JPS6024720B2 - 微生物によるアンドロスタン系化合物の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるアンドロスタン系化合物の製造方
法に関するものである。

詳しくは、突然変異株の微生物によるアンドロスタン系
化合物の製造方法に関するものである。ミコバクテリウ
ム（Ｍｙｃｏｂａｃ企ｒｉｍｍ）（以下「Ｍ．」と略記
する）属に属する微生物を用いてアンドロスタン系化合
物を製造する方法は既に知られている。

その１つの方法は、キレート剤またはニッケル、コバル
トなどの阻害剤を用いる方法で、例えば侍公昭４３一２
４９０８号公報、同４６一１７９５１号公報などに記載
されている。また、もう１つの方法は突然変異株を用い
る方法で、米国特許第３，６８４，６５７号および同３
，７５９，７９１号各明細書ならびに持開昭５２−１０
５２８計号公報などに記載されている。本発明者等は、
アンドロスタン系化合物を多量蓄積する新規な製造方法
を関発すべ〈鋭意研究を進めた結界、Ｍ．属に属する微
生物で、既知の方法の微生物とは異なる種の突然変異株
を用いればよいことを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明の要旨はステロール類を基質にして
Ｍ．パラフオーツイタムコンプレツクス（ｐａｒａｂｒ
ｔｕｉｔｕｍｃｏｍｐｌｅｘ）に属する突然変異株を培
養することを特徴とするアンドロスタン系化合物の製造
方法に存する。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明方法で使用される微生物は、Ｍ．パラフオーッィ
タムコンプレツクスに属する突然変異株である。

従来知られているＭ．／ぐラフオーツィタムコソプレッ
クスに属する微生物（以下「野生株」という）は、アン
ドロスタン系化合物の分解酵素を有していて、キレート
剤またはニッケル、コバルトなどの阻害剤の存在下など
の特殊な条件下ではアンドロスター１，４ージエンー３
，１７ージオン（以下「ＡＤＤ」と略記する）、アンド
ロストー４−ェンー３，１７−ジオン（以下「必血」と
略記する）や１７８−ヒドロキシアンドロス夕−１，４
ージエンー３−オン（＝１−デヒドロテストステロン）
（以下「ＤＨＴ」と略記する）などのアンドロスタン系
化合物を生成するが、通常の培養を行ったのではァンド
ロスタン系化合物の生成はみられなｔ、。

従って、本発明で用いられる突然変異株は、野生株の有
するアンドロスタン系化合物の分解酵素の何れかが欠失
または低活性化したものであり、このような突然変異株
は、キレート剤またはニッケル、コバルトなどの阻害剤
が存在しない通常の培養条件下においてアンドロスタン
系化合物を多量に生成する点で明白に野生株と区別され
る。

このような突然変異株としては、例えばＭ．パラフオー
ッィタムコンプレツクスＭＣＩ−０８０１号菌および同
ＭＣＩ−０８０２号菌を挙げることができる。この二菌
株は、何れもＭ．パラフオーッィタムコンプレツクスＡ
ＴＣＣ ２５７９ぴ号菌〔＝Ｍ．ネオオーラム（ｎｅｏ
ａｕｍｍ）ＡＴＣＣ２５７９び号菌〕を親株とし、紫外
光による処理あるいはＮ−メチル−Ｎ′ーニトローＮ−
ニトロソグアニジンによる処理により、おのおの得られ
た。両菌株は、微生物工業技術研究所に次の番号で寄託
されている。

微生物 Ｍ．／ぐラフオーツイタムコンプレツクスＭＣＩ−０８
０１号菌微工研菌寄第４２５叫号 Ｍ．パラフオーツイタムコンプレツクスＭＣＩ−０８０
２号菌微工研菌寄第４２６ぴ号 本菌の親株について詳述すると、親株 ＡＴＣＣ２５７９ぴ号菌は、Ｍ．に関する専門家達１３
名が集った抗酸菌分類国際研究班（ｌｎにｒ岬ｔｉｏｎ
ａＩＷｏｒｋｉｎｇＧｒｏｕｐｏｎ Ｍｙｃｏｂａｃに
ｒｉａＩＴａｘｏｎｏｍｙ）の共同研究の結論として、
Ｍ．／ぐラフオーッィタムコンプレックスに属するとさ
れている。

〔斉藤肇、東村道雄らインターナショナルジャーナルオ
ブシステマテイツクバクテレオロジー（ｌｎｔ．Ｊ．Ｓ
＄ｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）２７巻、７５〜８５頁（
１９７７年、アメリカ）参照〕この菌株ＡＴＣＣ２５７
９び号菌は、初め東村＃３０９号菌として、東村＃３５
８号菌（ＡＴＣＣ２３３６６号菌）を基準菌株として設
けた新種Ｍ．オーラム（ａｍｍｍ）東村に含められてい
た。

〔東村道雄、医学と生物学、７２蓋、２７０〜２７３頁
、１９６６年〕その後、束村氏は東村＃３５０３号菌（
ＡＴＣＣ２５７９５号菌）を基準菌株とし、Ｍ．オーラ
ムの別種としてＭ．ネオオーラム（ｎｅｏａｍｍｍ）東
村を創設したが、ＡＴＣＣ２５７９び号菌はＭ．オーラ
ムに属するとされていた。〔東村道雄、医学と生物学、
８５巻、２２９−２３３頁、１９７２王〕しかし、最近
の斉藤、東村らの文献（前出）によれば、ＡＴＣＣ２５
７９び号菌は、Ｍ．オーラムではなくＭ．ネオオーラム
の一員であるとされている。

〔斉藤、東村ら、前出文献７７頁図１参照〕さらに、同
じ文献の中で、Ｍ．属の分類に関してＭ．パラフオーッ
ィタム東村、Ｍ．オーラム東村、Ｍ．ネオオーラム東村
、Ｍ．ディェルンホフェリーベニツクアンドコーハク（
ｄｉｅｒ肌ｏｆｅｒｉＢ′′ｏｍｉｃｋｅ ＆Ｊ地ａｓ
ｚ）および“力ナザワストレインズ”（“Ｋａｎａｚａ
ｗａＳｔｒａｉｎｓ”）は相互に極めて近緑関係にあり
、現段階では区別できないとして、この５種は分散して
おかずにＭ．パラフオーッィタムコンプレックスとして
一括して取り扱うよう結論づけられている。東村らも別
な文献でほぼ同様な結論に達し、Ｍ．オーラムおよびＭ
．ネオオーラムはＭ．パラフオーツィタムコンプレツク
スの一員としてか、またはＭ．パラフオーツィタムの亜
種とするとしている。

〔ジヤーナルオプジエネラルマイクロバイオロジー（Ｊ
ｏｕｍａｌｏｆ戊ｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ）９８巻５１１〜５１刀頁、（１９７７年、イギリス
）参照〕Ｍ．パラフオーッイタムコンプレックスの一般
的性質および近縁同類との比較は斉藤肇（結核、５碇蓋
、４０２頁、１９７３王）斉藤ら（前出、７９雀、８０
〜８１頁、１９７７年）および束村ら（前出、５１５頁
、１９７７年）を参照されたい。以上の如く親株ＡＴＣ
Ｃ２５７９０号菌〔ッカムラ（Ｔｓｕｋａｍｕｒａ）＃
３０９〕の分類学的位置は、この方面の最高権威者の結
論に従い、Ｍ．パラフオーッィタムコンプレックスに属
するものとするのが妥当である。

Ｍ．パラフオーツイタムコンプレツクスはグラム陽・性
、抗酸性、非運動性、非胞子形成の樟菌であり、迅速発
育性、階発色性抗酸酸（ｒａｐｉｄ鱗ｏＭｎｇｓｃｏｂ
ｃｈｒｏｍｏ蟹ｎｌｃｍｙｃｏ戊ｃｔｅｒｉａ）あるい
はルニョン（Ｒｕｎｙｏｎ）のＷ群抗酸菌に属する。一
方この親株ＡＴＣＣ２５７９０号菌より分離した突然変
異株ＭＣＩ−０８０１号菌及びＭＣＩ−０８０２号菌は
親株に比し、前二者が寒天塔地上で粗面の（ｒｏｕｇｈ
）集落を形成する点以外に菌学的な相違はなかったし、
さらに親株が既述の如くＭ．パラフオーッィタムコンプ
レックスに属するので突然変異株ＭＣＩ−０８０１号菌
及びＭＣＩ−０８０２号菌はいずれもＭ．パラフオーツ
ィタムコンプレツクスに属する。

故に当然の事ながら、これらの突然変異株２株は、米国
特許第３，７５９，７９１号および同３，６８４，６５
７号明細書に４ＡＤおよびＡＤＤ生産突然変異株として
開示されたＭ．スピ−シーズ（ＳＰ。

）ＮＲＲＬ Ｂ−３６８３号菌および同ＮＲＲＬ Ｂ−
３８０５号菌〔本菌株は特開昭５２−１０５，２８９号
公報にてＭ．バッカェ（ｖａｃｃａｅ）と同定されてい
る〕と異なる新規な菌であり、また特公昭５２一１０５
２８ｙ号公報に記載された、ＡＤＤおよび４ＡＤ生産
突然変異株ＮＲＲＬ Ｂ−８１５３号菌および同Ｂ−８
１５４号菌が属するＭ．フオーッィタム（ｆｏｎｕｉｔ
ｕｍ）およびＭ．フレィ（ｐｈｌｅｉ）とも明らかに異
なる。これらの分類群の比較についてはバーギーの便覧
第８版（‘‘ 我ｒ袋ｙ′ｓ Ｍｏｎｕａｌ ｏｆ
Ｄｅｔｅ肌ｉＭｔｉＶｅ鞠ｃｔｅｒｉｏｌｏ数ｅｄ
．８’’，６９５〜６９６頁、ウィリアム＆ウイルキン
スカンパニ一（Ｗｉｍａｍｓ ＆ＷｉｌｋｉｎｓＣｏ．
）、１９７４年、アメリカ）〕、斉藤肇（前出、４０２
頁１９７５年）、斉藤ら（前出、８０〜８１頁、１９７
７年）および東村ら（前出、５１５、１９７７年）の文
献を参照されたい。なお、ＭＣＩ−０８０１号菌、ＭＣ
Ｉ−０８０２号菌はＮＲＲＬ Ｂ−３８０５号菌、Ｂ−
３６８３号菌と分類学的性質の他、ＡＤＤ，４ＡＤ，虹
‐ＯＨ−叫Ｄの分解能力が異なり、前者がこれらを基質
にして生育するのに、後者は生育しないという相違点が
ある。

このように突然変異株ＭＣＩ−０８０１号菌およびＭＣ
Ｉ−０８０２号菌はいずれもＭ．パラフオーッィタムコ
ンプレックスに属するものと考えられるし、且つ、既知
のＡＤＤ，必Ｄ生産突然変異株とは分類学上別のもので
あることが明白である。本発明の製造方法の目的物であ
るアンドロスタン系化合物とはアンドロスタン骨格を有
してＣ−１７に酸素原子またはヒドロキシ基を置換基と
して有し、Ｃ−１７に炭素原子を含む置換基を有しない
化合物の総称である。

アンドロスタン系化合物としては、前記したＡＤＤ，４
ＡＤ，ＤＨＴの他に、テストステロン、５Ｑ−アンドロ
スタン−３，６，１７−トリオン（以下「５Ｑ−ＡＴ」
と略記する）、５８ーアンドロスト−１ーエン−３，１
７ージオン（以下「５８一ｌＡＤ」と略記する）、９Ｑ
−ヒドロキシアンドロスト−４−エン−３，１７−ジオ
ン（以下「９Ｑ−ＯＨ−４ＡＤ」と略記する）、５Ｑ−
アンドロスタンー３，１７−ジオン（以下「５Ｑ−ＡＤ
」と略記する）、３３−ヒドロキシアンドロスト−５−
エン−１７−オン（＝デヒドロェピアンドロステロン）
（以下「ＤＨＡ」と略記する）などが挙げられる。これ
らのアンドロスタン系化合物のなかでは、ＡＤＤおよび
少血が本発明の主な目的化合物である。本発明で基質と
して用いられているステロール類とは、各種ステロール
、そのＣ一３ェステル、エーテル譲導体またはそれらの
酸化中間体を総合してステロール類と称す。

各種ステロールとは、ベルヒドロシクロベンタノフェナ
ントレン核のＣ−３にヒドロキシル基を、通常Ｃ−５に
二重結合を、Ｃ−１７に炭素数８ないし１川固の鎖式の
側鎖を有し、場合によってはＣ−７，Ｃ−８，Ｃ−９（
１１）等に二重結合を有してもよい。このような各種ス
テロールとしては、コレステロール、スチグマステロー
ル、力ンベステロール、シトステロール、エルゴステロ
ール、プラツシカステロール、フコステロール、ラノス
テロール、アグノステロール、ジヒドロラノステロール
、ジヒドロアグノステロール等が挙げられる。

好ましいステロールはコレステロール、カンベス７ロー
ルおよびシトステロールである。また各種ステロールの
３３水酸基と硫酸等の無桟酸または脂肪酸等の有機酸と
のＣ−３ヱステル誘導体も本発明方法の原料として使用
される。

このようなＣ−３ェステル譲導体としては、コレステリ
ルオレエート、コレステリルパルミテ−ト、コレステリ
ルサルフェート等が挙げられる。さらに、たとえば各種
ステロールの３８水酸基にアルキレンオキシドを付加さ
せる方法等により得られるＣ−３エーテル誘導体も本発
明方法の原料として使用される。このようなＣ−３エー
テル誘導体としてはポリオキシェチレンコレステリルェ
ーテル等が挙げられる。

上記した各種ステロールのＣ−３ェステル誘導体を含有
する羊毛脂（ウールワックス）、ラノリン、およびラノ
リンの加水分解で得られるコレステロールを含有するウ
ールアルコールおよびウールアルコールにエチレンオキ
シドを反応させて得られる、Ｃ−３エーテル誘導体であ
るポリオキシェチレンラノリンアルコールェーテルも本
発明方法の原料として使用されることはいうまでもない
。

魚油やいか油からのアルカリ洗浄ダーク油さらに植物油
の脱臭スカム、脱臭スラツジ、トール油などのステロー
ル含有天然物および加工物も同様に本発明方法の原料と
して使用される。

さりこ各種ステロールまたはそのＣ−３ェステルもしく
はエーテル誘導体の酸化中間体も本発明方法の基質とし
て使用される。

このような酸化中間体としては各種ステロール、そのＣ
−３ェステル、Ｃ−３ーェーテル誘導体の４ーェン−３
−オン又は１，４ージェンー３ーオン譲導体が挙げられ
るが、具体的には、たとえば、コレスト−４ーエンー３
−オン、コレスター１，４ージエン−３ーオン、コレス
ター４，２２−ジェンー３−オン等である。本発明方法
で使用される培地には、炭素源、窒素源および無機物が
適宜添加される。

炭素源としては、たとえば、ｎ−パラフィン、Ｑーオレ
フィン、キシレン等の炭化水素：メタノール、エタノー
ル、グリセリン、高級アルコ−ル等のアルコール類；コ
ハク酸、酢酸、高級脂肪酸等の有機酸およびその塩；大
豆油、綿実油等のグリセリド、油脂；澱粉、麦芽糖、シ
ョ糖、ブドウ糖、ラムノース等の糖類があげられる。

炭素源、窒素源およびその他の栄養物質を含む天然栄養
源としては、ハィテスト糖蜜、精製糖蜜およびキシロー
ス糖蜜を含む糠蜜類：バガス、コーンコフ・アルフアル
フア、コーンステイープリカー、デイスティラーズソル
ブル、味液、魚粉、フスマ、肉エキス、酵母、酵母エキ
ス、ポテトエキス、麦芽エキス、グルテン、ベプトン、
グルタミン酸塩、アスパラギン、グリシン、カゼイン、
カゼイン分解物、スキムミルク、大豆柏・菜種粕・ゴマ
柏・亜麻仁粕・綿実粘等の植物油脂粕および丸大豆、菜
種、ゴマ、亜麻仁・綿実等の油種子・油果実があげられ
る。無機物としては、硫安、塩安などの窒素源；リン酸
水素二カリウム等のカリウムおよびリン源；鉄、銅、マ
グネシウム、マンガン、コバルト、亜鉛、カルシウム等
の塩類；糖蜜等天然物の灰化物があげられる。

その他必要に応じてビタミン類を添加することもできる
。培地の組成は用いる菌種の種類に応じて選ばれるが、
炭素源、窒素源、カリウム、リンおよびマグネシウムは
培地成分として不可欠である。

消泡剤が必要な場合には周知のものを添加すればよい。
具体的にはポリオキシアルキレングリコールなどが挙げ
られるが必ずしも消泡剤を添加する必要はない。界面活
性剤はステロール類の乳化剤として有効であり、培地中
に添加されることが望ましい。

界面活性剤としては、非イオン系及び陰イオン系のもの
が好ましい。具体的にはたとえば、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノステアレート、ソルピタンモノパルミテ
ート、ポリエチレングリコールモノステアレートなどを
挙げることができる。培養温度は通常２０〜４０ｏｏで
あるが、培養温度は３０〜３５午０付近が最適である。
培地のｐＨは通常５〜１０に調整されるが、６〜９が好
ましい。

本発明で使用する微生物がＭ．属に属するものなので周
知のように１針寸近のｐＨ‘こも耐えられる。本発明方
法の原料であるステロール類は培地と共に殺菌されるの
が一般的であるが、培養開始後、培地に添加されてもよ
い。また分割添加も可能である。この場合、乾燥殺菌あ
るいは湿熱殺菌後そのまま添加されるか、あるいはジメ
チルホルムアミド等に溶解して溶液として添加されるか
、あるいは超音波処理により微細に分散懸濁して懸濁液
として添加される。また、界面活性剤を同時に添加する
と基質ステロール類等の乳化が促進されるので好ましい
。培養時間は特に制限されないが、通常、原料スプロー
ル類等添加後３日目頃からアンドロスタン系化合物の生
産量が急増する。

その後は、培養時間と共に徐々にアンドロスタン系化合
物の生産量が増加するが２０日以上培養するのは工業的
意味が薄い。培養終了後、培養液中に蓄積したアンドロ
スタン系化合物は既知の方法で採取、分離精製されうる
。

たとえば培養液からアンドロスタン系化合物を数倍量の
酢酸エチルなどの水と混和し１こくい有機溶媒で抽出し
、抽出液から溶媒を留去したのち、得られた粗混合アン
ドロスタン系化合物を多孔性樹脂、シリカゲル、アルミ
ナ等を吸着剤とし、石油エーテル、ベンゼン、クロロホ
ルム、エーテル、アセトン、メタノール・酢酸エチル等
を港藤剤として使用するカラムクロマトグラフィにより
、上記生成物を分離することができる。培養条件により
特定のアンドロスタン系化合物、例えばＡＤＤまたは４
ＡＤを壬生産物とする事が可能だが、その際は、培養液
の溶媒抽出液から溶媒蟹去後、シクロヘキサンやへキサ
ンなどに溶解させて再結晶を繰り返せば、カラムクロマ
トグラフィーの必要なく、ＡＤＤまたは４ＡＤの純結晶
を得る事が出来る。本発明によれば、副生物の少ないア
ンドロスタン系化合物を収率良く製造することが可能で
あり、さらに従来法にみられない高い基質濃度でそれに
比例した収率が得られる点で効果が大きい。

以下の実施例で、本発明をさらに詳細に説明するが、本
発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定さ
れない。なお以下の実施例に於て、ステロール類アンド
ロスタン系化合物の定性および定量はガスクロマトグラ
フイにより行った。

また以下の実施例に於て、パーセントは重量による。

実施例 １ グルコース１．０％、肉エキス１．０％、ベプトン１．
０％および水よりなる種培地（ｐＨ７．２）１００私を
５００肌肩付きフラスコに分注し、１２０ｏｏで１５分
間蒸気殺菌後、Ｍ．／ャラフオーッィタムコンプレック
スＭＣＩ−０８０１号菌を１白金耳接種し、３０℃で１
２０往復／分、振幅７肌の往復振麹条件で４劉時間種培
養する。

この種培養液２の‘を丸大豆磨砕物４．０％，ＮａＮｏ
３０．２％，Ｋ２ＨＰ０４０．２％，Ｍ＄０４・７日２
００．１％、コレステロール１．０％および水からなる
本培養地５０の【（ｐＨ７．０，１２０００で２び分間
蒸気殺菌）を含む５００の【肩付きフラスコ１０本に接
種する。本培養は３０つ○で、１２の主復／分、振幅７
仇の往復振鰹条件で行い、培養開始後１５曲時間目に培
養を停止し、培養液を全て併せ酢酸エチル２そで２回抽
出する。この抽出液をあわせて菌体などの不溶物を炉過
後、ステロイド舎量をガスクロマトグラフィ‐で分析し
た結果は、ＡＤＤＯ．７５夕，４ＡＤＯ．１３夕，ＤＨ
ＴＯ．０３夕，企ＳｔｏＳｔｅｒｏｎｅ０．０２夕，５
Ｑ−ＡＴＯ．０１夕，５８一ｌＡＤＯ．０２タ生産され
ていた。

薄層クロマトの結果０．０１タ以下で９Ｑ−ＯＨ−少血
，５Ｑ−ＡＤの生成が確認された。実施例 ２ グルコース１．０％、肉エキス１．０％、ベプトン１．
０％および水よりなる種塔地（ｐＨ７．２）１００の上
を５００の‘肩付フラスコに分注し、１２０００で１５
分間蒸気殺菌後、Ｍ．パラフオーッィタムコンプレック
スＭＣＩ一０８０２号菌を１白金耳接種し３０ｑ○で１
２０往復／分、振幅７肌の往復振縄条件で４劉時間種培
養する。

この種培養液２０の‘を丸大豆磨砕物２．０％、酵母２
．０％、グリセリン４．０％，ＮａＮ０３０．２％，Ｋ
２ＨＰ０４０．２％，ＭｇＳ０４・７日２００．１％、
コレステロール１．０％および水よりなる本培養培地８
００私（ｐＨ７．０，１２０ｏ０で２０分間蒸気殺菌）
を含む６〆容肩付フラスコに接種する。本培養は３００
０でｌｏｗ主復／分、振幅７肌の往復振縁条件で行い、
培養開始後１８ｍ時間割こ培養を停止し、培養液を酢酸
エチル２．４そで抽出する。この抽出液中には、アンド
ロスタン系化合物として、ＡＤＤ２．６５夕，４ＡＤＯ
．５５夕，ＤＨＴＯ．０５夕、テストステロン０．０５
夕が生成され、さらに５Ｑ−ＡＴ，５８一ＩＡＤ，ＤＨ
Ａ，５Ｑ一ＡＤがトレース量（０．０１タ以下）生成し
ていた。

実施例 ３ 実施例２において基質コレステロールの代りに、Ｂーシ
トステロールとカンベステロールの２：１混合物、ステ
イグマステロール、コレストー４−エンー３−オン、コ
レスター１，４ージエン−３−オンおよびコレステリル
オレェートを用いた事を除いては実施例２を繰り返す。

蓄積された主生成物ＡＤＤおよび必心の量を表１に示す
。表 １ＡＤＤ ４ＡＤ （９） （９）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ステロール類を基質にして、ミコバクテリウム・パ
   ラフオーツイタムコンプレツクスＭＣＩ０８０１号菌ま
   たはミコバクテリウム・パラフオーツイタムコンプレツ
   クスＭＣＩ０８０２号菌を培養することを特徴とするア
   ンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオンおよび
   アンドロスト−４−エン−３，１７−ジオンからなる群
   から選ばれるアンドロスタン系化合物の製造方法。 ２ 特許請求の範囲第１項記載の方法において、ステロ
   ール類が、ステロール、そのＣ−３エステル誘導体、Ｃ
   −３エーテル誘導体またはそれらの酸化中間体からなる
   群から選ばれたものであることを特徴とする方法。