DD248145A1

DD248145A1 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von sterolabbauprodukten

Info

Publication number: DD248145A1
Application number: DD26643284A
Authority: DD
Inventors: Peter Atrat; Volker Deppmeyer; Elke Hueller; Claere Hoerold; Heidrun Naumann; Peter Hoesel; Lutz Blei; Birgit Gottschaldt; Karl-Heinz Boehme; Beate Sczekalla; Bernd Koch; Werner Beithan
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1984-08-20
Filing date: 1984-08-20
Publication date: 1987-07-29
Also published as: DD248145B3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Sterolabbauprodukten, insbesondere der Androstanderivate 9a-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion, Androst-4-en-3,17-dion und Androst-1,4-dien-3,17-dion durch Transformation von Sterolen bzw. Sterolgemischen, vorzugsweise durch Mikroorganismen aus der Gattung Mycobacterium. Dabei erfolgt durch spezielle Polyaethylenoxid-Polypropylenoxid-Blockkopolymere bzw. -Addukte eine Erhoehung der Produktausbeute. Die in der Erfindung beschriebene Wirkung der verwendeten Tenside wird dabei erreicht durch Komplexe aus Sterolsubstrat und Tensid oder durch Zugabe des Tensids zu Fermentationsansaetzen, die das Sterol als Standardpraeparation enthalten, oder durch Behandlung der Mikroorganismen mit dem Tensid in der Wachstumsphase vor der Substratgabe oder durch Tensidbehandlung der freien Zellen in Pufferloesung.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Sterolabbauprodukten aus Sterolen bzw. aus Sterolgemischen, speziell der für die Partialsynthese von Steroidpharmaka wichtigen Ausgangsprodukte der Androstanreihe. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der pharmazeutischen und unter Umständen.in Teilbereichen der mikrobiologischen Industrie-allgemein. . - -

-2- 248 145 Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß Sterole zu einer Vielzahl von partialsynthetisch verwertbaren Produkten mikrobiell abgebaut werden können (K.Kieslich: „Steroid conversion" in: A.H.Rose (Ed.) Microbial enzymes and bioconversion. Economic Microbiolgy, 5 [1980], 37CM167, Academic press, London, New York, Toronto, Sydnay, San Francisco).

Es ist bekannt, daß die mikrobielle Transformation von Sterolen bzw. allgemein von Steroiden aufgrund der hydrophoben Eigenschaften dieser Substanzklasse mit zahlreichen Problemen verbunden ist, die oft die Ursache für schlechte Umsatzraten darstellen (siehe wiederum K.Kieslich, a.a.O.).

Es hat nicht an Versuchen gefehlt, durch spezifische technische Lösungen, so durch gezielte Zusätze zum Fermentationsansatz, z. B. die Substratverfügbarkeit (Wie Benetzbarkeit, Verteilung oder Solubilisierung), den Stoffübergang oder die Schaumregulierung zu beeinflussen und damit die Gesamtumsatzraten bzw. die Produktausbeuten zu erhöhen. Nichtionischen Tensiden kommt hierbei seit langem eine besondere Bedeutung zu. So sind für die mikrobielle Transformation von Steroiden, insbesondere von Sterolen, vorwiegend folgende nichtionische Tensidklassen im Gebrauch: Polyäthylenoxidaddukte von Sorbitanfettsäureestern; Sorbitanfettsäureester; partielle Fettsäureester des Glycerols, desÄthylenglycols, des 1,2-Propandiols usw.; Polyäthylenoxidaddukte von Glycerolfettsäureestern; spezielle Polyäthylenoxidaddukte von Polyolfettsäureestern sowie Polyäthylenglykoläther langkettiger aliphatischer Alkohole. In diesem Zusammenhang sei auf die Patentschriften DD 139859 bzw. DE-OS 2757156 verwiesen. Die Anwendung von Glyceriden sowie allgemein von pflanzlichen und tierischen Fetten wird in DE-OS 2625333 bzw. EP 0001622 beschrieben. Der positive Effekt der genannten Tenside wird in der Literaturfast ausschließlich auf die verbesserte Benetzbarkeit des Steroidsubstrates zurückgeführt. Andererseits wurde am Beispiel der mikrowellen Transformation von /3-Sitosterol zu Ring-B-Secoverbindungen in Gegenwart von Polyäthylenoxid-Polypropylenoxid-Kopolymeren gezeigt, daß nichtionische Tenside die Fermentation auch negativ beeinflussen können (Schömer, U. und Wagner, F., European J. Appl. Microbioi. Biotechnol. 10,99-106 [1980]).

Nachteilig ist ferner, daß für spürbare Steigerungen in den Transformationsraten Tensidkonzentrationen verwendet werden, die über 1 g/l, in einigen Fällen sogar über 5g/l liegen. Sowohl hohe Tensidkonzentrationen als auch hohe Konzentrationen an Glyceriden bzw. auch an ölhaltigen Rückständen pflanzlichen und tierischen Ursprungs beeinträchtigen in der Regel die Aufarbeitung der Fermentationsansätze, insbesondere die Extraktion und Reinigung der Umwandlungsprodukte.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die mikrobielle Herstellung von Sterolabbauprodukten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren für die Herstellung von Sterolabbauprodukten, isnbesondere von 9a-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion (9-OH-AD), Androst-4-en-3,17-dion (AD) und Androst-1,4-dien-3,17-dion (ADD) durch mikrowellen Abbau von Sterolen anzugeben, das die Nachteile der bisher bekannten Lösungen vermeidet. Es wurde überraschend gefunden, daß bei der mikrowellen Transformation von Sterolen wie Sitosterol oder Campesterol oder Stigmasterol oder Cholesterol oder Ergosterol bzw. von Sterolgemischen zu Androstanderivaten deutlich erhöhte Substratumsatzraten und verbesserte Produktausbeuten auftreten, wenn spezielle Tenside oder Tensidgemische vom Typ Polyäthylenoxid-Polypropylenoxid-Blockkopolymeren (PEO-PPO-Blockkopolymere) zum Einsatz gebracht werden. Dieser Effekt ist insofern überraschend, da für die genannte Tensidklasse am Beispiel des mikrowellen Abbaus von ^-Sitosterol zu Ring-B-Secoverbindungen ja eine Hemmung des Prozesses bekannt ist

Das Wesen des Verfahrens,

welches sich in seinem technologischen Teil aus an sich bekannten Verfahrensschritten zusammensetzt, wobei üblicherweise für Fermentationen einsetzbare Apparaturen wie Schüttelkolben, Fermentoren im Labor-, Pilot- und Produktionsmaßstab zur Anwendung kommen

und wobei zur mikrobiologischen Transformation als Mikroorganismen ein Vertreter aus für diesen Einsatzzweck bekannten, gut geeigneten Gattungen wie Mycobacterium bzw. Nocardia eingesetzt wird,

besteht darin, daß die Vermentation in Gegenwart von Polyäthylenoxid-Polypropylenoxid-Kopolyeren der Strukturen I oder Il (vgl. Abbildung) in einer Konzentration von 1 % bis 50%, vorzugsweise 10%, in bezug auf das in den Fermentationsansatz eingetragene Sterolsubstrat durchgeführt wird, wobei es für das erfindungsgemäße Verfahren ohne Belang ist, ob die genannten nichtionischen Tenside oder Tensidgemische der Vorkultur und/oder der Fermentation gemeinsam mit dem Sterol oder von diesem getrennt zugeführt werden oder ob mit diesen die separat angezüchtete Biomasse nach dem Abtrennen in Puffer behandelt und danach für die Umwandlung des Sterolsubstrates in Puffer mit oder ohne weiteren Tensidzusatz verwendet wird

Abbildung: Polyäthylenoxid-Polypropylenoxid-Kopolymere

Sturkturl:

O-CH-CH^^-f 0-CM₂-CUj-OH

CH,

mit m = · 0-40, vorzugsweise 5-20 η =15-60, vorzugsweise 25—40 und ο —= 0-40, vorzugsweise 5-20.

Struktur II:

CH₃ CH₃

Hr-B_x-Ay-fO-CHjr CH-^ |-f CH-CH^-O·)- Ay-B_x-H

N- R-N

Hr B_x- Ay-f O-CHj- CH^I Lf CH-CH₂-Of A_y-B_x-H

I 2>

^ oder sowie A, B ^H₂-CH₂ O-oder

*-CH₂-CH₂-N-CH₂-CH₂ -CH-CH₂-O-

HX-CH C

2>

X 2> ,

I O

mit χ = 0-20 y = 0-15 ζ = 1-15.

Hinsichtlich der Verwendung derTenside obiger Kennzeichnung weist das Verfahren damit folgende Varianten auf:

Variante A

Zum Zwecke der mikrowellen Umwandlung werden aus Sterolsubstrat und Tensiden oder Tensidgemischen obiger Kennzeichnung Sterol-Tensid-Präparationen entweder in an sich bekannter Weise (Naßvermahlung, Homogenisierung, Lyophilisierung) oder durch gemeinsames Eindüsen in die Gasphase hergestellt, indem der Anteil der Tenside bzw. der Tensidgemische 1 % bis 50%, vorzugsweise 10%, in bezug auf das Sterol beträgt, und diese in einer Konzentration von 1 g/l bis 50g/l, vorzugsweise 10 g/l, bei einem pH-Wert von 6 bis pH 8, vorzugsweise pH 7 und einer Temperatur von 26°C bis 35°C, vorzugsweise 28°C, in einem Nährmedium, welches eine Kohlenstoff- sowie eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, während eines Zeitraumes von 2 Tagen bis 6 Tagen zu Sterolabbauprodukten, insbesondere zu Androstanderivaten, vorzugsweise zu 9a-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion (9-OH-AD), Androst-4-en-3,17-dion (AD) oder Androst-1,4-dien-3,17-dion (ADD), fermentiert.

Variante B

Ein ansonsten komplettes Nährmedium, welches 1 g/l bis 50g/l, vorzugsweise 10g/l, einer Sterol-Standardpräparation enthält, wobei unter Sterol-Standardpräparation neben dem in der Verfahrensvariante A gekennzeichneten Material alternativ auch ein mikronisiertes Sterol verstanden wird, das lediglich zum Zwecke der verbesserten Benetzbarkeit in wäßrigen Medien in geringen Konzentrationen, die unter 0,5g/l liegen, ein Netzmittel enthalten kann, wird mit einem Tensid obiger Kennzeichnung in einer Konzentration von 0,1 g/l bis 25g/l, vorzugsweise 1 g/l, versetzt, sterilisiert und der Fermendation des Sterolsubstrates zu Androstanderivaten wie 9-OH-AD, AD oder ADD zugeführt.

Variante C

Der für die Fermentation jeweils einzusetzende Mikroorganismenstamm wird zunächst im kompletten Nährmedium in Gegenwart eines Tensids bzw. Tensidgemisches obiger Kennzeichnung, welches in einer Konzentration von 0,1 g/l bis 25g/l, vorzugsweise 1 g/l, vorliegt, angezüchtet und nach 12 Stunden bis 36 Stunden, vorzugsweise 24 Stunden, mit einer Sterol-Standardpräparation in einer Konzentration von 1 g/l bis 50 g/l, vorzugsweise 10 g/l, versetzt und die eigentliche Transformation durchgeführt oder ein komplettes Nährmedium, welches das Sterol in der angegebenen Konzentration enthält, wird mit dieser Mikroorganismenkultur im Verhältnis 1:5 beimpft und die Transformation des Sterolsubstrates zu Androstanderivaten in einem Zeitraum von 2 Tagen bis 6 Tagen zu Ende geführt. -

Variante D

Der für die Transformation von Steroien geeignete Mikroorganismenstamm obiger Kennzeichnung wird in einem kompletten Nährmedium, ggf. in Gegenwart von 0,2 g/l bis 0,5g/l Sterolsubstrat angezüchtet, vom Nährmedium abgetrennt, mitTensiden obiger Kennzeichnung in einer Konzentration von 0,1 g/l bis 25g/l, vorzugsweise 2 g/l, in Phosphatpuffer, pH 7, bei 26°C bis 35°C, vorzugsweise 28°C, über einen Ze.itraum von 0,5 Stunden bis 10 Stunden, vorzugsweise 2 Stunden, inkubiert, danach von dieser Tensid-Puffer-Mischung abgetrennt, wiederum auf Phosphatpuffer, pH7, der nunmehr eine Sterol-Standardpräparation in einer Konzentration von 0,1 g/l bis 50g/l, vorzugsweise 10g/l, enthält, gesetzt und bei 26°C bis 28°C über einen Zeitraum von 2 Tagen bis 6 Tagen, wie in Variante B und C beschrieben, zur Umwandlung des Sterolsubstrates zu Androstanderivaten eingesetzt.

Die Aufarbeitung der Kulturlösung erfolgt in an sich bekannter Weise, z. B. durch Extraktion und Kristallisation.

Gegenüber den bekannten Verfahren bestehen die Vorteile der vorliegenden Lösung darin, daß deutlich höhere Umsatzraten erzielt werden, d. h. es treten drastische Verkürzungen der Fermentationszeit ein.

Es hat sich gezeigt, daß die chemische Aufarbeitung durch die definierten Tenside obiger Kennzeichnung im Gegensatz zu den bekannten Verfahren, die mit Fermentationshilfsstoffen pflanzlichen oder tierischen Ursprungs arbeiten, nicht beeinträchtigt

Ein weiterer Vorteil ist in der hohen Wirksamkeit der Tenside zu sehen: In der Regel wird in den bisher bekannten Verfahren mit Tensiden gearbeitet, die in einer 10fach höheren Konzentration angewendet werden müssen, um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Damit erhöht sich die Ökonomie der Einsatzstoffe wesentlich.

Ausführungsbeispiele

Anhand einiger Ausführungsbeispiele soll das Verfahren näher erläutert werden:

Beispiel 1: (Variante A)

1,5kg eines Sterolgemisches, bestehend aus 90% Sitosterol und 10% Campesterol, werden unter Hinzufügen von 150g eines Tensids der Struktur I mit einem Gesamtgehalt von 30% Polyäthylenoxid und einem Molekulargewicht von 2790 in 151 Benzol unter Erwärmen gelöst, schnell abgekühlt auf —40⁰C und lyophilisiert. Das entstehende Produkt wird, wie in den Beispielen ab Nr.7 beschrieben, in 1001 Nährmedium eingerührt, sterilisiert und zur Fermentation eingesetzt.

Beispiel 2: (Variante A)

1 kg eines Sterolgemisches, bestehend aus 55% Sitosterol, 6% Campesterol und 39% Stigmasterol werden bei ca. 30°C unter Hinzufügen von 0,1 kg eines PEO-PPO-Blockkopolymeren der Struktur I mit einem Gesamtgehait von 27% Polyäthylenoxid und einem Molekulargewicht von 1 730 in 5 kg Chloroform gelöst und die entstehende Lösung über eine G 2-Frittefiltriert. Die Lösung wird in einem üblichen Sprühtrockner verdüst. Das entstehende feinverteilte Produkt wird, wie in den Beispielen ab Nr.7 beschrieben, ii\67l Nährlösung eingerührt, sterilisiert und für die Fermentation zum Einsatz gebracht.

Beispiel 3: (Variante A)

1 kg /8-Sitosterol werden in Gegenwart von 0,1 kg eines PEO-PPO-Blockkopolyeren der Struktur I zu einem Produkt mit Partikelgrößen νοη4μ.ιη bis 10μηη mikronisiert und mit der Kulturlösung mit einem Gesamtgehalt von 14% PEO (Molekulargewicht des Kopolymeren 1 650) angeteigt und auf 1001 mit Nährlösung gemäß Beispiel Nr.7 verdünnt, sterilisiert und zum Einsatz gebracht.

Beispiel 4: (Variante A)

1 kg /3-Sitosterol werden in Gegenwart von 0,1 kg eines PEO-PPO-Blockkopolymeren der Struktur I mit einem Molekulargewicht von 2251 und einem Gesamtgehalt von 20% PEO naß gemahlen und gemeinsam mit dem Fermentationsmedium nach Beispiel Nr.7 sterilisiert und zum Einsatz gebracht.

Beispiel 5: (Variante A)

1,5 kg 0-Sitosterol werden in 3,01 Dimethylformamid in der Hitze gelöst, mit 150g eines nichtionischen Tensids der Struktur Il mit χ = 20, y = 2, ζ = 2 (Molekulargewicht 700) versetzt und in 101 heißes Wasser eingerührt, abzentrifugiert und das Sediment im Nährmedium gemäß Beispiel Nr.7 resuspendiert, sterilisiert und zum Einsatz gebracht.

Beispiel 6: (Variante A)

1 kg des nach Beispiel 1 bezeichneten Sterolgemisches werden mit 0,1 g eines PEO-PPO-Blockkopolymeren der Struktur I mit dem Molekulargewicht von 3100 und einem Gesamtgehalt von 58% PEO in Gegenwart von 31 0,1 M Phosphatpuffer pH 7 (nach Sorensen) mit Hilfe eines leistungsfähigen Homogenisators gemeinsam verteilt. Die entstandene Suspension wird ins Nährmedium nach Beispiel Nr. 7 verteilt, sterilisiert und zur Fermentation gebracht.

Beispiel 7: (Variante A)

3 Tage alte Schrägagarkulturen von Mycobacterium fortuitum ZIMET 10851 werden zum Beimpfen von 500ml Standkolben mit je 50 ml einer Nährlösung, bestehend aus Hefeextrakt 10g, Glycerol 10g, KH₂PO₄ 0,5g, K₂HPO₄ 0,5g, (NH₄I₂HPO₄ 1,5g, MgSO₄ · 7H₂O 0,2g, angefüllt mit Aqua dest. auf 1 Liter, verwendet. Die Kulturen werden bei 28°C 24 Stunden auf dem Rundschwingtisch inkubiert. Danach werden 2,51-lmpfflaschen mit je 400ml der oben angegebenen Nährlösung mit dieser ersten Vorkultur beimpft und 24 Stunden bei 28⁰C auf dem Rundschwingtisch inkubiert. Der Inhalt von je 4 Impfflaschen dient dann zum Beimpfen von 151 Nährlösung in einem 301-Kleinfermentor mit Rührer (500U/min) unter Belüftung (151/min). Ein 2501-Tank mit dergleichen Nährlösung, die 2,25 kg einer Sterolpräparation nach Beispiel 1 enthält, wird mit 2mal 151 dieser Impfkultur beimpft, so daß ein Endvolumen von 1501 vorliegt. Der Tank wird bei 30⁰C mit 301 Luft/min gefahren. Nach 3 Tagen wird die Fermentation abgebrochen und das Produkt 9-OH-AD mit einer Gesamtausbeute von 500g in an sich bekannter Weise aufgearbeitet.

Beispiele: (VarianteA)

Mycobacterium fortuitum ZIMET 10850 wird unter den im Beispiel 7 genannten Bedingungen kultiviert. Im 2501-Tank werden 2,25kg (Trockengewicht) der im Beispiel 5 bezeichneten Sitosterolpräparation in 1501 Nährmedium fermentiert. Die nach 72 Stunden in bekannter Weise erfolgte Aufarbeitung ergibt eine Gesamtausbeute von 525g 9-OH-AD.

Beispiel 9: (Variante A)

Zwanzig 500ml-Standkolben mit je 50 ml einer Nährlösung, bestehend aus Caseinhydrolysat7,5g, Glucose 5,0 g, Lactose 15 g, (NH₄J₂HPO₄ 3g, MgSO₄ · 7H₂O 0,02 g, FeSO₄ · 7H₂O 0,01 g und ZnSO₄ · 7H₂O 0,02 g, werden mit je 500 mg einer nach Beispiel 2 hergestellten Sitosterolpräparation versetzt. Nach dem Sterilisieren wird mit je 5 ml einer 48 Stunden alten Vorkultur M. fortuitum ZIMET 10849 beimpft. Nach 96 Stunden wird das Fermentationsprodukt 9-OH-AD in bekannter Weise isoliert. Ausbeute 3,0g 9-OH-AD.

Beispiel 10: (Variante C)

50ml einer Nährlösung, bestehend aus den im Beispiel 7 angegebenen Komponenten sowie 50mg des im Beispiel 5 bezeichneten nichtionischen Tensids werden mit einer 3 Tage alten Schrägkultur von M. fortuitum ZIMET 10851 und 48 Stunden bei 28⁰C auf dem Rundschwingtisch inkubiert. Danach werden mit je 5 ml dieser so behandelten Vorkultur zwanzig 500 ml Standkolben, die jeweils 50ml derim Beispiel 7 angegebenen Nährlösung sowie 500mg einer nach Beispiel 7 angegebenen Sitosterolstandardpräparation enthalten, beimpft. Die Aufarbeitung des Fermentationsansatzes nach 72 Stunden ergibt 4g 9-OH-AD. ^:

Beispiel 11: (Variante C)

Unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 10 angegeben, kommt das im Beispiel 1 bezeichnete nichtionische Tensid zum Einsatz. Nach der Aufarbeitung werden 3,7 g 9-OH-AD erhalten.

Beispiel 12: (Variante D)

Zwanzig 500ml-Rundkolben mit je 50 ml derim Beispiel 7 angegebenen Nährlösung werden mit je 10 ml einer 2 Tage alten Vorkultur von Mycobacterium fortuitum ZIMET 10851 beimpft und 24 Stunden bei 28⁰C auf dem Rundschwingtisch inkubiert. Danach werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, mit Vis-Phosphatpuffer gewaschen und je 2g Feuchtzellen in 50 ml des gleichen Puffers, der 1,0% des in Beispiel 5 angegebenen nichtionischen Tensids enthält, resuspendiert. Nach 2 Stunden bis

4 Stunden Inkubation auf dem Rundschwingtisch bei 28°C werden die Zellen (je 2g) von der wäßrigen Phase abgetrennt und mit je 50 ml Puffer, der 500 mg der in Beispiel 1 angegebenen Situsterolpräparation enthält, zur Fermentation gebracht. Nach 4 Tagen wird das Produkt 9-OH-AD in bekannter Weise mit einer Ausbeute von 4,5g aufgearbeitet.

Beispiel 13: (Variante D)

Zwanzig Rundkolben mit je 50 ml Nährlösung nach Beispiel 12, welche zusätzlich 10 mg Sitosterol enthalten, werden in beschriebener Weise mit M. fortuitum ZIMET 10851 beimpft und kultiviert. Die geernteten Zellen werden wie in Beispiel 12 mit Tensid behandelt und für die Fermentation eingesetzt. Aus 10g Sitosterolpräparation werden in 4 Tagen Transformation in Puffer 4,5g 9-OH-AD erhalten.

Beispiel 14: (Variante B) .

Zwanzig 500ml-Rundkolben mit je 50ml einer in Beispiel 7 angegebenen Nährlösung, die 500mg einer Sitosterolstandardpräparation enthält, werden mit je 50 mg des im Ausführungsbeispiel 1 angegebenen Tensids versetzt und nach dem Sterilisieren mit je 5 ml einer 48 Stunden alten Vorkultur M. fortuitum ZIMET 10851 beimpft. Kulturführung und Aufarbeitung erfolgen in an sich bekannter Weise. Aus 10g Sitosterol werden 4,0g 9-OH-AD erhalten.

Claims

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Sterolabbauprodukten aus Sterolen, insbesondere der Androstanderivate 9a-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion, Androst-4-en-3,17-dion und Androsta-1,4-dien-3,17-dion, gekennzeichnet dadurch, daß die mikrobielle Umwandlung des Sterols bzw. Sterolgemisches, welches in einer Konzentration von 1 g/l bis 50g/l vorliegt, in Gegenwart von 0,5g/l bis 25g/l eines Polyäthylenoxid-Polypropylenoxid-Blockkopolymeren der Struktur I (siehe Abbildung), welches einen Anteil von 30% bis 70% Polypropylenglykol enthält und ein Molekulargewicht von 1000 bis 3500 besitzt, oder in Gegenwart eines Polyäthylenoxid-Polypropylenoxid-Adduktes der Struktur Il (siehe Abbildung) erfolgt und die Fermentation bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8 bei Temperaturen von 26°C bis 35⁰C während eines Zeitraumes von 2 Tagen bis 6 Tagen in Puffer oder in einem kompletten Nährmedium durchgeführt wird und die als Sterolabbau-Produkte anfallenden Androstanderivate in an sich bekannter Weise extrahiert und isoliert werden.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die mikrobielle Transformation des Sterolsubstrats erfolgt, indem

— ein ansonsten komplettes Nährmedium miteinem Komplex aus dem Sterol bzw. Sterolgemisch und einem Tensid obiger Kennzeichnung versetzt, sterilisiert und der Fermentation zugeführt wird, oder daß

— ein ansonsten komplettes Nährmedium zunächst mit einer Standardpräparation des Sterol-Substrats und anschließend mit dem Tensid versetzt, sterilisiert und der Fermentation zugeführt wird, oder daß

— die jeweils eingesetzten Mikroorganismen zunächst in einem kompletten Nährmedium in Gegenwart eines Tensids obiger Kennzeichnung angezüchtet und nach 12 Stunden bis 36 Stunden mit einer Präparation des zu transformierenden Sterolsubstrats versetzt und die Fermentation unter den genannten Bedingungen zu Ende geführt wird, oder daß

— die jeweils eingesetzten Mikroorganismen nach dem Wachstum in Gegenwart eines Tensids obiger Kennzeichnung zur Beimpfung eines Fermentationsmediums, welches das zu transformierende Sterol oder Sterolgemisch enthält, verwendet und die Fermentation durchgeführt wird, oder daß

— die jeweils eingesetzten Mikroorganismen zunächstin einem kompletten Nährmedium, welches zum Zwecke der Enzyminduktion 0,2g/l bis 0,5g/l Sitosterol bzw. Sterolgemisch enthalten kann, über einen Zeitraum von 24 Stunden angezüchtet, vom Nährmedium abgetrennt, mit einem Tensid obiger Kennzeichnung in einer Konzentration von 0,1 g/l bis 2,5g/! in Phosphatpuffer, pH7, bei einer Temperatur von 26°C bis 35°C über einen Zeitraum von 0,5 Stunden bis 10 Stunden inkubiert, danach abgetrennt und nunmehr für die Umwandlung einer Sterol-Präparation in Phosphatpuffer, pH 7, verwendet werden.

3. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnetdadurch, daß einTensid-Sterol-Komplexzum Einsatz gelangt, welcher dadurch gebildet wird, daß Sterol und Tensid gemeinsam mechanisch behandelt z. B. durch Naßmahlung oder Homogenisieren, aus organischen Lösungsmitteln versprüht, lyophilisiert oder aus der Lösung in einem organischen Lösungsmittel in wäßrigen Systemen zur Fällung gebracht werden.

4. Verfahren nach Punkt 1 bis3, gekennzeichnet dadurch, daß zur Fermentation Mikroorganismen aus der Gattung Mycobacterium mit der Fähigkeit zur Produktanreicherung beim Sterolabbau verwendet werden.

5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß als Sterole Sitosterol oderCampesterol oder Stigmasterol oder Cholesterol oder Ergosterol bzw. als Sterolgemische, vorzugsweise Sitosterol-Campesterol-Gemische verwendet werden.

6. Verfahren nach Punkt 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß als Pufferlösungen 0,01 molare bis 0,1 molare Phosphatpuffer eingesetzt werden.