DD202694A5 - Verfahren zur herstellung von peptiden - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die die Sekretion von Gonadotropinen durch die Hypophyse inhibieren und die Abgabe von Steroiden durch die Geschlechtsdruesen inhibieren. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Peptiden mit verbesserter antagonistischer Wirkung, die bewirken, bei Verabreichung einer wirksamen Menge die Ovulation weiblicher Saeugetiereier und/oder die Abgabe von Steroiden durch die Geschlechtsdruesen zu verhindern. Erfindungsgemaess werden Peptide der Formel X-R tief 1-R tief 2-R tief 3-Ser-Tyr-R tief 4-R tief 5-Arg-Pro-R tief 6 hergestellt, worin X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit 7 oder weniger Kohlenstoffatomen ist; R tief 1 Dehydro Pro oder Dehydro D-Pro ist; R tief 2 D-Phe, Cl-D-Phe, Dichlor-D-Phe, CF tief 3-D-Phe, F-D-Phe, Difluor-D-Phe, AcNH-D-Phe, NO tief 2-D-Phe, Dinitro-D-Phe, Br-D-Phe, Dibrom-D-Phe, CH tief 3-S-D-Phe, OCH tief 3-D-Phe oder CH tief 3-D-Phe ist; R tief 3 D-Trp oder B-D-NAL ist; R tief 4 eine D-Isomer-Aminosaeure und vorzugsweise B-D-NAL ist; R tief 5 Leu oder N alpha Me-Lau ist; und R tief 6 Gly-NH tief 2 oder NHCH tief 2 CH tief 3 ist, unter d. Voraussetzung allerdings, dass entweder R tief 3 oder R tief 4 B-D-NAL ist.
Description
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AP O12N/239 196/3 60 658 18 3.11.82
Verfahren zur Herstellung von Peptiden Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die als GnRH-Antagonisten brauchbar sind.
Die erfindungsgemäßen Peptide inhibieren die Abgabe von Gonadotropinen durch die Hypophyse bei Säugetieren, einschließlich Menschen· Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Verhinderung der Ovulation und/oder zur Inhibition der Abgabe von Steroiden. Insbesondere betrifft die Erfindung Peptide, die die Funktion der Geschlechtsdrüsen und die Abgabe der Steroidhormone Progesteron und Testosteron inhibieren.
Die Hypophyse ist durch einen Stiel mit dem Bereich in der als Hypothalamus bekannten Gehirnbasis verbunden. Vor allem werden das follikelanregende Hormon (FSH) und das luteInislerende Hormon (LH), die manchmal als Gonadotropine oder gonadotrope Hormone bezeichnet werden, durch die Hypophyse abgegeben. Diese Hormone regulieren in Kombination das Funktionieren der Geschlechtsdrüsen zur Erzeugung von Testosteron in den Hoden und von Progesteron und Estrogen in den Ovarien, und sie regulieren außerdem die Bildung und Reifung von Geschlechtszellen«
Die Abgabe eines Hormons durch den Hypophysenvorderlappen erfordert im allgemeinen eine vorausgehende Abgabe einer anderen, von dem Hypothalamus erzeugten Klasse von Hormonen. Eines der Hypothalamushormone wirkt als ein Faktor, der die Abgabe der gonadotropen Hormone, vor allem von LH, auslöst. Das als Abgabefaktor für IiI wirkende Hypothalamushormon wird hier als GnRH bezeichnet, obwohl es auch
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als LH-RH und ale LRF bezeichnet worden ist. GnRH ist isoliert worden und ist als Decapeptid mit folgender Struktur charakterisiert worden: p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-KHg
Bei Peptiden handelt es sich um Verbindungen, die zwei oder mehr Aminosäuren enthalten, in denen die Carboxylgruppe einer Säure mit der Aminogruppe der anderen Säure verkettet ist. Die oben für GnRH angegebene Formel stimmt mit der herkömmlichen Darstellung von Peptiden überein, bei denen die Aminogruppe links und die Carboxylgruppe rechts steht. Die Stellung des Aminosäurerestes wird durch die Numerierung der Aminosäurereste von links nach rechts gekennzeichnet. Im Falle von GnRH wurde der Hydroxylantell der Carboxylgruppe von Glycin durch eine Aminogruppe (HH«) ersetzt. Die Abkürzungen für die einzelnen oben genannten Aminosäurereste sind allgemein üblich und basieren auf dem Trivialnamen der Aminosäure, z, B. ist p-Glu Pyroglutaminsäure, His Histidin, Trp Tryptophan, Ser Serin, Tyr Tyrosin, GIy Glycin, Leu Leucin, Arg Arginin* Pro Prolin, Phe Phenylalanin und AIa Alanin, Diese Aminosäuren werden zusammen mit Valin, Isoleucin, Threonin, Lysin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutamin, Cystein, Methionin, Phenylalanin und Prolin allgemein als die üblichen, natürlich vorkommenden Aminosäuren angesehen. Außer Glycin weisen die Aminosäuren der erfindungsgemäßen Peptide die L-Konfiguration auf, wenn nichts anderes angegeben ist«
Es ist bekannt, daß die Substitution von D-Aminosäuren für GIy in der 6-Stellung des GnRH-Decapeptides ein Peptid« material ergibt, das eine um etwa das 1- bis 35-fache
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stärkere Wirksamkeit ale GnRH hinsichtlich der Abgabe von IH und anderen Gonadotropinen durch die Hypophyse von Säugetieren aufweiat. Von K. U· Prasad, u, a·, J. Med» Chern,, Bd. 19, 492 (1976) wird berichtet, daß eine größere Wirksamkeit auch durch die Substitution in der 3-Stellung vom 3-(1-Naphthyl) AIa erzielt werden kann. Die Abgabewirkung wird erzielt, wenn das GnRH-Analogon. intravenös, subkutan, intramuskulär, oral, intranasal oder intravaginal einem Säugetier verabreicht wird·
Es ist ebenfalls bekannt, daß die Substitution von verschiedenen Aminosäuren für His (oder die Deletion von His) in der 2-Stellung des GnRH-Decapeptides Analoge erzeugt, die eine inhibitorische Wirkung auf die Abgabe von IH und anderen Gonadotropinen durch die Hypophyse von Säugetieren ausüben·
Einige weibliche Säugetiere, die keinen Ovulationszyklus haben und keine Hypophysen- und Eierstookstörung aufweisen, beginnen normale Mengen der Gonadotropine IH und FSH nach der entsprechenden Verabreichung von GnRH abzusondern· Daher ist man der Meinung, daß die Verabreichung von GnRH zur Behandlung von denjenigen Fällen von Unfruchtbarkeit, in denen eine funktionelle Störung in dem Hypothalamue vorhanden ist, erfolgreich ist·
Es gibt auch Gründe, in denen die Ovulatlon bei weiblichen Säugetieren verhindert werden möchte, und es wurde die Verabreichung von GnRH-Analogen, die antagonistisch auf die normale Funktion von GnRH wirken, zur Verhinderung der Ovulation vorgenommen· Aus diesem Grunde werden Analoge von GnRH, die antagonistisch gegenüber GnRH sind, auf ihre potentielle Verwendung als Empfängnisverhütungsmittel oder für die Regulierung der Kontieptionsperioden hin untersucht«
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Ziel der Erfindung 1st die Bereitatellung von neuartigen Peptiden, die stark antagonistisch gegen endogenes GnRH sind und die die Sekretion von IH und die Abgabe von Steroiden durch die Geschlechtsdrüsen von Säugetieren verhindern·
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Peptide aufzufinden, welche höher potente LRF-Antagonisten sind und die einen gewünschten antagonisten Effekt bewirken, ohne daß die Notwendigkeit besteht, hohe Dosen zu verabreichen·
Durch die Erfindung werden Peptide,zur Verfügung gestellt, die die Abgabe von Gonadotropinen bei Säugetieren, einschließlich Menschen, inhibieren, und auch Verfahren für die Inhibition der Abgabe von Steroiden durch die Geschlechts· drüsen von männlichen und weiblichen Säugetieren. Die verbesserten GnEH-Analoge sind antagonistisch gegen GnBH und üben eine inhibitorische Wirkung auf die Fortpflanzungsprozesse von Säugetieren aus« Diese Analoge können zur Inhibierung der Erzeugung von Gonadotropinen und Geschlechtshormonen und verschiedener Zustände wie vorzeitige Pubertät, hormonabhängige Tumorbildung, Dysmenorrhoe und Endometrioeex verwendet werden.
Erfindungsgemäß sind allgemein Peptide synthetisiert worden, die die Sekretion von Gonadotropinen durch die Hypophyse von Säugetieren, einschließlich Menschen, stark inhibieren und/oder die Abgabe von Steroiden durch die Geschlechtsdrüsen inhibieren· Diese Peptide sind Analoge von GnHH, in
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denen eine 1-Stellungs-Substitution in lOrm von Dehydroprolin, eine 3- und/oder 6-Stellungs-Substitution in Porm von B-(Naphthyl) D-Alanin (anschließend B-D-NAL) und vorzugsweise auch ein Substituent in der 2-Stellung vorhanden sind. Der Substituent in der 1-Stellung kann so modifiziert sein, daß seine alpha-Aminogruppe eine Acylgruppe wie Formyl, Acetyl, Acrylyl, Vinylacetyl oder Benzoyl enthält. Dehydro L-Pro wird in der 1-Stellung bevorzugt. Modifiz&ertes D-Phe ist vorzugsweise in der 2-Stellung anzutreffen und führt zu erhöhter antagonistischer Aktivität infolge der spezifischen, im Benzolring vorhandenen Modifikationen. Einzelne Substitutionen für Wasserstoff sind vorzugsweise in der para- oder 4-Stellung zu finden und Doppel-Substitutionen werden vorzugsweise in der 2,4- oder der 3»4-Stellung vorgenommen. Die Substituenten werden am günstigsten unter Chlor, Dichlor, Methyl, Fluor, Difluor, Trifluormethyl, Methoxy, Brom, Dibrom, Nitro, Dinitro, Acetylamino und Methylmercaptox ausgewählt. B-D-NAI wird in der 3-Stellung bevorzugt; es kann Jedoch D-Trp verwendet werden. B-D-NAL oder imBzl D-His oder D-Trp oder irgendeine andere lipophile aromatische D-Aminosäure wird in der 6-Stellung bevorzugt, obwohl jede D-Isomer-Aminosäure, vor allem natürlich vorkommende Aminosäuren, unsubstituiert oder substituiert, ζ. B. D-Leu und D-Ser (0-t But) verwendet werden können. Die Substitutionen in der 7- und 10-Stel lung sind wahlweise«
Da diese Peptide sehr wirksam für die Inhibition der Abgabe von LH sind, werden sie oft als GnRH-Antagonisten bezeichnet. Die Peptide inhibieren die Ovulation bei weiblichen Säugetieren, wenn sie in sehr geringen Mengen proöstrus verabreicht werden, und sie führen auch wirksam zur Resorption von befruchteten Eiern, wenn sie kurz nach der Konzep-
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tion verabreicht werden. Diese Peptide Bind auch für die kontrazeptive Behandlung männlicher Säugetiere wirksam,»
Die erfindungsgemäßen Peptide werden spezifisch durch fol gende Formel dargestellt»
worin X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit 7 oder weniger Kohlenstoffatomen iatj R1 Dehydro Pro oder Dehydro D-Pro 1st j R2 D-Phe, Cl-D-Phe, Dichlor-D~Phe, OF^-D-Phe, P-D-Phe, Difluor-D-Pne, AcHH-D-Phe, NOg-D-Phe, Dinitro-D-Phe, Br-D-Phe, Dibrom-D-Phe, CH,-S-D-Phe, OCH^-D-Phe oder OHo-D-Phe ist; R^ D-Trp oder B-D-BfAL 1st; R. eine aromatische D-Isomer-Aminosäure oder B-D-HAL ist; Rc Leu oder N0^Me-LeU istj und Rg GIy-HHp oder HHCHpCH, is"fc| vorausgesetzt allerdings, daß entweder Ro oder R, B-D-NAL ist.
Unter Dehydro Pro ist 3,4-Dehydroprolin, CcHyOgU, zu verstehen, und wenn Σ ein Acylradikal ist, dann ist es an den Stickstoff gebunden. Unter B-D-HAL ist das D-Isomere von Alanin zu verstehen, das durch Haphthyl am B-Kohlenstoffatom substituiert ist, das auoh als 3-B-D-HAL bezeichnet werden kann. Vorzugsweise wird B-D-2HAL verwendet, aber B-D-1HAL kann ebenfalls verwendet werden·
Die erfindungsgemäßen Peptide können durch klassische Lösungssynthese oder durch eine Pestphasentechnik unter Verwendung eines chlormethylierten Harzes, eines Methylbenzylhydrylaminharzes (MBHA) oder eines Benzhydrylamin (BHA) Harzes synthetisiert werden. Die Festphasensynthese wird in einer Weise durchgeführt, bei der die Aminosäuren in der Kette in der ausführlich in der US-PS 4 211 693 beschriebenen Form schrittweise zugesetzt werden. Im Fachgebiet all-
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gemein bekannte Seitenketten-Schutzgruppen werden vorzugsweise zu Ser, Tyr, Arg und His hinzugefügt, bevor diese Aminosäuren mit der auf dem Harz aufgebauten Kette gekoppelt werden. Durch eine solche Methode entsteht das vollkommen geschützte Zwischenprodukt Peptidoresin«
Die erfindungsgemäßen Zwischenprodukte können folgendermaßen dargestellt werden:
X1-R1-R2-R3-Ser(X2)-!Tyr(X3)-R4-R5-Arg(X4)-Pro-X5 worin bedeuten:
X eine solche alpha-Aminoschutzgruppe, von der im Fachgebiet bekannt ist, daß sie für die schrittweise Synthese von Polypeptiden geeignet ist; und wenn X in der verlangten Peptidzueammensetzung eine bestimmte Acylgruppe ist, kann diese Gruppe als Schutzgruppe verwendet werden« Zu dem Klassen von alpha-Aminoschutzgruppen, die durch X dargestellt werden, gehören (1) acylartige Schutzgruppen, wie Pö^rmyl (For), Trifluoracetyl, Phthalyl, p- Toluol sulfonyl (Tos)» Benzoyl (Bz), Benzolsulfonyl, o-Nitrophenylsulfenyl (lips), Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxyacetyl, Acrylyl (Acr), Chlöracetyl, Acetyl (Ac) und alpha-Ghlorbutyryl; (2) aromatische urethanartige Schutzgruppen, z. B. Benzyloxycarbonyl (Z) und substituiertes Benzyloxycarbonyl, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl| (3) aliphatisch© ürethanschutzgruppen wie Tertbutyloxycarbonyl (Boo), Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Äthoxyoarbonyl und Allyloxycarbonyl; (4) OycIoalkylurethan-Typ-Schutzgruppen wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclone xy Io xy carbonyl | (5) Thiourethan-Typ-Schutzgruppen wie Phenylthiocarbonyl; (6) alkylartige Schutzgruppen wie Allyl (AIy), Triphenylmethyl(trityl) und Benzyl (BzI); (7) Tri-
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alkylsilangruppen wie Trimethylsilan. Die bevorzugte alpha-Aminoschutzgruppe ist Boc, wenn X Wasserstoff ist«
X eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Ser und ausgewählt aus der Acetyl, Benzoyl, Tetrahydropyranyl, tert-Butyl, Trityl, Benzyl und 2,6-Dichlorbenzyl umfassenden Gruppe. Benzyl wird bevorzugt.
Ύ? eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr, ausgewählt aus der Tetrahydropyranyl, tert-Butyl, Trityl, Benzyl, Benzyloxycarbony1, 4-Brombenzyloayoarbonyl und 2,6-Dichlorbenzyl umfassenden Gruppe. 2,6-Dichlorbenzyl wird bevorzugt.
. eine Schutzgruppe für die Stickstoffatome von Arg und ausgewählt aus der Hitro, Tos, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Boc umfaasenden Gruppe $ alternativ kann X Wasserstoff sein, was bedeutet, daß an den Stickstoffatomen der Seitenkette von Arginin keine Schutzgruppen vorhanden sind. Tos wird bevorzugt.
X^ aus der GIy-O-CH2-(Harzträgermittel)j 0-CH2-(Harzträgermittel) $ GIy-NH-(Harzträgermittel) und OH, Ester, Amid und Hydrazid von GIy umfassenden Gruppe oder direkt an Pro angefügt ist.
Als Kriterium für die Auswahl von Seitenketten-Schutzgruppen für Χ2~χ4 gilt, daß die Schutzgruppe gegenüber dem Reagens bei den für die Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe für jeden Syntheseschritt ausgewählten Reaktionsbedingungen be« ständig sein muß. Die Schutzgruppe darf unter Verknüpfungs-
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bedingungen nicht abgespalten werden, und die Schutzgruppe muß nach Abschluß der Synthese der geforderten Aminosäuresequenz unter Reaktionsbedingungen, die die Feptidkette nicht verändern, entfernbar sein·
Wenn die X -Gruppe Gly-O-CH«-(Harzträgermittel oder 0-CHg-(Harzträgermittel) ist, wird die Esterkomponente einer der vielen funktioneilen Gruppen des Polystyrolharzträgermittels dargestellt. Wenn die X -Gruppe GIy-MH-(Harzträgermittel) ist, verbindet eine Amidbindung GIy mit BHA-Harz oder einem ISBHA-Harz,
Wenn X Acetyl, Formyl, Acrylyl, Vinylacetyl, Benzoyl, oder irgendeine andere Acylgruppe mit 7 Kohlenstoffatomen oder weniger ist, dann kann es als die X1-Schutzgruppe für die alphä-Aminogruppe von R- verwendet werden, wobei es in diesem Falle vor dem Verknüpfen der letzten Aminosäure mit der Feptidkette zugesetzt werden kann. Alternativ kann eine Reaktion mit dem Peptid an dem Harz ausgeführt werden, z· B* die Itasetzung mit Essigsäure in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder vorzugsweise mit Essigsäureanhydrid.
Das vollständig geschützte Peptid kann durch Ammonolyse, wie sie im Fachgebiet allgemein bekannt ist, von dem chlormethylierten Harzträgermittel abgespalten werden, wodurch sich ein vollständig geschütztes Amidzwischenprodukt ergibt« Die Entfernung des Schutzes von dem Peptid sowie die Abspaltung des Peptide von dem Benzylhydrylaminharz kann bei 0 0C mit Fluorwasserstoffsäure (HF) erfolgen» Anisol wird dem Peptid vorzugsweise vor der Behandlung mit HF zugesetzt.
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Nach der Entfernung von HP unter Vakuum, wird das abgespaltene ungeschützte Peptid in herkömmlicher Weise mit Äther behandelt, dekantiert, in verdünnter Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert.
Die Reinigung des Peptides erfolgt durch Ionenaustausch« Chromatographie auf einer CMC-Säule und anschließend durch Verteilungschromatographie unter Anwendung des Eluierungssystemsx n-Butanolj 0,1 N Essigsäure (iyi Volumenverhältnis) auf einer mit Sephadex G-25 gefüllten Säule oder durch Anwendung von HPLC wie im Fachgebiet bekannt ist.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind in Mengen von weniger als 200 Mikrogramm je Kilogramm Körpergewicht wirksam, wenn sie gegen Mittag am Tage des Proöstrus zur Verhinderung von Ovulation bei weiblichen Ratten angewandt werden· S1Ur eine längere unterdrückung der Ovulation kann es erforderlich sein, im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 5 Milligramm Je Kilogramm Körpergewicht liegende Dosismengen anzuwenden. Diese Antagonisten sind auch als Kontrazeptiva wirksam, wenn sie männlichen Säugetieren auf regelmäßiger Basis verabreicht werden· Da diese Verbindungen die Testosteronspiegel reduzieren werden (eine unerwünschte Folge beim normalen, sexuell aktiven Mann), kann es empfehlenswert sein, zusätzliche Mengen von Testosteron zusammen mit dem GnRH-Antagonisten zu verabreichen« Diese Antagonisten können auch zur Regulierung der Erzeugung von Gonadotropinen und Sexualsteroiden für andere als die oben genannten Zwecke verwendet werden.
Im folgenden Beispiel soll die Erfindung deutlicher erläutert werden:
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Die folgenden Peptide mit der Formel X-Dehydro Ser-Tyr-R.-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 werden mit Hilfe der oben erläuterten Festphasenmethode hergestellt.
| Tabelle I | X | R2 | R3 | R4 |
| Hr, | Ac | 4-F-D-Phe | D-Tr ρ | B-D-2NAL |
| 1 | Il | Il | B-D-2UAL | D-Trp |
| 2 | H | 3,4-F2-D-HIe | Il | Il |
| 3 | Il | 4-Cl-D-Phe | It | Il |
| 4 | It | 4-NO2-D-Phe | Il | 11 |
| 5 | Ac r | 4-F-D-Phe | B-D-1NAL | Il |
| 6 | Il | 4-F-D-Phe | D-Tr ρ | B-D-1NAL |
| 7 | Ac | 4-F-D-Phe | B-D-1NAL | H |
| 8 | Il | 4-Gl-D-Phe | B-D-2NAL | Il |
| 9 | Il | 2,4 012-D-Phe | Il | B-D-2NAL |
| 10 | It | 3,4 Gl2-D-Phe | H | Il |
| 11 | ti | 4-F-D-Phe | H | Il |
| 12 | ti | 4-N02-D-Phe | Il | Il |
| 13 | Il | 3,4-F2-D-Phe | Il | Il |
| 14 |
Als ein Beispiel wird eine repräsentative Festphasensynthese des obigen Peptide Nr. 1, das als /Ic-Dehydro Pro 4-F-D-Phe2, D-Trp3, B-D-2NAL^7-GnRH bezeichnet wird, anschließend beschrieben. Dieses Peptid hat folgende Formelt
Ac-Dehydro Pro^-F-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-B-D^NAL-Leu-Arg- -Pro-Gly-NH2
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Es wird ein BHA-Harz verwendet, und Boc-geschütztes GIy wird im Laufe von 2 Stunden in CHp-Cl2 unter Verwendung eines dreifachen Überschusses von Boc-Derivat und DCC als Aktivierungsreagens mit dem Harz verknüpft. Der Glycinrest bindet sich durch eine Amid-Bindung an den BHA-Rest*
Nach dem Verknüpfen jedes Aminosäurerestes werden Waschen, Deblockieren und Verknüpfen des nächsten Aminosäurerestes nach folgendem Schema unter Verwendung einer automatischen Maschine und mit 5 Gramm Harz beginnend wie folgt ausgeführt:
Schritt Reaktionsmittel und Arbeitsgänge Mischzeiten,
min
CH2Cl2 Waschlösung 80 ml (zweimal) Methanol (MeOH) Waschlösung 30 ml (zweimal)
CH2Cl2 Waschlösung 80 ml (dreimal) 50 % Ti1A plus 5 % 1,2-Äthandithiol in GH2Cl2 70 ml (zweimal) CH2Cl2 Waschlösung 80 ml (zweimal) TEA 12,5 % in CH3Cl2 70 ml (zweimal) MeOH Waschlösung 40 ml (zweimal) CH2Cl2 Waschlösung 80 ml (dreimal) Boc-Aminosäure (10 raMol) in 30 ml von entweder DMP oder CHgOlg, je nach der Löslichkeit der betreffenden geschützten Aminosäure (einmal) plus DCC (10 mMol) in JdH2Cl2
MeOH Waschlösung 40 ml (zweimal) TEA 12,5 % in CH2Cl2 70 ml (einmal) MeOH Waschlösung 30 ml (zweimal)
3 3
10 3 5 2 3
CH2Cl2
Waschlösung 80 ml (zweimal)
30 - 300 3 3 3 3
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Nach Schritt 13 wird eine Aliquote für einen Ninhydrin-Test genommen: Wenn der Test negativ ist, ist zu Sohritt 1 zur Verknüpfung der nächsten Aminosäure zurückzugehen; ist der Test positiv oder leicht positiv, ist auf die Schritte 9 bis 13 zurückzugehen und diese sind zu wiederholen.
Das obige Schema wird für die Verknüpfung jeder der Aminosäuren des erfindungsgemäßen Peptide, nachdem die erste Aminosäure angefügt worden 1st, verwendet, No^" Boc-Schutz wird für jede der verbleibenden Aminosäuren während der Synthese angewandt, No£ BocB-D-NAL wird nach einer im Fachgebiet bekannten Methode hergestellt, z, B0 wie ausführlich in der US-PS 4 234 571, ausgegeben am 18, November 1980, beschrieben wird. Die Seitenkette von Arg wird mit Tos geschützt, OBzI wird als Seitenketten-Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Ser verwendet, und 2-6-Dichlorbenzyl wird als Seitenketten-Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Tyr verwendet, N-Acetyl-dehydro Pro wird als die letzte Aminosäure eingebaut, Boc-Arg(Tos) und Boc-D-Trp, die eine geringe Löslichkeit in CHpCl« aufweisen, werden unter Verwendung von DMF - GHgClg-Gemischen verknüpft.
Die Abspaltung des Peptides von dem Harz und die vollständige Entfernung des Schutzes von den Seltenketten erfolgt bei 0 0O mit HF sehr schnell. Anisol wird als Reinigungsmittel vor der HF-Behandlung zugesetzt. Nach der Entfernung von HF unter Vakuum wird das Harz mit 50 SSiger Essigsäure extrahiert, und die Waschabgänge werden lyophilisiert, um ein rohes Peptidpulver zu gewinnen.
Die Reinigung des Peptide erfolgt anschließend mit Hilfe von lonenaustausch-Chromatographie auf CMO (Whatman OM 32,
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unter Verwendung eines Gradienten von 0,05 bis 0,3 M IJH ,OAc in 50/50 Methanol/Wasser) und anschließend duroh Verteilungschromatographie in einer GeIfiltrations-Säule unter Anwendung folgenden Eluierungssystems» n-Butanolj 0,1 N Essigsäure (1ti - Volumenverhältnis).
Das Peptid wird auf Homogenität hin beurteilt, wozu Diinnschichtchromatographie und mehrere verschiedene Lösungsmittelsysteme sowie TJWkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie und eine wäßrige Triäthylammoniumphosphatlösung plus Acetonitril verwendet werden. Die Aminosäure-Analyse des resultierenden gereinigten Peptide stimmt mit der Formel für die vorbereitete Struktur überein, da sie im wesentlichen ganzzahlige Werte für jede Aminosäure in der Kette ergibt. Die optische Drehung wird mit Hilfe eines lichtelektrischen Polarimeter als £oCj D22 16,1° + 1 (c a 1 j 50 %lge Essigsäure) ermittelt.
Das Peptid wird in vitro und in vivo analysiert. Der in-v vitro-Test wird unter Verwendung von dissoziierten Hypophysenzellen von Ratten durchgeführt, die 4 Tage lang vor der Analyse in Kultur gehalten wurden. Die sich als Reaktion auf die Anwendung von Peptiden ergebenden Spiegel von IH werden durch eine spezifische Radioimmunoanalyse für Ratten-IH untersucht. Kontrollschalen von Zellen erhalten nur eine Menge, die 3 Nanomol GnRH beträgt: Versuchsschalen erhalten eine Menge von 3 Nanomol GnRH plus eine Menge mit einer zwischen 0,01 und 3 Nanomol liegenden Konzentration des Test-Peptids. Die Menge des in den nur mit GnRH behandelten Proben ausgeschiedenen IH wird mit der Menge verglichen, die von den mit dem Peptid plus GnRH behandelten Proben ausgeschieden wurde«, Die Ergebnisse werden berechnet, um
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das Molkonzentrationsverhältniß von Test-Peptid und GnRH (Antagonist/GnRH) zu bestimmen, das gebraucht wird, um die Menge des duroh 3 Nanomol GnRH freigesetzten IH auf 50 Prozent des Kontrollwertes (ICR50), der mit 0,005 ermittelt wurde, zu reduzieren.
Pas oben beschriebene Peptid wird auch benutzt, um die Wirksamkeit zur Verhinderung der Ovulation bei weiblichen Ratten zu bestimmen. Bei diesem Versuch erhält eine spezifische Anzahl ausgewachsener weiblicher Sprague-Dawley-Ratten, mit je einem Körpergewicht von 225 bis 250 Gramm, 5 Mikrogramm Peptid in Maiskeimb'l etwa mittags am Tage des Pro ös tr us injizierte Proöstrus ist der Nachmittag vor östrus (Ovulation). Eine gesonderte Gruppe weiblicher Ratten wird als Kontrolle verwendet, denen kein Peptid verabreicht wird. Jedes der Kontrollrattenweibchen hat Ovulation bei östrusj von den behandelten Ratten hat keine ovuliert. Infolgedessen nimmt man an, daß das Peptid in einer sehr geringen Dosis äußerst wirksam zur Verhinderung der Ovulation weiblicher Ratten ist, und man glaubt, daß das Peptid vollkommen wirksam bei einer Dosis von einem Milligramm ist.
Peptid Nr. 2 wird in ähnlicher Weise synthetisiert und gereinigt. Nach Abschluß der Aminosäureanalyse wird die optische Drehung mit Hilfe eines lichtelektrischen Polarimeters als £~oCjl>22 * -69,3° + 1 (c « 1, 50 %ige Essigsäure) ermittelt. Der in ähnlicher Weise in vitro durchgeführte Versuch zeigt, daß das Peptid einen ICRc0 von 0,011 hat. Beim invivo-Versuch mit einer Dosierung von 5 /Ug ergibt sich, daß 0 von 10 Ratten ovulieren, und daß bei einer Dosierung von 2»5 /Ug nur 2 von 10 Ratten ovulieren.
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Peptid Nr, 12 wird in ähnlicher Weise synthetisiert und gereinigt. Nach Beendigung der Aminosäureanalyse zeigt ein ähnlich in vitro durchgeführter Versuch, daß das Peptid einen ICR50 von 0,008 hat. Beim in-vivo-Versuch mit einer Dosierung von 2,5 /Ug ovolieren 0 von 10 Ratten. Peptid Nr, 8 wird in ähnlicher Form in vivo bei einer Dosierung von 5 /Ug getestet, und nur 2 von 10 Ratten ovulieren. Ein Versuch mit Peptid Nr, 2 ergibt, daß Null von 10 Ratten bei einer Dosis von 5 /Ug ovulieren und nur 3 von 10 Ratten bei einer Dosis von 2,5 /Ug ovulieren.
Die übrigen Peptide werden in ähnlicher Weise getestet und werden gleichfalls als wirksam für die Verhinderung der Ovulation weiblicher Ratten bei sehr geringen Dosierungen eingestuft.
Die erfindungsgemäßen Peptide werden häufig in Form von pharmazeutisch annehmbaren nicht-toxischen Salzen wie.Säureadditionssalzen, oder von Metallkomplexen, z, B. Zink, Barium, Calcium, Magnesium, Aluminium oder dergleichen (die als Additionssalze zum Zwecke der Erfindung angesehen werden) oder von Kombinationen dieser beiden verabreicht· Beispiele für derartige Säureadditionssalze sind HydrochlorId, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Nitrat, Oxalat, Fumarat, Gluconat, Tannat, Maleat, Acetat, Gitrat, Benzoat, Suecinat, Alginat, Pamoat, Malat, Ascorbat, Tartrat und dergleichen. Wenn der Wirkstoff In Tablettenform verabreicht werden soll, kann die Tablette ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel enthalten, das ein Bindemittel wie !Traganth, Maisstärke oder Gelatine, ein Abbaumittel wie Alginsäure und ein Schmiermittel wie Magnesiumstearat aufweist. Wenn die Verabreichung in flüssiger Form vorgesehen ist, kann ein Süßstoff und/oder ein Geschmacksstoff als Teil des phar-
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3.1V82
mazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittels verwendet werden, und es kann die intravenöse Verabreichung in isotonischer Kochsalzlösung, Phosphatpufferlösungen oder dergleichen vorgenommen werden·
Die erfindungsgemäßen Peptide sollten unter Anleitung eines Arztes verabreicht werden, und pharmazeutische Zusammensetzungen werden das Peptid gewöhnlich in Verbindung mit einem herkömmlichen pharmazeutisch annehmbaren Trägermittel enthalten. Normalerweise wird die Dosismenge etwa 0,1 bis etwa 100 Mikrogramm Peptid je Kilogramm Körpergewicht des Wirtes betragen» Gesamtbehandlung von Patienten mit diesen Peptiden wird im allgemeinen in der gleichen Weise wie die klinische Behandlung unter Verwendung anderer Antagonisten von GnRH ausgeführt.
Diese Peptide können Säugetieren intravenös, subkutan, intramuskulär, oral, intranasal oder intravaginal verabreicht werden, um die Fruchtbarkeitsinhibition und/oder Regelung zu erreichen. Wirksame Dosismengen werden je nach der Art der Verabreichung und der betreffenden zu behandelnden Säugetierspezies variieren. Ein Beispiel für eine typische Dosierungsform ist eine physiologische Kochsalzlösung, die das Peptid enthält und so verabreicht wird, daß eine im Bereich von etwa 0,1 bis 5 mg/kg Körpergewicht liegende Dosis erzielt wird· Die orale Verabreichung des Peptide kann entweder in fester Form oder in flüssiger Form erfolgen·
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsbeispiele beschrieben wurde, so dürfte doch klar
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3.1-U82
sein, daß Veränderungen und Modifikationen von Fachleuten auf diesem Gebiet ohne Abweichung vom Geltungsbereich der Erfindung, wie er in den angefügten Ansprüchen festgelegt ist, vorgenommen werden können· Beispielsweise können andere im Fachgebiet bekannte Substitutionen, die die Wirksamkeit der Peptide nicht wesentlich vermindern, in den erfindungsgemäßen Peptiden angewandt werden·
Bestimmte Merkmale der Erfindung werden in den folgenden Ansprüchen festgelegt»
Claims (10)
1 2
worin X eine alpha-Aminosäuresohutzgruppe ist; X eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe von Ser ist; Ir eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr ist; ΊΤ eine Schutzgruppe für die Stickstoffatome von Arg ist; und X unter GIy-O-CHg (Harzträgermittel), O-CH2-(Harzträgermittel), GIy-NH-(Harz-· trägermittel), GIy-NH2 und NHCH2CH3 ausgewählt ist; eine oder mehrere der Gruppen X bis Ir abgespalten werden und/ oder von jeglichem in X^ enthaltenen Harzträgermittel abgetrennt werden, und auf Wunsch ein resultierendes Peptid in ein nichttoxisches Salz davon umgewandelt wird·
1· Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel: X-R1-Rg-R-j-Ser-Tyr-R .-Rc-Arg-Pro-Rg
worin X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit 7 oder weniger Kohlenstoffatomen ist; R1 Dehydro Pro oder Dehydro D-Pro ist; R2 D-Phe, Cl-D-Phe, Dichlor-D-Phe, CF,-D-Phe, F-D-Phe,Difluor-D-Phe, AcNH-D-Phe, NOg-D-Phe, Dinitro» D-Phe, Br-D-Phe, Dibrom-D-Phe, CHyS-D-Phe, OGEL-D-Phe oder CH3-D-Phe ist; R3 D-Trp oder B-D-NAL ist; R4 B-D-NAL oder eine andere D-Isomer-Aminosäure ist; Re Leu oder N<£Me-Leu ist; und Rg GIy-NHg oder NHCH2CH3 ist, unter der Voraussetzung jedoch, daß entweder R, oder R/B-D-NAL ist und gegebenenfalls von deren nichttoxLsohsi Salzen, gekennzeichnet dadurch, daß in einer Zwischenverbindung der Formel:
X1-R1-R2-R3-Ser(X2)-Tyr(X3)-R4-R5-Arg(X4)-Pro-X5
2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß 2 4-Cl-D-Phe, Dichlor-D-Phe, 4-CJy-D-Phe, 4-F-D-Phe, Difluor-D-Phe, 4-AcNH-D-Phe, 4-NOg-D-Phe, Dinitro-D-Phe, 4-Br-D-Phe, Dibrom-D-Phe, 4-CH3S-D-PhO, 4-OCH3-D-PhO oder 4-CH3-D-PhO ist·
-2Q-
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AP C 12 N/239 196/3 - 20 - 60 658 18
3· Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß R1 Dehydro-Pro ist.
4· Verfahren nach Punkt 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß R3 B-D-NAL ist.
5. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß R3 B-D-2NAL ist.
6. Verfahren nach Punkt 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß R. B-D-2NAL ist.
7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß R4 B-D-2NAL ist.
8. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß R4 B-D-NAL ist.
9. Verfahren nach Punkt 5» gekennzeichnet dadurch, daß , R4 B-D-2NAL ist.
10. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß X5 GIy-NH (Harzträgermittel) ist·
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