CZ301021B6 - V podstate cistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chripkový HAO hemaglutininový protein, vektor pro výrobu rekombinantního HAO hemaglutininového proteinu, zpusob výroby uvedeného proteinu a vakcína obsahující uvedený protein - Google Patents

V podstate cistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chripkový HAO hemaglutininový protein, vektor pro výrobu rekombinantního HAO hemaglutininového proteinu, zpusob výroby uvedeného proteinu a vakcína obsahující uvedený protein Download PDF

Info

Publication number
CZ301021B6
CZ301021B6 CZ0373897A CZ373897A CZ301021B6 CZ 301021 B6 CZ301021 B6 CZ 301021B6 CZ 0373897 A CZ0373897 A CZ 0373897A CZ 373897 A CZ373897 A CZ 373897A CZ 301021 B6 CZ301021 B6 CZ 301021B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
influenza
protein
hemagglutinin
recombinant
leu
Prior art date
Application number
CZ0373897A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ373897A3 (cs
Inventor
Eugene Smith@Gale
Volvovitz@Franklin
E. Wilkinson@Bethanie
I. Voznesesnsky@Andrei
Stanway Hackett@Craig
Original Assignee
Protein Sciences Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27508642&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ301021(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Protein Sciences Corporation filed Critical Protein Sciences Corporation
Publication of CZ373897A3 publication Critical patent/CZ373897A3/cs
Publication of CZ301021B6 publication Critical patent/CZ301021B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/816—Viral vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Rešení se týká v podstate cistého, rekombinantního, zralého, glykosylovaného chripkového HAO hemaglutininového proteinu, exprimovaného v bakulovirovém expresním systému v kultivovaných hmyzích bunkách, který je purifikovaný do 95% nebo vyšší cistoty a je imunogenní a indukuje ochrannou imunitní odezvu pri použití jako vakcína, jakož i vektoru pro výrobu tohoto proteinu, zpusobu výroby uvedeného proteinu a vakcíny obsahující uvedený protein.

Description

Vynález se týká v podstatě čistého, rekombinantního, zralého, glykosylovaného chřipkového HAO hemaglutininoveho proteinu, vektoru pro výrobu rekombinantního HAO hemaglutininové10 ho proteinu, způsoby výroby uvedeného proteinu a vakcíny obsahující uvedený protein
Dosavadní stav techniky t5 Každoročně v celém světě propukají epidemie chřipky, které způsobují značnou nemocnost a úmrtnost. Chřipkový vir nejčastěji napadá děti, které se velkou měrou podílí na přenosu virů chřipky ve společnosti. U starých osob a osob se zdravotními problémy existuje v případě inťikace chřipkovým virem zvýšené riziko vzniku možných komplikaci a s nimi spojené hospitalizace. V samotných Spojených státech amerických způsobil zápal plic a chřipka v letech 1956 až 1988 během každé chřipkové sezóny více než 10 000 úmrtí a každou druhou sezónu bylo zaznamenáno dokonce více než 40 000 úmrtí (Update: Influenza Activity - United States and Worldwide, and Composition of the 1992-1993 Influenza Vaccine, Morbidity and Mortality Weekly Report. U.S. Departmente of Health and Human Services, Public Health Service, 41/No. 18: 315-323, 1992). Chřipkové, viry jsou vysoce pleomorfní částice, tvořené dvěmi povrchovými glykoproteiny, hemaglutininem (HA) a neuraminidázou (NA). HA zprostředkovává navázání viru na hostitelskou membránu a fúzi viro-buněčné membrány během pronikání viru do buňky. Genom chřipkového viru je tvořen osmi jednořetězcovými protismyslnými RNA segmenty z nichž Čtvrtý největší segment kóduje HA gen. Chřipkové viry jsou rozděleny na základě antigenových diferenciací na typ A, B a C. Viry chřipky A popisuje nomenklatura, jejíž součástí je označení podty30 pu nebo typu, geografické místo původu, počet řetězců a rok izolace, například A/Beijing/353/89. Existuje alespoň 13 podtypů HA (H1-H13) a devět podtypů NA (N1-N9). Všechny tyto podtypy byly nalezeny u ptáků, ale u lidí, prasat a koní byly zjištěny pouze H1-H3 a N1-N2 (Murphy and Webster, „Orthomyxoviruses“, in Virology, ed. Fields, Β. N., Knipe, D.M., Chanock, R.M., 1091-1152 (Raven Press, New York, (1990)).
Protilátky, jejichž úkolem je HA neutralizace viru a vytvoření báze pro vytvoření přirozené imunity proti infekci způsobené chřipkou, popisuje například Clements v článku „Influenza Vaccines“ ve Vaccines: New Approaches to Immunological Problems, ed. Ronald W. Ellís str. 129150 (Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA 1992). Antigenová variace v HA molekule je často zodpovědná za propuknuti chřipky a omezenou imunizační kontrolu infekce.
Trojrozměrná struktura HA a interakce s jejím celulámím receptorem, kyselinou sialovou, byla extenzivně studována (Wilson a kol., Structure of the hemagglutinin membrane glykoprotein of influenza virus at 3A’ rozlišení“ Nátuře 289: 366-378 (1981); Weis a kol., „Structure of the influenza virus hemagglutinin completed with its receptor, sialic acid“ Nátuře. 333: 426-431 (1988); Murphy and Webster, 1990). HA molekula je ve virionu přítomna jako trimer. Každý monomer existuje ve formě řetězců HA1 a HA2, vázaných jednoduchou disulfídovou vazbou. Infikované hostitelské buňky produkují prekurzorový glykosylátovaný polypeptid (HAO) s molekulovou hmotností přibližně 85 000, který se následně rozštěpí na HA 1 a HA2.
Přítomnost chřipky, HA-specificky neutralizující IgG a IgA protilátku, souvisí s rezistencí vůči infekci a nemoci (Clements, 1992). Celý inaktivovaný virus nebo částečně vyčištěné (podjednotka získaná sestřihem) vakcíny proti chřipce jsou standardizovány tak, že obsahují určité množství HA z každého řetězce. Chřipkové vakcíny zpravidla obsahuji 7 až 25 pg HA z každého ze zmíně55 ných tří řetězců chřipkového viru.
Role dalšího hlavního povrchového glykoproteinu, NA, pokud jde o ochrannou imunitu protilátky nebo T-buněčné odezvy na chřipkové viry, nebyla doposud definována. Neuraminídáza je v případě čištění a skladování velmi nestálá (Murphy a Webster, 1990) a množství NA v součas5 ně používaných vakcínách proti chřipce není standardizováno. Vyčištěná HA, ale nikoli v NA vakcína chrání před onemocněním zvířata napadená chřipkou (Johansson a kol, „Purified influenza virus hemagglutinin and neuraminidase are equivalent in stimulation of antibody response but induce contrasting types of immunity to infection“ J. Virology. 63: 1239-1246 (1989)). Ukázalo se, že experimentální vakcína na bázi neuraminidázového antigenu neposkytuje člověku io ochranu (Orga a kol., J. Infect. Dis. 135:499-506 (1977)).
Vakcíny proti chřipce, na které bylo uděleno povolení, jsou tvořeny formalinem inaktivovanými podtypy virů (H1N1 a H3N2) influenzy A a jedním podtypem virů influenzy B nebo přípravky, tvořenými podjednotkami získanými chemickým štěpením těchto virů. Před každým chřipkovým is obdobím doporučuje „U.S. Food and Drug Administration s Vaccines and Related Biologicals
Advisory Comittee“ pro nadcházející období použití trojvalenční vakcíny proti chřipce. Vakcíny, používané vletech 1992 až 1993 obsahovaly viry podobné virům A/Texas/36/91-(HlNl), A/Beijing/353/89-H3N2 a B/Panama/45/90, FDA navrhla, aby v letech 1993 až 1994 vakcína proti chřipce obsahovala stejné texaské a panamské kmeny a nový kmen influenzy A Beijing (A/Beijing/32/92).
Vakcinace vysoce rizikových osob, prováděná každoročně před vypuknutím chřipkového období, je nej účinnějším opatřením pro snížení možnosti infikace chřipkovým virem. Nízká četnost použití, slabá účinnost u starších osob a u mládeže, produkce ve vejcích, antigen ní variace a nežádoucí reakce jsou omezujícími faktory současně dostupných vakcín.
Centrum pro kontrolu chorob (CDC) odhaduje, že je proti chřipce každoročně vakcinováno méně než 30% rizikových jedinců (MMWR, 1992). Současné inaktivované vakcíny dosahují vysoké úspěšnosti při ochraně proti onemocnění ve skupině normálních zdravých jedinců, pokud jsou antigeny vakcíny a antigeny cirkulujících virů influenzy blízce příbuzné. Ve skupině starších osob je úspěšnost prevence proti onemocnění mnohem nižší, zejména v případě, kdy jsou tyto starší osoby umístěny v ústavech (Clements, 1992), Nedávné studie zpracované Powersem a Belsheem, J. Inf. Dis. 167: 584-592 (1993), uvádí, že podstatnější odezvy protilátky na trojvalenční subvirionovou vakcínu proti chřipce byly pozorovány u méně než třiceti procent osob ve věku 65 let nebo starších.
Zárodečné viry pro vakcíny influenzy A a B jsou přirozeně se vyskytující kmeny, které se replikují do vysokých titrů v alantoické dutině vajec kuřat. Alternativně je kmenem viru influenzy A přeuspořádaný vir se správnými povrchovými antigenními geny. Přeuspořádaný vir je tako40 vý vir, který má v důsledku segmentace virového genomu vlastnosti všech parentálních kmenů. Pokud buňku infikuje více než jeden kmen viru influenzy, potom se tyto segmentované viry smísí a vytvoří progenní virion, který obsahuje virová přeskupení genů z obou rodičovských kmenů.
Ochrana pomocí současně používaných vakcín proti chřipce, tvořených celými podtypy virů nebo jejich segmenty, je krátkodobá a její účinnost ještě snižuje výskyt antigenního posunu v epidemických kmenech chřipky. Viry influenzy podléhají antigennímu posunu, který je výsledkem imunitní selekce vírů se změnami aminokyselinové sekvence v molekule hemaglutínínu. V ideálním případě virové kmeny vakcíny odpovídají virovým kmenům influenzy, které způsobují onemocnění. Nicméně současná produkce chřipkových vakcín je omezena propagací víru v oplodně50 ných kuřecích vejcích. Ne všechny kmeny viru influenzy se dobře replikují ve vejcích; je tedy třeba viry přizpůsobit nebo realizovat virová přeskupení. V hemaglutininu virů influenzy vypěstovaných ve vejcích se objevila extenzívní heterogenita v porovnání s primárními izoláty, izolovanými z infikovaných jedinců, rostoucími v savčích buňkách (Wang a kol., Viril. 171: 275-279 (1989); Rajakumar a kol,, Proč. Nati. Acad, Sci. USA 87: 4 154—4 158 (1990)). Změny v HA v průběhu selekce a produkce chřipkových vakcín mohou mít za následek vznik směsi antigenoCZ 301021 B6 vě distrinktních subpopulact viru. Viry ve vakcíně se mohou tedy lišit od variant přítomných v epidemických kmenech, což může mít za následek nižší úroveň ochrany.
U osob trpících vážnou alergií na vejce může zbytek vaječného proteinu ve vakcíně způsobit střední hypersenzitivní reakce. Prasečí chřipková vakcína byla v roce 1976 dávána do souvislosti se zvyšující se četností výskytu Guillain-Barré syndromu. U následných vakcín, připravených z dalších virových kmenů influenzy, nebyl již dále pozorován zvýšený výskyt tohoto vzácného onemocnění.
io Způsobem výroby chřipkové vakcíny, který nevyžaduje propagaci ve vejcích, lze získat čistší produkt, u kterého bylo méně pravděpodobné, že způsobí nežádoucí imunitní reakci. Kromě toho by čistší vakcínový přípravek nevyžadoval virovou inaktivaci nebo organickou extrakci složek virové membrány, čímž by se eliminovala denaturace antigenových epitopů a vyloučily by se reziduální chemikálie, které mohou nežádoucím způsobem ovlivnit bezpečnost nákazy.
Kromě toho chřipková vakcína, vyrobená za nepřítomností vaječné propagace, by zabránila genetické heterogenitě, která se objevuje při přizpůsobování a průchodem vejci. Výsledkem toho je, že se vakcína lépe přizpůsobí chřipkovým epidemickým kmenům a bude mít vyšší účinnost.
Cílem vynálezu by rovněž mělo být poskytnutí způsobů výroby chřipkové vakcíny, která nevyžaduje replikaci ve vejcích.
Cílem vynálezu by mělo být poskytnutí způsobu výroby chřipkové vakcíny, který by byl rychlý, čistý a ekonomicky efektivní a který by umožňoval vyrábět vakcíny z primárních chřipkových zdrojů,
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je v podstatě čistý, rekombínantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein exprimovaný v bakulovirovém expresním systému v kultivovaných hmyzích buňkách, který je purifikovaný do 95% nebo vyšší čistoty a je imunogenní a indukuje ochrannou imunitní odezvu při použití jako vakcína. Výhodně v podstatě čistý, rekombínantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein dále zahrnuje bakulovtrový signální peptid, který se váže přímo na HAO protein bez intervenujících aminokyselin. Výhodně v podstatě čistý, rekombínantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein je dále sdružen s farmaceuticky přijatelným nosičem pro podání ve formě vakcíny. Výhodně v podstatě čistý, rekombínantní zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein je dále sdružen s adjuvans a farmaceuticky přijatelným nosičem pro podání ve formě vakcíny.
Výhodně je farmaceuticky přijatelným nosičem polymemí systém pro dopravu proteinu. Výhodně se chřipkový HAO hemaglutininový protein zvolí z množiny sestávající z kmenů chřipky A, kmenů chřipky B, kde výhodně virový kmen chřipky infikuje lidi. Výhodně v podstatě Čistý, rekombínantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein je dále sloučen s druhým proteinem, který se váže na hemaglutinin. Výhodně je druhý protein zvolen z množiny sestávající z virových proteinů hepatitidy B, HIV proteinů, karcinoemryonálního antigenu a neuraminidasy.
Předmětem vynálezu je rovněž vektor pro výrobu rekombinantního chřipkového HAO hemaglutininového proteinu obsahujícího následující R'—► 3' sekvence: polyhedrinový promotor signální zbakuloviru, ATG translační startovací kodon, peptid, sekvence kódující zralý hemaglutinin z chřipkového kmene, trans lační terminační kodon a polyhedrinový RNA polyadenylaění signál. Výhodně je signálním peptidem bakulovirový protein mající molekulovou hmotnost přibližně 61 kDa a aminokyselinovou sekvenci tvořenou prvními aminokyselinami sekvence ID No. 7. Výhodně je signálním peptidem chřipkový hemaglutininový proteinový promotor. Výhodně sekvence kódující signální peptid a hemaglutinin nekódují žádnou intervenující aminokyselinu.
_ 7 .
Výhodně vektor pro výrobu rekombinantního chřipkového HAO hemaglutininového proteinu dále zahrnuje sekvenci kódující druhý protein, který se exprimuje jako fúzní protein s hemaglutininem. Výhodně je vektor transfekován v kultivovaných hmyzích buňkách.
Předmětem vynálezu rovněž způsob výroby výše definovaného rekombinantního chřipkového hemaglutininového proteinu, jehož podstata spočívá vtom, že se kultivované hmyzí buňky infikuji vektorem obsahujícím následující 5' —>3' sekvence: polyhedrinový promotor z bakuloviru, ATG translační startovací kodon, signální peptid, sekvence kódující hemaglutinin z chřipkového kmene zvoleného ze skupiny sestávající z chřipkového kmenu A a chřipkového kmenu B, io translační terminační kodon a polyhedrinový RNA polyadenilační signál, buňky se následně kultivují v živném prostředí a protein se izoluje z hmyzích buněk.
Výhodně se HAO chřipkový hemaglutininový protein izoluje z buněk v alespoň 95% čistotě. Výhodně se protein izoluje separací hemaglutininu z membránových proteinů při alkalickém pH, promytím proteinů navázaných na membránu, při kterém se eluuje hemaglutinin, separováním hemaglutininu od dalších proteinů navázáním na aniontoměničovou pryskyřici změnou pH, aseparováním hemaglutininu od ostatních proteinů navázáním na kationtoměniěovou pryskyřici změnou koncentrace soli. Výhodně se vektor připraví tak, že se vir sklidí z buněčného média a v případě chřipkových kmenů A se izoluje virová RNA, nebo v případě chřipkových kmenů B se izoluje mRNA; cDNA se syntetizuje za použití univerzálního primerů (5-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID No. 1) pro virovou RNA z chřipkových kmenů A nebo se z chřipkových kmenů B syntetizuje nahodilý primer tvořící mRNA, přičemž primery 5' a 3' mají na koncích, které se nenalézají uvnitř hemaglutininových genů, restrikční enzymová místa; chřipkové A nebo B primery a chřipková cDNA smísená se segmenty hemaglutininového genu se amplifíkují za vzniku dvouřetězcových DNA fragmentů obsahujících celé sekvence kódující zralý hemaglutidin; identifikuje se signální peptid hemaglutininových genů, načež se amplifíkují hemaglutininové geny bez signálního peptidu; a klonují do vektoru obsahujícího AcNPV polyhedrinový promotor, Výhodně se hemaglutininové geny klonují do vektoru za použití PCR tak, že vektor kóduje signální peptid navázaný přímo na hemaglutinin bez intervenujících aminokyselin. Výhodně se vektor transfekuje do hmyzích buněk a vyberou se buňky pro hemaglutininovou expresi.
Předmětem vynálezu je také vakcína, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje zralý glykosylovaný hemaglutininový protein, který dále obsahuje bakulovirový signální peptid navázaný přímo na hemaglutininový protein bez intervenujících aminokyselin, jakož i farmaceuticky přijatelný nosič. Výhodně vakcína dále obsahuje adjuvans. Výhodně je farmaceuticky přijatelným nosičem polymemí systém pro dopravu.
Předmětem vynálezu je rovněž vakcína, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje zralý glykosylovaný hemaglutininový protein obsahující druhý protein, který je navázán na hemaglutinin, jakož i farmaceuticky přijatelný nosič. Výhodně je druhým proteinem neuraminidasa. Výhodně vakcína obsahuje dále adjuvans.
Vynález rovněž popisuje obecný přístup pro účinnou extrakci a purifikaci rekombinantního proteinu produkovaného v hmyzích buňkách, konkrétně pro purifikaci rHA proteinů z A podtypů a B typu chřipkových virů. Rekombinantní vakcínu lze vyvinout spíše z primárních zdrojů chřipky, například z nazálních sekretů infikovaných jedinců, než z viru přizpůsobeného a kultivovaného v kuřecích vejcích. To umožňuje rychlý vývoj vakcíny přímo z epidemických kmenů chřipky a eliminuje problémy spojené s přizpůsobováním viru kultivaci ve vejcích a rovněž eliminuje reakci pacientů na vaječnou kontaminaci ve výsledné vakcíně.
Příklady demonstrují formulaci a klinickou účinnost vakcíny v imunizující dávkové formě, zahrnující purifíkované rHA antigeny ze tří kmenů chřipkového viru, doporučených FDA pro 1993/1994 a 1994/1995 chřipková epidemická období. Funkční imunita se měřila pomocí testů, které kvantifikovaly protilátky, které se váží na chřipkový hemaglutinin blokující schopnost chřipkového viru srážet červené krvinky nebo které neutralizují chřipkový virus. Ochranné imuCZ 301021 B6 nitní odpovědi na rHA vakcíny se měřily u živočichů, kteří jsou citliví na chřipkovou infekci nebo v rámci humánních imunologických studií.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 schematicky znázorňuje klonování HA genů z chřipkových A kmenů z puntíkovaných virálních RNA přípravků, purifikaci exprimovaného rHA a biologickou charakterizaci rHA. Zkratky použité obrázcích mají následující význam:
io
FDA - Foood and Drug Administration;
MDCK - (Madin Darby Canine Kidney) ledviny psa Madin Darby;
TPCK - tosylfenylalanylchloromethylketon;
RNA - ribonukleová kyselina;
cDNA - komplementární deoxyribonukleová kyselina;
HA - hemaglutinin;
FBS - fetální bovinní sérum;
PCR - polymerázová řetězová reakce; a BV - bakulovirus.
Obr. 2 detailněji znázorňuje způsob, schematicky znázorněný na obrázku 1, aplikovaný na klonování a expresi HA genu chřipkového kmene A/Texas/36/91. Chřipkový HA gen se získal z RNA purifikované z MDCK buněk infikovaných chřipkovým kmenem influenza A/Texas/36/91 pomocí reverzní transkriptázy a univerzálního primeru (SEQ ID NO. 1), a následných dvou cyklů PCR amplifikace a klonování. Při prvním cyklu PCR reakcí se použil 5' koncový primer SEQ ID NO. 2 a 3' koncový primer SEQ ID NO. 3. Při druhém cyklu PCR reakcí se použil 5' koncový primer SEQ ID NO. 4 a 3' koncový primer SEQ ID NO. 5. Zkonstruoval se bakulovirový rekombinantní vektor obsahující polyhedrinový promotor a signální peptidovou sekvenci z bakulovirového 61K genu (bakulovirový gen, který kóduje signální peptid mající molekulovou hmotnost přibližně 61 000) a následně kompletní kódující sekvence pro zralý HA protein. Tento rekombinantní vektor se následně použil pro produkci bakulovirového expresního vektoru, který produkuje HA z tohoto kmene viru.
Obr. 3 znázorňuje graf anti-HA imunitní odezvy u myší ve 42. dni, n=5, na titr protilátky pro čistý rHAO; vakcíny Fluzone; a rHAO-kamence; při dávkách 0,5 gg (černé sloupce), 0,1 gg (stínované sloupce), 0,02 gg (tečkované sloupce) a 0,004 gg (bílé sloupce).
Obr. 4a, 4b a 4c znázorňují grafy anti-HA imunitní odezvy u myší imunizovaných rHA nebo schválenou trojvalenční vakcínou, 1994-1995 formule, v týdnech po vakcinaci vs. HIA titru pro
HAI A/Texas/36/91 (obrázek 4a), HAI A/Shangdong/9/93 (obrázek 4b) a HAI B/Panama/45/90 (obrázek 4c), rHA (kosočtverce) a FLUVIRON zeslabené vakcíny kultivované ve vejcích (čtverečky).
Jak již bylo uvedeno, vynález se týká způsobu výroby rekombinantní chřipkové vakcíny.
Celodélkový, neštěpený (HAO), hemaglutininový antigen z chřipkového viru se produkuje pomocí bakulovirových expresních vektorů v kultivovaných hmyzích buňkách a purifíkuje za nedenaturačních podmínek. Dva nebo více purifikovaných hemaglutininových antigenů z kmenů influenzy A a/nebo influenzy B se smísily za vzniku multivalenční chřipkové vakcíny. Účinnost rekombinantních antigenů lze zvýšit jejich sloučením s nosičem adjuvansu.
Použití rekombinantní DNA chřipkových vakcín nabízí řadu chřipkovou vakcínu lze vyrábět technologie při výrobě výhod: rekombinantní DNA za bezpečných a přísněji kontrolovaných podmínek; není zapotřebí propagace infekční influenzou ve vejcích; rekombinantní HA protein je
čistší, což v podstatě eliminuje vedlejší účinky způsobené kontaminujícími proteiny; purifíkační postupy pro rekombinantní HA nesmí zahrnovat virovou inaktivací nebo organickou extrakci virálních membránových složek, čímž se eliminuje denaturace antigenů; produkce HA rekombinantní DNA technologií dává možnost eliminovat genetickou heterogenitu, ke které dochází během adaptace a průchodu vejci, což by mělo umožnit lépe přizpůsobit vakcínové kmeny epidemickými kmeny influenzy A dosáhnout tak vyšší účinnosti; přičemž rekombinantní přístup rovněž umožňuje provádět kmenovou selekci později v průběhu roku, čímž se získá delší čas pro shromáždění a vyhodnocení spolehlivějších epidemiologický dat, na jejichž základě se zmíněná selekce provede.
io
Bakulovirový expresní systém
Jako bakuloviry se označují DNA viry spadající do rodiny Baculoviridae. Je známo, že tyto viry mají úzké hostitelské rozmezí, které se omezuje zejména na hmyzí druhy Lepídoptery (motýly !5 a můry). Bakulovirus Autographa califomica Nuclear Polyhedrosis Virus (AcNPV), který se stal prototypem bakulovíru se účinně replikuje v úspěšně pěstovaných hmyzích buňkách. AcNPV má dvouřetězcový uzavřený kruhový DNA genom tvořený přibližně 130 000 bazickými páry a je dobře charakterizován pokud jde o hostitelské rozmezí, molekulární biologii a genetické vlastnosti.
Mnoho bakulovirů včetně AcNPV, tvoři velké proteinové krystalické okluze uvnitř jader infikovaných buněk. Jediný polypeptid, označený jako polyhedrin, má na svědomí přibližně 95 % proteinové hmoty těchto okluzních těl. Gen pro polyhedrin je přítomen v jediné kopii v AcNPV virovém genomu. Vzhledem k tomu, že polyhedrinový gen není podstatný pro virovou replikací v kultivovaných buňkách, může snadno modifikovat expresi cizích genů. Sekvence cizího genu se vloží do AcNPV genu právě 3' koncem k polyhedrínové promotorové sekvenci, tj. za transkripční kontroly polyhedrinového promotoru.
Rekombinantní bakuloviry, které exprimují cizí geny se konstruují homologíckou rekombinací mezi DNA bakulovíru a chimérickými plasmidy obsahujícími sledovanou genovou sekvenci. Rekombinantní viry lze detekovat pomocí jejich odlišitelné plakové morfologie a purifikovat z plak do homogenity.
Bakuloviry jsou použitelné zejména jako eukaryotické klonovací a expresní vektory. Díky svému úzkému hostitelskému rozhraní, které se omezuje na artropody, jsou obecně bezpečné. US úřad pro ochranu životního prostředí (EPA) schválil použití tri bakulovirových druhů pro kontrolu škodlivého hmyzu. AcNPV se již několik let aplikuje na zemědělské plodiny.
AcNPV standardní typ a rekombinantní viry se replikují v celé řadě různých hmyzích buněk včetně kontinuálních buněčných linií odvozených ze Spodoptery frugiperdy (Lepidoptera; Noctuidae). Čas zdvojení u buněk S.frugiperda je 18 až 24 hodin. Tyto buňky se mohou propagovat v monovrstvě nebo volných suspenzních kulturách.
Rekombinantní HA proteiny se mohou produkovat například v buňkách odvozených z motýlích druhů Spodpotera frugiperda. Dalšími hmyzími buňkami, které lze infikovat bakulovirem, jsou například buňky druhů Bombix moři, Galleria mellanoma, Trichplusia ni nebo Lamanthria dispar, které lze rovněž použít jako vhodný substrát pro produkci rekombinantních HA proteinů.
Nej výhodnější hostitelskou buněčnou linií pro produkci proteinů z rekombinantních bakulovirů je so SF900+. Další výhodnou hostitelskou buněčnou linií pro produkci proteinů z rekombinantních bakulovirů je Sf9. Sf900+ a Sf9 představují netransformované, netumorigenové kontinuální buněčné linie odvozené ze Spodoptery frugiperdy (Lepidoptera; Noctuidae). Buňky SÍ900+ a Sf9 se propagují při 28 ± 2 °C bez obohacení oxidem uhličitým. Kultivačním médiem použitým pro buňky Sf9S je TNMFH, prostá směs solí, vitaminů, cukrů a aminokyselin, doplněná 10% fetál55 ním bovinním sérem. S výjimkou fetálního bovinního séra se žádné další produkty odvozené ze zvířat (tj. trypsin atd.) při buněčné propagaci nepoužívají. Pro růst buněk Sť9 lze rovněž použít séra prosté kultivační médium (dostupné jako SÍ900 kultivační médium, Gibco BRL, Gaithersburg, MD), které je vhodné zejména pro propagaci buněk Sf900+.
Doba populačního zdvojení buněk Sf9 je 18 až 24 hodin, tyto buňky se mohou propagovat jako monovrstva nebo jako volné suspenzní kultury. Doposud nebylo zveřejnéno, že by buňky 5. frugiperdy podporovaly replikaci jakéhokoliv známého savčího viru.
Odborníkům v daném oboru je zřejmé, že expresní vektor se neomezuje pouze na bakulovirový ío expresní systém. Rekombinantní HA proteiny se rovněž mohou exprimovat v dalších expresních vektorech, například virech Entomopox (virus hmyzího moru) a hmyzí buňky se potom mohou transformovat konstituční expresí rekombinantního HA genu nebo genů.
Izolace kmenů influenzy
Z těl jedinců infikovaných chřipkou se izoloval jeden nebo několik kmenů influenzy. Výhodně jsou kmeny influenzy ty kmeny, které identifikoval Úřad pro potraviny a léčiva (FDA) nebo CDC, které mají epidemický potenciál pro následující chřipkové období. Výhodou zde popsaného způsobu je to, že jako přímý zdroj viru lze použít například nazální sekrety pacientů infíkova20 ných chřipkou. Alternativně lze viry získat z FDA nebo CDC.
Propagace kmenů influenzy
Kmeny se dále propagovaly v buňkách produkujících vysoké virové titry, například v Madin
Darby psích ledvinových (MDCK) buňkách (dostupných ve sbírce American Type Culture Colection pod přístupovým číslem ATCC CCL34). Například MDCK buňky se infikují v přítomnosti tosylfenylalanylchloromethylketonem (TPCK) částečně inaktivovaném trypsinu a v takových koncentracích fetálního bovinního séra, které jsou optimální pro produkci vysokých titrů prvního viru. MDCK buňky se infikovaly chřipkovými kmeny při nízké násobnosti infekce (0,1 až 0,5), jak určil standardní HA test (Rosen, „Hemagglutination with Animal Viruses“ in Fundamental Techniques in Virology, ed. K. Habel a N.P. Salzman, str. 276-28 (Academie Press, New York 1969). Infikované buňky se inkubovaly 48 hodin při 33 °C a médium se použilo pro testy, jejichž úkolem bylo určit hemagiutinační aktivitu a tedy virovou produkci. Podmínky poskytující nejvyšší HA aktivitu se následně použily pro přípravu velké zásoby viru influenzy.
Purifikace viru
Virové částice, produkované z první frakce, se purifikovaly z média za použití některé známé purifikační metody, například odstřeďování s hustotním gradientem sacharózy. Virus se napří40 klad sklidil 24 až 48 hodin po infikaci centrifugačním médiem MDCK buněk infikovaných influenzou. Výsledná virová peleta se resuspendovala v pufru a odstřeďovala přes pufrovaný sacharózový gradient. Pás chřipkového viru se sklidil ze 40 až 45 % sacharózového úseku gradientu, naředil pufrem a peletoval odstřeďováním při 100 000 x g. Purifikovaná virová peleta se resuspendovala v pufru skladovala při -70 eC.
Klonování hemaglutininových chřipkových genů
Přehled způsobů klonování HA genů poskytuje obrázek 1. Buňky jsou v podstatě infikovány chřipkovým kmenem, který se má klonovat. Virus se sklidí z buněčného média a izoluje se buď so virová RNA pro kmeny influenzy A, nebo mRNA pro kmeny influenzy B. Virová RNA (-RNA) se extrahuje z purifikovaných virionů a pomocí standardních metod analyzuje na formaldehydoagarózových gelech. cDNA se syntetizuje, buď za použití univerzálního příměrového systému v případě virové RNA izolované z kmenů influenzy A, nebo za použití nahodilých primerů v případě mRNA izolované z kmenů influenzy B. Plus-standardní komplimentámí DNA (cDNA) se připraví za použití univerzálního oligonukleotidového primeru (5 -AGCAAAAGCAGG-3' *7 (SEQ ID NO: 1)), který je homologický se všemi hemaglutininovými RNA segmenty ve virech influenzy A a B (Davis a kol., „Construction and characterization of a bacterial cloně containing the hemagglutinin gene of the WSN strain (HONÍ) of influenza virus“ Gene, 10: 205-218 (1980)). primery jsou navrženy tak, aby byly homologícké se zachovanými úseky na 5' a 3' kon5 cí chřipkových hemaglutininových genů. Jak 5', tak 3' primer má na svých koncích rovněž restrikční enzymatická místa, která se nacházejí v hemaglutininových genech.
Vhodné primery influenzy A a B a chřipková cDNA se smísí a pomocí standardních PCR postupů se amplifikují hemaglutininové genové segmenty. Výsledné dvouřetězcové DNA fragio menty obsahují sekvence kódující celý zralý hemaglutinin. Pro amplifikaci celého HA genu, který se následně nakloňuje do vhodného bakteriálního hostitele, jakým je například E. coli, se používá polymerázová řetězová reakce („PCR“). 5' konce se sekvencují s cílem identifikovat signální peptid HA genů, načež se pro amplifikaci HA genů bez signálního peptidu použije PCR.
Ten se následně nakloňuje do plasmidového transferového vektoru obsahujícího AcNPV poly15 hedrinový promotor. Výsledné transferové vektory obsahují následující 5' -> 3' sekvence: polyhedrinový promotor zbakuloviru A. californica NPV, ATG translační startovací kodon, 61K bakulovirový signální peptid, kódující sekvence pro zralý hemaglutin, přirozený hemaglutinový translační terminační kodon, polyhedrinový RNA polyadenylační signál a lemovací bakulovirovou DNA.
Purifikovaná DNA chimérického transferového plasmidu, která obsahuje klonovaný hemaglutininový gen se následně smísí s AcNPV standardním typem DNA, vysráží společně s vápníkem a transfektuje do buněk S. jrugiperdy. Rekombinantní bakuloviry se rozdělí za základě morfologie plak a dále purifikují dalšími cykly plakové purifikace. U klonovaných rekombinantních bakulovirů se určuje hemaglutininová exprese a jednotlivé bakulovirové expresní vektory se rozdělí tak, aby produkovaly základní virovou banku.
Kmeny influenzy A
HA geny z kmenů influenzy A se klonovaly z purifikovaných virových RNA přípravků. Vírová RNA se extrahovala ze 100 až 200 gl purifikovaných vírionů influenzy A, obsahujících 1000 až 2000 hemaglutinačních jednotek (HAU) influenzy. Jedna HAU odpovídá množství viru, které bude srážet 50 % červených krvinek ve standardním testu srážlivosti (Rosen, 1969), Viriony se ošetří proteinázou K, jejímž úkolem je digerovat protein a potom se virová DNA extrahuje shod35 nými objemy fenolu a chloroformu a vysráží ethanolem v přítomnosti tRNA nosiče. Virová RNA se resuspenduje v pufru a digeruje RNAzy-prostou DNAzou, jejímž úkolem je odstranit veškerou kontaminující DNA, načež se extrakční a srážecí krok zopakuje. Virová RNA (vRNA) se následně analyzuje za použití formaldehydoagarózových gelů způsobem, který popisuje Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Labolatory Manual. str. 86-96 a 366367 (Cold Spring Harbor Lab.,
Cold Spring, N.Y. 1982).
Kmeny influenzy B
HA geny z kmenů influenzy B se klonují z celkové mediátorové RNA (mRNA), extrahované z buněk infikovaných kmenem influenzy B. Celá RNA se následně extrahovala z infikovaných buněk. Sklizené buňky se lyžovaly v přítomnosti guanidiniumthiokyanátu a celá buněčná RNA se purifikovala, například za použití RNA extrakční sady od společnosti Pharmacia Biotech lne. (Piscataway, NJ). Celá mRNA se extrahovala z buněčné RNA na Oligo-(dT)-celulózových odstředěných kolonách, například pomocí RNA extrakční sady od společnosti Pharmacia Biotech lne.
Exprese a zpracování rekombinantního hemaglutinínu v hmyzích buňkách
Rekombinantní hemaglutininové antigeny se exprimovaly ve vysoké koncentraci, v buňkách
5. frugiperda infikovaných AcNPV-hemaglutininovými vektory. Hlavním genovým produktem
CZ 301021 Bó je nezpracovaný celodélkový hemaglutinin (rHAO), který se nesekretuje ale zůstává spojen s periferními membránami infikovaných buněk. Tímto rekombinantním HAO je protein s molekulovou hmotností 68 000, který je glykosylátovaný N-navázaným vysokomanósovým typem glykanů, které se liší od glykanů produkovaných expresí virových proteinů v savčích nebo pta5 Čích buňkách. To dokazuje, že rHAO tvoří posttranslačně trimery, které se akumulují v cytoplazmatických membránách.
Vektory pro expresy HAO a dalších proteinů ío HAO je díky své vynikající stabilitě v porovnání sHAl/HA2 komplexem a díky zachování správného sbalení během purifikace a skladování lepší vakcínou. Vynikající stabilita je zvláště patrná v případě B kmenů, což se projevuje u titrů, které jsou přibližně 5krát větší než titry, získané pomocí komerčně dostupných, slabších, B kmenů.
Jak zmiňují níže uvedené příklady, pokud se HA geny klonovaly vpMGS12 přes restrikční místa, potom se HA zralý signální peptid odstranil a nahradil bakulovirovým chitínázovým signálním peptidem, označeným jako 61 kD signální peptid. Vzhledem k tomu, že HA gen je na chitinázový signální peptid navázán přes restrikční místa, jsou mezi zralým HAO proteinem a 61 kD signálním peptidem, v závislosti na zvoleném restrikčním místě, tři až pět aminokyselin. Přesto, že s kmenem influenzy A nebyly žádné problémy, kmen HAO B exprimovaný dalšími aminokyselinami se nesbalil správným způsobem.
Pro řešení tohoto problému byly vyvinuty dva způsoby. Prvním je použití nového vektoru, pMGS3, který nekóduje 61 kD signální peptid. HAO se svým přirozeným signálním peptidem se nakloňuje do vektoru a exprimuje. Při SDS-PAGE charakterizaci HAO B kmene exprimovaný v tomto vektoru, vykazuje lepší glykosylaci a zpracování, než pokud je exprimován v pMGS12. Tento HAO je sbalen tak dokonale, že ho lze kvantitativně převést na HA1/HA2. Naneštěstí, jak ukázal westernový přenos, výtěžek není tak vysoký. Druhý způsob zvyšuje výtěžek použitím 61 kD signálního peptidu v pMGS12 pro řízenou expresi, pri které se HAO gen inzertuje bez použití restrikčních enzymů. Nový vektor zahrnující 61kD signální peptid a HAO gen bez sekvence, kódující zevně intervenující aminokyseliny, je označen jako pMGS27.
pMGS27 může být použit pro klonování a expresi libovolného genu v bakulovirovém expresním systému. Cílový gen, namísto aby se klonoval do vektoru restrikcí a ligaci, se klonuje do vektoru temperací. Reakční činidla lze získat u společnosti Clontech v jejich PCR-řízeném klonovacím systému. pMGS27 je navržen tak, že může být linearizován na konci úseku, kódujícího chitinázový signální peptid, a dva dlouhé jednořetězcové konce lze vytvořit ošetřením linearizovaného pMGS27 T4 DNA polymerázou a dATP.
Cílový gen se amplifikuje pomocí polymerázové řetězové reakce („PCR“) nebo pomocí reverzní transkriptázové-PCR („RT-PCR“) s párem oligonukleotidů navržených tak, aby vytvořily jednořetězcové konce, které jsou komplementární s konci ošetřeného pMGS27, načež se PCR fragment ošetři T4 DNA polymerázou a dTTP. Pomoci prosté temperace lze následně sloučit dvě molekuly tak, že se vytvoří kruhový plasmid, který se snadno transformuje do hostitele. Kromě toho, že tento postup je rychlejší a snadnější než tradiční restrikčně—ligační způsob klonování HA genu do pMGS12, Je výhodou pMGS27 to, že neposkytuje nadbytečné aminokyseliny, kódované restrikčními místy mezi chitínázovým signálním peptidem a zralým HA proteinem. V některých případech, například v případě B kmene HA, může přítomnost nadbytečných aminokyseliny vést k tomu, že signální peptidáza nemůže rozštěpit signál nebo že se kódovaný protein sbalí nesprávným způsobem.
Purifikace rekombinantního HAO
Několik dní po infikaci lze rHAO selektivně extrahovat z periferních membrán AcNPV-hema55 glutininem infikovaných buněk nedenaturačním noniovým detergentem nebo dalšími způsoby,
Λ které jsou pro purifikaci rekombinantních proteinů z hmyzích buněk včetně afinitní nebo ge:ové chromatografie a navázání protilátek odborníkům v daném oboru známy. rHAO rozpustný v detergentů může být dále purifikován pomocí DEAE iontoměničové a čočkové lektinové afinitní chromatografie nebo dalších ekvivalentních metod, odborníkům v daném oboru známých.
U výhodného provedení se rHAO purifikuje postupem, který je opatrnější a jeho výsledkem je vyšší výtěžek rHAO z B kmenů influenzy. Tento postup je zpravidla následující.
HAO protein, který tvoří nedílnou součást membrány hmyzích buněk se separuje z rozpustných io proteinů, periferních membránových proteinů a většiny DNA a RNA extrakcí buněk v relativně viskózním roztoku alkálie, přičemž pH alkálie se pohybuje přibližně v rozmezí od 9,5 do 10,5.
Viskóza se zvyšuje v důsledku inkluze sacharózy při koncentraci přibližně 250 mM. Disulfidredukující činidlo, například β-merkaptoethanol, je použito v takové koncentraci, která účinně brání navázání proteinu ze směsi na disulfid. Buňky se suspendují v extrakčním pufru, homoge15 nizují a následně odstřeďují. Peleta se promyje homogenizací v pufru s nízkou iontovou silou, který obsahuje disulfid—redukující činidlo při alkalickém pH (vodivost je zpravidla menší než 1 mS, pH 10,5) a odstreďuje se. HAO se následně extrahuje z pelety v pufru, který obsahuje 0,3 až 1,5 % detergentů, například Tritonu a disagregační činidlo v množství, které brání tvorbě komplexů způsobené vzájemnými reakcemi mezi náboji, například 0,3 až 1,0 M betainu nebo paurinu, při alkalickém pH (výhodně 9,5). HAO v supematantu se následně purifikuje aniontoměničovou chromatografií a následnou kationtoměničovou chromatografií. HAO se ve stejném pufru, ve kterém se extrahoval ale který se naředí alespoň 1:2 dalším pufrem, aplikuje na iontoměničovou kolonu, například DEAE nebo Q-Sepharosa (agarózová kuličková kolona s kvartérními aminoskupinami), která se před tím uvedla do rovnovážného stavu pufrem, který obsahoval přibližně 1/10 koncentrace detergentů a disulfid—redukujícího činidla. HAO se následně eluuje snížením pH přibližně na 8,5. Eluovaný HAO se aplikuje na kationtoměničovou kolonu ve v podstatě stejném pufru. Kontaminující látky se eluují snížením pH přibližně na 7,4, a následně se HAO eluuje zvýšením koncentrace soli na 0,15 M NaCI.
Tento výhodný způsob purifikace bude podrobněji popsán níže.
Preparace rekombinantní HA-obsahující membránové frakce
Buňky exprimující rekombinantní HA (6,2 g buněk z 0,34 1 kultury) se suspendují při 100 mg/ml v ledově studeném 100 mM pyrofosfátu sodném, 100 mM chloridu sodného, 250 mM sacharózy, 0,1% β-merkaptoethanol, pH 10,5. Buňky se rozrušily pomocí homogenizéru Polytron (Brinkman Instruments lne., Westbuiy, NY) při dvouminutovém nastavení 4. Pro zvýšení rozpustnosti kontaminujících proteinů a zvýšení čistoty membránového přípravku je třeba použít alkalické pH homogenizačního média. Homogenizát se odstreďuje 30 minut pří 9 200 g, Supematant se rozruší a pelety se shromáždí. Po preparaci membránové frakce následuje promývací krok, ve kterém se membránová frakce promývá roztokem s nízkou iontovou silou. Peleta se resuspenduje do původního objemu v ledově studeném 0,1 % β-merkaptoethanolu, 10,5, a homogenizuje za použití homogenizeru Polytron při dvou minutovém nastavení 4. Homogenizát se odstřeďuje 30 minut při 9200 g. Supematant se odstraní a pelety se seberou. Tento průplach s nízkou iontovou silou odstraní další část periferních membránových proteinů. Preparace membránové frakce vede ke značnému obohacení rekombinantního HA a k odstranění kontaminujících nukleových kyselin.
Extrakce rekombinantního HA
Rekombinantní HA se následně selektivně extrahuje z membránové pelety za podmínek, které nedenaturují antigen. Membránová peleta se homogenizuje ve 41 ml ledově studeného lOmM ethanolaminu, pH9,5, 1% Tritonu N101, 0,1% β-merkaptoethanolu, 25 mM NaCI a 400 mM betainu za použití homogenizéru Polytron při dvouminutovém nastavení 4. Po čtyricetiminutové inkubaci při 23 °C se směs odstřeďuje 30 minut při 9200 g. Supematant obsahující rekombinant55 ní HA se oddekantuje a naředí na dvojnásobek stejným pufrem.
Proteiny se analyzují pomocí SDS polyakrylamídové gelové elektroforézy. Vzorky se rozruší desetiminutovým pobytem ve vroucí vodní lázni v přítomnosti 2% dodecylsulfátu sodném (SDS) a 5% β-merkaptoethanolu, podrobí elektroforéze na 11% polyakiylamidovém gelu v přítomnosti
0,1% SDS a následně se zabarví modří Coomassie.
Chromatografická purifikace
Chromatografická purifikace rekombinantního HA se zjednoduší a drahá afinitní chromatografie io na čočkové lectin-sepharóze se z procesu vyloučí a nahradí dvoustupňovým chromatografickým purifikačním procesem, který poskytne vysoce purifikovaný rekombínantní HA antigen, který není denaturován a lze vhodně použít jako složka chřipkové vakcíny pro humánní aplikaci. Jako chromatografické gelové matrice se použily matrice Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow a CMSepharose Fast Flow.
Aniontoměničová chromatografie
Celá chromatografie se provádí při pokojové teplotě. Extrakt, který obsahuje rekombínantní HA, připravený výše popsaným způsobem se aplikuje rychlostí 1 ml/min na Pharmacia Q-Sepharose
Fast Flow (5 ml v koloně Cl0/10 Pharmacia), která se předtím uvede do rovnovážného stavu 10 mM ethanolaminem pH 9,5, 0,1% tritonem N101, 0,01% β-merkaptoethanolem, 25 mM NaCI a 400 mM betainem. Kolona se potom promývá vyrovnávacím pufřem, dokud se DV absorbance odtékající látky nevrátí zpět na počáteční hodnotu. Za těchto podmínek se rekombínantní HA váže na kolonu, zatímco část kontaminujících látek proudí touto kolonou bez zachycení. Částečně purifikovaný rekombínantní HA se následně eluuje 30 mM diethanolaminu pH 8,5, 0,1% Tritonem N101,0,01 % β-merkaptoethanolem, 25 mM NaCI a 400 mM betainem.
Kationtoměničová chromatografie
Q-Sepharosový eluát (23 ml) se naředí na dvojnásobný objem 30 mM diethanolaminem pH 8,5, 0,1% Tritonem NI01, 0,01% β-merkaptoethanolem, 10 mM NaCI a 400 mM betainem. Kolona se následně promyje 35 ml 10 mM fosforečnanem sodným pH 7,4, 0,1% Tritonem N101, 0,01% β-merkaptoethanolem, 10 mM NaCI a 400 mM betainem. Toto ošetření eluuje kontaminující látky z kolony, zatímco rekombínantní HA zůstane navázaný na CM Sepharose. Detergent se následně odstraní promýváním kolony 10 mM fosforečnanem sodným pH 7,4, 10 mM NaCI, které se ukončí až potom, co UV absorbance proudu vytékajícího z kolony dosáhne opět své počáteční hodnoty. Purifikovaný rekombínantní HA se eluuje fosfátem pufřovaným fyziologickým roztokem, pH 7,5 (PBS).
Purifikovaný rHAO se resuspenduje v isotonickém pufrovaném roztoku. Po odstranění detergentu bude purifikovaný HAO účinně aglutinovat červené krvinky.
Strukturní a biochemické vlastnosti rekombinantního HAO rHAO se purifikuje do dosažení alespoň 95% čistoty, výhodněji do dosažení 99% čistoty. Na SDS-polyakrylamidovém gelu migruje, převážně jako jediný, hlavní polypeptid s molekulovou hmotností 68 000. Kvartémí struktura purifikovaného rekombinantního HAO antigenu se určuje pomocí elektronové mikroskopie, trypsinové resistence, hustotní sedimentační analýzy a schopnosti aglutinovat červené krvinky. Z výsledků těchto testů vyplývá, že rekombínantní
HAO tvoří trimery, které se sestavují do tvaru růžic.
Purifikovaný rHAO neaglutinuje před odstraněním detergentu buňky, z Čehož vyplývá, že aby se antigen mohl křížově navázat na červené krvinky kuřete, musí vytvořit komplexy (růžice). Kvantitativní schopnost purifikovaného rHAO aglutinovat buňky se využívá jako (lot—to—lot) míra konzistence antigenu. Hemaglutininová jednotka se definovala jak množství antigenu, které je
I potřebné pro dosažení 50% aglutinace ve standardním hemaglutininovém testu, prováděném na červených krvinkách kuřete. Srovnávací data ukázala, že purifíkované rHAO antigeny aglutinují červené krvinky s účinností, srovnatelnou s účinností pozorovanou v souvislosti s celkovými chřipkovými viriony.
Rekombinantní HAO se může štěpit v místě disulfidové vazby, což může způsobit konformační změnu, která vede k vytvoření dvou řetězců, HA1 a HA2, jak uvádí Carr, C.M. a Kim, P.S., „A Spring-loaded Mechanism for the Conformational Change of Influenza Hemagglutin“, Cell 73: 823-832 (1993). Rozštěpení rekombinantního HAO je podrobněji popsáno v níže uvedeném io příkladu 6. Rovněž se dá předpokládat, že po rozštěpení přirozeného HAO na HA1 a HA2, se řetězce stanou infekčními získáním schopnosti vázat se na buňky a tak se dosáhne lepší imunitní odezvy. Toto zpracování antigenu, například chřipkového hemaglutininu, se projeví navázáním antigenových peptidů na hlavní histokompatibilní (MHC) molekuly. Rozpoznání antigen/MHC komplexu T buňkami představuje iniciaci imunitní odezvy, jak přehledně popisuje Harding aGeuze, Current Opinion in Cell Biology 5: 596-605 (1993), Nicméně rHAO, produkovaný v bakuloviru, je vysoce stabilní a imunogenní jako intaktní molekula. Porovnání molekul cukru na HAO exprimovaném v hmyzích buňkách ukázalo, že se tyto glykany liší od glykanů na HAO, exprimovaném v savčích nebo ptačích buňkách.
Produkce fúzních proteinů
Fúzni proteiny, tvořené HAO navázaným na druhý antigenový protein, lze produkovat, pokud je antigenicita druhého proteinu nižší nebo pokud je výhodné vyvolání imunogenní odezvy na více antigenů. Příkladem druhého výhodného antigenu je neuraminidáza produkovaná chřipkou.
Tento antigen může být tvořen cetulámím, virovým nebo bakteriálním proteinem nebo jeho antigenovou částí, zahrnující alespoň pět až osm aminokyselin. Další antigeny zahrnují hepatitický B antigen, HIV antigeny a karcinoembiyonický antigen. Výraz „imunitní odezva“, jak je zde uveden, označuje buď humorální odezvu, měřenou produkcí protilátky k antigenu, nebo celulámí odezvu, měřenou vyvoláním T buňkou mediované odezvy na antigen. V některých přípa30 dech se může mezi HA a antigen zavést „vazebník“ neantigenových aminokyselin a tím tak dále zvýšit antigenicitu antigenu, v porovnání s původním HA. Součástí způsobu je zkonstruování DNA plasmidů pro fúzi genů cílového antigenu na celodélkový HA gen chřipkového genu nebo jeho fragmenty za použití oligonukleotidových sond a metodologie polymerázové řetězové reakce (PCR).
Fúzni geny HA-cílového antigenu se modifikují pro správnou expresi hmyzích buněk delecí přirozených hydrofobních signálních peptidových sekvencí a jejich náhradou novým bakuΙον irovým signálním peptidem. Fúzni protein se zavede do bakulovirového expresního vektoru tak, že bakulovirový polyhedronový promotor řídí transkripci fúzních proteinů v infikovaných hmy40 zích buňkách. Osmnáctiaminokyselinový bakulovirový signální peptid řídí transkripci fúzního polypeptidů HA-cílového antigenu do glykosylační dráhy hmyzí buňky a není přítomen na zralém fúzním proteinu.
Například plasmid pA9440, který obsahuje HA gen A/Beijing/32/92 kmene v níže popsaném pMGS12 bakulovirovém transferovém plasmidů se použije jako matrice pro amplifikaci HA genu polymerační řetězovou reakcí (PCR) a za použití protokolu doporučeného dodavatelem (Gene Amp PCR cloning kit, Perkin Elmer Cetus). Reakční směs (100 μί), obsahovala 20 pmol primerů navržených pro temperaci částí HA genu. 5' a 3' primer byly navrženy s endonukleázovými místy na koncích, které se nenacházely v HA genu. 5' PCR primer (0 až 567) pro HAO a HA1 fragmenty začíná 52 bazických párů za 5' koncem sekvencí kódujících přirozený HA gen, které postrádají přirozenou signální peptidovou sekvenci, a přidává Smál místo bezprostředně za 5' na sekvence kódující HA, 5' PCR primer (0 až 651) pro HA2 začíná na nukleotidu 1108 zralého HA genu, bezprostředně následujícím za kodonem kódujícím argininový zbytek, který se odstranil během rozštěpení HAO na HAÍ a HA2. Byl navržen 3' PCR primer (0 až 680) pro
HAO a HA2 fragmenty, který zavede Kpn\ místa bezprostředně za HA kódující sekvence, které
CZ 301021 Bó odstraňují přirozený koncový kodon. 3' PCR primer pro HA1 (0 až 679) upravuje gen bezprostředně před argininovým zbytkem odstraněným během HAO štěpení. Amplifikace fragmentu
HA genu se prováděla ve třiceti cyklech, z nichž každý sestával zjednominutové denaturace °C, dvouminutového temperování primerů při 55 °C a dvouminutové extenze při 72 °C.
Výsledné amplifikované fragmenty HA genu se podrobily elektroforéze na agarózovém gelu, purifikovaly z gelu pomocí sady GeneClean (Bio 101, lne.) a ligovaly do plasmidu, navrženého tak, aby přijal PCR-generované fragmenty (pCRIl; Invitrogen). Takže se získají plasmidy pB142, pB144 a pB33O, které obsahují HAO, HA1, resp. HA2 genové fragmenty.
io Z plasmidů pB142, pB144 a pB330 se pomocí Smál a Kpnl restrikčních enzymů odstranily HA genové fragmenty, které se následně subklonovaly standardními rekombinantními DNA technikami (Sambrook a kol., 1989) do AcNPV transferového plasmidu pMGS12. Plasmid pMGS12 obsahuje, směrem od 5' k 3', AcNPV polyhedronový promotor, ATG iniciační kodon, sekvenci pro odštěpitelný signální peptid z bakulovirového glykoproteinu s molekulovou hmotností 61 000 (61K), 5/waI a Kpnl klonovací místa pro restrikční enzym a TAA univerzální koncovou kodonovou sekvenci. Tyto regulační oblasti lemuje DNA £coRI I fragmentu AcNPV genomu (Summers a Smith, „A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture proceduies“, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987)). Klonované HA PCR fragmenty se izolují zpCRII klonovacího vektoru pomocí Smál a Kpnl, purifikovaných elektroforézou na agarózovém gelu a sadou GeneClean, a ligovaly do pMGSl2, který byl rovněž digerován Smál a ApnI. Výsledné AcNPV transferové plasmidy, pB879, pB 1201 a PB1205, obsahovaly kódovací oblasti pro HAO, HA1 resp. HA2 navázané v rámci s rozštěpitelným bakulovirovým signálním peptidem 61K genu a polyhedrinovým promotorem. Výsledné AcNPV transferové plasmidy, pB879, pB 1201 a PB1205 lze použít pro fúzi HAO, HA1 nebo HA2 na libovolný sledovaný gen.
Druhým krokem při konstrukci HA-CEA ťuzních genových transferových plasmidů je zavedení CEA-kódujících sekvencí do HA-kódujících konstruktů. Restrikční endonukleázou rozpoznávací/štěpná místa pro Smál a A/wI se umístila PCR amplifikací plasmidu pA9080 na oba konce CEA genu. 5' PCR primer, 0-649, začíná 82 bazických párů od 5' konce genu s delecí sekvence zralého CEA signálního peptidu. 3 'PCR primer, 0-650, byl navržen pro deleci posledních 72 bazických párů na 3'konci genu, který kóduje hydrofobní sekvenci C- koncového úseku. Amplifikace CEA genového fragmentu se provádí ve třiceti cyklech, z nichž každý sestává zjednominutové denaturace pri 94 °C, dvouminutového temperování primerů při 55 °C a dvouminutové extenze pri 72 °C. Výsledný amplifikovaný CEA genový fragment se podrobil elektro35 foréze na agarózovém gelu, purifíkoval metodou GeneClean a ligoval do pCRIl (Invitrogen) způsobem, který doporučuje výrobce. Výsledný plasmid, pB806, obsahuje CEA gen bez jeho přirozeného signálního peptidu, C-koncové hydrofobní domény nebo koncového kodonu, ale jak se £mal, tak s Kpnl místem na obou koncích genu.
Příprava peptidu ve velkém měřítku se prováděla pomocí plasmidu pB806 a DNA se digerovala buď pomocí 5/ndI, nebo Kpnl. CEA-kódující fragmenty se purifikovaly elektroforézou na agarózovém gelu pomocí sady GeneClean a purifikované fragmenty se ligovaly do každého ze tří HAkóduj ících konstruktů (pB879, pB1201 nebo pB 1205), stejným restrikčním enzymem. Například digerovaných CEA-kódující fragmenty s Smal-sestřiženými konci se ligovaly do HAO-, HAl45 a HA2-kóduj ících konstruktů (pB879, pB1201, resp. pB1205) sestřižených tak, že vytvořily plasmidy pB1250, pB1555, resp. pB1584. CEA-kódující fragmenty s A/wI-sestřiženými konci se ligovaly do HAO-, HA1- a HA2-kódujících konstruktů, sestřižených Kpnl tak, že vytvořily plasmidy pB1264 resp. pBl564 a pB1593. Inzerce CEA genu na Smol místě zavede CEA-kódující sekvence za HA-kóduj ící sekvence. V případě všech konstruktů byly navrženy so PCR primery tak, aby se EA gen vložil v rámci HA a aby se fúzní genová translace ukončila na univerzálním translačním koncovém signálu (TAATTAATTAA) (SEQ ID NO: 4) vpMGS12 vektorových sekvencích Kpnl místem.
Tento konstrukt lze vylepšit deleci intervenujících aminokyselin, buď mezi signálním peptidem a HAO, jak bude popsáno dále, nebo mezi HAO a fúzním genem, a zlepšit tak jeho sbalení a imunogenicitu.
Formulace a balení vakcíny rHA lze formulovat a balit samotné nebo v kombinaci s dalšími chřipkovými antigeny, za použití metod a materiálů, které jsou odborníkům v oboru chřipkových vakcín známy. U výhodného provedení se HA proteiny ze dvou kmenů A a jednoho kmene B sloučí za vzniku multivalenční vakcíny.
U zvláště výhodného provedení se HA sloučí s adjuvansem, který se použije v množství, účinném pro zvýšení imunogenní odezvy proti HA proteinům. V současnosti je jediným, v širším měřítku používaným, adjuvansem u lidí kamenec (fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý), is Saponin a jeho purifíkovaná složka Quil A, Freundův kompletní adjuvans a další adjuvansy používané při výzkumu a při veterinárních aplikacích mají toxicitu, která omezuje jejich potenciální použití v lidských vakcínách. Nicméně nově chemicky definované přípravky, jakými jsou například muramyldipeptid, monofosforyl lipid A, fosfolipidové konjugáty, například konjugáty, které popsal Goodman-Snitkoff a kol., J. Immunol. 147: 410-415 (1991), a rovněž by se mělo použít zapouzdření proteinu v proteoliposomu, jak popisuje Miller a kol., J. Exp. Med. 176: 1739-1744 (1992), a zapouzdření proteinu v lipidových vehikulech, například lipidových vehikulech Novasome (Micro Vescular Systems, lne., Nashua, NH).
U výhodného provedení se vakcína balí ve formě jediné dávky, určené pro imunizaci parenterál25 ním (tj. intramuskulámím, intradermálním nebo subkutánním) podáním nebo nazofaryngeálním (tj. intranazálním) podáním. Účinná dávka se stanoví způsoby, popsanými v níže uvedených příkladech. Nosičem je zpravidla voda nebo pufrovaný fyziologický solný roztok, s konzervační látkou nebo bez konzervační látky. Antigen se může lyofílizovat a v okamžiku podání resuspendovat, nebo podávat v roztoku.
Nosičem může rovněž být polymemí systém se zpožděným uvolňováním. Syntetické polymery jsou zvláště použitelné při formulaci vakcíny, u které má být dosaženo kontrolovaného uvolňování antigenů. Raným příkladem byla polymerace methylmethakrylátu do kuliček, s průměrem menším než jeden mikrometr, za vzniku takzvaných nanočástic, které popsal Kreuter J., Micro35 capsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology, M. Donbrow (ed.), CRC press, str. 125-148. Odezva protilátky, stejně jako ochrana proti infikaci chřipkovým virem, byla podstatně lepší než v případě, kdy se antigen podával v kombinaci s hydroxidem hlinitým. Experimenty s dalšími částicemi ukázaly, že přídavný účinek těchto polymerů závisí na velikosti částic a hydrofobicitě.
Mikrozapouzdřením injekce mikrozapouzdřených farmaceutických látek se dosáhne jejích kontrolovaného uvolňování. Na volbu příslušného polymeru pro mikrozapouzdření má vliv celá řada faktorů. Reprodukovatelnost polymemí syntézy a mikrozapouzdřovací proces, cena zapouzdřovacího materiálu a ekonomická náročnost způsobu zapouzdřování, toxikologický profil, poža45 dávky pro různou kinetiku uvolňování a fyzikochemickou slučitelnost polymeru a antigenů představují faktory, které je třeba vzít při rozhodování v úvahu. Použitelnými polymery jsou například polykarbonáty, polyestery, polyurethany, polyorthoestery a polyamidy, zejména ty, které jsou biologicky degradovatelné.
Často voleným nosičem pro farmaceutika a v poslední době častěji pro antigeny je poly(d,l-laktid-ko-glykolid) (PLGA), což je biologicky degradovatelný polyester, který se v lékařské praxi již dlouhou dobu používá, například v případě vstřebávacích stehů, kostních plotének a dalších dočasných implantátů, kde nevykazuje žádnou toxicitu. Do PLGA mikrokapslí se formuluje celá řada různých farmaceutik. K tomu, aby bylo možné upravit PLGA tak, aby kontrolované uvolňovala antigen, je třeba shromáždit určitá tělesná data, jak uvádí například
Eldridge, J.H. a kol., Current Topics in Microbiology and Immunology, 1989, 146: 59-66.
Zachycení antigenů v PLGA mikrokulíčkách o průměru 1 až 10 pm ukázalo, že mají značně adjuvansní účinek, pokud se podají orálně. PLGA mikrozapouzdřovací proces používá fázovou separaci emulze typu „voda v oleji“. Sledovaná sloučenina se připraví jako vodný roztok a PLGA se rozpustí ve vhodných organických rozpouštědlech, například v methylenchloridu a ethylacetátu. Tyto dva nemísitelné roztoky se ko-emulgují vysokorychlostním mícháním. Potom se přidá nerozpouštědlo pro polymer, což způsobí vysrážení polymeru okolo vodných kapiček za vzniku embryonálních mikrokapslí. Mikrokapsle se ochladí a stabilizují jedním z činidel, která zahrnují polyvinylalkohol (PVA), želatinu, algináty, polyvinyípyrrolidon (PVP) a methylcelulózu, a buď ío sušením ve vakuu, nebo extrakcí rozpouštědla se zbaví rozpouštědla.
Vynález se stane zřejmějším po prostudování následujících příkladů.
is Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Propagace a purifikace chřipkových virů
Z FDA v alantoické kapalině vejce kuřete se získaly následující kmeny chřipkové vakcíny:
A/Beíjing/353/89-podobný (H3N2)
A/Beijing/32/92-podobný (H3N2)
A/Texas /3 6/91-podobný (H1N1)
B/Panama/45/90.
Pro propagaci původní zásoby chřipkového viru, získaného z FDA, se MDCK buňky infikovaly v přítomnosti TPCK-ošetřeného trypsinu (Sigma Chemical Co,, st. Louis, MO) a koncentracích fetálního bovinního séra, které jsou optimální pro přípravu nej vyšších titrů viru první choroby.
MDCK buňky se infikovaly chřipkovými kmeny při nízké multiplicitě infekce (0,1 až 0,5), jak určil standardní HA test (Rosen, „Hemagglutination with Animal Viruses“ in Fundamental Techniques in Virology, ed. K. Habel a N.P. Salzman, str. 276-28 (Academie Press, New York 1969)). Infikované buňky se inkubovaly 48 hodin při 33 °C a u média se provedl test hemaglutininové aktivity stanovující produkci viru. Podmínky poskytující nejvyšší HA aktivitu se použily pro přípravu velkých zásob chřipkového viru. Optimální koncentrace TPCK trypsinu a fetálního bovinního séra pro výše uvedené chřipkové viry jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 1.
«
Tabulka 1 Optimální koncentrace TPCK trypsinu a fetálního bovinního séra
Purifikace chřipkového viru
Virus se 24 až 48 hodin po infikaci sklidil z 10 TI75 kultivačních nádob klarifiačního média 5 (1000 x g po dobu 10 minut), chřipkou infikovaných MDCK buněk. Virus se peletoval z média při lOOOOOxg po dobu 1 hodiny. Výsledná virová peleta se resuspendovala v 1 ml fosfátem pufřovaného fyziologického roztoku (PBS) pH7,4 a odstřeďovala přes 20 ml 20 až 60% (hm./obj.) sacharózového gradientu v PBS. Pás chřipkového viru se sklidil ze 40 až 45 % sacharózové oblasti gradientu, naředil PBS a peletoval při 100 000 x g. Purífikovaná virová peleta se ío resuspendovala v 0,5 ml PBS, skladovaného při -70 °C.
Příklad 2
Klonování HA genu influenzy A/Texas/36/91
Specifický příklad klonovaného kroku pro jeden z chřipkových HA genů je znázorněn na obrázku 2. Virová RNA se extrahovala výše získané popsaným způsobem z influenzy A/Texas/36/91, zCDC. Univerzální primer, komplementární s koncem 3' chřipkových RNA seg20 mentů 5-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 1), se použil spolu s reverzní transkriptázou viru myší Maloneyovy leukémie (MMuLV) pro výrobu chřipkové cDNA. Purifikovaná virová RNA nebo mRNA (5 pg) se použila jako matrice pro výrobu cDNA, používající M-MuLV reverzní transkriptázu, dodanou společností Pharmacia lne. v sadě First-Strand cDNA Synthesis Kit. Primerem, použitý pro cDNA virové RNA z chřipkových kmenů A, byl syntetický oligo25 nukleotidový primer (5-AGCAAAAGCAGG-3 ) (SEQ ID NO: 1), který je homologický s koncem 3' všech segmentů HA genového virionu.
Amplifikace HA genů z cDNA se provedla polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití standardních reakčních podmínek (Gene Amp kits; Cetus/Perkin Elmer, Norwalk, CT). PCR reakční směs (100 pL) obsahovala 20 pmol primerů, specifických pro 5' a 3' konec HA genu chřipkového kmene influenza A (H3) nebo A (Hl) nebo chřipkové kmeny influenza B, jak ukazují konvenční sekvence zjištěné v genové bance DNA dat, která ukazuje tabulka 2. Amplifíkace se prováděla ve třiceti cyklech, z nichž každý sestával zjednominutové denaturace při 94 °C, dvouminutové temperace při 55 °C a tříminutové extenze při 72 °C. Správná velikost PCR produktů se před klonováním potvrdila na 0,8% agarózových gelech.
PCR primery z konce 5' HA genu: 5' -GGG GGT ACC CCC GGG AGC AAA AGC AGG GGA AAA TAA AAA-3' (SEQ ID NO: 2) a konce 3' HA genu: 5'GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC-3' (SEQ ID NO: 3) se použily při PCR k získání celo40 délkového HA genu.
Nový 5' PCR primer byl navržen z 5' konce genu: 5-GGG GGT ACC CCC GGG GAC ACA ATA TGT ATA GGC TAC CAT-3' (SEQ ID NO: 4) a 3' konce genu: 5' -GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC-3' (SEQ ID NO: 5). Tyto primery se použily pri PCR k získání HA genu bez sekvence signálního peptidu. Ten se následně vložil do TA vektoru rozštěpeného Kpnt 61K signální peptid pro bakulovirovou expresi a polyhedrinový promotor se následně vložil do TA vektoru, obsahujícího HA gen postrádající sekvencí chřipkového signálního peptidu. Výsledný bakulovirový rekombinantní vektor obsahoval polyhedrinový promotor, 61K bakulovirový signální peptid a HA gen pro influenzu A/Texas/36/91.
HA geny z chřipkových kmenů influenzy B se klonovaly z celkové mediátorové RNA (mRNA), extrahované z MDCK buněk infikovaných chřipkovým kmenem B, B/Panama/ 45/90. Celková RNA se připravila z 5 TI 75 láhví infikovaných buněk. Sklizené buňky se lyžovaly v přítomnosti guanidiniumthiokyanátu a celková RNA se purifikovala výše popsaným způsobem. Celková
7
CZ 301021 Bó mRNA se extrahovala zcelulámí RNA za použití výše popsaných oligo-(dT)-celulózových odstřeďovaných kolon.
Primerem, použitým pro mRNA chřipkových kmenů B byl nahodilý oligonukleotidový DNA primer (Pharmacia, lne.).
(Μ tn
LQ o Q Ů) H
Λ
Tabulka 2 pokračováni
B/Panama/45/90
n
Ei 0 0 S O O g k.
0 CO
£-» 0 §
E4
§ GGG
3 0 rtí
0 O
a 0 0 Ε-» O
0 Ej
0 rf
O £
O V) 0
O 0
O H
1—1 á
£4 fi 0. 0
0 S
0 0
O o
6“» o
H 1—I o
rf Pí 0 o
ρς 0 0
0 w rf
0 ÉH
0 0
0 0
* S.
m in
r-1 (tí
I
5—1 fi
S4
O □ ω fi ·· o o Cn £ ϋ Q cd H fi
O* * w - 0 m —
O lq
- 0 Γ9 0
CM
CO
O %
O
H a
ω w
u (D fi
O n
Kpnl BamHÍ EcoRI
CZ 301021 Bó
Příklad produktů cDNA syntézy použil jako matrici virovou RNA chřipkového viru A/Texas/36/91. Oblast cDNA segmentů, která kóduje chřipkové proteiny by mohla být zjištěna následujícím způsobem. Purifikovaná virová RNA se sloučí v reakční směsí s univerzálním jednořetězco5 vým DNA primerem 5'-AGCAAAAGCAGG-3'(SEQIDNO: 124) (SEQ ID NO: 1). Tento primer je komplementární s3r koncem již zmíněných segmentů chřipkového virionu. Reakce rovněž zahrnovala přidání [a-32P]dCTP, čímž se zajistila vizualizace cDNA produktů, které se separovaly na 1,5% alkalickém hydrolyzačním gelu (Maniatis a kol., 1982) a exponovaly na XOMAT-AR film.
io
Příklad 3
Klonování HA genů do bakteriálních plasmidu
PCR amplifikované rHA geny se klonovaly do pUC-podobného plasmidového vektoru, za použití TA klonovacího systému (Invitrogen, lne.). Přítomnost HA genů se ověřila restrikčně enzymatickou digerační analýzou plasmidové DNA, purifíkované standardními postupy (Maniatis a kol., 1982). Konec 5' rHA genů se následně analyzoval DNA sekvencováním a pro odstra20 nění sekvencí, kódujících hydrofobní signální peptidy na N-konci HA proteinů, byly navrženy nové primery. Specifické 5' a 3' oligonukleotidové primeiy, jejichž seznam uvádí tabulka 2, se následně použily pro amplifikaci cDNA produktů, k níž se použila PCR, a standardními klonovacími metodami se klonovaly do £. coli TA plasmidových vektorů (Invitrogen, lne,). Výsledné DNA klony obsahovaly kódovací sekvence pro zralé HA, rHA geny z A/Texas/36/91, A/Beijing/353/89, A/Beijing/32/92 a B/Panama/45/90 se subklonovaly standardními postupy (Maniatis a kol., 1982) do bakulovirových expresních vektorů. HA geny se odstranily z TA klonovacích plasmidu pomocí vhodných restrikěním enzymů a DNA fragment purifikovaného HA se vložil do bakulovirového rekombinantního plasmidu. Výsledné bakteriální klony se prohledávaly na ampicilinovou rezistenci a následně sestřihly restrikčními enzymy, uvolnily vložený HA genu a tím potvrdily jeho přítomnost. Rekombinantní plasmidy, obsahující HA geny, se purifikovaly na gradientech chloridu česného a ethidíumbromidu (Maniatis a kol., 1982). 5' konec plasmidů se sekvencovai s cílem potvrdit přítomnost správných bakulovirových signálů (sekvence AcNPV polyhedrinového promotoru, ATG translačního startovního signálu, a bakulovirového signálu) a správnou HA-kódující sekvenci ve správném čtecím rámci. DNA sekvence na 5' konci HA genů a lemovací AcNPV polyhedrinový promotor a bakulovirový signální peptid (prvních 18 aminokyselin každé aminokyselinové sekvence) je znázorněno v sekvenčním protokolu.
SEQ ID NO. 6 kóduje sekvenci 5 konce HA genu pro A/Beijing/32/92 (sekvenční rozsah 1-481). SEQ ID NO: 7 je odpovídající aminokyselinová sekvence (začíná na startovacím kodonu „ATG“ [nukleotidu 21] SEQ ID NO: 6). Aminokyselinová sekvence 61K signálního peptidu je uvedena v SEQ ID NO: 7 jako aminokyseliny 1—18.
SEQ ID NO. 8 kóduje sekvenci 5'konce HA genu pro A/Texas/36/91 (sekvenční rozmezí 1481). SEQ ID NO: 9 je odpovídající aminokyselinovou sekvencí (začínající na startovacím kodonu „ATG“ [nukleotidu 21] SEQ ID NO: 8). Aminokyselinová sekvence 61K signálního peptidu je uvedena v SEQ ID NO: 9 jako aminokyseliny 1-18.
so SEQ ID NO: 10 kóduje sekvenci 5'konce HA genu pro B/Panama/45/90 (sekvenční rozmezí 1-434). SEQ ID NO: 11 je odpovídající aminokyselinovou sekvencí (začínající na startovacím kodonu „ATG“ [nukleotidu 21] SEQ ID NO: 10). Aminokyselinová sekvence 61K signálního peptidu je uvedena v SEQ ID NO. 11 jako aminokyseliny 1-18.
V SEQ ID NO 6, 8 a 10 nukleotidy 1-20 kódují 3' konec polyhedrinového promotoru, nukleotidy
21-74 kódují 61K signální peptid a nukleotidy 75 až konec kódují 5' konec HA genu.
Příklad 4
Exprese rekombinantního HA ve hmyzích buňkách
Chimérické rekombinantní plasmidy, obsahující klonované HA geny se purifíkovaly a 2 gg se io smísily s 1 gg standardního typu DNA AcNPV. DNA se vysrážely s vápníkem a transfektovaly do buněk 5. frugiperda za použití standardních postupů (Smith, Summers a Fraser, Mol. and
Cello Biol. 3: 2 156-2 165 (1983)). Rekombinantní bakuloviry se identifikovaly na základě morfologie plak a následně dále purifíkovaly dalšími cykly purifikace plak. Plakově purifikované rekombinantní bakuloviry se prohledávaly s cílem analyzovat expresi rHA a pro další vývoj se zvolil jediný bakulovirový expresní vektor.
Buňky & frugiperda se infikovaly bakulovirovým vektorem, obsahujícím HA gen z chřipkového kmene: B/Panama/45/90. 24, 48 a 72 hodin po infikaci se 1 x 106 buněk pulzovalo s25 gCi [35S]methioninu po dobu 15 minut, čímž se značené proteiny syntetizovaly. Buňky se sebraly a proteiny se separovaly na 11% polyakrylamidovém gelu v přítomnosti 0,1% SDS, Radiologicky značené proteiny se detekovaly expozicí na X-OMAT-AR film. Umístění proteinových standardů a jejich velikosti v kilodaltonech (kd) naznačily, že 85 kD rekombinantní HA protein je jedním z hlavních proteinů, které se syntetizovaly v buňkách 48 hodin a 72 hodin po infikaci.
Příklad 5
Produkce a purifikace rekombinantního HA
Bakulovirový expresní vektor A8611, který obsahuje gen pro influenzu A/Beijing/353/89, produkovaný v podstatě výše popsaným způsobem pro A/Beij i ng/3 2/92 hemaglutinin pod kontrolou polyhedrinového promotoru, se použil pro infikování buněk 5. frugiperda. Buňky se nechaly narůst při 27 °C do hustoty 1 x 106 buněk/ml v TNMFH médiu (Gibco BLR, Gaithersburg, MD) obohaceném 10% fetálním bovinním sérem a infikovaly se při multiplicitě infekce (MOI)
1 A8611 rekombinantním bakulovirem. Během infikace se hemaglutinin influenzy A/Beijing/353/89 produkoval za transkripční kontroly bakulovirového polyhedrinového promotoru. Buňky se sklidily 72 hodin po infikaci patnáctiminutovým odstřeďováním při 3400 x g a promyly resuspenzí v séru prostém TNMFH médiu a následně třiceti minutovým odstřeďováním při 10 400 x g. Supematant se oddekantoval a infikované buněčné pelety se skladovaly při -70 °C.
Vyvinul se způsob, ve kterém se rekombinantní HA za podmínek, které nedenaturují antigen selektivně extrahoval z infikovaných buněk. Není-li stanoveno jinak, provádí se všechny extrakční kroky při 4 °C. Buněčná peleta z 0,5 1 kultury (přibližně 5 x 108 buněk) se rozrušovala 2 minuty ve 40 ml ledově studených 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 1% (obj./obj.)
Tweenu-20, 1 mg/ml leupeptinu za použití homogenizátoru Polytron (Brinkmann Instrumens lne. Westbury, NY). Homogenát se odstřeďoval třicet minut při 9200 x g. Supematant se vypustil a pelety se sebraly. Tento krok odstranil rozpustné a periferní membránové proteiny z hmyzích buněk bez extrakce integrálním membránovým proteinům podobného rHA. rHA se z pelet extrahoval dvouminutovou homogenizací při nastavení 4 ve 40 ml ledově studeného 30 mM Tris,
10 mM ethanolaminu, pH 11, 25 mM LiCl a 2% Tweenu-20. Po šedesátiminutové inkubaci na ledu se pH hodnota homogenátu nastavila na 8,4 pomocí l N HCI a nerozpustný materiál se odstranil třicetiminutovým odstřeďováním při 9200 x g. Supematant obsahující rozpustný rHA se oddekantoval a pH hodnota se zkontrolovala, a pokud to bylo nezbytné, tak se nastavila na 8,4 při pokojové teplotě. Nerozpustný materiál se pro analytické účely resuspendoval ve 40 ml vody.
HA integrální membránový protein se solubilizoval při vysokém pH v přítomnosti detergentu
Tween-20 a zůstal v roztoku potom, co pH pokleslo.
Proteiny se analyzovaly SDS elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Vzorky se rozrušily ve vroucí vodní lázni, kde se ponechaly 10 minut v přítomnosti 2% dodecylsulfátu sodného (SDS) a 5% beta-merkaptoethanolu, načež se podrobily elektroforéze na 11% polyakrylamidovém gelu v přítomnosti 0,1% SDS, načež se zabarvily modří Coomassie.
Pro purifikací rekombinantního cHA byl vyvinut chromatografický purifikační proces, který io poskytuje vysoce puntíkovaný rekombinantní HA antigen, který není denaturovaný a je vhodný jako složka chřipkové vakcíny pro humánní aplikaci. Pro čištění A/Beijing/353/89 HA z buněk
5. frugiperda infikovaných rekombinantním virem A8611 se použil následující postup.
Chromatografickými gelovými matricemi, použitými pro purifikací HA z 0,5 1 infikovaných buněk S. frugiperda, bylo 30 ml Pharmacia DEAD Sepharose Fast Flow (v koloně Pharmacia 06/20) a 4 ml Pharmacia Lentil Lectin Sepharose 4B (v koloně Pharmacia 00/10). Výstup DEAE kolony je spojen se vstupem čočkové lektinové kolony a SíN 2 buněčný extrakt, připravený výše popsaným způsobem, se aplikoval do spojených kolon rychlostí 1 ml/minutu. Kolony se promyly 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,5% Tween-20 dokud se hodnota UV absorpce při 280 nm proudu vytékajícího z čočkové lektinové kolony navrátila na výchozí hodnotu. Za těchto podmínek se většina kontaminujících proteinů navázala na DEAE, ale rekombinantní HA proudí kolonou. Zbývající kontaminující látky prochází čočkovou kolonou a glykosylátovaný rHA se váže na čočkovou lektinovou afinitní matrici. DEAE kolona se rozpojí a lektinová kolona se promyje dalšími 40 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,5%
Tween-20. Lektinová kolona se následně promyta 40 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,4,25 mM LiCl, 0,4% (obj/obj) deoxycholátu sodného (DOC). Tento krok nahradí detergent Tween-20 detergentem, jako je DOC, který lze z proteinu odstranit dialýzou. Rekombinantní HA se následně z lektinové kolony eluovala pomocí přibližně 20 ml 40 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,4% (obj/obj) ddeoxycholátu sodného, obsahujícího 0,3 M a-D-methylmannosidu. Výsledky se analyzovaly pomocí 11% PAGE.
Díky generické variabilitě chřipkových HA proteinů se detaily, týkající se výše uvedeného purifikačního postupu, mohou v případě každého jedinečného rekombinantního HA proteinu lišit. rHA se může například vázat na DEAE intoměničovou kolonu namísto toho, aby touto kolonou procházely. V tomto případě by se rHA mohl z DEAE kolony odstranit promytím kolony pufrem obsahujícím vysokou koncentraci LiCl, NaCl nebo jiné soli.
Pro odstranění DOC detergentu a dalších složek pufru se proud vytékající z lektinové kolony, který obsahuje purifikovaný rHA, dialyzoval proti fosfátem pufřovanému fyziologickému rozto40 ku, pH 7,5 (PBS). Purifikovaný rekombinantní HA měl alespoň 95% čistotu, stanoveno analýzou na SDS polyakrylamidových gelech.
Příklad 6
Analýza proteázové rezistence rHA
Zralý HA tvoří trimerové struktury, které jsou rezistentní proti různým proteázám včetně trypsinu, které degradují HA monomery (Murphy a Webster, 1990). Rezistence vůči trypsinovému ošetření může být tedy použita jako test pro určení funkční trimerové tvorby. Pro studie rezistence rHA vůči proteázovému ošetření se použil následující postup.
Dva alikvotní podíly purifikovaného rHA (A/Beijing/353/89) při koncentraci 60 pg/ml se inkubovaly po dobu 30 minut na ledu, v 30 mM Tris-HCl, pH 8,4,150 mM NaCl, v přítomnosti a za absence 50 pg/ml TPCK-Ošetřeného trypsinu. Reakce se ukončila přidáním 57,4 mM fenyl methy Isulfony Ifluoridu v isopropanolu do konečné koncentrace 1 mM. Alikvotní podíly každého vzorku se denaturovaly varem v 3% SDS za redukčních podmínek, podrobily elektroforéze na
11,5% polyakrylamidových gelech a pomocí westernového přenosu přenesly na nitrocelulózový filtr. HA polypeptidy se detekovaly za použití anti-HA séra morčete, připraveného proti purifi5 kovanému rHA a kozího anti-morčecího IgG alkalínfosfatázového konjugátu.
Neošetrený rHA migroval při velikosti HA prekurzoru (HAO). Proteázové ošetření vedlo k vytvoření dvou hlavních pásů, které migrovaly při velikostech předpokládaných pro chřipkový hemaglutinin HA1 a HA2. Výsledky ukázaly, že trypsin rozštěpil rHA protein a dal tak vzniknout ío dvěma polypeptidům, jejichž velikosti odpovídají předpokládaným HA1 HA2 velikostem.
K žádnému dalšímu protalytickému procesu nedošlo. Tyto výsledky ukazují, že rHA, purifikovaný výše popsaným způsobem, je rezistentní proti degradaci proteázou. Tato vlastnost je specifická pro purifikovaný rHA, který se nachází ve formě trimerů.
Příklad 7
Stanovení imunogenicity rHA pomocí standardizovaného testu myší potence
Jedním způsobem měření imunogenicity antigenu je stanovení množství, nezbytného pro indukci detekovatelné odezvy na protilátku u myší (test myší potence). Standardizovaný test myší potence se používá pro měření imunogenicity rHAO vakcíny. Skupiny pěti až deseti myší se imunizovaly jednou vakcínou, obsahující postupná naředění rHA, tj. 0,500 pg, 0,1 pg, 0,02 pg a 0,004 pg purifikovaného rHA. Séra se odebrala 28 dní po imunizaci a protilátky proti rHA antigenu se měřily pomocí standardního testu (ELISA) v 96jamkových mikrotitraěních plotnách. Myši jsou sérokonvertované, pokud je OD450 při 1:100 na ředění 28denního antiséra vyšší, než průměrná hodnota OD450 myšího pre-imunního séra, zvýšená o tři standardní odchylky. Účinná dávka vakcíny, potřebná pro 50% sérokonverzi myší (ED50) je mírou imunogenicity antigenu.
Například čtyři skupiny zahrnující 10 myší se imunizovaly 0,1 pg, 0,02 pg, 00,004 pg nebo 0,0008 pg (pětinásobné naředění), rHAO vakcínou. Séra se shromáždila 28 dnů po imunizaci a pomocí ELISA testu se měřila proti každému rHAO antigenu ve vakcíně, s cílem určit sérokonverzi. Vypočetla se dávka, potřebná pro 50% sérokonverzi myší (ED50), a pro každý rHAO antigen se určila minimální hodnota ED50.
Předběžná data ukázala, že jedna dávka 0,004 pg rHAO bude sérokonvertovat alespoň 50 % myší.
Příklad 8
Podání rHA v kombinaci s adjuvansem a srovnání s dostupnými chřipkovými vakcínami
Myší potence purifikovaného rHA chřipkového kmene A/Beijing/3 53/89 se analyzovala s kamencem nebo bez kamence a srovnávala s komerčně dostupnou chřipkovou vakcínou FLUZONE (Connaugth Laboratories, lne. Swiftwater, PA), která obsahovala A/Beijing/353/89 chřipkový kmen. Vakcína se podala v dávce 0,5 pg, 0,1 pg, 0,02 pg a 0,04 pg. Dvacátý osmý den se myším ínjektovaly výše popsané dávky purifikovaného rHA. Čtyřicetidvoudenní myší sérum se titrovalo v ELISA testu, s cílem stanovit IgG-HA protilátky.
Výsledky jsou znázorněny na obrázku 3. Za nepřítomnosti adjuvansu indukovala pouze dávka 0,5 pg produkci podstatnějšího titru protilátky (200 000). V přítomnosti adjuvansů produkovaly podstatnější množství protilátky již dávky 0,004 pg rHAO. Zvířata, imunizovaná rHA (bez kamence) produkovala přibližně stejné koncentrace anti-HA protilátek jako komerční vakcína.
Kamenec zvýšil imunogenicitu rHA, přičemž v přítomnosti adjuvansu se generovaly minimálně desetinásobně vyšší anti-HA titry než v nepřítomnosti adjuvansu.
Srovnání imunogenicity purifikovaných rHAO s komerční celovirionovou chřipkovou vakcínou
FLUZONE (Connaugth Laboratories, Inc. Swiftwater, PA) ukazuje, že rHAO vyvolává po dobu 48 dnů podobnou imunitní odezvu u myší. Adsorpce rHAO na kamenec podstatně zvyšuje imunogenici tu purifikovaného rHAO u myší, jak ukazují výsledky testu, popsaného v příkladu 7. Kombinace s kamencem způsobuje vyšší tvorbu IgG hemaglutininových protilátek než chřipkové vakcíny FLUZONE.
Příklad 9
Studie hemaglutinaění ínhibice
Hemaglutinačně inhibiční (HAI) protilátky se váží na tři ze čtyř známých epitopů na hemaglutininu a blokují schopnost chřipky aglutinovat červené krvinky (Wilson a kol, „Structure of the hemaglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A' resolution Nature, 289-366-378 (1981)). Tyto antigenní determináty se shlukují okolo vazebného místa receptoru kyseliny síalové na hemaglutininových trimerech. Protilátky proti těmto místům budou neutralizovat infekčnost viru (Weis a kol., „Structure of the influenza virus hemaglutinin comlexed with its receptor, stálic acid“, Nature 333: 426-431 (1988)). Titr a specifičnost HAI protilátek jsou důležitými mírami potence chřipkové vakcíny chránit proti infikaci podobnými nebo odvozenými typy chřipky.
Studie, porovnávající schopnost purifikovaného rHAO připraveného z chřipkového kmene A/Beijing/353/89 a chřipkové vakcíny FLUZONE (Connaugth Laboratories, Inc. Swiftwater, PA) vyvolávat tvorbu HAI protilátek, se prováděly na myších. Skupiny pěti myší se injektovaly nultý a dvacátý osmý den 0,05 pg, 0,1 pg, 0,02 pg nebo 0,004 pg rHAO nebo třikrát stejnými množstvími vakcíny FLUZONE, takže se podala stejná množství rekombinantního nebo virového
A/Beijing/353/89 hemaglutininu. Například myši v nejvyšší dávkové skupině byly imunizovány 1,5 pg FLUZONE hemaglutininu (0,5 pg hemaglutininu z každého kmene) a 0,5 pg rHAO. Přítomnost dalšího hemaglutininového antigenu ve vakcíně FLUZONE ze dvou dalších chřipkových kmenů může vést k určitým křížově reaktivním protilátkám.
Anti-hemaglutininové protilátky (hemaglutininový IgG) se měřily proti purifikovanému rHAO ve standardním testu ELISA. HAI protilátky se měřily proti čtyřem hemaglutininovým jednotkám následujících antigenů: celý chřipkový virus A/Beijing/353/89 (A/Bei), purifikovaný rHAO A/Beijing/3 53/89 antigen a FLUZONE. HAI titr odpovídá nej vyššímu naředění antiséra, které z 50 % inhibuje aglutinaci kuřecích červených krvinek.
Tabulka 3 uvádí titry sérového hemaglutininového IgG a HAI u myší, stanovené 42. den. Vyšší hladiny anti-hemaglutininových protilátek produkovala rekombinantní rHAO vakcína. Tyto titry byly přibližně desetkrát vyšší než titry získané pri aplikaci vakcíny FLUZONE. Nejpodstatnější je to, že rHAO vakcína produkovala dobré titry protilátek, které blokovaly aglutinaci červených krvinek, způsobenou virem A/Beijing/353/89 a rHAO antigeny. Takže rHAO vakcína produkovala HAI protilátky, které rozpoznávaly stejně dobře imunogen a chřipkový vír A/Beijing. Nižší HAI titry, naměřené proti vakcíně FLUZONE, mohou být způsobeny neschopností antiséra blokovat aglutinaci způsobovanou dalšími dvěma kmeny hemaglutininu ve vakcíně FLUZONE. Na druhé straně myši imunizované vakcínou FLUZONE produkují vysoké titry HAI protilátek v případě, že se měření provádí proti vakcíně FLUZONE. HAI titry proti chřipkovému viru A/Beijing/353/89 a rHAO antigenu byly podstatně nižší. Podobné schéma bylo možné pozorovat u myší, spadajících do nižších dávkových skupin.
W §
CM
D
Pl b
-d
4J
O d
d
4->
Ή
-P ω
rtí
2*
H d
X3 (0
H
Ifluzone o o kO O O kO O o CO a o •M1 o o o 1 Ψ 1 ** 1
o o o
ffi rd CM o O o oo 1
d v rd kO n oo tn I
jAl
tí <D Tj H *d Φ PQ o O
<! rd CM o o o a>
CM ffi < V rd kO n co tn
1 « o O o o o o
S 2 0 o O o o o o
I ° Cn o O o o o 00
NI H Q » • * • • «
o g kD CM kO ω CM CS
Pl g K LQ rd LO CM rd cn
Cm d CM LD CM rd ΙΌ cn
w
I JZJ π
O y
N
E> LT> m O) O O f* 1
E rd rd rd Γ7 CD cs i
q O O O O O
2 kO CO kO ko kO ω
d σ cn σ σ 00
♦d o o O o
Φ CM CM CM
H CQ σ o σ\ o σ Xř
• co • kO ♦
52 rd vp rd σ H H
r* O O o o o o
Φ Ό O o o o o o
O • o t o • o o o •
kD kO CM k£> kO tn
CM O cn σ cn σ σ rd
gj o * o rd o o <Λ
d M* M1 00 SP M·
-d
Φ
CQ o Pí
I cn >u
s H xn .g
1 3 á > rtj
LJ= 2 2 rd CM tn m
CZ 301021 Bť>
Z těchto výsledků rovněž vyplývá, že mezi chřipkovým kmenem A/Beijing/3 53/89 ve vakcíně
FLUZONE a stejným chřipkovým kmenem získaným z FDA a před použitím v HAI testu jednou pasážovaným ve vejcích jsou genetické rozdíly. Skutečnost, že protilátky produkované v odezvě na rekombinantní HAO, klonovaný z chřipkového viru A/Beijing/353/89, blokují aglutinaci červených krvinek způsobovanou tímto chřipkovým kmenem je dobrým důkazem toho, že během klonování nedošlo k žádným genetickým změnám, které by ovlivnily vazebné místo receptorů kyseliny sialové na purifikovaném rHAO antigenu.
io
Příklad 10
Formulace a klinická účinnost chřipkové vakcíny 1993/1994 is Provedla se celá řada humánních klinických testů, které měly charakterizovat bezpečnost a imunogenicitu experimentální chřipkové vakcíny, obsahující rekombinantní HA u lidí a pomoci získat předběžná data, týkající se ochranné účinnosti této vakcíny proti přirozené infíkaci během epidemického období. Výsledky ukazují, že vakcíny obsahující rekombinantní chřipkový hemaglutinin (rHAO), připravený zde popsanými způsoby způsobovaly méně místních nežádoucích reakcí a poskytovaly stejnou nebo lepší ochrannou imunitní odpověď v porovnání s komerčně dostupnou, licencí opatřenou, zředěnou chřipkovou vakcínou vyráběnou ve vejcích.
Materiály a metody
Vakcíny
Rekombinantní HA vakcíny použité v této studii zahrnovaly celodélkový neštěpený HA (HAO) glykoprotein z chřipkového viru A/Beijing/32/92 (H3N3). Rekombinantní HAO (RHAO) se produkoval v kulturách motýlích (hmyzích) buněk, načež následovala expozice bakulovirovým vektorem obsahujícím cDNA inzerty kódující HA gen. Exprimovaný protein se purifikoval za nedenaturačních podmínek do 95% čistoty, měřeno kvantitativní skenovací densitometrií objemného antigenu separovaného elektroforézou na natrium dodecylsulfátpolyakiylamidových gelech. Identita peptidu se potvrdila aminokyselinovou analýzou, N-koncového sekvencování a analýzy westernového blotu protichřipkovým A/Beijing/32/92 sérem. rHAO vakcíny obsaho35 vály specifické množství syntetický syntetického HA antigenu buď rozpuštěného ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku, nebo adsorbovaném na fosforečnanu hlinitém (kamenci), jako adjuvansu, ve formě gelové suspenze. Schválená trojvalenční subvirionová vakcína použitá při studii obsahovala 15 pg/dávku každého HA z chřipkového viru A/Texas/36/91 (N1N1), chřipkového viru A/Beijing/32/92 (H3N2) a chřipkového viru B/Panama/45/90 ředěné chřipkové vakcíny FLUZONE vyráběné ve vejcích (Connaugth Laboratories, lne. Swiftwater, PA).
Klinické testy
Institucionálními posudkovými týmy Univerzity Saint Louis a Univerzity v Rochesteru schválily identické studijní protokoly. Studií na obou univerzitách se účastnily zdraví dospělí jedinci ve věku 18 až 45 let. Subjekty se nahodile rozdělily do skupin, kterým se následně aplikovala jedna z následujících pěti vakcínových přípravků dvojím slepým způsobem: (1) 15 pg rHAO, (2) pg rHAO plus kamenec, (3) 90 pg rHAO, (4) schválená trojvalenční inaktivovaná chřipková vakcína, nebo (5) fyziologické placebo. Vakcíny se podávaly intramuskulámí injekcí v objemu 0,5 ml.
Pro počáteční odhad bezpečnosti tří vakcínových přípravků obsahujících rHAO, se zvolilo nahodile a nezávisle na ostatních subjektech prvních 25 jedinců, kteří měli být vakcinováni, (tj. 5 osob na studii) a tyto jedinci byli 48 hodin po vakcinaci před tím, než se aplikovaly zbývající vakcíny, nepřetržitě telefonicky sledováni. Všichni zvolení jedinci byli instruováni tak, aby vyplňovali denní zprávu a v ní uvedli veškeré nežádoucí reakce včetně lokálních a systemických příznaků, které se u nich projevily během prvních šesti dní po vakcinaci. Pokud jde o povahu příznaků,
-97.
jedinci sami tyto příznaky hodnotili jako mírné, střední nebo vážné. Pokud sledovaní jedinci cítili, že mají zvýšenou teplotu, potom rovněž zaznamenali hodnoty orálně měřené teploty. Pokud se na místě po injekci objevilo lokální zduření nebo erytém, potom se hodnotilo zdaje plocha zduření nebo erytému menší, resp. větší než čtvrtdolar. Všechny vakcíny se aplikovaly v průběhu posledního týdnu měsíce listopadu a prvního týdně měsíce prosince 1993. Vzorky séra se odebraly každému jedinci v okamžiku vakcinace, tři týdny po vakcinaci a znovu koncem března nebo v měsíci dubnu 1994 alespoň dva až tři týdny potom, co již viiy necirkulovali v místních komunitách. Účastníci studie byly rovněž instruování, aby kontaktovali studijní centrum, pokud během zimního chřipkového epidemického období prodělají chřipce podobnou chorobu. Chřipce podobit) ná choroba byla definována jako výskyt jakéhokoli v respiračního příznaku trvajícího déle než dva dny a doprovázeného horečkou a/nebo systemickými příznaky myalgie nebo nachlazení. Jedincům, kteří zaznamenali chřipkové příznaky, se provedly nosohltanové výtěry za účelem získání a identifikace virové kultury. Klinické vzorky se opatřily identifikačními kódy a zpracovaly slepím způsobem.
Sérologie
Pro jednotlivé typy sérologických testů se všechny vzorky shromážděné v obou institucích testovaly najednou v jediné laboratoři. Hemaglutinačně inhibíční (HAI) protilátky proti antigenů chřipkového viru A/Beijing/32/93 (H3N2) se měřily v séru standardním mikrotitračním testem, načež následovalo odstranění nespecifického inhibitoru pomocí enzymu ničícího receptor a odstranění studených aglutininů hemadsorpcí při 4 °C. Titr se definoval jako nejvyšší naředění séra, které zcela zabránilo hemaglutinaci způsobené čtyřmi antigenovými jednotkami viru, přičemž jako výchozí na ředění se zvolilo naředění 1:4. Protilátky sérového HA-specifíckého imunoglo25 bulin G (IgG) se měřily pomocí testu ELISA, při kterém se jako potahový antigen použil puntíkovaný rHAO chřipkového viru A/Beijing/32/92 (H3N2). Sled reakčních činidel směrem ven z pevné fáze tvořil (1) purifikovaný rHAO antigen, (2) vzorek séra, (3) alkalinfosfatáza-konjugovaná s kozím anti-humánním IgG a (4) substrát na bázi p-nitrofenylfosfátu disodného, ELISA titr se exprimoval jako nejvyšší naředění, při kterém byla optická hustota obsahu jamky obsahu30 jící antigen alespoň dvakrát vyšší, než optická hustota obsahu odpovídající kontrolní jamky bez antigenů. Neutralizované protilátky se měřily za použití mikroneutralizačního testu, kteiý již popsal Treanor J.J. a Betts R.F., J. Infect. Dis. 168: 455-459 (1993). Postupná naředění tepelně inaktivovaného séra se smísila s přibližně 100 TCID50 chřipkového viru A/Beijíng/32/92 (H3N2) a inkuboval jednu hodinu při 37 °C. Směs viru a séra se následně adsorbovala při pokojové teplotě v průběhu jedné hodiny na splývající monovrstvu ledvinových buněk psa Madin-Darby (MDCK) v jamkách devadesátišestijamkových ploten. Plotny se promyly za účelem odstranění zbytkového inokula a opět naplnily séra prostým Dulbeccovým MEM s 2 gg/ml trypsinu a sedmdesát dva hodin inkubovaly v 5% CO2 při 33 °C. Buňky se následně fixovaly methanolem a virová replikace se vyhodnotila za použití seznamu myších monoklonálních protilátek specifických pro matrici a nukleoproteiny chřipkového viru A (Centers for Disease Control, Atlanta, GA), a následně alkalinfosfatázou-konjugovanou santi-myším ÍgG. Poslední titr séra se definoval jako nejvyšší naředění, které způsobuje 50% signálu v porovnání s neneutralizovanými kontrolními jamkami.
Virologie
Virové kultury vzorků nosohltanových výtěrů se zpracovaly v každé instituci standardními technikami. Vzorky se očkovaly buď v MDCK. nebo ledvinových buňkách makaka a inkubovaly 14 dní pří 33 °C. Hemadsorpce buněčných monovrstev se testovala pomocí 0,4% roztoku eiythrocytů morčete. Chřipkové viry se identifikovaly v hemadsorpčně pozitivních kulturách HAI za použití H3-specifického antiséra (Centers for Disease Control).
Statistické analýzy
Reciproký HAI, ELISA IgG a titry neutralizační protilátky se logaritmicky transformovaly pro účely statistické analýzy. Jako významná odpověď na vakcinaci se definovalo čtyřnásobné nebo větší zvýšení titru protilátky mezi vzorky séra odebranými před vakcinaci a po vakcinaci. Laboratorní důkaz chřipkového virové infekce A (H3N2) se definoval jako izolace viru z nosohltanových sekretů a/nebo čtyřnásobné a větší zvýšení titru HAI protilátky v séru mezi tří týdenním post-vakcinačním vzorkem (presezonní) odebraným v prosinci a odpovídajícím (postsezonním) vzorkem, odebraným následující jaro. Rozdíly mezi vakcinovanými skupinami se analyzovaly pomocí Fisherova exaktního testu, jehož cílem je porovnat podíly subjektů s nežádoucími reakcemi, s podstatnou protilátkovou odezvou nebo laboratorně potvrzenou chřipkovou nemocí nebo infekcí, a analyzováním rozdílu (ANOVA), a porovnat postvakcinaění průměrný reciproký log2 titru protilátky. Modifikovaný test Bonferroniho nepravidelnosti a Tukey-Kramerův test se aplikovaly v případě, kdy bylo pro dosažení konečného výsledku vhodné provést více možných srovnání.
Výsledky
Reaktogenícíta rHAO vakcíny v této studii byly bezpečné a velmi tolerantní. Nezdálo se, že by byla frekvence nežádoucích reakcí ovlivněna změnou dávky rHAO antigenu v rozmezí od 10 do 90 pg, ale přidáním kamence se může mírně zvýšit. Lokalizovaný erytém, citlivost a bolestivost v místě injekce byly častěji zaznamenány u jedinců, kterým se aplikovala schválená subvironová vakcí25 na, než u jedinců kterým se aplikovalo 15 nebo 90 pg rHAO ve fyziologickém roztoku. S výjimkou jediné osoby, která pociťovala po imunizaci schválenou vakcínou v paží středně silnou bolest, citlivost a ztuhlost, byly všechny příznaky hodnoceny jako příznaky mírné povahy, které zpravidla trvaly 1 až 2 dny. Lokalizovaný erytém a/nebo zatvrdnutí, pokud se objevilo, bylo podstatně menší než čtvrtdolar.
Imunogenicita
Základní titry sérové HAI protilátky proti chřipkovému viru A/Beijing/32/92 (H3N2) dosahovaly maximálně 1:8 u 64 (50%) ze 127 zúčastněných subjektů. Většina subjektů v každé ze čtyř vakcinovaných skupin poskytla HA-specifickou sérologickou odpověď, měřeno pomocí HAI a testu ELISA (tabulka 4). Postvakcinaění titry sérové HAI protilátky dosahovaly u všech osob, kterým byla podána-vakcína maximálně 1:32 s výjimkou dvou osob, kterým bylo podáno 15 pg rHAO a jedné osoby, která byla podána již schválená vakcína. Vakcinace byla jinak u většiny dobrovolníků spojena s produkcí neutralizační protilátky. Průměrné zvýšení titrů protilátky a hodnoty sérokonverze po imunizaci 15 pg rHAO bylo poněkud nižší než v případě imunizace již schválenou vakcínou, nicméně tyto rozdíly neměly statistický význam. Protilátková odezva na rHAO se přidáním kamence nezvýšila. Subjekty imunizované 90 pg rHAO dosáhly po vakcinaci průměrného titru HAI a ELISA IgG protilátky, který byl dvakrát až pětkrát vyšší než v případě zjištěné zbývajících tří vakcinaČních skupin (rozdíly při porovnávání titrů sérového HAI byly statisticky významné).
Ochranná účinnost
V průběhu sledované periody, zaznamenalo celkem 28 subjektů chorobu podobnou chřipce.
Čtyřem z těchto jedinců (z nichž třem bylo aplikováno placebo a jednomu, který byl imunizován 15 pg rHAO) byl z nosohltanových kultur izolován chřipkový virus typu A (H3N2). Podstatné zvýšení titru HAI protilátky proti chřipkovému viru A/Beijing/32/92 (H3N2) mezi předsezónním a postsezonním vzorkem séra bylo rovněž zjištěn ve třech ze čtyřech případech, kdy byl v kultuře potvrzen virus, ale u žádného dalšího jedince, který zaznamenal chorobu. Jediný rHAO příjemce,
u kterého se následně vyvinula laboratorně potvrzená chřipková choroba, měl pozitivní kulturu získanou 31 dní po imunizaci a sérokonvertoval se z prevakcinačního HAI titru, který byí menší než 1:4, na postvakcinační (předsezónní) titr, který dosahoval 1:32. Dvě další osoby, kterým se podávalo placebo, a jeden dobrovolník imunizovaný již schválenou vakcínou měl sérologický důkaz infíkace chřipkovým virem A (H3N2) v průběhu epidemického období při absenci klinické nemoci. Při srovnání všech vakcinovaných subjektů (neboli všech subjektů, kteří přijali libovolnou rHAO vakcínu) se zjistilo, že u jedinců, kterým bylo aplikováno pouze placebo, bylo zaznamenáno podstatně vyšší procento jedinců, kteří prodělali laboratorně potvrzenou chřipku typu A (H3N2) (p<0,05) nebo kteří byly infikováni jejím virem (p<0,005).
Výše uvedené výsledky naznačují, že chřipkové vakcíny obsahující purifíkovaný rHAO antigen, připravené způsobem popsaným ve výše uvedené patentové přihlášce, jsou tolerantní a schopné vyvolávat ochranné imunitní odezvy u lidských subjektů. I při dávce 90 gg nebyl rHAO, hodnocený v této studii, reaktogeničtější než placebo na bázi fyziologického roztoku a způsoboval pódií statně méně místních nežádoucích reakcí než již schválená a patentovaná trojvalenční subvirionová vakcína obsahující poloviční množství (tj, 45 μg) celkového HA antigenů.
Odezvy neutralizačních HA-specifických protilátek na 15 gg rHAO přípravku byly srovnatelné s odezvami vyvolanými subvirionovou vakcínou a podstatně se zvýšily zvýšením dávky rHAO na 90 gg.
Celková četnost infíkace a nemoci, způsobená přirozenou expozicí cirkulujícímu epidemickému chřipkového kmenu A (H3N2), byla podstatně nižší u vakcinovaných subjektů než u jedinců, kterým se podalo placebo. Z těchto výsledků vyplývá, že ochranná imunita poskytnutá rHAO, zejména pokud je podán ve vyšších dávkách, je srovnatelná nebo vyšší než ochranná imunita, získaná aplikací v současnosti dostupných vakcín.
Tabulka 4 Odezvy Sérových protilátek u mladých dospělých subjektů, po imunizaci vakc zahrnujícími purifikovaný rekombinantní hemaglitinin (rHAO) získaný z chřipkového A/Beijing/32/92 (H3N2)r již schválenou třívalenční subvironovou vakcínu obsahující 15 pg A/Beijing/32/92 (H3N2) nebo placebo tvořené fyziologickým roztokem._
Neutralizace protilátky 1 Ν β Ή κ ΰ fl* Φ # Λ|χη tn CD 76 rt oi to Ol 03
0 Oj fl· O d o o i—1 (fl O d rt oí a· o d (fl o I—1 fl· o d Ol Ol Ί* o -H Lfj
1 Ή 1 (ti tí o d »υ ΰ U Λ Μ Ί3 tí a P o -d φ -d -d 55 C H 4J Oí rt o -H P* tn A· O d fl· rt rt o -H r- rfl rt a d co tn fl» o d rt til
ELISA IgG HA protilátka X Ali xo > Ή <#> Μ β m 09 rt r- o o r4 Cfl Ol O
O a rt O d O s. <N rt fl· O d m rt rt fl· ht O d rt rt rt a* o d o CM rt rt O d rt Ol
W M t M JJ <D tíl -d >d ω -u o, rt O d co fl· O d fl< Ol fl· O d tn a fl· O d rt CD O d r4 * A
HAI protilátka σΐ « ·· <d <*> Λ| <N Ol o o rt o o rt LO A 00
X ΛΙ J, Λ) « >1 e > Ή <#> N C tn o ffl CD O O i-i o o r4 o
+J (0 0 Cu + tO O d O Ol + fl· O d ID 03 M O -H r4 r4 r4 + tn o -H rt Ol tn O d (0 rt
d H JJ <1) rf -d d X JJ cu rt *. o d r- rt in s s <*> i fl» o d rt rt ·. o d t rt m s o d r- rt
m xi) tí -M tí rt 0) *d u >u a 3 8.«S > — > n cn q tí.~ rf KD tí ď) N Μ °d *· u o Λ 2· tí O tí. m φ _ rf tí β tO tí tf) d (fl M d rd ajx — bi O =L~ rf to 3 O <N d σι Schvále- ný subviron (26) 0 Λ <tí 0 — (ti V •d M CU
HAI, hemaglutinaČní inhibice; HA, hemaglutinin. Vzorky postvakcinačního séra se získaly tři týdny po imunizaci. Titry protilátky se vyjádřily jako průměry reciprokého log2+.SEM. Statistická srovnání se provedla mezi průměrným postvakcinačním HAI titrem navržené skupiny a průměrným postvakcinačním. titrem 90 pg rHAO vakcinační skupiny analýzou rozdílu pomocí Dunnettova testu pro vícečetná srovnání. P<0,l; + , P<0,05; #, P<0,01.
Ί I
Příklad 11
Způsob výroby zlepšeného HAO klonujícího vektoru
Byl navržen vylepšený klonovací vektor pro expresi zralého HA, ve kterém se gen kódující HA lokalizoval bezprostředně za sekvencí kódující chitínázový signální peptid.
Vytvořil se lineární pMGS27 s jednořetězcovými konci io
V pMGS12 plasmidů se HA nakloňoval do Szwal nebo Kpn\ místa bezprostředně za chitinázovým signálním peptidem, Nukleokyselinová a aminokyselinová sekvence jsou znázorněny jako SEQ ID NO: 22, resp. SEQ ID NO: 23:
5' -chitínázový signální peptid Smál Kpnl
TGG TTG GTC GCC GTT TCT AAC GCG ATT CCC GGG GGT ACC
TRP LEU VAL ALA VAL SER ASN ALA ILE PRO GLY GLY THR
Tento úsek se změnil pomocí oligo řízené mutageneze za vzniku pMGS27 (změněné báze jsou podtržené) (SEQ ID NO: 24):
5'TGG TTA GTC GCC GTG TCCTGCAGGCCAGAGAGGCCTT GGT ACC
Pstl
Plasmid pMGS27 se linearizoval Ps/l sestřihem (znázorněné zbytky 6 až 35 SEQ ID NO. 24):
A GTC GCC GTG TCC TGCA 5' GGCCAGAGAGGCC T
T CAG CGG CAC AGG 5' ACGTCCGGTCTCTCCGG A načež se lineárním pMGS27 ošetřil T4 DNA polymerázou plus dATP za vzniku výše uvedených jednořetězcových konců (zbytky 23 až 36 a doplněk zbytků 6 až 18 SEQ ID NO. 24):
A 5' GGCCAGAGAGGCC T
T CAG CGG CAC AGG 5' A
Cílový HA gen se nakloňoval do pMGS27
Krok 1 Syntetizovaly se PCR primery
Původní oligo (SEQ ID NO: 25):
5' GTC GCC GTG TCC AAC GCG (5' konec 20 bází zralého HA)
Reverzní oligo [doplněk SEQ ID NO:26):
(3' konec 20 bází zralého HA) ATT AA CCGGTCTCTCCGG 5'
PCR HA genu
PCR cílového HA genu se dvěma oligonukleotidy se použil pro získání (SEQ ID NO: 25 a SEQ
ID NO: 26):
5' GTC GCC GTG TCC AAC GCG (zralý HA)
CAG CGG CAC AGG TTG CGC {zralý HA)
TAA TTGGCCAGAGAGGCC 3' 5 ATT AACCGGTCTCTCCGG
Tepelná hybridizace cílového HA genu do pMHGS27 a transformace E. coli
Lineární pMGS27 a T4 DNA polymerázou ošetřený PCR fragment HA genu se smísily. Dvě molekuly vzájemně tepelně hybridizovaly za vzniku kruhového plasmidů, který je připraven pro io použití při transformování E. coli. Diagram zahrnuje SEQ ID NOS. 25 a 26, zbytky 23 až 36 a 6 až 18 SEQ ID NO. 24
SEQ ID NO: 24.
GTCGCCGTGTCCAACGCG (zralý HA) TAATT
TTGCGC (zralý HA) ATTAACCGGTCTCTCCGG
A
TCAGCGGCACAGG
GGCCAGAGAGGCCT
A až chitinázový signální peptid konec
GTCGCCGTGTCCAACGCG (zralý HA
TAATT GGCCAGAGAGGCCT
Z výše uvedeného vyplývá, že mezi signálním peptidem a zralým HA neexistuje žádná další aminokyselina.
Příklad 12
Příprava a účinnost trojvalenčních chřipkových vakcín typu A a B 1995-1996
Chřipková vakcína, purifikovaný rekombinantní hemaglutinin, trojvalenční chřipková vakcína typu A a B A/Texas/36/92/1 (H1N1), A/Johanesburg/33/94 (H3N2) a B/Harbin/7/94)je neinfekční podjednotka odvozená z purifikovaných rekombinantních chřipkových hemaglutininových antigenů (HA). HA geny se klonovaly z výše popsaných kmenů chřipkových virů A a B, doporučených institucí pro kontrolu léčiv a k identifikaci jednotlivých klonovaných genů se použila
DNA sekvenční analýza. Bakulovirové expresní vektory obsahující klonované HA geny z chřipkových virových kmenů A/Texas/36/91 (H1N1), A/Johanesburg/33/94 (H3N2), B/Harbin/7/94 se použily pro výrobu rekombinantních HA antigenů v kultivovaných hmyzích buňkách. Rekombinantní HA proteiny jsou celodélkové, neštěpené hemaglutininy (rHAO) s molekulovou hmotností přibližně 69 000. rHAO se produkují v buněčné linii Spodoptery frugiperdy (rád motýlů) uchován vane v séru prostém kultivačním médiu. Třívalenční vakcíny jsou tvořeny purifikovaným (s více než 95% čistotou, pravděpodobněji s99% čistotou) rHAO ze dvou chřipkových A kmenů a jednoho B kmene, smíchanými ve stejném poměru. Vakcína, která se dodává pro klinické použití, je tvořena puriftkovanými typy A B rHAO proteinů ve fosfátem pufrovaném fyziologic5 kém roztoku bez konzervačních látek.
Studie, testující jednovalenční, dvouvalenční a trojvalenční rHAO vakcíny na zvířatech, měly ukázat, že jsou v podstatě netoxické. Ve vakcíně nebyla zjištěna žádná toxická látka. Studie obecné bezpečnosti a imunogenicity A/Beijing/32/92 a A/Texas/36/91 rHAO se prováděly na myších io a morčatech. Při těchto studiích nebyly zaznamenány žádné nežádoucí reakce. U myší jediná imunizace 15mikrogramy rHAO antigenů bez adjuvansu vyvolala během dvou až tří týdnů vytvoření vysoké hladiny anti-HA IgG protilátek, hemaglutininově inhibičních (HAI) protilátek a neutralizačních protilátek.
V jedné studii se skupiny deseti myší imunizovaly 15 gg purifíkovaného rHAO A/Beijing/32/92 (H3N2) vyrobeného v buňkách přizpůsobených médiu obsahujícímu 10% fetální bovinní sérum nebo rHAO, vyrobeným v hmyzích buňkách přizpůsobených médiu obsahujícímu 10% fetální bovinní sérum nebo rHAO vyrobeném v hmyzích buňkách přizpůsobených séra prostému médiu (rHAO-SF). Dva a tři týdny po infikaci se myším odebrala krev a připravily se vzorky séra.
V každého séra se stanovoval obsah anti-HA IgG a HAI protilátek. Jak rHAO, tak rHAO-SF antigeny poskytují podobné titry anti-HA a HAI protilátek. Dva týdny po imunizaci měla většina myší značné titry HAI protilátek a do tří týdnů osm z deseti myší v každé skupině mělo HAI titry 32 nebo vyšší. Tyto a další biochemické a imunologické studie ukázaly, že rHAO produkovaný v séra prosté hmyzí buněčné kultuře, je nerozlišitelný od rHAO vyrobeného za sérum obsahuj í25 cích fermentačních podmínek.
Cílem další studie bylo porovnat 1994-1995 formulaci trojvalenční rHAO chřipkové vakcíny s již schválenou vakcínou Fluvirin povrchového antigenu purifíkovaného viru (ředěná chřipková virová vakcína obsahující 15 gg rHAO nebo virového HA na 0,5 ml z A/Texas/36/91 (HIN1),
A/Shangdong/9/93 (H3N2) a B/Panama/45/90 chřipkových kmenů.
Tabulka 5
Srovnání trojvalenční rHAO vakcíny s Fluvirinem
Srovnání trojvalenční rHAO vakcíny s Fluvirinem.
II GMT (n=10 myší) | Virový kmen použi tý (jako antigen Trojvalenční rHAO Fluvirin CHřipkovál vakcína GMT (n=10 myší) 1 anti-HA IgG anti-HA IgG
Týden 0 Týden 3 Týden 0 Týden 3
A/Texas/36/91 (H1N1) <1000 103.000 <1000 11.200
IA/Shangdong/32/92 I(H3N2) <1000 162.400 <1000 41.000
|B/Panama/45/90 <1000 164.800 <1000 26.000
ll Virový kmen použitý Jjako antigen HAI HAI |
JA/Texas/36/91 (H1N1) <8 1.522 <8 1.088
A/Shangdong/32/92 (H3N2) <8 494 <8 435
B/Panama/45/90 <8 174 <8 42 J
Virový kmen použitý jako antigen Neutralizační Ab Neutralizační Ab !
A/Texas/36/91 (H1N1) <100 5.800 <100 2.720
A/Shangdong/32/92 (H3N2) <100 840 <100 360
B/Panama/45/90 <100 1.300 <100 700
Konečně je třeba uvést, že výše popsané způsoby a kompozice mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.
Sekvenční protokol (1) údaje k SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 12 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina io (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:
AGCAAAAGCA GG 12 (1) údaje k SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2
GGGGGTACCC CCGGGAGCAA AAGCAGGGGA AAATAAAAA (1) údaje k SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3
CCCGCTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG 35 (I) údaje k SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 bazických párů 20 (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4
GGGGGTACCC CCGGGGACAC AATATGTATA GGCTACCAT 39 (1) údaje k SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5
CCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG 35
(1) údaje k SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: I 793 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Bejing/32/92 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE, lažl 8 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinové signální sekvence (B) POZICE. 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE. 73 až 11 728 35 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE. 1771 až 1777 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE. 1 776 až 1 782 35 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE. 1 783 až 1 793
CZ 301021 BÓ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGACTTTCCA GGAAATGACA ACAGCACAGC AACGCTGTGC 120
CTGGGACATC ATGCAGTGCC AAACGGAACG CTAGTGAAAA CAATCACGAA TGATCAAATT 180
GAAGTGACTA ATGCTACTGA GCTGGTTCAG AGTTCCTCAA CAGGTAGAAT ATGCGACAGT 240
CCTCACCGAA TCCTTGATGG AAAAAACTGC ACACTGATAG ATGCTCTATT GGGAGACCCT 300
CATTGTGATG GCTTCCAAAA TAAGGAATGG GACCTTTTTG TTGAACGCAG CAAAGCTTAC 360
AGCAACTGTT ACCCTTATGA TGTACCGGAT TATGCCTCCC TTAGGTCACT AGTTGGCTCA 420
TCAGGCACCC TGGAGTTTAT CAATGAAGAC TTCAATTGGA CTGGAGTCGC TCAGGATGGG 480
GGAAGCTATG CTTGCAAAAG GGGATCTGTT AACAGTTTCT TTAGTAGATT GAATTGGTTG 540
CACAAATCAG AATACAAATA TCCAGCGCTG AACGTGACTA TGCCAAACAA TGGCAAATTT 600
GACAAATTGT ACATTTGGGG GGTTCACCAC CCGAGCACGG ACAGAGACCA AACCAGCCTA 660
TATGTTCGAG CATCAGGGAG AGTCACAGTC TCTACCAAAA GAAGCCAACA AACTGTAACC 720
CCGAATATCG GGTCTAGACC CTGGGTAAGG GGTCAGTCCA GTAGAATAAG CATCTATTGG 780
ACAATAGTAA AACCGGGAGA CATACTTTTG ATTAATAGCA CAGGGAATCT AATTGCTCCT 840
CGGGGTTACT TCAAAATACG AAATGGGAAA AGCTCAATAA TGAGGTCAGA TGCACCCATT 900
GGCACCTGCA GTTCTGAATG CATCACTCCA AATGGAAGCA TTCCCAATGA CAAACCTTTT 960
CAAAATGTAA ACAGGATCAC ATATGGGGCC TGCCCCAGAT ATGTTAAGCA AAAGACTCTG 1020
AAATTGGCAA CAGGGATGCG GAATGTACCA GAGAAACAAA CTAGAGGCAT ATTCGGCGCA 1080
ATCGCAGGTT TCATAGAAAA TGGTTGGGAG GGAATGGTAG ACGGTTGGTA CGGTTTCAGG 1140
CATCAAAATT CTGAGGGCAC AGGACAAGCA GCAGATCTTA AAAGCACTCA AGCAGCAATC 1200
GACCAAATCA ACGGGAAACT GAATAGGTTA ATCGAGAAAA CGAACGAGAA ATTCCATCAA 1260
ATCGAAAAAG AATTCTCAGA AGTAGAAGGG AGAATTCAGG ACCTCGAGAA ATATGTTGAA 1320
GACACTAAAA TAGATCTCTG GTCTTACAAC GCGGAGCTTC TTGTTGCCCT GGAGAACCAA 1380
CATACAATTG ATCTAACTGA CTCAGAAATG AACAAACTGT TTGAAAAAAC AAGGAAGCAA 1440
CTGAGGGAAA ATGCTGAGGA CATGGGCAAT GGTTGCTTCA AAATATACCA CAAATGTGAC 1500
AATGCCTGCA TAGGGTCAAT CAGAAATGGA ACTTATGACC ATGATGTATA CAGAGACGAA 1560
GCATTAAACA ACCGGTTCCA GATCAAAGGT GTTGAGCTGA AGTCAGGATA CAAAGATTGG 1620
ATCCTATGGA TTTCCTTTGC CATATCATGC TTTTTGCTTT GTGTTGTTTT GCTGGGGTTC 1680
ATCATGTGGG CCTGCGAAAA AGGCAACATT AGGTGCAACA TTTGCATTTG AGTGTATTAA 1740
TTAAAAACAC CCTTGTTTCT AGGATGATTC GGTACCAGAT CTTAATTAAT TAA 1793
CZ 301021 Bó (1) údaje k SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 570 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne 15 (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Bejing/32/92 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE, laž 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ. Zralá rHA (B) POZICE: 19 až 552 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:
Met Pro 1 Leu Tyr Lys Leu 5 Leu Asn Val Leu 10 Trp Leu Val Ala Val 15 Ser
Asn Ala Ile Pro Gly Asp 20 Phe Pro Gly 25 Asn Asp Asn Ser Thr 30 Ala Thr
Leu Cys Leu 35 Gly His His Ala Val 40 Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr
Ile Thr 50 Asn Asp Gin Ile Glu 55 Val Thr Asn Ala Thr GÍu 60 Leu Val Gin
Ser Ser 65 Ser Thr Gly Arg 70 Ile Cys Asp Ser Pro 75 His Arg Ile Leu Asp 80
Gly Lys Asn Cys Thr Leu 85 Ile Asp Ala Leu 90 Leu Gly Asp Pro His 95 Cys
Asp Gly Phe Gin Asn Lys 100 Glu Trp Asp 105 Leu Phe Val Glu Arg 110 Ser Lys
Ala Tyr Ser 115 Asn cys Tyr Pro Tyr 120 Asp Val Pro Asp Tyr 125 Ala Ser Leu
Arg Ser Leu val Ala Ser ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu Asp
130 135 140
Phe Asn Trp Thr Gly Val Ala Gin Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Cys Lys
145 150 155 160
Arg Gly Ser Val Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Bis Lys
165 170 175
Ser Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Gly
ieo 185 190
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val Hifi His Pro Ser Thr Asp
195 200 205
Arg Asp Gin Thr Ser Leu Tyr Val Arg Ala Ser Gly Arg Val Thr Val
210 215 220
Ser Thr Lys Arg Ser Gin Gin Thr Val Thr Pro Asn Ile Gly Ser Arg
225 230 235 240
Pro Trp Val Arg Gly Gin Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile
245 250 255
Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile
260 265 270
Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Ser Ile Met
275 280 285
Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Thr Cys Ser Ser Glu Cys Ile Thr Pro
290 295 300
Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gin Asn Val Asn Arg Ile
3 05 310 315 320
Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu
325 330 335
Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gin Thr Arg Gly Ile Phe
340 345 350
Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp
355 360 365
Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gin Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gin Ala
370 375 380
Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gin Ala Ala Ile Asp Gin Ile Asn Gly Lys
385 390 395 400
Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gin Ile Glu
405 410 415
Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gin Asp Leu Glu Lys Tyr
420 425 430
Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu
435 440 445
Val Ala Leu Glu Asn Gin His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met
450 455 460
Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Lys Gin Leu Arg Glu Asn Ala Glu
485 470 475 480
Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala
485 490 495
cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg
500 505 510
Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gin Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys
515 520 525
Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys
530 535 540
Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gin
545 550 555 560
Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ue
565 570
(1) údaje k SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1 766 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina
Λ i (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne to (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Texas/36/91 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE, laž 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinového signálního peptidu (B) POZICE. 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE. 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Knpl restrikční místa (B) POZICE. 82 až 87 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE. 88 až 93 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE. 73 až 1 734 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Knpl restrikční místa (B) POZICE. 1 744 až 1749 so (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Bglll restrikční místa (B) POZICE. 1750 až 1755 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE. 1756 až 1766 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGGTACCCCC GGGGACACAA TATGTATAGG CTACCATGCG 120
AACAACTCAA CCGACACTGT TGACACAGTA CTTGAGAAGA ACGTGACAGT GACACACTCT 180
GTCAACCTAC TTGAGGACAG TCACAACGGA AAACTATGTC GACTAAAGGG AATAGCCCCA 240
CTACAATTGG GTAATTGCAG CGTTGCCGGA TGGATCTTAG GAAACCCAAA ATGCGAATCA 300
CTGTTTTCTA AGGAATCATG GTCCTACATT GCAGAAACAC CAAACCCTGA GAATGGAACA 360
TGTTACCCAG GGTATTTCGC CGACTATGAG GAACTGAGGG AGCAATTGAG TTCAGTATCA 420
TCATTCGAGA GATTCGAAAT ATTCCCCAAA GAAAGCTCAT GGCCCAACCA CACCGTAACC 480
AAAGGAGTAA CGAGATCATG CTCCCATAAT GGGAAAAGCA GTTTTTACAG AAATTTGCTA 540
TGGCTGACGG AGAAGAATGG CTTGTACCCA AATCTGAGCA AGTCCTATGT AAACAACAAA 600
GAGAAAGAAG TCCTTGTACT ATGGGGTGTT CATCACCCGT CTAACATAAG GGACCAAAGG 660
GCCATCTATC ATACAGAAAA TGCTTATGTC TCTGTAGTGT CTTCACATTA TAGCAGAAGA 720
TTCACCCCAG AAATAGCAAA AAGACCCAAA GTAAGAGATC AAGAAGGAAG AATTAACTAC 780
TACTGGACTC TGCTGGAACC CGGGGACACA ATAATATTTG AGGCAAATGG AAATCTAATA 840
GCGCCATGGT ATGCTTTCGC ACTGAGTAGA GGCTTTGGGT CAGGAATCAT CACCTCAAAC 900
GCATCAATGG ATGAATGTGA CGCGAAGTGT CAAACACCCC AGGGAGCTAT AAACAGTAGT 960
CTTCCTTTCC AGAATGTACA CCCAGTCACA ATAGGAGAGT GTCCAAAGTA TGTCAGGAGT 1020
ACAAAATTAA GGATGGTTAC AGGACTAAGG AACATCCCAT CCATTCAATC CAGAGGTTTG 1080
TTTGGAGCCA TTGCCGGTTT CATTGAAGGG GGGTGGACTG GAATGATAGA TGGATGGTAT 1140
GGTTATCATC ATCAGAATGA ACAAGGATCT GGCTATGCTG CGGACCAAAA AAGCACACAA 1200
AATGCCATTA ACGGGATTAC AAACAAGGTG AATTCTGTAA TCGAGAAAAT GAACACTCAA 1260
TTCACAGCTG TGGGCAAAGA ATTCAACAAA TTAGAAAGAA GGATGGAAAA CTTAAATAAA 1320
AAAGTTGATG ATGGATTTCT GGACATTTGG ACATATAATG CAGAATTGTT GGTTCTACTG 1380
GAAAATGGAA GGACTTTGGA TTTTCATGAC TCAAATGTGA AGAATCTGTA TGAGAAAGTA 1440
AAAAGCCAAT TGAAGAATAA TGCCAAAGAA ATAGGGAACG GGTGTTTTGA ATTCTATCAC 1500
AAGTGTAACA ATGAATGCAT GGAAAGTGTG AAAAATGGAA CTTATGACTA TCCAAAATAT 1560
TCCGAAGAAT CAAAGTTAAA CAGGGGAAAA ATTGATGGAG TGAAATTGGA ATCAATGGGA 1620
GTCTATCAGA TTCTGGCGAT CTACTCAACT GTCGCCAGTT CACTGGTGCT TTTGGTCTCC 1680
CTGGGGGCAA TCAGCTTCTG GATGTGTTCT AATGGGTCTT TGCAGTGCAG AATATGAATC 1740 TGAGGTACCA GATCTTAATT AATTAA 1766 . AI (1) údaje k SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 572 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne 15 (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Texas/36/91 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová sekvence (B) POZICE. 1 až 18 (ix) ZNAKY:
(A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 19 až 554 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
1 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr Pro Gly Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr
20 25 30
His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn
35 40 45
Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly
50 55 60
Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile Ala Pro Leu Gin Leu Gly Asn Cys
65 70 75 80
ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn Pro Lys Cys Glu Ser Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile Ala Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn
100 105 110
Gly Thr cys Tyr Pro Gly Tyr Phe Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu
115 120 125
Gin Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg phe Glu Ile Phe Pro Lys
130 135 140
Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr Val Thr Lys Gly Val Thr Arg Ser
145 150 155 160
Cys Ser His Asn Gly 165 Lys Ser Ser Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu
170 175
Thr Glu Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn
180 185 190
Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His Pro Ser
195 200 205
Asn Ile Arg Asp Gin Arg Ala Ile Tyr His Thr Glu Asn Ala Tyr Val
210 215 220
Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala
225 230 235 240
Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gin Glu Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp
245 250 255
Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn
260 265 270
Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser
275 2Θ0 285
Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser Met Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys
290 295 300
Gin Thr Pro Gin Gly Ala Ile Asn Ser Ser Leu Pro Phe Gin Asn Val
305 310 315 320
His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys
325 330 335
Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gin ser Arg
340 345 350
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly
355 360 365
Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gin Asn Glu Gin Gly Ser
370 375 380
Gly Tyr Ala Ala Asp Gin Lys Ser Thr Gin Asn Ala Ile Asn Gly Ile
385 390 395 400
Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr
405 410 415
Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu
420 425 430
Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala
435 440 445
Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gly Arg Thr Leu Asp Phe His Asp
450 455 460
Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gin Leu Lys Asn
465 470 475 480
Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys
485 490 495
Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro 500 505 510
Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Gly Lys Ile Asp Gly Val 515 520 525
Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gin Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr 530 535 540
Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser phe 545 550 555 560
Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gin Cys Arg Ile
565 570
Γ (1) údaje k SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: I 799 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Panama/45/90 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE. 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K signální peptidové sekvence (B) POZICE. 16 až 69 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE. 22 až 27 35 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE. 70 až 1773 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Knpl restrikční místa (B) POZICE. 1777 až 1782 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE, 1783 až 1788 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE. 1 789 až 1 799 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:
taaaaaaacc tataaataat gcccgggaag gcaataattg tactactcat GGTAGTAACA 60 TCCAACGCAG ATCGAATCTG CACTGGGATA ACATCTTCAA ACTCACCTCA TGTGGTCAAA 120 ACAGCTACTC AAGGGGAAGT CAATGTGACT GGTGTGATAC CACTGACAAC AACACCAACA 180 AAATCTCATT TTGCAAATCT AAAAGGAACA AAGACCAGAG GGAAACTATG CCCAAACTGT 240 CTCAACTGCA CAGATCTGGA TGTGGCCTTG GGCAGACCAA TGTGTGTGGG GACCACACCT 300 TCGGCAAAAG CTTCAATACT CCACGAAGTC AGACCTGTTA CATCCGGGTG CTTTCCTATA 360 ATGCACGACA GAACAAAAAT CAGACAGCTA CCCAATCTTC TCAGAGGATA TGAAAATATC 420 AGATTATCAA CCCAAAACGT TATCAACGCA GAAAGAGCAC CAGGAGGACC CTACAGACTT 480 GGAACCTCAG GATCTTGCCC TAACGTTACC AGTAGAGACG GATTCTTCGC AACAATGGCT 540
TGGGCTGTCC CAAGGGACAA CAAAACAGCA ACGAATCCAC TAACAGTAGA AGTACCATAC 600 ATTTGTACCA AAGGAGAAGA CCAAATTACT GTTTGGGGGT TCCATTCTGA TAACAAAATC 660 CAAATGAAAA ACCTCTATGG AGACTCAAAT CCTCAAAAGT TCACCTCATC TGCCAATGGA 720 GTAACCACAC ATTATGTTTC TCAGATTGGT GGCTTCCCAA ATCAAACAGA AGACGGAGGG 780 CTACCACAAA GCGGCAGAAT TGTTGTTGAT TACATGGTGC AAAAACCTGG GAAAACAGGA 840 ACAATTGTCT ATCAAAGAGG TGTTTTGTTG CCTCAAAAGG TGTGGTGCGC AAGTGGCAGG 900 AGCAAGGTAA TAAAAGGGTC CTTGCCTTTA ATTGGTGAAG CAGATTGCCT TCACGAAAAA 960 TACGGTGGAT TAAACAAAAG CAAGCCTTAC TACACAGGAG AACATGCAAA AGCGATAGGA 1020 AATTGCCCAA TATGGGTGAA AACACCTTTG AAGCTTGCCA ATGGAACCAA ATATAGACCT 1080 CCTGCAAAAC TATTAAAGGA AAGGGGTTTC TTCGGAGCTA TTGCTGGTTT CTTAGAAGGA 1140 GGATGGGAAG GAATGATTGC AGGTTGGCAC GGATACACAT CTCATGGAGC ACATGGAGTG 1200 GCAGTGGCAG CAGACCTTAA GAGTACGCAA GAAGCCATAA ACAAGATAAC AAAAAATCTC 1260 AATTCTTTGA GTGAGCTAGA AGTAAAGAAT CTTCAAAGAC TAAGTGGTGC CATGGATGAA 1320 CTCCKCAACÚ AAATACTCGA GCTGGATGAG AAAGTGGATG ATCTCAGAGC TGACACAATA 1380 AGCTCGCAAA TAGAGCTTGC AGTCTTGCTT TCCAACGAAG GAATAATAAA CAGTGAAGAT 1440
GAGCATCTAT TGGCACTTGA GAGAAAACTA AAGAAAATGC TGGGTCCCTC TGCTGTAGAC 1500
ATAGGQAATG GATGCTTCGA AACCAAACAC AAGTGCAACC AGACCTGCTT AGACAGGATA 1560
GCTGCTGGCA CCTTTAATGC AGGAGAATTT TCTCTTCCCA CTTTTGATTC ACTGAATATT 1620 ACTGCTGCAT CTTTAAATGA TGATGGATTG GATAATCATA CTATACTGCT CTACTACTCA 1680 ACTGCTGCTT CTAGTTTGGC TGTAACATTG ATGATAGCTA TTTTTATTGT TTATATGGTC 1740 TCCAGAGACA ATGTTTCTTG TTCCATC7GT CTGTGAGGTA CCAGATCTTA ATTAATTAA 1799
(1) údaje k SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 585 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) DRUH MOLEKULY: peptid ( iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne 15 (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Panama/45/90 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: HA signální peptid (B) POZICE. 1 až 17 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE. 18 až 568 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:
Met Pro 1 Ala Asp Gly Arg Lys Ala 5 Ile Cys 20 Ile Thr Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn
10 15 His Val
Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro
25 30
Val Lys Thr Ala Thr Gin Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro
35 40 45
Leu Thr Thr Thr Pro Thr Ly3 Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr
50 55 60
Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu
65 70 75 80
Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala
85 90 95
Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe
100 105 110
Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gin Leu Pro Asn Leu Leu
115 120 125
Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gin Asn Val Ile Asn Ala
130 135 140
Glu Arg Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly ser cys
145 150 155 160
CL 301021 B6
Pro Asn Val Thr Ser Arg Asp Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala
165 170 175
Val Pro Arg Asp Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val
18Q 185 190
Pro Tyr Ile Cys Thr Lys Gly Glu Asp Gin Ile Thr Val Trp Gly Phe
195 200 205
His Ser Asp Asn Lys Ile Gin Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn
210 215 220
Pro Gin Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val
225 230 235 240
Ser Gin Ile Gly Gly Phe Pro Asn Gin Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro
245 250 255
Gin Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gin Lys Pro Gly Lys
260 265 270
Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gin Arg Gly Val Leu Leu Pro Gin Lys Val
275 280 285
Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu
290 295 300
Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys
305 310 315 320
Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys
325 330 335
Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr
340 345 350
Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile
355 360 365
Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp His
370 375 380
Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Lys Ser Thr Gin Glu Ala Ile Asn Lys Zle Thr Lys Asn Leu Asn Ser
405 410 415
Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gin Arg Leu Ser Gly Ala Met
420 425 430
Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp
435 440 445
Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gin Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu
450 455 460
Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu
465 470 475 4B0
Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Asp Ile Gly
4Θ5 490 495
Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gin Thr Cys Leu Asp
500 50S 510
Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr
515 520 525
Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu
530 535 540
Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu
54S 550 555 560
Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser Arg
565 570 575
Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
560 585
(1) údaje k SEQ ID NO: 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1 811 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Netherlands/13/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE. 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinové signální sekvence (B) POZICE. 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE. 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE. 73 až 1785 40 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Knpl restrikční místa (B) POZICE. 1789 až 1794 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE. 1795 až 1800 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE. 1801 až 1811 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 50
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGATCGAATC TGCACTGGGA TAACATCTTC AAAATCACCT 120
CATGTAGTCA AAACAQCTAC TCAAGGGGAG GTCAATGTGA CTGGTGTGAT ACCACTGACG 180
ACAACACCAA CAAAATCTCA TTTTGCAAAT CTCAAAGGAA CAAAGACCAG AGGGAAACTA 240
TGCCCAAACT GTCTCAACTG CAQAGATCTG GATGTGGCCT TGGGCAGACC AATGTGTGTG 300
GGGATCACAC CTTCGGCAAA AGCTTCAATA CTCCACGAAG TCAGACCTGT TACATCCGGG 360
TGCTTTCCTA TAATGCATGA CAGAACAAAA ATCAGACAGC TACCCAATCT 7CTCAGAGGA 420
TATGAAAACA TCAGACTATC AACCCAAAAC GTTATCAACG CAGAAAAGGC ACCAGGAGGA 480
CCCTACAGAC TTGGAACCTC AGGATCTTGC CCTAACGTTA CCAGTAGAAC CGGATTCTTC 540
GCAACAATGG CTTGGGCTGT CCCAAGGGAC AACAAAACAG CAACGAATCC ACTAACAGTA 600
GAAGTACCAT ACATTTGTAC GAAAGGAGAA GACCAKATTA CTGTTTGGGG GTTCCATTCT 660
GATAACAAAA CCCAAATGAA AAACGTCTAT GGAGACTCAA ATCCTCAAAA GTTCACCTCA 720
TCTGCCAATG GAGTAACCAC ACATTATGTT TCTCAGATTG GTGGCTTCCC AGATCAAACA 780
GAAGACGGAG GACTACCACA AAGCGGCAGA ATTGTTGTTG ATTACATGGT GCAAAAACCT 840
GGGAAAACAG GAACAATTGT CTATCAAAGA GGTATTTTGT TGCCTCAAAA GGTGTGGTGC 900
GCAAGTGGCA GGAGCAAGGT AATAAAAGGG TCCTTGCCTT TAATTGGTGA AGCAGATTGC 960
CTTCACGAAA AATACGGTGG ATTAAACAAA AGCAAGCCTT ACTACACAGG AGAACATGCA 1020
AAAGCCATAG GAAATTGCCC AATATGGGTG AAAACACCTT TGAAGCTTGC CAATGGAACC 1080
AGATATAGAC CTCCTGCAAA ACTATTAAAG GAAAGGGGTT TCTTCGGAGC TATTGCTGGT 1140
TTCTTAGAAG GAGGATGGGA AGGAATGATT GCAGGTTGGC ACGGATACAC ATCTCACGGG 1200
GCACATGGAG TGGCAGTGGC AGCAGACCTT AAGAGTACGC AAGAAGCCAT AAACAAGATA 1260
ACAAAAAATC TCAATTCTTT GAGTGAGCTA GAAGTAAAGA ACCTTCAAAG ACTAAGTGGT 1320
GCCATGGATG AACTCCACAA CGAAATACTC GAGCTGGATG AGAAAGTGGA TGATCTCAGA 1380
GCTGACACAA TAAGCTCGCA AATAGAGCTT GCAGTCTTAC TTTCCAACGA AGGAATAATA 1440
AACAGTGAAG ATOAGGATCT ATTGGCACTT GAGAGAAAAC TAAAGAAAAT GCTGGGTCCC 1500 TCTGCTGTAG ACATAGGGAA TGGATGCTTC GAAACAAAAC AGAAGTGCAA CCAGACCTGC 1560 TTAGACAGGA TAGCTGCTGG CACCTTTAAT GCAGGAGAAT TTTCTCTTCC CACTTTTGAT 1620 TCACTGAATA TTACTGCTGC ATCTTTAAAT GATGATGGAT TGGATAATCA TACTATACTG 1680 CTCTACTACT CAACTGCTGC TTCTAGTTTG GCTGTAACAT TGATGATAGC ΤΆΓΠΠΤΑΤΤ 1740 GTTTATATGG TCTCCAGAGA CAATGTTTCT TGTTCCATCT GTCTGTGAGG TACCAGATCT 1800
TAATTAATTA A 1811 « 1 (1) údaje k SEQ ID NO: 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 589 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Netherlands/13/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE. 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE. 19 až 571 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu
1 5
Asn Ale Ile Pro Gly Asp Arg
20
Ser Pro Kis Val val Lys Thr
35
Gly Vel Ile Pro Leu Thr Thr
50 55
Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg
gs 70
Cys Thr Aap Leu Asp Val Ala
85
Thr Pro Ser Ala Lys Ala Ser
100
Ser Gly Cys Phe pro Ile Met
115
Pro Asn Leu Leu Arg Gly Tyx
130 135
Val Ile Asn Ala Glu Lys Ala
145 150
Ser Gly Ser Cys Pro Asn Val
13:
Asn Val Leu Trp Leu Val Ala val Ser
10 15
Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Lys
25 30 Thr
Ala Thr Gin Gly Glu Val Asn val
40 45
Thr Pro Thr Lys ser His Phe Ala Asn
60
Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Leu Asn
75 80
Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Ile
50 95
Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr
105 110
Hle Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gin Leu
120 125
Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gin Asn
140
Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr
155 160
Thr Ser Arg Thr Gly Phe Phe Ala Thr
170 176
165
Met Ala Trp Ala Val Pro Arg Aap Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu 180 185 190
Thr Val Glu val Pro Tyr Ile Cys Thr Lys Gly clu Asp Gin ile Thr 195 300 205
Val Trp Gly Phe Kil Ger Asp Aaa lye Thr Gin Met Lys Asn leu Tyr 310 215 220
Gly Asp Ser Asn Pro Gin Lys Phe Thr ser Ser Ala Asn Gly Val Thr
225 Thr His 230 Tyr Val Ser Gin Ile Gly Gly 235 Phe Pro Asp Gin Thr 240 Glu Asp
Gly Gly 245 Leu Pro Gin Ser Gly Arg Ile 250 Val Val Asp Tyr Met 255 Val Gin
Lys Pro 260 Gly Lys Thr Gly 265 Thr Ile Val 270 Tyr Gin Arg Gly Ile Leu Leu
Pro Gin 275 Lys Val Trp Cys 260 285 Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly
Ser 290 Leu Pro Leu Ile Gly 295 300 Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly
305 Gly Leu 310 Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr 315 Thr Gly Glu His Ala 320 Lys Ala
Ile Gly 325 Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys 330 Thr Pro Leu Lys Leu 335 Ala Asn
Gly Thr 340 Arg Tyr Arg Pro 345 Pro Ala Lys 350 Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe
Phe Oly 355 Ala Ile Ala Gly 360 Phe Leu Glu 365 Gly Gly Tip Glu Gly Met Ile
Ala 370 Gly Trp His Gly Tyr 375 Thr Ser His 380 Gly Ala His Gly Val Ala Val
385 Ala Ala 390 Asp Leu Lys Ser Thr Gin Glu 395 Ala Ile Asn Lys Ile 400 Thr Lys
Asn Leu 405 Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu 410 Val Lys Asn Leu Gin 415 Arg Leu
Ser Gly 420 Ala Met Asp Glu 425 Leu His Asn 430 Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu
Lys Val 435 Asp Asp Leu Arg 440 Ala Asp Thr 445 Ile Ser Ser Gin Ile Glu Leu
Ala 450 Val Leu Leu Ser Asn 455 Glu Gly Ile 46Q Ile Asn Ser Glu Asp Glu His
465 Leu Leu 470 Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys 475 Lys Met Leu Gly Pro 480 Ser Ala
Val Asp 485 Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu 490 Thr Lys His Lys Cys 495 Asn Gin
Thr Cys 500 Leu Asp Arg Ile 505 Ala Ala Gly 510 Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe
Ser Leu 515 Pro Thr Phe Asp 520 Ser Leu Asn 525 Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn
530 Asp Asp Gly Leu Asp Asn 535 His Thr Ile 540 Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala
545 Ala Ser 550 Ser Leu Ala Val Thr Leu Met 555 Ile Ala Ile Phe Ile 560 Val Tyr
Met Val 565 Ser Arg Asp Asn 580 Val Ser Cys 585 570 Ser Ile Cys Leu S75
(1) údaje k SEQ ID NO: 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1 557 bazických párů ίο (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir io (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Shandong/9/93 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE, laž 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinové signální sekvence 20 (B) POZICE. 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa 25 (B) POZICE. 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA 30 (B) POZICE. 73 až 1 728 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Kpnl restrikční místa 35 (B) POZICE. 1 735 až 1 740 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa 40 (B) POZICE. 1741 až 1746 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál 45 (B) POZICE. 1 741 až 1 757 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACCTTTTGTO GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GCAAGACCTT CCAGGAAATG ACAACAGCAC AGCAACGCTO 120
TGCCTGGGAC ATCATGCAGT GCCAAACGGA ACGCTAOTGA AAACAATCAC GAATGATCAA 180
ATTGAAGTGA CTAATGCTAC TGAGTTOCTT CAGAGTTCCT CAACAGGTAG AATATGCGGC 240
AGTCCTCACC GAATCCTTGA TGGAAAAAAC TGCACACTGA TAGATGCTCT ATTGGGAGAC 300
CCTCATTGTG ATGGCTTCCA AAATAAGGAA TGGGACCTTT TTGTTGAACG CAGCAAAGCT 360
TACAGCAACT GTTACCCTTA TOATGTGCCG GATTATGCCT CCCTTAGGTC ACTAGTTGCC 420
TCATCAGGCA CCCTGGAGTT TATCAATGAA GACTTCAATT GGACTGGAGT CGCTCAGGAT 480
GGGGGAAGCT ATGCTTGCAA AAGAGGATCT GTTAACAGTT TCTTTACTAG ATTGAATTGG 540
TTGCACAAAT TAGAATACAA ATATCCAGCG CTGAACGTGA CTATGCCAAA CAATGGCAAA 600
TTTGACAAAT TGTACATTTG GGGGGTTCAC CACCCGAGCA CGGACAGTGA CCAAACCAGC 660
CTATATGTTC GAGCATCAGG GAGAGTCACA GTCTCTACCA AAAGAAGCCA ACAAACTGTA 720
ACCCCGAATA TCGQGTCTAG ACCCTGGGTA AGGGGTCAJGT CCAGTAGAAT AAGCATCTAT 780
TGGACAATAG TAAAACCGGG AGACATACTT TTGATTGATA GCACAGGGAA TCTAATTGCT 840
CCTCGGGGTT ACTTCAAAAT ACGAAATGGG AAAAGCTCAA TAATGAGGTC AGATGCACCC 900
ATTGGCAACT GCAGTTCTGA ATGCATCACT CCAAATGGAA GCATTCCCAA TGACAAACCT 960
TTTCAAAATG TAAACAGAAT CACATATGGG GCCTGCCCCA GATATGTTAA GCAAAACACT 1020
CTOAAATTOG CAACAGGGAT GCGGAATGTA CCAGAGAAAC AAACTAGAGG CATATTCGGC 1080
GCAATCGCAG GTTTCÁTAGA AAATGGTTGG GAGGGAATGG TAGACGGTTG GTACGGTTTC 1140
AGGCATCAAA ATTCTGAGGG CACAGGACAA GCAGCAGATC TTAAAAGCAC TCAAGCAGCA 1200
ATCGACCAAA TCAACGGGAA ACTGAATAGG TTAATCGAGA AAACGAACGA GAAATTCCAT 1260
CAAATCGAAA AAGAATTCTC AGAAGTAGAA GGGAGAATTC AGGACCTCGA GAAATATGTT 1320
GAAGACACTA AAATAGATCT CTGGTCTTAC AACGCGGAGC TTCTTGTTGC CCTGGAGAAC 1380
CAACATACAA TTGATCTAAC TGACTCAGAA ATGAACAAAC TGTTTGAAAA AACAAGGAAG 1440
CAACTGAGGG AAAATGCTGA GGACATGGGC AATGGTTGCT TCAAAATATA CCACAAATGT 1500
GACAATGCCT GCATAGGGTC AATCAGAAAT GGAACTTATG ACCATGATGT ATACAGAGAC 1560
GAAGCATTAA ACAACCGGTT CCAGATCAAA GGTGTTGAGC TGAAGTCAGG ATACAAAGAT 1620
TGGATCCTAT GGATTTCCTT TGQCATATCA TGCTTTTTGC TTTGTGTTGT TTTGCTGGGG 1680
TTCATCATGT GGGCCTGCCA AAAAGGCAAG ATTAGGTGCA ACATTTGCAT TTGAGGTACC 1740
AGATCTTAAT TAATTAA 1757
- 55 .
(1) údaje k SEQ ID NO: 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 571 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne us (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) SDRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Shandong/9/93 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE. I až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE. 19 až 553 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
1 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Gin Asp Leu pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala 20 25 30
Thr Leu Cys 35 Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys 40 45
Thr Ile Thr 50 Asn Asp Gin Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val 55 60
Gin Ser Ser 65 Ser Thr Gly Arg Ile Cys Gly Ser Pro His Arg Ile Leu 70 75 80
Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His 85 90 95
Cys Asp Gly Phe Gin Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser 100 105 HO
Lys Ala Tyr 115 Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser 120 125
Leu Arg Ser 130 Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu 135 140
Asp Phe Asn 145 Trp Thr Gly Vai Ala Gin Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Cys 150 155 160
Lys Arg Gly Ser Val Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His 165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn 180 185 190
Gly Lys Phe 195 Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr 200 205
Asp Ser Asp 210 Gin Thr Ser Leu Tyr Val Arg Ala Ser Gly Arg Val Thr 215 220
Val Ser Thr 225 Lys Arg Ser Gin Gin Thr Val Thr Pro Asn Ile Gly Ser 230 235 240
Arg Pro Trp Val Arg Gly Gin Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr 245 250 255
Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asp Ser Thr Gly Asn Leu 260 265 270
Ile Ala Pro 275 Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Ser Ile 280 285
Met Arg Ser 290 Asp Ala Pro Ile Gly Asn Cys Ser Ser Glu Cys Ile Thr 295 300
Pro Asn Gly 305 Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gin Asn Val Asn Arg 310 315 320
Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys 325 330 335
Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gin Thr Arg Gly Ile 340 345 350
Phe Gly Ala 3S5 Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Vel 360 365
Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gin Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gin 270 375 380
Ala Ala Asp 385 Leu Lys Ser Thr Gin Ala Ala Ile Asp Gin Ile Asn Gly 390 395 400
Lys Leu Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gin Ile 405 410 415
Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gin Asp Leu Glu Lys 420 425 430
«Τ
Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn 445 Ala Glu Leu
435 440
Leu Val Ala Leu Glu Asn Gin His Thr Ue Asp Leu Thr ASp Ser Glu
450 455 460
Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Lys Gin Leu Arg Glu Asn Ala
465 470 475 480
Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn
485 490 495
Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr
500 505 510
Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu
515 520 525
Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser
530 535 540
Cys Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys
545 550 555 560
Gin Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
(1) údaje k SEQ ID NO: 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1814 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Shanhai/4/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE. 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinové signální sekvence (B) POZICE. 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE. 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restřikční místa 5 (B) POZICE. 82 až 87 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA ίο (B) POZICE. 73 až 1 794 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál 15 (B) POZICE. 1 804 až 1814 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGGTACCGAT CGAATCTGCA CTGGGATAAC ATCTTCAAAC 120
TCACCTCATG TGGTCAAAAC AGCTACTCAA GGGGAGGTCA ATGTGACTGG TGTGATACCA 180
CTGACAACAA CACCAACAAA ATCTCATTTT GCAAATCTCA AAGGAACAAA GACCAGAGGG 240
AAACTATGCC CAAACTGTCT CAACTGCACA GATCTGGATG TGGCCTTGGG CAGACCAATG 300
tgtgtgggga ccacaccttc ggcaaaagct TCAATACTCC acgaagtcag ACCTGTTACA 36Ů
TCCGGGTGCT TTCCTATAAT GCACGACAGA ACAAAAATCA GACAGCTACC CAATCTTCTC 420
AGAGGATATG AAAATATCAG ATTATCAACC CAAAACGTTA TCAACGCAGA AAAGGCACCA 4B0
GGAGGACCCT ACAGACTTGG AACCTCAGGA TCTTGCCCTA ACGCTACCAG TAGAAGCGGA 540
TTTTTCGCAA CAATGGCTTG GGCTGTCCCA AGGGACAACA ACAAAACAGC AACGAATCCA 600
CTAACAGTAG AAGTACCATA CATTTGCACA AAAGGAGAAG ACCAAATTAC TGTTTGGOGG 660
TTCCATTCTG ATAACAAACC CCAAATGAAA AACCTCTATG GAGACTCAAA TCCTCAAAAG 720
TTCACCTCAT CTGCTAATGG AGTAACCACA CATTATGTTT CTCAGATTGG CGGCTTCCCA 780
GATCAAACAG AAGACGGAGG GCTACCACAA AGCGGCAGAA TTGTTGTTGA TTACATGGTG 840
CAAAAACCTG GGAAGACAGG AACAATTGTC TATCAGAGAG GTGTTTTGTT GCCTCAAAAG 900
GTGTGGTGCG CTAGTGGCAG GAGCAAAGTA ATAAAAGGGT CCTTGCCTTT AATTGGTGAA 960
GCAGATTGCC TTCACGAAAA ATACGGTGGA TTAAACAAAA GCAAGCCTTA CTACACAGGA 1020
GAACATGCAA AAGCCATAGG AAATTGCCCA ATATGGGTGA AAACACCTTT GAAGCTTGCC 1080
AATGGAACCA AATATAGACC TCCTGCAAAA CTATTAAAGG AAAGGGGTTT CTTOGGAGCT 1140
ATTGCTGGTT TCTTAGAAGG AGGATGGGAA GGAATGATTG CAGGTTGGCA CGGATACACA 1200
TCTCACGGAG CACATGGAGT GGCAGTGGCA GCAGACCTTA AGAGTACGCA AGAAGCCATA 1260
AACAAGATAA CAAAAAATCT CAATTCTTTG AGTGAGCTAG AAGTAAAGAA TCTTCAAAGG 1329
CTAAGTGGTG CCATGGATGA ACTCCACAAC GAAATACTCG AGCTGGATGA GAAAGTGGAT 1380
GATCTCAGAG CTGACACAAT AAGCTCGCAA ATAGAACTTG CAGTCTTGCT TTCCAACGAA
GGAATAATAA ACAGTGAAGA TGAGCATCTA TTGGCACTTG AGAGAAAACT AAAGAAKATG
CTGGGTCCCT CTGCTGTAGA CATAGGAAAT GGATGCTTCG AAACCAAACA CAAGTGCAAC
CAGACCTGCT TAGACAGGAT AGCTGCTGGC ACCTTTAATG CGGGAGAATT TTCTCTTCCC
ACTTTTGATT CACTGAATAT TACTGCTGCA TCTTTAAATG ATGATGGATT GGATAACCAT
ACTATACTGC TCTACTACTC AACTGCTGCT TCTAGTTTGG CGGTAACATT GATGATAGCT
ATTTTTATTG TTTATATGGT CTCCAGAGAC AATGTTTCTT GCTCCATCTG TCTGTGAGGA
TCTTAATTAA TTAA (1) údaje k SEQ ID NO: 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 592 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Shanhai/4/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinový signální peptid (B) POZICE. 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE. 19 až 574
1440
1500
1560
1620
1660
1740
1800
1814 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val ser
i 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser
20 25 30
Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gin Gly Glu Val Asn
35 40 45
Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe
50 55 60
Ala Asn Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys
65 70 75 80
Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val
85 90 95
Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala Ser Xle Leu His Glu Val Arg Pro
100 105 110
Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg
115 120 125
Gin Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr
130 135 140
Gin Asn Val Ile Asn Ala Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu
145 150 155 160
Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn Ala Thr Ser Arg Ser Gly Phe Phe
165 170 175
Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro Arg Asp Asn Asn Lys Thr Ala Thr
180 185 190
Asn pro Leu Thr Val Glu Val Pro Tyr Ile Cys Thr Lys Gly Glu Asp
195 200 205
Gin Ile Thr Val Trp Gly Phe His Ser Asp Asn Lys Pro Gin Met Ly3
210 215 220
Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn Pro Gin Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn
225 230 235 240
Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser Gin Ile Gly Gly Phe Pro Asp Gin
245 250 255
Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gin Set Gly Arg Ile Val Val ASp.Tyr
260 265 270
Met Val Gin Lys Pro Gly Lys Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gin Arg Gly
275 280 285
Val Leu Leu Pro Gin Lys Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys val
290 295 300
Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu
305 310 315 320
Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His
325 330 335
Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys
340 345 350
Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu
355 360 365
Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu
370 375 380
Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly
385 390 395 400
Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gin Glu Ala Ile Asn Lys
405 410 415
Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu
420 425 430
Gin Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu
435 440 445
Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gin
450 455 460
Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu
465 470 475 480
Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly
485 490 495
Pro Ser Ala Val Asp Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys
500 505 510
r i
Cys Asn Gin 515 Thr Cys Leu Asp Arg 520 Ile Ala Ala Gly Thr 525 Phe Asn Ala
Gly Glu 530 Phe Ser Leu Pro Thr Phe 535 Asp Ser Leu Asn 540 Ile Thr Ala Ala
Ser Leu 545 Asn Asp Asp Gly 550 Leu Asp Asn His Thr 555 Ile Leu Leu Tyr Tyr 560
Ser Thr Ala Ala Ser Ser 56S Leu Ala Val Thr 570 Leu Met Ile Ala Ile Phe 575
Ile val Tyr Met Val Ser 5S0 Arg Asp Asn 585 Val Ser Cys Ser Ile 590 Cys Leu
(1) údaje k SEQ ID NO: 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1 802 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne 15 (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Harbin/7/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE. 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast HA signální peptidové sekvence (B) POZICE. 19 až 69 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE. 22 až 27 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE. 70 až 1776 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE. 1780 až 1785 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Bgin restrikční místa 5 (B) POZICE. 1786 až 1791 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál ιο (B) POZICE. 1792 až 1802 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCGGGAAG GCAATAATTG TACTACTCAT ggtagtaaca 60
TCCAACGCAG ATCGAATCTG CACTGGGATA ACATCTTCAA ACTCACCTCA TGTGGTCAAA 120
ACAGCTACTC AAGGGGAAGT CAATGTGACT GGTGTGATAC CACTGACAAC AACACCAACA 180
AAATCTCATT TTGCAAATCT AAAAGGAACA AAGACGAGAG GGAAACTATG CCCAAACTGT 240
CTCAACTGCA CAGATCTGGA TGTGGCCTTG GGCAGACCAA TGTGTGTGGG GACCACACCT 300
TCGGCAAAAG CTTCAATACT CCACGAAGTC AGACCTGTTA CATCCGGGTG CTTTCCTATA 360
ATGCACGACA GAACAAAAAT CAGACAGCTA CCCAATCTTC TCAGAGGATA TGAAAATATC 420
AGATTATCAA CCCAAAACGT TATCAATGCA GAAAAAGCAC CAGGAGGACC CTACAGACTT 480
ggaacctcag gatcttgccc taacgctacc agtagaagcg gattttttgc AACAATGGCT 540
TGGGCTGTCC CAAGGGACGA CAACAAAACA GCAACGAATC CACTAACAGT AGAAGTACCA 600
TACGTTTGTA CAGAAGGAGA AGACCAAATT ACTGTTTGGG GGTTCCATTC TGATAACAAA €60
GCCCAAATGA AAAACCTCTA TGGAGACTCA AATCCTCAAA AGTTCACCTC ATCTGCTAAT 720
GGAGTAACCA CACATTATGT TTCTCAGATT GGCGGCTTCC CAGATCAAAC AGAAGACGGA 780
GGGCTACCAG AAAGCGGCAG AATTGTTGTT GATTACATGG TGCAAAAACC TGGGAAAACA 840
GGAACAATTG TCTATCAAAG AGGTGTTTTG TTGCCTCAAA AGGTGTGGTG CGCGAGTGGC 900
AGGAGCAAAG TAATAAAAGG GTCCTTGCCT TTAATTGGTG AAGCAGATTG CCTTCACGAA 960
AAATACGGTG GATTAAACAA AAGCAAGCCT TACTACACAG GAGAACATGC AAAAGCCATA 1020
GGAAATTGCC CAATATGGGT GAAAACACCT TTGAAGCTTG CCAATGGAAC CAAATATAGA 1080
CCTCCTGCAA AACTATTAAA GGAAAGGGGT TTCTTCGGAG CTATTGCTGG TTTCTTAGAA 1140
GGAGGATGGG AAGGAATGAT TGCAGGTTGG CACGGATACA CATCTCACGG AGCACATGGA 1200
GTGGCAGTGG CAGCAGACCT TAAGAGTACG CAAGAAGCCA TAAACAAGAT AACAAAAAAT 1260
CTCAATTCTT TGAGTGAGCT AGAAGTAAAG AATCTTCAAA GACTAAGTGG TGCCATGGAT 1320
GAACTCCATA ACGAAATACT CGAGCTGGAT GAGAAAGTGG ATGATCTCAG AGCTGACACT 1380
ATAAGCTCGC AAATAGAACT TGCAGTCTTG CTTTCCAACG AAGGAATAAT aaacagtgaa 1440
GATGAGCATC TATTGGCACT TGAGAGAAAA CTAAAGAAAA TGCTGGGTCC CTCTGCTGTA 1500
GACATAGGGA ATGGATGCTT CGAAACCAAA CACAAGTGCA ACCAGACCTG CTTAGACAGG 1560
ATAGCTGCTG GCACCTTTAA TGCAGGAGAA TTTTCTCTCC CCACTTTTGA TTCACTGAAT 1620
ATTACTGCTG CATCTTTAAA TGATGATGGA TTGGATAATC ATACTATACT GCTCTACTAC 16 Θ0
TCAACTGCTG CTTCTAGTTT GGCTGTAACA TTGATGATAG CTATTTTTAT TGTTTATATG 1740
GTCTCCAGAG ACAATGTTTC ATGCTCCATC TGTCTGTGAG GTACCAGATC ΊΤΑΑΤΤΑΑΤΤ 1800
AA 1802 (1) údaje k SEQ ID NO: 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 586 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Harbin/7/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: HA signální peptid (B) POZICE, laž 17 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE. 18 až 569 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:
Met 1 Pro Gly Lys Ala Ile 5 Ile Val Leu Leu 10 Met Val Val Thr Ser 15 Asn
Ala Asp Arg Xle 20 Cys Thr Gly Ile Thr 25 Ser Ser Asn Ser Pro 30 His Val
Val Lys Thr 35 Ala Thr Gin Gly Glu 40 Val Asn Val Thr Gly Val 45 Ile Pro
Leu Thr Thr 50 Thr Pro Thr Lys Ser 55 His Phe Ala Asn 60 Leu Lys Gly Thr
Lys 65 Thr Arg Gly Lys Leu 70 Cys Pro Asn Cys Leu 75 Asn Cys Thr Asp Leu 80
Asp Val Ala Leu Gly Arg 85 Pro Met Cys Val 90 Gly Thr Thr Pro Ser 95 Ala
Lys Ala Ser Ile 100 Leu His Glu Val Arg 105 Pro Val Thr Ser Gly Cys 110 Phe
CZ 301021 Bó
Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gin Leu Pro Asn Leu Leu
115 120 125
Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg LeU ser Thr Gin Asn Val Ile Asn Ala
130 135 140
Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr ser Gly Ser Cys
145 150 155 160
pro Asn Ala Thr Ser Arg Ser Oly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala
165 170 175
Val Pro Arg Asp Asp Asn Lys Thr Ala Thr Asn pro Leu Thr Val Glu
180 185 190
Val Pro Tyr val Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gin Ile Thr val Trp Gly
195 200 - 205
Phe His Ser Asp Asn Lys Ala Gin Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser
210 215 220
Asn Pro Gin Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr
225 230 235 240
Val Ser Gin Ile Gly 245 Gly Phe Pro Asp Gin Thr Glu Asp Gly Gly Leu
250 255
Pro Gin Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gin Lys Pro Gly
260 265 270
Lys Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gin Arg Gly Val Leu Leu Pro Gin Lys
275 280 285
Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro
290 295 300
Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn
305 310 315 320
Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn
325 330 335
Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys
340 345 350
Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala
355 360 365
Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp
370 375 380
His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp
385 390 395 400
Leu Lys Ser Thr Gin Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn
405 410 415
Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gin Arg Leu Ser Gly Ala
420 425 430
Met Asp Glu Leu HÍS Asn Glu Ile Leu GlU Leu Asp Glu Lys Val Asp
435 440 445
Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gin Ile Glu Leu Ala Val Leu
450 455 460
Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala
465 470 475 480
Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Asp Ile
485 490 495
Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lya Cys Asn Gin Thr Cys Leu
500 505 510
Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro
515 520 525
Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly
530 535 540
Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser
545 550 555 560
Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser
565 570 575
Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580 585 r r (1) údaje k SEQ ID NO: 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1 757 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT:A/Johannesburg/33/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE, laž 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinového signálního peptidu (B) POZICE, 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE. 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE. 73 až 1731 40 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE, 1 735 až 1 740 45 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE. 1 741 až 1 747 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE. 1 747 až 1 757 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 20:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GCAGGACCTT CCAGGAAATG ACAACAGCAC AGCAACGCTG 120
TGCCTGGGAC ACCATGCAGT GCCAAACGGA ACGCTAGTGA AAACAATCAC GAATGATCAA 180
ATTGAAGTGA CTAATGCTAC TGAGCTGGIT CAGAQTTCCC CAACAGGTAG AATATGCGAC 240
AGTCCTCACC GAATCCTTGA TGGAAAGAAC TGCACACTGK TAGATGCTCT ATTGGGAGAC 300
CCTCATTGTG ATGGCTTCCA AAATAAGGAA TGGGACCTTT TTGTTGAACG CAGCAAAGCT 360
TACAGCAACT GTTACCCTTA TGATGTGCCG GATTATGCCT CCCTTAGGTC AGTAGTTGCC 420
TCATCAGGCA CCCTGGAGTT TATCAACGAA AACTTCAATT GGACTGGAGT CGCTCAGGAT 480
GGGAAAAGCT ATGCTTGCAA AAGGGGATCT GTTAACAGTT TCTTTAGTAG ATTGAATTGG 540
TTGCACAAAT TAGAATACAA ATATCCAGCG CTGAACGTGA CTATGCCAAA CAATGGCAAA 600
TTTGACAAAT TGTACATTTG GGGGGTTCAC CACCOGAGCA CGGACAGTGA CCAAACCAGC 660
CTATATGTCC GAGCATCAGG GAGAGTCACA GTCTCTACCA AAAGAAGCCA ACAAACTGTA 720
ATCCCGGATA TCGGGTATAG ACCATGGGTA AGGGGTCAGT CCAGTAGAAT AGGCATCTAT 760
TGGACAATAG TAAAACCGGG AGACATACTT
CCTCGGGGTT ACTTCAAAAT ACGAAATGGG
ATTGGCAACT GCAGTTCTGA ATGCATCACT
TTTCAAAATG TAAACAGGAT CACATATGGG
CTGAAATTGG CAACAGGGAT GCGGAATGTA
GCAATCGCAG GTTTCATAGA AAATGGTTGG
AGGCATCAAA ATTCTGAGGG CACAGGACAA
ATCGACCAAA TCAACGGGAA ACTGAATAGG
CAAATCGAAA AAGAATTCTC AGAAGTAGAA
GAAGACACTA AAATAGATCT CTGGTCTTAC
CAACATACAA TTGATCTAAC TGACTCAGAA
CAACTGAGGG AAAATGCTGA GGACATGGGC
GACAATGCCT GCATAGGGTC AATCAGAAAT
GAAGCATTAA ACAACCGGTT CCASATCAAA
TGGATTCTAT GGATTTCCTT TGCCATATCA
TTCATCATGT GGGCCTGCCA AAAAGGCAAC
AGATCTTAAT TAATTAA
TTGATTAATA GCACAGGGAA TCTAATTGCT 840
AAAAGCTCAA TAATGAGGTC AGATGCACCC 900
CCAAATGGAA GCATTCCCAA TGACAAACCT 960
GCCTGCCCCA GATATGTTAA GCAAAACACT 1020
CCAGAGAAAC AAACTAGAGG CATATTCGGC 1030
GAGGGAATGG TAGACGGTTG GTACGGTTTC 1140
GCTGCAGATC TTAAAAGCAC TCAAGCAGCA 1200
TTAGTCGAGA AAACGAACGA GAAATTCCAT 1260
GGGAGAATTC AGGACCTCGA GAAATATGTT 1320
AATGCGGAGC TTCTTGTTGC TCTGGAGAAC 1380
ATGAACAAAC TGTTTGAAAG AAGAAGGAAG 1440
AATGGTTGTT TCAAAATATA CCACAAATGT 1500
GGAACTTATG ACCATGATGT ATACAGAGAC 1560
GGTGTTGAGC TGAAGTCAGG ATACAAAGAT 1620
TGCTTTTTGC TTTGTGTTGT TTTGCTTGGG 1680
ATTAGGTGCA ACATTTGCAT TTGAGGTACC 1740
1757
(1) údaje k SEQ ID NO: 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 571 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Johannesburg/33/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE. 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE. 19 až 569 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 21:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala val Ser
i 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Gin Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala
20 25 30
Thr Leu Cys Leu Gly HiS His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys
35 40 45
Thr Ile Thr Asn Asp Gin Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val
50 55 60
Gin Ser Ser Pro Thr Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Arg Ile Leu
65 70 75 80
Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Gin Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser
100 105 110
Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu
130 135 140
Asn Phe Asn Trp Thr Gly Val Ala Gin Asp Gly Lys Ser Tyr Ala Cys
145 150 155 160
Lys Arg Gly Ser Val Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn
180 185 190
Gly Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr
195 200 205
Asp Ser Asp Gin Thr Ser Leu Tyr Val Arg Ala Ser Gly Arg Val Thr
210 215 220
Val Ser Thr Lys Arg Ser Gin Gin Thr Val Ile Pro Asp Ile Gly Tyr
225 230 235 240
Arg Pro Trp Val Arg Gly Gin Ser Ser Arg Ile Gly Ile Tyr Trp Thr
245 250 255
Ile val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu
260 265 270
Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Ser Ile
275 280 285
Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Asn Cys Ser Ser Glu Cys Ile Thr
290 295 300
Pro Asn Gly ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gin Asn Val Asn Arg
305 310 315 320
Ile Thr Tyr Gly Ala cys Pro Arg Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys
325 330 335
Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gin Thr Arg Gly Ile
340 345 350
Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val
355 360 365
Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gin Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gin
370 375 380
Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gin Ala Ala Ile Asp Gin Ile Asn Gly
385 390 395 400
Lys Leu Asn Arg Leu val Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gin Ile
405 410 415
Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gin Asp Leu Glu Lys
420 425 430
Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu
435 440 445
Leu Val Ala Leu Glu Asn Gin His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu
450 455 460
Met Asn Lys Leu Phe Glu Arg Thr Arg Lys Gin Leu Arg Glu Asn Ala
465 470 475 480
Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn
485 490 495
Ala Cys Ile Gly ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr
500 505 510
Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gin Ile Lys Gly Val Glu Leu
515 520 525
Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser
530 535 540
Cys Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys
545 550 555 560
Gin Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
(1) údaje k SEQ ID NO: 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý io (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 22:
TGGTTGGTCG CCGTTTCTAA CGCGATTCCC GGGGGTACC 39 (1) údaje k SEQ ID NO: 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 13 aminokyselinaminokyselina kyselina 20 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 23:
Trp Leu Val Ala Val Ser Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr 15 10 (1) údaje k SEQ ID NO: 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 43 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 24:
TGGTTAGTCG CCGTGTCCTG CAGGCCAGAG AGGCCTTGGT ACC (1) údaje k SEQ ID NO: 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineám!
i o (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 25:
CTCGCCGTGT CCAACGCG 18 (1) údaje k SEQ ID NO: 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 26:
TAATTGGCCA GAGAGGCC 18 (1) údaje k SEQ ID NO: 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 27:
GGGGGATCCG GTACCAGCAA AAGCAGGGGA TAATTCTAI (1) údaje k SEQ ID NO: 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 38 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 28:
GGGGGTACCC CCGGGGACTT TCCAGGAAAT GACAACAG 38 *71 (1) údaje k SEQ ID NO: 29;
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 44 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 29:
CCCGGTACCG AATCATCCTA GAAACAAGGG TGTTTTTAAT TAAT 44 (1) údaje k SEQ ID NO: 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 47 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 30:
GGGGAATTCG GTACCCCCGG GAAGGCAATA ATTGTACTAC TCATGGT 47 (1) údaje k SEQ ID NO: 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 31:
GGTACCCCCG GGGATCGAAT CTGCACTGGG ATAACA 36 (1) údaje k SEQ ID NO: 32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 50 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 32:
GGGGAATTCG GATCCGGTAC CTCACAGACA GATGGARCAA GAAACATTGT

Claims (30)

  1. 5 1. V podstatě čistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein exprimovaný v bakulovirovém expresním systému v kultivovaných hmyzích buňkách, který je purifikovaný do 95% nebo vyšší čistoty, je imunogenní a indukuje ochrannou imunitní odezvu při použití jako vakcína.
    io
  2. 2. V podstatě čistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 1, který dále zahrnuje bakulovirový signální peptid, kteiý se váže přímo na HAO protein bez intervenujících aminokyselin.
  3. 3. V podstatě čistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový is protein podle nároku 1, který je dále sdružen s farmaceuticky přijatelným nosičem pro podání ve formě vakcíny.
  4. 4. V podstatě čistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 1, který je dále sdružen s adjuvans a farmaceuticky přijatelným nosičem pro
    20 podání ve formě vakcíny.
  5. 5. V podstatě čistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 3, kde farmaceuticky přijatelným nosičem je polymemí systém pro dopravu proteinu.
  6. 6. V podstatě čistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 1, kde se chřipkový HAO hemaglutininový protein zvolí z množiny zahrnující kmeny chřipky A a kmeny chřipky B.
    30
  7. 7. V podstatě čistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 6, kde virový kmen chřipky infikuje lidi.
  8. 8. V podstatě čistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 1, který je dále sloučen s druhým proteinem, který se váže na hemaglutinin.
  9. 9. V podstatě čistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 8, kde je druhý protein zvolen z množiny zahrnující virové proteiny hepatitidy B, HÍV-proteiny, karcinoembryonální antigen a neuraminidasy.
    40
  10. 10. Vektor pro výrobu proteinu rekombinantního chřipkového HAO hemaglutininového proteinu podle nároku 1, obsahujícího následující 5'—> 3' sekvence: polyhedrinový promotor z bakuloviru, ATG translační startovací kodon, signální peptid, sekvence kódující zralý hemaglutinin z chřipkového kmene, translační terminační kodon a polyhedrinový RNA polyadenylaČní signál.
    45
  11. 11. Vektor podle nároku 10, kde je signálním peptidem bakulovirový protein mající molekulovou hmotnost okolo 61 kDa a aminokyselinovou sekvenci tvořenou prvními 18 aminokyselinami sekvence ID No. 7.
  12. 12. Vektor podle nároku 10, kde je signálním peptidem chřipkový hemaglutininový proteinový
    50 promotor.
  13. 13. Vektor podle nároku 10, kde sekvence kódující signální peptid a hemaglutinin nekódují žádnou intervenující aminokyselinu.
  14. 14. Vektor podle nároku 10, který dále zahrnuje sekvenci kódující druhý protein, který se exprimuje jako fúzní protein s hemaglutininem.
  15. 15. Vektor podle nároku 10, který je transfekován v kultivovaných hmyzích buňkách.
  16. 16. Způsob výroby rekombinantního chřipkového hemaglutininového proteinu podle nároku 1, vyznačený tím, že se kultivované hmyzí buňky infikují vektorem obsahujícím 5'—* 3' sekvence: polyhedrinový promotor z bakulovíru, ATG translační startovací kodon, signální peptid, sekvence kódující hemaglutinin z chřipkového kmene zvoleného ze skupiny zahrnující io chřipkové kmeny A a chřipkové kmeny B, translační terminační kodon a polyhedrinový RNA polyadeny lační signál, a buňky se následně kultivují v živném prostředí a protein se izoluje z hmyzích buněk.
  17. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačený tím, že se HAO chřipkový hemaglutininový
    15 protein izoluje z hmyzích buněk v alespoň 95% čistotě.
  18. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že se protein izoluje separací hemaglutininu z nemembránových proteinů při alkalickém pH, promytím proteinů navázaných na membránu, při kterém se eluuje hemaglutinin, separováním hemaglutininu od dalších proteinů
    20 navázáním na an Íontoměničovou pryskyřici změnou pH, a separováním hemaglutininu od ostatních proteinů navázáním na kationtoměničovou pryskyřici změnou koncentrace soli.
  19. 19. Způsob podle nároku 16, vyznačený tím, že se vektor připraví tak, že se vir sklidí z buněčného média a v případě chřipkových kmenů A se izoluje virová RNA, nebo v případě
    25 chřipkových kmenů B se izoluje mRNA; cDNA se syntetizuje za použití univerzálního primeru (5-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID No, 1)) pro virovou RNA z chřipkových kmenů A nebo se z chřipkových kmenů B syntetizuje nahodilý primer tvořící mRNA, přičemž primery 5' a 3' mají na koncích, které se nenalézají uvnitř hemaglutininových genů, restrikční enzymová místa; chřipkové A nebo B primery a chřipková cDNA smíšená se segmenty hemaglutininového genu se
    30 amplifikují za vzniku dvouřetězcových DNA fragmentů obsahujících celé sekvence kódující zralý hemaglutinin; identifikuje se signální peptid hemaglutininových genů, načež se amplifikují hemaglutininové geny bez signálního peptidu; a klonují do vektoru obsahujícího AcNPV polyhedrinový promotor.
    35
  20. 20. Způsob podle nároku 19, vyznačený tím, že se hemaglutininové geny klonují za použití PCR tak, že vektor kóduje signální peptid navázaný přímo na hemaglutinin bez intervenujících aminokyselin.
  21. 21. Způsob podle nároku 19, vyznačený tím, že se vektor transfekuje do hmyzích
    40 buněk a vyberou se buňky pro hemaglutininovou expresi.
  22. 22. Vakcína, vyznačená tím, že obsahuje zralý glykosylovaný hemaglutininový protein podle nároku 2 a farmaceuticky přijatelný nosič.
    45
  23. 23. Vakcína podle nároku 22, vyznačená tím, že dále obsahuje adjuvans.
  24. 24. Vakcína podle nároku 22, vyznačená tím, že farmaceuticky přijatelným nosičem je polymemí transportní systém.
    50
  25. 25. V podstatě čistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný hemaglutininový protein podle nároku 8 z viru influenzy zvolené ze skupiny zahrnující chřipkové kmeny A a chřipkové kmeny B.
  26. 26. V podstatě čistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný hemaglutininový protein podle nároku 25 z viru infikujícího lidi.
  27. 27. Vakcína, vyznačená tím, že obsahuje zralý glykosylovaný hemaglutininový protein podle nároku 8 a farmaceuticky přijatelný nosič.
  28. 28. Vakcína podle nároku 17, vyznačená tím, že v jejím zralém hemaglutininovém 5 proteinu je druhým proteinem neuraminidáza.
  29. 29. Vakcína podle nároku 28, vyznačená tím, že dále obsahuje adjuvans.
  30. 30. V podstatě čistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný hemaglutininový protein podle nároio ku 8, ve kterém je druhým proteinem neuraminidáza.
CZ0373897A 1993-09-13 1995-05-26 V podstate cistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chripkový HAO hemaglutininový protein, vektor pro výrobu rekombinantního HAO hemaglutininového proteinu, zpusob výroby uvedeného proteinu a vakcína obsahující uvedený protein CZ301021B6 (cs)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/120,607 US5762939A (en) 1993-09-13 1993-09-13 Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
CA2222129A CA2222129C (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
PCT/US1995/006750 WO1996037624A1 (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
CNB951979280A CN100390289C (zh) 1993-09-13 1995-05-26 生产流感血凝素多价疫苗的方法
LT97-201A LT4461B (lt) 1993-09-13 1997-12-23 Gripo hemagliutinino multivalentinių vakcinų gamybos būdas

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ373897A3 CZ373897A3 (cs) 1999-02-17
CZ301021B6 true CZ301021B6 (cs) 2009-10-14

Family

ID=27508642

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20080037A CZ299862B6 (cs) 1993-09-13 1995-05-26 Polypeptid obsahující baculovirový signální peptid
CZ0373897A CZ301021B6 (cs) 1993-09-13 1995-05-26 V podstate cistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chripkový HAO hemaglutininový protein, vektor pro výrobu rekombinantního HAO hemaglutininového proteinu, zpusob výroby uvedeného proteinu a vakcína obsahující uvedený protein

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20080037A CZ299862B6 (cs) 1993-09-13 1995-05-26 Polypeptid obsahující baculovirový signální peptid

Country Status (21)

Country Link
US (2) US5762939A (cs)
EP (2) EP0833933B1 (cs)
JP (1) JP3757318B2 (cs)
CN (1) CN100390289C (cs)
AT (2) ATE518000T1 (cs)
AU (1) AU712776B2 (cs)
BR (1) BR9510590A (cs)
CA (1) CA2222129C (cs)
CZ (2) CZ299862B6 (cs)
DE (1) DE69534449T2 (cs)
DK (3) DK0833933T3 (cs)
ES (1) ES2248799T3 (cs)
FI (1) FI974319A7 (cs)
HU (1) HUT77921A (cs)
IS (1) IS4620A (cs)
LT (1) LT4461B (cs)
NO (1) NO975434L (cs)
NZ (1) NZ288026A (cs)
PT (1) PT1605052E (cs)
SK (1) SK286441B6 (cs)
WO (1) WO1996037624A1 (cs)

Families Citing this family (192)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6387373B1 (en) * 1993-01-15 2002-05-14 Novavax, Inc. Vaccines containing paucilsmellar lipid vesicles as immunological adjuvants
EP2374894B1 (en) * 1993-09-13 2014-09-17 Protein Sciences Corporation A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
DE19612966B4 (de) * 1996-04-01 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren
DE19612967A1 (de) * 1996-04-01 1997-10-02 Behringwerke Ag Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur, sowie die durch das Verfahren erhältlichen Influenzaviren
US7157089B1 (en) * 1996-11-26 2007-01-02 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses using compositions containing stress proteins
NZ538399A (en) * 1997-08-05 2007-05-31 Nventa Biopharma Corp Fusion protein comprising an HPV E7 protein and a stress protein wherein the E7 protein is joined directly to the amino terminus of the stress protein
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6348450B1 (en) * 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US7390619B1 (en) 1998-02-11 2008-06-24 Maxygen, Inc. Optimization of immunomodulatory properties of genetic vaccines
US6541011B2 (en) * 1998-02-11 2003-04-01 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
US8026096B1 (en) 1998-10-08 2011-09-27 Protein Sciences Corporation In vivo active erythropoietin produced in insect cells
NZ512980A (en) * 1998-12-17 2003-07-25 Aventis Pasteur Multivalent immunogenic composition containing RSV subunit composition and influenza virus preparation
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
JP2003504074A (ja) 1999-07-08 2003-02-04 ストレスゲン バイオテクノロジーズ コーポレイション インビトロでのＴｈ１様応答の誘導
US6544750B1 (en) 1999-08-17 2003-04-08 Thromgen, Inc. Peptide analogs as selective inhibitors of thrombin activation of protease activated receptor 1
DE19963857A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-26 Qiagen Gmbh Primer, insbesondere für Primer-abhängige Nukleinsäure-Syntheseprozesse und Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren
NZ523408A (en) 2000-06-26 2006-02-24 Stressgen Biotechnologies Corp Human papilloma virus treatment
US20060177416A1 (en) * 2003-10-14 2006-08-10 Medivas, Llc Polymer particle delivery compositions and methods of use
GB0022969D0 (en) * 2000-09-19 2000-11-01 Chiron Spa Influenza a virus subtype H16
JPWO2002062381A1 (ja) * 2001-02-05 2004-06-03 久光製薬株式会社 バキュロウイルスベクターワクチン
DE10144906B4 (de) * 2001-09-12 2013-11-28 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen
US7232670B2 (en) 2001-09-28 2007-06-19 St. Jude Children's Research Hospital Targeting proteins to cells expressing mannose receptors via expression in insect cells
DE10218129A1 (de) * 2002-04-23 2003-11-20 Univ Ruprecht Karls Heidelberg Genetischer Impfstoff gegen RNA-Virus-Infektionen
US7566458B2 (en) 2003-06-16 2009-07-28 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
CA2503774C (en) * 2003-06-20 2007-09-25 Microbix Biosystems Inc. Improvements in virus production
US8541003B2 (en) 2003-06-20 2013-09-24 Protein Sciences Corporation Vectors expressing SARS immunogens, compositions containing such vectors or expression products thereof, methods and assays for making and using
US8992939B2 (en) 2003-07-11 2015-03-31 Novavax, Inc. Highly efficient influenza matrix (M1) proteins
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
US8080255B2 (en) 2003-07-11 2011-12-20 Novavax Inc. Functional influenza virus like particles (VLPs)
US8506967B2 (en) 2003-07-11 2013-08-13 Novavax, Inc. Functional influenza virus like particles (VLPs)
US7527967B2 (en) * 2003-11-25 2009-05-05 Academia Sinica Recombinant baculovirus and virus-like particle
BRPI0507169A (pt) * 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos do hormÈnio de crescimento humano modificados e seu usos
AU2005249450A1 (en) 2004-05-27 2005-12-15 Centocor, Inc. Cynomolgus prostate specific antigen
CA2570563A1 (en) * 2004-06-15 2006-09-28 Centocor, Inc. Method for screening agents against human prostate disease
US7632924B2 (en) * 2004-06-18 2009-12-15 Ambrx, Inc. Antigen-binding polypeptides and their uses
WO2006091231A2 (en) * 2004-07-21 2006-08-31 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
US8420102B2 (en) * 2006-03-07 2013-04-16 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin
BRPI0519430A2 (pt) 2004-12-22 2009-02-10 Ambrx Inc hormânio do crescimento humano modificado
CN103520735B (zh) * 2004-12-22 2015-11-25 Ambrx公司 包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方
EP1836298B1 (en) * 2004-12-22 2012-01-18 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
EP2399893B1 (en) 2004-12-22 2018-08-15 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
EP1836316A4 (en) 2004-12-22 2009-07-22 Ambrx Inc PROCESS FOR EXPRESSION AND CLEANING OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE
EP2374474A1 (en) 2005-01-19 2011-10-12 Vaxinnate Corporation Compositions comprising pathogen-associated molecular patterns and antigens and their use to stimulate an immune response
CN101163494A (zh) * 2005-02-23 2008-04-16 Uab研究基金会 烷基糖苷增强的接种
EP2471552B1 (en) 2005-03-08 2015-05-06 MedImmune, LLC Reassortant influenza viruses
AR054020A1 (es) 2005-03-23 2007-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Nuevo uso
US11865172B2 (en) 2005-04-21 2024-01-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
AU2006255122B2 (en) * 2005-06-03 2010-10-21 Ambrx, Inc. Improved human interferon molecules and their uses
US7871626B2 (en) 2005-08-04 2011-01-18 St. Jude Children's Research Hospital Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency
AU2005335491B2 (en) 2005-08-18 2010-11-25 Ambrx, Inc. Compositions of tRNA and uses thereof
CA2623198C (en) 2005-09-22 2014-08-05 Medivas, Llc Bis-(a-amino)-diol-diester-containing poly(ester amide) and poly(ester urethane) compositions and methods of use
JP5178520B2 (ja) * 2005-09-22 2013-04-10 メディバス エルエルシー 固体ポリマー送達組成物およびその使用法
US7468187B2 (en) 2005-10-18 2008-12-23 Iowa State University Research Foundation, Inc. Canine influenza virus and related compositions and methods of use
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
NZ568211A (en) 2005-11-04 2011-11-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Influenza vaccines including combinations of particulate adjuvants and immunopotentiators
CA2628152C (en) * 2005-11-04 2016-02-02 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
CN102755645A (zh) 2005-11-04 2012-10-31 诺华疫苗和诊断有限公司 佐剂配制的包含细胞因子诱导剂的流感疫苗
NZ594482A (en) 2005-11-04 2012-11-30 Novartis Vaccines & Diagnostic Influenza vaccines with reduced amount of oil-in-water emulsion as adjuvant
CN101400646A (zh) * 2005-11-08 2009-04-01 Ambrx公司 用于修饰非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的促进剂
DK2339014T3 (en) * 2005-11-16 2015-07-20 Ambrx Inc Methods and compositions comprising non-natural amino acids
WO2007067744A2 (en) * 2005-12-07 2007-06-14 Medivas, Llc Method for assembling a polymer-biologic delivery composition
WO2007070659A2 (en) * 2005-12-14 2007-06-21 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
PL2478916T3 (pl) 2006-01-27 2020-11-16 Seqirus UK Limited Szczepionki przeciw grypie zawierające hemaglutyninę i białka macierzy
TWI477602B (zh) 2006-02-09 2015-03-21 Educational Foundation Jichi Medical Univ Novel viral vector
US9333249B2 (en) 2006-02-09 2016-05-10 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
CU23576A1 (es) 2006-02-28 2010-09-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la influenza aviar
CN101448523A (zh) 2006-03-24 2009-06-03 诺华疫苗和诊断有限两合公司 无需冷藏储存流感疫苗
CA2649672C (en) * 2006-05-02 2015-07-07 Medivas, Llc Delivery of ophthalmologic agents to the exterior or interior of the eye
CN102258778B (zh) * 2006-05-05 2014-08-13 淡马锡生命科学研究院有限公司 生物分子表面展示及其用途
WO2007133616A2 (en) * 2006-05-09 2007-11-22 Medivas, Llc Biodegradable water soluble polymers
MX2009000660A (es) 2006-07-17 2009-04-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna de influenza.
GB0614460D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Novartis Ag Vaccines
JP5399906B2 (ja) * 2006-09-08 2014-01-29 アンブルックス，インコーポレイテッド 脊椎動物細胞用のハイブリッドサプレッサーｔｒｎａ
EP2064333B1 (en) * 2006-09-08 2014-02-26 Ambrx, Inc. Suppressor trna transcription in vertebrate cells
CN106008699A (zh) * 2006-09-08 2016-10-12 Ambrx公司 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
US20100105025A1 (en) * 2006-10-12 2010-04-29 Engelhard Eric K Devices for generating detectable polymers
US20080124710A1 (en) * 2006-10-12 2008-05-29 Engelhard Eric K Devices for generating detectable polymers
WO2008118487A2 (en) * 2007-03-26 2008-10-02 University Of Massachusetts Medical School Compositions and methods for incresing immunogenicity of glycoprotein vaccines
CN107501407B (zh) 2007-03-30 2022-03-18 Ambrx公司 经修饰fgf-21多肽和其用途
PE20090146A1 (es) 2007-04-20 2009-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica contra el virus influenza
US8114630B2 (en) 2007-05-02 2012-02-14 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
KR20100045437A (ko) * 2007-06-27 2010-05-03 노파르티스 아게 첨가물이 적은 인플루엔자 백신
WO2009076778A1 (en) 2007-11-27 2009-06-25 Medicago Inc. Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
CA2615372A1 (en) * 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
CA2709412A1 (en) * 2007-07-24 2009-01-29 Medivas, Llc Biodegradable cationic polymer gene transfer compositions and methods of use
MX2010005317A (es) 2007-11-20 2010-06-02 Ambrx Inc Polipeptidos de insulina modificados y sus usos.
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
MX344166B (es) 2008-02-08 2016-12-07 Ambrx Inc Leptina-polipeptidos modificados y sus usos.
AU2009236585B2 (en) 2008-04-18 2013-03-07 Vaxinnate Corporation Deletion mutants of flagellin and methods of use
AU2009267769B2 (en) * 2008-07-08 2015-07-16 Medicago Inc. Soluble recombinant influenza antigens
RU2523587C2 (ru) 2008-07-11 2014-07-20 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Варианты гемагглютинина и нейрамидазы вируса гриппа
CN102159230A (zh) 2008-07-23 2011-08-17 Ambrx公司 经修饰的牛g-csf多肽和其用途
WO2010019716A1 (en) * 2008-08-13 2010-02-18 Medivas, Llc Aabb-poly(depsipeptide) biodegradable polymers and methods of use
US8658180B2 (en) 2008-08-15 2014-02-25 Mark A. Miller Vaccines against influenza virus
AU2009296267B2 (en) * 2008-09-26 2013-10-31 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines
BR122012024318A2 (pt) 2008-09-26 2019-07-30 Ambrx, Inc. Polipeptídeos modificados de eritropoetina animal e seus usos
EP3173097A3 (en) 2009-02-10 2017-07-12 Seqirus UK Limited Influenza vaccines with reduced amounts of squalene
USH2283H1 (en) 2009-04-27 2013-09-03 Novartis Ag Vaccines for protecting against influenza
NZ596671A (en) 2009-05-29 2013-06-28 Novartis Ag Assays for influenza virus hemagglutinins
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
GB2471093A (en) * 2009-06-17 2010-12-22 Cilian Ag Viral protein expression in ciliates
HUE039100T2 (hu) 2009-06-24 2018-12-28 Medicago Inc Hemagglutinint tartalmazó kimer influenzavírus-jellegû részecskék
CA2803282C (en) 2009-07-06 2018-05-01 David E. Anderson Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom
JP5854559B2 (ja) 2009-07-06 2016-02-09 ヴァリエーション バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド 小胞を調製する方法及びこれから製造される製剤
US8810417B2 (en) * 2009-08-28 2014-08-19 The Invention Science Fund I, Llc Beverage immersate with detection capability
US9024766B2 (en) * 2009-08-28 2015-05-05 The Invention Science Fund, Llc Beverage containers with detection capability
US20120237536A1 (en) 2009-09-10 2012-09-20 Novartis Combination vaccines against respiratory tract diseases
KR101773431B1 (ko) 2009-09-22 2017-09-12 메디카고 인코포레이티드 식물-유래 ｖｌｐ의 제조방법
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
BR112012015597A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-31 Ambrx Inc peptídeos de somatotropina suínos modificados e seus usos
EP2519636B8 (en) * 2009-12-28 2017-08-09 DSM IP Assets B.V. Production of hemagglutinin-neuraminidase protein in microalgae
CA3028175C (en) * 2009-12-28 2022-05-24 Sanofi Vaccine Technologies, S.A.S. Methods of producing heterologous viral neuraminidase proteins in microalgae
CN102939101A (zh) * 2010-01-26 2013-02-20 科罗拉多大学董事会，法人 用于通用疫苗的流感病毒组合物和方法
US20110305748A1 (en) 2010-03-11 2011-12-15 Immune Design, Corp. Vaccines for Pandemic Influenza
AU2011230619C1 (en) 2010-03-25 2016-06-23 Oregon Health & Science University CMV glycoproteins and recombinant vectors
CA2801151A1 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Novartis Ag Concentration of vaccine antigens with lyophilization
WO2011151723A2 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Novartis Ag Concentration of vaccine antigens without lyophilization
WO2012006367A2 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Variation Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for treating influenza
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
EA030886B1 (ru) 2010-08-17 2018-10-31 Амбркс, Инк. Модифицированные полипептиды релаксина, содержащие некодируемую в природе аминокислоту, связанную с полимером, и их применение
WO2012023044A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Novartis Ag Soluble needle arrays for delivery of influenza vaccines
US8513006B2 (en) 2010-09-14 2013-08-20 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Tetravalent influenza vaccine and use thereof
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
CN102023213B (zh) * 2010-09-28 2014-04-02 汕头大学医学院 一种检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法
BR112013018074A2 (pt) 2011-01-13 2020-12-01 Variation Biotechnologies, Inc. métodos para a preparação de vesículas e formulações produzidas a partir dessas
US10736844B2 (en) 2011-01-13 2020-08-11 Variation Biotechnologies Inc. Compositions and methods for treating viral infections
ES2645156T3 (es) 2011-03-21 2017-12-04 Altimmune Inc. Agente terapéutico inmunológico de acción rápida y prolongada
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
HUE037408T2 (hu) 2011-06-10 2018-08-28 Univ Oregon Health & Science CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok
US9873765B2 (en) 2011-06-23 2018-01-23 Dsm Ip Assets, B.V. Biodegradable polyesteramide copolymers for drug delivery
ES2992024T3 (es) 2011-06-23 2024-12-05 Dsm Ip Assets Bv Nuevos copolímeros de poliesteramida biodegradables para la administración de fármacos
CA2789539A1 (en) 2011-09-12 2013-03-12 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2768528A1 (en) 2011-10-20 2014-08-27 Novartis AG Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
US20140328876A1 (en) 2011-11-18 2014-11-06 Variation Biotechnologies Inc. Synthetic derivatives of mpl and uses thereof
WO2013088367A1 (en) 2011-12-12 2013-06-20 Novartis Ag Assay for influenza virus hemagglutinins
AU2013208693B2 (en) 2012-01-12 2017-12-07 Variation Biotechnologies Inc. Compositions and methods for treating viral infections
EP2806894A4 (en) 2012-01-27 2015-11-04 Variation Biotechnologies Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR THERAPEUTIC AGENTS
TWI434933B (zh) * 2012-04-17 2014-04-21 Nat Univ Tsing Hua 抗多型禽流感病毒之ｄｎａ疫苗及其組合物
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
US8932598B2 (en) 2012-08-28 2015-01-13 Vaxinnate Corporation Fusion proteins and methods of use
GB201218195D0 (en) 2012-10-10 2012-11-21 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie Composition
JP2015015931A (ja) 2013-07-12 2015-01-29 株式会社Ｕｍｎファーマ ウイルス様粒子を含む培養物の製造方法
JP6479305B2 (ja) 2013-07-12 2019-03-06 株式会社Ｕｍｎファーマ ウイルス様粒子の精製方法
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
CN114805532A (zh) 2014-10-24 2022-07-29 百时美施贵宝公司 修饰的fgf-21多肽及其用途
US10434071B2 (en) 2014-12-18 2019-10-08 Dsm Ip Assets, B.V. Drug delivery system for delivery of acid sensitivity drugs
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
US9931394B2 (en) 2015-03-23 2018-04-03 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
CA3001725C (en) * 2015-05-04 2021-06-15 Epivax, Inc. Modified h7 hemaglutinin glycoprotein of the influenza a/shanghai/2/2013 h7 sequence
US11013795B2 (en) 2015-06-26 2021-05-25 Seqirus UK Limited Antigenically matched influenza vaccines
KR102790570B1 (ko) * 2015-07-07 2025-04-04 세퀴러스 유케이 리미티드 인플루엔자 효능 검정
CA2996007A1 (en) 2015-09-03 2017-03-09 Novavax, Inc. Vaccine compositions having improved stability and immunogenicity
BR112018014109A2 (en) 2016-01-11 2018-12-11 Verndari, Inc. microneedle compositions and methods of using them
US10063211B2 (en) 2016-02-03 2018-08-28 Qualcomm Incorporated Compact bypass and decoupling structure for millimeter-wave circuits
CN106749554B (zh) * 2017-01-20 2021-01-15 中山大学 一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法
PE20191716A1 (es) 2017-02-08 2019-12-05 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos de relaxina modificada que comprenden un mejorador farmacocinetico y sus usos
US10874737B2 (en) 2018-06-01 2020-12-29 Iowa State University Research Foundation, Inc. Influenza nanovaccine
CA3160955A1 (en) 2019-11-12 2021-05-20 Dsm Ip Assets B.V. Polyesteramide copolymers possessing high glass transition temperatures
MX2023002356A (es) 2020-08-24 2023-03-22 Sanofi Pasteur Inc Vacunas contra la covid-19 con coadyuvantes en emulsion de escualeno que contiene tocoferol.
US20240016918A1 (en) 2020-08-24 2024-01-18 Sanofi Pasteur Inc. Vaccines against sars-cov-2 infections
AU2022361432A1 (en) 2021-10-08 2024-05-23 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent influenza vaccines
AU2022379948A1 (en) 2021-11-05 2024-06-20 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent influenza vaccines comprising recombinant hemagglutinin and neuraminidase and methods of using the same
WO2023079113A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Hybrid multivalent influenza vaccines comprising hemagglutinin and neuraminidase and methods of using the same
EP4565604A2 (en) 2022-08-01 2025-06-11 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Immunomodulatory proteins and related methods
US20240228620A1 (en) 2022-10-06 2024-07-11 Bicara Therapeutics Inc. Multispecific proteins and related methods
WO2024151583A2 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
WO2024167885A1 (en) 2023-02-06 2024-08-15 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory compositions and related methods
WO2024167880A1 (en) 2023-02-06 2024-08-15 Bicara Therapeutics Inc. Combination therapy and related methods
WO2024258829A1 (en) 2023-06-12 2024-12-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2025006419A1 (en) 2023-06-26 2025-01-02 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Engineered plasmodia and related methods
AU2024299328A1 (en) 2023-07-21 2026-01-22 Marrow Therapeutics, Inc. Hematopoietic cell targeting conjugates and related methods
KR20260044217A (ko) 2023-07-25 2026-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 Vii, 엘엘씨 Cas 엔도뉴클레아제 및 관련 방법
WO2025024493A1 (en) 2023-07-25 2025-01-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas endonucleases and related methods
CN116763915B (zh) * 2023-08-17 2023-11-03 山东兴瑞生物科技有限公司 一种用于治疗和预防流感病毒的多价疫苗
WO2025054236A2 (en) 2023-09-06 2025-03-13 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2025072331A1 (en) 2023-09-26 2025-04-03 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas nucleases and related methods
WO2025117877A2 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas nucleases and related methods
WO2025129034A2 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025129001A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128936A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128954A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128943A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128953A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128934A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
TW202545974A (zh) 2024-01-26 2025-12-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 免疫受體抑制蛋白及相關方法
US20250353881A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor inhibitory proteins and related methods
WO2025245111A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor targeting proteins and related methods

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4029763A (en) * 1974-08-05 1977-06-14 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Influenza vaccine containing purified neuraminidase antigen and method of using the same
IN150740B (cs) * 1978-11-24 1982-12-04 Hoffmann La Roche
US4659669A (en) * 1981-03-02 1987-04-21 Regents Of The Univ. Of California Microbial expression of human influenza hemagglutinin proteins
US4752473A (en) * 1984-10-12 1988-06-21 The Regents Of The University Of California Expression of glycosylated human influenza hemagglutinin proteins
US4920213A (en) * 1985-06-20 1990-04-24 Biotechnology Research Partners, Ltd. Method and compositions useful in preventing equine influenza
JPH02502876A (ja) * 1987-03-16 1990-09-13 アメリカン　バイオジェネティック　サイエンシズ　インク ワクチンと生物学的殺虫剤における組換えバクロウイルス閉塞体
GB9106185D0 (en) * 1991-03-22 1991-05-08 Wellcome Found Biological control agents
CA2084180A1 (en) * 1991-12-11 1993-06-12 Paul P. Hung Expression of specific immunogens using viral antigens
WO1995032286A2 (en) * 1994-05-20 1995-11-30 Microgenesys, Inc. Immunogenic carcinoembryonic antigen and methods of use and production

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kuroda K. et al.: "Expression of the influenza virus haemagglutinin in insect cells by a baculovirus vector", EMBO J., Vol. 5(6):, 1359-1365, 1986 *
Matsuura Y. et al.:"Baculovirus expression vectors: the requirements for high level expression of proteins, including glycoproteins", J. Gen. Virol., 68 (Pt 5), 1233-50, 1987 *
Possee R.D.: "Cell-surface expression of influenza virus haemagglutinin in insect cells using a baculovirus vector", Virus Res., Vol. 5(1), 43-59, 1986 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1194005A (zh) 1998-09-23
DK0833933T3 (da) 2005-10-10
JP2000513922A (ja) 2000-10-24
US5762939A (en) 1998-06-09
NZ288026A (en) 1999-11-29
FI974319A7 (fi) 1998-01-22
HK1083867A1 (en) 2006-07-14
DK1275726T3 (da) 2008-06-23
US5858368A (en) 1999-01-12
DE69534449T2 (de) 2006-07-06
ATE304602T1 (de) 2005-09-15
HUT77921A (hu) 1998-10-28
EP1605052A2 (en) 2005-12-14
SK158897A3 (en) 1999-06-11
JP3757318B2 (ja) 2006-03-22
EP0833933B1 (en) 2005-09-14
LT4461B (lt) 1999-02-25
AU712776B2 (en) 1999-11-18
NO975434D0 (no) 1997-11-26
BR9510590A (pt) 1999-11-30
CZ373897A3 (cs) 1999-02-17
DK1605052T3 (da) 2011-11-07
CZ299862B6 (cs) 2008-12-17
ES2248799T3 (es) 2006-03-16
WO1996037624A1 (en) 1996-11-28
AU2692595A (en) 1996-12-11
CA2222129C (en) 2010-04-27
IS4620A (is) 1997-11-25
DE69534449D1 (de) 2006-01-26
ATE518000T1 (de) 2011-08-15
EP0833933A1 (en) 1998-04-08
EP1605052B1 (en) 2011-07-27
SK286441B6 (sk) 2008-10-07
EP1605052A3 (en) 2008-08-13
NO975434L (no) 1998-01-19
PT1605052E (pt) 2011-10-19
LT97201A (en) 1998-09-25
FI974319A0 (fi) 1997-11-25
CA2222129A1 (en) 1996-11-28
CN100390289C (zh) 2008-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6245532B1 (en) Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
EP0833933B1 (en) A vector and method for producing influenza hemagglutinin
KR101153929B1 (ko) 기능성 인플루엔자 바이러스 유사입자
JP2014505681A (ja) 改変インフルエンザヘマグルチニンタンパク質およびその使用
SG176419A1 (en) Novel h5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use
US20120064117A1 (en) Tetravalent influenza vaccine and use thereof
Holtz et al. Production of a recombinant influenza vaccine using the baculovirus expression vector system
EP1275726B1 (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
EP2374894B1 (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
CN101353375A (zh) 生产流感血凝素多价疫苗的方法
AU733191B2 (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
HK1083867B (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
BRPI9510590B1 (pt) composição compreendendo proteína de hemaglutina hao gripal recombinante
HK1017711B (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
CN101365481B (zh) 犬流感病毒及相关组合物和使用方法
Shehata Truncated Sequences of Influenza Subtype H5 Haemagglutinin for Vaccination and Diagnostic Purposes: Avian influenza, Yeast expression, Peptide vaccination, recombinant Elisa

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20150526