CZ297083B6 - Cinidlo pro prevenci a lécbu zánetlivého onemocnení streva obsahující aktivní slozku antagonistu IL-6 - Google Patents

Abstract

Pouzití antagonisty interleukinu-6 (IL-6) pro prípravu cinidla pro prevenci nebo lécení zánetlivéhoonemocnení streva, jako je napríklad Crohnova nemoc a ulcerózní kolitida.

Description

Dosavadní stav techniky

IL-6 je cytokin, který se rovněž nazývá B buňky stimulující faktor 2 (BSF2) nebo interferon β2. IL-6 byl objeven jakožto diferenciační faktor, který se účastní aktivace B-lymfocytických buněk (Hirano, T a kol., Nátuře (1986) 324, 73 až 76). Potom se zjistilo, že je multifunkčním cytokinem, který ovlivňuje řadu buněčných funkcí (Akira, S. a kol., Adv. in Immunology maturation of T-lymphocytic cells (Loz, M. a kol., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253 až 1258).

IL-6 přenáší svůj biologický signál na buňku přes dva proteiny. Jedním z nich je receptor IL-6, protein vážící IL-6 s molekulovou hmotností 80 kD (Taga, T. a kol., J. Exp. Med. (1987) 166, 967 až 981; Yamasaki, K. a kol., Science (1987) 241, 825 až 828). Receptor IL-6 se nevyskytuje pouze ve formě vázané na membránu s transmembránovou doménou exprimovanou na buněčném povrchu, ale také jako rozpustný receptor IL-6 obsahující převážně mimobuněčnou část.

Druhý protein je protein vázaný na membránu gpl30 o molekulové hmotnosti 130 kD, který se účastní v neligandové vazebné transdukce signálu. IL-6 a receptor IL-6 vytváří komplex IL-6/receptor IL-6, který po navázání je gpl30 přenáší svůj biologický signál na buňku (Taga a kol., Cell (1989) 58, 573 až 581).

Antagonisté IL-6 jsou látky, které inhibují transdukci biologické aktivity IL-6. Jako antagonisté IL-6 jsou doposud známy protilátky proti IL-6 (anti- IL-6 protilátky), protilátky proti receptoru IL-6 (anti- IL-6 receptorové protilátky) a protilátky proti gpl30 (anti-gpl30 protilátky), alterovaný IL-6, jednotlivé peptidy IL-6 nebo receptoru IL-6 apod.

Protilátky proti IL-6 receptoru jsou popsány v několika pracích (Novick D. a kol., Hybridoma (1991) 10, 137 až 146, Huang, Y. W. a kol., Hybridoma (1993) 12, 621 až 630, Intemational Patent Publication WO 95/09873, French Patent Application FR 2694767, United States Patent US 521628). O humanizované PM-1 protilátce se ví, že byla získána navázáním části determinující komplementaritu (CDR) myší protilátky PM-1 (Hirata, Y, a kol., J. Immunology (1989) 143, 2900 až 2906) s lidskou vzorovou protilátkou (the Intemational Patent Publication WO 92/19759).

Zánětlivé onemocnění střeva (IBD-inflammatory bowel disease) jsou nespecifické záněty, mezi které patří ulcerózní kolitida a Crohnova nemoc. Na počátku onemocnění se vyskytují imunologické poruchy, ale ty nevedly k objasnění příčiny tohoto onemocnění. Má se za to, že monocyty a lymfocyty, které se shlukují v postiženém místě, se podílejí na poškození sliznice amediátory zánětu, zvláště cytokiny (jako je například ILfi, TNFa a IL-6) si zaslouží zvláštní pozornost.

Z mediátorů zánětu se upírá pozornost ke vlivu IL-6 a stádium onemocnění, nebo zda by IL-6 mohl být specifickým ukazatelem pro zánětlivá onemocnění střev. Sérové hladiny IL-6 se zvyšuje jak u Crohnova choroby, tak i u ulcerózní kolitidy a hladiny korelují se stavem onemocnění (Holtkamp, W. a kol., J. Clin. Gastroenterology (1995) 20, 123 až 126, Niederau, C. a kol., Hepatogastroenterology (1997) 44, 90 až 107). Stanovení množství mRNA IL-6 ve stání pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce) odhalilo, že dobře koreluje se stádiem onemocnění c

-1 CZ 297083 B6 (Stevens, C. a kol., Dig. Dis. Sci. (1992), 37, 818 až 826). Byl zkoumán mechanismus zvýšení tvorby IL-6 během aktivní fáze zánětlivého onemocnění střeva a bylo zjištěno, že množství produkce, pokud jsou mononukleámí buňky ve vrstvě lamina propria stimulovány mitogenem Pokeweed, dobře koreluje s klinickým stavem onemocnění (Reinicker, H.-C. a kol., Clin. Exp. Imunol (1993) 94, 174 až 181).

Proto byla studována korelace mezi produkcí IL-6 a klinickým stavem onemocnění v kultuře mononukleárních buněk získaných z vrstvy lamina propria a ve tkáňové kultuře sliznice pacientů. U předchozího případu bylo také prokázáno, že se také ve slizniční tkáni zvyšuje počet buněk, které produkují IL-6. Makrofázy jsou nej důležitějšími buňkami mezi mononukleámími buňkami, které produkují IL-6. Bylo potvrzeno, že se vyskytuje velký počet CD 68 pozitivních makrofágů, které intenzivně produkují IL-6 v lamina propria a pacientů d chronickým zánětlivým onemocněním střeva, kteří jsou v aktivním stádiu choroby. (Kusugami, K. a kol., Dig. Dis. Sci. (1995), 40, 949 až 959).

Bylo také zjištěno, že produkce IL-6 koreluje s endoskopickým nálezem u pacientů s Crohnovou chorobou (Reimund, J. - M. a kol., Gut (1996) 39, 684 až 689). Dále existují některé práce, že nejenom IL-6, ale i sérové koncentrace IL-6 receptorů dobře korelují s klinickým stádiem onemocnění (Mitsuyama, K. a kol., Gut (1996), 36, 45 až 49).

Co se týká jiných mediátorů zánětu než IL-6, je známo, že množství produkce IL-Ιβ koreluje také s klinickým stádiem onemocnění. Na druhé straně, toto neplatí vždy pro INF-α, kde množství produkce má tendenci se zvyšovat u klinického stádia s nízkou aktivitou onemocnění. (Reinecker, H.-C. a kol., Clin. Exp. Immunol. (1993) 94, 174 až 181, Reimund, J.-M. a kol., Gut (1996)39, 684 až 689).

Současný způsob léčby zánětlivého onemocnění střeva zahrnuje kombinaci dietního režimu a předepsaného léčiva, které obsahuje salazosulfapyridin, glukokortikoidy apod. Avšak i u těchto léků jsou pacienti, kteří je netolerují pro jejich vedlejší účinky, a proto se vyskytují problémy s dlouhodobým podáváním.

Na druhé straně probíhají klinické studie, u kterých je použit nový druh léčby zánětlivého onemocnění střeva, u kterého se projevy onemocnění zmírňují inhibicí cytokinové aktivity. Hlavním cílem jsou IL-1 a TNF-α ,Van Deventer, S. J. H. Gut (1997) 40, 443 až 448); pro IL-1 je to antagonista IL-1 receptorů (Cominelli F. a kol. Gastroenterology (1992) 103, 65 až 71) a inhibitor IL-1, CGP47969A (Casini-Raggi a kol., Gastroenterology (1995) 109, 812 až 818) a podobně jsou právě sledovány na úrovni klinického nebo experimentálního pokusu na zvířatech. Pro TNF-α se pacientům s Crohnovou chorobou podávala specifická monoklonální protilátka, u které byla pozorována snížená aktivita a vyléčené vředové léze. (Van Dullemen, Η. M. a kol. Gastrenterology (1995) 109, 129 až 135). Není však známo, zda-li antagonista IL-6 může léčit zánětlivé onemocnění střeva tím, že specificky potlačí biologickou aktivitu IL-6.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou použití antagonisty interleukinu-6 (IL-6) pro přípravu preventivního nebo terapeutického činidla u zánětlivého onemocnění střeva.

Předmětem tohoto předkládaného vynálezu je tedy poskytnout preventivní nebo terapeutické činidlo pro zánětlivá onemocnění střev.

Proto předkládaný vynález poskytuje (1) preventivní nebo terapeutické činidlo pro zánětlivé onemocnění střeva, které obsahuje jakožto aktivní přísadu antagonistu IL-6.

-2CZ 297083 B6

Předkládaný vynález také poskytuje (2) preventivní nebo terapeutické činidlo pro zánětlivé onemocnění střeva, které obsahuje jakožto aktivní přísadu protilátku proti IL-6 receptoru.

Předkládaný vynález také poskytuje (3) preventivní nebo terapeutické činidlo pro zánětlivé onemocnění střeva, které obsahuje jakožto aktivní přísadu monoklonální protilátku proti IL-6 receptoru.

Předkládaný vynález také poskytuje (4) preventivní nebo terapeutické činidlo pro zánětlivé onemocnění střeva, které obsahuje jakožto aktivní přísadu monoklonální protilátku proti lidskému IL-6 receptoru. Monoklonální protilátkou proti lidskému IL-6 receptoru je s výhodou PM-1 protilátka.

Předkládaný vynález také poskytuje (5) preventivní nebo terapeutické činidlo pro zánětlivé onemocnění střeva, které obsahuje jakožto aktivní přísadu monoklonální protilátku proti myšímu IL6 receptoru. Monoklonální protilátka proti myšímu IL-6 receptoru je s výhodou protilátka MR16-1.

Předkládaný vynález také poskytuje (6) preventivní nebo terapeutické činidlo pro zánětlivé onemocnění střeva, které obsahuje jakožto aktivní přísadu rekombinantní protilátku proti IL-6 receptoru. Rekombinantní protilátka proti IL-6 receptoru obsahuje s výhodou konstantní oblast (oblast C) lidské protilátky.

Předkládaný vynález také poskytuje (7) preventivní nebo terapeutické činidlo pro zánětlivé onemocnění střeva, které obsahuje jakožto aktivní přísadu chimérovou nebo humanizovanou protilátku proti IL-6 receptoru.

Předkládaný vynález také poskytuje (8) preventivní nebo terapeutické činidlo pro zánětlivé onemocnění střeva, které obsahuje jakožto aktivní přísadu humanizovanou protilátku PM-1.

Současný vynález také poskytuje (9) preventivní nebo terapeutické činidlo pro Crohnovu nemoc nebo ulcerózní kolitidu, které obsahuje jakožto aktivní přísadu antagonistu IL-6 jak je výše uvedené od (1) do (8).

Současný vynález také poskytuje (10) činidlo k potlačování úbytku hmotnosti u zánětlivého onemocnění střeva. Zmíněné činidlo obsahuje jakožto aktivní přísadu antagonistu IL-6, jak je výše uvedeno (1) až (8).

Současný vynález také poskytuje (11) činidlo k potlačování úbytku hmotnosti u zánětlivého onemocnění střeva. Zmíněné činidlo obsahuje jakožto aktivní přísada antagonistu IL-6, jak je výše uvedeno (3) až (8).

Podrobný popis vynálezu

Antagonisté IL-6, které jsou použity v tomto vynálezu, mohou být jakéhokoliv původu, jakéhokoliv druhu a jakékoliv formy, pokud mají preventivní nebo terapeutický účinek na zánětlivé onemocnění střeva nebo účinek na potlačování úbytku hmotnosti u zánětlivého onemocnění střeva.

Antagonisté IL-6 blokují signální transdukci IL-6 a tím inhibují biologickou aktivitu IL-6. Jakožto antagonisté IL-6 se s výhodou uvádějí protilátky anti-IL-6, protilátky proti IL-6 receptoru, anti-gpl30 protilátky, alterovaný IL-6, alterovaný rozpustný IL-6 receptor, parciální peptid IL-6 nebo peptid IL-6 receptoru látky s nízkou molekulovou hmotností, které mají stejnou aktivitu jako tyto látky.

-3CZ 297083 B6

Protilátky anti-IL-6, které jsou použity v tomto vynálezu, se mohou získat známým způsobem jako polyklonální nebo monoklonální protilátky. Jako protilátky anti-IL-6, které jsou použity v tomto vynálezu, jsou upřednostňovány jejich monoklonální protilátky, zvláště savčího původu. Mezi monoklonální protilátky savčího původu patří ty, které se vyrábějí pomocí hybridomů, a rekombinantní protilátky, které jsou produkovány hostitelskou buňkou, která je transformována pomocí expresního vektoru obsahujícího geneticky upravené protilátkové geny. Tyto protilátky, přes vazbu na IL-6, blokují navázání IL-6 na receptor IL-6 a tím blokují signální transdukci biologické aktivity IL-6 na buňku.

Mezi takovéto protilátky patří například MH166 (Matsuda a kol., Eur. J. Immuno. (1988) 18, 951 až 956) a protilátky SK2 (Sáto, K. a kol., The 21^st Nihon Mennekigakkai Soukai (Generál Meeting of the Japan Immunology Society), Academie record (1991) 21, 166) apod.

Hybridom produkující protilátky anti-IL-6 může být v podstatě vytvořen známým postupem, jak je popsáno níže. IL-6 se může proto použít jako senzibilizační antigen běžným způsobem imunizace. Imunizované buňky takto získané se spojují se známými mateřskými buňkami konvenčním způsobem buněčné fúze. Pro přípravu požadovaného hybridomů se potom buňky, které produkují monoklonální protilátky, zachycují běžným sereeningovým způsobem.

Zvláště protilátky anti-IL-6 se mohou získávat následujícím způsobem. Například lidský IL-6 pro použití jakožto senzibilizující antigen k získání protilátky se získává použitím sekvence aminokyselin genu IL-6, popsané v Eur. J. Biochem (1987) 168, 543 až 550, J. Immuno, (1988), 140, 1534 až 1541, nebo v Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685 až 2688.

Poté, co je vhodná hostitelská buňka transformována vložením sekvence genu IL-6 do známého vektoru genové exprese, se protein IL-6 se purifíkuje z hostitelské buňky nebo z tkáňového supernatantu. Purifíkovaný protein IL-6 se může použít jako senzibilizující antigen. Alternativně se může použít jako senzibilizující antigen protein vytvoření fúzí proteinu IL-6 s jiným proteinem.

Protilátky proti IL-6 receptoru pro použití v tomto vynálezu se mohou získat známým způsobem jakožto polyklonální nebo monoklonální protilátky. Jako protilátky anti-IL-6 pro použití v tomto vynálezu jsou upřednostňovány monoklonální protilátky zejména savčího původu. Mezi monoklonální protilátky zejména savčího původu patří ty, které jsou produkovány hybridomy a ty, které jsou produkovány hostitelskou buňkou, která byla transformována pomocí expresního vektoru, který obsahuje geneticky upravené geny protilátek. Protilátky přes navázání na IL-6 receptor inhibují vazbu IL-6 na IL-6 receptor a tím blokují přenos biologické aktivity IL-6 do buňky.

Mezi příklady takovýchto protilátek patří MR16-1 protilátky (Tamura, T., a kol., Froc. Nati. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924 až 11928), PM-1 protilátky (Hirata a kol., J. Immunology (1989) 143, 2900 až 2906), nebo AUK12-20 protilátky, AUK64-7 protilátky nebo AUK146-15 protilátky (International Patent Publication WO 92 /19759) apod. Z nich jsou nejvíce upřednostňovány protilátky PM-1.

Hybridomová buněčná linie, která produkuje protilátky PM-1, byla mezinárodně uložena podle Budapešťské dohody jako PM-1 dne 10. července 1990 u National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-2298. Hybridomová buněčná linie, která produkuje protilátky MR16-1, byla mezinárodně uložena podle Budapešťské dohody MR16-1 dne 13. března, 1997 u National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-5875.

Hybridomy, které produkují monoklonální protilátky proti IL-6 receptoru, mohou být v podstat vytvořeny použitím známého postupu, jak je popsáno níže. Proto se používá běžným způsobem

-4CZ 297083 B6 imunizace jako senzibilizující antigen receptoru IL-6. Takto získané imunizované buňky se nechají fúzovat se známými mateřskými buňkami běžným způsobem buněčné fúze a potom se pro přípravu požadovaného hybridomu buňky zjišťují běžnou screeningovou metodou.

Protilátky proti IL-6 receptoru se mohou připravovat následujícím způsobem. Například jako senzibilizující antigen se použije lidský IL-6 receptor pro získání protilátky, která se získá za použití genové sekvence receptoru IL-6/aminokyselinové sekvence popsané v European Patent Application EP 325474, a myší IL-6 receptor může být získán tak, jak je to popsáno v Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 3 (1991) - 155795.

Existují dva druhy proteinů IL-4 receptoru: IL-6 receptor exprimovaný na buněčné membráně a IL-6 receptor izolovaný z buněčné membrány (solubilní IL-6 receptor) (Yasukawa, K. a kol., J. Biochem. (1990) 108, 673 až 676). Protilátky proti solubilnímu IL-6 receptoru se v podstatě skládají z mimobuněčné oblasti IL-6 receptoru navázaného na buněčnou membránu a tím se odlišují od IL-6 receptoru navázaného na buněčnou membránu tak, že ten druhý neobsahuje transbuněčnou oblast anebo jak transbuněčnou oblast, tak i nitrobuněčnou oblast. Jako protein IL-6 receptoru se může použít jakýkoliv IL-6 receptor, pokud se může použít jako senzibilizující antigen pro tvorbu protilátek proti IL-6 receptoru pro použití v tomto vynálezu.

Poté, co se genová sekvence vloží do známého expresního vektorového systému, aby došlo k přeměně příslušné hostitelské buňky, požadovaný protein IL-6 receptoru se purifíkuje známým způsobem buď z hostitelských buněk, nebo ze supematantu jejich kultury. Takto purifíkovaný protein IL-6 receptoru se může použít jako senzibilizující antigen. Jinak se také mohou jako senzibilizující antigeny použít buňky, které mají exprimovaný IL-6 receptor nebo protein vzniklý fúzí proteinu IL-6 receptoru s jiným proteinem.

E. coli která obsahuje plazmid pIBIBSF2R, který obsahuje cDNA kódující lidský IL-6 receptor byla mezinárodně uložena podle Budapešťské dohody jako HB101-pIBIBSF2R dne 9. ledna 1989 u National Institute fo Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-2232.

Protilátky anti-gp 130, které se používají v tomto vynálezu, se mohou získávat jako známým způsobem jako monoklonální nebo polyklonální. Jako protilátky anti-gpl30, které se používají v tomto vynálezu, jsou upřednostňovány jako monoklonální protilátky zvláště savčího původu. Mezi monoklonální protilátky savčího původu patří ty, které jsou produkovány hybridomy, a ty, které jsou produkovány hostitelskou buňkou, která byla transformována pomocí expresního genu, který obsahuje geneticky upravené geny protilátek. Protilátky inhibují přes navázání na gpl30 vazbu navázání gpl30 na komplex IL-6/IL-6 receptor a tím blokují přes biologické aktivity IL-6 do buňky.

Mezi takovéto protilátky patří například protilátky AM64 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 3 (1991) - 219894), protilátky 4B11 a protilátky 2H4 (US 5571513), protilátky BS12 a protilátky B-P8 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 3 (1991) - 291199).

Hybridomy, které produkují monoklonální protilátky, se mohou vytvořit v podstatě při použití známého postupu, jak je popsáno níže. Antigen gpl30 se může použít jako senzibilizující antigen a používá se pro imunizaci v běžným způsobu imunizace. Takto získané imunizované buňky se nechají fúzovat se známými mateřskými buňkami podle běžného postupu buněčné fúze a hybridomy, které produkují monoklonální protilátky se zachycují běžnou screeningovou metodou pro přípravu požadovaného hybridomu.

Zvláště monoklonální protilátky mohou být získány následujícím způsobem. Například gpl30, který se používá jako senzibilizující antigen pro produkci protilátek, se získává z genové sekvence gpl30 popsané v European Patent Application EP 411946.

-5CZ 297083 B6

Poté, co se genové sekvence gpl30 vloží do známého expresního vektorového systému, je vhodná hostitelská buňka tímto vektorovým systémem transformována na protein gpl30 se purifíkuje z hostitelské buňky nebo ze supematantu jejich kultury.

Purifikovaný protein gpl30 receptoru se může použít jako senzibilizující antigen. Jinak se může jako senzibilizující antigen použít protein gpl30 proteinu fúzovaný s jiným proteinem.

I když neexistuje zvláštní omezení, kteří savci mohou být imunizováni pomocí senzibilizujícího antigenu, při výběru pro buněčnou fúzi jsou upřednostňovány druhy s ohledem na jejich kompatibilitu s mateřskou buňkou. Mezi takovéto druhy například patří hlodavci, jako například myši, krysy, křečci apod.

Imunizace zvířat pomocí senzibilizujícího antigenu se provádí známou metodou. Mezi obecné metody například patří nitrobřišní nebo podkožní podání senzibilizujícího antigenu savcům. Senzibilizující antigen, který se naředí a suspenduje v příslušném množství fyziologického roztoku pufrovaného fosfátovým pufrem (PBS) nebo ve fyziologickém roztoku atd., se podle potřeby míchá a příslušným množstvím běžného adjuvancia, například Freudova kompletního adjuvancia. Po emulgaci se přednostně podává savcům několik každé 4 dny až 21 dnů. Alternativně se může při imunizaci použít spolu se senzibilizujícím antigenem vhodný nosič.

Po imunizace a potvrzení vzestupu titru požadovaných protilátek v séru, se ze savce odstraní imunizované buňky a použití se k buněčné fúzi. Mezi imunizované buňky, které jsou upřednostňovány, patří zvláště buňky sleziny.

Savčí myelomové buňky stejně jako další mateřské buňky, které se používají při buněčné fúzi výše uvedených imunitních buněk, s výhodou patří mezi různorodé známé buněčné linie, jako například p3X63Ag8.653) (Keamey, J.F. a kol. J. Immunol. (1979) 123: 1548 až 1550), P3X63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology), (1978), 81 „ 1 až 7), NS-1 (Kohler, G. a Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511 až 519), MPC-11 (Margulies, D. H. a kol., Cell (1976) 8: 405 až 415), SP 2/0 (Shulman, M. a kol., Nátuře (1978) 276: 269 až 270), FO (de St. Groth, S.F. a kol., J. Immunol. Methods (1980) 35“ 1 až 21. (Trpwbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313 až 323), R210 (Galfre, G. a kol., Nátuře (1979) 277: 131 až 133) apod.

Buněčná fúze mezi výše uvedenými imunizovanými buňkami a myelomovými buňkami se provádí podle známé metody, kterou popisuje Milstein a kol., (Kohler, G. a Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3 až 46) apod.

Speciálněji se buněční fúze provádí v běžném živném bujónu za přítomnosti například urychlovače buněčné fúze. Jako urychlovač buněčné fúze se může použít například polyethylenglykol (PEG), Sendai virus (HVJ) apod. Navíc se pro zvýšení účinnosti buněčné fúze může přidat adjuvant, jako například dimethylsuífoxid.

Poměr imunizovaných buněk ku myelomovým buňkám je s výhodou například takový, že i 1 až 1 Okřát více imunizovaných buněk než myelomových buněk. Mezi kultivační média, která se používají pro výše uvedenou buněčnou fúzi, patří například médium RPMI1640 a kultivační médium MEM, která jsou vhodná pro růst výše uvedených myelomových buněčných linií, dále buněčné kultivační médium používané pro tento druh buněčné fůze a náhrada séra, jako je například fetální telecí sérum (FCS).

Při buněčné fúzi plánované množství výše uvedených imunizovaných buněk a myelomových buněk se dobře promíchá ve výše uvedeném kultivačním médiu, ke kterému se přidá roztok PEG, který se před tím zahřeje na teplotu 37 °C, například roztok PEG s průměrnou molekulovou hmotností 1000 až 6000, který se přidá v koncentraci 30 až 60 % (hmotnost/objem) a smíchá se tak, aby byly získány požadované fúzované buňky (hybridomy). Poté se opakuje přidávání vhod-6CZ 297083 B6 ného kultivačního média a centrifugace, aby se odstranil supematant, činidla buněčné fúze apod., které jsou nežádoucí pro růst hybridomů.

Zmíněné hybridomy jsou vybrány zběžného výběrového média, například HAT médium (kultivační médium obsahující hypoxantin, aminopterin a thymidin). Kultivace v HAT médiu pokračuje obecně po dobu, která je dostačující k účinnému usmrcení jiných buněk, než jsou požadované hybridomy (nefúzující buňky). Obecně je tato doba několik dní až několik týdnů. Provádí se běžná metodika limitního ředění tak, že hybridomy produkují požadované protilátky a ty jsou zachycovány a klonovány.

Další možností získat výše uvedené hybridomy imunizací zvířete jiným než lidským antigenem je možnost senzibilizovat lidské lymfocyty ve zkumavce pomocí požadovaného antigenu nebo pomocí buněk exprimujících požadovaný antigen.

Výsledné senzibilizované B lymfocyty se nechají fúzovat s lidskými myelomovými buňkami, například U266, aby se získala požadovaná lidská protilátka, která se vyznačuje schopností navázat se na požadovaný nebo na buňky exprimující požadovaný antigen (viz Japanese Post-examined Patent Publication (Kokoku) 1 (1989) - 59787). Mimo to transgenní zvíře, které má repertoár všech genů pro lidské protilátky, se nechá imunizovat pomocí antigenu nebo pomocí buněk exprimujících antigen, aby se získala požadovaná lidská protilátka výše popsanou metodou (viz Intemational Patent Publication WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 a WO 96/33735).

Hybridomy produkující monoklonální protilátky takto vytvořené se mohou nechat kultivovat v běžném kultivačním médiu, nebo se mohou uchovat po delší časové období v tekutém dusíku.

Aby se ze zmíněného hybridomů získaly monoklonální protilátky, používá se metoda, při které se zmíněný hybridom nechal kultivovat běžným způsobem a protilátka se získá ze supematantu. Nebo se používá metoda,n při které se nechá hybridom růst v těle savce, který je kompatibilní se zmíněným hybridomem a protilátka se získá z ascitické tekutiny. Ta dříve uvedená metoda je vhodná pro zisk vysoce čisté protilátky, zatímco ta druhá je vhodná pro tvorbu protilátek širokého rozsahu.

Specificky se hybridom produkující protilátky proti IL-6 receptoru mohou připravovat za použití metody, která je popsána v Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 3 (1989) - 139293. Tato příprava se může provádět způsobem podle kterého se hybridom produkující PM-1 protilátky, který byl mezinárodně uložen podle Budapešťské dohody jako FERM BP-2998 dne 10. července 1990 u national Institute of Bioscience and Human Technollogy, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukaba-shi, Ibaraki před., Japan, injekčně vpraví do nitrobřišní dutiny myši BALB/c, aby se získal acietes, ze kterého se purifikuje PM-1 protilátka. Nebo se provádí způsobem, při kterém se nechá zmíněný hybridom kultivovat ve vhodném kultivačním médiu, jako je například RPMI1640 médium, které obsahuj 10% fetální hovězí sérum a 50 BM-Condimed (vyráběný firmou Boehringe Mannheim), médium SFM (vyráběné firmou GIBCO-BRL), médium PFHM-II (vyráběné firmou GIBCO-BRL), apod. Protilátka PM-1 se purifikuje ze supematantu.

Rekombinantní protilátka, která byla vytvořena genovou rekombinační technologií, u které se gen protilátky klonuje z hybridomů a začleňuje do vhodného vektoru, který transformuje hostitelské buňky, se může použít v tomto vynálezu jako monoklonální protilátka (viz například Borrebaeck C.A. K., a Larrick J.W. Therapeutic Monoclonal Antibodies, publikováno ve Spojeném království firmou Macmillian Publishers, ltd. 1990).

Specificky mRNA kódující variabilní oblast (V) požadované protilátky se izoluje z buněk produkujících protilátky jako je hybridom. Izolace mRNA se provádí tak, že se připraví celková RNA, za použití například známé metody jako je guanidinová ultracentrifugační metoda (Chirwin, J. M.

-7CZ 297083 B6 a kol., Biochemistiy (1979) 18, 5294 až 5299), metoda AGPC (Chomczynski, P. a kol., Anal. Biochem. (1987) 162, 156 až 159). Potom se mRNA purifikuje z celkové RNA za použití mRNA purifíkační soupravy (vyráběné firmou Pharmacia) apod. Alternativně se může mRNA připravit přímo za použití purifíkační soupravy Quick Prep mRNA Purrification Kit (vyráběné firmou Pharmacia).

cDNA oblasti V protilátky se může syntetizovat z mRNA za použití reverzní transkriptázy. cDNA se může nechat syntetizovat za použít testovací soupravy AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Syntesis Kit apod. Alternativně se pro syntézu a amplifíkaci cDNA používá 5'-Ampli FINDER RACE Kit (vyráběný firmou Clontech) a metoda 5-RACE (Frohman, M.A. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1988), 85, 8998 až 9002; Balyavsky, A. a kol., Nucleic Acid Res. (1989) 17, 2919 až 2932), která zahrnuje polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Požadovaný fragment DNA se purifikuje ze získaného výsledného PCR produktu a může být navázán na vektorovou DNA. Navíc rekombinantní vektor se z ní připravuje a transformuje do E. coli atd., z něhož se vyberou kolonie pro přípravu požadovaného rekombinantního vektoru. Sekvence nukleotidů požadované DNA se potvrdí známou metodou, jako je například dideoxy metoda.

Jakmile se jednou získá DNA kódující V oblast požadované protilátky, může se navázat na DNA kódující konstantní oblast (C oblast) požadované protilátky, která se potom integruje do expresního vektoru. Alternativně se může DNA kódující V oblast protilátky integrovat do expresního vektoru, který již obsahuje DNA kódující C oblast protilátky.

Pro přípravu protilátky pro použití v tomto vynálezu se gen protilátky integruje jak je níže popsáno do expresního vektoru tak, že je kontrolovatelně exprimován exprimační regulační oblastí, například pomocí posilovače a/nebo promotéru. Následně se expresní vektor může transformovat do hostitelské buňky a tam potom může být protilátka exprimována.

V souladu s tímto vynálezem se používají uměle alterované rekombinantní protilátky jako jsou například chimérické protilátky a humanizované protilátky za účelem snižování heterologní antigenicity proti člověku. Tyto alterované protilátky se připravují známými způsoby.

Chimérické protilátky se získávají navázáním takto vzniklé DNA kódující V oblast protilátky na DNA kódující C oblast lidské protilátky, která se integruje do expresního vektoru a transformuje do hostitelských buněk, aby se v nich tvořily protilátky (viz European Patent Application EP 125023, a International Patent Publication WO 92/19759). Za použití této známé metody se může získat chimérická protilátka užitečná pro tento vynález.

Například plazmid, který obsahuje DNA kódující L řetězec V oblasti nebo H řetězec V oblasti chimérické PM-1 protilátky byl navržen jako pPM-k3 nebo pPM-hl. E. coli obsahující plazmid, který byl mezinárodně uložen podle Budapešťské dohody jako NCIMB 40366 a NCIMB 40362 dne 11. února, 1991 u National Collections of Industrial and Marině Bacterial Limited.

Humanizovaná protilátka, která se také nazývá přeformovaná lidská protilátka, se připravuje transplantováním komplementaritu určujících oblastí (CDR) protilátky savce jiného než člověka, například myší protilátky na CDR lidské protilátky. Obecná rekombinantní DNA technologie pro přípravu takových protilátek je také známa (viz European Patent Application EP 125023 a International Patent Publication WO 92/19759).

Specificky se sekvence DNA, která byla navržena pro navázání CDR smyší protilátkou se strukturálními oblastmi lidské protilátky, syntetizuje z několika oddělených oligonukleotidů, které mají na svých koncích části překrývající se sjinými. Takto získaná DNA se naváže na DNA kódující C oblast lidské protilátky a potom se začlení do expresního vektoru, který se transformuje do hostitelských buněk, aby se vytvářely protilátky (viz European Application EP 239400 a International PatentPublication WO 92/19759).

-8CZ 297083 B6

Pro strukturální oblastí FR lidské protilátky navázané na CDR se vybírá CDR, který utváří strukturu vážící příhodný antigen. Když je to žádoucí, mohou se aminokyseliny ve strukturální oblasti variabilní části protilátky nahradit tak, že CDR přeměněné lidské protilátky může vytvářet strukturu vážící příslušný antigen (Sáto, K. a kol., Cancer Res. (1993) 53, 851 až 856).

Například pro chimérickou nebo humanizovanou protilátku se používá C oblast lidské protilátky. Jako C oblast lidské protilátky stojí za zmínku Cy, může se například použít Cyl, Cy2, Cy3 a Cy4. C oblast lidské protilátky může být modifikována, aby se zlepšila stabilita protilátky nebo její produkce.

Chimérická protilátka se skládá z variabilní oblasti protilátky odvozené od savce jiného než člověk, zatímco humanizovaná protilátka se skládá z komplementaritu určující oblasti protilátky, odvozené od savce jiného než člověk a ze strukturálních oblastí a z C oblasti protilátky odvozené od lidské protilátky. Díky tomu byla tedy jejich antigenícita v lidském těle snížena tak, že se mohou používat jako protilátky pro použití v tomto vynálezu.

Upřednostňovaná složka humanizované protilátky pro použití v tomto vynálezu obsahuje humanizovanou PM-1 protilátku (viz Intemational Patent Publiccation WO 92/19759).

Geny protilátek vytvořené tak, jak je výše popsáno mohou být exprimovány a výsledný produkt se získá známými způsoby. V případě savčích buněk může být exprese genu doprovázena použitím vektoru, který obsahuje tradičně používaný užitečný promotér, gen protilátky, který má být exprimován a DNA, u které póly A signál je navázán na 3' konec po směru nebo vektor, který obsahuje zmíněnou DNA. Mezi příklady promotéru/enhanceru patří lidský cytomegalovirový bezprostřední časný promotér/enhancer.

Navíc se v tomto vynálezu může použít promotér/enhancer, který se používá k expresi protilátky. Mezi takové patří například virové promotéry/enhancery jako jsou například retrovirus, polyoma virus, adenovirus a símian virus 40 (SV 40) a promotéry/enhancery odvozené od savčích buněk jako například lidský elongační faktor la (HEFla).

Exprese může být například snadno dosaženo metodou podle Mulligana a kol. pokud se používá SV40 promotéru/enhanceru (Mulligan, a R. C. a kolk., Nátuře (1979) 277, 108 až 114) nebo metodou podle Mizushima a kol. (Mizushima, S. a Nagata, S. Nucleic Acid Res. (1990) 18, 5332), pokud se používá promotéru/enhanceru HEFla.

V případě E. coli se exprese provádí vazbou běžného promotéru, signální sekvenci pro sekvenci protilátek, na gen protilátky, který má být exprimován na následnou jejich expresí.

Jako promotér se může použít například lacz promotér a araB promotér. Tato metoda podle Warda a kol. (Ward, E. S. a kol., Nátuře (1989) 341, 544 až 546; Ward E. S. a kol. FASEB J. (1992), 6, 2422 až 2427) se používá, když se použije lacz promotér a metoda podle Bettera a kol. (Better, M. a kol., Science (1988), 240, 1041 až 1043) se používá, když se použije araB promotér.

Jako signální sekvence pro sekreci protilátek, když jsou produkovány v pariplazmě E. coli, se může použít signální sekvence pelB (Lei, S.P. a kol., J. Bacteriol, (1987) 169, 4379 až 4383). Po oddělení protilátek nahromaděných v periplazmě se znovu před použitím upraví jejich struktura, (viz například WO 96/30394).

Jako začátek replikace mohou být použity ty, které jsou odvozené od SV40, polyoma viru, adenoviru, hovězího papillomaviru (BPV) apod. Dále kamplifíkaci počtu genových kopií v hostitelském buněčném systému mohou expresní vektoiy obsahovat jako volitelné markéry gen aminoglykosidfosfotransferázy (APH), gen thymidinkinázy (TK), gen xantinguanidinfosforibosyntrasferázy E. coli (Ecogpt), gen dihydrofolátreduktázy (dhfr) apod.

-9CZ 297083 B6

K produkci protilátky pro použití v tomto vynálezu se používá jakéhokoliv produkčního systému. Produkční systém. Produkční systém přípravy protilátek zahrnuje produkční systém v organismu (in vivo) nebo ve zkumavce (in vitro). Jako produkční systém přípravy protilátek ve zkumavce (in vitro) stojí za zmínku produkční systém, ve kterém se používají eukaryotické buňky v produkční systém, ve kterém se používají prokaryotické buňky.

Pokud se používají eukaryotické buňky, používá se produkční systém, který zahrnuje živočišné buňky, rostlinné buňky a buňky hub. Mezi známé živočišné buňky patří (1) savčí buňky, jako jsou například buňky CHO, buňky COS, myelomové buňky, buňky ledviny mláděte křečka (BHK), HaLa buňky a Věro buňky, (2) buňky obojživelníků, jako jsou například vajíčka Xenopus, nebo (3) buňky hmyzu, jako jsou například sf9, sf21 a Tn5. Mezi známé rostlinné buňky patří například ty, které jsou odvozeny od Nicotiana tabacum. Mezi známé buňky hub patří kvasnice, jako je například rod Saccharomyces, specifičtěji Saccharomycs cereviceae nebo vláknité houby, jako je například rod Aspergillus, specifičtěji Aspergillus niger.

Pokud se používají prokaryotické buňky, používá se produkční systém, který zahrnuje bakteriální buňky. Mezi známé bakteriální buňky patří Escherichia coli (E. coli) a Bacillus subtilis.

Protilátky se získávají transformací genu pro požadovanou protilátku do buněk a následnou kultivací transformovaných buněk ve zkumavce. Kultivace se provádí známým způsobem. Jako kultivační médium se například používá DMEM, MEM, RPMI 1640 a IMDM a mohou se kombinovat se sérovými náhradami, jako je například fetální telecí sérum (FCS). Kromě toho se mohou protilátky tvořit v organizmu (in vivo) pomocí injekce buněk transformovaných genem protilátky do dutiny břišní zvířete apod.

Jako produkční systémy přípravy protilátek v organismu (in vivo) stojí za zmínku ty, u kterých se používají živočichové a rostliny. Pokud se používají živočichové, produkční systémy obsahují savce a hmyz.

Jako savci se mohou používat kozy, prasata, ovce, myši a skot (Visky Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Jako hmyz se mohou použít housenky bource morušového.

Pokud se používají rostliny, může se například použít tabák.

Geny protilátek jsou transformovány do těchto živočichů nebo rostlin a v nich se tvoří protilátky, které se pak znovu získají. Pro přípravu fúzovaných genů se vloží například gen protilátky doprostřed genu kódujícího protein, který se vrozeně tvoří v mléce, jako je např. kozí β kasein. Fragmenty DNA, které obsahují fúzovaný gen, do kterého byl začleněn gen protilátky, se injekčně vpraví do kozího embiya a embryo se zavede do kozí samičky. Požadované protilátky se získává z mléka, které produkuje transgenická koza narozená koze, které bylo embryo potomka zavedeno. Aby se zvýšilo množství tvorby mléka obsahujícího požadovanou protilátku, které produkuje transgenická koza, podávají sejí příslušné hormony. (Ebert, K. M. a kol., Bio/Technology (1994) 12, 699 až 702).

Pokud se používají housenky bource morušového, nechají se infikovat baculovirem, do kterého byl vložen gen požadované protilátky, a požadovaná protilátka se získá z tělesné tekutiny housenky bource morušového (Meada, S. a kol., Nátuře (1985) 315, 592 až 594). Pokud se navíc použije tabák, gen požadované protilátky se vlož do expresního genu rostlin, například pMON 530 a tímto vektorem je infikována bakterie, jako je například Agrobacterium tumefacies. Potom se bakterie infikuje tabák, aby se z listů tabáku získaly požadované protilátky. (Jilian, K.-C. Ma a kol. Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131 až 138).

Pokud se protilátky produkují v produkční systému v organismu (in vivo) nebo ve zkumavce (in vitro), jak je uvedeno výše, DNA kódující těžké řetězce (H řetězce) nebo lehké řetězce

-10CZ 297083 B6 (L řetězce) protilátek se odděleně začlení do každého expresního vektoru a hostitelé jsou transformováni současně. Nebo DNA kódující těžké řetězce (H řetězce) nebo lehké řetězce (L řetězce) může být začleněna do jednotlivého expresního vektoru a hostitelé jsou transformováni současně. Nebo DNA kódující těžké řetězce (H řetězce) nebo lehké řetězce (L řetězce) může být začleněna do jednotlivého expresního vektoru a hostitel je jím transformován (viz intemational Patent Publication WO 94-11529).

Protilátky pro použití v tomto vynálezu mohou být buď fragmenty protilátek, nebo jejich modifikované verze, pokud jsou vhodné k použití. Jako fragmenty protilátek stojí za zmínku například Fab, F(ab')2, Fv nebo jednoduchý řetězec Fv (ScFv), u kterého jsou Fv těžkého nebo lehkého řetězce spojeny pomocí vhodného linkeru.

Protilátky jsou specificky upravovány pomocí enzymů, například papainu nebo pepsinu, aby produkovaly fragmenty protilátek. Nebo jsou geny kódující fragmenty protilátek vytvořeny a potom začleněny do expresního vektoru, kterýje exprimován na vhodné hostitelské buňce (viz například Co, M. S. a kol., J. Immunol. (1994) 152, 2968 až 2976; Better, M. a Horwitz, A. H., Methods in Enzymology (1989), 178, 476 až 496; Plueckthun, A. a Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 476 až 496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1986) 121, 652 až 663; Rousseaux, J. a kol., Methods in Enzymology (1986) 121, 663 až 669; Bird, R. E. a kol., TIBTECH (1991) 9, 132 až 137).

ScFv se může získat spojením V oblasti těžkého řetězce a V oblasti lehkého řetězce protilátky. V případě scFv, V oblast těžkého řetězce a V oblast lehkého řetězce jsou s výhodou spojeny přes spojku, s výhodou je to peptidová spojka (Huston, J. S. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879 až 5883). V oblast těžkého řetězce a V oblast lehkého řetězce u scFv mohou být odvozeny od kterékoliv výše uvedené protilátky. Jako peptidová spojka pro spojení V oblastí se může použít jakýkoliv peptid s jednoduchým řetězcem, která obsahuje například 12 až 19 aminokyselinových zbytků.

DNA kódující scFv se může získat, za použití DNA kódující H řetězec nebo H řetězec V oblasti výše uvedené protilátky a DNA kódující L řetězec nebo L řetězec V oblasti výše uvedené protilátky, jako šablona amplifikací části DNA kódující požadovanou sekvenci aminokyselin zvýše uvedených sekvencí pomocí techniky PCR spárem primer, kteří specifikují oba jejich konce a další amplifikací kombinace DNA kódující část peptidová spojky a páru primeru, který určuje oba konce míněné DNA napojené na těžké a lehké řetězce.

Jakmile je jednou vytvořena DNA kódující scFV, může se běžnými způsoby získat hostitel transformovaný zmíněným expresním vektorem, který tuto DNA obsahuje a scFv se může získat běžným způsobem za použití transformovaného hostitele.

Tyto fragmenty protilátek mohou být vytvořeny, pokud se získá jejich gen podobným způsobem, jaký je uveden výše a pokud je umožněno, aby byl gen exprimován u hostitele. Pojem „protilátka“, jak je uvedeno v patentovém nároku této patentové žádosti, zahrnuje tyto fragmenty protilátek.

Jako modifikované protilátky se mohou použít protilátky spojené s různorodými molekulami, jako je například polyethylenglykol (PEG). Pojem „protilátka“, jak je uvedeno v patentovém nároku této patentové žádosti, zahrnuje tyto modifikované protilátky. Tyto modifikované protilátky se mohou získávat chemickou modifikací takto získaných protilátek. Tyto metody už jsou v daném oboru zavedeny.

Protilátky produkované a exprimované, jak je výše uvedeno, se separují z vnitřku nebo z vnějšku hostitelské buňky a potom se purifikují, aby se dosáhlo jejich homogenicity. Separace a purifikace protilátek pro použití v tomto vynálezu se provádí afinitní chromatografií. Jako sloupce pro použití v té afinitní chromatografií se může použít sloupec proteinu A a sloupec proteinu G. Mezi

-11 CZ 297083 B6 nosiče použité u sloupce proteinu A patří například Hyper D, POROS, Sepharose F. F. apod. Mohou být použity i další alternativní metody separace a purifíkace protilátek bez jakéhokoliv omezení. Separace a purifíkace protilátek pro použití v tomto vynálezu se může dosáhnout kombinací chromatografíe jiné než výše zmíněné afínitní chromatografíe, filtrace, ultrafíltrace, 5 vysolování, dialýzy apod. Chromatografíe zahrnuje například iontoměničovou chromatografií, hydrofobní chromatografií, gelovou filtraci apod. Tyto chromatografíe mohou být aplikovány technikou HPLC. Alternativně se může použít HPLC s reverzní fází.

Koncentrace protilátek získaných výše uvedeným způsobem se určuje měřením absorbance nebo 10 pomocí metody ELISA apod. Pokud se použije měření absorbance, vzorek se vhodně naředí pomocí PBS (-) a absorbance se měří při vlnové délce 280 nm s následným výpočtem při použití absorpčního koeficientu 1,35 OD při 1 mg/ml. Pokud se použije metoda ELISA, měření se provádí tak, jak je níže uvedeno. 100 μΐ kozího antihumánního IgG (vyráběné firmou TABO) se naředí na 1 pg/ml. Pokud se použije metoda ELISA, měření se provádí tak, jak je níže uvedeno. 15 100 μΐ kozího antihumánního IgG (vyráběné firmou TÁGO) s naředí na 1 pg/ml v 0,1 M hydrogenuhličitanovém pufru, pH 9,6, a přidá se do 96jamkové plotny (vyráběné firmou Nunc) a nechá se inkubovat přes noc při teplotě +4 °C, aby se protilátky imobilizovaly. Po navázání se přidá 100 μΐ každé příslušně naředěné protilátky tohoto vynálezu nebo vzorku obsahujícího protilátku, nebo 100 μΐ lidské IgG (Vyráběného firmou CAPPEL) jakožto standardu a nechá se inkubovat 20 při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny.

Pro promytí se přidá 100 μΐ 5000x naředěné antihumánní protilátky značené alkalickou fosfatázou (vyráběné firmou BIO SOURCE) a nechá se inkubovat při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny. Po promytí se přidá roztok substrátu a nechá se inkubovat a následně se měří absorbance 25 při vlnové délce 405 nm za použití spektrometru MICROPLATE READER Model 3550 (vyráběné firmou Βίο-Rad), aby se mohla spočítat koncentrace požadované protilátky.

Pozměněný IL-6 pro použití v tomto vynálezu má schopnost navázat se na IL-6 receptor, ale nepřenáší biologickou aktivitu IL-6. Proto pozměněný IL-6, který soutěží s IL-6 o vazbu na 30 IL-6 receptor a nepřenáší biologickou aktivitu, blokuje transdukci signálu IL-6.

Pozměněný IL-6 vzniká provedením mutace tak, že se sekvence aminokyselin IL-6 nahradí zbytky aminokyselin. IL-6, zdroj modifikovaného IL-6, může být jakéhokoliv původu, ale pokud se rozhoduje o antigenicitě, používá se s výhodou lidský IL-6.

Sekundární struktura IL-6 se předpovídá pomocí známého programu pro molekulární modelování sekvence aminokyselin, například Whatif (Vriend a kol, J. Mol. Graphics (1990) 8, 52 až 56), a hodnotí se celkové účinky zbytků aminokyselin, které mají být nahrazeny. Poté, co se určí příslušný zbytek aminokyseliny, provede se mutace běžně používanou metodou polymerázové 40 řetězové reakce (PCR) s použitím vektoru, který obsahuje sekvence nukleotidů kódující lidský

IL-6 gen. Takto se získá gen kódující pozměněný IL-6. Tento se potom začlení dle požadavku do příslušného expresního vektoru, ze kterého se získá pozměněný IL-6 podle exprese, produkce a purifíkace zmíněné rekombinantní protilátky.

Specifické příklady pozměněného IL-6 popisuje Brakenhoff a kol., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86 až 93, a Savino a kol., EMBO J. (1994) 13, 1357 až 1367, WO 96-18648 a WO 96-17869.

Parciální peptidy IL-6 nebo receptoru IL-6 pro použití v tomto vynálezu mají schopnost navázat se na IL-6 receptor nebo na IL-6, ale nepřenášejí biologickou aktivitu IL-6. Proto se parciální 50 peptidy IL-6 nebo receptoru IL-6 navážou na IL-6 receptor nebo na IL-6 a tím ho obsadí. To vede k tomu, že nedochází k přenosu biologické aktivity IL-6 a blokuje se transdukce signálu IL-6.

-12CZ 297083 B6

Parciální peptidy IL-6 nebo receptoru IL-6 jsou peptidy, které obsahují některé nebo všechny sekvence aminokyselin oblasti, které se uplatňují při vazbě na IL-6 nebo receptor IL-6. Takovéto peptidy obecně obsahují 10 až 80 aminokyselinových zbytků, s výhodou 20 až 50, ještě výhodněji 20 až 40.

Parciální peptidy IL-6 nebo receptoru IL-6 se tvoří tak, že se specifikuje oblast sekvence aminokyselin IL-6 a IL-6 receptoru, která se uplatňuje při vazbě IL-6 a IL-6 receptor. Potom následuje produkce někteiých nebo všech sekvencí aminokyselin běžnou metodou, jako je technologie genového inženýrství nebo metoda peptidové syntézy.

Aby se vytvořily parciální peptidy IL-6 nebo receptoru IL-6 technologií genového inženýrství, DNA sekvence kódující požadovaný peptid se začlení do expresního vektoru, ze kterého se získává peptid pomocí exprese, produkce a purifikace zmíněné rekombinantní protilátky.

Produkce parciálního peptidu IL-6 nebo receptoru IL-6 pomocí metody peptidové syntézy se provádí za použití běžně užívané peptidové syntézy, jako je například syntéza na pevné fázi nebo syntéza v tekuté fázi.

Zvláště je vhodné použít metodu, kterou popisuje Zoku-lyakuhinno Kaithatsu (Sequel to Development od Pharmaceuticals), Vol. 14, Peputido Gousei (Peptide Synthesis), vydáno Haruaki Yajima, Hirokawa, Shoten, 1991. Použitá metoda syntézy v pevné fázi zahrnuje například reakci, při které se spojují aminokyseliny odpovídajícími C-konci peptidu, kteiý má být syntetizován, na nosič, který je nerozpustný v organických rozpouštědlech. Potom se aminokyselina, která má α-amino skupinu nebo funkční skupinu na boční řetězci, chráněnou pomocí příslušné protektivní skupiny, nechá zkondenzovat do jedné aminokyseliny najednou ve směru od C konce k N konci. Reakce, při které se zmíněná protektivní skupina α-amino skupiny aminokyseliny nebo peptidu spojuje s pryskyřicí se buď vypustí, nebo se opakuje tak, aby se prodloužil peptidový řetězec. Metody peptidové syntézy pevné fáze se dělí na metodu Boc a metodu Fmoc v závislosti na druhu použité protektivní skupiny.

Po dokončení syntézy požadovaného peptidu se provádí reakce, kdy se peptidový řetězec zbaví protektivní skupiny a nosiče. Pro odštěpení nosiče od peptidového řetězce se běžně používá fluorovodík nebo kyselina trifluormetansulfonová v případě metody Boc a TFA u metody Fmoc. U metody Boc se například výše zmíněná peptidová pryskyřice upravuje ve fluorovodíku za přítomnosti anizolu. Následně se odstraní proteiktivní skupina a peptid se obnoví tím, že se odštěpí nosič. Jeho lyofilizací se získá surový peptid. Na druhé straně u metody Fmoc se používá například TFA podobným způsobem, který je výše uveden, aby se provedlo odstranění protektivní skupiny a odštěpení nosiče od peptidu.

Takto získaný surový peptid se metodou HPLC separuje a purifikuje. Jeho promývání se provádí ve vodném acetonitrilovém rozpouštěcím systému, který se běžně používá k purifikaci proteinů za optimálních podmínek. Získaná frakce, která odpovídá vrcholu profilu, se shromáždí a lyofilizuje. Takto purifikovaná peptidová frakce se identifikuje pomocí stanovení molekulové hmotnosti na hmotnostním spektroskopu, pomocí analýzy skladby jednotlivých aminokyselina a analýza sekvence aminokyselin, apod.

Specifické příklady parciálního peptidu IL-6 nebo receptoru IL-6 jsou popsány v Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 2 (1990) - 188600, Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 7 (1995) - 324097, Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 8 (1996)- 311098 aUnited States Patent US 5 2100 075.

Aktivita antagonisty IL-6 pro použití v tomto vynálezu se stanoví za použití běžně známé metody. Zvláště se kultivuje buňka HM60.BSF2 závislá na IL-6, ke které se přidá IL-6 a aktivita se stanoví tak, že se začlení do buňky závislé na IL-6 ³H-thymidin za současné přítomnosti antagonisty IL-6. Alternativně se stanovení provádí kultivací U266, buňky exprimující IL-6 receptor

-13CZ 297083 B6 tak, že se kní přidá současně IL-6 značený pomocí ¹²⁵I a antagonista. Potom se určí IL-6 označený pomocí ¹²⁵I- navázaný na buňku exprimující IL-6 receptor. U výše uvedeného testovacího systému se navíc ke skupině obsahující antagonistu IL-6 připraví negativní kontrolní skupina, která neobsahuje žádného antagonistu IL-6. Výsledky získané z těchto skupin se potom porovnávají, aby se stanovila inhibiční aktivita antagonisty IL-6 receptoru.

Aby se potvrdily účinky, kterých bylo v tomto vynálezu dosaženo, antagonista IL-6 použitý v tomto vynálezu se podává zvířatům, u kterých se vyvinulo zánětlivé onemocnění střeva, pomocí injekce CD4-pozitivních a CD45RB-silně pozitivních buněk (CD4⁺CD45RB^hl8h cells) a hodnotí se účinnost při potlačování úbytku hmotnosti a zlepšení skóre zánětlivého onemocnění střeva. Další účinky tohoto vynálezu jsou snížené nechutenství, zmírnění bolesti břicha, zlepšení průjmů a prevence opětovného výskytu zánětlivého onemocnění střeva.

Buňky CD4⁺CD45RB^hlsh, které se přenesou do zvířat pomocí antagonisty IL-6, se izolují například pomocí metody uvedené níže v příkladech. Zvířata, ze kterých buňky CD4⁺CD45RB^hlgh pocházejí, jsou běžně používaná zvířata v experimentálních pokusech, jako jsou například myši nebo ktysy.

Jak je popsáno u příkladu níže, u živočichů, u kterých dojde k rozvoji zánětlivého onemocnění střev, podání protilátky proti IL-6 receptoru vede k potlačení úbytku hmotnosti a zlepšení skóre zánětlivého onemocnění střev. Tím bylo zjištěno, že antagonisté IL-6, jako jsou například protilátky proti IL-6 receptoru, se podílejí na terapeutickém účinku u zánětlivého onemocnění střev.

Jedinci, kteří byli určeni pro léčbu v tomto vynálezu, jsou savci. S výhodou byl vybrán člověk, jako jedinec určený k léčbě.

Preventivní nebo terapeutická činidla tohoto vynálezu se podávají buď ústy nebo parenterálně, celkově nebo lokálně. Používá se například nitrožilní injekce, jako je například podání infúze, nitrosvalová injekce, nitrobřišní injekce, podkožní injekce, čípky, proplachování střev, střevní potahované tablety pro podávání ústy apod. a způsob podání se vybírá podle věku a stavu nemocného. Účinná jednotlivá dávka se vybírá z rozmezí od 0,001 mg do 100 mg na kg tělesné hmotnosti. Alternativně se pohybuje jednotlivá dávka v rozmezí od 0 do 1000 mg, s výhodou od 5 do 50 mg.

Preventivní nebo terapeutická činidla pro zánětlivá onemocnění střev tohoto vynálezu mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné nosiče nebo přísady v závislosti na způsobu podání. Mezi takovéto nosiče nebo přísady patří například voda, farmaceuticky přijatelné organické rozpouštědlo, kolagen, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, polymer karboxyvinylu, sodná sůl karboxymethylcelulózy, sodná sůl polyakrylátu, sodná sůl alginátu, dextran rozpustný ve vodě, sodná sůl karboxymethylovaného škrobu, pektin, methylcelulóza, ethylcelulóza, xantanová pryskyřice, arabská pryskyřice, kasein, želatina, agar, diglycerin, propylenglykol, polyethylenglykol, vazelína, parafín, stearylalkohol, kyselina stearová, lidský sérový albumin (HSA), manitol, sorbitol, laktóza, farmaceuticky přijatelný surfaktant apod. Přísady se vybírají bez omezení z výše uvedených látek nebo jejich kombinací v závislosti na podávané formě.

Onemocněním určeným k léčbě tohoto vynálezu je zánětlivé onemocnění střev. Zánětlivé onemocnění střev zahrnuje ulcerózní kolitidu a Crohnovo onemocnění. Tato onemocnění se nejčastěji vyskytují u mladých lidí ve věku okolo 20 let a i v dnešní době je známo velmi málo o příčinných antigenech nebo o mechanismu zánětlivé patologie. Nicméně probíhá rozsáhlý výzkum různých buněk a cytokinů k jejich objasnění.

V průběhu posledních několika let byl zaznamenán pokrok v analýze buněk, které způsobují zánětlivé onemocnění střev. Je zřejmé, že se může vytvořit živočišný model zánětlivého onemocnění střev pomocí přesunu purifíkovaných CD4-pozitivních buněk, buněk CD45RB-silně pozitivních (CD4⁺CD45RB^hlgh) na imunodefícientní myš (SCID myš) (Morrissey, P.J. a kol., J. Exp.

-14CZ 297083 B6

Med. (1993) 178, 237 až 244; Leach, M. W. a kol., Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503 až 1515; Aranda, R. a kol., J. Imunol. (1997) 158, 3464 až 3473).

Na druhé straně se vykazuje, že CD4-pozitivní buňky, buňky CD45RB-slabě pozitivní (CD4⁺CD45RB^hlgh) nevyvolávají zánětlivé onemocnění střev a poněkud potlačují vyvolání zánětlivého onemocnění střev vyvolané pomocí CD4-pozitivních buněk, buněk CD45RB-silně pozitivních (Powrie, F.R. a kol., J. Exp. Med. (1994) 179, 589 až 600). Je známo, že množství exprese CD45RB na jednu buňku koreluje s produkcí cytokinů. Proto se má za to, že CD4-pozitivní buňky, buňky CE45RB-silně pozitivní, jsou pomocné buňky typu 1 (T helper cells - Thl), obdobně jako buňky, které produkují IFN-α a TNF-α, zatímco CD4-pozitivní buňky, buňky CD45RB-slabě pozitivní jsou pomocné buňky typu 2 (T helper cells - Th2), obdobně jako buňky, které produkují IL-4, IL-10 apod. (Lee, W. a kol. J. Immunol. (1990) 144, 3288 až 3295).

Proto se má za to, že vzplanutí zánětlivého onemocnění střev nej pravděpodobněji souvisí porušením rovnováhy Thl a Th2, a to potvrzuje i skutečnost, že chronický zánět střeva, který je obdobný lidské ulcerózní kolitidě, vzniká u myší s deficitem IL-10, vytvořeným pomocí genové metody. (Kuhn, R. a kol., Cell (1993), 75, 263 až 274).

Modelová zvířata, která se používají v příkladech, jsou v histologickém obraze tlustého střeva velmi podobná pacientům s ulcerózní kolitidou a Crohnovou chorobou (Leach, M.W. a kol. Am. J. Pethol. (1996) 148., 1503 až 1515). V případě ulcerózní kolitidy se efekty pozorují často ve velkém rozsahu v konečníku a slizničním epitelie jsou specificky poškozené. U tohoto modelu jsou klinické patologie velmi obdobné vtom, že poškozená místa postihují rozsáhlé oblasti, i když jsou převážně lokalizovány v tlustém střevě s rozsahem do krypt.

Na druhé straně je Crohnovo onemocnění chorobou, kdy zánět postihuje celou tloušťku stěny, není lokalizován ve sliznici a může se šířit kdekoliv a trávicí trubici od dutiny ústí až po konečník. Histologicky se popisuje jako granulomatózní nekaseifikující zánět. Tento model je velmi podobný Crohnově choroby v tom, že zánět není lokalizován pouze ve slizniční vrstvě, kde se nacházejí makrofágy, lymfocyty a shluky mnohojademých obrovských buněk, často má formu granulomů a pouze zřídka se objevují abscesy v kryptách.

Proto jsou v klinickém výzkumu uváděny i případy, které měly současně charakteristické projevy ulcerózní kolitidy a Crohnova onemocnění (Tanaka, M. a kol., Hepatogastroenetrology (1990) 37, 18 až 31). U zánětlivého onemocnění střev byla zjištěna v epitelu zesílená exprese hlavního histokompatibilního komplexu třídy II (Trejdosiewicz, L.K. a kol., Dig. Dis. Sci. (1989) 34, 1449 až 1456) a toto bylo potvrzeno i u tohoto modelu. U tohoto modelu se objevuje charakteristické ztluštění epiteliální tkáně, které zřejmě souvisí se zvýšeným buněčným růstem, který byl zjištěn u pacientů s ulcerózní kolitidou (Sarafíni, E. P. a kol., Gut (1981) 22, 648 až 652).

Tento současný model je velmi podobný klinickému zánětlivému onemocnění střev a může vyvolat pokles hmotnosti u těžkých případů. V pokusu, který tento model používá, se histologická poškození významně zlepšila a nebyl zjištěn pokles hmotnosti, což svědčí pro to, že antagonisté IL-6 se vyznačují terapeutickým účinkem u zánětlivého onemocnění střev, jako je ulcerózní kolitida a Crohnovo onemocnění.

Příklady provedení vynálezu

Tento vynález bude nyní vysvětlen podrobněji s odkazem na pracovní příklady, referenční příklady a experimentální příklady. Avšak je třeba zdůraznit, že není omezen pouze na tyto příklady.

- 15CZ 297083 B6

Příklad 1

Slezina se za aseptických podmínek odstranila ze samčí myši BALB/c a po homogenizaci se připravila suspenze jednotlivých buněk. Potom, aby se odstranily červení krvinky, byly shluky buněk upravovány pomocí lyzačního roztoku (směs 0,16 M NH4CI a 0,17 M Tris pufru s pH 7,2 v poměru 9 : 1) a dále se dvakrát promyly pomocí fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem. Takto se získaly myší slezinné buňky.

Promyté myší slezinné buňky se suspendovaly v médiu RPMI1640, které obsahuje 2 % FCS. Po spočítání buněk se uzpůsobily na 1,1 x 10⁸/ml. Pak se přidaly proti-myší CD4 protilátky (L3T4 Microbeads, vyráběné firmou Miltenyi Biotech) v objemu 1/9 a ty se na buňky vázaly na ledu po dobu 15 minut (při buněčné hustotě 1 x 10⁸/ml). Dále se frakce CD4 pozitivních buněk oddělovala pomocí separačního systému Mini MACS (vyráběného firmou Miltenyi Biotech). Po spočítání buněk se suspendovaly ve fyziologickém roztoku pufrovaného fosfátem s přídavkem 2 % FCS, aby se upravila buněčná hustota na 4 x 10⁷/ml.

K suspenzi CD4 pozitivních buněk se přidá 1/100 objemu králičích proti-myších CD4 (L3T4) protilátek značených pomocí LE (0,2 mg/ml, klon RM4-5, vyráběné firmou Pharmingen) a 1/100 objemu králičích proti-myších CD45RB protilátek značených pomocí FITC (0,5 mg/ml, klon 16A, vyráběné firmou Pharmingen). Dále se směs nechá stát na ledu po dobu 20 minut, aby se mohly protilátky navázat. K označeným buňkám se přidá médium RPMI 1640 s přídavkem 2 % FCS, dále se promyje centrifugací a resuspenduje ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem s přídavkem 2 % FCS a uskladní se na tmavém chladném místě.

Z označených CD4 pozitivních buněk se vyberou CD4 pozitivní buňky a buňky CD45RB silně pozitivní (CD4⁺CD45RB^hlgh) za použití průtokového cytometru (FACS Valtage, vyráběný firmou Becton Dickinson). Tato buněčná skupina odpovídá horním 50 % buněk, které mají exprimován CD45RB, z CD4 a CD45RB pozitivních buněk. Takto získané buňky se po centrifugací suspendují ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem na koncentraci 4 x 10⁶/ml. Čistota buněk byla 97 % jakožto CD45RB pozitivních buněk, jejich koeficient přežívání byl 98 %.

Tyto vysoce purifikované buňky se injekčně vpravily do dutiny břišní v koncentraci 4 x 10⁵/ml (100 μΐ obsahuje 4 x 10⁶/ml) myších C.B.-17 scid, aby se připravil model zánětlivého onemocnění střev (Leach, M.W. a kol., Am. J. Pathol. (1996) 148, 1503 až 1515, Aranda, R. a kol., J. Immunol. (1997) 158, 3464 až 3473). Experiment byl prováděn u tří následujících skupin podle způsobu léčby: (1) skupina s přenosem buněk, s žádných podáváním protilátky proti IL-6 receptoru, 5 myší; (2) skupina s přenosem buněk, s podáváním protilátky proti IL-6 receptoru, 3 myši; (3) skupina bez přenosu buněk, 3 myši.

Protilátka proti IL-6 receptoru MR16-1 byla podávána následovně. Nejprve byla upravena na 20 mg/ml ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem. Každé myši bylo podáno 100 μΐ do dutiny břišní 15 až 30 minut před injekčním podáním výše uvedených buněk. O týden později byla protilátka upravena na 10 mg/ml ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem a každé myši bylo podáno do dutiny břišní 100 μΐ. Tento postup se opakoval každý týden až do 8. týden od přenosu buněk. Skupina, které se protilátka nepodávala, dostávala podobným způsobem fyziologický roztok pufrovaný fosfátem.

8. až 9. týden po přenosu buněk se myši vážily a tkáň tlustého střeva (sestupné části tlustého střeva) se odstranila a ponořila do látky OCT. Vzorky se zamrazily při teplotě -80 °C. Za použití kryostatu se bločky vzorků, které se fixovaly 10% roztokem formalínu, krájely na tenké plátky o tloušťce 6 pm. Tyto zmrazené řezy se pro histologické zkoumání obarvily dvojitou metodou pomocí hematoxilin-eozinu. Bylo provedeno zhodnocení účinnosti léku tak, že se stanovily přesné změny tělesné hmotnosti (poměr před a po přenosu buněk) a provádělo se histologické vyšetření před vyvoláním zánětlivého onemocnění střev pomocí přenosu buněk a 8 až 9 týdnů po přenosu buněk. Pro histologické vyšetření tkáň každé myši byla hodnocena na základě následuj í-16CZ 297083 B6 čího skóre o 4 stupních zánětíivého onemocnění střev (dále zde označovaného jako skóre zánětlivého onemocnění střev) (lito, H. a kol., autoimmunity (1997) 10, 455 až 459).

Skóre zánětíivého onemocnění střev:

Stupeň 0 (žádný): neodlišitelný od normální BALB/c myši;

Stupeň 1 (minimální): zjištěna mírná hypertrofie epiteliálních tkáni;

Stupeň 2 (střední): mezi stupni 1 a 3

Stupeň 3 (těžký): významná hypertrofie epiteliální tkáně doprovázená rozsáhlým rozsevem infiltrace zánětlivými buňkami a chybění pohárkových buněk.

Výsledky změn tělesné hmotnosti a skóre zánětíivého onemocnění střev jsou znázorněny v tabulce 1.

U myší, kterým byly implantovány CD4 pozitivní a CD45RB silně pozitivní buňky, došlo k rozvoji zánětíivého onemocnění střev a také histologicky byl zjištěn významný zánět. Také se u nich projevila tělesná slabost související se vzplanutím onemocnění a v průměru 11% pokles tělesné hmotnosti. Na druhé straně u skupiny, které byla podávána protilátka proti IL-6 receptoru, byl zjištěn statisticky významný pokles tělesné hmotnosti, bylo dosaženo téměř stejné tělesné hmotnosti jako před přenosem buněk. Stejně tak došlo i ke zlepšení histologického skóre zánětíivého onemocnění střev. Pro statistické hodnocení změn tělesné hmotnosti byla nejprve provedena ANOVA (Analysis of variance, SPSS for Windows ver. 65. SPSS Inc.) k potvrzení významnosti a následně bylo provedeno mnohočetné srovnání metodou Bronferroni, u které byla zjištěna významnost s 5% hladinou významnosti.

Tento model je velmi obdobný lidskému zánětlivému onemocnění střev, a proto se na něm demonstrovalo, že protilátka proti IL-6 receptoru je účinná jakožto preventivní nebo terapeutické činidlo pro zánětlivé onemocnění střev, jako je například ulcerózní kolitida a Crohnovo onemocnění.

-17CZ 297083 B6

Tabulka 1: Potlačení poklesu tělesné hmotnosti a zhoršování zánětlivého onemocnění střev pomocí protilátky proti IL-6 receptoru

Vstřikovaná buňka	Léčba	Počet zvířat	Změny tělesné hmotnosti (%)	Skóre zánětlivého onemocnění střev
CD4+CD45RBn®rt	Fyziologický roztok pufrovaný fosfátem	5	88,8 + 6,7	2,4
CD4+CD45RBhl9h	Protilátka proti IL-6 receptoru	3	100,9 + 4,5	1,0
Žádná	Fyziologický roztok pufrovaný fosfátem	3	107,7 + 0,9	0,3

Změny tělesné hmotnosti jsou vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka skupiny.

Skóre zánětlivého onemocnění střev je vyjádřena jako průměr skupiny.

Referenční příklad 1. Příprava lidského rozpustného receptoru IL-6

Rozpustný IL-6 receptor se připravuje metodou PCR za použití plazmidu pBSF2R.236, který obsahuje cDNA, která kóduje IL-6 receptor získaný metodou podle Ymasaki a kol., (Ymasaki, K. a kol., Science (1988) 241, 825 až 828). Plazmid pBSF2R.236 byl rozštěpen pomocí restrikčního enzymu Sph I, aby se získala cDNA IL-6 receptoru, která byla potom začleněna do mpl8 (vyráběné firmou Amersham). Bylo použito syntetického oligoprimeru navrženého pro vložení zastavovacího kodónu do cDNA IL-6 receptoru, mutace proběhla v cDNA IL-6 receptoru pomocí metody PCR za použití mutagenního systému Mutagenesis Systém (vyráběného firmou Amersham). Proces vedl k vložení zastavovacího kodónu do aminokyseliny na pozici 345 a byla získána cDNA kódující rozpustný IL-6 receptor.

Aby došlo k expresi cDNA solubilního IL-6 receptoru na CHO buňkách, byl navázán plazmid pSV (vyráběný firmou Pharmacia), aby se získal plazmid pSVL344. cDNA solubilního IL-6 receptoru, která byla odštěpena pomocí Hind ΙΠ-Sal I, byla vložena do plazmidu pECEdhfr obsahujícího cDNA dfhr. Tím se získal plazmid pECEdhfr344, který je exprimován na CHO buňkách.

Potom bylo 10 pg plazmidu pECEdhfr344 přeneseno na dhfr-CHO buněčnou linii DXB-11 (Urland a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216 až 4220) pomocí precipitační metody s fosfátem vápenatým (Chem C. a kol., Mol. Cell. Biol. /1987) 7, 2745 až 2751). Buňky CHO byly kultivovány po dobu 3 týdnů v α MEM selekčním médiu bez nukleosidů, které obsahuje 1 mmol glutaminu, 10 % dialyzovaného FCS, 100 U/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu.

-18CZ 297083 B6

Vybrané CHO buňky byly filtrovány pomocí limitní diluční metody, aby se získal jednoduchý buněčný klon CHO. Buněčný klon CHO byl amplifikován ve 20 až 200 nmol methotrexátu (MTX), aby se získala buněčná linie CHO 5E27, která produkuje lidský rozpustný IL-6 receptor. Buněčná linie CHO 5E27 byla kultivována v Dulbeccově médiu modifikovaném podle Iscova (IMDM, vyráběném firmou Gibco), které obsahuje 5 % FBS. Sbíral se supematant kultury a stanovovala se koncentrace solubilního IL-6 receptoru v supematantu kultury pomocí ELISA. Výsledek potvrdil, že solubilní IL-6 receptor je v supematantu kultury přítomen.

Referenční příklad 2. Příprava lidské IL-6 protilátky

Pomocí 10 pg rekombinantního IL-6 (Hirano a kol, Immunol. Lett., 17:41, 1988) dohromady s kompletní Freundovou přísadou byly imunizovány myši BALB/c. Toto se opakovalo každý týden, dokud se nepodařilo v séru zachytit protilátky proti IL-6. Imunitní buňky byly vyjmuty z lokální lymfatické uzliny a potom se nechaly fúzovat s myelomovými buňkami linie P301 za použití polyethylenglykolu 1500. Hybridomy se vybíraly metodou podle Oi a kol. (Selektive Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman a Co., San Francisco, 351, 1980), ve které se používá HAT médium a byly ustanoveny hybridomy, které produkují lidskou protilátku proti IL-6.

Hybridomy, které produkují lidské IL-6 protilátky, se podrobily níže uvedené analýze. Mikrotitrační plotna s 96 jamkami, vyrobena z průběžného polyvinylu (vyrobena firmou Dynatech, Laboratories, Inc. Alexandria, VA), byla potahována 100 μΐ kozích proti-myších protilátek IgG (10 μΐ/ml, vyrobených firmou Cooper Biomedical, Inc. Malvern, PA) přes noc při teplotě 4 °C. Následně se nechal působit PBS obsahující 1 % hovězího sérového albuminu (BSA) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti.

Po vymytí PBS se do každé plotny přidá 100 μΐ supematantu kultury hybridomu a nechá se inkubovat přes noc při teplotě 4 °C. Plotna se promyje, do každé jamky se přidá rekombinantní IL-6 značený pomocí ¹²⁵I v koncentraci 2000 cpm/0,5 ng/jamku a stanovuje se radioaktivita každé jamky po promytí pomocí gamma počítačky (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA). Z 216 hybridních klonů bylo 32 pozitivních v tomto testu vazby IL-6. Z těchto klonů byl nakonec získán stabilní MH166.BSF2. Protilátky anti-IL-6 MH166 produkované výše uvedeným hybridomem měly subtyp IgGl k.

Dále se použil myší IL-6 dependentní hybridní klon MH60.BSF2, aby se zjistila neutralizační aktivita s hlediska růstu hybridomu pomocí protilátky MH166. Buňky MH60.BSF2 se rozdělily do 1 x 10⁴/200 μΐ/jamku a k nim se přidaly vzorky obsahující protilátky MH166, dále se nechaly kultivovat po dobu 48 hodin, přidal se ³H-thymidin 0,5 pCi/jamku (New England Nuclear, Boston, MA) a dále se nechal kultivovat po dobu dalších 6 hodin. Buňky se potom daly na skleněný filtrační papír a nechaly se pomnožit pomocí automatického pomnožovače (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japonsko). Jakožto kontrola se používaly králičí protilátky proti IL-6.

Výsledně protilátky MH166 inhibovaly v závislosti na dávce začlenění ³H-thymidinu do buněk MH60.BSF2 indukované pomocí IL-6. To odhalilo skutečnost, že protilátky MH166 neutralizují aktivitu IL-6.

Referenční příklad 3. Příprava lidské protilátky proti IL-6 receptoru

Protilátky proti IL-6 receptoru MT18, které se připravily metodo podle Hiraty a kol. (Hirata, Y. a kol., J. Immunol., 143, 2900 až 2906, 1989), se navázaly na sefarózu 4B aktivovanou pomocí CNBr (vyráběnou firmou Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) podle připojeného režimu a purifikoval se receptor IL-6 (Ymasaki, K. a kol., Science (1988), 241, 825 až 828).

-19CZ 297083 B6

Buněčná linie lidského myelomu U266 se rozpustila pomocí lmM p-para-aminofenylmethansulfonylfluoridhydrochloridu (vyráběného firmou Wako Chemicals), 10 mM triethanolamin (pH 7,8) a 0,15 M NaCl (digitoninový pufr) a smíchala se s protilátkou MT18 vázanou na kuličky se sefarózou 4B. Kuličky se potom šestkrát promyly digitoninovým pufrem a tak byl připraven částečně purifikovaný IL-6 receptor.

Myši BALB/c se imunizovaly čtyřikrát každým deset dní pomocí částečně purifikovaného IL-6 receptoru získaného z 3 x 10⁹ U266 buněk a hybridom se potom připravil pomocí standardní metody. Supernatant kultury hybridomu z jamek z pozitivním růstem se testoval na aktivitu vazby na IL-6 receptor pomocí metody níže uvedené. Buňky 5 x 10⁷ U266 se označily pomocí ³⁵S-methioninu (2,5 mCi) a rozpustily se pomocí výše uvedeného digitoninového pufru. Rozpuštěné buňky U266 se smíchaly s 0,04 ml protilátky MT18 vázanými na kuličky se sefarózou 4B. Potom se šestkrát promyly pomocí digitoninového pufru. IL-6 receptor značený pomocí ³⁵Smethioninu se louhoval pomocí 0,25 ml digitoninového pufru (pH 3,4) a neutralizoval se v 0,025 ml 1M Tris (pH 7,4).

0,05 ml supernatantu kultury hybridomu se smíchalo s 0,01 ml proteinu G sefarózy (vyráběné firmou Pharmacia). Po promývání se sefaróza nechala inkubovat s 0,005 ml roztoku IL-6 receptoru značeného pomocí ³⁵S, jak je výše popsáno. Imunoprecipitát se potom analyzoval pomocí SDS-PAGE, aby se nalezl supernatant kultury hybridomu, který reaguje s IL-6 receptorem. Výsledkem je založení pozitivního klonu hybridomu PM-1. Protilátky produkované hybridomem PM-1 měly subtyp IgGl k.

Byla sledována inhibiční aktivita protilátek produkovaných hybridomem PM-1 proti vazbě IL-6 na lidský IL-6 receptor za použití buněčné linie lidského myelomu U266. Lidský rekombinantní IL-6 se připravil z E. coli (Hirano a kol., Immunol. Lett., 17: 41 až 45, 1988) a označil se pomocí ¹²⁵I za použití Bolton-Humterovy reagencie (New England Nuclear, Boston, MA) (Taga, T. a kol., J. Exp. Med. (1987) 166, 967 až 981). 4 x 10⁵ buněk U266 se nechalo kultivovat se 70% (v/v) supernatantu kultury hybridomu PM-1 spolu se 10,000 cpm IL-6 značeného ¹²⁵I po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. 70 μΐ vzorku se navrstvilo na 300 μΐ FCS do mikrocentrifugační polyethylénové zkumavky o objemu 400 μΐ. Po centrifugaci se stanovovala radioaktivita buněk.

Výsledek odhalil skutečnost, že protilátky produkované hybridomem PM-1 inhibují vazbu IL-6 a IL-6 receptor.

Referenční příklad 4. Příprava myších protilátek proti IL-6 receptoru

Monoklonální protilátka proti myšímu IL-6 receptoru se připravila metodou, kterou popisuje Saito a kol., J. Immunol. (1993) 147, 168 až 173.

Buňky CHO, které produkují myší solubilní IL-6 receptor, se nechaly kultivovat v médiu IMDM, které obsahovalo 10 % FCS. Ze supernatantu kultury se purifikoval myší solubilní IL-6 receptor za použití protilátky proti solubilního IL-6 receptoru RS12 (viz Saito, a kol.) a afinitní sloupec se fixoval na Affigel 10 gel (vyráběn firmou Biorad).

Myší solubilní IL-6 receptor (50 pg) se smíchal s Freundovou kompletní přísadou a pak se injekčně vpravil do dutiny břišní krys Wistar. Po 2 týdnech po podání byla zvířatům podána Freundova nekompletní přísada. 45. den se krysy usmrtily a slezinné buňky v množství 2x 10⁸ se nechaly fúzovat s 1 x 10⁷ buňkami myších myelomových buněk P3U1 za použití 50% PEG 1500 (Boehringer Mannheim) běžným způsobem, a potom se zachycovaly pomocí kultivačního média HAT.

-20CZ 297083 B6

Poté, co se supernatant z kultur hybridomů přidal na plotnu potaženou králičí proti-myší protilátkou IgG (vyráběnou firmou Cappel), přidal se myší solubilní IL-6 receptor. Následně za použití králičí protilátky, proti myšímu IL-6 receptorů a alkalickou fosfatázou značené ovčí protikráličí protilátky, hybridomy produkující protilátku proti myšímu solubilnímu IL-6 receptorů se stanovovaly pomocí ELISA. Poté, co se prokázala produkce požadované protilátky, hybridní klony se stanovovaly dvakrát, aby se získal jednoduchý hybridní klon. Klon byl označen jako MR16-1.

Neutralizační aktivita protilátky produkované hybridomem signální transdukce myšího IL-6 byla měřena pomocí začleněného ³H-thymidinu, s použitím buněk MH60.BSF2 (Mastuda, T. a kol. J. Immunol. (1988) 18, 951 až 956). Buňky MH60.BSF2 se připravily v koncentraci 1 x 10⁴buněk/200 μΐ/jamku na mikrotitrační desce o 96 jamkách. Do každé jamky se přidalo 10 pg/ml myšího IL-6 a protilátky MR16-1 nebo protilátky RS12 v koncentraci 12,3 až 1000 ng/ml a nechalo se kultivovat při teplotě 37 °C po dobu 44 hodin v prostředí s 5 % CO₂. Potom se přidal 1 pVi/jamku ³H-thymidinu. Po 4 hodinách se měřil začleněný ³H-thymidin. Výsledkem bylo, že protilátka MR16-1 potlačila začlenění ³H-thymidin u buněk MH60.BSF.2.

Tím bylo prokázáno, že protilátky produkované hybridomem MR16-1 inhibují vazbu IL-6 na IL-6 receptor.

Průmyslová využitelnost

Vynález podle předkládané přihlášky vynálezu má využití ve farmaceutickém průmyslu, zejména pro výrobu léčiv pro léčení zánětlivého onemocnění střev, zejména pro léčbu ulcerózní kolitidy a Crohnovy nemoci.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (10)

1. Použití antagonisty interleukinu-6 (IL6) pro přípravu preventivního nebo terapeutického činidla u zánětlivého onemocnění střeva.

2. Použití podle nároku 1, kde antagonistou proti IL-6 receptorů je monoklonální protilátka proti IL-6 receptorů.

3. Použití podle nároku 2, kde protilátkou proti IL-6 receptorů je monoklonální protilátka proti lidskému IL-6 receptorů.

4. Použití podle nároku 2, kde protilátkou proti IL-6 receptorů je monoklonální protilátka proti myšímu IL-6 receptorů.

5. Použití podle kteréhokoliv z nároků 2 až 4, kde protilátkou proti IL-6 receptorů je rekombinantní protilátka.

6. Použití podle nároku 3, kde monoklonální protilátkou proti IL-6 receptorů je PM-1 protilátka.

7. Použití podle nároku 4, kde monoklonální protilátkou proti myšímu IL-6 receptorů je MR16-1 protilátka.

-21 CZ 297083 B6

8. Použití podle kteréhokoliv z nároku 2 nebo 3, kde protilátkou proti IL-6 receptoru je chimérická nebo humanizovaná protilátka proti IL-6 receptoru.

5

9. Použití podle nároku 8, kde humanizovanou protilátkou proti IL-6 receptoru je humanizovaná PM-1 protilátka.

10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, kde zánětlivým onemocněním střeva je ulcerózní kolitida nebo Crohnova nemoc.