CZ373897A3 - Způsob výroby hemaglutininových multivalentních vakcín proti chřipce - Google Patents

Způsob výroby hemaglutininových multivalentních vakcín proti chřipce Download PDF

Info

Publication number
CZ373897A3
CZ373897A3 CZ973738A CZ373897A CZ373897A3 CZ 373897 A3 CZ373897 A3 CZ 373897A3 CZ 973738 A CZ973738 A CZ 973738A CZ 373897 A CZ373897 A CZ 373897A CZ 373897 A3 CZ373897 A3 CZ 373897A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
influenza
hemagglutinin
protein
recombinant
hao
Prior art date
Application number
CZ973738A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ301021B6 (cs
Inventor
Gale Eugene Smith
Franklin Volvovitz
Bethanie E. Wilkinson
Andrei I. Voznesesnsky
Craig Stanway Hackett
Original Assignee
Protein Sciences Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27508642&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ373897(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Protein Sciences Corporation filed Critical Protein Sciences Corporation
Publication of CZ373897A3 publication Critical patent/CZ373897A3/cs
Publication of CZ301021B6 publication Critical patent/CZ301021B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/816—Viral vaccine for avian species, e.g. poultry or other birds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

(57) Anotace:
Způsob výroby rekombinantní chřipkové vakciny za použití DNA technologie. Výsledná vakcína je multivalenční, výhodně trojvalenční chřipková vakcína, jejíž bázi tvoří směs rekomblnantních hemaglutininových antigenů klonovaných z chřipkových virů, které mají epidemický potenciál. Rekombinantní hemaglutininové antigeny jsou celodélkové, neštěpené /HAO/ glykoproteiny produkované z bakulovirových expresivních vektorů v kultinovovaných hmyzích buňkách a purifikované za nedenaturačních podmínek. U výhodného provedení se klonované HA geny následně modifikují delecí přirozených hydrofobních signálních peptidových sekvencí a jejich nahrazením novým bakulovlrovým chitinázovým signálním peptidem. Vynález se rovněž týká obecného přístupu pro účinnou extrakci a purifíkaci rekombinantního HA proteinu produkovaného v hmyzích buňkách pro purifikaci
INJTKACE DESET
ZMRAZENÍ
TCKVTzmr
AIANTOICKÉ
ZÁSOBA CHŘIPKOVÉHO viru z ro*
1. RDAGLUTimÓNÍ TEST
2. HA-XNHIBIČNÍ TEST
3. TEST NEUTRALIZACE VIRU
I i
i i
X
X X
X X X i X X X X
X
X X
X X i X X i X X X X
X X » X X X X X
I
TITR^VIpU (KEMRSLUTÍímCNÍ testi
ÍHO VEJCE OPTIMALIZACE X. TPCK TRYPSINU 2-r INTIKACE NJCK BUNĚK /SKLI8EŘ VIRU Z z z l
IZOLACE RNA:
A 1MENY - VIROVÁ RXA B OKNY . nJUÍA l
SYNTÉZA CDNA: A KMENY - UNIVERZÁLNÍ RR«®R/VXRQVÁ RNA B KMENY - NAHODILÉ PRIKERY/mBKA PCR PHO ANPLXFIKACI CELÉHO HA GENU KLONOVÁNÍ DO t.^COlí PLASMIDU i SEKVENCE KONCE 5* PRO IPENTiriKACI SEKVENCE SIGNÁLNÍHO PEPYIDU l PCR PRO AMPLlriKACI KA SCWNU BEZ SIGNÁLNÍHO PEPTIDU
KLONOVÁNI DO BAKULOVIROVÉHO REKOMBINANTNÍHO VEKTORU l TRANSFEKCE MVltCX BUWÉK/ VÝBÉR BAKULOVIRQVtHO EXPRESNÍHO VEKTORU l PRODUKCE rKA V HMYZÍCH BUŇKÁCHí purifikace NniacNU | ZVÍŘECÍ A HUMÁNNÍ STUDIE VMtCtWY | ·· «· · ·· ·* ··
01-2810-97 Če
Způsob výroby hemaglutininových multivalenčních vakcín proti chřipce
Oblast techniky
Vynález se obecně týká rekombinantních vakcin proti chřipce.
Dosavadní stav techniky
Každoročně v celém světě propukají epidemie chřipky, které způsobují značnou nemocnost a úmrtnost. Chřipkový vir nej častěji napadá děti, které se velkou měrou podílí na přenosu virů chřipky ve společnosti. U starých osob a osob se zdravotními problémy existuje v případě infikace chřipkovým virem zvýšené riziko vzniku možných komplikací a s nimi spojené hospitalizace. V samotných Spojených státech amerických způsobil zápal plic a chřipka v letech 1956 až 1988 během každé chřipkové sezóny více než 10 000 úmrtí a každou druhou sezónu bylo zaznamenáno dokonce více než 40 000 úmrtí (Update: Influenza Activity - United States and Worldwide, and Composition of the 1992-1993 Influenza V a c c i n e, Morbidity and Mortality Weekly Report. U.S. Departmente of Health and Human Services, Public Health Service, 41/No. 18:315-323, 1992). Chřipkové viry jsou vysoce pleomorfní částice, tvořené dvěmi povrchovými glykoproteiny, hemaglutininem (HA) a neuraminidázou (NA) . HA zprostředkovává navázání viru na hostitelskou membránu a fúzi viro-buněčné membrány během pronikání viru do buňky. Genom chřipkového viru je tvořen osmi jednořetězcovými • ·
01-2810-97 Če protismyslnými RNA segmenty z nichž čtvrtý největší segment kóduje HA gen. Chřipkové viry jsou rozděleny na základě antigenových diferenciaci na typ A, B a C. Viry chřipky A popisuje nomenklatura, jejíž součástí je označeni podtypu nebo typu, geografické místo původu, počet řetězců a rok izolace, například A/Beijing/353/89. Existuje alespoň 13 podtypů HA (H1-H13) a devět podtypů NA (N1-N9). Všechny tyto podtypy byly nalezeny u ptáků, ale u lidí, prasat a koní byly zjištěny pouze H1-H3 a N1-N2 (Murphy and Webster, „Orthomyxoviruses, in Virology, ed. Fields, B.N., Knipe, D.M., Chanock, R.M., 1091-1152 (Raven Press, New York, (1990) ) .
Protilátky, jejichž úkolem je HA neutralizace viru a vytvoření báze pro vytvoření přirozené imunity proti infekci způsobené chřipkou, popisuje například Clements v článku „Influenza Vaccines ve Vaccines: New Approaches to Immunological Problems, ed. Ronald W. Ellis str. 129-150 (Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA 1992). Antigenová variace v HA molekule je často zodpovědná za propuknutí chřipky a omezenou imunizační kontrolu infekce.
Trojrozměrná struktura HA a interakce s jejím celulárním receptorem, kyselinou sialovou, byla extenzivně studována (Wilson a kol., Structure of the hemagglutinin membrane glykoprotein of influenza virus at 3A* rozlišení Nátuře 289:366-378 (1981); Weis a kol., „Structure of the influenza virus hemagglutinin completed with its receptor, sialic acid Nátuře, 333:426-431 (1988); Murphy and Webster, 1990). HA molekula je ve virionu přítomna jako trimer. Každý monomer existuje ve formě řetězců HA1 a HA2, vázaných jednoduchou disulfidovou vazbou. Infikované hostitelské buňky produkují prekurzorový glykosylátovaný • ·
01-2810-97 Ce *· • · ·· • « · · 4 • · · • · · · polypeptid (HAO) s molekulovou hmotností přibližně 85 000, který se následně rozštěpí na HA1 a HA2.
Přítomnost chřipky, HA-specificky neutralizující IgG a IgA protilátku, souvisí s rezistencí vůči infekci a nemoci (Clements, 1992). Celý inaktivovaný virus nebo částečně vyčištěné (podjednotka získaná sestřihem) vakcíny proti chřipce jsou standardizovány tak, že obsahují určité množství HA z každého řetězce. Chřipkové vakcíny zpravidla obsahují 7 až 25 pg HA z každého ze zmíněných tři řetězců chřipkového viru.
Role dalšího hlavního povrchového glykoproteinu, NA, pokud jde o ochrannou imunitu protilátky nebo T-buněčné odezvy na chřipkové viry, nebyla doposud definována. Neuraminidáza je v případě čištění a skladování velmi nestálá (Murphy a Webster, 1990) a množství NA v současně používaných vakcínách proti chřipce není standardizováno. Vyčištěná HA, ale nikoliv NA vakcína chrání před onemocněním zvířata napadená chřipkou (Johansson a kol., „Purified influenza virus hemagglutinin and neuraminidase are equivalent in stimulation of antibody response but induce contrasting types of immunity to infection J. Virology, 63:1239-1246 (1989)). Ukázalo se, že experimentální vakcína na bázi neuraminidázového antigenu neposkytuje člověku ochranu (Orga a kol., J. Infect. Dis. 135:499-506 (1977)).
Vakcíny proti chřipce, na které bylo uděleno povolení, jsou tvořeny formalinem inaktivovanými podtypy virů (H1N1 a
H3N2) influenzy A a jedním podtypem virů influenzy B nebo přípravky, tvořenými podjednotkami získanými chemickým štěpením těchto virů. Před každým chřipkovým obdobím doporučuje „U.S. Food and Drug Administration's Vaccines
01-2810-97 Če and Related Biologicals Advisory Comittee pro nadcházející období použití trojvalenční vakcíny proti chřipce. Vakcíny, používané v letech 1992 až 1993 obsahovaly viry podobné virům A/Texas/36/91-(H1N1), A/Beijing/353/89-H3N2 a B/Panama/45/90. FDA navrhla, aby v letech 1993 až 1994 vakcína proti chřipce obsahovala stejné texaské a panamské kmeny a nový kmen influenzy A Beijing (A/Beijing/32/92).
Vakcinace vysoce rizikových osob, prováděná každoročně před vypuknutím chřipkového období, je nejúčinnějším opatřením pro snížení možnosti infikace chřipkovým virem. Nízká četnost použití, slabá účinnost u starších osob a u mládeže, produkce ve vejcích, antigenní variace a nežádoucí reakce jsou omezujícími faktory současně dostupných vakcín.
Centrum pro kontrolu chorob (CDC) odhaduje, že je proti chřipce každoročně vakcinováno méně než 30% rizikových jedinců (MMWR, 1992). Současné inaktivované vakcíny dosahují vysoké úspěšnosti při ochraně proti onemocnění ve skupině normálních zdravých jedinců, pokud jsou antigeny vakcíny a antigeny cirkulujících virů influenzy blízce příbuzné. Ve skupině starších osob je úspěšnost prevence proti onemocnění mnohem nižší, zejména v případě, kdy jsou tyto starší osoby umístěny v ústavech (Clements, 1992). Nedávné studie zpracované Powersem a Belsheem, J. Inf. Dis. 167:584-592 (1993), uvádí, že podstatnější odezvy protilátky na trojvalenční subvirionovou vakcínu proti chřipce byly pozorovány u méně než třiceti procent osob ve věku 65 let nebo starších.
Zárodečné viry pro vakcíny přirozeně se vyskytující kmeny, influenzy A a B jsou které se replikují do vysokých titrů v alantoické dutině vajec kuřat.
Alternativně je kmenem viru influenzy A přeuspořádaný vir
01-2810-97 Če • · ·♦ • · ·· • · ·· · • t♦ · · se správnými povrchovými antigennimi geny. Přeuspořádaný vir je takový vir, který má v důsledku segmentace virového genomu vlastnosti všech parentálnich kmenů. Pokud buňku infikuje více než jeden kmen viru influenzy, potom se tyto segmentované viry smísí a vytvoří progenní virion, který obsahuje virová přeskupení genů z obou rodičovských kmenů.
Ochrana pomocí současně používaných vakcín proti chřipce, tvořených celými podtypy virů nebo jejich segmenty, je krátkodobá a její účinnost ještě snižuje výskyt antigenního posunu v epidemických kmenech chřipky. Viry influenzy podléhají antigennímu posunu, který je výsledkem imunnitní selekce virů se změnami aminokyselinové sekvence v molekule hemaglutininu. V ideálním případě virové kmeny vakcíny odpovídají virovým kmenům influenzy, které způsobují onemocnění. Nicméně současná produkce chřipkových vakcín je omezena propagací viru v oplodněných kuřecích vejcích. Ne všechny kmeny viru influenzy se dobře replikují ve vejcích; je tedy třeba viry přizpůsobit nebo realizovat virová přeskupení. V hemaglutininu virů influenzy vypěstovaných ve vejcích se objevila extenzívní heterogenita v porovnání s primárními izoláty, izolovanými z infikovaných jedinců, rostoucími v savčích buňkách (Wang a kol., Viril. 171:275-279 (1989); Rajakumar a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:4154-4158 (1990)). Změny v HA v průběhu selekce a produkce chřipkových vakcín mohou mít za následek vznik směsi antigenově distinktních subpopulací viru. Viry ve vakcíně se mohou tedy lišit od variant přítomných v epidemických kmenech, což může mít za následek nižší úroveň ochrany.
U osob trpících vážnou alergií na vejce může zbytek vaj ečného proteinu ve vakcíně způsobit střední
01-2810-97 Če hypersenzitivní reakce. Prasečí chřipková vakcína byla v roce 1976 dávána do souvislosti se zvyšující se četností výskytu Guillain-Barré syndromu. U následných vakcín, připravených z dalších virových kmenů influenzy, nebyl již dále pozorován zvýšený výskyt tohoto vzácného onemocnění.
Způsobem výroby chřipkové vakciny, který nevyžaduje propagaci ve vejcích, lze získat čistší produkt, u kterého je bylo méně pravděpodobné, že způsobí nežádoucí imunitní reakci. Kromě toho by čistší vakcínový přípravek nevyžadoval virovou inaktivaci nebo organickou extrakci složek virové membrány, čímž by se eliminovala denaturace antigenových epitopů a vyloučily by se reziduální chemikálie, které mohou nežádoucím způsobem ovlivnit bezpečnost nákazy.
Kromě toho chřipková vakcína, vyrobená za nepřítomnosti vaječné propagace, by zabránila genetické heterogenitě, která se objevuje při přizpůsobování a průchodem vejci. Výsledkem toho je, že se vakcína lépe přizpůsobí chřipkovým epidemickým kmenům a bude mít vyšší účinnost.
Cílem vynálezu by rovněž mělo být poskytnutí způsobů výroby chřipkové vakciny, která nevyžaduje replikaci ve vej cích.
Cílem vynálezu by mělo být poskytnutí způsobu výroby chřipkové vakciny, který by byl rychlý, čistý a ekonomicky efektivní a který by umožňoval vyrábět vakciny z primárních chřipkových zdrojů.
01-2810-97 Če
Podstata vynálezu
Vynález tedy poskytuje způsob výroby rekombinantního chřipkového hemaglutininového proteinu, který spočívá v expresi tohoto proteinu v hmyzích buňkách bakulovirovým expresním systémem. Výsledný protein je použitelný při výrobě multivalenční chřipkové vakcíny, jejíž podstatu tvoří směs rekombinantních hemaglutinových antigenů, klonovaných z chřipkových virů, které mají epidemický potenciál. Rekombinantní hemaglutininové proteiny jsou celodélkové neštěpené (HAO) glykoproteiny, které zahrnují jak HA1 tak HA2 podjednotky (HAO), purifikované za nedenaturačních podmínek do alespoň 95% čistoty, výhodně do 99% čistoty.
Vynález se rovněž týká způsobu klonování chřipkových hemaglutininových genů z chřipkových virů A a B za použití specificky navržených oligonukleotidových sond a metody využívající polymerázové řetězové reakce (PCR). U výhodného provedení se klonované HA geny modifikují delecí nukleotidů, kódujících přirozené hydrofobní signální peptidové sekvence, a nahrazují se novým bakulovirovým signálním peptidem, čímž se získá sekvence, kódující signální peptid bezprostředně sousedící s hemaglutininem. Tyto chimérické geny se zavedou do bakulovirových expresních vektorů tak, že bakulovirový polyhedrinový promotor řídí expresy rekombinantních HA proteinů v infikovaných hmyzích buňkách. Osmnáctiaminokyselinový bakulovirový signální peptid směruje translaci rHA do glykosylační dráhy hmyzí buňky a není přítomen ve zralém rHA glykoproteinu. U výhodného provedení je vektor navržen tak, že mezi signálním peptidem a hemaglutininovým proteinem nekóduje žádné intervenující aminokyseliny.
< ·
01-2810-97 Če
Tuto metodologii lze rozšířit na všechny typy chřipkových virů včetně prevalenčního A (H1N1) podtypu, A(H3N2) podtypu a typu B, který infikuje lidi, a rovněž chřipkových virů, které infikují další savčí a ptačí druhy.
Vynález rovněž popisuje obecný přístup pro účinnou extrakci a purifikaci rekombinantního proteinu produkovaného v hmyzích buňkách, konkrétně pro purifikaci rHA proteinů z A podtypů a B typu chřipkových virů. Rekombinantní vakcínu lze vyvinout spíše z primárních zdrojů chřipky, například z nazálních sekretů infikovaných jedinců, než z viru přizpůsobeného a kultivovaného v kuřecích vejcích. To umožňuje rychlý vývoj vakcíny přímo z epidemických kmenů chřipky a eliminuje problémy spojené s přizpůsobováním viru kultivaci ve vejcích a rovněž eliminuje reakci pacientů na vaječnou kontaminaci ve výsledné vakcíně.
Příklady demonstrují formulaci a klinickou účinnost vakcíny v imunizující dávkové formě, zahrnující purifikované rHA antigeny ze tří kmenů chřipkového viru, doporučených FDA pro 1993/1994 a 1994/1995 chřipková epidemická období. Funkční imunita se měřila pomocí testů, které kvantifikovaly protilátky, které se váží na chřipkový hemaglutinin blokující schopnost chřipkového viru srážet červené krvinky nebo které neutralizují chřipkový virus. Ochranné imunitní odpovědi na rHA vakcíny se měřily u živočichů, kteří jsou citliví na chřipkovou infekci nebo v rámci humánních imunologických studií.
01-2810-97 Če • ·
Stručný popis obrázků
Obr. 1 schematicky znázorňuje klonováni HA genů z chřipkových A kmenů z purifikovaných virálnich RNA přípravků, purifikaci exprimovaného rHA a biologickou charakterizaci rHA. Zkratky použité obrázcích mají následující význam:
FDA - Foood and Drug Administration;
MDCK - (Madin Darby Canine Kidney) ledviny psa Madin Darby; TPCK - tosylfenylalanylchloromethylketon;
RNA - ribonukleová kyselina;
cDNA - komplementární deoxyribonukleová kyselina;
HA - hemaglutinin;
FBS - fetální bovinní sérum;
PCR - polymerázová řetězová reakce; a
BV - bakulovirus.
Obr. 2 detailněji znázorňuje způsob, schematicky znázorněný na obrázku 1, aplikovaný na klonování a expresi HA genu chřipkového kmene A/Texas/36/91. Chřipkový HA gen se získal z RNA purifikované z MDCK buněk infikovaných chřipkovým kmenem influenza A/Texas/36/91 pomocí reverzní transkriptázy a univerzálního primeru (SEQ ID N0.1), a následných dvou cyklů PCR amplifikace a klonování. Při prvním cyklu PCR reakcí se použil 5' koncový primer SEQ ID NO. 2 a 3' koncový primer SEQ ID NO. 3. Při druhém cyklu PCR reakcí se použil 5' koncový primer SEQ ID NO. 4 a 3' koncový primer SEQ ID NO. 5. Zkonstruoval se bakulovirový rekombinantní vektor obsahující polyhedrinový promotor a signální peptidovou sekvenci z bakulovirového 61K genu (bakulovirový gen, který kóduje signální peptid mající molekulovou hmotnost přibližně 61 000) a následně kompletní kódující sekvence pro zralý HA protein. Tento
01-2810-97 Če rekombinantní vektor se následně použil pro produkci bakulovirového expresního vektoru, který produkuje HA z tohoto kmene viru.
Obr. 3 znázorňuje graf anti-HA imunitní odezvy u myší ve 42. dni, n=5, na titr protilátky pro čistý rHAO; vakcíny Fluzone; a rHAO-kamence; při dávkách 0,5 pg (černé sloupce), 0,1 gg (stínované sloupce), 0,02 pg (tečkované sloupce) a 0,004 pg (bílé sloupce).
Obr. 4a, 4b a 4c znázorňují grafy anti-HA imunitní odezvy u myší imunizovaných rHA nebo schválenou trojvalenční vakcínou, 1994-1995 formule, v týdnech po vakcinaci vs. HIA titru pro HAI A/Texas/36/91 (obrázek 4a), HAI A/Shangdong/ 9/93 (obrázek 4b) a HAI B/Panama/45/90 (obrázek 4c), rHA (kosočtverce) a FLUVIRON zeslabené vakcíny kultivované ve vejcích (čtverečky).
Jak již bylo uvedeno, vynález se týká způsobu výroby rekombinantní chřipkové vakcíny. Celodélkový, neštěpený (ΗΑ0), hemaglutininový antigen z chřipkového viru se produkuje pomocí bakulovirových expresních vektorů v kultivovaných hmyzích buňkách a purifikuje za nedenaturačních podmínek. Dva nebo více purifikovaných hemaglutininových antigenů z kmenů influenzy A a/nebo influenzy B se smísily za vzniku multivalenční chřipkové vakcíny. Účinnost rekombinantních antigenů lze zvýšit jejich sloučením s nosičem adjuvansu.
Použití rekombinantní DNA technologie při výrobě chřipkových vakcín nabízí řadu výhod: rekombinantní DNA chřipkovou vakcínu lze vyrábět za bezpečných a přísněji φφ φφ φ φ φ φ φφ φφφφ φ φ φ φ « · φ φ
01-2810-97 Če
• Φ ·· φ φ φ φ φφφ · kontrolovaných podmínek; není zapotřebí propagace infekční influenzou ve vejcích; rekombinantní HA protein je čistší, což v podstatě eliminuje vedlejší účinky způsobené kontaminujícími proteiny; purifikační postupy pro rekombinantní HA nesmí zahrnovat virovou inaktivaci nebo organickou extrakci virálních membránových složek, čímž se eliminuje denaturace antigenů; produkce HA rekombinantní DNA technologií dává možnost eliminovat genetickou heterogenitu, ke které dochází během adaptace a průchodu vejci, což by mělo umožnit lépe přizpůsobit vakcínové kmeny epidemickými kmeny influenzy a dosáhnout tak vyšší účinnosti; přičemž rekombinantní přístup rovněž umožňuje provádět kmenovou selekci později v průběhu roku, čímž se získá delší čas pro shromáždění a vyhodnocení spolehlivějších epidemiologický dat, na jejichž základě se zmíněná selekce provede.
Bakulovirový expresní systém
Jako bakuloviry se označují DNA viry spadající do rodiny Baculoviridae. Je známo, že tyto viry mají úzké hostitelské rozmezí, které se omezuje zejména na hmyzí druhy Lepidoptery (motýly a můry). Bakulovirus Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus (AcNPV), který se stal prototypem bakuloviru se účinně replikuje v úspěšně pěstovaných hmyzích buňkách. AcNPV má dvouřetězcový uzavřený kruhový DNA genom tvořený přibližně 130 000 bazickými páry a je dobře charakterizován pokud jde o hostitelské rozmezí, molekulární biologii a genetické vlastnosti.
• ·
01-2810-97 Ce
Mnoho bakulovirů včetně AcNPV, tvoři velké proteinové krystalické okluze uvnitř jader infikovaných buněk. Jediný polypeptid, označený jako polyhedrin, má na svědomí přibližně 95% proteinové hmoty těchto okluzních těl. Gen pro polyhedrin je přítomen v jediné kopii v AcNPV virovém genomu. Vzhledem k tomu, že polyhedrinový gen není podstatný pro virovou replikaci v kultivovaných buňkách, může snadno modifikovat expresi cizích genů. Sekvence cizího genu se vloží do AcNPV genu právě 3' koncem k polyhedrinové promotorové sekvenci, tj . za transkripční kontroly polyhedrinového promotoru.
Rekombinantní bakuloviry, které exprimují cizí geny se konstruují homologickou rekombinací mezi DNA bakuloviru a chimérickými plasmidy obsahujícími sledovanou genovou sekvenci. Rekombinantní viry lze detekovat pomocí jejich odlišitelné plakové morfologie a purifikovat z plak do homogenity.
Bakuloviry jsou použitelné zejména jako eukaryotické klonovací a expresní vektory. Díky svému úzkému hostitelskému rozhraní, které se omezuje na artropody, jsou obecně bezpečné. US úřad pro ochranu životního prostředí (EPA) schválil použití tří bakulovirových druhů pro kontrolu škodlivého hmyzu. AcNPV se již několik let aplikuje na zemědělské plodiny.
AcNPV standardní typ a rekombinantní viry se replikují v celé řadě různých hmyzích buněk včetně kontinuálních buněčných linií odvozených ze Spodoptery frugiperdy (Lepidoptera; Noctuidae). Čas zdvojení u buněk S.
frugiperda je 18 až 24 hodin. Tyto buňky se mohou propagovat v monovrstvě nebo volných suspenzních kulturách.
01-2810-97 Če
Rekombinantní HA proteiny se mohou produkovat například v buňkách odvozených z motýlích druhů Spodpotera frugiperda. Dalšími hmyzími buňkami, které lze infikovat bakulovirem, jsou například buňky druhů Bomblx moři, Galleria mellanoma, Trichplusia ni nebo Lamanthria dispar, které lze rovněž použít jako vhodný substrát pro produkci rekombinantních HA proteinů.
Nejvýhodnější hostitelskou buněčnou linií pro produkci proteinů z rekombinantních bakulovirů je Sf900+. Další výhodnou hostitelskou buněčnou linií pro produkci proteinů z rekombinantních bakulovirů je Sf9. Sf900+ a Sf9 představují netransformované, netumorigenové kontinuální buněčné linie odvozené ze Spodoptery frugiperdy (Lepidoptera; Noctuidae). Buňky Sf900+ a Sf9 se propagují při 28+2°C bez obohacení oxidem uhličitým. Kultivačním médiem použitým pro buňky Sf9S je TNMFH, prostá směs solí, vitaminů, cukrů a aminokyselin, doplněná 10% fetálním bovinním sérem. S výjimkou fetálního bovinního séra se žádné další produkty odvozené ze zvířat (tj. trypsin atd.) při buněčné propagaci nepoužívají. Pro růst buněk Sf9 lze rovněž použít séra prosté kultivační médium (dostupné jako Sf900 kultivační médium, Gibco BRL, Gaithersburg, MD), které je vhodné zejména pro propagaci buněk Sf900+.
Doba populačního zdvojení buněk Sf9 je 18 až 24 hodin, tyto buňky se mohou propagovat jako monovrstva nebo jako volné suspenzní kultury. Doposud nebylo zveřejněno, že by buňky S. frugiperdy podporovaly replikaci jakéhokoliv známého savčího viru.
Odborníkům v daném oboru je zřejmé, že expresní vektor se neomezuje pouze na bakulovirový expresní systém. Rekombinantní HA proteiny se rovněž mohou exprimovat v
01-2810-97 Če dalších expresních vektorech, například virech Entomopox (virus hmyzího moru) a hmyzí buňky se potom mohou transformovat konstituční expresí rekombinantního HA genu nebo genů.
Izolace kmenů influenzy
Z těl jedinců infikovaných chřipkou se izoloval jeden nebo několik kmenů influenzy. Výhodně jsou kmeny influenzy ty kmeny, které identifikoval Úřad pro potraviny a léčiva (FDA) nebo CDC, které mají epidemický potenciál pro následující chřipkové období. Výhodou zde popsaného způsobu je to, že jako přímý zdroj viru lze použít například nazální sekrety pacientů infikovaných chřipkou. Alternativně lze viry získat z FDA nebo CDC.
Propagace kmenů influenzy
Kmeny se dále propagovaly v buňkách produkujících vysoké virové titry, například v Madin Darby psích ledvinových (MDCK) buňkách (dostupných ve sbírce Američan Type Culture Colection pod přístupovým číslem ATCC CCL34). Například MDCK buňky se infikují v přítomnosti tosylfenylalanylchloromethylketonem (TPCK) částečně inaktivovaném trypsinu a v takových koncentracích fetálního bovinního séra, které jsou optimální pro produkci vysokých titrů prvního viru. MDCK buňky se infikovaly chřipkovými kmeny při nízké násobnosti infekce (0,1 až 0,5), jak určil standardní HA test (Rosen, „Hemagglutination with Animal Viruses in Fundamental Techniques in Virology, ed. K. Habel a N.P. Salzman, str. 276-28 (Academie Press, New York 1969). Infikované buňky se inkubovaly 48 hodin při 33°C a
01-2810-97 Če médium se použilo pro testy, jejichž úkolem bylo určit hemaglutinační aktivitu a tedy virovou produkci. Podmínky poskytující nejvyšší HA aktivitu se následně použily pro přípravu velké zásoby viru influenzy.
Purifikace viru·
Virové částice, produkované z první frakce, se purifikovaly z média za použití některé známé purifikační metody, například odstřeďování s hustotním gradientem sacharózy. Virus se například sklidil 24 až 48 hodin po infikaci centrifugačním médiem MDCK buněk infikovaných influenzou. Výsledná virová peleta se resuspendovala v pufru a odstřeďovala přes pufrovaný sacharózový gradient. Pás chřipkového viru se sklidil ze 40 až 45% sacharózového úseku gradientu, naředil pufrem a peletoval odstřeďováním při 100 000 x g. Purifikovaná virová peleta se resuspendovala v pufru skladovala při -70°C.
Klonování hemaglutininových chřipkových genů
Přehled způsobů klonování HA genů poskytuje obrázek 1. Buňky jsou v podstatě infikovány chřipkovým kmenem, který se má klonovat. Virus se sklidí z buněčného média a izoluje se buď virová RNA pro kmeny influenzy A nebo mRNA pro kmeny influenzy B. Virová RNA (-RNA) se extrahuje z purifikovaných virionů a pomocí standardních metod analyzuje na formaldehydo-agarózových gelech. cDNA se syntetizuje, buď za použití univerzálního příměrového systému v případě virové RNA izolované z kmenů influenzy A nebo za použiti nahodilých primerů v případě mRNA izolované
01-2810-97 Če z kmenů influenzy B. Plus-standardní komplimentární DNA (cDNA) se připraví za použití univerzálního oligonukleotidového primeru (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO:1)), který je homologický se všemi hemaglutininovými RNA segmenty ve virech influenzy A a B (Davis a kol., „Construction and characterization of a bacterial cloně containing the hemagglutinin gene of the WSN strain (HONÍ) of influenza virus Gene, 10:205-218 (1980)). Primery jsou navrženy tak, aby byly homologické se zachovanými úseky na 5' a 3' konci chřipkových hemaglutininových genů. Jak 5', tak 3' primer má na svých koncích rovněž restrikční enzymatická místa, která se nacházejí v hemaglutininových genech.
Vhodné primery influenzy A a B a chřipková cDNA se smísí a pomocí standardních PCR postupů se amplifikují hemaglutininové genové segmenty. Výsledné dvouřetězcové DNA fragmenty obsahují sekvence kódující celý zralý hemaglutinin. Pro amplifikaci celého HA genu, který se následně nakloňuje do vhodného bakteriálního hostitele, jakým je například E. coli, se používá polymerázová řetězová reakce („PCR). 5' konce se sekvencují s cílem identifikovat signální peptid HA genů, načež se pro amplifikaci HA genů bez signálního peptidu použije PCR. Ten se následně nakloňuje do plasmidového transferového vektoru obsahujícího AcNPV polyhedrinový promotor. Výsledné transferové vektory obsahují následující 5' -> 3' sekvence: polyhedrinový promotor z bakuloviru A. californica NPV, ATG translační startovací kodon, 61K bakulovirový signální peptid, kódující sekvence pro zralý hemaglutin, přirozený hemaglutinový translační terminační kodon, polyhedrinový RNA polyadenylační signál a lemovací bakulovirovou DNA.
φφ φφ φ φ φ φ
ΦΦΦ φ 999 9 Φ
Φ Φ Φ
ΦΦ ΦΦ
01-2810-97 Ce « ·♦·· • φ « φ« • φ φφ • φ «φφ φ φ φ·
Φ· φφφ
Purifikované DNA chimérického transferového plasmidu, která obsahuje klonovaný hemaglutininový gen se následně smísí s AcNPV standardním typem DNA, vysráží společně s vápníkem a transfektuje do buněk S. frugiperdy. Rekombinantní bakuloviry se rozdělí za základě morfologie plak a dále purifikují dalšími cykly plakové purifikace. U klonovaných rekombinantních bakulovirů se určuje hemaglutininová exprese a jednotlivé bakulovirové expresní vektory se rozdělí tak, aby produkovaly základní virovou banku.
Kmeny influenzy A
HA geny z kmenů influenzy A se klonovaly z purifikovaných virových RNA přípravků. Virová RNA se extrahovala ze 100 až 200 μΐ purifikovaných virionů influenzy A, obsahujících 1 000 až 2 000 hemaglutinačních jednotek (HAU) influenzy. Jedna HAU odpovídá množství viru, které bude srážet 50 % červených krvinek ve standardním testu srážlivosti (Rosen, 1969). Viriony se ošetří proteinázou K, jejímž úkolem je digerovat protein a potom se virová DNA extrahuje shodnými objemy fenolu a chloroformu a vysráží ethanolem v přítomnosti tRNA nosiče. Virová RNA se resuspenduje v pufru a digeruje RNAzy-prostou DNAzou, jejímž úkolem je odstranit veškerou kontaminující DNA, načež se extrakční a srážecí krok zopakuje. Virová RNA (vRNA) se následně analyzuje za použití formaldehydoagarózových gelů způsobem, který popisuje Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Labolatory Manual. str. 86-96 a 366367 (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring, N.Y. 1982).
01-2810-97 Če
Kmeny influenzy B
HA geny z kmenů influenzy B se klonuji z celkové mediátorové RNA (mRNA), extrahované z buněk infikovaných kmenem influenzy B. Celá RNA se následně extrahovala z infikovaných buněk. Sklizené buňky se lyžovaly v přítomnosti guanidiniumthiokyanátu a celá buněčná RNA se purifikovala, například za použití RNA extrakční sady od společnosti Pharmacia Biotech lne. (Piscataway, NJ) . Celá mRNA se extrahovala z buněčné RNA na Oligo-(dT)celulózových odstředěných kolonách, například pomocí RNA extrakční sady od společnosti Pharmacia Biotech lne.
Exprese a zpracování rekombinantního hemaglutininu v hmyzích buňkách
Rekombinantní hemaglutininové antigeny se exprimovaly ve vysoké koncentraci, v buňkách S. frugiperda infikovaných AcNPV-hemaglutininovými vektory. Hlavním genovým produktem je nezpracovaný celodélkový hemaglutinin (rHAO), který se nesekretuje ale zůstává spojen s periferními membránami infikovaných buněk. Tímto rekombinantním HAO je protein s molekulovou hmotností 68 000, který je glykosylátovaný N-navázaným vysokomanósovým typem glykanů, které se liší od glykanů produkovaných expresí virových proteinů v savčích nebo ptačích buňkách. To dokazuje, že rHAO tvoří posttranslačně trimery, které se akumuluji v cytoplazmatických membránách.
01-2810-97 Če · ·‘ ··
Vektory pro expresy HAO a dalších proteinů
HAO je díky své vynikající stabilitě v porovnání s HA1/HA2 komplexem a díky zachování správného sbalení během purifikace a skladování lepší vakcínou. Vynikající stabilita je zvláště patrná v případě B kmenů, což se projevuje u titrů, které jsou přibližně 5krát vetší než titry, získané pomocí komerčně dostupných, slabších, B kmenů.
Jak zmiňují níže uvedené příklady, pokud se HA geny klonovaly v pMGS12 přes restrikční místa, potom se HA zralý signální peptid odstranil a nahradil bakulovirovým chitinázovým signálním peptidem, označeným jako 61 kD signální peptid. Vzhledem k tomu, že HA gen je na chitinázový signální peptid navázán přes restrikční místa, jsou mezi zralým HAO proteinem a 61 kD signálním peptidem, v závislosti na zvoleném restrikčním místě, tři až pět aminokyselin. Přesto, že s kmenem influenzy A nebyly žádné problémy, kmen HAO B exprimovaný dalšími aminokyselinami se nesbalil správným způsobem.
Pro řešení tohoto problému byly vyvinuty dva způsoby. Prvním je použití nového vektoru, pMGS3, který nekóduje 61 kD signální peptid. HAO se svým přirozeným signálním peptidem se nakloňuje do vektoru a exprimuje. Při SDS-PAGE charakterizaci HAO B kmene exprimovaný v tomto vektoru, vykazuje lepší glykosylaci a zpracování, než pokud je exprimován v pMGS12. Tento HAO je sbalen tak dokonale, že ho lze kvantitativně převést na HA1/HA2. Naneštěstí, jak ukázal westernový přenos, výtěžek není tak vysoký. Druhý způsob zvyšuje výtěžek použitím 61 kD signálního peptidu v pMGS12 pro řízenou expresi, při které se HAO gen inzertuje
01-2810-97 Če bez použití restrikčních enzymů. Nový vektor zahrnující 61kD signální peptid a HAO gen bez sekvence, kódující zevně intervenující aminokyseliny, je označen jako pMGS27.
pMGS27 může být použit pro klonování a expresi libovolného genu v bakulovirovém expresním systému. Cílový gen, namísto aby se klonoval do vektoru restrikcí a ligací, se klonuje do vektoru temperací. Reakční činidla lze získat u společnosti Clontech v jejich PCR-řízeném klonovacím systému. pMGS27 je navržen tak, že může být linearizován na konci úseku, kódujícího chitinázový signální peptid, a dva dlouhé jednořetězcové konce lze vytvořit ošetřením linearizovaného pMGS27 T4 DNA polymerázou a dATP.
Cílový gen se amplifikuje pomocí polymerázové řetězové reakce („PCR) nebo pomocí reverzní transkriptázové-PCR („RT-PCR) s párem oligonukleotidů navržených tak, aby vytvořily jednořetězcové konce, které jsou komplementární s konci ošetřeného pMGS27, načež se PCR fragment ošetří T4 DNA polymerázou a dTTP. Pomocí prosté temperace lze následně sloučit dvě molekuly tak, že se vytvoří kruhový plasmid, který se snadno transformuje do hostitele. Kromě toho, že tento postup je rychlejší a snadnější než tradiční restrikčně-ligační způsob klonování HA genu do pMGS12, je výhodou pMGS27 to, že neposkytuje nadbytečné aminokyseliny, kódované restrikčními místy mezi chitinázovým signálním peptidem a zralým HA proteinem. V některých případech, například v případě B kmene HA, může přítomnost nadbytečných aminokyseliny vést k tomu, že signální peptidáza nemůže rozštěpit signál nebo že se kódovaný protein sbalí nesprávným způsobem.
01-2810-97 Če
Purifikace rekombinantního HAO
Několik dni po infikaci lze rHAO selektivně extrahovat z periferních membrán AcNPV-hemaglutininem infikovaných buněk nedenaturačním noniovým detergentem nebo dalšími způsoby, které jsou pro purifikaci rekombinantních proteinů z hmyzích buněk včetně afinitní nebo gelové chromatografie a navázání protilátek odborníkům v daném oboru známy. rHAO rozpustný v detergentu může být dále purifikován pomocí DEAE iontoměničové a čočkové lektinové afinitní chromatografie nebo dalších ekvivalentních metod, odborníkům v daném oboru známých.
U výhodného provedení se rHAO purifikuje postupem, který je opatrnější a jeho výsledkem je vyšší výtěžek rHAO z B kmenů influenzy. Tento postup je zpravidla následující.
HAO protein, který tvoří nedílnou součást membrány hmyzích buněk se separuje z rozpustných proteinů, periferních membránových proteinů a většiny DNA a RNA extrakcí buněk v relativně viskózním roztoku alkálie, přičemž pH alkálie se pohybuje přibližně v rozmezí od 9,5 do 10,5. Viskóza se zvyšuje v důsledku inkluze sacharózy při koncentraci přibližně 250 mM. Disulfid-redukující činidlo, například β-merkaptoethanol, je použito v takové koncentraci, která účinně brání navázání proteinu ze směsi na disulfid. Buňky se suspendují v extrakčním pufru, homogenizují a následně odstřeďují. Peleta se promyje homogenizací v pufru s nízkou iontovou silou, který obsahuje disulfid-redukující činidlo při alkalickém pH (vodivost je zpravidla menší než 1 mS, pH 10,5) a odstřeďuje se. HAO se následně extrahuje z pelety v pufru, který obsahuje 0,3 až 1,5 % detergentu, například Tritonu a
01-2810-97 Če disagregační činidlo v množství, které brání tvorbě komplexů způsobené vzájemnými reakcemi mezi náboji, například 0,3 až 1,0 M betainu nebo paurinu, při alkalickém pH (výhodně 9,5). HAO v supernatantu se následně purifikuje aniontoměničovou chromatografií a následnou kationtoměničovou chromatografií. HAO se ve stejném pufru, ve kterém se extrahoval ale který se naředí alespoň 1:2 dalším pufrem, aplikuje na iontoměničovou kolonu, například DEAE nebo Q-Sepharosa (agarózová kuličková kolona s kvarterními aminoskupinami), která se před tím uvedla do rovnovážného stavu pufrem, který obsahoval přibližně 1/10 koncentrace detergentu a disulfid-redukujícího činidla. HAO se následně eluuje snížením pH přibližně na 8,5. Eluovaný HAO se aplikuje na kationtoměničovou kolonu ve v podstatě stejném pufru. Kontaminující látky se eluují snížením pH přibližně na 7,4, a následně se HAO eluuje zvýšením koncentrace soli na 0,15 M NaCl.
Tento výhodný způsob purifikace bude podrobněji popsán níže.
Preparace rekombinantní HA-obsahující membránové frakce
Buňky exprimující rekombinantní HA (6,2 g buněk z 0,34 1 kultury) se suspendují při 100 mg/ml v ledově studeném 100 mM pyrofosfátu sodném, 100 mM chloridu sodného, 250 mM sacharózy, 0,1% β-merkaptoethanol, pH 10,5. Buňky se rozrušily pomocí homogenizéru Polytron (Brinkman Instruments lne., Westbury, NY) při dvouminutovém nastavení 4. Pro zvýšení rozpustnosti kontaminujících proteinů a zvýšení čistoty membránového přípravku je třeba použít alkalické pH homogenizačního média. Homogenizát se
01-2810-97 Če • · · · · odstřeďuje 30 minut při 9 200 g. Supernatant se rozruší a pelety se shromáždí. Po preparaci membránové frakce následuje promývací krok, ve kterém se membránová frakce promývá roztokem s nízkou iontovou silou. Peleta se resuspenduje do původního objemu v ledově studeném 0,1% βmerkaptoethanolu, 10,5, a homogenizuje za použití homogenizeru Polytron při dvou minutovém nastavení 4. Homogenizát se odstřeďuje 30 minut při 9 200 g. Supernatant se odstraní a pelety se seberou. Tento průplach s nízkou iontovou silou odstraní další část periferních membránových proteinů. Preparace membránové frakce vede ke značnému obohacení rekombinantního HA a k odstranění kontaminujících nukleových kyselin.
Extrakce rekombinantního HA
Rekombinantní HA se následně selektivně extrahuje z membránové pelety za podmínek, které nedenaturují antigen. Membránová peleta se homogenizuje ve 41 ml ledově studeného 10 mM ethanolaminu, pH 9,5, 1% Tritonu N101, 0,1% βmerkaptoethanolu, 25 mM NaCl a 400 mM betainu za použití homogenizéru Polytron při dvouminutovém nastavení 4. Po čtyřicetiminutové inkubaci při 23 °C se směs odstřeďuje 30 minut při 9 200 g. Supernatant obsahující rekombinantní HA se oddekantuje a naředí na dvojnásobek stejným pufrem.
Proteiny se analyzují pomocí SDS gelové elektroforézy. Vzorky se rozruší pobytem ve vroucí vodní polyakrylamidové desetiminutovým v přítomnosti lázni
2% dodecylsulfátu sodném (SDS) podrobí elektroforéze na 11% přítomnosti 0,1% SDS a následně a 5% β-merkaptoethanolu, polyakrylamidovém gelu v se zabarví modří Coomassie.
• · • ·
01-2810-97 Če
Chromatografická purifikace
Chromatografická purifikace rekombinantniho HA se zjednoduší a drahá afinitni chromatografie na čočkové lectin-sepharóze se z procesu vyloučí a nahradí dvoustupňovým chromatografickým purifikačním procesem, který poskytne vysoce purifikovaný rekombinantní HA antigen, který není denaturován a lze vhodně použít jako složka chřipkové vakcíny pro humánní aplikaci. Jako chromatografické gelové matrice se použily matrice Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow a CM-Sepharose Fast Flow.
Aniontoměničová chromatografie
Celá chromatografie se provádí při pokojové teplotě. Extrakt, který obsahuje rekombinantní HA, připravený výše popsaným způsobem se aplikuje rychlostí 1 ml/min na Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow (5 ml v koloně C10/10 Pharmacia), která se předtím uvede do rovnovážného stavu 10 mM ethanolaminem pH 9,5, 0,1% tritonem N101, 0,01% β-merkaptoethanolem, 25 mM NaCl a 400 mM betainem. Kolona se potom promývá vyrovnávacím pufrem, dokud se UV absorbance odtékající látky nevrátí zpět na počáteční hodnotu. Za těchto podmínek se rekombinantní HA váže na kolonu, zatímco část kontaminujících látek proudí touto kolonou bez zachycení. Částečně purifikovaný rekombinantní HA se následně eluuje 30 mM diethanolaminu pH 8,5, 0,1% Tritonem N101, 0,01% β-merkaptoethanolem, 25 mM NaCl a 400 mM betainem.
• ·
01-2810-97 Če
Q-Sepharosový eluát (23 ml) se naředí na dvojnásobný
0,1% Tritonem N101,
Kationtoměničová chromatografie objem mM diethanolaminem pH 8,5,
0, 01% β-merkaptoethanolem, 10 mM NaCl a 400 mM betainem.
Kolona se následně promyje 35 ml 10 mM fosforečnanem sodným pH 7,4, 0,1%
Tritonem
N101, 0,01% β-merkaptoethanolem, mM NaCl a
400 mM betainem. Toto ošetření eluuje kontaminuj ící látky kolony, zatímco rekombinantní HA zůstane navázaný na
CM Sepharose. Detergent se následně odstraní promýváním kolony 10 mM fosforečnanem sodným pH 7,4, mM NaCl, které se ukončí až potom, co UV absorbance proudu vytékajícího z kolony dosáhne opět své počáteční hodnoty. Purifikovaný rekombinantní
HA se eluuje fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem, pH
7,5 (PBS).
Purifikovaný rHAO se resuspenduje v isotonickém pufrovaném roztoku. Po odstranění detergentu bude purifikovaný ΗΑ0 účinně aglutinovat červené krvinky.
Strukturní a biochemické vlastnosti rekombinantního ΗΑ0 rHAO se purifikuje do dosažení alespoň 95% čistoty, výhodněji do dosažení 99% čistoty. Na SDS-polyakrylamidovém gelu migruje, převážně jako jediný, hlavní polypeptid s molekulovou hmotností 68 000. Kvarterní struktura purifikovaného rekombinantního ΗΑ0 antigenu se určuje pomoci elektronové mikroskopie, trypsinové resistence, hustotní sedimentační analýzy a schopnosti aglutinovat červené krvinky. Z výsledků těchto testů vyplývá, že rekombinantní ΗΑ0 tvoří trimery, které se sestavují do tvaru růžic.
01-2810-97
Purifikovaný rHAO neaglutinuje před odstraněním detergentu buňky, z čehož vyplývá, že aby se antigen mohl křížově navázat na červené krvinky kuřete, musí vytvořit komplexy (růžice). Kvantitativní schopnost purifikovaného
rHAO aglutinovat buňky se využívá jako (lot-to-lot) míra konzistence antigenu.
Hemaglutininová jednotka se definovala jak množství antigenu, které je potřebné pro dosažení 50% aglutinace ve standardním hemaglutininovém testu, prováděném na červených krvinkách kuřete. Srovnávací data ukázala, že purifikované rHAO antigeny aglutinují červené krvinky s účinností, srovnatelnou s účinností pozorovanou v souvislosti s celkovými chřipkovými viriony.
Rekombinantní HAO se může štěpit v místě disulfidové vazby, což může způsobit konformačni změnu, která vede k vytvoření dvou řetězců, HA1 a HA2, jak uvádí Carr, C.M. a Kim, P.S., „A Spring-loaded Mechanism for the Conformational Change of Influenza Hemagglutin, Cell 73:823-832 (1993). Rozštěpení rekombinantního HAO je podrobněji popsáno v níže uvedeném příkladu 6. Rovněž se dá předpokládat, že po rozštěpení přirozeného HAO na HA1 a HA2, se řetězce stanou infekčními získáním schopnosti vázat se na buňky a tak se dosáhne lepší imunitní odezvy. Toto zpracování antigenů, například chřipkového hemaglutininu, se projeví navázáním antigenových peptidů na hlavní histokompatibilní (MHC) molekuly. Rozpoznání antigen/MHC komplexu T buňkami představuje iniciaci imunitní odezvy, jak přehledně popisuje Harding a Geuze, Current Opinion in Cell Biology 5:596-605 (1993). Nicméně rHAO, produkovaný v bakuloviru, je vysoce stabilní a imunogenní jako intaktní molekula. Porovnání molekul cukru na HAO exprimovaném v
01-2810-97 hmyzích buňkách ukázalo, že se tyto glykany liší od glykanů na HAO, exprimovaném v savčích nebo ptačích buňkách.
Produkce fúzních proteinů
Fúzní proteiny, tvořené HAO navázaným na druhý antigenový protein, lze produkovat, pokud je antigenicita druhého proteinu nižší nebo pokud je výhodné vyvolání imunogenní odezvy na více antigenů. Příkladem druhého výhodného antigenu je neuraminidáza produkovaná chřipkou. Tento antigen může být tvořen celulárním, virovým nebo bakteriálním proteinem nebo jeho antigenovou částí, zahrnující alespoň pět až osm aminokyselin. Další antigeny zahrnují hepatitický B antigen, HIV antigeny a karcinoembryonický antigen. Výraz „imunitní odezva, jak je zde uveden, označuje buď humorální odezvu, měřenou produkcí protilátky k antigenu, nebo celulární odezvu, měřenou vyvoláním T buňkou mediované odezvy na antigen. V některých případech se může mezi HA a antigen zavést „vazebník neantigenových aminokyselin a tím tak dále zvýšit antigenicitu antigenu, v porovnání s původním HA. Součástí způsobu je zkonstruování DNA plasmidu pro fúzi genů cílového antigenu na celodélkový HA gen chřipkového genu nebo jeho fragmenty za použití oligonukleotidových sond a metodologie polymerázové řetězové reakce (PCR).
Fúzní geny HA-cílového antigenu se modifikují pro správnou expresi hmyzích buněk delecí přirozených hydrofobních signálních peptidových sekvencí a jejich náhradou novým bakulovirovým signálním peptidem. Fúzní protein se zavede do bakulovirového expresního vektoru tak, že bakulovirový polyhedronový promotor řídí transkripci
01-2810-97 • · · · · fúzních proteinů v infikovaných hmyzích buňkách. Osmnáctiaminokyselinový bakulovirový signální peptid řídí transkripci fúzního polypeptidu HA-cílového antigenu do glykosylační dráhy hmyzí buňky a není přítomen na zralém fúzním proteinu.
Například plasmid pA9440, který obsahuje HA gen A/Beijing/32/92 kmene v níže popsaném pMGS12 bakulovirovém transferovém plasmidu se použije jako matrice pro amplifikaci HA genu polymerační řetězovou reakcí (PCR) a za použiti protokolu doporučeného dodavatelem (Gene Amp PCR cloning kit, Perkin Elmer Cetus). Reakční směs (100 μΐ), obsahovala 20 pmol primerů navržených pro temperaci částí HA genu. 5' a 3' primer byly navrženy s endonukleázovými místy na koncích, které se nenacházely v HA genu. 5' PCR primer (0 až 567) pro HAOa HA1 fragmenty začíná 52 bazických párů za 5' koncem sekvencí kódujících přirozený HA gen, které postrádají přirozenou signální peptidovou sekvenci, a přidává Smál místo bezprostředně za 5' na sekvence kódující HA. 5' PCR primer (0 až 651) pro HA2 začíná na nukleotidu 1108 zralého HA genu, bezprostředně následujícím za kodonem kódujícím argininový zbytek, který se odstranil během rozštěpení ΗΑ0 na HA1 a HA2. Byl navržen 3' PCR primer (0 až 680) pro ΗΑ0 a HA2 fragmenty, který zavede Kpnl místa bezprostředně za HA kódující sekvence, které odstraňují přirozený koncový kodon. 3' PCR primer pro HA1 (0 až 679) upravuje gen bezprostředně před argininovým zbytkem odstraněným během ΗΑ0 štěpení. Amplifikace fragmentu HA genu se prováděla ve třiceti cyklech, z nichž každý sestával z jednominutové denaturace při 94°C, dvouminutového temperování primerů při 55 °C a dvouminutové extenze při 72°C. Výsledné amplifikované fragmenty HA genu
01-2810-97 • · ··
Φ 4 4Φ • 44 4 4
Φ ΦΦ se podrobily elektroforéze na agarózovém gelu, purifikovaly z gelu pomocí sady GeneClean (Bio 101, lne.) a ligovaly do plasmidu, navrženého tak, aby přijal PCR-generované fragmenty (pCRII; Invitrogen). Takže se získají plasmidy pB142, pB144 a pB330, které obsahují HAO, HA1, resp. HA2 genové fragmenty.
Z plasmidů pB142, pB144 a pB330 se pomoci Smál a Kpnl restrikčních enzymů odstranily HA genové fragmenty, které se následně subklonovaly standardními rekombinantnimi DNA technikami (Sambrook a kol., 1989) do AcNPV transferového plasmidu pMGS12. Plasmid pMGS12 obsahuje, směrem od 5' k 3', AcNPV polyhedronový promotor, ATG iniciační kodon, sekvenci pro odštěpitelný signální peptid z bakulovirového glykoproteinu s molekulovou hmotností 61 000 (61K), Smál a Kpnl klonovací místa pro restrikční enzym a TAA univerzální koncovou kodonovou sekvenci. Tyto regulační oblasti lemuje DNA £coRI I fragmentu AcNPV genomu (Summers a Smith, „A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987)). Klonované HA PCR fragmenty se izolují z pCRII klonovacího vektoru pomocí Smál a Kpnl, purifikovaných elektroforézou na agarózovém gelu a sadou GeneClean, a ligovaly do pMGS12, který byl rovněž digerován Smál a Kpnl. Výsledné AcNPV transferové plasmidy, pB879, pB1201 a PB1205, obsahovaly kódovací oblasti pro HAO, HA1 resp. HA2 navázané v rámci s rozštěpitelným bakulovirovým signálním peptidem 61K genu a polyhedrinovým promotorem. Výsledné AcNPV transferové plasmidy, pB879, pB1201 a PB1205 lze použít pro fúzi HAO, HA1 nebo HA2 na libovolný sledovaný gen.
01-2810-97
Druhým krokem při konstrukci HA-CEA fúzních genových transferových plasmidů je zavedení CEA-kódujících sekvencí do HA-kódujících konstruktů. Restrikční endonukleázou rozpoznávací/štěpná místa pro Smál a KpnT se umístila PCR amplifikací plasmidů pA9080 na oba konce CEA genu. 5' PCR primer, 0-649, začíná 82 bazických párů od 5' konce genu s delecí sekvence zralého CEA signálního peptidu. 3' PCR primer, 0-650, byl navržen pro deleci posledních 72 bazických párů na 3' konci genu, který kóduje hydrofobní sekvenci C-koncového úseku. Amplifikace CEA genového fragmentu se provádí ve třiceti cyklech, z nichž každý sestává z jednominutové denaturace při 94 °C, dvouminutového temperování primerů při 55°C a dvouminutové extenze při 72 °C. Výsledný amplifikovaný CEA genový fragment se podrobil elektroforéze na agarózovém gelu, purifikoval metodou GeneClean a ligoval do pCRII (Invitrogen) způsobem, který doporučuje výrobce. Výsledný plasmid, pB806, obsahuje CEA gen bez jeho přirozeného signálního peptidu, C-koncové hydrofobní domény nebo koncového kodonu, ale jak se Smál, tak s KpnT místem na obou koncích genu.
Příprava peptidu ve velkém měřítku se prováděla pomocí plasmidů pB806 a DNA se digerovala buď pomocí Smál nebo Kpnl. CEA-kódující fragmenty se purifikovaly elektroforézou na agarózovém gelu pomocí sady GeneClean a purifikované fragmenty se ligovaly do každého ze tří
HA-kódujících konstruktů (pB879, pB1201 nebo pB1205), stejným restrikčním enzymem. Například digerovaných
CEA-kódující fragmenty s Smal-sestřiženými konci se ligovaly do ΗΑ0-,
HA1- a HA2-kódujících konstruktů (pB879, pB1201, resp.
pB1205) sestřižených Smál tak, že vytvořily plasmidy pB1250, pB1555, resp. pB1584. CEA-kódující fragmenty s
01-2810-97
KpnI-sestřiženými konci se ligovaly do ΗΑ0-, HA1- a HA2kódujících konstruktů, sestřižených KpnI tak, že vytvořily plasmidy pB1264 resp. pB1564 a pB1593. Inzerce CEA genu na Smál místě zavede CEA- kódující sekvence za HA-kódující sekvence. V případě všech konstruktů byly navrženy PCR primery tak, aby se EA gen vložil v rámci HA a aby se fúzní genová translace ukončila na univerzálním translačním koncovém signálu (TAATTAATTAA) (SEQ ID NO: 4) v pMGS12 vektorových sekvencích za Kpnl místem.
Tento konstrukt lze vylepšit delecí intervenujících aminokyselin, buď mezi signálním peptidem a HAO, jak bude popsáno dále, nebo mezi HAO a fúzním genem, a zlepšit tak jeho sbalení a imunogenicitu.
Formulace a balení vakcíny rHA lze formulovat a balit samotné nebo v kombinaci s dalšími chřipkovými antigeny, za použití metod a materiálů, které jsou odborníkům v oboru chřipkových vakcín známy. U výhodného provedení se HA proteiny ze dvou kmenů A a jednoho kmene B sloučí za vzniku multivalenční vakcíny.
U zvláště výhodného provedení se HA sloučí s adjuvansem, který se použije v množství, účinném pro zvýšení imunogenní odezvy proti HA proteinům. V současnosti je jediným, v širším měřítku používaným, adjuvansem u lidí kamenec (fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý). Saponin a jeho purifikovaná složka Quil A, Freundův kompletní adjuvans a další adjuvansy používané při výzkumu a při veterinárních aplikacích mají toxicitu, která omezuje jejich potenciální použití v lidských vakcínách. Nicméně »9
01-2810-97 nově chemicky definované přípravky, jakými muramyldipeptid, monofosforyl lipid A, konjugáty, například konjugáty, které
Snitkoff a kol., J. Immunoi. 147:410-415 jsou například fosfolipidové popsal Goodman (1991), a rovněž by se mělo použít zapouzdření proteinu v proteoliposomu, jak popisuje Miller a kol., J, Exp. Med. 176:1739-1744 (1992), a zapouzdření proteinu v lipidových vehikulech, například lipidových vehikulech Novasome (Micro Vescular
Systems, lne., Nashua, NH).
U výhodného provedení se vakcína balí ve formě jediné dávky, určené pro imunizaci parenterálním (tj. intramuskulárním, intradermálním nebo subkutánním) podáním nebo nazofaryngeálním (tj. intranazálním) podáním. Účinná dávka se stanoví způsoby, popsanými v níže uvedených příkladech. Nosičem je zpravidla voda nebo pufrovaný fyziologický solný roztok, s konzervační látkou nebo bez konzervační látky. Antigen se může lyofilizovat a v okamžiku podání resuspendovat, nebo podávat v roztoku.
Nosičem může rovněž být polymerní systém se zpožděným uvolňováním. Syntetické polymery jsou zvláště použitelné při formulaci vakcíny, u které má být dosaženo kontrolovaného uvolňování antigenů. Raným příkladem byla polymerace methylmethakrylátu do kuliček, s průměrem menším než jeden mikrometr, za vzniku takzvaných nanočástic, které popsal Kreuter J., Microcapsules and Nanoparticles in Medcine and Pharmacology, M. Donbrow (ed.), CRC Press, str. 125-148. Odezva protilátky, stejně jako ochrana proti infikaci chřipkovým virem, byla podstatně lepší než v případě, kdy se antigen podával v kombinaci s hydroxidem hlinitým. Experimenty s dalšími částicemi ukázaly, že
01-2810-97 přídavný účinek těchto polymerů závisí na velikosti částic a hydrofobicitě.
Mikrozapouzdřením injekce mikrozapouzdřených farmaceutických látek se dosáhne jejich kontrolovaného uvolňování. Na volbu příslušného polymeru pro mikrozapouzdření má vliv celá řada faktorů. Reprodukovatelnost polymerní syntézy a mikrozapouzdřovací proces, cena zapouzdřovacího materiálu a ekonomická náročnost způsobu zapouzdřování, pro různou toxikologický profil, kinetiku uvolňování a fyzikochemickou a antigenů představují rozhodování v úvahu.
faktory, které
Použitelnými požadavky slučitelnost polymeru je třeba vzít při polymery jsou například polykarbonáty, polyurethany, polyorthoestery a polyamidy, které jsou biologicky degradovatelné.
polyestery, zejména ty,
Často voleným nosičem pro farmaceutika a v poslední době častěji pro antigeny je póly(d, 1-laktid-ko-glykolid) (PLGA), což je biologicky degradovatelný polyester, který se v lékařské praxi již dlouhou dobu používá, například v případě vstřebávacích stehů, kostních plotének a dalších dočasných implantátů, kde nevykazuje žádnou toxicitu. Do PLGA mikrokapslí se formuluje celá řada různých farmaceutik. K tomu, aby bylo možné upravit PLGA tak, aby kontrolované uvolňovala antigen, je třeba shromáždit určitá tělesná data, jak uvádí například Eldridge, J.H. a kol., Current Topics in Microbiology and Immunology, 1989, 146: 59-66. Zachycení antigenů v PLGA mikrokuličkách o průměru 1 až 10 gm ukázalo, že mají značně adjuvansní účinek, pokud se podají orálně. PLGA mikrozapouzdřovací proces používá fázovou separaci emulze typu „voda v oleji. Sledovaná sloučenina se připraví jako vodný roztok a PLGA
01-2810-97 se rozpustí ve vhodných organických rozpouštědlech, například v methylenchloridu a ethylacetátu. Tyto dva nemísitelné roztoky se ko-emulgují vysokorychlostním mícháním. Potom se přidá nerozpouštědlo pro polymer, což způsobí vysrážení polymeru okolo vodných kapiček za vzniku embryonálních mikrokapslí. stabilizují jedním z polyvinylalkohol (PVA), polyvinylpyrrolidon (PVP) a
Mikrokapsle se ochladí a činidel, která zahrnují želatinu, algináty, methylcelulózu, a buď sušením ve vakuu nebo extrakcí rozpouštědla se zbaví rozpouštědla.
Vynález se stane zřejmějším po prostudování následujících příkladů.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Propagace a purifikace chřipkových virů
Z FDA v alantoické kapalině vejce kuřete se získaly následující kmeny chřipkové vakcíny:
A/Beijing/353/89-podobný (H3N2)
A/Beijing/32/92-podobný (H3N2) A/Texas /36/91-podobný (H1N1) B/Panama/45/90.
Pro propagaci původní zásoby chřipkového viru, získaného z FDA, se MDCK buňky infikovaly v přítomnosti
TPCK-ošetřeného trypsinu (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO) a koncentracích fetálního bovinního séra, které jsou optimální pro přípravu nejvyšších titrů viru první choroby.
01-2810-97
MDCK buňky se infikovaly chřipkovými kmeny při nízké multiplicitě infekce (0,1 až 0,5), jak určil standardní HA test (Rosen, „Hemagglutination with Animal Viruses in Fundaiaental Techniques in Virology, ed. K. Habel a N.P. Salzman, str. 276-28 (Academie Press, New York 1969)). Infikované buňky se inkubovaly 48 hodin při 33°C a u média se provedl test hemaglutininové aktivity. stanovující produkci viru. Podmínky poskytující nejvyšší HA aktivitu se použily pro přípravu velkých zásob chřipkového viru. Optimální koncentrace TPCK trypsinu a fetálního bovinního séra pro výše uvedené chřipkové viry jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 1.
9 9 9 · 9 9 · 9 ·
9·· 9
9 9 * 9 9 9 • ·· · • · ·· • · ·9 • 9 9999 • ·9 • 99 9
9 9 * 9 • ·
9 9 • 9
9 9 9 9 9 9
01-2810-97 φ · · · φ · · · · φφφφφ φ φ · φφφφ φ φ φ φ φ φφφ • · φφφφφφφ «· · ·
Purifikace chřipkového viru
Virus se 24 až 48 hodin po infikaci sklidil z 10 T175 kultivačních nádob klarifiačního média (1 000 x g po dobu 10 minut), chřipkou infikovaných MDCK buněk. Virus se peletoval z média při 100 000 x g po dobu 1 hodiny. Výsledná virová peleta se resuspendovala v 1 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) pH 7,4 a odstřeďovala přes 20 ml 20-60% (hm./obj.) sacharózového gradientu v PBS. Pás chřipkového viru se sklidil ze 40-45% sacharózové oblasti gradientu, naředil PBS a peletoval při 100 000 x g. Purifikované virová peleta se resuspendovala v 0,5 ml PBS, skladovaného při -70°C.
Přiklad 2
Klonování HA genu influenzy A/Texas/36/91
Specifický příklad klonovaného kroku pro jeden z chřipkových HA genů je znázorněn na obrázku 2. Virová RNA se extrahovala výše popsaným způsobem z influenzy A/Texas/36/91, získané z CDC. Univerzální primer, komplementární s koncem 3' chřipkových RNA segmentů 5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID N0:l), se použil spolu s reverzní transkriptázou viru myší Maloneyovy leukémie (MMuLV) pro výrobu chřipkové cDNA. Purifikované virová RNA nebo mRNA (5 gg) se použila jako matrice pro výrobu cDNA, používající M-MuLV reverzní transkriptázu, dodanou společností Pharmacia lne. v sadě First-Strand cDNA Synthesis Kit. Primerem, použitý pro cDNA virové RNA z chřipkových kmenů A, byl syntetický oligonukleotidový
01-2810-97 primer (5'-AGCAAAAGCAGG-3') (SEQ ID NO:1), který je homologický s koncem 3' všech segmentů HA genového virionu.
Amplifikace HA genů z cDNA se provedla polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použiti standardních reakčních podmínek (Gene Amp kits; Cetus/Perkin Elmer, Norwalk, CT). PCR reakční směs (100 gL) obsahovala 20 pmolů primerů, specifických pro 5' a 3' konec HA genu chřipkového kmene influenza A (H3) nebo A (Hl) nebo chřipkové kmeny influenza B, jak ukazují konvenční sekvence zjištěné v genové bance DNA dat, která ukazuje tabulka 2. Amplifikace se prováděla ve třiceti cyklech, z nichž každý sestával z jednominutové denaturace při 94°C, dvouminutové temperace při 55 °C a tříminutové extenze při 72°C. Správná velikost PCR produktů se před klonováním potvrdila na 0,8% agarózových gelech.
PCR primery z konce 5' HA genu: 5'-GGG GGT ACC CCC
GGG AGC AAA AGC AGG GGA AAA TAA AAA-3' (SEQ ID NO:2) a konce 3' HA genu: 5'GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC-3' (SEQ ID NO: 3) se použily při PCR k získání celodélkového HA genu.
Nový 5' PCR primer byl navržen z 5' konce genu: 5' -GGG GGT ACC CCC GGG GAC ACA ATA TGT ATA GGC TAC CAT-3' (SEQ ID NO: 4) a 3' konce genu: 5'-GA AAC GTC ACG TCT TAT ACG/T TAG/T ACT CCA TGG CCC-3' (SEQ ID NO:5). Tyto primery se použily při PCR k získání HA genu bez sekvence signálního peptidu. Ten se následně vložil do TA vektoru rozštěpeného KpnI. 61K signální peptid pro bakulovirovou expresi a polyhedrinový promotor se následně vložil do TA vektoru, obsahujícího HA gen postrádající sekvenci chřipkového signálního peptidu. Výsledný bakulovirový rekombinantní vektor obsahoval polyhedrinový promotor,
01-2810-97
61K bakulovirový signální peptid a HA gen pro influenzu A/Texas/36/91.
HA geny z chřipkových kmenů influenzy B se klonovaly z celkové mediátorové RNA (mRNA), extrahované z MDCK buněk infikovaných chřipkovým kmenem B, B/Panama/45/90. Celková RNA se připravila z 5 T175 láhví infikovaných buněk. Sklizené buňky se lyžovaly v přítomnosti guanidiniumthiokyanátu a celková RNA se purifikovala výše popsaným způsobem. Celková mRNA se extrahovala z celulární RNA za použití výše popsaných oligo-(dT)-celulózových odstřeďováných kolon.
Primerem, použitým pro mRNA chřipkových kmenů B byl nahodilý oligonukleotidový DNA primer (Pharmacia, lne.).
• · ti · · · ·· · · • 9 · · ··« · · · 99
9 9 9 « 9 9 999
9 999 9 9 9 9 999 9· • 9 9 9 9 9 99
99 999 9999 9999
Tabulka 2 Primery použité pro PCR amplifikaci
·· · · · · · ·· ·· * · · · · · · · · · · · ···· · · · · ♦» • ····· · 9 · ··· ··
9 9 9 9 9 99
99 999 9999 9999
01-2810-97
e;
CO EH
H H
0 0
0 0
Eh 0
<
O Eh
Eh 0
O 0
EH O 0 TGG
< <
EH 0
0 0
0
Eh
EH EH EH
<; 0
0
Eh 0 0
< 0 0
Eh
GC AC < 0
0 0 <
TG 0 <
0 0 EH
0 EH 0
0 r-H <
ti 0
0 β <
O 0 CO
O 0 0
O EH <
O 0
x—1 0 <
EH a 0
0 w 0 0
0 0 ϊ—1 ti
0 0 β
H 0 0 2
EH Γ—| Pí 0 0
co 0 0 <
d <: nl Eh Eh
0 EH a 0
0 0
0 0 Eh
a '(0 LO LO 0
>
0 0
>o 0
ti • ·
M o
Λ4 a
O rí]
a S Ό Q
o •H H
ΟΊ o cn 4J ,—]
\ 2 0 2 a 0 CX
0 ΰ • · tí φ .. M
φ o Ή a o 0
CM \ tn Ϊ5 β a
(tí Ή
m β U Q o tí Q υ
Λ! o) Φ H Φ Η H φ
r—1 tí tí ti 'Φ a
p (0 O O o tí CX o
X) a Λ! M Λ! tn ω
ti 0 -rl 0
EH ra m '—' LO m 0
01-2810-97 • · • ··♦ ♦
Přiklad produktů cDNA syntézy použil jako matrici virovou RNA chřipkového viru A/Texas/36/91. Oblast cDNA segmentů, která kóduje chřipkové proteiny by mohla být zjištěna následujícím způsobem. Purifikovaná virová RNA se sloučí v reakční směsi s univerzálním jednořetězcovým DNA primerem 5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ ID NO: 124) (SEQ ID N0:l). Tento primer je komplementární s 3' koncem již zmíněných segmentů chřipkového virionu. Reakce rovněž zahrnovala přidání [a-32P]dCTP, čímž se zajistila vizualizace cDNA produktů, které se separovaly na 1,5% alkalickém hydrolyzačním gelu (Maniatis a kol., 1982) a exponovaly na X-OMAT-AR film.
Příklad 3
Klonování HA genů do bakteriálních plasmidů
PCR amplifikované rHA geny se klonovaly do pUC-podobného plasmidového vektoru, za použití TA klonovacího systému (Invitrogen, lne.). Přítomnost HA genů se ověřila restrikčně enzymatickou digerační analýzou plasmidové DNA, purifikované standardními postupy (Maniatis a kol., 1982). Konec 5' rHA genů se následně analyzoval DNA sekvencováním a pro odstranění sekvencí, kódujících hydrofobní signální peptidy na N-konci HA proteinů, byly navrženy nové priméry. Specifické 5' a 3' oligonukleotidové priméry, jejichž seznam uvádí tabulka 2, se následně použily pro amplifikaci cDNA produktů, k níž se použila PCR, a standardními klonovacími metodami se klonovaly do E. coli TA plasmiďových vektorů (Invitrogen, lne.). Výsledné DNA klony obsahovaly kódovací sekvence pro zralé HA.
* ♦ ♦ · • · ·· ·· · · · • · ·
01-2810-97
A/Beij ing/353/89, ·· • · • · · rHA geny
A/Beijing/32/92
A/Texas/36/91,
B/Panama/45/90 se subklonovaly standardními postupy bakulovirových expresních vektorů. HA TA klonovacích plasmidů pomocí vhodných restrikčním enzymů a DNA fragment purifikovaného HA se vložil do (Maniatis a kol.,
1982) do geny se odstranily z bakulovirového rekombinantniho bakteriální klony se rezistenci a následně plasmidu. Výsledné prohledávaly na ampicilinovou sestřihly restrikčními enzymy, a tím potvrdily jeho přítomnost.
uvolnily vložený HA genu
Rekombinantní plasmidy, obsahující HA geny, se purifikovaly na gradientech chloridu česného a ethidiumbromidu (Maniatis a kol., 1982). 5' konec plasmidů se sekvencoval s cílem potvrdit přítomnost správných bakulovirových signálů (sekvence AcNPV polyhedrinového promotoru, ATG translačního startovního
HA-kódující na 5' konci signálu, a bakulovirového signálu) a sekvenci ve správném čtecím rámci. DNA HA genů a lemovací AcNPV polyhedrinový aminokyselin v sekvenčním správnou sekvence promotor a bakulovirový signální peptid (prvních 18 každé aminokyselinové sekvence) je znázorněno protokolu.
SEQ ID NO.6 kóduje sekvenci
A/Beijing/32/92 (sekvenční rozsah odpovídající aminokyselinová startovacím kodonu „ATG [nukleotidu 21]
5' konce sekvence
HA genu pro
SEQ ID NO:7 je (začíná na
SEQ ID NO:6).
Aminokyselinová sekvence 61K signálního peptidu je uvedena v SEQ ID NO:7 jako aminokyseliny 1-18.
SEQ ID NO. 8 kóduje sekvenci 5' konce HA genu pro
A/Texas/36/91 (sekvenční rozmezí 1-481) . SEQ ID NO: 9 je odpovídající aminokyselinovou sekvencí (začínající startovacím kodonu „ATG [nukleotidu 21] SEQ ID NO:
na • · · ·
01-2810-97
Aminokyselinová sekvence 61K signálního peptidu je uvedena v SEQ ID NO: 9 jako aminokyseliny 1- 18.
SEQ ID NO: 10 kóduje sekvenci 5' konce HA genu pro B/Panama/45/90 (sekvenční rozmezí 1-434). SEQ ID NO: 11 je odpovídající aminokyselinovou sekvencí (začínající na startovacím kodonu „ATG [nukleotidu 21] SEQ ID NO: 10) . Aminokyselinová sekvence 61K signálního peptidu je uvedena v SEQ ID NO. 11 jako aminokyseliny 1-18.
V SEQ ID NO 6, 8a 10 nukleotidy 1-20 kódují 3' konec polyhedrinového promotoru, nukleotidy 21-74 kódují 61K signální peptid a nukleotidy 75 až konec kódují 5' konec HA genu.
Příklad 4
Exprese rekombinantního HA ve hmyzích buňkách
Chimérické rekombinantní plasmidy, obsahující klonované HA geny se purifikovaly a 2 gg se smísily s 1 gg standardního typu DNA AcNPV. DNA se vysrážely s vápníkem a transfektovaly do buněk S. frugiperda za použití standardních postupů (Smith, Summers a Fraser, Mol, and Cell. Biol. 3:2156-2165 (1983)). Rekombinantní bakuloviry se identifikovaly na základě morfologie plak a následně dále purifikovaly dalšími cykly purifikace plak. Plakově purifikované rekombinantní bakuloviry se prohledávaly s cílem analyzovat expresi rHA a pro další vývoj se zvolil jediný bakulovirový expresní vektor.
Buňky S. frugiperda se infikovaly bakulovirovým vektorem, obsahujícím HA gen z chřipkového kmene:
01-2810-97 • · · · ·
B/Panama/45/90. 24, 48 a 72 hodin po infikaci se 1 x 106 buněk pulzovalo s 25 gCi [35S] methioninu po dobu 15 minut, čimž se značené proteiny syntetizovaly. Buňky se sebraly a proteiny se separovaly na 11% polyakrylamidovém gelu v přítomnosti 0,1% SDS. Radiologicky značené proteiny se detekovaly expozicí na X-OMAT-AR film. Umístění proteinových standardů a jejich velikosti v kilodaltonech (kd) naznačily, že 85 kd rekombinantní HA protein je jedním z hlavních proteinů, které se syntetizovaly v buňkách 48 hodin a 72 hodin po infikaci.
Příklad 5
Produkce a purifikace rekombinantního HA
Bakulovirový expresní vektor A8611, který obsahuje gen pro influenzu A/Beijing/353/89, produkovaný v podstatě výše popsaným způsobem pro A/Beijing/32/92 hemaglutinin pod kontrolou polyhedrinového promotoru, se použil pro infikování buněk S. frugiperda. Buňky se nechaly narůst při 27 °C do hustoty 1 x 106 buněk/ml v TNMFH médiu (Gibco BLR, Gaithersburg, MD) obohaceném 10% fetálním bovinním sérem a infikovaly se při multiplicitě infekce (MOI) 1 A8611 rekombinantním bakulovirem. Během infikace se hemaglutinin influenzy A/Beijing/353/89 produkoval za transkripční kontroly bakulovirového polyhedrinového promotoru. Buňky se sklidily 72 hodin po infikaci patnáctiminutovým odstřeďováním při 3 400 x g a promyly resuspenzí v séru prostém TNMFH médiu a následně třicetiminutovým odstřeďováním při 10 400 x g. Supernatant se oddekantoval a infikované buněčné pelety se skladovaly při -70°C.
• 9 * 9
99
01-2810-97
Vyvinul se způsob, ve kterém se rekombinantní HA za podmínek, které nedenaturuji antigen selektivně extrahoval z infikovaných buněk. Neni-li stanoveno jinak, provádí se všechny extrakční kroky při 4°C. Buněčná peleta z 0,5 1 kultury (přibližně 5 x 108 buněk) se rozrušovala 2 minuty ve 40 ml ledově studených 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 1% (obj./obj.) Tweenu-20, 1 mg/ml leupeptinu za použití homogenizátoru Polytron (Brinkmann Instrumens lne. Westbury, NY) . Homogenát se odstřeďoval třicet minut při 9 200 x g. Supernatant se vypustil a pelety se sebraly. Tento krok odstranil rozpustné a periferní membránové proteiny z hmyzích buněk bez extrakce integrálním membránovým proteinům podobného rHA. rHA se z pelet extrahoval dvouminutovou homogenizací při nastavení 4 ve 40 ml ledově studeného 30 mM Tris, 10 mM ethanolaminu, pH 11, 25 mM LiCl a 2% Tweenu-20. Po šedesátiminutové inkubaci na ledu se pH hodnota homogenátu nastavila na 8,4 pomocí 1 N HCI a nerozpustný materiál se odstranil třicetiminutovým odstřeďováním při 9 200 x g. Supernatant obsahující rozpustný rHA se oddekantoval a pH hodnota se zkontrolovala, a pokud to bylo nezbytné, tak se nastavila na 8,4 při pokojové teplotě. Nerozpustný materiál se pro analytické účely resuspendoval ve 40 ml vody. HA integrální membránový protein se solubilizoval při vysokém pH v přítomnosti detergentu Tween-20 a zůstal v roztoku potom, co pH pokleslo.
Proteiny se analyzovaly SDS elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Vzorky se rozrušily ve vroucí vodní lázni, kde se ponechaly 10 minut v přítomnosti
2% dodecylsulfátu sodného (SDS) a 5% beta-merkaptoethanolu, načež se podrobily elektroforéze na 11% polyakrylamidovém
01-2810-97
gelu v přítomnosti 0,1% SDS, načež se zabarvily modří
Coomassie.
Pro purifikaci rekombinantního cHA byl vyvinut chromatografický purifikační proces, který poskytuje vysoce purifikovaný rekombinantní HA antigen, který není denaturovaný a je vhodný jako složka chřipkové vakcíny pro humánní aplikaci. Pro čištění A/Beijing/353/89 HA z buněk 5. frugiperda infikovaných rekombinantním virem A8611 se použil následující postup.
Chromatografickými gelovými matricemi, použitými pro purifikaci HA z 0,5 1 infikovaných buněk S. frugiperda, bylo 30 ml Pharmacia DEAD Sepharose Fast Flow (v koloně Pharmacia Cl6/20) a 4 ml Pharmacia Lentil Lectin Sepharose 4B (v koloně Pharmacia C10/10). Výstup DEAE kolony je spojen se vstupem čočkové lektinové kolony a S/N 2 buněčný extrakt, připravený výše popsaným způsobem, se aplikoval do spojených kolon rychlostí 1 ml/minutu. Kolony se promyly 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,5% Tween-20 dokud se hodnota UV absorpce při 280 nm proudu vytékajícího z čočkové lektinové kolony navrátila na výchozí hodnotu. Za těchto podmínek se většina kontaminujících proteinů navázala na DEAE, ale rekombinantní HA proudí kolonou. Zbývající kontaminující látky prochází čočkovou kolonou a glykosylátovaný rHA se váže na čočkovou lektinovou afinitní matrici. DEAE kolona se rozpojí a lektinová kolona se promyje dalšími 40 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,5% Tween-20. Lektinová kolona se následně promyla 40 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LiCl, 0,4% (obj/obj) deoxycholátu sodného (DOC). Tento krok nahradí detergent Tween-20 detergentem, jako je DOC, který lze z proteinu odstranit dialýzou. Rekombinantní HA se následně z
01-2810-97 lektinové kolony eluovala pomoci přibližně 20 ml 40 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 25 mM LÍCI, 0,4% (obj/obj) ddeoxycholátu sodného, obsahujícího 0,3 M a-D-methylmannosidu. Výsledky se analyzovaly pomocí 11% PAGE.
Díky generické variabilitě chřipkových HA proteinů se detaily, týkající se výše uvedeného purifikačního postupu, mohou v případě každého jedinečného rekombinantního HA proteinu lišit. rHA se může například vázat na DEAE intoměničovou kolonu namísto toho, aby touto kolonou procházely. V tomto případě by se rHA mohl z DEAE kolony odstranit promytím kolony pufrem obsahujícím vysokou koncentraci LiCl, NaCl nebo jiné soli.
Pro odstranění DOC detergentu a dalších složek pufru se proud vytékající z lektinové kolony, který obsahuje purifikovaný rHA, dialyzoval proti fosfátem pufrovanému fyziologickému roztoku, pH 7,5 (PBS). Purifikovaný rekombinantní HA měl alespoň 95% čistotu, stanoveno analýzou na SDS polyakrylamidových gelech.
Příklad 6
Analýza proteázové rezistence rHA
Zralý HA tvoří trimerové struktury, které jsou rezistentní proti různým proteázám včetně trypsinu, které degradují HA monomery (Murphy a Webster, 1990). Rezistence vůči trypsinovému ošetření může být tedy použita jako test pro určení funkční trimerové tvorby. Pro studie rezistence rHA vůči proteázovému ošetření se použil následující postup.
01-2810-97 • e alikvotni podíly purifikováného rHA
Dva (A/Beijing/353/89) při koncentraci gg/ml se inkubovaly po dobu 30 minut na ledu, v 30 mM Tris-HCl, pH 8,4, 150 mM
NaCl, v přítomnosti a za absence 50 gg/ml TPCK-ošetřeného trypsinu. Reakce se ukončila přidáním 57,4 mM fenylmethylsulfonylfluoridu v isopropanolu do konečné koncentrace 1 mM. Alikvotni podíly každého vzorku se denaturovaly varem v 3% SDS za redukčních podmínek, podrobily elektroforéze na 11,5% polyakrylamidových gelech a pomocí westernového přenosu přenesly na nitrocelulózový filtr. HA polypeptidy se detekovaly za použití anti-HA séra morčete, připraveného proti purifikovanému rHA a kozího anti-morčecího IgG alkalinfosfatázového konjugátu.
Neošetřený rHA migroval při velikosti HA prekurzoru (HAO). Proteázové ošetření vedlo k vytvoření dvou hlavních pásů, které migrovaly při velikostech předpokládaných pro chřipkový hemaglutinin HA1 a HA2. Výsledky ukázaly, že trypsin rozštěpil rHA protein a dal tak vzniknout dvěma polypeptidům, jejichž velikosti odpovídají předpokládaným HA1 HA2 velikostem. K žádnému dalšímu protalytickému procesu nedošlo. Tyto výsledky ukazují, že rHA, purifikovaný výše popsaným způsobem, je rezistentní proti degradaci proteázou. Tato vlastnost je specifická pro purifikovaný rHA, který se nachází ve formě trimerů.
01-2810-97 ·»«· φ · ·· • φ φ· • φ ··· · • φ· φφ φφ
Příklad 7
Stanovení imunogenicity rHA pomoci standardizovaného testu myší potence
Jedním způsobem měření imunogenicity antigenu je stanovení množství, nezbytného pro indukci detekovatelné odezvy na protilátku u myší (test myší potence). Standardizovaný test myší potence se používá pro měření imunogenicity rHAO vakcíny. Skupiny pěti až deseti myší se imunizovaly jednou vakcinou, obsahující postupná naředění rHA, tj . 0,500 gg, 0,1 gg, 0,02 gg a 0,004 μς purifikovaného rHA. Séra se odebrala 28 dní po imunizaci a protilátky proti rHA antigenu se měřily pomocí standardního testu (ELISA) v 96jamkových mikrotitračních plotnách. Myši jsou sérokonvertované, pokud je OD450 při 1:100 naředění 28denního antiséra vyšší, než průměrná hodnota OD450 myšího pre-imunního séra, zvýšená o tři standardní odchylky. Účinná dávka vakcíny, potřebná pro 50% sérokonverzi myší (ED50) je mírou imunogenicity antigenu.
Například čtyři skupiny zahrnující 10 myší se imunizovaly 0,1 gg, 0,02 pg, 0, 004 μg nebo 0, 0008 μg (pětinásobné naředění), rHAO vakcinou. Séra se shromáždila
28 dnů po imunizaci a pomocí
každému rHAO antigenu ve
sérokonverzi. Vypočetla se
sérokonverzi myší (ED5o) z a
určila minimální hodnota ED50.
ELISA testu se měřila vakcíně, s cílem proti určit
50% dávka, potřebná pro pro každý rHAO antigen se
Předběžná data ukázala, že jedna dávka 0,004 gg rHAO bude sérokonvertovat alespoň 50 % myší.
01-2810-97 Če
Příklad 8
Podáni rHA v kombinaci s adjuvansem a srovnání s dostupnými chřipkovými vakcínami
Myší potence purifikovaného rHA chřipkového kmene A/Beijing/353/89 se analyzovala s kamencem nebo bez kamence a srovnávala s komerčně dostupnou chřipkovou vakcínou FLUZONE (Connaugth Laboratories, lne. Swiftwater, PA),„ která obsahovala A/Beijing/353/89 chřipkový kmen. Vakcína se podala v dávce 0,5 μρ, 0,1 μρ, 0,02 μρ a 0,04 μρ. Dvacátý osmý den se myším injektovaly výše popsané dávky purifikovaného rHA. Čtyřicetidvoudenní myší sérum se titrovalo v ELISA testu, s cílem stanovit IgG-HA protilátky.
Výsledky jsou znázorněny na obrázku 3. Za nepřítomnosti adjuvansu indukovala pouze dávka 0,5 μρ produkci podstatnějšího titru protilátky (200 000). V přítomnosti adjuvansu produkovaly podstatnější množství protilátky již dávky 0,004 μρ rHAO. Zvířata, imunizovaná rHA (bez kamence) produkovala přibližně stejné koncentrace anti-HA protilátek jako komerční vakcína. Kamenec zvýšil imunogenicitu rHA, přičemž v přítomnosti adjuvansu se generovaly minimálně desetinásobně vyšší anti-HA titry než v nepřítomnosti adjuvansu.
Srovnání imunogenicity purifikovaných rHAO s komerční celovirionovou chřipkovou vakcínou FLUZONE (Connaugth
Laboratories, lne. Swiftwater, PA) ukazuje, že rHAO vyvolává po dobu 48 dnů podobnou imunitní odezvu u myší.
Adsorpce rHAO na kamenec podstatně zvyšuje imunogenicitu purifikovaného rHAO u myší, jak ukazují výsledky testu,
01-2810-97 Če popsaného v přikladu 7. Kombinace s kamencem způsobuje vyšší tvorbu IgG hemaglutininových protilátek než chřipkové vakcíny FLUZONE.
Přiklad 9
Studie hemaglutinační inhibice
Hemaglutinačně inhibiční (HAI) protilátky se váží na tři ze čtyř známých epitopů na hemaglutininu a blokují schopnost chřipky aglutinovat červené krvinky (Wilson a kol., „Structure of the hemaglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A* resolution. Nátuře, 289-366-378 (1981)). Tyto antigenní determináty se shlukují okolo vazebného místa receptoru kyseliny sialové na hemaglutininových trimerech. Protilátky proti těmto místům budou neutralizovat infekčnost viru (Weis a kol., „Structure of the influenza virus hemaglutinin comlexed with its receptor, sialic acid, Nátuře 333:426-431 (1988)). Titr a specifičnost HAI protilátek jsou důležitými mírami potence chřipkové vakcíny chránit proti infikaci podobnými nebo odvozenými typy chřipky.
Studie, porovnávající schopnost purifikovaného rHAO připraveného z chřipkového kmene A/Beijing/353/89 a chřipkové vakcíny FLUZONE (Connaugth Laboratories, lne. Swiftwater, PA) vyvolávat tvorbu HAI protilátek, se prováděly na myších. Skupiny pěti myší se injektovaly nultý a dvacátý osmý den 0,05 gg, 0,1 μg, 0,02 μg nebo 0,004 μg rHAO nebo třikrát stejnými množstvími vakcíny FLUZONE, takže se podala stejná množství rekombinantního nebo virového A/Beijing/353/89 hemaglutininu. Například myši v
01-2810-97 Če • ·· nejvyšší dávkové skupině byly imunizovány 1,5 gg FLUZONE hemaglutininu (0,5 gg hemaglutininu z každého kmene) a
0,5 gg rHAO. Přítomnost dalšího hemaglutininového antigenu ve vakcíne FLUZONE ze dvou dalších chřipkových kmenů může vést k určitým křížově reaktivním protilátkám.
Anti-hemaglutininové protilátky (hemaglutininový IgG) se měřily proti purifikovanému rHAO ve standardním testu ELISA. HAI protilátky se měřily proti čtyřem hemaglutininovým jednotkám následujících antigenu: celý chřipkový virus A/Beijing/353/89 (A/Bei), purifikovaný rHAO A/Beijing/353/89 antigen a FLUZONE. HAI titr odpovídá nejvyššímu naředění antiséra, které z 50 % inhibuje aglutinaci kuřecích červených krvinek.
Tabulka 3 uvádí titry sérového hemaglutininového IgG a HAI u myší, stanovené 42. den. Vyšší hladiny antihemaglutininových protilátek produkovala rekombinantní rHAO vakcína. Tyto titry byly přibližně desetkrát vyšší než titry získané při aplikaci vakcíny FLUZONE. Nejpodstatnější je to, že rHAO vakcína produkovala dobré titry protilátek, které blokovaly aglutinaci červených krvinek, způsobenou virem A/Beijing/353/89 a rHAO antigeny. Takže rHAO vakcína produkovala HAI protilátky, které rozpoznávaly stejně dobře imunogen a chřipkový vir A/Beijing. Nižší HAI titry, naměřené proti vakcíně FLUZONE, mohou být způsobeny neschopností antiséra blokovat aglutinaci způsobovanou dalšími dvěma kmeny hemaglutininu ve vakcíně FLUZONE. Na druhé straně myši imunizované vakcínou FLUZONE produkují vysoké titry HAI protilátek v případě, že se měření provádí proti vakcíně FLUZONE. HAI titry proti chřipkovému viru A/Beijing/353/89 a rHAO antigenu byly podstatně nižší.
01-2810-97 Če
Podobné schéma bylo možné pozorovat u myši, spadajících do nižších dávkových skupin.
Tabulka 3 HAI titry proti rHAO a FLUZONE
01-2810-97 Če
Z těchto výsledků rovněž vyplývá, že mezi chřipkovým kmenem A/Beijing/353/89 ve vakcině FLUZONE a stejným chřipkovým kmenem získaným z FDA a před použitím v HAI testu jednou pasážovaným ve vejcích jsou genetické rozdíly. Skutečnost, že protilátky produkované v odezvě na rekombinantní HAO, klonovaný z chřipkového viru A/Beijing/353/89, blokují aglutinaci červených krvinek způsobovanou tímto chřipkovým kmenem je dobrým důkazem toho, že během klonování nedošlo k žádným genetickým změnám, které by ovlivnily vazebné místo receptorů kyseliny sialové na purifikovaném rHAO antigenů.
Přiklad 10
Formulace a klinická účinnost chřipkové vakcíny 1993/1994
Provedla se celá řada humánních klinických testů, které měly charakterizovat bezpečnost a imunogenicitu experimentální chřipkové vakcíny, obsahující rekombinantní HA u lidí a pomoci získat předběžná data, týkající se ochranné účinnosti této vakcíny proti přirozené infikaci během epidemického období. Výsledky ukazují, že vakcíny obsahující rekombinantní chřipkový hemaglutinin (rHAO), připravený zde popsanými způsoby způsobovaly méně místních nežádoucích reakcí a poskytovaly stejnou nebo lepší ochrannou imunitní odpověď v porovnání s komerčně dostupnou, licencí opatřenou, zředěnou chřipkovou vakcínou vyráběnou ve vejcích.
01-2810-97 Če • · · · ·
Materiály a metody
Vakcíny
Rekombinantní HA vakcíny použité v této studii zahrnovaly celodélkový neštěpený HA (HAO) glykoprotein z chřipkového viru A/Beijing/32/92 (H3N3). Rekombinantní HAO (RHAO) se produkoval v kulturách motýlích (hmyzích) buněk, načež následovala expozice bakulovirovým vektorem obsahujícím cDNA inzerty kódující HA gen. Exprimovaný protein se purifikoval za nedenaturačních podmínek do 95% čistoty, měřeno kvantitativní skenovací densitometrií objemného antigenu separovaného elektroforézou na nátrium dodecylsulfátpolyakrylamidových gelech. Identita peptidu se potvrdila aminokyselinovou analýzou, N-koncového sekvencování a analýzy westernového blotu protichřipkovým A/Beijing/32/92 sérem. rHAO vakcíny obsahovaly specifické množství syntetický syntetického HA antigenu buď rozpuštěného ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku nebo adsorbovaném na fosforečnanu hlinitém (kamenci), jako adjuvansu, ve formě gelové suspenze. Schválená trojvalenční subvirionová vakcina použitá při studii obsahovala 15 gg/dávku každého HA z chřipkového viru A/Texas/36/91 (N1N1), chřipkového viru A/Beijing/32/92 (H3N2) a chřipkového viru B/Panama/45/90 ředěné chřipkové vakcíny FLUZONE vyráběné ve vejcích (Connaugth Laboratories, lne.
Swiftwater, PA).
01-2810-97 Če
Klinické testy
Institucionálními posudkovými týmy
Univerzity Saint
Louis a v Rochesteru schválily identické studijní protokoly.
Studií na obou univerzitách se účastnily zdraví dospěli jedinci ve věku 18 až 45 let.
se nahodile rozdělily do skupin,
Subj ekty následně aplikovala jedna z následujících pěti kterým se vakcínových přípravků dvojím slepým způsobem: (1) 15 gg rHAO, (2) gg rHAO plus kamenec, (3) 90 gg rHAO, (4) schválená trojvalenční inaktivovaná chřipková vakcína, nebo (5) fyziologické placebo. Vakcíny se podávaly intramuskulární injekcí v objemu 0,5 ml. Pro počáteční odhad bezpečnosti tří vakcínových přípravků obsahujících rHAO, se zvolilo nahodile a nezávisle na ostatních subjektech prvních 25 jedinců, kteří měli být vakcinováni, (tj. 5 osob na studii) a tyto jedinci byli 48 hodin po vakcinaci před tím, než se aplikovaly zbývající vakcíny, nepřetržitě telefonicky sledováni. Všichni zvolení jedinci byli instruováni tak, aby vyplňovali denní zprávu a v ní uvedli veškeré nežádoucí reakce včetně lokálních a systemických příznaků, které se u nich projevily během prvních šesti dní po vakcinaci. Pokud jde o povahu příznaků, jedinci sami tyto příznaky hodnotili jako mírné, střední nebo vážné. Pokud sledovaní jedinci cítili, že mají zvýšenou teplotu, potom rovněž zaznamenali hodnoty orálně měřené teploty. Pokud se na místě po injekci objevilo lokální zduření nebo erytém, potom se hodnotilo zda je plocha zduření nebo erytému menší, resp. větší než čtvrtdolar. Všechny vakcíny se aplikovaly v průběhu posledního týdnu měsíce listopadu a prvního týdně měsíce prosince 1993. Vzorky séra se odebraly každému jedinci v okamžiku vakcinace, tři týdny po vakcinaci a znovu koncem
01-2810-97 Če
března nebo v měsíci dubnu 1994 alespoň dva až tři týdny potom, co již viry necirkulovali v místních komunitách. Účastníci studie byly rovněž instruování, aby kontaktovali studijní centrum, pokud během zimního chřipkového epidemického období prodělají chřipce podobnou chorobu. Chřipce podobná choroba byla definována jako výskyt jakéhokoliv respiračního příznaku trvajícího déle než dva dny a doprovázeného horečkou a/nebo systemickými příznaky myalgie nebo nachlazení. Jedincům, kteří zaznamenali chřipkové příznaky, se provedly nosohltanové výtěry za účelem získání a identifikace virové kultury. Klinické vzorky se opatřily identifikačními kódy a zpracovaly slepím způsobem.
Sérologie
Pro jednotlivé typy sérologických testů se všechny vzorky shromážděné v obou institucích testovaly najednou v jediné laboratoři. Hemaglutinačně inhibični (HAI) protilátky proti antigenu chřipkového viru A/Beijing/32/93 (H3N2) se měřily v séru standardním mikrotitračnim testem, načež následovalo odstranění nespecifického inhibitoru pomocí enzymu ničícího receptor a odstranění studených aglutininů hemadsorpcí při 4°C. Titr se definoval jako nejvyšší naředění séra, které zcela zabránilo hemaglutinaci způsobené čtyřmi antigenovými jednotkami viru, přičemž jako výchozí naředění se zvolilo naředění 1:4. Protilátky sérového HA-specifického imunoglobulin G (IgG) se měřily pomocí testu ELISA, při kterém se jako potahový antigen použil purifikovaný rHAO chřipkového viru A/Beijing/32/92 (H3N2). Sled reakčních činidel směrem ven z pevné fáze
01-2810-97 Če séra, tvořil (1) purifikovaný rHAO (3)alkalinfosfatáza-konjugovaná • ♦ ·♦ • · · ·· « ·· «· * · •9 99 «9
9 9 9 9 antigen, (2) vzorek s kozím anti-humánním
IgG a (4) substrát na bázi p-nitrofenylfosfátu disodného. exprimoval jako nejvyšší naředění, při kterém byla obsahu jamky obsahující antigen alespoň titr se optická hustota vyšší, kontrolní jamky měřily za použití
ELISA dvakrát než optická hustota obsahu odpovídající antigenu. Neutralizované protilátky se mikroneutralizačního testu, který již a Betts R.F., J. Infect. Dis. 168:455bez popsal Treanor J.J.
459 (1993). Postupná naředění tepelně inaktivovaného séra se smísila s přibližně 100 TCID50 chřipkového viru A/Beijing/32/92 (H3N2) a inkuboval jednu hodinu při 37°C.
se následně adsorbovala při pokojové
Směs viru a séra j edné teplotě v průběhu ledvinových buněk devadesátišestij amkových účelem odstranění zbytkového inokula a opět naplnily séra psa hodiny na splývající monovrstvu Madin-Darby (MDCK) v jamkách ploten. Plotny se promyly za prostým Dulbeccovým hodin inkubovaly v
MEM s 2 gg/ml trypsinu a sedmdesát dva 5% C02 při 33°C. Buňky se následně a virová replikace se vyhodnotila za myších monoklonálních protilátek fixovaly methanolem použití seznamu specifických pro matrici a nukleoproteiny chřipkového viru A (Centers for Disease Control,
Atlanta, GA), a následně anti-myším IgG. Poslední nejvyšší naředění, které způsobuje 50% redukci signálu v porovnání s neneutralizovanými kontrolními jamkami.
alkalinfosfatázou-konjugovanou s titr séra se definoval jako 50% redukci «
01-2810-97 Če
Virologie
Virové kultury vzorků nosohltanových výtěrů se zpracovaly v každé instituci standardními technikami. Vzorky se očkovaly buď v MDCK nebo ledvinových buňkách makaka a inkubovaly 14 dni při 33°C. Hemadsorpce buněčných monovrstev se testovala pomocí 0,4% roztoku erythrocytů morčete. Chřipkové viry se identifikovaly v hemadsorpčně pozitivních kulturách HAI za použití H3-specifického antiséra (Centers for Disease Control).
Statistické analýzy
Reciproký HAI, ELISA IgG a titry neutralizační protilátky se logaritmicky transformovaly pro účely statistické analýzy. Jako významná odpověď na vakcinaci se definovalo čtyřnásobné nebo větší zvýšení titru protilátky mezi vzorky séra odebranými před vakcinaci a po vakcinaci. Laboratorní důkaz chřipkového virové infekce A (H3N2) se definoval jako izolace viru z nosohltanových sekretů a/nebo čtyřnásobné a větší zvýšení titru HAI protilátky v séru mezi třítýdenním post-vakcinačním vzorkem (presezonní) odebraným v prosinci a odpovídajícím (postsezonním) vzorkem, odebraným následující jaro. Rozdíly mezi vakcinovanými skupinami se analyzovaly pomocí Fisherova exaktního testu, jehož cílem je porovnat podíly subjektů s nežádoucími reakcemi, s podstatnou protilátkovou odezvou nebo laboratorně potvrzenou chřipkovou nemocí nebo infekcí, a analyzováním rozdílu (ANOVA), a porovnat postvakcinační průměrný reciproký log2 titrů protilátky. Modifikovaný test Bonferroniho nepravidelnosti a Tukey-Kramerův test se
01-2810-97 Če
aplikovaly v případě, kdy bylo pro dosaženi konečného výsledku vhodné provést více možných srovnání.
Výsledky
Reaktogenicita rHAO vakciny v této studii byly bezpečné a velmi tolerantní. Nezdálo se, že by byla frekvence nežádoucích reakcí ovlivněna změnou dávky rHAO antigenu v rozmezí od 10 gg do 90 gg, ale přidáním kamence se může mírně zvýšit. Lokalizovaný erytém, citlivost a bolestivost v místě injekce byly častěji zaznamenány u jedinců, kterým se aplikovala schválená subvironová vakcína, než u jedinců kterým se aplikovalo 15 gg nebo 90 gg rHAO ve fyziologickém roztoku. S výjimkou jediné osoby, která pociťovala po imunizaci schválenou vakcínou v paži středně silnou bolest, citlivost a ztuhlost, byly všechny příznaky hodnoceny jako příznaky mírné povahy, které zpravidla trvaly 1 až 2 dny. Lokalizovaný erytém a/nebo zatvrdnutí, pokud se objevilo, bylo podstatně menší než čtvrtdolar.
Imunogenicita
Základní titry sérové HAI protilátky proti chřipkovému viru A/Beijing/32/92 (H3N2) dosahovaly maximálně 1:8 u (50%) ze 127 zúčastněných subjektů. Většina subjektů v každé ze čtyř vakcinovaných skupin poskytla HA-specifickou sérologickou odpověď, měřeno pomocí HAI a testu ELISA (tabulka 4). Postvakcinační titry sérové HAI protilátky dosahovaly u všech osob, kterým byla podána vakcína
01-2810-97 Če maximálně 1:32 s výjimkou dvou osob, kterým bylo podáno 15 pg rHAO a jedné osoby, která byla podána již schválená vakcína. Vakcinace byla jinak u většiny dobrovolníků spojena s produkcí neutralizační protilátky. Průměrné zvýšeni titrů protilátky a hodnoty sérokonverze po imunizaci 15 pg rHAO bylo poněkud nižší než v případě imunizace již schválenou vakcinou, nicméně tyto rozdíly neměly statistický význam. Protilátková odezva na rHAO se přidáním kamence nezvýšila. Subjekty imunizované 90 pg rHAO dosáhly po vakcinaci průměrného titru HAI a ELISA IgG protilátky, který byl dvakrát až pětkrát vyšší než v případě zbývajících tří vakcinačnich skupin (rozdíly zjištěné při porovnáváni titrů sérového HAI byly statisticky významné).
Ochranná účinnost
V průběhu sledované periody, zaznamenalo celkem 28 subjektů chorobu podobnou chřipce. Čtyřem z těchto jedinců (z nichž třem bylo aplikováno placebo a jednomu, který byl imunizován 15 gg rHAO) byl z nosohltanových kultur izolován chřipkový virus typu A (H3N2). Podstatné zvýšeni titru HAI protilátky proti chřipkovému viru A/Beijing/32/92 (H3N2) mezi předsezónním a postsezónním vzorkem séra bylo rovněž zjištěn ve třech ze čtyřech případech, kdy byl v kultuře potvrzen virus, ale u žádného dalšího jedince, který zaznamenal chorobu. Jediný rHAO příjemce, u kterého se následně vyvinula laboratorně potvrzená chřipková choroba, měl pozitivní kulturu získanou 31 dní po imunizaci a sérokonvertoval se z prevakcinačního HAI titru, který byl menši než 1:4, na postvakcinačni (předsezónni) titr, který
01-2810-97 Če ·· • ·· • ·· * ··· •· ·· ·· • ···· dosahoval 1:32. Dvě další osoby, kterým se podávalo placebo, a jeden dobrovolník imunizovaný již schválenou vakcínou měl sérologický důkaz infikace chřipkovým virem A (H3N2) v průběhu epidemického období při absenci klinické nemoci. Při srovnání všech vakcinovaných subjektů (neboli všech subjektů, kteří přijali libovolnou rHAO vakcínu) se zjistilo, že u jedinců, kterým bylo aplikováno pouze placebo, bylo zaznamenáno podstatně vyšší procento jedinců, kteří prodělali laboratorně potvrzenou chřipku typu A (H3N2) (p<0,05) nebo kteří byly infikováni jejím virem (p<0, 005) .
Výše uvedené výsledky naznačují, že chřipkové vakcíny obsahující purifikovaný rHAO antigen, připravené způsobem popsaným ve výše uvedené patentové přihlášce, jsou tolerantní a schopné vyvolávat ochranné imunitní odezvy u lidských subjektů. I při dávce 90 gg nebyl rHAO, hodnocený v této studii, reaktogeničtější než placebo na bázi fyziologického roztoku a způsoboval podstatně méně místních nežádoucích reakcí než již schválená a patentovaná trojvalenční subvirionová vakcína obsahující poloviční množství (tj. 45 μρ) celkového HA antigenu.
Odezvy neutralizačních HA-specifických protilátek na 15 μρ rHAO přípravku byly srovnatelné s odezvami vyvolanými subvirionovou vakcínou a podstatně se zvýšily zvýšením dávky rHAO na 90 μρ.
Celková četnost infikace a nemoci, způsobená přirozenou expozicí cirkulujícímu epidemickému chřipkového kmenu A (H3N2), byla podstatně nižší u vakcinovaných subjektů než u jedinců, kterým se podalo placebo. Z těchto výsledků vyplývá, že ochranná imunita poskytnutá rHAO,
01-2810-97 Če zejména pokud je podán ve vyšších dávkách, je srovnatelná nebo vyšší než ochranná imunita, získaná aplikací v současnosti dostupných vakcín.
• ·· ·· ·· • · · · ♦ ·· · • · · · ·♦ • ······ · • · · · · ······· · · ·· • · · · • · · · • · · · • · ··· ·
01-2810-97 Če >1 · 'Φ
Tabulka 4 Odezvy Sérových protilátek u mladých dospělých subjektů po imunizaci vakcinami zahrnujícími purifikovaný rekombinantní hemaglitinin (rHAO) získaný z chřipkového viru A/Beijing/32/92 (H3N2), již schválenou třívalenční subvironovou vakcínu obsahující 15 pg HA z A/Beijing/32/92 (H3N2) nebo placebo tvořené fyziologickým roztokem._______
Neutralizace protilátky % s >4x zvý šením in 00 to r- kD σι to CT1 00
0 cu K O Ή O o r-4 9,3±0,2 'šT1 o 44 Ol o rH 9,9±0,4 o 44 'tr LQ
l Ή 1 03 d O M >U P 4-J (ti P U A ί N JJ Φ -Η φ -Η -H >P Š β H 44 Λ CO O 44 Γ- ιο o 44 CO *» O 44 r- LQ 00 o 44 oo in o 44 00 LQ
ELISA IgG HA protilátka % s >4x zvýšením 00 00 kD Γ- o o rH Ol σ» O
o CL co o +1 o Ol r4 11,5±0,4 13,l±0,4 o 44 O Ol r4 00 O 44 τ-1 cn
ELISA titr před 8,7±0,3 o 44 σ> o 44 m 00 8, l±0, 4 00 o 44 r4 K cn
HAI protilátka % s >1:32 1 OJ 0Ί o o t—1 o o t—1 CO 0Ί 00 00
% s >4x zvýšením LQ 00 CO 00 O o r-i O O t-1 o
4-> co o CL + *» O 44 o σι ·* o +1 co 00 CO O 44 t—1 r-1 r4 + LQ O 44 co σι 44 uo K. O 44 00 *» co
HAI titr Pre co o 44 Γ- ΟΟ LQ O* 44 CO »» O 44 CO co o 44 Γ- 00 LQ O 44 r· 00
Vakcína (počet ve skupině) Gn O řití K LT) CM P <—l rHAO 15 gg plus kamenec (26) tn O žití co W O 04 P 03 — Schválený subviron (26) Placebo (24)
r~4 s (5
03 H Φ
Al v> >P
CO + 1 P
Ή N >
N Cn (ti
O g
Φ i—1
CO O β
(ti x: Φ
o P
P A! 4->
O) 0 H
CO P CL 4-)
O •r4 H
Λ o
Ή Φ
d >O P w
cti >1 g
d P Ή
•H >φ d
O g >o
A! G3 ctí
(ti P g
> CL •P
4-J O
CO O Al
O A! Φ
CL cti >
•r-|
4-> 03
4-> CO
ÍX|
4->
CO O &
£ c p >φ g •P
P CL •H
N Φ g
O
CL '05
Al > O tí -H Ό 4-> '>1 CO
d
•H CL =#:
GJ • s
Al LO
co O o
Ή v
C >o cu
(ti
d •H +
O • K
A! r-4
(ti K.
> O o v CLi
co
P Ή
Cn i β '(ti tí >
o O
σι P CO
g '(ti
Φ d
P 4J
4-> Φ
•r4 >O
4-> Φ O Ή
g Ή >
d o
>O P
(0 ΰ CL
-H G3
O 4->
A! CO
(ti Φ
> 4-> 4-1
CO Cti
0 >
CL O 4->
CL o O
g
(ti o
CL
P
d 1—1
•H Ή
Cl Ό
P N
A! O
CO P
• · · ·
01-2810-97 Če
• · · ·
Příklad 11
Způsob výroby zlepšeného HAO klonujícího vektoru
Byl navržen vylepšený klonovací vektor pro expresi zralého HA, ve kterém se gen kódující HA lokalizoval bezprostředně za sekvencí kódující chitinázový signální peptid.
Vytvořil se lineární pMGS27 s jednořetězcovými konci
V pMGS12 plasmidu se HA nakloňoval do Smál nebo Kpnl místa bezprostředně za chitinázovým signálním peptidem. Nukleokyselinová a aminokyselinová sekvence jsou znázorněny jako SEQ ID NO:22, resp. SEQ ID NO:23:
5' -chitinázový signální peptid Smál Kpnl
TGG TTG GTC GCC GTT TCT AAC GCG ATT CCC GGG GGT ACC
TRP LEU VAL ALA VAL SER ASN ALA ILE PRO GLY GLY THR
Tento úsek se změnil pomocí oligo řízené mutageneze za vzniku pMGS27 (změněné báze jsou podtržené) (SEQ ID NO:24):
5'TGG TTA GTC GCC GTG TCCTGCAGGCCAGAGAGGCCTT GGT ACC
Pstl
Plasmid pMGS27 se linearizoval Pstl sestřihem (znázorněné zbytky 6 až 35 SEQ ID NO. 24):
A GTC GCC GTG TCC TGCA
5' GGCCAGAGAGGCC T
T CAG CGG CAC AGG 5'
ACGTCCGGTCTCTCCGG A
01-2810-97 Če načež se lineárním pMGS27 ošetřil T4 DNA polymerázou plus dATP za vzniku výše uvedených jednořetězcových konců (zbytky 23 až 36 a doplněk zbytků 6 až 18 SEQ ID NO.24):
5' GGCCAGAGAGGCC T
T CAG CGG CAC AGG 5'
Cílový HA gen se nakloňoval do pMGS27
Krok 1 Syntetizovaly se PCR primery
Původní oligo (SEQ ID NO:25):
5' GTC GCC GTG TCC AAC GCG (5' konec 20 bází zralého HA)
Reverzní oligo (doplněk SEQ ID NO:26):
(3' konec. 20 bází zralého HA) ATT AA
CCGGTCTCTCCGG 5'
PCR HA genu
PCR cílového HA genu se dvěma oligonukleotidy se použil pro získání (SEQ ID NO:25 a SEQ ID NO:26):
5' GTC GCC GTG TCC AAC GCG (zralý HA)
CAG CGG CAC AGG TTG CGC (zralý HA)
TAA TTGGCCAGAGAGGCC 3'
ATT AACCGGTCTCTCCGG * ·
01-2810-97 Če
Tepelná hybridizace cílového
HA genu do pMHGS27 a transformace E. coli
Lineární pMGS27 a T4 DNA polymerázou ošetřený PCR fragment HA genu se smísily. Dvě molekuly vzájemně tepelně hybridizovaly za vzniku kruhového plasmidů, který je připraven pro použití při transformování E. coli. Diagram zahrnuje SEQ ID NOS. 25 a26, zbytky 23 až 36 a 6 až 18 SEQ ID NO.24
SEQ ID NO:24.
GTCGCCGTGTCCAACGCG (zralý HA) TAATT
TTGCGC (zralý HA) ATTAACCGGTCTCTCCGG
A
TCAGCGGCACAGG až chitinázový signální peptid GTCGCCGTGTCCAACGCG (zralý HA
Z výše uvedeného vyplývá, ž zralým HA neexistuje žádná další
GGCCAGAGAGGCCT
A konec
TAATTGGCCAGAGAGGCCT mezi signálním peptidem a aminokyselina.
Příklad 12
Příprava a účinnost trojvalenčních chřipkových vakcín typu
A a B 1995-1996
Chřipková vakcína, purifikovaný rekombinantní hemaglutinin, trojvalenční chřipková vakcína typu A a B
01-2810-97 Če
A/Texas/36/92\l (Η1Ν1), a
ΦΦ ·« « · ♦ · • · · φ φ φ φφφ φ · φ φφ φφ
« ΦΦ ΦΦ • ·
φ φ « Φ * e · φ
• Φ φ φ • ·
• Φ φ φφφ · •
φ Φ • φ φ
•«a aaaa φφ φφ
A/Johanesburg/33/94 (Η3Ν2)
B/Harbin/7/94) je neinfekčni podjednotka odvozená z purifikovaných rekombinantnich chřipkových hemaglutininových antigenů (HA) . HA geny se klonovaly z výše popsaných kmenů chřipkových virů A a B, doporučených instituci pro kontrolu léčiv a k identifikaci jednotlivých klonovaných genů se použila DNA sekvenční analýza. Bakulovirové expresní vektory obsahující klonované HA geny z chřipkových virových kmenů A/Texas/36/91 (H1N1), A/Johanesburg/33/94 (H3N2), B/Harbin/7/94 se použily pro výrobu rekombinantnich
HA antigenů v kultivovaných hmyzích buňkách. Rekombinantní HA proteiny jsou celodélkové, neštěpené hemaglutininy (rHAO) s molekulovou hmotností přibližně 69 000. rHAO se produkují v buněčné linii Spodoptery frugiperdy (řád motýlů) uchovávané v séru prostém kultivačním médiu. Třívalenční vakcíny jsou tvořeny purifikovaným (s více než 95% čistotou, pravděpodobněji s 99% čistotou) rHAO ze dvou chřipkových A kmenů a jednoho B kmene, smíchanými ve stejném poměru. Vakcína, která se dodává pro klinické použití, je tvořena purifikovanými typy A B rHAO proteinů ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku bez konzervačních látek.
Studie, testující jednovalenční, dvouvalenční a trojvalenční rHAO vakcíny na zvířatech, měly ukázat, že jsou v podstatě netoxické. ve vakcíně nebyla zjištěna žádná toxická látka. Studie obecné bezpečnosti a imunogenicity A/Beijing/32/92 a A/Texas/36/91 rHAO se prováděly na myších a morčatech. Při těchto studiích nebyly zaznamenány žádné nežádoucí reakce. U myší jediná imunizace 15 mikrogramy rHAO antigenů bez adjuvansu vyvolala během dvou až tří týdnů vytvoření vysoké hladiny anti-HA IgG protilátek, • · · · · · • · · · · · • · · ·· • · ·«·· · • · · · ····· ·· ·· • ·
01-2810-97 Ce a
inhibičních hemaglutininově neutralizačních protilátek.
protilátek
V jedné studii se skupiny deseti myší imunizovaly pg purifikovaného rHAO v buňkách přizpůsobených bovinní sérum nebo
A/Beijing/32/92 (H3N2) vyrobeného přizpůsobených médiu nebo rHAO vyrobeném prostému médiu (rHAO-SF). Dva a myším odebrala krev a připravily séra se stanovoval obsah anti-HA médiu obsahujícímu 10% fetální rHAO, vyrobeným v hmyzích buňkách obsahujícímu 10% fetální bovinní sérum v hmyzích buňkách přizpůsobených séra po infikaci se séra. U každého tři týdny se vzorky
IgG a HAI protilátek. Jak rHAO, tak rHAO-SF antigeny poskytují podobné titry anti-HA a HAI protilátek. Dva týdny po imunizaci měla většina myší značné titry HAI protilátek a do tří týdnů osm z deseti myší v každé skupině mělo HAI titry 32 nebo vyšší. Tyto a další biochemické a imunologické studie ukázaly, že rHAO produkovaný v séra prosté hmyzí buněčné kultuře, je nerozlišitelný od rHAO vyrobeného za sérum obsahujících fermentačních podmínek.
Cílem další studie bylo porovnat 1994-1995 formulaci trojvalenční rHAO chřipkové vakcíny s již schválenou vakcínou Fluvirin povrchového antigenu purifikovaného viru (ředěná chřipková virová vakcina obsahující 15 gg rHAO nebo virového HA na 0,5 ml z A/Texas/36/91 (H1N1), A/Shangdong/9/93 (H3N2) a B/Panama/45/90 chřipkových kmenů.
01-2810-97 Če • · · ·
Srovnáni trojvalenčni rHAO vakcíny s Fluvirinem
Tabulka 5
GMT (n=10 myší) Virový kmen použitý jako antigen Trojvalenčni rHAO Fluvirin CHřipková vakcína GMT (n=10 myší) anti-HA IgG anti-HA IgG
Týden 0 Týden 3 Týden 0 Týden 3
A/Texas/36/91 (H1N1) <1000 103.000 <1000 11.200
A/ Shangdong/32/92 (H3N2) <1000 162.400 <1000 41.000
B/Panama/45/90 <1000 164.800 <1000 26.000
Virový kmen použitý jako antigen HAI HAI
A/Texas/36/91 (H1N1) <8 1.522 <8 1.088
A/ Shangdong/32/92 (H3N2) <8 494 <8 435
B/Panama/45/90 <8 174 <8 42
Virový kmen použitý jako antigen Neutralizační Ab Neutralizační Ab
A/Texas/36/91 (H1N1) <100 5.800 <100 2.720
A/ Shangdong/32/92 (H3N2) <100 840 <100 360
B/Panama/45/90 <100 1.300 <100 700
Konečně je třeba uvést, že výše popsané způsoby a kompozice mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.
01-2810-97 Če
Sekvenční protokol (1) údaje k SEQ ID N0:l:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 12 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:
AGCAAAAGCA GG 12 (1) údaje k SEQ ID NO:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:
GGGGGTACCC CCGGGAGCAA AAGCAGGGGA AAATAAAAA 39 (1) údaje k SEQ ID NO:3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:
CCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG 35 (1) údaje k SEQ ID NO:4:
01-2810-97 Če (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:
GGGGGTACCC CCGGGGACAC AATATGTATA GGCTACCAT (1) údaje k SEQ ID NO:5:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:
CCCGGTACCT CAKATKCATA TTCTGCACTG CAAAG (1) údaje k SEQ ID NO:6:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1793 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: Ά/Bejing/32/92 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinové signální sekvence (B) POZICE: 19 až 72
01-2810-97 Če (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 73 až 11728 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE: 1771 až 1777 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE: 1776 až 1782 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE: 1783 až 1793 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGACTTTCCA GGAAATGACA ACAGCACAGC AACGCTGTGC 120
CTGGGACATC ATGCAGTGCC AAACGGAACG CTAGTGAAAA CAATCACGAA TGATCAAATT 180
GAAGTGACTA ATGCTACTGA GCTGGTTCAG AGTTCCTCAA CAGGTAGAAT ATGCGACAGT 240
CCTCACCGAA TCCTTGATGG AAAAAACTGC ACACTGATAG ATGCTCTATT GGGAGACCCT 300
CATTGTGATG GCTTCCAAAA TAAGGAATGG GACCTTTTTG TTGAACGCAG CAAAGCTTAC 360
AGCAACTGTT ACCCTTATGA TGTACCGGAT TATGCCTCCC TTAGGTCACT AGTTGCCTCA 420
TCAGGCACCC TGGAGTTTAT CAATGAAGAC TTCAATTGGA CTGGAGTCGC TCAGGATGGG 480
GGAAGCTATG CTTGCAAAAG GGGATCTGTT AACAGTTTCT TTAGTAGATT GAATTGGTTG 540
CACAAATCAG AATACAAATA TCCAGCGCTG AACGTGACTA TGCCAAACAA TGGCAAATTT 600
GACAAATTGT ACATTTGGGG GGTTCACCAC CCGAGCACGG ACAGAGACCA AACCAGCCTA 660
TATGTTCGAG CATCAGGGAG AGTCACAGTC TCTACCAAAA GAAGCCAACA AACTGTAACC 720
CCGAATATCG GGTCTAGACC CTGGGTAAGG GGTCAGTCCA GTAGAATAAG CATCTATTGG 780
ACAATAGTAA AACCGGGAGA CATACTTTTG ATTAATAGCA CAGGGAATCT AATTGCTCCT 840
CGGGGTTACT TCAAAATACG AAATGGGAAA AGCTCAATAA TGAGGTCAGA TGCACCCATT 900
GGCACCTGCA GTTCTGAATG CATCACTCCA AATGGAAGCA TTCCCAATGA CAAACCTTTT 960
CAAAATGTAA ACAGGATCAC ATATGGGGCC TGCCCCAGAT ATGTTAAGCA AAACACTCTG 1020
AAATTGGCAA CAGGGATGCG GAATGTACCA GAGAAACAAA CTAGAGGCAT ATTCGGCGCA 1080
ATCGCAGGTT TCATAGAAAA TGGTTGGGAG GGAATGGTAG ACGGTTGGTA CGGTTTCAGG 1140
CATCAAAATT CTGAGGGCAC AGGACAAGCA GCAGATCTTA AAAGCACTCA AGCAGCAATC 1200
GACCAAATCA ACGGGAAACT GAATAGGTTA ATCGAGAAAA CGAACGAGAA ATTCCATCAA 1260
ATCGAAAAAG AATTCTCAGA AGTAGAAGGG AGAATTCAGG ACCTCGAGAA ATATGTTGAA 1320
• · • ·
01-2810-97 Če
GACACTAAAA TAGATCTCTG GTCTTACAAC GCGGAGCTTC TTGTTGCCCT GGAGAACCAA 1380
CATACAATTG ATCTAACTGA CTCAGAAATG AACAAACTGT TTGAAAAAAC AAGGAAGCAA 1440
CTGAGGGAAA ATGCTGAGGA CATGGGCAAT GGTTGCTTCA AAATATACCA CAAATGTGAC 1500
AATGCCTGCA TAGGGTCAAT CAGAAATGGA ACTTATGACC ATGATGTATA CAGAGACGAA 1560
GCATTAAACA ACCGGTTCCA GATCAAAGGT GTTGAGCTGA AGTCAGGATA CAAAGATTGG 1620
ATCCTATGGA TTTCCTTTGC CATATCATGC TTTTTGCTTT GTGTTGTTTT GCTGGGGTTC 1680
ATCATGTGGG CCTGCCAAAA AGGCAACATT AGGTGCAACA TTTGCATTTG.AGTGTATTAA 1740
TTAAAAACAC CCTTGTTTCT AGGATGATTC GGTACCAGAT CTTAATTAAT TAA 1793
(1) údaje k SEQ ID NO:7:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 570 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Bejing/32/92 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 19 až 552 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:
Val Ala Leu Glu Asn Gin His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser
450 455 460
Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Lys Gin Leu Arg Glu Asn
465 470 475
Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp
485 490
Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val
• 500 505 510
Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gin Ile Lys Gly Val Glu
515 520 525
Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile
530 535 540
Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala
545 550 555
Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
Glu Met
Ala Glu
480 Asn Ala 495 Tyr Arg
Leu Lys
Ser Cys
Cys Gin
560 • · « · • ·
01-2810-97 Če
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
1 5 10 15
Asn Ala lle Pro Gly Asp Phe Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr
20 25 30
Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr
35 40 45
lle Thr Asn Asp Gin lle Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gin
50 55 60
Ser Ser Ser Thr Gly Arg lle Cys Asp Ser Pro His Arg lle Leu Asp
65 70 75 80
Gly Lys Asn Cys Thr Leu lle Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys
85 90 95
Asp Gly Phe Gin Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys
100 105 110
Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu
115 120 125
Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe lle Asn Glu Asp
* 130 135 140
Phe Asn Trp Thr Gly Val Ala Gin Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Cys Lys
145 150 155 160
Arg Gly Ser Val Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His Lys
165 170 175
Ser Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Gly
180 185 190
Lys Phe Asp Lys Leu Tyr lle Trp Gly Val His His Pro Ser Thr Asp
195 200 205
Arg Asp Gin Thr Ser Leu Tyr Val Arg Ala Ser Gly Arg Val Thr Val
210 215 220
Ser Thr Lys Arg Ser Gin Gin Thr Val Thr Pro Asn lle Gly Ser Arg
225 230 235 240
Pro Trp Val Arg Gly Gin Ser Ser Arg lle Ser lle Tyr Trp Thr lle
245 250 255
Val Lys Pro Gly Asp lle Leu Leu lle Asn Ser Thr Gly Asn Leu lle
260 265 270
Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys lle Arg Asn Gly Lys Ser Ser lle Met
275 280 285
Arg Ser Asp Ala Pro lle Gly Thr Cys Ser Ser Glu Cys lle Thr Pro
290 295 300
Asn Gly Ser lle Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gin Asn Val Asn Arg lle
305 310 315 320
Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu
325 330 335
Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gin Thr Arg Gly lle Phe
340 345 350
Gly Ala lle Ala Gly Phe lle Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp
355 360 365
Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gin Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gin Ala
370 375 380
Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gin Ala Ala lle Asp Gin lle Asn Gly Lys
385 390 395 400
Leu Asn Arg Leu lle Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gin lle Glu
405 410 415
Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg lle Gin Asp Leu Glu Lys Tyr
420 425 430
Val Glu Asp Thr Lys lle Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu
435 440 445
(1) údaje k SEQ ID NO:8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1766 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina
01-2810-97 Če (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Texas/36/91 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinového signálního peptidu (B) POZICE: 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Knpl restrikční místa (B) POZICE: 82 až 87 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 88 až 93 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 73 až 1734 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Knpl restrikční místa (B) POZICE: 1744 až 1749 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE: 1750 až 1755 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE: 1756 až 1766 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:8:
• φ • ·
01-2810-97 Če
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGGTACCCCC GGGGACACAA TATGTATAGG CTACCATGCG 120
AACAACTCAA CCGACACTGT TGACACAGTA CTTGAGAAGA ACGTGACAGT GACACACTCT 180
GTCAACCTAC TTGAGGACAG TCACAACGGA AAACTATGTC GACTAAAGGG AATAGCCCCA 240
CTACAATTGG GTAATTGCAG CGTTGCCGGA TGGATCTTAG GAAACCCAAA ATGCGAATCA 300
CTGTTTTCTA AGGAATCATG GTCCTACATT GCAGAAACAC CAAACCCTGA GAATGGAACA 360
TGTTACCCAG GGTATTTCGC CGACTATGAG GAACTGAGGG AGCAATTGAG TTCAGTATCA 420
TCATTCGAGA GATTCGAAAT ATTCCCCAAA GAAAGCTCAT GGCCCAACCA CACCGTAACC 480
AAAGGAGTAA CGAGATCATG CTCCCATAAT GGGAAAAGCA GTTTTTACAG AAATTTGCTA 540
TGGCTGACGG AGAAGAATGG CTTGTACCCA AATCTGAGCA AGTCCTATGT AAACAACAAA 600
GAGAAAGAAG TCCTTGTACT ATGGGGTGTT CATCACCCGT CTAACATAAG GGACCAAAGG 660
GCCATCTATC ATACAGAAAA TGCTTATGTC TCTGTAGTGT CTTCACATTA TAGCAGAAGA 720
TTCACCCCAG AAATAGCAAA AAGACCCAAA GTAAGAGATC AAGAAGGAAG AATTAACTAC 780
TACTGGACTC TGCTGGAACC CGGGGACACA ATAATATTTG AGGCAAATGG AAATCTAATA 840
GCGCCATGGT ATGCTTTCGC ACTGAGTAGA GGCTTTGGGT CAGGAATCAT CACCTCAAAC 900
GCATCAATGG ATGAATGTGA CGCGAAGTGT CAAACACCCC AGGGAGCTAT AAACAGTAGT 960
CTTCCTTTCC AGAATGTACA CCCAGTCACA ATAGGAGAGT GTCCAAAGTA TGTCAGGAGT 1020
ACAAAATTAA GGATGGTTAC AGGACTAAGG AACATCCCAT CCATTCAATC CAGAGGTTTG 1080
TTTGGAGCCA TTGCCGGTTT CATTGAAGGG GGGTGGACTG GAATGATAGA TGGATGGTAT 1140
GGTTATCATC ATCAGAATGA ACAAGGATCT GGCTATGCTG CGGACCAAAA AAGCACACAA 1200
AATGCCATTA ACGGGATTAC AAACAAGGTG AATTCTGTAA TCGAGAAAAT GAACACTCAA 1260
TTCACAGCTG TGGGCAAAGA ATTCAACAAA TTAGAAAGAA GGATGGAAAA CTTAAATAAA 1320
AAAGTTGATG ATGGATTTCT GGACATTTGG ACATATAATG CAGAATTGTT GGTTCTACTG 1380
GAAAATGGAA GGACTTTGGA TTTTCATGAC TCAAATGTGA AGAATCTGTA TGAGAAAGTA 1440
AAAAGCCAAT TGAAGAATAA TGCCAAAGAA ATAGGGAACG GGTGTTTTGA ATTCTATCAC 1500
AAGTGTAACA ATGAATGCAT GGAAAGTGTG AAAAATGGAA CTTATGACTA TCCAAAATAT 1560
TCCGAAGAAT CAAAGTTAAA CAGGGGAAAA ATTGATGGAG TGAAATTGGA ATCAATGGGA 1620
GTCTATCAGA TTCTGGCGAT CTACTCAACT GTCGCCAGTT CACTGGTGCT TTTGGTCTCC 1680
CTGGGGGCAA TCAGCTTCTG GATGTGTTCT AATGGGTCTT TGCAGTGCAG AATATGAATC 1740
TGAGGTACCA GATCTTAATT AATTAA
1766
01-2810-97 Če (1) údaj e k SEQ ID NO:9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 572 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Texas/36/91 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 19 až 554 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
1 • 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr Pro Gly Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr
20 25 30
His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn
35 40 45
Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly
50 55 60
Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile Ala Pro Leu Gin Leu Gly Asn Cys
65 70 75 80
Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn Pro Lys Cys Glu Ser Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile Ala Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn
100 105 110
Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu
115 120 125
Gin Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys
130 135 140
Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr Val Thr Lys Gly Val Thr Arg Ser
145 150 155 160
01-2810-97 Ce
Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu
165 170 175
Thr Glu Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn
180 185 190
Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His Pro Ser
195 200 205
Asn Ile Arg Asp Gin Arg Ala Ile Tyr His Thr Glu Asn Ala Tyr Val
210 215 220
Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala
225 230 235 240
Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gin Glu Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp
245 250 255
Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn
260 265 270
Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser
275 280 285
Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser Met Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys
290 295 300
Gin Thr Pro Gin Gly Ala Ile Asn Ser Ser Leu Pro Phe Gin Asn Val
305 310 315 320
His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys
325 330 335
Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gin Ser Arg
340 345 350
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly
355 360 365
Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gin Asn Glu Gin Gly Ser
370 375 380
Gly Tyr Ala Ala Asp Gin Lys Ser Thr Gin Asn Ala Ile Asn Gly Ile
385 390 395 400
Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr
405 410 415
Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu
420 425 430
Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala
435 440 445
Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gly Arg Thr Leu Asp Phe His Asp
450 455 460
Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gin Leu Lys Asn
465 470 475 480
Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys
485 490 495
Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro
500 505 510
Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Gly Lys Ile Asp Gly Val
515 520 525
Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gin Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr
530 535 540
Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe
545 550 555 560
Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gin Cys Arg Ile
565 570
01-2810-97 Če (1) údaje k SEQ ID NO:10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1799 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genoxnová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Panama/45/90 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K signální peptidová sekvence (B) POZICE: 19 až 69 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 22 až 27 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 70 až 1773 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE: 1777 až 1782 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE: 1783 až 1788 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE: 1789 až 1799 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:
01-2810-97 Če
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCGGGAAG TCCAACGCAG ATCGAATCTG CACTGGGATA ACAGCTACTC AAGGGGAAGT CAATGTGACT AAATCTCATT TTGCAAATCT AAAAGGAACA CTCAACTGCA CAGATCTGGA TGTGGCCTTG TCGGCAAAAG CTTCAATACT CCACGAAGTC ATGCACGACA GAACAAAAAT CAGACAGCTA AGATTATCAA CCCAAAACGT TATCAACGCA GGAACCTCAG GATCTTGCCC TAACGTTACC
GCAATAATTG TACTACTCAT GGTAGTAACA 60
ACATCTTCAA ACTCACCTCA TGTGGTCAAA 120
GGTGTGATAC CACTGACAAC AACACCAACA180
AAGACCAGAG GGAAACTATG CCCAAACTGT240
GGCAGACCAA TGTGTGTGGG GACCACACCT300
AGACCTGTTA CATCCGGGTG CTTTCCTATA360
CCCAATCTTC TCAGAGGATA TGAAAATATC420
GAAAGAGCAC CAGGAGGACC CTACAGACTT480
AGTAGAGACG GATTCTTCGC AACAATGGCT540
TGGGCTGTCC CAAGGGACAA CAARACAGCA ACGAATCCAC TAACAGTAGA AGTACCATAC 600
atttgtacca AAGGAGAAGA CCAAATTACT GTTTGGGGGT TCCATTCTGA TAACAAAATC 660
CAAATGAAAA ACCTCTATGG AGACTCAAAT CCTCAAAAGT TCACCTCATC TGCCAATGGA 720
GTAACCACAC ATTATGTTTC TCAGATTGGT GGCTTCCCAA ATCAAACAGA AGACGGAGGG 780
CTACCACAAA GCGGCAGAAT TGTTGTTGAT TACATGGTGC AAAAACCTGG GAAAACAGGA 840
ACAATTGTCT ATCAAAGAGG TGTTTTGTTG CCTCAAAAGG TGTGGTGCGC AAGTGGCAGG 900
AGCAAGGTAA TAAAAGGGTC CTTGCCTTTA ATTGGTGAAG CAGATTGCCT TCACGAAAAA 960
TACGGTGGAT TAAACAAAAG CAAGCCTTAC TACACAGGAG AACATGCAAA AGCCATAGGA 1020
AATTGCCCAA TATGGGTGAA AACACCTTTG AAGCTTGCCA ATGGAACCAA ATATAGACCT 1080
CCTGCAAAAC TATTAAAGGA AAGGGGTTTC TTCGGAGCTA TTGCTGGTTT CTTAGAAGGA 1140
GGATGGGAAG GAATGATTGC AGGTTGGCAC GGATACACAT CTCATGGAGC ACATGGAGTG 1200
GCAGTGGCAG CAGACCTTAA GAGTACGCAA GAAGCCATAA ACAAGATAAC AAAAAATCTC 1260
aattctttga GTGAGCTAGA AGTAAAGAAT CTTCAAAGAC TAAGTGGTGC CATGGATGAA 1320
CTCCACAACG AAATACTCGA GCTGGATGAG AAAGTGGATG ATCTCAGAGC TGACACAATA 1380
AGCTCGCAAA TAGAGCTTGC AGTCTTGCTT TCCAACGAAG GAATAATAAA CAGTGAAGAT 1440
GAGCATCTAT TGGCACTTGA GAGAAAACTA AAGAAAATGC TGGGTCCCTC TGCTGTAGAC 1500
ATAGGGAATG GATGCTTCGA AACCAAACAC AAGTGCAACC AGACCTGCTT AGACAGGATA 1560
GCTGCTGGCA CCTTTAATGC AGGAGAATTT TCTCTTCCCA CTTTTGATTC ACTGAATATT 1620
ACTGCTGCAT CTTTAAATGA TGATGGATTG GATAATCATA CTATACTGCT CTACTACTCA 1680
ACTGCTGCTT CTAGTTTGGC TGTAACATTG ATGATAGCTA TTTTTATTGT TTATATGGTC 1740
TCCAGAGACA ATGTTTCTTG TTCCATCTGT CTGTGAGGTA CCAGATCTTA ATTAATTAA 1799
• ·
01-2810-97 Če (1) údaje k SEQ ID NO:11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 585 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Panama/45/90 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: HA signální peptid (B) POZICE: 1 až 17 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 18 až 568 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID N0:ll:
Met Pro 1 Gly Arg Lys Ala 5 Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn
Thr 10 15 His Val
Ala Asp Ile 20 Cys Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro
25 30
Val Lys Thr Ala Thr Gin Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro
35 40 45
Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr
50 55 60
Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu
65 70 75 80
Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala
• 85 90 95
Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe
100 105 110
Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gin Leu Pro Asn Leu Leu
115 120 125
Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gin Asn Val Ile Asn Ala
130 135 140
Glu Arg Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys
145 150 155 160
01-2810-97 Ce • ····
Pro Asn Val Thr Ser Arg 165 Asp Gly Phe Phe Ala 170 Thr Met Ala Trp Ala 175
Val Pro Arg Asp Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu Val
180 185 190
Pro Tyr lle Cys Thr Lys Gly Glu Asp Gin lle Thr Val Trp Gly Phe
195 200 205
His Ser Asp Asn Lys lle Gin Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn
210 215 220
Pro Gin Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr Val
225 230 235 240
Ser Gin lle Gly Gly Phe Pro Asn Gin Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro
245 250 255
Gin Ser Gly Arg lle Val Val Asp Tyr Met Val Gin Lys Pro Gly Lys
260 265 270
Thr Gly Thr lle Val Tyr Gin Arg Gly Val Leu Leu Pro Gin Lys Val
275 280 285
Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val lle Lys Gly Ser Leu Pro Leu
290 295 300
lle Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys
305 310 315 320
Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala lle Gly Asn Cys
325 330 335
Pro lle Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr
340 345 350
Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala lle
355 360 365
Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met lle Ala Gly Trp His
370 375 380
Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Lys Ser Thr Gin Glu Ala lle Asn Lys lle Thr Lys Asn Leu Asn Ser
405 410 415
Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gin Arg Leu Ser Gly Ala Met
420 425 430
Asp Glu Leu His Asn Glu lle Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp
435 440 445
Leu Arg Ala Asp Thr lle Ser Ser Gin lle Glu Leu Ala Val Leu Leu
450 455 460
Ser Asn Glu Gly lle lle Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu
465 470 475 480
Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Asp lle Gly
485 490 495
Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gin Thr Cys Leu Asp
500 505 510
Arg lle Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr
515 520 525
Phe Asp Ser Leu Asn lle Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu
530 535 540
Asp Asn His Thr lle Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu
545 550 555 560
Ala Val Thr Leu Met lle Ala lle Phe lle Val Tyr Met Val Ser Arg
565 570 575
Asp Asn Val Ser Cys Ser lle Cys Leu
580 . 585 • ·
01-2810-97 Če (1) údaje k SEQ ID NO:12:
(i) CHARAKTERIŠTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1811 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Netherlands/13/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinové signální sekvence (B) POZICE: 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 73 až 1785 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE: 1789 až 1794 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE: 1795 až 1800 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE: 1801 až 1811 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:
01-2810-97 Če
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGATCGAATC TGCACTGGGA TAACATCTTC AAAATCACCT 120
CATGTAGTCA AAACAGCTAC TCAAGGGGAG GTCAATGTGA CTGGTGTGAT ACCACTGACG 180
ACAACACCAA CAAAATCTCA TTTTGCAAAT CTCAAAGGAA CAAAGACCAG AGGGAAACTA 240
TGCCCAAACT GTCTCAACTG CACAGATCTG GATGTGGCCT TGGGCAGACC AATGTGTGTG 300
GGGATCACAC CTTCGGCAAA AGCTTCAATA CTCCACGAAG TCAGACCTGT TACATCCGGG 360
TGCTTTCCTA TAATGCATGA CAGAACAAAA ATCAGACAGC TACCCAATCT TCTCAGAGGA 420
TATGAAAACA TCAGACTATC AACCCAAAAC GTTATCAACG CAGAAAAGGC ACCAGGAGGA 480
CCCTACAGAC TTGGAACCTC AGGATCTTGC CCTAACGTTA CCAGTAGAAC CGGATTCTTC 540
GCAACAATGG CTTGGGCTGT CCCAAGGGAC AACAAAACAG CAACGAATCC ACTAACAGTA 600
GAAGTACCAT ACATTTGTAC GAAAGGAGAA GACCAAATTA CTGTTTGGGG GTTCCATTCT 660
GATAACAAAA CCCAAATGAA AAACCTCTAT GGAGACTCAA atcctcaaaa GTTCACCTCA 720
TCTGCCAATG GAGTAACCAC ACATTATGTT TCTCAGATTG GTGGCTTCCC AGATCAAACA 780
GAAGACGGAG GACTACCACA AAGCGGCAGA ATTGTTGTTG ATTACATGGT GCAAAAACCT 840
GGGAAAACAG GAACAATTGT CTATCAAAGA GGTATTTTGT TGCCTCAAAA GGTGTGGTGC 900
GCAAGTGGCA GGAGCAAGGT AATAAAAGGG TCCTTGCCTT TAATTGGTGA AGCAGATTGC 960
CTTCACGAAA AATACGGTGG ATTAAACAAA AGCAAGCCTT ACTACACAGG AGAACATGCA 1020
AAAGCCATAG GAAATTGCCC AATATGGGTG AAAACACCTT TGAAGCTTGC CAATGGAACC 1080
AGATATAGAC CTCCTGCAAA ACTATTAAAG GAAAGGGGTT TCTTCGGAGC TATTGCTGGT 1140
TTCTTAGAAG GAGGATGGGA AGGAATGATT GCAGGTTGGC ACGGATACAC ATCTCACGGG 1200
GCACATGGAG TGGCAGTGGC AGCAGACCTT AAGAGTACGC AAGAAGCCAT AAACAAGATA 1260
ACAAAAAATC TCAATTCTTT GAGTGAGCTA GAAGTAAAGA ACCTTCAAAG ACTAAGTGGT 1320
GCCATGGATG AACTCCACAA CGAAATACTC GAGCTGGATG AGAAAGTGGA TGATCTCAGA 1380
GCTGACACAA TAAGCTCGCA AATAGAGCTT GCAGTCTTAC TTTCCAACGA AGGAATAATA 1440
AACAGTGAAG ATGAGCATCT ATTGGCACTT GAGAGAAAAC TAAAGAAAAT GCTGGGTCCC 1500
TCTGCTGTAG ACATAGGGAA TGGATGCTTC GAAACAAAAC ACAAGTGCAA CCAGACCTGC 1560
TTAGACAGGA TAGCTGCTGG CACCTTTAAT GCAGGAGAAT TTTCTCTTCC CACTTTTGAT 1620
TCACTGAATA TTACTGCTGC ATCTTTAAAT GATGATGGAT TGGATAATCA TACTATACTG 1680
CTCTACTACT CAACTGCTGC TTCTAGTTTG GCTGTAACAT TGATGATAGC TATTTTTATT 1740
GTTTATATGG TCTCCAGAGA CAATGTTTCT TGTTCCATCT GTCTGTGAGG TACCAGATCT 1800
TAATTAATTA A
1811
01-2810-97 Če
• · 99 • ·· ·· 99
• 9 9 · 99 9 9 • · 9 9
• * • · • · • 9 99
9 9 ··· 9 • · 9 999 9 9
0 · • • · 9 9 •
·· ·· 4·· ·*♦* 99 99
(1) údaje k SEQ ID NO:13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 589 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Netherlands/13/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 19 až 571 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:
Met Pro Leu 1 Tyr Lys 5 Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Lys
20 25 30
Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gin Gly Glu Val Asn Val Thr
35 40 45
Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn
50 55 60
Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Leu Asn
65 70 75 80
Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Ile
85 90 95
Thr Pro Ser Ala Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gin Leu
115 120 125
Pro Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gin Asn
130 • 135 140
Val Ile Asn Ala Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr
14.5 150 155 160
Ser Gly Ser Cys Pro Asn Val Thr Ser Arg Thr Gly Phe Phe Ala Thr
165 170 175
Met Ala Trp Ala Val Pro Arg Asp Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu
180 185 190
Thr Val Glu Val Pro Tyr Ile Cys Thr Lys Gly Glu Asp Gin Ile Thr
195 200 205
Val Trp Gly Phe His Ser Asp Asn Lys Thr Gin Met Lys Asn Leu Tyr
210 215 220
01-2810-97 Ce
Gly Asp Ser Asn Pro Gin Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr
225 230 235 240
Thr His Tyr Val Ser Gin Ile Gly Gly Phe Pro Asp Gin Thr Glu Asp
245 250 255
Gly Gly Leu Pro Gin Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gin
260 265 270
Lys Pro Gly Lys Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gin Arg Gly Ile Leu Leu
275 280 285
Pro Gin Lys Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly
* 290 295 300
Ser Leu Pro Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly
305 310 315 320
Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala
325 330 335
Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn
340 345 350
Gly Thr Arg Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe
355 360 365
Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile
370 375 380
Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val
385 390 395 400
Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gin Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys
405 410 415
Asn Leu Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gin Arg Leu
420 425 430
Ser Gly Ala Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu
435 440 445
Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gin Ile Glu Leu
450 455 460
Ala Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His
465 470 475 480
Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala
485 490 495
Val Asp Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr 'Lys His Lys Cys Asn Gin
500 505 510
Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe
515 520 525
Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn
530 535 540
Asp Asp Gly Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala
545 550 555 560
Ala Ser Ser Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Val Tyr
565 570 575
Met Val Ser Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580 585
(1) údaje k SEQ ID NO:14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1557 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) • · * ·
01-2810-97 Če (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Shandong/9/93 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinové signální sekvence (B) POZICE: 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 73 až 1728 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE: 1735 až 1740 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE: 1741 až 1746 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE: 1747 až 1757 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GCAAGACCTT CCAGGAAATG ACAACAGCAC AGCAACGCTG 120
TGCCTGGGAC ATCATGCAGT GCCAAACGGA ACGCTAGTGA AAACAATCAC GAATGATCAA 180
ATTGAAGTGA CTAATGCTAC TGAGTTGGTT CAGAGTTCCT CAACAGGTAG AATATGCGGC 240
AGTCCTCACC GAATCCTTGA TGGAAAAAAC TGCACACTGA TAGATGCTCT ATTGGGAGAC 300
CCTCATTGTG ATGGCTTCCA AAATAAGGAA TGGGACCTTT TTGTTGAACG CAGCAAAGCT 360
TACAGCAACT GTTACCCTTA TGATGTGCCG GATTATGCCT CCCTTAGGTC ACTAGTTGCC 420
TCATCAGGCA CCCTGGAGTT TATCAATGAA GACTTCAATT GGACTGGAGT CGCTCAGGAT 480
GGGGGAAGCT ATGCTTGCAA AAGAGGATCT GTTAACAGTT TCTTTAGTAG ATTGAATTGG 540
TTGCACAAAT TAGAATACAA ATATCCAGCG CTGAACGTGA CTATGCCAAA CAATGGCAAA 600
• ·
01-2810-97 Če
TTTGACAAAT TGTACATTTG GGGGGTTCAC CACCCGAGCA CGGACAGTGA CCAAACCAGC 660
CTATATGTTC GAGCATCAGG GAGAGTCACA GTCTCTACCA AAAGAAGCCA ACAAACTGTA 720
ACCCCGAATA TCGGGTCTAG ACCCTGGGTA AGGGGTCAGT CCAGTAGAAT AAGCATCTAT 780
TGGACAATAG TAAAACCGGG AGACATACTT TTGATTGATA GCACAGGGAA TCTAATTGCT 840
CCTCGGGGTT ACTTCAAAAT ACGAAATGGG AAAAGCTCAA TAATGAGGTC AGATGCACCC 900
ATTGGCAACT GCAGTTCTGA ATGCATCACT CCAAATGGAA GCATTCCCAA TGACAAACCT 960
TTTCAAAATG TAAACAGAAT CACATATGGG GCCTGCCCCA GATATGTTAA GCAAAACACT 1020
CTGAAATTGG CAACAGGGAT GCGGAATGTA CCAGAGAAAC AAACTAGAGG CATATTCGGC 1080
GCAATCGCAG GTTTCÁTAGA AAATGGTTGG GAGGGAATGG TAGACGGTTG GTACGGTTTC 1140
AGGCATCAAA ATTCTGAGGG CACAGGACAA GCAGCAGATC TTAAAAGCAC TCAAGCAGCA 1200
ATCGACCAAA TCAACGGGAA ACTGAATAGG TTAATCGAGA AAACGAACGA GAAATTCCAT 1260
CAAATCGAAA AAGAATTCTC AGAAGTAGAA GGGAGAATTC AGGACCTCGA GAAATATGTT 1320
GAAGACACTA AAATAGATCT CTGGTCTTAC AACGCGGAGC TTCTTGTTGC CCTGGAGAAC 1380
CAACATACAA TTGATCTAAC TGACTCAGAA ATGAACAAAC TGTTTGAAAA AACAAGGAAG 1440
CAACTGAGGG AAAATGCTGA GGACATGGGC AATGGTTGCT TCAAAATATA CCACAAATGT 1500
GACAATGCCT GCATAGGGTC AATCAGAAAT GGAACTTATG ACCATGATGT ATACAGAGAC 1560
GAAGCATTAA ACAACCGGTT CCAGATCAAA GGTGTTGAGC TGAAGTCAGG ATACAAAGAT 1620
TGGATCCTAT GGATTTCCTT TGCCATATCA TGCTTTTTGC TTTGTGTTGT TTTGCTGGGG 1680
TTCATCATGT GGGCCTGCCA AAAAGGCAAC ATTAGGTGCA ACATTTGCAT TTGAGGTACC 1740
AGATCTTAAT TAATTAA 1757
(1) údaje k SEQ ID NO:15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 571 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Shandong/9/93 rHA
01-2810-97 Če
• · (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 19 až 553 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:
Met 1 Pro Leu Tyr Lys 5 Leu Leu Asn Val Leu 10 Trp Leu Val Ala Val Ser 15
Asn Ala lle Pro Gly Gin Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala
20 25 30
Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys
35 40 45
Thr lle Thr Asn Asp Gin lle Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val
50 55 60
Gin Ser Ser Ser Thr Gly Arg lle Cys Gly Ser Pro His Arg lle Leu
65 70 75 80
Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu lle Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Gin Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser
100 105 110
Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
115 120 125 C
Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe lle Asn Glu
130 135 140
Asp Phe Asn Trp Thr Gly Val Ala Gin Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Cys
145 150 155 160
Lys Arg Gly Ser Val Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn
180 185 190
Gly Lys Phe Asp Lys Leu Tyr lle Trp Gly Val His His Pro Ser Thr
195 200 205
Asp Ser Asp Gin Thr Ser Leu Tyr Val Arg Ala Ser Gly Arg Val Thr
210 215 220
Val Ser Thr Lys Arg Ser Gin Gin Thr Val Thr Pro Asn lle Gly Ser
225 230 235 240
Arg Pro Trp Val Arg Gly Gin Ser Ser Arg lle Ser lle Tyr Trp Thr
245 250 255
lle Val Lys Pro Gly Asp lle Leu Leu lle Asp Ser Thr Gly Asn Leu
260 265 270
lle Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys lle Arg Asn Gly Lys Ser Ser lle
275 280 285
Met Arg Ser Asp Ala Pro lle Gly Asn Cys Ser Ser Glu Cys lle Thr
290 295 300
Pro Asn Gly Ser lle Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gin Asn Val Asn Arg
305 310 315 320
lle Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys
325 330 335
Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gin Thr Arg Gly lle
340 345 350
Phe Gly Ala lle Ala Gly Phe lle Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val
* 355 360 365
Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gin Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gin
370 375 380
Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gin Ala Ala lle Asp Gin lle Asn Glý
385 390 395 400
Lys Leu Asn Arg Leu lle Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gin lle
405 410 415
Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg lle Gin Asp Leu Glu Lys
420 425 430 • · • ·
01-2810-97 Če
Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu
435 440 445
Leu Val Ala Leu Glu Asn Gin His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser G1U
450 455 460
Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Lys Gin Leu Arg Glu Asn Ala
465 470 475 480
Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn
485 490 495
Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr
500 505 510
Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gin Ile Lys Gly Val Glu Leu
515 520 525
Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser
530 535 540
Cys Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys
545 550 555 560
Gin Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
(1) údaje k SEQ ID NO:16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1814 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Shanhai/4/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinové signální sekvence (B) POZICE: 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE: 82 až 87 (ix) ZNAKY
01-2810-97 Ce
t (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 73 až 1794 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE: 1804 až 1814 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GGGTACCGAT CGAATCTGCA CTGGGATAAC ATCTTCAAÁC 120
TCACCTCATG TGGTCAAAAC AGCTACTCAA GGGGAGGTCA ATGTGACTGG TGTGATACCA 180
CTGACAACAA CACCAACAAA ATCTCATTTT GCAAATCTCA AAGGAACAAA GACCAGAGGG 240
AAACTATGCC CAAACTGTCT CAACTGCACA GATCTGGATG TGGCCTTGGG CAGACCAATG 300
TGTGTGGGGA CCACACCTTC GGCAAAAGCT TCAATACTCC ACGAAGTCAG ACCTGTTACA . 360
TCCGGGTGCT TTCCTATAAT GCACGACAGA ACAAAAATCA GACAGCTACC CAATCTTCTC 420
AGAGGATATG AAAATATCAG ATTATCAACC CAAAACGTTA TCAACGCAGA AAAGGCACCA 480
GGAGGACCCT ACAGACTTGG AACCTCAGGA TCTTGCCCTA ACGCTACCAG TAGAAGCGGA 540
TTTTTCGCAA CAATGGCTTG GGCTGTCCCA AGGGACAACA ACAAAACAGC AACGAATCCA 600
CTAACAGTAG AAGTACCATA CATTTGCACA AAAGGAGAAG ACCAAATTAC TGTTTGGGGG 660
TTCCATTCTG ATAACAAACC CCAAATGAAA AACCTCTATG GAGACTCAAA TCCTCAAAAG 720
TTCACCTCAT CTGCTAATGG AGTAACCACA CATTATGTTT CTCAGATTGG CGGCTTCCCA 780
GATCAAACAG AAGACGGAGG GCTACCACAA AGCGGCAGAA TTGTTGTTGA TTACATGGTG 840
CAAAAACCTG GGAAGACAGG AACAATTGTC TATCAGAGAG GTGTTTTGTT GCCTCAAAAG 900
GTGTGGTGCG CTAGTGGCAG GAGCAAAGTA ATAAAAGGGT CCTTGCCTTT AATTGGTGAA 960
GCAGATTGCC TTCACGAAAA ATACGGTGGA TTAAACAAAA GCAAGCCTTA CTACACAGGA 1020
GAACATGCAA AAGCCATAGG AAATTGCCCA ATATGGGTGA AAACACCTTT GAAGCTTGCC 1080
AATGGAACCA AATATAGACC TCCTGCAAAA CTATTAAAGG AAAGGGGTTT CTTCGGAGCT 1140
ATTGCTGGTT TCTTAGAAGG AGGATGGGAA GGAATGATTG CAGGTTGGCA CGGATACACA 1200
TCTCACGGAG CACATGGAGT GGCAGTGGCA GCAGACCTTA AGAGTACGCA AGAAGCCATA 1260
AACAAGATAA CAAAAAATCT CAATTCTTTG AGTGAGCTAG AAGTAAAGAA TCTTCAAAGG 1320
CTAAGTGGTG CCATGGATGA ACTCCACAAC GAAATACTCG AGCTGGATGA GAAAGTGGAT 1380
• ·
01-2810-97 Če
GATCTCAGAG CTGACACAAT AAGCTCGCAA ATAGAACTTG CAGTCTTGCT TTCCAACGAA 1440
GGAATAATAA ACAGTGAAGA TGAGCATCTA TTGGCACTTG AGAGAAAACT AAAGAAAATG 1500
CTGGGTCCCT CTGCTGTAGA CATAGGAAAT GGATGCTTCG AAACCAAACA CAAGTGCAAC 1560
CAGACCTGCT TAGACAGGAT AGCTGCTGGC ACCTTTAATG CGGGAGAATT TTCTCTTCCC 1620
ACTTTTGATT CACTGAATAT TACTGCTGCA TCTTTAAATG ATGATGGATT GGATAACCAT 1680
ACTATACTGC TCTACTACTC AACTGCTGCT TCTAGTTTGG CGGTAACATT GATGATAGCT 1740
ATTTTTATTG TTTATATGGT CTCCAGAGAC AATGTTTCTT GCTCCATCTG TCTGTGAGGA 1800
TCTTAATTAA TTAA 1814
(1) údaje k SEQ ID NO:17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 592 aminokyselin
(B) TYP: amino kys e1ina
(C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
(D) TOPOLOGIE: lineární
(ii) DRUH MOLEKULY: peptid
(iii) HYPOTETICKÁ: ne
(iv) PROTISMYSLNÝ: ne
(v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce
(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Shanhai/4/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinový signální peptid (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 19 až 574 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
1 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser
20 25 Gly 30 Val
Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys Thr Ala Thr Gin Glu Asn
35 40 45 His Phe
Val Thr Gly Val Ile Pro Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser
50 55 60
Ala Asn Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys
65 70 75 80
Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val
85 90 95
• ·
01-2810-97 Če
Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro
100 105 110
Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg
115 120 125
Gin Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr
130 135 140
Gin Asn Val Ile Asn Ala Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu
145 150 155 160
Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn Ala Thr Ser Arg Ser Gly Phe Phe
165 170 175
Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro Arg Asp Asn Asn Lys Thr Ala Thr
180 185 190
Asn Pro Leu Thr Val Glu Val Pro Tyr Ile Cys Thr Lys Gly Glu Asp
195 200 205
Gin Ile Thr Val Trp Gly Phe His Ser Asp Asn Lys Pro Gin Met Lys
210 215 220
Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn Pro Gin Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn
225 230 235 240
Gly Val Thr Thr His Tyr Val Ser Gin Ile Gly Gly Phe Pro Asd Gin
245 250 255
Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gin Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr
260 265 270
Met Val Gin Lys Pro Gly Lys Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gin Arg Gly
275 280 285
Val Leu Leu Pro Gin Lys Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val
290 295 300
Ile Lys Gly Ser Leu Pro Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu
305 310 315 320
Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His
325 330 335
Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys
340 345 350
Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu
355 360 365
Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu
370 375 380
Gly Met Ile Ala Gly Trp His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly
385 390 395 400
Val Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gin Glu Ala Ile Asn Lys
405 410 415
Ile Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu
420 425 430
Gin Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu
435 440 445
Leu Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gin
450 455 460
Ile Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu
465 470 475 480
Asp Glu His Leu Leu Ala Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly
485 490 495
Pro Ser Ala Val Asp Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys
500 505 510
Cys Asn Gin Thr Cys Leu Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala
515 520 525
Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala
530 535 540
Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr
545 550 555 560
Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe
565 570 575
Ile Val Tyr Met Val Ser Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580 585 590
01-2810-97 Če
(1) údaje k SEQ ID NO:18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1802 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Harbin/7/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast HA signální peptidové sekvence (B) POZICE: 19 až 69 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 22 až 27 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 70 až 1776 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: KpnI restrikční místa (B) POZICE: 1780 až 1785 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE: 1786 až 1791 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translačni terminační signál (B) POZICE: 1792 až 1802 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:
01-2810-97 Če
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCGGGAAG GCAATAATTG TACTACTCAT GGTAGTAACA 60
TCCAACGCAG ATCGAATCTG CACTGGGATA ACATCTTCAA ACTCACCTCA TGTGGTCAAA 120
ACAGCTACTC AAGGGGAAGT CAATGTGACT GGTGTGATAC CACTGACAAC AACACCAACA 180
AAATCTCATT TTGCAAATCT AAAAGGAACA AAGACCAGAG GGAAACTATG CCCAAACTGT 240
CTCAACTGCA CAGATCTGGA TGTGGCCTTG GGCAGACCAA TGTGTGTGGG GACCACACCT 300
TCGGCAAAAG CTTCAATACT CCACGAAGTC AGACCTGTTA CATCCGGGTG CTTTCCTATA 360
ATGCACGACA GAACAAAAAT CAGACAGCTA CCCAATCTTC TCAGAGGATA TGAAAATATC 420
AGATTATCAA CCCAAAACGT TATCAATGCA GAAAAAGCAC CAGGAGGACC CTACAGACTT 480
GGAACCTCAG GATCTTGCCC TAACGCTACC AGTAGAAGCG GATTTTTTGC AACAATGGCT 540
TGGGCTGTCC CAAGGGACGA CAACAAAACA GCAACGAATC CACTAACAGT AGAAGTACCA 600
TACGTTTGTA CAGAAGGAGA AGACCAAATT ACTGTTTGGG GGTTCCATTC TGATAACAAA 660
GCCCAAATGA AAAACCTCTA TGGAGACTCA AATCCTCAAA AGTTCACCTC ATCTGCTAAT 720
GGAGTAACCA CACATTATGT TTCTCAGATT GGCGGCTTCC CAGATCAAAC AGAAGACGGA 780
GGGCTACCAC AAAGCGGCAG AATTGTTGTT GATTACATGG TGCAAAAACC TGGGAAAACA 840
GGAACAATTG TCTATCAAAG AGGTGTTTTG TTGCCTCAAA AGGTGTGGTG CGCGAGTGGC 900
AGGAGCAAAG TAATAAAAGG GTCCTTGCCT TTAATTGGTG AAGCAGATTG CCTTCACGAA 960
AAATACGGTG GATTAAACAA AAGCAAGCCT TACTACACAG GAGAACATGC AAAAGCCATA 1020
GGAAATTGCC CAATATGGGT GAAAACACCT TTGAAGCTTG CCAATGGAAC CAAATATAGA 1080
CCTCCTGCAA AACTATTAAA GGAAAGGGGT TTCTTCGGAG CTATTGCTGG TTTCTTAGAA 1140
GGAGGATGGG AAGGAATGAT ŤGCAGGTTGG CACGGATACA CATCTCACGG AGCACATGGA 1200
GTGGCAGTGG CAGCAGACCT TAAGAGTACG CAAGAAGCCA TAAACAAGAT AACAAAAAAT 1260
CTCAATTCTT TGAGTGAGCT AGAAGTAAAG AATCTTCAAA GACTAAGTGG TGCCATGGAT 1320
GAACTCCATA ACGAAATACT CGAGCTGGAT GAGAAAGTGG ATGATCTCAG AGCTGACACT 1380
ATAAGCTCGC AAATAGAACT TGCAGTCTTG CTTTCCAACG AAGGAATAAT AAACAGTGAA 1440
GÁTGAGCATC TATTGGCACT TGAGAGAAAA CTAAAGAAAA TGCTGGGTCC CTCTGCTGTA 1500
GACATAGGGA ATGGATGCTT CGAAACCAAA CACAAGTGCA ACCAGACCTG CTTAGACAGG 1560
ATAGCTGCTG GCACCTTTAA TGCAGGAGAA TTTTCTCTCC CCACTTTTGA TTCACTGAAT 1620
ATTACTGCTG CATCTTTAAA TGATGATGGA TTGGATAATC ATACTATACT GCTCTACTAC 1680
TCAACTGCTG CTTCTAGTTT GGCTGTAACA TTGATGATAG CTATTTTTAT TGTTTATATG 1740
GTCTCCAGAG ACAATGTTTC atgctccatc TGTCTGTGAG GTACCAGATC ΤΤΑΑΤΤΆΑΤΤ 1800
AA
1802
01-2810-97 Če (1) údaje k SEQ ID NO:19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 585 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (VÍ) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: B/Harbin/7/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: HA signální peptid (B) POZICE: 1 až 17 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 18 až 569 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:
Met Pro Gly Lys Ala Ile Ile Val Leu Leu Met Val Val Thr Ser Asn
1 5 10 15
Ala Asp Arg Ile Cys Thr Gly Ile Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Val
20 25 30
Val Lys Thr Ala Thr Gin Gly Glu Val Asn Val Thr Gly Val Ile Pro
35 40 45
Leu Thr Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr
50 55 60
Lys Thr Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asn Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu
65 70 75 80
Asp Val Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Val Gly Thr Thr Pro Ser Ala
85 90 95
Lys Ala Ser Ile Leu His Glu Val Arg Pro Val Thr Ser Gly Cys Phe
100 105 110
Pro Ile Met His Asp Arg Thr Lys Ile Arg Gin Leu Pro Asn Leu Leu
115 120 125
Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Arg Leu Ser Thr Gin Asn Val Ile Asn Ala
130 135 140
Glu Lys Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys
145 150 155 160
Pro Asn Ala Thr Ser Arg Ser Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala
165 170 175
Val Pro Arg Asp Asp Asn Lys Thr Ala Thr Asn Pro Leu Thr Val Glu
180 185 190
Vál Pro Tyr Val Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gin Ile Thr Val Trp Gly
195 200 205
Phe His Ser Asp Asn Lys Ala Gin Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser
210 215 220
Asn Pro Gin Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Val Thr Thr His Tyr
225 230 235 240
··
01-2810-97 Če
100
Val Ser Gin Ile Gly 245 Gly Phe Pro Asp Gin Thr Glu Asp Gly Gly Leu
250 255
Pro Gin Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met Val Gin Lys Pro Gly
260 265 270
Lys Thr Gly Thr Ile Val Tyr Gin Arg Gly Val Leu Leu Pro Gin Lys
275 280 285
Val Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val Ile Lys Gly Ser Leu Pro
290 295 300
Leu Ile Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn
305 310 315 320
Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala Ile Gly Asn
325 330 335
Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys
340 345 350
Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala
355 360 365
Ile Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met Ile Ala Gly Trp
370 375 380
His Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val Ala Val Ala Ala Asp
385 390 395 400
Leu Lys Ser Thr Gin Glu Ala Ile Asn Lys Ile Thr Lys Asn Leu Asn
405 410 415
Ser Leu Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gin Arg Leu Ser Gly Ala
420 425 430
Met Asp Glu Leu His Asn Glu Ile Leu Glu Leu Asp Glu Lys Val Asp
435 440 445
Asp Leu Arg Ala Asp Thr Ile Ser Ser Gin Ile Glu Leu Ala Val Leu
450 455 460
Leu Ser Asn Glu Gly Ile Ile Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala
465 470 475 480
Leu Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Val Asp Ile
485 490 495
Gly Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gin Thr Cys Leu
500 505 510
Asp Arg Ile Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro
515 520 525
Thr Phe Asp Ser Leu Asn Ile Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly
530 535 540
Leu Asp Asn His Thr Ile Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser
545 550 555 560
Leu Ala Val Thr Leu Met Ile Ala Ile Phe Ile Val Tyr Met Val Ser
565 570 575
Arg Asp Asn Val Ser Cys Ser Ile Cys Leu
580 585 (1) údaje k SEQ ID NO:20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1757 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ;
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir
01-2810-97 Če
101 (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Johannesburg/33/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: vedoucí polyhedrinová mRNA (částečná) (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast AcNPV 61K proteinového signálního peptidu (B) POZICE: 19 až 72 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Smál restrikční místa (B) POZICE: 76 až 81 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: kódující oblast zralé rHA (B) POZICE: 73 až 1731 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: Knpl restrikční místa (B) POZICE: 1735 až 1740 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: BglII restrikční místa (B) POZICE: 1741 až 1747 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: univerzální translační terminační signál (B) POZICE: 1747 až 1757 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:20:
TAAAAAAACC TATAAATAAT GCCCTTGTAC AAATTGTTAA ACGTTTTGTG GTTGGTCGCC 60
GTTTCTAACG CGATTCCCGG GCAGGACCTT CCAGGAAATG ACAACAGCAC AGCAACGCTG 120
TGCCTGGGAC ACCATGCAGT GCCAAACGGA ACGCTAGTGA AAACAATCAC GAATGATCAA 180
ATTGAAGTGA CTAATGCTAC TGAGCTGGTT CAGAGTTCCC CAACAGGTAG AATATGCGAC 240
AGTCCTCACC GAATCCTTGA TGGAAAGAAC TGCACACTGA TAGATGCTCT ATTGGGAGAC 300
CCTCATTGTG ATGGCTTCCA AAATAAGGAA TGGGACCTTT TTGTTGAACG CAGCAAAGCT 360
TACAGCAACT GTTACCCTTA TGATGTGCCG GATTATGCCT CCCTTAGGTC ACTAGTTGCC 420
TCATCAGGCA CCCTGGAGTT TATCAACGAA AACTTCAATT GGACTGGAGT CGCTCAGGAT 480
GGGAAAAGCT ATGCTTGCAA AAGGGGATCT GTTAACAGTT TCTTTAGTAG ATTGAATTGG 540
TTGCACAAAT TAGAATACAA ATATCCAGCG CTGAACGTGA CTATGCCAAA CAATGGCAAA 600
TTTGACAAAT TGTACATTTG GGGGGTTCAC CACCCGAGCA CGGACAGTGA CCAAACCAGC 660
CTATATGTCC GAGCATCAGG GAGAGTCACA GTCTCTACCA AAAGAAGCCA ACAAACTGTA 720
ATCCCGGATA TCGGGTATAG ACCATGGGTA AGGGGTCAGT CCAGTAGAAT AGGCATCTAT 780
01-2810-97 Če
102
TGGACAATAG TAAAACCGGG AGACATACTT TTGATTAATA GCACAGGGAA TCTAATTGCT 840
CCTCGGGGTT ACTTCAAAAT ACGAAATGGG AAAAGCTCAA TAATGAGGTC AGATGCACCC 900
ATTGGCAACT GCAGTTCTGA ATGCATCACT CCAAATGGAA GCATTCCCAA TGACAAACCT 960
TTTCAAAATG TAAACAGGAT CACATATGGG GCCTGCCCCA GATATGTTAA GCAAAACACT 1020
CTGAAATTGG CAACAGGGAT GCGGAATGTA CCAGAGAAAC AAACTAGAGG CATATTCGGC 1080
GCAATCGCAG GTTTCATAGA AAATGGTTGG GAGGGAATGG TAGACGGTTG GTACGGTTTC 1140
AGGCATCAAA ATTCTGAGGG CACAGGACAA GCTGCAGATC TTAAAAGCAC TCAAGCAGCA 1200
ATCGACCAAA TCAACGGGAA ACTGAATAGG TTAGTCGAGA AAACGAACGA GAAATTCCAT 1260
CAAATCGAAA AAGAATTCTC AGAAGTAGAA GGGAGAATTC AGGACCTCGA GAAATATGTT 1320
GAAGACACTA AAATAGATCT CTGGTCTTAC AATGCGGAGC TTCTTGTTGC TCTGGAGAAC 1380
CAACATACAA TTGATCTAAC TGACTCAGAA ATGAACAAAC TGTTTGAAAG AACAAGGAAG 1440
CAACTGAGGG AAAATGCTGA GGACATGGGC AATGGTTGTT TCAAAATATA CCACAAATGT 1500
GACAATGCCT GCATAGGGTC AATCAGAAAT GGAACTTATG ACCATGATGT ATACAGAGAC 1560
GAAGCATTAA ACAACCGGTT CCAGATCAAA GGTGTTGAGC TGAAGTCAGG ATACAAAGAT 1620
TGGATTCTAT GGATTTCCTT TGCCATATCA TGCTTTTTGC TTTGTGTTGT TTTGCTTGGG 1680
TTCATCATGT GGGCCTGCCA AAAAGGCAAC ATTAGGTGCA ACATTTGCAT TTGAGGTACC 1740
AGATCTTAAT TAATTAA 1757
(1) údaje k SEQ ID NO:21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 571 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) PROTISMYSLNÝ: ne (v) DRUH FRAGMENTU: fragment N-konce (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: chřipkový vir
01-2810-97 Če
103 (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: A/Johannesburg/33/94 rHA (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: AcNPV 61K proteinová signální sekvence (B) POZICE: 1 až 18 (ix) ZNAKY (A) NÁZEV/KLÍČ: zralá rHA (B) POZICE: 19 až 569 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:
Met Pro Leu Tyr Lys Leu Leu Asn Val Leu Trp Leu Val Ala Val Ser
1 5 10 15
Asn Ala Ile Pro Gly Gin Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala
20 25 30
Thr Leu Cys Leu Gly His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Leu Val Lys
35 40 45
Thr Ile Thr Asn Asp Gin Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val
50 55 60
Gin Ser Ser Pro Thr Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Arg Ile Leu
65 70 75 80
Asp Gly Lys Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Gin Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser
100 105 110
Lys Ala Tyr Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Ile Asn Glu
130 135 140
Asn Phe Asn Trp Thr Gly Val Ala Gin Asp Gly Lys Ser Tyr Ala Cys
145 150 155 160
Lys Arg Gly Ser Val Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn
180 185 190
Gly Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Ser Thr
195 200 205
Asp Ser Asp Gin Thr Ser Leu Tyr Val Arg Ala Ser Gly Arg Val Thr
210 215 220
Val Ser Thr Lys Arg Ser Gin Gin Thr Val Ile Pro Asp Ile Gly Tyr
225 230 235 240
Arg Pro Trp Val Arg Gly Gin Ser Ser Arg Ile Gly Ile Tyr Trp Thr
245 250 255
Ile Val Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu
260 265 270
Ile Ala Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Ser Ile
275 280 285
Met Arg Ser Asp Ala Pro Ile Gly Asn Cys Ser Ser Glu Cys Ile Thr
290 295 300
Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gin Asn Val Asn Arg
305 310 315 320
Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys
325 330 335
Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gin Thr Arg Gly Ile
340 345 350
Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val
355 360 365
01-2810-97 Če
104
Asp Gly 370 Trp Tyr Gly Phe Arg His Gin Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gin
375 380
Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gin Ala Ala Ile Asp Gin Ile Asn Gly
385 390 395 400
Lys Leu Asn Arg Leu Val Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gin iíe
405 410 415
Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gin Asp Leu Glu Lys
• 420 425 430
Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu
435 440 445
Leu Val Ala Leu Glu Asn Gin His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu
450 455 460
Met Asn Lys Leu Phe Glu Arg Thr Arg Lys Gin Leu Arg Glu Asn Ala
465 470 475 480
Glu Asp Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn
485 490 495
Ala Cys Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr
500 505 510
Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gin Ile Lys Gly Val Glu Leu
515 520 525
Lys Ser Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser
530 535 540
Cys Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys
545 550 555 560
Gin Lys Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile
565 570
(1) údaje k SEQ ID NO:22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:
TGGTTGGTCG CCGTTTCTAA CGCGATTCCC GGGGGTACC (1) údaje k SEQ ID NO:23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 13 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:
Trp Leu Val Ala Val Ser Asn Ala Ile Pro Gly Gly Thr
10 (1) údaje k SEQ ID NO:24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
» *
01-2810-97 Če
105 (A) DÉLKA: 43 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:
TGGTTAGTCG CCGTGTCCTG CAGGCCAGAG AGGCCTTGGT ACC (1) údaje k SEQ ID NO:25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:25:
GTCGCCGTGT CCAACGCG 18 (1) údaje k SEQ ID NO:26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:
TAATTGGCCA GAGAGGCC 18 (1) údaje k SEQ ID NO:27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:27:
GGGGGATCCG GTACCAGCAA AAGCAGGGGA TAATTCTAT (1) údaje k SEQ ID NO:28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 38 bází • · «
· · ♦ • · • · · • · · · ·
01-2810-97 Če
106 (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:28:
GGGGGTACCC CCGGGGACTT TCCAGGAAAT GACAACAG (1) údaje k SEQ ID NO:29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 44 bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:29:
CCCGGTACCG AATCATCCTA GAAACAAGGG TGTTTTTAAT ΤΑΆΤ 44 (1) údaje k SEQ ID NO:30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 47 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:30:
GGGGAATTCG GTACCCCCGG GAAGGCAATA ATTGTACTAC TCATGGT 47 (1) údaje k SEQ ID NO:31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:31:
GGTACCCCCG GGGATCGAAT CTGCACTGGG ATAACA 36 (1) údaje k SEQ ID NO:32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 50 bází (B) TYP: nukleová kyselina
01-2810-97 Če
107 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:32:
GGGGAATTCG GATCCGGTAC CTCACAGACA GATGGARCAA GAAACATTGT

Claims (25)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Rekombinantní chřipkový HAO hemaglutininový protein exprimovaný v bakulovirovém expresním systému v kultivovaných hmyzích buňkách.
  2. 2. Rekombinantní chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 1, vyznačený tím, že dále zahrnuje bakulovirový signální peptid, který se váže přímo na HAO protein bez intervenujících aminokyselin.
  3. 3. Rekombinantní chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 1, vyznačený tím, že dále obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič pro podání ve formě vakcíny.
  4. 4. Rekombinantní chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 1, vyznačený tím, že dále zahrnuje adjuvans a farmaceuticky přijatelný nosič pro podání ve formě vakcíny.
  5. 5. Rekombinantní chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 3, vyznačený tím, že
    01-2810-97 Če
    109 farmaceuticky přijatelným nosičem je polymerní dopravní systém.
  6. 6. Rekombinantní chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 1, vyznačený tím, že chřipka se zvolí ze skupiny tvořené chřipkovými kmeny A a chřipkovými kmeny B.
  7. 7. Rekombinantní chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 6, vyznačený tím, že chřipka infikuje lidi.
  8. 8. Rekombinantní chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 1, vyznačený tím, že dále obsahuje druhý protein, který se váže na hemaglutinin.
  9. 9. Rekombinantní chřipkový HAO hemaglutininový protein podle nároku 8, vyznačený tím, že se zvolí ze skupiny tvořené virovými proteiny hepatitidy B, proteiny HIV, karcinoembryonickým antigenem a neuraminidázou.
  10. 10. Vektor pro výrobu rekombinantního chřipkového HAO hemaglutininového proteinu obsahujícího následující 5' -> 3' sekvence: polyhedrinový promotor z bakuloviru, ATG translační startovací kodon, signální peptid, kódující sekvence pro zralý hemaglutinin z chřipkového kmene, • ·
    01-2810-97 Če
    110 translační terminační kodon a polyhedrinový RNA polyadenylačni signál.
  11. 11. Vektor podle nároku 10, vyznačený t i m , že signálním, peptidem je bakulovirový protein mající molekulovou hmotnost přibližně 61K a aminokyselinovou sekvenci tvořenou prvními osmnácti aminokyselinami sekvence ID NO 7.
  12. 12. Vektor podle nároku 10, vyznačený tím, že signálním peptidem je chřipkový hemaglutininový proteinový promotor.
  13. 13. Vektor podle nároku 10, vyznačený tím, že sekvence kódující signální peptid a hemaglutinin nekódují žádnou intervenující aminokyselinu.
  14. 14. Vektor podle nároku 10, vyznačený tím, že dále zahrnuje sekvenci kódující druhý protein, který se exprimuje jako fúzní protein s hemaglutininem.
  15. 15. Vektor podle nároku 10, vyznačený tím, že je transfektován v kultivovaných hmyzích buňkách.
    01-2810-97 Ce
    111 ··· · ····· ····· · · · ♦··· · • · · · · · · ·· «······ · · · ·
  16. 16. Způsob výroby rekombinantního chřipkového hemaglutininového proteinu, vyznačený tím, že zahrnuje infikaci kultivovaných hmyzích buněk vektorem obsahujícím následující 5' -> 3' sekvence: polyhedrinový promotor z bakuloviru, ATG translační startovací kodon, signální peptid, kódující sekvence pro zralý hemaglutinin z chřipkového kmene, translační terminační kodon a
    polyhedrinový RNA polyadenylační signál, a kultivaci buněk v živném prostředí. 17. Způsob podle nároku 16, v y z n a č e n ý tím , že dále zahrnuje izolaci HAO chřipkového
    hemaglutininového proteinu z buněk v čistotě alespoň 95%.
  17. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačený tím, že protein se izoluje separací hemaglutininu z nemembránových proteinů při alkalickém pH, promytím proteinů navázaných na membránu, při kterém se eluuje hemaglutinin, separování hemaglutininu od dalších proteinů navázáním na aniontoměničovou pryskyřici změnou pH, a separováním hemaglutininu od ostatních proteinů navázáním na kationtoměničovou pryskyřici změnou koncentrace soli.
  18. 19. Způsob výroby vektoru obsahujícího následující 5' -> 3' sekvence: polyhedrinový promotor z bakuloviru, ATG translační startovací kodon, signální peptid, kódující sekvence pro zralý hemaglutinin z chřipkového kmene, translační terminační kodon a polyhedrinový RNA polyadenylační signál, vyznačený tím, že
    01-2810-97 Če
    112 zahrnuje sklizeň viru z buněčného média
    RNA, v případě chřipkových kmenů A, nebo mRNA, v kmenů B; syntetizaci cDNA za virové a izolaci případě chřipkových univerzálního použití primeru (5'-AGCAAAAGCAGG-3' (SEQ z chřipkových kmenů z chřipkových kmenů B, koncích,
    RNA pro virovou primerů pro mRNA a 3' mají na které se
    ID
    NO.
    A nebo nahodilých primery 5' nenalézájí přičemž uvnitř hemaglutininových genů, amplifikaci chřipkových A restrikční a B primerů enzymová a chřipkové cDNA místa;
    smísené se segmenty hemaglutininového zralý hemaglutinin; identifikaci hemaglutininových genů, potom signálního amplifikaci genu za vzniku dvouřetězcových DNA fragmentů obsahujících celé sekvence kóduj ící peptidu hemaglutininových genů bez signálního peptidu; hemaglutininových genů bez signálního peptidu obsahujícího AcNPV polyhedrinový promotor.
    a klonování do vektoru
  19. 20. Způsob podle nároku 19, vyznačený tím, že se hemaglutininové geny klonují do vektoru za použití PCR tak, že vektor kóduje signální peptid navázaný přímo na hemaglutinin bez intervenujících aminokyselin.
  20. 21. Způsob podle nároku 19, vyznačený tím, že dále zahrnuje transfektaci vektoru do hmyzích buněk a výběr buněk pro hemaglutininovou expresi.
  21. 22. Způsob vakcinace živočichů proti chřipce, vyznačený tím, že zahrnuje podání účinného množství rekombinantního chřipkového HAO hemaglutininového
    01-2810-97 Ce
    113 proteinu, exprimovaného v bakulovirovém expresním systému v kultivovaných hmyzích buňkách, živočichovi.
  22. 23. Způsob podle nároku 22, vyznačený tím že dále zahrnuje podání proteinu v polymerním dopravním systému.
  23. 24. Způsob podle nároku 22, tím vyznačený že se chřipka zvolí ze skupiny tvořené chřipkovými kmeny A a chřipkovými kmeny B.
  24. 25. Způsob podle nároku
    22, vyznačený tím že se živočich zvolí ze skupiny tvořené savčími a ptačími druhy.
  25. 26. Způsob podle nároku 22, tím, že živočichem je člověk.
CZ0373897A 1993-09-13 1995-05-26 V podstate cistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chripkový HAO hemaglutininový protein, vektor pro výrobu rekombinantního HAO hemaglutininového proteinu, zpusob výroby uvedeného proteinu a vakcína obsahující uvedený protein CZ301021B6 (cs)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/120,607 US5762939A (en) 1993-09-13 1993-09-13 Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
CA2222129A CA2222129C (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
PCT/US1995/006750 WO1996037624A1 (en) 1993-09-13 1995-05-26 A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
CNB951979280A CN100390289C (zh) 1993-09-13 1995-05-26 生产流感血凝素多价疫苗的方法
LT97-201A LT4461B (lt) 1993-09-13 1997-12-23 Gripo hemagliutinino multivalentinių vakcinų gamybos būdas

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ373897A3 true CZ373897A3 (cs) 1999-02-17
CZ301021B6 CZ301021B6 (cs) 2009-10-14

Family

ID=27508642

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20080037A CZ299862B6 (cs) 1993-09-13 1995-05-26 Polypeptid obsahující baculovirový signální peptid
CZ0373897A CZ301021B6 (cs) 1993-09-13 1995-05-26 V podstate cistý, rekombinantní, zralý, glykosylovaný chripkový HAO hemaglutininový protein, vektor pro výrobu rekombinantního HAO hemaglutininového proteinu, zpusob výroby uvedeného proteinu a vakcína obsahující uvedený protein

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20080037A CZ299862B6 (cs) 1993-09-13 1995-05-26 Polypeptid obsahující baculovirový signální peptid

Country Status (21)

Country Link
US (2) US5762939A (cs)
EP (2) EP0833933B1 (cs)
JP (1) JP3757318B2 (cs)
CN (1) CN100390289C (cs)
AT (2) ATE518000T1 (cs)
AU (1) AU712776B2 (cs)
BR (1) BR9510590A (cs)
CA (1) CA2222129C (cs)
CZ (2) CZ299862B6 (cs)
DE (1) DE69534449T2 (cs)
DK (3) DK0833933T3 (cs)
ES (1) ES2248799T3 (cs)
FI (1) FI974319A7 (cs)
HU (1) HUT77921A (cs)
IS (1) IS4620A (cs)
LT (1) LT4461B (cs)
NO (1) NO975434L (cs)
NZ (1) NZ288026A (cs)
PT (1) PT1605052E (cs)
SK (1) SK286441B6 (cs)
WO (1) WO1996037624A1 (cs)

Families Citing this family (192)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6387373B1 (en) * 1993-01-15 2002-05-14 Novavax, Inc. Vaccines containing paucilsmellar lipid vesicles as immunological adjuvants
EP2374894B1 (en) * 1993-09-13 2014-09-17 Protein Sciences Corporation A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
DE19612966B4 (de) * 1996-04-01 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren
DE19612967A1 (de) * 1996-04-01 1997-10-02 Behringwerke Ag Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur, sowie die durch das Verfahren erhältlichen Influenzaviren
US7157089B1 (en) * 1996-11-26 2007-01-02 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses using compositions containing stress proteins
NZ538399A (en) * 1997-08-05 2007-05-31 Nventa Biopharma Corp Fusion protein comprising an HPV E7 protein and a stress protein wherein the E7 protein is joined directly to the amino terminus of the stress protein
US6706693B1 (en) 1997-08-13 2004-03-16 The Uab Research Foundation Vaccination by topical application of genetic vectors
US6716823B1 (en) 1997-08-13 2004-04-06 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom, and uses thereof
US6348450B1 (en) * 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
US20030125278A1 (en) * 1997-08-13 2003-07-03 Tang De-Chu C. Immunization of animals by topical applications of a salmonella-based vector
US20030045492A1 (en) * 1997-08-13 2003-03-06 Tang De-Chu C. Vaccination by topical application of recombinant vectors
US7390619B1 (en) 1998-02-11 2008-06-24 Maxygen, Inc. Optimization of immunomodulatory properties of genetic vaccines
US6541011B2 (en) * 1998-02-11 2003-04-01 Maxygen, Inc. Antigen library immunization
US8026096B1 (en) 1998-10-08 2011-09-27 Protein Sciences Corporation In vivo active erythropoietin produced in insect cells
NZ512980A (en) * 1998-12-17 2003-07-25 Aventis Pasteur Multivalent immunogenic composition containing RSV subunit composition and influenza virus preparation
US20040009936A1 (en) * 1999-05-03 2004-01-15 Tang De-Chu C. Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts
JP2003504074A (ja) 1999-07-08 2003-02-04 ストレスゲン バイオテクノロジーズ コーポレイション インビトロでのＴｈ１様応答の誘導
US6544750B1 (en) 1999-08-17 2003-04-08 Thromgen, Inc. Peptide analogs as selective inhibitors of thrombin activation of protease activated receptor 1
DE19963857A1 (de) * 1999-12-30 2001-07-26 Qiagen Gmbh Primer, insbesondere für Primer-abhängige Nukleinsäure-Syntheseprozesse und Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren
NZ523408A (en) 2000-06-26 2006-02-24 Stressgen Biotechnologies Corp Human papilloma virus treatment
US20060177416A1 (en) * 2003-10-14 2006-08-10 Medivas, Llc Polymer particle delivery compositions and methods of use
GB0022969D0 (en) * 2000-09-19 2000-11-01 Chiron Spa Influenza a virus subtype H16
JPWO2002062381A1 (ja) * 2001-02-05 2004-06-03 久光製薬株式会社 バキュロウイルスベクターワクチン
DE10144906B4 (de) * 2001-09-12 2013-11-28 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen
US7232670B2 (en) 2001-09-28 2007-06-19 St. Jude Children's Research Hospital Targeting proteins to cells expressing mannose receptors via expression in insect cells
DE10218129A1 (de) * 2002-04-23 2003-11-20 Univ Ruprecht Karls Heidelberg Genetischer Impfstoff gegen RNA-Virus-Infektionen
US7566458B2 (en) 2003-06-16 2009-07-28 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
CA2503774C (en) * 2003-06-20 2007-09-25 Microbix Biosystems Inc. Improvements in virus production
US8541003B2 (en) 2003-06-20 2013-09-24 Protein Sciences Corporation Vectors expressing SARS immunogens, compositions containing such vectors or expression products thereof, methods and assays for making and using
US8992939B2 (en) 2003-07-11 2015-03-31 Novavax, Inc. Highly efficient influenza matrix (M1) proteins
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
US8080255B2 (en) 2003-07-11 2011-12-20 Novavax Inc. Functional influenza virus like particles (VLPs)
US8506967B2 (en) 2003-07-11 2013-08-13 Novavax, Inc. Functional influenza virus like particles (VLPs)
US7527967B2 (en) * 2003-11-25 2009-05-05 Academia Sinica Recombinant baculovirus and virus-like particle
BRPI0507169A (pt) * 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos do hormÈnio de crescimento humano modificados e seu usos
AU2005249450A1 (en) 2004-05-27 2005-12-15 Centocor, Inc. Cynomolgus prostate specific antigen
CA2570563A1 (en) * 2004-06-15 2006-09-28 Centocor, Inc. Method for screening agents against human prostate disease
US7632924B2 (en) * 2004-06-18 2009-12-15 Ambrx, Inc. Antigen-binding polypeptides and their uses
WO2006091231A2 (en) * 2004-07-21 2006-08-31 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
US8420102B2 (en) * 2006-03-07 2013-04-16 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin
BRPI0519430A2 (pt) 2004-12-22 2009-02-10 Ambrx Inc hormânio do crescimento humano modificado
CN103520735B (zh) * 2004-12-22 2015-11-25 Ambrx公司 包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方
EP1836298B1 (en) * 2004-12-22 2012-01-18 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
EP2399893B1 (en) 2004-12-22 2018-08-15 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
EP1836316A4 (en) 2004-12-22 2009-07-22 Ambrx Inc PROCESS FOR EXPRESSION AND CLEANING OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE
EP2374474A1 (en) 2005-01-19 2011-10-12 Vaxinnate Corporation Compositions comprising pathogen-associated molecular patterns and antigens and their use to stimulate an immune response
CN101163494A (zh) * 2005-02-23 2008-04-16 Uab研究基金会 烷基糖苷增强的接种
EP2471552B1 (en) 2005-03-08 2015-05-06 MedImmune, LLC Reassortant influenza viruses
AR054020A1 (es) 2005-03-23 2007-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Nuevo uso
US11865172B2 (en) 2005-04-21 2024-01-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for respiratory disease control in canines
AU2006255122B2 (en) * 2005-06-03 2010-10-21 Ambrx, Inc. Improved human interferon molecules and their uses
US7871626B2 (en) 2005-08-04 2011-01-18 St. Jude Children's Research Hospital Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency
AU2005335491B2 (en) 2005-08-18 2010-11-25 Ambrx, Inc. Compositions of tRNA and uses thereof
CA2623198C (en) 2005-09-22 2014-08-05 Medivas, Llc Bis-(a-amino)-diol-diester-containing poly(ester amide) and poly(ester urethane) compositions and methods of use
JP5178520B2 (ja) * 2005-09-22 2013-04-10 メディバス エルエルシー 固体ポリマー送達組成物およびその使用法
US7468187B2 (en) 2005-10-18 2008-12-23 Iowa State University Research Foundation, Inc. Canine influenza virus and related compositions and methods of use
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
NZ568211A (en) 2005-11-04 2011-11-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Influenza vaccines including combinations of particulate adjuvants and immunopotentiators
CA2628152C (en) * 2005-11-04 2016-02-02 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
CN102755645A (zh) 2005-11-04 2012-10-31 诺华疫苗和诊断有限公司 佐剂配制的包含细胞因子诱导剂的流感疫苗
NZ594482A (en) 2005-11-04 2012-11-30 Novartis Vaccines & Diagnostic Influenza vaccines with reduced amount of oil-in-water emulsion as adjuvant
CN101400646A (zh) * 2005-11-08 2009-04-01 Ambrx公司 用于修饰非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的促进剂
DK2339014T3 (en) * 2005-11-16 2015-07-20 Ambrx Inc Methods and compositions comprising non-natural amino acids
WO2007067744A2 (en) * 2005-12-07 2007-06-14 Medivas, Llc Method for assembling a polymer-biologic delivery composition
WO2007070659A2 (en) * 2005-12-14 2007-06-21 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
PL2478916T3 (pl) 2006-01-27 2020-11-16 Seqirus UK Limited Szczepionki przeciw grypie zawierające hemaglutyninę i białka macierzy
TWI477602B (zh) 2006-02-09 2015-03-21 Educational Foundation Jichi Medical Univ Novel viral vector
US9333249B2 (en) 2006-02-09 2016-05-10 Educational Foundation Jichi Medical University Recombinant baculovirus vaccine
CU23576A1 (es) 2006-02-28 2010-09-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la influenza aviar
CN101448523A (zh) 2006-03-24 2009-06-03 诺华疫苗和诊断有限两合公司 无需冷藏储存流感疫苗
CA2649672C (en) * 2006-05-02 2015-07-07 Medivas, Llc Delivery of ophthalmologic agents to the exterior or interior of the eye
CN102258778B (zh) * 2006-05-05 2014-08-13 淡马锡生命科学研究院有限公司 生物分子表面展示及其用途
WO2007133616A2 (en) * 2006-05-09 2007-11-22 Medivas, Llc Biodegradable water soluble polymers
MX2009000660A (es) 2006-07-17 2009-04-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna de influenza.
GB0614460D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Novartis Ag Vaccines
JP5399906B2 (ja) * 2006-09-08 2014-01-29 アンブルックス，インコーポレイテッド 脊椎動物細胞用のハイブリッドサプレッサーｔｒｎａ
EP2064333B1 (en) * 2006-09-08 2014-02-26 Ambrx, Inc. Suppressor trna transcription in vertebrate cells
CN106008699A (zh) * 2006-09-08 2016-10-12 Ambrx公司 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
US20100105025A1 (en) * 2006-10-12 2010-04-29 Engelhard Eric K Devices for generating detectable polymers
US20080124710A1 (en) * 2006-10-12 2008-05-29 Engelhard Eric K Devices for generating detectable polymers
WO2008118487A2 (en) * 2007-03-26 2008-10-02 University Of Massachusetts Medical School Compositions and methods for incresing immunogenicity of glycoprotein vaccines
CN107501407B (zh) 2007-03-30 2022-03-18 Ambrx公司 经修饰fgf-21多肽和其用途
PE20090146A1 (es) 2007-04-20 2009-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica contra el virus influenza
US8114630B2 (en) 2007-05-02 2012-02-14 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
KR20100045437A (ko) * 2007-06-27 2010-05-03 노파르티스 아게 첨가물이 적은 인플루엔자 백신
WO2009076778A1 (en) 2007-11-27 2009-06-25 Medicago Inc. Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
CA2615372A1 (en) * 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
CA2709412A1 (en) * 2007-07-24 2009-01-29 Medivas, Llc Biodegradable cationic polymer gene transfer compositions and methods of use
MX2010005317A (es) 2007-11-20 2010-06-02 Ambrx Inc Polipeptidos de insulina modificados y sus usos.
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
MX344166B (es) 2008-02-08 2016-12-07 Ambrx Inc Leptina-polipeptidos modificados y sus usos.
AU2009236585B2 (en) 2008-04-18 2013-03-07 Vaxinnate Corporation Deletion mutants of flagellin and methods of use
AU2009267769B2 (en) * 2008-07-08 2015-07-16 Medicago Inc. Soluble recombinant influenza antigens
RU2523587C2 (ru) 2008-07-11 2014-07-20 МЕДИММЬЮН, ЭлЭлСи Варианты гемагглютинина и нейрамидазы вируса гриппа
CN102159230A (zh) 2008-07-23 2011-08-17 Ambrx公司 经修饰的牛g-csf多肽和其用途
WO2010019716A1 (en) * 2008-08-13 2010-02-18 Medivas, Llc Aabb-poly(depsipeptide) biodegradable polymers and methods of use
US8658180B2 (en) 2008-08-15 2014-02-25 Mark A. Miller Vaccines against influenza virus
AU2009296267B2 (en) * 2008-09-26 2013-10-31 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines
BR122012024318A2 (pt) 2008-09-26 2019-07-30 Ambrx, Inc. Polipeptídeos modificados de eritropoetina animal e seus usos
EP3173097A3 (en) 2009-02-10 2017-07-12 Seqirus UK Limited Influenza vaccines with reduced amounts of squalene
USH2283H1 (en) 2009-04-27 2013-09-03 Novartis Ag Vaccines for protecting against influenza
NZ596671A (en) 2009-05-29 2013-06-28 Novartis Ag Assays for influenza virus hemagglutinins
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
GB2471093A (en) * 2009-06-17 2010-12-22 Cilian Ag Viral protein expression in ciliates
HUE039100T2 (hu) 2009-06-24 2018-12-28 Medicago Inc Hemagglutinint tartalmazó kimer influenzavírus-jellegû részecskék
CA2803282C (en) 2009-07-06 2018-05-01 David E. Anderson Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom
JP5854559B2 (ja) 2009-07-06 2016-02-09 ヴァリエーション バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド 小胞を調製する方法及びこれから製造される製剤
US8810417B2 (en) * 2009-08-28 2014-08-19 The Invention Science Fund I, Llc Beverage immersate with detection capability
US9024766B2 (en) * 2009-08-28 2015-05-05 The Invention Science Fund, Llc Beverage containers with detection capability
US20120237536A1 (en) 2009-09-10 2012-09-20 Novartis Combination vaccines against respiratory tract diseases
KR101773431B1 (ko) 2009-09-22 2017-09-12 메디카고 인코포레이티드 식물-유래 ｖｌｐ의 제조방법
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
BR112012015597A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-31 Ambrx Inc peptídeos de somatotropina suínos modificados e seus usos
EP2519636B8 (en) * 2009-12-28 2017-08-09 DSM IP Assets B.V. Production of hemagglutinin-neuraminidase protein in microalgae
CA3028175C (en) * 2009-12-28 2022-05-24 Sanofi Vaccine Technologies, S.A.S. Methods of producing heterologous viral neuraminidase proteins in microalgae
CN102939101A (zh) * 2010-01-26 2013-02-20 科罗拉多大学董事会，法人 用于通用疫苗的流感病毒组合物和方法
US20110305748A1 (en) 2010-03-11 2011-12-15 Immune Design, Corp. Vaccines for Pandemic Influenza
AU2011230619C1 (en) 2010-03-25 2016-06-23 Oregon Health & Science University CMV glycoproteins and recombinant vectors
CA2801151A1 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Novartis Ag Concentration of vaccine antigens with lyophilization
WO2011151723A2 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Novartis Ag Concentration of vaccine antigens without lyophilization
WO2012006367A2 (en) 2010-07-06 2012-01-12 Variation Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for treating influenza
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
EA030886B1 (ru) 2010-08-17 2018-10-31 Амбркс, Инк. Модифицированные полипептиды релаксина, содержащие некодируемую в природе аминокислоту, связанную с полимером, и их применение
WO2012023044A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Novartis Ag Soluble needle arrays for delivery of influenza vaccines
US8513006B2 (en) 2010-09-14 2013-08-20 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Tetravalent influenza vaccine and use thereof
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
CN102023213B (zh) * 2010-09-28 2014-04-02 汕头大学医学院 一种检测流感病毒抗体的荧光微量细胞凝集方法
BR112013018074A2 (pt) 2011-01-13 2020-12-01 Variation Biotechnologies, Inc. métodos para a preparação de vesículas e formulações produzidas a partir dessas
US10736844B2 (en) 2011-01-13 2020-08-11 Variation Biotechnologies Inc. Compositions and methods for treating viral infections
ES2645156T3 (es) 2011-03-21 2017-12-04 Altimmune Inc. Agente terapéutico inmunológico de acción rápida y prolongada
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
HUE037408T2 (hu) 2011-06-10 2018-08-28 Univ Oregon Health & Science CMV glikoproteinek és rekombináns vektorok
US9873765B2 (en) 2011-06-23 2018-01-23 Dsm Ip Assets, B.V. Biodegradable polyesteramide copolymers for drug delivery
ES2992024T3 (es) 2011-06-23 2024-12-05 Dsm Ip Assets Bv Nuevos copolímeros de poliesteramida biodegradables para la administración de fármacos
CA2789539A1 (en) 2011-09-12 2013-03-12 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2768528A1 (en) 2011-10-20 2014-08-27 Novartis AG Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
US20140328876A1 (en) 2011-11-18 2014-11-06 Variation Biotechnologies Inc. Synthetic derivatives of mpl and uses thereof
WO2013088367A1 (en) 2011-12-12 2013-06-20 Novartis Ag Assay for influenza virus hemagglutinins
AU2013208693B2 (en) 2012-01-12 2017-12-07 Variation Biotechnologies Inc. Compositions and methods for treating viral infections
EP2806894A4 (en) 2012-01-27 2015-11-04 Variation Biotechnologies Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR THERAPEUTIC AGENTS
TWI434933B (zh) * 2012-04-17 2014-04-21 Nat Univ Tsing Hua 抗多型禽流感病毒之ｄｎａ疫苗及其組合物
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
US8932598B2 (en) 2012-08-28 2015-01-13 Vaxinnate Corporation Fusion proteins and methods of use
GB201218195D0 (en) 2012-10-10 2012-11-21 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie Composition
JP2015015931A (ja) 2013-07-12 2015-01-29 株式会社Ｕｍｎファーマ ウイルス様粒子を含む培養物の製造方法
JP6479305B2 (ja) 2013-07-12 2019-03-06 株式会社Ｕｍｎファーマ ウイルス様粒子の精製方法
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
CN114805532A (zh) 2014-10-24 2022-07-29 百时美施贵宝公司 修饰的fgf-21多肽及其用途
US10434071B2 (en) 2014-12-18 2019-10-08 Dsm Ip Assets, B.V. Drug delivery system for delivery of acid sensitivity drugs
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
US9931394B2 (en) 2015-03-23 2018-04-03 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
CA3001725C (en) * 2015-05-04 2021-06-15 Epivax, Inc. Modified h7 hemaglutinin glycoprotein of the influenza a/shanghai/2/2013 h7 sequence
US11013795B2 (en) 2015-06-26 2021-05-25 Seqirus UK Limited Antigenically matched influenza vaccines
KR102790570B1 (ko) * 2015-07-07 2025-04-04 세퀴러스 유케이 리미티드 인플루엔자 효능 검정
CA2996007A1 (en) 2015-09-03 2017-03-09 Novavax, Inc. Vaccine compositions having improved stability and immunogenicity
BR112018014109A2 (en) 2016-01-11 2018-12-11 Verndari, Inc. microneedle compositions and methods of using them
US10063211B2 (en) 2016-02-03 2018-08-28 Qualcomm Incorporated Compact bypass and decoupling structure for millimeter-wave circuits
CN106749554B (zh) * 2017-01-20 2021-01-15 中山大学 一种流感病毒血凝素蛋白的纯化方法
PE20191716A1 (es) 2017-02-08 2019-12-05 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos de relaxina modificada que comprenden un mejorador farmacocinetico y sus usos
US10874737B2 (en) 2018-06-01 2020-12-29 Iowa State University Research Foundation, Inc. Influenza nanovaccine
CA3160955A1 (en) 2019-11-12 2021-05-20 Dsm Ip Assets B.V. Polyesteramide copolymers possessing high glass transition temperatures
MX2023002356A (es) 2020-08-24 2023-03-22 Sanofi Pasteur Inc Vacunas contra la covid-19 con coadyuvantes en emulsion de escualeno que contiene tocoferol.
US20240016918A1 (en) 2020-08-24 2024-01-18 Sanofi Pasteur Inc. Vaccines against sars-cov-2 infections
AU2022361432A1 (en) 2021-10-08 2024-05-23 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent influenza vaccines
AU2022379948A1 (en) 2021-11-05 2024-06-20 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent influenza vaccines comprising recombinant hemagglutinin and neuraminidase and methods of using the same
WO2023079113A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Hybrid multivalent influenza vaccines comprising hemagglutinin and neuraminidase and methods of using the same
EP4565604A2 (en) 2022-08-01 2025-06-11 Flagship Pioneering Innovations VII, LLC Immunomodulatory proteins and related methods
US20240228620A1 (en) 2022-10-06 2024-07-11 Bicara Therapeutics Inc. Multispecific proteins and related methods
WO2024151583A2 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
WO2024167885A1 (en) 2023-02-06 2024-08-15 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory compositions and related methods
WO2024167880A1 (en) 2023-02-06 2024-08-15 Bicara Therapeutics Inc. Combination therapy and related methods
WO2024258829A1 (en) 2023-06-12 2024-12-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2025006419A1 (en) 2023-06-26 2025-01-02 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Engineered plasmodia and related methods
AU2024299328A1 (en) 2023-07-21 2026-01-22 Marrow Therapeutics, Inc. Hematopoietic cell targeting conjugates and related methods
KR20260044217A (ko) 2023-07-25 2026-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 Vii, 엘엘씨 Cas 엔도뉴클레아제 및 관련 방법
WO2025024493A1 (en) 2023-07-25 2025-01-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas endonucleases and related methods
CN116763915B (zh) * 2023-08-17 2023-11-03 山东兴瑞生物科技有限公司 一种用于治疗和预防流感病毒的多价疫苗
WO2025054236A2 (en) 2023-09-06 2025-03-13 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Sars-cov-2 vaccine compositions and related methods
WO2025072331A1 (en) 2023-09-26 2025-04-03 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas nucleases and related methods
WO2025117877A2 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Cas nucleases and related methods
WO2025129034A2 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025129001A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128936A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128954A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128943A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128953A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
WO2025128934A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Esterases and related methods
TW202545974A (zh) 2024-01-26 2025-12-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 免疫受體抑制蛋白及相關方法
US20250353881A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor inhibitory proteins and related methods
WO2025245111A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor targeting proteins and related methods

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4029763A (en) * 1974-08-05 1977-06-14 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Influenza vaccine containing purified neuraminidase antigen and method of using the same
IN150740B (cs) * 1978-11-24 1982-12-04 Hoffmann La Roche
US4659669A (en) * 1981-03-02 1987-04-21 Regents Of The Univ. Of California Microbial expression of human influenza hemagglutinin proteins
US4752473A (en) * 1984-10-12 1988-06-21 The Regents Of The University Of California Expression of glycosylated human influenza hemagglutinin proteins
US4920213A (en) * 1985-06-20 1990-04-24 Biotechnology Research Partners, Ltd. Method and compositions useful in preventing equine influenza
JPH02502876A (ja) * 1987-03-16 1990-09-13 アメリカン　バイオジェネティック　サイエンシズ　インク ワクチンと生物学的殺虫剤における組換えバクロウイルス閉塞体
GB9106185D0 (en) * 1991-03-22 1991-05-08 Wellcome Found Biological control agents
CA2084180A1 (en) * 1991-12-11 1993-06-12 Paul P. Hung Expression of specific immunogens using viral antigens
WO1995032286A2 (en) * 1994-05-20 1995-11-30 Microgenesys, Inc. Immunogenic carcinoembryonic antigen and methods of use and production

Also Published As

Publication number Publication date
CN1194005A (zh) 1998-09-23
DK0833933T3 (da) 2005-10-10
JP2000513922A (ja) 2000-10-24
US5762939A (en) 1998-06-09
NZ288026A (en) 1999-11-29
FI974319A7 (fi) 1998-01-22
HK1083867A1 (en) 2006-07-14
DK1275726T3 (da) 2008-06-23
US5858368A (en) 1999-01-12
DE69534449T2 (de) 2006-07-06
ATE304602T1 (de) 2005-09-15
HUT77921A (hu) 1998-10-28
EP1605052A2 (en) 2005-12-14
SK158897A3 (en) 1999-06-11
JP3757318B2 (ja) 2006-03-22
EP0833933B1 (en) 2005-09-14
LT4461B (lt) 1999-02-25
AU712776B2 (en) 1999-11-18
CZ301021B6 (cs) 2009-10-14
NO975434D0 (no) 1997-11-26
BR9510590A (pt) 1999-11-30
DK1605052T3 (da) 2011-11-07
CZ299862B6 (cs) 2008-12-17
ES2248799T3 (es) 2006-03-16
WO1996037624A1 (en) 1996-11-28
AU2692595A (en) 1996-12-11
CA2222129C (en) 2010-04-27
IS4620A (is) 1997-11-25
DE69534449D1 (de) 2006-01-26
ATE518000T1 (de) 2011-08-15
EP0833933A1 (en) 1998-04-08
EP1605052B1 (en) 2011-07-27
SK286441B6 (sk) 2008-10-07
EP1605052A3 (en) 2008-08-13
NO975434L (no) 1998-01-19
PT1605052E (pt) 2011-10-19
LT97201A (en) 1998-09-25
FI974319A0 (fi) 1997-11-25
CA2222129A1 (en) 1996-11-28
CN100390289C (zh) 2008-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ373897A3 (cs) Způsob výroby hemaglutininových multivalentních vakcín proti chřipce
US6245532B1 (en) Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
KR101153929B1 (ko) 기능성 인플루엔자 바이러스 유사입자
US9180180B2 (en) Functional influenza virus-like particles (VLPs)
US10544399B2 (en) Highly efficient influenza matrix (M1) proteins
US8506967B2 (en) Functional influenza virus like particles (VLPs)
EP1275726B1 (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
EP2374894B1 (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
CN101353375A (zh) 生产流感血凝素多价疫苗的方法
AU733191B2 (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
HK1083867B (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines
BRPI9510590B1 (pt) composição compreendendo proteína de hemaglutina hao gripal recombinante
HK1017711B (en) A method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20150526