PL186842B1 - Konstrukt genowy kodujący białko mające aktywnośćoksydazy protoporfirynogenu, komórka gospodarza, komórka roślinna i jej potomstwo, sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji, sposób selekcji roślin, tkanek roślinnych lub komórek roślinnych - Google Patents

Abstract

1 . Konstrukt genowy kodujacy bialko majace aktywnosc oksydazy protoporfirynogenu zawierajacy pro- motor zdolny do funkcjonowania w roslinie lub w komórce roslinnej, który jest funkcjonalnie polaczony z cza- steczka heterologicznego DNA, wyizolowana z genu hemG E coli lub genu hemY B subtilis i kodujaca bialko majace aktywnosc oksydazy protoporfirynogenu 7. Komórka gospodarza zawierajaca konstrukt z promotorem zdolnym do funkcjonowania w roslinie lub w komórce roslinnej, funkcjonalnie polaczonym z czasteczka heterologicznego DNA kodujaca bialko majace aktywnosc oksydazy protoporfirynogenu, znamienna tym, ze zawiera czasteczke DNA wyizolo- wana z genu hemG E coli albo genu hemY B. subtilis. 12 Komórka roslinna i jej potomstwo zawierajaca promotor zdolny do funkcjonowania w roslinie lub w komórce roslinnej, funkcjonalnie polaczony z czasteczka heterologicznego DNA kodujaca bialko majace aktywnosc oksydazy protoporfirynogenu, znamienna tym, ze zawiera czasteczke DNA wyizolo- wana z genu hemG E coli lub genu hemY B subtilis. 19 Sposób kontrolowania wzrostu niepozadanej wegetacji, przez traktowanie populacji roslin sku- teczna iloscia herbicydu hamujacego oksydaze protoporfirynogenu, znam ienny tym, ze do roslin, które maja byc chronione wprowadza sie konstrukt zawierajacy promotor zdolny do funkcjonowania w roslinie lub w komórce roslinnej 1 funkcjonalnie polaczony z czasteczka heterologicznego DNA kodujaca bialko majace aktywnosc oksydazy protoporfirynogenu, która to czasteczka DNA jest wyizolowana z genu hemG E colt lub genu hemY B subtilis PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest konstrukt genowy kodujący białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu, komórka gospodarza, komórka roślinna i jej potomstwo oraz sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji i sposób selekcji roślin.

Wynalazek stosuje się do manipulowania aktywnością enzymatyczną odpowiedzialną za przekształcenie protoporfirynogenu IX w protoporfirynę IX w szlaku biosyntetycznym wspólnym dla wszystkich organizmów eukariotycznych. W jednym z aspektów, wynalazek stosuje się:

186 842 do wytwarzania oporności na herbicydy w roślinach, tkankach roślinnych i w nasionach, w innych: do opracowania diagnostyki i leczenia braku takiej aktywności u zwierząt i u ludzi.

Szlaki biosyntetyczne, które prowadzą do wytwarzania chlorofilu i hemu mają wiele wspólnych etapów. Chlorofil jest gromadzącym światło pigmentem obecnym u wszystkich zielonych organizmów prowadzących fotosyntezę. Hem jest kofaktorem hemoglobiny, cytochromów, oksygenaz P-450 o złożonym działaniu, peroksydaz oraz katalaz (patrz np. Lehninger, Biochemistry. Worth Publishers, New York (1975)), a zarazem jest niezbędnym składnikiem wszystkich organizmów aerobowych.

Ostatnim wspólnym etapem biosyntezy chlorofilu i hemu jest utlenienie protoporfirynogenu IX do protoporfiryny IX. Oksydaza protoporfirynogenu (określana tu jako „protoks”) jest enzymem, który katalizuje ten ostatni etap utleniania (Matringe et al., Biochem. J. 260: 231 (1989)).

Enzym protoks został częściowo lub całkowicie oczyszczony z dużej liczby organizmów, włączając w to drożdże Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois and Labbe, W Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E.H. Dailey, ed. McGraw Hill: New York, str. 235-285 (1990)), etioplasty owsa (Jacobs and Jacobs, Biochem. J. 244: 219 (1987)), i mysią wątrobę (Dailey and Karr, Biochem. 26: 2697 (1987)). Geny kodujące protoks zostały wyizolowane z dwóch organizmów prokariotycznych, Escherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) i Bacillus subtilis (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Geny te nie wykazują podobieństwa sekwencji, jak również ich przewidywane produkty białkowe nie wykazują jakiegokolwiek podobieństwa sekwencji aminokwasowej. Białko E coli ma wielkość około 21 kD i jest związane z błoną komórkową. Białko B. subtilis o wielkości około 51 kD ma aktywność rozpuszczalną, cytoplazmatyczną.

W chwili obecnej zbyt mało wiadomo o enzymie protoks, aby możliwe było izolowanie genów kodujących protoks z wyższych organizmów eukariotycznych (tj. zwierząt, roślin i wszystkich innych wielokomórkowych zawierających jądra organizmów, innych niż niższe mikroorganizmy eukariotyczne, takie jak drożdże, jednokomórkowe glony, pierwotniaki itd.) stosując znane podejścia.

W szczególności, wiele ze standardowych technik izolacji nowych białek i genów opiera się na założeniu, ze ich struktura pierwszorzędowa (tj. sekwencja aminokwasów i DNA) będzie wykazywać znaczące podobieństwo do znanych białek i genów, które mają taką samą funkcję. Takie standardowe techniki obejmują hybrydyzację kwasów nukleinowych i powielanie w reakcji łańcuchowej polimerazy przy zastosowaniu starterów oligonukleotydowych odpowiadających konserwowanym motywom w sekwencji aminokwasowej. Nie można się spodziewać przydatności tych technik do izolowania eukariotycznych genów protoks przy zastosowaniu obecnie dostępnej informacji o strukturze, która ogranicza się jedynie do prokariotycznych genów protoks, ponieważ nie ma podobieństwa strukturalnego nawet pomiędzy znanymi prokariotycznymi genami i białkami.

Inne podejście, które było stosowane do izolowania genów biosyntetycznych z innych szlaków metabolicznych z wyższych eukariontów polega na komplementacji mutantów mikroorganizmów z brakiem aktywności będącej przedmiotem zainteresowania. W takim podejściu biblioteka cDNA z wyższego eukarionta jest klonowana w wektorze, który może kierować ekspresją cDNA w mikroorganizmie będącym gospodarzem. Wektor jest następnie transformowany lub wprowadzany w inny sposób do zmutowanego mikroorganizmu i izoluje się kolonie, które fenotypowo nie sąjuż mutantami.

Strategia ta powiodła się przy izolacji genów z wyższych eukariontów, które są związane z kilkoma drogami metabolicznymi, włączając w to biosyntezę histydyny (np. patent USA nr 5290926 i WO 94/026909 dla Ward i wsp., włączony tu w całości jako odnośnik), biosyntezę lizyny (np. Frisch et al., Mol. Gen. Genet. 228: 287 (1991)), biosyntezę puryn (np. Aimi et al., J. Biol. Chem. 265: 9011 (1990)), oraz biosyntezę tryptofanu (np. Niyogi et al., Plant Cell 5: 1011 (1993)) Jednakże pomimo dostępności mutantów mikroorganizmów, które, jak się uważa, są defektywne pod względem aktywności protoks (np. E. coli (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., J. Bacteriol. 174. 3953 (1992)) i Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al,. Biochem. Biophys. Res. Comm. 106.

186 842

724 (1982)), zastosowanie tej techniki do izolowania cDNA kodujących eukariotyczną aktywność enzymatyczną protoks jest na podstawie dostępnych informacji co najmniej nieprzewidywalne.

Istnieje wiele przyczyn tego faktu. Po pierwsze, poziom ekspresji sekwencji cDNA eukariotycznego protoks może nie być odpowiedni w zmutowanym mikroorganizmie, na przykład z powodu użycia kodonów, pozostającego w niezgodzie z preferencjami użycia w mikroorganizmie będącym gospodarzem. Po drugie, pierwotny produkt translacji sklonowanej eukariotycznej sekwencji kodującej może nie wytwarzać funkcjonalnego polipeptydu, na przykład, gdy aktywność wymaga posttranslacyjnej modyfikacji, takiej jak glikozylacja, która nie jest przeprowadzana przez mikroorganizm. Po trzecie białko eukariotyczne może nie przyjmować aktywnej konformacji w mikroorganizmie będącym gospodarzem, np. gdy białko jest normalnie kierowane do specyficznego systemu błon organellarnych, których nie posiada mikroorganizm będący gospodarzem. Ta ostatnia możliwość jest szczególnie prawdopodobna dla roślinnego enzymu protoks, który jest związany w komórce roślinnej z organellami nieobecnymi w mikroorganizmach, będących gospodarzami w teście komplementacji. W szczególności roślinny enzym protoks jest związany zarówno z błoną zewnętrzną chloroplastu, jak i błonami tylakoidu (Matringe et al., J. Biol. Chem. 267: 4646 (1992) i prawdopodobnie dociera do tego systemu membran w rezultacie posttranslacyjnego mechanizmu transportu, obejmującego zarówno N-końcową sekwencję kierującą, jak i własności samego dojrzałego polipeptydu (patrz np. Kohorn and Tobin, Plant Cell 1: 159 (1989); Li et al., Plant Cell 3: 709 (1991); Li et al., J. Biol.Chem. 267: 18999 (1992)).

Wiadomo, że enzym protoks odgrywa rolę w pewnych przypadkach chorób ludzkich. Pacjenci cierpiący na różnorodne porfirie, autosomalną chorobę dominującą, charakteryzują się zarówno symptomami neuropsychiatrycznymi, jak i defektami skóry, uzależnionymi od wzrostu poziomu aktywności protoks (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med 302: 765 (1980)). Wskutek braku wiedzy odnośnie ludzkiego enzymu protoks i odpowiadającego mu genu, możliwości diagnostyki i leczenia tej choroby są w chwili obecnej bardzo ograniczone.

Stosowanie herbicydów do kontrolowania niepożądanej wegetacji, takiej jak chwasty lub rośliny na zbiorach, stało się nieomalże powszechną praktyką. Związane z tym wydatki przekraczają rocznie bilion dolarów. Pomimo intensywnego stosowania, utrzymywanie pod kontrolą chwastów pozostaje znaczącym i kosztownym problemem dla rolników.

Stosowanie herbicydów wymaga rozsądnego postępowania. Przykładowo: czas, sposób postępowania oraz stadium rozwojowe chwastów są krytyczne dla uzyskania dobrej kontroli chwastów poprzez herbicydy. Wytwarzanie skutecznych herbicydów staje się coraz ważniejsze, ponieważ różne gatunki chwastów pozostają oporne na herbicydy.

Należy zauważyć, ze herbicydy, które cechują się dużą intensywnością, szerokim zasięgiem działania wobec chwastów i szybkim rozpadem w glebie, często cechują się też większą fitotoksycznością dla upraw. Jednym z rozwiązań stosowanych w takim przypadku jest wytworzenie roślin uprawnych, które są oporne lub tolerują herbicydy. Hybrydowe rośliny uprawne lub odmiany oporne na herbicydy umożliwiły użycie herbicydu w uprawach, w których jego użycie było uprzednio wykluczone lub ograniczone (np. do stosowania przed-zagrożeniowego) wskutek wrażliwości uprawy na herbicyd. Przykładowo Patent USA Nr 4 761 373 dla Anderson i wsp. odnosi się do roślin opornych na różnorodne herbicydy imidazolinonowe lub sulfonamidowe. Oporność jest uzyskiwana poprzez zmieniony enzym syntazę kwasu hydroksy-octowego (AHAS). Patent USA Nr 4 975 374 dla Goodmana i wsp. dotyczy komórek roślinnych i roślin zawierających gen kodujący zmutowaną syntetazę glutaminy (GS) oporną na hamowanie przez herbicydy, o których wiadomo, ze hamują GS, np. fosfinotrycynę i sulfoksy-minę metioniny. Patent USA Nr 5 013 659 dla Bedbrooka i wsp. dotyczy roślin, w których następuje ekspresja zmutowanej syntazy acetylomleczanowej, co czyni roślinę oporną na hamowanie przez herbicydy sulfonylomocznikowe. Patent USA Nr 5 162 602 dla Somersa i wsp. opisuje rośliny wykazujące tolerancję wobec hamowania przez herbicydy: cykloheksa-nedion i kwas arylooksyfenoksypropionowy. Tolerancja jest wynikiem zmienionej karboksylazy acetylokoenzymu A (ACCazy).

Enzym protoks służy jako cel dla wielu związków będących herbicydami. Herbicydy, które hamują protoks obejmują wiele różniących się strukturalnie klas cząsteczek (Duke et al.,

186 842

Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)). Herbicydy takie obejmują difenyloetery {np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluorometylo)fenoksy]-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorfen, 2-chloro-1-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen)}, oksydiazole, (np. oksydiazon, 3-[2,4-di-chloro-5-(1-metyloetoksy)fenylo)-5-(1,1-dimetyloetylo)-1,3,4-oksadiazol-2-(3H)-on), cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargiloksyfenylo)-3,4,5,6-tetra-hydroftalimid; chloroftalim, N-(4-chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), fenylopirazole (np. TNPP-etyl, 2-[1-(2,3,4-trichlorofenylo)-4-nitropirazolilo-5-oksy)propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydyny (np. LS 82-556) oraz fenopilan i jego analogi O-fenylo-pirrolidynowe i piperydynokarbaminowe. Wiele z tych związków kompetytywnie hamuje normalną reakcję katalizowaną przez enzym, działając jako analogi substratów.

Przewidywany sposób działania herbicydów hamujących protoks obejmuje akumulację protoporfirynogenu IX w chloroplastach. Uważa się, że akumulacja ta prowadzi do wyciekania protoporfirynogenu do cytoplazmy, gdzie jest on utleniany przez aktywność peroksydazy do protoporfiryny IX. Gdy protoporfiryna IX jest wystawiona na działanie światła, może powodować wytwarzanie singletowego tlenu w cytozolu. Ten singletowy tlen może z kolei prowadzić do powstania innych aktywnych związków tlenu, które powodująperoksydację tłuszczy i uszkodzenie błony, prowadząc do gwałtownej śmierci komórki (Lee et al., Plant Physiol.102: 881 (1993).

Nie wszystkie enzymy protoks są wrażliwe na herbicydy, które hamują roślinne enzymy protoks. Zarówno enzymy protoks kodowane przez geny izolowane z Escherichia coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993), jak i Bacillus subtilis (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994) są oporne na hamowanie przez herbicydy. Ponadto, opisano mutanty jednokomórkowych glonów Chlamydomonas reinhardtii oporne na fenyloimidowy herbicyd S-23142 (Kataoka et al., J. Pesticide Sci. 15: 449 (1990); Shibata et al., W Research in Photosynthesis, Vol.I II; N. Murata, ed. Kluwer: Netherlands. str. 567-570 (1992)). Co najmniej jeden z takich mutantów okazał się mieć zmienioną aktywność protoks, która jest oporna nie tylko na herbicyd, na który mutant był wyselekcjonowany, ale również na inne klasy inhibitorów protoks (Oshio et al., Z. Naturforsch. 48c: 339 (1993); Sato et al., W ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ed. ACS Press: Washington, D.C. (1994)). Opisano również linię komórkową mutanta tytoniu, która jest oporna na inhibitor S21432 (Che et al., Z. Naturforsch. 48c: 350 (1993).

Konstrukt genowy, który koduje białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu ma, zgodnie z wynalazkiem, promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub w komórce roślinnej funkcjonalnie połączony z cząsteczką heterologicznego DNA, wyizolowaną z genu hemG E coli lub genu hemY B. subtilis i kodującą białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu.

W szczególności konstrukt zawiera gen hemG E. coli albo gen hemY B. subtilis.

Korzystnie konstrukt według wynalazku zawiera dodatkowo sekwencję sygnałową funkcjonalnie połączoną z cząsteczką DNA, przy czym ta sekwencja jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do chloroplastu albo do mitochondrium. Konstrukt według wynalazku jest korzystnie częścią genomu roślinnego.

Komórka gospodarza według wynalazku zawiera konstrukt z promotorem zdolnym do funkcjonowania w roślinie lub w komórce roślinnej, funkcjonalnie połączonym z cząsteczką heterologicznego DNA kodującą białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu i charakteryzuje się tym, że zawiera cząsteczkę DNA wyizolowaną z genu hemG E. coli albo genu hemY B. subtilis.

Korzystnie komórka gospodarza zawiera konstrukt, który ma dodatkowo sekwencję sygnałową funkcjonalnie połączoną z cząsteczką DNA, przy czym ta sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do chloroplastu albo do mitochondrium.

186 842

Komórka gospodarza jest korzystnie wybrana z grupy obejmującej komórki roślinne, komórki bakteryjne, komórki drożdży i komórki owada, a szczególnie korzystnie jest komórką roślinną.

Komórka roślinna i jej potomstwo według wynalazku zawiera promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub w komórce roślinnej, funkcjonalnie połączony z cząsteczką heterologicznego DNA kodującą białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu i charakteryzuje się tym, że zawiera cząsteczkę DNA wyizolowaną z genu hemG E coli lub genu hemY B. subtilis.

Korzystnie komórka roślinna według wynalazku ma wprowadzoną cząsteczkę DNA, która zawiera gen hemG E coli albo zawiera gen hemY B. subtilis.

Komórka roślinna według wynalazku jest korzystnie komórką rośliny dwuliściennej, w szczególności wybraną z grupy składającej się z komórek soi, bawełny, tytoniu, buraka cukrowego i rzepaku, albo alternatywnie jest komórką rośliny jednoliściennej, w szczególności wybraną z grupy składającej się z komórek kukurydzy, pszenicy, sorgo, żyta, owsa, trawy darniowej i ryżu.

Sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji według wynalazku polega na traktowaniu populacji roślin skuteczną ilością herbicydu hamującego oksydazę protoporfirynogenu i charakteryzuje się tym, ze do roślin, które mają być chronione wprowadza się konstrukt zawierający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub w komórce roślinnej i funkcjonalnie połączony z cząsteczką heterologicznego DNA kodującą białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu, która to cząsteczka DNA jest wyizolowana z genu hemG E. coli lub genu hemY B. subtilis.

Korzystnie sposobem według wynalazku chroni się rośliny wybrane z grupy obejmującej soję, bawełnę, tytoń, buraki cukrowe, rzepak, kukurydzę, pszenicę, sorgo, żyto, owies, trawę darniową i ryż, a jako herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu korzystnie stosuje się herbicyd wybrany z grupy składającej się z arylouracylu, difenyloeteru, oksydiazolu, cyklicznego imidu, fenylopirazolu, pochodnych pirydynowych, podstawionego w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazolu, fenopilanu oraz O-fenylopirolidyno- i piperydynokarbanylowych analogów tego fenopilanu.

Równie korzystnie w sposobie według wynalazku jako herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu stosuje się cykliczny imid o wzorze 5, w którym Q oznacza wzór 6 albo 7, albo 8, albo 9, albo 9a, albo 9b i w którym Ri oznacza H, Cl albo F, R2 oznacza Cl, a R3 jest eterem, tioeterem, estrem, grupą aminową albo alkilową i w którym R2 i R3 razem mogą tworzyć 5- albo 6-składnikowy pierścień heterocykliczny.

Korzystnie też w sposobie według wynalazku jako herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu stosuje się cykliczny imid wybrany z grupy składającej się ze związków o wzorze 10, 11, 112, 113, 14. 15, 16 i 17, w których R oznacza grupę albo herbicyd określony wzorem wybranym z grupy obejmującej wzory 18, 19, 20 i 21.

Sposób selekcji roślin, tkanek roślinnych lub komórek roślinnych stransformowanych transgenem będącym przedmiotem zainteresowania spośród roślin nie stransformowanych według wynalazku polega na tym, że:

(a) transformuje się rośliny, tkanki roślinne lub komórki roślinne transgenem będącym przedmiotem zainteresowania i konstruktem zawierającym promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub w komórce roślinnej, funkcjonalnie połączonym z cząsteczką heterologicznego DNA, kodującą białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu, wyizolowaną z genu hemG E. coli lub genu hemY B. subtilis.

(b) przenosi się tak stransformowane rośliny lub komórki roślinne do pożywki zawierającej inhibitor oksydazy protoporfirynogenu, który jest wybrany z grupy złożonej z arylouracylu, difenyloeteru, oksydiazolu, cyklicznego imidu, fenylopirazolu, pochodnych pirydynowych, podstawionego w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazolu, fenopilanu oraz O-fenylopirolidynoi piperydynokarbanylowych analogów tego fenopilanu, przy czym stężenie herbicydu hamującego oksydazę prctcporfirynogenu w pożywce wynosi 0,001 do 3000 części na milion, oraz (c) selekcjonuje się rośliny lub komórki roślinne, które przezywają w pożywce.

Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania komórki roślinnej, zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z prokariota mające aktywność oksydazy prctopcrfirynogenu

186 842 (protoks), charakteryzuje się tym, że komórkę roślinną transformuje się zrekombinowaną cząsteczką wektora według wynalazku.

Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania transgenicznego potomstwa transgenicznej rośliny rodzicielskiej, zawierającej wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z prokariota mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks), charakteryzuje się tym, ze roślinę rodzicielską transformuje się zrekombinowaną cząsteczką wektora według wynalazku i przenosi się na potomstwo cechy tolerowania herbicydu takiej rodzicielskiej rośliny transgenicznej, stosując znane techniki hodowli roślin.

Jak zostało wcześniej stwierdzone, wynalazek znajduje szereg zastosowań do manipulowania aktywnością enzymatyczną odpowiedzialną za przekształcenie protoporfirynogenu IX w protoporfirynę IX w szlaku biosyntetycznym wspólnym dla wszystkich organizmów eukariotycznych.

W szczególności znajduje zastosowanie przy wytwarzaniu roślin, komórek roślinnych, tkanek roślinnych i nasion roślin ze zmienioną aktywnością protoks, które są oporne lub przynajmniej tolerują hamowanie przez herbicydy na poziomie, który normalnie hamuje naturalnie występującą w roślinach aktywność protoks, a zwłaszcza roślin, w których zmieniona aktywność protoks jest wynikiem nadprodukcji enzymu protoks typu dzikiego lub ekspresji cząsteczki DNA, kodującej enzym protoks tolerujący herbicyd. Taki enzym protoks tolerujący herbicyd może być zmodyfikowaną formą enzymu protoks, który naturalnie występuje w organizmie eukariotycznym, w tym roślinie lub w organizmie prokariotycznym. Wynalazek jest szczególnie korzystnie stosowany w odniesieniu do roślin jednoliściennych i dwuliściennych, a zwłaszcza roślin hybrydowych. Korzystne są takie rośliny, które mogłyby być potencjalnym celem dla herbicydów hamujących protoks, a szczególnie ważne uprawy rolne, takie jak kukurydza i inne uprawy zbożowe, takie jak pszenica, owies, żyto, sorgo, ryż, jęczmień, proso, oraz trawy darniowe i paszowe i temu podobne, jak również bawełna, tytoń, trzcina cukrowa, buraki cukrowe, rzepak i soja.

Jedno z konkretnych zastosowań wynalazku dotyczy wytwarzania transgenicznych roślin kukurydzy, tkanek kukurydzy lub nasion kukurydzy i ich transgenicznego potomstwa, które zostały stabilnie transformowane cząsteczką zrekombinowanego DNA, zawierającą odpowiedni promotor, działający w roślinach, połączony w sposób funkcjonalny z genem struktury kodującym niezmodyfikowany prokariotyczny enzym protoks, który jest oporny na herbicyd. Również uzyskanie nadprodukcji w roślinach niezmodyfikowanego protoks, wystarczającej do przezwyciężenia hamowania enzymu przez herbicyd jest możliwe przez stabilne stransformowanie komórek roślinnych, tkanek roślinnych i nasion roślin oraz ich transgenicznego potomstwa cząsteczką zrekombinowanego DNA, zawierającą odpowiedni promotor działający w roślinach, połączony w sposób funkcjonalny z genem struktury, kodującym niezmodyfikowany eukariotyczny enzym protoks. Wynalazek może być stosowany również przy wytwarzaniu roślin, w których zachodzi ekspresja zmienionego enzymu protoks, tolerującego hamowanie enzymu przy stężeniu herbicydu, które normalnie hamuje aktywność niezmienionego protoks typu dzikiego. Wówczas, roślina może być stabilnie transformowana zrekombinowaną cząsteczką DNA zawierającą gen struktury, kodujący oporny protoks lub być uzyskana poprzez bezpośrednie techniki selekcji, dzięki którym izoluje się, charakteryzuje i wprowadza linie oporne na herbicyd.

Niniejszy wynalazek może być stosowany do poszukiwania nowych herbicydów, które wpływają na aktywność protoks i do identyfikacji mutantów protoks opornych na herbicyd, natomiast geny kodujące zmieniony protoks mogą być użyte jako marker selekcyjny przy transformowaniu komórek roślinnych.

W zakres stosowania wynalazku należy zaliczyć wytwarzanie kaset ekspresyjnych i sond zdolnych do specyficznej hybrydyzacji z sekwencją eukariotycznego DNA oraz sposobów wykrywania takich sekwencji DNA w organizmach eukariotycznych i obecności w nich różnych postaci genu protoks, a także określania poziomu oddziaływania transkryptów genu protoks w organizmie. Sposoby te mogą być użyte do diagnozowania chorób, które są związane ze zmienioną formą enzymu protoks lub zmienionymi poziomami ekspresji enzymu protoks.

Izolowana cząsteczka DNA, która koduje eukariotyczną postać oksydazy protoporfirynogenu (nazywanego tu „protoks”), koduje enzym katalizujący utlenienie protoporfirynogenu IX

186 842 do proroporfiryny IX. Kodujące sekwencje DNA i odpowiadające sekwencje aminokwasowe dla enzymu protoks z Arabidopsis thaliana są przedstawione jako SEK NR ID 1-4 i 9-10. Kodujące sekwencje DNA i odpowiadające sekwencje aminokwasowe dla enzymów protoks z kukurydzy są przedstawione jako SEK NR ID 5-8.

W oparciu o ujawnione dane może zostać wyizolowany dowolny, pożądany eukariotyczny DNA kodujący enzym protoks. Konkretne przykłady sposobu izolowania sekwencji kodującej protoks eukariotyczny są dalej przedstawione w opisie. W tych sposobach klony cDNA kodujące protoks są identyfikowane w bibliotece klonów cDNA, pochodzących z odpowiedniego organizmu eukariotycznego, w oparciu o ich zdolność do dostarczania enzymatycznej aktywności protoks zmutowanemu organizmowi gospodarza, któremu brak tej aktywności. Organizmami odpowiednimi do zastosowania w tej metodzie są takie organizmy, które mogą być użyte do przeszukiwania ekspresyjnych bibliotek cDNA i dla których dostępne są lub mogą być rutynowo wytworzone mutanty defektywne pod względem aktywności protoks. Takie organizmy obejmują między innymi E. coli (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol.113: 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) i Saccharomyces cerevisiae (Camadro et al. Biochem. Biophys. Res. Comm.106: 724 (1982)).

Alternatywnie, eukariotyczne sekwencje kodujące protoks mogą być izolowane według dobrze znanych technik opartych o homologię ich sekwencji do sekwencji kodujących protoks z Arabidopsis thaliana (sEk NR ID: 1,3 i 9) i Zea mays SEK NR ID: 5 i 7. W tych technikach cała znana sekwencja kodująca protoks lub jej część jest stosowana jako sonda, która selektywnie hybrydyzuje do innych sekwencji kodujących protoks, obecnych w populacji sklonowanych genomowych fragmentów DNA lub fragmentów cDNA (tj. bibliotek genomowych lub cDNA) z wybranego organizmu. Takie techniki obejmują przeszukiwanie poprzez hybrydyzację wysianych bibliotek DNA (łysinek bądź kolonii; patrz Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989)) i powielanie poprzez PCR przy zastosowaniu starterów oligonukleotydowych, odpowiadających sekwencji domen konserwowanych w obrębie znanych sekwencji aminokwasowych protoks (patrz np. Innis et al., PCR Protocols a Guide to Methods and Applications eds., Academic Press (1990)). Metody te są szczególnie odpowiednie do izolowania sekwencji kodujących protoks z organizmów pokrewnych z tymi, z których pochodziła sekwencja sondy. Przykładowo, można się spodziewać, że zastosowanie tych metod przy użyciu jako sond sekwencji kodujących z Arabidopsis będzie szczególnie odpowiednie do izolowania sekwencji kodującej protoks z innych gatunków roślin.

Izolowane eukariotyczne sekwencje protoks, odpowiednio do potrzeb, mogą być poddawane manipulacjom według standardowych technik inżynierii genetycznej. Przykładowo, cała sekwencja protoks lub jej część może być użyta jako sonda mająca zdolność do specyficznej hybrydyzacji z sekwencjami kodującymi protoks i informacyjnymi RNA. Aby uzyskać specyficzną hybrydyzację w różnych warunkach, takie sondy obejmują sekwencje, które są unikalne wśród sekwencji kodujących protoks i mają długość co najmniej 10 nukleotydów, a korzystniej długość 20 nukleotydów. Takie sondy mogą być użyte do powielania i analizowania sekwencji kodującej protoks z wybranych organizmów przy zastosowaniu dobrze znanego procesu - reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Technika ta może być użyteczna do powielania i analizy sekwencji kodujących protoks z żądanych organizmów lub jako test diagnostyczny do stwierdzania obecności sekwencji kodującej protoks w organizmie i do skorelowania zmienionych sekwencji kodujących z niepomyślnymi przypadkami, takimi jak autosomalna dominująca choroba u ludzi, charakteryzująca się zarówno objawami neuropsychiatrycznymi, jak i skórnymi, w której zmniejszony jest poziom aktywności protoks (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765(1980)).

Sondy do hybrydyzacji specyficzne dla protoks mogą być również użyte do ustalania lokalizacji natywnego eukariotycznego genu(genów) protoks w genomie wybranego organizmu przy zastosowaniu standardowych technik opartych o selektywną hybrydyzację sondy z genomowymi sekwencjami protoks. Techniki te obejmują między innymi identyfikację polimorfizmów DNA, zidentyfikowanych lub zawartych w obrębie sekwencji sondy protoks i zastosowanie takich polimorfizmów do śledzenia segregacji genu protoks w stosunku do innych markerów o znanej pozycji mapowej w pochodzącej z samozapłodnienia hybrydy dwóch

186 842 polimorficznych linii rodzicielskich (patrz Helentjaris et al., Plant Mol. Biol. 5: 109 (1985). Sommer et al. Biotechniques 1282 (1992); D'Ovidio et al., Plant Mol. Biol. 15: 169 (1990)). Jakkolwiek dowolna eukariotyczna sekwencja protoks może być brana pod uwagę jako użyteczna do zastosowania jako sonda do mapowania genów protoks z dowolnego organizmu eukariotycznego, korzystnymi sondami są sekwencje protoks z organizmów bliżej spokrewnionych z wybranym organizmem, a najkorzystniejszymi sondami są sekwencje protoks z wybranego organizmu. Mapowanie genów protoks w taki sposób uważa się za szczególnie użyteczne w przypadku roślin ze względów hodowlanych. Przykładowo, znając pozycję na mapie genetycznej zmutowanego genu protoks, warunkującego oporność na herbicyd, można zidentyfikować otaczające markery DNA ze znanej mapy genetycznej (patrz np. Helentjaris, Trends Genet. 3: 217 (1987)). Podczas wprowadzania cechy oporności na herbicyd do nowej linii hodowlanej, markery te mogą być stosowane do śledzenia zasięgu otaczającego chromosomalnego DNA sprzężonego z protoks, nadal obecnego we wstecznym pokoleniu rodzicielskim po każdej rundzie krzyżowania wstecznego.

Sondy specyficznie hybrydyzujące z protoks mogą być również używane do oznaczania poziomu mRNA dla protoks w organizmie przy zastosowaniu standardowych technik, takich jak analiza Northern. Taka technika może być stosowana jako test diagnostyczny do wykrywania zmienionych poziomów ekspresji, co może być związane z niektórymi przypadkami chorób, takimi jak autosomalna dominująca choroba u ludzi, charakteryzująca się zarówno objawami neuropsychiatrycznymi, jak i skórnymi, w której zmniejszony jest poziom aktywności protoks (Brenner and Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765 (1980)).

Celem wytworzenia zrekombinowanego enzymu w organizmie gospodarza, sekwencja kodująca protoks może być wstawiona do kasety ekspresyjnej, zaprojektowanej dla wybranego gospodarza i wprowadzonej do gospodarza, w którym protoks ma być wytworzony na drodze rekombinacji. Wybór specyficznych sekwencji regulacyjnych, takich jak promotor, sekwencja sygnałowa, sekwencje 5' i 3' nie podlegające translacji oraz sekwencje wzmacniające (ang. enhancer) pozostają z zakresie umiejętności biegłych w tej dziedzinie. Uzyskana w rezultacie cząsteczka, zawierająca poszczególne elementy połączone w odpowiedniej ramce odczytu, może być włączona do wektora, którym można transformować komórki gospodarza. Odpowiednie wektory ekspresyjne i metody wytwarzania białek technikami rekombinowania DNA są dobrze znane dla organizmów gospodarzy, takich jak E. coli (patrz, np. Studier and Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113 (1986); Brosius, DNA 8: 759 (1989)), drożdże (patrz np. Schneider and Guarente, Meth. Enzymol.194: 373 (1991)) i komórki owada (patrz np. Luckow and Summers, BiolTechnol. 6: 47 (1988)). Konkretne przykłady obejmują plazmidy, takie jak pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), pTrcHis (Invitrogen, La Jolla, CA) oraz bakulowirusowe wektory ekspresyjne, np. takie, które pochodzą z genomu wirusa Autographica californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV). Korzystnym systemem bakulowirus/owad są komórki pVI11392/Sf21 (Invitrogen, La Jolla, CA).

Eukariotyczny enzym protoks, wytworzony poprzez rekombinowanie DNA ma wiele zastosowań. Przykładowo, może być on użyty do dostarczania enzymatycznej aktywności protoks in vitro. Może być również stosowany w teście in vitro do przeszukiwania związków chemicznych będących herbicydami, których cel nie został zidentyfikowany, dla określenia czy hamują one protoks. Taki test in vitro może być również stosowany jako bardziej ogólna metoda poszukiwań celem zidentyfikowania związków chemicznych, które hamują aktywność protoks i które są zatem kandydatami na herbicydy. Alternatywnie, enzym protoks wytwarzany poprzez rekombinowanie DNA może być użyty do dalszej charakteryzacji jego powiązania ze znanymi inhibitorami celem racjonalnego projektowania nowych inhibitorów-herbicydów, jak również form enzymu tolerujących herbicyd.

Typowo, hamujący wpływ na protoks jest określany poprzez pomiar fluorescencji przy około 395 do 410 nm (patrz np. Jacobs and Jacobs, Enzyme 28: 206 (1982); Sherman et al., Plant Physiol. 97: 280 (1991)). Test ten jest oparty na fakcie, ze protoporfiryna IX jest pigmentem fluorescencyjnym, a protoporfirynogen jest niefluorescencyjny. Ekstrakty białkowe są przygotowywane z wybranych frakcji komórkowych np. etioplastów, mitochondriów, mikrosomów lub błony

186 842 plazmatycznej poprzez różnicowe wirowanie (patrz np. Lee et al., Plant Physiol. 102: 881 (1993); Prado et al., Plant Physiol. 65: 956 (1979); Jackson and Moore, w Plant Organelles. Reid, ed., str. 1-12; Jacobs and Jacobs, Plant Physiol. 101: 1181 (1993)). Protoporfirynogen jest przygotowywany poprzez redukcję protoporfiryny amalgamatem sodu, jak opisano w Jacobs and Jacobs (1982). Mieszanina reakcja typowo zawiera 100 mM Hepes (pH 7,5), 5 mM EDTA, 2 mM DTT, około 2 M protoporfirynogen IX i około 1 mg/ml ekstraktu białkowego. Roztwory inhibitora w różnych stężeniach np: 1 mM, 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 nM, 10 nM, nM, 100pM dodaje się do ekstraktu enzymatycznego przed rozpoczęciem reakcji enzymatycznej. Po dodaniu ekstraktu białkowego przez kilka minut śledzi się fluorescencję i oblicza się nachylenie krzywej (szybkość reakcji) z regionu liniowego. Określa się IC50 poprzez porównanie krzywej w reakcji hamowanej z reakcją kontrolną.

Inny typowy test obejmujący użycie enzymu protoks w teście do identyfikacji mutantów protoks opornych na inhibitor przedstawia się następująco:

(a) inkubowanie pierwszej próbki protoks i jego substratu, protoporfirynogenu IX, w obecności drugiej próbki zawierającej inhibitor protoks, (b) pomiar aktywności enzymatycznej protoks z etapu (a), (c) inkubowanie pierwszej próbki zmutowanego protoks i jego substratu w obecności drugiej próbki zawierającej ten sam inhibitor protoks, (d) pomiar aktywności enzymatycznej zmutowanego protoks z etapu (c) oraz (e) porównanie enzymatycznej aktywności zmutowanego protoks z aktywnością niezmutowanego protoks.

Mieszanina reakcyjna i warunki reakcji są takie same, jak w teście dla identyfikacji inhibitorów protoks (test inhibitora), z następującymi modyfikacjami. Po pierwsze, zmutowany protoks, otrzymany jak opisano powyżej, jest zastąpiony w jednej z mieszanin reakcyjnych przez protoks typu dzikiego w teście inhibitora. Po drugie, inhibitor protoks typu dzikiego jest obecny w obu mieszaninach reakcyjnych. Po trzecie, aktywność zmutowana (aktywność enzymatyczna w obecności inhibitora i zmutowanego protoks) i aktywność niezmutowana (aktywność enzymatyczna w obecności inhibitora i protoks typu dzikiego) są porównywane dla określenia, czy obserwuje się znaczące zwiększenie aktywności przy porównaniu aktywności zmutowanej i niezmutowanej. Aktywnością zmutowaną jest każdy pomiar aktywności enzymatycznej zmutowanego enzymu w obecności odpowiedniego substratu i inhibitora. Aktywnością niezmutowaną jest każdy pomiar aktywności enzymatycznej enzymu protoks typu dzikiego w obecności odpowiedniego substratu i inhibitora. Znaczący wzrost jest zdefiniowany jako zwiększenie aktywności enzymatycznej, która jest większa niż margines błędu właściwy dla techniki pomiarowej, korzystnie około dwukrotny wzrost aktywności enzymu typu dzikiego w obecności inhibitora, korzystniej wzrost około 5-krotny, jeszcze korzystniej wzrost większy niż dziesięciokrotny.

Herbicydy, które hamują protoks obejmują wiele różnych strukturalnych klas cząsteczek (Duke et al., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli et al., Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193 (1992); Matringe et al., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase and Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)). Herbicydy te obejmują difenyloetery {np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluorometylo)fenoksy]-2-nitrObenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorfen,

2- chloro-1-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen)}, oksydiazole, (np. oksydiazon,

3- [2,4-dichloro-5-(1-metyloetoksy)fenylo)-5-(1,1-dimetyloetylo)-1,3,4-oksadiazol-2-(3H)-on), cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargiloksyfenylo)-3,4,5,6-tetra-hydroftalimid; chloroftalim, N-(4-chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydrofalimid), fenylopirazole. (np. TNPP-etyl, 2-[1-(2,3,4-trichlorofenylo)-4-nitropirazolilo-5-oksy)propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydyny (np. LS 82-556) oraz fenopilan i jego analogi O-fenylopirTolidynowe i piperydynokarbaminowe.

Difenyloeterami o szczególnym znaczeniu są te o wzorze ogólnym 1, w którym R odpowiada -COONa (wzór 2), -CONHSO2CH3 (wzór 3) lub -COOCH2COOC2H5 (wzór 4; patrz Maigrot et al, Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 47-51 (1989)).

186 842

Kolejnymi difenyloeterami będącymi przedmiotem zainteresowania są takie, w których R oznacza związek o wzorze 4a. (Wzór 4a; patrz Hayashi et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 53-58 (1989)).

Kolejny difenyloeter będący przedmiotem zainteresowania ma wzór 4b. (Wzór 4b; bifenoks, patrz Dest et al., Proc. Northeast Weed Sci. Conf. 27: 31 (1973)).

Znaczenie ma również klasa herbicydów, znana jako imidy, o wzorze ogólnym 5, gdzie Q oznacza wzór 6, 7, 8, 9 lub 9a, lub 9b (patrz Hemper et al. (1995) w „Proceedings of the Eighth International Congress of Pesticide Chemistry”, Ragdale et al., ed Amer. Chem. Soc, Washington, D.C., str. 42-48 (1994)), a Rj oznacza H, Cl lub F, R₂ oznacza Cl i R3 jest optymalnie podstawionym eterem tioeterem, estrem, grupą aminową lub alkilową. Alternatywnie, R2 i R3 razem mogą tworzyć 5- lub 6-składnikowy pierścień heterocykliczny. Przykładami herbicydów imidowych, będących przedmiotem szczególnego zainteresowania są imidy o wzorze 10, wzorze 11, wzorze 12 (patrz Miura et al., Brighton Crop Protection ConferenceWeeds: 35-40 (1993)), wzorze 13, wzorze 14, wzorze 15 i wzorze 16.

Działanie powyższych związków jako herbicydów jest opisane w Proceedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (wzór 10 i 16), Proceedings of the 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (wzór 12 i 13), Patent uSa Nr 4 746 352 (wzór 11) oraz Abstracts of the Weed Science Society of America vol. 33, str. 9 (1993) (wzór 14).

Najbardziej korzystnymi herbicydami imidowymi są te zaklasyfikowane jako aryluracyle o wzorze ogólnym 17, gdzie R oznacza grupę Cj-ń-alkenyloksYkarbonylo-C]-4-alkilową, jak opisano w patencie USA Nr 5 183 492, włączonym tutaj jako odnośnik.

Znaczenie mają również herbicydy o wzorze ogólnym 18 (tiadiazimina; patrz Weiler et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, str. 29-34 (1993)); o wzorze 19 (karfentrazon, patrz Van Saun et al., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: pp. 19 - 22 (1993)); N-podstawione pirazole o wzorze ogólnym 20 (patrz międzynarodowe publikacje patentowe WO 94/08999, WO 93/10100 oraz Patent USA Nr 5 405 829 uzyskany przez Schering); N-fenylopirazole, takie jak ten o wzorze 21 (nipiraklofen; patrz strona 621 w „The Pesticide Manual”, 9th ed., wyd. przez C.R. Worthing, British Crop Protection Council, Surrey (1991)) oraz podstawione w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazole (Lyga et al. Pesticide Sci. 4229-36(1994)).

Poziomy herbicydu, które normalnie hamują aktywność protoks, uwzględniają normy stosowania znane w tej dziedzinie i zależą częściowo od czynników zewnętrznych, takich jak środowisko, czas i metoda stosowania. Przykładowo, w przypadku herbicydów imidowych, opisanych wzorami od 10 do 17, dawki mieszczą się w zakresie od 0,0001 do 10 kg/ha, korzystnie od 0,005 do 2 kg/ha. To dawkowanie lub stężenie herbicydu może różnić się, zależnie od pożądanego działania i konkretnego zastosowanego związku i może być ustalone znanymi w tej dziedzinie metodami.

„Zmieniona aktywność enzymu protoks” oznacza aktywność enzymatyczną protoks różniącą się od tej, która naturalnie występuje w roślinach (tj. aktywność protoks, która jest naturalnie obecna przy braku bezpośredniego lub pośredniego manipulowania taką aktywnością przez człowieka), wykazująca oporność na herbicydy, które hamują naturalnie występującą aktywność. Zmieniona aktywność enzymu protoks może być uzyskana w roślinie poprzez zwiększenie ekspresji protoks typu dzikiego, wrażliwego na herbicyd, ekspresji zmienionego, tolerującego herbicyd eukariotycznego enzymu protoks w roślinie, ekspresji niezmodyiikowanej lub zmodyfikowanej bakteryjnej postaci enzymu protoks, który jest oporny na herbicyd w roślinie lub poprzez kombinację tych technik.

Uzyskanie zmienionej aktywności enzymu protoks poprzez zwiększoną ekspresję jest rezultatem osiągnięcia poziomu protoks w komórkach roślinnych co najmniej wystarczającego dla przezwyciężenia hamowania wzrostu powodowanego przez herbicyd. Poziom ekspresji protoks jest co najmniej dwukrotnie, korzystniej pięciokrotnie, a jeszcze korzystniej co najmniej dziesięciokrotnie wyższy od poziomu natywnej ekspresji. Zwiększona ekspresja może być wynikiem wielu kopii dzikiego genu protoks, wielokrotnego występowania sekwencji kodującej protoks w obrębie genu protoks (tj. amplifikacji genu lub mutacji w niekodującej

186 842 sekwencji regulacyjnej endogennego genu protoks w komórce roślinnej. Rośliny zawierające taką zmienioną aktywność enzymu protoks mogą być otrzymane poprzez bezpośrednią selekcję w roślinach. Metoda ta jest znana w tej dziedzinie. Patrz Somers et al., w patencie USA nr 5 162 602, i Anderson et al., w patencie USA nr 4 761 373 i odnośniki tam cytowane. Takie rośliny mogą być również uzyskane poprzez techniki inżynierii genetycznej znane w tej dziedzinie.

Zwiększona ekspresja protoks wrażliwego na herbicyd może być również uzyskana poprzez stabilną transformację komórki roślinnej zrekombinowaną lub chimerową cząsteczką DNA, zawierającą promotor zdolny do kierowania ekspresją związanego z nim genu struktury w komórce roślinnej DNA, połączony z homologicznym lub heterologicznym genem struktury kodującym protoks. „Homologiczny” oznacza, że gen protoks jest izolowany z organizmu, taksonomicznie identycznego z docelową komórką roślinną. „Heterologiczny” oznacza, że gen protoks jest otrzymany z organizmu taksonomicznie odrębnego od docelowej komórki roślinnej. Homologiczne geny protoks można otrzymać poprzez komplementację bakteryjnych lub drożdzowych mutantów auksotroficznych ekspresyjną biblioteką cDNA z docelowej rośliny. Patrz np. przykład 1 i Snustad et al., Genetics 120: 1111-1114 (1988) (syntaza glutaminy z kukurydzy); Delauney et al., Mol. Genet. 221: 299-305 (1990) (reduktaza pirclinc-5-karboksylanu z soi); Frisch et al., Mol. Gen. Genet. 228: 287-293 (1991) (syntaza dihydrodipikclinianu z kukurydzy); Eller et al., Plant Mol. Biol. 1857-566 (1992) (chloroplastowa dehydrogenaza 3-izopropylojabłczanu z rzepaku); Proc. Natl. Acad Sci, USA 88: 1731-1735 (1991); Minet et al., Plant J. 2: 417-422 (1992) (dehydrogenaza dihydrccrctancwa) i odnośniki tam cytowane. Inne znane metody obejmują przeszukiwanie bibliotek genomowych lub cDNA wyższych roślin, na przykład pod kątem sekwencji, które hybrydyzują ze specyficznymi kwasami nukleinowymi-sondami lub poprzez przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych pod kątem wytwarzania enzymu protoks, który reaguje krzyżowo ze specyficznymi przeciwciałami. Korzystna metoda obejmuje komplementację auksotroficznych mutantów E. coli hemG przy użyciu biblioteki cDNA z kukurydzy lub Arabidopsis thaliana.

Przykłady promotorów zdolnych do funkcjonowania w roślinach lub komórkach roślinnych, tj. takich, które mają zdolność do kierowania ekspresją w komórkach roślinnych połączonych z nimi genów struktury, takich jak protoks, obejmują promotory 19S i 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) i podwójne promotory CaMV; promotory syntazy nopaliny; promotory białka związanego z patogenezą (PR); promotory małej podjednostki karboksylazy rybulczcbifcsfcranu (ssuRUBlSCO) i temu podobne. Korzystne są: promotor aktyny z ryżu (McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231: 150 (1991)), promotor ubikwityny z kukurydzy (EP 0 342 926; Taylor et al., Plant Cell Rep.12: 491 (1993)) oraz promotor Pr-1 z tytoniu, Arabidopsis lub kukurydzy (patrz Międzynarodowe Zgłoszenie Patentowe Nr PCT/IB9S/00002 dla Ryals et al., dołączone tu w całości jako odnośnik). Korzystny jest również promotor 35S i wzmacniacz lub podwójny promotor 35S, taki jak opisany w Kay et al., Science 236: 1299-1302 (1987) i podwójny promotor 35S sklonowany w pCGN2II3, zdeponowany jako ATCC 40587, które są ujawnione w EP-A 0 392 225, a których odpowiedni opis jest tu w całości włączony jako odnośnik. Same promotory mogą być modyfikowane celem manipulowania siłą promotora dla zwiększenia ekspresji protoks, zgodnie ze sposobami znanymi w tej dziedzinie.

W chimerowych konstruktach DNA według wynalazku, do sekwencji kodującej protoks mogą być dołączone sygnałowe lub kierujące peptydy, celem kierowania transportem powstającego w wyniku ekspresji enzymu protoks do pożądanego miejsca działania. Przykłady sygnałowych peptydów obejmują takie, które są natywnie połączone z roślinnymi białkami związanymi z patogenezą, np. PR-1, PR-2 i temu podobne. Patrz Payne et al., Plant Mol. Biol. 11: 89-94 (1988). Przykłady peptydów tranzytowych obejmują chloroplastowe peptydy tranzytowe, takie jak opisane w Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126 (1991); Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (1987); Vorst et al., Gene 65: 59 (1988) i mitochondrialne peptydy tranzytowe, takie jak opisane w Boutry et al., Nature 328340-342 (1987). Chloroplastowe i mitochondrialne peptydy tranzytowe są uważane w niniejszym wynalazku za szczególnie użyteczne, ponieważ aktywność enzymatyczna protoks występuje typowo w mitochcndriach i chloroplastach. Bardziej korzystne jest użycie chloroplastowych peptydów tranzytowych ponieważ uważa się ze hamowanie aktywności enzymatycznej protoks w chloroplastach leży

186 842 u podłoża działania herbicydów hamujących protoks (Witkowski and Halling, Plant Physiol. 87: 632 (1988); Lehnen et al., Pestic. Biochem. Physiol. 37 239 (1990); Duke et al., Weed Sci. 39: 465 (1991)). Uwzględnione są również sekwencje, które powodują lokalizację kodowanego białka w różnych przedziałach komórkowych, takich jak wakuole. Patrz na przykład Neuhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10362-10366 (1991) oraz Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 21-53 (1991). Odpowiednie publikacje są tu załączone w całości jako odnośniki.

Chimerowy(e) konstrukt(y) DNA według wynalazku mogą zawierać wiele kopii promotora lub wiele kopii genów struktury protoks. Dodatkowo, konstrukt(y) mogą obejmować sekwencje kodujące dla markerów i sekwencje kodujące dla innych peptydów, takich jak peptydy sygnałowe lub tranzytowe, każdy w odpowiedniej ramce odczytu w stosunku do innych funkcjonalnych elementów w cząsteczce DNA. Przygotowanie takich konstruktów mieści się w zwykłym zakresie umiejętności w tej dziedzinie.

Użyteczne markery obejmują peptydy dające oporność na herbicyd, antybiotyk lub lek, jak na przykład oporność na hydromycynę, kanamycynę, G418, gentamycynę, linkomycynę, metotreksat, glifosat, fosfinitrycynę i temu podobne. Markery te mogą być stosowane do wyselekcjonowania komórek stransformowanych chimerowymi konstruktami DNA według wynalazku spośród komórek niestransformowanych. Innymi użytecznymi markerami są enzymy peptydowe, które mogą być łatwo wykrywane poprzez widoczną reakcję, na przykład reakcję barwną, przykładowo lucyferaza, b-glukuronidaza lub b-galaktozydaza.

Zmienioną aktywność protoks można również uzyskać poprzez wytworzenie lub identyfikację zmienionej postaci wyizolowanej eukariotycznej sekwencji kodującej protoks, mającej co najmniej jedno podstawienie aminokwasowe, wstawienie lub delecję, która koduje zmieniony enzym protoks oporny na herbicyd, który hamuje nie zmienioną, naturalnie występującą postać (tj. postać, która naturalnie występuje w organizmie eukariotycznym nie poddanym manipulowaniu, bądź bezpośrednio na drodze rekombinowania DNA lub pośrednio poprzez selektywną hodowlę itd., przez człowieka). Geny kodujące takie enzymy można otrzymać stosując wiele strategii znanych w tej dziedzinie. Pierwsza ogólna strategia obejmuje pośrednie lub bezpośrednie sposoby mutagenezy w mikroorganizmach. Przykładowo, podatny na manipulacje genetyczne mikroorganizm, np. E. coli lub S. cerevisiae, może być poddany losowej mutagenezie in vivo, przy użyciu np. światła UV lub metanosulfonianu etylu lub metylu. Sposoby mutagenezy są opisane na przykład w Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972); Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983); i Patent USA Nr 4 975 374 (Goodman et al.). Mikroorganizm selekcjonowany pod kątem mutagenezy zawiera normalnie wrażliwy na herbicyd eukariotyczny gen protoks i jest zalezny od aktywności protoks warunkowanej przez ten gen. Poddane mutagenezie komórki hoduje się w obecności herbicydu w stężeniach, które hamują niezmodyfkowany enzym protoks. Kolonie poddanego mutagenezie mikroorganizmu, które rosną w obecności inhibitora lepiej, niż mikroorganizm nie poddany mutagenezie, są wybrane do dalszej analizy. Geny protoks z tych kolonii są izolowane, bądź poprzez klonowanie, bądź poprzez powielanie w reakcji łańcuchowej polimerazy i ustala się ich sekwencje. Sekwencje kodujące zmieniony enzym protoks są następnie klonowane ponownie w mikroorganizmie celem potwierdzenia ich zdolności do nadawania oporności na inhibitor.

Druga metoda otrzymywania zmutowanych alleli eukariotycznego enzymu protoks opornych na herbicyd obejmuje bezpośrednią selekcję w roślinach. Przykładowo, wpływ inhibitora protoks, takiego jak te opisane powyżej na hamowanie wzrostu roślin, takich jak Arabidopsis, soja, lub kukurydza można określić poprzez wysiew nasion sterylizowanych metodami znanymi w tej dziedzinie ma płytki z prostą pożywką minimalną z soli mineralnych, zawierającą wzrastające stężenie inhibitora. Takie stężenia zawierają się w zakresie 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 110, 300, 1000 i 3000 części na milion (ppm). Najniższa dawka, przy której można powtarzalnie wykrywać znaczące zahamowanie wzrostu, jest stosowana do kolejnych eksperymentów.

186 842

Mutageneza materiału roślinnego może być stosowana do zwiększenia częstości, z którą w wybranej populacji pojawiają się oporne allele. Mutagenizowany materiał nasienny może pochodzić z różnych źródeł, włączając w to chemiczną lub fizyczną mutagenezę nasion lub chemiczną lub fizyczną mutagenezę pyłku (Neuffer, In Maize for Biological Research. Sheridan, ed. Univ.Press, Grand Forks, ND., str. 61-64 (1982)), który jest następnie używany do zapładniania roślin i gdzie zbiera się powstałe w rezultacie zmutowane nasiona Mj. Typowo, dla Arabidopsis, nasiona M2 (Lehle Seeds, Tucson, AZ), tj. potomne nasiona roślin powstałych z nasion mutagenizowanych związkami chemicznymi, takimi jak metanosulfonian etylu lub czynnikami fizycznymi, takimi jak promienie gamma lub szybkie neutrony, są wysiewane, przy gęstości do 10000 nasion/plytkę (10 cm średnicy) na minimalną pożywkę mineralną zawierającą odpowiednie stężenie inhibitora, celem selekcji na oporność. Kiełki, które nadal rosną i pozostają zielone 7-21 dni po wysianiu, przenosi się do gleby i hoduje do dojrzałości i wydania nasion. Potomstwo z tych nasion jest testowane pod kątem oporności na herbicyd. Jeżeli cecha oporności jest dominująca, rośliny, których nasiona segregują 3:1 :: oporne:wrażliwe, są uważane za heterozygotyczne pod względem oporności w pokoleniu M2. Rośliny, które dają wszystkie nasiona oporne, są uważane za homozygotyczne pod względem oporności w pokoleniu M2. Taka mutageneza na nienaruszonych nasionach i przeszukiwanie nasion z pokolenia M2 mogą być również prowadzone dla innych gatunków, na przykład soi (patrz np. Pat. USA Nr 5 084 082 (Sebastian)). Zmutowane nasiona, które mają być przeszukiwane pod kątem tolerancji wobec herbicydów, można również otrzymać w wyniku zapłodnienia pyłkiem mutagenizowanym sposobami chemicznymi lub fizycznymi.

Można zastosować dwa podejścia dla potwierdzenia, ze podstawą genetyczną oporności jest zmieniony gen protoks. Po pierwsze, allele genu protoks z roślin wykazujących oporność na inhibitor mogą być izolowane przy zastosowaniu starterów PCR w oparciu o konserwowane regiony w sekwencjach cDNA protoks Arabidopsis i kukurydzy, pokazanych poniżej w SEK ID NR: 1,3,5,7 lub, korzystniej, w oparciu o niezmienione sekwencje genu protoks z rośliny użytej do wytworzenia alleli opornych. Po sekwencjonowaniu alleli celem ustalenia obecności mutacji w sekwencji kodującej, allele mogą być testowane pod kątem ich zdolności do nadawania oporności roślinom, do których alelle przypuszczalnie nadające oporność zostały wtransformowane. Roślinami tymi może być bądź Arabidopsis lub inna dowolna roślina, której wzrost jest wrażliwy na inhibitory. Po drugie, geny protoks mogą być zmapowane względem znanych polimorfizmów długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) (patrz na przykład, Chang et al. Proc. Natl. Acad, Sci, USA 85: 6856-6860 (1988); Nam et al., Plant Cell 1: 699-705 (1989)). Cecha oporności może być niezależnie zmapowana przy zastosowaniu tych samych markerów. Jeżeli oporność jest powodowana mutacją w takim genie protoks, cecha oporności będzie mapować się w pozycji nieodróżnialnej od pozycji genu protoks.

Trzecia metoda otrzymywania alleli protoks opornych na herbicydy jest poprzez selekcję w kultury komórek roślinnych. Eksplanty tkanki roślinnej, np. zarodków, dysków liściowych itd. lub szybko rosnący kalus lub hodowla w zawiesinie z rośliny będącej przedmiotem zainteresowania, hoduje się na zdefiniowanej pożywce nie zawierającej hemu w obecności rosnących stężeń herbicydu o działaniu hamującym lub analogicznego inhibitora odpowiedniego do zastosowania w warunkach laboratoryjnych. Śledzi się zróżnicowanie stopnia wzrostu w różnych hodowlach. W niektórych hodowlach pojawiają się szybko rosnące odmiany kolonii, które kontynuują wzrost nawet w obecności stężeń inhibitora, które normalnie hamują wzrost. Częstość, z którą takie szybko rosnące warianty powstają, może być zwiększona poprzez traktowanie chemicznym lub fizycznym mutagenem przed poddaniem tkanek lub komórek działaniu herbicydu. Potencjalne allele genu protoks warunkujące oporność są izolowane i testowane tak, jak opisano w poprzednich paragrafach. Allele te, zidentyfikowane jako warunkujące oporność na herbicyd, mogą być następnie poddane zabiegom inżynierii genetycznej celem uzyskania maksymalnej ekspresji i transformowane do roślin. Alternatywnie, z tkanek i kultur komórkowych, zawierających te allele, mogą być regenerowane rośliny.

Czwarta metoda obejmuje mutagenezę genów protoks typu dzikiego, wrażliwych na herbicyd w bakterii lub drożdżach, a następnie hodowanie mikroorganizmu w pożywce nie zawierającym hemu, ale która zawiera hamujące stężenia inhibitora i selekcjonowanie takich

186 842 kolonii, które rosną w obecności inhibitora. Bardziej konkretnie, roślinny cDNA, taki który koduje protoks z Arabidopsis lub kukurydzy jest klonowany w mikroorganizmie, który wykazuje brak aktywności protoks. Przykłady takich mikroorganizmów obejmują szczep E. coli SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979), szczep S. typhimurium TE2483 lub TT13680 (Xu et al., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) oraz mutanta drożdży heml4-l (Camadro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)). Stransformowany mikroorganizm poddaje się mutagenezie in vivo, takiej jak opisano tuz powyżej lub mutagenezie in vitro dowolną z wielu chemicznych lub enzymatycznych metod znanych w tej dziedzinie, np. dwusiarczkiem sodu (Shortle et al., Methods Enzymol. 100: 457-468 (1983); metoksylaminą (Kadonaga et al., Nucleic Acids Res. 13: 1733-1745 (1985); mutagenezą saturacyjną z użyciem oligonukleotydów (Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 83: 710-714 (1986) lub poprzez różne strategie z błędnym włączaniem przez polimerazę (patrz np. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 1588-1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64. 313-319 (1988); oraz Leung et al., Technique 1: 11-15 (1989). Kolonie, które rosną w obecności stężeń inhibitora, normalnie wykazujących hamowanie, są zbierane i czyszczone poprzez powtarzanie posiewu redukcyjnego. Plazmidy są oczyszczane i testowane pod kątem ich zdolności do przenoszenia oporności na inhibitor poprzez ponowną transformację do mikroorganizmu nie mającego aktywności protoks. Następnie ustala się sekwencje DNA wstawek cDNA dla protoks z plazmidów, które przechodzą pomyślnie taki test.

Gdy allel protoks oporny na herbicyd zostanie zidentyfikowany, może być poddany zabiegom inżynierii genetycznej celem uzyskania optymalnej ekspresji w roślinie uprawnej. Może to obejmować zmianę sekwencji kodującej allelu oporności dla optymalnej ekspresji w gatunku rośliny uprawnej będącej przedmiotem zainteresowania. Sposoby modyfikowania sekwencji kodujących dla osiągnięcia optymalnej ekspresji w konkretnym gatunku rośliny uprawnej są dobrze znane (patrz np. Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 (1991); Cozily et al., Biotechnol. 11: 194 (1993)). Zabiegi inżynierii genetycznej dla allelu protoks w celu uzyskania optymalnej ekspresji mogą również obejmować dołączone w sposób funkcjonalny odpowiednie sekwencje regulacyjne (tj. promotor, sekwencję sygnałową, terminatory transkrypcji). Korzystnymi promotorami będą takie, które warunkują wysoki konstytutywny poziom ekspresji lub, korzystniej, takie, które warunkują wysoki specyficzny poziom ekspresji w tkankach podatnych na uszkodzenie przez herbicyd.

Cząsteczki zrekombinowanego DNA mogą być wprowadzane do komórki roślinnej wieloma sposobami znanymi w tej dziedzinie. Dla biegłych będzie jasne, że wybór metody będzie zależał od typu rośliny, tj. jednoliściennej czy dwuliściennej, będącej celem transformacji. Odpowiednie sposoby transformowania komórek roślinnych obejmują mikroiniekcję (Crossway et al., BioTechniques 4320-334 (1986)), elektroporację (Riggs et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 83: 5602-5606 (1986), transformację za pośrednictwem Agrobacterium (Hinchee et al., Biotechnology 6: 915-921 (1988)), bezpośrednie przeniesienie genu (Paszkowski et al., EMBO J. 3.2717-2722 (1984)), oraz balistyczne przyspieszenie cząstek przy zastosowaniu urządzeń dostępnych z Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin and Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (patrz na przykład, Sanford et al., Patent USA 4 945 050; and McCabe et al., Biotechnology 6923-926 (1988)). Patrz także, Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22: 421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5.27-37 (1987) (cebula); Christou et al., Plant Physiol. 87671-674 (1988) (soja); McCabe et al., BiolTechnology 6: 923-926 (1988) (soja); Datta et al., BiolTechnology 8: 736-740 (1990) (ryż); Klein et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 85: 4305-4309 (1988) (kukurydza); Klein et al., BiolTechnology E559-563 (1988) (kukurydza); Klein et al., Plant Physiol. 91: 440-444 (1988) (kukurydza); Fromm et al., BiolTechnology 8833-839 (1990); oraz Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990) (kukurydza).

Za pośrednictwem wcześniej opisanych sposobów otrzymywane są transgeniczne płodne rośliny i ich potomstwo, powstałe na drodze bezpłciowej i płciowej, które nadal pozostaje lub co najmniej toleruje hamowanie przez herbicyd na poziomie, który ma działanie hamujące w stosunku do naturalnie występującej w roślinie aktywności protoks. Szczególnie korzystne są hybrydowe rośliny, które są oporne lub co najmniej tolerują hamowanie przez herbicyd na

186 842 poziomie, który ma działanie hamujące w stosunku do naturalnie występującej w roślinie aktywności protoks.

Transgeniczną rośliną może być roślina dwuliścienna lub jednoliścienna. Korzystne są rośliny jednoliścienne z rodziny Graminaceae, włączając w to Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Orjizae, Avena, Hordeum, Secale i Setaria. Szczególnie korzystne są: transgeniczna kukurydza, pszenica, jęczmień, sorgo, żyto, owies, trawy darniowe i ryz.

Wśród roślin dwuliściennych szczególnie preferowane są tu: soja, bawełna, tytoń, burak cukrowy, rzepak i słonecznik.

Termin „potomstwo” ma obejmować potomstwo roślin transgenicznych powstałe zarówno na drodze „bezpłciowej” jak i „płciowej”. Definicja ta ma również oznaczać wszystkie mutanty i warianty, które można otrzymać za pośrednictwem znanych sposobów, takich jak na przykład fuzja komórek lub selekcja mutantów, które nadal wykazują charakterystyczne właściwości wyjściowej transformowanej rośliny, łącznie ze wszystkimi produktami krzyżowania i fuzji transformowanego materiału roślinnego.

Materiał do namnażania z transgenicznych roślin jest zdefiniowany jako dowolny materiał, który może być namnażany na drodze płciowej lub bezpłciowej in vivo lub in vitro. Szczególnie korzystne są tu protoplasty, komórki, kalus, tkanki, narządy, nasiona, zarodki, pyłek, komórki jajowe, zygoty, łącznie z dowolnym innym materiałem rozrodczym otrzymanym z transgenicznych roślin.

Części roślin, według wynalazku są to na przykład kwiaty, łodygi, owoce, liście, korzenie pochodzące z rośliny transgenicznej lub jej potomstwa, uprzednio transformowanej sposobem według wynalazku, a zatem złożone co najmniej w części z komórek transgenicznych.

Przed sprzedażą roślinnego materiału rozrodczego [owoce, bulwy, ziarno, nasiona], w szczególności nasion, jako produktu handlowego, jest on zwykle traktowany ochronnym materiałem powlekającym zawierającym herbicydy, insektycydy, fungicydy, środki przeciw bakteriom, nicieniom i ślimakom lub mieszaninę kilku tych preparatów, jeżeli trzeba, łącznie z kolejnymi nośnikami, środkami powierzchniowo czynnymi lub dodatkami ułatwiającymi stosowanie, zwykle używanymi w dziedzinie wytwarzania preparatów do uzyskiwania ochrony przed uszkodzeniami powodowanymi przez szkodniki bakteryjne, grzybowe lub zwierzęce.

Celem traktowania nasion, ochronna powłoka może być może być wytwarzana na nasionach bądź przez impregnację bulw i ziarna substancją płynną lub poprzez opłaszczanie ich poprzez kombinację mokrych i suchych związków'. Dodatkowo, w specjalnych przypadkach, możliwe są inne metody stosowania wobec roślin, np. działanie skierowane na pączki lub owoce.

Nasiona roślin według wynalazku obejmujące sekwencję DNA kodującą białko z organizmu eukariotycznego, mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protoks) mogą być traktowane powłoką chroniącą nasiona, zawierającą związki stosowane do traktowania nasion, takie jak kaptan, karboksyna, tiram (TMTD®), metalaksyl (Apron®) i pirymifosmetyl (Actellic®) oraz inne, które są zwykle używane przy traktowaniu nasion.

A zatem przedmiotem wynalazku jest również roślinny materiał do namnażania kultur roślin, a w szczególności nasiona roślin, które są traktowane powłoką chroniącą nasiona, zwykle stosowaną przy traktowaniu nasion.

Gdy allel protoks oporny na herbicyd jest otrzymany poprzez bezpośrednią selekcję w roślinie uprawnej lub kulturze komórek roślinnych, z których roślina uprawna może być zregenerowana, może być ona przeniesiona do odmian handlowych przy zastosowaniu tradycyjnych technik hodowlanych dla wytworzenia rośliny uprawnej tolerującej herbicyd bez potrzeby poddawania allelu zabiegom inżynierii genetycznej i transformowania go do rośliny. Alternatywnie, allel oporny na herbicyd może być izolowany, poddany zabiegom inżynierii genetycznej dla uzyskania optymalnej ekspresji, a następnie transformowany do pożądanej odmiany.

Geny kodujące zmieniony protoks oporny na inhibitor protoks, mogą być stosowane jako marker selekcyjny w metodach transformacji komórek roślinnych. Przykładowo, rośliny, tkanki roślinne lub komórki roślinne transformowane transgenem mogą być również transformowane genem kodującym zmieniony protoks, mogący podlegać ekspresji w roślinie. Tak transformowane komórki są przenoszone do pożywki zawierającej inhibitor protoks, w której tylko komórki stransformowane przeżyją. Inhibitorami protoks, które uważa się za szczególnie

186 842 użyteczne czynniki selektywne, są: difenyloetery {np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-trifluorometylo)fenoksy]-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorfen, 2-chloro-1-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen)}, oksydiazole, (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(1-metyłoetoksy)fenylo)-5-(1,1-dimetyloetylo)-1,3,4-oksadiazol-2-(3H)-on), cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargiloksyfenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid: chloroftalim, N-(4-chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), fenylopirazole (np. TNPP-etyl, 2-[1-(2,3,4-trichlorofenylo)-4-nitropirazolilo-5-oksy)propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydyny (np. LS 82-556) oraz fenopilan oraz jego analogi O-fenylopirrolidynowe i piperydynokarbaminowe. Metoda ma zastosowanie dla dowolnej komórki roślinnej mogącej podlegać transformacji zmienionym genem kodującym protoks i może być użyta dla dowolnego transgenu, będącego przedmiotem zainteresowania. Ekspresja transgenu i genu protoks może być kierowana przez ten sam promotor funkcjonalny w komórkach roślinnych lub przez odrębne promotory.

Depozyty

Następujące cząsteczki wektorów zostały zdeponowane w Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street. Peoria, Illinois 61604, USA w terminie wskazanym poniżej:

Protoks-1, w wektorze pBluescript SK, zdeponowano 5 kwietnia 1994 jako pWDC-2 (#B-21238).

Protoks-2, w wektorze pFL61, zdeponowano 5 kwietnia 1994 jako pWDC-1 (NRRL #B-21237).

MzProtoks-1, w wektorze pBluescript SK, zdeponowany 20 maja 1994 jako pWDC-4 pod nazwą NRRL (#B-21260), pokazany w SEK NR ID: 5.

MzProtoks-1, w wektorze pBluescript SK, zdeponowany ponownie 11 lipca 1994 jako pWDC-4 pod nazwą NRRL (#B-21260N), pokazany w SEK ID NR: 5.

MzProtoks-2, w wektorze pBluescript SK, zdeponowany 20 maja 1994, jako pWDC-3 pod nazwą NRRL (#B-21259), pokazany w SEK NR ID:7.

Protoks-3, w wektorze pFL61, został zdeponowany 10 czerwca 1994, jako pWDC-5 (NRRL #B-21280).

pMzC-1 Val, w wektorze pBluescript SK, został zdeponowany 30 września 1994 pod nazwą pWDC-8 i depozyt oznaczono NRRL #21340.

pAraC-2Cys, w wektorze pFL61 wektor, zdeponowano 14 listopada 1994 pod nazwą pWDC-7 i depozyt oznaczono NRRL #21339N.

Przykłady

Stosowane tutaj, standardowe techniki rekombinowania DNA i klonowania, są dobrze znane w tej dziedzinie i są opisane przez T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). T.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).

Przykład 1: Izolacja cDNA dla genów kodujących protoks z Arabidopsis poprzez funkcjonalną komplementację mutanta E. coli.

Otrzymano i powielono bibliotekę cDNA Arabidopsis thaliana (Landsberg) na plazmidowym wektorze pFL61 (Minet et al., Plant J. 2: 417-422 (1992)). Drugą bibliotekę cDNA Arabidopsis (Columbia) w wektorze lambda UniZap (Stratagene) zakupiono i powielono jako plazmidy pBluescript poprzez masowe wycinanie in vivo z zawiesiny wyjściowej faga. Mutant E. coli hemG SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)) został otrzymany i był utrzymywany na pożywce L zawierającej 20 mg/ml hematyny (United States Biochemicals). Bibliotekę plazmidów transformowano do SASX38, stosując elektroporację przy użyciu Bio-Rad Gene Pulser i warunki polecane przez producenta. Komórki wysiewano na agar L zawierający 100 mg/ml ampicyliny, przy gęstości około 500000 transformantów/szalkę o średnicy 10 cm. Komórki hodowano w 37°C przez 40 godzin przy słabym świetle i selekcjonowano na zdolność do wzrostu bez dodawania egzogennego hemu. Prototrofy hemowe odzyskiwano z częstością 400/10⁷ z biblioteki pFL61 i z częstością 2/10⁷ z biblioteki pBluescript. DNA plazmidowy izolowano z 24 kolonii celem analizy sekwencji. Każdy z 24 był ponownie transformowany do SASX38 celem zweryfikowania zdolności do komplementacji.

186 842

Analiza sekwencji wykazała obecność dwóch klas przypuszczalnych genów protoks. Dziewięć było typu oznaczonego jako „Protoks-1”. Każdy z nich pochodził tego samego genu, a dwa były klonami pełnej długości. cDNA miało długość 1719 bp i kodowało białko o masie cząsteczkowej 57,7 kD. N-końcowa sekwencja peptydu miała cechy charakterystyczne dla chloroplastowego peptydu sygnałowego o długości około 60 aminokwasów. Przeszukanie bazy danych programem GAP (Deveraux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387-395 (1984) ujawniło homologię z białkiem hemY (protoks) z B. subtilis (Hansson and Hederstedt 1992, Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Te dwa białka wykazują 53% podobieństwa, 31% identyczności i mają regiony wysokiej homologii, włączając w to proponowaną domenę białka hemY wiążącą dinukleotyd (Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)).

innych klonów cDNA należało do typu oznaczonego jako „Protoks-2”. One również okazały się pochodzić z pojedynczego genu. Uzyskany pełnej długości cDNA ma wielkość 1738 bp i koduje białko o masie cząsteczkowej 55,6 kD. Koniec aminowy jest charakterystyczny dla mitochondrialnego peptydu tranzytowego. Białko Protoks-2 ma ograniczoną homologię do Protoks-1 (53% podobieństwa, 28% identyczności) i do protoks z B. subtilis (50% podobieństwa, 27% identyczności).

Protoks-1, w wektorze pBluescript SK, został zdeponowany 5 kwietnia 1994, jako pWDC-2 (NRRL #B-21238).

Protoks-2, w wektorze pFL61, został zdeponowany 5 kwietnia 1994, jako pWDC-1 (NRRL #B-21237).

cDNA kodujący protoks-1 z Arabidopsis, zawarty w pWDC-2, i protoks-2, zawarty w pWDC-1, są przedstawione poniżej w SEK NR ID· 1 i 3, odpowiednio.

Przykład 2: Izolacja cDNA dla genów kodujących protoks z kukurydzy poprzez funkcjonalną komplementację mutantów E. coli.

Bibliotekę cDNA z Zea Mays (odmiana B73) w wektorze lambda UniZap otrzymano ze Stratagene i przekształcono w bibliotekę na plazmidzie pBluescript poprzez masowe wycięcie in vivo. Drugą handlowo dostępną bibliotekę cDNA z kukurydzy na wektorze UniZ otrzymano z firmy Clontech i podobnie przekształcono w plazmidy pBluescript. Selekcję pod kątem funkcjonalnych genów protoks z kukurydzy przeprowadzono, jak opisano powyżej w przykładzie 1 dla bibliotek Arabidopsis.

Z biblioteki Stratagene spośród 10⁷ transformantów wyizolowano dwa hemowe prototrofy, dla których wykazano ponowną komplementację i ustalono sekwencję. cDNA były identyczne i udowodniono, że są homologiczne z Protoks-1 z Arabidopsis. Ten klon kukurydzy, oznaczony jako MzProtoks-1, jest niekompletny. cDNA ma długość 1698 bp i koduje jedynie przypuszczalny dojrzały enzym protoks; brak jest sekwencji peptydu tranzytowego i inicjacyjnego kodonu metioninowego. Gen jest w 68% identyczny z genem Arab Protoks-1 na poziomie nukleotydów i w 78% identyczny (87% podobieństwa) na poziomie aminokwasów (pokazane w tabeli 1).

Z biblioteki Clontech spośród 107 transformantów wyizolowano jednego hemowego prototrofa, dla którego wykazano ponowną komplementację i ustalono sekwencję. cDNA okazał się kompletny, ma długość 2061 bp i koduje białko o masie 59 kD. Klon ten koduje homolog Protoks-2 z Arabidopsis i jest oznaczony jako MzProtoks-2. Gen jest w 58% identyczny z genem Arab Protoks-1 na poziomie nukleotydów i 58% identyczny (76% podobieństwa) na poziomie aminokwasów (pokazane w tabeli 2). Klon kukurydzy ma N-końcową sekwencję, która jest o 30 aminokwasów dłuższa niż klon Arabidopsis. Tak jak w przypadku klonów Arabidopsis, homologia pomiędzy dwoma genami protoks z kukurydzy jest niska, wynosi jedynie 31% identyczności między dwiema sekwencjami białkowymi.

MzProtoks-1, w wektorze pBluescript SK, zdeponowany 20 maja 1994, jako pWDC-4 pod nazwą NRRL (#B-21260), pokazany w SEK NR ID: 5.

MzProtoks-1, w pBluescript SK wektor, ponownie zdeponowany 11 lipca 1994, jako pWDC-4 pod nazwą NRRL (#B-21260N), pokazany w SEK NR ID: 5.

MzProtoks-2, w wektorze pBluescript SK, zdeponowany 20 maja 1994, jako pWDC-3 pod nazwą NRRL (#B-21259), pokazany w SEK NR ID: 7.

186 842

Przykład 3: Izolacja dalszych genów protoks w oparciu o homologię sekwencji ze znanymi sekwencjami kodującymi protoks.

Fagowa lub plazmidowa biblioteka została wysiana przy gęstości około 10000 łysinek na płytkę Petriego o średnicy 10 cm i łysinki przeniesiono na filtr po inkubacji płytek przez noc w 37°C. Przeniesione łysinki były przeszukiwane przy użyciu jednego z cDNA z zestawu SEK NR ID: 1, 3, 5 lub 7, wyznakowanego 32P-dCTP metodą losowych starterów, stosując Prima Time kit (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT). Warunki hybrydyzacji były następujące: 7% sodowy siarczan dodecylu (SDS), 0,5 M NaPO4 pH 7, 0,1 mM EDTA w 50°C. Po prowadzonej przez noc hybrydyzacji filtry były płukane w 2 X SSC, 1% SDS. Pozytywnie hybrydyzujące łysinki wykrywano poprzez autoradiografię. Po oczyszczeniu do pojedynczej łysinki, izolowano wstawkę cDNA i oznaczano jej sekwencję metodą terminacji łańcucha, stosując terminatory dideoksy wyznakowane barwnikami fluorescencyjnymi (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA).

Standardowy protokół doświadczalny opisany powyżej może być użyty przez biegłego w tej dziedzinie do otrzymania genów protoks homologicznych pod względem sekwencji do znanych sekwencji kodujących protoks z dowolnego innego organizmu eukariotycznego, a w szczególności z innych gatunków roślin wyższych. Wzajemne porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych odpowiednich białek, kodowanych przez sekwencje pokazane w SEK NR ID: 2 i 6, jest przedstawione w tabeli 1. Wzajemne porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych odpowiednich białek, kodowanych przez sekwencje pokazane w SEK NR ID: 4 i 8, jest przedstawione w tabeli 2.

186 842

Tabela 1

Porównanie sekwencji aminokwasowych Protoks-1 z Arabidopsis (SEK NR ID: 2) i kukurydzy I SEK NR ID: 6)

Procent podobieństwa: 87,137 Procent identyczności. 78,008 Protoks-1 Pep x Mzprotoks-l.Pep

GGTTITTDCVIVGGGISGLCIAQALATKHPDAAPNLIVTEAKDRVGGNII 100 . .1 ll : lllll ll l l . l lll l l : l : . ml lll: · l · l ll l · . . . . NSADCVVVGGGISGLCTAQALATRH. . GVGDVLVTEARARPGGNIT 4 4

101 T. . REENGFLWEEGPNSFQPSDPMLTMVVDSGLKDDLVLGDPTAPRFVLW 148 l l . l:l:llllllllli illl:lll · llllllllll : lll · l l l l l l l

5 TVERPEEGYLWEEGPNSFQPSDPVLTMAVDSGLKDDLVFGDPNAPRFVLW 94

149 NGKLRPVPSKLTDLPFFDLMSIGGKIRAGFGALGIRPSPPGREESVEEFV 198 :lllllllll ·llllllllll·ll:lll:lllllll·ll l l l l l ll l l l

EGKLRPVPSKPADLPFFDLMSIPGKLRAGLGALGIRPPPPGREESVEEFV 144

199 RRNLGDEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWKLEQNGGSIIGG 24 8 lllll.llllllll llllllllllllllllllllllll:ll: · l ll l l l l

145 RRNLGAEVFERLIEPFCSGVYAGDPSKLSMKAAFGKVWRLEETGGSIIGG 194

9 TFKAIQERKNAPKAERDPRLPKPQGQTVGSFRKGLRMLPEAISARLGSKV 298 l : l ·ΙΙΙl···ll:·ll:lllll · I lll : l l llll l l l : l l · · · l l lll

195 TIKTIQERSKNPKPPRDARLPKPKGQTVASFRKGLAMLPNAITSSLGSKV 244

299 KLSWKLSGITKLESGGYNLTYETPDGLVSVQSKSVVMTVPSHVASGLLRP 348 llllll.:lll : · l l l·llll:l:llll·lll:ll:l l · l ll.: lll

245 KLSWKLTSITKSDDKGYVLEYETPEGVVSVQAKSVIMTIPSYVASNILRP 294

9 LSESAANALSKLYYPPVAAVSISYPKEAIRTECLIDGELKGFGQLHPRTQ 398

I l · · Ι l:lll:: l lllllll·:llil llll·ΙΙΙΙllI l.Ill i i i I l · l 295 LSSDAADALSRFYYPPVAAVTVSYPKEAIRKECLIDGELQGFGQLHPRSQ 344

399 GVETLGTIYSSSLFPNRAPPGRILLLNYIGGSTNTGILSKSEGELVEAVD 4 48

II l l l ll l l llllllllllIll:llllllll·lllll:ll · l : lll llll

5 GVETLGTIYSSSLFPNRAPDGRVLLLNYIGGATNTGIVSKTESELVEAVD 394

449 RDLRKMLIKPNSTDPLKLGVRVWPQAIPQFLVGHFDILDTAKSSLTSSGY 498 l l l lllll.....ill lllllllll l lll l lll : l : l : · l l · · l :ll

395 RDLRKMLINSTAVDPLVLGVRVWPQAIPQFLVGHLDLLEAAKAALDRGGY 4 44

499 EGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYETAIEVNNFMSRYAYK* 538 : l l l lllll llll llll l l llll l · l ::·:l : · : l llll

445 DGLFLGGNYVAGVALGRCVEGAYESASQISDFLTKYAYK* 484

Identyczne reszty są oznaczone poprzez pionowe kreski pomiędzy dwiema sekwencjami. Porównamie sekwencji zostało wykonane przy zastosowaniu programu GAP opisanego w Deveraux et al., Nucleic Acids Res. 12387-395 (1984).

186 842

Tabela 2

Porównanie sekwencji aminokwasowych Protoks-2 z Arabidopsis (SEK. NR I ID 4) i kukurydzy ( SEK NR I D 8)

Procent podobieństwa 75 889 Procent identyccności i 57 905 Protoks-2.Pep x Mzprotoks-2.Pep

............................AVSG A VAD.HQ IEAVSGARVAV 21 .1 I : i i . : l i . : : .lll

MLALTASASSASSHPYRHASAHTRRPRLRAVLAMAGSDDPRAAPARSVAV 50

VGAGVSGLAAAYKLKSRGLNVTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT 71 llllllllllll: I : - l : I llllll-: I - lll: l - : - I :: I I I I I I I

VGAGVSGLAAAYRLRQSGVNVTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDEGANT 100

MTEAEPEVGSLLDDLGLREKQQFPISQKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT 121 l I I ( I l ( ( . l : l l I I l -I I I : l l l -I l I l l : : l - l . : : l - : l l i l : 101 MTEGEWEASRLIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPALIPSDPISLMK 150

122 SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK--.-KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE 167 l l l I l l - l l : - : : : I l l l : l l - l : I l l : f - l I l : - l : l l l l - l 151 SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGR£ 200

168 VVDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGAIRTKFA 217 llll: : I lll: l lll: I l: Ill::I -ll-Ill:l:-:ll :lllll - I: l 201 VVDYFVDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA 250

218 AKGGKSRDTKSSPGTKKGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSHDEINLDSK 267 l I I i . : . - . l - l - : : - - l . I l 1 l - I l l l l : - l - - : : - l : : - l : - 251 AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALHNEVGDDNVKLGTE 300

268 VLSLS-.YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ...NPHYDAVIMTAPLCNVK 312 llll- : : : - - : . I I : l - l : l - : I l l I l l I l l i I l :

301 VLSLACTFDGVPALGRWSISVDSKDSGDKDLASNQTFDAVIMTAPLSNVR 350

313 EMKVMKGGQPFQLNFLPEINYMPLSVLITTFTKEKVKRPLEGFGVLIPSK 362 l I i l l l - l - I : I I I . : i I : I I I : : : I . I . I : . I I : I I I I I I I I I I l 351 RMKFTKGGAPVVLDFLPKMDYLPLSLMVTAFKKDDVKKPLEGFGVLIPYK 400

363 E.QKHGFKTLGTLFSSMMFPDRSPSDVHLYTTFIGGSRNQELAKASTDEL 411 I I I I I : I I I I I I I I I I I I I I I . I . I - I I I I I : I I I : I - : I I I . I - I

401 EQQKHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPDDQYLYTTFVGGSHNRDLAGAPTSIL 450

412 KQVVTSDLQRLLGVEGEPVSVNHYYWRKAFPLYDSSYDSVMEAIDKMEND 461 I I:I I I I I - : l I I I I I : I - I-I II - I l I I I : . I . I l : lll : lll.:

451 KQLVTSDLKKLLGVEGQPTFVKHVYWGNAFPLYGHDYSSVLEAIEKMEKN 500

462 LPGFFYAGNHRGGLSVGKSIASGCKAADLVISYLESCSNDKKPNDSL* 509 llllll I I I : : l I - I I - I I I I : ll I I I. l I I I I I ......:

501 LPGFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSiKtADLAISYLESHTKHNNSH*... 545

186 842

Przykład 4: Izolowanie będącego zanieczyszczeniem drożdżowego klonu protoks z biblioteki cDNA Arabidopsis.

W celu podjęcia próby identyfikacji rzadko występujących cDNA niosących aktywność protoks, dokonano ponownego przeszukania biblioteki Arabidopsis na wektorze pFL61, znowu uzyskując setki komplementujących klonów. Około 600 z nich wyszczepiono na osobne płytki szablonowe i hodowano w 28°C przez 18 godzin. Wykonano dwie repliki kolonii na filtrach Colony/Plaque screen (NEN), zgodnie z instrukcjami producenta. cDNA Protoks-1 i Protoks-2 wycięto z wektorów poprzez trawienie odpowiednio, EcoRI/XhoI i NotI. Wstawki rozdzielano poprzez elektroforezę w 1,0% agarozie SeaPlaque GTG (FMC), wycinano i znakowano 32p stosując losowe startery (Life Technologies). Jeden zestaw filtrów hybry-dyzowano z każdą z sond. Hybrydyzacja i warunki płukania były jak opisane w Church and Gilbert, 1984.

Kolonie (~20), które nie hybrydyzowafy wyraźnie z Protoks-1 lub Protoks-2, namnażano w płynnej hodowli i otrzymywano plazmidowy DNA. DNA trawiono NotI, powtórzone próbki poddawano elektroforezie w 1,0% żelu agarozowym, a następnie przenoszono metodą Southerna na filtr Gene Screen Plus (NEN) [New England Nuclear]. Sondy dla dwóch znanych genów protoks znakowano i hybrydyzowano jak poprzednio. Dwa identyczne klony nie były ani Protoks-1 ani Protoks-2. Wykazano, że ten klon ponownie komplementuje mutanta SASX38, jakkolwiek rośnie bardzo wolno, i nazwano go Protoks-3.

Protoks-3, w wektorze pFL61, został zdeponowany 8 czerwca 1994 jako pWDC-5 (NRRL #B-21280). Stwierdzono, ze ta sekwencja kodująca pochodzi z DNA drożdży, które było obecne jako niewielkie zanieczyszczenie biblioteki cDNA Arabidopsis. Drożdżowy DNA kodujący protoks-3, zawarty w pWDC-5, jest przedstawiony poniżej w SEK NR ID: 9.

Przykład 5: Wykazanie wrażliwości roślinnego klonu protoks na herbicydy hamujące protoks w systemie bakteryjnym.

Płynne kultury Protoks-l/SASX38, Protoks-2/SASX38 i pBluescript/XL1-Blue były hodowane w L amp^li)0. Próbki po sto mikrolitrów z każdej hodowli wysiewano na pożywkę L amp , zawierającą różne stężenia (1,0 nM-10 nM) arylouracylu-herbicydu hamującego protoks o wzorze 17. Powtórzoną serię płytek hodowano przez 18 godzin w 37°C przy słabym świetle lub w kompletnej ciemności.

Szczep E. coli XL1-Blue nie* wykazywał wrażliwości na żadne stężenie herbicydu, co pozostaje w zgodzie z opisywaną opornością natywnego bakteryjnego enzymu na podobne herbicydy. Protoks-1/SASX38 był wyraźnie wrażliwy, z murawą bakterii prawie całkowicie wyeliminowaną przy tak małym stężeniu inhibitora, jak 10 nM. Protoks-2/SASX38 był również wrażliwy, ale jedynie przy wyższym stężeniu herbicydu (10 M). Wpływ herbicydu na oba szczepy z roślinnym protoks był bardziej dramatyczny przy słabym świetle, ale również widoczny na płytkach trzymanych w całkowitej ciemności. Toksyczność herbicydu była całkowicie wyeliminowana poprzez dodanie do płytek 20 mg/ml hematyny.

Różna tolerancja wobec herbicydu dwóch szczepów z roślinnym Protoks jest prawdopodobnie raczej wynikiem zróżnicowanej ekspresji z tych dwóch plazmidów niż jakąś swoistą różnicą we wrażliwości enzymu. Protoks-1/sAsx38 rośnie znacznie szybciej niż Protoks-2/SASX3B w każdej pożywce nie zawierającej hemu. Dodatkowo, szczep MzProtoks-2/SASX38, który rośnie porównywalnie z Arab Protoks-l/SASX38, jest również bardzo wrażliwy na herbicyd w niższych (10-100 nM) stężeniach. Wstępna charakterystyka drożdzowego Protoks-3 wykazała, ze jest on również wrażliwy na herbicyd.

Przykł ad 6: Selekcjonowanie roślinnych genów protoks opornych na herbicydy hamujące protoks w systemie ekspresji E. coli.

Hamowanie roślinnych enzymów protoks w systemie bakteryjnym jest użyteczne przy poszukiwaniach na dużą skalę mutacji opornych na herbicyd w genach roślinnych. Wyjściowe doświadczenia z odpowiedzią na dawkę, wykonane poprzez wysiew z hodowli płynnych, prowadziły do powstania z dużą częstością „opornych” kolonii nawet przy wysokich stężeniach herbicydu. Oporność ta nie była zależna od plazmidu, co stwierdzono w oparciu o ponowną transformację/test na wrażliwość na herbicyd. Transformacja plazmidów Protoks do mutanta SASX38 i bezpośrednie wysianie na płytki zawierające herbicyd, prawie całkowicie redukują ten problem tła.

186 842

Roślinne plazmidy protoks mutagenizuje się na wiele sposobów, stosując opublikowane procedury mutagenezy chemicznej (np. dwusiarczkiem sodowym (Shortle et al., Methods Enzymol. 100: 457-468 (1983); metoksylaminą (Kadonaga et al., Nucleic Acids Res. 13: 1733-1745 (1985); mutagenezę saturacyjną za pośrednictwem oligonukleotydów (Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 83: 710-714 (1986); lub różne strategie oparte o błędne włączanie przez polimerazę (patrz, np. Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 1588-1592 (1982); Shiraishi et al., Gene 64313-319 (1988); and Leung et al., Technique 1: 11-15 (1989)). Spodziewane mutanty o podwyższonej aktywności promotora po mutagenezie całego plazmidu są eliminowane poprzez ponowne klonowanie sekwencji kodującej do wektora typu dzikiego i powtórzenie testu. Zakładając, że wyższa ekspresja prawdopodobnie prowadzi do lepszego wzrostu w nieobecności herbicydu, możliwe jest również wizualne poszukiwanie mutantów w sekwencji kodującej.

Dowolny roślinny gen protoks, wywołujący oporność na herbicyd w systemie bakteryjnym, może być poddany zabiegom inżynierii genetycznej celem uzyskania optymalnej ekspresji i transformowany do roślin przy zastosowaniu opisanych tu standardowych technik. Otrzymane w rezultacie rośliny mogą być następnie traktowane herbicydem dla ilościowego potwierdzenia poziomu oporności warunkowanej przez wprowadzony gen protoks.

Przykład 7: Konstrukty do ekspresji opornego na herbicyd genu(ów) protoks z mikroorganizmów w roślinach.

Sekwencje kodujące genu protoks hem Y z B. subtilis (Hansson and Hederstedt, J. Bacteriol.174: 8081 (1992); Dailey et al., J. Biol. Chem. 269: 813 (1994)) i genu protoks hemG z E coli (Sasarman et al., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) zostały wyizolowane ze szczepów laboratoryjnych poprzez powielanie w reakcji PCR, stosując standardowe warunki i startery otaczające te geny, zaprojektowane na podstawie opublikowanych sekwencji. Wiadomo, ze geny te kodują postaci enzymu protoks oporne na herbicyd.

Stosując standardowe techniki fuzji zachodzących na siebie produktów PCR (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. (1994)), oba bakteryjne geny zostały dołączone do dwóch różnych sekwencji chloroplastowych peptydów tranzytowych (CTP) z Arabidopsis. Pierwszym był CTP z syntetazy kwasu acetohydroksylowego, który powinien umożliwić import do strony chloroplastów. Druga była z genu dla plastocyjaniny z Arabidopsis (Vorst et al., Gene 65: 59 (1988)), który ma dwuczęściowy peptyd tranzytowy. Amino-końcowa część tego CTP kieruje białko do chloroplastów, gdzie koniec karboksylowy wprowadza je do membran tylakoidu. Wszystkie cztery fuzje genowe zostały sklonowane za promotorem 2x35S w binarnym wektorze ekspresyjnym zaprojektowanym do wytwarzania transgenicznych roślin poprzez transformację z użyciem Agrobacterium.

Po wyizolowaniu cDNA dla protoks z Arabidopsis i kukurydzy, chloroplastowy peptyd tranzytowy z Protoks-1 lub MzProtoks-1 może być również połączony z dwoma bakteryjnymi białkami protoks w taki sam sposób jak wyżej.

Opisane powyżej wektory mogą być następnie transformowane do żądanych gatunków roślin i otrzymane transformanty testowane pod kątem wzrastającej oporności na herbicyd.

Przykład 8: Zamiana domen między genami Arabidopsis/B. subtilis, celem wytworzenia protoks chimerowego, opornego na herbicydy.

Jednym z podejść, które mogą być zastosowane do wytworzenia genu protoks, który jest zarówno oporny na herbicyd, jak i zdolny do dostarczania skutecznej aktywności enzymatycznej protoks w roślinie, jest łączenie części (jednej lub wielu) bakteryjnego i roślinnego genu protoks. Powstałe w rezultacie chimerowe geny mogą być przeszukiwane pod kątem takich, które mają zdolność dostarczania komórce roślinnej opornej na herbicydy aktywności protoks. Przykładowo, sekwencje peptydu protoks z Arabidopsis i B. subtilis (hemY) są podobne, z regionami o wysokiej homologii. Sekwencję kodującą hemY klonuje się w plazmidzie pBlu-escript i testuje na zdolność do ekspresji w SASX38 aktywności protoks opornej na herbicydy. Chimerowe geny Protoks-1/hemY są konstruowane przy zastosowaniu technik fuzyjnej reakcji PCR, a następnie powtórną ligację do wektora pBluescript. Wyjściowa wymiana dotyczy środka białka. Fuzje te są testowane pod kątem funkcji protoks poprzez komplementację,

186 842 a następnie testowane na oporność na herbicyd poprzez wysianie na herbicyd, z nienaruszonymi Protoks-1 i hemY jako kontrolą.

Przykład 9: Wytwarzanie roślin tolerujących herbicyd poprzez nadprodukcję roślinnych genów protoks.

Celem uzyskania ekspresji białka Arabidopsis lub kukurydzy w transgenicznych roślinach, odpowiednie pełnej długości cDNA wstawiono do roślinnego wektora ekspresyjnego pCGNI 761ENX, który powstał z pCGNI761 jak następuje. PCGNI761 został strawiony w swoim unikalnym miejscu EcoRI i poddany ligacji z dwuniciowym fragmentem DNA, zawierającym dwie sekwencje oligonukleotydowe 5' AAT TAT GAĆ GTA ACG TAG GAA TTA GCG GCCC GCT CTC GAG T 3' (SEK NR ID: 11) i 5' AAT TAC TCG AGA GCG GCC GCG AAT TCC TAC GTT ACG TCA T 3' (SEK NR ID: 12). Uzyskany w rezultacie plazmid, pCGNI761ENX, zawiera unikalne miejsca EcoRI, NotI i XhoI, które lezą pomiędzy podwojonym promotorem 35S wirusa mozaiki kalafiora (Kay et al., Science 236: 1299-131)2 (1987)) i nie podlegającymi translacji sekwencjami 3' genu tml z Agrobacterium tumefaciens. Plazmid ten jest trawiony i poddawany ligacji z fragmentem powstałym w wyniku trawienia enzymami restrykcyjnymi jednego z plazmidów niosących cDNA protoks, tak, ze przenosi on kompletny cDNA protoks. Z takiego plazmidu wycinany jest fragment XbaI zawierający cDNA protoks z Arabidopsis, otoczony przez podwojony promotor 35S i nie podlegające translacji sekwencje 3' genu tml z A. tumefaciens. Ten fragment XbaI jest wstawiony do binarnego wektora pCIB200 w jego pojedyncze miejsce XbaI, które leży między sekwencjami granicznymi T-DNA. Otrzymany w rezultacie plazmid, oznaczony jako pCIB200protoks jest transformowany do szczepu A. tumefaciens CIB542. Patrz np. Uknes et al., Plant Cell 5: 159-169 (1993).

Dyski liściowe Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc są infekowane A. tumefaciens CIB542, niosącym pCIB2001GPD, tak jak opisano w Horsch et al., Science 227: 1229 (1985). Pędy oporne na kanamycynę z 15 niezależnych dysków liściowych przeniesiono do pożywki do ukorzeniania, a następnie przesadzano do gleby i uzyskane w rezultacie rośliny hodowano w szklarni do osiągnięcia dojrzałości. Nasiona z tych roślin zbierano i pozostawiano do skiełkowania na agarze MS zawierającym kanamycynę. Wiele indywidualnych kiełków opornych na kanamycynę z każdego niezależnego pierwotnego transformanta hodowano do dojrzałości w szklarni, a ich nasiona zbierano. Nasiona te kiełkowały na pożywce agarowej MS zawierającej kanamycynę.

Linie roślinne, które dawały wyłącznie kiełki oporne na kanamycynę są homozygotyczne dla wstawionego genu i są poddane dalszej analizie. Dyski liściowe z 15 niezależnych linii transgenicznych są wycinane z krążkiem papieru i umieszczane na agarze MS zawierającym różne wzrastające stężenia herbicydu hamującego protoks.

Po trzech tygodniach dwa zestawy po 10 dysków z każdej linii ważono i wyniki rejestrowano. Linie transgeniczne bardziej oporne na inhibitor niż nie transformowane rośliny dzikiego typu wybierano do dalszej analizy.

Z liści z każdej z tych linii izoluje się RNA. Totalny RNA z każdej niezależnej linii homozygotycznej i z nietransgenicznych roślin kontrolnych rozdziela się poprzez elektroforezę w żelu agarozowym w obecności formaldehydu (Ausubel et al., Current Protocols w Molecular Biology, Wiley & Sons, New York (1987)). Przeprowadza się transfer z żelu na filtr (Ausubel et al., supra.) i hybrydyzuje się z wyznakowanym radioaktywnie cDNA protoks z Arabidopsis. Hybrydyzacja i warunki płukania są takie, jak opisane przez Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1991-1995 (1984). Filtr jest poddawany autoradiografii; intensywne pasma RNA odpowiadające transgenowi protoks wykrywa się we wszystkich liniach roślin transgenicznych tolerujących herbicyd.

W celu dalszej oceny oporności linii nadprodukującej protoks, rośliny są hodowane w szklarni i poddane działaniu różnych stężeń herbicydu hamującego protoks.

Przykład 10: Wzrost komórek tytoniu w kulturze zawiesinowej.

Pożywki:

MX1: Pożywka ta składa się z roztworu soli podstawowych Murashige i Skoog („MS”, T. Murashige et al., Physiol. Plant. 15: 473-497 (1962), soli dodatkowych i Fe-EDTA (Gibco # 500-1117, 4,3 g/l), 100 mg/l mioinositolu, 1 mg/l kwasu nikotynowego, 1 mg/l pirydoksyny-HCl,

186 842 mg/l tiaminy-HCl, 2-3 g/l sacharozy, 0,4 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego oraz 0,04 mg/l kinetyny, pH 5,8. Pożywkę sterylizuje się poprzez autoklawowanie.

N6: Pożywka to zawiera makroelementy, mikroelementy oraz Fe-EDTA jak opisano przez C-C. Chu et al., Scientia Sinica 18659 (1975) i następujące związki organiczne: piry-doksynę-HCl (0,5 mg/l), tiaminę-HCl (0,1 mg/l), kwas nikotynowy (0,5 mg/l), glicynę (2,0 mg/l) oraz sacharozę (30,0 g/l). Roztwór jest autoklawowany. Końcowe pH wynosi 5,6.

Uwagi: Makroelementy są przygotowywane jako 10x stężony roztwór wyjściowy, a mikroelementy jako 1000x stężony roztwór wyjściowy. Roztwór wyjściowy witamin jest normalnie sporządzany jako 100x stężony.

Zawiesinę komórek Nicotiana tabacum, linii S3 (Harms and DiMaio, J. Plant Physiol 137, 513-519 (1991) hoduje się w płynnej pożywce hodowlanej MX1. 100 ml kolby Erlenmeyera zawierające 25 ml pożywki MX1 zaszczepia się 10 ml kultury komórek hodowanych uprzednio przez 7 dni. Komórki inkubuje się w 25°C w ciemności w wytrząsarce orbitalnej przy 100 rpm (skok 2 cm). Komórki hoduje się dalej, co 7 dni przeszczepiając próbkę do świeżej pożywki, poprzez zlanie lub odpipetowanie 90% zawiesiny komórek, a następnie uzupełnienie świeżej pożywki, tak aby uzyskać żądaną objętość zawiesiny. 5-8 gramów świeżej masy komórkowej wytwarza się w ciągu 10 dni hodowli z inokulum 250-350 mg komórek.

Przykład 11: Wytwarzanie kultur komórek tytoniu tolerujących herbicydy-inhibitory protoks poprzez wysiew komórek na zestaloną pożywkę selekcyjną.

Komórki są wstępnie hodowane tak, jak w przykładzie 10. Komórki zbiera się poprzez umożliwienie im sedymentacji lub poprzez krótkie wirowanie przy 500 x g, a pożywkę odrzuca się. Komórki rozcieńcza się następnie w świeżą pożywką hodowlaną celem uzyskania gęstości komórek odpowiedniej do wysiewu komórek, czyli około 10000 jednostek tworzących kolonie na ml. W celu wysiania, komórki w małej objętości pożywki (około 1 ml) rozprowadza się równo na powierzchni zestalonej pożywki hodowlanej (MXI, 0,8% agar), zawierającej żądane stężenie inhibitora.

Stosowano około 20-30 ml pożywki na płytkę Petriego o średnicy 10 cm. Odpowiednie stężenie inhibitora określa się z krzywej odpowiedzi na dawkę (przykład 14) i jest ono co najmniej dwukrotnie wyższe niż IC50 komórek wrażliwych typu dzikiego.

Płytki hodowlane zawierające komórki wysiane na pożywkę selekcyjną inkubuje się w normalnych warunkach wzrostu w 25-28°C w ciemności aż do utworzenia kolonii komórek. Pojawiające się kolonie komórek są przenoszone do świeżej pożywki zawierającej inhibitor o pożądanym stężeniu.

W korzystnej modyfikacji opisanej metody, hodowana wstępnie kultura zawiesinowa komórek jest najpierw wysiewana w małej ilości pożywki hodowlanej na powierzchnię zestalonego agaru. Dodaje się równą ilość ciepłej płynnej pożywki agarowej (1,2-1,6% agaru), trzymanego w formie upłynnionej w temp. około 40°C, i płytkę natychmiast przechyla się łagodnie, równo rozprowadzając komórki na powierzchni pożywki i mieszając komórki z pożywką agarową, zanim pożywka się zestali.

Alternatywnie, komórki miesza się z roztopioną pożywką agarową przed wysianiem na powierzchnię pożywki selekcyjnej. Sposób ten ma tą zaletę, że komórki są zagłębione i unieruchamiane w cienkiej warstwie zestalonej pożywki, na powierzchni pożywki selekcyjnej. Pozwala to na lepsze napowietrzanie komórek w porównaniu z komórkami zagłębionymi w całkowitej objętości 20-30 ml.

Przykład 12: Wytwarzanie kultur komórek tytoniu tolerujących herbicyd-inhibitor protoks poprzez hodowanie komórek w płynnej pożywce selekcyjnej.

Komórki hodowane tak, jak w przykładzie 10 są dodawane przy odpowiedniej gęstości kultury jako inokulum do pożywki płynnej MX1, zawierającej pożądane stężenie herbicydu-inhibitora protoks. Komórki inkubuje się i hoduje tak jak w przykładzie 10. Komórki sąpasazowane po upływie 7-10 dni, z uwzględnieniem tempa wzrostu, przy zastosowaniu świeżej pożywki zawierającej pożądane stężenie inhibitora.

W zależności od zastosowanego stężenia inhibitora, wzrost komórek może być wolniejszy niż w przypadku braku inhibitora.

186 842

Przykład 13: Wytwarzanie komórek tytoniu o podwyższonym poziomie enzymu protoks.

Celem otrzymania kultury komórek lub kalusa o podwyższonym poziomie enzymu protoks, kultury płynne lub kalus przenoszone są sukcesywnie, do wzrastających skokowo stężeń herbicydu-inhibitora protoks. W szczególności przeprowadzone są następujące etapy:

W celu otrzymania kultury zawiesinowej, kolonie komórek, pojawiające się ponad wysianymi komórkami z przykładu 11, są przenoszone do płynnej pożywki MX1 zawierającej takie same stężenie inhibitora protoks, jak stosowane przy selekcji według przykładu 11. Alternatywnie, wybrane zawiesinowe kultury komórkowe z przykładu 12 są dalej kodowane w pożywce płynnej MX1 zawierającej takie same stężenie inhibitora protoks, jak stosowane przy selekcji według przykładu 12. Kultury sąpasazowane 1-20 razy w odstępach tygodniowych, a następnie przeniesione do pożywki MX1, zawierającej kolejne wyższe stężenie herbicydu. Komórki są następnie hodowane przez 1-10 pasaży w pożywce zawierającej to wyższe stężenie herbicydu. Komórki przenosi się następnie do pożywki MX1 zawierającej kolejne wyższe stężenie herbicydu.

Alternatywnie, kawałki wybranego kalusa z przykładu 11 przenosi się do zestalonej pożywki MX1, uzupełnionej pożądanym stężeniem herbicydu. Przeniesienie do wyższych stężeń herbicydu odbywa się według procedury omówionej w poprzednim paragrafie, z tym wyjątkiem, że stosowana jest zestalona pożywka.

Przykład 14: Pomiar wzrostu komórek w kulturach zawiesinowych, zależnego od dawki herbicydu.

W celu otrzymania krzywej odpowiedzi na dawkę oznaczono wzrost komórek przy różnych stężeniach herbicydu. Zawiesinową kulturę komórek S3 tytoniu typu dzikiego, wrażliwych na herbicyd-inhibitor protoks oraz wyselekcjonowanych lub transgenicznych komórek S3, tolerujących herbicyd hoduje się wstępnie na pożywce płynnej, tak jak w przykładzie 11, przy dużej gęstości, przez 2-4 dni. Komórki są przemywane, resztki pożywki odrzucane i dodawana jest świeża pożywka bez herbicydu do uzyskania pożądanej gęstości komórek (około 150 mg FW komórek na ml zawiesiny).

Próbkami po 2,5 ml zawiesiny komórek, zawierającymi około 250-300 mg FW komórek, zaszczepiano następnie około 30 ml pożywki płynnej o żądanym stężeniu herbicydu, zawartej w 100 ml kolbie Erlenmeyera. Dbano, aby każdą kolbę zaszczepić taką samą ilością komórek. Każda kolba zawierała taką samą objętość pożywki. Dla jednego stężenia herbicydu szczepiono 3-6 powtórzonych kolb. Dobrano stężenia herbicydu od zera (=kontrola), 0,1 ppb, 0,3 ppb, 1 ppb, 3 ppb, 10 ppb, 30 ppb, 100 ppb, 300 ppb, 1000 ppb, 3000 ppb, i 10000 ppb. W momencie zakładania hodowli pobierano również kilka próbek komórek stanowiących inokulum dla określenia masy komórkowej użytej jako inokulum na kolbę.

Komórki inkubuje się następnie w kontrolowanych warunkach w 28°C w ciemności przez 10 dni. Komórki są zbierane poprzez wylanie zawartości każdej kolby na krążki bibuły filtracyjnej, połączonej z próżniowym urządzeniem ssącym, celem usunięcia całego płynu i otrzymania masy stosunkowo suchych świeżych komórek. Świeża masa jest następnie ważona. Sucha masa próbek może być otrzymana po wysuszeniu.

Wzrost komórek jest określany i wyrażany jako komórki uzyskane wciągu 10 dni i przedstawiany w procentach względem komórek rosnących w nieobecności herbicydu, zgodnie ze wzorem: (końcowa masa komórek rosnących w obecności herbicydu minus masa x 100 podzielona przez końcową masę komórek rosnących bez herbicydu minus masa inokulum). Wartości IC50 są określone na podstawie wykresów lub plotów (względna masa komórek wobec stężenia herbicydu). IC50 oznacza stężenie herbicydu, przy którym wzrost komórek stanowi 50% wzrostu kontrolnego (komórki rosnące w nieobecności herbicydu).

W modyfikacji metody, kilka kawałków kalusa pochodzącego z kultury komórek opornych na herbicyd, takich jak otrzymane w przykładach 11 i 13, przenosi się na zestaloną pożywkę do hodowli kalusa, zawierającą różne stężenia herbicydu. Względny wzrost określa się po okresie hodowli przez 2-6 tygodni poprzez ważenie kawałków kalusa i porównanie z kontrolną kulturą hodowaną na pożywce bez herbicydu. Jednakże metoda zawiesinowa jest korzystniejsza ze względu na większą dokładność.

186 842

Przykład 15: Określenie tolerancj i krzyżowej.

Celem określenia stopnia w jakim komórki wykazują tolerancję wobec analogicznych lub innych herbicydów, przykład 14 jest powtarzany poprzez hodowanie komórek przy wzrastających stężeniach wybranych herbicydów. Dla porównania, dla każdego herbicydu określony jest względny wzrost komórek i ich wartość IC50.

Przykład 16: Określenie stabilności fenotypu tolerancji na herbicyd w czasie.

W celu określenia, czy fenotyp tolerancji na herbicyd kultury komórkowej jest utrzymywany w czasie, komórki przenosi się z pożywki zawierającej herbicyd do pożywki bez herbicydu. Komórki hoduje się tak, jak opisano w przykładzie 10, w nieobecności herbicydu przez okres 3 miesięcy, stosując regularne pasażowanie w odpowiednich odstępach czasu (7-10 dni dla kultur zawiesinowych; 3-6 tygodni dla kultury kalusowej). Znane ilości komórek przenosi się następnie z powrotem do pożywki zawierającej herbicyd i hoduje się przez 10 dni (hodowla zawiesinowa) lub 4 tygodnie (hodowla kalusowa). Względny wzrost określa się tak, jak w przykładzie 14.

Przykład 17: Indukcja i hodowla embrioidalnego kalusa z tkanki tarczki kukurydzy.

Kłosy są zbierane z samozapylonych roślin kukurydzy w osobnej linii Funk 2717 12-14 dni po zapyleniu. Łuski są usuwane i kłosy sterylizowane przez około 15 minut poprzez wytrząsanie w 20% roztworze handlowo dostępnego wybielacza Chlorox z kilkoma kroplami detergentu dodanego dla lepszego zwilżania. Kłosy płucze się następnie kilka razy sterylną wodą. Kolejne etapy przeprowadza się aseptycznie pod sterylnym wyciągiem. Zarodki o długości 1,5-2,5 mm usuwa się z ziaren szpatułką i umieszcza się, osią zarodkową skierowaną w dół, na pożywce hodowlanej MS zawierającej 2 mg/l kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) i 3% sacharozę, utwardzonej 0,24% Gelritem®.

Embrioidalny kalus tworzy się w tkance tarczki zarodków w ciągu 2-4 tygodni hodowli w 28°C w ciemności. Kalus usuwa się z eksplantu i przenosi do świeżej zestalonej pożywki MS, zawierającej 2 mg/l 2,4-D. Pasażowanie embrioidalnego kalusa powtarza się co tydzień. Przeszczepia się jedynie części kalusa mające morfologię zarodkową.

Przykład 18: Selekcja kultur komórek kukurydzy tolerujących herbicydy-inhibitory protoks.

a) Selekcja przy zastosowaniu embrioidalnego kalusa : embrioidalny kalus z przykładu 17 jest przenoszony do pożywki utrzymującej kalus, składającej się z pożywki Nó, zawierającej 2 mg/l 2,4-D, 3% sacharozę i inhibitor protoks w stężeniu wystarczającym dla opóźnienia wzrostu, ale który nie wpływa na stan zarodkowy kultury, zestalonej przy użyciu 0,24% Gelrihi®. Dla zwiększenia częstości mutacji tolerujących herbicyd, kultury mogą być przed selekcją wstępnie traktowane mutagenem chemicznym, np. sulfonianem etylometanu lub mutagenem fizycznym, np. światłem UV, w stężeniach tuż poniżej stężenia, przy którym wykrywane jest hamowanie wzrostu, tak jak się to określa w przykładzie 14. Kultury są hodowane w ciemności w 28°C. Po 14 dniach rosnący kalus jest przenoszony do świeżej pożywki o tym samym składzie. Dalszej hodowli poddaje się jedynie kultury o pożądanej zarodkowej morfologii, znanej jako luźny kalus embrioidalny o morfologii typu II. Kultury namnaża się poprzez 2-10 krotne pasażowanie kultury w odstępach tygodniowych do świeżej pożywki, dzięki czemu przeszczepiane są jedynie najszybciej rosnące kultury. Szybko rosnące kalusy są następnie przenoszone do pożywki utrzymującej kalus, zawierającej herbicyd hamujący protoks w odpowiednim stężeniu, jak określono w przykładzie 11. Jeżeli kalus rośnie dobrze na takim stężeniu herbicydu, zwykle po około pięciu do dziesięciu co tygodniowych pasażach, kalus przenosi do pożywki utrzymującej kalus, zawierającej trzykrotnie wyższe stężenie inhibitora, i hoduje ponownie, dopóki nie otrzyma się dobrze rosnącej kultury. Proces ten jest powtarzany przy użyciu pożywki zawierającej inhibitor protoks w stężeniu dziesięciokrotnie wyższym niż odpowiednie stężenie wyjściowe, a następnie pożywki zawierającej 20-krotnie i 40-krotnie wyższe stężenia.

Po wytworzeniu odpowiedniego kalusa jest on przenoszony do pożywki regeneracyjnej, odpowiedniej dla dojrzewania zarodka i regeneracji rośliny. Embrioidalny kalus, rosnący na każdym z zastosowanych stężeń herbicydu, jest przenoszony do pożywki regeneracyjnej.

b) Selekcja przy zastosowaniu embrioidalnych kultur zawiesinowych: embrioidalne kultury zawiesinowe w osobnej linii 2717 kukurydzy Funk są przygotowane według przykładu 24

186 842 i utrzymywane poprzez kolejne pasażowanie w odstępach tygodniowych do świeżej pożywki N6, zawierającej 2 mg/l 2,4-D. Dla zwiększenia częstości mutacji tolerujących herbicyd, kultury mogą być w tym czasie traktowane mutagenem chemicznym, np. sulfonianem etylometanu w stężeniu tuz poniżej stężenia, przy którym wykrywane jest hamowanie wzrostu, tak jak się to określa w przykładzie 14. W celu selekcji, kultury przenosi się do płynnej pożywki N6 zawierającej 2 mg/l 2,4-D i stężenie inhibitora wystarczające do opóźnienia wzrostu, ale nie wpływające na stan embrioidalny kultury. Kultury hoduje się na wytrząsarce przy 120 rpm w 28°C w ciemności. W odstępach tygodniowych pożywkę usuwa się i dodaje świeżej pożywki. Kultury rozcieńcza się pożywką hodowlaną, biorąc pod uwagę ich tempo wzrostu, celem otrzymania około 10 ml upakowanych komórek z 50 ml pożywki. W każdym z kolejnych pasaży, kultury są badane i jedynie szybko rosnące kultury o pożądanej kruchej embrioidalnej morfologii są zachowywane do dalszych pasaży. Po dwóch do dziesięciu pasażach w pożywce N6 tempo wzrostu kultury zwiększa się co najmniej dwu-trzykrotnie na tygodniowy pasaż. Kultury przenosi się następnie do płynnej pożywki N6, zawierającej 2 mg/l 2,4-D i trzykrotnie wyższą dawkę inhibitora, niż stosowana oryginalnie. Rosnące kultury sąpasażowane w tej pożywce dwa do dziesięciu razy tak, jak opisano powyżej. Szybko rosnące kultury o pożądanej luźnej, embrioidalnej morfologii wybiera się do dalszych pasaży. Szybko rosnące kultury przenosi się następnie do pożywki N6, zawierającej 2 mg/l 2,4-D i dziesięciokrotnie wyższą dawkę inhibitora, niż oryginalnie stosowana, i proces pasażowania rosnących kultur o pożądanej luźnej embrioidalnej morfologii jest powtarzany dwa do dziesięciu razy, aż do otrzymania szybko rosnących kultur. Kultury przenosi się następnie do pożywki N6, zawierającej 2 mg/l 2,4-D i 30-krotnie wyższą dawkę inhibitora, niż stosowana oryginalnie.

Dla wytworzenia embrioidalnego kalusa, w celu regeneracji roślin, kultury przenosi się najpierw z każdej zarodkowej kultury płynnej, wybranej dla wspomnianego poziomu stężenia herbicydu, na podłoże N6 zestalone 0,24% Gelritem® i zawierające 2 mg/l 2,4-D oraz, ewentualnie stężenie inhibitora, przy którym hodowle rosły. Embrioidalny kalus przeszczepia się na świeżą pożywkę utrzymującą kalus, aż do uzyskania odpowiedniej ilości kalusa do regeneracji. Pasażuje się jedynie kultury o pożądanej zarodkowej morfologii.

Przykład 19: Regeneracja roślin kukurydzy z wybranego kalusa lub kultury zawiesinowej.

Rośliny regeneruje się z wybranych kultur embrioidalnego kalusa z przykładu 13 poprzez przeniesienie do świeżej pożywki regeneracyjnej. Stosowanymi pożywkami regeneracyjnymi są: pożywka 0N6 składająca się z pożywki N6 bez 2,4-D, lub N61 składająca się z pożywki N6 zawierającej 0,25 mg/l 2,4-D i 10 mg/l kinetyny (6-furfuryloaminopuryny) lub N62 składającej się z pożywki N6 zawierającej 0,1 mg/l 2,4-D i 1 mg/l kinetyny, wszystkich zestalonych przy użyciu 0,24% Gelritu®. Kultury hoduje się w 28°C na świetle (16 godz. na dzień 10-100 mEinsteinów/m²sek z białych lamp fluorescencyjnych). Kultury pasażuje się co dwa tygodnie na świeżą pożywkę. Rośliny rozwijają się w ciągu 3 do 8 tygodni. Rośliny o wysokości co najmniej 2 cmusuwa sśę z przyległego ka^sa i p^t^r^cosi do pożywki idconzeniającej.

Stosuje się różne pożywki ukorzeniające. Pożywka składa się z pożywki N6 lub MS bez witamin, bądź ze zwykłą ilością soli, bądź z solami zmniejszonymi do połowy, sacharozą zmniejszoną do 1 g/l, a dalej, bądź bez związków regulujących wzrost, bądź zawierającej 0,1 mg/l kwasu α-naftalenooctowego. Kiedy tylko korzenie dostatecznie się rozwiną, roślinki są przesadzane do mieszanki doniczkowej składającej się z wermikulitu, torfowca i ziemi ogrodniczej. W czasie przesadzania wszystkie pozostałe części kalusa są odcinane, cały agar odpłukany i liście przycinane do połowy. Roślinki hoduje się w szklarni początkowo przez kilka dni przykryte odwróconym przezroczystym plastykowym kubkiem w celu utrzymania wilgotności, po czym hodowla jest zacieniana. Po aklimatyzacji rośliny są przesadzane i hodowane do osiągnięcia dojrzałości. Dla zapewnienia prawidłowego rozwoju roślin stosuje się nawóz Peters 20-20-20 (Grace Sierra). Po zakwitnięciu, rośliny są zapylane, najkorzystniej samozapylane.

Przykład 20: Konstrukcja wektorów do transformacji roślin.

Dostępnych jest wiele wektorów do transformacji roślin, a geny chimerowe według wynalazku mogą być stosowane w połączeniu z dowolnym z takich wektorów. Wybór wektora, który ma być zastosowany będzie zależał od korzystnej techniki transformacji i gatunku

186 842 stanowiącego cel transformacji. Dla niektórych gatunków docelowych, może być korzystny odmienny antybiotykowy lub herbicydowy marker do selekcji. Markery selekcyjne stosowane rutynowo przy transformacji obejmują gen nptII, który wywołuje oporność na kanamycynę i pokrewne antybiotyki (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983)), gen bar, który wywołuje oporność na herbicyd fosfinotrycynę (White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990), Spencer et al. Theor Appl Genet 79: 625-631 (1990)), gen hph, który wywołuje oporność na antybiotyk higromycynę (Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol 4: 2929-2931) oraz gen dhfr, który wywołuje oporność na metotreksat (Bourouis et al., EMBOJ. 2(7): 1099-1104(1983)).

(1) Konstrukcja wektorów odpowiednich do transformacji z użyciem Agrobacterium

Dostępnych jest wiele wektorów do transformacji przy zastosowaniu Agrobacterium tumefaciens. Przenoszą one co najmniej jedną skrajną sekwencję T-DNA i obejmują takie wektory, jak pBINI9 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)). Poniżej opisana jest konstrukcja dwóch typowych wektorów.

Konstrukcja pCIB200 i pCIB2001

Binarne wektory pCIB200 i pCIB2001 są użyte do konstrukcji zrekombinowanych wektorów celem zastosowania z Agrobacterium i zostały skonstruowane w następujący sposób. pTJS75kan został utworzony poprzez trawienie Narl plazmidu pTJS75 (Schmidhauser & Helinski, J. Bactericl.164: 446-455 (1985)), co umożliwiło wycięcie genu oporności na tetracyklinę, a następnie wstawienie fragmentu Accl z pUC4K niosącego NPTII (Messing & Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et al., Nature 304: 184-187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Bfology 14: 266-276 (1990)). Adaptery XhoI zostały dołączone w wyniku ligacji do fragmentu EcoRV plazmidu pCIB7, który zawiera lewy i oprawy brzeg T-DNA, roślinny marker selekcyjny-gen chimerowy nos/nptII i polilinker z pUC (Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)), po czym fragment strawiony XhoI został sklonowany w plazmidzie pTJS75kan, strawionym SaII, z utworzeniem pCIB200 (patrz również EP 0 332104, przykład 19 [1338]). pCIB200 zawiera następujące miejsca restrykcyjne w polilinkerze: EcoRI, SstI, KpnI, BgIII, XbaI i SaIł. pCI82001 jest pochodną pCIB200, która jest utworzona poprzez wstawienie do polilinkera dodatkowych miejsc restrykcyjnych. Pojedynczymi miejscami w polilinkerze pCIB2001 są: EcoRI, SstI, KpnI, BgIII, XbaI, SaII, MluI, BeII, AvrII, ApaI, HpaI i StuI. pCIB2001,oprócz tego, że zawiera te unikalne miejsca restrykcyjne, ma również roślinny i bakteryjny marker selekcyjny-kanamycynę, lewy i prawy brzeg T-DNA do transformacji za pośrednictwem Agrobacterium, pochodzącą od RK2 funkcję trfA do przekazywania pomiędzy E coli i innymi gospodarzami oraz funkcje OriT i OriV, również z RK2. Polilinker pCIB2001 nadaje się do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających swoje własne sygnały regulacyjne.

Konstrukcja pCIB10 i selekcja jego pochodnych na higromycynie

Binarny wektor pCIB10 zawiera gen kodujący oporność na kanamycynę do selekcji w roślinach, lewą i prawą sekwencję skrajną T-DNA i włączone sekwencje z plazmidu pRK252 o szerokim zakresie gospodarzy, umożliwiające jego replikację zarówno w E. colt, jak i Agrobacterium. Jego konstrukcja jest opisana przez Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987). Skonstruowano różne pochodne pCIB10, w których dołączony jest gen dla fosfotransferazy higromycyny B, opisany przez Gritz et al., Gene 25: 179-188 (1983)). Pochodne te umożliwiają selekcję transgericzrych roślin jedynie na higromycynie (pCIB743) lub higromycynie i kanamycynie (PCIB7I5, pCIB7I7) [Rothstein et al., Gene 53: 153-161 (1987)].

(2) Konstrukcja wektorów odpowiednich do transformacji nie poprzez Agrobacterium.

Transformacja bez u życia Agrobacterium tumefaciens omija wymaganie sekwencji T-DNA w wybranym wektorze do transformacji i w konsekwencji wektory, które nie mają tych sekwencji mogą być stosowane obok wektorów, takich jak opisane powyżej, które zawierają sekwencje T-DNA. Techniki transformacji, które nie są zależne od Agrobacterium, obejmują transformacją poprzez bombardowanie cząstkami, pobieranie przez protoplasty (np. PEG lub elektrcpcracja) i mikroiniekcja. Wybór wektora zależy w dużej mierze od korzystnej selekcji dla gatunku, który jest transformowany. Poniżej jest opisana konstrukcja niektórych typowych wektorów.

186 842

Konstrukcja pCIB3064 pCIB3064 jest wektorem pochodnym pUC, nadającym się do stosowania technik bezpośredniego przeniesienia genu w kombinacji z selekcją przy użyciu herbicydu basta (lub fosfi-norticyny). Plazmid pCIB246 zawiera promotor 35S z CaMV funkcjonalnie połączony z genem GUS z E coli i terminatorem transkrypcji 35S z CaMV i jest opisany w opublikowanym zgłoszeniu PCT WO 93/07278. Promotor 35S tego wektora zawiera dwie sekwencje ATG położone 5' od miejsca startu. Miejsca te zostały zmutowane przy zastosowaniu standardowych technik PCR w taki sposób, aby usunąć miejsca ATG i utworzyć miejsce restrykcyjne SspI i PvuII. Te nowe miejsca restrykcyjne znajdowały się 96 i 37 bp od pojedynczego miejsca SaII oraz 101 i 42 bp od miejsca startu. Uzyskana pochodna pCIB246 została nazwana pCIB3025. Gen GUS został następnie wycięty z pCIB3025 poprzez trawienie SaII and SacI, końce przekształcone w tępe i ponownie ligowane, z wytworzeniem pCIB3060. Plazmid pJIT82 został otrzymany z John Innes Centre, Norwich i fragment SmaI o długości 400 bp, zawierający gen bar ze Streptomyces viridochromogenes, został wycięty i wstawiony w miejsce HpaI plazmidu pCIB3060 (Thompson et al. EMBO J 6: 2519-2523 (1987)). Powstał w ten sposób plazmid pCIB3064, który zawiera gen bar pod kontrolą promotora i terminatora 35S z CaMV, do selekcji na herbicyd, gen fro oporności na ampicylinę (do selekcji w E. coli) oraz polilinker z pojedynczymi miejscami cięcia SphI, PstI, HindIII i BamHI. Wektor ten jest odpowiedni do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających swoje własne sygnały regulacyjne.

Konstrukcja plazmidów pSOGI9 i pSOG35 pSOG35 jest wektorem do transformacji, który wykorzystuje gen dla reduktazy dihydrofolanu (DHFR) z E. coli jako marker selekcyjny przenoszący oporność na metotreksat. Reakcja PCR była zastosowana do powielenia promotora 35S (~800 bp), intronu 6 z genu Adh1 kukurydzy (~550 bp) [Lou et al., Plant J 3: 393-403, 1993; Dennis et al., Nucl. Acids Res. 12: 3983-4000, 1984] oraz sekwencji nie podlegającego translacji lidera GUS o długości 18 bp z plazmidu pSOG10. Fragment 250 bp kodujący reduktazę dihydrofolanu typu II z E. coli był również powielany poprzez PCR i te dwa fragmenty PCR były łączone z fragmentem SacIPstI z pBI221 (Clontech), który zawierał szkielet wektora pUCI9 i terminator syntazy nopaliny. W wyniku połączenia tych fragmentów powstał plazmid pSOGI9, który zawiera promotor 35S przyłączony do sekwencji intronu 6 lidera GUS, genu DHFR i terminatora syntazy nopaliny. Poprzez zamianę lidera GUS w pSOGI9 na sekwencję liderową z wirusa Maize Chlorotic Mottle Virus (MCMV) powstał wektor pSOG35. Plazmidy pSOG19 i pSOG35 przenoszą gen oporności na ampicylinę z pUC i mają miejsca HindIII, SphI, PstI i EcoRI do klonowania obcych sekwencji.

pSOG10

Ten wektor ekspresyjny z β-glukuronidazą (GUS) pochodził od plazmidu pBII21, otrzymanego z Clonetech Laboratories; Palo Alto, California. Intron 6 z genu Adh1 kukurydzy został powielony poprzez PCR z plazmidu pB428, opisanego w Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 81: 4125-4128 (1987), stosując startery oligonukleotydowe SON0003 i SON0004.

SON0003: 5'-CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG-3'

SON0004: 5'-ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG-3'

Produkt reakcji PCR był trawiony endonukleazą restrykcyjną BamHI, przecinając miejsce BamHI, dodane na końcu 5' każdego ze starterów. Uzyskany w rezultacie fragment DNA był oczyszczany w żelu agarozowym i włączany w wyniku ligacji w miejsce BamHI plazmidu pBII21, które znajduje się pomiędzy promotorem 35S z CaMV i genem GUS. Połączony w wyniku ligacji DNA był transformowany do E coli i klony z intronem 6 Adh1 w tej samej orientacji, co gen GUS, były identyfikowane poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi.

pSOG19

Ten wektor ekspresyjny z reduktazą dihydrofolianu (DHFR) powstał poprzez połączenie promotora 35S i intronu 6 Adh1 z plazmidu pSOG10 do genu DHFR z plazmidu plazmid pHCO, opisanego w Bourouis i Jarry, EMBO J. 2: 1099-1104 (1983). Promotor 35S i intron 6

186 842

Adh1 wytworzono poprzez powielenie w reakcji PCR fragmentu z pSOG10, stosując startery SON0031 i SON0010.

SONOO31: 5'-CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC-3'

SON0010: 5-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'

Otrzymany w rezultacie fragment był trawiony PstI i BspHI i oczyszczony w żelu agarozowym.

Region kodujący DHFR został wytworzony poprzez powielenie w reakcji PCR z pHCO przy zastosowaniu starterów SON0016 i SON0017.

SON0016: 5'-GCTACCATGGCCACATAGAACACC-3'

SON0017: 5'-CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG-3'

Otrzymany w rezultacie fragment był trawiony NcoI i SacI i oczyszczony w żelu agarozowym.

Dwa fragmenty opisane powyżej zostały połączone w wyniku ligacji z fragmentem wektora, otrzymanym z pBII21, poprzez trawienie nukleazami restrykcyjnymi PstI i SacI i oczyszczenie fragmentu o wielkości 3 kb zawierającego region terminatora N i region pUCI9 z pBII21 w żelu agarozowym. W wyniku takiej trójetapowej ligacji nastąpiło połączenie: promotor 35S-intron 6 Adh1-gen DHFR- terminator Nos we właściwym porządku i orientacji dla funkcjonalnej ekspresji w roślinach.

pSOG 30

Wektor ekspresyjny GUS powstał z pSOG10 poprzez wstawienie lidera z wirusa Maize Chlorotic Mottle Virus (MCMV), opisanego w Lommel et al., Virology 181: 382-385 (1991), do nie ulegającego translacji lidera genu 35S-GUS w trzyetapowej ligacji.

Obie nici sekwencji lidera białka kapsydu MCMV o długości 17 bp plus odpowiednie miejsca dla enzymów restrykcyjnych zostały zsyntetyzowane i połączone. Otrzymany dwuniciowy fragment był trawiony BamHI i NcoI i oczyszczony w żelu akryloamidowym.

Region kodujący genu GUS został powielony poprzez PCR przy użyciu starterów: SON0039 i SON0041 oraz pBII21 jako matrycy.

SON0039: 5'-CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCCACA-3'

SON0041: 5'-ATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC-3'

Startery te dodały miejsce NcoI na końcu 5' GUS i miejsce SacI na końcu 3' GUS.

Uzyskany w rezultacie fragment był trawiony endonukleazami NcoI i SacI i oczyszczony w żelu agarozowym.

Gen GUS został usunięty z plazmidu pSOG10 poprzez trawienie endonukleazą restrykcyjną SacI i częściowe trawienie endonukleazą restrykcyjną BamHI. Uzyskany w rezultacie wektor, który ma miejsce BamHI i miejsce SacI do ponownego wstawienia regionu kodującego za promotorem 35S-intronem 6Adh1, był oczyszczony w żelu agarozowym.

Trzy fragmenty opisane powyżej były łączone w wyniku trójetapowej ligacji z wytworzeniem fiizji genowej o strukturze: promotor 35S-intron 6 Adh1-lider MCMV-GUS-terminator Nos, wszystko w szkielecie wektora pUCI9.

pSOG 35

Wektor z markerem selekcyjnym DHFR jest identyczny, jak pSOGI9 z tą różnicą, ze lider MCMV jest wstawiony do nie podlegającego translacji lidera genu DHFR dla zwiększenia translacji. Został on utworzony w dwóch etapach. Najpierw region kodujący GUS w pSOG32, wektorze identycznym jak pSOGSO z tą różnicą, że zawiera zmodyfikowany promotor Adh zamiast 35S, został zastąpiony regionem kodującym DHFR z pSOGI9 poprzez wycięcie GUS przez NcoI i SacI i włączenie w wyniku ligacji do DHFR jako fragment NcoI-SacI. Uzyskano w rezultacie wektor pSOG33, który ma następującą strukturę: promotor Adh-intron 6Adh1lider MCMV-region kodujący DHFR-terminator Nos, z miejscem BgIII pomiędzy promotorem i intronem oraz miejscem SacI pomiędzy regionem kodującym i terminatorem. Fragment BgIII-SacI został wyizolowany poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi i oczyszczenie w żelu agarozowym i włączony w wyniku ligacji w miejsca BamHI i SacI pSOG30, zastępując intron 6 Adhł-lider MCMV-region kodujący GUS z pSOG30 przez intron 6 Adh1-lider MCMV-region kodujący DHFR z pSOG33

186 842

Przykład 21: Konstrukcja roślinnych kaset ekspresyjnych.

Sekwencje genów, które mają podlegać ekspresji w transgenicznych roślinach, są najpierw wstawione do kaset ekspresyjnych za odpowiednim promotorem i przed odpowiednim terminatorem transkrypcji. Takie kasety ekspresyjne mogą być następnie łatwo przenoszone do wektorów do transformacji roślin, opisanych powyżej w przykładzie 19.

Wybór promotora

Wybór promotora stosowanego w kasetach ekspresyjnych będzie określał przestrzenny i czasowy wzór ekspresji transgenu w roślinach transgenicznych. Wybrane promotory będą kierować ekspresją transgenów w specyficznych typach komórek (takich jak komórki epidermalne liścia, komórki mezofilu, komórki skóry korzenia) lub w specyficznych tkankach czy organach (na przykład korzeniach, liściach lub kwiatach) i ten wybór będzie odzwierciedlać pożądaną lokalizację ekspresji w transgenie. Alternatywnie, wybrany promotor może kierować ekspresją genu pod promotorem indukowanym przez światło lub promotorem regulowanym czasowo w inny sposób. Dalszą alternatywę stanowi regulacja chemiczna wybranego promotora. Dostarcza to możliwości indukowania ekspresji transgenu jedynie wtedy, gdy to jest pożądane, poprzez działanie induktora chemicznego.

Terminatory transkrypcji

Dostępnych jest wiele terminatorów transkrypcji do zastosowania w kasetach ekspresyjnych. Są one odpowiedzialne za terminację transkrypcji za transgenem i jego prawidłową poliadenylację. Odpowiednie terminatory transkrypcji oraz te, o których wiadomo, ze działają w roślinach, obejmują terminator 35S z CaMV, terminator tmI, terminator syntazy nopaliny, terminator rbcS E9 z grochu. Mogą być one stosowane zarówno u roślin jednoliściennych, jak i dAwillścieimych.

Sekwencje do zwiększenia lub regulowania ekspresji

Stwierdzono, że liczne sekwencje zwiększają ekspresję genu w obrębie jednostki transkrypcyjnej i sekwencje te mogą być użyte w połączeniu z ujawnionymi genami do zwiększania ich ekspresji w roślinach transgenicznych.

Wykazano, że różnorodne sekwencje intronów zwiększają ekspresję, szczególnie w komórkach roślin jednoliściennych. Przykładowo stwierdzono, ze introny genu Adh1 z kukurydzy po wprowadzeniu do komórek kukurydzy znacząco zwiększają ekspresję genu typu dzikiego pod jego pokrewnym promotorem. Wykazano, ze intron 1 jest szczególnie skuteczny i zwiększa ekspresję w połączeniu z genem dla acetylotransferazy chloramfenikolu (Callis et al.; Genes Develop.1: 1183-1200 (1987)). W tym samym systemie eksperymentalnym, intron z genu bronze 1 z kukurydzy dawał podobny efekt zwiększania ekspresji (Callis et al., supra). Sekwencje intronowe są rutynowo włączane do wektorów do transformacji roślin, typowo w obrębie lidera nie podlegającego translacji.

Wiadomo, że wiele sekwencji liderowych nie podlegających translacji pochodzących z wirusów, również zwiększa ekspresję, i ze są one szczególnie efektywne w komórkach roślin dwuliściennych. W szczególności wykazano, że sekwencje liderowe z Wirusa Mozaiki Tytoniu (Tobacco Mozaic WVirus, TMV; „sekwencja-W”), Maize Chlorotic Mottle Virus (MCMV) oraz Alfalfa Mosaic Virus (AMV) efektywnie zwiększają ekspresję (np. Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987); Skuzeski et al. Plant Molec. Biol.15: 65-79 (1990)).

Transport produktu genu wewnątrz komórki

Wiadomo, ze istnieją różne mechanizmy transportu produktów genów w roślinach i scharakteryzowano do pewnego stopnia sekwencje kontrolujące funkcjonowanie tych mechanizmów. Przykładowo, transport produktów genów do chloroplastów jest kontrolowany przez sekwencję sygnałową znajdywaną na końcu aminowym różnych białek, która jest odcinana w czasie importu do chloroplastów, wskutek czego powstaje dojrzałe białko (np. Comai et al. J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)). Te sekwencje sygnałowe mogą być dołączane do produktów heterologicznych genów w celu uzyskania transportu produktów heterologicznych genów do chloroplastów (van den Broeck et al. Nature 313: 358-363 (1985)). DNA kodujący odpowiednie sekwencje sygnałowe może być izolowany z końców 5' cDNA kodującego białko RUBISCO, białko CAB, enzym syntazę EPSP, białko GS2 i wiele innych białek, o których wiadomo, ze są zlokalizowane w chloroplastach.

186 842

Inne produkty genów są zlokalizowane w innych organellach, takich jak mitochondria i peroksyzomy (np. Ungeret al. Plant Molec. Biol. !3: 411-418 (1989)). cDNA kodujący te produkty może być również poddawany manipulacjom celem uzyskania transportu produktów genów heterologicznych do tych organelli. Przykładami takich sekwencji są kodowane w jądrze ATPazy i mitochondrialne izoformy aminotransferazy asparaginianu. Transport do komórkowych ciałek białkowych został opisany przez Rogers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-6516(1985).

Ponadto scharakteryzowano sekwencje, które powodują transport produktów genów do innych części komórki. Sekwencje na końcu aminowym są odpowiedzialne za transport do ER, apoplastu i wydzielanie na zewnątrz z komórek bielma (Koehler & Ho, Plant Celi 2: 769-783 (1990)). Ponadto sekwencje na końcu aminowym, w połączeniu z sekwencjami na końcu karboksylowym, są odpowiedzialne za transport produktów genów do wakuoli (Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)).

Poprzez fuzje opisanych wyżej odpowiednich sekwencji sygnałowych z sekwencjami transgenu, będącymi przedmiotem zainteresowania, możliwe jest kierowanie produktu transgenu do dowolnego organellum lub części komórki. Na przykład dla transportu chloroplastów, sekwencję sygnałową chloroplastu z genu RUBISCO, genu CAB, genu syntazy EPSP lub genu GS2 przyłącza się w ramce odczytu do ATG na końcu aminowym transgenu. Wybrane sekwencje sygnałowe powinny zawierać znane miejsce cięcia i w skonstruowanych fuzjach należy uwzględnić obecność za miejscem cięcia dowolnego aminokwasu wymaganego do cięcia. W niektórych przypadkach to wymaganie może być zrealizowane poprzez dodanie niewielkiej liczby aminokwasów pomiędzy miejscem cięcia i ATG transgenu lub alternatywnie zamianę niektórych aminokwasów w obrębie transgenu. Fuzje skonstruowane do transportu do chloroplastów mogą być testowane pod kątem wydajności pobrania przez chloroplast poprzez translację in vitro konstruktów transkrybowanych in vitro, a następnie pobieranie przez chloroplast in vitro, stosując techniki opisane przez (Bartlett et al. W: Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier. str. 1081-1091 (1982); Wasmann et al. Mol. J Gen. Genet. 205: 446-453 (1986)). Takie techniki konstrukcji są dobrze znane w tej dziedzinie i mają również zastosowanie do mitochondriów i peroksyzomów. Wybór lokalizacji, wymaganej do ekspresji transgenów, będzie zależał od komórkowej lokalizacji prekursora, będącego punktem wyjścia w danym szlaku. Będzie ona zwykle cytozolowa lub chloroplastowa, jakkolwiek w niektórych przypadkach może być mitochondrialna lub peroksyzomalna. Produkt ekspresji transgenu zwykle nie wymaga transportu do ER, apoplastu lub wakuoli.

Opisane powyżej mechanizmy transportu wewnątrzkomórkowego mogą być wykorzystane nie tylko w połączeniu z własnymi promotorami, ale również w połączeniu z heterologicznymi promotorami tak, aby uzyskać specyficzną lokalizację, a jednocześnie regulację transkrypcyjną promotora, którego wzór ekspresji jest odmienny od promotora, z którego pochodzi sygnał transportowy.

Przykład 22: Transformacja roślin dwuliściennych.

Techniki transformacji roślin dwuliściennych są dobrze znane w tejdziedzinie i obejmują techniki oparte o Agrobacterium i techniki, które nie wymagają Agrobacterium. Techniki bez Agrobacterium obejmują pobieranie egzogennego materiału genetycznego bezpośrednio przez protoplasty lub komórki. Można to osiągnąć poprzez pobranie za pośrednictwem PEG lub elektroporacji, dostarczenie poprzez bombardowanie cząstkami lub mikroiniekcję. Przykłady tych technik są opisane przez Paszkowskiego et al., EMBO J 3: 2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986) oraz Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987). W każdym przypadku transformowane komórki są regenerowane do całych roślin przy użyciu standardowych technik znanych w tej dziedzinie.

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium jest preferowaną techniką transformacji roślin dwuliściennych ze względu na swoją wysoką wydajność transformacji i swoje szerokie zastosowanie dla wielu różnych gatunków. Liczne gatunki roślin uprawnych, które mogą rutynowo podlegać transformacji przez Agrobacterium obejmują: tytoń, pomidory, słonecznik, bawełnę, rzepak, ziemniaki, soję, lucernę i topolę ((EP 0 317 511) (bawełna), EP 0 249 432

186 842 (pomidor, Calgene), WO 87/07299 (kapusta, Calgene), US 4 795 855 (topola)). Transformacja Agrobacterium zwykle obejmuje przeniesienie binarnego wektora niosącego obcy DNA, będący przedmiotem zainteresowania (np. pCIB200 lub pCEB2001), do odpowiedniego szczepu Agrobacterium, które może zależeć od komplementacji genów vir, przenoszonych przez szczep gospodarza Agrobacterium bądź na współobecnym plazmidzie Ti, bądź na chromosomie (np. szczep CB542 dla pCIB200 i pCIB2001 (Uknes et al. Plant Cell 5: 159-169 (1993)). Przeniesienie zrekombinowanego binarnego wektora do Agrobacterium osiąga się poprzez procedurę trójrodzicielskiego krzyżowania przy zastosowaniu E. coli niosącej zrekombinowany wektor binarny, pomocniczego szczepu E. coli, który przenosi plazmid, taki jak pRK2013 i który jest zdolny do mobilizowania zrekombinowanego wektora binarnego do wejścia do szczepu Agrobacterium. Alternatywnie, zrekombinowany wektor binarny może być przenoszony do Agrobacterium poprzez transformację DNA (Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 9877 (1988)).

Transformacja docelowego gatunku rośliny przez zrekombinowane Agrobacterium zwykle obejmuje równoczesne hodowanie Agrobacterium z eksplantami z roślin według protokołów dobrze znanych w tej dziedzinie. Transformowaną tkankę, niosącą marker odporności na antybiotyk lub herbicyd pomiędzy skrajnymi T-DNA w wektorze binarnym, regeneruje się na pożywce selekcyjnej.

Przykład 23: Transformacja roślin jednoliściennych.

Transformacja większości gatunków roślin jednoliściennych stała się ostatnio czynnością rutynową. Korzystne techniki obejmują bezpośrednie przeniesienie genu do protoplastów przy zastosowaniu technik z użyciem PEG lub elektroporacji oraz bombardowanie cząstkami tkanki kalusa. Transformację można wykonywać przy użyciu pojedynczego rodzaju DNA lub wielu rodzajów DNA (np. kotransformacja) i obie te techniki są odpowiednie. Korzystną stroną kotransformacji jest możliwość uniknięcia skomplikowanych konstrukcji wektora i powstawanie roślin transgenicznych z niesprzężonymi loci dla genu będącego przedmiotem zainteresowania i markera selekcyjnego, umożliwiające usunięcie markera selekcyjnego w kolejnych pokoleniach, co może okazać się pożądane. Jednakże wadą stosowania kotransformacji jest mniej niż 100% częstość, z którą odrębne rodzaje DNA są integrowane do genomu (Schocher et al. Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)).

Zgłoszenie Patentowe EP 0 292 435 (Ciba-Geigy), EP 0 392 225 (Ciba-Geigy) i WO 93/07278 (Ciba-Geigy) opisują techniki przygotowania kalusa i protoplastów wsobnej linii elite kukurydzy, transformację protoplastów przy użyciu PEG lub elektroporacji i regenerację roślin kukurydzy ze stransformowanych protoplastów. Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990)) i Fromm et al., Biotechnology 8: 833-839 (1990)) opublikowali techniki transformacji linii kukurydzy pochodzącej od A188 przy użyciu bombardowania cząstkami. Ponadto, zgłoszenie WO 93/07278 (Ciba-Geigy) i Koziel et al., Biotechnology 11: 194-200 (1993)) opisują techniki transformacji wsobnej linii kukurydzy elite poprzez zastosowanie bombardowania cząstkami. Technika ta stosuje niedojrzałe zarodki kukurydzy o długości 1,5-2,5 mm wycięte z kłosów kukurydzy 14-15 dni po zapyleniu oraz urządzenie PDS-1000He Biolistics do bombardowania.

Transformacja ryżu może być także wykonana poprzez techniki bezpośredniego przenoszenia genu przy zastosowaniu protoplastów lub bombardowania cząstkami. Transformacja przy użyciu protoplastów została opisana dla typu Japonica i typu Indica (Zhang et al., Plant Cell Rep 7: 379-384 (1988); Shimamoto et al. Nature 338: 274-277 (1989); Datta et al. Biotechnology 8: 736-740 (1990)). Oba typy są rutynowo transformowane przy zastosowaniu bombardowania cząstkami (Christou et al. Biotechnology 9: 957-962 (1991)).

Zgłoszenie Patentowe EP 0 332 581 (Ciba-Geigy) opisuje techniki wytwarzania, transformacji i regeneracji protoplastów Pooideae. Techniki te umożliwiają transformację Dactylis i pszenicy. Ponadto, pszenicy została opisana przez Vasii et al., Biotechnology 10:

667-674 (1992)) z zastosowaniem bombardowania cząstkami do komórek typu C kalusa długotrwale ulegającego regeneracji, a także przez Vasil et al., Biotechnology 11: 1553-1558 (1993)) i Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993) z zastosowaniem bombardowania cząstkami niedojrzałych zarodków i niedojrzałych kalusów pochodzenia zarodkowego. Jednakże

186 842 korzystna technika transformacji pszenicy, to transformacja pszenicy poprzez bombardowanie cząstkami niedojrzałych zarodków, obejmująca etap z wysokim stężeniem sacharozy bądź maltozy przed dostarczeniem genu. Przed bombardowaniem, dowolna liczba zarodków (długości 0,75-1 mm) jest wysiewana na pożywkę MS zawierającą 3% sacharozę (Murashige & Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)) i 3 mg/l 2,4-D celem indukcji zarodków somatycznych, która odbywa się w czasie hodowania w ciemności. W wybranym dniu bombardowania, zarodki są usuwane z pożywki indukującej i umieszczane w środowisku osmotycznym (tj. pożywce indukującej z dodaną sacharozą lub maltozą w pożądanym stężeniu, zwykle 15%). Zarodkom umożliwia się plazmolizę przez 2-3 godz. i następnie bombarduje. Zwykle na szalce jest dwadzieścia zarodków, chociaż nie jest to liczba bezwzględnie wymagana. Odpowiednie przenoszące gen plazmidy (takie jak pCIB3064 lub p5G35) są osadzane na cząstkach złota o wielkości mikrometra przy użyciu standardowej procedury. Do każdej płytki z zarodkami strzela się przy użyciu DuPont Biolistics, urządzenia z helem, stosując uderzenie ciśnienia ~1000 psi stosując standardowy ekran 80 mesh. Po bombardowaniu zarodki są ponownie umieszczane na 24 godz. w ciemności w celu regeneracji (stale w środowisku osmotycznym). Po 24 godz. zarodki są usuwane ze środowiska osmotycznego i umieszczane ponownie na pożywce indukcyjnej, gdzie pozostają przez około miesiąc przed regeneracją. Następnie eksplanty zarodkowe z rozwijającym się kalusem embrioidalnym przenosi się do pożywki regeneracyjnej (MS + 1 mg/litr NAA, 5 mg/litr GA), zawierającej nadal odpowiedni czynnik selekcyjny (10 mg/l basta w przypadku pCIB3064 i 2 mg/l metotreksatu w przypadku pSOG35). Po upływie około jednego miesiąca, rozwijające się korzenie przenosi się do dużego, jałowego pojemnika, znanego jako „GA7s”, który zawiera o połowę mniej stężony MS, 2% sacharozę i to samo stężenie czynnika selekcyjnego. Zgłoszenie Patentowe 08/147 161 opisuje metody transformacji pszenicy i jest tu załączone jako odnośnik.

Przykład 24: Selekcja roślinnych genów protoks opornych na herbicydy-inhibitory protoks w systemie ekspresyjnym E. coli.

Plazmid pWDC-4, kodujący chloroplastowy enzym protoks z kukurydzy jest transformowany do szczepu XL1-Red (Stratagene, La Jolla, CA), w którym uzyskuje się losową mutagenezę. Transformacja jest wysiewana na pożywkę L, zawierającą 50 g/ml ampicyliny i inkubowana przez 48 godzin w 37°C. Murawka stransformowanych komórek jest zdrapywana z szalek i DNA plazmidowy otrzymywany przy użyciu zestawu Wizard Megaprep (Promega, Madison, WI). Przewiduje się, że DNA plazmidowy izolowany ze szczepu mutatorowego zawiera około jedną losową zmianę na 2000 nukleotydów (patrz Greener et al., Strategies 7(2): 32-34 (1994)).

Zmutowany plazmidowy DNA transformuje się do mutanta hemG SASX38 (Sasarman et al., J. Gen. Microbiol. 1113: 297 (1979) i wysiewa się na pożywkę L zawierającą 100 g/ml ampicyliny i na tą samą pożywką zawierającą różne stężenia herbicydu hamującego protoks. Płytki są inkubowane przez 2-3 dni w 37°C. DNA plazmidowy jest izolowany ze wszystkich kolonii, które rosną w obecności stężeń herbicydu, które skutecznie zabijają szczep typu dzikiego. Izolowany DNA jest następnie transformowany do SASX38 i wysiewany ponownie na herbicyd dla upewnienia się, że oporność pochodzi od plazmidu.

Zmutowany DNA plazmidu pWDC-4 jest ponownie izolowany z opornych kolonii i sekwencja kodująca protoks jest wycinana poprzez trawienie EcoRI i XhoII. Wycięta sekwencja kodująca protoks jest następnie ponownie wklonowana do nie zmutagenizowanego wektora pBluecript i jeszcze raz testowana na oporność na herbicyd hamujący protoks w ten sam sposób, jak opisano powyżej.

Proces ten eliminuje mutacje w sekwencji niekodującej, które nadają oporność, takie jak mutanty z podwyższoną aktywnością promotora (to jest mutanty, których oporność jest skutkiem mutacji powodujących zwiększoną ekspresję niezmodyfikowanego protoks) i pozostawia jedynie mutanty, których oporność jest wynikiem mutacji w sekwencji kodującej genu protoks. Określa się sekwencję DNA dla wszystkich przypuszczalnych 'genów protoks tolerujących herbicyd zidentyfikowanych w taki sposób i identyfikuje się mutacje poprzez porównanie z sekwencją protoks typu dzikiego w plazmidzie pWDC-4.

Stosując procedurę opisaną powyżej, zidentyfikowano mutację oporności zmieniającą C do T w pozycji nukleotydowej 498 w sekwencji pWDC-4 (SEK NR ID 5). Plazmid niosący tą

186 842 mutację został oznaczony jako pMzC-1 Val. Zmiana ta zmienia kodon GCT dla alaniny w pozycji amino kwasowej 166 (SEK NR ID 6) w kodon GTT dla waliny i powoduje powstanie enzymu protoks, który jest co najmniej 10x bardziej oporny na herbicyd hamujący protoks w teście bakteryjnym.

Plazmid pMzC-1 Val, w wektorze pBluescript SK został zdeponowany 30 września 1994 pod nazwą pWDC-8 w Agricultural Research Culture Collection i otrzymał oznaczenie depozytowe NRRL #21340.

Ta sama strategia była stosowana do poszukiwania form opornych na herbicydy z genem Protoks-1 z Arabidopsis w różnych wektorach. Jedną mutację oporności zidentyfikowano jako zmianę C do T w nukleotydzie 689 w sekwencji pWDC-2 (SEK NR ID 1); plazmid ten jest oznaczony jako pAraC-1 Val. Ta zmiana jest identyczna, jak w zmutowanym plazmidzie pMzC-1 Val powyżej, zmieniająca kodon GCT dla alaniny w pozycji aminokwasowej 220 (SEK NR ID 2) do kodonu GTT dla waliny w odpowiadającej pozycji sekwencji białka protoks z Arabidopsis.

Drugi gen oporności zawiera zmianę A do G w pozycji nukleotydowej 1307 w sekwencji pWDC-2 (SEK NR ID 1); plazmid ten jest oznaczony jako pAraC-2Cys. Zmiana ta zamienia kodon TAC dla tyrozyny w pozycji ammokwasowej 426 (SEK NR ID 2) w kodon TGC dla cysteiny. Odpowiadający kodon tyrozynowy w sekwencji protoks-1 kukurydzy w pozycji nukleotydowej 1115-1117 (SEK NR ID 5; pozycja aminokwasowa 372 w SEK Nr iD 6) może być zmutowana w podobny sposób celem wytworzenia postaci tego enzymu opornej na herbicyd.

Trzeci mutant oporności ma zmianę G do A w pozycji 691 sekwencji nukleotydowej pWDC-2 (SEK NR ID 1); ten plazmid jest oznaczony jako pAraC-3Ser. Mutacja ta zmienia kodon GGT dla glicyny w pozycji aminokwasowej 221 (SEK NR ID 2) do kodonu AGT dla seryny, sąsiadującego z mutacją w pAraC-1. Odpowiadający glicynie kodon w sekwencji protoks-1 kukurydzy w pozycji nukleotydowej 497-499 (SEK NR ID 5; pozycja aminokwasową 167 w SEK NR ID 6) może być podobnie zmutowana celem utworzenia postaci tego enzymu opornej na herbicyd.

W wyniku wszystkich mutacji opisanych powyżej, enzym protoks jest przynajmniej 10x bardziej oporny na herbicyd hamujący protoks w teście bakteryjnym.

pAraC-2Cys, w wektorze pFL61, został zdeponowany 14 listopada 1994 pod oznaczeniem pWDC-7 w Agricultural Research Culture Collection i otrzymał oznaczenie depozytowe NRRL #21339N.

Przykład 25: Dodatkowe, nadające oporność na herbicyd podstawienia w kodonach, identyfikowane poprzez przeszukiwanie losowe.

Aminokwasy identyfikowane jako miejsca oporności na herbicyd w losowym przeszukiwaniu są zastępowane przez inne aminokwasy i testowane pod kątem funkcji i tolerancji na herbicyd w systemie bakteryjnym. Mutageneza sekwencji Protoks-1 z Arabidopsis z zastosowaniem cligcnukleotydów jest wykonywana przy użyciu zestawu Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech, Palo Alto, CA). Później zamiany aminokwasu są potwierdzane poprzez analizę sekwencji, zmutowane plazmidy są transformowane do SASX38 i wysiewane na pożywkę L-amp1°⁰' celem testowania funkcji, i na różne stężenia herbicydu hamującego protoks, celem badania tolerancji.

Procedura ta była zastosowana dla kodonu alaniny w pozycji nukleotydowej 688-690 i kodonu tyrozyny w pozycji nukleotydowej 1306-1308 w sekwencji protoks z Arabidopsis (SEK NR ID 1). Wyniki wykazują, ze kodon alaniny w pozycji nukleotydowej 688-690 może być zmieniony do kodonu waliny, treomny, leucyny lub cysteiny, prowadząc do powstania enzymu protoks opornego na herbicyd, który zachowuje funkcjonalność. Wyniki wykazują ponadto, że kodon tyrozyny w pozycji nukleotydowej 1306-1308 może być zmieniony do cysteiny, izoleucyny, leucyny, waliny lub treomny, prowadząc do powstania enzymu protoks opornego na herbicyd, który zachowuje funkcjonalność.

186 842

Przykład 26: Wykazanie tolerancji krzyżowej mutacji oporności na różne związki hamujące protoks.

Zmutowane plazmidy oporności, wyselekcjonowane na oporność wobec pojedynczego herbicydu, są testowane na szereg innych związków hamujących protoks. Szczep SASX38 zawierający plazmid typu dzikiego jest wysiewany na różne stężenia każdego ze związków dla określenia stężenia letalnego każdego z nich. Szczep SASX38 ze zmutowanymi plazmidami oporności jest wysiewany i testowany pod kątem zdolności przeżycia na stężeniu każdego ze związków, które jest co najmniej 10-krotnie wyższe od stężenia, które jest letalne dla szczepu SASX38, zawierającego plazmid typu dzikiego.

Wyniki testowania tolerancji krzyżowej pokazują, że każda ze zidentyfikowanych mutacji warunkuje tolerancję na różne związki hamujące protoks. Konkretnie, wyniki pokazują, ze 1) mutacja AraCI-Val nadaje oporność na inhibitory protoks obejmujące między innymi związki o wzorach 4, 11, 13, 14, 15 i 17; 2) mutacja AraC-2Cys nadaje oporność na inhibitory protoks obejmujące między innymi związki o wzorach 11, 13, 15 i 17; 3) Mutacja MzC-I Val nadaje oporność na inhibitory protoks obejmujące między innymi związki o wzorach 11, 12, 13, 14, 15, 16 i 17; 4) Mutacja AraC-3Ser nadaje oporność na inhibitory protoks obejmujące między innymi bifenoks oraz związki o wzorach 4, 12, 13,14, 15 i 17.

Przykład 27: Wytwarzanie roślin opornych na herbicyd poprzez nadprodukcję roślinnych genów protoks.

Sekwencje kodujące Protoks-1 z Arabidopsis, zarówno z genów typu dzikiego, jak i mutanta oporności AaC-1 Val, są wycięte poprzez częściowe trawienie EcoRI i XhoI i sklonowane w roślinnym wektorze ekspresyjnym pCGNI761ENX. Kasety ekspresyjne zawierające fuzje genowe 2X355-Protoks są wycinane przez XbaI i klonowane w binarnym wektorze pCIB200. Te binarne plazmidy protoks są transformowane poprzez elektroporację do Agrobacterium, a następnie do Arabidopsis, przy zastosowaniu metody infiltracji pod próżnią (Bechtold et al., 1993). Transformanty są transformowane na kanamycynę i z różnych niezależnych linii wytwarzane są nasiona T2. Nasiona te wysiewa się na pożywki GM zawierające różne stężenia herbicydu hamującego protoks i testowane pod kątem kiełkowania i przezywania. Liczne linie transgeniczne nadprodukujące protoks, bądź typu dzikiego, bądź zmutowany-oporny, wytwarzają znaczną liczbę zielonych kiełków przy stężeniu herbicydu, który jest letalny dla kontroli z pustym wektorem.

186 842

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY.

(A) NAZWA: CIBA-GEIGY AG (B) ULICA: Klybeckstr. 141 (C) MIASTO: Bazyleja (E) PAŃSTWO: S>2A/vajoaria (F) KOD POCZTOWY (ZlP): 4002 (G) TELEFON: +41 61 69 11 11 (H) TELEFAX: + 41 61 696 79 76 (I) TEL-ΕΞΧ: 962 991 (ii) TUTUŁ WYNALAZKU: Manipulowanie aktywnością enzymatyczną oksy dazy protoporfirynogenu w organizmach eukariotycznych (iii) LICZBA SEKWENCJI: 20 (iv) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

(A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

W DŁUGOŚĆ: 1719 par zasad (B) TYP: nukleotydową (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA · Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (bc) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYYJA: 211... 1644 (D) INNE INFORMAYJE: /uwaga = „Arabidopsis protox-1 cDNA;

sekwencja z pWDC-2” (xi) OPIS SEKWENYJI· SEK ID NR 1

186 842

TGACAAAATT CCGA^TTCTC TGCG^TTTCC ATG GAG TTA TCT CTT CTC CGT CCG 55

Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro

5

ACG ACT CAA TCG

(CTT GTT CCG TCT TTT TTIG PTAG CCC PAT GPC

(CGC Arg

CTA ^u

W2

Thr Thr 10

Gln

Ser

leu

leu

Pro 15

Ser Phe Ser

Lys Pro PAn 20

leu

AAT

GTT

TAT

PAG

CCT

(CTT

ACG

cttc

Cd'

TTG·

TCCA

CTG

«rc

«GT

GGA

CCT

100

Asn

Wl

Tyr

Lys

Pro

leu

PAg

leu

frg

Cyy

Ser

wa

PAa

dy

Gly

Pro

25

30

35

40

ACC

GTC

GGA

TGT

TCA

TTA

AAT

(GA

GCT

(GA

(GA

CTC

ACC

ACT

ATC

ACT

198

Thr

Wl

Gly

Ser

Ser

Lys

Ile

du

dy

dy

dy

dy

TTr

Thr

Ile

•Tir

45

50

55

ACG

GAT

TGT

GGT

ATT

CTC

GGG

CGG.

GGG

AAT

ACT

GCT

CTC

TTG

ATC

GCTT

246

Thr

Asp

Cys

Wl

Ile

vva

dy

dy

dy

Ile

Ser

dy

Ilu

Cys

Ile

PAa

60

65

70

CAG

GCG

CTT

GCT

ACT

PAG

(TTT

CCT

GATT

CTT

CTC

CCG

PAC

ΊΓΑ

A(T

GTC

224

Gln

Ala

Leu

Ala

Thr

Lys

His

Ppo

PAp

PAa

PAa

Ppo

PAn

Lee

Ile

wa

75

80

85

ACC

GAG

GCT

AAG

GAT

CCT

GGT

GGG

Gd

PAT

AAT

AAT

ACT

CCG

(GA

(GAG

332

Thr

GLu

Ala

Lys

PTp

PAg

Vaa

dy

dy

Acn

Ile

Ile

TTh

Arg

Glu

du

90

95

100

AAT

CTT

TTT

CTC

TCT

(GA

GGT

GGG

CCC

PAT

ACT

ttt

CCT

CCC

TCT

(GT

339

Asn

Gly

Phe

Leu

'I’Tp

Glu

du

dy

Ppo

AAn

See

PPh

dn

Ppo

Ser

PAp

105

110

115

120

CCT

ATG

CTC

ACT

TTG

GTG

GTC

GAT

AGT

GCT

(TTG

PAG

GAT

(GAT

TTG

drc

438

Pro

Met

Leu

Thr

Mett

Wl

Wl

Asp

Ser

GIg

leu

Lls

PTp

Assp

leu

Wl

125

130

115

TTG

GGA

GAT

CCT

ACT

GCG

CCA

AGG

TTT

GIC

GTTG

TCT

PAT

CG

PACA

TTG

486

Leu

Gly

Csp

Pro

Thr

Ala

Pro

Tog

Phe

Wl

leu

Trp

PCn

dy

Lys

Leu

140

145

150

AGG

CCG

GTT

CCA

TCG

AAG

CTC

ACT

GCC

TTA

CCC

TTTC

ttt·

<gt

CTC

ATC

554

Arg

Pro

Wl

Pro

Ser

Lys

Leu

Thr

Asp

Leu

Pro

PPh

PPh

Asp

Leu

PMt

155

110

115

TGT

ATT

GGT

GGG

TCG

ATT

AGA

GCT

GGT

nr

TGG

GGC

CTT

Gd

ACT

C(GA

582

Ser

Ile

Gly

Gly

Lys

Ile

Arg

Ala

dy

Phe

dy

PAa

Lee

dy

Ile

PCg

170

117

110

CCG

TCA

CCT

CCA

GGT

CGT

GAA

GTT

TCT

GTC

GGT

GGA

TTT

GGT

CGG

CGT

663

Pro

Ser

Pro

Pro

dy

Arg

Hu

Hu

Ser

Wl

dii

du

PPh

wa

PTg

PAg

185

199

H9

200

186 842

AAC CTC Gd CGT GAG CTT TTT GAG CGC CTG ATT GAA CCG TCT TCT TCA

678

Asn

Leu

Gly .Asp

Glu Val 205

Phe

Glu Arg

Leu 210

Ile;

Glu

Pro

Phe Cys Ser 215

GGT

GTT

TAT

«TT

©GT

GAT

CCT

TCA

AGA

CTG

AdC

AAC

WA

«cc

«CG

ΤΓΓ

726

Gly

Val

Tyr

Ma

Gly

Mp

Pjco

Ser

Lys

Ilu

Ser

Mee

Lyy

Ma

Ma

Phe

220

225

230

GGG

AAG

GGT

TGG

AAA

CTA

GAG

GAA

MT

KG'

GGA

ACH

AAA

ATA

«GT

«GT

7*74

Gly

Lys

Val

Tpp

Ly s

Ilu

Glu

Gln

Asn

Gly

dy

Ser

Ile

Ile

Gly

Gly

235

240

245

GAT

TTT

AAG

CGAA

ATT

CCAG

GAG

ACH

AGA

MC

CGC

CCC

MG

CGC

GGA

CAGA

822

Thr

Phe

Lys

Ma

Ile

Gln

Glu

Mg

Lys

Mn

Ma

Pro

Lyy

Ma

du

Mg

250

255

260

GAC

CCG

CCCI

CCC

CCA

AAA

CGA

GAG

«GC

GAA

AAC

GGT'

GGT

ACA

CTC

A«S

870

Asp

Pro

Arg

Ilu

Pro

Lys

Pro

Gln

dy

Gln

TTh

Vvl

dy

SSr

Phe

Mg

265

270

275

280

AAG

GGA

CCT

CCGA

ATG

TTG

CCA

GAA

(GCA

AK

TCT

(GCA

AAG.

CTA

CGH

ACH

918

Lys

Gly

Leu

Mg

Met

Ilu

Pro

Glu

Ma

Ile

Ser

Ma

Mg

Leu

Gly

Ser

285

290

295

AAA

GTT

AAG

TTG

TCT

KK

AAG

CTC

TCA

KG

ATC

ACT

MG

CTG

GAG

A<GC

966

Lys

Val

Lys

Llu

Ser

Τηρ

Lys

Ilu

Ser

Gly

Ile

Thr

Lyy

Leu

Glu

Ser

300

305

310

GGA

GGA

TAC

MC

CTA

AGA

TAT

GAG

ACAT

CCAC

GAT

CGG·

CTT

GGT

ICC

CTC

1014

Gly

Gly

Tyr

Mn

Ilu

Thr

Tyr

Glu

Thr

Pro

Mp

dy

Lye

Vv1

Ser

Vv1

315

320

325

CGG

GGC

AAA

AGT

GTT

GTA

ATG

ACG

GIG

CCA

TCT

CAT

GTT

GGA

ACT

GCT

1062

Gln

Ser

Lys

Ser

Val

Val

Met

Thr

Val

Pro

Ser

His

Val

Ala

Ser

Gly

330

335

340

CTC

TTG

CGC

CCT

CTT

TCT

GAA

TCT

GAT

GCA

AAT

GCA

CTC

TGA

AM

CTT

1110

Leu

Leu

Arg

Pro

Leu

Ser

Glu

Ser

Ala

Ala

Asn

Ala

Leu

Ser

Lyy

Lye

345

350

355

360

TAT

TAC

CCG

CCA

GTT

GCA

GCA

GTA

TCT

ATC

TAG

TAC

CCG

AMC

GGG

GGT

1118

Tyr

Tyr

Pro

Pro

Val

Ala

Ma

Val

Ser

Ile

Ser

Tyr

Pro

Lys

GGi

Ma

365

370

375

ATT

CGA

ACA

GAA

TGT

TTG

ATA

GAT

GGT

GAA

CTA

AAG

GGT

TCT

GGG

CAG

1100

Ile

Arg

Thr '

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp

Gly

Hu

Leu

Lys

dy

Phe

dy

GGi

380

385

390

TTG <

CAT 1

TCA c

CGC .

ACG c

CM i

GGA 1

GTT a

GAA ,

ACA '

TT A (

GGA

AC!

AA’C ;

TAC .

ACH

Leu l

His i

Pro .

Arg '

Thr i

Sin i

Gly

val i

Siu '

Thr

Llu i

Gly

Thr

Ile

Tyr

Ser

395 '.00 600)

186 842

TCC TCA CTC TTT CCC

/AT /An

CCG tAg 415

GCA CGG CCC

GGA GAA TTT TTG CTC

TTG bsu

1302

Ser Ser Leu Phe

Pro

Ala

Pro

Pro

Gly Arg Ile 420

Luu Leu

410

AAC

TAC

ATT

GGC

HG

TTC'

AG

AAC

CCC

GG

ATT

CGG

CCC

aAG

TCT

GAA

1350

Asn

Tyr

Ile

Gly

GGy

Ser

Thr

Asn

Thr

Gly

Ile

Ilu

Sur

Lys

Ser

Glu

425

430

435

440

GGC

GAG

TTA

GIG

GGA

GG

(GT

GAC

AG

GT

TTG

AH

AAA

ATG

CTA

ATT

1398

Gly

Glu

Leu

Val

du

/Aa

Via

Asp

/Ag

Asp

Leu

/Arg

Lys

Met

Ilu

Ile

445

450

455

AAG

CCC

AAT

CGG

CCC

GT

HG

CTT

A/A

TAA

GGA

CCT

GGG

GCA

Td

(CCT

1446

Lys

Pro

Asn

Ser

TTr

/Ap

Pro

Leu

Lys

Leu

Gly

Vaa

Arg

Val

Trp

Pro

460

465

470

CAA

GCC

ATT

CTT

GG

TTCA

CCA

GTT

GG

CCC

tcc

GTT

CCC

CCC

GC

AH

1494

Gln

Ala

Ile

Pro

Gln

Phe

Ilu

Val

Gly

His

Phe

/Ap

Ile

Luu

/Ap

Thr

475

480

485

GCT

AAA

TCA

CCT

TAA

AH

TTG

TCG

GC

ACC

GA

GGG

TAA

TCC

TAG

(HT

1542

Ala

Lys

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Ser

dy

Tyr

Hu

Gly

Luu

Phe

Leu

GG-^y

490

495

500

GGC

AAT

TAC

TCC

CCT

HG

(GA

GCC

TAA

GC

CGG

GGT

GTA

GA

(GGC

(GG

1590

Gly

Asn

Tyr

Val

AAa

GGy

via

ALa

Llu

Gly

Arg

Ccs

Val

Glu

dy

/Aa

505

550

515

520

TAT

GAA

ACC

CGG

CTT

G^

<GC

AAC

AAC

TC

ATG

CG

G3G

TAC

(GG

T/AC

1638

Tyr

Glu

Thr

Ala

I le

du

vn

Asn

/An

Phe

Met

Ser

Arg

Tyr

/Aa

TT’r

525 530 535

AAG TAAATGTAAA ACATTAAATC TCCCAGCTTG CHTGCUTCTT ATTAAATATT 1691

Lys

TTGAGATATC CAAAAAAAAA AAAAAAAA 1719 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 537 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) 0(318 SEKWENCJI: SEK ID NR: 2

Mec Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser

186 842

1	5	10	15
Phe	Ser Lys Pro Asn Leu 20	Arg Leu Asn Val Tyr Lys Pro Leu 25 30	Arg Leu
Arg	Cys Ser Val Ala Gly 35	dy Pro Thr Val dy Ser Ser Lys 40 45	Ile du
Gly Gly Gly Gly Thr Thr 50	Ile Thr Thr Asp Cys Val Ile Val 55 60	dy dy
Gly 65	Ile Ser Gly Leu Cys 70	Ile Ala Gln Ma Leu Ala Thr Lys 75	His Pro 80
Asp	Ala Ala Pro Asn Leu 85	Ile Val Thr Glu ALa Lys Asp Arg 90	Val dy 95
Gly	Asn Ile Ile Thr Arg 100	du du Asn dy Phe Leu Trp du 105 110	du dy
Pro	Asn Ser Phe Gln Pro 115	Ser /Ap Pro MMe Leu Thr Itee Val 120 125	Val /Ap
Ser	dy Leu Lys /Ap /Ap 130	Leu Vv1 Leu dy /Ap Pro Thr Ma 15^^ 140	Pro Mr
Phe 145	Val Leu Trp Asn dy 150	Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys 155	Leu Thr 160
Asp	Leu Pro Phe Phe Asp 165	Leu Met Ser Ile dy dy Lys Ile 170	Arg Ala 175
Gly	Phe dy Ala Leu dy 180	Ile Arg Pro Ser Pro Pro dy Arg 115 190	du du
Ser	Val Glu Gil PPh VVa 195	Mg Mg /Asn Leu dy /Ap du Vv1 200 205	Phe du
Arg	Leu Ile du Ppo Phh 210	Cyy See Gly Val Tyy Ma dy /Ap 211 2H	Pro Ser
Lys 225	Leu Ser Met Lys Ala 230	Ala Phe dy Lys Val Trp Lys Leu 235	du Gln 240
Asn	dy dy Ser Ile Ile 245	dy dy Thr Phe Lys Ala Ile Gln 220	du Arg 225
Lys	Asn Ala Pro Lys Ala 260	du Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys 265 270	Pro Gln
Gly	Gln Thr Val dy Ser	Phe Arg Lys dy Leu Arg Met Leu	Pro du

275 280 285

186 842

Ala

Ile 290

Ser

ALa

Arg

dy 295

Ser

Lys

Val

Lys

Leu 300

Ser

Trp

Lys

Leu

Ser 305

Gly

Ile

Thr

Lys

Leu 310

du

Ser

dy

dy

Tyr 315

Asn

Thr

Tyr

du 320

Thr

Pro

Asp

dy

Leu 325

Val

Ser

Val

dn

Ser 330

Lys

Ser

Val

Val

Met 335

Thr

Val

Pro

Ser

His 340

Val

Ma

Ser

dy

Leu 345

Ilu

Arg

Pro

Leu

Ser 350

Glu

Ser

Ala

Ala

Mn 355

Ma

Leu

Ser

Lye

Leu 360

iyr

Tyr

Pro

Pro

VaP 365

Mr

Vla

Val

Ser

Ile 370

Ser

Tyr

Pro

Lys

Glu 375

Ala

Ile

AAg

Thr

Glu 380

(Cys

Leu

Ile

Asp

Gly 385

GLu

Leu

Lys

dy

Phe 390

Gly

dn

Leu

His

Pro 395

Arg

Thr

dn

dy

Val 400

Glu

Thr

dy

Thr 405

Ile

Tyr

Ser

Ser

Ser 440

^u

Phe

Pro

Asn

Arg 415

ALa

Pro

Pro

Gly

Arg 420

Ile

Leu

Leu

Leu

Asn 425

TTr

Ile

Gly Gly

Ser 430

Thr

Mn

Thr

dy

Ile 435

Leu

Ser

Lys

Ser

Glu 440

dy

Glu

Leu

Val

du 445

ALa

Val

Mp

Arg

Asp 450

Leu

Arg

Lys

Mat

Ilu 455

Ile

Lys

Pro

Asn

Ser 440

Thr

Mp

Pro

Ilu

Lys 465

Leu

dy

Val

Arg

Val 470

Trp

Pro

dn

ALa

Ile 475

Pro

dn

Phe

Leu

Val 480

Gly

His

Phe

Asp

Ile 485

Leu

Asp

Thr

ALa

Lys 449

Ser

Ser

^u

Thr

Ser 445

Ser

Gly Tyr

du

dy 500

teu

Phe

Gly Gly 505

Mn

Tyr

Val

ALa

Gly 550

Val

Ma

Leu Gly

/Ag 515

Cys

Val

Glu

Gly

Ma 520

Tyr

du

Thr

ALa

Ile 525

Glu

Val

Mn

Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr Lys 530 535

186 842 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 3’ (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI.

(A) DŁUGOŚĆ: 1738 aminokwasów (β) TYP’ nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI cDNA (iii) HIPOTETYCZNA · Nie (iv) ANTYSENSOWNA Nie (ix) CECHY· (A) NAZWA/KLUCZ CDS (B) POZYCJA: 70 . 1596 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga = „Arabidopsis protox-2 cDNA;

sekwencja z pWDC-1” (xi) OPIS SEKWENCJI SEK ID NR 3

TTTTTTACTT ITTTCCGTCA CTGCTTTCGA CTGGTCAGAG ITTTTGACTC TGAATTGTTG 60

CAGATAGCA ATG GCG TCT GGA GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT GAA GCG 108

Met Ha Ser Gly Ala Val Ala Asp His Gln Ile Glu Ha

5 10

GTT TCA GGA AAA AGA

GTC GCA GTC

GTA GGT GCA GGT GTA AGT GGA CTT

156

Gal Ser Gly Lys 15

Arg

Gal

Ha Gal 20

Gal

Gly

ALa Gly Gal 25

Ser Gly

Aeu

GCG

GCG

GCT

TAC

AAG

TTG

AAA

TCG

AGG

GCT

TTTG

GAT

CTG

ACT

CTG

TTT

204

Ha

Ala

Ala

Tyr

Lys

Leu

Lys

Ser

Arg

Gly

Ilu

GAn

Val

Thr

Val

Phe

30

35

40

45

GAA

GCT

GAT

GGA

AGA

GTA

GGT

GGG

AAG

TTC

GAA

ACT

CTT

ATC

CAA

AAT

2252

Glu

Ala

Asp Gly

Arg

Gal

Gly

Gly

Lys

LeL

GAg

Ser

Vg1

Mee

GGn

GAsn

50

55

60

GGT

TTG

ATT

TGG

GAT

GAA

GGA

GCA

AAC

Ad

CAG

ACT

GGA

GCT

<G^C3

CCCA

330

Gly

Leu

Ile

Trp

Asp

Glu

Gly

Ala

Asn

Thr

Met

TTr

GGu

Ha

GGu

Pro

65

70

75

GAA

GTT

GGG

AGT

TTA

CTT

GAT

GAT

CTT

GGG

GCT

CGG

GGA

AAA

(CU

CCA

348

Glu

Gal

Gly

Ser

Leu

Leu

Asp

Asp

Leu

G1g

LAe

AAg

GGu

Las

GGn

GGn

80

85

90

TTT

CCA

ATT

TCA

CAG

AAA

AAG

CGG

TAT

ATT

GTG

Cd

AAT

GGT

CTA

CCT

396

Phe

Pro

Ile

Ser

Gln

Lys

Lyc

Arg

Tyr

Ile

val

Arg

A jen

Gly

Val

Pro

110 105

186 842

GTG ATG CTA CCCACC AAT

CCC ATA GAG CTG GTC AGA AU AUT GITG CC

444

Val 110

M;t Leu

Pro Thir Mn 115

Pro Ile

du

Ilu

Val Thr Ser Ser Val du

120

125

TCT

ACC

CAA

TCT

AAG

CTT

CTA

ATC

TTG

CTG

CCCA

TCT

CTA

TH

MAG

492

Ser

Thr

Gln

Ser

Lys

Phe

Gln

Ile

Ilu

du

Glu

Pro

Phe

du

Τηρ

Lys

130

135

140

AAA

AAG

TCC

TCA

AAA

GTC

TCA

GAT

GCA

TCT

GCT

GAA

GAA

ACT

CTA

AGC

540

Lys

Lys

Ser

Ser

Lys

Val

Ser

Mp

Mii

Ser

Ma

du

du

Ser

Val

Ser

145

150

155

GAG

TTC

TTT

CCA

C(GC

CAT

TTT

(HA

CCA

GAG

GTT

(CTT

GAC

TAT

GTC

ATC

588

Glu

Phe

Phe

Gln

Mg

Hhs

Phe

Gly

dn

du

Val

vva

Mii

Ityr

du

Ile

160

165

170

GAC

CCT

TTT

GCT

GT

GA

AGA

TAGT

GT

GG

GAC

CCC'

GAT

TCC

CTT

TCA

636

Asp

Pro

Phe

Val

Gly

Gly

Thr

Mli

Mli

Mp

Pro

Mp

Ser

Leu

Ser

175

180

185

ATG

AAG

CAT

TCT

TTC

CCA

GAT

CTC

TH

AAT

CTA

GAG

AAA

ACT

CTT

GGG

668

Mit

Lys

His

Ser

Phe

Pro

Mp

Ilu

Trp

Am

Val

du

Lys

Ser

Phe

dy

190

195

200

225

TCT

ATT

ATA

GTC

GT

GA

ATC

AGA

ACA

TAG

TCT

GGC

GGC

AA

GCT'

GCT

773

Ser

Ile

Ile

Val

Gly

Ma

Ile

Mg

TTh

Lyy

Phe

Ma

Ma

Lyy

dy dn/

210

225

222

AAA

AGT

AGA

GAC

AGA

MAG

ACT

TCT

CCC

GG

AGA

AAA

AAA

GCT

TCC

CCT

770

Lys

Ser

Arg

Asp

Thr

LLy

Ser

Ser

Pro

dy

Thr

Lyy

Lyy

dy

SSr

Mgr

225

230

235

GGG

TCA

TTC

TCT

TTT

GAG

GGG

CHA

ATC

CCA

ACT

CTT

CCT

GAT

ACS

TTG

822

Gly

Ser

Phe

Ser

Phh

Lyy

dy

dy

MM;

dn

Ile:

Llu

Ppo

Mp

TTh

Llu

240

245

250

TGC

AAA

AGT

CTC

TCA

CAT

CTT

GAG

ATC

AAT

CTA

GAC

TCC

AAG

CTA

CTC

87(5

Cys

Lys

Ser

du

Ser

Hhs

Asp

Glu

Ile

Mn

du

Mp

Ser

Lyy

Vvl

leu

255

260

225

TCT

TTG

TCT

TAC

MAT

TCT

CHA

TGA

AGA

GAG

GAG

MAC

'IG

IGA

CTA

TCT

992

Ser

Leu

Ser

Tyr

Mn

Ser

dy

Ser

Mg

dn

Glu

Mn

Trp

Ser

Leu

Ser

270

275

280

285

TGT

GTT

TCG

CAT

TAI'

gaa

ACG

GAG

AGA

CCAs

AAC

CCC

CCA

TAA

GM

GCT

977

Cys

Val

Ser

His

Mn

du

TTr

dn

mo

dn

Mn

Ppo

HHs

iTy

Mp

Mn

290

295

300

GTA

ATT

ATG

ACG

GCC

CCC'

CTG

TG

AAA

GTC

AAG

GMA

AAG

AAA

CTT

AAT

1122

Val

Ile .

Met

Thr

Ma

Pro

Llu

CCy

Mn

Wl

Lyy

du

MM;

Lyy

Wl

Met

305 310 315

186 842

AAA Lys

GGA GGA CAA CCC TTT CAG CTA AAC

TTT CTC CCC GAG Phe Leu Pro Glu 330

ATT AAT TAC

1088

dy

Gly 320

dn

Pro Phe

Gln

Leu 325

Asn

Ile

Asn

Tyr

GTC

CCC

crc

TCG

GIC TCA

ATC

ACC

ACA

(CC ACA GAG GAG

AC/

CTA

AAG

1116

^t

Pro

Leu

er r

Va 1 Leu

He

Thr

Thr

Phe Thr Lys du

Lls

Val

Lys

335

340

355

AGA

CCT

CTC

©GA

GGC TTC

GGG

CTA

CCC

GTC CCA ICC GAG

CAG

©GG

AAG

1164

Arg

Pro

Leu

Glu

Gly Pee

Gly

Val

Leu

Ile Pro Ser Lys

du

Gln

Lys

350

35 5

360

365

CCT

GGT

TCTT

CAG

ACT CTA

GGT

GCA

CCC

TTC TCG TCA CTG

ATC

TCC

Cd

1212

His

dy

Phe

Lys

Thr Leu

dy

Thr

Leu

Phe Ser Ser

Mst

Phe

Pro

370

375

380

GCT

CGT

TCC

CCC

AGT GGC

GTT

CAT

CTC

TAT ACA .ACT TTT

ATT

GIT

GTC

1260

Asp

Arg

Ser

Pro

Ser Asp

Vil

His

Leu

Tyr Thr Thr Phe

Ile

dy

Gly

385

300

395

AGT

ATC

AAA

CAG

©A CTA

GCC

GGG

GCT

TCC ACT GAC GAG

TCA

CCA

CAA

130 8

Ser

Arg

Asn

dn

du Leu

Ala

Lys

Ala

Ser Thr Gsp Glu

Ilu

Lls

Gln

400

405

410

GCT

GTC

ACT

TCT

(AC CCT

CAG

CCA

CTG

TTC GTC GTT GGA

GGT

GAG

CCC

1356

Val

Val

Thr

Ser

Asp Leu

Gln

Arg

Leu

Leu dy Val du

dy

Glu

Pro

415

420

425

GTG

TCT

GTC

/AAC

CAT TAC

TAT

(GG

AG

GAG CAATCC CCG

'TTC

TAT

©GC

1144

Val

Ser

Val

/An

His Tyr

Tyr

Τηρ

Mg

Lys Ala Phe Pro

leu

Tyr

/Gp

430

<135

440

445

AGC

AGC

TAT

(GAC

(CA CTC

ATC

GCA

GCA

ATC GcAC /GG ATG

©GG

GATT

GAT

1142

Ser

Ser

Tyr /Ap

Ser Val

Met

Hu

Cla

Ile /Gp Lys l^t

Glu

/Asn

Alp

450

455

446

CTC

CCT

GTC

GTC

TCC tat

GA

GGT

AAT

CAT GGA GGG GTC

CTC

CCT

GTC1

1150

Leu

Pro

dy

Phe

Phe Tyr

Ala

Gly

Asn

His Mg Gly Gly

Luu

Ser

Vll

465

470

445

m

AAA

TCTC

GGT

GCA TCG

GGT

TGC

AGA

GCA GGT (AC CTT

GTC

ATC

CA

1154

dy

Lys

Ser

Ile

Ali Ser

Gly

Cys

Lys

Ala Ala Asp Leu

Wi

Ile

Ssu

480

48r

490

TAC -

CTG

GACA '

TTC

TTG TTC

AGA

GAC

AC

/GGG CCA CCT GAC

AGC

TCA

TAAdTCCTrC

1603

Tyr

tóu i

du

Ser '

Cys Ser

Asn

Asp

Lys

Lys Pro Gsn Asp

Ser

Leu

495 500 505

CCGGTTCGTC CCITCTTATC GATCACTTCl TAAACTTGTA AAATGCAACA GGCAlCAGTG 1663

CGATTAGCCA ACAACTCAGC AAAACCCAGA TTCTCATAAG GCTCACTAAT TCCAGAATAA 1172

AcyAyyyATl taaaa

1138

186 842

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 4: (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 508 aminokwasów
	(B) TYP: aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko
(xi) OPIS SEKWENCJI. SEK	ID NR. 4
Met 1	Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp 5	His Gln Ile Glu Ala Val Ser Gly 10 15
Lys	Arg Val Ala Val Val Gly Ala 20	Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala 25 30
Tyr	Lys Leu Lys Ser Arg Gly Leu 35 40	Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Asp 45
Gly	Arg Val Gly Gly Lys Leu Arg 50 55	Ser Val Met Gln Asn Gly Leu Ile 60
Trp 65	Asp Glu Gly Ala Asn Thr Met 70	Thr Glu Ala Glu Pro Glu Val Gly 75 80
Ser	Leu Leu Asp Asp Leu Gly Leu 85	Arg Glu Lys Gln Gln Phe Pro Ile 90 95
Ser	Gln Lys Lys Arg Tyr Ile Val 100	Arg Asn Gly Val Pro Val Met Leu 105 110
Pro	Thr Asn Pro Ile Glu Leu Val 115 120	Thr Ser Ser Val Leu Ser Thr Gln 125
Ser	Lys Phe Gln Ile Leu Leu Glu 130 135	Pro Phe Leu Trp Lys Lys Lys Ser 140
Ser 145	Lys Val Ser Asp Ala Ser Ala 150	Glu Glu Ser Val Ser Glu Phe Phe 155 160
Gln	Arg His Phe Gly Gln Glu Val 165	Val Asp Tyr Leu Ile Asp Pro Phe 170 175
Val	Gly Gly Thr Ser Ala Ala Asp 180	Pro Asp Ser Leu Ser Met Lys His 185 190

Ser Phe Pro Asp Leu Trp Asn Val Glu Lys Ser Phe Gly Ser Ile Ile

186 842

195 200 205

Vai

Gly 210

/Aa

He

/Ag

Thr

Lys 215

Phe

Ma

Ma

Lys

Gly 220

Gly

Lys

Ser

Arg

Asp 225

Thr

Lys

Ser

Ser

Pro 230

dy

Thr

Lys

Lys

dy 235

Ser

Arg

dy

Ser

PTe 240

Ser

Phe

Lys

dy

Gly 245

Itet

dn

Ile

Leu

Pro 250

/Ap

Thr

Leu

Cys

Lys 255

Ser

^u

Ser

His

Asp 260

Glu

Ile

Asn

Leu

Asp 265

Ser

Lys

VaL

Ilu

Ser 270

Ilu

Ser

Tyr

Asn

Ser 275

Gly

Ser

Arg

Hn

du 280

Asn

Tir>

Ser

Leu

Ser 285

<C^£5

Val

Ser

His

Asn 290

du

Thr

Gin

Arg

Hn 295

Asn

Pro

His

Tyr

Asp 300

Ma

Val

Ile

Met

Thr 305

ALa

Pro

Leu

Cys

Asn 310

Val

Lys

Glu

Mee

Lys 15 5

Val

Mee

Lys

dy Gly 320

dn

Pro

Phe

Gln

Ilu 325

/An

Phe

Leu

Pro

Glu 330

Ile

sn n

Tyr

Met

Pro 335

Ilu

Ser

Val

Ilu

Ile 340

Thr

Thr

Phe

Thr

Lys 345

du

Lys

Val

Lys

Mg 350

Pro

Ilu

GLu

Gly

Phe 355

Gly

Val

Ilu

Ile

Pro 0 60

Ser

Lys

Glu

dn

Lry 365

Hhs

dy

Phe

Lys

Thr 370

Leu

dy

Thr

Ilu

Phe 375

Ser

Ser

Met

Met

Phh 380

Pro

/Ap)

/Ag

Ser

Pro 385

Ser

Asp

Val

His

Lru 390

fyr

Thr

Thr

Phe

He 395

Gyy Gly

Ser

Arg

/An 440

Gln

Glu

Lru

Ala

Lys 405

Ma

Ser

Thr

Asp

du 441

Ilu

Lys

Gln

Val

Val 441

TTr

Ser

Asp

Lre

dn 420

/Ag

Leu

Leu

Gly

aal 442

Glu

Gly

Glu

Paro

Wl 443

Ser

Wl

Asn

His

Tyr 435

Tyr

Trp

Arg

Lys

Ma 440

Phe

Pro

^u

Asp 444

Ssi

Ssi

TTy

Asp :

Ser

Val i

Met

Glu

Ala

Ile

Asp

Lys i

Met

Glu

Asn

Asp

Leu

Pro

Gly

450 455 460

Phe Phe Tyr Ala Gly Asn His Arg Gly Gly Leu Ser Val Gly Lys Ser 465 470 475 480

186 842

Ile Ala Ser Gly Cys Lys Ala Ala Asp Leu Val Ile Ser Tyr Leu Glu 485 490 495

Ser Cys Ser Asn Asp Lys Lys Pro Asn Asp Ser Leu 500 505 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID^- 5:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1698 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA· liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (iii) HIPOTETYCZNA: Nie (iv) ANTYSENSOWNA. Nie (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: 2 .. 1453 (D) INNE INFORMACJE: /uwaga = „Maize protox-1 cDNA;

(nie pełna długość); sekwencja z pWDC-4” (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR: 5

G AAT TCG GCG GAC TGC GTC GTG GTG GGC GGA GGC ATC AGT GGC CTC 46

Asn Ser Ala Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu

10 15

TGC ACC GCG CAG GCG Cys Thr Ala Gln Ala

CTG GCC

ACG CGG

CAC GGC GTC GGG GAC GTG CTT His Gly Val Gly Asp Val Leu

94

Leu

Ala

Thr

Arg

20

25

30

GTC

ACG

GAG

GCC

CGC

GCC

CGC

CCC

GGC

GGC

AAC

ATT

ACC

ACC

GTC

GAG

142

Val

Thr

Glu

Ala

Arg

Ala

Arg

Pro

Gly

Gly

Asn

He

Thr

Thr

Val

Glu

35

40

45

CGC

CCC

GAG

GAA

GGG

TAC

CTC

TGG

GAG

GAG

GGT

CCC

AAC

AGC

TTC

CAG

190

Arg

Pro

Glu

Glu

Gly

Tyr

Leu

Trp

Glu

Glu

Gly

Pro

Asn

Ser

Phe

Gln

50

55

60

CCC

TCC

GAC

CCC

GTT

CTC

ACC

ATG

GCC

GTG

GAC

AGC

GGA

CTG

AAG

GAT

238

Pro

Ser

Asp

Pro

Val

Leu

Thr

Met

Ala

val

Asp

Ser

Gly

Leu

Lys

Asp

65

70

75

186 842

GAC

TTG

GTT

TTT

Gd

GAC

CCA

AAC

GCG

CCG

CGT

TTC

GTG

CTG

Td

GAG

286

Asp 80

Aeu

Gal

Phe

Gly

Asp 85

Pro

Asn

ALa

Pro

Arg 99

Phe

Gal

Aeu

Trp

GLu 95

Gd

AAG

CTG

AGG

CCC

GTG

CCA

TCC

AAG

CCC

GCC

GAC

CTC

CCG

TTC

TTC

334

Gly

Lys

Aeu

Arg

Pro 100

Gal

Pro

Ser

Lys

Pro 15 5

ALa

Asp

Leu

Pro

Phe 110

Phe

GAT

CTC

ATG

AGC

ATC

CCA

Gd

AAG

CTC

Ad

GCC

Ayτ

CTA

GGC

GCG

CTT

3182

Asp

Aeu

^t

Ser 115

Ile

Pro

Gly

Ays

Leu 200

Arg

ALa

Gly

Aeu

Gly 125

Ala

Leu

GGC

ATC

CGC

Cd

CCT

CCT

CCA

GGC

CGC

GAA

GAG

TCA

GTG

GAG

GAG

TTT

430

Gly

Ile

Arg 130

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly 135

Arg

Glu

Glu

Ser

Gal 140

G1g

Glu

Phe

GTG

CGC

CGC

AAC

CTC

Ayτ

GCT

GAG

GTC

TTT

GAG

CGC

CTC

ATT

GAG

CCT

478

Gal

Arg 145

Arg

Asn

Aeu

Gly

Ha 150

Glu

Gal

Phe

GLu

Arg 155

Aeu

Ile

GLu

Pro

TTC

TGC

TCA

GOT

GTC

TAT

GCT

GGT

GAT

CCT

TCT

HG

CTC

AGC

ATG

AAG

526

Phe 160

Cys

Ser

Gly

Gal

Tyr 165

Ala

Gly

Asp

Pro

Ser 117

Ays

Leu

Ser

Met

Ays 175

GCT

GCA

TTT

Gd

AAG

GTT

TGG

CGG

TTG

GAA

GAA

ACT

GGA

GGT

AGT

ATT

574

ALi

Ala

Phe

Gly

Ays 180

Gal

Trp

Arg

Leu

Glu 185

Glu

Thr

Gly

Gly

Ser 110

Ile

ATT

GGI

GGA

ACC

ATC

HG

ACA

ATT

CAG

GAG

Ad

AGC

HG

AAT

CCA

AAA

662

Ile

Gly

Gly

Thr 195

Ile

Lys

Thr

Ile

GLn 200

Glu

Arg

Ser

Lys

Asn 220

Pro

Lys

CCA

CCG

AGG

GAT

GCC

CGC

CTT

CCG

AAG

CCA

AH

GGG

CAG

ACA

GIG

Td

660

Pro

Pro

Arg 210

Asp

ALa

Arg

Leu

Pro 215

Ays

Pro

Lys

Gly

Gln 220

Thr

rai

A1a

TCT

TTC

Ad

AAG

yGT

CTT

GCC

ATG

CTT

CCA

AAT

GCC

ATT

ACA

TCC

AGC

771

Ser

Phe 225

Arg

Lys

Gly

Aeu

Ala 230

^t

Aeu

Pro

Asn

Ala 235

Ile

Thr

Ser

Ser

TTG

GOT

AGT

AAA

GTC

AAA

CTA

TCA

TGG

HA

CTC

ACG

AGC

ATT

ACA

AAA

766

Aeu 240

Gly

Ser

Ays

Gal

Ays 245

Aeu

Ser

Trp

Ays

Aeu 250

Thr

Ser

Ile

Thr

Lys 255

TCA

GAT

GAC

HG

GGA

TAT

GTT

TTG

GAG

TAT

GH

ACG

CCA

GH

Gd

GTT

814

Ser

Asp

Asp

Ays

Gly 260

Tyr

Gal

Aeu

Glu

Tyr 265

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly 270

Gal

GTT '

TCG '

GTG

CAG

GCT

AAA .

AGT '

GTT

ATC .

ATG .

ACT

ATT '

CCA

TCA

TAT

GTT

866

Gal :

Ser

Gal

Gln

ALa

Ays

Ser

Gal

Ile 1

Met '

Thr

Ile

Pro

Ser

Tyr

Gal

275 280 285

186 842

GCT CCT TAC

CTT TAG CCT

CCT CAA TCT CCT CAT CAT CAA CAA GCCC CTA

910

Tla

Seo PAn 290

liii

Llu

PCg

Pio Ilu 295

Ser

Ser

Acp PCa

Tla 300

Csp

PCa

leu

TCA

CCA

TTT

TAT

TAT

Cd

CCG

GGT’

CTC

CCC

<CA

TCT

GTT

TCG

TAT

Cd

958

Ser

Tog

Phe

TT r

T(r

Pro

Pro

wa

PCa

PTa

wa

Thr

WL

Ser

Τ-γ

Pro

305

310

315

CTG

CTA

GCC

ATT

AGA

TTT

CCC

TGC

ATT

TTA

GAA

CTC

GAA

CTC

TGG

GCC

l<^06

Lys

Hu

PTa

Ile

Pcg

Lus

du

Ccs

leu

Ile

PAp

Gly

GLu

Leu

Gln

Gly

320

325

330

335

TTT

CCT

CCC

TAG

CCC

Cd

CCT

ATT

CCT

CCC

GCT

CTG

Ad

ATT

«GA

ACCA

1054

Phe

Hy

dn

Llu

His

Pro»

PTg

Ser

dn

dy

wa

du

Thr

Luu

Gly

Tino

340

345

350

ATT

TTC

ATG’

TAC

TTC

CCC

TTA1

CCC.

ACT

CCG

(CC

CCT

CCC

CCT

ATU

GAC

1102

Ile

Tyr

Ser

Ser

Ser

Llu

PPh

Pro

PAn

PTg

PTa

Pro

Tsp

CLy

PAg

WT

355

360

365

TTT

CTT

CCA

PTT

TAT

ATT

GCG

GCC

GCT

Ad

WT

Ad

Gd

ATT

CTT

TTC

1150

Leu

Leu

Leu

PCn

TTr

Ile

dy dy

PTa

TTh

PAn

TTh

dy

Ile

WT

Ser

370

3715

380

CTG

ACT

GGC

ATI

GCT

CCT

GCA

GCT

GGC

GCA

dT

CCA

GAC

CTC

Cd

PTT

1198

Lys

Thr

du

SSr

du

Leu

Wl

du

PAa

wa

PCp

PAg

PCp

Leu

PAg

Lls

385

390

395

ATG

CTT

ATT

CAT

CTT

CTA

CAA

TCG

TCC

CAT

TTC

CTC

TTT

GGA

GAT

CCT

1040

Leu

Ile

PCn

Ser

Thr

PAa

wa

PTp

Poo

Leu

Wl

Leu

GLy

Wl

Tog

400

405

410

445

GTT

TCG

CCCC

ACTA

(GCC

ATA

CCT

dG

•acc

CTG

(CA

CCC

CAT

CAA

GAT

(CTT

1294

Wl

Top

Pro

Gln

PCa

Ile

Pro

dn

Phe

Leu

Wl

Gly

iis

Leu

PCp

leu

420

442

440

CTC

GAT

GCC

CCA

TTA

CAT

CTC

AGG

TCC

GTA

ccg

CCT

CAC

GAA

«GC

CAC

1342

Leu

Hu

AlT

PCa

Ley

PCa

PCa

leu

PCp

Tog

Gly

dy

Tyo

Csp

Glys

leu

435

444

445

TTC

CTA

GGG

TAG

ATT

TAT

GGT

GGC.

GGC

GCA

GCC

CTC

CCC

AGA

TCT

(CTT

1390

Phe

Leu

GIg

Gly

PCs

T(s

Wl

PAa

dy

Wl

PTa

Ilu

Gly

Arg

tys

WT

450

455

460

GAG

<CCC

GCC

CAT

GGT

ATG

GCC

TAC

CCT

ATT

TCC

CCC

ATC

TTC

ACC

PTG

1438

du

Gly

P<1a

TTs

du

Sst

PA il

Ssu

dn

Ile

Ser

PTp

Phe

Liu

Thr

Lls

465 470 475

TTT CTC TAC TTG TCATlACCCT T<lTGCAlGAG TTCTTCTTCT TC<GrTTATGT

Tyr Ala Tyo Lys

480

1490

186 842

TGCATATATT AGGTGCCTCC ^HGGAGAGA AGGTTTG^\T ACTATTTTTT	ATTCITATTr	1550
TGTAAATTrT GTTTCTGTTT TTTTTTCTAT TA^AATTAG 'ΓΓΑΤΑ'ΠΤΓΑ		1^10
GGATTGTrCT GTTCACTGTC CTTCAAAAGA GATTTTGTTT TTCGTTAITr	TATTGAGCAGT*	1670
GTGCTGCTTA AAAAGAAGAA AAGAGGAG		1698

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI:

(X) DŁUGOŚĆ: 363 aminokwasów (B) TYP. aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR- 6

Asn 1

Ser

Ala

Asp Cys 5

Val

Val

Val

Gly

Gly 10

GLy

Ile

Ser

GLy

Leu 15

Cys

Thr

Ala

Gln

Ala 20

Leu

Ala

Thr

Arg

His 25

Gly

Val

Gly

Mp

Val 30

Leu

Val

Thr

Glu

Ala 35

Arg

Ala

Arg

Pro

Gly 40

Gly

Asn

Ile

Thr

Thr 45

Val

Glu

Arg

Pro

Glu 50

Glu

Gly

iy<r

Ilu

Τη? 55

Glu

Glu

Gly

Pro

Mn 60

Ser

Phe

Gln

Pro

Ser 65

Mp

Pro

Val

Llu

Thr 70

Mee

Ala

Val

Asp

Ser 75

Gly

Ilu

Lys

Mp

Mp 80

Leu

Val

Phe

Gly

Mp 85

Pro

Asn

ALa

Pro

Grg 90

Phe

Val

Leu

Trp

Glu 95

Gly

Lys

Leu

Arg

Pro 100

Val

Pro

Ser

Lys

Pro 105

Ala

Mp

Leu

Pro

Phe 110

Phe

Mp

Leu

Met

Ser 115

Ile

Pro

Gly

Lys

Leu 120

Arg

Ala

GLl

Leu

Gly 125

Ala

Leu

gll

Ile

Arg 130

Pro

Pro

Pro

Pro

Gly 135

Arg

Glu

Glu

Ser

Val 140

Glu

Glu

Phe

Val

Arg 145

Arg

Mn

Leu

Gly

Ala 150

GLu

Val

Phe

Glu

Arg 155

Leu

Ile

Glu

Pro

Phe 160

Cys

Ser

Hy

Val

Tyr 165

ALa

Ul

Asp

Pro

Ser 170

Lys

Leu

Ser

Met

Lys 175

Ala

186 842

Ala

Phe

Gly

Lys 180

Val

Trp

Arg

Leu

Glu 185

Glu

Thr

Gly

Gly

Ser 190

Ile

Ile

Gly

Gly

Thr 195

Ile

Lys

Thr

Ile

Gln 200

Glu

Arg

Ser

Lys

Asn 205

Pro

Lys

Pro

Pro

Arg 210

Asp

/lla

Arg

Leu

Pro 215

Lys

Pro

Lys

GIy

Gln 220

Thr

Val

Ala

Siar

Phe 225

Arg

Lys

Gly

Leu

Ala 230

Met

Leu

Pro

Asn

Ala 235

Ile

Thr

Ser

Ser

Leu 240

Gly

Ser

Lys

Val

Lys 245

Leu

Ser

Trp

Lys

Leu 250

Thr

Ser

Ile

Thr

Lys 255

S<ar

Asp

Asp

Lys

Gly 260

Tyr

Val

Leu

Glu

Tyr 265

Glu

Thr

Pro

Glu

Gly 270

Val

Val

Ser

Val

Gln 275

/Lla

Lys

Ser

Val

Ile 280

Met

Thr

Ile

Pro

Ser 285

Val

Ala

Ser

Asn 290

Ile

Leu

Arg

Pito

Leu 2495

Ser

Ser

Asp

Ala

Ala 300

Asp

Ala

Leu

Ser

Arg 305

Phe

Tyr

Tyr

Pro

Pro 310

val

Ala

Ala

Val

Thr 315

Val

Ser

Tyr

Pro

Lys 320

Glu

Ala

Ile

Arg

Lys 325

Glu

Cys

Leu

Ile

Asp 330

Gly

Glu

Leu

Gln

Gly 335

Phe

Gly

Gln

Leu

His 340

Pro

Arg

Ser

Gln

Gly 345

Val

Glu

Thr

Leu

Gly 350

Thr

Ile

Tyr

Ser

Ser 355

Ser

Leu

Phe

Pro

Asn 360

Arg

ALa

Pro

Asp Gly 365

Arg

Val

Leu

Leu

Leu 370

Asn

Tyr

Ile

Gly

Gly 375

Ala

Thr

Asn

TT tir

Gly 380

Ile

Val

Ser

Lys

Thr 385

Glu

Ser

Glu

Leu

Val 390

Glu

Ala

Val

Asp

Arg 395

Asp

leu

Arg

Lys

Met 400

Leu

Ile

Asn

Ser

Thr 405

Ala

val

Asp

Pro

Leu 410

Val

Leu

Gly

Val

Arg 415

Val

Trp

Pro

Gln

ALa 420

Ile

Pro

Gln

Phe

leu 425

val

Gly

His

leu

Asp 430

Leu

Leu

Glu

Ala

Ala

Lys

Ala

Ala

Leu

Aso

Arg

Gly

Gly

Tyr

Asp

Gly

Leu

Phe

35 4 10

186 842

Leu

Gly 4 50

Gly Ais

Tyr

Val

Ala 455

Gly

Va 1

U. a

Leu

Gly 460

Mg

Cys

vaU

Glu

Gly 465

Ala

Tyr Glu

Ser

Ala 470

Ser

Gln

Ile

Ser

Asp 475

Phe

du

Thau

Lyu

Tyr 480

Ala Tyr Lys (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID 7 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENYJL (A) DŁUGOŚĆ: 2061 par zasad (β) TYP nuleotydowa (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI cDNA (ni)HIPOTETYCZNA Nie (iv) ANTYSENSOWNA Nie (ix) CECHY (A) NAZWA/KLUCZ CDS (B) POZYCJA 64 . 1698 (D) INNE INFORMACJE /uwaga = „Maize protox-2 cDNA, sekwencja z pWDC-3” (xi) OPIS SEKWENYJL SEK ID NR 7

CTCTCCTACC TCCACCTCCA CGACAACAAG CAAATCCCCA TCCAGTTCCA AACCCTAACT 60

CAA ATG Met

CTC GCT Leu Ala

TTG ACT GCC TCA GCC TCA TCC GCT TCG TCC CAT CCT

108

Leu Thr 5

Ala

Ser

Ala

Ser

Ser 10

Ala

Ster

Ser

His Pro 15

1

TAT

CGC

CAC

Gd

TCC

CTG

CAC

ACT

CGT

CGC

CCC

CGC

CTA

CCT

GCG

GTC

156

Tyr

Arg

His

Ala

Ser

Ala

His

Thr

Arg

Arg

Pro

Arg

du

Ar cj

Ala

Val

20

25

30

CTC

GCG

ATC

GCG

GGC

TCC

GAC

CTC

CCC

CCT

GCA

GCG

CCC

GCC

AGA

TCG

20^ł

Leu

Ala

Met

Alei

Gly

Ser

Asp

Asp

Pro

Arg

Ala

Ala

Pro

Ala

Mg

Ser

35

40

45

GTC

GCC

GTC

GTC

GGC

GCC

GGG

GTC

A GC

CGG

CTC

GCG

GCG

GCG

TAC

AGG

252

Val

Ala

Val

Val

Gly

Al a

Gly

Val

Ser

Gl'/

du

Ala

Ala

Ala

Tyr

Mg

55 60

186 842

CTC AGA CAG AGC

GGC GTG AAC

GTA ACG GTG TTC GAA GCG

GCC GAC Ala Asp

AGG Arg

300

Leu Arg 65

Gln

Ser

Gly Val

Asn 70

Val

Thr Val

Phe

Glu 75

Ala

GCG

GGA

GGA

AAG

ATA

CGG

ACC

AAT

TCC

GAG

GGC

GGG

TTT

GTC

TGG

GAT

348

Ala

Gly

Gly

Lys

Ile

Arg

Thr

Asn

Ser

Glu

Gly

Gly

Phe

Val

Trp

Asp

80

85

90

95

GAA

GGA

GCT

AAC

ACC

ATG

ACA

GAA

GGT

GAA

TGG

GAG

GCC

ACT

Ad

CTG

396

Glu

Gly

Ala

Asn

Thr

Met

Thr

Glu

Gly

Glu

Trp

Glu

Ala

Ser

Arg

Leu

100

105

110

ATT

GAT

GAT

GTT

GGT

CTA

CAA

GAC

AAA

CAG

CAG

TAT

CCT

AAC

TCC

CAA

444

Ile

Asp

Asp

Lau

Gly

Leu

Gln

Asp

Lys

Gln

Gln

Tyr

Pro

Asn

Ser

Gln

115

120

125

CAC

AAG

CGT

TAC

ATT

GTC

AAA

GAT

GGA

GCA

CCA

GCA

CTC

ΑΊΤ

CCT

TOS

492

His

Lys

Arg

Tyr

Ile

Val

Lys

Asp

Gly

Ala

Pro

Ala

Lau

Ile

Pro

Ser

130

135

140

GAT

CCC

ATT

TCG

CTA

ATG

AAA

AGC

AGT

GTT

CTT

TCG

ACA

AAA

TCA

AAG

540

Asp

Pro

Ile

Ser

Leu

Met

Lys

Ser

Ser

Val

Leu

Ser

Thr

Lys

Ser

Lys

145

150

155

ATT

GCG

TTA

ΏΓ

TTT

GAA

CCA

TTT

CTC

TAC

AAG

AAA

GCT·

AAC

ACA.

AGA

588

He

Ala

Leu

Phe

Phe

Glu

Pro

Phe

Lau

Tyr

lys

Lys

Ala

Asn

Thr

Arg

160

l<5ió

170

175

AAC

TCT

GGA

AAA

GTG

TCT

GAG

GAG

CAC

TTG

ACT

GAG

ACT

GTT

GGG

AGC

636

Asn

Ser

Gly

Lys

Val

Ser

Glu

Glu

His

Leu

Ser

Glu

Ser

Val

Gly

Ser

180

185

190

TTC

TGT

GAA

CGC

CAC

TTT

GGA

AGA

GAA

GTT

GTT

GAC

TAT

TTT

GTT

GAT

6(34

Phe

Cys

Glu

Arg

His

Phe

Gly

Arg

Glu

Val

Val

Asp

Tyr

Phe

Val

Asp

195

200

205

CCA

TTT

GTA

GCT

GGA

ACA

AGT

GCA

GGA

GAT

CCA

GAG

TCA

CTA

TCT

ATT

732

Pro

Phe

Val

Ala

Gly

Thr

Ser

Ala

Gly

Asp

Pro

Glu

Ser

Leu

Ser

Ile

210

215

220

CGT

CAT

GCA

TTC

CCA

GCA

TTC

TGG

AAT

TTG

GAA

AGA

AAG

TAT

GGT

TCA

780

Arg

His

Ala

Phe

Pro

Ala

Leu

Trp

Asn

Leu

Glu

Arg

Lys

Tyr

Gly

Ser

225 230 235

GTT ATT GTT

GGT Gly

GCC ATC

TTG TCT Leu Ser

AAG CTA GCA GCT AAA GGT GAT

CCA Pro 255

val 240

Ile

Val

Ala

Ile 245

Lys

Leu

Ala 250

Ala

Lys

Gly

Asp

GTA

AAG

ACA

AGA

CAT

GAT

TCA

TCA

GGG

AAA

AGA

AGG

AAT

AGA

CGA

GTG

Val

Lys

Thr

Arg

His

Asp

Ser

Ser

Gly

Lys

Arg

Arg

Asn

Arg

Arg

Val

260

265

270

186 842

TCG Ser

TTT TCA TTT CAT GGT GGA ATG CAG TCA CTA ATA AAT GCA CTT CAC

924

Phe

Ser

Phe His 275

Gly

Gly

Met

Gln Ser 280

Leu

Ile

Asn

Ala 285

Leu

H1S

AAT

GAA

GTT

GGA

GAT

GAT

AAT

GTG

AAG

CTT

GGT

ACA

GAA

GTG

TTG

TCA

972

Asn

Glu

Val

Gly

Asp

Asp

Asn

Val

Lys

Leu

Gly

Thr

Glu

Val

Leu

Ser

290

295

300

TTG

GCA

TGT

ACA

TTT

GAT

GGA

GTT

CCT

GCA

CTA

GGC

AGG

TGG

TCA

ATT

1020

Leu

Ala

Cys

Thr

Phe

Asp

Gly

Val

Pro

Ala

Leu

Gly

Arg

Trp

Ser

Ile

305

310

315

TCT

GTT

GAT

TCG

AAG

GAT

AGC

GGT

GAC

AAG

GAC

CTT

GCT

AGT

AAC

CAA

1068

Ser

Val

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Gly

Asp

Lys

Asp

Leu

Ala

Ser

Asn

Gln

320

325

330

335

ACC

TTT

GAT

GCT

GTT

ATA

ATG

ACA

GCT

CCA

TTG

TCA

AAT

GTC

CGG

AGG

1116

Thr

Phe

Asp

Ala

Val

Ile

Met

Thr

Ala

Pro

Leu

Ser

Asn

Val

Arg

Arg

340

345

350

ATG

AAG

TTC

ACC

AAA

GGT

GGA

GCT

CCG

GTT

GTT

CTT

GAC

TTT

CTT

CCT

1164

Met

Lys

Phe

Thr

Lys

Gly

Gly

Ala

Pro

Val

Val

Leu

Asp

Phe

Leu

Pro

355

360

365

AAG

ATG

GAT

TAT

CTA

CCA

CTA

TCT

CTC

ATG

GTG

ACT

GCT

TTT

AAG

AAG

1212

Lys

Met

Asp

Tyr

Leu

Pro

Leu

Ser

Leu

Met

Val

Thr

Ala

Phe

Lys

Lys

370

375

380

GAT

GAT

GTC

AAG

AAA

CCT

CTG

GAA

GGA

TTT

GGG

GTC

TTA

ATA

CCT?

TAC

1260

Asp

Asp

Val

Lys

Lys

Pro

Leu

Glu

Gly

Phe

Gly

val

Leu

Ile

Pro

Tyr

385

390

395

AAG

GAA

CAG

CAA

AAA

CAT

GGT

CTG

AAA

ACC

CTT

GGG

ACT

GTC

TTT

TCC

1308

Lys

Glu

Gln

Gln

Lys

His

Gly

Leu

Lys

Thr

Leu

Gly

Thr

Leu

Phe

Ser

400

405

410

415

TCA

ATG

ATG

TTC

CCA

GAT

CGA

GCT

CCT

GAT

GAC

CAA

TAT

TTA

TAT

ACA

1356

Ser

Met

Met

Phe

Pro

Asp

Arg

Ala

Pro

Asp

Asp

Gln

Tyr

Leu

Tyr

Thr

420

425

430

ACA

TTT

GTT

GGG

GGT

AGC

CAC

AAT

AGA

GAT

CTT

GCT

GGA

GCT

CCA

ACG

1404

Thr

Phe

Val

Gly

Gly

Ser

His

Asn

Arg

Asp

leu

Ala

Gly

AL ia

Pro

Thr

435

440

445

TCT

ATT

CTG

AAA

CAA

CTT

GTG

ACC

TCT

GAC

CTT

AAA

AAA

CTC

TTG

GGC

1452

Ser

Ile

Leu

Lys

Gln

Leu

Val

Thr

Ser

Asp

Leu

Lys

Lys

Leu

Leu

Gly

4 50

455

4 60

GTA

GAG

GGG

CAA

CCA

ACT

TTT

GTC

/V\G

CAT

GTA

TAC

TGG

GGA

AuAT

GCT

1500

Val 1

Glu i

Gly

Gln

Pro

Thr

Phe

Val

Lys

His

val

Tyr

Trp

Gly

Asn

Ala

4 65

970

475

186 842

TTT Phe 480

CCT TTG TAT

GGC CAT GAT TAT AGT TCT GTA TTG GAA GCT ATA GAA

1548

Pro Leu

Tyr

Gly

His 485

Asp

Tyr

Ser

Ser

val 4 90

Leu

Glu

Ala

Ile

Glu 495

AAG

ATG

GAG

AAA

AAC

CIT

CCA

GGG

TTC

TTC

TAC

GCA

GGA

AAT

AGC

AAG

1596

Lys

Met

Glu

Lys

Asn

Leu

Pro

Gly

Phe

Phe

Tyr

Ala

Gly

Asn

Ser

Lys

500

505

510

GAT

GGG

CTT

GCT

GTT

GGA

AGT

GTT

AT Aa

GCT

TCA

GGA

AGC

AAG

GCT

GCT

1644

Asp

Gly

Leu

Ala

Val

Gly

Ser

val

Ile:

Ala

Ser

Gly

Ser

Lys

Ala

Ala

515

520

525

GAC

CTT

GCA

ATC

TCA

TAT

CTT

GAA

TCT

CAC

ACC

AAG

CAT

AAT

AAT

TCA

16512

Asp

Leu

Ala

Ile

Ser

iyr

Leu

Glu

Ser

His

Thr

Lys

His

Asn

Asn

Ser

530 535 540

CAT TGAAAGTGTC TGACCTATCC TCIAGCAGTT GTCGACAAAT TTCTCCAGTT 174 5

His

545

CATGTACAGT	AGAAACCGAT GCGTTGCAGT TTCAGAACAT CTTCACTTCT TCAGATATTA	1805
ACCCTTCGTT	GAACATCCAC CAGAAAGGTA GTCACATGTG TAAGTGGGAA AATGAGGTTA	1865
AAAACTATTA	TGGCGGCCGA AATGTTCCTT TTTGTTTTCC TCACAAGTGG CCTACGACAC	1925
TTGATGTTGG	AAATACATTT AAATTTGTTG AATTGTTTGA GAACACATGC GTGACGTGTA	1985
ATATTTGCCT	ATTGTGATTT TAGCAGTAGT CTTGGCCAGA TTATGCTTTA CGCCTTTAAA	2045
AAAAAAAAAA	AAAAAA	2061

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID 8 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ 544 aminokwasów (B) TYP aminokwasowa (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI białko (xi) OPIS SEKWENCJI SEK ID NR. 8

Met

Leu

Ala

Leu

Thr

Ala

Ser

Ala

Ser

Ser

Ala

Ser

Ser

His

Pro

Tyr

1

5

10

15

Arg

His

Ala

Ser

Ala

His

Thr

Mg

Arg

Pro

Arg

Leu

Arg

Ala

Val

leu

20

25

30

Ala

Met

Ala

Gly

Ser

Asp

Asp

Pro

.Arg

Ala

Ala

Pro

Ala

Arg

Ser

Val

35

4 0

15

186 842

Ala

Val 50

Val

Gly

Ala

Gly

Val 55)

Ser

Gly

Leu

Ala

Ala 60

Ala

Tyr

Arg

Leu

Arg 65

Gln

Ser

Gly

Val

Asn 70

val

Thr

Val

Phe

Glu 75

Ala

Ala

Asp

Arg

Ala 80

Gly

Gly

Lys

Ile

Arg 85

Thr

Asn

Ser

Glu

Gly 90

Gly

Phe

\/ćil

Trp

Asp 95

Glu

Gly

Ala

Asn

Thr 100

Met

Thr

Glu

Gly

Glu 105

Trp

Glu

Ala

Ser

Arg 11.0

Le u

Ile

Asp

Asp

Leu 115

Gly

Leu

Gln

Asp

Lys 120

Gln

Gln

Tyr

Pro

Asn 125

Ser

Gln

His

Lys

Arg 130

Tyr

Ile

val

Lys

Asp 135

Gly

Ala

Pro

Ala

Leu 140

Ile

Pito

Ser

Asp

Pro 145

Ile

Ser

Leu

Met

Lys 150

Ser

Ser

Val

Leu

Ser 155

Thr

Lys

Ser

Lys

Ile 160

Ala

Leu

Phe

Phe

Glu 165

Pro

Phe

Hsu

Tyr

Lys 1-70

Lys

Ala

Asn

Thr

Arg 175

Asn

Ser

Gly

Lys

Val 180

Ser

G1 u

G1 u

His

Leu 185

Ser

Glu

Se r

Val

Gly 190

Ser

Phe

Cys

Glu

Arg 195

His

Phe

Gly

Arg

Glu 200

Val

Val

Tyr

Phe 205

Val

Asp

Pro

Phe

Val 210

Ala

Gly

Thr

Ser

Ala 221

Gly

Asp

Pro

Glu

Ser 220

leu

Ser

Ile

Arg

His 225

Ala

Phe

Pro

Ala

Leu 230

Trp

Asn

Leu

Glu

Arg 233

Lys

T/r

GIy

Ser

Val 240

Ile

Val

Gly

Ala

Ile 245

Leu

Ser

Lys

Leu

Ala 250

Ala

Lys

Gly

As p

Pro 255

val

Lys

Thr

Arg

His 260

Asp

Ser

Ser

Gly

Lys 265

Arg

Arg

Asn

Arg

Air tg 227

Val

Ser

Phe

Ser

Phe 275

His

Gly

Gly

Met

Gln 280

Ser

Leu

Ile

Asn

Ala 225

Leu

His

Asn

Glu

Val 290

Gly

Asp

Asp

Asn

val 295

Lys

Leu

Gly

Thr

Glu 300

Val

Leu

Ser

Leu

Ala Cys Thr Phe Asp Gly Val Pro Ala Leu Gly Arg Trp Ser Ile Ser 305 310 315 320

186 842

Val

Asp

Ser

Lys

Asp 325

Ser

Gly

Asp

Lys

Asp 330

du

Ala

Ser

Asn

Gln 335

hhr

Phe

Asp

Ma

Val 340

Ile

Met

Thh

Ma

Ppo 345

du

Ser

Asn

VaT

Arg 350

Arg

Met

Lys

Phe

Thr 355

Lys

Gly

Gly

Ala

Pro 360

Val

Val

du

Asp

Phe 365

Leu

Pro

Lys

Met

Asp 370

Tyr

Leu

Pro

Leu

Ser ΡΆο

du

Met

va 1

Thr

Ala 380

Phe

Lys

Lys

Asp

Asp 385

Val

Lys

Lys

Pro

Leu 390

Glu

Gly

Phe

Gly

Val 395

du

Ile

Pro

Tyr

Lys 400

Glu

Gln

Gln

Lys

His 405

Gly

Leu

Lys

Thr

du 410

Gly

Tlir

Leu

Phe

Ser 415

S«ar

Met

Met

Phe

Pito 420

Asp

Arg

Ala

Pro

Asp 442

Asp

Gln

Tyr

du

Tyr 430

Thr

Thr

Phe

Val

Gly 435

Gly

Ser

His

Asn

Arg 440

Asp

du

Ma

GIy

Ma 445

Pro

Thr

Siar

Ile

Leu 4 50

Lys

Gln

Leu

val

Thr 455

Ser

Asp

Leu

Lys

Lys 4 40

du

du

Gly

Val

Glu 465

Gly

Gln

Pro

Thr

Phe 440

Val

Lys

His

Val

Tyr 475

Trp

Gly

Mn

Ma

Phe 440

Pro

Leu

Tyr

Gly

His 485

Asp

Tyr

Star

Ser

Val 4 90

Leu

Glu

Ma

He

Glu 495

Lys

Met

Glu

Lys

Asn 500

du

Pro

Gly

Phe

Phe 500

Tyr

Pila

Gly

Mn

Ser 550

Lys

Mp

Gly

Leu

Ala 515

Val

Gly

Ser

val

Ile 550

Ma

Ser

Gly

Ser

Lys 552

AL di

Ma

Mp

Leu

Ala

Ile

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

His

Thr

Lys

His

Asn

Asn

Ser

His

530 535 540 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID 9 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI.

(A) DŁUGOŚĆ 1697 par zasad (B) TYP· nuleotydowa (C) SPLOT pojedynczy (D) TOPOLOGIA liniowa

186 842 (ii) TYP CZĄSTECZKI cDNA (iii) HIPOTETYCZNA Nie (iv) ANTYSENSOWNA’ Nie (ix) CECHY (A) NAZWA/KLUCZ CDS (B) POZYCJA 29 1501 (D) INNE INFORMACJE /uwaga = „yeast protox-3 cDNA, sekwencja z pWDC-5” (xi) OPIS SEKWENCJI SEK ID NR 9

TTGGCATTTG CCTTGAACCA ACAATTCT ATG TCA ATT GCA ATT TGT GGA GGA 52

Met Ser Ile Ala Ile Cys Gly Gly

5

GGT Gly

ATA GCT GGT CTT AGT ACA GCA TTT TAT CTT GCT AGA TTC

ATT 11(5

CCA Pro

100

Ile Ala Gly leu Ser Thr

Ala Phe

Tyr

Leu Ala 20

Arg

Leu

10

15

AAA

TGT

ACT

ATT

CAT

TTG

TAC

GAA

AAA

GGT

CCT

CGT

TTA

GCT

Gd

TCG

148

Lys

Cys

Thr

Ile

Asp

Leu

Tyr

Glu

Ly s

Gly

Pro

Arg

Leu

Gly

Gly

Trp

25

30

35

40

CTT

CAG

TCG

GTC

AAA

ATC

CCG

TCT

GCA

CAT

TCT

CCA

ACA

GGA

ACG

CTT

196

Leu

Gln

Ser

Val

Lys

Ile

Pro

Cys

Ala

Asp

Ser

Pro

Thr

Gly

Thr

Val

45

50

55

TTG

TTT

GACA

CAA

GGT

CCT

ACA

ACT

CTT

CCT

CCT

GCT

GGG

GTT

GCT

GGC

244

Leu

Phe

Glu

Gln

Gly

Pro

Arg

Thr

Iz^u

Arg

Pro

Ala

Gly

Val

Ala

Gly

60

65

70

TTA

GCA

AAC

TTA

GAT

TTA

ATT

AGC

AAG

TTG

GGC

ATC

GAA

GAC

AAG

TTG

292

Leu

Ala

Asn

Leu

Asp

Leu

Ile

Ser

Lys

Leu

Gly

Ile

Glu

Asp

Lys

leu

75

80

85

TTA

AGG

ATT

TCG

AGC

AAT

TCT

CCC

AGC

GCA

AAA

AAC

CCA

TAT

ATT’

TAT

340

Leu

Arg

He

S<err

Ser

Asn

Ser

Pro

Ser

Ala

Lys

Asn

Arg

Tyr

Tyr

90

95

100

TAC

CCA

GAT

CGC

TTA

AAT

CAA

ATT

CCT

TCA

AGC

ATT

TTA

Gd

ACT

ATA

:388

Tyr

Pro

Asp

Arg

Leu

Asn

Glu

Ile

Pro

Ser

Ser

Ilee

Leu

Gly

Ser

Ile

105

110

115

120

AAG

TCG

ATT

ATG

CAG

CCT

CCT

TTG

CGT

CCG

ATG

CCT

TTC

GCT

ATC

ATG

4 36

Lys

Ser

Ile

Met

Gln

Pro

Al a

leu

Arg

Pro

Mec

Pro

Leu

Ala

Met

Met

186 842

125 130 135

CTT GAG CCC

TTT CGT

TA AGT AAG CGA GAT TCG ACA GAT GAA AGC GTG

4 84

Leu Glu

Pro

Piie; 140

Arg

Lys Ser-

Lys

Ar <5 145

Asp

Ser

Thr

Asp

Glu 150

Ser

Val

GGT

TCA

ΤΤΓ

ATC

AGA

Ad

Ad

ΤΓΓ

GGT

AAA

AAC

GTT

ACG

(GAT

AGA

GTT

532

Gly

Ser

Phe

Met

Arg

Mg

Arg

Phe

Gly

Lys

Asn

Val

Thr

Asp

Arg

Val

155

160

165

ATG

AGT

GCA

ATG

ATA

AAT

GGT

ATT?

TAT

GCT

GGT

GAT

TTG

AAT

GAT

TTG

5f3O

Met

Ser

Ala

Met

Ile

Asn

Gly

Ile

Tyr

Ala

Gly

Asp

Leu

P3sn

Asp

Leu

170

175

180

TCT

ATG

CAT

TCT

AGC

ATC

TTT

GGA

TTT

TTA

GCG

AAG

ATT

dA

AAA

P3AG

6128

Ser

Met

Hrs

Se r

Se r

Met

Phe

Gly

Phe

Leu

Ala

Lys

Ile

Glu

Lys

Lys

185

190

19S

200

TAT

GGA

AAC

ATT

ACT

irc

Gd

ATT1

Ad

GCT

CTT

CTT

GCA

CGT

GP3A

6-76

Tyr

Gly

Asn

I le

Thr

Leu

Gly

leu

Ile:

Ar g

Ala

Leu

Leu

Ma

Arg

Glu

205

210

215

ATA

TTA

TCT

CCT

GCT

GAG

AAA

GCT

TTC

GAA

AGC

AGC

ACT

ACT

CGC

Ad

72 4

Ile

Leu

Ser

Pro

Ala

Glu

Lys

Ala

Izsu

Glu

Ser

Ser

Thr

Thr

Mg

Mg

220

225

230

GCC

AAA

AAC

AGC

AGA

GCT

GTC

AAA

(GAG

TAT

GAA

ATC

GAC

AAG

TAT

GIT

772

Ala

Lys

Asn

Ser

Arg

Ala

Val

Lys

Gln

T\r

Glu

Ile

Asp

Lys

Tyr

Val

235

240

245

GCT

TTC

AAG

GAA

GGG

ATT

GAG

ACT

ATT

Ad

TTG

TCA

ATA

GCA

(GAT

GAA

820

Ala

Phe

Lys

Glu

Gly

Ile

Glu

Thr

Ile;

Thr

Leu

Ser

liLe

Ala

Asp

Glu

250

255

260

TTA

AAA

AAA

ATG

CCG

AAT

GTC

AAG

AT Aa

(GAT

CTA

AAC

AAA

CCG

GCC

CAA

868

Leu

Lys

Lys

Met

Pro

Asn

Val

Lys

Ile

His

Leu

Asn

Lys

Pro

Ma

Gln

265

270

275

280

ACT

TTG

GTT

CCA

CAT

TA

ACT

dG

TCT

GIT

GTA

GAC

CTC

AAT

GGT

CAA

916

Thr

Leu

Val

Pro

His

Lys

Thr

Gln

Ser

Leu

Val

Asp

Val

Asn

Gly

Gln

285

290

295

GCT

TAC

GAG

TAT

GTT

CTC

TTT

GCA

AAC

TCT

TCT

CGC

AAT

ΤΓΑ

dG

AAT

964

Ala

Tyr

Glu

Tyr

val

Val

Phe

.Al <3

Asn

Ser

Ser

Arg

Asn

Leu

Glu

P3sn

300

305

310

CTA

ATA

TCT

TGT

CCT

AAA

ATG

(GAA

ACT

CCG

ACG

TCG

AGT

GTT

TAT

GTC

1012

Leu

He

Ser

Cys

Pro

Lys

Met

Glu

Thr

Pro

Thr

Ser

Ser

Val

Tyr

Val

315

320

325

GTC

AAC

GTT

TAT

TAT

AAG

GAC

CCT

AAT

gtt

CTT

CCA

ATC'

CGT

CGTI

ΤΤΓ

1060

Val

Asn

Val

lyr

Tyr

Lys

Asp

Pro

Asn

vai

Leu

Pro

1 le

Arg

Gly

Phe

186 041

330 335 334

GGG Gly 34 5

CTT TTG ATT

CCA Pro

TCA TGC ACT Cd ΑΛΤ AAT CCG AAT dT GTT CTT

1108

Leu

Leu

Ile

Ser Cys Thr 350

Pro

Asn Asn 355

Pro

Asn

His

Val

Leu 3630

GGT

ATC

GTT

TTT

GAT

AGT

dG

CAA

AAC

AAC

CCT

GAA

AAT

GITA

AGC

AAG

1156

Gly

Ile

Val

Phe

Asp

Ser

Glu

Gln

Asn

Asn

Piso

Glu

Asn

Gly

Star

Lys

365

370

375

GTC

ACT

GTC

ATG

ATG

GGA

GGG

TCT

GCT

TAT

ACTA

AAA

AAT

AGT

TCT

TIG

11304

Val

Thr

Val

Mec

Met

Gly

Gly

Ser

Ala

Tyr

Thr

lys

Asn

Thr

Star

Lau

380

385

390

ATT

CCA

ACC

AAC

CCC

GAA

GAA

GCC

CTT

AAC

AAT

GCT

CTC

AAA

GCT

TTC

11352

Ile

Pro

Thr

Asn

Pro

Glu

Glu

Ala

Val

Asn

Asn

Ala

Lau

lys

Ala

Lau

395

400

405

CAG

CAT

ACT

TTA

AAA

ATA

TCC

AGT

AAG

CCA.

ACTA

CTC

ACG

aat:

Gd

ACTA

1300

Gln

His

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Ser

Lys

Piso

Thr

Lau

TIyjs

Asn

Ala

Thrs

410

415

420

TTA

CAA

CCA

AAT

TGC

ATC

CCT

CAA

TAT

CGT

GTT

GGG

CAT

CAA

GAT

AAT

1348

Leu

Gln

Pro

Asn

Cys

Ile

Pro

Gln

Tyr

Arg

Val

Gly

His

Gln

Asp

Asn

425

4330

435

440

CTT

AAT

TCT

TTG

AAA

TCT

TGG

ATT

GAG

AAA

AAT

ATG

GGA

GGG

CGA

ATT

1396

Leu

Asn

Ser

Leu

Lys

Ser

Trp

• Ile

Glu

Lys

Asn

Met

Gly

Gly

Arg

Ile

445

450

455

CTT

CTA

ACT

GGA

AGT

TGG

TAT

AAT

GGT

GTT

AGT

ATT

GGG

dT

TCT

ATT

1444

Leu

Leu

Thr

Gly

Ser

Τηρ

Tyr

Asn

Gly

Val

Ser

Ile

Gly

Asp

Cys

Ile

460

465

470

ATG

AAT

GGA

CAT

TCA

ACA

GCT’

CGA

AAA

CTA

GCTA

Td

CTG

ATG

AAT

TCT

1492

Mec

Asn

Gly

His

Ser

Thr

Ala

Arg

Lys

Lau

Ala

Ser

Lau

Met

Asn

Ser

475

480

485

TCT TCT TGAGCGTTTA TAAATGTTGA TATAAAATTA GTATATAGTT CCTTTGATTA 1548

Ser Ser

90

TTTTATdGT	TGAAAATGCC	ACTTCTGAAA	TAATTTTGd	CAAGCCCTTT	TATTAddC	1608
GTATATGCGA	GGACATTCGA	CAAACGTTTG	AAATTAAAAA	TdTATGCCT	TTTAGCTTAA	1668
GACATCAAGG	TCATGAATAA	TAAAATTTT				1697

(2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID 10 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI

186 842 (A) DŁUGOŚĆ: 490 aminokwasów (B) TYP aminokwasowa (D) TOPOLOGIA liniowa (u) TYP CZĄSTECZKI: bia«<o (xi) OPIS SEKWENYJI'SEK ID NR 10

Met 1

Ser Ile

Ala

Ile 5

Cys Gly

Gly Gly

Ile 11

Ala

Gly du Ser

Thr 15

Ala

Phe

Tyr

Leu

Ala

Arg

Leu

Ile

Pro

Lys

Cys

Thr

Ile

Mp

du

Tyr

Glu

20

25

30

Lys

Gly

Pro

Mg

Leu

GIL;/

Gly

Trp

Leu

Gln

Ser

Val

Lys

Ile

Pro

Cys

35

40

45

Ala

Asp

Ser

Pro

Thr

Gly

Thr

Val

du

Phe

GLu

Gln

Gly

Pro

Arg

Thr

50

55

60

Leu

Arg

Pro

Ala

Gly

Val

Ala

Gly

Leu

/da

Asn

Leu

Asp

Leu

liii

Ser

65

70

75

80

Lys

Leu

Gly

Ile

Glu

Asp

Lys

Leu

Leu

Arg

Ile

Ser

Ser

Asn

Ser

Pro

85

90

99

Ser

Ala

Lys

Asn

Arg

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Arg

du

Asn

Glu

Ile

100

105

110

Pro

Ser

Ser

Ile

Leu

Gly

Ser

Ile

Lys

Ser

Ile

Met

Gln

Pro

Ala

du

115

112

112

Arg

Pro

Met

Pro

Leu

Ala

Met

Met

Leu

Glu

Pro

Phe

Mg

Lys

Ser

Lys

130

113

110

Arg

Asp

Ser

Thr

Asp

Glu

Ser

'/al

Gly

Ser

Phe

Met

Arcj

Arg

Arg

Phe

145

110

115

116

Gly

Lys

Asn

Val

Thr

Asp

Arg

Val

Met

Ser

Ala

Met

Ile

Asn

Gly

Ile

165

117

117

Tyr

Ala

Gly

Asp

Leu

Asn

Asp

Leu

Ser

Met

His

Ser

Ser

Met

Phe

Gly

180

118

119

Phe

Leu

Ala

Lys

Ile

Glu

Lys

Lys

Tyr

Gly

Asn

Ile

Thr

Leu

Gly

du

195

220

220

Ile

Arg

Ala

Leu

Leu

Ala

Arg

Glu

Ile

Leu

Ser

Pro

Ala

Glu

Lys

Ala

210 215 220

Leu Glu Ser Ser Thr Thr Mg Arg Ala Lys Asn Ser Arg Ala Val Lys 230 235 240

186 842

Gln Tyr Glu

Ile Asp 245

Lys Tyr Val

ALa Phe 250

Lys

GIu Gly

Ile

Glu 255

Thr

Ile

Thr

Leu

Ser

Ile

Ala

Asp

Glu

Leu

Lys

Lys

Met

Pito

Asn

Val

Lys

260

265

270

Ile

His

Leu

Asn

Lys

Pro

Ala

Gln

Thr

Leu

Val

Pro

His

Lys

Thr

Gln

275

280

285

Ser

Leu

Val

fi^p

\^ćłl

/^n

Gly

Gln

Ala

Tyr

Glu

Tyr

Val

Val

Phe

Ala

290

295

33(0

Asn

Ser

Ser

Arg

Asn

Leu

Glu

Asn

Leu

Ile

Ser

Cys

Pro

Lys

Met

Glu

305

310

33.5

320

Thr

Pro

Thr

Ser

Ser

Val

Tyr

Val

Val

Asn

Val

Tyr

Tyr

Lys

Asp

Pro

325

330

335

Asn

Val

Leu

Pro

Ile

Arg

Gly

Phe

Gly

Leu

Leu

Ile

Pro

Ser

Cys

Thr

340

334

330

Pro

Asn

Asn

Pro

Asn

His

Val

Leu

Gly

Ile

val

Phe

Asp

Ser

Glu

Gln

355

330

365

Asn

Asn

Pro

Glu

Z^n

Gly

Ser

Lys

Val

Thr

Val

Met

Met

Gly

Gly

Ser

370

337

380

Ala

Tyr

Thr

Lys

Asn

Thr

Ser

Leu

Ile

Piso

Thr

Asn

Pro

Glu

Glu

Ala

385

399

339

4 00

Val

Asn

Asn

Alei

Leu

Lys

Ala

Leu

Gln

His

Thr

Leu

Lys

Ile

Ser

Ser

405

410

441

Lys

Pito

Thr

leu

Thr

Asn

Ala

Thr

Leu

Gln

Pro

Asn

Cys

Ile

Pro

Gln

420

442

443

Tyr

Arg

Val

Gly

His

Gln

Asp

Asn

Leu

Asn

Ser

Leu

Lys

Ser

Trp

Ile

435

440

445

Glu

Lys

Asn

Met

Gly

Gly

? rg

He

Leu

Leu

Thr

Gly

Ser

Trp

Tyr

Asn

4 50

445

4 46

Gly

Val

Ser

Ile

Gly

Asp

Cys

Ile

Met

Asn

Gly

His

Ser

Thr

Ala

Arg

465

470

475

480

Lys

Leu

Ala

Ser

Leu

Met

Asn

Ser

Ser

Ser

485 490

186 842 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID 11 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI.

(A) DŁUGOŚĆ 41 par zasad (β) TYP. nuleotydowa (C) SPLOT pojedynczy (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI mny kwas nukleinowy (A) OPIS oligonukleotyd użyty do konstrukcji pCGN1761ENX (iii) HIPOTETYCZNA Nie (iv) ANTYSENSOWNA. Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 11 AATTATGACG TAACGTAGGA ATTAGCGGCC CGCTCTCGAG T (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID' 12 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ' 40 par zasad (B) TYP nuleotydowa (C) SPLOT pojedynczy (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI inny kwas nukleinowy (A) OPIS oligonukleotyd użyty do konstrukcji pCGN 1761ΕΝΧ (iii) HIPOTETYCZNA Nie (jv) ANTYSENSOWNA. Ni ie (xi) OPIS SEKWENCJI SEK ID NR 12 AATTACTCGA GAGCGGCCGC GAATTCCTAC GTTACGTCAT (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID 13 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ 31 par zasad (B) TYP nuleotydowa (C) SPLOT pojedynczy (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI inny kwas nukleinowy (A) OPIS starter SON0003 użyty do konstrukcji pSOGIO (iii) HIPOTETYCZNA. Nie 0v) ANTYSENSOWNA' Nie (xi) OFIIS SEKWENCJI SEK ID NR 13 CTCGGATCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG

186 842 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID 14 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ 31 par zasad (B) TYP nuleotydowa (C) SPLOT pojedynczy (D) TOPOLOGIA· liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI inny kwas nukleinowy (A) OPIS starter SON0004 użyty do konstrukcji pSOGIO (in) HIPOTETYCZNA Nie (iv) ANTYSENSOWNA Nie (xi) OPIS SEKWENCJI. SEK ID NR 14

ACGGGATCCAACTTCCTAGCTGAAAAATGGG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID: 15 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ 26 par zasad (B) TYP. nuleotydowa (C) SPLOT pojedynczy (D) TOPOLOGIA liniowa (u) TYP CZĄSTECZKI inny kwas nukleinowy (A) OPIS starter SON0013 użyty do konstrukcji pSOG19 (in) HIPOTETYCZNA Nie (iv) ANTYSENSOWNA: Nie (xi) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 15

CATGAGGGACTGACCACCCGGGGATC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID 16 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI.

(A) DŁUGOŚĆ 24 par zasad (B) TYP. nuleotydowa (C) SPLOT· pojedynczy (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI, inny kwas nukleinowy (A) OPIS starter SON0010 użyty do konstrukcji pSOG19 (iii) HIPOTETYCZNA Nie (iv) ANTYSENSOWNA Nie (xi) OPIS SEKWENCJI SEK ID NR 16 AGCGGATAACAATTTCACACAGGA

186 842 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID 17 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ 24 par zasad (β) TYP: nuleotydowa (θ) SPLOT pojedynczy (D) TOPOLOGIA liniowa (u) TYP CZĄSTECZKI inny kwas nukleinowy (A) OPIS starter SON0016 użyty do konstrukcji pSOG19 (iii) HIPOTETYCZNA Nie (iv) ANTYSENSOWNA Nie (xi) OPIS SEKWENCJI· SEK ID NR 17 GCTACCATGGCCACATAGAACACC (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID 18 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ 23 par zasad (β) TYP nuleotydowa (C) SPLOT pojedynczy (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI· inny kwas nukleinowy (A) OPIS: starter SON0017 użyty do konstnjkcii pSOG19 (iii) HIPOTETYCZNA Nie (iv) ANTYSENSOWNA· Nie (xi) OPIS SEKWENCJI SEK ID NR: 18 CGAGAGCTCGCACTTCAACCTTG (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID 19 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ· 28 par zasad (B) TYP· nuleotydowa (C) SPLOT· pojedynczy (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI inny kwas nukleinowy (A) OPIS· starter SON0039 użyty do konstrukcii pSOG30 (ii) HIPOTETYCZNA Nie (iv) ANTYSENSOWNA Nie (xi) OPIS SEKWENCJI SEK ID NR 19

CGACATGGTACGTCCTGTAGAAACCC ACA

186 842 (2) INFORMACJE DOTYCZĄCE SEK NR ID’ 20 (i) CHARAKTERYSTYKI SEKWENCJI (A) DŁUGOŚĆ 24 par zasad (B) TYP: nuleotydowa (C) SPLOT' pojedynczy (D) TOPOLOGIA liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI inny kwas nukleinowy (A) OPIS starter SON0041 użyty do konstrukcii pSOG30 (iii) HIPOTETYCZNA Nie (iv) ANTYSENSOWNA Nie (xi) OFIIS SEKWENCJI SEK ID NRi 20 ATCGCAGACCGGCAAGATTC

186 842

186 842

NO,

NOCH2COOCH3

CCH2OCH3

C

COOCH

Cl

Wzór 4a

Wzór 4b

Wzór 5

Wzór 6

Wzór 7

Wzór 8

186 842 ^CH3\eN

I ’Νhf₂c ^NY o

Wzór 9

Cl o _/=( A-n'^{CHF2 α}Λ/“ TJ.

/- ^N CK

CKSO₂NH

Wzór 10

Wzór 11

186 244

Wzór 12

Wzór 13

Wzór 14

Wzór 15

Wzór 16

186 204

Wzór 17

Wzór 18

Wzór 20 Wzór 21

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 70 egz. Cena 6,00 zl

Claims (25)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Konstrukt genowy kodujący białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu zawierający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub w komórce roślinnej, który jest funkcjonalnie połączony z cząsteczką heterologicznego DNA, wyizolowaną z genu hemG E coli lub genu hemY B. subtilis i kodującą białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu.
2. 2. Konstrukt według zastrz. 1, znamienny tym, że cząsteczka DNA zawiera gen hemG E. coli.
3. 3. Konstrukt według zastrz. 1, znamienny tym, że cząsteczka DNAzawiera gen hemY B. subtilis.
4. 4. Konstrukt według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową funkcjonalnie połączoną z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do chloroplastu.
5. 5. Konstrukt według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową funkcjonalnie połączoną z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do mitochondrium.
6. 6. Konstrukt według zastrz. 1, znamienny tym, że jest częścią genomu roślinnego.
7. 7. Komórka gospodarza zawierająca konstrukt z promotorem zdolnym do funkcjonowania w roślinie lub w komórce roślinnej, funkcjonalnie połączonym z cząsteczką heterologicznego DNA kodującą białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu, znamienna tym, ze zawiera cząsteczkę DNA wyizolowaną z genu hemG E. coli albo genu hemY B. subtilis.
8. 8. Komórka gospodarza według zastrz. 7, znamienna tym, że konstrukt dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową funkcjonalnie połączoną z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do chloroplastu.
9. 9. Komórka gospodarza według zastrz. 7, znamienna tym, że konstrukt dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową funkcjonalnie połączoną z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do mitochondrium,
10. 10. Komórka gospodarza według zastrz. 7, znamienna tym, że jest wybrana z grupy obejmującej komórki roślinne, komórki bakteryjne, komórki drożdży i komórki owada.
11. 11. Komórka gospodarza według zastrz. 10, znamienna tym, że jest komórką roślinną.
12. 12. Komórka roślinna i jej potomstwo zawierająca promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub w komórce roślinnej, funkcjonalnie połączony z cząsteczką heterologicznego DNA kodującą białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu, znamienna tym, ze zawiera cząsteczkę DNA wyizolowaną z genu hemG E. coli lub genu hemY B. subtilis.
13. 13. Komórka roślinna według zastrz. 12, znamienna tym, że cząsteczka DNA zawiera gen hemG E coli.
14. 14. Komórka roślinna według zastrz. 12, znamienna tym, że cząsteczka DNA zawiera gen hemY B. subtilis.
15. 15. Komórka roślinna według zastrz. 12 albo 13, albo 14, znamienna tym, że jest komórką rośliny dwuliściennej.
16. 16. Komórka roślinna według zastrz. 15, znamienna tym, że jest komórką wybraną z grupy składającej się z komórek soi, bawełny, tytoniu, buraka cukrowego i rzepaku.
17. 17. Komórka roślinna według zastrz. 12 albo 13, albo 14, znamienna tym, ze jest komórką rośliny jednoliściennej.

    186 842
18. 18. Komórka roślinna według zastrz. 17, znamienna tym, że jest komórką wybraną z grupy składającej się z komórek kukurydzy, pszenicy, sorgo, żyta, owsa, trawy darniowej i ryżu.
19. 19. Sposób kontrolowania wzrostu niepożądanej wegetacji, przez traktowanie populacji roślin skuteczną ilością herbicydu hamującego oksydazę protoporfirynogenu, znamienny tym, że do roślin, które mają być chronione wprowadza się konstrukt zawierający promotor zdolny do funkcjonowania w roślinie lub w komórce roślinnej i funkcjonalnie połączony z cząsteczką heterologicznego DNA kodującą białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu, która to cząsteczka DNA jest wyizolowana z genu hemG E. coli lub genu hemY B. subtilis.
20. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że chroni się rośliny wybrane z grupy obejmującej soję, bawełnę, tytoń, buraki cukrowe, rzepak, kukurydzę, pszenicę, sorgo, żyto, owies, trawę darniową i ryz.
21. 21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu stosuje się herbicyd wybrany z grupy składającej się z arylouracylu, dife-nyloeteru, oksydiazolu, cyklicznego imidu, fenylopirazolu, pochodnych pirydynowych, podstawionego w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazolu, fenopilanu oraz O-fenylopirolidynoi piperydynokarbanylowych analogów tego fenopilanu.
22. 22. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu stosuje się cykliczny imid o wzorze 5, w którym Q oznacza wzór 6 albo 7, albo 8, albo 9, albo 9a, albo 9b i w którym Rj oznacza H, Cl albo F, R2 oznacza Cl, a R3 jest eterem, tioeterem, estrem, grupą aminową albo alkilową i w którym R2 i R3 razem mogą tworzyć 5- albo 6-składnikowy pierścień heterocykliczny.
23. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że jako herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu stosuje się cykliczny imid wybrany z grupy składającej się ze związków o wzorze 10,11,12,13,14, 15,16 i 17, w których R oznacza grupę (C2-6-alkenyloksy)karbonylo-C1-4-alkilową.
24. 24. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu stosuje się herbicyd o wzorze wybranym z grupy obejmującej wzory 18, 19, 20 i 21.
25. 25. Sposób selekcji roślin, tkanek roślinnych lub komórek roślinnych stransformowanych transgenem będącym przedmiotem zainteresowania spośród roślin nie stransformowanych, znamienny tym, że:

    (a) transformuje się rośliny, tkanki roślinne lub komórki roślinne transgenem będącym przedmiotem zainteresowania i konstruktem zawierającym promotor zdolny do z funkcjonowania w roślinie lub w komórce roślinnej, funkcjonalnie połączonym z cząsteczką heterologicznego DNA, kodującą białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu, wyizolowaną z genu hemG E. coli lub genu hemY B. subtilis.

    (b) przenosi się tak stransformowane rośliny lub komórki roślinne do pożywki zawierającej inhibitor oksydazy protoporfirynogenu, który jest wybrany z grupy złożonej z aryloura-cylu, difenyloeteru, oksydiazolu, cyklicznego imidu, fenylopirazolu, pochodnych pirydynowych, podstawionego w pozycji 3 2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazolu, fenopilanu oraz O-fenylopirolidynoi piperydynokarbanylowych analogów tego fenopilanu, przy czym stężenie herbicydu hamującego oksydazę protoporfirynogenu w pożywce wynosi 0,001 do 3000 części na milion, oraz (c) selekcjonuje się rośliny lub komórki roślinne, które przeżywają w pożywce.