CZ299862B6 - Polypeptid obsahující baculovirový signální peptid - Google Patents

Polypeptid obsahující baculovirový signální peptid Download PDF

Info

Publication number
CZ299862B6
CZ299862B6 CZ20080037A CZ200837A CZ299862B6 CZ 299862 B6 CZ299862 B6 CZ 299862B6 CZ 20080037 A CZ20080037 A CZ 20080037A CZ 200837 A CZ200837 A CZ 200837A CZ 299862 B6 CZ299862 B6 CZ 299862B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
influenza
gly
leu
asn
ser
Prior art date
Application number
CZ20080037A
Other languages
English (en)
Inventor
Eugene Smith@Gale
Volvovitz@Franklin
E. Wilkinson@Bethanie
I. Voznesensky@Andrei
Stanway Hackett@Craig
Original Assignee
Protein Sciences Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27508642&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ299862(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Protein Sciences Corporation filed Critical Protein Sciences Corporation
Publication of CZ299862B6 publication Critical patent/CZ299862B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/816—Viral vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Rešení poskytuje polypeptid, obsahující baculovirový signální peptid obsahující aminokyseliny 1 až 18 SEQ ID NO. 7 nebo 9, operativne navázané na heterologickou aminokyselinovou sekvenci.

Description

Polypeptid obsahující baculovirový signální peptid
Oblast techniky
Vynález se týká polypeptidů obsahujícího baculovirový signální peptid.
Dosavadní stav techniky
Každoročně v celém světě propukají epidemie chřipky, které způsobují značnou nemocnost a úmrtnost. Chřipkový vir nejčastěji napadá děti. které se velkou měrou podílí 11a přenosu virů chřipky ve společnosti. U starých osob a osob se zdravotními problémy existuje v případě inflkace chřipkovým virem zvýšené riziko vzniku možných komplikací a s nimi spojené hospitalizace.
V samotných Spojených státech amerických způsobil zápal plic a chřipka v letech 1956 až 1988 během každé chřipkové sezóny více než 10 000 úmrtí a každou druhou sezónu bylo zaznamenáno dokonce více než 40 000 úmrtí (Update: Influenza Activity United States and Worldwide. and Composition oťthe 1992-1993 Influenza Vaccine, Morbidity and Mortality2 Weekly Report. U.S. Departmente of Health and Human Services, Public Health Service. 41/No. 18:315-323, 1992).
Chřipkové viry jsou vysoce pleomorfní částice, tvořené dvěmi povrchovými glykoproteiny. hcmaglutininem (HA) a neuraminidázou (NA), HA zprostředkovává navázání viru na hostitelskou membránu a fúzi viro-buněčné membrány během pronikání viru do buňky. Genom chřipkového viru jc tvořen osmi jednořetězcovými protismyslnými RNA segmenty z nichž čtvrtý největší segment kóduje HA gen. Chřipkové viry jsou rozděleny na základě antigenovvch diferenciací
11a typ A, B a C. Viry chřipky A popisuje nomenklatura, jejíž součástí je označení podtypu nebo typu, geografické místo původu, počet řetězců a rok izolace, například A/Beijing/3 53/89. Existuje alespoň 13 podtypů HA (H1-H13) a devět podtypů NA (NI - N9). Všechny tyto podtypy byly nalezeny 11 ptáků, ale u lidí, prasat a koní byly zjištěny pouze HI-H3 a NI-N2 (Murphy and Webster, „Orthomyxoviruses“, in Virology, cd. Fields, Β. N.. Knipe. D. M., Chanock, R. M.,
1091-1152 (Raven Press, New York, (1990)).
Protilátky, jejichž úkolem je HA neutralizace viru a vytvoření báze pro vytvoření přirozené imunity proti infekci způsobené chřipkou, popisuje například Clemcnts v článku ..Influenza Vacci nes“ ve Vaccines: New Approaches to Immunologica! Problems, ed. Rona Id W. El lis str, 129 150 (Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA 1992). Antigenová variace v HA molekule je často zodpovědná za propuknutí chřipky a omezenou imunizační kontrolu infekce.
Trojrozměrná struktura HA a interakce sjejím celulárním receptorem, kyselinou sialovou, byla extenzivně studována (Wilson a kok, Structure of the hemagglutinin membrane glykoprotein •to of influenza virus at 3 A rozlišení“ Nátuře 289:366-378 (1981); Weis a kok, „Structure of the influenza virus hemagglutinin completed with its receptor, sialic acid“ Nátuře. 333:426^431 (1988); Murphy and Webster, 1990). HA molekula je ve virionu přítomna jako trimer. Každý monomer existuje ve formě řetězců HAI a HA2, vázaných jednoduchou disulfidovou vazbou. Infikované hostitelské buňky produkují prekurzorový glykosylátovaný polypeptid (ΗΑ0) s mole45 kulovou hmotností přibližně 85 000, který se následně rozštěp na HAI a HA2.
Přítomnost chřipky, HA-specificky neutralizující IgG a IgA protilátku, souvisí s rezistencí vůči infekci a nemoci (Clemcnts, 1992). Celý inaktivovaný virus nebo částečně vyčištěné (podjednotka získaná sestřihem) vakcíny proti chřipce jsou standardizovány tak, že obsahují určité množství so HA z každého řetězce. Chřipkové vakcíny zpravidla obsahují 7 až 25 pg HA z každého ze zmíněných tří řetězců chřipkového viru.
Role dalšího hlavního povrchového glykoproteinu, NA. pokud jde o ochrannou imunitu protilátky nebo T-buněčné odezvy na chřipkové viry, nebyla doposud definována. Neuraminidáza je v případě čištění a skladování velmi nestálá (Murphy a Webster, 1990) a množství NA v sou- I CZ 2y9S6ž B6 časně používaných vakcínách proti chřipce není standardizováno. Vyčištění HA, ale nikoliv NA vakeína chrání před onemocnění zvířata napadená chřipkou (Johansson a kol.. „Purifled influenza virus hemagglulinin and neuraminidase are equivalent in stimulation of anti body response but induce contrasting types of immuníty to infection J. Virology, 63: i239-1246 (1989)). Ukázalo sc, že experimentální vakeína na bázi neurarninidázoveho antigenů neposkytuje člověku ochranu (Orga a kok, J. Infect. Dis. 135:499-506 (1977)).
Vakcíny proti chřipce, na které bylo uděleno povolení, jsou tvořeny formalinem inaktivovanými podtypy virů (H1N1 a H3N2) influenzy A a jedním podtypem virů influenzy B nebo přípravky, ío tvořenými podjednotkami získanými chemickým štěpením těchto virů. Před každým chřipkovým obdobím doporučuje „U.S. Food and Drug Administratiotfs Vaccines and Related Biologicals
Advisory Comittee“ pro nadcházející období použití trojvalenční vakcíny proti chřipce. Vakcíny, používané vletech 1992 až 1993 obsahovaly viry podobné virům A/Texas/3ó/91-(HINl), A/Beijing/353/89 H3N2 a B/Panama/45/90. FDA navrhla, aby vletech 1993 až 1994 vakeína proti chřipce obsahovala stejné texaské a panamské kmeny a nový kmen influenzy A Beijing (A/Beijing/32/92).
V a ke i nace vysoce rizikových osob, prováděná každoročně před vypuknutím chřipkového období, je nej účinnějším opatřením pro snížení možnosti infikaee chřipkovým virem. Nízká četnost použití, slabá účinnost u starších osob a u mládeže, produkce vc vejcích, antigenní variace a nežádoucí reakce jsou omezujícími faktory současně dostupných vakcín.
Centrum pro kontrolu chorob (CDC) odhaduje, že je proti chřipce každoročně vakeinováno méně než 30 % rizikových jedinců (MMWR, 1992), Současné inaktivované vakcíny dosahují vysoké úspěšnosti při ochraně proti onemocnění ve skupině normálních zdravých jedinců, pokud jsou antigeny vakcíny a antigeny cirkulujících vírů influenzy blízce příbuzné. Ve skupině starších osob je úspěšnost prevence proti onemocnění mnohem nižší, zejména v případě, kdy jsou tyto starší osoby umístěny v ústavech (Clcments. 1992). Nedávné studie zpracované Powersem a Belsheem, J. Inť. Dis. 167:584 592 (1993), uvádí, že podstatnější odezvy protilátky na trojvalenční so subvirionovou vakcínu proti chřipce byly pozorovány li méně než třiceti procent osob ve věku let nebo starších.
Zárodečné viry pro vakcíny influenzy A a B jsou přirozeně se vyskytující kmeny, které se replikují do vysokých titrů v lantoické dutině vajec kuřat. Alternativně je kmenem viru influenzy A přeuspořádaný vir se správnými povrchovými antigenními geny. Přeuspořádaný vir je takový vir, který má v důsledku segmentace virového genomu vlastnosti všech parenterálních kmenů. Pokud buňku infikuje více než jeden kmen viru influenzy, potom se tyto segmentované víry smísí a vytvoří progenní virion. který' obsahuje virová přeskupení genii z obou rodičovských kmenů.
Ochrana pomocí současně používaných vakcín proti chřipce, tvořených celými podtypy virů nebo jejich segmenty, je krátkodobá a její účinnost ještě snižuje výskyt antigenního posunu v epidemických kmenech chřipky. Viry influenzy podléhají antigennímu posunu, který' je výsledkem imunitní selekce viru se změnami aminokyselinové sekvence v molekule hemaglutininu. V ideálním případě virové kmeny vakcíny odpovídají virovým kmenům influenzy, které způsobují one45 mocnění. Nicméně současná produkce chřipkových vakcín je omezena propagací viru v oplodněných kuřecích vejcích. Ne všechny kmeny viru influenzy se dobře replikují ve vejcích; je tedy třeba viry přizpůsobit nebo realizovat virová přeskupení. V hemaglutininu virů influenzy vypěstovaných ve vejcích se objevila extenzívní beterogenita v porovnání s primárními izoláty. izolovanými z infikovaných jedinců, rostoucími v savčích buňkách (Wanga kol., Vířil, 171:275so 279 (1989); Rajakumar a kol., Proč. Nati. Acad· Sci. USA 87:4154-4158 (1990)). Změny v HA v průběhu selekce a produkce chřipkových vakcín mohou mít za následek vznik směsi antigenově distinktních subpopulací viru. Viry ve vakcíně se mohou tedy lišit od variant přítomných v epidemických kmenech, eož může mít za následek nižší úroveň ochrany.
s
U osob trpících vážnou alergií na vejce muže zbytek vaječného proteinu ve vakcíně způsobit střední hypersenzitivní reakce. Prasečí chřipková vakcína byla v roce 1976 dávána do souvislosti se zvyšující se četností výskytu Guillain-Barré syndromu. U následných vakcín, připravených z dalších virových kmenů influenzy, nebyl již dále pozorován zvýšený výskyt tohoto vzácného onemocnění.
Způsobem výroby chřipkové vakcíny. který nevyžaduje propagaci ve vejcích, lze získat čistší produkt, u kterého by bylo méně pravděpodobné, že způsobí nežádoucí imunitní reakci. Kromě toho by čistší vakcínovy přípravek nevyžadoval virovou inaktivaci nebo organickou extrakci sloto žek virové membrány, čímž by se eliminovala denaturace antigenových epitopú a vyloučily by se rezidua]ní chemikálie, které mohou nežádoucím způsobem ovlivnit bezpečnost nákazy.
Kromě toho chřipková vakcína, vyrobená za nepřítomnosti vaječné propagace, by zabránila genetické heterogenitč. která se objevuje při přizpůsobováni a průchodem vejci. Výsledkem toho je, že se vakcína lépe přizpůsobí chřipkovým epidemickým kmenům a bude mít vyšší účinnost.
Cílem vynálezu by rovněž mělo být poskytnutí způsobů výroby chřipkové vakcíny, která nevyžaduje replikaci ve vejcích.
Cílem vynálezu by mělo být poskytnutí způsobu výroby chřipkové vakcíny, který by byl rychlý, čistý a ekonomicky efektivní a který' by umožňoval vyrábět vakcíny z primárních chřipkových zdrojů.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je polypeptid obsahující baeulovirový signální peptid obsahující aminokyseliny I až 18 SEQ ID. No. 7 nebo 9, operativně navázané na hcterologickou aminokyselinovou sekvenci.
Vynález rovněž popisuje obecný přístup pro účinnou extrakci a puriftkaei rekombinantního proteinu produkovaného v hmyzích buňkách, konkrétně pro purifikaci rHA proteinů z A podtypů a B typu chřipkových virů. Rekombinantní vakcínu lze vyvinout spíše z primárních zdrojů chřipky, například z nazálních sekretů infikovaných jedinců, než z víru přizpůsobeného a kultivované35 ho v kuřecích vejcích. To umožňuje rychlý vývoj vakcíny přímo z epidemických kmenů chřipky a eliminuje problémy spojené s přizpůsobováním viru kultivaci ve vejcích a rovněž eliminuje reakci pacientů na vaječnou kontaminaci ve výsledné vakcíně.
Příklady demonstrují formulaci a klinickou účinnost vakcíny v imunizující dávkové formě, zahr40 n ujíeí purifl kované rHA a nt i geny ze tří kmenů chřipkového viru, doporučených FD A pro 1993/1994 a 1994/1995 chřipková epidemická období. Funkční imunita sc měřila pomocí testů, které kvantifikovaly protilátky, které se váží na chřipkový hcmaglutinin blokující schopnost chřipkového viru srážet červené krvinky nebo které neutralizují chřipkový virus. Ochranné imunitní odpovědi na rHA vakcíny se měřily li živočichů, kteří jsou citliví na chřipkovou infekci nebo v rámci humánních imunologických studií.
- 3 CZ B6
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 schematicky znázorňuje klonování HA genů z chřipkových A kmenů z puntíkovaných virálních RNA přípravků, purifikaci exprimovaného rHA a biologickou charakterizaci rHA.
Zkratky použité na obrázcích mají následující význam:
FDA - Food and Drug Administration;
MDCK (Madín Darby C' ani ne Kidney) ledviny psa Madin Darby;
TPCK - tosylfenylalanylchloromethylketon;
RNA - ribonukleová kyselina;
eDNA - komplementární deoxyribonukleová kyselina;
ΗΛ -hemaglutinin;
FBS - fetální bovinní sérum;
PCR - polymerázová řetězová reakce; a
BV - baču loví rus.
Obr. 2 detailněji znázorňuje způsob, schematicky znázorněný na obrázku 1, aplikovaný na klonování a expresi HA genu chřipkového kmene A/Texas/36/91. Chřipkový HA gen se získal z RNA purifikované z MDCK buněk infikovaných chřipkovým kmenem influenza A/Texas/36/91 pomo2o cí reverzní transkriptázy a univerzálního primerů (SEQ ID NO. 1), a následných dvou cyklů PCR amplifikace a klonování. Při prvním cyklu PCR reakcí se použil 5' koncový primer SEQ ID NO. 2 a 3' koncový primer SEQ ID NO. 3, Při druhém cyklu PCR reakcí se použil 5' koncový primer SEQ ID NO. 4 a 3' koncový primer SEQ ID NO. 5. Zkonstruoval se bac ulov irový rekombinantní vektor obsahující polyhedrinový promotor a signální peptidovou sekvenci z baculovirového 61K genu (baculovirový gen, který kóduje signální peptid mající molekulovou hmotnost přibližně 61 000) a následně kompletní kódující sekvence pro zralý HA protein. Tento rekombinantní vektor se následně použil pro produkci baculovirového expresního vektoru, který’ produkuje HA z tohoto kmene viru.
Obr. 3 znázorňuje graf anti-ΗΛ imunitní odezvy u myší v 42. dni, n=5, na titr protilátky pro čistý rHAO; vakcíny Fluzone; a rl IA0-kamence; při dávkách 0,5 pg (černé sloupce). 0, pg (stínované sloupce), 0.02 pg (tečkované sloupec) a 0,004 pg (bílé sloupce).
Obr. 4a, 4b a 4c znázorňují grafy anti -HA imunitní odezvy u myší imunizovaných rHA nebo schválenou trojvalenční vakcínou. 1994-1995 formule, v týdnech po vakcinaci vs. Η1Λ titru pro HAI A/Texas/36/91 (obrázek 4a), HAI A/Shangdong/ 9/93 (obrázek 4b) a HAI B/Panama/45/90 (obrázek 4c), rHA (kosočtverce) a FLUVIRON zeslabené vakcíny kultivované ve vejcích (čtverečky).
Jak již bylo uvedeno, vynález se týká způsobu výroby rekombinantní chřipkové vakcíny. Celodélkový, neštčpený (ΗΑ0). hemaglutininový antigen z chřipkového viru se produkuje pomocí baculovirových expresních vektorů v kultivovaných hmyzích buňkách a purifikuje za nedenaturačních podmínek. Dva nebo více purifikovaných hemaglutininových antigenů z kmenů influenzy A a/nebo influenzy B se smísily za vzniku multivalenční chřipkové vakcíny. Účinnost rekom45 binantních antigenů lze zvýšit jejich sloučením s nosičem adjuvansu.
Použití rekombinantní DNA technologie při výrobě chřipkových vakcín nabízí řadu výhod: rekombinantní DNA chřipkovou vakcínu lze vyrábět za bezpečných a přísněji kontrolovaných podmínek; není zapotřebí propagace infekční influenzou ve vejcích; rekombinantní HA protein je čistší, což v podstatě eliminuje vedlejší účinky způsobené kontaminujícími proteiny; purifi kační postupy pro rekombinantní HA nesmí zahrnovat virovou inaktivaci nebo organickou extrakci virálních membránových složek, čímž se eliminuje denaturace antigenů; produkce HA rckombi-4CZ 299Wt>2 B6 nantní DNA technologií dává možnost eliminovat genetickou heterogenitu. ke které dochází během adaptace a průchodů vejci, eož by mělo umožnit lépe přizpůsobit vakcínové kmeny epidemickými kmeny influenzy a dosáhnout tak vyšší účinnosti; přičemž rekombinantní přístup rovněž umožňuje provádět kmenovou selekci později v průběhu roku, čímž se získá delší čas pro shro? máždění a vyhodnocení spolehlivějších epidemiologických dat. na jejichž základě se zmíněná selekce provede.
Baeuíovirový expresní systém ui Jako baculoviry se označují DNA viry spadající do rodiny Baculoviridue. Je známo, že tyto viry mají úzké hostitelské rozmezí, které se omezuje zejména na hmyzí druhy Lepidoptery (motýly a můry). Baculovirus Autographa californica Nuclear Polyhcdrosis Virus (AcNPV), který se stal prototypem baculoviru se účinně replikuje v úspěšně pěstovaných hmyzích buňkách. AcNPV má dvouřelězeový uzavřený kruhový DNA genom tvořený přibližně 130 000 bazickými páry a je dobře charakterizován pokud jde o hostitelské rozmezí, molekulární biologii a genetické vlastnosti.
Mnoho baculoviru včetně AcNPV, tvoří velké proteinové krystalické ok luze uvnitř jader infikovaných buněk. Jediný polypeptid, označený jako polyhedrin. má na svědomí přibližně 95 % pro2o teinové hmoty těchto okluzních těl. Gen pro polyhedrin je přítomen v jediné kopii v AcNPV virovém genomu. Vzhledem k tomu, že po lyhcdr i nový gen není podstatný pro virovou replikaci v kultivovaných buňkách, může snadno modifikovat expresi cizích genu. Sekvence cizího genu se vloží do AcNPV genu právě 3' koncem k polyhedrinové promotorové sekvenci, tj. za transkrípční kontroly polyhedrinového promotoru.
Rekombinantní baculoviry, které exprimují cizí geny se konstruují homologickou rekombinací mezi DNA baculoviru a chimérickými plazmidy obsahujícími sledovanou genovou sekvenci. Rekombinantní viry lze detekovat pomocí jejich odliš i tel né p lakové morfologie a purifikovat z plak do homogenity.
Bačuloviiy jsou použitelné zejména jako eukaryotické klonovací a expresní vektory. Díky svému úzkému hostitelskému rozhraní, které se omezuje na artropody, jsou obecně bezpečné. US úřad pro ochranu životního prostředí (EPA) schválil použití tří baculovirových druhů pro kontrolu škodlivého hmyzu. AcNPV se již několik let aplikuje na zemědělské plodiny.
AcNPV standardní typ a rekombinantní viry se replikují v celé řadě různých hmyzích buněk včetně kontinuálních buněčných linií odvozených ze Spodoptery frugiperdy (Uepidoptera; Noctuidae). Čas zdvojení u buněk .v. frugiperda je 18 až 24 hodin. Tyto buňky se mohou propagovat v monovrstvě nebo volných suspcnzníeh kulturách.
Rekombinantní HA proteiny se mohou produkovat například v buňkách odvozených z motýlích druhů Spodoptera frugiperda. Dalšími hmyzími buňkami, které lze infikoval bac ulov i rem, jsou například buňky druhů Bombix moři, Galleria mellanoma, Trichplusia ni nebo Lamanlhria dispar. které lze rovněž použít jako vhodný substrát pro produkci rekombinantních HA proteinů.
Nej výhodnější hostitelskou buněčnou linií pro produkci proteinů z rekombinantních baculoviru je Sf900+. Další výhodnou hostitelskou buněčnou linií pro produkci proteinů z rekombinantních baculoviru je Sf9. SÝ900+ a Sf9 představují netransformované, netumorigenové kontinuální buněčné linie odvozené ze Spodoptery frugiperdy (Lepidoptera; Noctudiae). Buňky SP900+ a Sř9 se propagují při 28±2 °C bez obohacení oxidem uhličitým. Kultivačním médiem použitým pro buňky Sf9S jc TNMF11, prostá směs solí, vitaminů, cukrů a aminokyselin, doplněná 10% fetálníirt bovinním sérem. S výjimkou fetálního bovinního séra se žádné další produkty odvozené ze zvířat (tj. trypsin atd.) při buněčné propagaci nepoužívají. Pro růst buněk St9 lze rovněž použít séra prosté kultivační médium (dostupné jako Sf900 kultivační médium, Gibco BRL, Gaithers55 burg, MD). které je vhodné zejména pro propagaci buněk SP900+.
- 5 CZ 299862 B6
Doba populačního zdvojení buněk Sf9 je 18 až 24 hodin, tyto buňky se mohou propagovat jako monovrstva nebo jako volné suspenzní kultury . Doposud neby lo zveřejněno, že by buňky S. frugiperdy podporovaly replikaci jakéhokoliv známého savčího viru.
Odborníkům v daném oboru je zřejmé, že expresní vektor se neomezuje pouze na bac ulo virový expresní systém. Rekombinantní HA proteiny se rovněž mohou exprimovat v dalších expresních vektorech, například virech Entomopox (virus hmyzího moru) a hmyzí buňky sc potom mohou transformovat konstituční expresí rekombinantního HA genu nebo genů.
io
Izolace kmenů influenzy
Z těl jedinců infikovaných chřipkou se izoloval jeden nebo několik kmenů influenzy. Výhodné jsou kmeny influenzy ty kmeny, které identifikoval Úřad pro potraviny a léčiva (FDA) nebo
CDC, které mají epidemický potenciál pro následující chřipkové období. Výhodou zde popsaného způsobuje to, že jako přímý zdroj viru lze použít například nazální sekrety pacientů infikovaných chřipkou. Alternativně lze víry získat z FDA nebo CDC.
Propagace kmenů influenzy
Kmeny se dále propagovaly v buňkách produkujících vysoké virové titry. například v Madin Darby psích ledvinových (MDCK) buňkách (dostupných ve sbírce American Type Culture Coleclion pod přístupovým číslem A TCC CCL34). Například MDCK buňky sc infikují v přítomnosti tosylfcnylalanylchloromethylketonem (TPCK) částečně inaktivovaném trypsinu a v tako25 vých koncentracích fetálního bovinního séra, kleré jsou optimální pro produkci vysokých titrů prvního viru. MDCK buňky se infikovaly chřipkovými kmeny při nízké násobnosti infekce (OJ až 0,5), jak určil standardní HA test (Rosen, „Hemagglutination with Anirnal Viruses in Fundament al Techniques in Virology, ed. K. Ha bel a N. P. Salzman. str. 276-28 (Academie Press. New York 1969). Infikované buňky se inkubovaly 48 hodin při 33 °C a médium se použilo pro testy, jejichž úkolem bylo určit hemaglutinační aktivitu a tedy virovou produkci. Podmínky poskytující nejvyšší HA aktivitu se následně použily pro přípravu velké zásoby viru influenzy.
Purifikace viru
Virové částice, produkované z první frakce, se purifikovaly z média za použití některé známé purifikační metody, například odstřeďování s hustotním gradientem sacharózy. Virus se například sklidil 24 až 48 hodin po infikací centrifugačním médiem MDCK buněk infikovaných infkienzou. Výsledná virová peleta sc resuspendovala v pufru a odstřeďovala přes pufrovaný sacharózový gradient. Pás chřipkového viru sc sklidil ze 40 až 45% sacharózového úseku gra40 dientu, naředil pufrem a peletoval odstřelováním při 100 000 x g. Purifikovaná virová peleta se resuspendovala v pufru skladovala při -70 °C.
Klonování hemaglutininových chřipkových genů
Přehled způsobů klonování HA genů poskytuje obrázek 1. Buňky jsou v podstatě infikovány chřipkovým kmenem, který se má klonovat. Virus se sklidí z buněčného média a izoluje se bud’ virová RNA pro kmeny influenzy A, nebo mRNA pro kmeny influenzy B. Virová RNA (-RNA) se extrahuje z purifikovaných virionů a pomocí standardních metod analyzuje na formaldehydoagarózových gelech. cDNA se syntetizuje, bud' za použití univerzálního příměrového systému v případě virové RNA izolované z kmenů influenzy A, nebo za použití nahodilých primerů v případě mRNA izolované z kmenů influenzy B. Plus-standardní komplimentární DNA (cDNA) se připraví za použití univerzálního olígonukleotidového primerů (5' AGCAAAAGC'AGG-3' {SEQ ID NO:Q). který je homologický se všemi hemaglutininovými RNA segmenty ve virech influenzy A a B (Davis a kol., „Construction and characterization of a bacterial cloně containing the hemagglutinin gene of the WSN strain (HONÍ) of influenza virus Gene, 10.205-218
-6CZ 299S62 B6 (1980)). Primery jsou navrženy tak, aby byly homologické se zachovanými úseky na 5' a 3' konci chřipkových hemaglutininových genů. Jak 5'. tak 3' primer má na svých koncích rovněž restrikční enzymatická místa, která se nacházejí v hemaglutininových genech.
Vhodné primery influenzy A a B a chřipková cDNA se smísí a pomocí standardních PCR postupů se amplifikují hcmaglutininové genové segmenty. Výsledné dvouřetězcové DNA fragmenty obsahují sekvence kódující celý zralý hemaglutinin. Pro amplifikaci celého HA genu, který se následně nakloňuje do vhodného bakteriálního hostitele, jakým jc například E. coli. se používá polymerázová řetězová reakce („PCR1’), 5’ konce se sekvencují s cílem identifikovat signální io peptid HA genů, načež se pro amplifikaci HA genů bez signálního peptidů použije PCR, Ten se následně nakloňuje do plazmidovčho transferového vektoru obsahujícího AcNPV polyhedrinový promotor. Výsledné transferové vektory obsahují následující 5' -> 3' sekvence: polyhedrinový promotor z baculoviru A. catifornica NPV. ATG translační startovací kodon, 61K baculovirový signální peptid, kódující sekvence pro zralý hemaglutin, přirozený hemaglutinový translační ter15 minační kodon. polyhedrinový RNA polyadenylační signál a lemovací baeulovirovou DNA.
Purifikovaná DNA chimérického transferového plazmidu, která obsahuje klonovaný hemaglutininový gen se následně smísí s AcNPV standardním typem DNA, vysráží společně s vápníkem a transfektuje do buněk S. fřugiperdy. Rekombinantní baculoviry se rozdělí na základě morfo20 logie plak a dále purifikují dalšími cykly plakovč purifíkace. U klonovaných rekombinantních baculoviru se určuje hemaglulininová exprese a jednotlivé baču lov i rove expresní vektory se rozdělí tak, aby produkovaly základní virovou banku.
Kmeny influenzy A
HA geny z kmenů influenzy A se klonovaly z purifikovaných virových RNA přípravků. Virová RNA se extrahovala ze 100 až 200 μΙ purifikovaných virionů influenzy A. obsahujících 1000 až 2000 hemaglutinačních jednotek (IIAU) influenzy. Jedna HAU odpovídá množství víru, které bude srážet 50% červených krvinek ve standardním testu srážlivosti (Rosen, 1969). Viriony se to ošetří protcinázou K, jejímž úkolem jc digerovat protein a potom se virová DNA extrahuje shodnými objemy fenolu a chloroformu a vysráží ethanolem v přítomnosti tRNA nosiče. Virová RNA se resuspenduje v pufru a digeruje RNAzy-prostou DNAzou, jejímž úkolem je odstranit veškerou kontaminující DNA, načež se extrakční a srážecí krok zopakuje. Virová RNA (vRNA) se následně analyzuje za použití forma Idehy do agarózových gelů způsobem, který popisuje
Maniatis a kok, Molecular Cloníng: A Laboratory Manual. str. 86-96 a 366-367 (Cold Spring 1 larbor Lab., Cold Spring, N. Y. 1982).
Kmeny influenzy B
HA geny z kmenů influenzy B se klonují z celkové mediátorové RNA (mRNA), extrahované z buněk infikovaných kmenem intluenzy B. Celá RNA se následně extrahovala z infikovaných buněk. Sklizené buňky se lyžovaly v přítomností guanidiniumthiokyanátu a celá buněčná RNA se purifikovala, například za použití RNA extrakční sady od společnosti Pharmacia Biotech Inc. (Piscataway, NJ), Celá mRNA sc extrahovala z buněčné RNA na Oligo-(dT)-eelulózových odstředěných kolonách, například pomocí RNA extrakční sady od společnosti Pharmacia Biotcch Inc.
Exprese a zpracování rekombinantního hemaglutininu v hmyzích buňkách
5() Rekombinantní hemaglutininové antigeny se exprimovaly ve vysoké koncentraci, v buňkách S. frugiperdu infikovaných AcNPV-hemaglutininovýmí vektory. Hlavním genovým produktem je nezpracovaný celodélkový hemaglutinin (rHAO), který se nesekrcluje ale zůstává spojen s periferními membránami infikovaných buněk. Tímto rekombinantním ΗΑ0 je protein s molekulovou hmotností 68 000, který jc gly kosy lát o váný N-na vázaným vy so kom a nožovým typem gly kanu, které sc liší od glykanů produkovaných expresí virových proteinů v savčích nebo ptačích buň-7CZ 299862 B6 kách. To dokazuje, že rHAO tvoří posttranslačně trimcry. které se akumulují v cytoplazmatických membránách.
Vektory pro expresy HAO a dalších proteinů
HAO je díky své vynikající stabilitě v porovnání s Η A1/HA2 komplexem a díky zachování správného sbalení během purifikaee a skladování lepší vakcínou. Vynikající stabilita je zvláště patrná v případě B kmenů, což sc projevuje u titru, které jsou přibližně 5krát větší než titry, získané pomocí komerčně dostupných, slabších, B kmenů.
Jak zmiňují níže uvedené příklady, pokud se HA geny klonovaly vpMGS12 přes restrikční místa, potom se HA zralý signální peptid odstranil a nahradil baculovirovým chitinázovým signálním peptidem. označeným jako 61 kD signální peptid. Vzhledem ktomu, že HA gen je na chitinázový signální peptid navázán přes restrikční místa, jsou mezi zralým HAO proteinem i? a 61 kD signálním peptidem, v závislosti na zvoleném restrikčním místě, tři až pět aminokyselin.
Přesto, že s kmenem influenzy A nebyly žádné problémy, kmen HAO B exprimovaný dalšími aminokyselinami se nes balil správným způsobem.
Pro řešení tohoto problému byly vyvinuty dva způsoby. Prvním jc použiti nového vektoru. 20 pMGS3, který nekóduje 61 kD signální peptid. HAO se svým přirozeným signálním peptidem se nakloňuje do vektoru a exprimuje. Při SDS-PAGE charakterizaci HAO B kmene exprimovaný v tomto vektoru, vykazuje lepší glykosylaei a zpracování, než pokud je exprimován v pMGS12.
Tento HAO je sbalen tak dokonale, že ho lze kvantitativně převést na HA1/HA2. Naneštěstí, jak ukázal westernový přenos, výtěžek není tak vysoký. Druhý způsob zvyšuje výtěžek použitím
61 kD signálního peptidu vpMGS12 pro řízenou expresi, při které se HAO gen inzertuje bez použití restrikčníeli enzymů, Nový vektor zahrnující 61 kD signální peptid a HAO gen bez sekvence, kódující zevně intervenující aminokyseliny, je označen jako pMGS27.
pMGS27 může být použit pro klonování a expresí libovolného genu v baculovirovém expresním
5u systému. Cílový gen, namísto aby se klonoval do vektoru restrikcí a ligací, se klonuje do vektoru temperaci. Reakční činidla lze získat u společnosti Clonteeh v jejich PCR-řízeném klonovacím systému. pMGS27 je navržen tak, že může být lincarizován na konci úseku, kódujícího chitinázový signální peptid. a dva dlouhé jednořetězcové konce lze vytvořit ošetřením linearizovaného pMGS27 T4 DNA polymerázou a dATP.
Cílový gen se amplifuje pomocí polymerázové řetězové reakce („PCR) nebo pomocí reverzní transkriptázové-PCR („RT-PCR“) s párem oligonukleotidů navržených tak, aby vytvořily jednořetězcové konce, které jsou komplementární s konci ošetřeného pMGS27, načež se PCR fragment ošetří T4 DNA polymerázou a dTTP. Pomocí prosté temperace lze následně sloučit dvě molekuly tak, že se vytvoří kruhový plazmid, který7 se snadno transformuje do hostitele. Kromě toho, že tento postup je ry chlejší a snadnější než tradiční restrikčně-ligační způsob klonování HA genu do pMGSl2, je výhodou pMGS27 to, že neposkytuje nadbytečné aminokyseliny, kódované restrikčními místy mezi chitinázovým signálním peptidem a zralým HA proteinem. V některých případech, například v případě B kmene HA, může přítomnost nadbytečných aminokyseliny vést k tomu, že signální peptidáza nemůže rozštěpit signál nebo že se kódovaný protein sbalí nesprávným způsobem.
Purifikaee rekombínantního HAO
Několik dní po inflkaei lze rHAO selektivně extrahovat z periferních membrán AcNPV-hemaglutininem infikovaných buněk nedenaturačním noniovým detergentern nebo dalšími způsoby, které jsou pro purifíkaei rekombinantních proteinů z hmyzích buněk včetně afinitní nebo gelové chroinatografie a navázání protilátek odborníkům v daném oboru známy. rHAO rozpustný v detergentu může být dále purifíkován pomocí DEAE iontoměničové a čočkové lektinové afinitní chroma55 tografic nebo dalších ekvivalentních metod, odborníkům v daném oboru známých.
-8CZ 299862 B6
U výhodného provedení se rHAO purifikuje postupem, který je opatrnější a jeho výsledkem je vyšší výtěžek rHAO z B kmenů influenzy. Tento postup je zpravidla následující.
HAO protein, který tvoří nedílnou součást membrány hmyzích buněk se separuje / rozpustných proteinů, periferních membránových proteinů a většiny DNA a RNA extrakcí buněk v relativně viskózním roztoku alkálie, přičemž pH alkálie se pohybuje přibližně v rozmezí od 9,5 do 10.5. Viskóza se zvyšuje v důsledku inkluzc sacharózy při koncentraci přibližně 250 mM. Disulfid-red ukuj ící činidlo, například β-merkaptoethanol. je použito v takové koncentraci, která to účinně brání navázání proteinu ze směsi na disulfid. Buňky se suspendují v cxlrakčním pufru, homogenizují a následně odstředují. Peleta sc promyje homogenizací v pufru s nízkou iontovou silou, který obsahuje disulfid—redukující činidlo při alkalickém pH (vodivost je zpravidla menší než 1 mS, pH 10,5) a odstřeďujc se. HAO se následně extrahuje z pelety v pufru. který' obsahuje 0,3 až 1,5 % detergentu, například Tritonu a disagregační činidlo v množství, které brání tvorbě komplexů způsobené vzájemnými reakcemi mezi náboji, například 0,3 až 1,0 M betainu nebo paurinu, při alkalickém pH (výhodně 9,5). ΗΛ0 v supernatantu se následně purifikuje aniontoměničovou chromatografií a následnou kationtomčničovou chromatografií. HAO se vc stejném pufru. vc kterém se extrahoval ale který sc naředí alespoň 1:2 dalším pufrem, aplikuje na iontoměničovou kolonu, například DEAE nebo Q-Scpharosa (agarózová kuličková kolona s kvartér20 nimi aminoskupinami), která se před tím uvedla do rovnovážného stavu pufrem, který obsahoval přibližně 1/10 koncentrace detergentu a disulfid-redukujícího činidla. HAO se následně eluuje snížením pH přibližně na 8,5. Eluovaný HAO se aplikuje na kalionloměničovou kolonu ve v podstatě stejném pufru. Kontaminující látky sc eluují snížením pH přibližně na 7,4, a následně se 1IA0 eluuje zvýšením koncentrace soli na 0,15 M NaCI.
Tento výhodný způsob purifíkacc bude podrobněji popsán níže.
Preparace rekombinantní HA-obsahující membránové frakce
5» Buňky exprimující rekombinantní HA (6,2 g buněk z 0.34 1 kultury) se suspendují při 100 mg/ml v ledově studeném lOOmM pyrofosfátu sodném, lOOmM chloridu sodného, 250 mM sacharózy, 0,1% β-merkaptoethanol. pH 10,5. Buňky se rozrušily pomocí homogenizéru Polytron (Brinkman Instruments lne., Westbury, NY) při dvouminutovém nastavení 4. Pro zvýšení rozpustnosti kontaminujících proteinů a zvýšení čistoty membránového přípravku je třeba použít alkalické pH homogenizačního média. Homogenizát se odstřeďujc 30 minut při 9 200 g. Supernatant se rozruší a pelety se shromáždí. Po preparaci membránové frakce následuje promývací krok. ve kterém se membránová frakce promývá roztokem s nízkou iontovou silou. Peleta se resuspenduje do původního objemu v ledově studeném 0,1% β-merkaptoethanolu, 10,5, a homogenizuje za použití homogenizeru Polytron při dvou minutovém nastavení 4. Homogenizát se odstřeďuje
4o 30 minut při 9200 g. Supernatant se odstraní a pelety se seberou. Tento průplach s nízkou iontovou sílou odstraní další část periferních membránových proteinů. Preparace membránové frakce vede ke značnému obohacení rckombinantního HA a k odstranění kontaminujících nukleových kyselin.
Extrakce rekombinantního HA
Rekombinantní HA sc následně selektivně extrahuje z membránové pelety za podmínek, které nedenaturují antigen. Membránová peleta se homogenizuje ve 41 ml ledově studeného IOitiM elhanolaminu, pil 9,5, 1% Tritonu NI01, 0,1% β-merkaptoethanolu, 25 mM NaCI a 40OmM betainu za použití homogenizéru Polytron při dvouminutovém nastavení 4. Po čtyřicetiminutovč inkubaci při 23 °C se směs odstřeďuje 30 minut při 9 200 g. Supernatant obsahující rekombinantní HA se oddekantuje a naředí na dvojnásobek stejným pufrem.
Proteiny se analyzují pomocí SDS polyakrylamidové gelové elektroforézy. Vzorky se rozruší desetiminutovým pobytem ve vroucí vodní lázni v přítomnosti 2% dodecylsulfátu sodném (SDS)
-9CZ 299862 B6 a 5% β-merkaptoethanolu, podrobí elektroforcze 11a 11% polyakrv larnidovérn gelu v přítomnosti 0.1% SDS a následně se zabarví modří Coomassie.
Chromatografická purifikace
Chromatografická purifikace rekombinantního HA se zjednoduší a drahá afinitní chromatografie na čočkové lectin-sepharózc se z procesu vyloučí a nahradí dvoustupňovým chromatografie kým purifikaěnim procesem, který poskytne vysoce purifikovaný rekombinantní HA antigen, který' není denaturován a lze vhodné použít jako složka chřipkové vakcíny pro humánní aplikaci. Jako io chromatografické gelové matrice se použily matrice Pharmacia Q Sepharose Fast Flow a CMSepharose Fast Flow.
An iontoměn ičová chromatografie
Celá chromatografie se provádí při pokojové teplotě. Extrakt, který obsahuje rekombinantní HA, připravený výše popsaným způsobem se aplikuje rychlostí 1 ml/min na Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow (5 ml v koloně Cl0/10 Pharmacia), která se předtím uvede do rovnovážného stavu ΙΟιηΜ ethanolaminent pH 9.5. 0,1% tritonem N101, 0,01% β merkaptoethanolem, 25 mM NaCl a 400mM betainetn. Kolona se potom promývá vyrovnávacím pufrem, dokud se UV absorbance
2d odtékající látky nevrátí zpět na počáteční hodnotu. Za těchto podmínek se rekombinantní HA váže na kolonu, zatímco část kontaminujících látek proudí touto kolonou bez zachycení. Částečné purifikovaný rekombinantní HA se následně eluuje 30 mM dielhanolaminu pH 8,5, 0,1% Tritonem N101.0.01% β-merkaptoethanolem, 25 mM NaCl a 4()0mM betainem.
Kationtoméničová chromatografie
Q Sepharosový eluát (23 ml) se naředí na dvojnásobný objem 30mM diethanolamineni pH 8,5, 0.1% Tritonem NI01,0,01% β-merkaptoetanolem, 10 mM NaCl a 400mM betainem. Kolona se následně promyje 35 ml lOmM fosforečnanem sodným pH 7,4, 0,1% Tritonem N101, 0,01% w β-merkaptoethanolem, 10 mM NaCl a 400mM betainem. Toto ošetření eluuje kontaminující látky z kolony, zatímco rekombinantní HA zůstane navázaný na CM Sepharose. Detergent se následně odstraní promýváním kolony lOmM fosforečnanem sodným pH 7,4, 10 mM NaCl. které se ukončí až potom, co UV absorbance proudu vytékajícího z kolony dosáhne opčt své počáteční hodnoty. Purifikovaný rekombinantní HA se eluuje fosfátem pufrovanym fyziologickým rozto55 kem. píl 7,5 (PBS).
Purifikovaný rHAO sc resuspenduje v isotonickém puProváném roztoku. Po odstranění detergentu bude purifikovaný ΗΑ0 účinně aglutinovat červené krvinky.
w Strukturní a biochemické vlastnosti rekombinantního ΗΑ0 rHAO se purifikuje do dosažení alespoň 95% čistoty, výhodněji do dosažení 99% čistoty. Na SDS-polyakrylamidovéni gelu migruje, převážně jako jediný, hlavní polypeptid s molekulovou hmotností 68 000. Kvartérní struktura puntíkovaného rekombinantního ΗΑ0 antigenu se určuje pomocí elektronové mikroskopie, trypsinové resistence, hustotní sedimentační analýzy a schopnosti aglutinovat červené krvinky, / výsledků těchto testů vyplývá. Že rekombinantní ΗΑ0 tvoří trimery, které se sestavují do tvaru růžic.
Purifikovaný rHAO neaglutinuje před odstraněním detergentu buňky, z čehož vyplývá, že aby se antigen mohl křížově navázat na červené krvinky kuřete, musí vytvořit komplexy (růžice). Kvantitativní schopnost purifikovaného rHAO aglutinovat buňky se využívá jako (lot—to—lot) míra konzistence antigenu. Hemaglutininová jednotka se definovala jak množství antigenu, kterc je potřebné pro dosažení 50% aglutinace ve standardním hemaglutininovém testu, prováděném na červených krvinkách kuřete. Srovnávací data ukázala, že puntíkované rHAO antigeny aglutinují
- 10CZ 299862 B6 červené krvinky s účinnosti, srovnatelnou s účinností pozorovanou v souvislosti s celkovými chřipkovými viriony.
Rekombinantní IÍAO se může štěpit v místě disulfidové vazby, což může způsobit konformační ? změnu, která vede k vytvoření dvou řetězců. HAI a HA2, jak uvádí Carr, C. M. a Kim, P. $.. „A Spring-loaded Mechanism for the Conformational Change of Influenza HcmagglutínJ Cell 73:823-832 (1993). Rozštěpení rekombinantního HAO je podrobněji popsáno v níže uvedeném příkladu 6. Rovněž se dá předpokládat, že po rozštěpení přirozeného HAO na HAI a HA2, se řetězce stanou infekčními získáním schopnosti vázat se na buňky a tak se dosáhne lepší imunitní io odezvy. Toto zpracování antigenů, například chřipkového hcmaglutininu, se projeví navázáním antigenových peptidů na hlavní histokompalibilni (MHC) molekuly. Rozpoznání antigen/MHC komplexu T buňkami představuje iniciaci imunitní odezvy, jak přehledně popisuje Hard ing a Gcuze, Current Opiu ion in Cell Biology- 5:596-605 (1993). Nicméně rHAO, produkovaný v baculoviru. je vysoce stabilní a imunogenní jako intaktní molekula. Porovnání molekul cukru i? na HAO exprimovaném v hmyzích buňkách ukázalo, že se tyto glykany liší od glykanů na HAO, exprimovaném v savčích nebo ptačích buňkách.
Produkce fúzní ch proteinů
Fúzní proteiny, tvořené HAO navázaným na druhý antigenový protein, lze produkovat, pokud je antigenicita druhého proteinu nižší nebo pokud je výhodné vyvolání imunogenní odezvy na víee antigenů. Příkladem druhého výhodného antigenů je neuraminidáza produkovaná chřipkou. Tento antigen může být tvořen celulárním. virovým nebo bakteriálním proteinem nebo jeho antigenovou částí, zahrnující alespoň pět až osm aminokyselin. Další antigeny zahrnují hepatitický B antigen, HIV antigeny a karcinocmbryonický antigen. Výraz „imunitní odezva, jak je zde uveden, označuje bud' humorální odezvu, měřenou produkcí protilátky k antigenů, nebo celulární odezvu, měřenou vyvoláním T buňkou mediované odezvy na antigen. V některých případech se může mezi HA a antigen zavést „vazebníK' neantigenových aminokyselin a tím tak dále zvýšit antigenicitu antigenů, v porovnání s původním HA. Součástí způsobuje zkonstruování DNA plazmidu pro fúzi genů cílového antigenů na celodélkový HA gen chřipkového genu nebo jeho fragmenty za použití oligonukleotidovvch sond a metodologie polvmerázovc řetězové reakce (PCR).
Fúzní geny HA-cílovcho antigenů se modifikují pro správnou expresi hmyzích buněk delecí při35 rozených hydrofobních signálních peptidových sekvencí a jejich náhradou novým baculovirovým signálním peptidem. Fúzní protein se zavede do baculovirového expresního vektoru tak, že baču loví rovy polyhedronový promotor řídí transkripci fúzních proteinů v infikovaných hmyzích buňkách, Osmnáct i aminokyselinový baču lo virový signální peptid řídí transkripci fúzní ho polypeptidu HA—cílového antigenů do glykosylační dráhy hmyzí buňky a není přítomen na zralém fúzní in proteinu.
Například plazmid pA9440, který7 obsahuje HA gen A/Bcijing/32/92 kmene v níže popsaném pMGSI2 baculovirovcm transferovém plazmidu se použije jako matrice pro amplifikaci HA genu polymerační řetězovou reakcí (PCR) a za použití protokolu doporučeného dodavatelem (Gene Amp PCR cloning kit, Perkin Elmcr Cetus). Reakční směs (100 μί), obsahovala 20 pniol primeru navržených pro temperaci částí HA genu. 5' a 3' primer byly navrženy s endonukleázovýmí místy na koncích, které se nenacházely v HA genu. 5' PCR primer (0 až 567) pro HAO a HAI fragmenty začíná 52 bazických párů za 5' koncem sekvencí kódujících přirozený HA gen, které postrádají přirozenou signální peptídovou sekvenci, a přidává Sma\ místo bezprostředně za 5' na sekvence kódující HA. 5' PCR primer (0 až 651) pro HA2 začíná na nukleotidu 1108 zralého HA genu, bezprostředné následujícím za kodonem kódujícím argininový zbytek, který se odstranil během rozštěpení HAO na HAI a HA2. Byl navržen 3' PCR primer (0 až 680) pro HAO a HA2 fragmenty, který zavede KpnI místa bezprostředně za HA kódující sekvence, které odstraňují přirozený koncový kodon. 3' PCR primer pro 1IA1 (0 až 679) upravuje gen bezprostředně před argininovým zbytkem odstraněným během HAO štěpení. Amplifikace fragmentu HA genu se prováděla ve třiceti cyklech, z nichž každý sestával z jednominutové denaturace při 94 °C. dvouminutového temperování příměrů při 55 °C a dvou minutové extenze při 72 °C. Výsledné ampliflkovanc fragmenty HA genu se podrobily elektroforézc na agarózovém gelu. purifíkovaly z gelu pomocí sady GeneClean (Bio 101, lne.) a ligovaly do plazmidu, navrženého tak. aby přijal PCR-generované fragmenty (pCRII; Invitrogcn). Takže se získají plazmidy pB 142. pBI44 apB33O, které obsahují HAO, HA1, resp. HA2 genové fragmenty.
io Z plazmidů pB142. pB144 a pB330 se pomocí ,S)?wl a KptA restrikěníeh enzymů odstranily HA genové fragmenty, které se následně subklonovaly standardními rekombinantními DNA technikami (Sambrook a kol., 1989) do AcNPV transferového plazmidu pMGS12. Plazmid pMGS12 obsahuje, směrem od 5' k 3', AcNPV polyhedronový promotor, ATG iniciační kodon, sekvenci pro odštěpitelný signální peptid z baeulovirového glykoproteinu s molekulovou hmotností 61 000 i? (61K), S/fitil a KptA klonovací místa pro restrikční enzym a ΤΛΑ univerzální koncovou kodonovou sekvenci. Tyto regulační oblasti lemuje DNA £eoRI I fragmentu AcNPV genornu (Šummers a Smith, „A manul of methods for bačulovirus veetors and inséct cell culture procedures, Texas Agrieullural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987)). Klonované HA PCR fragmenty se izolují zpCRII klonovacího vektoru pomocí ,S7//t/l a A/?z/I. puntíkovaných elektroforézou na agarózovém gelu a sadou GeneClean, a ligovalv do pMGSI2, který byl rovněž digerován Snu A a KptA. Výsledné AcNPV transferové plazmidy. pB879, pB 1201 a PBl 205. obsahovaly kódovací oblasti pro ΠΑ0, HAI resp. HA2 navázané v rámci s rozštěp itelným baculovirovým signálním peptidem 61K genu a polyhedrinovým promotorem. Výsledné AcNPV transferové plazmidy, pB879, pB1201 a PB 1205 lze použít pro fúzi HAO, HAI nebo HA2 na libovolný sledovaný gen.
Druhým krokem při konstrukci HA-CEA fúzních genových transferovaných plazmidů je zavedení CEA-kódujících sekvencí do HA-kódujíeíeh konstruktů. Restrikční endonukleázou rozpoznávaeí/štěpná místa pro SmcA a KptA se umístila PCR ainplifikací plazmidu pA9080 na oba konce CEA genu. 5' PCR primer. 0 649, začíná 82 bazických párů od 5' konce genu s deleeí sekvence .to zralého CEA signálního peptidu. 3' PCR primer, 0-650, byl navržen pro deleci posledních 72 bazických párů na 3' konci genu, který kóduje hydro fobní sekvenci C-koncového úseku. Amplifikace CEA genového fragmentu se provádí ve třiceti cyklech, z nichž každý sestává z jednominutové denaturace při 94 °C, dvouminutového temperování přimet u při 55 °C a dvouminutové extence při 72 °C. Výsledný amplifikovaný CEA genový fragment se podrobil elektroforézc na agarózovém gelu, purifikoval metodou GeneClean a ligoval do pCRII (Invitrogen) způsobem, který doporučuje výrobce. Výsledný plazmid. pB806. obsahuje CEA gen bez jeho přirozeného signálního peptidu, C-koncové hydro fobní domény nebo koncového kodon u, ale jak se SttuA. tak s KptA místem na obou koncích genu.
4o Příprava peptidu ve velkém měřítku se prováděla pomoeí plazmidu pB806 a DNA se digerovala buď pomocí 5/Wřd, nebo KptA. CEA-kódující fragmenty se purifíkovaly elektroforézou na agarózovém gelu pomocí sady GeneClean a purifi kované fragmenty se ligovaly do každého ze tří H A kódujících konstruktů (pB879, pBl201 nebo pB 1205). digerovanýeh stejným restrikěním enzymem. Například CEA-kódující fragmenty s Smál sestřiženými konci sc ligovaly do HA0-,
HAI— a HA2-kódujících konstruktů (pB879, pB 1201, resp. pBl205) sestřižených SttuA tak, že vytvořily plazmidy pB 1250, pB 1555. resp. pB 1584. CEA-kódující fragmenty s sestřiženými konci se ligovaly do ΗΑ0-, HAI- a HA2- kódujících konstruktů, sestřižených KptA tak, že vytvořily plazmidy pB1264 resp. pBl564 a pB 1593. Inzerce CEA genu na SttuA místě zavede CEA- kódující sekvence za IIA-kódující sekvence. V případě všech konstruktů byly navrženy
PCR příměry' tak, aby sc EA gen vložil v rámci HA a aby se fúzní genová translace ukončila na univerzálním translačním koncovém signálu (ΤΑΑΤΤΑΑΤΤΛΑ) (SEQ ID N():4) vpMGS12 vektorových sekvencích za A/?«I místem.
- 12v/. zvvaoz tso
Tento konstrukt lze vylepšit dclecí intervenujících aminokyselin, buď mezi signálním peptidem a HAO. jak bude popsáno dále, nebo mezi HAO a fúzním genem, a zlepšit tak jeho sbalení a imunogenicitu.
s Formulace a balení vakcíny rHA lze formulovat a balit samotné nebo v kombinaci s dalšími chřipkovými antigeny, za použití metod a materiálů, kterc jsou odborníkům v oboru chřipkových vakcín známy. U výhodného provedení se HA proteiny ze dvou kmenů A a jednoho kmene B sloučí za vzniku mu lti va lenění m vakcíny.
U zvláště výhodného provedení se HA slouží sadjuvansem. který se použije v množství, účinném pro zvýšení imunogenní odezvy proti HA proteinům. V současnosti je jediným, v širším měřítku používaným, adjuvansem u lidí kamenec (fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý), i? Saponin a jeho puri Ukovaný složka Quil A, Freundův kompletní adjuvans a další adjuvans používané při výzkumu a při veterinárních aplikacích mají toxicitu, která omezuje jejich potenciální použití v lidských vakcínách. Nicméně nově chemicky definované přípravky, jakými jsou například muramyldipeplid, monofosforyl lipid A, íosfolipidové konjugáty. například konjugáty; které popsal Goodman-Snitkoff a kok, J. Immunol. 147:410-415 (1991), a rovněž by se mělo použít zapouzdření proteinu v proteoliposomu, jak popisuje Míller a kok. .1. Exp. Med. 176:1739 -1744 (1992), a zapouzdření proteinu v lipidových vehikulcch, například lipidových vehikulech Novasoine (Micro Vescular Systems. lne., Nashua. NH).
U výhodného provedení se vakeína balí ve formě jediné dávky, určené pro imunizaci parenterál25 ním (tj. intramuskulárním. intradermálníni nebo subkutánním) podáním nebo nazofaryngeálním (tj, intranazálním) podáním. Účinná dávka se stanoví způsoby, popsanými v níže uvedených příkladech. Nosičem je zpravidla voda nebo pufrovaný fyziologický solný roztok, s konzervační látkou nebo bez konzervační látky. Antigen se může lyofilizovat a v okamžiku podání resuspendovat, nebo podávat v roztoku.
Nosičem může rovněž být póly měrní systém se zpožděným uvolňováním. Syntetické polymery' jsou zvláště použitelné při formulaci vakcíny, u které má být dosaženo kontrolovaného uvolňování antigenu. Kaným příkladem byla polymerace methyl methakrylátu do kuliček, s průměrem menším než jeden mikrometr, za vzniku takzvaných nanočástic, které popsal Kreuler J.. Micro35 capsules and Nanoparticles in Medcine and Pharmacology, M. Donbrow (ed.), CRC Press, str. 125-148. Odezva protilátky, stejně jako ochrana proti infíkaci chřipkovým virem, byla podstatně lepší než v případě, kdy se antigen podával v kombinaci s hydroxidem hlinitým. Experimenty s dalšími částicemi ukázaly, že přídavný účinek těchto polymerů závisí na velikosti částic a hydrofobicitě.
Mikrozapouzdřením injekce tnikrozapouzdřených farmaceutických látek se dosáhne jejich kontrolovaného uvolňování. Na volbu příslušného polymeru pro mikrozapouzdření má vliv celá řada faktorů. Reprod ukováte Inost polymemí syntézy a mikrozapouzdrovaci proces, cena zapouzdřovacího materiálu a ekonomická náročnost způsobu zapouzdřování, toxikologický pro45 fil, požadavky pro různou kinetiku uvolňování a fyzikochentickou slučitelnost polymeru a antigC“ nů představují faktory, které je třeba vzít při rozhodování v úvahu. Použitelnými polymery jsou například polykarbonáty, polyestery, polyurethany, polyorthoestery a polyamidy, zejména ty. které jsou biologicky degradovatelné.
5o Často voleným nosičem pro farmaceutika a v poslední době častěji pro antigeny je poly(d, 1 laktid-ko-gly kolid) (PLGA). což je biologicky degradovatelný poly ester, který se v lékařské praxi již dlouhou dobu používá, například v případě vstřebávacích stehů, kostních plotének a dalších dočasných implantátů, kde nevykazuje žádnou toxicitu. Do PLGA mikrokapslí se formuluje celá řada různých farmaceutik. K tomu, aby bylo možné upravil PLGA tak, aby kontrolo55 vaně uvolňovala antigen, je třeba shromáždit určitá tělesná data, jak uvádí například Eldridge,
- 13 CZ 299802 B6
J. H. a kol.. Current Topics in Microbiology and Iminu no logy. 1989. 146: 59-66. Zachycení antigenů v PLGA míkrokuličkáeh o průměru 1 až 10 pm ukázalo, že mají značně adjuvansní účinek, pokud se podají orálně. PLGA mikrozapouzdřovací proces používá fázovou separaci emulze typu ..voda v oleji. Sledovaná sloučenina se připraví jako vodný roztok a PLGA se rozpustí ve vhod5 ných organických rozpouštědlech, například v methylenehloridu a ethylacetátu. Tyto dva nemísitelné roztoky se ko-emulgují vysokorychlostním mícháním. Polom se přidá nerozpouštědlo pro polymer, což způsobí vysrážení polymeru okolo vodných kapiček za vzniku embryonálních mikrokapslí. Mikrokapsle se ochladí a stabilizují jedním z činidel, která zahrnují polyvinylalkohol (PVA). želatinu, algináty, polyvinylpyrrolidon (PVP) a methyleelulózu, a buď sušením ve kj vakuu, nebo extrakcí rozpouštědla se zbaví rozpouštědla.
Vynález se stane zřejmějším po prostudování následujících příkladů.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Propagace a purifikaee chřipkových virů
Z PDA v alantoické kapalině vejce kuřete se získaly následující kmeny chřipkové vakcíny:
A/Beijing/353/89-podobný (H3N2)
A/Bcijing/32/92-podobný (H3N2)
A/Beijing/36/91-podobný (Η 1N1)
B/Panama/45/90.
Pro propagaci původní zásoby chřipkového viru, získaného z PDA, se MDCK buňky infikovaly sa v přítomnosti TPCK-ošetřeného try psinu (Sigma Chemical Co., St. Louis. MO) a koncentracích fetálního bovinního séra. které jsou optimální pro přípravu nej vyšších titrů viru první choroby.
MDCK buňky se infikovaly chřipkovými kmeny pří nízké multiplicitě infekce (0.1 až 0,5), jak určil standardní HA test (Rosen. ,J lemagglutination with Animal Viruses in Fwidamental Techniifues in Virolog)', ed. K. Habel a N. P. Salzman. str. 276-28 (Academie Press, New York
1969)). Infikované buňky se inkubovaly 48 hodin při 33 °C a u média se provedl test hemaglutininové aktivity, stanovující produkci viru. Podmínky poskytující nejvyšší HA aktivitu se použily pro přípravu velkých zásob chřipkového viru. Optimální koncentrace TPCK trypsinu a fetálního bovinního séra pro výše uvedené chřipkové viry jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 1.
- 14LZ ZMV8O2 Bó
Optimální koncentrace TPCK trypsinu a fetálního bovinního séra
- 15 ez Bb
Purifíkace chřipkového viru
Virus se 24 až 48 hodin po infikaci sklidil z 10 Tl75 kultivačních nádob klarifiačního media (1000 x g po dobu 10 minut), chřipkou infikovaných MDCK buněk. Virus se peletoval z média při 100 000 x g po dobu 1 hodiny. Výsledná virová peleta se resuspendovala v 1 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) pH 7,4 a odstřeďovala přes 20 ml 20 až 60% (lim./obj.) sacharózového gradientu v PBS. Pás chřipkového viru se sklidil ze 40 až 45% sacharózové oblasti gradientu, naředil PBS a peletoval při 100 000 x g. Purifíkovaná virová peleta se resuspendovala v 0,5 ml PBS, skladovaného při -70 °C.
Příklad 2
Klonovaná HA genu influenzy A/Tcxas/36/91
Specifický příklad klonovaného kroku pro jeden z chřipkových HA genů je znázorněn na obrázku 2. Virová RNA se extrahovala výše popsaným způsobem z influenzy' A/Texas/36/91, získané zCDC. Univerzální primer, komplementární skončeni 3' chřipkových RNA segmentů 5'AGCAAAAGCAGG-3' (SFQ ID NO:1), se použil spolu s reverzní transkriptázou viru myší
Maloneyovy leukémie (M MuLV) pro výrobu chřipkové cDNA. Purifíkovaná virová RNA nebo mRNA (5 pg) se použila jako matrice pro výrobu cDNA. používající M-MuLV reverzní transkriptázu. dodanou společnou Pharmacia lne. v sadě First-Strand cDNA Synthesis Kit. Primerem, použitý pro cDNA virové RNA z chřipkových kmenů A, byl syntetický oligonukleotidový primer (5-AGCAAAAGCAGG-3') (SEQ ID NO:1), který je homologický s koncem 3' všech segmentů
HA genového virionu.
Amplifikace HA genů z cDNA se provedla polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití standardních reakčních podmínek (Gene Amp kits; Cetus/Perkin Elmer, Norwalk, CT). PCR reakční směs (100 pL) obsahovala 20 prnolů primerů, specifických pro 5' a 3' konec HA genu chřipkového kmene influenza A (H3) nebo A (Hl) nebo chřipkové kmeny influenza B, jak ukazují konvenční sekvence zjištěné v genové bance DNA dat. která ukazuje tabulka 2. Amplifikace se prováděla vc třiceti cyklech, z nichž každý sestával z jednominutové denaturace při 94 °C, dvouminutové temperace při 55 °C a tříminutové extenze při 72 °C. Správná velikost PCR produktů se před klonováním potvrdila na 0.8% agarózových gelech.
PCR primeiy z konce 5' HA genu: 5' GGG GGT ACC CCC GGG AGC AAA AGC AGG GGA AAA TAA ΛΛΑ-3' (SEQ ID NO:2) a konce 3' HA genu: 5ΌΑ AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC-3' (SEQ ID NO:3) se použily při PCR k získání celodélkového HA genu.
Nový 5' PCR primer byl navržen z 5' konce genu; 5' GGG GGT ACC CCC GGG GAC ACA A l A TGT ATA GGC TAC CAT-3' (SEQ ID NO:4) a 3' konce genu; 5'-GA AAC GTC ACG TCT TA I ACG/T TAG/T ACT CAA TGG CCC-3' (SEQ ID NO:5). Tyto primery se použily při PCR k získání HA genu bez sekvence signálního peptidu. fen sc následně vložil do TA vektoru rozštěpeného KptA, 61K signální peptid pro baculovirovou expresi a polyhedrinový promotor se následně vložil do TA vektoru, obsahujícího HA gen postrádající sekvenci chřipkového signálního peptidu. Výsledný baculovirový rekombinantní vektor obsahoval polyhedrinový promotor, 61K baculovirový signální peptid a HA gen pro influenzu A/Texas/36/91.
5o HA geny z chřipkových kmenů influenzy B se klonovaly z celkové mediátorové RNA (mRNA), extrahované z MDCK buněk infikovaných chřipkovým kmenem B, B/Panama/45/90. Celková RNA se připravila z 5 Tl75 láhví infikovaných buněk. Sklizené buňky se lyžovaly v přítomnosti guanidiniumthiokyanátu a celková RNA se purifikovala výše popsaným způsobem. Celková
- (6CZ 2W862 B6 mRNA sc extrahovala z celulární RNA za použití výše popsaných oligo-ýdT) celulózových odstreďovaných kolon.
Primerem, použitým pro mRNA chřipkových kmenů B byl nahodilý oligonukleotidový DNA 5 primer (Pharmacia, lne.).
- 17CZ 299862 B6
Tabulka 2 Primery použité pro PCR amplifíkaci
cn
LD o
to p
x o
EH <
LO
CM
O s
Q
H σ
ta ca p
p o
pí u
0)
P o
ld
P
Ě ca p
ÍX tt
Ci
E-i υ
u <
H
O
O o
<
H
U ío <
<
O <
O <
o o
u o
o o
υ o
o
EH
O
O o
o o
LO lo
-a rc £
ca
P
ÍX tt h
,-}
P
P
P ~
Η
CQ ·· O CZ.
Q CO Hl ρ σ ή ta £ w υ φ Ό P Ή O r> i4 a - <L>
lo a (SEQ ID NO:3} 3' GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC o
<D
P
O
CO
- 18CZ 299862 B6
Tabulka 2 pokračování
- 19CZ 299862 B6
Příklad produktů eDNA syntézy použil jako matrici virovou RNA chřipkového viru A/Texas/36/91. Oblast eDNA segmentů, která kóduje chřipkové proteiny by mohla byt zjištěna následujícím způsobem. Purifikovaná virová RNA se sloučí v reakční směsi s univerzálním jednořetězcovým DNA primerem 5'-AGCAAAAGCAGG 3' (SEQ ID NO: 124) (SEQ ID NO: 1). Tento primer je komplementární s 3' koncem již zmíněných segmentů chřipkového virionu. Reakce rovněž zahrnovala přidání [a 1?P]dCTP, čímž se zajistila vizualizace eDNA produktů, které se separovaly na 1.5% alkalickém hydrolyzačním gelu (Maniatis a kol,, 1982) a exponovaly na XOMAT-AR film.
io
Příklad 3
Klonování HA genů do bakteriálních plastidň is PCR amplifikované rHA geny sc klonovaly do pUC-podobného plazmidového vektoru, za použití TA klo novací ho systému (Invitrogcn, lne.). Přítomnost HA genů se ověřila restrikčně enzymatickou digerační analýzou plazmidové DNA, purifikované standardními postupy {Maniatis a kol., 1982). Konec 5' rl IA genů se následně analyzoval DNA sekvencován ím a pro odstranění sekvencí, kódujících hydrofobní signální peptidv na N-konci HA proteinů, byly navrženy nové
2n primery. Specifické 5' a 3' oligonukleotidové primery, jejichž seznam uvádí tabulka 2, se následně použily pro amplifikaci eDNA produktů, k níž se použila PCR. a standardními klonovaeimi metodami se klonovaly do E. coli TA plazmidových vektorů (Invitrogen, lne.). Výsledné DNA klony obsahovaly kódovací sekvence pro zralé HA.
rHA geny z A/Texas/36/91, Λ/Beijing/353/89. Λ/Beijing/32/92 a B/Panama/45/90 se subklonovaly standardními postupy (Maniatis a kol. 1982) do baculovirových expresních vektorů. HA geny se odstranily z TA klonovacích plazmidu pomocí vhodných restrikčních enzymů a DNA fragment puntíkovaného 11A se vložil do baculovirového rekombinantního plazmidu. Výsledné bakteriální klony se prohledávaly na ampicilinovou rezistenci a následně sestřihly restrikěními
3o enzymy, uvolnily vložený HA genu a tím potvrdily jeho přítomnost. Rekombinantní plazmidy, obsahující HA geny, se purifikovaly na gradientech chloridu česného a ethidiumbromidu (Maniatis a kol.. 1982). 5' konec plazmidu se sekvencoval s cílem potvrdil přítomnost správných bac uloví ro vých signálů (sekvence AcNPV po lyhedri nového promotoru, ATG trans lační ho startovního signálu, a baculovirového signálu) a správnou HA-kódující sekvenci ve správném čtecím rámci.
DNA sekvence na 5' konci HA genů a lemovací AcNPV polyhedrinový promotor a baculovirový signální peptid (prvních 18 aminokyselin každé aminokyselinové sekvence) je znázorněno v sekvenčním protokolu.
SEQ ID NO.6 kóduje sekvenci 5' konce HA genu pro A/Bcij ing/32/92 (sekvenční rozsah 1-481).
SEQ ID NO;7 je odpovídající aminokyselinová sekvence (začíná na startovacím kodonu „ATG“ [nukleotidu 21] SEQ ÍD NO:6). Aminokyselinová sekvence 61K signálního peptidů je uvedena v SEQ ID NO:7 jako aminokyseliny 1-18.
SEQ ID NO. 8 kóduje sekvenci 5' konce HA genu pro A/Texas/36/91 (sekvenční rozmezí
1-481). SEQ ID NO: 9 je odpovídající aminokyselinovou sekvencí (začínající na startovacím kodonu „ATG1' [nukleotidu 21] SEQ ID NO: 8). Aminokyselinová sekvence 61K signálního peptidů je uvedena v SEQ ID NO; 9 jako aminokyseliny 1-18.
SEQ ID NO: 10 kóduje sekvenci 5' konce HA genu pro B/Panama/45/90 (sekvenční rozmezí
1-434). SEQ ID NO: 11 je odpovídající aminokyselinovou sekvencí (začínající na startovacím kodonu „ATG“ [nukleotidu 21] SEQ ID NO: 10). Aminokyselinová sekvence 61K signálního peptidů je uvedena v SEQ ID NO. 11 jako aminokyseliny 1-18.
-20LZ B6
V SEQ ID NO 6. 8 a 10 nukleotidy t—20 kódují 3' konec polyhedrínového promotoru, nukleotidy 21-74 kódují 61K signální peptid a nukleotidy 75 až konec kódují 5' konec HA genu.
s Příklad 4
Exprese rekombinantního HA ve hmyzích buňkách
Chimérické rekombinantní plazmidy, obsahující klonované HA geny se purifikovaly a 2 pg se io smísily s 1 pg standardního typu DNA AcNPV. DNA se vy srážely s vápníkem a transfektovaly do buněk S. frugiperda za použití standardních postupů (Srnith, Summers a Fraser, Mol, and Cell.
Biol. 3:2156-2165 (1983)). Rekombinantní baculoviry se identifikovaly na základě morfologie plak a následně dále purifikovaly dalšími cykly purifikace plak. Plakově purifikované rekombinantní baculoviry se prohledávaly s cílem analyzovat expresi rHA a pro další vývoj se zvolil jediný baculovirový expresní vektor.
Buňky S. Jrugiperda se infikovaly baculovirovým vektorem, obsahujícím HA gen z chřipkového kmene: B/Panama/45/90. 24, 48 a 72 hodin po infikací sc 1 x 106 buněk pulzovalo s 25 pCi [^Sjmethioninu po dobu 15 minut, čímž se značené proteiny syntetizovaly. Buňky se sebraly
2o a proteiny se separovaly na 11% polyakrylamidovéin gelu v přítomnosti 0,1% SDS. Radiologicky značené proteiny se detekovaly expozicí na X-OMAT-AR film. Umístění proteinových standardů a jejich velikosti v kilodaltonech (kd) naznačily, že 85 kd rckombinantní I IA protein je jedním z hlavních proteinu, které se syntetizovaly v buňkách 48 hodin a 72 hodin po infikací.
Příklad 5
Produkce a purifikace rekombinantního HA
Baculovirový expresní vektor A86II, který' obsahuje gen pro influenzu A/Beijing/353/89, produkovaný v podstatě výše popsaným způsobem pro A/Beijing/32/92 hemaglutínin pod kontrolou polyhedrínového promotoru, se použil pro infikování buněk V frugiperda. Buňky se nechaly narůst při 27 °C do hustoty I x 10(’ buněk/ml v TNMFH médiu (Gibco BER, Gaithersburg, MD) obohaceném 10% íctálním bovinním sérem a infikovaly se při muítiplicité infekce (MOI) I
A 8611 rekombinantním baču lov i re m. Během inflkace sc hemaglutínin influenzy A/Beij ing/3 53/89 produkoval za transkripční kontroly baculovirového polyhedrínového promotoru. Buňky se sklidily 72 hodin po infikací patnáctí minutovým odstřeďování m při 3 400 x g a promyly resuspenzí v séru prostém TNMFH médiu a následně třieetiminutovým odstřeďováním při 10 400 x g. Supernatant se oddekantoval a infikované buněčné pelety se skladovaly při -70 °C.
41)
Vyvinul se způsob, ve kterém se rekombinantní HA za podmínek, které nedenaturují antigen selektivně extrahoval z infikovaných bunčk. Není-li stanoveno jinak, provádí se všechny extrakční kroky při 4 °C. Buněčná peleta z 0.5 I kultury (přibližně 5 x 10K buněk) se rozrušovala 2 minuty ve 40 ml ledově studených 30 mM Tris-HCI, pH 8,4, 25 mM LiCl, 1% (obj./obj.) Tween u-20,
1 mg/ml leupeptinu za použití homogenizátoru Polytron (Brinkmann Instruments lne. Westbury,
NY). Homogenát se odstřeďoval třicet minut při 9200 x g. Supernatant se vypustil a pelety se sebraly. Tento krok odstranil rozpustné a periferní membránové proteiny z hmyzích buněk bez extrakce integrálním membránovým proteinům podobného rHA. rHA se z pelet extrahoval dvouminutovou homogenizací při nastavení 4 ve 40 ml ledově studeného 30 mM Tris, lOmM etlianolaminu, pH 11, 25 mM LiCl a 2% Tween u-20. Po šedesáti minutové inkubaci na ledu se pH hodnota homogenátu nastavila na 8.4 pomocí l N HCI a nerozpustný materiál se odstranil třieetiminutovým odstřeďováním při 9200 x g. Supernatant obsahující rozpustný rHA se oddekantoval a pH hodnota se zkontrolovala, a pokud lo bylo nezbytné, tak se nastavila na 8,4 při pokojové teplotě. Nerozpustný materiál se pro analytické účely resuspendoval ve 40 ml vody.
-21 CZ 299862 B6
ΙΑ integrální membránový protein se solubilizoval při vysokém pH v přítomnosti detergentu Tween- 20 a zůstal v roztoku potom, co pl i pokleslo.
Proteiny se analyzovaly $DS elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Vzorky se rozrušily ve vroucí vodní lázni, kde se ponechaly 10 minut v přítomnosti 2% dodecylsulfátu sodného (SDS) a 5% beta-merkaptoethanolu. načež se podrobily elektroforéze na 11% polyakrylamídovém gelu v přítomnosti 0.1% SDS, načež se zabarvily modří Coomassie.
Pro purifíkae i rekombínantního eHA byl vyvinut chromatografieký purifikační proces, který id poskytuje vysoce purifikovaný rekombinantní HA antigen, který není denaturovaný a je vhodný jako složka chřipkové vakcíny pro humánní aplikaci. Pro čištění A/Beijing/353/89 HA z buněk
5. frugiperdu infikovaných rekombinantním virem A8611 sc použil následující postup.
Chromatografiekými gelovými matricemi, použitými pro purifíkae i HA z 0,5 1 infikovaných i? buněk 5. frugiperda. bylo 30 ml Pharmacia DEAD Sepharose Fast Flow (v koloně Pharmacia
Cl6/20) a 4 ml Pharmacia Lentil Lectin Sepharose 4B (v koloně Pharmacia C10/10). Výstup DEAE kolony je spojen se vstupem čočkové lektinové kolony a S/N 2 buněčný extrakt, připravený výše popsaným způsobem, se aplikoval do spojených kolon rychlostí 1 ml/minutu. Kolony se promyly 30 mM Tris-HCI, pH 8,4, 25 mM Liči, 0,5% Tween 20 dokud se hodnota UV absorpce při 280 nm proudu vytékajícího z čočkové lektinové kolony navrátila na výchozí hodnotu. Za těchto podmínek se většina kontaminujících proteinů navázala na DEAE, ale rekombinantní HA proudí kolonou. Zbývající kontaminující látky prochází čočkovou kolonou a glykosylátovaný rHA se váže na čočkovou lekl i novou afinitní matrici. DEAE kolona se rozpojí a lektinové kolona se promyje dalšími 40 ml 30 mM Tris—1IC1, pil 8,4, 25 mM LÍCI, 0,5%
Tween 20. Lektinové kolona se následně promyla 40 ml 30 mM Tris-HCI. pH 8.4, 25 mM LiCl, 0,4% (obj./obj.) deoxycholátu sodného (DOC). Tento krok nahradí detergent Tween-20 detergentern, jako je DOC, který lze z proteinu odstranit dialýzou, Rekombinantní HA se následné z lektinové kolony eluovala pomocí přibližně 20 ml 40 ml 30 mM Tris-HCI, pil 8,4, 25 mM LÍCI, 0,4% (obj/obj) deoxyeholátu sodného, obsahujícího 0,3 M a D melhylmannosidu. Výslední ky se analyzovaly pomocí 11% PAGE.
Díky generické variabilitě chřipkových HA proteinů sc detaily, týkající se výše uvedeného purifikaěního postupu, mohou v případě každého jedinečného rekombínantního HA proteinu lišit. rHA se může například vázat na DEAE íntomčníčovou kolonu namísto toho, aby touto kolonou pro35 cházely. V tomto případě by se rllA mohl z DEAE kolony odstranit promyt ím kolony putrem obsahujícím vysokou koncentraci LiCl, NaCl nebo jiné soli.
Pro odstranění DOC detergentu a dalších složek pufru se proud vytékající z lektinové kolony, který obsahuje purifikovaný rHA. dialyzoval proti fosfátem pufrovanému fyziologickému rozlo40 ku, pH 7,5 (PBS). Purifikovaný rekombinantní HA měl alespoň 95% čistotu, stanoveno analýzou na SDS polyakrylamidovýeh gelech.
Příklad 6
Analýza proteázové rezistence rHA
Zralý HA tvoří trimerovč struktury, které jsou rezistentní proti různým proteázám včetně trypsinu. které degradují HA monomery' (Murphy a Webster, 1990). Rezistence vůči trypsínovému
5o ošetření může být tedy použita jako test pro určení funkční trimerovč tvorby. Pro studie rezistence rHA vůči proteázovému ošetření se použil následující postup.
Dva alikvotní podíly puriflkovaného rHA (A/Bcijing/353/89) při koncentraci 60 pg/ml se inkubovaly po dobu 30 minut na ledu, v 30 mM Tris-HCI, pH 8,4, 150 mM NaCl, v přítomnosti a za absence 50 pg/ml TPCK-ošetřeného trypsinu. Reakce se ukončila přidáním 57,4 mM fcnyl- 22 CZ 299862 B6 methyl sulfonyl fluor idu v isopropanolu do konečné koncentrace ] mM. Alikvotní podíly každého vzorku se denalurovaly varem v 3% SOS za redukčních podmínek, podrobily elektroforéze na 11.5% polyakrylamidových gelech a pomocí westernového přenosu přenesly na nitroeelulózový filtr. HA polypeptidy se detekovaly za použití anti-HA séra morčete, připraveného proti purifi5 kovanému rHA a kozího antí-morčecího IgG alkalinfosfatázového konjugátu.
Neošetřený rHA migroval při velikosti HA prekurzoru (HAO). Proteázové ošetření vedlo k vytvoření dvou hlavních pásů, které migrovaly při velikostech předpokládaných pro chřipkový hemaglutinin HA1 a HA2. Výsledky ukázaly, že trypsin rozštěpil rHA protein a dal tak vzniknout io dvěma polypeptidům, jejichž velikosti odpovídají předpokládaným HA1 HA2 velikostem, K žádnému dalšímu protalylickému procesu nedošlo. Tyto výsledky ukazují, že rHA, purifikovaný vvše popsaným způsobem, je rezistentní proti degradaci proteázou. Tato vlastnost je specifická pro puntíkovaný HIA, který se nachází ve formě trimerů.
Příklad 7
Stanovení ímunogenicity rl IA pomocí standardizovaného testu myší potence
Jedním způsobem měření ímunogenicity antigenu je stanovení množství, nezbytného pro indukci detekovatelné odezvy na protilátku u myší (test myší potence). Standardizovaný test myší potence se používá pro měření ímunogenicity rHAO vakcíny. Skupiny pěti až deseti myší sc imunizovaly jednou vakcínou, obsahující postupná naředěni rl 1A, tj, 0,500 gg, 0,1 gg, 0,02 gg a 0,004 gg purifi kovaného rlIA. Séra se odebrala 28 dní po imunizaci a protilátky proti rHA antigenu se měřily pomocí standardního testu (ELISA) v 96jamkových mikrotitračních plotnách. Myši jsou serokonvertované, pokud je OD450 při 1:100 naředěni 28denního antiséra vyšší, než průměrná hodnota OD450 myšího prc-imunního sera, zvýšená o tři standardní odchylky. Účinná dávka vakcíny, potřebná pro 50% sérokonverzi myší (ED50) je mírou ímunogenicity antigenu.
Například čtyři skupiny zahrnující 10 myší se imunizovaly 0,1 gg, 0,02 gg. 0.004 gg nebo 0,008 gg (pětinásobné naředěni), rl IA0 vakcínou. Séra se shromáždila 28 dnů po imunizaci a pomocí ELISA testu se měřila proti každému rHAO antigenu ve vakcíně, s cílem určit sérokonverzi. Vypočetla se dávka, potřebná pro 50% sérokonverzi myší (ED5((). a pro každý rHAO antigen se určila minimální hodnota ED5().
3?
Předběžná data ukazovala, že jedna dávka 0,004 gg rHAO bude sérokonverlovai alespoň 50% myší.
Příklad 8
Podání rHA v kombinaci s adjuvansem a srovnání s dostupnými chřipkovými vakcínami
Myší potence purifi ková ného rHA chřipkového kmene Λ/Raij ing/353/89 se analyzovala s ka4? mencem nebo bez kamence a srovnávala s komerčně dostupnou chřipkovou vakcínou FLUZONE (Connaugth Laboratories, lne. Swiftwater, PA), která obsahovala A/Bcijing/353/89 chřipkový kmen. Vakeína se podala v dávce 0,5 gg, 0.1 gg. 0,02 gg a 0,04 gg. Dvacátý osmý den se myším injektovaly výše popsané dávky puntíkovaného rlIA. Čtyřicetidvoudenní myší sérum se titrovalo v ELISA testu, s cílem stanovit IgG-HA protilátky.
Výsledky jsou znázorněny na obrázku 3. Za nepřítomnosti adjuvansu indukovala pouze dávka 0.5 gg produkci podstatnějšího titru protilátky (200 000). V přítomnosti adjuvansů produkovaly podstatnější množství protilátky již dávky 0,004 gg rHAO. Zvířata, imunizovaná rHA (bez kamence) produkovala přibližně stejné koncentrace anti-ΗΛ protilátek jako komerční vakeína.
- 23 C7 299862 B6
Kamenec zvýšil imunogenicitu rllA, přičemž v přítomnosti adjuvansu se generovaly minimálně desetinásobné vvšší anti—HA titry než v nepřítomnosti adjuvansu.
Srovnání imunogenieily purifikovaných rHAO s komerční celovirionovou chřipkou vakcínou
FLUZONE (Connaugth Laboratories. Inc. Swiftwater, PA), ukazuje, že rHAO vyvolává po dobu 48 dnů podobnou imunitní odezvu u myší. Adsorpce rHAO na kamenec podstatně zvyšuje imunogenicitu purifikovaného rHAO u myší, jak ukazují výsledky testu, popsaného v příkladu 7. Kombinace s kamencem způsobuje vyšší tvorbu IgG hemaglutininových protilátek než chřipkové vakcíny FLUZONE.
Příklad 9
Studie hemaglutinační inhibice i?
Hemaglutinačně inhibiční (HA1) protilátky sc váží na tři ze čtyř známých epitopů na hemaglutininu a blokují schopnost chřipky aglutinovat červené krvinky (Wilson a kol., „Structure of the hemaglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A resolution. Nátuře, 289-366-378 (1981)). Tvto antigenní determináty se shlukují okolo vazebného místa receptorů kyseliny sialové na hemaglutininových trimerech. Protilátky proti těmto místům budou neutralizovat infekčnost viru (Weis a kol., „Structure of the influenza virus hemaglutinin comlexed with its reeeptor. sialic acid'\ Nátuře 333:426-431 (1988)). 1 itr a specifičnost HA1 protilátek jsou důležitými mírami potence chřipkové vakcíny chránit proti infikaci podobnými nebo odvozenými typy chřipky.
2ς Studie, porovnávající schopnost purifikovaného rHAO připraveného z chřipkového kmene A/Beijing/353/89 a chřipkové vakcíny FLUZONE (Connaugth Laboratories, lne. Swiftwater, PA), vyvolávat tvorbu HAI protilátek, se prováděly na myších. Skupiny pěti myší se injektovaly nultý a dvacátý osmý den 0,05 pg, 0,1 pg, 0,02 pg nebo 0,004 pg rHAO nebo třikrát stejnými množstvími vakcíny FLUZONE, takže se podala stejná množství rekombinantního nebo virového so A/Beijing/353/89 hemaglutininu. Například myši v nejvyšší dávkové skupině byly imunizovány 1.5 pg FLUZONE hemaglutininu (0,5 pg hemaglutininu z každého kmene) a 0,5 pg rHAO. Přítomnost dalšího hemaglutininového antigenů ve vakcíně FLUZONE ze dvou dalších chřipkových kmenů může vést k určitým křížově reaktivním protilátkám.
3? Anti-hemaglutininové protilátky (hemaglutininový IgG) se měřily proti puntíkovanému rHAO ve standardním testu ELISA. HAI protilátky sc měřily proti čtyřem hemaglutininovým jednotkám následujících antigenů: celý chřipkový virus A/Bijing/353/89 (A/Bci) purifíkovány rHAO A/Beijing/353/89 antigen a FLUZONE, HAI titr odpovídá nej vyššímu naředění antiséra, které z 50 % inhibuje aglutinaci kuřecích čerstvých krvinek.
411
Tabulka 3 uvádí titry' sérového hemaglutininového IgG a HAI u myší, stanovené 42. den. Vyšší hladiny anti-hemaglutininových protilátek produkovala rekombinantní rHAO vakcína. Tyto titry byly přibližně desetkrát vyšší než titry získané při aplikaci vakcíny FLUZONE. Nej podstatnější je to. že rHAO vakcína produkovala dobré titry protilátek, které blokovaly aglutinaci červených krvinek, způsobenou virem A/Beijing/353/89 a rHAO antigenů. l akže rHAO vakcína produkovala HAI protilátky, které rozpoznávaly stejně dobře imunogen a chřipkový vir A/Beijing. Nižší HAI titry. naměřené proti vakcíně FLUZONE, mohou být způsobeny neschopností antiséra blokovat aglutinaci způsobenou dalšími dvěma kmeny hemaglutininu ve vakcíně TLUZONE. Na druhé straně myši imunizované vakcínou FLUZONE produkují vysoké titry HAI protilátek v případě, že se měření provádí proti vakcíně FLUZONE. HAI titry' proti chřipkovému viru A/Beij ing/353/89 a rHAO antigenů byly podstatně nižší. Podobné schéma bylo možné pozorovat u myší, spadajících do nižších dávkových skupin.
-24cz 299862 Bó
-25 CZ 299862 B6 /těchto výsledků rovněž vyplývá, že mezi chřipkovým kmenem A/Beijing/3 53/89 ve vakeíně FLUZONE a stejným chřipkovým kmenem získaným z EDA a před použitím v HAI testu jednou pasážovaným ve vejcích jsou genetické rozdíly. Skutečnost, že protilátky produkované v odezvě na rekombinantní HAO. klonovaný z chřipkového viru A/Beijing/353/89, blokují aglutinaci čer5 vených krvinek způsobenou tímto chřipkovým kmenem je dobrým důkazem toho, že během klonování nedošlo k žádným genetickým změnám, které by ovlivnily vazebné místo receptorů kmeny sialové na puntíkovaném rHAO antigenů.
io Příklad 10
Formulace a klinická účinnost chřipkové vakcíny 1993/1994
Provedla se celá řada humánních klinických testů, které měly charakterizovat bezpečnost a imu15 nogcnicitu experimentální chřipkové vakcíny, obsahující rekombinantní HA u lidí a pomoci získat předběžná dala, týkající se ochranné účinnosti této vakcíny proti přirozené inflkaci během epidemického období. Výsledky ukazují, že vakcíny obsahující rekombinantní chřipkový hemaglutinin (rllAO). připravený zde popsanými způsoby způsobovaly méně místních nežádoucích reakcí a poskytovaly stejnou nebo lepší ochrannou imunitní odpověď v porovnání s komerčně
2o dostupnou, licencí opatřenou, zředěnou chřipkovou vakcínou vyráběnou ve vejcích.
Materiály a metody
Vakcíny
Rekombinantní HA vakcíny použité v této studii zahrnovaly celodélkový neštěpený HA (HAO) glykoprotein z chřipkového viru A/Beijing/32/92 (H3N3). Rekombinantní HAO (RHAO) se produkoval v kulturách motýlích (hmyzích) buněk, načež následovala expozice baculovirovým vektorem obsahujícím cDNA inzerty kódující HA gen. Exprimovány protein se purifikoval za so nedenaturačních podmínek do 95% čistoty, měřeno kvantitativní skenovací densitometrií objemněho antigenů separovaného elektroforézou na nátrium dodecylsulfátpolyakrylamidových gelech.
Identita peptidu se potvrdila aminokyselinovou analýzou, N-koncového sek věncování a analýzy westernového blotu protichřipkovým A/Beijing/32/92 sérem. rHAO vakcíny obsahovaly specifické množství syntetický syntetického HA antigenů buď rozpuštěného ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku, nebo adsorbovaném na fosforečnanu hlinitém (kamenci), jako adjuvansu, ve formě gelové suspenze. Schválená trojvalenční subvirionová vakeína použitá při studii obsahovala 15 gg/dávku každého HA z chřipkového viru A/Texas/36/91 (N1N1), chřipkového viru A/Beijing/32/92 (H3N2) a chřipkového viru B/Panama/45/90 ředěné chřipkové vakcíny FLUZONE vyráběné ve vejcích (Connauglh Laboratories, lne. Swiftwater, PA).
Klinické testy
Institucionálními posudkovými typy Univerzity Saint Louis a Univerzity v Rochcstcru schválily identické studijní protokoly. Studií na obou univerzitách se účastnili zdraví dospělí jedinci vc věku 18 až 45 let. Subjekty sc nahodile rozdělily do skupin, kterým se následně aplikovala jedna z následujících pěti vakcínových přípravků dvojím slepým způsobem: (I) 15 Lig rllAO, (2) pg rHAO plus kamenec, (3) 90 Lig rHAO, (4) schválená trojvalenční inaktivovaná chřipková vakeína, nebo (5) fyziologické placebo. Vakcíny se podávaly intramuskulámí injekcí v objemu 0,5 ml. Pro počáteční odhad bezpečnosti tří vakcínových přípravků obsahujících rHAO, se zvolilo naho50 díle a nezávisle na ostatních subjektech prvních 25 jedinců, kteří měli být vakcinováni, (tj. 5 osob na studii) a tyto jedinci byli 48 hodin po vakcínaci před tím, než se aplikovaly zbývající vakcíny. nepřetržitě telefonicky sledování. Všichni zvolení jedinci byli instruováni tak, aby vyplňovali denní zprávu a v ní uvedli veškeré nežádoucí reakce včetně lokálních a systém ických příznaků, které se u nich projevily během prvních šesti dní po vakcínaci. Pokud jde o povahu příznaků, jedinci sami tyto příznaky hodnotili jako mírné, střední nebo vážné. Pokud sledovaní
-26C7 299862 B6 jedinci cítili, že mají zvýšenou teplotu, potom rovněž zaznamenali hodnoty orálně měřené teploty, Pokud se na místě po injekci objevilo lokální zduření nebo erytém. potom se hodnotilo zdaje plocha zduření nebo erytému menší. resp. vetší než ětvrtdolar, Všechny vakcíny se aplikovaly v průběhu posledního týdnu měsíce listopadu a prvního týdně měsíce prosince 1993. Vzorky séra se odebraly každému jedinci v okamžiku vakcinace, tři týdny po vakcinaci a znovu koncem března nebo v měsíci dubnu 1994 alespoň dva až tři týdny potom, co již viry nccirkulovali v místních komunitách. Účastníci studie byly rovněž instruováni, aby kontaktovali studijní centrum, pokud během zimního chřipkového epidemického období prodělají chřipce podobnou chorobu. Chřipce podobná choroba byla definována jako výskyt jakéhokoli respiračního příznaku trvající déle než io dva dny a doprovázeného horečkou a/nebo systemickými příznaky myelgie nebo nachlazení. Jedincům, kteří zaznamenali chřipkové příznaky, se provedly nosohltanové výtčry za účelem získání a identifikace virové kultury. Klinické vzorky sc opatřily identifikačními kódy a zpracovaly slepím způsobem.
Sérologie
Pro jednotlivé typy sérologických testů se všechny vzorky shromážděné v obou institucích testovaly najednou v jediné laboratoři. Hcmaglutinacně inhibiční (HA!) protilátky proti antigenu chřipkového viru A/Bcijing/32/93 (Π3Ν2) se měřily v séru standardním mikrotitračním testem, načež následovalo odstranění nespecifického inhibitoru pomocí enzymu ničícího receptor a odstranění studených aglutininů hemadsorpcí při 4 °C. Titr se definoval jako nejvyšší naředění séra. které zcela zabránilo hemaglutinaci způsobené čtyřmi antigenový mi jednotkami viru. přičemž jako výchozí naředění se zvolilo naředění 1:4. Protilátky sérového HA specifického imunoglobulin G (IgG) se měřily pomocí testu ELISA. při kterém se jako potahový antigen použil purifíkovaný rHAO chřipkového viru A/Beijing/32/92 (H3N2). Sled reakčních činidel směrem ven zpěvné fáze tvořil (1) purifíkovaný rHAO antigen, (2) vzorek séra. (3) alkalinfosfatáza-konjugovaná s kozím anti-humánním IgG a (4) substrát na bázi p-nitrofenylfosfátu disodného. ELISA titr se exprímoval jako nejvyšší naředění, při kterém byla optická hustota obsahu jamky obsahující antigen alespoň dvakrát vyšší, než optická hustota obsahu odpovídající so kontrolní jamky bez antigenu. Neutralizované protilátky sc měřily za použití mikroneutralizačního testu, který již popsal Trcanor J.J. a Betts R.R.../ Infeet. Dis. 168:455-459 (1993). Postupná naředění tepelně inaktívovaného séra se smísila s přibližně 100 TClDs« chřipkového víru A/Beíjíng/32/92 (H3N2) a inkuboval jednu hodinu při 37 °C. Smčs viru a séra sc následně adsorbovala při pokojové teplotě v průběhu jedné hodiny na splývající monovrstvu ledvinových buněk psa Madin-Darbv (MDCK) v jamkách devadesátišestijamkových ploten. Plotny sc promy ly za účelem odstranění zbytkového inokula a opět naplnily séra prostým Dulbeccovým MEM s 2 pg/ntl trypsinu a sedmdesát dva hodin inkubovaly v 5% CO2 při 33 °C. Buňky se následně fixovaly rnethanoiem a virová replikace sc vyhodnotila za použití seznamu myších myších monokl onál nich protilátek specifických pro matrici a nukleoproleiny chřipkového viru A (Centers for to Disease Control, Atlanta, GA), a následně alka linfosfatázou-konjugo vanou s anti-myším IgG. Poslední litr séra se definoval jako nejvyšší naředění. které způsobuje 50% redukci signálu v porovnání s neneutralizovanými kontrolními jamkami,
Virologic
Virově kultury vzorků nosohltanových výtčrů se zpracovaly v každé instituci standardními technikami, Vzorky se očkovaly buď v MDCK. nebo ledvinových buňkách makaka a inkubovaly 14 dní při 33 °C. Hemadsorpce buněčných monovrstev se testovala pomocí 0.4% roztoku erythrocytú morčete. Chřipkové viry se identifikovaly v hemadsorpčně pozitivních kulturách
HA1 za použití H3-specillckého antiséra (Centers for Disease Control).
Statistické analýzy
Reciproký HA1, ELISA IgG a titry' neutralizační protilátky se logaritmicky transformovaly pro účely statistické analýzy. Jako významná odpověď na vakcinaci se definovalo čtyřnásobné nebo
-27C'Z 299862 B6 větší zvýšení titru protilátky mezi vzorky séra odebranými před vakcinaci a po vakcinaci. Laboratorní důkaz chřipkového virové infekce A (H3N2) sc definoval jako izolace viru z nosohRanových sekretů a/nebo čtyřnásobné a vetší zvýšení Utru HAI protilátky v séru mezi třítýdenním post-vakcinačnítn vzorkem (presezonní) odebraným v prosinci a odpovídajícím (postsezonním) ? vzorkem, odebraným následující jaro. Rozdíly mezi vakcinovanými skupinami se analyzovaly pomocí Lisherova exaktního testu, jehož cílem je porovnat podíly subjektů s nežádoucími reakcemi, s podstatnou proti látkovou odezvou nebo laboratorně potvrzenou chřipkovou nemocí nebo infekcí, a analyzováním rozdílu (ANOVA), a porovnat postvakcinační průměrný reciproký log2 titrů protilátky. Modifikovaný test Bonferroniho nepravidelnosti a Tukey-Kramerův test se aplilo kovaly v případě, kdy bylo pro dosažení konečného výsledku vhodné provést vícero možných srovnání.
Výsledky i? Reaktogenieita rHAO vakcíny v této studii byly bezpečné a velmi tolerantní. Nezdálo se, že by byla frekvence nežádoucích reakcí ovlivněna změnou dávky rHAO antigenu v rozmezí od 10 do 90 pg, ale přidáním kamence se může mírně zvýšit. Lokalizovaný crytém, citlivosti a bolestivost v místě injekce byly častěji zaznamenány u jedinců, kterým se aplikovala schválená subvironová vakcína, než n jedinců kterým se aplikovalo 15 nebo 90 pg rHAO ve fyziologickém roztoku. S výjimkou jediné osoby, která pociťovala po imunizaci schválenou vakcínou v paži středně silnou bolest, citlivost a ztuhlost, byly všechny příznaky hodnoceny jako příznaky mírné povahy, které zpravidla trvaly 1 až 2 dny. Lokalizovaný erytém a/nebo zatvrdnutí, pokud se objevilo, bylo podstatně menší než čtvrtdolar.
Imunogenicita
Základní titry sérové HAI protilátky proti chřipkovému viru A/Bcijing/32/92 (II3N2) dosahovaly
3(i maximálně l:8 u 64 (50%) ze 127 zúčastněných subjektů. Většina subjektů v každé ze čtyř vakcinovaných skupin poskytla HA-specifickou sérologickou odpověď, měřeno pomocí HAI atestu ELISA (tabulka 4). Postvakcinační titry sérové HAI protilátky dosahovaly u všech osob. kterým byla podána vakcína maximálně 1:32 s výjimkou dvou osob, kterým bylo podáno 15 pg rHAO a jedné osoby, která byla podána již schválená vakcína. Vakcinacc byla jinak u většiny odborníků ts spojena s produkcí neutralizační protilátky. Průměrné zvýšení titrů protilátky a hodnoty sérekonverze po imunizaci 15 pg rHAO bylo poněkud nižší než v případě imunizace již schválenou vakcínou, nicméně tyto rozdíly neměly statistický význam. Proti látková odezva na rHAO sc přidáním kamence nezvýšila. Subjekty imunizované 90 pg rHAO dosáhly po vakcinaci průměrného titru ΗΛ1 a ELISA IgG protilátky, který byl dvakrát až pětkrát vyšší než v případě zbývajících
4d tří vakcinačních skupin (rozdíly zjištěné při porovnávání titrů sérového HAI byly statisticky významné).
Ochranná účinnost )5 V průběhu sledované periody, zaznamenalo celkem 28 subjektů chorobu podobnou chřipce. Čtyřem z těchto jedinců (z nichž třem bylo aplikováno placebo a jednomu, který byl imunizován 15 pg rHAO) byl z nosohltanových kultur izolován chřipkový virus typu A (H3N2). Podstatné zvýšení titru HAI protilátky proti chřipkovému viru A/Bcij ing/32/92 (H3N2) mezi předsezónním a postsezonním vzorkem séra bylo rovněž zjištěno vc třech zc čtyřech případech, kdy byl v kultu50 ře potvrzen virus, ale u žádného dalšího jedince, který zaznamenal chorobu. Jediní rHAO příjemce, u kterého se následně vyvinula laboratorně potvrzená chřipková choroba, měl pozitivní kulturu získanou 31 dní po imunizaci a sérokonvertoval se z prcvakcinačního HAI titru. který byl menší než 1:4, na postvakcinační (předsezónní) titr. který· dosahoval 1:32. Dvě další osoby, kterým se podávalo placebo, a jeden dobrovolník imunizovaný již schválenou vakcínou měl sérolo-28CZ 299862 Bó gickv důkaz inflkace chřipkovým virem A (H3N2) v průběhu epidemického období při absenci klinické nemoci, Při srovnání všech vakcinovaných subjektů (nebolí všech subjektů, kteří přijeli libovolnou rHAO vakcínu) se zjistilo, že u jedinců, kterým bylo aplikováno pouze placebo. bylo zaznamenáno podstatně vyšší procento jedinců, kteří prodělali laboratorně potvrzenou chřipku typu A (H2N2) (p<0.05), nebo kteří byly infikováni jejím virem (p<0,005).
Výše uvedené výsledky naznačují, že chřipkové vakcíny obsahující purifikovaný rHAO antigen, připravené způsobem popsaným ve výše uvedené patentové přihlášce, jsou tolerantní a schopné vyvolávat ochranné imunitní odezvy u lidských subjektů. I při dávce 90 pg nebyl rHAO, hodnocený v této studii, reaktogeničtější než placebo na bázi fyziologického roztoku a způsoboval podstatně méně místních nežádoucích reakcí než již schválená a patentovaná troj valenční subvirionová vakcína obsahující poloviční množství (tj. 45 pg) celkového HA antigenu.
Odezvy neutralizačních HA-speciflckých protilátek na 15 pg rHAO přípravku byly srovnatelné s odezvami vyvolanými subvirionovou vakeínou a podstatně se zvýšily zvýšením dávky rHAO na 90 pg.
Celková četnost inflkace a nemoci, způsobená přirozenou expozicí cirkulujícímu epidemickému chřipkového kmenu Λ (H3N2), byla podstatně nižší u vakcinovaných subjektů než u jedinců, kterém sc podalo placebo. Z těchto výsledků vyplývá, že ochranná imunita poskytnutá rHAO. zejména pokud je podán ve vyšších dávkách, je srovnatelná nebo vyšší než ochranná imunita, získaná aplikací v současnosti dostupných vakcín.
- 29 C/. 299862 Bó
H (ti
X
CO a
rJ
Φ w
rt p
'Φ co
O íp ío
- .o
X c 12 1 ω >t< + 1 P ? rt c
í<£
Pí
O
P a
•P
U li
P
Ή □
Pí (ti >
a
W
O a
□ o
ts'
CP >7
P a
•H a
> £ P ,H >0 c £ >υ °? ra Ρ P íi -P U o a PC rt rt >
Pí
P
O rJ >
>
(—1 •P
Ή
Ό 'rt a
π
Pí /j ω
Ό
C >u rt
C
P υ
Pí rt >
rt, a cr
Cí
P c
-P a
CP rt ω
u
P >
rt
V) >1
Pí
4-’ 'rt a
P a
o
P a
a p
P
-P
H „ť.
ri *r~| mP c
>u rt rt
P a
rt
H
Di rt £
Φ
Λ
P u
rt
N
-P £
-P
rt σι
P >rt· E £
•rt rt
P P
a —I
P N CJ P a £
£ •P
ρ
D o
>
o
P a
rt a
g *rt rt >
o
P
0] a-«
Pí > u c p Ό a '> w a a 4-1 p rt >p a a vi rt >U rt
C •H υ
Pí ra >
i* to o
a rt
P >rt £
•rt p
a rt ílu pomocí Dunnettova testu pro vícečetná srovnání c -P a ό rt p pí o CO P i/ tyyooí uo
Příklad 11
Způsob výroby zlepšeného HAO klonujícího vektoru
Bvl navržen vylepšený klonovací vektor pro expresi zralého HA, ve kterém se gen kódující HA lokalizoval bezprostředně za sekvencí kódující chitinázový signální peptid.
Vytvořil se lineární pMGS27 s jednořetězcovými konci ίο V pMGSI2 plazmidu se HA nakloňoval do Smál nebo Kpn\ místa bezprostředně za chitinázovým signálním peptidem. Nukleokyselinová a aminokyselinová sekvence jsou znázorněny jako SbQ ID NO:22, resp. SEQ ID NO:23:
5' -chitinázový signální peptid Sňal Apnl TGG TTG GTC GCC GTT TCT AAC GCG ATT CCC GGG GGT ACC
TRP LEU VAL ALA VAL SER ASN ALA ILE PRO GLY GLY THR
Tento úsek se změnil pomocí oligo řízené mutageneze za vzniku pMGS27 (změněné báze jsou podtržené) (SEQ ID NO: 24):
5' TGG TTA GTC GCC GTG TCCTGCAGGCCAGAGAGGCCTT GGT kCC
PS ti
Plazmid pMGS27 se linearizoval Pst! sestřihem (znázorněné zbytky 6 až 35 SEQ ID NO. 24):
A GTC GCC GTG TCC TGCA 5' GGCCAGAGAGGCC T
T CAG CGG CAC AGG 5' ACGTCCGGTCTCTCCGG A načež se lineárním pMGS27 ošetřil T4 DNA polymerázou plus dATP za vzniku výše uvedených 20 jed no řetězcových konců (zbytky 23 až 36 a doplněk zbytků 6 až 18 SEQ ID NO. 24):
A 5' GGCCAGAGAGGCC T
T CAG CGG CAC AGG 5' A
Cílový HA gen se nakloňoval do pMGS27
Krok 1 Syntetizovaly se PCR primery
Původní oligo (SEQ ID NO:25):
5' GTC GCC GTG TCC AAC GCG (5f konec 20 bází zralého HA)
Reverzní oligo (doplněk SEQ ID NO:26):
(3' konec 20 bází zralého HA) ΑΤΓΤ AA CCGGTCTCTCCGG 5'
-31 CZ 299862 B6
PCR HA genu
PCR cílového HA genu se dvěma oligonukleotidy sc použil pro získání (SEQ ID NO; 25) a SEQ ID NO:26):
5' GTC GCC GTG TCC AAC GCG (zralý HA)
CAG CGG CAC AGG TTG CGC (zralý HA)
TAA TTGGCCAGAGAGGCC 3'
ATT AACCGGTCTCTCCGG
Tepelná hybrid izaee cílového HA genu do pMHGS27 a transformace E. co/i
Lineární pMGS27 a T4 DNA polymerázou ošetřený PCR fragment HA genu sc smísily. Dvě molekuly vzájemně tepelné hybridizovaly za vzniku kruhového plazmidu, který je připraven pro io použití při transformování E. coli. Diagram zahrnuje SEQ ID NO. 25 a 26, zbytky 23 až 36 a 6 až
SEQ ID NO. 24
SEQ ID NO: 24.
GTCGCCGTGTCCAACGCG (zralý HA) TAATT
TTGCGC (zralý HA) ATTAACCGGTCTCTCCGG
A
TCAGCGGCACAGG
GGCCAGAGAGGCCT
A chitinázový signální peptid GTCGCCGTGTCCAACGCG (zralý HA konce
TAAT TGGCCAG.AGAGGCCT
Zvýše uvedeného vyplývá, žc mezi signálním peptidem a zralým HA neexistuje žádná další aminokyselina.
Příklad 12
Příprava a účinnost trojvaleněních chřipkových vakcín typu A a B 1995-1996
Chřipková vakcína, purifíkovány rekombinantní hcmaglutinin. trojvalenění chřipková vakcína typu Λ a B A/Tcxas/36/92/1 (H1N1), A/Johanesburg/33/94 (1I3N2) a B/Harbin/7/94) je neinfekění podjednolka odvozená z purifikovaných rekombinantních chřipkových hemaglutininových antigenů (HA). HA geny se klonovaly z výše popsaných kmenu chřipkových viru A a B, doporučených institucí pro kontrolu léčiv a k identifikaci jednotlivých klonovaných genů se použila .to DNA sekvenční analýza. Baculovirové expresní vektory obsahující klonované ΠΑ geny z chřipkových virových kmenů A/Texas/36/91 (Η IN1), A/Johanesburg/33/94 (113N2). B/I larbin/7/94 se použily pro výrobu rekombinantních HA antigenů v kultivovaných hmyzích buňkách. Rekombi nantní HA proteiny jsou celodélkové, ncštčpené hemaglutininy (rHAO) s molekulovou hmotností přibližně 69 00. rHAO se produkují v buněčně linii Spodoplery frugiperdy (řád motýlů) uchovávané v sérn prostém kultivačním médiu. Třívalenční vakcíny jsou tvořeny purifikovaným (s více než 95% čistotou, pravděpodobněji s 99% čistotou) rHAO ze dvou chřipkových A kmenů a jed5 noho B kmene, smíchanými ve stejném poměru. Vakcína, která se podává pro klinické použití, je tvořena purifikovanými typy A B rHAO proteinů ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku bez konzervačních látek.
Studie, testující jednovalenční. dvouvalenční a troj valenční rHAO vakcíny na zvířatech, měly io ukázat, že jsou v podstatě netoxické ve vakcíně nebyla zjištěna žádná toxická látka. Studie obecné bezpečnosti a ímunogenicity A/Beijing/32/92 a A/Ίexas/36/91 rHAO se prováděly na myších a morčatech. Při těchto studiích nebyly zaznamenány žádné nežádoucí reakce. U myší jediná imunizace 15 tnikrogramy rHAO antigenu bez adjuvansu vyvolala během dvou až tří týdnů vytvoření vysoké hladiny anti HA IgG protilátek, hemaglutininově inhibičních (HA1) protilátek a neutralizačních protilátek.
V jedné studii se skupiny deseti myší imunizovaly 15 pg puntíkovaného rHAO A/Beijing/32/92 (H3N2) vyrobeného v buňkách přizpůsobených médiu obsahujícímu 10% fetální bovinní sérum nebo rHAO, vyrobeným v hmyzích buňkách přizpůsobených médiu obsahujících 10% fetální
2« bovinní sérum nebo rHAO vyrobeném v hmyzích buňkách přizpůsobených séra prostému médiu (rHAO SF). Dva a tři týdny po infikaci se myším odebrala krev a připravily se vzorky séra, U každého séra se stanovoval obsah anti-HA IgG a HAI protilátek. Jak rHAO, tak rHAO-SF antigeny poskytují podobné titry anti-HA a HAI protilátek. Dva týdny po imunizaci měla většina myší značné titry HAI protilátek a do tří týdnů osm z deseti myší v každé skupině mělo HAI titry
32 nebo vyšší. Tyto a další biochemické a imunologické studie ukázaly, že rHAO produkovaný v séru prosté hmyzí buněčné kultuře, je nerozlišitelný od rHAO vyrobeného ze sérum obsahujících fermentačních podmínek.
Cílem další studie bylo porovnat 1994-1995 formulaci trojvalenění rHAO chřipkové vakcíny s již
3(i schválenou vakeínou Fluvirin povrchového antigenu puntíkovaného viru (ředěná chřipková virová vakcína obsahující 15 pg) rHAO nebo virového HA na 0.5 ml z A/Texas/36/01 (H1N1), A/Shangdong/9/93 (H3N2) a b/Panama/45/90 chřipkových kmenů.
Tabulka 5
Srovnání troj va lenění rHAO vakcíny s Huvirinem
3vlT (n~10 myši) Virový kmen použitý jako antigen Trojvalenční rHAO Fluvirin CHřipkováj vakcina Q4T (n=10 myší) | anti-HA IgG anti-KA IgG j
Týden 0 Týden 3 Týden 0 --- Týden 3
A/Iczas/36/9: (H1N1) <1000 103.000 <1000 11.200
A/Shangdcng/32/92 (H3N2) <1000 162.400 <1000 41.000
B/Panama/45/9C <1000 164.300 <1000 26,000
Virový kmen použitý jako antigen HAI HAI
A/Texas/36/91 (HANÍ) <8 1,522 <3 1.088
A/ Shar.gdong/ 3 2/92 (H3N2) <8 494 <8 435
B/Panama/45/90 <8 174 <3 42
Virový kmen použitý jako antigen Neutralizační Ab Neutralizační Ab
A/Texas/36/91 (H1N1) <100 5.800 <100 2,720
A/Shangdong/32/92 1(H3N2) <100 840 <100 360
B/Panams/45/90 <100 1.300 <100 700
Konečně je třeba uvést, že výše popsané způsoby a kompozice mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačné vymezen přiloženými patentovými nároky.
-34CZ 299862 B6
SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) údaje k SE ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 12 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina ui (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ÍDNO: 1:
AGCAAAAGCA GG 12 (1) údaje k SE ID NO:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE;
3o (A) DÉLKA: 39 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
GGGGGTACCC CCGGGAGCAA AAGCAGGGGA AAATAAAAA 3 9
- 35 V Z 299862 B6 (1) údaje k SE ID N0:3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA; 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineami io (ii) DRUH MOLEKULY; DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:
CCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG 35 (!) údaje k SE ID NO:4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 bazických párů 20 (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY; DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:
GGGGGTACCC CCGGGGACAC AATATGTATA GGCTACCAT 39 (1) údaje k SE ID NO:5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:
CCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG 35
-36CZ 299862 B6 (1) údaje k SE ID N0:6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉEKA: 1793 bazických páru (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne 15 (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Bcjing/32/92 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: I AŽ 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinové signální sekvence (B) POZICE: 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍC: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 73 až 11728 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Kpnl restrikční místa (B) POZICE: 1771 až 1777 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Bglll restrikční m síta (B) POZICE: 1776 až 1782 15 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE: 1783 až 1793
-37CZ 299862 Bó (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGACTTTCCA GGAAATGACA ACAGGACAGC AACGCTGTGC 120
CTGSGACATC ATGCAGTGCC AAACGGAACG CTAGTGAAAA CAATCACGAA TGATCAAATT 180
GAAG7GAC7A ATGGTAGTGA GCTGGTTCAG AGTTCCTCAA CAGGTAGAAT ATGCGACAGT 240
CCTGACCGAA TCCTTGATGG AAAAAACTGC ACACTGATAG ATGCTCTATT GGGAGACCCT 300
CATTGTGA7C- GCTTCCAAAA TAAGGAATGG GACCTTTTTG TTGAACGCAG CAAAGCTTAC 360
AGCAACTGTT ACCCTTATGA tgtaccggat TATGCCTCCC TTAGGTCACT AGTTGCCTCA 420
TCAGGGACCC TGGAGTTTAT CAATGAAGAC TTCAATTGGA CTGGAGTCGC TCAGGATGGG 480
GGAAGCTATG CTTGCAAAAG GGGATCTGTT AACAGTTTCT TTAGTAGATT GAATTGGTTG 540
CACAAATCAG AATACAAATA TCCAGCGCTG AACG7GACTA TGCCAAACAA TGGCAAATTT 600
GACAAATTGT ACATTTGGGG GGTTCACCAC CCGAGCACGG ACAGAGACCA AACCAGCCTA 66C
TATGTTCGAG CATCAGGGAG AGTCACAGTC TCTACCAAAA GAAGCCAACA AACTGTAACC 720
CCGAATATCG CGTCTAGACC CTGGGTAAGG GGTCAGTCCA GTAGAATAAG CATC7A7TGG 780
ACAATAGTAA AACCGGGAGA CATACTTTTG ATTAATAGCA CAGGGAATCT AA77GC7CCT 840
CGGGGTTACT TCAAAATACG AAATGGGAAA AGCTCAATAA TGAGGTCAGA TGCACCCA77 900
GGCACCTGCA GTTCTGAATG CATCACTCCA aatggaagca TTCCCAATGA CAAACCTTTT 960
CAAAATGTAA ACAGGATCAC ATATGGGGCC TGCCCCAGAT ATGTTAAGCA AAACACTCTG 1020
AAATTGGCAA CAGGGATGCG GAATGTACCA GAGAAACAAA CTAGAGGCAT A7TCGGCGCA 10B0
ATCGCAGGTT TCATAGAAAA TGGTTGGGAG GGAATGGTAG ACGGTTGGTA CGGTTTCAGG 1140
CATCAAAATT CTGAGGGCAC AGGACAAGCA GCAGATCTTA AAAGCACTCA AGCAGCAATC 1200
GACCAAATCA ACGGGAAACT GAATAGGTTA ATCGAGAAAA CGAACGAGAA ATTCCATCAA 1260
atcgaaaaag AATTCTCAGA AGTAGAAGGG AGAATTCAGG ACCTCGAGAA ATATGTTGAA 1320
GACACTAAAA tagatctctg GTC7TACAAC 1 GCGGAGCTTC TTGTTGCCCT GGAGAACCAA 1380
CATACAATTG ATCTAACTGA CTCAGAAATG . AAGAAACTGT TTGAAAAAAC AAGGAAGGAA 1440
CTGAGGGAAA ATGCTGAGGA CATGGGCAAT GGTTGCTTCA AAATATACCA CAAATGTGAC 1500
AATGCCTGCA TAGGGTCAAT CAGAAATGGA ACTTATGACC ATGATGTATA CAGAGACGAA 1560
gcattaaaca ACCGGTTCCA GATCAAAGGT GTTGAGC7GA AGTCAGGATA CAAAGA7TGG 1620
ATCCTATGGA TTTCCTTTGC CATATCATGC TTTTTGCTTT GTGTTGTTTT GCTGGGGTTC 1680
ATCATGTGGG cctgccaaaa AGGCAACATT aggtggaaca TTTGCATTTG AGTGTAT7AA 1740
TTAAAAACAC CCTTGTTTCT AGGATGATTC GGTACCAGAT CTTAATTAAT TAA 1793
-38CZ 299862 Bó (1) údaje k SE ID N0:7;
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE;
(A) DÉLKA. 570 aminokyselin (B) TYP; nukleová kyselina (C) DRUH ŘETÉZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU; fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
2o (A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT; Λ/Bej ing/32/92 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY ao (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 19 až 552 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:
Val Ala Leu Glu Asn Gin His Thr Ile Asp Le-u 455 Thr 450 Asp Ser Glu Met
450
Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Lys Gin Leu Arg Glu Asn Ala. Glu
465 470 475 480
Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala
485 490 495
Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg
500 505 510
Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gin Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys
515 520 525
Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser cys
530 535 540
Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gin
545 550 555 560
Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
-39CZ 299802 B6
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
1 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Asp Phe Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr
35 40 45
Ile Thr Asn Asp Gin Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gin
50 55 60
Ser Ser Ser Thr Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Arg Ile Leu Asp
es 70 75 80
Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys
85 90 95
AS? Gly Phe Gin Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys
100 105 110
Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu
115 120 125
Are Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu Asp
130 135 140
Phe Asn Trp Thr Gly Val Ala Gin Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Cys Lys
145 150 155 160
Arg Gly Ser Val Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His Lys
165 170 175
Ser Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Mat Pro Asn Asn Gly
180 185 190
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro £er Thr Asp
195 200 205
Arg Asp Gin Thr Ser Leu Tyr Val Arg Ala Ser Gly Arg Val Thr Val
210 215 220
Ser Thr Lys Arg Ser Gin Gin Thr Val Thr Pro Asn Ile Gly Ser Arg
225 230 235 240
Pro Trp Val Arg Gly Gin Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile
245 250 255
Val lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Tle Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile
260 265 270
Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Ser Ile Met
275 2B0 285
Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Thr Cys Ser Ser Glu Cys Ile Thr Pro
290 295 300
Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gin Asn Val Asn Arg Ile
305 310 315 320
Thr Tyr Gly Ala Cvs Pro Arg Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu
325 330 335
Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gin Thr Arg Glv Ile Phe
340 345 350
Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp
355 3S0 365
Gly Trn Tyr Gly Phe Arg His Gin Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gin Ala
370 375 3B0
Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gin Ala Ala Ile Aso Gin Ile Asn Gly Lys
385 390 395 400
Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gin Ile Glu
4 05 410 415
Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gin Asp Leu Glu Lys Tyr
420 425 430
Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu
435 440 445
(1) údaje k SE ID NO:8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1766 bazických párii (Β) TYP: nukleová kyselina
-40cz B6 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne io (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Tcxas/36/91 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: 1 AŽ 18
2() (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 6] K proteinové signálního peptidu (B) POZICE: 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Kpnl restrikční místa (B) POZICE: 82 až 87 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 88 až 93 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ; kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 73 až 1734* (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Kpnl restrikční místa (B) POZICE: 1744 až 1749 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE: 1750 až 1755
-41 CZ 299802 B6 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KEÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE: 1756 až 1766 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:
TAAAAAAACC ΤΑΤΑΑΑΤΑΑΪ GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGT77TGTG GTTGGTCGCC 60
GT7TCTAACG CGATTCCCGG GGGTACCCCC ggggacacaa TATGTATAGG CTACCATGCG 120
AACAAC7CAA CCGACACTG7 TGACACAG7A CTTGAGAAGA ACGTGACAG7 GACACACTCT 180
GTCAACC7AC T7GAGGACAG TCACAACGGA aaactatgtc GACTAAAGGG AA7AGCCCCA 240
CTACAATTGG GTAATTGCAG CGTTGCCGGA TGGATCTTAG GAAACCCAAA ATGCGAATCA 300
CTG77T7CTA AGGAATCATG GTCCTACATT gcagaaacac CAAACCCTGA GAATGGAACA 360
TGT7ACGCAG GGTATTTCGC CGACTATGAG GAACTGAGGG AGCAATTGAG TTCAGTATCA 420
TCA7TCGAGA GATTCGAAAT attccccaaa GAAAGCTCAT GGCCCAACCA CACCGTAACC 480
AAAGGAGTAA CGAGATCATG CTCCCATAAT GGGAAAAGCA GTTT7TACAG 7AATTTGCTA 540
TGGCTGACGG AGAAGAATGG CTTGTACCCA aatctgagca AGTCCTATGT AAACAACAAA 600
gagaaagaag TCCTTGTACT ATGGGGTGTT CATCACCCGT CTAACATAAG ggaccaaagg 660
GCCATCTATC ATACAGAAAA TGCTTATGTC TCTGTAGTGT CTTCACATTA TAGCAGAAGA 720
TTCACCCCAG AAATAGCAAA AAGACCCAAA GTAAGAGATC AAGAAGGAAG AATTAACTAC 780
TACTGGACTC TGCTGGAACC CGGGGACACA ATAATATTTG AGGCAAATGG AAATCTAATA 840
GCGCCATGGT ATGCTTTCGC ACTGAGTAGA GGCTTTGGGT CAGGAATCAT CACCTCAAAC 900
GCATCAATGG ATGAATGTGA CGCGAAGTGT CAAACACCCC AGGGAGCTAT AAACAGTAGT 960
CTTCCTTTCC AGAATGTACA CCCAGTCACA ATAGGAGAGT GTCCAAAGTA TGTGAGGAGT 1020
ACAAAATTAA GGATGGTTAC AGGAC7AAGG AACATCCCAT CCATTCAATC CAGAGGT7TG 1080
TTTGGAGCCA TTGCCGGTTT CATTGAAGGG GGGTGGACTG GAATGATAGA TGGATGGTAT 1140
ggttatcatc ATCAGAATGA ACAAGGATCT GGCTATGCTG CGGACCAAAA AAGCACACAA 1200
AATGCCATTA ACGGGATTAC AAACAAGGTG AATTCTGTAA TCGAGAAAAT GAACACTCAA 1260
TTCACAGCTG TGGGCAAAGA ATTCAACAAA TTAGAAAGAA GGATGGAAAA C7TAAATAAA 1320
AAAGTTGATG ATGGATTTCT GGACATTTGG ACATATAATG CAGAATTGTT GGTTCTACTG 1380
GAAAATGGAA GGACTTTGGA TTTTCATGAC TCAAATGTGA AGAATCTGTA TGAGAAAGTA 1440
AAAAGCCAAT TGAAGAATAA TGCCAAAGAA ATAGGGAACG GGTGTTTTGA ATTCTATCAC 1500
AAGTGTAACA ATGAATGCAT GGAAAGTGTG AAAAATGGAA CTTATGACTA TCCAAAATAT 1560
TCCGAAGAAT CAAAGTTAAA CAGGGGAAAA ATTGATGGAG TGAAATTGGA ATCAATGGGA 1620
GTCTATCAGA TTCTGGCGAT CTACTCAACT GTCGCCAGTT CACTGGTGCT TTTGGTCTCC 1680
CTGGGGGCAA TCAGCTÍCTG GATGTGTTCT AATGGGTCTT TGCAGTGCAG AATATGAATC 1740
TGAGGTACCA GATCTTAATT AATTAA 1766
-42CZ 299862 R6 (1) údaje kSF. ID N0:9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 572 aminokyselin (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ; ne 15 (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N -konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
2o (A) ORGANISMUS; chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ 1ZOLÁT: A/Texas/36/91 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KEÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY
3f) (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 19 až 554 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Ann val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
1 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr Pro Gly Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr
20 25 30
His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn
35 40 45
Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly
50 55 60
Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile Ala Pro Leu Gin Leu Gly Asn Cys
65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn Pro Lys Cys Glu Ser Leu Phe
85 90 95
Ser Lys GlU Ser Trp Ser Tyr Ile Ala Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn
100 105 110
Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu
115 120 125
Gin Leu ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys
130 135 140
Glu £er Ser Trp Pro Asn His Thr Val Thr Lys Gly Val Thr Arg Ser
145 150 155 160
-43 CZ 299862 B6
Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu
165 170 175
Thr Glu Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn
180 165 190
Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu val Leu Trp Gly Val His His Pro Ser
195 200 205
Asn Tle Arg Asp Gin Arg Ala Ile Tyr His Thr Glu Asn Ala Tyr Val
210 215 220
Ser Val Val Ser Ser His Tyr £er Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala
225 230 235 240
Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gin Glu Gly Arg lle Asn Tyr Tyr Trp
245 250 255
Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn
260 253 270
Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser
275 260 285
Gly Ile lle Thr Ser Asn Ala Ser Met Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys
290 295 3Q 0
Gin Thr Pro Gin Gly Ala Ile Asn Ser Ser Leu Pro Phe Gin Asn Val
305 310 315 320
His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys
325 330 335
Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gin Ser Arg
340 345 350
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu C-ly Gly Trp Thr Gly
355 360 365
Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gin Asn Glu Gin Gly Ser
370 375 380
Gly Tyr Ala Ála Asp Gin Lys Ser Thr Gin Asn Ala Ile Asn Gly Ile
3B5 390 395 400
Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr
405 410 415
Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu
420 425 430
Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala
435 440 445
Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gly Arg Thr Leu Asp Phe His Asp
450 455 460
Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gin Leu Lys Asn
465 470 475 480
Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys cys
485 490 495
Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro
500 505 510
Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Gly Lys Ile Asp Gly Val
515 520 525
Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gin Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr
530 535 540
Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe
545 550 555 560
Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gin Cys Arg Ile
5S5 570 (1) údaje k SE ID NO: 10:
(i) CHARAKTERIS TIKÁ SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1799 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne 15 (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOEÁT: A/Panama/45/90 rí IA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍC: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: I až 18 25 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61 K proteinové peptidové sekvence (B) POZICE: 19 až 69 50 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Sinal restrikční místa (B) POZICE: 22 až 27 35 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 70 až 1773' (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE: 1777 až 1782 15 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Bgltl restrikční místa (B) POZICE: 1783 až 1788 50 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍC: univerzální translační lenninační signál (B) POZICE: 1789 až 1799 .45CZ 299862 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCGGGAAG GCAATAATTG TAC7AC7CAT GGTAGTAACA 60
TCCAACGCAG ATCGAATCTG CACTGGGATA ACATCTTCAA ACTCACCTCA TGTGGTCAAA 120
ACAGC7ACTC AAGGGGAAGT CAATGTGACT GG7G7GATAC CACTGACAAC AACACCAACA 180
AAATCTCAT7 TTGCAAATCT AAAAG3AACA AAGACCAGAG GGAAAC7ATG CCCAAACTGT 240
CTCAACTGCA CAGA7CTGGA TGTGGCCTTG GGCAGACCAA TGTGTGTGGG GACCACACCT 300
TCGGCAAAAG CTTCAATACT CCACGAAGTC AGACCTGTTA CATCCGGGTG CTTTCCTATA 360
ATGCACGACA GAACAAAAAT CAGACAGCTA CCCAATCTTC TCAGAGGATA TGAAAATATC 420
AGATTATCAA CCCAAAACGT TATCAACGCA GAAAGAGCAC CAGGAGGACC CTACAGAC1T 4B0
GGAACCTCAG GATCTTGCCC TAACGTTACC AGTAGAGACG GATTCTTCGC AACAATGGCT 540
TGGGCTGTCC CAÁGGGACAA CAAAACAGCA ACGAATCCAC TAACAG7AGA AGTACCÁTAC 600
ATTTGTACCA AAGGAGAAGA CCAAATTACT GTTTGGGGGT TCCATTCTGA TAACAAAATC 660
CAAATGAAAA ACCTCTATGG AGACTCAAAT CCTCAAAAGT TCACCTCATC TGCCAATGGA 720
GTAACCACAC ATTATGTTTC TCAGATTGGT GGCTTCCCAA ATCAAACAGA AGACGGAGGG 780
CTACCACAAA GCGGCAGAAT TGTTGTTGAT TACATGGTGC AAAAACCTGG GAAAACAGGA 840
ACAATTGTCT ATCAAAGAGG TGTTTTGTTG CCTCAAAAGG TGTGGTGCGC AAGTGGCAGG 900
AGCAAGGTAA TAAAAGGGTC CTTGCCTT7A ATTGGTGAAG CAGATTGCCT TCACGAAAAA 960
TACGGTGGAT TAAACAAAAG CAAGCCTTAC TACACAGGAG AACATGCAAA AGCCATAGGA 1020
AATTGCCCAA TATGGGTGAA aacacctttg aagcttgcca atggaaccaa atatagacct 1080
CCTGCAAAAC TATTAAAGGA AAGGGGTTTC TTCGGAGCTA TTGCTGGTTT CTTAGAAGGA 1140
GGATGGGAAG GAATGATTGC AGGTTGGCAC GCATACACAT CTCATGGAGC ACATGGAGTG 1200
GCAGTGGCAG CAGACCTTAA GAGTACGCAA GAAGCCATAA ACAAGATAAC AAAAAATCTC 1260
AATTCTTTGA GTGAGCTAGA AGTAAAGAAT CTTCAAAGAC TAAGTGGTGC CATGGATGAA 1320
CTCCACAACG AAATACTCGA GCTGGATGAG AAAGTGGATG ATCTCAGAGC TGACACAATA 1380
AGCTCGGAAA TAGAGCTTGC AGTCTTGCTT TCCAACGAAG GAATAATAAA CAGTGAAGAT 1440
GAGCATCTAT TGGCACTTGA GAGAAAACTA AAGAAAATGC TGGGTCCCTC TGCTGTAGAC 1500
A7AGGGAA7G GATGCTTCGA AACCAAACAC AAGTGCAACC AGACCTGCTT AGACAGGATA 1560
GCTGCTGGCA CCTT7AATGC AGGAGAATTT TCTCTTCCCA CTTTTGATTC ACTGAATATT 1620
ACTGCTGCAT C777AAA7GA TGATGGATTG GATAATCATA CTATACTGCT CTACTACTCA 1680
ACTGCTGCTT CTAGTTTGGC TGTAACATTG ATGATAGCTA 77T77AT7G7 TTATATGGTC 1740
TCCAGAGACA ATGTTTCTTG 77CCATCTG7 CTGTGAGGTA CCAGATCTTA ΑΤΤΑΆ7ΤΑΑ 1799
-46CZ 299862 Bó (1) údaje k SE IDNO:11;
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 585 aminokyselin (Β) TYP; nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne 15 (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ;
2o (A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Panama/45/90 rHA (ix) ZNAKY
2? (A) NÁZEV/KFÍČ: 1 IA signální peptid (B) POZICE: I až 17 (ix) ZNAKY so (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 18 až 568 (xi) POPIS SEKVENCE; SEQ IDNO:11:
Met. Pro I Gly Lys Ala Ile Ile Val· Leu 5 Leu 10 Ser Met Val Val Thr Ser Asn 15
Ser Asn Ser
Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Pro 30 His Val
20 25
Val Lys Thr Ala Thr Gin Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro
35 40 45
Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr
50 55 60
Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu
65 70 75 80
Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala
05 90 95
Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe
100 105 110
Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gin Leu Pro Asn Leu Leu
115 120 125
Arg Gly Tyr Glu Asn Xle Arg Leu Ser Thr Gin Asn Val Ile Asn Ala
130 135 140
Glu Arg Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys
145 150 155 160
-47CZ 299862 Bó
Pro Asn Val Thr Ser Arg Asp Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala
165 170 175
Val Pro Arg Asp Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val
180 185 190
Pro Tyr Ile Cys Thr Lys Gly Glu Asp Glr. Ile Thr Val Trp Gly Phe
195 200 205
His Ser Asp Asn Lys Ile Gin Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn
210 215 220
Pro Gin Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val
225 230 235 240
Ser Gin Ile Gly Gly Phe Pro Asn Gin Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro
245 250 255
Glr. Ser Gly Arg Ile Val val Asp Tyr Met Val Gin Lys Pro Gly Lys
260 265 270
Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gin Arg Gly Val Leu Leu Pro Gin Lys Val
275 280 285
Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu
290 295 3 ob
Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys lyr Gly Gly Leu Asn Lys
205 310 315 320
Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys
325 330 335
Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr
340 345 350
Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile
355 360 365
Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His
370 375 380
Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu
3B5 390 395 400
Lys Ser Thr Gin Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser
405 410 415
Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gin Arg Leu Ser Gly Ala Met
420 425 430
Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp
43 5 440 445
Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gin Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu
450 455 460
Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu
465 470 475 480
Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Asp Ile Gly
485 490 495
Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gin Thr Cys Leu Asp
500 505 510
Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr
515 520 525
Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu
530 535 540
Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu
545 550 555 560
Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser Arg
565 570 575
Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580 5B5
-48CZ 299862 B6 (1) údaje k SE ID NO: 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1811 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne 15 (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Nctherlands/13/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: I až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinové peptidové sekvence (B) POZICE: 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zrale rHA (B) POZICE: 73 až 1785’ (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Kpnl restrikční místa (B) POZICE: 1789 až 1794 45 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BgW restrikční místa (B) POZICE: 1795 až 1800 (IX) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační termín ač ní signál (B) POZICE: 1801 až 1811
-49CZ. 299862 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:
TAAAAAAAGC TATAAATAA? GCCCTTGTAC AAATTGTTAA AGGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAAGG CGATTCCCGG GGATCGAATC TGCACTGGGA TAACATCTTC AAAATCACCT 120
CATGTAGTCA AAACAGCTAC TCAAGGGGAG GTCAKTGTGA CTGGTGTGAT ACCACTGACG 1B0
ACAACACCAA CAAAATCTCA TTTTGCAAAT CTCAAAGGAA CAAAGACCAG AGGGAAACTA 240
TGCCCAAAGT GTCTCAACTG CACAGATCTG GATGTGGCCT TGGGCAGACC AATGTGTGTG 300
GGGATCACAC CTTCGGCAAA AGCTTCAATA CTCCACGAAG TCAGACCTGT TACATCCGGG 360
TGCTTTCCTA TAATGCATGA CAGAACAAAA ATCAGACAGC TACCCAATCT TCTCAGAGGA 420
TATGAAAACA TCAGACTATC AACCCAAAAC GTTATCAACG CAGAAAAGGC ACCAGGAGGA 480
CCCTACAGAC TTGGAACCTC AGGATCTTGC cctaacgtta CCAGTAGAAC CGGATTCTTC 540
GCAACAATGG CTTGGGCTGT CCCAAGGGAC AACAAAACAC- CAACGAATCC ACTAACAGTA 600
GAAGTACCAT ACATTTGTAC GAAAGGAGAA GACGAAATTA CTGTTTGGGG GTTCCATTCT 660
GATAAGAAAA CCCAAATGAA AAACCTCTAT GGAGACTCAA ATCCTCAAAA gttcacctca 720
TCTGGCAATG GAGTAACCAC ACATTATGTT TCTCAGATTG GTGGCCTCCC AGATCAAACA 780
GAAGACGGAG GACTACGACA AAGCGGCAGA ATTGTTGTTG ATTACATGGT GCAAAAACCT 840
GGGAAAACAG GAACAATTGT CTATCAAAGA GGTATTTTGT TGCCTCAAAA GGTGTGGTGC 900
GCAAGTGGCA GGAGCAAGGT AATAAAAGGG TCCTTGCCTT TAATTGGTGA AGCAGATTGC 960
CTTCACGAAA AATACGGTGG ATTAAACAAA AGCAAGCCTT ACTACACAGG AGAACATGCA 1020
AAAGCCATAG GAAATTGCCC AATATGGGTG AAAACACCTT TGAAGCTTGC CAATGGAACC 1060
AGATATAGAC CTCCTGCAAA ACTATTAAAG GAAAGGGGTT TCTTCGGAGC TATTGCTGGT 1140
TTCTTAGAAG GAGGATGGGA AGGAATGATT GCAGGTTGGC ACGGATACAC ATCTCACGGG 1200
GCACATGGAG TGGCAGTGGC AGCAGACCTT aagagtacgc AAGAAGCCAT AAACAAGATA 1260
ACAAAAAATC TCAATTCTTT GAGTGAGCTA GAAGTAAAGA ACCTTCAAAG ACTAAGTGGT 1320
GCCATGGATG AACTCCACAA CGAAATACTC GAGCTGGATG AGAAA5TGGA TGATCTCAGA 1380
GCTGACACAA TAAGCTCGCA AATAGAGCTT GCAGTCTTAG TTTCCAACGA AGGAATAATA 1440
AACAGTGAAG ATGAGCATCT ATTGGCACTT GAGAGAAAAC TAAAGAAAAT GCTGGGTCCC 1500
TCTGCTGTAG AGATAGGGAA TGGATGCTTC GAAACAAAAC ACAAGTGCAA CCAGACCTGC 1560
TTAGACAGGA TAGCTGCTGG CACCTTTAAT GCAGGAGAAT TTTCTCTTCC cacttttgat 1620
TCACTGAATA TTACTGCTGC ATCTTTAAAT GATGATGGAT TGGATAATCA TACTATACTG 1680
CTCTACTACT CAACTGCTGC TTCTAGTTTG GCTGTAACAT TGATGATAGC TATTTTTATT 1740
GTTTATATGG TCTCCAGAGA CAATGTTTCT TGTTCCATCT GTCTGTGAGG TACCAGATCT 1800
TAATTAATTA A 1811
(1) údaje k SE ID NO: 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 589 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina
C.7 299862 B6 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: nc io (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir i? (C) INDIVIDUÁLNÍ 1ZOLÁT: B/Nclhcrlands/13/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence 20 (B) POZICE: I až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá ri IA 25 (B) POZICE: 19 až 571 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ1DNO;13:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
X 5 10 15 Lys
Asn. Ala Ile Pro Gly Asp Arg Ile cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser
20 25 30 Val Thr
Ser Pro His Val val Lys Thr Ala Thr Gin Gly Glu Val Asn
35 40 45 Ala Asr.
Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe
50 55 60 Asn
Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Leu
65 70 75 80
Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Ile
85 90 95
Thr Pro Ser Ala Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gin Leu
115 120 125
Pro Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gin Asn
130 135 140
Val Ile Asn Ala Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr
145 150 155 160
Ser Gly Ser Cys Pro Asn Val Thr Ser Arg Thr Gly Phe Phe Ala Thr
165 170 175
Met Ala Trp Ala Val Pro Arg Asp Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu
180 1Θ5 190
Thr Val Glu Val Pro Tyr Ile Cys Thr Lys Gly Glu Asp Gin Ile Thr
195 200 205
Val Trp Gly Phe His Ser Asp Asn Lys Thr Gin Met Lys Asn Leu Tyr
210 215 220
Gly Asp Ser Asn Pro Gin Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr
225 230 235 240
Thr His Tyr Val Ser Gin Ile Gly Gly Phe Pro Asp Gin Thr Glu Asp
245 250 255
Gly Gly Leu Pro Gin Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gin
260 265 270
Lys Pro Gly Lys Thr Gly Thr Xle Val Tyr Gin Arg Gly Iie Leu Leu
275 260 265
Pro Gin Lys Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly
290 295 300
Ser Leu Pro Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly
305 310 315 320
Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Giy Glu His Ala Lys Ala
325 330 335
Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn
340 345 350
Gly Thr Ars Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe
355 360 365
Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile
370 375 360
Ala Gly Trp His Gly Τγϊ Thr Ser Eis Gly Ala His Gly Val Ala Val
385 390 395 400
Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gin Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys
405 410 415
Αε π Leu Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gin Arg Leu
420 425 430
Ser Gly Ala Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu
435 440 445
Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gin Ile Glu Leu
450 455 460
Ala Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His
465 470 475 480
Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala
4S5 490 495
Val Asp Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gin
500 505 510
Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe
515 520 525
Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn
530 535 540
Asp Asp Gly Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala
545 550 555 560
Ala Ser Ser Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Val Tyr
565 570 575
Met Val Ser Arg Asp Asn val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580 585
(1) údaje k SE ID NO: 14:
s (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1557 bazických párů (B) TYP; nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne 15 (iv) PROTISMYSLNÝ: ne
- S2 .
C7. 299862 B6 (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Shandong/9/93 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinové signální sekvence (B) POZICE: 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Srna! restrikční místa (B) POZICE: 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 73 až 1728’ (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Kpnl restrikční místa (B) POZICE: 1735 až 1740 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Bglll restrikční místa (B) POZICE: 1741 až 1746 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální trans lační terminační signál (B) POZICE: 1747 až 1757
- 53 C7. 299862 Bó (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14;
TAAAAAAACC ΤΑΤΑΑΑΤΆΑΤ GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GCAAGACCTT CCAGGAAATG ACAACAGCAC AGCAACGCTG 12C
TGCCTGGGAC ATCATGCAGT GCCAAACGGA ACGCTAGTGA AAACAATCAC gaatgatcaa ISO
ATTGAAGTGA CTAATGCTAC TGAGTTGGTT CAGAGTTCCT CAACAGGTAG AATATGCGGC 240
AGTCCTCACC GAATCCTTGA TGGAAAAAAC TGCACACTGA TAGATGCTCT ATTGGGAGAC 300
CCTCATTGTG A7GGCTTCCA aaataaggaa TGGGACCTTT TTGTTGAACG CAGCAAAGCT 360
TACAGCAACT GTTACCCTTA TGATGTGCCG GATTATGCCT CCCTTAGGTC ACTAGTTGCC 420
TCATCAGGCA CCCTGGAGTT TATCAATGAA GACTTCAATT GGACTGGAGT CGCTCAGGAT 460
GGGGGAAGGT ATGCTTGCAA AAGAGGATCT GTTAACAGTT TCTTTAGTAG ATTGAATTGG 540
TTGCACAAAT tagaatacaa ATATCCAGCG CTGAACGTGA CTATGCCAAA caatggcaaa 600
TTTGACAAAT TGTACATTTG GGGGGTTCAC CACCCGAGCA CGGACAGTGA CCAAACCAGC 660
CTATATGTTC GAGCATCAGG GAGAGTCACA GTCTCTACCA AAAGAAGCCA ACAAACTGTA 720
ACCCCGAATA TCGGGTCTAG ACCCTGGGTA AGGGGTCAGT CCAGTAGAA7 AAGCATCTAT 7Θ0
TGGACAATAG TAAAACCGGG AGACATACTT TTGATTGATA GCACAGGGAA TCTAATTGCT B40
CCTCGGGG77 ACTTCAAAAT ACGAAATGGG aaaagctcaa TAATGAGG7C AGATGCACCC 900
ATTGGCAACT GCAGTTCTGA ATGCATCACT CCAAATGGAA GCATTCCCAA TGACAAACCT 960
TTTCAAAATG TAAACAGAAT CACATATGGG GCCTGCCCCA GATATGTTAA GCAAAACACT 1020
CTGAAATTGG CAACAGGGAT GCGGAATGTA CCAGAGAAAG AAACTAGAGG CATATTCGGC 10B0
GCAATCGCAG GTTTCATAGA AAATGGTTGG GAGGGAATGG TAGACGGTTG GTACGGTTTC 1140
AGGCATCAAA ATTCTGAGGG CACAGGACAA GCAGCAGATC TTAAAAGCAC TCAAGCAGCA 1200
ATCGACCAAA TCAACGGGAA ACTGAATAGG TTAATCGAGA AAACGAACGA GAAATTCCAT 1260
CAAATCGAAA AAGAATTCTC AGAAGTAGAA GGGAGAATTC AGGACCTCGA GAAATATGTT 1320
gaagacacta AAATAGATCT CTGGTCTTAC AACGCGGAGC TTCTTGTTGC CCTGGAGAAC 1360
CAACATACAA TTGATCTAAC TGACTCAGAA ATGAACAAAC TGTTTGAAAA AACAAGGAAG 1440
CAACTGAGGG AAAATGCTGA GGACATGGGC AATGGTTGCT TCAAAATATA CCACAAATGT 1500
GACAATGCCT GCATAGGGTC AATCAGAAAT GGAACTTATG ACCATGATGT ATACAGAGAC 1560
GAAGCATTAA ACAACCGGTT CCAGATCAAA GGTGTTGAGC TGAAGTCAGG ATACAAAGAT 1620
TGGATCCTAT GGATTTCGTT TGCCATA7CA TGCTTTTTGC TTTGTGTTGT TTTGCTGGGG 168 0
TTCATCATGT GGGCCTGCCA AAAAGGCAAC ATTAGGTGCA ACATTTGCA? TTGAGGTACC 1740
AGATCTTAAT TAATTAA 1757
-54C'Z 299862 B6 ) údaje k SE ID NO: 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 571 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOEÁT: A/Shandong/9/93 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE: I až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 19 až 553
SS C7. 299862 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15;
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val ser
i 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Gin Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala
20 25 30
Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys
35 40 45
Thr Ile Thr Asn Asp Gin Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val
50 55 60
Gin Ser Ser Ser Thr Gly Arg Ile Cys Gly Ser Pro His Arg Ile Leu
65 70 75 SO
Asn Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
es 90 95
Cys Asp Gly Phe Gin Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val· Glu Arg Ser
100 105 110
Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val pro Asp Tyr Ala Ser
115 120 12 5 t
Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu
130 135 140
Asd Phe Asn Trp Thr Gly Val Ala Gin Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Cys
145 150 155 160
Lys Arg Gly Ser Val Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn
180 185 190
Gly Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr
195 200 205
Asp Ser Asp Gin Thr Ser Leu Tvr Val Are Ala Ser Gly Arg Val Thr
210 215 220
Val Ser Thr Lys Arg Ser Gin Gin Thr Val Thr Pro Asn Ile Gly Ser
225 230 235 240
Arg Pro Trn Val Arg Gly Gin Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr
245 250 255
Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asp Ser Thr Gly Asn Leu
260 265 270
Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Ser Ile
275 260 285
Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Asn Cys Ser Ser Glu Cys Ile Thr
290 295 300
Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gin Asn Val Asn Arg
305 310 315 320
Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys
325 330 335
Leu Ala Thr Glv Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gin Thr Arg Gly Ile
340 345 350
Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val
355 360 365
Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gin Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gin
370 37S 380
Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gin Ala Ala Ile Asp Gin Ile Asn Gly
385 390 395 400
Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gin Ile
405 410 415
Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gin Asp Leu Glu Lys
420 425 430
Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu
435 440 445
Leu Val Ala Leu Glu Asn Gin His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu
450 455 460
Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Lys Gin Leu Arg Glu Asn Ala
465 470 475 4Θ0
Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn
465 490 495
Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asn Val Tyr
500 505 sio
Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gin Ile Lys Gly Val Glu Leu
515 520 525
Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser
530 535 540
Cys Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys
545 550 555 560
Gin Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
údaje k SE IDN 0:16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1814 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUI1 ŘETĚZCE: jednoduchý io (D)TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
zo (A)ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOEÁT: B/Shanhai/4/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY
3o (A) NÁZEV/KLÍČ; kódující oblast AcNPV 61K proteinové signální sekvence (B) POZICE: i9 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 76 až 8 i (ix) ZNAKY io (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE: 82 až 87
-57C7. 299862 Bó (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 73 až 1794 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE: 1804 až 1814 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:
TAAAAAAACC tataaataat GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
gtttctaagg CGATTCCCGG GGGTACCGAT CGAATCTGCA CTGGGATAAC ATCTTCAAAC 120
TCACCTCATG TGSTCAAAAC AGCTACTCAA GGGGAGGTCA ATGTGACTGG TGTGATACCA 180
CTGACAACAA CACCAACAAA ATCTCATTTT GCAAATCTCA aaggaacaaa GACCAGAGGG 240
AAACTATGCC CAAACTGTCT CAACTGCACA GATCTGGATG TGGCCTTGGG CAGACCAATG 300
TGTGTGGGGA CCACACCTTC GGCAAAAGCT TCAATACTCC ACGAAGTCAG ACCTGTTACA 360
TCCGGGTGCT TTCCTATAAT GCACGACAGA ACAAAAATCA gacagctacc CAATCTTCTC 420
AGAGGATATG AAAATATCAG ATTATCAACC CAAAACGTTA TCAACGCAGA aaaggcacca 480
GGAGGACCCT ACAGACTTGG AACCTCAGGA TCTTGCCCTA ACGCTACCAG TAGAAGCGGA 540
TTTT7CG2AA CAATGGCTTG GGCTGTCCCA kGGGACAACA ACAAAACAGC AACGAATCCA 600
CTAACAGTAG AAGTACCATA CATTTGCACA AAAGGAGAAG ACCAAATTAC TGTTTGGGGG 660
TTCCATTCTG ATAACAAACC CCAAATGAAA AACCTCTATG GAGACTCAAA TCCTCAAAAG 720
77CACCTCAT CTGCTAATGG AGTAACCACA CATTATGTTT CTCAGATTGG CG3CTTCCCA 7B0
GATCAAACAG AAGACGGAGG GCTACCACAA AGCGGCAGAA TTGTTGTTGA TTACATGGTG 840
CAAAAACCTG GGAAGACAGG AACAATTGTC TATCAGAGAG GTGTTTTGTT GCCTCAAAAG 90C
GTGTGGTGCG CTAGTGGGAG GAGCAAAGTA ATAAAAGGGT CCTTGCCTTT aattggtgaa 960
GCAGATTGCC TTCACGAAAA ATACGGTGGA TTAAACAAAA GCAAGCCTTA CTACACAGGA 1020
GAACATGCAA AAGCCATAGG AAATTGCCCA ATATGGGTGA AAACACCTTT GAAGCTTGCC 1080
AATGGAACCA AATATAGACC TCCTGCAAAA CTATTAAAGG aaaggggttt CTTCGGAGCT 1140
ATTGCTGGTT TCTTAGAAGG AGGATGGGAA GGAATGATTG CAGGTTGGCA CGGATACACA 1200
TCTCACGGAG CAGATGGAGT GGCAGTGGCA GCAGACCTTA AGAGTACGCA AGAAGCCATA 1260
AACAAGATAA CAAAAAATCT CAATTCTTTG AGTGAGCTAG AAGTAAAGAA TCTTCAAAGG 1320
CTAAGTGGTG CCATGGATGA ACTCCACAAC GAAATACTCG AGCTGGATGA GAAAGTGGAT 1380
-58CZ 299862 B6
GATCTCAGAG CTGACACAAT AAGCTCGCAA ATAGAACTTG CAGTCTTGCT TTCCAACGAA 1440
GGAATAATAA ACAGTGAAGA TGAGCATCTA TTGGCACTTG AGAGAAAACT AAAGAAAATG 1500
CTGGGTCCCT CTGCTGTAGA CATAGGAAAT GGATGCTTCG AAACCAAACA CAAGTGCAAC 1560
CAGACCTGG7 TAGACAGGAT AGCTGCTGGC ACCTTTAATG CGGGAGAATT TTCTCTTCCC 1620
ACTTTTGATT CACTGAATAT TACTGCTGCA TCTTTAAATG ATGATGGATT GGATAACCAT 1600
ACTA7ACTGC TCTACTACTC AACTGCTGCT TCTAGTTTGG CGGTAACATT GATGATAGCT 1740
ATTTTTATTG TTTATATGGT CTCCAGAGAC AATGTTTCTT GCTCCATCTG TCTGTGAGGA 1800
TCTTAATTAA TTAA 1614
(3) údaje k SE ID NO: 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 592 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý ío (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne 15 (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT; B/Shanhai/4/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AeNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 19 až 584 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val ser
1 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser
20 25 30
Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gin Gly Glu Val Asn
35 40 45
Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe
50 55 60
Ala Asn Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys
65 70 75 80
Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val
65 90 95
- 59 CZ 299862 B6
Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala
100
Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro ile
ΪΪ5 Í20
Gin Leu Pro .Ásn Leu Leu Arg Gly
Gin Í30 ' -135
Asn Val· Ile Asn. Ala· Glu Lýs
145 150
Gly Thr Ser Gly Ser Cys; Pro Ásh,
165
Ala. Thř Met. Ala Trp Ala Val Pro
180
Asn Pro Léu Ťhr Vál Glu Val Pro
Sér I-lfe Leu His Glu Val, Arg Pro
105 110
Met His Asp Arg Thř Lys Ilé Arg
125
Tyr Glu Asn Ile: Árg Leu Seř Ťhr
140
Ala. Pro Gly Gly Pro Týr Arg Leu
155 160
Ala Ťhr Šeř Ařg, Ser Gly Phe Phe
170' 175
Arg· Asp: Asn Asn·· Lys Thř Ala Thř
185 190
Tyr Ile Čýs Thr Lys Gly Glu Asp
Glň Asn 225 Ile 210 Leu 195 Thr Val Trp 200 Gly Phe His •215
Tyr Glý’ Ásp, Šeř Ašn 230 Pro.
Gly Val Thr Thř His Tyt Vál Sér
245 r
Thr Glu Asp Gly Glý Leu Pro Gin
260 í
Met Val Gin Lýs Pro Glý Lys Thr
275 ,280
Val Leu Leu Pro Gin Lys Val Trp
290 295
Ile Lys Gly Sér Leu Pro Leu Ile
3U5 3Ϊ0
Lys Týr Glý Glý Leu Asn Lys- Ser
325
Ala Lys: Ala Ile Gly Asii Cys· Pro
340
Leu. Ala .Ašň Gly Thr Lys Ťyr Arg
355 360
Árg Gly Phe Phe Glý Ala Ile Ala
370 375
Gly Met Ile Ala Glý Trp His Gly
385 390
Val Ala Val .Ala Ala Asp Léu Lys
,405 .205
Ser Asp Asn Lys Pro Gin Met Lys 220
Gin. Lys Phe Thr Ser- Ser Ala Ásn 235 ' 2.40
Gin- Ile Glyí Glý Phe Pro Asp' Gin ,250 255.
Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr.
265 270
Gly Tíir Ile vál Tyr: Gin Arg Glý
285
Cys Ala· Sér Gly- Arg sér Lys, Val 3Ό0
Gly Glu Ala Asp Cys Leu His, Glu 315 320
Lys Pro Ťyr Tyr Thr Glý Glu His 330 ’ 335 ..
Ile Trp Val Lys Ťhr Pro Leu, Lys
345, 35.0
Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys G1U
365
Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu
3B0
Tyr Thr Sér His Gly Ala His Gly 395 ... 400
Ser Thř Glh Glu Ala ile Asn Lys
410
415
Ile Ťhr Lys Asn Leu Ásh Šeř Leu Sér Glu Leu Glu· Val Lys· Asii Leu 420 425 430
Gin Arg Leu Ser Gly Ala Met Ašp Glu Leu Ηϊέ Asii Glu Ile:'Leu Glu ' 435 440 445
Léu. Asp Glu Lys Val Ásp Asp L.eu Arg Ala Asp Ťhr Ile Sér Ser· Gin·
450 455, , 460
Ilé Glu Leu Ala Vál Leu Leu Šer Ásn Glu Gly Ile Ile Asn Ser GlU
465 470 475 480
Asp Glu His Leu .'Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lýs Met Leu Gly
'485 490 495
Pro • Ser Ala Val Asp Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Ťhr Lys His Lýs
50Ó 505 Thr •510
Cys Asn Gin Thr Čýs Leu Ásp; Arg ile Ala Ala Gly Phe Asn Ala
515 520 525 Ala
Gly Glu Phe Seř Léu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala
530 535 540
Ser Leu Asn, Asp Asp Glý Leů Asp Ásn His. -Thr Ile Leu liéu Tyr Tyr
.545 550 Léu Ala 555 Ile 560;
ser Thr· Ala Ala· Šer Seř Vál Thr Létl Meť Ile Ala Phe
555 570 Ile 575
Ilé Val Tyr Met Val Šer Arg Asp Asn Val Seř Cýs Ser cys Leu
580: 585. 590
-60CZ 299862 B6 (1) údaje k SE ID NO; 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1802 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne 15 .
(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Harbin/7/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: laž 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K signální peptidové sekvence (B) POZICE: 19 až 69 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 22 až 27 35 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA - .
(B) POZICE: 70 až 1776 40 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE: 1780 až 1785 45 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ:BglII restrikční místa (B) POZICE: 1786 až 1791 50 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE: 1792 až 1802
-61CZ 299862 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCGGGAAG GCAATAATTG TACTAČTČAT GGTAGTAACA €0
TCCAAČGCAG ATCGAATCTG CÁCTGGGATA AGATCTTCAA ÁCTČÁČCTCA ŤGTGGTCAÁA 120
ACAGCTACTC AAGGGGAAGT CAATGTGACT GGTGTGATAC CACTGACAAC AACAČCAACA Ϊ80
AAATCTCATT TTGCAAATCT AAAÁGGAACA AAGACCAGAG GGAAACTATG CCGAAACTGT 240
CTCAACTGCA CAGATCTGGA TGTGGCCTTG, GGCAGACCAA TGTGTGTGGG GACCACACCT 300
TCGGCAAAAG CTTCAATACT CCACGAAGTC AGACCTGŤTA. CATCCGGGTG CTTTCCTATA 360
ATGCACGAČA GAACAAAAÁT CÁGACAGCTA CCCAATCTTG. TCAGAGGATA TGAAAATATC 420
AGATTATCAÁ CCCAAAAČGŤ TATCAATGCA GAÁAAAGCAC CAGGAGGACC CTACAGÁCTT 480
GGAACCTCAG GATCTTGCCC TAACGCTACC AGTAGAÁGCG GÁTTTTTTGC ÁACÁATGG.CT 540
TGGGCTGTCC CAAGGGACGÁ CAÁCAAAAGA GCAAČGÁATC CACTAACAGT AGAAGTAC1A 600·
TAČGTTTGTA CAGAAGGAGA' AGACCAAATT ACTGTTTGGG .GGTŤCČATTC TGATAAGAAA 66 0
GCCCAAATGA AAAACCTČŤA TGGAGACTCÁ ÁATCCTCAAA .AGT7ČACČTC ATCTGČTAAT 720'
GGAGTAACCA CACATTATGŤ xTCTCAGATT GGCGGCTTCC CAGATCAAAC AGAAGÁCGGA 780
GGGGTACCAC AAAGCGGCAG AATTGTTGTT GATTACATGG: 7GCÁAAAÁCC TGGGAÁAACA 840
GGAACAATTG TCTATCAAAG AGGTGTTTTG ŤTGCCTCAAA AGGTGTGGTG CGCGAGTGGC SOČ’
AGGAGCAAAG TAATAAAAGG GTCCTTGCCT TTAATTGGTG AAGGAGATTG CČTŤCACGAA 960.
AAATACGGTG GATTAAACAA AAGCAAGCCT TACTACACAG GAGAACATGC AAAAGCČATA 1020.
GGAAATTGCC' CAATATGGGT GAAAACACCT TTGAAGCTTG CCAATGGAAC CAAATATAGA 1080
CCTCCTGCAA AACTÁTTAAA GGAAAGGGGT TTCTTCGGAG CTATTGCTGG TTTCTTAGAA 1140.
GGAGGATGGG; AAGGAATGAT TGCAGGTTGG CACGGATACA CATCTCACGG AGCACATGGÁ 1200
GTGGCAGTGG CAGCAGACCT TAAGÁGTAGG CAAGAAGCCA TAAACAAGAT AACAAAAAAT 1260
CTCAATTCTT TGAGTGAGCT AGAAGTAAAG AATČT.TCÁAA GACTAAGTGG TGCCATGGAT· 132ÍO: 'GAAGTGCATA ACGAAATÁCT CGAGCTGGAT GAGAAAGTGG ATGATCTCAG-AGCTGACAGT .1380 AŤaAGCTCGC AAATÁGÁÁCŤ ' TGCAGTČTŤG ČTTTCGaACG AAGGAATAAT AAACAGTGAA 1440''
GATGAGCATC TATTGGCACT TGÁGAGÁAAA CTAAAGAAAA TGCTGGGTCC CTCTGCTGTA 1500 GÁCATAGGGA AŤGGÁTGCŤT CGAAACČAAA CAGAAGTGCA ÁCCAGACCTG CTTAGACAGG 1560 ATAGČTGCTS GCACCTTTAA TGCAGGAGAA.TTTTCTCTCC CCAČTTTTGA TTCACTGAAT 1620 ATTACTGCTG' CATCTTTAAA TGATGATGGA TTGGÁTAATC ATACTATAGT GCTCTACTAC 1680 TCAACTGCTG CTTCTAGTTT GGCTGTAACA ŤTGÁTGATAG CTATTTTTAT TGTTTATATG 1740 GTCTCCAGAG ACAATGTŤŤC ATGCTCČATC TGTCTGTGAG GTACCAGATC TTAATTAATT. 1800 AA 1802
-62CZ 299862 B6 (1) údaje k SE ID NO: 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 586 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ťo (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne 15 (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Harbin/7/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: HA signální peptid (B) POZICE: 1 až 17 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ; zralá rHA (B) POZICE: 18 až 569
-63CZ 299862 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:
Met Pro Gly Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn
1 5 10 15
Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val
20 25 30
Val Lys Thr Ala Thr Gin Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Zle Pro
35 40 45
Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr
50 55 60
Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn. Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu
65 70 75 eo
Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala
85 90 95
Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe
100 105 110
Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gin Leu Pro Asn Leu Leu
115 120 125
Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gin Asn Val Ile Asn Ala
130 135 . 140
Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys.
145 150 155 160
Pro Asn Ala Thr Ser Arg Ser Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala
165 170 175
Val Pro Arg Asp Asp Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu
180 185 190
Val Pro Tyr Val Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gin Ile Thr Val Trp Gly
19S 200 205
Phe His Ser Asp Asn Lys Ala Gin Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser
210 215 220
Asn Pro Gin Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr
225 230 235 240
-64CZ 299862 B6
Val Ser Gin Ile Gly Gly Phe Pro Asp Gin Thr Glu Asp Gly Gly Leu
245 250 255
Pro Gin Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gin Lys Pro Gly
260 2S5 270
Lys Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gin Arg Gly Val Leu Leu Pro Gin Lys
275 280 285
Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro
290 295 300
Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn
305 310 315 320
Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Alaj Lys Ala Ile Gly Asn
325 330 335
Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys
340 345 350
Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala
355 360 365
Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp
370 375 380
His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp
385 390 3 95 400
Leu Lys Ser Thr Gin Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn
405 410 415
Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gin Arg Leu Ser Gly Ala
420 425 430
Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp
435 440 445
Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile ser ser Gin Ile Glu Leu Ala Val Leu
450 455 460
Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala
465 470 475 480
Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Asp Ile
485 490 495
Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gin Thr Cys Leu
500 505 510
Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro
515 520 525
Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly
530 535 £40
Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser
545 550 555 560
Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser
565 570 575
Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580 585
- . J. — . . .-
(1) údaje k SE ID NO:20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1757 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne
- fiS CZ 299862 B6 (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Johannesburg/33/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinova mRNA (částečná) (B) POZICE: 1 až 18 ...
(ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinového signálního peptidu (B) POZICE: 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 73 až 1731 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE: 1735 až 1740 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE: 1741 až 1747 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální trarislační terminační signál (B) POZICE: 1747 až 1757
- 66 .
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 20:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GCAGGACCTT CCAGGAAATG ACAACAGCAC AGCAACGCTG 120
TGCCTGGGAC ACCATGCAGT GCCAAACGGA ACGCTAGTGA AAACAATCAC GAATGATCAA 180
ATTGAAGTGA CTAATGCTAC TGAGCTGGTT CAGAGTTCCC CAACAGGTAG AATATGCGAC 240 ., AGTCCTCACC GAATCCTTGA TGGAAAGAAC TGCACACTGA TAGATGCTCT, ATTGGGAGAC .300
CCTCATTGTG ATGGCTTCCA AAATAAGGAA TGGGACCTTT TTGTTGAACG CAGCAAAGCT 360
TACAGCAACT GTTACCCTTA TGATGTGCCG GATTATGCCT CCCTTAGGTC ACTAGTTGCC 420
TCATCAGGCA CCCTGGAGTT TATCAACGAA AACTTCAATT GGACTGGAGT CGCTCAGGAT 4B0
GGGAAAAGCT ATGCTTGCAA AAGGGGATCT GTTAACAGTT TCTTTAGTAG ATTGAATTGG 540
TTGCACAAAT TAGAATACAA ATATCCAGCG CTGAACGTGA CTATGCCAAA CAATGGCAAA 600
TTTGACAAAT TGTACATTTG GGGGGTTCAC CACCCGAGCA CGGACAGTGA CCAAACCAGC 660
CTATATGTCC GAGCATCAGG GAGAGTCACA GTCTCTACCA AAAGAAGCCA ACAAACTGTA 720
ATCCCGGATA TCGGGTATAG ACCATGGGTA AGGGGTCAGT CCAGTAGAAT AGGCATCTAT 780
TGGACAATAG TAAAACCGGG AGACATACTT TTGATTAATA GCACAGGGAA TCTAATTGCT 840
CCTCGGGGTT ACTTCAAAAT ACGAAATG3G AAAAGCTCAA TAATGAGGTC. AGATGCACCC 900
ATTGGCAACT GCAGTTCTGA ATGCATCACT CCAAATGGAA GCATTCCCAA TGACAAACCT 960
TTTCAAAATG TAAACAGGAT CACATATGGG GCCTGCCCCA GATATGTTAA GCAAAACACT 1020
CTGAAATTGG CAACAGGGAT GCGGAATGTA CCAGAGAAAC AAACTAGAGG CATATTCGGC 1060
GCAATCGCAG·GTTTCATAGA AAATGGTTGG GAGGGAATGG TAGACGGTTG GTACGGTTTC 1140
AGGCATCAAA ATTCTGAGGG CACAGGAGAA GCTGCAGATC TTAAAAGCAC TCAAGCAGCA 1200
ATCGACCAAA TCAACGGGAA ACTGAATAGG ŤTAGTCGAGA AAACGAACGA GAAATTCCAT 1260
CAAATCGAAA AAGAATTCTC AGAAGTAGAA GGGAGAATTC AGGACCTCGA GAAATATGTT 1320 GAAGACACTA AAATAGATCT CTGGTCTTAC AATGCGGAGC TTCTTGTTGC TCTGGAGAAC 1380 CAACATACAA TTGATCTAAC TGACTCAGAA ATGAACAAAC TGTTTGAAAG AACAAGGAAG 1440 CAACTGAGGG AAAATGCTGA GGACATGGGC AATGGTTGTT TCAAAATATA CCACAAATGT 1500 GACAATGCCT GCATAGGGTC AATCAGAAAT GGAACTTATG ACCATGATGT ATACAGAGAC 1560 GAAGCATTAA ACAACCGGTT CCAGATCAAA GG TG TTG AGC TGAAGTCAGG ATACAAAGAT 1620 TGGATTCTAT GGATTTCCTT TGCCATATCA TGCTTTTTGC TTTGTGTTGT TTTGCTTGGG 1660 TTCATCATGT GGGCCTGCCA AAAAGGCAAC ATTAGGTGCA ACATTTGCAT TTGAGGTACC 1740 AGATCTTAAT TAATTAA 1757
CZ 299862 Bó (1) údajekSE IDN0:21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 571 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární * 10 (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne '
(v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Johannesburg/33/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 18 až 569 ,.
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:
Met Pro. Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val 10 Ala Val Ser 15
1 5
Asn Ala Ile Pro Gly Gin Asp 20 Leu Pro 25 Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala 30
Thr Leu Cys Leu Gly His His 35 Ala Val 40 Pro Asn Gly Thr 45 Leu Val Lys
Thr Ile 50 Thr Asn Asp Gin Ile 55 Glu Val Thr Asn Ala Thr €0 Glu Leu Val
Gin Ser €5 Ser Pro Thr Gly Arg 70 Ile Cys Asp Ser Pro His 75 Arg Ile Leu 80 .
Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu 05 Ile Asp Ala Leu Leu Gly 90 Aso Pro His 95
Cys Asp Gly Phe Gin Asn Lys 100 Glu Trp Asp Leu Phe Val 105 Glu Arg Ser 110
Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr 115 Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser 120 125
Leu Arg 130 Ser Leu Val Ala Ser 135 Ser Gly Thr Leu Glu Phe 140 Ile Asn Glu
Asn Phe 145 Asn Trp Thr Gly Val 150 Ala Gin Asp Gly Lys Ser 155 Tyr Ala Cys 160
Lys Arg Gly Ser Val Asn Ser 165 Phe Phe Ser Arg Leu Asn 170 Trp Leu His 175
Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Pro 180 Ala Leu 185 Asn Val Thr Met Pro Asn Asn 190
Gly Lys Phe Asp Lys Leu Tyr 195 Ile Trp 200 Gly Val His His 205 Pro Ser Thr
Asp Ser 210 Asp Gin Thr Ser Leu 215 Tyr Val Arg Ala Ser Gly Arg Val Thr 220
Val Ser 225 Thr Lys Arg Ser Gin 230 Gin Thr Val Ile Pro Asp 235 Ile Gly Tyr 240
Arg pro Trp Val Arg Gly Gin 245 Ser ser Arg Ile Gly Ile 250 Tyr Trp Thr 255
Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile 260 Leu Leu 265 Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu 270
Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe 275 Lys Ile 280 Arg Asn Gly Lys 285 Ser Ser Ile
Met Arg 290 Ser Asp Ala Pro Ile 29S Gly Asn Cys Ser Ser Glu 300 Cys Ile Thr
Pro Asn 305 Gly Ser Ile Pro Asn 310 Asp Lys Pro Phe Gin Asn 315 Val Asn Arg 320
Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro 325 Arg Tyr Val Lys GÍn Asn 330 Thr Leu Lys 335
Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn 340 ' Val Pro v 345 Glu Lys Gin Thr Arg Gly Ile 350
Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 355 Ile Glu 360 Asn Gly Trp Glu 365 Gly Met Val
Asp Gly Trp Tyr Gly Phé Arg His Gin Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gin
370 375 380
Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gin Ala Ala Ile Asp Gin Ile Asn Gly
365 390 395 400
Lys Leu Asn Arg Leu Val Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gin Ile
405 410 415
Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gin Asp Leu Glu Lys
420 425 430
Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu
435 440 445
Leu Val Ala Leu Glu Asn Gin His Thr Ile Asp LeuThr Asp Ser Glu
450 455 460
Met Asn Lys Leu Phe Glu Arg Thr Arg Lys Gin Leu Arg Glu Asn Ala
465 470 475 480
Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn
465 490 495
Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg. Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr
500 505 510
Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gin Ile Lys Gly Val Glu Leu
515 520 525
Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser
530 535 540
CY® Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys
545 550 555 560
Gin Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570 (1) údaje k SEQ ID NO:22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý ío (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:
TGGTTGGTCG CCGTTTCTAA CGCGATTCCC GGGGGTACC 39 (1) údaje k SE ID NO:23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 13 aminokyselin 20 (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:
Trp Leu Val Ala Val Ser Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr 1 5
-in.
(1) údaje k SE ID NO:24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 43 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární io (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:
TGGTTAGTCG CCGTGTCCT.G CAGGCCAGAG AGGCCTTGGT ACC (1) údaje k SEQ ID NO:25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:25:
GTCGCCGTGT CCAACGCG 18 (1) údaje k SEQ ID NO:26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 bazických párů 30 ,(B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:
„ TAATTGGCCA GAGAGGCC 18 (1) údaje k SEQ ID NO:27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:27:
GGGGGATCCG GTACCAGCAA AAGCAGGGGA TAATTCTAT 39
- 71 CZ 299862 B6 (1) údaje k SEQ ID NO:28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 38 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:28:
GGGGGTACCC CCGGGGACTT TCCAGGAAAT GACAACAG 38 (1) údaje k SEQ ID NO:29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 44 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:29:
CCCGGTACCG AATCATCCTA GAAACAAGGG TGTTTTTAAT TAAT 44 (1) údaje k SEQ ID NO:30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 47 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:30:
GGGGAATTCG GTACCCCCGG GAAGGCAATA ATTGTACTAC TCATGGT 47 (1) údaje k SEQ ID NO:31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE;
(A) DÉLKA: 36 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:31:
GGTACCCCCG GGGATCGAAT CTGCACTGGG ATAACA 36
7Ί
CZ 299862 Bó (1) údaje k SEQ ID NO:32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 50 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý . t .. . (D) TOPOLOGIE: lineární

Claims (9)

1. Polypeptid, obsahující baculovirový signální peptid obsahující aminokyseliny 1 až 18 SEQ 20 ID NO, 7 nebo 9, operativně navázané na heterologickou aminokyselinovou sekvenci.
2. Izolovaná nukleová kyselina kódující polypeptid podle nároku 1.
3. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 2.
25
4. Způsob exprese exogenního proteinu, vyznačený tím, že se jako vektor v baculovirovém expresním systému použije vektor podle nároku 3.
5. Izolovaná nukleová kyselina obsahující nukleotidy 21 až 74 SEQ ID NO. 6 nebo 8 kódující 30 baculovirový signální peptid podle nároku 1, která je operativně navázána na heterologické kódující sekvenci,
6. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 5.
35
7. Způsob exprese exogenního proteinu, vyznačený tím, že se jako vektor v baculovirovém expresním systému použije vektor podle nároku 6.
8. Vektor podle nároku 3 nebo 6, ve kterém je heterogenní sekvencí sekvence hemaglutininu influenzy.
9. Buňka enzymu transfektovaná vektorem podle nároků 3,6 nebo 8.
CZ20080037A 1993-09-13 1995-05-26 Polypeptid obsahující baculovirový signální peptid CZ299862B6 (cs)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/120,607 US5762939A (en) 1993-09-13 1993-09-13 Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
CA2222129A CA2222129C (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
PCT/US1995/006750 WO1996037624A1 (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
CNB951979280A CN100390289C (zh) 1993-09-13 1995-05-26 生产流感血凝素多价疫苗的方法
LT97-201A LT4461B (lt) 1993-09-13 1997-12-23 Gripo hemagliutinino multivalentinių vakcinų gamybos būdas

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ299862B6 true CZ299862B6 (cs) 2008-12-17

Family

ID=27508642

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20080037A CZ299862B6 (cs) 1993-09-13 1995-05-26 Polypeptid obsahující baculovirový signální peptid
CZ0373897A CZ301021B6 (cs) 1993-09-13 1995-05-26 V podstate cistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chripkový HAO hemaglutininový protein, vektor pro výrobu rekombinantního HAO hemaglutininového proteinu, zpusob výroby uvedeného proteinu a vakcína obsahující uvedený protein

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0373897A CZ301021B6 (cs) 1993-09-13 1995-05-26 V podstate cistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chripkový HAO hemaglutininový protein, vektor pro výrobu rekombinantního HAO hemaglutininového proteinu, zpusob výroby uvedeného proteinu a vakcína obsahující uvedený protein

Country Status (21)

Country Link
US (2) US5762939A (cs)
EP (2) EP0833933B1 (cs)
JP (1) JP3757318B2 (cs)
CN (1) CN100390289C (cs)
AT (2) ATE518000T1 (cs)
AU (1) AU712776B2 (cs)
BR (1) BR9510590A (cs)
CA (1) CA2222129C (cs)
CZ (2) CZ299862B6 (cs)
DE (1) DE69534449T2 (cs)
DK (3) DK0833933T3 (cs)
ES (1) ES2248799T3 (cs)
FI (1) FI974319A7 (cs)
HU (1) HUT77921A (cs)
IS (1) IS4620A (cs)
LT (1) LT4461B (cs)
NO (1) NO975434L (cs)
NZ (1) NZ288026A (cs)
PT (1) PT1605052E (cs)
SK (1) SK286441B6 (cs)
WO (1) WO1996037624A1 (cs)

Families Citing this family (192)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6387373B1 (en) * 1993-01-15 2002-05-14 Novavax, Inc. Vaccines containing paucilsmellar lipid vesicles as immunological adjuvants
EP2374894B1 (en) * 1993-09-13 2014-09-17 Protein Sciences Corporation A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
DE19612966B4 (de) * 1996-04-01 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren
DE19612967A1 (de) * 1996-04-01 1997-10-02 Behringwerke Ag Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur, sowie die durch das Verfahren erhältlichen Influenzaviren
US7157089B1 (en) * 1996-11-26 2007-01-02 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses using compositions containing stress proteins
NZ538399A (en) * 1997-08-05 2007-05-31 Nventa Biopharma Corp Fusion protein comprising an HPV E7 protein and a stress protein wherein the E7 protein is joined directly to the amino terminus of the stress protein
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6348450B1 (en) * 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US7390619B1 (en) 1998-02-11 2008-06-24 Maxygen, Inc. Optimization of immunomodulatory properties of genetic vaccines
US6541011B2 (en) * 1998-02-11 2003-04-01 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
US8026096B1 (en) 1998-10-08 2011-09-27 Protein Sciences Corporation In vivo active erythropoietin produced in insect cells
NZ512980A (en) * 1998-12-17 2003-07-25 Aventis Pasteur Multivalent immunogenic composition containing RSV subunit composition and influenza virus preparation
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
JP2003504074A (ja) 1999-07-08 2003-02-04 ストレスゲン バイオテクノロジーズ コーポレイション インビトロでのＴｈ１様応答の誘導
US6544750B1 (en) 1999-08-17 2003-04-08 Thromgen, Inc. Peptide analogs as selective inhibitors of thrombin activation of protease activated receptor 1
DE19963857A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-26 Qiagen Gmbh Primer, insbesondere für Primer-abhängige Nukleinsäure-Syntheseprozesse und Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren
NZ523408A (en) 2000-06-26 2006-02-24 Stressgen Biotechnologies Corp Human papilloma virus treatment
US20060177416A1 (en) * 2003-10-14 2006-08-10 Medivas, Llc Polymer particle delivery compositions and methods of use
GB0022969D0 (en) * 2000-09-19 2000-11-01 Chiron Spa Influenza a virus subtype H16
JPWO2002062381A1 (ja) * 2001-02-05 2004-06-03 久光製薬株式会社 バキュロウイルスベクターワクチン
DE10144906B4 (de) * 2001-09-12 2013-11-28 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen
US7232670B2 (en) 2001-09-28 2007-06-19 St. Jude Children's Research Hospital Targeting proteins to cells expressing mannose receptors via expression in insect cells
DE10218129A1 (de) * 2002-04-23 2003-11-20 Univ Ruprecht Karls Heidelberg Genetischer Impfstoff gegen RNA-Virus-Infektionen
US7566458B2 (en) 2003-06-16 2009-07-28 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
CA2503774C (en) * 2003-06-20 2007-09-25 Microbix Biosystems Inc. Improvements in virus production
US8541003B2 (en) 2003-06-20 2013-09-24 Protein Sciences Corporation Vectors expressing SARS immunogens, compositions containing such vectors or expression products thereof, methods and assays for making and using
US8992939B2 (en) 2003-07-11 2015-03-31 Novavax, Inc. Highly efficient influenza matrix (M1) proteins
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
US8080255B2 (en) 2003-07-11 2011-12-20 Novavax Inc. Functional influenza virus like particles (VLPs)
US8506967B2 (en) 2003-07-11 2013-08-13 Novavax, Inc. Functional influenza virus like particles (VLPs)
US7527967B2 (en) * 2003-11-25 2009-05-05 Academia Sinica Recombinant baculovirus and virus-like particle
BRPI0507169A (pt) * 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos do hormÈnio de crescimento humano modificados e seu usos
AU2005249450A1 (en) 2004-05-27 2005-12-15 Centocor, Inc. Cynomolgus prostate specific antigen
CA2570563A1 (en) * 2004-06-15 2006-09-28 Centocor, Inc. Method for screening agents against human prostate disease
US7632924B2 (en) * 2004-06-18 2009-12-15 Ambrx, Inc. Antigen-binding polypeptides and their uses
WO2006091231A2 (en) * 2004-07-21 2006-08-31 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
US8420102B2 (en) * 2006-03-07 2013-04-16 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin
BRPI0519430A2 (pt) 2004-12-22 2009-02-10 Ambrx Inc hormânio do crescimento humano modificado
CN103520735B (zh) * 2004-12-22 2015-11-25 Ambrx公司 包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方
EP1836298B1 (en) * 2004-12-22 2012-01-18 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
EP2399893B1 (en) 2004-12-22 2018-08-15 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
EP1836316A4 (en) 2004-12-22 2009-07-22 Ambrx Inc PROCESS FOR EXPRESSION AND CLEANING OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE
EP2374474A1 (en) 2005-01-19 2011-10-12 Vaxinnate Corporation Compositions comprising pathogen-associated molecular patterns and antigens and their use to stimulate an immune response
CN101163494A (zh) * 2005-02-23 2008-04-16 Uab研究基金会 烷基糖苷增强的接种
EP2471552B1 (en) 2005-03-08 2015-05-06 MedImmune, LLC Reassortant influenza viruses
AR054020A1 (es) 2005-03-23 2007-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Nuevo uso
US11865172B2 (en) 2005-04-21 2024-01-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
AU2006255122B2 (en) * 2005-06-03 2010-10-21 Ambrx, Inc. Improved human interferon molecules and their uses
US7871626B2 (en) 2005-08-04 2011-01-18 St. Jude Children's Research Hospital Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency
AU2005335491B2 (en) 2005-08-18 2010-11-25 Ambrx, Inc. Compositions of tRNA and uses thereof
CA2623198C (en) 2005-09-22 2014-08-05 Medivas, Llc Bis-(a-amino)-diol-diester-containing poly(ester amide) and poly(ester urethane) compositions and methods of use
JP5178520B2 (ja) * 2005-09-22 2013-04-10 メディバス エルエルシー 固体ポリマー送達組成物およびその使用法
US7468187B2 (en) 2005-10-18 2008-12-23 Iowa State University Research Foundation, Inc. Canine influenza virus and related compositions and methods of use
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
NZ568211A (en) 2005-11-04 2011-11-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Influenza vaccines including combinations of particulate adjuvants and immunopotentiators
CA2628152C (en) * 2005-11-04 2016-02-02 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
CN102755645A (zh) 2005-11-04 2012-10-31 诺华疫苗和诊断有限公司 佐剂配制的包含细胞因子诱导剂的流感疫苗
NZ594482A (en) 2005-11-04 2012-11-30 Novartis Vaccines & Diagnostic Influenza vaccines with reduced amount of oil-in-water emulsion as adjuvant
CN101400646A (zh) * 2005-11-08 2009-04-01 Ambrx公司 用于修饰非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的促进剂
DK2339014T3 (en) * 2005-11-16 2015-07-20 Ambrx Inc Methods and compositions comprising non-natural amino acids
WO2007067744A2 (en) * 2005-12-07 2007-06-14 Medivas, Llc Method for assembling a polymer-biologic delivery composition
WO2007070659A2 (en) * 2005-12-14 2007-06-21 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
PL2478916T3 (pl) 2006-01-27 2020-11-16 Seqirus UK Limited Szczepionki przeciw grypie zawierające hemaglutyninę i białka macierzy
TWI477602B (zh) 2006-02-09 2015-03-21 Educational Foundation Jichi Medical Univ Novel viral vector
US9333249B2 (en) 2006-02-09 2016-05-10 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
CU23576A1 (es) 2006-02-28 2010-09-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la influenza aviar
CN101448523A (zh) 2006-03-24 2009-06-03 诺华疫苗和诊断有限两合公司 无需冷藏储存流感疫苗
CA2649672C (en) * 2006-05-02 2015-07-07 Medivas, Llc Delivery of ophthalmologic agents to the exterior or interior of the eye
CN102258778B (zh) * 2006-05-05 2014-08-13 淡马锡生命科学研究院有限公司 生物分子表面展示及其用途
WO2007133616A2 (en) * 2006-05-09 2007-11-22 Medivas, Llc Biodegradable water soluble polymers
MX2009000660A (es) 2006-07-17 2009-04-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna de influenza.
GB0614460D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Novartis Ag Vaccines
JP5399906B2 (ja) * 2006-09-08 2014-01-29 アンブルックス，インコーポレイテッド 脊椎動物細胞用のハイブリッドサプレッサーｔｒｎａ
EP2064333B1 (en) * 2006-09-08 2014-02-26 Ambrx, Inc. Suppressor trna transcription in vertebrate cells
CN106008699A (zh) * 2006-09-08 2016-10-12 Ambrx公司 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
US20100105025A1 (en) * 2006-10-12 2010-04-29 Engelhard Eric K Devices for generating detectable polymers
US20080124710A1 (en) * 2006-10-12 2008-05-29 Engelhard Eric K Devices for generating detectable polymers
WO2008118487A2 (en) * 2007-03-26 2008-10-02 University Of Massachusetts Medical School Compositions and methods for incresing immunogenicity of glycoprotein vaccines
CN107501407B (zh) 2007-03-30 2022-03-18 Ambrx公司 经修饰fgf-21多肽和其用途
PE20090146A1 (es) 2007-04-20 2009-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica contra el virus influenza
US8114630B2 (en) 2007-05-02 2012-02-14 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
KR20100045437A (ko) * 2007-06-27 2010-05-03 노파르티스 아게 첨가물이 적은 인플루엔자 백신
WO2009076778A1 (en) 2007-11-27 2009-06-25 Medicago Inc. Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
CA2615372A1 (en) * 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
CA2709412A1 (en) * 2007-07-24 2009-01-29 Medivas, Llc Biodegradable cationic polymer gene transfer compositions and methods of use
MX2010005317A (es) 2007-11-20 2010-06-02 Ambrx Inc Polipeptidos de insulina modificados y sus usos.
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
MX344166B (es) 2008-02-08 2016-12-07 Ambrx Inc Leptina-polipeptidos modificados y sus usos.
AU2009236585B2 (en) 2008-04-18 2013-03-07 Vaxinnate Corporation Deletion mutants of flagellin and methods of use
AU2009267769B2 (en) * 2008-07-08 2015-07-16 Medicago Inc. Soluble recombinant influenza antigens
RU2523587C2 (ru) 2008-07-11 2014-07-20 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Варианты гемагглютинина и нейрамидазы вируса гриппа
CN102159230A (zh) 2008-07-23 2011-08-17 Ambrx公司 经修饰的牛g-csf多肽和其用途
WO2010019716A1 (en) * 2008-08-13 2010-02-18 Medivas, Llc Aabb-poly(depsipeptide) biodegradable polymers and methods of use
US8658180B2 (en) 2008-08-15 2014-02-25 Mark A. Miller Vaccines against influenza virus
AU2009296267B2 (en) * 2008-09-26 2013-10-31 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines
BR122012024318A2 (pt) 2008-09-26 2019-07-30 Ambrx, Inc. Polipeptídeos modificados de eritropoetina animal e seus usos
EP3173097A3 (en) 2009-02-10 2017-07-12 Seqirus UK Limited Influenza vaccines with reduced amounts of squalene
USH2283H1 (en) 2009-04-27 2013-09-03 Novartis Ag Vaccines for protecting against influenza
NZ596671A (en) 2009-05-29 2013-06-28 Novartis Ag Assays for influenza virus hemagglutinins
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
GB2471093A (en) * 2009-06-17 2010-12-22 Cilian Ag Viral protein expression in ciliates
HUE039100T2 (hu) 2009-06-24 2018-12-28 Medicago Inc Hemagglutinint tartalmazó kimer influenzavírus-jellegû részecskék
CA2803282C (en) 2009-07-06 2018-05-01 David E. Anderson Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom
JP5854559B2 (ja) 2009-07-06 2016-02-09 ヴァリエーション バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド 小胞を調製する方法及びこれから製造される製剤
US8810417B2 (en) * 2009-08-28 2014-08-19 The Invention Science Fund I, Llc Beverage immersate with detection capability
US9024766B2 (en) * 2009-08-28 2015-05-05 The Invention Science Fund, Llc Beverage containers with detection capability
US20120237536A1 (en) 2009-09-10 2012-09-20 Novartis Combination vaccines against respiratory tract diseases
KR101773431B1 (ko) 2009-09-22 2017-09-12 메디카고 인코포레이티드 식물-유래 ｖｌｐ의 제조방법
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
BR112012015597A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-31 Ambrx Inc peptídeos de somatotropina suínos modificados e seus usos
EP2519636B8 (en) * 2009-12-28 2017-08-09 DSM IP Assets B.V. Production of hemagglutinin-neuraminidase protein in microalgae
CA3028175C (en) * 2009-12-28 2022-05-24 Sanofi Vaccine Technologies, S.A.S. Methods of producing heterologous viral neuraminidase proteins in microalgae
CN102939101A (zh) * 2010-01-26 2013-02-20 科罗拉多大学董事会，法人 用于通用疫苗的流感病毒组合物和方法
US20110305748A1 (en) 2010-03-11 2011-12-15 Immune Design, Corp. Vaccines for Pandemic Influenza
AU2011230619C1 (en) 2010-03-25 2016-06-23 Oregon Health & Science University CMV glycoproteins and recombinant vectors
CA2801151A1 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Novartis Ag Concentration of vaccine antigens with lyophilization
WO2011151723A2 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Novartis Ag Concentration of vaccine antigens without lyophilization
WO2012006367A2 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Variation Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for treating influenza
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
EA030886B1 (ru) 2010-08-17 2018-10-31 Амбркс, Инк. Модифицированные полипептиды релаксина, содержащие некодируемую в природе аминокислоту, связанную с полимером, и их применение
WO2012023044A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Novartis Ag Soluble needle arrays for delivery of influenza vaccines
US8513006B2 (en) 2010-09-14 2013-08-20 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Tetravalent influenza vaccine and use thereof
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
CN102023213B (zh) * 2010-09-28 2014-04-02 汕头大学医学院 一种检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法
BR112013018074A2 (pt) 2011-01-13 2020-12-01 Variation Biotechnologies, Inc. métodos para a preparação de vesículas e formulações produzidas a partir dessas
US10736844B2 (en) 2011-01-13 2020-08-11 Variation Biotechnologies Inc. Compositions and methods for treating viral infections
ES2645156T3 (es) 2011-03-21 2017-12-04 Altimmune Inc. Agente terapéutico inmunológico de acción rápida y prolongada
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
HUE037408T2 (hu) 2011-06-10 2018-08-28 Univ Oregon Health & Science CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok
US9873765B2 (en) 2011-06-23 2018-01-23 Dsm Ip Assets, B.V. Biodegradable polyesteramide copolymers for drug delivery
ES2992024T3 (es) 2011-06-23 2024-12-05 Dsm Ip Assets Bv Nuevos copolímeros de poliesteramida biodegradables para la administración de fármacos
CA2789539A1 (en) 2011-09-12 2013-03-12 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2768528A1 (en) 2011-10-20 2014-08-27 Novartis AG Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
US20140328876A1 (en) 2011-11-18 2014-11-06 Variation Biotechnologies Inc. Synthetic derivatives of mpl and uses thereof
WO2013088367A1 (en) 2011-12-12 2013-06-20 Novartis Ag Assay for influenza virus hemagglutinins
AU2013208693B2 (en) 2012-01-12 2017-12-07 Variation Biotechnologies Inc. Compositions and methods for treating viral infections
EP2806894A4 (en) 2012-01-27 2015-11-04 Variation Biotechnologies Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR THERAPEUTIC AGENTS
TWI434933B (zh) * 2012-04-17 2014-04-21 Nat Univ Tsing Hua 抗多型禽流感病毒之ｄｎａ疫苗及其組合物
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
US8932598B2 (en) 2012-08-28 2015-01-13 Vaxinnate Corporation Fusion proteins and methods of use
GB201218195D0 (en) 2012-10-10 2012-11-21 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie Composition
JP2015015931A (ja) 2013-07-12 2015-01-29 株式会社Ｕｍｎファーマ ウイルス様粒子を含む培養物の製造方法
JP6479305B2 (ja) 2013-07-12 2019-03-06 株式会社Ｕｍｎファーマ ウイルス様粒子の精製方法
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
CN114805532A (zh) 2014-10-24 2022-07-29 百时美施贵宝公司 修饰的fgf-21多肽及其用途
US10434071B2 (en) 2014-12-18 2019-10-08 Dsm Ip Assets, B.V. Drug delivery system for delivery of acid sensitivity drugs
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
US9931394B2 (en) 2015-03-23 2018-04-03 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
CA3001725C (en) * 2015-05-04 2021-06-15 Epivax, Inc. Modified h7 hemaglutinin glycoprotein of the influenza a/shanghai/2/2013 h7 sequence
US11013795B2 (en) 2015-06-26 2021-05-25 Seqirus UK Limited Antigenically matched influenza vaccines
KR102790570B1 (ko) * 2015-07-07 2025-04-04 세퀴러스 유케이 리미티드 인플루엔자 효능 검정
CA2996007A1 (en) 2015-09-03 2017-03-09 Novavax, Inc. Vaccine compositions having improved stability and immunogenicity
BR112018014109A2 (en) 2016-01-11 2018-12-11 Verndari, Inc. microneedle compositions and methods of using them
US10063211B2 (en) 2016-02-03 2018-08-28 Qualcomm Incorporated Compact bypass and decoupling structure for millimeter-wave circuits
CN106749554B (zh) * 2017-01-20 2021-01-15 中山大学 一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法
PE20191716A1 (es) 2017-02-08 2019-12-05 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos de relaxina modificada que comprenden un mejorador farmacocinetico y sus usos
US10874737B2 (en) 2018-06-01 2020-12-29 Iowa State University Research Foundation, Inc. Influenza nanovaccine
CA3160955A1 (en) 2019-11-12 2021-05-20 Dsm Ip Assets B.V. Polyesteramide copolymers possessing high glass transition temperatures
MX2023002356A (es) 2020-08-24 2023-03-22 Sanofi Pasteur Inc Vacunas contra la covid-19 con coadyuvantes en emulsion de escualeno que contiene tocoferol.
US20240016918A1 (en) 2020-08-24 2024-01-18 Sanofi Pasteur Inc. Vaccines against sars-cov-2 infections
AU2022361432A1 (en) 2021-10-08 2024-05-23 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent influenza vaccines
AU2022379948A1 (en) 2021-11-05 2024-06-20 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent influenza vaccines comprising recombinant hemagglutinin and neuraminidase and methods of using the same
WO2023079113A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Hybrid multivalent influenza vaccines comprising hemagglutinin and neuraminidase and methods of using the same
EP4565604A2 (en) 2022-08-01 2025-06-11 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Immunomodulatory proteins and related methods
US20240228620A1 (en) 2022-10-06 2024-07-11 Bicara Therapeutics Inc. Multispecific proteins and related methods
WO2024151583A2 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
WO2024167885A1 (en) 2023-02-06 2024-08-15 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory compositions and related methods
WO2024167880A1 (en) 2023-02-06 2024-08-15 Bicara Therapeutics Inc. Combination therapy and related methods
WO2024258829A1 (en) 2023-06-12 2024-12-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2025006419A1 (en) 2023-06-26 2025-01-02 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Engineered plasmodia and related methods
AU2024299328A1 (en) 2023-07-21 2026-01-22 Marrow Therapeutics, Inc. Hematopoietic cell targeting conjugates and related methods
KR20260044217A (ko) 2023-07-25 2026-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 Vii, 엘엘씨 Cas 엔도뉴클레아제 및 관련 방법
WO2025024493A1 (en) 2023-07-25 2025-01-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas endonucleases and related methods
CN116763915B (zh) * 2023-08-17 2023-11-03 山东兴瑞生物科技有限公司 一种用于治疗和预防流感病毒的多价疫苗
WO2025054236A2 (en) 2023-09-06 2025-03-13 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2025072331A1 (en) 2023-09-26 2025-04-03 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas nucleases and related methods
WO2025117877A2 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas nucleases and related methods
WO2025129034A2 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025129001A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128936A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128954A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128943A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128953A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128934A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
TW202545974A (zh) 2024-01-26 2025-12-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 免疫受體抑制蛋白及相關方法
US20250353881A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor inhibitory proteins and related methods
WO2025245111A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor targeting proteins and related methods

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4029763A (en) * 1974-08-05 1977-06-14 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Influenza vaccine containing purified neuraminidase antigen and method of using the same
IN150740B (cs) * 1978-11-24 1982-12-04 Hoffmann La Roche
US4659669A (en) * 1981-03-02 1987-04-21 Regents Of The Univ. Of California Microbial expression of human influenza hemagglutinin proteins
US4752473A (en) * 1984-10-12 1988-06-21 The Regents Of The University Of California Expression of glycosylated human influenza hemagglutinin proteins
US4920213A (en) * 1985-06-20 1990-04-24 Biotechnology Research Partners, Ltd. Method and compositions useful in preventing equine influenza
JPH02502876A (ja) * 1987-03-16 1990-09-13 アメリカン　バイオジェネティック　サイエンシズ　インク ワクチンと生物学的殺虫剤における組換えバクロウイルス閉塞体
GB9106185D0 (en) * 1991-03-22 1991-05-08 Wellcome Found Biological control agents
CA2084180A1 (en) * 1991-12-11 1993-06-12 Paul P. Hung Expression of specific immunogens using viral antigens
WO1995032286A2 (en) * 1994-05-20 1995-11-30 Microgenesys, Inc. Immunogenic carcinoembryonic antigen and methods of use and production

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kuroda K. et al.: "Expression of the influenza virus haemagglutinin in insect cells by a baculovirus vector", EMBO J., Vol. 5(6):, 1359-1365, 1986 *
Matsuura Y. et al.:"Baculovirus expression vectors: the requirements for high level expression of proteins, including glycoproteins", J. Gen. Virol., 68 (Pt 5), 1233-50, 1987 *
Possee R.D.: "Cell-surface expression of influenza virus haemagglutinin in insect cells using a baculovirus vector", Virus Res., Vol. 5(1), 43-59, 1986 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1194005A (zh) 1998-09-23
DK0833933T3 (da) 2005-10-10
JP2000513922A (ja) 2000-10-24
US5762939A (en) 1998-06-09
NZ288026A (en) 1999-11-29
FI974319A7 (fi) 1998-01-22
HK1083867A1 (en) 2006-07-14
DK1275726T3 (da) 2008-06-23
US5858368A (en) 1999-01-12
DE69534449T2 (de) 2006-07-06
ATE304602T1 (de) 2005-09-15
HUT77921A (hu) 1998-10-28
EP1605052A2 (en) 2005-12-14
SK158897A3 (en) 1999-06-11
JP3757318B2 (ja) 2006-03-22
EP0833933B1 (en) 2005-09-14
LT4461B (lt) 1999-02-25
AU712776B2 (en) 1999-11-18
CZ301021B6 (cs) 2009-10-14
NO975434D0 (no) 1997-11-26
BR9510590A (pt) 1999-11-30
CZ373897A3 (cs) 1999-02-17
DK1605052T3 (da) 2011-11-07
ES2248799T3 (es) 2006-03-16
WO1996037624A1 (en) 1996-11-28
AU2692595A (en) 1996-12-11
CA2222129C (en) 2010-04-27
IS4620A (is) 1997-11-25
DE69534449D1 (de) 2006-01-26
ATE518000T1 (de) 2011-08-15
EP0833933A1 (en) 1998-04-08
EP1605052B1 (en) 2011-07-27
SK286441B6 (sk) 2008-10-07
EP1605052A3 (en) 2008-08-13
NO975434L (no) 1998-01-19
PT1605052E (pt) 2011-10-19
LT97201A (en) 1998-09-25
FI974319A0 (fi) 1997-11-25
CA2222129A1 (en) 1996-11-28
CN100390289C (zh) 2008-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ299862B6 (cs) Polypeptid obsahující baculovirový signální peptid
US6245532B1 (en) Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
KR101153929B1 (ko) 기능성 인플루엔자 바이러스 유사입자
US8506967B2 (en) Functional influenza virus like particles (VLPs)
US20140193447A1 (en) Functional influenza virus-like particles (vlps)
JP2000253876A (ja) センダイウイルスベクターを用いたワクチンおよびワクチンタンパク質
EP2374894B1 (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
EP1275726B1 (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
CN101353375A (zh) 生产流感血凝素多价疫苗的方法
AU733191B2 (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
HK1083867B (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
HK1017711B (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
HK1017711A1 (zh) 生產流感血凝素多價疫苗的方法
CN101365481B (zh) 犬流感病毒及相关组合物和使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20150526