DD160534A5

DD160534A5 - Verfahren zur herstellung von peptiden

Info

Publication number: DD160534A5
Application number: DD81229265A
Authority: DD
Inventors: Catherine L Rivier; Jean E F Rivier; Jr Wylie W Vale
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1980-04-15
Filing date: 1981-04-15
Publication date: 1983-09-07
Also published as: DK150206C; IL62449A0; DK150206B; DE3164661D1; GR74501B; KR830005114A; EP0038135B1; AU6881481A; KR850001159B1; DK166581A; AU543921B2; IE810703L; IL62449A; ES501321A0; IE51068B1; EP0038135A3; YU98981A; NZ196558A; EP0038135A2; ES8207510A1

Abstract

Peptide, die die Sektretion der Gonadotropine durch die Hirnanhangsdruese und die Freisetzung der Steroide durch die Gonaden hemmen. Die Verabreichung einer wirksamen Menge verhuetet die Ovulation der Eier von weiblichen Saeugetieren und/oder die Freisetzung von Steroiden durch die Gonaden. Die Peptide haben die folgende Struktur: X-R tief 1-R tief 2-R tief 3-Ser-Tyr-R tief 4-R tief 5-Arg-Pro-R tief 6, darin ist X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit 7 oder weniger Kohlenstoffatomen, R tief 1 Dehydro-Pro, Dehydro D-Pro, Thz oder D-Thz; R tief 2 ist D-Phe, D-His, D-Trp, Trp, Cl-D-Phe, Dichlor-D-Phe, CF tief 3-D-Phe, F-D-Phe, Difluor-D-Phe, AcNH-D-Phe, NO tief 2-D-Phe, Dinitro-D-Phe. Br-D-Phe, Dibrom-D-Phe, CH tief 3 S-D-Phe, OCH tief 3-D-Phe oder CH tief 3-D-Phe; R tief 3 ist D-Trp, D-Phe oder D-His; R hoch 4 ist Gly oder eine D-isomere Aminosaeure; R hoch 5 ist Leu oder N hoch alpha Me-Leu; und R tief 6 ist Gly-NH tief 2 oder NHCH tief 2 CH tief 3.

Description

Verfahren zur Herstellung von LRF-ANTAGONISTEN Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Peptide, die die

Freisetzung der Gonadotropine durch die HirnanhangcTrlTslin"

bei Säugetieren, einschließlich Menschen, verzögern, sowie auf Methoden zur Verhütung der Ovulation und/oder Verzögerung der Freisetzung von Steroiden, Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Peptide, die die gonadale Funktion und die Freisetzung der Steroidhormone, Progesteron und Testosteron, verzögern.

Charakteristik der bekannten technischen Losungen

Die Hirnanhangdrüse 'sitzt im Bereich der Basis des Hirns auf einem als Hypothalamus bekannten Stiel, Die Hirnanhangdrüse besteht aus zwei Lappen, dem Vorderlappen und dem Hinterlappen, Vom Hinterlappen der Hirnanhangdrüse werden zwei Hormone gespeichert und in den allgemeinen Kreislauf gegeben, die im Hypothalamus erzeugt werden. Hierbei handelt es sich um das Vasopressin und Oxytozin. Der Vorderlappen der Hirnanhangdrüse gibt eine Reihe von Hormonen ab, bei denen es sich um komplexe Protein- oder Glycoproteinmoleküle handelt, die über den Blutkreislauf zu den verschiedensten Organen gelangen und dort wiederum die Sekretion anderer Hormone aus den peripheren Organen stimulieren. Insbesondere werden von der Hirnanhangdrüse das Follikel stimulierende Hormon (FSH) und das Luteinisierungshormon (LH), gelegentlich als Gonadotropine oder

U.MAI1982*GO983£

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gonadotrope Hormone bezeichnet, freigesetzt» Diese Hormone regulieren gemeinsam die Funktion der Gonaden zur Erzeugung des Testosterons in den Testikeln und des Progesterons und D'strogens in den Ovarien und regulieren darüber hinaus die Erzeugung und Reifung der Samenzellen.

Die Freisetzung eines Hormons durch den Vorderlappen der Hirnanhangdrüse erfordert in der Regel eine vorangegangene Freisetzung einer weiteren Klasse von Hormonen, die durch den Hypothalamus erzeugt werden. Eines der Hypothalamushormone wirkt als ein Faktor, der die Freisetzung der Gonadotropinhormone steuert, insbesondere das LH» Das Hypothalamushormon, das als ein freisetzender Faktor für das LH wirkt, wird nachfolgend als LRF bezeichnet, obgleich auch Bezeichnungen wie LH-RH und GnRH bekannt sind. Das LRF wurde isoliert und charakterisiert als ein Decapeptid der folgenden Struktur:

P-Glu-His-Trip-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂

Peptide sind Verbindungen, die zwei oder mehrere Aminosäuren enthalten, bei denen die Carboxylgruppe der einen Säure mit der Aminogruppe der anderen Säure verbunden ist. Die voranstehend dargestellte Formel für das LRF entspricht der konventionellen Darstellung der Peptide, bei der die Aminogruppe auf der linken Seite und die Carboxylgruppe auf der rechten Seite erscheint. Die Position des Aminosäurerestes ist gekennzeichnet durch die Numerierung der Aminosäurereste von links nach rechts. Im Falle des LRF wurde der Hydroxylteil der Carboxylgruppe des Glycins durch eine Aminogruppe (NHp) ersetzt. Die Abkürzungen für die einzelnen Aminosäurereste beruhen üblicherweise auf

α ι iinuiin/i^n η η ο ο

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dem Trivialnamen der Aminosäuren: Darin bedeuten p-Glu die Pyroglutaminsäure, His das Histidin, Trp das Tryptophan, Ser das Serin, Tyr das Tyrosin, GIy das Glycin, Leu das Leucin, Arg das Arginin und Pro das Prolin. Mit Ausnahme des Gycins weisen die Aminosäuren der Peptide der vorliegenden Erfindung die L-Konfiguration auf, sofern nicht anders gekennzeichnet wird.

Es ist bekannt, daß die Substitution der D-Aminosäuren beim GIy in der 6-Stellung des LRF-Decapeptid zu einer Peptidsubstanz führt, die etwa 1- bis 35mal größere Wirksamkeit bei der Freisetzung des LH und anderer Gonadotropine durch die Hirnanhangdrüsen bei Säugetieren als das LRF aufweist» Die freisetzende Wirkung wird dadurch erzielt, wenn das LRF einem Säugetier entsprechend intravenös, subcutan, intramuskulär, oral, intranasal oder intravaginal verabreicht wird.

Ebenfalls ist bekannt, daß die Substitution der verschiedenen Aminosäuren für das His (oder die Entfernung des His) in 2-Stellung des LRF-Decapeptid analoge Substanzen erzeugt, die eine inhibierende Wirkung auf die Freisetzung des LH und anderer Gonadotropine durch die Hirnanhangdrüse der Säugetiere ausübt. Insbesondere werden unterschiedliche Grade der Verzögerung der Freisetzung des LH erzielt, wenn His entfernt (des His) oder durch D-AIa, D-Phe oder GIy ersetzt wird. Die Inhibitorwirkung solcher in 2-Stellung modifizierter Peptide läßt sich noch verstärken, wenn für das GIy in der 6-Stellung der Decapeptide eine D-Aminosäure gesetzt wird. Beispielsweise das Peptid:

pGlu-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH ,

or...., η π Q R λ

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das als Inhibitor für dia Freisetzung der Gonadotropine eine vielfach stärkere IVirkung als die gleichen Peptide aufweist, bei denen das GIy anstelle des D-AIa in 6-Stellung ist«

Einige weibliche Säugetiere, die keinen Ovulationszyklus besitzen und keine Schädigung der Hirnanhangdrüse oder der Ovarien aufweisen, beginnen die normalen Mengen der Gonadotropine LH und FSH nach einer entsprechenden Verabreichung von LRF zu erzeugen. Hiermit ist die Verabreichung des LRF für die Behandlung solcher Zellen der Infertilität geeignet, bei denen es zu einer funktionellen Beeinträchtigung des Hypothalamus kommt.

Ebenfalls gibt es Gründe, bei weiblichen Säugetieren eine Verhinderung der Ovulation anzustreben, weshalb die Verabreichung von LRF-Analogen, die zur normalen LRF-Funktion antagonistisch sind, zur Verhinderung der Ovulation eingesetzt wurden. Zu diesem Zweck wurden Analoga des LRF₁ die zum LRF antagonistisch sind, auf ihre mögliche Anwendung als Kontrazeptiva oder zur Regulierung, _d_e„r__Empfängniszeiten untersucht,

Ziel der Erfindung

Es wäre wünschenswert, Peptide bereitzustellen, die zum endogenen LRF stark antagonistisch sind und die Sekretion des LH und die Freisetzung der Steroide durch die Gonaden von Säugetieren verhüten.

U.MAM982*OO98S:

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Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung von LRF-Antagonisten bereitzustellen,

Dia vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls Methoden zur Inhibierung der Freisetzung von SteroidelT~d~ürch die Gonaden männlicher und weiblicher Säugetiere, Die verbesserten LRF-Analoga sind zum LRF antagonistisch und-besitzen eine inhibierende Wirkung auf die Fortpflanzungsprozesse bei Säugetieren. Diese Analoga können zur Verzögerung der Produktion der Gonadotropine und der Sexualhormone unter den verschiedensten Umständen eingesetzt werden, einschließlich bei frühreifer, hormonabhängiger Neoplasie, Dysmenorrhoe und Endometriosis.

Im Einklang mit der vorliegenden Erfindung wurden Peptide synthetisiert, die die Erzeugung der Gonadotropine durch die Hirnanhangdrüse bei Säugetieren, einschließlich Menschen, stark hemmen und/oder die Freisetzung von Steroiden durch die Gonaden inhibieren. Diese Peptide sind Analoga des LRF, bei denen es in der !-Stellung eine Substitution etwa in der Form des Dehydroprolins oder der m-Thiazolidin-2-carbonsäure gibt, wobei vorzugsweise auch Substituenten in den 2-, 3- und 6-Stellungen vorhanden sind. Der Substituent in !-Stellung kann so modifiziert werden, daß seine Alphaaminogruppe eine Acylgruppe enthält, wie beispielsweise eine Formyl-, Acetyl-, Acrylyl-, Vinylacetyl oder Benzoylgruppe,

Das Dehydro L~Pro wird in 1—Stellung bevorzugt. Ein modifiziertes D-Phe ist vorzugsweise in 2-Stellung vorhanden

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und vermittelt eine verstärkte antagonistische Aktivität infolge spezieller, am Benzolring vorgenommener Modifikationen. Einzelne Substitutionen für Wasserstoff erfolgen vorzugsweise in der Para-Stellung oder der4-Stellung, während zweifache Substitutionen vorzugsweise in den 2,4- oder 3,4-Steilungen vorgenommen werden» Besonders bevorzugt 'werden die Substituenten gewählt aus Dichloro-, Methyl-, Fluoro—, Difluoro-, Trifluoromethyl-, Methoxy-, Brom-, Dibrom-, Nitro-, Dinitro-, Acetylamino- und Methylmercapto-Gruppen. Das D-Trp wird in 3-Stellung bevorzugt, während das BzI D-His oder D-Trp sowie andere Lipophile aromatische D-Aminosäuren bevorzugt in 5-Stellung eingebaut werden, obgleich auch das GIy oder irgendeine andere D-isomere Aminosäure verwendet werden können, z. B. D-Leu und D-Ser (0-t But), Die Substitutionen in den 7- und 10-Stellungen können wahlweise erfolgen.

Da diese Peptide besonders geeignet sind, die Freisetzung des LH zu hemmen, werden sie oftmals als Antagonisten des LRF bezeichnet. Die Peptide hemmen die Ovulation weiblicher Säugetiere bei Verabreichung in sehr geringen Konzentrationen und bewirken ebenfalls die Resorption befruchteter Eier> wenn sie unmittelbar nach der Empfängnis verabreicht werden.

Die Peptide der vorliegenden Erfindung werden insbesondere durch die folgende Formel dargestellt:

X-R. -R₀ -R-, -Ser-Tyr-R, -R_c -Arg-Pro-R_r

Darin sind X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit 7 oder weniger Kohlenstoffatomen, R. Dehydro-Pro, Dehydro-D-Pro,

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Thz oder D-Thz; R₀ ist D-P'ne, D-His, D-Trp, Trp, Cl-D-Phe, Dichlor-D-Phe, CF^-D-Phe, F-D-Phe, Difluoro-D-Phe, AcNH-D-Phe, N0₂-D-Phe, Dinitro-D-Phe, Br-D-Phe, Dibrom-D-Phe, CH S-D-Phe, OCH„-D-Phe oder CH -D-Phe; R, ist

O O -ό ό

D-Trp, Trp, D-Phe oder D-His; R_A ist GIy oder eine D-isomere Aminosäure; R₁. ist Leu oder N Me-Leu; während R_

b ο

GIy-NH₂ oder NHCH₂CH₃ ist.

Unter Dehydro-Pro ist das 3,4-Dehydroprolin, C H₇O₂N zu verstehen, wobei das X als ein Acylradikal am Stickstoff sitzt. Unter Thz wird m-Thiazolidin-2-carbonsäure, G.H_,OpNS, verstanden, die durch Behandlung des Cysteinhydrochlorid mit Formaldehyd dargestellt werden kann, wobei sich beispielsweise das Ac-Thz durch Reaktion des Thz mit Essigsäureanhydrid darstellen läßt.

Die Peptide der folgenden Erfindung lassen sich unter Anwendung eines chlormethylierten Harzes, eines Methylbenzhydrylamin-Harzes (MBHA) oder eines Benzhydrylamin-Harzes (BHA) durch ein Verfahren in fester Phase synthetisieren. Die Synthese mit einer solchen Form durchgeführt, daß schrittweise die Aminosäuren in der Kette hinzugefügt werden, wird im Detail im US-Patent Nr, 4.211.693 beschrieben, Seitenketten-Schutzgruppen, wie sie allgemein bekannt sind, werden bevorzugt zu den SEA, Ser, Tyr, Arg und His hinzugefügt, bevor diese Aminosäuren mit der sich auf dem Harz aufbauenden Kette gekoppelt werden.

Eine solche Methode liefert das vollständig geschützte intermediäre Peptidharz. Die Zwischensubstanzen der vorliegenden Erfindung lassen sich folgendermaßen darstellen:

(X²)~Tyr (X³)-R -B -Arg (X⁴)-Pro-X⁵

i, t y i. y w w

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t Darin sind )C eins Alpha-Amxno-Gruppe vom bekannten Typ für die schrittweise Synthese von Polypeptiden, wobei, wenn X in der gewünschten Peptidzusammensetzung eine spezielle Acylgruppe darstellt, diese Gruppe als Schutz-

gruppe verwendet werden kann. Unter den von X dargestellten Klassen der Alpha-Amino-Schutzgruppen sind (1) Schutzgruppen vom Acyltyp, z, B. Formyl (FoV), Trifluoracetyl, Phthalyl-, p-Toluolsulfonyl- (Tos), Benzoyl (Bz),

,"^ Benzolsulfonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl- (Nps), Tritylsulfenyl-, o-Nitrophenoxyacetyl-, Acrylyl- (Acr), Chloracetyl-, Acetyl (Ac) und - ^-Chlorbutyryl; (2) aromatische Schutzgruppen vom Urethantyp, z. B, Benzyloxycarbonyl- (Z) und substituiertes Benzyloxycarbonyl-, wie beispielsweise p-Chlor-Benzyloxycarbonyl-, p-Nit robenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbcryl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl; (3) aliphatische Urethan-Schutzgruppen, wie beispielsweise Tertiarbutyloxycarbonyl- (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl-, Isopropyloxycarbonyl-, Ätnoxycarbonyl- und Allyloxycarbonyl-; (4) Schutzgruppen vom Cycloalkylurethan-Typ, wie beispielsweise Cyclopentyloxycarbonyl-, Adamanthyloxycarbonyl- und Cyclohexyloxycarbonyl-; (5)

Schutzgruppen vom Thiourethan-Typ, wie beispielsweise Phenylthiocarbonyl-, (S) Schutzgruppen vom Alkyltyp, wie beispielsweise Allyl- (AIy), Triphenylmethyl (Trityl)- und Benzyl (BzI); (7) Trialkylsilangruppen, wie beispielsweise Trimethylsilan. Die bevorzugte Alpha-Amino-Schutzgruppe ist Boc, wenn X einen IVasserstoff darstellt.

X ist eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe des Ser und wird ausgewählt aus einer Gruppe von Acetyl-, Benzoyl-, Tetrahydropyranyl-, tert.-butyl-, Trityl-, Benzyl- und 2,5-Dichlorbenzyl. Hierbei wird Benzyl bevorzugt.

η ι λ η G r· ,·., η /'. ο W ό

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X° ist eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe des Tyr und wird ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus: Tetrahydropyranyl-, tert.-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, Benzyloxycarbonyl-, 4-Brombenzyloxycarbonyl- und 2,6-Dichlorbenzyl.

X ist eine Schutzgruppe für die Stickstoffatome des Arg und wird ausgewählt aus Nitro-, Tos-, Benzyloxycarbonyl-,

Adamanthyloxycarbonyl- und ßoc. Andernfalls kann X Wasserstoff darstellen, was bedeutet, daß es keine Schutzgruppen

an den Stickstoffatomen der Seitenkette des Arginin gibt.

X wird ausgewählt aus Gly-0-CH₂-(Harztrager); O-CI-L-(Harzträger) und Gly-NH-(Harzträger),

Das Kriterium für die Auswahl der Seitenketten-Schutzgruppen für X -X besteht darin, daß die Schutzgruppen gegenüber dem Reaktionsteilnehmer unter den Reaktionsbedingungen stabil sein müssen, die zur Entfernung der Alpha-Amino-Schutzgruppe im jeweiligen Verfahrensschritt der Synthese ausgewählt werden. Die Schutzgruppe darf unter den Kupplungsbedingungen nicht abgespalten werden, sie muß dennoch nach Beendigung der Synthese von der gewünschten Aminosäuresequenz unter den Reaktionsbedingungen entfernbar sein, bei denen die Peptidkette nicht verändert wird.

Wenn die X -Gruppe GIy-O-CH₂-(Harztrager) ist, so wird der Esterrest einer der zahlreichen funktioneilen Gruppen des Polystyrol-Harzträgers dargestellt. Wenn es sich bei der X -Gruppe um Gly-NH-(Harztrager) handelt, so bindet eine Amidbindung das GIy an das 3HA-Harz oder an das MBHA-Harz.

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Wenn X eine Acetyl-, Formyl-, Acrylyl-, Vinylacetyl-, Benzoyl- oder eine bestimmte andere Acylgruppe mit 7 Kohlenstoffatomen oder weniger ist, läßt sie sich als ⁱ

ι die X -Schutzgruppe für die Alpha-Amino-Gruppe von R₁ einsetzen. In einem sol ehe n___Fa_ll -kann sie vor der Kopplung der letzten Aminosäure an die Peptidkette hinzugefügt werden. Andernfalls läßt sich eine Reaktion mit dem Peptid ajf dem Harz durchführen, z, 3. die Reaktion mit Essigsäure in Gegenwart des Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder bevorzugt mit Essigsäureanhydrid.

Das vollständig geschützte Peptid vom chlormethylierten Harzträger kann durch Amonolyse in bekannter Weise abgespalten werden, um das vollständig geschützte Amidzwischenprodukt zu ergeben. Die Entfernung der Schutzgruppe vom Peptid sowie die Abspaltung des Peptids von Benzhydrylamin-

harz findet mit Flußsäure (HF) bei 0 C statt. Vor der Behandlung mit HF wird dem Peptid Anisol-zugesetzt. Nach der Entfernung der Flußsäure unter Vakuum wird das abgespaltene und nicht mehr geschützte Peptid mit Äther behandelt, dekantiert, in verdünnter Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert.

Die Reinigung des Peptids wird durch lonenaustauschchromatographie an einer CMC-Säule durchgeführt, gefolgt von einer Trennungschromatographie unter Verwendung des folgenden Eluierungssystems: n-Butanol; O,1N Essigsäure (Volumenverhältnis 1 : 1) an einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule oder in bekannter Weise durch Hochdruck-Flüssigchromatographie. Die Peptide der vorliegenden Erfindung werden in Konzentrationen von weniger als 200 Mikrogramm pro Kilogramm Körpergewicht wirksam, wenn sie am Tage

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vor der Ovulation zur Verhütung der Ovulation bei weiblichen Ratten gegeben wurden.

Bei längerer Ovulationsunterdrückung kann es erforderlich werden, Dosiskonzentrationen im Bereich von etwa 0,1 bis et'„7a 5 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht zu verabreichen. Diese Antagonisten sind ebenfalls als Kontrazeptiva wirksam, wenn sie männlichen Säugetieren in regelmäßigen Abständen verabreicht werden«

Da es sich hierbei um Verbindungen handelt, die die Testosteronkonzentrationen herabsetzen (eine beim normalen, sexuell aktiven männlichen Exemplar ungewünschte Folge), kann es ratsam sein, gemeinsam mit dem LRF-Antagonisten eine Ersatzdosis des Testosterons zu verabreichen.

Die folgenden Beispiele sollen die verschiedenen Merkmale der vorliegenden Erfindung veranschaulichen, den Anwendungsbereich der Erfindung, wie sie durch die beigefügten Erfindungsansprüche definiert wird, jedoch nicht einschränken.

Beispiel I

Die folgenden Peptide haben die Formel

X-Dehydro Pro-R₂~D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-R_r--Arg-Pro-Gly-NH

Sie werden nach dem voranstehend ausgeführten Verfahren in.fester Phase dargestellt.

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Tabelle ι	\/ /\	^R2
Peptid	Ac	3,4 Cl₂-D-Phe
1	11	4 CF„-D-Phe
2	II	4 F-D-Phe
3	Il	4 AcNH-D-Plre--
4	II	4 N0₂-D-Phe
5	IT	4 Br-D-Phe
6	Il	4 CH₃S-D-Phe
7	ti	4 OCH -D-Phe
8	II	4 CH^-D-Phe
9	Il	2,4 Cl₂-D-Phe
10	Acr	3,4 Cl₂-D-Phe
11	Ac	4 OCH -D-Phe-
12	It	4 CH -D-Phe
13	ti	' 3,4 CU-D-Phe
14

"5 Leu

N MeLeu

Als Beispiel.· wird nachfolgend eine repräsentative Synthese in fester Phase für das Peptid Nr. 1 durchgeführt, das als (Ac-Dehydro-Pro¹, 3,4 Cl₂-D-Phe², D-Trp"³'⁵)-LRF bezeichnet wird. Dieses Peptid hat die folgende Formel:

Ac-Dehydro Pro-3,4 Clp-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-PrO-GIy-NH₂

Es wird ein BHA-Harz verwendet und Boc-geschütztes GIy ,mit dem Harz unter Verwendung eines dreifachen Oberschusses des Boc-Derivates und von DCC als Aktivierungsmittel für eine Dauer von 2 Stunden mit dem Harz gekoppelt. Der Glycinrest geht an den BHA-Rest über eine Amidbindung.

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Nach der Kopplung des jeweiligen Aminosäurerestes wird nach dem folgenden Schema unter Anwendung einer automatischen Vorrichtung und beginnend mit etwa 5 g Harz gewaschen, deblockiert und der nächste Aminosäurerest gekoppelt :

Schritt Reagienzien und Operationen

Mischdauer in min.

3 3

10 3 5 2 3

80 ml (zweimal)

Methanol (MeOH)-VVasehe, 30 ml (zweimal) CH₂C1₂-Wäsche, 80 ml (dreimal) 50%iges TFA plus 5%igss 1,2-A'thandithiol in CHpCIp, 70 ml (zweimal) CH₂Cl₂~Wäsche, 80 ml (zweimal) TEA, 12,5%ig in CH₂Cl₂, 70 ml (zweimal) MeOH-lA/äsche, 40 ml (zweimal) CH₂Cl -Wäsche, 30 ml (dreimal) Boc-Aminosäure (10 mMol) in 30 ml entweder DMF oder CH^Clp, je nach der Löslichkeit der jeweils geschützten Aminosäure (einmal) plus DCC (10 mMol) in CH₂Cl₂ 30.»300

MeOH-Wäsche, 40 ml (zweimal) 3

TEA 12,5%ig in CH₂Cl₂, 70 ml (einmal) 3 MeOH-l-Väsche, 30 ml (zweimal) 3

CHpClp-VVäsche, 30 ml (zweimal) 3

Nach Schritt 13 wird eine Probe für einen Ninhydrintest genommen. Fällt der Test negativ aus, so wird zum Schritt zurückgegangen und die -nächste Aminosäure gekoppelt. Fällt der Test positiv oder leicht positiv aus, so werden die Schritte 9 bis 13 wiederholt.

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Das voranstehend ausgeführte Schema wird für die Kopplung der jeweiligen Aminosäuren des Peptids der Erfindung zur Anwendung gebracht, indem die erste Aminosäure zugefügt wurde. Der N-*Boc-Schutz wird für die jeweils verbleibenden Aminosäuren bei der Synthese durchgeführt. Die Seitankette des Arg wird mit Tos geschützt. Als Seitenkettsnschutzgruppe für die Hydroxylgruppe des Ser wird 03zl verwendet, '/Jährend als Seitenkettenschutzgruppe für die Hydroxylgruppe des Tyr 2,6-Dichlorbenzyl verwendet wird. Als letzte Aminosäure wird das N-Acetyl-Dehydro Pro eingeführt. Boc-Arg (Tos) und Boc-D-Trp werden mit ihrer geringen Löslichkeit in CHpCl₂ unter Verwendung von DMF CH-Cl Mischungen gekoppelt.

Die Abspaltung des Peptids vom Harz und die vollständige Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen findet ohne weiteres bei O ⁰C unter Verwendung von Flußsäure statt. Vor der HF-Behandlung wird Anisol als Spülmittel zugegeben. Nach der Entfernung der Flußsäure unter Vakuum wird das Harz mit 50%iger Essigsäure extrahiert und die IVaschlösungen lyophilisiert, um ein rohes Peptidpulver zu ergeben.

Die Reinigung des Peptids wird sodann mit Hilfe der lonenaustauschchromatographie an CMC (Whatman CM 32, unter Verwendung eines Gradienten von O,05...O,3 m NH.OAc in 50/50 Methanol/lVasser) durchgeführt, gefolgt von einer Trennungschromatographie in einer Gel-Filtrationssäule und unter Anwendung des folgenden Eluierungssystems:

n-Butanol; 0,ln Essigsäure (Volumenverhältnis 1:1).

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Die in der voranstehenden Tabelle aufgeführten Peptide werden in vitro und in vivo ausgewertet. Der in vitro-Test wird unter Verwendung von aufgelösten Hirnanhangdrüsen-Zellen vorgenommen, die vier Tage lang vor der Auswertung in Kultur gehalten wurden. Es werden die infolge der Peptidgabe vermittelten LH-Mengen durch Strahlungsimmunisierungsanalyse für Ratten-LH bestimmt. Kontrollschalen der Zellen erhielten lediglich eine 3 nanomolare Menge LRF, Versuchsschalen erhielten eine 3 nanomolars LRF-Menge plus eine Konzentration des Testpeptids von 0,01...S nanomolar. In den ausschließlich mit LRF behandelten Proben sekretierte LH-Menge wurde mit derjenigen verglichen, die von den mit Peptid plus LRF behandelten Proben abgegeben wurde. Die Ergebnisse wurden errechnet und in Tabelle I A (in vitro-Spalte) als molares Konzentrationsverhältnis des Test-Peptids zum LRF (Antagonist/LRF) angegeben, das zur Reduzierung der LH-Menge benötigt wurde, die von einem 3 nanomolaren LRF bis zu 50 % des Vergleichswerts freigesetzt wurde. (ICR₅₀),

Die voranstehend beschriebenen Peptide werden zur Ermittlung der Wirksamkeit zur .Ovulationsverhütung bei weiblichen Ratten verwendet. Bei diesem Test wird einer bestimmten Zahl erwachsener, weiblicher Spra-gue-Dawley-Ratten mit jeweils einem Körpergewicht zwischen 225.,.25O- g entweder eine Menge von 10 Mikrogramm des Peptids in Maiskeimöl etwa am Vortage der Ovulation injiziert,Dieses ist der Nachmittag vor dem Ovulationstermin. Eine separate Gruppe von weiblichen Ratten wird als Vergleichsreihe verwendet, der kein Peptid verabreicht wird. Oede der Vergleichsratten hat ihre Ovulation zum Ovulationstermin, Aus der in vivo-Spalte kann entnommen werden, daß die Peptide be-

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sonders wirksam zur Verhütung der Ovulation bei weiblichen Ratten in sehr geringen Konzentrationen sind, wobei sämtliche Peptidzusammensetzungen als "total" wirksam in Mengen von einem Milligramm anzusehen sind.

ι abelle	I A
in vitro
Peptid	ICR₅₀
1	0,039
2	0,070
3	0,021
4
5	0,011
6	0,010
7	0,030
8	0,125
9	0,044
10
11	0,048
12	0,29
13	O₁Il
14	0,05
Beispiel	II

in vivo (10 ^g) in vivo (5 ug) ovulierende Ratten

0/10 4/7

7/9

0/10 0/10

9/10

0/10 2/10

5/7

1/10 7/10

3/10

1/7 9/9

5/10 4/7

1/10 4/10

5/10

3/4

1/3 . 8/10

Nach den in Beispiel I beschriebenen Verfahren inffester Phase wurden-die folgenden Peptide der Formel

X-R^pCl-D-Phe-D-Trp-SeT-Ty T-R₄-R₅-ArQ-PrO-R₅

mit Ausnahme von Nr, 20 dargestellt, das auf einem chlormethylierten Harz hergestellt wurde.

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Tabelle II

Peptid	/\	^Rl	^R4	"5	^R5
15	Ac	Dehydro-Pro	D-T rp	Leu	GIy-MH₂
16	Il	ti	II	N⁰⁴MeLeU	IT
17	It	Dehydro-D-Pro	11	Leu	II
18	ti		If	M^MeLeu	tt
19	Acr	Dehydro-Pro	11	ti	It
20	Ac	Dehydro-O-Pro	ti	Leu	NHCH₂CH,
21	It	Thz	ti	It	GIy-NH₂
22	Il	Il	11	N¹* Me Leu	U
23	tt	D-Thz	If	tt	11
24	ti	It	II	Leu	ti

Dehydro-Pro (imBzl)

Dehydro-D-Pro

Thz D-Thz

D-His

Die in der voranstehenden tabelle aufgeführten Peptide werden in vitro und in vivo analysiert. Der in vitro-Test wird unter Verwendung von aufgelösten Zellen der Hirnanhangdrüse von Ratten durchgeführt, die vier Tage vor der Bestimmung in Kultur gehalten wurden, Die infolge der Anwendung der Peptide vermittelten LH-Mengen werden durch spezielle Strahlungsimmunisierungsanalyse für Ratten-LH bestimmt,

Vergleichsschalen von Zellen erhielten lediglich eine 3-nanomolare LRF-Menge; Versuchsschalen erhielten eine 3-nanomolare LRF-Menge plus eine Konzentration des Test-

U.NlAl13B2*009-832

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AP C 07 C/229 255/5 - 13 - 59 045/12

peptids von 1,,.1OO nanomolar. Dia in den mit LRF behandelten Proben sekretierte Menge wird mit derjenigen Menge verglichen, die von den mit Peptid plus LRF behandelten Proben abgegeben wurde. Die Ergebnisse wurden errechnet und in Tabelle Il (in vitro-Spalte) als molares Konzentrationsverhältnis des Testpeptids LRF dargestellt ~(~Antagonist/LRF), das zur Reduzierung der LH-Menge benötigt wird, die von 3-nanomolaren LRF bis zu 50 % des Vergleichswerts (ICR _) freigesetzt wird.

Verschiedene, voranst.ehend beschriebene Peptide wurden zur Bestimmung der Wirksamkeit bei der Verhütung der Ovulation bei weiblichen Ratten verwendet. Sei diesem Test wurden vier, sieben, neun oder zehn erwachsenen weiblichen Sprague-Dawley-Ratten mit jeweils einem Körpergewicht von 225.,,25O g eine Menge von 0,02 mg Peptid (sofern nicht anders angegeben) in Maiskeimöl etwa gegen Mittag am Vortage der Ovulation injiziert.

Dieser Zeitpunkt ist der Machmittag vor dem Ovulationstermin. Eine separate Gruppe von weiblichen Ratten wurde als Kontrollversuch gehalten, denen kein Peptid verabreicht wurde, üede der zehn weiblichen Vergleichsratten hatte die Ovulation zum Ovulationstermin, Wie aus der in~vivo-Spalte zu entnehmen ist, sind die Peptide zur Verhütung der Ovulation bei weiblichen Ratten besonders wirksam in geringen Konzentrationen, wobei sämtliche' Peptidzusammensetzungen als "total" wirksam bei einer Dosis von einem Milligramm betrachtet werden können.

J_- U V im W V W

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045/12

Tabelle II A	in vitro
Peptid	0,043
15	0,058
15	0,19
17	0,27
18	Ö7Ö3
19	0,2
20	0,14
21	0,13
22	0,1
23	0,12
24	0,042
25	- 0,2
26	0,15
27	0,1
28

in vivo ovulierende Ratten

0/10 0/7 3/8 _r 5/1 O² 0/9

5/8 _r 9/1O⁵

4/10

10/10 7/10

2)

1) ... 0,025 mg

Beispiel IxI

2) ... 0,010 mg

Die folgenden Peptide hatten die Formel:

X - R. - R₂ - R-, - Ser - bTyr - D-Trp - R₅ - Arg - Pro - R^

Sie wurden in dem in Beispiel I allgemein beschriebenen Verfahren in fester Phase dargestellt mit Ausnahme von Nr, 37, bei dem ein chlormethyliertes Harz verwendet wurde.

Ji 1111382*009832

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AP C 07 C/229 255/5

59 045/12

"abelle III

Peptid	H	^1Λ1	^R2	^R3	It	It	^R5	"5	ti
29	H	Dehydro-D,L-Pro	D-Phe	D-Trp	D-Phe	N⁰VeLeU GIy-NH₂	II
30	Ac	ti	II	If	Trp	Leu	Il
31	H	D ehyd ro-D,L-P ro	Il	11	ti	It	¹¹
32	Ac	tt	Il	Tt	D-His	N*MeLeu	It
33	Ac	Dehydro-Pro	It	It	D-Trp	Leu	Il
34	H	Dehydro-D-Pro	11	It	tt	II
35	H	Dehydro-Pro	II	II	II	NHCH₂CH,
36	H	Dehydro-D-Pro	II	II	It	GIy-MH₂
37	Bz	Dehydro-Pro	tr	ir	It
33	For	Dehydro-Pro	D-Trp	It	II
39	For	Dehydro-Pro	tr	TI	11
40	Acr	Dehydro-Pro	D-His	Il	It
41	Bz	Dehydro-Pro	It	It	It
42	Acr	Dehydro-Pro	Trp	ir
43	Dehydro-Pro	Il	tt

Die in der voranstehenden Tabelle aufgeführten Peptide wurden in vitro und in vivo bestimmte Die in-vitro-Bestimmung wurde unter Verwendung einer vier Tage alten Primärkultur von aufgelösten Zellen der Hirnanhangdrüse von Ratten durchgeführt. Die Mengen des infolge der Anwendung von Peptiden vermittelten LH wurden durch spezielle Strahlungsimmunisierungsanalysen für Ratten-LH ermittelt. Vergleihsschalen von Zellen erhielten lediglich eine 3-nanomolare Menge LRF, Versuchsschalen erhielten eine 3-nanomolare LRF-Menge plus eine Konzentration des Testpeptids im Bereich zwischen 1 und 100 nanomolar. Die ledig-

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lieh mit LRF behandelten Proben sekretierte LH-Monge wurde mit derjenigen verglichen/ die von Proben erzeugt wurde, die mit Peptid plus LRF behandelt wurden, Die Ergebnisse wurden errechnet und in Tabelle III A (in vitro-Spalte) als das molare Konzentrationsverhältnis des Testpeptids dargestellt, das zur Reduzierung der LH-Menge benötigt wird, die dirch 3-nanomolares LRF bis zu 50 % des Vergleichswerts freigesetzt wird (ICR _Q).

Es wurden verschiedene derjvoranstehend beschriebenen Peptide zur Bestimmung der Wirksamkeit' der Verhütung der Ovulation bei weiblichen Ratten verwendet. Bei diesen Tests wurden eine Reihe von erwachsenen, weiblichen Sprague-Dawley-Ratten mit jeweils einem Körpergewicht zwischen 225 und 250 g eine Menge von 0,02 mg des Peptids in Maiskeimöl etwa am Tage vor der Ovulation injiziert. Dieser Zeitpunkt ist der Nachmittag vor dem Ovulationstermin. Eine separate Gruppe von weiblichen Ratten erhielt kein Peptid und wurde zum Kontrollversuch verwendet, Oede der weiblichen Vergleichsratten hatte die Ovulation zum Ovulationstermin. . aus~ der-in^v-ivo-Spalte zu entnehmen ist, sind die

Peptide zur Verhütung' der Ovulation bei weiblichen Ratten besonders wirksam in sehr niedrigen Konzentrationen, wobei sämtliche Peptidzusammensetzungen als "total" wirksam bei einer Dosis von einem Milligramm betrachtet werden können,.

H.NIAI19S2*OO983£

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59 045/12

iabelle Ij.± A

Peptid

in vitro

in vivo ovulierende Ratten

29 30 31 32 33

0,5 : 1

0,8 : 1

0,3 : 1

0,4 : 1

0,5 : 1

4/10 7/10 1/10 2/10 0/4¹ ·

1) .., Dosis von 0,025 mg.

Diese Peptide können Säugetieren intravenös, subkutan, intramuskulär, oral, intranasal oder intravaginal zur Erzielung einer Infertilitätsinhibierung und/oder -regulierung verabreicht werden. Wirksame Konzentrationen hängen von der Art der Verabreichung der speziellen Species der zu behandelnden Säugetiere ab. Ein Beispiel für eine typische Dosierungsform ist eine physiologische Salzlösung, die das Peptid enthält und zur Verabreichung einer Menge

von 0,1...5 mg/kg Körpergewicht gegeben wird. Die orale Verabreichung des Peptids kann entweder in fester Form

oder in flüssiger Form erfolgen.

Obgleich die Erfindung hinsichtlich bevorzugter Durchführungen beschrieben wurde, kann davon ausgegangen werden, daß Änderungen und Modifikationen für den Fachmann durchführbar sind, ohne vom IVesen der Erfindung abzuweichen, die in den beigefügten Erfindungsansprüchen definiert sind. Beispielsweise lassen sich bei den Peptiden der vorliegenden Erfindung weitere bekannte Substitutionen vornehmen, ohne die Wirksamkeit der P.eptide zu beeinträchtigen.

UMIlMQ G η * η η η ο «

Claims

- 2k -

AP G 07 G /229 265/5 5$ 045 12

Erfindungsanspruch
LRP-Antagonisten

1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der formel:

-R₁ -R₂-E--Se j^-Tyr-E^-E^-Arg-Prö-

worin X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit 7 oder weniger Kohlenstoffatomen ist, R₁ Behydro-Pro, Eehydro-D-Pro, Thz oder D-Thz, R₂ ist B-Phe, B-His, D-Trp, Trp, Cl-D-Phe, Oichlor-O-Phe, C?--D-PJie, F-D-Phe, Difluor-D-Phe, AcNH-D-Phe, H0₂-D-Phe, Dinitro-I)-Phe, Br-D-Phe, Di"brom-Ov-Phe, CH^S-D-Phe, OGHo-B-Phe, CH^-O-Phe, R₃ ist D-Trp, Trp, D—Phe oder D-His, R. ist GIy oder eine isomere Aminosäure, R₅ ist Leu oder lÄe-Leu, Rg istGly-KHp oder M₂CH₂CH^, oder deren nichttoxische Salze, gekennzeichnet dadurch, daß

a) durch Festphasensynthese auf einem synthetischen Harz eine Zwischenverbindung der folgenden Formel gebildet wird:

X¹-R₁-R₂-E₃-SSr (X²)-Tyr- (X³^)-R₄-R₅-ATg (X⁴)-Pro-X⁵,

1 2

worin 1 eine Alpha-Amino-Schutzgruppe ist, X eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe des

Ser, X eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe des Tyr, X* eine Schutzgruppe für die Stickstoffen
atome des Arg und Ir ausgewählt wird aus GIy-O-CH₂ (Harzträger), O-CH₂-(Harzträger), GIy-NH-(Harzträger),

b) eine oder mehrere Gruppen X ...X abgespalten werden und im Bedarfsfall ein reduzierendes Peptid in dessen nicht-toxisches Salz überführt wird.
28.0E 1982*043698

- 59 045/12
12.5.1982

AP C 07 C/229 255/5
2. Verfahren nach Punkt I₁ gekennzeichnet dadurch, daß Rp Dichlor-D-Phe, CF -D-Phe, Dirluor-0-Phe, AcIMH-D-Phe,
Dibrom-D-Phe, CH„S-D~Phe, OCH -D-Phe oder CH_-D-Phe ist.

3, Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß R. Dehydrc—Pro ist,

4, Verfahren nach Punkt 1 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß R₂ Dichlor-D-Phe ist.

5, Verfahren nach Punkt 1 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß R₂ 4 CF₃~D-Phe ist.

6, Verfahren nach Punkt 1 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß R₂ 4 AcNH-D-Phe ist.

7, Verfahren nach Punkt 1 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß R₂ 4 N0₂-D-Phe ist.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß R₂ 4 Br-D-Phe ist.
9. Verfahren nach Punkt 1 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß R_p 4 O-US-D-Phe ist.

^ O

10, Verfahren nach Punkt 1 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß R₂ 4 OCH_-D-Phe ist.

11, Verfahren nach Punkt 1 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß R₂ 4 CH -D-Phe ist,

12, Verfahren nach Punkt 1 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß X Acryl ist.

1 L n!i .11 -i Q .^ Ί -i /1 .Oil ο <-· ο
12.5.1932

₉₅· AP C 07 C/229 265/5

- 26 - 59 045/12

13, Verfahren nach Punkt 1 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß X Acetyl ist.

14, Verfahren nach Punkt 12 oder 13, gekennzeichnet dadurch _t daß R₂ 2,4 Cl-D-Phe ist, 3,4 Cl-D-Phe, 4 F-D-Phe, 4 NO₂-D-Phe, 4 Br-D-Phe oder 4 CH₃S-D-PhB.

15, Verfahren nach Punkt 1 oder 3 oder 14, gekennzeichnet dadurch, daß R-, D-Trp ist.

IS* Verfahren nach Punkt 1 oder 3 oder 14, gekennzeichnet dadurch, daß R₄ D-Trp ist.
17. Verfahren nach Punkt 1 oder 3 oder 14,? gekennzeichnet dadurch, daß R^, eine lipophile, aromatische D-isomere Aminosäure ist.
13. Verfahren nach Punkt 1 oder 3 oder 14, gekennzeichnet dadurch, daß R₅ Leu ist.
19. Verfahren nach Punkt 1 oder '3 oder 14, gekennzeichnet dadurch, daß R_r Gly-NH_p ist..

20, Verfahren nach den voranstehenden Punkten 1 bis 2 oder nach Punkt 14, gekennzeichnet dadurch, daß X Acetyl, R₃ D-Trp, R₄ D-Trp und R_r GIy-NH₂ sind.
21., Verfahren nach den voranstehenden Punkten 1 bis 11 oder nach Punkt 14, gekennzeichnet dadurch, daß X Acrylyl, R₃ D-Trp, R₄ D-Trp und R GIy-MH₂ sind.

, , ,, η η 1 J Π Γ- Γ; .,, ί\ I \ Q
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^₆ AP C 07 C/229 255/5

~ ST - 59 045/12
22. Verfahren nach Punkt 21 oder 22, gekennzeichnet dadurch,

daß R„ Leu ist.
ο
23. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß R₂ 4 Cl-D-Phe ist.
24. Verfahren nach Punkt 23, gekennzeichnet dadurch, daß R₁ D-Trp ist.
25. Verfahren nach Punkt 23, gekennzeichnet dadurch, daß R. imBzl-D-His ist.

26* Verfahren nach Punkt 23, gekennzeichnet dadurch, daß R^ eine lipophile, aromatische, D-isomere Aminosäure ist.
27. Verfahren nach den voranstehenden Punkten 23 bis 25, gekennzeichnet dadurch, daß R_ Leu ist.
28. Verfahren nach den voranstehenden Punkten 23 bis 27, gekennzeichnet dadurch, daß R,- GIy-NH₀ ist.
29. Verfahren nach den voranstehenden Punkten 23 bis 23, gekennzeichnet dadurch, daß X Acetyl ist.
30. Verfahren nach den voranstehenden Punkten 23 bis 28, gekennzeichnet dadurch, daß X Acrylyl ist.
31. Verfahren nach den voranstehenden Punkten 23 bis 30, gekennzeichnet dadurch, daß R₁ Dehydro-Pro ist.
32. Verfahren nach den voranstehenden Punkten 23 bis 30, gekennzeichnet dadurch, daß R₁ Dehydro-D-Pro ist.

λ ι. y PiHQ QO * ti Ci V) Ö
12.5,1932

^ AP C 07. C/229 255/5

- 2-3" - 59 045/12
33. Verfahren nach den voranstehenden Punkten 23 bis 30, gekennzeichnet dadurch, daß R^ Thz ist.
34. Verfahren nach den voranstehenden Punkten 23 bis 30, gekennzeichnet dadurch, daß R* D-Thz ist.
35. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß
R D-Phe und R D-Trp sind.
35. Verfahren nach Punkt 35, gekennzeichnet dadurch, daß X Wasserstoff ist.

37, Verfahren nach Punkt 35, gekennzeichnet dadurch, daß X Acetyl ist.
38.. Verfahren nach Punkt 35, gekennzeichnet dadurch, daß X Acrylyl ist.
39. Verfahren nach den voranstehenden Punkten 35 bis 38, gekennzeichnet dadurch, daß R_n. Leu ist.
40. Verfahren nach den voranstehenden Punkten 35 bis 38, gekennzeichnet dadurch, daß R₁- i\r*MeLeu ist.
41. Verfahren nach Punkt 39 oder 40, gekennzeichnet dadurch,

daß R_r GIy-NH₀ ist.
5 ' 2
42. Verfahren nach Punkt 39 oder 40, gekennzeichnet dadurch, daß R- NHCH₀CH- ist.

U !Vl AMi^ «9 *n HÖR S