DD228302A1 - Verfahren zur herstellung eines polyether-aehnlichen antibiotikums - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines polyetheraehnlichen Antibiotikums, Griseochelin, das eine inhibitorische Wirkung gegenueber grampositiven Bakterien aufweist und auf Grund der allgemeinen Eignung von Polyether-Antibiotika zum Einsatz in der industriellen Tierhaltung (Ergotropikum oder Veterinaerpharmakon) von potentiellen Nutzen ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines neuen polyetheraehnlichen Antibiotikums der Bruttozusammensetzung C33H60O7 unter Verwendung eines Mikroorganismus Streptomyces griseus ZIMET 43681. Die Aufgabe wird in der Weise geloest, dass durch aerobe Fermentation des Stammes ZIMET 43681 in Medien mit geeigneten C-, N-Quellen und Mineralsalzen das polyetheraehnliche Antibiotikum Griseochelin gebildet und mit Hilfe extraktiver Verfahren aus Myzel und Kulturfiltrat isoliert und nachfolgend durch chromatografische Methoden gereinigt wird. Die Struktur des neuen polyetheraehnlichen Antibiotikums Griseochelin ist aus beiliegender Abb. 2 ersichtlich. Abb. 2
Description
Titel der Erfindung
Verfahren zur Herstellung eines Polyether-ähnlichen Antibiotikums
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Polyether-ähnlichen Antibiotikums mit der Bezeichnung Griseochelin, das auf Grund der allgemeinen Eignung der Carboxylsäure-Ionophore vom Typ der Polyether zum Einsatz in der Tierernährung sowie in der Veterinärmedizin von potentiellem Nutzen ist.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Es ist bekannt, daß Streptomyceten eine Reihe ionophorer Sekundärmetabolite produzieren, unter denen die sogenannten Polyether oder Carboxylsäure-Ionophore die zahlenmäßig und hinsichtlich ihrer ökonomischen Bedeutung wichtigste Gruppe bilden (WESTLEY, J.W,, 1977, Adv. Appl. Microbiol.v 22., 177-223;WBSTLEY, J.W., 1981, Antibiotics IV, Biosynthesis, Ed, CORCORAIi, J.W., Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-Hew-York, pp. 41-73)· Die volkswirtschaftliche Bedeutung einiger Polyether-Antibiotika aus Streptomyceten, so z. B· Monensin, Lasalocid, Salinomycin u. a., ergibt sich insbesondere aus ihrer Eigenschaft als Futtermittelzusatz für landwirtschaftliche Uutztiere, bevorzugt Wiederkäuer, eine ergotrope Wirkung entfalten zu können· Weiterhin ist der Einsatz als Coccidiostatikum in der Geflügelhaltung bekannt· Ein weiteres potentielles Anwendungsgebiet resultiert aus ihrer cardiovaskulären Wirkung (WESTLEY et al., 1977, Adv. Appl. Microbiol. 22., 177-223). Die Produktion der Polyether-Antibiotika erfolgt auf fermentativem Wege unter Verwendung entsprechender Produktionsstämme von Streptomyceten.
Die bisher bekannten Polyther-Produkte weisen bei ihrer Anwendung Nachteile, wie z. B. eine relativ hohe Toxizität für Hutztiere,
A -» IL'I- ΙΠΛ1 ... Λ f'l j\ i\ O Λ
- 2 aufCWESTLBY et al., 1977, Adv. Appl. Microbiol. 22,, 177-223).
Ziel der Erfindung
Die Erfindung dient der Herstellung eines neuen Polyether-ähnlichen Antibiotikums mit der Bezeichnung Griseochelin, um die Palette bekannter Carboxylsäure-Ionophore durch einen in seiner Struktur neuartigen Wirkstoff zu erweitern, der für die industrielle Tierhaltung als Epgo/'tropikum oder als Coccidiostatikum von potentiellem Uutzen ist.
Darlegung des Wesens der Erfindtang
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe das Polyetherähnliche Antibiotikum Griseochelin aus Myzel und/oder Kulturfiltrat eines Streptomyces-Stammes auf einem leicht zugänglichen Medium unter Verwendung billiger Einsatzstoffe hergestellt, mit Hilfe organischer Lösungsmittel extrahiert und mit chromatografisehen Methoden gereinigt werden kann.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen KuItürbedingungen in einem flüssigen Medium mit entsprechenden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalzen der Mikroorganismus oder seine Varianten und Mutanten gezüchtet werden. Der Mikroorganismus, der in diesem Verfahren Verwendung findet ist Streptomyces griseua ZIMET 43681. Er ist unter dieser Bezeichnung und Registriernummer in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, DDR 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, hinterlegt.
Biochemische und morphologische Eigenschaften dieses Mikroorganismus sind bei U. GRÄPE et al., 1981 Z„ AlIg. Mikrobiol., 21., 633-642, und U. GRÄPE et al., 1982, Z. AlIg. Mikrobiol., 2j2, 97-106, beschrieben.
Die Kultivierung des Streptomyces griseus ZIMET 43681 erfolgt unter aeroben Bedingungen. In Glucose/Gelatine C5%ig) lyophilisierte Myzelfragmente werden auf geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien eingeimpft, und das entsprechende Myzel wird in an sich bekannter Weise bei einer Tem-
peratur zwischen 20 0C und 38 0G, vorzugsweise bei 28 0C, über einen Zeitraum von 2 Tagen bia 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Azidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 5,5 und pH 8,3 liegt· Das Mhrmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie aua Mineralsalzen. Als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können die in der Fermentationsindustrie üblichen Einsatzstoffe verwendet werden» Die Fermentation des Stammes Streptomyces griseus ZIMET 43681 kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, in Glasfermentern sowie in V2A-Tanks durchgeführt werden·
Die Isolation des neuen Polyether-ähnlichen Antibiotikums Griseochelin erfolgt in an sich für lipophile Substanzen üblicher Weise nach dem Separieren der angesäuerten Kulturl'dsung sowohl aus dem Myzel durch Extraktion mit organischen Lösungsmittelgemischen, vorzugsweise Chloroform/Methanol (1:1, v/v), als auch aus dem Kulturfiltrat durch Extraktion mit organischen Extraktionsmitteln, vorzugsweise Butylacetat (Abb. 1),
Durch Einengen der erhaltenen Extrakte des Myzels oder des Kulturfiltrates werden Rohprodukte erhalten, die säulenchromatografisch an organophilen Extrangelen gereinigt werden· Dabei kristallisiert ein Teil des neuen Carboxylsäure-Ionophors Griseochelin I- (Abb· 2) als Komplexsalz mit ein-· und zweiwertigen Kationen, vorzugsweise Calcium, aus·
Die den Polyether in Form der Eydroxysäure enthaltenden Fraktionen werden durch Säulenchromatografie an Kieselgel unter Verwendung unpolarer Lösungsmittelgemische weiter gereinigt· Das natürlich vorkommende Komplexsalz des Polyethers Griseochelin wird durch Chromatografie an organophilen Dextrangelen in hochreiner Form erhalten· Durch Säulenchromatografie an Kieselgel unter Verwendung eines Essigsäure-haltigen Solvens wird aus dem natürlich vorkommenden Komplexsalz dann gleichfalls hochreine Hydroxysäure J[ hergestellt· Außerdem wird aus I1. durch Behandeln einer Lösung in Chloroform mit Ca(OH)ρ das reine Calciumsalz 2_ erhalten· Auf Grund der physikochemischen Analyse (IR, MS, Osmometrie, 25 MHz
-5C und 400 MHz H HMR (Bruker WM 400), Atomabsorptionsspektrometrie) besitzt das Polyether-Antibiotikum Griseochelin die in der Abb. 2 gezeigte Struktur 1_ einer Tetrahydropyrantetrahydroxysäure mit der Bnttoformel ^33%οΟ7*
- 4 -
Tab. 1 zeigt die physikochemisehen Eigenschaften von J_ und des reinen Calciumsalzes 2.
Tab· 2 enthält die Zuordnung der JQ UHR-Signale von I-. Die in Abb. 2 gezeigte Struktur von 2. sowie die Bildung von Komplexsalzen mit verschiedenen ein- und zweiwertigen Kationen wurden durch umfangreiche 400 MHz H-Kernresonanzuntersuchungen nachgewiesen (TJ· GRÄFE et al., Publikation in Vorbereitung; L. RADIOS, Publikation in Vorbereitung)·
Der nachweis der antibiotischen Wirkung des Polyethers Griseochelin erfolgt durch Testung der methanolischen Lösung der Hydroxysäure I1 oder des Ca-Salzes 2, gegenüber Bacillus subtilis ATCC 6633 als Testkeim mit Hilfe des Loehplatten-Diffusionstests oder des Röhrchen-Verdünnungstestes* Im Lochplatten-Diffusionstest wurde als minimale Hemmkonzentration ein Wert von 1.10 g ermittelt. Im Röhrchen-Verdünnungstest wurde eine signifikante antibiotische Wirkung in einer Konzentration oberhalb von 4.1Qg · ml" nachgewiesen· Die Wachstumshemmung erstreckt sich auch auf andere grampositive Keime, während Griseochelin gegenüber aeroben gramnegativen Organismen und Pilzen unwirksam ist. Die EDcq Ratte, orale Applikation als ITa-SaIz oder Suspension von V) liegt bei über 1 g pro kg, bei intravenöser Verabreichung (Maus) dagegen bei 1-2 mg/kg.
Ausführungsbeispiele
1· An Erde lyophil getrocknete Myzelfragmente des Stammes ZIMET 43681 dienen zur Beimpfung eines für Streptomyceten üblichen Agarmediums folgender Zusammensetzung (g.l" ): Backhefe 15, Maisstärke 10, HaCl 5, Fleischpepton 1, Agar 20; pH 7. Inokulumkultüren werden durch Einsaat von Myzelstücken der Agarkultur oder von gefriergetrockenten (lyophilisierten Myzelien als Stammkultur in ein Medium folgender Zusammensetzung erhalten (g.l"1)^: Sojamehl 40, Glucose 40, HaCl 2,5, HaCO^ 5, KH2PO^ 0,25» pH 6,3. Die zweite Vorkultur erfolgt auf dem gleichen Medium. Hach 4Bstündiger Bebrütung der Vorkultur (500 ml Steilbrustflaschen, 80 ml Inhalt, 25 0C, Rundschwingtisch, 240 U.p.M.) wird die stufenweise Maßstabvergrößerung durch Übertragung von Kulturproben in 5 1-Steilbrustflaschen (0,5 1 Medium), und weitere 24 h Bebrütung bei 27 0C durchgeführt. Pur die Kultivierung in JPermentoren wird ein Medium folgender
- 5 Zusammensetzung eingesetzt (g.l~ ): Sojamehl 30, Glucose 30, NaCl 2,5, CaCO3 2, (HHOgSO- 3, KH3I1O4 0,5; pH 6,2 (vor der Sterilisation)« Die Belüftung erfolgt mit steriler Luft (1:1), die Fermentationszeit beträgt 72 h bis 144 h, vorzugsweise 96 h, die Rührgeschwindigkeit 280 ü«p.H«. Die Schaumbildung kann durch Zusatz kleiner Mengen an siliconhaltigen Schaumschutzmittein kontrolliert werden. Each 96 h Fermentation wird das Myzel durch Separatoren abgetrennt und bei 80 0C getrocknet. Die Kulturlösung wird mit 0,2 Volumenteilen Butylacetat extrahiert.
2. 500 1 Kulturlösung ergeben ca. 25 kg feuchten Myzelrückstand, der mit Resten des Mediums vermischt ist und der 5 kg bis 7 kg trocknem Myzelrückstand entspricht. Feuchtes Myzel wird 48 h bei Raumtemperatur mit 5 l/kg Aceton extrahiert. Nach Einengen des organischen Extraktes werden pro kg Trockenmyzel 50 g Rückstand erhalten, der auf eine Kieselgelsäule (1 m χ 2 cm, Benzen als Solvens) gegeben wird. Anschließend erfolgt die Elution zunächst mit 2 1 Benzen, dann mit einem Gemisch von Benzen/Aceton (9:1 bis 4:6, v/v)· Dabei wird eine rohe Fraktion (6 g) erhalten, die durch ihre rote Anfärbung im Dünnschichtchromatogramm bei Verwendung von 1 % Vanillin in konz. HpSO- als Sprühreagenz erkannt werden kann. Die weitere Reinigung erfolgt durch Säulenchromatografie über organophile Dextrangele unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel· Aus den Polyetherfraktionen kristallisieren 0,5 g des natürlich vorkommenden Komplexsalzes mit verschiedenen ein- und zweiwertigen Kationen, vorzugsweise Calcium, aus· Die freie Rydroxysäure 1_ verbleibt in der methanolischen Lösung und. wird mit Aktivkohle unter Rückfluß behandelt. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum werden 3 g 1. erhalten.
3. 250 1 Kulturlösung einer 96 h-Kultur des Streptomyces. griseus ZIMET 43681 werden nach Ansäuern auf pH 2 bis pH 4 mit 0,2 Volumina Butylacetat extrahiert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Im Rückstand (200 g) wird I1. durch Säulenchromatografie an organophilen Dextrangelen unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel weiter angereidßrt. Aus den Polyetherfraktionen, kenntlich durch ihre charakteristische rote Anfärbung im Dünnschichtchromatogramm durch 1 % Vanillin in konz. H
kristallisieren bis zu 2,5 g des Komplexsalzes mit verschiedenen ein- und zweiwertigen Kationen, vorzugsweise Calcium, aus, das durch Säulenchromatografie an organophilen Dextrangelen unter Verwendung von Methanol/Essigester (1:1, v/v) weiter gereinigt wird· Die die freie Hydroxysäure J[ enthaltenden Fraktionen werden durch Säulenchromatografie an Kieselgel weiter gereinigt· Dabei wird zunächst mit Benzen, dann mit einem Gradienten von Benzen/Aceton (9:1 bis 4:6, v/v) eluiert. Es werden auf diese Weise 1,5 gj, erhalten, die in Methanol gelöst und mit Aktivkohle unter Rückfluß erwärmt werden· Ausbeute: 1 g I1,
4. Die freie Hydroxysäure I- wird aus dem natürlich vorkommenden Komplexsalz mit verschiedenen ein-"und zweiwertigen Kationen, vorzugsweise Calcium, durch Säulenschromatografie über Kieselgel (Hexan/CHC1,/Eisessig, 45:45:10, v/v) oder durch Lösen des Komplexsalzes in 2,5 % methanolischer KOH (48 h) und nachfolgendes Ansäuern bis pH 1 und Extraktion mit CHCIo erhalten. Ausbeute: quantitativ.
5. Das reine Ca-SaIz 2_ des Polyether-Antibiotikums Griseochelin 1_ wird durch Schütteln einer Lösung von 1_ i** CHCl^ mit einer halbmolaren Menge an Ca(OH)2 erhalten* Nach Abdampfen des Lösungsmittels wird reines 2_ isoliert, Ausbeute: quantitativ·
Das auf diesem Wege gewonnene Polyether-Antibiotikum Griseochelin 1. und gleichermaßen auch sein Ca-SaIz 2_ sind beide
- als Epgotropikum in der Hutztierhaltung sowie
- als Coccidiostatikum in der Veterinärmedizin einsetzbar.
Abb. 1: Aufarbeitungsschema Kulturflüssigkeit (96 h bis 120 h) 50Ql
Kulturlösung (250 1) Myzelrückstand
C5 -7 kg Trockengewicht)
• Extraktion mit organischen Lösungsmitteln . Rückstand (200 g) Rückstand (100 - 150 g)
SG, organophile SC,Kieselgel, Gradient
Dextrangele Benzen/Aceton
Rohpolyether 1 Komplexsalz .Rohpolyether 1 (6 g)
Ua. 1,5 S) (ca. 0,5 g) '
I SG, organophile Dextrangele
SC, Kieselgel, Gradient Benzen
Aceton Polyether 1_(3 g)
Polyether 1
15
CH3 CH3
Abb 2
Tab. 1: Physikochemische Charakteristika des Polyether-Antibiotikums Griseochelin und des Ca-Salzes 2
Freie Hydroxysäure 1 Ga-SaIz 2
Eigenschaft en Schmelzpunkt (0C) Molekulargewicht (MS) 725
Molekulargewicht (Osmometrie)
Formel
Analyse Gefunden (%) Berechnet IR (CHOU)
Charakteristische MS Peaks
farbl. Öl
550.4197 (M+-H2O, ber. 550 4233)
0°, (c UO, CHCl.)
°33Η6Ο°7
C 71.8, H 10.8, 0 17.4
C 72.0,.Η 10,5, 0 17.5
3220 cm"1 (OH) -1
3390 cm"1 (QH)
3250 cm""1 (CO-OH)
1732 cm"1 (COOH)
1200 cm"1 (CO-OH)
428,3169 (ber. 428.3138 für C24H44O6)
229.1429 (ber. 229.1440 für C12H21O4)
211.1307 (ber. 211.1334 für C12H19O3)
171.1012 (ber. 171.1021 für C9H15O3)
153.0931 (ber, 153.0915 für C9H13O2)
141.1276 (ber. 141.1279 für C9H17O) weiße Kristalle 235 - 237
+17.3° (c 1,0, CHCl3) 1170± 20
C66H118°nCa 01^0> C6?,5, H 10,0, 0 13,0, Ca C 6?.f, H 10.-?, 0 19.-Ii, Ca 3540 cm"1(OH) 3280 cm**1 (OH)
1580 cm 1425 cm'
—1 -1
(CO2"*) as (C02")s
Tab. 2: Zuordnung der 50 MHz- ^G-NMR-Signale des Polyethers 1 (Bruker, V/P 200/SY, chemische Verschiebung in ppm, relativ zu TMS als int. Standard, CDCl, als Solvens; Multiplizität im off-resonance-Spektrum:"s: Singulett; d: Dublett; t: Triplett; qj Quartett)
Chemische Verschiebung (ppm) '
176.09 135.63 134.71 133.57 132.33 84.46 83.45 82.14 76.32 74.36 69*33 42.21 40.04 37.94 , 37.28 36.72 34.37 33.24 32.03 31.88 28.64 26.39 25.19 .20.99 20.67 17.48 17.11 15.58 14.18
| Zuordnung | Bindungstyp |
| C-1 | C(OOH) |
| C-21 | =C-H |
| C-16 | =C-H |
| C-20 | —C |
| C-17 | β C-H |
| C-9 | CH-O- |
| C-11 | CH-OH |
| 0-19 | CH-OH |
| 0-7 | CH-O- |
| 0-3 | CH-OH |
| C-13 | CH-O- |
| 0-18 | CJI-CH-j |
| C-23 | -CH2- . |
| C-2 | CH-CH3 |
| 0-10 | CH-CH-j |
| 0-12 | CH-CHo |
| 0-14 | -CH2- |
| 0-8 | CJi-CHo |
| C-6 | CH-CHo |
| C-22 | CJi-CHo |
| 0-15 | -CH2- |
| C-5 | -CH2- |
| 0-4 | -CH2- |
| C-26 | -CH3 |
| 0-24 | -CH2- |
| C-2 8 | -CH3 |
| C-32 | -CH3 |
| C-33 | -CH3 |
| C-25 | -CH3 |
Chemische Verschiebung (ppm)
| Zuordnung | Bindungst.yp |
| C-30 | -CH3 |
| C-31 | -CH3 |
| C-27 | -CH3 |
| C-29 | -CH3 |
12.38 11.27 10.87 10.77
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung eines Polyether-ähnlichen Antibiotikums auf mikrobiologischem Wege, gelmnzeichnet dadurch, daß
- der Mikroorganismus Streptomyces griseus ZIMET 43681 unter aeroben und sterilen Bedingungen in flüssigen Hährmedien, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 20 0C bis 38 0C während eines Zeitraumes von 2 Tagen bis 6 Tagen bei einer Azidität, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 5,5 und pH 8,3 liegt, kultiviert wird und
- das teils im Myzel gespeicherte und teils in das Kulturfiltrat ausgeschiedene neue Polyether-ähnliche Antibiotikum Griseochelin, welches als freie Rydroxysäure die Bruttozusammensetzung CooHgQOy besitzt und die in Abb. 2 gezeigte Struktur aufweist, anschließend gegebenenfalls isoliert wird·
2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Mkroorganismus Streptomyces griseus ZTMET 43681 bei 28 0C während eines Zeitraumes von 4 Tagen kultiviert wird,
3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß im Falle der Reinherstellung des Polyether-Antibiotikums Griseochelin aus dem Myzel dieses durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln/Lösungsmittelgemischen gewonnen und durch übliche chromatografische Methoden weiter gereinigt wird.
4.Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß im Falle der Reinherstellung des Polyether-Antibiotikums Griseochelin aus dem auf pH 2 bis pH 4 angesäuerten Kulturfiltrat dieses durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln/Lösungsmittelgemischen gewonnen und nachfolgend mit Hilfe üblicher chromatografischer Methoden gereinigt wird.^
Hierzu 2 Seiten Abbildungen und -3 Seiten Tabellen.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DD26489784A DD228302A1 (de) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | Verfahren zur herstellung eines polyether-aehnlichen antibiotikums |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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1984
- 1984-03-08 DD DD26489784A patent/DD228302A1/de not_active IP Right Cessation
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