCT

CCA TTT

GGG

AAG GTT

TCG

CGG

TTG

GAA

ACT

GGA

GGT

AGT

ATT

574

AJ.a

Ala Phe

Gly

Lys Val 180

Trp

Arg

Leu

Glu 185

Glu

Thr

Gly Gly

Ser 190

Ile

ATT

GGT GGA

ACC

ATC AAG

ACA

ATT

CAG

GAG

AGG

AGC

AAG

AAT

CCA

AAA

622,

Ile

Gly Gly

Thr 195

Ile Lys

Thr

Ile

Gin 200

Glu

Arg

Ser

Lys Asn 205

Pro

Lys

110

-

CCA CCG AGG GAT GCC CGC CTT CCG 'AAG CCA AAA GGG CAG ACA GTT GCA

670

Pro

Pro Arg Asp Ala Arg Leu 210

Pro 215

Lys

Pro

Lys

Gly

Gin 220

Thr

Val

Ala

TCT

TTC

AGG

AAG

GGT

CTT

GCC

ATG

CTT

CCA

AAT

GCC

ATT

ACA

TCC

AGC

718

•

Ser

Phe

Arg

Lys

Gly

Leu

Ala

Met

Leu

Pro

Asn

Ala

Ile

Thr

Ser

225

230

235

TTG

GGT

AGT

AAA

GTC

AAA

CTA

TCA

TGG

AAA

CTC

ACG

AGC

ATT

ACA

AAA

7 66

Leu

Gly

Ser

Lys

Val

Lys

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu

Thr

Ser

Ile

Thr

Lys

240

245

250

255

.

TCA

GAT

GAC

AAG

GGA

TAT

GTT

TTG

GAG

TAT

GAA

ACG

CCA

GAA

GGG

GTT

814

Ser

Asp

Lys

Gly

Tyr

Val

Leu

Glu

Tyr

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly

Val

260

265

270

GTT

TCG

GTG

CAG

GCT

AAA

AGT

GTT

ATC

ATG

ACT

ATT

CCA.

TO.

TAT

GTT

862

Val

Ser

Val

Gin

Ala

Lys

Ser

Val

Ile

Met

i ΠΣ

Tle

Pro

Ser

Tyr

Val

275 280 285

GCT

AGC

ARC

ATT

TTG

CGT

CCA

CTT

TCA

AGC

GAT

GCT

GCA

GAT

GCT

CTA

910

Ala

Ser

Asn

Ile

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Asp

Ala

Asp

Ala

Leu

290

295

300

TCA

AGA

TTC

TAT

CCA

CCG

GTT

GCT

GTA

ACT

GTT

TCG

TAT

CCA

958

Ser

Arg

Phe

Tyr

Pro

Val

.Ala

Ala

Val

Thr

Val

Ser

Tyr

Pro

305

310

315

ARG

GAA

GCA

ATT

AGA

AAA

GAA

TGC

TTA

ATT

GAT

GGG

GAA

CTC

CAG

GGC

1006

Lys

Glu

Ala

Ile

Arg

Lys

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp

Gly

Glu

Leu

Gin

Gly

320

325

330

335

TTT

GGC

CAG

TTG

CAT

CCA

CGT

AGT

CAA

GGA

GTT

GAG

ACA

TTA

GGA

ACA

1054

Phe

Gly

Gin

Leu

His

Pro

Arg

Ser

Gin

Gly

Val

Glu

Thr

Leu

Gly

Thr

340

345

350

ATA

TAC

AGT

TCC

TCA

CTC

TTT

CCA

AAT

CGT

GCT

CCT

GAC

GGT

AGG

GTG

1102

Ile

Tyr

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn

Arg

Ala

Pro

Asp

Gly

Arg

Val

355

360

365

TTA

CTT

CTA

AAC

TAC

ATA

GGA

GGT

GCT

ACA

ARC

ACA

GGA

ATT

GTT

TCC

1150

Leu

Asn

Tyr

Ile

Gly Gly

Ala

Thr

Asn

Thr

Gly

Ile

Val

Ser

370

375

380

ARG

ACT

GAR

AGT

GAG

CTG

GTC

GAA

GCA

GTT

GAC

CGT

GAC

CTC

CGA

AAA

1198

Lys

Thr

Glu

Ser

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

Val

Asp

Arg

Asp

Leu

Arg

Lys

385

390

395

ATG

CTT

ATA

AAT

TCT

ACA

GCA

GTG

GAC

CCT

TTA

GTC

CTT

GGT

GTT

CGA

1246

Met

Leu

Ile

Asn

Ser

Thr

Ala

Val

Asp

Pro

Leu

Val

Leu

Gly

Val

Arg

400

405

410

415

111

GTT Val

TGG Trp

CCA CAA

GCC Ala 420

ATA Ile

CCT CAG TTC CTG GTA GGA CAT CTT GAT CTT

1294

Pro

Gin

Pro Gin

Phe

Leu Val 425

Gly Kis Leu Asp 430

Leu

CTG

GAA

GCC

GGA

AAA

GCT

GCC

CTG

GA.C

CGA.

GGT

GGC

TAC

GAT

GGG

CTG

1342

Leu

Glu

Aa

Ala

Lys

Ala

Leu

Asp

Arg

Gly

Tyr

Asp

Gly

Leu

435

440

445

TTC

CTA

GGA

GGG

AAC

TAT

GTT

GGA

GTT

GCC

CTG

GGC

AGA

TGC

GTT

1390

Phe

Leu

Gly

Asn

Tyr

Val

Ala

Gly

Val

Ala

Leu

Gly

Arg

Cys

Val

450

455

460

GAG

/''•/—I—· ΙΐΜΛ-,

GCG

TAT

GAA

AGT

GCC

TCG

CAA

ATA

TCT

GA.C

TTC

TTG

ACC

AAG

1438

Glu

Gly

Ala

Tyr

Glu

Ser

Ala

Ser

Gin

Ile

Ser

Asp

Phe

Leu

Thr

Lys

465 470 475

TAT GCC TAC PAG TGATGAAA.GA AGTGGAGCGC TACTTGTTAA TCGTTTATGT 1490

Tyr Aa Tvr Lys

430

TGCATAGATG	AGGTGCCTCC	GGGGAAAAAA	AAGCTTGAAT	AGTATTTTTT	ATTCTTATTT	1550
TGTAAATTGC	ATTTCTGTTC	TTTTTTCTAT	CAGTAATTAG	TTATATTTTA	GTTCTGTAGG	1610
AGATTGTTCT	GTTCACTGCC	CTTCAAAAGA	AATTTTATTT	TTGATTCTTT	TATGAGAGCT	1670

GTGCTACTTA AAAAAAAAAA AAAAAAAA

1698

112 (2) Informace o SEQ ID č.:6:

(i) Charakteristika sekvencí:

	(A)	délka: 483 aminokyselin
	(B)	typ: aminokyselina
	(C)	topologie: lineární
(ii)	Typ	molekuly: protein
(iii)	i Popis sekvence: SEQ ID č.:

Asn 1

Ser

Ala

Asp

Cys 5

Val

Gly

Gly 10

Gly

Ile

Ser

Gly

Leu 15

Cys

Thr

Ala

Gin

Ala 20

Leu

Ada

Thr

Arg

His 25

Cdy

Val

Gly

Asp

Val 30

Leu

Val

Thr

Glu

Ala 35

Arg

Ala

Arg

Pro

Gly 40

Gly

Asn

Ile

Thr

Thr 45

Val

Glu

Arg

Pro

Glu 50

Glu

Gly

Th/r

Leu

Trp 55

Glu

Gly

Pro

Asn 60

Ser

Phe

Gin

Pro

Ser 65

Asp

Pro

Val

Leu

Thr 70

Met

Ada

Val

Asp

Ser 75

Gly

Leu

Lys

Asp

Asp 80

Leu

Val

Phe

Gly

Asp 85

Pro

Asn

Ada

Pro

Arg 90

Phe

Val

Leu

Trp

Glu 95

Gly

Lys

Leu

Arg

Pro 100

Val

Pro

Ser

Lys

Pro 105

Ada

Asp

Leu

Pro

Phe 110

Phe

Asp

Leu

Met

Ser 115

Ile

Pro

Gly

Lys

Leu 120

Arg

Ala

Gly

Leu

Gly 125

Ada

Leu

Gly

Ile

Arg 130

Pro

Gly 135

Arg

Glu

Ser

Val 140

Glu

Phe

Val

Arg 145

Arg

Asn

Leu

Gly

Ala 150

Glu

Val

Phe

Glu

Arg 155

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe 160

Cys

Ser

Gly

Val

Tyr 165

Ada

Gly

Asp

Pro

Ser 170

Lys

Leu

Ser

Met

Lys 175

Ada

113

Ala

Phe

Gly

Lys 180

Val

Trp

Arg

Leu

Glu 185

Glu

Thr

Gly

Ser 190

Ile

Gly

Thr 195

Ile

Lys

Thr

Ile

Gin 200

Glu

Arg

Ser

Lys

Asn 205

Pro

Lys

Pro

Arg 210

Asp

Ala

Arg

Leu

Pro 215

Lys

Pro

Lys

Gly

Gin 220

Thr

Val'

Ala

Ser

Phe 225

Arg

Lys

Gly

Leu

Ada 230

Met

Leu

Pro

Asn

Ala 235

Ile

Thr

Ser

Leu 240

Gly

Ser

Lys

Val

Lys 245

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu 250

Thr

Ser

Ile

Thr

Lys 255

Ser

Asp

Lys

Gly 260

Tyr

Val

Leu

Glu

Tyr 265

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly 270

Val

Ser

Val

C-ln 275

Ada

Lys

Ser

Val

Ile 280

Met

Thr

Ile

Pro

Ser 285

Tyr

Val

Ala

Ser

Asn 230

Ile

Leu

Arg

Pro

Leu 295

Ser

Asp

Ada

Ada 300

Asp

Ala

Leu

Ser

Arg 305

Phe

Tyr

Pro

Pro 310

Val

Ada

Val

Thr 315

Val

Ser

Tyr

Pro

Lys 320

Glu

Ala

Ile

Arg

Lys 325

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp 330

Gly

Glu

Leu

Gin

Gly 335

Phe

Gly

Gin

Leu

His 340

Pro

Arg

Ser

Gin

Gly 345

Val

Glu

Thr

Leu

Gly 350

Thr

Ile

Tyr

Ser

Ser 355

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn 360

Arg

Ala

Pro

Asp

Gly Arg 365

Val

Leu

Leu 370

Asn

Tyr

Ile

Gly Gly 375

Ala

Thr

Asn

Thr

Gly 380

Ile

Val

Ser

Lys

Thr 385

Glu

Ser

Glu

Leu

Val 390

Glu

Ala

Val

Asp

Arg 395

Asp

Leu

Arg

Lys

Met 400

Leu

Ile

Asn

Ser

Thr 405

Ala

Val

Asp

Pro

Leu 410

Val

Leu

Gly

Val

Axg 415

Val

Trp

Pro

Gin

Ada 420

Ile

Pro

Gin

Phe

Leu 425

Val

Gly

His

Leu

Asp 430

Leu

Glu

Ala

Ala 435

Lys

Ada

Leu

Asp 440

Arg

Gly Gly

Tyr

Asp 445

Gly

Leu

Phe

114

Leu	Gly	Gly	Asn	Tyr	Val
	450
Gly	Ala	Tyr	Glu	Ser	Ada
4 65					470
Ala	Tyr	Lys

Ala Gly Val Ala Leu 455

Ser Gin lle Ser Asp 475

Gly Arg Cys Val Glu 460

Phe Leu Thr Lys Tyr 480

115

Informace	o SEQ ID č.: 7:
(i)	Charakteristiky sekvencí: (A) délka: 2061 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární
(ii)	Typ molekuly: cDNK
(iii	.) Hypotetická: ne
(iv)	Anti-sense: ne
(v)	Rys : (A) jméno/klíč: CDS

(B) umístění: 64 1698 (C) další informace: /poznámka= protox-2 cDNK z kukuřice; sekvence z pWDC-3 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 7:

CTCTCCTACC TCCACCTCCA CGACAACAAG CAAATCCCCA TCCAGTTCCA AACCCTAACT 60

CAA

ATG Met 1

CTC GCT TTG ACT GCC

TCA Ser

GCC TCA TCC GCT TCG TCC

CAT His

CCT Pro 15

108

Leu

Ala Leu

Thr 5

Ala

Ala Ser

Ser 10

Ala

Ser

TAT

CGC

CAC

GCC

TCC

GCG

CAC

ACT

CGT

CGC

CCC

CGC

CTA

CGT

GCG

GTC

156

Tyr

Arg

His

Ala

Ser

Ala

His

Thr

Arg

Pro

Arg

Leu

Arg

Ala

Val

20

25

30

CTC

GCG

ATG

GCG

GGC

TCC

GAC

CCC

CGT

GCA

GCG

CCC

GCC

AGA

TCG

204

Leu

Ala

Met

Ala

Gly

Ser

Asp

Pro

Arg

Ala

Pro

Ala

Arg

Ser

35

40

45

GTC

GCC

GTC

GGC

GCC

GGG

GTC

AGC

GGG

CTC

GCG

TAC

AGG

252

Val

Ala

Val

Gly

Ala

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Ala

Tyr

Arg

50

55

60

116

CTC AGA CAG AGC GGC GTG AAC GTA

ACG GTG TTC CAA GCG GCC GAC AGG

300

Leu

Arg 65

Gin

Ser

Gly Val

Asn 70

Val

Thr

Val

Phe

Glu 75

Ma

Asp

Mg

GCG

GGA

AAG

ATA

CGG

ACC

AAT

TCC

GAG

GGC

GGG

TTT

GTC

TGG

GAT

348

Ala

Gly

Lys

Ile

Arg

Thr

Asn

Ser

Glu

Gly

Phe

Val

Trp

Asp

80

85

90

95

GAA

GGA

GCT

AAC

ACC

ATG

ACA

GAA

GGT

GAA

TGG

GAG

GCC

AGT

AGA

CTG

396

Glu

Gly

Ala

Asn

Thr

Met

Thr

Glu

Gly

Glu

Trp

Glu

Ma

Ser

Mg

Leu

100

105

110

ATT

GAT

CTT

GGT

CTA

CAA

GA.C

AAA

CAG

TAT

CCT

AAC

TCC

CAA

444

Ile

Asp

Leu

Gly

Leu

Gin

Asp

Lys

Gin

Tyr

Pro

Asn

Ser

Gin

115

120

125

CAC

AAG

CGT

TAC

ATT

GTC

AAA

GAT

GGA

GCA

CCA

GCA

CTG

ATT

CCT

TCG

492

His

Lys

Arg

Tyr

Ile

Val

Lys

Asp

Gly

Ala

Pro

Ala

Leu

Ile

Pro

Ser

130

135

140

GAT

CCC

ATT

TCG

CTA

ATG

AAA

AGC

AGT

GTT

CTT

TCG

ACA

AAA

TCA

AAG

540

Asp

Pro

Ile

Ser

Leu

Met

Lys

Ser

Val

Leu

Ser

Thr

Lys

Ser

Lys

145

150

155

ATT

GCG

TTA

TTT

GAA

CCA

TTT

CTC

TAC

AA.G

AAA.

GCT

AAC

ACA

588

Ile

Ala

Leu

Phe

Glu

Pro

Phe

Leu

Tyr

Lys

Ma

Asn

Thr

Are

160

165

170

175

AAC

TCT

GGA

AAA

GTG

TCT

GAG

CAC

TTG

AGT

CAG

AGT

GTT

GGG

AGC

636

Asn

Ser

Gly

Lys

Val

Ser

Glu

His

Leu

Ser

Glu

Ser

Val

Gly

Ser

180

185

190

TTC

TGT

GAA

CGC

CAC

TTT

GGA

AGA

CAA

GTT

GAC

TAT

TTT

GTT

CAT

684

Phe

Cys

Glu

Arg

His

Phe

Gly

Arg

Glu

Val

Asp

Tyr

Phe

Val

Asp

195

200

205

CCA

TTT

GTA

GCT

GGA

ACA

AGT

GCA

GGA.

CAT

CCA

GA.G

TCA

CTA

TCT

ATT

732

Pro

Phe

Val

Ala

Gly

Thr

Ser

Ala

Gly

Asp

Pro

Glu

Ser

Leu

Ser

Ile

210

215

220

CGT

CAT

GCA

TTC

CCA

GCA

TTG

TGG

AAT

TTG

GAA.

AGA

AAG

TAT

GGT

TCA

780

Arg

His

Ala

Phe

Pro

Ala

Leu

Trp

Asn

Leu

Glu

Arg

Lys

Tyr

Gly

Ser

225

230

235

GTT

ATT

GTT

GGT

GCC

ATC

TTG

TCT

AAG

CTA

GCA.

GCT

AAA

GGT

GAT

CCA

828

Val

Ile

Val

Gly

Ala

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

Ala

Lys

Gly

Asp

Pro

240

245

250

255

GTA

AAG

ACA

AGA

CAT

GAT

TCA

GGG

AAA.

AGA.

AGG

AAT

AGA

CGA

GTG

876

Val

Lys

Thr

Arg

His

Asp

Ser

Gly

Lys

Mg

Arg

Asn

Mg

.Mg

Val

260

265

270

117

924

TCG

TTT

TGA

TTT

GAT

GGT

GGA

ATG

CAG

TCA

CTA

ATA

AAT

GCA

CTT

CAC

Ser

Phe

Ser

Phe 275

His

Gly

Met

Gin 280

Ser

Leu

Ile

Asn

Ala 285

Leu

His

AAT

GAA

GTT

GGA.

GAT

AAT

GTG

AAG

CTT

GGT

ACA

GAA

GTG

TTG

TCA

Asn

Glu

Val 290

Gly

Asp

Asn

Val 295

Lys

Leu

Gly

Thr

Glu 300

Val

Leu

Ser

TTG

GGA

TGT

AGA

TTT

GAT

GGA

GTT

CCT

GCA

CTA

GGC

AGG

TGG

TCA

ATT

Leu

Ala 305

Cys

Thr

Phe

Asp

Gly 310

Val

Pro

Ada

Leu

Gly 315

Arg

Trp

Ser

Ile

TCT

GTT

GAT

TCG

AAG

GAT

AGC

GGT

GAC

AAG

GAC

CTT

GCT

AGT

AAC

CAA

Ser 320

Val

Asp

Ser

Lys

Asp 325

Ser

Gly Asp

Lys

Asp 330

Leu

Ala

Ser

Asn

Gin 335

ACC

TTT

GAT

GCT

GTT

ATA

ATG

ACA

GCT

CCA

TTG

TCA

AAT

GTC

CGG

AGG

Thr

Phe

Asd

Ala

Val 340

Ile

Met

Thr

Ada

Pro 345

Leu

Ser

Asn

Val

Arg Arg 350

ATG

AAG

TTC

ACC

AAA.

GGT

GGA

GCT

CCG

GTT

CTT

GAC

TTT

CTT

CCT

Lys

Phe

Thr 355

Lys

Gly

Ala

Pro 360

Val

Leu

Asp

Phe 365

Leu

Pro

AA.G

ATG

GAT

T.AT

CTA

CGA

CT.A

TCT

CTC

ATG

GTG

ACT

GCT

TTT

AA.G

AAG

Lys

Asd 370

Tyr

Leu

Pro

Leu

Ser 375

Leu

Met

Val

Thr

Ala 380

Phe

Lys

GAT

GA.T

GTC

AAG

AAA.

CCT

CTG

GGA

TTT

GGG

GTC

TTA

ATA

CCT

TAC

Asp

Asd 385

Val

Lys

Pro

Leu 390

Glu

Gly

Phe

Gly

Val 395

Leu

Ile

Pro

Tyr

AAG

GAA

GAG

GAA.

AAA

GAT

GGT

CTG

AAA

ACC

CTT

GGG

ACT

CTC

TTT

TCC

Lys 400

Glu

Gin

Lys

His 405

Gly

Leu

Lys

Thr

Leu 410

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser 415

TGA

ATG

TTC

CGA

GA.T

CGA

GCT

CCT

GAT

GAC

CAA

TAT

TTA

TAT

AGA

Ser

Met

Phe

Pro 420

Asp

Arg

Ala

Pro

Asp 425

Asp

Gin

Tyr

Leu

Tyr 430

Thr

AGA

ypr

GTT

GGG

GGT

AGC

CA.C

AAT

AGA

GAT

CTT

GCT

GGA

GCT

CCA

ACG

Thr

Phe

Val

Gly 435

Gly

Ser

His

Asn

Arg 440

Asp

Leu

Ada

Gly

Ala 445

Pro

Thr

TCT

ATT

CTG

AAA

CAA

CTT

GTG

ACC

TCT

GAC

CTT

AAA.

AAA

CTC

TTG

GGC

Ser

Ile

Leu 450

Lys

Gin

Leu

Val

Thr 455

Ser

Asp

Leu

Lys

Lys 460

Leu

Gly

GTA

GAG

GGG

GAA

CGA

ACT

TTT

GTC

AAG

CAT

GTA

TAC

TGG

GGA

AAT

GCT

Val

Glu 465

Gly

Gin

Pro

Thr

Phe 470

Val

Lys

His

Val

Tyr 475

Trp

Gly

Asn

Ala

972

1020

1068

1116

1164

1212

1260

1308

1356

1404

1452

1500

118

TTT Phe 480

CCT TTG TAT

GGC Gly

CAT GAT

TAT AGT TCT GTA

TTG GAA Leu Glu

GCT Ada

ATA GAA Ile Glu 495

1548

Pro Leu

Tyr

His 485

Asp

Tyr Ser Ser

Val 490

AAG

ATG

GAG

AAA

AAC

CTT

CCA

GGG

TTC

TAC

GGA

AAT

AGC

AAG

1596

Lys

Met

Glu

Lys

Asn

Leu

Pro

Gly

Phe

Tyr

Ala

Gly

Asn

Ser

Lys

500

505

510

GAT

GGG

CTT

GCT

GTT

GGA

AGT

GTT

ATA

GCT

TGA

GGA

AGC

AAG

GCT

1644

Asp

Gly

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

Val

Ile

Ala

Ser

Gly

Ser

Lys

Ada

Ala

515

520

525

GAC

CTT

GCA

ATC

TCA

TAT

CTT

GAA

TCT

CAC

ACC

AAG

GAT

AA.T

AAT

TGA

1692

Asp

Leu

Ala

Ile

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

His

Thr

Lys

His

Asn

Ser

530 535 540

CAT TGAAAGTGTC TGACCTATCC TCTAGCAGTT GTCGAGAAAT TTCTCCACTT 1745

His

545

CATGTACAGT AGAAACCGAT GCGTTGCAGT TTGAGAAGAT CTTCACTTCT TGAGA.TATTA. 1805

ACCCTTCGTT GAAGATCGAC CAGAAAGGTA. GTCACATGTG TAAGTGGGAA AATGAGGTTA 1865

AAAACTATTA TGGCGGCCGA AATGTTCCTT TTTGTTTTCC TCACAAGTGG CCTACGACAC 1925

TTGATGTTGG AAATACATTT AAA.TTTGTTG AATTGTTTGA GAAGAGATGC GTGACGTGTA 1985

ATATTTGCCT ATTGTGATTT TAGCAGTAGT CTTGGCCAGA TTATC-CTTTA CGCCTTTAAA 2045

AAAAAAAAAA AAAAAA

2061

119 (2) Informace o SEQ ID č.: 8:

(i) Charakteristika sekvencí:

(A) délka: 544 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Popis sekvence: SEQ ID č.: 8:

Met

Leu

Ala

Leu

Thr

Ala

Ser

Ala

Ser

Ala

Ser

His

Pro

Tyr

1

5

10

15

Arg

His

Ala

Ser

Ala

His

Thr

A.rg

Axg

Pro

Arg

Leu

Aura

Aia

Val

leu

20

25

30

Ala

Met

Aia

Gly

Ser

Asp

A.sp

Pro

Arg

Ala

Pro

Ala

Arg

Ser

Val

35

40

45

Ala

Val

Gly

Ala

Gly

Val

Ser

Gly

Leu

Ala

Tyr

Arg

Leu

50

55

60

Arg

Gin

Ser

Gly

Val

Asn

Val

Thr

Val

Phe

Glu

Ala

Asp

Arg

Ala

65

70

75

80

Gly

Lys

Ile

Arg

Thr

Asn

Ser

Glu

Gly

Phe

Val

Trp

Asp

Glu

85

90

95

Gly

Ala

Asn

Thr

Met

Thr

Glu

Gly

Glu

Trp

Glu

Ala

Ser

Arg

Leu

Ile

100

105

110

Asp

Leu

Gly

Leu

Gin

Asp

Lys

Gin

Tyr

Pro

Asn

Ser

Gin

His

115

120

125

Lys

Arg

Tyr

Ile

Val

Lys

Asp

Gly

Ala

Pro

Ala

Leu

Ile

Pro

Ser

Asp

130

135

140

Pro

Ile

Ser

Leu

Met

Lys

Ser

Val

Leu

Ser

Thr

Lys

Ser

Lys

Ile

145

150

155

160

Ala

Leu

Phe

Glu

Pro

Phe

Leu

Tyr

Lys

Ala

Asn

Thr

Arg

Asn

165

170

175

Ser

Gly

Lys

Val

Ser

Glu

His

Leu

Ser

Glu

Ser

Val

Gly

Ser

Phe

180

185

190

Cys

Glu

Arg

His

Phe

Gly

Arg

Glu

Val

Asp

Tyr

Phe

Val

Asp

Pro

195

200

205

Phe Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser Ile Arg 210 215 220

120

His

Ala

Pne

Pro

Ala

Leu

Trp

Asn

Leu

Glu

Arg

Lys

Tyr

Gly

Ser

Val

225

230

235

240

lle

Val

Gly

Ala

lle

Leu

Ser

Lys

Leu

Ala

Lys

Gly

Asp

Pro

Val

245

250

255

Lys

Thr

?_rg

His

Asp

Ser

Gly

Lys

Arg

Asn

Arg

Val

Ser

260

265

270

Phe

Ser

Phe

His

Gly

Met

Gin

Ser

Leu

lle

Asn

Ala

Leu

His

Asn

275

280

285

Glu

Val

Gly

Asp

Asn

Val

Lys

Leu

Gly

Thr

Glu

Val

Leu

Ser

Leu

290

295

300

Ala

Cys

Thr

Phe

Asp

Gly

Val

Pro

Ala

Leu

Gly

Arg

Trp

Ser

lle

Ser

305

310

315

320

Val

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Gly

Asp

Lys

Asp

Leu

Ala

Ser

Asn

Gin

Thr

325

330

335

Phe

Asp

Ala

Val

lle

Met

Thr

Ala

Pro

Leu

Ser

Asn

Val

Arg

Met

340

345

350

Lys

Phe

Thr

Lys

Gly

Ala

Pro

Val

Leu

Asp

Phe

Leu

Pro

Lys

355

360

365

Met

Asp

Tyr

Len

Pro

Leu

Ser

Leu

Met

Val

Thr

Ala

Phe

Lys

Asp

370

375

380

Asp

Val

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Phe

Gly

Val

Leu

lle

Pro

Tyr

Lys

385

390

395

400

Glu

Gin

Lys

His

Gly

Leu

Lys

Thr

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser

405

410

415

Met

Phe

Pro

Asp

Arg

Ala

Pro

Asp

Gin

Tyr

Leu

Tyr

Thr

420

425

430

121

Phe

Val

Gly Gly 435

Ser

His

Asn

Arg 440

Asp

Leu

Ala

Gly

Ala 445

Pro

Thr

Ser

Ile

Leu 450

Lys

Gin

Leu

Val

Thr 455

Ser

Asp

Leu

Lys

Lys 460

Leu

Leu.

Gly

Vaí

Glu 465

Gly

Gin

Pro

Thr

Phe 470

Val

Lys

His

Val

Tyr 475

Trp

Gly

Asn

Ala

Phe 480

Pro

Leu

Tyr

Gly

His 485

Asp

Tyr

Ser

Val 490

Leu

Glu

Ala

Ile

Glu 495

Lys

Met

Glu

Lys

Asn 500

Leu

Pro

Gly

Phe

Phe 505

Tyr

A_La

Gly

Asn

Ser 510

Lys

Asp

Gly

Leu

Ala 515

Val

Gly

Ser

Val

Ile 520

Ala

Ser

Gly

Ser

Lys 525

Ala

Asp

Leu

Ala

Ile

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

His

Thr

Lys

His

Asn

Ser

Kis

530 535 540

122

Informace	o SEQ	ID č. : 9 :
(i)	Charakteristiky sekvencí:
	(A)	délka: 1697 párů baží
	(B)	typ: nukleová kyselina
	(C)	řetězovost: jeden řetězec
	(D)	topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: cDNK (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Rys:

(A) jméno/klíč: CDS (B) umístění: 29 1501 (C) další informace: /poznámka= protox-3 cDNK z kvasinky; sekvence z pWDC-5 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č.: 9:

TTGGCATTTG CCTTGAACCA ACAATTCT ATG TCA ATT GCA ATT TGT GGA GGA 52

Met Ser Ile Ala. Ile Cvs Glv Gly

5

GGT ATA GCT

GGT CTT AGT

ACA Thr 15

GCA TTT TAT CTT GCT ACA TTG ATT CCA

100

Gly Ile 10

Ala

Gly Leu

Ser

Ala

Phe

Tyr Leu

Ala 20

Arg Leu Ile Pro

AAA

TGT

ACT

ATT

GAT

TTG

TAC

GAA

AAA.

GGT

CCT

CGT

TTA

GGT

GGA

TGG

148

Lys

Cys

Thr

Ile

Asp

Leu

Tyr

Glu

Lys

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly Glv

Trp

25

30

35

40

CTT

CAG

TCG

GTC

AAA

ATC

CCG

TGT

GCA

GAT

TCT

CCA

ACA

GGA

ACG

GTT

196

Leu

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Pro

Cys

Ala

Asp

Ser

Pro

Thr

Gly

Thr

Val

45

50

55

TTG

TTT

CAG

CAA

GGT

CCT

ACA

ACT

CTT

CGT

CCT

GCT

GGG

GTT

GCT

bcc

244

Leu

Phe

Glu

Gin

Gly

Pro

Arg

Thr

Leu

Arg

Pro

Ala

Gly

Val

Ala

Gly

60

65

70

TTA

GCA

AAC

TTA

GAT

TTA

ATT

AGC

AAG

TTG

GGC

ATC

GAA

GAC

AAG

TTG

292

Leu

Ala

Asn

Leu

Asp

Leu

Ile

Ser

Lys

Leu

Gly

Ile

Glu

Asp

Lys

Leu

80 85

123

TTA AGG ATT TCG

AGC AAT TCT CCC AGC GCA AAA AAC CGA TAT ATT TAT

340

Leu Arg Ile 90

Ser

Ser Asn Ser 95

Pro

Ser

Ala

Lys Asn 100

Arg

Tyr Ile

Tyr

TAC

CCA

GAT

CGC

TTA

AAT

GAA

ATT

CCT

TCA

AGC

ATT

TTA

GGG

AGT

ATA

388

Tyr

Pro

Asp

Arg

Leu

Asn

Glu

Ile

Pro

Ser

Ile

Leu

Gly

Ser

Ile

105

110

115

120

AA.G

TCG

ATT

ATG

CAG

CCT

GCT

TTG

CGT

CCG

ATG

CCT

TTG

GCT

ATG

436

Lys

Ser

Ile

Met

Gin

Pro

Ala

Leu

Arg

Pro

Met

Pro

Leu

Ala

Met

125

130

135

CTT

GAG

CCC

TTT

CGT

AAA

AGT

AAG

CGA

GAT

TCG

ACA

GAT

GAA

AGC

GTG

484

Leu

Glu

Pro

Phe

Arg

Lys

Ser

Lys

Arg

Asp

Ser

Thr

Asp

Glu

Ser

Val

140

145

150

GGT

TCA

TTT

ATG

AGA.

AGA

TTT

GGT

AAA

AAC

GTT

ACG

GAT

AGA

GTT

532

Gly

Ser

Phe

Met

Arg

Phe

Gly

Lys

Asn

Val

Thr

Asp

Arg

Val

155

160

165

ATG

AGT

GCA

ATG

ATA.

AA.T

GGT

ATT

TAT

GCT

GGT

GAT

TTG

AAT

GAT

TTG

580

Msn

Ser

Ala

Met

Ile

Asn

Gly

Ile

Tyr

Ala

Gly

Asp

Leu

Asn

Asp

Leu

170

175

180

TCT

ATG

CAT

TCT

AGC

ATG

TTT

GGA

TTT

TTA

GCG

AAG

ATT

GAA

AAA

AAG

628

Ser

Meh

His

Ser

Met

Phe

Gly

Phe

Leu

Ala

Lys

Ile

Glu

Lys

185

190

195

200

TAT

GGA.

AAC

A.TT

ACT

TTG

GGA.

TTA

A.TT

AGA

GCT

CTT

GCA

CGT

GAA

676

Tyr

Gly

Asn

Ile

Thr

Leu

Gly

Leu

Ile

Arg

Ala

Leu

Ala

Arg

Glu

205

210

215

ATA

TTA

TCT

CCT

GCT

GAG

AAA.

GCT

TTG

GAA

AGC

ACT

CGC

AGA

724

Ile

Leu

Ser

Pro

Ala

Glu

Lys

Ala

Leu

Glu

Ser

Thr

Arg Arg

220

225

230

GCC

AAA.

AAC

AGC

AGA

GCT

GTC

AAA

CAG

TAT

GAA

ATC

GAC

AAG

TAT

GTT

772

Ala

Lys

Asn

Ser

Arg

Ala

Val

Lys

Gin

Tyr

Glu

Ile

Asp

Lys

Tyr

Val

235

240

245

GCT

TTC

AAG

GAA

GGG

ATT

GAG

ACT

ATT

AGA

TTG

TCA

ATA

GCA

GAT

GAA

820

Ala

Phe

Lys

Glu

Gly

Ile

Glu

Thr

Ile

Thr

Leu

Ser

Ile

Ala

Asp

Glu

250

255

260

TTA

AAA

ATG

CCG

AAT

GTC

AAG

ATA

CAT

CTA

AAC

AAA

CCG

GCC

CAA

868

Leu

Lys

Met

Pro

Asn

Val

Lys

Ile

His

Leu

Asn

Lys

Pro

Ala

Gin

265

270

275

280

ACT

TTG

GTT

CGA

GAT

AAA.

ACT

CAG

TCT

CTT

GTA

GAC

GTC

AAT

GGT

CAA

916

Thr

Leu

Val

Pro

His

Lys

Thr

Gin

Ser

Leu

Val

Asp

Val

Asn

Gly

Gin

*.

285 290 295

124

GCT Ala

TAC GAG TAT GTT GTG

TTT Phe

GCA Ala

AAC TCT TCT CGC AAT TTA GAG AAT

964

Tyr

Glu

Tyr Val 300

Val

Asn 305

Ser Ser

Arg

Asn

Leu 310

Glu

Asn

CTA

ATA

TCT

TGT

CCT

AAA

ATG

GAA

ACT

CCG

ACG

TCG

AGT

GTT

TAT

GTC

1012

Leu

Ile

Ser

Cys

Pro

Lys

Met

Glu

Thr

Pro

Thr

Ser

Val

Tyr

Val

315

320

325

GTC

AAC

GTT

TAT

AAG

GAC

CCT

AAT

GTT

CTT

CGA

ATC

CGT

GGT

TTT

1060

Val

Asn

Val

Tyr

Lys

Asp

Pro

Asn

Val

Leu

Pro

Ile

Arg

Gly

Phe

330

335

340

GGG

CTT

TTG

ATT

CCA

TCA

TGC

ACT

CCA

AAT

CCG

AAT

GAT

GTT

CTT

1108

Gly

Leu

Ile

Pro

Ser

Cys

Thr

Pro

Asn

Pro

Asn

His

Val

Leu

345

350

355

360

GGT

ATC

GTT

TTT

GAT

AGT

GAG

GAA

AAC

CCT

GAA

AAT

GGA.

AGC

AAG

1156

Gly

Ile

Val

Phe

Asp

Ser

Glu

Gin

Asn

Pro

Glu

Asn

Gly

Ser

Lys

365

370

375

GTC

ACT

GTC

ATG

GGA

GGG

TCT

GCT

TAT

AGA

AAA

AA.T

ACT

TCT

TTG

1204

Val

Thr

Val

Met

Gly

Ser

Ala

Tyr

Thr

Lvs

Asn

Thr

Ser

Leu

380

385

390

ATT

CCA

ACC

AAC

ccc

GAA

GCC

GTT

AAC

AA.T

GCT

CTC

AAA

GCT

TTG

1252

íle

Pro

Thr Asn

Pro

Glu

Glu’

' Ala

Val

Asn

Ala

Leu

Lys

Ala

Leu

395

400

405

CAG

CAT

ACT

TTA

AAA

ATA

TCC

AGT

AAG

CGA

AGA

CTC

ACG

AA.T

GCA

AGA

1300

Gin

His

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Lys

Pro

Thr

Leu

Thr

Asn

Ala

Thr

410

415

420

TTA

GAA

CCA

AAT

TGC

ATC

CCT

CAA

TAT

CGT

GTT

GGG

GAT

GAA

GAT

AAT

1348

Leu

Gin

Pro

Asn

Cys

Ile

Pro

Gin

Tyr

Arg

Val

Gly

His

Gin

Asp

Asn

425

430

435

440

CTT

AAT

TCT

TTG

AAA

TCT

TGG

ATT

GA.G

AAA

AAT

ATG

GGA

GGG

CGA

ATT

1396

Leu

Asn

Ser

Leu

Lys

Ser

Trp

Ile

Glu

Lys

Asn

Met

Gly

Arg

Ile

445

450

455

CTT

CTA

ACT

GGA

AGT

TGG

TAT

AAT

GGT

GTT

AGT

ATT

GGG

GAT

TGT

ATT

1444

Leu

Thr

Gly

Ser

Trp

Tyr

Asn

Glv

Val

Ser

Ile

Gly Asp

Cys

Ile

460

465

470

ATG

AAT

GGA

CAT

TGA

ACA

GCT

CGA.

AAA

CTA

GGA

TGA

TTG

ATG

AAT

TCT

1492

Met

Asn

Gly

His

Ser

Thr

Ala

Arg

Lys

Leu

Ala

Ser

Leu

Met

Asn

Ser

475 430 485

125

TCT TCT TGAGCGTTTA TAAATGTTGA TATAAAATTA GTATATAGTT CCTTTGATTA Ser Ser

490

TTTTATGAGT TGAAAATGCC ACTTGTGAAA TAATTTTGCA CAAC-CCCTTT TATTACAGAC

GTATATGCGA GGACATTCGA CAAACGTTTG AAATTAAAAA TCATATGCCT TTTAGCTTAA

1548

1608

1663

GACATCAAGG TCATGAATAA TAAAATTTT

1697

126 (2) Informace o SEQ ID č.: 10:

(i) Charakteristika sekvencí:

	(A)	délka: 490 aminokyselin
	(B)	typ: aminokyselina
	(C)	topologie: lineární
li)	Typ	molekuly: protein
iii!	i Popis sekvence: SEQ ID č.:

-

Met 1

Ser Ile Ala

Ile Cys Gly Gly Gly Ile Ala Gly Leu Ser Thr

Ala

5

10

15

Phe

Tyr

Leu

Ala

Arg

Leu

Ile

Pro

Lys

Cys

Thr

Ile

Asp

Leu

Tyr

Glu

20

25

30

Lys

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Trp

Leu

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Pro

Cys

35

40

45

Ala

Asp

Ser

Pro

Thr

Gly

Thr

Val

Leu

Phe

Glu

Gin

Gly

Pro

Arg

Thr

50

55

60

Leu

Arg

Pro

Ala

Gly

Val

Ala

Gly

Leu

Ala

Asn

Leu

Asp

Leu

Ile

Ser

65

70

75

80

Lys

Leu

Gly

Ile

Glu

Asp

Lys

Leu

Arg

Ile

Ser

Asn

Ser

Pro

85

90

95

Ser

Ala

Lys

Asn

Arg

Tyr

Ile

Tyr

Pro

Asp

Arg

Leu

Asn

Glu

Ile

100

105

110

Pro

Ser

Ile

Leu

Gly

Ser

Ile

Lys

Ser

Ile

Met

Gin

Pro

Ala

Leu

115

120

125

Arg

Pro

Met

Pro

Leu

Ala

Met

Leu

Glu

Pro

Phe

Arg

Lys

Ser

Lys

130

135

140

«

Arg

Asp

Ser

Thr

Asp

Glu

Ser

Val

Gly

Ser

Phe

Met

Arg Arg Arg

Phe

145

150

155

160

Gly

Lys

Asn

Val

Thr

Asp

Arg

Val

Met

Ser

Ala

Met

Ile

Asn

Gly

Ile

165

170

175

Tyr

Ala

Gly

Asp

Leu

Asn

Asp

Leu

Ser

Met

His

Ser

Met

Phe

Gly

180 185 190

Phe Leu Ala Lys Ile Glu Lys Lys Tyr Gly Asn Ile Thr Leu Gly Leu 195 200 205

127

lle Arg Ala Leu Leu Ala Arg Glu

lle

Leu

Ser

Pro 220

Ala

Glu Lys

Ala

210

215

Leu

Glu

Ser

Thr

Arg

Ala

Lys

Asn

Ser

Arg

Ala

Val

Lys

225

230

235

240

Gin

Tyr

Giu

lle

Asp

Lys

Tyr

Val

Ala

Phe

Lys

Glu

Gly

lle

Glu

Thr

245

250

255

lle

Thr

Leu

Ser

lle

Ala

Asp

Glu

Leu

Lys

Met

Pro

Asn

Val

Lys

2S0

265

270

lle

His

Leu

Asn

Lys

Pro

Ala

Gin

Thr

Leu

Val

Pro

His

Lys

Thr

Gin

275

280

285

Ser

Leu

Val

Asp

Val

Asn

Gly

Gin

Ala

Tyr

Glu

Tyr

Val

Phe

Ala

290

295

300

Asn

Ser

Arg

Asn

Leu

Glu

Asn

Leu

lle

Ser

Cys

Pro

Lys

Met

Glu

305

310

315

320

Thr

Pro

Thr

Ser

Val

Tyr

Val

Asn

Val

Tyr

Lys

Asp

Pro

325

330

335

Asn

Val

Leu

Pro

lle

Arg

Gly

Phe

Gly

Leu

lle

Pro

Ser

Cys

Thr

340

345

350

Pro

Asn

Pro

Asn

His

Val

Leu

Gly

lle

Val

Phe

Asp

Ser

Glu

Gin

355

360

365

Asn

Pro

Glu

Asn

Gly

Ser

Lys

Val

Thr

Val

Met

Gly Gly

Ser

370

375

380

Ala

Tyr

Thr

Lys

Asn

Thr

Ser

Leu

Tle

Pro

Thr

Asn

Pro

Glu

Ala

385

390

395

400

Val

Asn

Ala

Leu

Lys

Ala

Leu

Gin

His

Thr

Leu

Lys

Tle

Ser

405 410 415

128

Lys

Pro

Thr

Leu 420

Thr

Asn

Ala

Thr

Leu 425

Gin

Pro

Asn

Cys

lle 430

Pro

Gin

Tyr

Arg

Val 435

Gly

His

Gin

Asp

Asn 440

Leu

Asn

Ser

Leu

Lys 445

Ser

Trp

lle

Glu

Lys 450

Asn

Met

Gly

Arg 455

lle

Leu

Thr

Gly 460

Ser

Trp

Tyr

Asn

Gly 465

Val

Ser

lle

Gly

Asp 470

Cys

lle

Met

Asn

Gly 475

His

Ser

Thr

Ala

Arg 430

Lys

Leu

Ala

Ser

Leu

Met

Asn

Ser

485 490

129

Informace	o SEQ ID č.: 11:
(i)	Charakteristiky sekvencí: (A) délka: 41 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární
(ii)	Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: oligonukleotidy užívané konstrukci pCGN1761ENX

pro (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Popis sekvence: SEQ ID č.: 11:

AATTATGACG TAACGTAGGA ATTAGCGGCC CGCTCTCGAG T (2) Informace o SEQ ID č. : 12:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 40 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: oligonukleotidy užívané konstrukci pCGN176lENX (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Popis sekvence: SEQ ID č.: 12:

AATTACTCGA GAGCGGCCGC GAATTCCTAC GTTACGTCAT pro

130 (2) Informace o SEQ ID č.: 13:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A)	délka: 31 párů baží
(B)	typ: nukleová kyselina
(C)	řetězovost: jeden řetězec
(D)	topologie: lineární
ii) Typ	molekuly: jiná nukleová kyselina
(A)	popis: primer SON0003	užívaný
	konstrukci pSOGlO

(iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Popis sekvence: SEQ ID č.: 13: CTCGGATCCAGCAGATTCAAGAAGGTACAG 31 (2) Informace o SEQ ID č.:14:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 31 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0004 užívaný pro konstrukci pSOGlO (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Popis sekvence: SEQ ID č.: 14:

ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG 31 (2) Informace o SEQ ID č.: 15:

(i) Charakteristiky sekvencí:

131 (A) délka: 26 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0004 užívaný pro konstrukci pSOG19 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Popis sekvence: SEQ ID č.: 15:

CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC 26 (2) Informace o SEQ ID č. : 16:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 24 párů baží (B) typ: nukleová kyselina (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SONOOIO užívaný pro konstrukci pSOG19 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Popis sekvence: SEQ ID č.: 16:

AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 24 (2) Informace o SEQ ID č.:17:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 24 párů baží (B) typ: nukleová kyselina

132 (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0016 užívaný pro konstrukci pSOG19 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Popis sekvence: SEQ ID č.: 17:

GCTACCATGGCCACAATAGAACACC 24 (2) Informace o SEQ ID č.: 18:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A)	délka: 23 párů baží
(B)	typ: nukleová kyselina
(C)	řetězovost: jeden řetězec
(D)	topologie: lineární
(ii) Typ	molekuly: jiná nukleová kyselina
(A)	popis: primer SON0017	užívaný
konstrukci pSOG19

(iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Popis sekvence: SEQ ID č.: 18:

CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG 23 (2) Informace o SEQ ID č.: 19:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A) délka: 28 párů baží (B) typ: nukleová kyselina

133 (C) řetězovost: jeden řetězec (D) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: primer SON0039 užívaný konstrukci pSOG30 (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Popis sekvence: SEQ ID č.: 19: CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA (2) Informace o SEQ ID č.: 20:

(i) Charakteristiky sekvencí:

(A)	délka: 24 párů baží
(B)	typ: nukleová kyselina
(C)	řetězovost: jeden řetězec
(D)	topologie: lineární
(ii) Typ	molekuly: jiná nukleová kyselina
(A)	popis: primer SON0041	užívaný
konstrukci pSOG30

pro (iii) Hypotetická: ne (iv) Anti-sense: ne (v) Popis sekvence: SEQ ID č.: 20:

ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC

Claims

Izolovaná molekula DNK vyznačující se tím, že kóduje protein, který se vyskytuje v eukaryontech a má aktivitu protoporfyrinogenové oxidázy (protox).
2. Izolovaná molekula

DNK podle nároku vyznačující se tím, že zmíněný eukaryont je vyšší eukaryont.

Izolovaná molekula DNK podle nároku 2 vyznačující se tím, že zmíněný vyšší eukaryont je rostlina.

Izolovaná molekula

DNK podle nároku vyznačující se tím, že zmíněná rostlina dvouděložná rostlina.

je

Izolovaná molekula

DNK podle nároku vyznačující se tím, že zmíněná dvouděložná rostlina je z druhu Arabidopsis.

podle nároku 5 že zmíněný protein

Izolovaná molekula DNK vyznačující se tím, obsahuje sekvenci aminokyseliny selektovanou ze skupiny, která se skládá 'ze SEQ ID č.: 2 a 4.
7. Izolovaná molekula DNK podle nároku 3 vyznačující se tím, že zmíněná rostlina je jednoděložní rostlina.

135

8. Izolovaná vyznač rostlina je molekula ující se kukuřice. DNK tím, podle nároku 7 že zmíněná jednoděložní 9. Izolovaná molekula DNK podle nároku 8 vyznač ující se tím, že zmíněný protein obsahuje sekvenci aminokyseliny selektovanou ze skupiny skládáj ící z SEQ ID č.: 6 a 8 .
10. Molekula DNK kóduje modifikovanou protoporfyrinogenovou oxidázu (protox), zahrnující eukaryontní protox, který má modifikovanou nejméně jednu aminokyselinu vyznačující se tím, že tento modifikovaný protox je tolerantní k množství herbicidu, které inhibuje zmíněný eukaryontní protox.
11. Molekula DNK vyznačující se protox pochází z rostliny.

podle tím, že nároku 10 zmíněný eukaryontní
12. Molekula DNK vyznačuj ící dvouděložná rostlina.

podle tím, že nároku zmíněná rostlina je
13. Molekula v y z n a č u rostlina je z

DNK podle jící se tím, druhu Arabidopsis.

nároku 12 že zmíněná dvouděložná
14. Molekula vyznačuj i protox obsahuje skupiny, která se

DNK c i se sekvenci skládá ze podle nároku 13 tím, že zmíněný eukaryontní aminokyseliny selektovanou ze SEQ ID č.: 2 a 4.

136
15. Molekula DNK podle nároku 14 vyznačující se tím, že zmíněný eukaryontní protox obsahuje sekvenci aminokyseliny, která je uvedena v SEQ ID č.: 2.
16. Molekula DNK podle nároku 15 vyznačující se tím, že zmíněná modifikace nejméně jedné aminokyseliny je substituce aminokyseliny selektované ze skupiny obsahující alanin v pozici 220, glycin v pozici 221 a tyrosin v pozici 426 SEQ ID č.:2.

17. Molekula DNK podle nároku 16 vyznačuj ící se tím, že zmíněný alanin v pozici 220 je zaměněn za aminokyselinu selektovanou ze skupiny obsahující valin, threonin, leucin, cystein a

tyrosin.

18. Molekula DNK jící se zaměněn za se: podle tím, rin. nároku že zmíněný glycin 16 v v y z n a č u pozici 221 je 19 . Molekula DNK podle nároku 16 v y z n a č u jící se tím, že zmíněný tyrosin v pozici 426 je zaměněn za aminokyselinu selektovanou ze skupiny obsahující cystein, izoleuci ,.leucin a threonin. 20 . Molekula DNK podle nároku 11

vyznačující se tím, že zmíněná rostlina je jednoděložní rostlina.

137
21. Molekula DNK vyznačující se rostlina je kukuřice.
22. Molekula DNK vyznačující se protox obsahuje sekvenci skupiny, která se skládá z<

podle nároku 20 tím, že zmíněná jednoděložní podle nároku 21 tím, že zmíněný eukaryontní aminokyseliny selektované ze SEQ ID č.: 6 a 8.
23. Molekula DNK podle nároku 22 vyznačující se tím, že zmíněný eukaryontní protox obsahuje sekvenci aminokyseliny, která je uvedena v SEQ ID č.: 6.
24. Molekula DNK podle nároku 23 vyznačující se tím, že zmíněná modifikace nejméně jedné aminokyseliny je substituce aminokyseliny selektované ze skupiny obsahující alanin v pozici 166, glycin v pozici 167 a tyrosin v pozici 372 SEQ ID č.:6.
25. Molekula DNK podle nároku 24 vyznačující se tím, že zmíněný alanin v pozici 166 je zaměněn aminokyselinou selektovanou ze skupiny, která se skládá z valinu, threoninu, leucinu, cysteinu a tyrosinu.

26. Molekula DNK podle nároku 24 vyznaču jící se tím, že zmíněný glycin v pozici 167 je zaměněn za serin.
27. Molekula DNK vyznačuj ící podle se tím, že nároku 24 zmíněný tyrosin v pozici 372 je zaměněn aminokyselinou selektovanou ze

138

skupiny, threonin. která zahrnuje cystein, izoleucin, leucin a 28. Molekula DNK podle libovolného z nároků 10 až 27 vyzná č u j ící se tím, že je součástí

rostlinného genomu.
29. Chimérický gen vyznačující se tím, že obsahuje promotor operabilně vázán k molekule heterogenní DNK, která kóduje protein z vyšších eukaryontů, jenž má aktivitu protoporfyrinogenní oxidázy (protox).
30. Chimérický gen podle nároku 29 vyznačující se tím, že zmíněný promotor je aktivní v rostlině.
31. Chimérický gen podle nároku 30 obsahující navíc signální sekvenci operabilně vázanou se zmíněnou molekulou DNK vyznačující se tím, že zmíněná signální sekvence je schopna směrovat protein, který je kódován zmíněnou molekulou DNK, do chloroplastu.
32. Chimérický gen podle nároku 30 obsahující navíc signální sekvenci operabilně vázanou ke zmíněné molekule DNK vyznačující se tím, že zmíněná signální sekvence je schopna směrovat protein, který je kódován zmíněnou molekulou DNK do mitochondria.
33. Chimérický gen obsahující promotor vyznačující se tím, že je aktivní v rostlině a je operabilně vázán k molekule DNK podle nároku

10.

139
34. Chimérický gen podle nároku 33 obsahující navíc signální sekvenci operabilně vázanou ke zmíněné molekule DNK vyznačující se tím, že zmíněná signální sekvence je schopna směrovat protein kódovaný zmíněnou molekulou DNK do chloroplastu.

34 obsahující navíc signální ke zmíněné molekule DNK i m, že tato signální protein kódovaný zmíněnou
35. Chimérický gen podle nároku sekvenci operabilně vázanou vyznačující se t sekvence je schopna směrovat molekulou DNK do mitochondria.

36. Chimérický gen podle libovolného z nároků 29 až 35 vyznač u j i c i se tím, že je součástí rostlinného genomu 37. Rekombinantní vektor obsahující chimérický gen podle libovolného z nároků 29 až 35 vyznač ují c i se tím, že zmíněný vektor je

schopný být stabilně transformován do hostitelské buňky.
38. Rekombinantní vektor obsahující chimérický gen podle nároku 33 vyznačující se tím, že zmíněný vektor je schopný být stabilně transformován do rostlinné buňky.
39. Hostitelská buňka stabilně transformována vektorem podle libovolného z nároků 37 nebo 38 vyznačující se tím, že zmíněná hostitelská buňka je schopna exprimovat zmíněnou molekulu DNK.

140
40. Hostitelská buňka podle vyznačující se tím, že skupiny obsahující rostlinnou buňku, kvasinkovou buňku a hmyzzí buňku.

nároku 39 je selektovaná ze bakteriální buňku,
41. Rostlina nebo rostlinná buňka zahrnující své potomstvo a obsahující molekulu DNK podle libovolného z nároků 10 až 28 vyznačující se tím, že zmíněná molekula DNK je exprimována ve zmíněné rostlině a propůjčuje této rostlině nebo rostlinné buňce schopnost tolerovat herbicid v takovém množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu.
42. Rostlina nebo rostlinná buňka zahrnující své potomstvo a obsahující chimérický gen podle libovolného z nároků 29 až 36 vyznačující se tím, že zmíněný chimérický gen propůjčuje zmíněné rostlině nebo rostlinné buňce schopnost tolerovat herbicid v takovém množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu.
43. Rostlina a její potomstvo, včetně jejích částí, vykazující pozměněnou aktivitu protoporfyrinogenové oxidázy (protox) vyznačující se tím, že zmíněná pozměněná protox aktivita propůjčuje rostlině a jejímu potomstvu schopnost tolerovat herbicid v takovém množství, které inhibuje přirozeně se vyskytující protox aktivitu.
44. Rostlina podle libovolného z nároků 41 až 43 vyznačující se tím, že zmíněná rostlina je dvoděložná rostlina.

141
45. Rostlina podle nároku 44 vyznačující se tím, že zmíněná rostlina je selektována ze skupiny zahrnující sóju, bavlnu, tabák, cukrovou řepu a řepku olejnou.
46. Rostlina podle libovolného z nároků 41 až 43 vyznačující se tím, že zmíněná rostlina je jednoděložná rostlina.
47. Rostlina podle nároku vyznačující se tím, že zmíněná rostlina je selektována ze skupiny zahrnující kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves, turfové traviny a rýži.
48. Rostlina podle libovolného z nároků 41 až 43 vyznačující se tím, že zmíněná pozměněná protox aktivita je způsobena nadměrnou expresí protox enzymu, který se přirozeně vyskytuje ve zmíněné rostlině.
49. Rostlina podle libovolného z nároků 41 až 43 vyznačující se tím, že zmíněná pozměněná protox aktivita je zajištěna expresí molekuly DNK, která kóduje k herbicidu tolerantní protox enzym.
50. Rostlina podle vyznačující se tí tolerantní k herbicidu se prokaryontech.
51. Rostlina podle vyznačující se tí je vybrán ze skupiny zahrnující typhimurium.

nároku 49 m, že zmíněný protox enzym přirozeně vyskytuje v nároku 50 m, že zmíněný prokaryont E. coli, B. subtilis a S.

142
52. Rostlina podle nároku 49 vyznačující se tím, že zmíněný protox enzym schopný tolerovat herbicid je modifikovaná forma proteinu, který se přirozeně vyskytuje v prokaryontech.
53. Semeno rostliny podle libovolného z nároků 41 až 52.
54. Rostlina podle libovolného z nároků 41 až 52 vyznačující se tím, že je hybridní rostlina.
55. Rostlinný pomnožovací materiál podle libovolného z nároků 41 až 54 vyznačující se tím, že je ošetřen ochraným povlakem.
56. Pomnožovací materiál podle nároku 55 vyznačující se tím, že obsahuje přípravek selektovaný ze skupiny, která zahrnuje herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, molluscicidy nebo jejich směsi.
57. Pomnožovací materiál podle vyznačující se tím, semene.

nároku 55 nebo že se sestává ze nežádoucí vegetace že spočívá v aplikaci růstu se tím,
58. Způsob kontroly vyznačuj ící účinného množství protox inhibujíčího herbicidu na populaci rostliny podle libovolného z nároků 41 až 54.

143
59. Způsob podle nároku 58 vyznačující se tím, že zmíněná rostlina je selektována ze skupiny obsahující sóju, bavlnu, tabák, cukrovou řepu, řepku olejnou, kukuřici, pšenici, čirok, žito, oves turfové traviny a rýži.
60. Způsob podle nároku 59 vyznačující se tím, že zmíněný protox inhibující herbicid je selektován ze skupiny zahrnující aryluracil, difenylether, oxidiazol, imid, fenyl pyrazol, derivát pyridinu, 3-substituovaný-2aryl-4,5,6,7-tetrahydroindazol, fenopylat a 0fenylpyrrolidino- a piperidinokarbamatové analogy zmíněného fenopylatu.
61. Způsob podle nároku 60 vyznačující se tím, že zmíněný protox inhibující herbicid je imid a má vzorec