DD210259A5 - Verfahren zur herstellung von polypeptiden - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden der Formel R-Thr-a-b-Lys-d-e-f-g-h-j-k-l-m-n-p-q-t-u-Pro-v-w-x-y-(z),-R tief 1, worin jeder Aminnosaeurerest L-Konfiguration hat, R Wasserstoff oder C tief 1-C tief 3-Alkyl ist, R tief 1 fuer OH oder NR tief3 R tief 4 steht, worin R tief 3 und R tief 4 Wasserstoff oder C tief 1-C tief 3-Alkyl sind u.die weiteren Symbole sowie der Index r folgende Bedeutung haben:a=IIE oder Leu,b = Ser oder Ala, d= Ala, Thr, Pro, oder Ser, = Lys, Arg,Thr oder Gly,f =Gly,Val oder Asn,g = Gln, Lys, Ser, Glu, Pro, Ala, Asn oder Thr,h = Pr,Ala,oder Thr,h = Pro,Val,Thr oder Phe,j = Arg,Leu,Pro oder Phe,k = Glu,Ala,IIe,Met oder Pro,I =Pro, Lys oder Glu,m = Gln,Glu oder Val, n=Val oder His,p=Tyr,His oder Leu,q=Thr,Val oder Leu,t=Leu,IIe,Met oder Pro,u=Pro oder Gly,v=Ser oder Pro,w=Arg,Gln,Glu oder Ser,x=Glu,Asp,Gln oder Asn,y=Glu,Gln,Gly oder Leu,z=Hse u.r= 0 oder 1, indem man von einem entsprechend geschuetzten Peptid der obigen Formel mit einem Deblockierungsmittel die Schutzgruppen Abspaltet. Diese Verbindungen eignen sich zur Modulierung von Immunreaktionen.
Description
250 789 7
Titel der Erfindung: 15
Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden Anwendungsgebiet der Erfindung:
Die Erfindung bezieht sich auf eine Klasse von Polypeptiden, die sich zur Modulierung von Immunreaktionen eignen.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen und Aufgabe der Erfindung: ^ Immunoglobuline sind Proteine/ die von Plasmazellen als eines der letzten Ereignisse in einer komplexes Folge von Ereignissen gebildet werden, welche durch Antigenreaktion des Wirts hervorgerufen werden. Die Plasmazellen als weiterer Teil dieser Folge sind von B-Lymphozyten abge-
leitet, die durch einen Mechanismus oder eine Reihe von Mechanismen in einer bisher noch nicht völlig klaren Weise aktiviert werden.
Es gibt fünf Klassen bekannter .immunoglobuline, nämlich IgG, IgA, IgM, IgD und IgE. Von diesen ist IgG der vorwiegende Anteil der zirkulierenden Immunoglobuline.
1QNlÄH933*088Sü8
j Das Immunoglobulinproteinmolekül setzt sich zusammen aus vier miteinander verbundenen Polypeptidketten, von denen zwei als leichte Ketten und zwei als schwere Ketten bezeichnet werden. Bei dieser Anordnung ist das Ig-Molekül
c in zwei identische Teile unterteilt, von denen jedes eine leichte und eine schwere Kette enthält, die über Disulfidbrücken gebunden sind, welche von Cysteinresten gebildet werden. Die zwei erhaltenen Anteile sind wiederum über Disulfidbrücken miteinander verbunden.
Jede der vier Ketten ist im allgemeinen aus zwei Teilen zusammengesetzt, nämlich einem veränderlichen Bereich (Vx und V„), der von der endständigen Aminogrupoe ausgeht
L· ti
und über eine stark variable Aminosäuresequenz verfügt, ]5 und einem konstanten Bereich (C_ und C), der von der endständigen Carboxylgruppe ausgeht und im allgemeinen konstante Aminosäuresequenzen hat. Jeder dieser Bereiche stellt einen diskreten Teil des Ig-Moleküls dar. Der CTT-Bereich ist weiter in drei Abschnitte unterteilt, die
auf. Basis konstanter Homologiebereiche als C,T1 , CT,2 und
ti a .
C133 bezeichnet werden, ti
Es ist bereits seit einer Reihe von Jahren bekannt, daß sich das Ig-Molekül enzymatisch in zwei diskrete Fragmente spalten läßt. Die Eigenschaften dieser Fragmente sind dann unter Anwendung der verschiedensten biologischen Untersuchungssysteme bestimmt worden.
Das IgG-Molekül kann unter Verwendung von Papain gespalten werden, wodurch ein Fc-Fragment und zwei Fab-Fragmente gebildet werden. Das Fc-Fragment stellt die C-endständigen Teile der beiden schweren Ketten dar, die über eine Disulfiabrücke miteinander verbunden sind, und die Fab-Fragmente sind zusammengesetzt aus dem N-endständigen Teil der schweren Kette und der gesamten leichten Kette, und über eine Disulfidbrücke miteinander verbunden.
Durch Pepsin und Plasmin kommt es zu einer Spaltung des IgG-Moleküls an Steilen, die näher am endständigen C der schweren Kette und nach der Disulfidbrücke liegen/ die die beiden schweren Ketten miteinander verbindet. Das Pepsinprodukt, welches als pFc'-Fragment bezeichnet wird, und das Piasminprodukt bilden somit die C-endständigen Teile des Fc-Fragments (C„3-Abschnitt von IgG).
Man weiß bereits, daß bestimmte biologische Wirkungen auf den Fc- und pFc'-Fragmenten beruhen. So werden beispielsweise B-Lymphozyten der Milz der Maus in Anwesenheit von von Papain abgeleiteten Fc-Fragmenten zu einer Proliferation induziert [J- Exp. Med. 146, 241 (1977)]. Weiter ist auch beobachtet worden, daß die Proliferationsreaktion abhängig ist von der Gegenwart von Makrophagen.
Makrophage spalten anscheinend enzymatisch das Fc-Fragment in ein Subfragment.mit einem Molekulargewicht von 14000, welches dann eine Proliferation von B-Zellen stimuliert [J. Exp. Med. 150, 256 (1979) und 151, 1(1979)]. 20
Im Anschluß daran konnte gezeigt werden, daß das Fc-Fragment die Fähigkeit hat, in Gegenwart von sowohl Makrophagen als auch T-Zellen eine polyklonale Antikörperreaktion bei Milzzellen der Maus einzuleiten [J. Immun. 124, 1330 (1980)].
Dementsprechend konnte ferner gezeigt werden, daß das durch Piasminverdauung von IgG gebildete kürzere Fragment an der Bildung einer polyklonalen Antikörperreaktion wU aktiv beteiligt ist [J. Supramolecular Structure 14, 201 (1980)] .
Darlegung des Wesens der Erfindung:
Es wurde nun eine Klasse kleiner Peptide gefunden. Diese Peptide eignen sich zur Modulierung der Immunreaktion
und sind entweder synthetisch unter Anwendung leicht zugänglicher Peptxdsynthesen oder durch enzymatische und chemische Spaltung des IgG-Moleküis zugänglich.
Werden sie durch Spaltverfahren hergestellt, dann wird das IgG zuerst mit Plasmin verdaut, worauf man die erhaltenen Segmente mit Cyanogenbromid behandelt. Das'erhaltene aktive Fragment enthält 23 Aminosäuren, die durch die Reste 335 bis 357 des IgG-Moleküls definiert sind, an das sie gebunden sind, und am endständigen C Homoserin (Hse), das vom Methionin (Rest 358) stammt, näm-. lieh der Stelle der Spaltung mit CNBr. Bezüglich einer Beschreibung dieser Strukturen wird beispielsweise hingewiesen auf die in Proc.- Nat 1I Acad. Sei. USA 53, 78 (1969) beschriebene Sequenz.
Die Peptide der im folgenden angegebenen Formel I sind, wie bereits·erwähnt, synthetisch erhältlich. Erfolgt die Herstellung auf diese Weise, dann kann gewünschtenfalls das C-endständige Homoserin weggelassen werden.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß verhältnismäßig kleine Peptide der Formel I die Immunreaktion insofern potenzieren, da sie die Fähigkeit besitzen, T-Zellen und natürliche Killerzellen zu aktivieren, die zur Antikörperbildung führende 3-Zellenunterscheidung zu initiieren und/oder zu fördern und eine vorhandene Immunreaktion zu steuern. Diese Peptide sind in ihrer Wirkung ziemlich selektiv, da sie im Gegensatz zum oben beschriebenen Fc-Fragment keine wesentliche 3-Zellenproliferation einleiten.
Die Erfindung betrifft daher eine Klasse von Verbindungen mit einer Formel, die durch eine Sequenz von 23 Aminosäurenfestgelegt ist/ welche dem Rest 335 bis 357 eines IgG-Moleküls:entspricht, an den durch Amidbildung an der endständigen Carboxylgruppe Homoserin oder das durch Dehvdratation von Homoserin gebildete Lacton gebunden i—"
} Bevorzugte Verbindungen aus dieser Klasse sind diejenigen der folgenden Formel I mit der Struktur
H-Thr-lie-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Arg-Glu-Glu-Hse,
worin Hse Homoserin oder Homoserinlacton ist. Diese Verbindungen werden vorzugsweise durch enzymatische und chemische Spaltung des IgG-Moleküls hergestellt.
Allgemein bezieht sich die Erfindung auf eine Klasse von
Verbindungen der Formel I mit der folgenden Struktur R-Thr-a-b-Lys-d-e-f-g-h-j-k-l-m-n-p-q-t-u-Pro-v-w-x-y-
worin jeder Aminösäurerest eine L-Konfiguration hat,
R für Wasserstoff oder C -C -Alkyl steht, R1 für OH oder NR-. R^ steht, worin R und R^ unabhängig Wasserstoff oder C.-C^-Alkyl sind
und die anderen Symbole folgende Bedeutungen haben:
a = He oder Leu,
b = Ser oder AIa,
d = Ala, Ihr, Pro, VaI oder Ser,
e = Lys, Arg, Thr oder GIy
f = GIy, VaI oder Asn,
g = GIn, Lys, Ser, GIu, Pro, AIa, Asn oder Thr,
h = Pro, VaI, Thr oder Phe,
j = Arg, Leu, Pro oder Phe,
k = GIu, Ala, He, Met oder Pro,
1 = Pro, Lys oder GIn,
3~> m = Gin, GIu oder VaI,
η = VaI oder His,
ρ = Tyr, His oder Leu,
q = Thr, VaI oder Leu,
t = Leu, He, Met oder Pro,
u = Pro oder GIy,
ν = Ser oder Pro,
w = Arg, Gin, GIu oder Ser,
5X= GIu, Asp, Gin oder Asn,
y = GIu, Gin, GIy oder Leu,
2 = Hse und
.r = 0 oder 1.
Zu einer bevorzugten Unterklasse gehören diejenigen Verbindungen der Formel I, worin die anderen Symbole folgende Bedeutungen besitzen:
| a | = He | Thr, | Pro | oder Ser, |
| b | = Ser, | oder | Arg, | |
| d | = AIa, | |||
| e | = Ly s | Lys, | Ser | oder Pro, |
| f | = GIy | oder | VaI., | |
| g | = GIn, | oder | Lau, | |
| = Pro | AIa, | He | oder Met, | |
| j | = Arg | |||
| k | = GIu, | oder | GIu, | |
| 1 | = Pro, | |||
| m | = GIn | |||
| η | = VaI, | VaI | oder | Leu, |
| P | = Tyr, | He | oder | Met, |
| q | = Thr, | oder | GIy, | |
| = Leu, | oder | Pro, | ||
| u | = Pro | |||
| V | = Ser | oder· | Äsp | und |
| W | = Arg, | oder | GIn - | |
| X | = GIu | |||
| y | = GIu | |||
Zu einer stärker bevorzugten Unterklasse der Formel ι gehören die Verbindungen, bei denen die weiteren Symbol« folgende Bedeutungen haben:
| a | = Ile | / | / | oder | oder Ser, |
| b | = - Ser | I | oder | Arg, | |
| d | = AIa | , Thr | , | ||
| e | = Lys | oder | oder | ||
| f | = GIy | I | oder | ||
| g | = GIn | r | |||
| h | = Pro | I | |||
| j | = Arg | t | |||
| k | = GIu | ||||
| 1 | = Pro | ||||
| m | = GIn | ||||
| η | = VaI | ||||
| P | = Tyr | ||||
| q | = Thr | GIy, | |||
| t | = Leu | Pro, | |||
| U | = Pro | ||||
| V | = Ser | Asp und | |||
| W | = Arg | GIn. | |||
| X | = GIu | ||||
| y | = GIu |
Zu einer noch stärker bevorzugten Unterklasse der Formel I gehören die Verbindungen, bei denen die weiteren Symbole folgende Bedeutungen haben:
| a | = lie, |
| b | = Ser, |
| d | = Ala oder Thr, |
| e | = Lys, |
| f | = GIy, |
| g | = GIn, |
| h | = Pro, |
| j | = Arg, |
Ik= GIu,
1 = Pro,
m = GIu oder Gin,
η = VaI,
P= Tyr,
q = Thr,
t = Leu,
u = Pro,
ν = Ser,
w= Arg oder Gin,
χ = GIu, Asp oder Gin und
y = GIu oder GIy.
Beispiele für bevorzugte Aminosäuresequenzen der Formel I sind folgende:
R-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Arg-Glu-Glu-R.. ,
R-Thr-ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Arg-Asp-Glu-R.. ,
R-Thr-Ile-Ser-Lys-Thr-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Arg-Glu-Glu-R., 25
R-Thr-Ile-Ser-Lys-Thr-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Glu-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Arg-Glu-Glu-R ,
R-Thr-Tle-Sar-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Gln-Glu-Glu-P^ ,
R-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Pro-Pro-Arg-Ils-Pro-rn-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Pro-Pro-Arg-x-y-R.,
R-Thr-Ile-Ser-Lys-Thr-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser-Arg-x-Gly-R., ,
Ί R-Thr-Ile-Äla-Lys-Val-Thr-Val-Asn-Thr-Phe-Pro-Pro-Gln-VaI-HiS-LeU-LeU-PrO-PrO-PrO-SeT-GIu-GIu-R1 und
R-Thr-Leu-Ser-Lys-Ser-Gly-Asn-Thr-Phe-Arg-Pro-Gln-Val-His-Leu-Leu-Pro-Pro-Pro-Ser-w-x-Leu-R .
Die Verbindungen der Formel I, worin r für 1 steht können durch enzymatische und chemische Spaltung von
0 IgG hergestellt werden. Das durch übliche Verfahren zugängliche IgG kann zur Reinigung einer Ammoniumsulfatfraktionierung und anschließenden Chromatographie mit DEAE-Cellulose unter Verwendung'von O/01-molarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8 als Eluiermittel
'5 unterzogen werden.
Das gewonnene IgG wird dann im allgemeinen über eine. Zeitdauer von 2 0 bis 3 0 Stunden bei erhöhter Temperatur von etwa 370C mit Plasmin verdaut. Das aktive Fragment
des erhaltenen verdauten igG kann auf Sephadex G-IOO unter Verwendung von 0,01-molarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 als Eluiermittel abgetrennt werden.
Der aktive Teil wird dann unter Anwendung üblicher Ver-
fahren mit CNBr behandelt. Diese bestehen im allgemeinen in einer Auflösung des nach der Piasminverdauung gewonnenen Produkts, in 70- bis 90%-iger Ameisensäure, die einen Überschuß an CNBr enthält. Man läßt die Spaltung bei Raumtemperatur über eine verlängerte Zeit-
dauer (etwa 2 4 Stunden) ablaufen. Das gewünschte Peptidprodukt, nämlich eine Sequenz aus den Resten 335 bis des IgG-Moleküls, bei welcher der Rest 358 (Methionin) durch die Spaltreaktion mit CNBr zu Homoserin oder Homo-
serinlacton verändert ist, läßt sich durch übliche 35
chromatographische Auftrennung gewinnen, beispielsweise durch Molekularausschlußhochleistungsflüs sigkeitsch.romatographie (HPLC) und Umkehrphasen-HPLC. Die erhaltene
ι Sequenz aus den durch Spaltung mit CNBr modifizierten Resten 3 35 bis 3 58 stellt Verbindungen der Formel I dar, worin r für 1 steht.
c Die Verbindungen der Formel I lassen sich ferner auch durch die verschiedensten bekannten Peptidsynthesen herstellen, beispielsweise durch klassische Lösungsverfahren, Festphasenverfahren und die in.neuerer Zeit verfügbaren rekombinanten DNA Methoden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel. I besteht in einer Festphasentechnik unter sequentiellem Aufbau einer Aminosäuresequenz ausgehend von einer ursprünglich unlöslichen harzgetragenen C-endständigen Aminosäure, Solche Festphasentechniken v/erden beispielsweise beschrieben in J. Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman and Co., San Francisco, 1969.
Sei einem solchen Festphasenverfahren bindet man im allgemeinen die Aminosäure, die dem C-endständigen Aminosäurerest des gewünschten Peptids entspricht, an einen unlöslichen Harzträger und bildet dann die Peptidkette beginnend an der harzgetragenen C-endständigen Aminosäure.
Es werden solange der Reihe nach einzelne Aminosäuren eingeführt, bis die gewünschte Aminosäuresequenz erreicht ist- Wahlweise kann man auch kleine Peptidfragmente herstellen und in der gewünschten Reihenfolge in die Peptidkette einführen. Die Peptidkette bleibt während der Sy.nthese an das Harz gebunden, wobei das Peptid erst nach Fertigstellung der Kette vom Harz gespalten wird.
Die Peptidkette ist an das Polystyrolharz über eine Esterbrücke gebunden, die zwischen der Carboxylgruppe des °5 C-endständigen Restes und einer der Methylengruppen gebildet ist, welche an der Harzmatrix als Stellen für eine solche Verknüpfung vorhanden sind. Das Polystyrolharz ist ein Styrolpolymer, das durch Zusatz von etwa
- 1 Ί -
] 0,5 bis 3 % Divinylbenzol quervernetzt und chiorir.athylierr oder hydroxymethyliert ist, wodurch sich Stellen für eine Este-rbildung ergeben- Ein Beispiel für ein solches hydroxymethyliertes Harz wird in Chem. Ind» (London) 38, 1597 bis 1598 (1966) beschrieben. Ein chlormethyliertes Polystyrolharz ist im Handel von Lab System, Inc., San Mateo, California, erhältlich. Dieses Harz ist ferner auch von Stewart et al. in Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman and Co., San Francisco, California, Seiten 1 bis 6, "IO beschrieben.
Die Aminosäuren werden unter Anwendung von Techniken aneinandergekuppelt, wie sie zur Bildung von Peptidbindungen üblich sind. Ein hierzu geeignetes Verfahren besteht in einer überführung der Aminosäure in ein Derivat, das die Carboxylgruppe besser zugänglich macht für eine Reaktion mit der freien N-endständigen Aminogruppe des Peptidfragments. So kann man die Aminosäure beispielsweise in ein gemischtes Säureanhydrid überführen, indem man eine geschützte Aminosäure mit Ethylchlorformiat, Phenylchlorformiat, s-Butylchlorformiat, Isobutylchlorformiat, Pivaloylchlorid oder ähnlichen Säurechloriden umsetzt. Wahlweise kann man die Aminosäure auch in einen aktiven Ester umwandeln, beispielsweise einen 2,4,5-Trichlorphenylester, einen Pentachlorphenylester, einen p-Nitrophenylester, einen aus N-Hydroxysuccinimid gebildeten Ester oder einen aus 1-Hydroxybenzotriazol gebildeten Ester.
Eine andere Kupplungsmethode besteht im Einsatz eines geeigneten Kupplungsmittels, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder N7N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC). Weitere geeignete Kupplungsmittel sind dem Fachmann bekannt [siehe Schroder und Lubke, The Peptides, Academic
press, 1965, Kapitel Hl].
Die.α-Aminogruppe einer jeden Aminosäure, die für die Peptidsynthese verwendet wird, muß während der Kupplungsreaktion selbstverständlich geschützt sein, um Nebenreaktionen der reaktionsfähigen a-Aminofunktion zu verhindem. Bestimmte Aminosäuren enthalten ferner auch reaktionsfähige seitenkettenfunktionelle Gruppen, beispielsweise Sulfhydryl, £-Amino, Carboxyl oder Hydroxyl, und solche funktionelle Gruppen müssen während der anfänglichen und nachfolgenden Kupplungsstufen natürlich ebenfalls geschützt sein. Hierzu geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt [siehe beispielsweise Protective Groups in Organic Chemistry, M. McOmie, Editor, Plenum Press, N.Y., 1973].
Bei der Auswahl einer besonderen Schutzgruppe müssen bestimmte Bedingungen beachtet werden. Eine a-Aminoschutzgruppe muß (1) stabil sein, (2) die a-Aminofunktion unter den bei der Kupplungsreaktion angewandten Bedingungen inert machen und (3) nach erfolgter Kupplungsreaktion leicht unter Bedingungen abspaltbar sein, die zu keiner Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen führen und die Struktur des Peptidfragments nicht verändern. Eine Seitenkettenschutzgruppe muß (1) die an der Seitenkette vorhandene funktionelle Gruppe unter den für die Kupplungsreaktion angewandten Bedingungen inert machen, (2) untör den zur Entfernung der a-Aminoschutzgruppe angewandten Bedingungen stabil sein und (3) nach Komplettierung der gewünschten Aminosäuresequenz unter Reaktionsbedingungen leicht abspaltbar sein, die die Struktur der Peptidkette nicht verändern. Es ist für den Fachmann selbstverständlich, daß die für eine Peptidsynthese als brauchbar bekannten Schutzgruppen hinsichtlich ihrer Reaktivität den Mitteln angepaßt sind, die zu ihrer Entfernung verwendet werden. So sind bespielsweise bestimmte Schutz-
OJ gruppen, wie Tripheny!methyl und 2- (p-3iphenylyl)isopropyloxycarbonyl sehr labil und können unter schwachsauren Bedingungen abgespalten werden. Andere Schutzgruppen, wie t-Butyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl,
] Adamantyloxycarbonyl und ρ—Methoxybenzyloxycarbonyl, sind dagegen weniger labil und erfordern zu ihrer Abspaltung mittelmäßig starke Säuren, wie Trifluoressigsäure, Chlorwasserstoffsäure oder Bortrifluorid in Essigsäure. Wieder andere Schutzgruppen, wie Benzyloxycarbonyl, Halogenbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbony1, Cycloalkyloxycarbonyl und Isopropyloxycarbonyl, sind noch weniger labil und machen zu ihrer Abspaltung den Einsatz starker Säuren erforderlich, wie Fluorwasserstoff, Brom-]0 wasserstoff oder Bortriflaoracetat in Trifluoressigsäure.
Typische Beispiele für Aminosäureschutzgruppen gehen aus folgender Aufstellung hervor:
A. Eine a-Aminogruppe kann geschützt sein durch
(a) Acylgruppen, wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, p-Toluolsulfonyl (Tosyl), Benzolsulf onyl, Nitrophenylsulfenyl und dergleichen,
(b) aromatische Urethangruppen, wie Benzyloxy-
carbonyl oder substituiertes Benzyloxycarbonyl,
beispielsweise p-Chlorbenzyloxycarbonyl,p-Brombenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbony1, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl und dergleichen,
(c) aliphatische Urethangruppen, wie t-Butyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, 2-(p-3iphenylyi)isopropyloxycarbonyi, Allyloxycarbonyl und dergleichen,
ό® (d) Cycloalkylurethangruppen, wie Cyclopentyloxy-
carbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und dergleichen,
(e) Thiourethangruppen, wie Phenylthiocarbonyl, ^0 (f) Alky!gruppen, wie Tripheny!methyl, oder
(g) Trialkylsilangruppen, wie Trimethylsilan.
. - 14 -
] Eine bevorzugte α-Aminoschutzgruppe ist t-Butyloxycarbonyl (BOC).
B. Die in Lysin vorhandene £ -Aminoschutzgruppe kann durch irgendwelche Gruppen geschützt sein, wie sie oben für den Schutz einer a-Aminogruppe erwähnt worden sind. Zu typischen Gruppen gehören beispiels weise Benzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, t-Butyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, p-Toluolsulfonyl und dergleichen. Die bevorzugte £ -Aminoschutzgruppe ist o-Chlorbenzyloxycarbonyl (ClBzL).
C. Die im Histidin vorhandene Imidazolgruppe kann
durch irgendwelche Gruppen geschützt sein, wie sie oben- für den Schutz einer a-Aminogruppe erwähnt worden sein. Bevorzugt hierfür sind jedoch Benzyl, ρ—Toluolsulfonyl (Tosyl), 2,4-Dinitrophenyl und Benzyloxymethyl.
· '
D. Die Guanidogruppe von Arginin kann durch irgendeine der oben für eine.a-Aminogruppe erwähnten Gruppen geschützt sein, ist jedoch vorzugsweise durch p-Toluolsulfonyl (Tosyl) geschützt.
E. Die Hydroxylgruppe von Serin, Homoserin, Threonin oder Tyrosin kann geschützt sein beispielsweise durch C1-C.-Alkyl, wie Methyl, Ethyl und t-3utyl, Benzyl, substituiertes"Benzyl, wie p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, p-Chlorbenzyl und o-Chlorbenzyl, C^-C^-Alkanoyl, wie Formyl, Acetyl und Propionyl, Tripheny!methyl oder Benzoyl. Die bevorzugte
- 15 •j Hydroxylschutzgruppe ist Benzyl (BzI) .
F. Die Carboxylgruppe von .Asparaginsäure oder Glutaminsäure kann beispielsweise durch Veresterung unter c Verwendung von Gruppen geschützt sein, wie Benzyl, t-Butyl, Cyclohexyl, Cyclopentyl und dergleichen. Die derzeitigen Gruppen der Wahl sind Cyclohexyl und Cyclopentyl.
jQ Nach Aufbau der gewünschten Peptidsequenz muß man das geschützte Peptid vom Harzträger abspalten und alle Schutzgruppen entfernen. Dieses Verfahren beinhaltet daher die Deblockierung eines entsprechend geschützten Peptids der Formel I mit einem Deblockierungsmittel. Ein Beispiel
]5 für ein entsprechend geschütztes Peptid entspricht der Formel II
(Rc)(R.)Thr-a-(R.)b-(R )Lys-(R )d-(R )e-f-(RQ)g-(R^)h-
DO OO O/ yo
(R8) j-(R1 0)k-(R11)1-(R10)m-(Rg)n-(R_)p-(R5)q-t-u-Pro-(R6 ) v- (R9) w- (R10) x- (R1 0) -[ (R6) z] r-Z
worin R,- Wasserstoff, C -C-."Alkyl oder eine a-Aminoblockiergruppe ist,
R,- Wasserstoff oder eine Hydroxylschutzgruppe
ο -
bedeutet,
R_ Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe oder eine
Hydroxyschutzgruppe darstellt, 30
R0 Wasserstoff oder eine Aminoschutzgrupoe ist, ο ^ *
R- für Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe, eine Hydroxylschutzgruppe oder eine Carboxylschutzgruppe steht,
R Wasserstoff oder eine Carboxylschutzgruppe darstellt,
R11 Wasserstoff, eine Carboxylschutzgruppe odsr eine Aminoschutzgruppe ist,
Z für Hydroxy, NR3R4, worin R3 und R4 unabhängig Wasserstoff oder C1-C-,-Alkyl sind oder einen Harzträger steht, 10
mit der Maßgabe, daß wenigstens einer derSubstituenten R
serstoff haben falls Z für Hydroxy oder NR3R4 steht.
bis R11 eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben muß,
Die Spaltreaktion und die Entfernung der Schutzgruppen können gleichzeitig oder stufenweise vorgenommen warden. Ist der Harzträger ein chlormethyliertes Polystyrolharz, dann ist die Bindung, über die das Peptid mit dem Harz verbunden ist, eine Esterbrücke, die zwischen der freien Carboxylgruppe am C-endständigen Rest und einer der vielen an der .Harzmatrix vorhandenen Chlormethylgruppen gebildet ist» Die Verankerungsbindung kann selbstverständlich durch Reagenzien gespalten werden, von denen man weiß, daß sie eine Esterbrücke aufbrechen und die Harzmatrix durchdringen. Eine besonders einfache Methode besteht in einer Behandlung mit einer starken Säure, wie HCl in. Eisessig, Ameisensäure (95%-ig oder darüber) oder flüssigem Fluorwasserstoff-, wobei flüssiger Fluorwasserstoff bevorzugt ist. Die starke Säure führt nicht
nur zu einer Abspaltung des Peptids vom Harz, sondern auch zu einer Entfernung aller Schutzgruppen. Der Einsatz dieses Reagens führt daher direkt zum vollständig von Schutzgruppen befreiten Peptid. Möchte man das Peptid ohne Entfernung der Schutzgruppen abspalten, dann läßt sich dies durch Methanolyse des Komplexes aus geschütztem Peptid und Harz unter Bildung des geschützten Peptids erreichen, dessen C-endständige Carboxylgruppe methyIiert ist. Der Methvlester kann dann unter milden alkalischen
] Bedingungen hydrolysiert werden, wodurch man zur freien C-endständigen Carboxylgruppe gelangt. Im Anschluß daran können die an der Peptidkette vorhandenen Schutzgruppen durch Behandlung mit einer starken Säure, wie flüssigem Fluorwasserstoff, entfernt werden. Eine besonders geeignete Technik zur Durchführung der Methanolyse geht hervor aus G. Moore et al., Peptides, Proc. 5th Amer. Pept. Symp., M. Goodman und J. Meinhofer, Eds., John Wiley, N.Y., 1977,Seiten 518 bis 521, wonach das geschützte Peptid-Harz mit Methanol und Kaliumcyanid in Anwesenheit eines Kronenethers behandelt wird.
Ein anderes Verfahren zur Abspaltung des geschützten Peptids vom Harz besteht in einer Ammonolyse oder einer Behandlung mit Hydrazin. Das erhaltene C-endständige Amid oder Hydrazid läßt sich zur freien C-endständigen Carboxylgruppe hydrolysieren und in üblicher Weise von den Schutzgruppen befreien.
Selbstverständlich kann die an der N-endständigen a-Aminogruppe vorhandene Schutzgruppe bevorzugt entweder vor oder nach Abspaltung des geschützten Peptids vom Harzträger entfernt werden.
aus Gründen der Einfachheit und des besseren Verständnisses werden die hierin angegebenen Aminosäuren sowohl durch ihre übliche Kurzbezeichnung aus drei Buchstaben als auch durch eine Bezeichnung mit einem Buchstaben
beschrieben. Diese Bezeichnungen lauten wie folgt: 30
drei Buchstaben ein Buchstabe Alanin Arginin
Asparagin
35 Ä ...
Asparaginsäure
Glutaminsäure
Glutamin
Glycin
| Ala | A |
| Arg | R |
| Äsn | N |
| Asp | D |
| GIu | |
| Gin | Q |
| GIy | G |
] drei Buchstaben ein Buchstabe
Histidin His H
Homoserin Hse
Isoleucin He I
Leucin Leu L
Lysin Lys K
Methionin Met M
Phenylalanin Phe F
Prolin Pro P
Serin Ser S
Threonin Thr T
Tyrosin Tyr Y
Valin - VaI V
unter Anwendung der einfachen Bezeichnung einer Aminosäure mit jeweils nur einem Buchstaben sind im folgenden Peptide als Beispiele für die Verbindungen der Formel I zusammengefaßt. Jede der angegebenen Verbindungen kann, obwohl dies bei den angeführten Verbindungen nicht angegeben ist, irgendwelche Substitusnten der im folgenden genannten Art enthalten:
(1) eine Alkylgruppe am aminoendständigen Stickstoff, 25
(2) ein alkylsubstituiertes oder unsubstituiertes Amid an der endständigen Carboxylgruppe und
(3*) ein Homoserin an der endständigen Carboxylgruppe, das durch Dehydratisierung in das entsprechende Lacton überführt sein kann.
S-R-E-E; S-R-D-S;
S-R-E-E; S-Q-E-E; P-R-D-E; S-R-S-G; P-S-E-E; S-Q-S-L,-S-R-D-Q; P-S-D-L; S-R-E-E; S-S-N-L; S-R-E-E; S-R-S-S;
T-I-S-K-A-K-G-Q-P-R-S-P-Q-V-Y-T-L-P-P-
T-I-S-K-A-K-G-Q-P-R-E-P-Q-V-Y-T-L-P-P-
T-I-S-K-T-K-G-Q-P-R-E-P-Q-V-Y-T-L-P-P-
?-I-S-K-T-K-G-Q-P-R-S-P-E-V-Y-T-L-P-P-
T-I-S-K-A-K-G-Q-P-R-E-P-Q-V-Y-T-L-P-P-
T-I-S-K-A-K-G-P-P-R-I-P-Q-V-Y-L-L-P-P-
7-1-S-K-T-K-G-Q-P-R-E-P-Q-V-Y-T-L-P-P-
T-I-A-K-V-T-V-N-T-F-P-P-Q-V-H-L-L-?-?-
T-L-S-K-S-G-N-T-F-R-P-Q-V-H-L-L-P-P-P-
T-I-S-K-S-R-G-Q-P-R--S-P-Q-V-Y-T-L-G-P-
7-L-A-K-V-G-V-S-F-L-M-P-E-H-Y-L-I-P-P-
T-I-A-K-P-G-V-K-P-R-S-K-S-V-Y-T-L-P-P-
T-I-S-K-T-R-G-Q-P-R-S-P-Q-V-Y-T-L-P-P-
T-L-S-K-V-K-G-Q-P-R-S-P-Q-V-Y-T-M-P-P-
T-I-S-K-P-G-G-Q-P-R-P-P-S-V-Y-T-L-P-P-
2η -
T-I-S-K-S-T-G-T-P-R-I-P-V-V-Y-T-L-P-P-S-Q-E-E;
T-I-S-K-A-K-V-S-P-R-A-P-Q-V-H-L-L-P-P-P-R-D-E;
T-I-S-K-T-T-G-Q-P-R-A-P-V-V-Y-T-L-P-P-S-R-E-G;
T-I-A-K-V-T-V-T-T-F-P-P-Q-V-H-L-L-G-P-P-S-S-E;
T-L-A-K-T-G-N-T-F-R-P-Q-V-H-H-L-P-P-P-S-Q-E-L;
T-I-S-K-P-R-V-Q-F-R-M-P-V-V-Y-T-L-G-P-s_r_d_q;
T-L-A-K-V-G-V-S-F-L-E-P-S-H-Y-L-I-P-P-P-R-E-E
und dergleichen.
Die Verbindungen der Formel I., die sich zur Modulierung der Immunreaktion warmblütiger Tiere eignen, sind breit einsetzbar. Sie können beispielsweise zur Behandlung von Krebs, Parasiteninfektionen und einem breiten Bereich an Autoimmunerkrankungen verwendet werden.
Die Verbindungen der Formel I können in einer Vielfalt an pharmazeutischen Zusammensetzungen und Formulierungen eingesetzt werden, die eine Verbindung der Formel I als Wirkstoff zusammen mit. ein oder mehr physiologisch unbedenklichen Trägern enthalten, und sie lassen sich nach den verschiedensten herkömmlichen Wegen verabreichen, beispielsweise intramuskulär, intravenös, subkutan, intraperitoneal und oral.
] Für eine parenteral.= oaer intraperitoneal Verabreichung der Verbindungen der Formel I eignen sich als pharmazeutische Formen für eine Injektion beispielsweise sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen oder sterile Pulver, die durch Rekonstitution in sterile injizierbare Lösungen oder Dispersionen überführt werden könne Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispergiermedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (wie Glycerin, Propylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol und der-
"IO gleichen geeignete Mischungen hiervon oder Pflanzenöle enthält. Eine saubere Fließfähigkeit läßt sich beispielsweise aufrechterhalten durch Anwendung eines Überzugs, wie Lecithin, durch Beibehaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle einer Dispersion oder durch Anwendung oberflächenaktiver Mittel. Ein Schutz vor Mikroorganismen läßt sich durch verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel erreichen, beispielsweise durch P.arabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und dergleichen-Gelegentlich kann auch die Mitverwendung isotonischer Mittel wünschenswert sein, beispielsweise von Zucker, Natriumchlorid und dergleichen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form läßt sich durch Verwendung absorptionsverzögemder Mittel erreichen, wie Aluminiummonostearat oder Gelatine .
Sterile injizierbare Lösungen kennen hergestellt werden, indem man die Verbindungen der Formel I in die notwendige Menge des jeweiligen Lösungsmittels einarbeitet, wobei man gewünschtenfalis auch noch verschiedene andere Zusätze verwendet.
Zur Erzielung.einer wirksameren Verteilung können die Verbindungen der Formel I gewünschtenfalls auch in den Wirkstoff langsam freigebende oder geschützte Systeme eingearbeitet sein, wie Polymermatrices,
Liposcmen und Mikrokügelchen
35
Die Verbindungen der Formel I können auch oral verabreicht werden. Sie können mit einem inerten Verdünnungsmittel oder einem pharmazeutischen Träger verwendet werden, der die Form von Kapseln, Tabletten, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, dispergierbaren Pulvern und dergleichen haben kann. Ferner lassen sich die Verbindungen der Formel I entweder allein oder in Form eines Gemisches aus mehreren wirksamen Bestandteilen verabreichen.
Dosen der Verbindungen der Formel I werden dem Rezipienten über eine Zeitdauer verabreicht, während der man eine Modulierung der Immunreaktion haben möchte. Die Größe der zur Einleitung einer bestimmten Wirkung notwendigen Dosis ist abhängig vom Gewicht des Rezipienten und der Art der Verabreichung. Bei einer parenteralen oder intra-1^ peritonealen Verabreichung liegt die Dosis im allgemeinen zwischen etwa 200 μg und 10 mg/kg Körpergewicht des Rezipienten und pro Tag während der gesamten Zeitdauer, während der man eine Modulation der Immunreaktion haben möchte- Vorzugsweise wird die Verbindung in einer Menge ^u von etwa 500 ng bis 5 mg/kg Körpergewicht und Tag verabfolgt.
Besonders zweckmäßig ist.die Formulierung der Verbindungen der Formel I in Einheitsdosierungsform, da sich eine
solche Form leicht verabreichen und gleichförmig dosieren läßt. Unter einer Einheitsdosierungsform wird vorliegend eine physikalisch diskrete Einheit verstanden, die- sich als Einheitsdosis für den zu behandelnden Rezipienten eignet. Jede Einheit enthält eine vorgegebene Menge der
Verbindung, die so berechnet ist, daß sie in Verbindung mit dem pharmazeutisch unbedenklichen Träger den gewünschten therapeutischen Effekt ergibt. Die spezielle Einheitsdosierungsf orm wird bestimmt und ist direkt abhängig von (a) den besonderen Eigenschaften der jeweiligen Zusammensetzung und (b) dem zu erzielenden besonderen therapeutischen Effekt.
] Ausf üh.rungsbeisp iele
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert. Der Schutzumfang soll durch sie in keiner Weise beschränkt sein.
BeisDiel 1
]0 Her ξ te1lung von L-τhreonyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-lysyl-L-alanyl-L-lysyl-glycyl-L-glutaminyl-L-prolyl-L-arginyl·- L-glutarnyl-L-prolyl-L-glutaminyl-L-valyl-L-tyrosy1-L-threonyl-L-leucyl-L-prolyl-L-prolyl-L-seryl-L-arginyl-L-glutamyl-L-glutaravl-L-homoserinlacton aus IgG und desen dessen biologische Stärke
Man bebrütet IQO mg IgG, (?et) , bezogen von Dr. Hans L. Spiegelberg, Scripps Clinic and Research Foundation, mit 1,2 mg Plasmin über eine Zeitdauer von 24 Stunden bei 370C und einem pH-Wert von 7,2. Das erhaltene verdaute IgG1 wird dann auf einer mit Sephadex G-100 gefüllten Säule (1,5 cm χ 75 cm) unter Verwendung von 0,01-molarem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 als Eluiermittel
aufgetrennt
25
Es lassen sich zwei Maxima feststellen. Jedes Maximum wird gesammelt und bezüglich seiner Fähigkeit analysiert B-Zellen der Milz einer Maus zur Abscheidung von poly-
klonaiem Antikörper zu veranlassen. Dieses Verfahren wird on ou in J. Immun. 124, 1330 (1980) beschrieben. Nur das Maximum II enthält biologisch aktives Material, wie sich aus folgender Aufstellung ergibt.
PFC/10°
Maximum I 35
Maximum Ii . 98+1
2QJilL1983*iO4Si-;-;
] Das aus dein Maximum II erhaltene Material (50 mg) löst man in 0,7 ml 88%-iger Ameisensäure. Man gibt einen 100-fachen Überschuß (Gewicht/Gewicht) an CNBr zu und läßt das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur reagieren.
5' Das erhaltene Gemisch wird auf Trockeneis eingefroren und zur Entfernung eines Überschusses an CNBr lyophilisiert.
Das bei der Lyophilisierung erhaltene Produkt unterzieht man einer Molekularausschlußhochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) unter Verwendung von zwei in Tandemanordnung befindlichen und mit Protein 1-60 gefüllten Säulen (7,8 mm χ 30 cm) (Waters Associates, Inc., Medford, Massachusetts, V.St.A.) in einer Waters HPLC Apparatur. Der Puffer der mobilen Phase besteht aus 0,1-molarem NH HCO . Die Elution wird bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt und bei 210 nm überwacht. Ss werden zwei Maxima, die als Sammlung 1 und Sammlung 2 bezeichnet werden, gewonnen und bezüglich ihrer Fähigkeit zur Einleitung einer polyklonalen Antikörperreaktion untersucht. Hierbei gelangt man zu folgenden Ergebnissen:
PFC/106
Sammlung 1 11 +_ 1 .
Sammlung 2 151 +_ 15
Die obigen Werte zeigen, daß sich das aktive Fragment in der Sammlung 2 befindet.
Das Material aus der Sammlung 2 unterzieht man einer Umkehrphasen HPLC unter _Verwendung einer mit TMS-Zorbax (Dupont Instrument, Wilmington, Del., V.St.A.) gefüllten Säule (4,6 mm χ 25 cm). Das Peptid wird unter Anwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 100 % Puffer B im Puffer A eluiert, wobei man 45 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min entwickelt. Der Puffer A ist zusammengesetzt aus 5 % CH-CN in 0,1 % H PO4 und der Puffer B aus 95 % CH-CN in 0,1 % H-PO . Die Elution wird
~ 25 -
•j durch die Absorption bei 210 nm überwacht.
Es werden fünf Sammlungen (A bis Ξ) gesammelt, wobei jede Sammlung hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht wird, B-Zellen der Milz von Mäusen zu einer Abscheidung von polyklonalem Antikörper zu bringen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Aufstellung hervor:
PFC/106
Sammlung A 95 + 2
Sammlung B 19 +_ 6
Sammlung C 10+4
Sammlung D 3 +_ 3
]5 Sammlung E 2 +_ 1
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß lediglich das Material aus der Sammlung A zu einer Einleitung einer polyklonalen
Antikörperbildung befähigt ist
20
Die Aminosäurezusammensetzung des Peptids der Sammlung A wird unter Verwendung eines Aminosäureanalysators von Beckmann, Modeil 121M, bestimmt. Die Probe wird 2 4 Stunden in einer evakuierten Ampulle mit 0,5 ml 1n HCl, 1 ml zo 88%-igem Phenol und 1 ml 2-Mercaptoethanol hydrolysiert-Hierbei gelangt man zu folgenden Ergebnissen auf Mol/Mol-Basis:
Thr = 2,02, Ser =.1,98, GIu = 5,01, Pro = 4,41, GIy = 1,08,
AIa = 1,01, VaI = 0,97, He = 0,98, Leu = 1,07, Tyr = 0,57,
Lys =1,97, Arg = 2,04, His = 0,11, Asp = 0,0, Phe = 0,0, Met = 0,0*
* Das Methionin wird durch Spaltung mit CNBr in Homoserin-
lacton überführt, so daß es sich nicht mengenmäßig bestimmen läßt.
] Beispiel 2
Herstellung von L-Threonyl-L-isoleucyl-L-seryl-L-lysyl-L-alanyl-L-lysyl-L-glycyl-L-glutaminyl-L-prolyl-L-arginyl-L-glutamyl-L-prolyl-L-glutaminyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-
glutamyl-L-glutaminsäure
^-· N-t-Butyloxycarbonyl-L-(γ-cyclopentyl)glutaminsäurehydroxymethylpolystyrolharzester
Man versetzt 50 ml 95%-iges Ethanol mit 3,784 g (12,0 mMol) N-t-Butyloxycarbonyl-L-(γ-cyclopentyl)-glutaminsäure. Die erhaltene Lösung wird dann mit
12,0 ml 1 η Cäsiumbicarbonatlösung versetzt, wodurch es gleichzeitig zur Entwicklung von CO_ kommt. Das Gemisch wird unter Vakuum zu einem Öl eingedampft. Das Öl wird in einem Gemisch aus Benzol und 95 % Ethanol gelöst und die erhaltene Lösung erneut eingedampft. Dieser Vorgang der azeotropen Entfernung von Wasser wird solange, wiederholt, bis das Wasser abgetrennt und ein weißer Feststoff entstanden ist.
Das Cäsiumsalz der geschützten Glutaminsäure wird in 2 00 ml N,N-Dimethy!formamid (DMF) gelöst, worauf man das- Gemisch in ein mit einem Rührer und einem Trockenröhrchen versehenes Gefäß gibt und unter trockener Stickstoffatmosphäre hält. Unter Aufrechterhaltung
der Stickstoffatmosphäre versetzt man das Ganze dann
mit 20,0 g chlormethyliertem Polystyrolharz (Merrifield Resin) (etwa 0,7 mMol Chlor pro g Harz). Das Gemisch wird etwa 72' Stunden bei 500C gerührt.
Das Harz wird durch Filtrieren gesammelt, worauf man es dreimal mit einer Folge aus zuerst einem Gemisch aus 8 5 % DMF und 15 % HO,
dann dreimal mit 95%-igem Ethanol und schließlich einmal mit DMF wäscht. Das Harz wird dann unter
Vakuum getrocknet, wodurch man zu 21 g eines Materials gelangt, das aufgrund einer Analyse etwa 0,2 inMol Glu pro g Harz enthält.
Das Harz wird in 200 ml DMF suspendiert und mit 5,96 g (31 mMol) Cäsiumacetat (Hydrat) versetzt. Das Gemisch wird in einer Atmosphäre aus trockenem Stickstoff etwa 72 Stunden bei 6O0C gerührt.
Das Harz wird durch Filtrieren gesammelt und mit DMF,
8 5%-igem DMF und 95%-igem Ethanol unter Anwendung einer ähnlichen Folge wie oben beschrieben gewaschen. Zur Entfernung der Feinstoffe suspendiert man das Harz in CHCl-. (sechs Anteile) in einem Scheidetrichter und zieht das CHCl^ ab. Das Harz wird filtriert, mit
9 5%-igem Ethanol gewaschen und über Macht unter Vakuum bei 450C getrocknet.
B. N-t-Butyloxvcarbonyl-L- (0-benzyl)threonyl-L-isoleucyl-L-(p-benzyl)seryl-L-CN^-o-chlorbenzyloxycarbonyl)-lysyl-L-alanyl-L-(N^-o-chlorbenzyloxycarbonyl)lysylglycyl-L-glutaminyl-L-prolyl-L·-(N-p-tosyl)arginyl-L-(γ-cyclopentyl)glutamyl-L-prolyl-L-glutaminyl-L-valyl-L-[O- (2,6-dichlorbenzyl) ] tyrosyl-L- (o-benzyl) threonvl- L-leucyl-L-prolyl-L-prolyl-L-(Q-benzyl)seryl-L-(N-p-tosyl)arginyl-L-(γ-cyclopentyl)glutamyl-L-(γ-cyclopentyl)-glutaminsaurehydroXymethylpolystyrolharZester
Man gibt 20,15 g eines gemäß Teil A hergestellten N-t-Butyloxycarbonyl-L-(γ-cyclopentyi)glutaminsäurehydroxymethylpolystyroiharzesters in ein Peptidsynthesegerät Modell 9903 von Beckrnan und behandelt das Ganze darin mit der folgenden Reihe an geschützten Aminosäuren unter Anwendung eines oder mehrerer der im folgenden angegebenen Schemata:
-j ' 1. N-t-Butyloxycarbonyl-L-(γ-cyclopentyl)-glutaminsäure
Schema A - 5,05 g Schema B- 3,73 g
2. N-t-Butyloxycarbonyl-L-(N-p-tosyl)arginin
Schema A- 6,85 g η Schema 3 - 5,14 g
Schema 3 - 5,14 g
3. N-t-Butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)serin
Schema A - 4,72 g
Schema 3 - 4,7 2 g
4. N-t-Butyloxycarbonyl-L-prolin
Schema A- 3,4 6 g
Schema B - 3,4 6 g
5. N-t-Butyloxycarbonyl-L-leucyl-L-prolin
Schema A - 5,27 g
Schema B- 5,27 σ
6. N-t-Butyloxycarbonyl-L-(O~benzyl)threonin
.30 ' Schema A- 4,95 g Schema 3 - 4,95 g
7. N-t-Butyloxycarbonyl-L--[O-{ 2 , β-äichlorbenzyl] tyrosin
Schema Ä - 7,04 g Schema 3 - 7,04 g
] 8. N-t-Butyloxycarbonyl-L-Vilirv Schema A - 3,4 8 g
Schema 3-2,6Og
Schema 3 - 2,6 0 g
9. N-t-Butyloxycarbonyl-L-glutamin-p-nitrophenylester
Schema C - 5,88 g }Q Schema D - 5,88 g
0'. N-t-Butyloxycarbonyl-L-prolin
Schema A - 3,46 g Schema 3 - 3,46 g
1 . N-t-Butyloxycarbonyl-L-(γ-cyclopentyl)glutaminsäure
Schema A - 5,05 g
Schema 3 - 3,7 8 g
12. N-t-Butyloxycarbonyl-L-(N-p-tosyl)arginin
Schema A - 6,85 g a Schema B - 5,14 g Schema B - 5,14 g
13. N-t-Butyloxycarbonyl-L-pro.iin -
Schema A - 3,4 6 g Schema 3 - 3,46 g
14. N-t-Butyloxycarbonyl-L-glutamin-O-nitrophenvlaster 35
Schema C - 5,88 g Schema D - 5,88 g
- 30 15. N-t-Butyloxycarbonylglycin
Schema A - 2,80 g
16. N-t-Butyloxycarbonyl-L- (N^-o-chlorbenzyloxycarbonyl)lysin
Schema A - 6,64 g Schema 3 - 6,64 g TO
7 .- N-t-Butyloxycarbonyl-L-alanin
Schema-A - 3,03 g
18. N-t-Butyloxycarbonyl-L- (M*-o-chlorbenzyloxycarbonyl)lysin
Schema A - 6 , 6 4·g
Schema B - 6,64 g 20
19. N-t-Butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)serin
Schema A - 4,72 g
Schema B - 4,72 g 25
20. N-t-Butyloxycarbonyl-L-isoleucin
Schema A - 3,70 g
Schema 3 - 3,70 σ 30
"21. N-t-Butyloxycarbonyl-L-(O-benzyl)threonin-
Schema A - 4,95 g Schema B- 4,95 g
Fußnoten: a) 1:9
b) DMF
- 31 Schema A
1. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml CH9Cl9 pro g Harz.
2. Entfernung der t-Butyloxycarbonyl-a-aminoschutzgruppe, zweimalige Behandlung über eine Zeitdauer von 20 Minuten mit jeweils 3,4 ml eines Gemisches aus
Trifluoressigsäure (29 %), CH9Cl3 (65 %) und Triethylsilan (6 %) pro g Harz.
3. Dreimaliges Waschen über eina Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml CH9Cl pro g Harz.
'^ 4. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml eines Gemisches aus 90 % t-BuOH und 10 % t-AmOH pro g Harz.
5. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten
mit jeweils 6,5 ml CH9Cl_ pro g Harz.
6. Neutralisation durch dreimaliges Behandeln über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml eines Gemisches aus 4 % Diisoprooylethylamin in CH9Cl9
„ " " 2 2
pro g Harz.
7. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten
mit jeweils 6,5 ml CH9Cl9 pro g Harz.
8. Dreimaliges Waschen 'über eine Zeitdauer von 3 Minuten
mit jeweils 6,5 ml eines Gemisches aus 90 % t-BuOH und 10 % t-AmOH pro g Harz.
9. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml CH9Cl9 pro g Harz.
10. Kupplung der Aminosäure durch Behandlung mit der geschützten Aminosäure und mit N,M'-Dicyclohexylcarbo-
] diimid (50 % auf Molbasis in Bezug auf die Aminosäure) in 8 0 ml CH9Cl2 über eine Zeitdauer von 110 Minuten.
11. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml CH Cl pro g Harz.
12. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml eines Gemisches aus 90 % t-BuOH und 10 % t-AmOH pro g Harz.
13. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml CH CL pro g Harz.
14. Neutralisation durch dreimalige Behandlung über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml eines Gemisches aus 4 % Diisopropylethylamin in CH Cl2 pro g Harz.
15. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml CH9Cl9 pro g Harz.
16· Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml eines Gemisches aus 90 % t-BuOH und. 10 % t-AmOH pro g Harz
25
17. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml CH9Cl9 pro g Harz.
Schema 3
1. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml DMF pro g Harz.
~° 2. Kupplung der Aminosäure durch Behandlung mit der geschützten Aminosäure und mit M,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (50 % auf Molbasis im Verhältnis zur Aminosäure) in 80 ml eines 1:1-Gemisches aus DMF und
ι CH9Cl9 über eine Zeitdauer von 110 Minuten.
3. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml DMF pro g Harz.
4. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten
mit jeweils 6,5 ml CH Cl9 pro g Harz.
5. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten ig mit jeweils 6,5 ml eines Gemisches aus 90 % t-BuOH und 10 % t-AmCH pro g Harz.
6.. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml CH9Cl9 pro g Harz.
7. Neutralisation durch dreimaliges Behandeln über eine
Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml eines Gemisches aus 4 % Diisopropylethylamin in CH9Cl pro g Harz.
8. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml CH Cl pro σ Harz.
9. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml eines Gemisches aus 90 % t-BuOH und 10 % t-AmOH. pro g Harz.
10. Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml CK CL pro g Harz.
Schema C
Dieses Schema C ist gleich wie das Schema A mit Ausnahme der Stufe 10 der Aminosäurekupplung. Diese Stufe 10 des Schemas A wird durch eine Folge aus den im folgenden erwähnten Stufen ersetzt:
a) Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml DMF pro g Harz.
b) Kupplung der Aminosäure durch Behandlung mit dem aktiven geschützten Aminosäureester in 80 ml eines 3:5-Gemisches aus DMF und CH Cl über eine Zeitdauer von 10 Stunden.
c) Dreimaliges Waschen über eine Zeitdauer von 3 Minuten mit jeweils 6,5 ml DMF pro g Harz.
Schema D
-j 5 Dieses Schema D ist gleich wie das Schema 3 mit Ausnahme der Stufe 2 der Aminosäurekupplung. Die Stufe 2 wird beim Schema D nämlich wie folgt durchgeführt:
Kupplung der Aminosäure durch Behandlung mit dem ge- OQ schützten aktiven Aminosäureester in 80 ml eines 5:3-Geinisches aus DMF und CH9Cl7 über eine Zeitdauer von 10 Stunden.
lysyl-glycyl-L-glutaininyl-L-prolyl-L-arginy'l-L-glutamyl-L·-prolyl-L-glutaIrίinyl-L·-valyl-L·-tyrosyl-L·-thraonyl-L-le·αcyl-L-prolyl-L-prolyl·-L·-seryl·-L-arginyl-L·-
glutaxnyl-L-'jlutaminsäure
Man versetzt 16,5 g des Harzproduktes von Teil 3 mit 23 ml Anisol und 23 ml Ethy!mercaptan. Das Gemisch wird in einem Bad aus flüssigem Stickstoff eingefroren,
-j π und in das Gemisch überträgt man durch Destillation 250 ml flüssigen KF. Das Bad aus flüssigem Stickstoff wird durch ein Eis-Wasser-Bad ersetzt und das Gemisch 2 Stunden bei 00C gerührt. Sodann entfernt man den HF unter Vakuum und versetzt das zurückbleibende
]5 Material mit Ethylacetat, um so das Peptidprodukt auszufällen. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Ether gewaschen und an der Luft getrocknet. Der Niederschlag, der aus deblockiertem Peptid und Harz besteht, wird in 25 ml 50%-iger Essigsäure aufgeschlämmt und filtriert. Der Rückstand (Harz) wird dann mit 10 ml 50%-iger Essigsäure gespült und dann wieder in 0,2-molarer Essigsäure aufgeschlämmt, worauf man das Ganze erneut filtriert und mit 10 ml 50%-iger Essigsäure spült. Das Harz wird dann viermal mit jeweils 30 ml 0,2-molarer Essigsäure extrahiert und mit Wasser gewaschen. Waschflüssigkeiten und Extrakte werden vereinigt und durch Glasfasern filtriert, wodurch man zu insgesamt 350 ml 6,9%-iger wässriger Essigsäure gelangt, die das deblockierte Peptidprodukt enthält.
Die das deblockierte Peptidprodukt enthaltende Essigsäurelösung wird auf eine mit Sephadex G-2 5F gefüllte und 10 χ 225 cm messende Säule gegeben, die mit entgaster 0,2-molarer Essigsäure äquilibriert worden ist.
Die Säule wird zuerst unter normaler Schwerkraft mit 0,2-molarer Essigsäure über eine Zeitdauer von 16 Stunden und dann bei 773,3 g/cm2 während der restlichen Zeit eluiert. Die optische Dichte (OD) des
Eluats wird mit einem Gerät von ISCO, Modell üV-5, unter Anwendung einer 1,0 cm Durchfluß zelle und eir.c-Ξ Filters zur Überwachung bei 2SO nm überwacht. Hierbei werden folgende Sammlungen mit den angegebenen Elutionsvoiumina und Gesamtvolumina hergestellt:
I 0-94 00 9400
Ii 94 0 0-10420 1020
III 10420-10970 550
IV 10970-11435 ' 465
V. 11435-12165 730
Die Sammlung II, die etwa 500 mg enthält, unterzieht man einer präparativen Umkehrphasenhochleistungsflüss-igkeitschromatographie (HPLC) unter folgenden
Bedingungen: 20
Säule: 5,0 cm χ 60 cm
Packung: C.~ LP-1
Lösungsmittel: 15% CH1CN/ 0,05-molar an HCOONH4, mit HCOOH auf pH 4,25 eingestellt Fließgeschwindigkeit: etwa 10 ml/min Überwachung bei 23 0 nm
Bei einem Elutionsvolumen von 1985 bis 23 79 ml erscheint ein Maximum. Dieses Maximum wird gesammelt, lyophilisiert und durch UV-Absorption untersucht, wodurch sich ein Peptidgehalt von etwa 180 mg ergibt;.
Das gewonnene Peptid wird in 50 ml 0,01n HCl mit einem Gehalt von 7 Mol Harnstoff gelöst und unter folgenden Bedingungen einer Chromatographie über Sephadex G-5CF unterzogen:
- ό ι -
] Säule: 5,0 cm χ 215 cm
Packung: Sephadex G-5Q Feinkorn Lösungsmittel: 1-molare Essigsäure Fließgeschwindigkeit: etwa 2,5 rni/min
Das Produktwird bei einem Eiutionsvolumen von 2690 bis 3120 ml gesammelt, lyophilisiert und durch UV-Absorption untersucht, wodurch sich ein Peptidgehalt von etwa 80 mg ergibt.
Aminosäureanalyse:
Thr = 1,93, Ser '= 2,03, GIu = 5,28, Pro = 4,19, GIy = 0,99, AIa = 1,00, VaI = 0,99, He = 0,93, Leu = 1,02, Tyr = 0,98, Lys = 2,00, Arg = 2,04.
Die obigen Ergebnisse sind Mittelwerte von 21 Stunden und 72 Stunden Hydrolysäten unter einem Verhältnis von 0,25 von GIy, AIa und Lys, mit der Ausnahme, daß Thr und Ser auf eine Hydrolyse von 0 Stunden extrapoliert worden sind und VaI auf eine Hydrolyse unbegrenzter Zeit extrapoliert worden ist.
Die Fähigkeit der Verbindung der Formel 1 zu einer Modulierung einer Iinmunreaktion wird anhand einer Reihe von Untersuchungen belegt. Bei jeder der folgenden Untersuchungen wird die gemäß Beispiel 2 hergestellte Verbindunc verwendet.
A.' Versuch zur Ermittlung der polyklonalen Antikörperreaktion
Bei diesem Versuch wird die Wirksamkeit der Versuchsverbindung zur Verstärkung einer polyklonalen Reaktion in vitro unter Verwendung von Mierenzellen der Maus und peripheren Biutzellen des Menschen gemessen.
1. Versuch an der Maus
Zur Erzeugung der polyklonalen fleckenbildenden Zellreaktion (PFC) suspendiert man Milζ zellen von Mäusen in einer Konzentration von 5x10 pro ml in RPMI 1640 (Flow Laboratories, Rockville, Md., V.St.A-)/ das ergänzt ist ^5 mit 2 mMol L-Glutamin, 1 % ΒΜΞ Vitaminen (Grand Island ' Biological Co., N.Y., V.St.A.), 100 Einheiten Penicillin, 100 μg Streptomycin, 5x10 Mol 2-Mercaptoethanol '(2-ME), 0?5 % frischem normalem Mäuseserum und 7,5 % Rinderfetenserum (FCS). Man gibt eine vorbestimmte Menge der Versuchs-
Of) 5
ζυ Verbindung zu. Doppelkulturen von 6x10 Zellen pro 0,3 ml inkubiert man auf Mikrotiterplatten bei 37°C in 5 % CO„. Die Doppelkulturen werden am dritten Tag geerntet und bezüglich ihrer Reaktion auf 2,4,6-Trinitrophenyl (TNP) durch die Objektträgermodifikation des Blättchenversuchs untersucht, wie er in Science 140, 405 (1963) beschrieben ist. Nach dem in J. Immunol. 104, 1558 (1970) beschriebenen Verfahren stellt man stark konjugierte TNP-rote Blutzellen von Schafen (TNP-SRBC) her, die man dann als roten Blutzellenindikator (RBC) verwendet. Serum von Meerschweinchen
dient als Quelle für Komplement (C) zur Entwicklung der direkten oder IgM-Blättchen. Die Ergebnisse dieses Blättchenbildungsversuchs gehen aus der folgenden Tabelle I hervor und sind ausgedrückt als Mittelwert aus PFC/10 Ursprungs zellen von Doppelsammlungen + der Standard-
^
Fenlergrenze.
Polyklonale Antikörperbildung durch Milzzellen von Mäusen
Verbindung iiiq/ml) Direkte Anti-TNP-Reaktion
PFC/10 + SF*
β _+ 7
0,025 87^3
0,25 201 +_ 5
2,5 . 31 J1 16
* SF = Standardfehlergrenze 15
2. Untersuchungen am Menschen
Diese Untersuchungen werden unter Verwendung peripherer Blutlymphozyten (P3L) von Menschen durchgeführt. Die peripheren Blutlymphozyten (PBL) werden hergestellt, indem man heparinisiertes peripheres Blut mit 2 Volumina einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) verdünnt, die mit 0,001 Mol Phosphat auf pH 7,2 eingestellt ist und 0,15 Mol NaCl enthält. Die Lymphozyten werden nach dem in J. Εχρ.
Med. 154, 778 (1981) beschriebenen Verfahren durch Gradientenzentrifugierung mit Ficoll-Paque (Pharmacia) abgetrennt.
Die PBL-Suspensionen werden bezüglich ihrer 3- und C-Zelien ou nach der in J. Exp. Med. 154, 778 (1981) beschriebenen Neuraminidase behandelten SRBC-Rosettentechnik angereichert. Die keine Rosetten bildenden Zellen werden als B-Zellen bezeichnet, und die monozytär angereicherten und Rosetten bildenden Zellen bezeichnet man als ange- ^3 reicherte T-Zellen. Die T-Zellenpopulation unterzieht man vor ihrer Verwendung beim vorliegenden Versuch einer Bestrahlung mit 2000 R.
] Die humane polyklonale Antikörperreaktion mißt man unter Verwendung eines Gemisches aus 1x10 3-Zellen und 2x10 bestrahltenT—Zellen, das man mit einer vorbestimmten Menge an Versuchsverbindung versetzt. Die Zellen v/erden wie oben für den polyklonalen Versuch an der Maus beschrieben suspendiert und behandelt, mit der Ausnahme, daß man die Kulturen nicht am dritten Tag, sondern erst am sechsten Tag erntet. Die dabei erhaltenen Versuchsergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle II hervor.
Polyklonale Antikörperbildung durch periphere Blutlymphozyten beim Menschen
Verbindung (.ug/ml) Ig abscheidende Zellen pro
10° B-Zellen + SF
. - 65 τ- 1
0,003 1.217 + 37
B. In vitro Anti-SRBC-Ädjuvansversuch 25
1. Untersuchungen an der Maus
Man entimmt die Milz von Mäusen, welche man 4 bis 6 Wochen vorher intraperitoneal mit 0,1 ml einer 10%-igen Suspension von SHBC gespritzt hat. Zur Erzeugung antikörperbildender Zellen verwendet man ein abgewandeltes Kultursystem von Mishell-Dutton. Die Zellen suspendiert man in einer Konzentration von 6x10 pro' ml RPMI-1640, das ergänzt ist mit 2 mMol L-Glutamin, 1 % 3ΜΞ Vitaminen, 100 Einheiten Penicillin, 100 μg Streptomycin, 5x10~° Mol 2-Me, 7,5 % FCS und 0,5 %. frischem normalem Mäuseserum.
Die Milzzellen züchtet man bei einer Konzentration von
5 4
6x10 zusammen mit 5x10" SRBC und einer vorbestimmten
] Menge an Versuchsverbindung in einem Endvolumen von 0,3 ip.~ in flachbödigen Mikrotiterplatten über eine Zeitdauer von 4 Tagen bei 370C in 5 % CO . Die direkte Anti-SRBC-Reaktion wird durch die Objektträgermodifikation des in Science 140, 40 5 (1963) beschriebenen Blättchenversuchs gemessen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle III hervor und' sind aufgezeichnet als direkte Anti-SRBC-Reaktion PFC pro 10 ursprünglicher Zellen + der Standardfehlergrenze. 10
Tabelle III Verbesserung der Anti-SRBC-Reaktion in vitro an der Maus
Verbindung (.ug/mi) SR3Ca Direkte Anti-SRBC-Reaktion PFC/Kultur + SF
+ 129 J1 9
0,03 + 560 τ 1i
a 5 χ 10' SRBC/Kultur
2, Untersuchungen am Menschen
Zur Ermittlung der primären Anti-SRBC-Reaktion geht man wie in Jc Exp. Med. 154, 1069 (1981) beschrieben vor. Man züchtet periphere Blutlymphozyten (5 χ 10 ) in 1 ml RPMI-16 40, das ergänzt ist mit 2 mMol L-Glutamin, 1 % 3MS
3Q Vitaminen, 10 Ξ Penicillin, 100 ug Streptomycin, 5 χ 10 Mol 2-ΜΞ und 10 % an SRBC-absorbiertem autologem Humanplasma. Die gewünschte Menge an Versuchsverbindung plus 1x10 SR3C gibt man vor der Züchtung zu. Man hält die Kulturen in bagasten Kästen, die man 11 Tage lang unter 7 oder 3,5 Cyclen pro Minute schüttelt. Jeden zweiten Tag versetzt man die Kulturen mit einem Gemisch aus autologem Plasma gemäß J. Sxp. Med. 126, 423 (1967).
Am 11. Tag der Züchtung mißt man die direkte oder IgM-Reaktion nach dem in Science 140, 405 (1963) beschriebenen Blättchenversuch. Die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle IV hervor und sind aufgezeichnet als direkte Änti-SRBC-Reaktion ?FC/Kultur -r der Standardf ehlerarenze .
Verbindung (ng/ml) SRBCa Direkte Anti-SRBC-Reak-9fl tion
PFC/Kultur + SF
+ 49 τ 4
0,03 + . · 292+16
a 1x10b SR3C/Kultur
C. In vivo Anti-SRBC-Andjuvansversuch 30
Man gibt Gruppen aus jeweils vier Mäusen intraperitoneal jeweils 0,1 ml einer SRBC-Suspension und spritzt ihnen unmittelbar daran intravenös eine Kochsalzlösung oder eine Kochsalzlösung, die die Versuchsverbindung enthält. Fünf OJ Tage nach Immunisierung untersucht man die Milz bezüglich ihrer PFC-Reaktion im Verhältnis zu den SRBC-werten. Die dabei erhaltenen Versuchsergebnisse gehen aus der folgen- -. den Tabelle V hervor.
- 43 - ] ' Tabelle V
SRBCa Verbindung ^g/Maus) Direkte Anti-SRSC-Reaktion
PFC/10 + S?
23 +_ 3 10 120+5
Jeder Maus spritzt man O7I ml einer 0,1%-igen Suspension.
®·
Versuch zur Zellübertragungslympholyse (CML)
Durch diesen Versuch wird die Fähigkeit der Versuchsverbindung zur Erhöhung der zytolytischen Reaktion von T-Zellen gemessen.
1. Induktion zytotoxischer Zellen (Sffektorzellen)
Man züchtet normale C5 73L/6 T-Zellen (2,5x10°) fünf Tage mit 2,5x1O3 bestrahlten (20. R) CBA/CaJ Milzzellen bei 370C in 5 % CO~ (Sndvolumen = 0,3 ml) in flachbödigen Mikrotiterplatten. Das Kulturmedium.besteht aus RPMI-1640, das ergänzt ist mit 2 mMol L-Glutamin, 1 % ΒΜΞ Vitaminen, 100 S Penicillin, 100 mg Streptomycin, 5x10 Mol 2-Mercaptoethanol (2-ΜΞ) und 10 % Kälberfetenserum (FCS).
2. Herstellung von Zielzellen
Zwei Tage vor Beginn des Versuchs bildet man CBA/CaJ Blastozellen (Zielzellen) durch Inkubierung von 5x10 CBA/CaJ Mllzzellen pro Röhrchen mit 20 )j.g/ml Lipopolysaccharid (LPS) in der oben für die normalen T-Zellen beschriebenen Weise.
] Am Versuchstag werden die Blastozellen geerntet und mit
Cr markiert, indem man 2x10 Elasten 50 Minuten mit 200 \xC± Cr (Natriumchromat) inkubiert· Die Zellen werden dann gewaschen und in RPMI-1640 resuspendiert, das 10 %
κ FCS enthält.
3. Versuch
Unterschiedliche Anzahlen an Effektorzellen züchtet man ]Q mit einer konstanten Anzahl an markierten Zielzellen vier Stunden in rundbödigen Kunststoffröhrchen mit den Abmessungen 12x75 mm. Am Ende der vier Stunden zentrifugiert man die Zellen 5 Minuten bei 1000 U/min und analysiert die überstehende Flüssigkeit bezüglich freigesetztem Cr. Die Versuchsdaten,die als prozentuale spezifische Freisatzung (SR) angegeben sind, werden in folgender Weise- ermittelt:
, exceriiiientelle Freisetzung - spontane Freisetzen
prozentuale - 3
maxiinale Freisetzung - spontane Freisetzung
Hierin ist die spontane Freisetzung die Menge an in Abwesenheit von Effektorzellen freigesetztem Cr, während die maximale Freisetzung die Menge an nach dreimaligem Einfrieren und Auftauen der Zielzellen freigesetzte Menge
an" Cr bedeutet.
Die dabei erhaltenen Versuchsergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle VI hervor.
Verbesserung der CML-ReaktjLon
Verbindung Verhältnis aus Effektorzellen prozentuale (μg/inl) und Zielzellsn Freisetzung
an 51Cr
10 12 z 2
0,17 10 72+2
E. Verbesserung der durch periphere Blutlymphozyten (PBL) eingeleiteten Proliferationsreaktion von Tetanustoxoidantigen
Man züchtet P3L-Zellen (4x10 Zellen) mit 1 ug/ml Tetanus-' toxoid in RPMI-1640, das ergänzt ist mit 2 üiMol L-Glutamin, 1 % ΒΜΞ Vitaminen, 100 E Penicillin, 100 ng Streptomycin λλ und 10 % humanem AB-Seruiu. Die Kulturen beschallt man am sechsten Tag mit 1 uCi [ H]Thymidin (TdR), und sie werden 24 Stunden später geerntet und mit einem 3-Zähler ausgezählt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle VII hervor.
Verbesserung der durch PBL eingeleiteten Proliferationsrekation von Tetanustoxoid .
Verbindung (ug/ml) Tetanustoxoid (ug/rnl) Aufnahme von
[3H]TdR cpm + SF
5133 +_ 2069
- 1 41770 +_
0,013 1 101730 +
Claims (10)
- - .46 Erfindungsansprüche1. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden der Formel I mit der StrukturR-Thr-a-b-Lys-d-e-f-g-h-j-k-1-m-n-p-q-t-u-Pro-v-w-x-y-'" worin jeder Aminosäurerest eine L-Konfiguration hat,R für Wasserstoff oder C. -C -Alkyl steht,R. für OH oder NR R^ steht, worin R_ und R4 unabhängigWasserstoff oder C -C -Alkyl sind , .und die anderen Symbole folgende Bedeutungen haben:a = He oder Leu, 'b = Ser oder Ala,d = AIa, Ihr, Pro, VaI oder Ser,e '= Lys, Arg, Ihr oder GIyf = GIy, VaI oder Asn,g = Gin, Lys, Ser/ GIu, Pro, Ala, Asn oder Thr,h = Pro, VaI, Thr oder Phe,j = Arg, Leu, Pro oder Phe,k = Glu, Ala, He, Met oder Pro-,1 = Pro, Lys oder Gin,m = Gin, GIu oder VaI,^q η = VaI oder His,ρ = Tyr, His oder Leu,q = Thr, VaI oder Leu,t = . Leu, He, Met oder Pro,u = Pro oder GIy,ν = Ser oder Pro,w = Arg, GIn, Glu oder Ser,χ = Glu, Asp, Gin oder Asn,y = Glu, Gin, GIy oder Leu,] ζ = Hsa und
r = O oder 1,dadurch gekennzeichnet, daß man ein entsprechend geschütztes Peptid der Formel I mit einem Deblockierungsrnittei von Schutzgruppen befreit. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Peptid der Formel II IO(R5)(Rg)Thr-a-(R6)b-(R8)Lys-(R6)d-(R7)e-f-(Rg)g-(Rg)h-(R8) j-(R10)k-(R11)1-(R10)m-(Rg)n-(R7)p-(R5)q-t-u-Pro-(R6)V-(R9)W-(R10)X-(R10)y-[ (R6) z]r-Z ,verwendet,worin R,- Wasserstoff, C1-C--Alkyl oder eine a-Aminoblockiergruppe ist,R^ Wasserstoff oder eine Hydroxylschutzgruppe bedeutet,R_ Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe oder eine Hydroxyschutzgruppa darstellt,R1- Wasserstoff oder eine Aminoschutzarupoe ist,Rp für Wasserstoff, eine Aminoschutzgruppe, eineHydroxylschutzgruppe oder eine Carboxylschutzgruppe steht,R10. Wasserstoff oder eine Carfaoxylschutzgruppedarstallt,- Δ S -R11 Wasserstoff, eine Carboxy!schutzgruppe oder eine Aminoschutzgruppe ist,Z für Hydroxy, NR3R4, worin R3 und R4 unabhängig Wasserstoff oder C-C3-AIkVl sind oder einen Harzträger steht,mit der Maßgabe',daß wenigstens einer der Substituenten R,-bis R11 eine andere Bedeutung als Was falls Z für Hydroxy oder NR^R, steht.bis R11 eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben muß/
- 3.· Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Deblockierungsrnittel eine starke Säure verwendet.
15 - 4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säure flüssigen HF verwendet.
- 5. Verfahren nach Punkt 3, dadurch Gekennzeichnet, daß . . "man als starke Säure HCl in Sisessia verwendet.
- 6. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als starke Säure Ameisensäure (95%-ig oder stärker konzentriert) verwendet.
- 7. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man, falls Z für einen Harzträgex" steht, als Deblockierungsmi ttel. Methanoi und dann eine starke Säure verwendet
- 8. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daßman als Deblockierungsmittel Methanol und Kaliumcyanid in Anwesenheit eines Kronenethers und dann eine starke Säure verwendet.
- 9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Deblockierungsmittel, falls Z ein Harzträger ist, Hydrazin oder ein Airunonclysersagens und dann eine Hydrolyse sowie eine starke Säure anwendet.
- 10. Verfahren nach Punkt 1,zur Herstellung von H-Thr-Ile-Ser-Lys-Ala-Lys-Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Vai-Tyr-Thr-Leu-Pro-Ser-Axg-Glu-Glu-OH, dadurch gekennzeichnet, daß man' N-t-3utyloxycarbonyl-(O-benzyl)Thr-Ile-(O-benzyl)Ser-(N^-o-cniorbenzyloxycarbonyl)Lys-Ala-(N^-o-chicrbenzyloxycarbonyl)-Lys-Gly-Gln-Pro-(M-p-tosyl)Arg-(γ-cyclopentyl)Glu-Pro-Gln-VaI-[O-(2,6-dichlorbenzyl)]Tyr-(O-benzyl)Thr-Leu-Pro-Pro-(O-benzyl)Ser-(M-p-tosyl)Arg-(γ-cyclopentyl)GIu-(γ-eyeIopentyliGlutarninsäurehydroxymethylpclystyrolharzester niit flüssigein KF umsetzt.
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