CZ298236B6 - Nová karbonylová reduktasa, gen, který ji kóduje a zpusob pro pouzití této reduktasy a genu - Google Patents
Nová karbonylová reduktasa, gen, který ji kóduje a zpusob pro pouzití této reduktasy a genu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ298236B6 CZ298236B6 CZ0276199A CZ276199A CZ298236B6 CZ 298236 B6 CZ298236 B6 CZ 298236B6 CZ 0276199 A CZ0276199 A CZ 0276199A CZ 276199 A CZ276199 A CZ 276199A CZ 298236 B6 CZ298236 B6 CZ 298236B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- enzyme
- transformed
- plasmid
- ethyl
- cell
- Prior art date
Links
- 108010031132 Alcohol Oxidoreductases Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 102000005751 Alcohol Oxidoreductases Human genes 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 66
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 21
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 title description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 title description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 168
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 166
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 81
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 56
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 19
- 150000001728 carbonyl compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 60
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 41
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 38
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 29
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 27
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 25
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 25
- -1 3-hydroxybutyrate ester Chemical class 0.000 claims description 24
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 24
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 23
- OHLRLMWUFVDREV-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(=O)CCl OHLRLMWUFVDREV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 18
- ZAJNMXDBJKCCAT-YFKPBYRVSA-N ethyl (3s)-4-chloro-3-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)C[C@H](O)CCl ZAJNMXDBJKCCAT-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 17
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 10
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 9
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 9
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 5
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 5
- ATPFRGQBOVFFQM-WJIDAKASSA-N [(1s,3r,7r,8r,8as)-3-(hydroxymethyl)-8-[2-[(2r,4r)-4-hydroxy-6-oxooxan-2-yl]ethyl]-7-methyl-1,2,3,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl] 2,2-dimethylbutanoate Chemical compound C([C@@H]1[C@H](C)C=CC2=C[C@H](CO)C[C@@H]([C@@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 ATPFRGQBOVFFQM-WJIDAKASSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 4
- HFLMYYLFSNEOOT-UHFFFAOYSA-N methyl 4-chloro-3-oxobutanoate Chemical group COC(=O)CC(=O)CCl HFLMYYLFSNEOOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- CZRWOPRGDPUSDE-UHFFFAOYSA-N methyl 4-bromo-3-oxobutanoate Chemical compound COC(=O)CC(=O)CBr CZRWOPRGDPUSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N R3HBA Natural products CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 5
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxybutyrate Chemical compound CC(O)CC([O-])=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 4
- WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-N acetoacetic acid Chemical compound CC(=O)CC(O)=O WDJHALXBUFZDSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 claims 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 claims 2
- 125000000440 benzylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 claims 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 claims 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims 1
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical group O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 36
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 31
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 20
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 20
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 20
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 20
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 19
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 17
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 12
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 229940089960 chloroacetate Drugs 0.000 description 8
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 8
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 101150019455 gdh gene Proteins 0.000 description 7
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 5
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 5
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 5
- REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N Quercetin Chemical compound C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2O)=O)C=1OC=2C1=CC=C(O)C(O)=C1 REFJWTPEDVJJIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 241000222292 [Candida] magnoliae Species 0.000 description 5
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 5
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- AIZRKZQHJNWBEI-YFKPBYRVSA-N ethyl (3s)-4-bromo-3-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)C[C@H](O)CBr AIZRKZQHJNWBEI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Substances CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AKDAXGMVRMXFOO-VKHMYHEASA-N (3s)-4-chloro-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound ClC[C@@H](O)CC(O)=O AKDAXGMVRMXFOO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- AQMRHANBRLVSLM-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-iodo-3-oxobutanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(=O)CI AQMRHANBRLVSLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 3
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 3
- WMRINGSAVOPXTE-BYPYZUCNSA-N methyl (3s)-4-chloro-3-hydroxybutanoate Chemical compound COC(=O)C[C@H](O)CCl WMRINGSAVOPXTE-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N Methylglyoxal Chemical compound CC(=O)C=O AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N Phosphine Chemical compound P XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N Quercetagetin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 ZVOLCUVKHLEPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N Rhynchosin Natural products C1=C(O)C(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 HWTZYBCRDDUBJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N benzyl chloride Chemical compound ClCC1=CC=CC=C1 KCXMKQUNVWSEMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940073608 benzyl chloride Drugs 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- QABCGOSYZHCPGN-UHFFFAOYSA-N chloro(dimethyl)silicon Chemical compound C[Si](C)Cl QABCGOSYZHCPGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-M chloroacetate Chemical compound [O-]C(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- VKYSMCMNKCLRND-YFKPBYRVSA-N ethyl (3s)-3,4-dihydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)C[C@H](O)CO VKYSMCMNKCLRND-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- SMWBHOKQXGBYJN-YFKPBYRVSA-N ethyl (3s)-3-hydroxy-4-iodobutanoate Chemical compound CCOC(=O)C[C@H](O)CI SMWBHOKQXGBYJN-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- RDULEYWUGKOCMR-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-chloro-3-oxobutanoate Chemical compound CCOC(=O)C(Cl)C(C)=O RDULEYWUGKOCMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZFWGBFTIQSEBN-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-hydroxy-2-methylbutanoate Chemical compound CCOC(=O)C(C)C(C)O BZFWGBFTIQSEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAJNMXDBJKCCAT-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(O)CCl ZAJNMXDBJKCCAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N ethyl acetoacetate Chemical compound CCOC(=O)CC(C)=O XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 108010029645 galactitol 2-dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M hexanoate Chemical compound CCCCCC([O-])=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N kaempferol Natural products OC1=C(C(=O)c2cc(O)cc(O)c2O1)c3ccc(O)cc3 MWDZOUNAPSSOEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004922 lacquer Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229960001285 quercetin Drugs 0.000 description 2
- 235000005875 quercetin Nutrition 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTQIANGQRHQQJU-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound CC(O)C(Cl)C(O)=O QTQIANGQRHQQJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSKPIOLLBIHNAC-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-acetaldehyde Chemical compound ClCC=O QSKPIOLLBIHNAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRWILAKSARHZPR-UHFFFAOYSA-N 3-chlorobenzaldehyde Chemical compound ClC1=CC=CC(C=O)=C1 SRWILAKSARHZPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZETIVVHRRQLWFW-UHFFFAOYSA-N 3-nitrobenzaldehyde Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC(C=O)=C1 ZETIVVHRRQLWFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AKDAXGMVRMXFOO-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound ClCC(O)CC(O)=O AKDAXGMVRMXFOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVPYQKSLYISFPO-UHFFFAOYSA-N 4-chlorobenzaldehyde Chemical compound ClC1=CC=C(C=O)C=C1 AVPYQKSLYISFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEZCMVCLPKSUOT-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-3-oxobutanoic acid Chemical compound OCC(=O)CC(O)=O JEZCMVCLPKSUOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BXRFQSNOROATLV-UHFFFAOYSA-N 4-nitrobenzaldehyde Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(C=O)C=C1 BXRFQSNOROATLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- YAXNATKKPOWVCP-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YAXNATKKPOWVCP-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- WGDNWOMKBUXFHR-BQBZGAKWSA-N Ala-Gly-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N WGDNWOMKBUXFHR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- AJBVYEYZVYPFCF-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AJBVYEYZVYPFCF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OQWQTGBOFPJOIF-DLOVCJGASA-N Ala-Lys-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N OQWQTGBOFPJOIF-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010011667 Ala-Phe-Ala Proteins 0.000 description 1
- XRUJOVRWNMBAAA-NHCYSSNCSA-N Ala-Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 XRUJOVRWNMBAAA-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N Ala-Ser Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O IPWKGIFRRBGCJO-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- CREYEAPXISDKSB-FQPOAREZSA-N Ala-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CREYEAPXISDKSB-FQPOAREZSA-N 0.000 description 1
- ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N Ala-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- IRRMIGDCPOPZJW-ULQDDVLXSA-N Arg-His-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O IRRMIGDCPOPZJW-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- DPLFNLDACGGBAK-KKUMJFAQSA-N Arg-Phe-Glu Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N DPLFNLDACGGBAK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PSUXEQYPYZLNER-QXEWZRGKSA-N Arg-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O PSUXEQYPYZLNER-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- XFJKRRCWLTZIQA-XIRDDKMYSA-N Asn-Lys-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XFJKRRCWLTZIQA-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- DOURAOODTFJRIC-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N DOURAOODTFJRIC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KVMPVNGOKHTUHZ-GCJQMDKQSA-N Asp-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KVMPVNGOKHTUHZ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N Asp-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101150084636 CRD gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222173 Candida parapsilosis Species 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034741 Cyclin-dependent kinase 20 Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000159512 Geotrichum Species 0.000 description 1
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IDEODOAVGCMUQV-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IDEODOAVGCMUQV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N Glu-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YSWHPLCDIMUKFE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- RLFSBAPJTYKSLG-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RLFSBAPJTYKSLG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QIZJOTQTCAGKPU-KWQFWETISA-N Gly-Ala-Tyr Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 QIZJOTQTCAGKPU-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VBOBNHSVQKKTOT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FKYQEVBRZSFAMJ-QWRGUYRKSA-N Gly-Ser-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FKYQEVBRZSFAMJ-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- UAQSZXGJGLHMNV-XEGUGMAKSA-N Ile-Gly-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N UAQSZXGJGLHMNV-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 1
- RMNMUUCYTMLWNA-ZPFDUUQYSA-N Ile-Lys-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N RMNMUUCYTMLWNA-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N Leu-Ala-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DLCOFDAHNMMQPP-SRVKXCTJSA-N Leu-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DLCOFDAHNMMQPP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101500014379 Lymnaea stagnalis Ovulation hormone Proteins 0.000 description 1
- MPOHDJKRBLVGCT-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N MPOHDJKRBLVGCT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VHXMZJGOKIMETG-CQDKDKBSSA-N Lys-Ala-Tyr Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N VHXMZJGOKIMETG-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- ZMMDPRTXLAEMOD-BZSNNMDCSA-N Lys-His-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ZMMDPRTXLAEMOD-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- YUAXTFMFMOIMAM-QWRGUYRKSA-N Lys-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O YUAXTFMFMOIMAM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- IOQWIOPSKJOEKI-SRVKXCTJSA-N Lys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IOQWIOPSKJOEKI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- LXCSZPUQKMTXNW-BQBZGAKWSA-N Met-Ser-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O LXCSZPUQKMTXNW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- XEXSSIBQYNKFBX-KBPBESRZSA-N Phe-Gly-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 XEXSSIBQYNKFBX-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- KXUZHWXENMYOHC-QEJZJMRPSA-N Phe-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KXUZHWXENMYOHC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- DOXQMJCSSYZSNM-BZSNNMDCSA-N Phe-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DOXQMJCSSYZSNM-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GMWNQSGWWGKTSF-LFSVMHDDSA-N Phe-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GMWNQSGWWGKTSF-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150050048 SNCB gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- KNZQGAUEYZJUSQ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N KNZQGAUEYZJUSQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- OLIJLNWFEQEFDM-SRVKXCTJSA-N Ser-Asp-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OLIJLNWFEQEFDM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- DJDSEDOKJTZBAR-ZDLURKLDSA-N Thr-Gly-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DJDSEDOKJTZBAR-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- XTCNBOBTROGWMW-RWRJDSDZSA-N Thr-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N XTCNBOBTROGWMW-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- DYIXEGROAOVQPK-VFAJRCTISA-N Trp-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N)O DYIXEGROAOVQPK-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N Trp-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 108010028939 alanyl-alanyl-lysyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010024078 alanyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N benzoyl chloride Chemical compound ClC(=O)C1=CC=CC=C1 PASDCCFISLVPSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 229940055022 candida parapsilosis Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 125000000068 chlorophenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 101150102678 clu1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- WASQWSOJHCZDFK-UHFFFAOYSA-N diketene Chemical compound C=C1CC(=O)O1 WASQWSOJHCZDFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- QWZNBZVDDQDKED-YFKPBYRVSA-N ethyl (2s)-4-chloro-2-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)[C@@H](O)CCCl QWZNBZVDDQDKED-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- XWWGVYVLALKWDS-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-chloro-3-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)C(Cl)C(C)O XWWGVYVLALKWDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FNENWZWNOPCZGK-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-methyl-3-oxobutanoate Chemical compound CCOC(=O)C(C)C(C)=O FNENWZWNOPCZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHTPQJBOGBAEJZ-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-azido-3-oxobutanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(=O)CN=[N+]=[N-] IHTPQJBOGBAEJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOQFROBMBSKWQY-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-cyano-3-hydroxybutanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(O)CC#N LOQFROBMBSKWQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NZJBBKAVCWXTPT-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-hydroxy-3-oxobutanoate Chemical compound CCOC(=O)CC(=O)CO NZJBBKAVCWXTPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010048994 glycyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- RQLKAKQYERUOJD-UHFFFAOYSA-N lithium;1,3,5-trimethylbenzene-6-ide Chemical compound [Li+].CC1=CC(C)=[C-]C(C)=C1 RQLKAKQYERUOJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- GYQRIAVRKLRQKP-UHFFFAOYSA-N methyl 2-chloro-3-oxobutanoate Chemical compound COC(=O)C(Cl)C(C)=O GYQRIAVRKLRQKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- QQZOPKMRPOGIEB-UHFFFAOYSA-N n-butyl methyl ketone Natural products CCCCC(C)=O QQZOPKMRPOGIEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QVBGSRKQOYZMLR-UHFFFAOYSA-N octyl 4-chloro-3-oxobutanoate Chemical compound CCCCCCCCOC(=O)CC(=O)CCl QVBGSRKQOYZMLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- DGTNSSLYPYDJGL-UHFFFAOYSA-N phenyl isocyanate Chemical compound O=C=NC1=CC=CC=C1 DGTNSSLYPYDJGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010024607 phenylalanylalanine Proteins 0.000 description 1
- HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N phenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=CC=C1 HKOOXMFOFWEVGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940067157 phenylhydrazine Drugs 0.000 description 1
- 229960002036 phenytoin Drugs 0.000 description 1
- 229910000073 phosphorus hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 125000003944 tolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Resení se týká enzymu s karbonyl redukcní aktivitou schopným asymetricky redukovat karbonylové slouceniny za vzniku opticky aktivního alkoholu, DNA kódující tento enzym, plazmidu nesoucího tuto DNA, transformantu, kterým je bunka transformovaná plazmidem, a zpusobu prípravy opticky aktivního alkoholu za pouzití enzymu a/nebo transformovaných bunek.
Description
Oblast techniky
Vynález se tyká enzymu s karbonyI reduktasovou aktivitou, která redukuje sloučeniny s asymetrickým karbonylem za vzniku opticky aktivního alkoholu (dále bude tento enzym označován jako CRD enzym), DNA kódující tento enzym, plazmidu nesoucího tuto DNA, trans forman tu, kterým 10 je buňka obsahující tento plazmid. a metody pro získávání opticky aktivního alkoholu za použití zmíněného enzymu a/nebo transformovaných buněk. Výsledný opticky aktivní alkohol, například (S)—4—halogen—3—hydroxybutyl ester, je užitečnou sloučeninou pro synthesu léčiv, chemikálií pro zemědělství a podobně.
Dosavadní stav techniky
Jc známo několik CRD enzymu (viz. Yuki Gosei Kagaku, 49, 52 (1991) a Eur. J. Biochem., 184, 1 (1981)). Mezi těmito CRD enzymy, jsou ty které působí na 4-halogenacelooclové estery za 20 vzniku (S)-4-halogen-3-hydroxybutyl esteru, získané z mikroorganismů, mající popsané charakteristiky, pouze enzymy získanými Geotrichum candidwn (Enzyme Microb. Technol. (1992), Vol. 14, 731) a z Candida parapsilosis (Enzyme Microb. Technol. (1993), Vol. 15, 950). Avšak doposud nebyly popsané Žádné informace o genech kódujících tyto dva typy enzymů. Redukce 4-halogen-acetooctových esteru za použití těchto enzymů probíhá pouze při nízkých 25 koncentracích substrátu. Je tudíž nepraktické syntetisovat (S)-4-halogen -3-hydroxybutyl ester za použití těchto enzymů jako katalyzátorů.
Kromě uvedené reakce používající dvou typů enzymů, celá rada reakcí používá mikrobiální buňky a o produktech těchto reakcí jc známo, že vznikly asymetrickou redukcí 4-halogcn-accto3o octového esteru (Japonský patent 723728, japonská Laid-Open publikace 6-209782 a 6-38776, a podobně). Avšak tyto reakce neprobíhají při vysokých koncentracích substrátu a tudíž nemohou být užívány v praxi jako účinná produkční metoda. Jako příklad může sloužit metoda reakce používající dvoufázový systém s organickým rozpouštědlem (Japonský patent 2566962). Rovněž byla popsaná metoda používající opticky aktivní fosftnový komplex s ruthenicm (japonská Laid 35 Open publikace 1-211551). Tato metoda však má mnoho problémů, které nejsou dořešeny, například požadavek na vysokotlakou reakční nádobu a potřeba drahého katalyzátoru.
Za těchto okolností bylo žádoucí vyvinout praktickou enzymovou metodu, která by prováděla asymetrickou redukci karbonylových sloučenin jako jsou 4-halogen-acetooctovc estery k pro40 dukci opticky aktivních alkoholů, například (S)-4-halogcn-3-hydroxy butyI ester.
Enzymy CRD typu vyžadují pro reakci redukční typ koenzymu. Má-li být redukovaná karbonylová sloučenina pomocí buněk mikroorganismů, které mají CRD enzym, je nutné do reakčního systému přidat cukr, například glukosu, aby se aktivovaly enzymy regeneračního systému pro 45 přeměnu oxidovaného koenzymu na redukovaný typ, a tento regenerovaný koenzym jc pak využit pro redukci. Skupina těchto enzymů regeneračního systému je náchylná k zablokování nebo poškození, a to buď substrátem, nebo produkty redukce. T ento fakt jc nutné brát v úvahu jako hlavní příčinu toho, proč reakce probíhá pouze tehdy, je-li koncentrace substrátu nebo produktu nízká. Je známé, že množství drahého koenzymu užívaného pro redukci lze značně 50 snížit kombinací enzymu majícího schopnost regenerace koenzymu, na kterém CRD enzym závisí, sCRD enzymem během reakce (Japonský patent 2566960) a Enzyme Microb. Technol. (1993). Vol. 15, 950). V tomto případě je však nutné připravit zdroj enzymu pro regeneraci odděleně od produkce CRD enzymu dříve, nc/ jc regenerační enzym přidán do reakční směsi.
CZ 298230 B6
Předkladatelé tohoto vynálezu objevili nový typ ORD enzymu u rodu Candida, a nalezli, že opticky aktivní alkohol může být účinně produkován z karbony lových sloučenin za užití tohoto
CRD enzymu.
Také nalezli, že opticky aktivní alkohol lze účinně produkovat za použití transformovaných buněk nesoucích gen se schopností souběžně regenerovat koenzym (například glukosodehydrogenasový gen).
Tudíž předložený vynález se dá popsal jako systém, který výhodně poskytuje nový typ CRD enzymu, DNA kódující tento enzym, plazmid nesoucí tuto DNA. a transformované buňky tímto plazmidem. Systém slouží jako produkční způsob k získání opticky aktivních alkoholů za použití zmíněného enzymu a/nebo transformovaných buněk.
Podstata vynálezu
Karbonylová reduktasa uváděná v předloženém vynálezu má následující fyzikální a chemické vlastnosti od (1) do (4):
(1) účinek;
působí na ethyl 4-chloracetoacetát při využití NADPH jako koenzymu za vzniku (S)-4-chlor-3hydroxybutyrátui (2) substrátová specifita;
vykazuje silnou aktivitu k ethyl 4 chloroacetoaeetátu, zatímco k ethyl acetoacctátu nevykazuje prakticky vůbec žádnou aktivitu;
(3) optimální pH: 5,5 až 6,5;
(4) optimální teplota reakce: 50 až 55 °C;
V jednom řešení má karbonylová reduktasa další fyzikální a chemické vlastnosti od (5) do (7):
(5) tepelná stabilita: je plně stabilní až do 40 °C, je-li uchována při pH 7,0 po 30 min:
(6) inhibitor: jc inhibovaná ionty rtuti a kvercctincm; a (7) molekulová hmotnost: určeno gelovou filtrací cca 76 000 a cca 32 000 pomocí SDS polyakry lam idové elektroforesy.
Karbonylová reduktasa uváděná v předloženém vynálezu má sekvenci aminokyselin SEQ ID No:l seznamu sekvencí nebo aminokyselinovou sekvenci s jednou nebo několika vynechanými aminokyselinami, substituované nebo přidané v aminokyselinové sekvenci SEQ ID No:l soupisu sekvencí, nebo část aminokyselinových sekvencí SEQ ID No:l soupisu sekvencí, a má aktivitu redukovat ethyl 4-chloracetoacetát asymetricky za vzniku ethyl (SM-chlor-3 hydroxybutyrátu.
V jednom provedení jc zmíněný enzym získáván v mikroorganizmu náležejícího do rodu Candida. S výhodou je tento enzym získáván zCandida magnoliae. Nej výhodněji je enzym získáván z druhu Candida magnoliae 1FO 0705.
DNA kódující podle předloženého vynálezu zmíněný enzym, lato látka, tj. zmíněná DNA má sekvenci nukleotidů odpovídající SEQ ID No:2 seznamu sekvencí.
Plazmid. který podle tohoto vynálezu má shora uvedenou DNA sekvenci. Plazmid těchto sekvencí je označen pNTSI.
Transformované buňky podle předloženého vynálezu jsou buňky, které byly transformovány 5 shora uvedeným plazmidem. Takovou transformovanou buňkou může být E. coli. Ve výhodném provedení jsou transformované buňky buňkami £. coli HB101 (pNTS 1).
Plazmid podle tohoto vynálezu má DNA kódující enzym mající schopnost asymetricky redukovat ethyl 4-chloracetoacetát za vzniku ethyl (S)-4-chlorhvdroxybutyrátu a DNA kódující enzym se 10 schopností regenerace koenzymu na kterém enzym závisí (například glukosodehydrogenasa).
V jednom řešení jc glukosodehydrogenasa získávána z B učilhis megalér i um. Jc výhodné, je-li nesena plazmidem pNTSIG.
Transformované buňky podle tohoto vynálezu jsou transformanti. kde buňky byly transformovány uvedeným plazmidem,
V jednom provedení jsou transformované buňky E. coli. Vc výhodném provedení, jsou transformované buňky E. coli HB 101 (pNTS I).
Transformované buňky podle předkládaného vynálezu jsou buňky transformované lak. že prvý plazmid obsahuje DNA kódující enzym s aktivitou asymetricky redukovat ethyl 4-chloroacetoacctát za vzniku ethyl (S)-4-chlor--3-hydroxybutyrátti a druhý plazmid obsahuje DNA kódující enzym mající aktivitu regenerovat koenzym na kterém je enzym závislý (například glukoso2? dehydrogenasa).
V jednom řešení lze za transformované buňky pokládat takové transformanty. jejichž buňky nesou plazmid pNTSI a plazmid, které obsahujíc DNA kódující glukosodehydrogenasu. získaný zBacillus megaterium. Přednostní formou transformovaných buněk jsou buňky E. coli.
Produkční způsob pro výrobu opticky aktivního 3-hydroxybulyl esteru podle předkládaného vynálezu zahrnuje následující kroky: reakce enzymu s aktivitou asymetricky redukovat s 3-oxobutyr ester s 3-oxo-butvr esterem za vzniku opticky aktivního 3-hydroxybutyl esteru, nebo kultura mikroorganizmu majícího schopnost produkce tohoto enzymu, nebo izolovaný produkt 35 této kultury; a získání vytvořeného produktu, kterým jc opticky aktivní 3 hydroxy—butyl ester.
Produkční způsob pro výrobu opticky aktivního 3-hydroxybutyl esteru podle předloženého vynálezu sestává z těchto kroků: reakce transformantů, kterými jsou buňky transformované plazmidem nesoucím DNA kódující enzym s aktivitou asymetricky redukovat 3-oxo-butyl ester 40 s 3-oxo-butyl esterem za vzniku opticky aktivního 3-hydroxybutyl esteru; a získání vzniklého produktu, kterým jc opticky aktivní 3-hydroxybulyl ester.
Produkční způsob pro výrobu opticky aktivního alkoholu podle předloženého vynálezu sestává z těchto kroků: transformanti. kterými jsou buňky transformované plazmidem nesoucím DNA, 45 která kóduje enzym s aktivitou asymetricky redukoval karbony love sloučeniny a dále DNA kódující enzym sc schopností regenerace koenzymu, na kterém enzym závisí reagují se sloučeninami obsahujícími karbonyI a dávají vznik opticky aktivnímu alkoholu; dále získání vzniklého produktu, kterým je opticky aktivní alkohol.
Produkční způsob k získání opticky aktivního alkoholu podle předloženého vynálezu sestává /kroků: se sloučeninami obsahujícími karbonylovou skupinu reaguje transformant. kterým je buňka, která obsahuje jako první plazmid nesoucí DNA kódující enzym s aktivitou asymetricky redukovat karbony love sloučeniny za vzniku opticky aktivního alkoholu a jako druhý plazmid. který obsahuje DNA kódující enzym, který má schopnost regeneroval koenzym na kterém jc enzym závislý; dále získání vzniklého produktu, kterým je opticky aktivní alkohol.
- j CZ 298236 B6
Jc výhodné, je-li sloučeninou, obsahující karbonyI 3-oxobutyl ester, který lze zobrazil obecným vzorcem:
O
R. χΑγ/ COOR.i
R?
a výsledný opticky aktivní alkohol je 3-hydroxybutyl ester, který lze zobrazit obecným vzorcem:
OH
COOR3
Jc výhodné, jsou-li ve shora uvedených obecných vzorcích skupiny R, a 1% nezávislé halogeny, azidy, aminobenzyly nebo vodík, přičemž jeden z Rj a R; má být vodík, a R. je substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová nebo arylová skupina.
Ještě výhodnější je, je-li ve shora uvedených obecných vzorcích R] chlor, R je vodík a R; je ethyl.
Je výhodné, jsou-li ve shora uvedených obecných vzorcích skupiny Rj a R nezávisle alkylové 15 skupiny, hydroxyiové skupiny nebo vodík, přičemž jeden zlý a R? má být vodík, a R- je substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová nebo arylová skupina.
Ještě výhodnější je, je-li ve shora uvedených obecných vzorcích R] hvdroxylová skupina, R? je vodík a Rj je ethyl.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. I je znázorněno pořadí bází a tomu odpovídající aminokyselinové sekvence.
Na obr. 2 je znázorněn způsob užitý při konstrukci rekombinantního plazmidu pNTSIG.
Příklady provedení vynálezu
Dále bude předložený vynález popsán se všemi podrobnostmi.
(Purifikace CRD enzymu)
Organizmus používaný jako zdroj CRD enzymu v předloženém vynálezu, není zcela přesně vymezen, ale muže jím být například kvasinka rodu Candidu. Jc obzvláště výhodné, je-li to kvasinka Candidci tiiagnoliae 1F0 0705, která je uložená ve sbírce mikroorganizmů „Cetraalbureau voor Schimmelcultures” (CBS; Oosterstraat 1, Postbus 273, NL/3740 AG Baarn. 1 lolandsko) pod číslem CBS166 a jejíž izolace a charakteristika jsou popsány v knize „Tlíc Yeasts. a Taxonomie
Study. 3rd ed. (1984) pp.731. Mikrob schopný produkce enzymu podle předloženého vynálezu může být buď divoký, nebo mutantní kmen. Rovněž může být používán mikrob získaný genetickými technikami, jakými jsou fuze buněk nebo genetické manipulace. Například mikrob získaný genetickou manipulací, který produkuje enzym podle předloženého vy nálezu lze získat metodou zahrnující tylo kroky: izolace a/nebo purifikace tohoto enzymu a určení části nebo celé sekvence aminokyselin; získání DNA sekvence nebo úseku DNA kódujícího enzym, na základě dříve zmíněné sekvence aminokyselin; vnesení této DNA do jiného mikroorganizmu s cílem získat rekombinantní mikroorganismus podle předloženého vynálezu.
Médium ke kultivaci mikroorganizmu pro získání enzymu podle předloženého vynálezu (nebo mikroorganizmu užitého pro přípravu (S M-ha logen-3-hydroxy butyl esteru podle předloženého vynálezu) není zvláště vymezené, pokud na něm může mikroorganismus růst. Například mohou byt použita obvyklá tekutá výživná média, obsahující zdroj uhlíku, zdroj dusíku, anorganické soli, organické nutrienty.
Pod ..mikrobiální kulturou zde pak rozumíme mikrobiální buňky nebo tekutou kulturu obsahující mikrobiální buňky a ..jejich vytvořený produkt“, což znamená produkt získaný extrakcí a purifikací. jak je popsáno dále.
Způsob extrakce a purifikace enzymu, které se užívají pro tyto účely odborníky v dané oblasti techniky, mohou být užity pro extrakci a purifikaci enzymu po výsledné kultivaci. Například /kultury se ccntrifugací separují mikrobiální buňky, které se suspendují do vhodného pufru. Buňky v této suspenzi se rozruší nebo rozpustí za použití fyzikálních technik, jako jc užití skleněných kuliček nebo biochemickými technikami, což představuje použití vhodného enzymu. Pevné částice jsou potom z roztoku odstraněny centrifugací a tak sc získá nečistý roztok enzymu. Podobně lze roztok surového enzy mu získat z kultury purifikačními metodami, které jsou podobné shora popsanému postupu.
Zmíněný roztok surového enzymu lze dále čistit za použití způsobů užívaných odborníky v dané oblasti techniky, jako jc srážení síranem amonným, dialysa a chromatografie. a to jak samotnými nebo v jejich kombinaci. Pokud jde o chromatografii, různé typy chromatografíí jako je hydrofobní chromatografie. iontoměnná chromatografie (např. DEAE Scpharosa). geiová filtrace, mohou být užity buď samotné, nebo v kombinaci pro získání enzymu podle předloženého vynálezu.
Například CRD enzym lze izolovat z Candidu magnoliue ΙΓΟ 0705 následujícím způsobem.
Nejprve sc shora uvedená kvasinka kultivuje vc vhodném médiu, a mikrobiální buňky jsou sklizeny z výsledné kultury ccntrifugací. Mikrobiální buňky jsou rozrušeny desintegrátorem Dyno (výrobce Dyno—Milí), a další centrifugací jsou odstraněny zbytky buněk a získá sc bezbuněčný extrakt. Tento bezbuněčný extrakt se pak dále zpracovává postupy jako oje vydolování (tj. srážení síranem amonným a fosforečnanem sodným), sráženi rozpouštědly (frakcionové srážení bílkovin za použití acetonu, ethanolu nebo podobnými látkami), dialýzou, gelovou filtraci, iontoměničovou chromatografíí a sloupcovou chromatografíí, což inůže být reverzní fázová chromatografie a ultrafiItrace samotná nebo v kombinaci s dalšími postupy, aby se enzym purifikoval. CRD enzymová aktivita může být určena měřením ze snížení absorpce 1 mM ethyl 4 chloracetátu jako substrát, při 340 nm a 30 °C v 100 mM fosfátovém pufru (pH 6.5). 0,1 mM NADPH jako koenzym po přidání sledovaného enzymu, nebo v 200 mM fosfátovém pufru (pil 7,0) s 0,2 mM ethyl 4-chloracctátem jako substrátem a 0.32 mM NADPH jako přidaný koenzym. Za těchto reakčních podmínek oxidace 1 μηιοΙ NADPH na NADP během I minuty je deformovaná jako jednotka enzymové aktivity.
Výraz, že enzym je ..stálý, který je zde užíván znamená, že enzym má při pH 7,0. teplotě 40 °C, po uplynutí 30 minut aktivitu 90% nebo více, než byla na začátku testu.
Molekulová hmotnost enzymu byla určená gelovou filtrací za použití kolony TSK-G3000SW (φ 0,75 x 60 cm; výrobce Tosoh Corporation). Jako eluent byl užit 0.1 M fosfátový pufr (pH 7.0) obsahující 0.1M Na2SO.| a 0.05 % NaNv Molekulová hmotnost podjednotky enzymu byla určena elektroforesou v 10 % SDS polyakrvlamidovém gelu za redukujících podmínek (reduktant:
v/v% 2-merkaptoethanol) a výpočtem z relativní pohyblivosti standardních proteinů.
- 5 CZ 298236 B6
Například CRD enzym, který má pořadí aminokyselin SEQ ID No:l podle předloženého vynálezu má fyzikální a chemické vlastnosti od (1) do (4):
(1) účinek:
reaguje s ethyl 4-chloracetoacetátem za použití NADPH jako koenzymu za vzniku ethyl (Sloh I o r—3 -hydroxy buty rát u:
(2) substrátová spec i Pita:
vykazuje silnou aktivitu k ethyl 4 chloracctoacetátu zatímco prakticky vůbec nevykazuje aktivitu k ethylacctoacetátu:
(3) optimální pH: 5,5 až 6,5; a (4) optimální teplota pro aktivitu: 50 až 55 °C.
Tato látka, totiž karbony! reduktasa mající pořadí aminokyselin SEQ ID No:I podle předloženého vynálezu, má další fyzikální a chemické vlastnosti od (5) do (7):
(5) teplotní stabilita: enzym je stálý až do teploty 40 °C. při pil 7,0 po 30 minul;
(6) inhibitor: enzym jc inhibován ionty rtuti a kvcrcetinem; a (7) molekulová hmotnost: cca 76 000 určeno gelovou filtrací a cca 32 000 stanoveno SDS pólyakrylamidovou elektroforesou.
Enzym mající v podstatě identické vlastnosti s enzymem podle předloženého vynálezu může být bud' přirozený, nebo rekombinantní enzym. Například rekombinantní enzym lze získat následujícím postupem: jedna nebo několik aminokyselin v aminokyselinovém pořadí enzymu získaného zCandida mugnoliue 1FO 0705 lze nahradit, vypustit, vložit nebo přidat a tak vytvořit rekombinantní enzym, jehož enzymová aktivita je měřitelná.
(Příprava synthetické oligonukleotidové sondy)
Purifikovaný CRD enzym získaný shora uvedeným postupem je denaturován (například 8M močovinou) a pak natráven endopeptidasou (například lysyl endopeptidasou). Pořadí aminokyselin ve vzniklých fragmentech peptidů je určeno Edmanovou metodou, DNA sonda je syntetisovaná na základě určeného pořadí aminokyselin. Takováto sonda může být označena například 12P.
(Příprava genové knihovny)
Chromosomální DNA mikroorganismu produkujícího CRD enzym podle předloženého vynálezu nebo cDNA téhož je částečně natrávena vhodným restrikčním enzymem, například, Sau3Al. Fragmenty DNA mající vhodnou velikost (například 23 kb až 20 kb) po působení restrikčního enzymu jsou vloženy do kompatibilního restrikčního enzymového místa na fágovém vektoru. Výsledný rekombinantní fágový vektor je uložen in vitro a potom jc možné jím infikovat E. coli a vytvořit tak genovou knihovnu.
(Klonování Genu CRD enzymu z genové knihovny)
Takto vzniklá genová knihovna může být prohlížena a vyhledáván gen pro CRD enzym pomocí metody plakovc hybridizacc za použití P značené synthetické DNA sondy. (Science, 196. 180
-6CZ Z98Z30 B6 (1977)). Analýza pořadí bází výsledné DNA muže být určena dideoxy sekvenční metodou, dideoxy řetězovou term i nač ní metodou nebo podobně. Určení sekvencí může být prováděno za použití ABI PRISM Dye Terminátor Cyclc Sequencing Ready Reaction Kit (výrobce Perkin Ehner) a ABI 373A DNA Sequencer(výrobce Applied Biosystems).
s
Výsledný fragment DNA může být amplifikován použitím metody PCR nebo podobné a klonován.
(Konstrukce rekombinantního plazmidů obsahujícího gen CRD enzymu)
Gen CRD enzymu je vpraven do hostitelského mikroorganizmu a exprimován zde pomocí DNA vektoru. Jako takový DNA vektor, lze užít jakýkoli DNA vektor, který může zabezpečit expresi genu CRD enzymu vc vhodném hostitelském mikroorganizmu. Příklady těchto DNA vektorů jsou plazmidové vektory, fágové vektory a případně cosmidy. Lze použít kyvadlový vektor, který 15 umožňuje výměnu genu mezi různými hostitelskými kmeny. Takový DNA vektor obsahuje řídicí úseky jako je promotor (například lacUVS promotor, trp promotor, trc promotor, tac promotor, lpp promotor, tuíB promotor, recA promotor a promotor pL) a úseky posilující tuto vazbu. Například pUCNT (WO94/03613) a podobný mohou být přednostně použity. Plazmid pUCNT je výhodný proto, neboť jeho inzerční místa jako Ndel a EcoRl leží vpravo za lac promotorem 20 (downstream).
(Konstrukce rekombinantního plazmidů nesoucího jak gen CRD, tak gen enzymu majícího schopnost regenerace koenzymu, na kterém aktivita CRD enzymu závisí)
Mohou být užity enzymy' se schopností regenerace koenzymu jako jsou hydrogenasa, lormiatdehydrogenasa, alkohol dehydrogenasa. glukoso-6 fosfátdehydrogenasa, glukosodehydrogcnasa. Je výhodné, je-li užita glukosodehydrogenasa. Přesněji, jde o glukosodehydrogenasu z kmene Racillus megalerium (dále zkracovanou jako GDH). kterou lze užít.
3(> Plazmid pGDA2 (J. Biol. Chem. (1988), 264,6381) obsahuje GDH gen získaný lBucíIIus megaterium. Fragment nesoucí GDH gen se dá vyjmout z tohoto plazmidů a vložit do plazmidů obsahujícího gen enzymu CRD, a to buď před něj, nebo za něj (upstream nebo downstream) a tak vytvořit rekombinantní plazmid nesoucí jak gen pro CRD enzym, tak gen pro GDH.
(Transformace)
Výsledný rekombinantní plazmid nesoucí gen CRD enzymu nebo rekombinantní plazmid mající jak gen CRD enzymu, tak gen GHD, mohou byt konvenčními metodami vneseny do hostitelské buňky. Nebo rekombinantní plazmid nesoucí gen CRD enzymu a rekombinantní plazmid nesoucí 4o gen GDH mohou být současně, nebo postupně vneseny do hostitelské buňky tak, aby se získal kmen transformovaný těmito dvěma plazmidy.
Jako hostitelskou buňku lze užít bakterii, kvasinku, vláknitou houbu, rostlinnou buňku, živočišnou buňku apod. Obzvláště výhodné je. uži je-li se E. co/i.
Plazmid je možno přenést do hostitelské buňky některou známou současnou metodou, jakou je metoda zahrnující smíchání hostitelské buňky v kompetentním stavu s rckombinaniním plazmidem a dále metoda zahrnující transfckci plazmidů za použití plazmidů typu „hclper pomocí konjugační transmise.
Plazmid vnesený do hostitelské buňky se v této může autonomně replikovat jako cpisom. Nebo celý plazmid nebo jeho části jsou včleněny do chromosomu a replikují se spolu s chromosoniem.
CZ Z982J6 B6
Aktivita GDH transformovaných buněk muže být určena měřením zvýšení absorpce při 340 nm při 25 °C. v 1 M Tris-HCl pufru (pH 8.0), v reakci, kde substrátem je 0.1 M glukosa. 2 mM
NADP je koenzymem, po přidání enzymu.
? (Získání opticky aktivního alkoholu)
Opticky aktivní 4-halogcn-3-hydroxybutyl ester, který je reprezentantem opticky aktivních alkoholů lze získat následujícím způsobem například takto.
Jako substrát je užit 4-halogen acetoacctyl ester přestavený následujícím obecným vzorcem:
I<2 (kde. R| je halogen, R? jc vodík a R;, jc substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo aryl).
V případě, je-li alkyl, mohou být použity například skupiny jako methyl, ethyl, propyl, buly!, nebo izopropyl. Je-li R aryl. pak například mohou být přítomny skupiny jako fenyl nebo tolyl.
Je-li IU substituovaný ary l, pak jsou výhodné skupiny jako flurofenyl, chlorofenyl a podobně.
Je výhodné, je-li jako R[ chlor nebo brom, a R Je pak alky lová skupina od 1 do 4 atomů uhlíku.
Ještě výhodnější je, je-li substrát methyl 4 chloracetoacetát. ethyl 4-chloracetoacclát, methyl 4-bromacetoacetát, nebo ethyl 4-bromacctoacetát. Rovněž ethyl 4-jodacetoacetát. ethyl jo 4-hydroxyacetoacetát, ethyl 2-chlor-3-oxobutyrát, ethyl 2-methy l-3 oxobutyrát, ethy l 4-azidoacetoacetát a podobné sloučeniny mohou být substráty.
Shora uvedený 4-halogenacetoacetátový ester lze připravit metodou uveřejněnou například v Japanese Laid-Open Publícation 61-146191. Například ty to 4-halogcnacetoacetátové estery' 25 mohou být připraveny metodou používající diketen jako výchozí materiál který reaguje s halogengenem za vzniku-halogenacetoacetát ha lidu, který pak reaguje s alkoholem. Nebo 4 halogen aeetoacetátový ester jc užit jako výchozí materiál a jeho kvartemí místo je přímo halogengenováno.
4 Halogenacctoacetyl ester jako substrát se vnáší do vhodného rozpouštědla spolu s NA DPH jako koenzymem a kulturou transformovaného mikroorganizmu, nebo z něj získaným produktem a směs je promíchávaná a pH se vhodně upraví. Tato reakce probíhá při pl I od 4 do 10 při teplotě od 10 do 70 °C. Ačkoli užívané koncentrace substrátu jsou v rozsahu od 0.1 do 90% (w/v), lze také substrát kontinuálně přidávat. Reakce může probíhat jak vsádkovým, tak kontinuálním 35 způsobem.
Produkt získaný z mikroorganizmu nebo jiných buněk, jak uvedeno shora, může být surový extrakt, nakultivované mikrobiální buňky, lyofilizované organizmy, acetonem vysušené organizmy, homogenát mikrobů a podobně. Tento vytvořený produkt může být užíván ve stavu imobili10 zovaném, jako enzym, nebo jako buňky mikroorganizmů. Pro (mobilizaci lze užít současné metody (například fyzikálně absorpční metody, zřetězující vazby nebo zachycovací metody).
V reakci pak, množství drahého koenzymu, může být značně sníženo za využití obecného regeneračního systému NADPH. Například může být užita metoda používající GDH a glukosu, která je typickým regeneračním systémem NADPH. Reakční podmínky, i když závisí na typu enzymu.
mikroorganizmu nebo jeho produktu, jsou následující: koncentrace substrátu je v rozmezí od 0.1 do 90 % wt. reakční teplota je od 10 do 50 °C. pH je od 5 do 8. a doba reakce jc mezi i až 36 hodinami.
-8CZ 298236 B6
Shora uvedená reakce může být prováděna za použití kultury transformovaného mikroorganizmu nebo vytvořeného produktu získaného vnesením jak genu pro CRD enzym a genu enzymu (GDH) majícího schopnost regenerovat koenzym, na kterém CRD enzym závisí, do hostitelského mikroorganizmu. V tomto případě pak už další příprava zdroje enzymu požadovaného pro rege5 neraci koenzymu není nutná, a (Spl-halogen-3-hydroxybutyl ester lze připravit s nižšími náklady.
Tento 4-halogcn- 3-hydroxy butyl ester vzniklý v reakci může být puntíkován standardními metodami. Například 4 halogen-3-hydroxy butyl ester je podroben centrifugách filtraci a dalším to postupům, které jsou obvyklé pro odstranění mikrobů z reakční směsi. Výsledný produkt jc pak extrahován organickým rozpouštědlem jako například ethylacetátcm a toluenem a odvodněn látkami jako síran sodný. Organické rozpouštědlo se odstraní pod vakuem. Výsledný produkt je pak podroben vakuovému sušení, chromatografii (například křemičité gelovc sloupcové chromatografii) a podobným purifikačním postupům.
Kvantitativní stanovení 4 halogen-3-hydroxy butyl esteru lze provádět plynovou chrom Biografií. Například kvantitativní stanovení ethyl 4-chlor-3-hydroxybutyrátu může být provedeno na chromatografu se skleněnou kolonou (ID 3 mm x 1 m) plněnou PEG 20M Chromosorb WAWDMCS 10% 80/100 mesh (150/200 otvorů na μπι) (vyrobeno GL Science Co. Ltd.) při 20 150 °C a FID detekci.
Optická čistota ethyl (S>-4-halogen-3 -hydroxybutyrátu může být určena použitím HPLC s optickou izolační kolonou CH1LCEI. OB (vyrobeno Daicel Chemical Industrics, Co.. Ltd.).
Tudíž jak svrchu popsáno předložený vynález umožňuje produkci CRD enzymu. Dále pak. za použití tohoto enzymu, je zabezpečen účinný produkční způsob k získání opticky aktivního alkoholu, jako například (S)-4-haIogen-3 hydroxybutyl esteru.
V dalším pak bude předložený vynález popsán podrobně na příkladech, které jsou pouze ilustrač30 ní a není jimi omezen rozsah ochrany.
Detaily způsobů použitých k genovým manipulacím užívaných k získání rekombinantní DNA jsou popsány na příkladech v následujících publikacích.
t5 (I) Molccular Cloning 2nd Edition (Čokl Spring Harbor Laboratory Prcss, 1989) (II) Current Protocols in Molccular Biology (Greene Publishing Associates and WileyIntcrscience) (Příklad 1: Purifikace CRD enzymu)
CRD enzym mající schopnost asymetricky redukovat 4-halogen acetoacctátový ester, získaný 7.Candkia mctgnoliae 1FO 0705, za vzniku (SM-halogen-3-hydroxybutyl esteru byl purifiko15 ván následujícím způsobem, tak, že se pohyboval jako jediný pruh v elektroforese.
Bylo připraveno 8 000 ml tekutého média následujícího složeni, toto médium bylo rozděleno po 400 ml dávkách do Sakaguchiho lahví o obsahu 2 000 ml a sterilizováno parou při I2O°C po 20 minut.
Složení media:
Glukosa
Polypepton
KH2POt
5,00 %
0,50 %
0,20 %
-9CZ 298236 B6
K;HPO4 0.10%
MgSOj.7 H2O 0,01%
Vodovodní voda
PH 6.5 s
Shora uvedené médium bylo zaočkováno kulturou Candida magnoliae IFO 0705. která byla předkultivovaná v objemu 5 ml/láhev po 3 dny na třepačce pří 30 °C. Buňky mikroorganizmu byly sklizeny / výsledné kultury ccntrifugací a dvakrát promyty roztokem soli, takže se získalo 230 g vlhké hmoty biomasy. Z této vlhké biomasy bylo 1 <80 g rozmícháno v 360 ml 50 mM io fosfátového pufru (pH 7,0). potom byly buňky rozbity dezintegrálorem. Dyno milí (výrobce
Dyno-Mill). Suspenze dczintegrovaných mikroorganizmu byla centrifugována. aby sc odstranily zbytky buněčných struktur a získalo se 760 ml bezbuněčného extraktu. K němu byl přidán síran amonný až do 40% nasycení. Výsledný prccipitát byl odstraněn ccntrifugací a supernatant byl dialyzován proti 10 mM fosfátovému pufru (pH 7.0) obsahujícímu 0,1 mMDTT. Výsledný 15 produkt byl nanesen na kolonu (500 ml) DEAE Scphacelu (výrobce Pharmacia Biotech), která obsahovala stejný pufr, a rovněž tímto pufrem byla kolona promyta. Frakce s enzymovou aktivitou byly sebrány a k naředénému roztoku, který prošel kolonou byl přidán NaCl až do konečné koncentrace 4 M. Aktivní frakce byly naneseny na kolonu (200 ml) plněnou Phemvl Scpharose CL-4B (výrobce Pharmacia Biotcch). ekvilibrovanou lOinM fosfátovým pufrem, 20 obsahujícím 4 M NaCl a 0,1 mM DTT. na kterou sc enzym adsorboval. Pote byla kolona promyta stejným pufrem. aktivní frakce byly eluovány lOmM fosfátovým pufrem (pH 7,0) s lineárním gradientem NaCl (od 4 M do 0 M) a ethylenglykolu (od 0 do 50 % w/v). Eluované aktivní frakce byly spojeny a dialyzovány přes noc v 10 mM fosfátovém pufru (pH 7,0).
Výsledný dialysát byl nanesen na kolonu (1 ml) Mono Q HR 5/5 (FPLC systém vyrobený Pharmacia Biotech). který byl ekvilibrován v 10 mM fosfátovém pufru. Aktivní frakce v promývacím roztoku byly spojeny a koncentrován v ultrafi Itrací na 200 μΙ. Tento koncentrát byl nanesen na kolonu (24 ml) obsahující Supcrdex 200 HR 10/30 (výrobce Pharmacia Biotech), která byla ekvilíbrovaná 10 mM fosfátovým pufrem (pH 7,0) obsahujícím 0.2 M NaCl a 0.1 mM LÍTÍ a 30 byly eluovaná týmž pufrem. Aktivní frakce byly spojeny pro získání purifi kovaného enzymu.
(Příklad 2: Měření vlastností enzymu)
Byly zkoumány enzymové charakteristiky enzymu získaného způsobem uvedeným v příkladu 1.
Enzymová aktivita byla určena ve 3 ml reakčního roztoku obsahujícího 0,2 mM ethyl 4-chloracctoacetát jako substrát, 0,32 mM NADPH jako koenzym a 0,1 ml roztoku enzymu v 200 mM fosfátovém pufru (pH 7,0) při 1 minutové reakci při 30 °C a měření snížení hodnot absorpce při 40 340 nm.
(1) Účinek: Enzym působí na ethyl 4-chloracetoacetát za přítomnosti NADPH jako koenzymu za vzniku ethyl (S)-4-hydroxybutyrátu, který má optickou čistotu minimálně 99% nebo více.
(2) Substrátová specifita; Enzym podle předloženého vynálezu reaguje s různými karbony 1 obsahujícími sloučeninami jak ukazuje níže uvedená Tabulka 1. Podmínky reakce těchto substrátů byly stejnéJako u ethyl 4-chloracetoacctátu, Výsledná substrátová specifita, kterou enzym vykazoval ukazuje Tabulka 1.
- 10CZ 298256 B6
Tabulka I
Substrát 0,2 mM
Relativní aktivita (%)
| ethyl 4-chIoracctacetát | 100 |
| cthyl-acetoacetát | 0 |
| p-nitrobcnzaldehyd | 0 |
| o-nitrobanzaldehyd | 0 |
| m-nitrobenzaldehyd | 0 |
| p-chlorbenzaldehyd | 0 |
| ochlorbcnzaldehyd | 0 |
| m-chlorbenzaldehyd | 0 |
| mkotínaldchyd | 0 |
| iso-mkotinaldehyd | 0 |
| benzaldehyd | 0 |
| glyoxal | 0 |
| mcthylglyoxal | 0 |
| diacelhyl | 19 |
| chloracetaldehyd | 0 |
| kamforylchinon | 0 |
| ethyl 2-chloracetoacetát | 95 |
| methyl 4-chIoracetacetát | 11 |
| methyl 2-chloracetoacetát | 11 |
| oktyl 4-chloracetoacetát | 36 |
(3) Optimální pil: Enzymová aktivita byla měřena vpil rozsahu od 5,0 do 8.5 v fosfátovém pufru nebo pufru Tris - HC1. Výsledkem bylo zjištění, že optimální pil pro účinek enzymu na ethyl (S) -4-chlor-3 hydroxybutyrát leží mezi hodnotami 5.5 - 6,5.
(4) Optimální teplota: Aktivita enzymu podle předloženého vynálezu byla měřena s užitím ethyl 4-chloraccloacetátu jako substrátu po 1 minutu v teplotním rozmezí od 20 do 60 QC. Výsled- kcm je zjištění, že optimální teplota je v rozmezí od 50 do 55 °C.
(5) Teplotní stabilita: Enzym podle předloženého vynálezu byl inkubován při pfl 7.0 při 40 °C po dobu 30 minut, výsledná aktivita byla měřena s ethyl 4-chloracctoacetátem jako substrátem. 7,a těchto podmínek byla zachovaná 90 % aktivita, kterou měl enzym před ošetřením.
(6) Inhibitor. Různé ionty kovů a inhibitory' v různých koncentracích jsou uvedeny v dále uvedené Tabulce 2. Koncentrace odpovídají těm. které byly v reakční směsi kde, měřeným produktem byl ethyl (S)-4-chlor-3-hydroxybutyrát, vytvořený ze substrátu ethyl 4-chloracetoacctátu. Výsledkem je zjištění, že enzym podle předloženého vynálezu byl inhibován kvercetinem a ionty rtuti, jak vyplývá z Tabulky 2.
-11CZ 298230 B6
Tabulka 2
| Sloučenina | koncentrace inhibitoru (mM) | relativní aktivita (%) |
| Bez přídavku | 100 | |
| Kvercetin | 0,01 | 84 |
| 0,1 | 0 | |
| Difenyl hydantoin | 1 | 84 |
| Dikutnarol | OJ | 97 |
| 2,4-dinitrofenol | OJ | 86 |
| DTNB | 0,05 | 100 |
| kyselina jodoctová | 1 | 100 |
| ΝΈΜ | 1 | 105 |
| PMSF | 1 | 93 |
| p-CMB | 1 | 88 |
| EDT.A | 1 | 95 |
| Fenylhydrazin | 1 | 97 |
| SnCb | 1 | 77 |
| PbCb | 1 | 86 |
| CdCI2 | 1 | 91 |
| CuCb | 1 | 85 |
| CoCl2 | 1 | 89 |
| MgCb | 1 | 83 |
| ZnCb | 1 | 97 |
| HgCb | OJ | 49 |
(7) Molekulová hmotnost: molekulová hmotnost enzymu byla měřena za užití TSK-G 3000SW kolony v 0.1M fosfátovém pufru (pil 7,0) obsahujícího 0.1M Na2SO,( a 0.05 % NaN« jako eluent. a byla stanovena cca 76 000. Molekulová hmotnost podjednotky enzymu byla určena z výsledků elektroforesy s 10 % SDS-polyakry (amidovým gelem v přítomnosti 2 % v/v 2-merkaptocthanolu a byla vypočtena z relativní pohyblivosti standardních proteinů. Jako výsledek byla stanovena molekulová hmotnost podjednotky enzymu cca 32000.
(8) Odolnost k organickým rozpouštědlům: do fosfátového pufru (pH 7.0) bylo přidáno ekvivalentní množství ethylacetátu nebo butylacetálu. kde byl přítomen enzym podle předloženého vynálezu a směs byla třepána při 28 °C po 30 minut a pak centrifugována. Zbytková aktivita enzymu ve vodné fázi byla měřena za použití ethyl 4-cliloracetoacctálu jako substrátu. Výsledkem je zachování 72 % aktivity po přidání ethylacetátu a zachování 85 % aktivity po přidání butylacetátu.
(Příklad 3: Produkce ethyl (S>-4 chlor-3-hydroxybutyrátu za použití enzymu podle předloženého vynálezu)
Ke 100 ml fosfátového pufru (pH6.5), bylo přidáno 25 ml obsahujících 50 jednotek enzymu podle předloženého vynálezu, 250 mg ethyl 4-cliloracetoacetátu, 1,56 mg NADP, 280 mg glukosy a 60 jednotek glukosodehydrogenasy (vyrobeno Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) a směs byla 24 hodin promíchávána při 30 °C. Po skončení reakce byla reakční kapalina extrahovaná ethylacetátem a extrakt po odstranění rozpouštědla byl analyzován. Jako výsledek bylo nalezeno.
LZ ZMSZJÍ) B6 že ethyl (SHJ-chlor 3 -hydroxybutyrát o optické čistotě minimálně 99% byl produkován s výtěžkem 98 %.
Optická čistota ethyl (S)-4-chlor-3- hydroxybutyrátu byla ověřena Na HPLC s optickou izolační kolonou. CHIRACLL OB (vyrobeno Daicel Chemical Industries, Co.. Líd.). Chromatografie byla prováděna s použitím směsi hexan/izopropanol v poměru 9/1 jako mobilní fáze při rychlosti průtoku 0.8 ml/min. detekce se prováděla měřením absorpce při 215 nm.
Kvantitativní stanovení ethyl (S) 4-chlor-3-hydroxybutyrátu bylo provedeno plynovou chromá· io tografií při 150 ŮC, s použitím skleněné kolony (ID 3 mm x 1 m) plněné PEG-20M Chromosorbem WAW DMCS 10% 80/100 rnesh 150/200 otvoru na μιη (vyrobeno GL Science Co.. Ltd.). detekce byla provedena pomocí FID.
i? (Příklad 4: Produkce ethyl (S)-4 -brom-3-hydroxybutyrátu za použili enzymu podle předloženého vynálezu)
Ke 100 ml fosfátového pufru (pH 6,5), bylo přidáno 2,5 ml obsahujících 5 jednotek puntíkovaného enzymu podle předloženého vynálezu, 25 mg ethyl 4-bromacetoacctátu, 0,16 mg NADP, 20 28 mg glukosy a 6 jednotek glukosodeliydrogenasy (vyrobeno Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) a smés byla 24 hodin promíchávána při 30 °C. Po skončení reakce byla reakční kapalina extrahovaná ethylacctátem a extrakt po odstranění rozpouštědla byl analyzován. Jako výsledek bylo shledáno, že ethyl (S) 4-broni-3 hydroxybutyrát byl produkován stejným způsobem jako ethyl (S)~ 4—chlor—3- hydroxybutyrát v příkladu 2.
(Příklad 5: produkce methyl-(S)-4-chlor-3-hydroxybutyrátu za použití enzymu podle předloženého vynálezu).
K 2,5 ml butylacetátu bylo přidáno 2,5 ml 100 mM fosfátového pufru (pil 6.5) obsahujícího 5 jednotek enzymu podle předloženého vynálezu. 25 mg methyl 4-chloracetoacetátu, 0,16 mg NADP, 28 mg glukosy a 6 jednotek glukosodehydrogcnasy (vyrobeno Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) a směs byla 24 hodin promíchávána při 30 °C. Po skončení reakce byla reakční kapalina extrahovaná ethylacctátem a extrakt po odstranění rozpouštědla byl analyzován. Jako výsledek bylo nalezeno, že methyl (S)-4-chlor-3-hydroxy buty rát byl produkován stejným způsobem jako ethyl (SM-chlor-3-hydroxybutyrát v příkladu 2.
(Příklad 6: produkce ethyl (S)—4—chlor—3-hydroxybutyrátu za použití enzymu podle předložené40 ho vynálezu: kontinuální přidávání substrátu)
EthyW-chloracetoacctál v množství 3,8 g byl kontinuálně přidáván k 50 ml 100 mM fosfátového pufru (pH 6,5) obsahujícího 5 jednotek enzymu podle předloženého vynálezu. 25 mg methyl 4-chloracetoacetátu. 1.56 mg NADP, 4,5 mg glukosy a 250 jednotek glukosodehydrogcnasy 45 (vyrobeno Amano Pharmaceutical Co., Ltd.). 0.24 g NaCI rychlostí 0,23 g za hodinu a směs byla hodin promíchávána při 30 °C, při stálé úpravě pH hydroxidem sodným. Po skončení reakce byla reakční kapalina extrahována ethylacetátem a extrakt po odstranění rozpouštědla byl analyzován. Jako výsledek bylo nalezeno, že ethyl (S)-4-chlor-3-hydroxybutyrát. s optickou čistotou 100% c.c. byl získán z výtěžkem 91 %. Kvantitativní analýzou prováděnou měřením 50 optické čistoty ethyl (S)-4-chlor-3-hydroxybutyrátu bylo zjištěno, že ethyl (S)—4—chlor—3— hydroxybutyrát byl produkován stejným způsobem jako v příkladu 2.
CZ 298256 B6 (Příklad 7: Klonování genu pro CRD enzym) (Vytvoření knihovny chromosomální DNA)
Chromosomální DNA byla extrahovaná z nakullivovaných buněk Candidu mugnoliue 1FO 0705 podle metody popsané Hercfordem (Cell, 18.1261 (1979)). Získaná chromosomální DNA byla částečně rozštěpena SauSAl a fragmenty DNA o velikosti 23 - 20 kb byly vloženy do místa Bamlll fágového vektoru EMBL3 (dodáno Stratagene). Výsledný rekombinantní fugový vektor byl in vitro „zapakován s užitím Gigapack II Gold (dodáno Stratagene) a pak byla provedena infekce E. coli NM4I5 tímto vektorem, a tak vznikla knihovna chromosomální DNA složená z cca 20 000 úseků DNA.
(Příprava synthetieke oligonuklcolidové sondy)
Purifikovaný CRD enzym získaný podle postupu popsaném v příkladu 1 byl denaturován v přítomnosti 8 M močoviny a pak natráven lysylpeptidasou z Achromobaeler (vyrobeno Wako Pure Chemical lndustries, Ltd.). Pořadí aminokyselin vzniklých peptidů bylo stanoveno Edmanovou metodou.
Na základě výsledného pořadí aminokyselin, byly syntetisovány DNA sondy o následujícím složení.
Sonda 1: 5'-GCNCAYACNAARAAYGA-3' (SEQ ID No:3) Sonda2: 5'-AAYGTNGARTAYCCNGC-3’ (SEQIDNo:4) Sonda 3: 5'-CTRGTYCTRCTRCTRTT-3ř (SEQ ID No:5 )
Sondy 1,2 a 3 byly označeny P za užití Megalabelu (vyrobeno Takara Shuzo Co„ Ltd.) a označené sondy byly použity v dalších experimentech.
(Klonování genu enzymu CRD z knihovny chromosomální DNA)
Knihovna chromosomální DNA vytvořená shora popsaným způsobem byla prohledávaná podle paků fágů obsahujících gen pro CRD enzym plakovou hybridizační metodou (Science, 196, 180 (1977)) za užití ’2P značených synthetických DNA sond. Jako výsledek byl získán jeden pozitivní plak. Poté byla rekombinantní fágová DNA získaná z pozitivního plaku natrávena dvěma enzymy: EcoRl a HindlIL výsledná DNA pak byla analyzovaná pomocí metody Southern blotting (J. Mol. Biol., 98, 53 (1975)). Jako výsledek byl nalezen fragment DNA cca 1.3 kb vytvořený účinkem EcoRl a HindlIL který' byl hybridizován se shora uvedenými synthctickými DNA sondami. Fragment DNA o velikosti cca 1,3 kb byl inzertován do místa EcoR 1—HindiII plazmidu pUC19 (dodán Takara Shuzo Co„ Ltd.) a tak byl vytvořen rekombinantní plazmid pUC HE a bylo určeno, že obsahuje část chromosomální DNA nesoucí gen pro CRD enzym. Tento plazmid byl pojmenován jako pUC-HE.
(Určení pořadí bází)
Celá řada rekombinantních enzymů, které působily na shora uvedený rekombinantní plazmid pUC-HE, byla užita a získané fragmenty byly analyzovány tak, aby vytvořili restrikční mapu enzymu. Potom, různé fragmenty DNA získané během analýzy byly inzerte vány do multi-klonových míst plazmidu pUC19 s cílem získat rekombinantní plazmid. Za použití těchto rekombinantních plazmidu, bylo pořadí bází daného vloženého fragmentu analyzováno za použití systému ΛΒΙ PRISM Dye Terminátor Cyclc Sequencing Ready Reaction Kit (vyrobeno Perkin Ehner) a ABI 373A DNA Scquencer (vyrobeno Applied Biosystems). Jako výsledek těchto postupů byla
- 14CZ 298236 B6 získaná celá sekvence bází fragmentu DNA o velikosti cca 1,3 kb. kde se očekávalo, že je přítomný gen pro CRD enzym. Obr. 1 ukazuje takto získané pořadí bází. Pořadí aminokyselin vypočtené z pořadí bází části strukturálního genu je rovněž zobrazeno pod odpovídajícími sekvencemi bází na obr. 1. Pořadí aminokyselin bylo porovnáno s částečným pořadím získaným 5 z fragmentu peptidu purifíkovaného enzy mu CRD po účinku lysylcndopeptidasy. Jako výsledek bylo nalezeno, žc částečné aminokyselinové sekvence z purifíkovaného CRD enzymu by ly rovněž nalezeny v poradí aminokyselin vypočteném na základě sekvence bází (tyto části jsou podtržené úseky pořadí aminokyselin na obr. 1) s výjimkou nepřítomnosti methíoninu na N konci. Předpokládá se, že methionin na N konci je odstraněn modifikacemi po skončení 10 protcosynthesy.
(Příklad 8: Konstrukce rekombinantního plazmidů obsahujícího gen enzymu CRD)
Aby mohl být CRD enzym tvořen v E. coli byl pomocí transformace připraven rekombinantní plazmid. Nejprve byla přidaná dvouřetčzcová DNA nesoucí Ndel místo, do iniciačního kodonu strukturálního genu pro CRD a rovněž EcoRl místo bylo přidáno bezprostředně po tcrminaci téhož kodonu, následujícím způsobeni. Jak N konec DNA primerů nesoucího místo Ndel vnesený do části iniciačního kodonu strukturálního genu CRD enzymu, tak C konec DNA primerů 20 nesoucí EcoRl místo přidané bezprostředné po terminaci kodonu strukturálního genu, nebyly syntetisovány. Pořadí bází těchto dvou primerů jc následující.
N-konec DNA primerů
5TAGTCGTTAACCATATGGCTAAGAAGAACTTCTCCAAC-3' (SEQ ID No: 6)
C-konec DNA primerů
5TCTGAGTTAACGAATTCTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGT-3' (SEQ ID No: 7)
Použitím těchto dvou shora uvedených synthetických DNA primerů, byla synthetizovaná dvouřetězcová DNA za použití plazmidů pUC-HE, vytvořeného jak uvedeno v příkladu 7. jako 25 tcrnplátu. Výsledný fragment DNA byl natráven Ndel a EcoRl a vložen do Ndel a EcoRl míst vpravo (downstrcam) od lac promotoru plazmidů pUCNT (WO94/03613). a tak byl vytvořen rekombinantní plazmid pNTSE stí (Příklad 9: Příprava rekombinantního plazmidů obsahujícího jak gen CRD enzymu, tak gen pro GDH)
Plazmid pGDA2 (J. Biol. Clicm. (1989), 264,6381) byl podroben dvěma enzymům; EcoRl a Pstl s cílem získat fragment DNA cca 0,9 kb velký, nesoucí gen GDH, pocházející z RaciHus 35 megaterium. Tento fragment DNA byl inzertován do EcoRI-Pstl místa plazmidů pSL301 (výrobce Invitrogen) s cílem konstrukce rekombinantního plazmidů pSI.G. Rekombinantní plazmid pSLG byl pak podroben digesci dvěma enzymy: EcoRl a Xhol a fragment DNA cca 0.9 kb velký nesoucí gen GDH, pocházející zBucillus niegaterium byl pak izolován. Tento DNA fragment byl inzertován do místa EcoRl-Sáli (umístěného vpravo „dovvnstream od CRD to genu) plazmidů pNTSl konstruovaného v příkladu 8. a tak byl získán rekombinantní plazmid pNTSIG. Metoda konstrukce a struktura pNTSIG jsou ukázány na obr. 2.
- 152982^() B6 (Příklad 10: Konstrukce rckombinantního E. coli)
E. coli HB101 (dodané Takra Shuzo Co., Lid.) byl transformován za použití rekombinantního plazmidu pNTSl. získaného podle příkladu 8 a dále za užití rekombinantního plazmidu pNTSIG. získaného podle příkladu 9. tak aby byl získán rekombinant E. coli HB lOl(pNTSl) allBlOl(pNTSlG). Takto získané rekombinantní kmeny E. coli HB 101(pNTSl) a HBlOl(pNTSlG) byly uloženy spolu s Ministerstvem zahraničního obchodu a průmyslu. Národním ústavem pro biovědy a humánní technologie pod sbírkovými čísly FERM BP 5834 a FERM BP-5835 dne 24. února 1997.
Dále, jak uvedeno v příkladu 9, byl plazmid pGDA2 (J. Biol. Chem. (1989), 264, 6381) podroben digesci dvou enzymů: EcoRl a Pstl, aby bylo možné fragment DNA cca 0,9 kb velký, nesoucí gen pro GDH z fíocillus megaterium. Tento fragment DNA byl vpraven do EcoRl-Pstl místa plazmidu pSTV28 (dodáno Takara Shuzo Co.. Ltd.) a tak vytvořen rekombinantní plazmid pSTVG. Kmen E. coli IIB 101 (pNTSS 1). u kterého byla navozena kompetence metodou s CaCE byl transformován s pS4 VG. a lak byl získán kmen E. coli HB10I (pNTSl. pSTVG).
(Příklad 1 I: Exprese enzymu CRD v rekombinantním E. coli) (Určení aktivity enzymu CRD v rekombinantním E. coli)
Rekombinantní kmen E. coli HBlOI(pNTSI) získaný podle příkladu 10 byl kultivován v 2 x ZT médiu obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu, zahuštěn a resuspendován vc 100 mM fosfátovém pufru (pH 6.5), a rozrušen působením ultrazvuku tak, aby byl získán bezbunečný lysat. Aktivita CRD enzymu v bezbuněčném lysátu byla měřena následujícím způsobem. Jako substrát byl užit 1 mM ethyl 4-chloracetoacetát. 0,1 mM NADPH jako koenzym a zkoumaný enzym byly přidány do 100 mM fosfátového pufru (pH 6.5). jako výsledek reakce bylo měřeno snížení absorpce při 340 nm při teplotě 30 °C. Za těchto reakčních podmínek oxidace 1 pmol NADPH na NADP během 1 minuty' byla definovaná jako jedna jednotka enzymové aktivity. Takto měřená aktivita CRD enzymu v bezbuněčném lysátu představovala specifickou aktivitu a v porovnání s aktivitou transformantů majících pouze vektorový plazmid. Také byla připravena bezbuněčná suspenze Candida magnoliae 1FO 0705. podle příkladu 1 a enzymová aktivita CRD enzymu byla porovnána, Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 3. Kmen E. coli ΗΒΙ0Ι (pNTSl) vykazoval zvýšenou aktivitu vc srovnání s kmenem E. coli HBIOl(plJCNT), který byl transformován pouze vektorovým plazmidem. a dále vykazoval 8.5 x vyšší aktivitu ve srovnání s Candida niugnoliae 1FO0705.
Tabulka 3
Označení kmene
Specifická aktivita CRD (U/mg)
HB101 (pUCNT)
HB101 (pNTSl)
Candida magnoliae IFO 0705 <0,01
16.0
1,89
- 16CZ 298236 B6 (Srovnání sekvencí na N-konci)
Pořadí aminokyselin na N-konci všech CRD enzymu purifikovaných zbezbuněěných extraktů získaných shora uvedenými postupy a z bezbuněčncho lysátu Candidu niugnoliae ΙΙΌ 0705. bylo určeno na 30 zbytků Edmanovou metodou. Výsledné poradí aminokyselin na N-konci bylo porovnáno a bylo zjištěno, že je všech případech stejné.
(Příklad 12: Současná exprese Enzymu CRD a GDH v rekombinantním E. coli)
Aktivita GDH v bezbunéčném lysátu získaném z rckombinantního E. coli HB101 (pNTSIG) a E. coli HB101 (pNTSI. pSTVG) získaných jak uvedeno v příkladu 10. způsobem popsaným v příkladu 1 I byla měřena následujícím způsobem. Jako substrát byla užita OJ M glukosa. 2 mM NADP jako koenzym, dále byl do reakce přidán enzym do 1 M Tris HO pufru (pH 8.0). bylo měřeno zvýšení absorpce při 340 nm při 25 °C. Za těchto reakčních podmínek, redukce 1 pmol NADP na NADPH za 1 minutu bylo definováno jako jedna jednotka enzymové aktivity. Aktivita CRD enzymu byla také měřena, a to způsobem uvedeným v příkladu 10. Tato naměřená aktivita CRD enzymu a aktivita GDH enzymu v bezbunéčném lysátu byly vyjádřeny jako specifické aktivity a porovnány s aktivitami E. coli HB101 (pNTSI). IIB101 (pNTSI, pSTVG) a transformantu HB101 (pUCNT). který obsahoval samotný vektor. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4. E. coli HB101 (pNTSI). HBKH (pNTSI, pSTVG) vykazovaly jasné zvýšení aktivity CRD enzymu a aktivity GDH v porovnání s E. coli HBI01 (pUCNT), který byl transformován jen vektorem.
Tabulka 4
| Jméno kmene | Specifická aktivita CRD (U/mg) | Specifická aktivita GDH (U/mg) |
| HB10I (pUCNT) | <0,01 | <0,01 |
| I-IB101 (pNTSI) | 16,0 | <0,01 |
| HBI01 (pNTSIG) | 8,03 | 62,6 |
| 11B10J (pNTS 1, pSTVG) | 13,5 | 1,6 |
(Příklad 13: Synthcsa (S)-4-halogen-3-hydroxybutyrát esteru / esteru 4-halogen-acctoacetátu za použití rckombinantního E. coli s vloženým genem CRD enzymu)
Rekombinantní kmen E. coli HB101 (pNTSI) získaný postupem uvedeným v příkladu 10, byl inokulován do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho bankách o obsahu 500 ml a kultivován na třepačce při 37 °C po 13 hodin. Enzym GDH (dodaný Atnano Pharmaceutical Co„ Ltd.) v množství I 250 jednotek, dále 5,5 g glukosy a 1,6 mg NADP bylo přidáno do 50 ml narostlé kultury. Směs byla promíchávaná při 30 °C a pH upraveno na 6,5 roztokem NaOH. Během míchání byl přidáván ethyl 4--chloracetoacetát v 250 mg dávkách každých 15 minut. Tímto způsobem bylo celkem přidáno 5 g ethyl 4-chloracctoacetátu a reakce probíhala 5 hodin. Poté byla reakční tekutina podrobena extrakci ethylacetátcm a extrakt byl po odstranění rozpouštědla analyzován. Bylo zjištěno, žc vzniklý ethyl (SM-chlor-3-hydroxybutyrát má 100 % optickou čistotu a byl získán s 90% výtěžkem.
Bylo provedeno kvantitativní stanovení ethyl 4-chlor-3 hydroxybutarátu plynovou chromatografií s použitím skleněné kolony (ID 3 mm x I m) plněné PEG-20M Chromosorbem WAW DMCS 10 % 80/100 mesli (150/200 otvorů na μιη) (vyrobeno GÍ. Science Co., ktd.) při 150 °C a detekce použila PID.
- 17 CZ 298236 B6
Optická čistota ethyl (S)~4—chlor 3-hydroxybutyrátu byla měřena pomocí HPLC s optickou izolační kolonou. CHIRACLL OB (vyrobeno Daicel Chcmical Industries. Co.. Ltd.). Při chromatografii byla užita směs hcxan/izopropanol v poměru 9/1 jako mobilní fáze při průtokové rychlosti 0.8 ml/min. Detekce byla prováděna měřením absorpce při 215 nm.
(Příklad 14: Synthesa (S)-4-halogen-3-hydroxybutyrát esteru z esteru 4-halogen-acetoacetátu pomocí rekombinantního kmene E. coli obsahujícího enzym CRD a GDH současně)
Rekombinantní kmen E. coli IIB10I (pNTSIG) získaný podle příkladu 10 byl inokulován do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho baňkách o obsahu 500 ml a kultivován na třepačce při 37 °C po 13 hodin. Do 50 ml výsledné kultury' bylo přidáno 5,5 g glukosy. 3,2 mg NADP. Kultura byla promíchávána při 30 °C a pil bylo upraveno na 6,5 pomocí 5 M NaOH. Během míchání byl přidáván ethyl 4-chloracctoacetát a reakce probíhala po 5 hodin. Po skončení reakce výsledná kapalina byla extrahována ethylacetátcm a extrakt byl analyzován po odstranění rozpouštědla. Bylo zjištěno, že ethyl (S)-4-chlor-3-hydroxybutý rat s optickou čistotou 100% byl produkován s výtěžkem 92 %.
Kvantitativní stanovení měření optické čistoty ethyl 4-chIor-3-hydro.xybutyrátu bylo provedeno stejným způsobem, který je uveden v příkladu 13.
(Příklad 15: Synthesa ethyl (S)-4-chlor-3-hydroxybutyrátu z ethyl 4-chloracetoacetátu za použití rekombinantního £. coli obsahujícího současně enzym CRD a GDI I)
Rekombinantní kmen E.coli 1ÍB101 (pNTSIG) vytvořený jak uvedeno v příkladu 10 byl inokulován do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho bankách o obsahu 500 ml a kultivován na třepačce při 37 °C po 13 hodin. Do 40 ml výsledné kultury bylo přidáno 19.2 g glukosy, 2,5 mg NADP. Kultura byla promíchávaná při 30 °C a pH bylo upraveno na 6,5 pomocí 5 M NaOlL Během míchání byl přidáván ethyl 4-chloracetoacetátu v celkovém množství 16,1 g kontinuálním způsobem, rychlostí 2 g/h. Reakce probíhala po 24 hodin. Po skončení reakce byla výsledná kapalina extrahovaná ethylaceíátem a extrakt byl zbaven pod vakuem rozpouštědla a koncentrát byl purifikován chromatografii na koloně s křcniičitanovým gelem s výtěžkem 15.6 g ethyl-(S)-4-chlor-3-hydroxybutyrátu. Optická čistota tohoto ethy l-(S)-4-chlor-3hydroxy butyrátu byla analyzována pomocí HPLC a byla 100 %. I H-NMR(CDCH3)ó(ppm): 1,33 (3H, t). 2,65 (2H, d). 3,31 (1IL d), 3,60 (2H, d). 4,2 (3H, m); kolona: Chiracel OB (0.46 x 25 cm) vyrobeno Daicel Chcmical Industries, Co., Ltd.; teplota kolony : 0 °C, cluent; n-hexan/2propanoi v poměru 9/1; průtoková rychlost: 0,8 ml/min.; detekce: 215 nm; elucc: 19,2 min pro (S), 17,0 minut pro (R).
(Příklad 16: Synthesa ethyl (S)-4-chlor-3-hydroxybutyrátu z ethyl 4-chloracetoacetátu za použití rekombinantního E. co!i obsahujícího současně enzym CRD a GDH)
Rekombinantní kmen E. coli HB10I (pNTSIG) vytvořený jak uvedeno v příkladu 10 by l inokulován do 100 ml 2 x YT media sterilizovaného v Sakaguchiho baňkách o obsahu 500 ml a kultivován na třepačce při 37 °C po 13 hodin. Do 40 ml výsledné kultury bylo přidáno 9,6 g glukosy. Kultura byla promíchávaná při 30 °C a pH bylo upraveno na 6,5 pomocí 5M NaOH. Během míchání byl přidáván ethyl 4 chloracetoacetátu v celkovém množství 8,1 g kontinuálním způsobem, rychlostí 2 g/h. Reakce probíhala po 24 hodin. Po skončení reakce, výsledná kapalina byla extrahovaná ethylaceíátem a extrakt zbaven rozpouštědla a koncentrát byl analyzován. Výsledkem byl ethyl (S)-4-chlor- 3-hydroxybutyrát o optické čistotě 100 %. s výtěžkem 96 %.
- IŠ CZ 298236 B6 (Přiklad 17: Synthesa ethyl (S)-4-brom-3-hydroxybutyrátu z ethyl 4-bromacetoacetátu za použití rekombínantního E. coli obsahujícího současně enzym CRD a GDH)
Rekombinantní kmen E. coli HB101 (pNTSIG) vytvořený jak uvedeno v příkladu 10 byl inoku5 lován do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného \ Sakaguchiho baňkách o obsahu 500 ml a kultivován na třepačce při 37 °C po 13 hodin. Do 50 ml výsledné kultury bylo přidáno 1.3 g glukosy.
3.2 mg NADP. Kultura byla promíchávaná při 30 °C a pH bylo upraveno na 6,5 pomocí 5M NaOH. Během míchání byl přidáván ethyl 4-chloracetoacetátu v celkovém množství 1 g. Reakce probíhala po 18 hodin. Po skončení reakce byla výsledná kapalina extrahovaná cthy lacetátem a io extrakt byl zbaven pod vakuem rozpouštědla a koncentrát byl purifikován chromatografií na koloně s křemičitá novým gelem s výtěžkem 900 mg ethyl (S) -4-brom-3 hydroxybutyrátu. Optická čistota tohoto ethyl (S)—4-brom-3-hydroxybutyrátu byla analyzována dále popsaným způsobem a byla 100%. Vzorek byl přeměněn na karbamál a ten měřen pomocí HPLC. IHNMR(CDC13) 6(ppm); 1.38 (3H. i). 2,75 (2H. m). 3,28 (1 H, br). 3.51 (2H, m). 4.18 (3H. q). 4,25 i? (111, m); Kolona Chiraccl OJ (0,46 x 25 cm) vyrobeno Daicel Chemical Industries Co., Ltd.;
Teplota kolony: 25 °C + Eluent: n-hexan/2-propanol v poměru 9/1; průtoková rychlost 0,8 ml/min.i detekce: 254 nm; doba eluce 24,2 min pro (S), 27,8 min pro (R),
2o (Příklad 18: Synthesa ethyl (S)—4—jod 3—hydroxybutyrátu z ethyl 4-jodacetoacetátu za použití rekombínantního E. coli obsahujícího současně enzym CRD a GDH)
Rekombinantní kmen E. coli ΗΒΙ0Ι (pNTSIG) vytvořený jak uvedeno v příkladu 10 byl iuokulován do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho baňkách o obsahu 500 ml a kulti25 vován na třepačce při 37 °C po 13 hodin. Do 50 ml výsledné kultury bylo přidáno 0,5 g glukosy,
3.2 mg NADP. Kultura byla promíchávaná při 30 °C a pH bylo upraveno na 6,5 pomocí 5M NaOH. Během míchání byl přidáván ethyl 4 jodacetoacctátu v celkovém množství 0,5 g. Reakce probíhala po 72 hodin. Po skončení reakce byla výsledná kapalina extrahovaná ethylacetátem a extrakt byl zbaven pod vakuem rozpouštědla a koncentrát byl purifikován chromatografií na koloně s křemičitanovým gelem s výtěžkem 900 mg ethyl (Sp4-jod-3 hydroxybutyrátu.
Optická čistota tohoto ethy l (S)—4—jod -3-hydroxybutyrátu byla analyzována dále uvedeným způsobem, byla 91,6 %. Takže vzorek byl zahříván spolu sNa-kyanidcm vdimethyl sulfoxidu aby sc získal ethyM-kyano-3-hydroxybutyrát, který pak byl změněn na ester kyseliny benzoové použitím benzoyl chloridu v přítomnosti pyridinu. Optická čistota benzoyl esteru pak byla měře35 na pomocí HPLC. NMR(CDC13)ó(ppm): 1.28 (3H. t), 2,65 (2H, d), 3,31 (311, m). 4,00 (IH. m).
4,20 (2H, q); Eluent: n-hexan/cthanol v poměru 95/5: průtoková rychlost: 19,6 minut pro (S), 21.3 minut pro (R).
(Příklad 19: Synthesa methyl (S)-4-chlor-3 hydroxybutyrátu z methyl 4-chloraccloacetátii za použití rekombínantního E. coli obsahujícího současně enzym CRD a GDH)
Rekombinantní kmen E. coli HB101 (pNTSIG) vytvořený jak uvedeno v příkladu 10 byl inokulován do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho baňkách o obsahu 500 ml 45 a kultivován na třepačce při 37 °C po 13 hodin. Do 50 ml výsledné kultury bylo přidáno 7.2 g glukosy. 3,2 mg NADP. Kultura byla promíchávaná při 30 °C a pí I bylo upraveno na 6.5 pomocí 5M NaOH. Během míchání byl přidáván ethy l 4-chloracetoacetátu v celkovém množství 4 g. Reakce probíhala po 24 hodin. Po skončení reakce byla výsledná kapalina extrahovaná ethylacetátem a extrakt byl zbaven pod vakuem rozpouštědla a koncentrát byl purifikován chromato>0 grafů na koloně s křemičitanovým gelem s výtěžkem 3.85 g methy l (SM-chlor-3-hydroxybutyrátu. Optická čistota tohoto ethyl (S) 4-chlor-3-hydroxybutyrátu byla analyzována jak popsáno dále a byla 100 %. Vzorek byl konvertován na karbamát pomocí fenyl izokyanátu v přítomnosti pyridinu a optická čistota produktu byla měřena na HPLC. 1H- NMR (CDC13)6(ppm): 2,65 (2H. m). 3,20 (IH. br), 3,63 (2H, m), 3,73 (3H, s), 4,28 (IH. m). Kolona: 55 Chiralcel OJ (0,46 x 25 cm) vyrobená Daicel Chemical Industries, Co.. Ltd.; teplota kolony:
-19 CZ 298236 B6 °C; elucnt: n-hexan/2- propanol v poměru 8/2; průtoková rychlost: Iml/min.; detekce:
254 nm: Eluční čas: 19.2 minut pro (S), 22.6 minut pro (R).
(Příklad 20: Synthesa ethyl (S)-4-azid-3-hydroxybutyrátu z ethy i 4 azidacctacetátu za použití rekombinantního E. coli obsahujícího současně enzym CRD a GDI!)
Rekombinantní kmen E. coli IIB101 (pNTSIG) vytvořený jak uvedeno v příkladu 10 byl inokulován do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho baňkách o obsahu 500 ml a kultivován na třepačce při 37 °C po 13 hodin, Do 50 ml výsledné kultury bylo přidáno 3.1 g glukosy.
3.2 mg NADP. Kultura byla promíchávaná při 30 °C a pH bylo upraveno na 6.5 pomocí 5M NaOH. Během míchání byl přidáván ethyl 4 azidoacctoacetátu v celkovém množství 2g kontinuálním způsobem, rychlostí 2 g/h, Reakce probíhala po 72 hodin. Po skončení reakce byla výsledná kapalina extrahovaná ethylacetátem a extrakt byl zbaven rozpouštědla a koncentrát byl analyzován HPLC metodou. Výsledkem byl ethyl (S)-4-azido-3-hydroxyblityrát o optické čistotě 90 %. 1H-NMR (CDC13)ó(ppm): 1.25 (3H. t). 3.30- 3.35 (3H, m). 4.20 (3H. ni): kolona: Chiralcel OB (0.46 x 25 cm) vyrobeno Daicel Chemical Industries, Co., Lid.: teplota kolony: 25 °C: elucnt: n-hexan/2-propanol v poměru 9/1: průtoková rychlost: Iml/min.; detekce: 254 nm; eluční čas: 16,2 minut pro (S), 19,6 minut pro (R).
(Příklad 21: Synthesa ethyl (S)--3.4--díhydroxybutyrátu z ethyl 4-hydroxyacetacetátu za použití rekombinantního E. coli obsahujícího současně enzym CRD a GDH)
Rekombinantní kmen E. coli HB101 (pNTSIG) vytvořený jak uvedeno v příkladu 10 byl i noku I ován do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho baňkách o obsahu 500 ml a kultivován na třepačce při 37 °C po 13 hodin. Do 50 ml výsledné kultury bylo přidáno 7,4 g glukosy, 3,2 mg NADP. Kultura byla promíchávaná při 30 °C a pH bylo upraveno na 6.5 pomocí 5M NaOH. Během míchání byl přidáván ethyl 4-hydroxyacetoacetátu v celkovém množství 4 g. Reakce probíhala po 18 hodin. Po skončení reakce byla výsledná kapalina extrahovaná ethylacetátem a extrakt byl zbaven rozpouštědla a koncentrát byl analyzován HPLC metodou. Výsledkem byl ethyl (S)-3,4-dihydroxybutyrát v množství 3.2 g a optické čistotě 100%. Analýza probíhala následujícím způsobem: vzniklý produkt reagoval s Na-kyanidem v prostředí ethanolu a pokojové teplotě za vzniku 4-kyano-3-hydroxyethylbutyrútu, který byl dále převeden benzovl chloridem v přítomnosti pyridinu na příslušný ester kyseliny benzoové. Optická čistota tohoto esteru byla měřena metodou HPLC, 1 NMR (CDC13)6(ppm): 1,30 (3H, t), 2.55 (311, m). 3.18 (1H, br). 3.55 (lil, d), 3.68 (IH. d). 4.15 (IH. s), 4.20 (2H. q): kolona: Chiralpak AS (0.46 x 25 cm) vyrobeno Daicel Chemical Industries, Co.. Ltd.: teplota kolony. 25 °C; Elnent: n-hcxan/ethanol v poměru 95/5: průtoková rychlost: Iml/min.: detekce: 254 nm; eluční čas: 19,6 minut pro (S), 21,3 minut pro (R).
(Příklad 22: Synthesa ethyl 3-hydroxy-2-methylbutyrútu redukcí z ethyl 2—methyl—3 -oxoacctátu za použití rekombinantního E. coli obsahujícího současně enzym CRD a GDH)
Rekombinantní kmen E. coli HB101 (pNTSIG) vytvořený jak uvedeno v příkladu 10 byl inokulován do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho baňkách o obsahu 500 ml a kultivován na třepačce při 37 °C po 13 hodin. Do 50 ml výsledné kultury bylo přidáno 7,5 g glukosy a 3,2 mg NADP. Kultura byla promíchávaná při 30 °C a pH bylo upraveno na 6.5 pomocí 5M NaOH. Během míchání byl přidáván ethyl 2-mcthy 1-3-oxoacetátu v celkovém množství 4 g, reakce probíhala po 18 hodin. Po skončení reakce, výsledná kapalina byla extrahovaná ethylacetátem a extrakt zbaven rozpouštědla a koncentrát byl analyzován na křemičitanové koloně. Výsledkem byl ethyl 3-hydroxy-2-methylbutyrát v množství 3,5 g o optické čistotě 91,6% e.e. Analýza probíhala následujícím způsobem; vzorek reagoval s Na-kyanidem v dimethylsulfoxidu při pokojové teplotě a vzniklý ethyl 4--kyano-3-hydroxybutyrál byl dále
-20CZ 298236 B6 podroben reakci s benzovl chloridem, v přítomnosti pyridinu za vzniku patřičného benzoyl esteru. Optická čistota této látky měřena pomocí HPLC. 1 H-NMR (CDC13)5(ppm): 1,17 (31L t), 1,22 - 3.35 (211, t). 1.28 (3H, t), 2.46 (1H, m). 2,82 (IH. br), 3,90 (I H. m). 4,18 (2H, q).
(Příklad 23: Synthesa ethyl 2-chlor-3-hydroxybiityrálu redukcí z ethyl 2-chlor-3 oxoacetátu za použití rekombinantního E. coli obsahujícího současně enzym CRD a GDH)
Rekombinantní kmen E. coli IIB101 (pNTSIG) vytvořeny jak uvedeno v příkladu 10 byl inokuio Iován do 100 ml 2 x YT media sterilizovaného v Sakaguchiho baňkách obsahu 500 ml a kultivován na třepačce při 37 °C po 13 hodin. Do 50 ml výsledné kultury bylo přidáno 6,5 g glukosy a
3.2 mg NADP. Kultura byla promíchávaná při 30 °C a pH bylo upraveno na 6,5 pomocí 5M NaOH. Během míchání byl přidáván ethyl 2-chlor-3-oxoacetátu v celkovém množství 4 g, reakce probíhala po 18 hodin. Po skončení reakce, výsledná kapalina byla extrahovaná cthvl15 acetátem a extrakt zbaven rozpouštědla a koncentrát by! analyzován na křemičitanové koloně.
Výsledkem byl ethyl 2-chlor-3-hydroxvbutyrát v množství 3,8 g. 1 H-NMR (CDCI3)8(ppm): 1.35 (6H. m). 2,55 (IH. br), 4,15 (IH, d), 4,25 (IH, m), 4,30 (211. q).
Průmyslová využitelnost
Použitím nového CRD enzymu je možno efektivně vytvářet opticky aktivní alkoholy jako například (SM-halogcn -3-hydroxy butyrát ester použitelný jako synthctický meziprodukt k výrobě léků.
Pomocí nakloňování gemu nesoucího gen pro CRD enzym a určením jeho pořadí bází, byl získán transformant s vysokou účinností produkce CRD enzymu. Také byl získán transformant s vysokou hladinou produkce CRD enzymu a zároveň GDH.
Použitím shora uvedených trans formantu jc možné provádět synthesu opticky aktivního alkoholu jako jc například (S) 4-halogen-3 hydroxybutyrát ester z karbony lových sloučenin, jako je například 4-halogen-acctoacetát s vysokou účinností.
- Ή CZ 298236 R6
Seznam sekvencí
Informace pro SEQ ID No: 1
Délka sekvence: 283
Typ sekvence: Aminokyselinová
Typ molekuly: peptid
Topologie: lineární
Popis sekvence;
| Mel | Ala | Lys | Asn | Phe | Ser | Asn | Val | Glu | Tyr | Pro | Ala | Pro | Pro | Pro | Ala |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| ííis | Thr | Lys | Asn | Glu | Ser | Leu | Gin | Val | Leu | Asp | Leu | Phe | Lys | Leu | Asn |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Gly | Lys | Val | Ala | Ser | l le | Thr | Gly | Ser | Ser | Ser | Gly | Ile | Gly | Tyr | Ala |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Leu | Ala | Glu | Ala | Phe | Ala | Gin | Val | Gly | Ala | Asp | Val | Ala | Hc | Trp | Tyr |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Asn | Ser | His | Asp | Ala | Thr | Gly | Lys | Ala | Glu | Ala | Leu | Ala | Lys | Lys | Tyr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Gly | Val | Lys | Val | Lys | Ala | Tyr | Lys | Ala | Asn | Val | Ser | Ser | Ser | Asp | Ala |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Val | Lys | Gin | Thr | Ile | Glu | Gin | Gin | Ile | Lys | Asp | Phe | Gly | His | Leu | Asp |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ile | Val | Val | Ala | Asn | Ala | Gly | Ile | Pro | Trp | Thr | Lys | Gly | Ala | Tyr | I le |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Asp | Gin | Asp | Asp | Asp | Lys | His | Phe | Asp | Gin | Val | Val | Asp | Val | Asp | Leu |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Lys | Gly | Val | Gly | Tyr | Val | Ala | Lys | His | Ala | Gly | Arg | His | Phe | Arg | Glu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Arg | Phe | Glu | Lys | Glu | Gly | Lys | Lys | Gly | Ala | Leu | Val | Phe | Thr | Ala | Ser |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Met | Ser | Gly | His | Ile | Val | Asn | Val | Pro | Gin | Phe | Gin | Ala | Thr | Tyr | Asn |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Ala | Ala | Lys | Ala | Gly | Val | Arg | His | Phe | Ala | Lys | Ser | Leu | Ala | Val | Glu |
- 77 _
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||
| Phe | Ala | Pro | Phe | Ala | Arg | Val Asn | Ser | Val | Ser | Pro | Gly | Tyr | l le | Asn |
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||
| Thr | Clu | 1 le | Ser | Asp | Phe | Val Pro | Gin | Clu | Thr | Gin | Asn | Lys | Trp | Trp |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||
| Ser | Leu | Val | Pro | Leu | Cly | Arg Cly | Gly | Clu | Thr | Ala | G1 li | Leu | Val | Gly |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| Ala | Tyr | Leu | Phe | Leu | Ala | Ser Asp | Ala | Gly | Ser | Tyr | Ala | Thr | Gly | Thr |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| Asp | 1 le | I le | Val | Asp | Gly | Gly Tyr | Thr | Leu | Pro |
275 280
Informace pro SEQ ÍD No: 2
Délka sekvence: 852 Typ sekvence: Nukleová kyselina Počet řetězců: dvojitý Topologie: lineární Typ sekvence: genomová DNA io Popis sekvence:
ATGGCTAAGA ACTTCTCCAA CGTCGAGTAC CCCGCCCCGC CTCCGGCCCA CACCAAGAAC 60
GAGTCGCTGC AGGTCCTTGA CCTGTTCAAG CTGAATGGCA AGCTTGCCAG CATCACTGGC 120
TCGTCCAGCG GTATTGGCTA CGCTCTGGCT GAGGCCTTCG CGCAGGTCGG CGCTGACGTC 180
GCCATCTGGT ACAACAGCCA CGACGCTACT GGCAAGGCTG AGCCCCTCGC CAAGAAGTAC 240
GGCGTCAAGG TCAAGGCCTA CAAGGCGAAC GTGAGCAGCT CTGACGCCGT CAAGCAGACG 300
ATCGAGCAGC AGATCAAGGA CTTCGGCCAC CTCGACATTG TCGTGGCGAA CGCCGGCATT 360
CCCTCGACGA AGGGTGCCTA CATCGACCAG GACGACGACA AGCACTTCGA CCAGGTCGTT 420
GACGTCCATC TGAAGGGTGT TCGATACGTC CCGAAGCACG CTGGCCGTCA CTTCCGCGAG 480
CGCTTCGAGA AGGAGGGCAA GAAGGGCGCC CTTGTGTTCA CGGCCTCCAT GTCTGGCCAC 540
ATTGTGAACG TGCCCCAGTT CCAGGCCACG TACAACGCGG CCA.AGGCTGG CGTGCGCCAC 600
TTCGCGAAGT CGCTGGCCGT CGAGTTCGCG CCGTTCGCGC GCGTGAACTC TGTGTCGCCG 660
GGCTACATCA ACACGGAGAT CTCGGACTTC GTGCCCCAGG AGACGCAGAA CAAGTGGTGG 720
TCGCTCGTCC CCCTTGGCCG CGGCGGAGAG ACGGCCGAGC TCGTTGGCGC CTACCTGTTC 780
CTTGCATCTG ACGCCGGCTC GTACGCCACT GGTACGGACA TCATTGTTGA CCGTGGCTAC 840
ACGCTTCCCT ΑΛ ««
Informace pro SEQ ID No: 3 i? Délka sekvence: 17
Typ sekvence: nukleotidová Počet řetězců: jeden Topologie: lineární
Typ sekvence: synthetická DNA
C'Z 298236 B6
Popis sekvence:
GCNCAACNA ARAAYGA
Informace pro SEQ ID No: 4
Délka sekvence: 17
Typ sekvence: nukleotidová
Počet řetězců: jeden
Topologie: lineární
Typ sekvence: synthetická DNA io Popis sekvence:
AAYGTNGART AYCCNGC
Informace pro SEQ ID No: 5
Dclka sekvence: 17
Typ sekvence: nukleotidová Počet řetězců: jeden Topologie: lineární Typ sekvence: synthetická DNA Popis sekvence:
,() CTRGTYCTRC TRCTRTT
Informace pro SEQ ID No; 6
Délka sekvence: 35
Typ sekvence: nukleotidová
Počet řetězců: jeden
Topologie: lineární
Typ sekvence: synthetická DNA
Popis sekvence:
TAGTCGTTAA CCATATGGCT AAGAACTTCT CCAAC .10
Informace pro SEQ ID No: 7
Délka sekvence: 40
Typ sekvence; nukleotidová
Počet řetězců: jeden
Topologie: lineární
Typ sekvence: synthetická DNA
Popis sekvence:
TCTGAATTAA CGAATTCTTA GGGAAGCGTG TAGCCACCGT
-24CZ 298236 B6
Claims (43)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Karbonylová reduktasa mající sekvenci aminokyselin odpovídající pořadí SEQ ID No; 1 v seznamu sekvencí, nebo sekvenci aminokyselin s jednou nebo více vynechanými, substituovanými. nebo přidanými aminokyselinami ve srovnání se SEQ OD No:l. ze seznamu sekvencí, nebo částečnou aminokyselinovou sekvenci a mající aktivitu, kterou je asymetrická redukce ethyl 4-chloracetoacetátu za vzniku ethyl (S)-4-chlor-3-hydroxybutyrátu.
- 2. Karbonylová reduktasa podle nároku 1. kde tento enzym byl získán z mikroba náležejícího do rodu Candida.
- 3. Karbonylová reduktasa podle nároku 2, kde tento enzym byl získán z Candida niagnoliae.
- 4. Karbonylová reduktasa podle kteréhokoli nároku 1 až 3. kde tento enzym byl získán /.Candida mugnoliae IEO 0705.
- 5. DNA kódující enzym podle kteréhokoli nároku 1 až 4.
- 6. DNA podle nároku 5, která má sekvenci uvedenou jako SEQ ID No;2 v seznamu sekvencí.
- 7. Plazmid nesoucí DNA podle nároku 5 nebo 6.
- 8. Plazmid podle nároku 7. kterým jc plazmid pNTSI.
- 9. Transformovaná buňka, která jc transformována plazmidem podle nároku 7 nebo 8.
- 10. Transformovaná buňka podle nároku 9. kterou je transformovaná buňka E coli.
- 11. Transformovaná buňka podle nároku 9, kterou je transformovaná buňka E. coli. HB101 (pNTSI).
- 12. Způsob přípravy (S)-4“halogen-3-hydroxybutyrátu majícího obecný vzorec:OHR, COOR·. ,R>kde R| označuje atom halogengenu. R2 označuje vodík a FQ označuje substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo ary I, vyznačující se t í in , že zahrnuje krok reakce 4-halogenacetoacetátu představeného obecným vzorcem:O Ri '-Άγ/ COORj R?a enzymu podle kteréhokoli nároku 1 až 4, nebo s kulturou mikroorganizmu majícího schopnost produkce tohoto enzymu, nebo s upraveným produktem této kultury.- 25 CZ 298236 B6
- 13. Způsob podle nároku 12. vy z n a č u j í c í se t í m . že atom halogenu je chlor nebo brom a FC je alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku.
- 14. Způsob podle nároku 13, v y z n a č u j í c i se t í m . že substrátem, je methyl 4-chloracetoacetát, ethyl 4-chloracetoacetát. methyl 4-bromacctoacetát nebo ethyl 4-bromacctoacetát.
- 15. Způsob podle kteréhokoli nároku 12 až 14. v v z π a č u j í c í se tím, že mikrobem je m i kroo rga n i s m u s n á 1 ežej íc í d o ro d u ('andida.
- 16. Způsob podle nároku 15, v y z n ač u j i c í se t í ni, žc mikrobem je mikroorganismus náležející do druhu ('andida magnoliae.
- 17. Způsob podle nároku 16. v y z n a č uj t c í se t í m , že mikrobem je mikroorganismus ('andida magnoliae IFO 0705.
- 18. Způsob podle kteréhokoli nároku 12 až 14, vyznačující se tím, že mikroorganismus je transformovanou buňkou podle kteréhokoli nároku 9 až 11.
- 19. Způsob přípravy opticky aktivního 3-hydroxybutyrát esteru představeného obecným vzorcem·.OHCOORi «2 vyznačující se t í m , žc zahrnuje krok reakce transformantu, kterým je buňka transformovaná plazmidem nesoucím DNA podle nároku 5 nebo 6 kódující enzym, který má schopnost asymetricky redukovat 3 oxo-butyrát, mající obecný vzorec:za vzniku opticky aktivního 3-hydroxybutyrátu. majícího obecný vzorec:OH s 3 -oxo-butyrátem. podle obecného vzorce:ORi χΑ. y COORíR2 a získání produkovaného opticky aktivního 3-hydroxybutyrátu o obecném vzorci;OH í<2 kde v obecných vzorcích jsou Rj a R- nezávisle halogen, azido. benzy lamino skupina, nebo vodík, jeden / R, a R? by měl být vodík. RJc substituovaná nebo ncsubstituovaná alkylová nebo arylová skupina, nebo v obecných vzorcích jsou R| a K2 nezávisle alkylová skupina, hydroxidová skupina nebo vodík, jeden z R] a R:· by měl být vodík a > je substituovaná nebo nesubstituovaná5 alkylová, nebo arylová skupina.
- 20. Způsob podle nároku 19, v y z n a č u j í c í se t í m , žc v obecném vzorci R] je hydroxylová skupina, R jc vodík a R. je ethyl· io
- 21. Způsob podle nároku 19. v y ι n a č u j í c í se t í m . že v obecném vzorci R| chlor, R2 je vodík a R Je ethy l.
- 22. Způsob podle kteréhokoli nároku 19 až 21. v y z n a č u j í c í se t i ni. že transformované buňky jsou transformovanými buňkami podle kteréhokoli nároku 9 až 1 I.
- 23. Plazmid nesoucí DNA podle nároku 5 nebo 6 a DNA kódující glukosodcliydrogenasu.
- 24. Plazmid podle nároku 23, vy z n ač u j í c í se tím, že glukosodehydrogenasa byla odvozena z Bac i Hus megalerium.
- 25. Plazmid podle nároku 2-4, kterým je plazmid pNTS IG.
- 26. Transformovaná buňka, která jc transformovaná plazinidem podle kteréhokoli nároku 23 až 25.
- 27. Transformovaná buňka podle nároku 26, kterou je transformovaná buňka E. coli.
- 28. Transformovaná buňka podle nároku 27, kterou je transformovaná buňka E. coli HR101 (pNTSIG).
- 29. Způsob přípravy opticky aktivního alkoholu, vyznačující se t í m , žc zahrnuje kroky reakce transformantu. kterým jc buňka transformovaná plazmidem majícím DNA podle nároku 5 nebo 6, která kóduje enzym s aktivitou, jíž je asy metrická redukce sloučeniny s karbony lem za vzniku opticky aktivního alkoholu, a dále DNA kódující enzym sc schopností regenerovat35 koenzym, na kterém jc aktivita prvého enzymu závislá, s karbonylovými sloučeninami a získání produkovaného opticky aktivního alkoholu.
- 30. Způsob podle nároku 29. v y z n a č u j i c í se tím, žc enzymem, který má schopnost regenerace koenzymu je glukosodehydrogenasa.
- 31. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím. že transformované buňky jsou transformované buňky podle kteréhokoli nároku 26 až 28.
- 32. Způsob podle kteréhokoli nároku 29 až 31, v y z n ač u j í c í se t í ni. žc karbonylovou 45 sloučeninou je 3-oxo-butyrát podle obecného vzorce:O uQ COOR;R2 a výsledný opticky aktivní alkohol je opticky aktivní 3 hydroxybutyrát mající obecný vzorec:-27CZ 29823b B6OHRlCOORR?
- 33. Způsob podle nároku 32, v y z n a Č uj í c i se t í m . že v obecných vzorcích jsou R, a R2 nezávisle halogen, azido. benzylamino skupina nebo vodík, jeden z R, a R2 by měl být vodík. R?, je substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová nebo arylová skupina, nebo v obecných vzorcích R, a R2 jsou nezávisle alkylová skupina, hydroxidová skupina nebo vodík, jeden zR, a R2 by měl být vodík a RJe substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová nebo ary lová skupina.
- 34. Způsob podle nároku 33, vy z n ač u j í c i se t í m , žc R| je chlor, R? je vodík a R? je ethyl.
- 35. Transformovaná buňka, kterou je buňka transformovaná s prvním plazmidem, který' má sekvenci DNA podle nároku 5 nebo 6, a druhým plazmidem. který má DNA kódující glukosodehydrogenasu.
- 36. Transformovaná buňka podle nároku 35, kde prvním plazmidem je pNTSl a glukosodehydrogenasa je odvozena z Bucillus megaterium.
- 37. Transformovaná buňka podle nároku 35 nebo 36. kterou je transformovaná buňka E. coli.
- 38. Způsob přípravy opticky aktivního alkoholu, vyznačující se t í m . že zahrnuje reakcí transformované buňky, kterou je buňka transformovaná s prvním plazmidem. který' má sekvenci DNA podle nároku 5 nebo 6 kódující enzym s aktivitou, kterou jc asymetrická redukce karbonylové sloučeniny za vzniku opticky aktivního alkoholu, a druhým plazmidem, který má DNA kódující enzym se schopností regenerovat koenzym na kterém je prvý enzym závislý, a karbonylové sloučeniny; a získání produkovaného opticky aktivního alkoholu.
- 39. Způsob podle nároku 38, v y z n ač u j í c í se t í m , Že enzym sc schopností regenerace koenzymu jc glukosodchydrogenasa.
- 40. Způsob podle nároku 38, vy zn ač u j í c í se t í m . že transformované buňky jsou buňky transformované podle kteréhokoli nároku 35 až 37.
- 41. Způsob podle kteréhokoli nároku 38 až 40, v y z n ač u j í c i se t í m , že karbonylovou sloučeninou je 3-oxo-butyrát představený obecným vzorcem:a výsledný opticky aktivní alkohol je opticky aktivní 3 -hydroxy butyrát podle obecného vzorce:OHR?
- 42. Způsob podle nároku 41, v y z n a č u j i c i se t í m . že v obecném vzorci jsou R] a R2 nezávisle halogen, azido, benzy lamino skupina, nebo vodík, jeden z R] a R? by měl být vodík. R.;je substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová nebo ary lová skupina, nebo v obecných5 vzorcích Ri a R2 jsou nezávisle alkylová skupina, hydroxidová skupina nebo vodík, jeden z R| a R> by měl být vodík a R je substituovaná nebo nesubstituovaná alky lová, nebo ary lová skupina.
- 43. Způsob podle nároku 42, v y z n a č u j í c í se t í ni, žc v obecném vzorci R, je chlor. lO R2 je vodík a R2 je ethyl.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2566797 | 1997-02-07 | ||
| JP11305297 | 1997-04-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ276199A3 CZ276199A3 (cs) | 2000-03-15 |
| CZ298236B6 true CZ298236B6 (cs) | 2007-08-01 |
Family
ID=26363321
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0276199A CZ298236B6 (cs) | 1997-02-07 | 1997-09-01 | Nová karbonylová reduktasa, gen, který ji kóduje a zpusob pro pouzití této reduktasy a genu |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6218156B1 (cs) |
| EP (1) | EP0967271B1 (cs) |
| JP (1) | JP4012257B2 (cs) |
| KR (1) | KR100506134B1 (cs) |
| AT (1) | ATE280218T1 (cs) |
| AU (1) | AU4032997A (cs) |
| CA (1) | CA2280502A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ298236B6 (cs) |
| DE (1) | DE69731317T2 (cs) |
| ES (1) | ES2235246T3 (cs) |
| IL (2) | IL131241A0 (cs) |
| SI (1) | SI20120A (cs) |
| SK (1) | SK105699A3 (cs) |
| WO (1) | WO1998035025A1 (cs) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6242253B1 (en) * | 1997-10-09 | 2001-06-05 | Regents Of The University Of California | IkB kinase, subunits thereof, and methods of using same |
| JP2000189170A (ja) | 1998-05-08 | 2000-07-11 | Daicel Chem Ind Ltd | 光学活性４―ハロ―３―ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法 |
| JP2000175693A (ja) * | 1998-12-18 | 2000-06-27 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | （ｒ）−２−ヒドロキシ−１−フェノキシプロパン誘導体の製造方法 |
| JP2000236883A (ja) * | 1998-12-21 | 2000-09-05 | Daicel Chem Ind Ltd | 新規なカルボニル還元酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするｄｎａおよびこれを利用したアルコールの製造方法 |
| KR20010103017A (ko) * | 1999-02-19 | 2001-11-17 | 플레믹 크리스티안 | 글루코스 데히드로게나제 융합 단백질 및 발현계에서의그의 용도 |
| TWI275645B (en) | 2000-02-16 | 2007-03-11 | Daicel Chemical Industries Ltd. | (R)-2-octanol dehydrogenases, methods for producing the enzymes, DNA encoding the enzymes, and methods for producing alcohols using the enzymes |
| WO2002000585A1 (en) * | 2000-06-27 | 2002-01-03 | Kaneka Corporation | Chlorohydroxyacetone derivative and process for producing optically active chloropropanediol derivative from the same |
| US6884607B2 (en) * | 2000-12-07 | 2005-04-26 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Process for producing optically active 4-halo-3-hydroxybutanoate |
| CA2450867A1 (en) * | 2001-07-02 | 2003-01-16 | Kaneka Corporation | Method of modifying enzyme and oxidoreductase variant |
| WO2003040382A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-05-15 | Kaneka Corporation | Process for producing optically active chroman derivative and intermediate |
| KR100522133B1 (ko) * | 2002-01-26 | 2005-10-18 | 한국과학기술연구원 | 클루이베로마이세스 마르시아누스로부터 분리 및 정제된 카르보닐 환원효소 및 그 제조 방법 |
| WO2003078634A1 (en) * | 2002-03-19 | 2003-09-25 | Mitsubishi Chemical Corporation | Novel carbonyl reductase, gene encoding it and process for producing optically active alcohols using the same |
| JP4228605B2 (ja) * | 2002-07-02 | 2009-02-25 | 住友化学株式会社 | 改変型還元酵素、その遺伝子及びそれらの利用 |
| JP4228606B2 (ja) * | 2002-07-03 | 2009-02-25 | 住友化学株式会社 | 改変型還元酵素、その遺伝子及びそれらの利用 |
| EP1382683B1 (en) * | 2002-07-15 | 2006-02-22 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Process for producing 3-hydroxycyclohexanone |
| JP4578240B2 (ja) * | 2002-08-09 | 2010-11-10 | コデクシス， インコーポレイテッド | ４−置換３−ヒドロキシ酪酸誘導体の生成のための酵素的プロセス |
| JP2007502124A (ja) * | 2003-08-11 | 2007-02-08 | コデクシス， インコーポレイテッド | 改良ケトレダクターゼポリペプチドおよび関連ポリヌクレオチド |
| EP1660669A4 (en) | 2003-08-11 | 2008-10-01 | Codexis Inc | ENZYMATIC PROCEDURES FOR THE PREPARATION OF 4-SUBSTITUTED 3-HYDROXYBUTYLIC ACID DERIVATIVES AND OF VICINAL CYANO, HYDROXY-SUBSTITUTED CARBOXYLIC ACID ESTERS |
| WO2006046455A1 (ja) * | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Kaneka Corporation | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 |
| US20100003732A1 (en) | 2005-05-31 | 2010-01-07 | Kaneka Corporation | Process for production of optically active 2-substituted propanal derivative |
| JP2009114065A (ja) * | 2006-02-21 | 2009-05-28 | Kaneka Corp | （２ｒ，３ｒ）および（２ｓ，３ｓ）−３−フェニルイソセリン誘導体の製造法 |
| EP2039689A4 (en) | 2006-05-26 | 2011-12-28 | Kaneka Corp | PROCESS FOR PREPARING OPTICALLY ACTIVE 3-AMINO-2-HYDROXYPROPIONIC ACID CYCLOPROPYLAMID DERIVATIVES AND SALTS THEREOF |
| CN101528917B (zh) | 2006-10-02 | 2015-07-29 | 科德克希思公司 | 用于制备立体异构纯的他汀类及其合成中间体的组合物和方法 |
| EP2123769B1 (en) | 2007-02-19 | 2016-05-18 | Kaneka Corporation | Method for producing optically active 3-aminopiperidine or salt thereof |
| EP2202303B1 (en) | 2007-09-26 | 2016-10-26 | Kaneka Corporation | Novel glucose dehydrogenase |
| BRPI0924997B1 (pt) * | 2009-06-22 | 2024-01-16 | Sk Biopharmaceuticals Co., Ltd | Método para preparar um composto de éster do ácido 1-aril-2- tetrazoil etil carbâmico |
| US8404461B2 (en) | 2009-10-15 | 2013-03-26 | SK Biopharmaceutical Co. Ltd. | Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester |
| JPWO2011078172A1 (ja) | 2009-12-25 | 2013-05-09 | 株式会社カネカ | 光学活性３−置換グルタル酸モノアミドの製造法 |
| CN111172124B (zh) * | 2020-02-26 | 2022-07-22 | 复旦大学 | 一种羰基还原酶突变体及其在制备(r)-4-氯-3-羟基-丁酸酯中的应用 |
| CN115433721B (zh) * | 2022-06-24 | 2024-01-23 | 山东理工大学 | 一种羰基还原酶突变体及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61146191A (ja) * | 1984-12-20 | 1986-07-03 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | （Ｓ）−γ−ハロ−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法 |
| JP2566960B2 (ja) * | 1987-06-08 | 1996-12-25 | 電気化学工業株式会社 | （Ｒ）−ｒ−置換−β−ハイドロキシ酪酸エステルの製造法 |
| JP3163338B2 (ja) * | 1992-05-28 | 2001-05-08 | 味の素株式会社 | （Ｓ）−γ−ハロゲン化−β−ハイドロキシ酪酸エステルの製造方法 |
| JP3155107B2 (ja) * | 1993-01-12 | 2001-04-09 | ダイセル化学工業株式会社 | 光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法 |
| JPH08336393A (ja) * | 1995-04-13 | 1996-12-24 | Mitsubishi Chem Corp | 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法 |
-
1997
- 1997-09-01 CA CA002280502A patent/CA2280502A1/en not_active Abandoned
- 1997-09-01 EP EP97937861A patent/EP0967271B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-01 ES ES97937861T patent/ES2235246T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-01 SI SI9720093A patent/SI20120A/sl not_active IP Right Cessation
- 1997-09-01 AU AU40329/97A patent/AU4032997A/en not_active Abandoned
- 1997-09-01 JP JP53409498A patent/JP4012257B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-01 IL IL13124197A patent/IL131241A0/xx active IP Right Grant
- 1997-09-01 WO PCT/JP1997/003051 patent/WO1998035025A1/ja not_active Ceased
- 1997-09-01 KR KR10-1999-7007161A patent/KR100506134B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-01 AT AT97937861T patent/ATE280218T1/de active
- 1997-09-01 DE DE69731317T patent/DE69731317T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-01 US US09/367,012 patent/US6218156B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-01 CZ CZ0276199A patent/CZ298236B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-09-01 SK SK1056-99A patent/SK105699A3/sk unknown
-
1999
- 1999-08-04 IL IL131241A patent/IL131241A/en not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-02-05 US US09/777,157 patent/US6448052B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Patel, R. N. et al.: Stereoselective reduction of a-keto esters by Geotrichum candidum. Enzyme Microbiol. Technol. 14 (1992) 731-738. * |
| Peters, J. et al.: A novel NADH-dependent carbonyl reductase with an extremely broad substrate range from Candida parapsilosis: purification and characterization. Enzyme Microb. Technol. 1993 Nov;15(11):950-8. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE280218T1 (de) | 2004-11-15 |
| US6448052B2 (en) | 2002-09-10 |
| WO1998035025A1 (en) | 1998-08-13 |
| EP0967271B1 (en) | 2004-10-20 |
| DE69731317T2 (de) | 2006-02-23 |
| SI20120A (sl) | 2000-06-30 |
| US20020006651A1 (en) | 2002-01-17 |
| SK105699A3 (en) | 2000-06-12 |
| IL131241A (en) | 2006-12-31 |
| KR100506134B1 (ko) | 2005-08-08 |
| EP0967271A1 (en) | 1999-12-29 |
| KR20000070896A (ko) | 2000-11-25 |
| JP4012257B2 (ja) | 2007-11-21 |
| DE69731317D1 (de) | 2004-11-25 |
| ES2235246T3 (es) | 2005-07-01 |
| CA2280502A1 (en) | 1998-08-13 |
| AU4032997A (en) | 1998-08-26 |
| EP0967271A4 (en) | 2002-09-25 |
| IL131241A0 (en) | 2001-01-28 |
| US6218156B1 (en) | 2001-04-17 |
| CZ276199A3 (cs) | 2000-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4012257B2 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、およびこれをコードする遺伝子、ならびにこれらの利用方法 | |
| JPWO1998035025A1 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、およびこれをコードする遺伝子、ならびにこれらの利用方法 | |
| JP4651896B2 (ja) | （ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするｄｎａおよびこれを利用したアルコールの製造方法 | |
| HUP0105331A2 (hu) | Új karbonil-reduktáz, ennek génje és alkalmazásának módszere | |
| JP2000236883A (ja) | 新規なカルボニル還元酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするｄｎａおよびこれを利用したアルコールの製造方法 | |
| JP4213524B2 (ja) | 新規なカルボニル還元酵素、その酵素をコードするｄｎａを含むポリヌクレオチド、その製造方法、およびこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| JPWO2001061014A1 (ja) | （ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするｄｎａおよびこれを利用したアルコールの製造方法 | |
| TW200305645A (en) | Novel carbonyl reductase, gene encoding the same and process for producing optically active alcohols using the same | |
| JP5308163B2 (ja) | 新規アルコール脱水素酵素、その遺伝子、ベクター、形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| JP4205496B2 (ja) | 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードするｄｎａ、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| EP1173585B1 (fr) | Epoxyde hydrolases d'origine aspergillus | |
| EP1306438B1 (en) | Novel carbonyl reductase, gene thereof and method of using the same | |
| JP4396972B2 (ja) | 新規ｒ体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| WO2007099994A1 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、ベクター、形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| JP4603171B2 (ja) | （ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造に有用な酵素をコードする遺伝子、その取得方法、およびこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| MXPA99007259A (en) | Novel carbonyl reductase, gene that encodes the same, and method of utilizing these | |
| JP2010279272A (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、ベクター、形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| JP2006280207A (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20100901 |