DD247024A1

DD247024A1 - Verfahren zur selektion von effektoren

Info

Publication number: DD247024A1
Application number: DD28726886A
Authority: DD
Inventors: Claus-Ruediger Kramer; Sabine Witter
Original assignee: Bitterfeld Chemie
Priority date: 1986-02-24
Filing date: 1986-02-24
Publication date: 1987-06-24

Abstract

Die Erfindung kann in der Pflanzenschutzforschung zur Selektion von Effektoren mittels Wachstums- und Ionenumsatzanalysen heterotropher Zellsuspensionen angewendet werden. Erfindungsgemaess werden die optischen Eigenschaften und der Ionenumsatz des Stickstoffhaushaltes substanzbehandelter heterotroph angezogener Mikroalgensuspensionen genutzt, um mittels substanzinitiierter Variation der optischen Eigenschaften und der Ionenumsaetze solcher Suspensionen die Effektoren in einem Arbeitsgang nach ihrer Wirkspezifik in primaere und sekundaere, die Atmung tangierende Effektoren bzw. Proteinsyntheseeffektoren sowie in atmungs- bzw. proteinsyntheseneutrale Effektoren differenzieren zu koennen.

Description

Hierzu 6 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion von Effektoren mittels Wachstums- und lonenumsatzanalysen heterotropher Zellsuspensionen, das beispielsweise in der Pflanzenschutzmittelforschung angewendet werden kann.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Der Einfluß chemischer Substanzen auf biologische Prozesse kann auf vielfältige Weise geprüft werden. Gemäß DD-PS 94234 lassen sich aus einer Stichprobe von Chemikalien diejenigen selektieren, die den fundamentalen Prozeß des autotrophen Zellwachstums, die Photosynthese, unmittelbar oder mittelbar beeinträchtigen oder fördern.

Als Indikatoren lassen sich auch Zellsuspensionen heterotroph kultivierter einzelliger Grünalgen nutzen. So lassen sich nach der DD-PS 211126 auf der Grundlage heterotropher Suspensionskulturen in einem Arbeitsgang primäre Atmungseffektoren von nicht primär die Atmung tangierenden Effektoren, die aber biologisch wirksam sind, selektieren.

Weitere Varianten (DD-PS 200472, DD-PS 212985, DD-PS 213949, DD-PS 213950, DD-PS 214146, DD-PS 216253 und DD-PS 216254) die auf Auswertungsmodi basieren, die die entwicklungsbedingten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften und/oder der photosynthetischen bzw. respiratorischen Gaswechselumsätze substanzbehandelter autotropher bzw. heterotropher Zellsuspensionen nutzen, ermöglichen Selektionen von vorrangigen Photosynthese- oder Atmungshemmern, von nicht primären Photosynthese-oder Atmungshemmern, die Aufdeckung von Permeationseffekten sowie die Selektion von Hemmern der Licht und der Dunkelreaktion. Diese Selektionsverfahren sind darüber hinaus in der Lage, über die Analyse dosisabhängiger Wirkzeitkurven die Effektoren nach ihrer Wirkspezifik näher zu charakterisieren. Eine ähnliche Differenzierung und Selektion der Wirkstoffe hinsichtlich ihrer spezifischen Beeinflussung des Stickstoffhaushalts bzw. der Proteinsynthese solcher Zeil- oder Organismensuspensionen, insbesondere unter heterotrophen Anzuchtbedingungen, bereitet bisher große Schwierigkeiten. So werden neben verschiedenen Verfahren zur Einweißbestimmung wie teilautomatisierte chromatographische Verfahren vor allem variierte Methoden der Stickstoffbestimmung nach der Kjeldahltechnik genutzt. Die Nachteile dieser Verfahren bestehen hauptsächlich im erheblichen Arbeitsaufwand. So erfordert das Kjeldahlverfahren die drei Arbeitsabschnitte Veraschung, Destillation und Titration. Die durch solche Verfahren determjnierten objektiven und subjektiven Fehlerquellen erschweren insgesamt eine Interpretation der Analysedaten, die nur in kleinen Bereichen variieren. Da für die Wirkstoffcharakterisierung auf der Grundlage komplexer Analysen der Lebensprozesse vergleichende Betrachtungen der Auswertungsergebnisse zunehmend an Bedeutung gewinnen, ergibt sich der Wunsch nach einem Verfahren, das auf heterotroph kultivierten Mikroalgensuspensionen beruht und dessen Meßtechnik und Auswertungsmodus neben der Charakterisierung der Effektoren hinsichtlich der Beeinflussung der optischen Eigenschaften von Zellsuspensionen auch eine Charakterisierung der Beeinflussung des Stickstoffhaushaltes gestattet und damit eine Differenzierung in primäre und sekundäre Effektoren der Atmung bzw. des Stickstoffhaushaltes in einem Arbeitsgang erlaubt.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, für Tests mit heterotrophen Suspensionskuituren einzelliger Grünalgen ein Verfahren vorzuschlagen, das in einem Arbeitsgang eine Selektion in primäre Atmungseffektoren, Effektoren, die primär den Stickstoffhaushalt tangieren bzw. Proteinsyntheseeffektoren und sekundäre Atmungs- bzw. Stickstoffhaushaltseffektoren ermöglicht und die Wirkspezifik solcher Effektoren hinsichtlich der Beeinflussung der optischen Eigenschaften und der lonenumsätze des Stickstoffhaushaltes der Suspensionskulturen genauer charakterisiert.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mittels eines speziellen Meß-und Auswertungsverfahrens Effektoren in einem geschlossenen Arbeitsgang als primäre Atmungseffektoren oder als primäre Effektoren des Stickstoffhaushaltes wie Proteinsynthese-, und andere Effektoren oder sekundäre Effektoren der Atmung oder des Stickstoffhaushaltes zu charakterisieren und zu differenzieren.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die optischen Eigenschaften und der lonenumsätz des Stickstoffhaushaltes substarizbehandelter heterotroph angezogener Mikroalgensuspensionen genutzt werden, um mittels substanzinitiierter Variation der optischen Eigenschaften und der lonenumsätze solcher Suspensionen die Effektoren in einem Arbeitsgang nach ihrer Wirkspezifik in primäre und sekundäre, die Atmung tangierende Effektoren bzw. Proteinsyntheseeffektoren sowie in atmungs- bzw. proteinsyntheseneutrale Effektoren differenzieren zu können. Als heterotrophe Zellsuspensionen können alle suspendierbaren heterotroph anziehbaren einzelligen Algen verwendet werden. Die optischen eigenschaften der Algensuspensionen werden mittels Spektralkolorimetrie, Spektralphotometrie oder Nephelometrie bei einem oder verschiedenen Wellenlängenbereichen oder ganzen Spektralbereichen im infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Spektralbereich analysiert.

Der lonenumsätz der Algensuspensionen wird mittels pH-Elektroden, nitratsensitiver Elektroden oder anderer ionensensitiver Elektroden, polarographischer Methoden oder anderer elektrochemischer Verfahren, spektralanalytischer Methoden oder durch Kombination mehrerer dieser Methoden analysiert.

Die optischen Eigenschaften und die lonenumsätze der heterotrophen Algensuspensionen werden kontinuierlich in einem Arbeitsgang oder in definierter Zeitfolge parallel oder simultan anlysiert.

Ausführungsbeispiel

Frisch geschlüpfte Aplanosporen snychroner Kulturen einzelliger Grünalgen der Species Chlorella vulgaris var. vulgaris, Stamm BÖHM und BORNS 1972/1, werden in eine anorganische Nährlösung mit Fe-EDTA-Komplex und Spurenstoffen so überführt, daß jeder Kubikzentimeter der Suspension etwa sechs Millionen Algenzellen enthält. 1 Liter der Kultur-Nährlösung N setzt sich dabei aus den drei Teilnährlösungen N₁, N₂ und N₃ zusammen:

1 000cm³ N = 998cm³ Ν·, + 1 cm³ N₂ + 1 cm³ N₃

Die Nährlösungen N₁, N₂ und N₃ enthalten folgende Substanzen:

Nährlösung N₁

Für die Nährlösung N₁ werden zunächst die Stammlösungen 1 bis 4 durch Auffüllen der genannten Substanzmengen mit Aqua dest. hergestellt:

Stammlösung 1: 10OgKNO₃ZIOOOCm³ .

Stammlösung 2: 25g CaCI₂ · 6H₂O/1 000cm³

Stammlösung 3: 250g MgSO₄ · 7H₂O/1 000cm³

Stammlösung 4: 160g KH₂PO₄/1 000cm³.

Diese Stammlösungen sind zu sterilisieren (Feuchtsterilisation) und kühl zu lagern.

Aus je 5cm³ der Stammlösung 1,0,5cm³ der Stammlösung 2,1cm³ der Stammlösung 3 und 5cm³ der Stammlösung 4 werden durch Auffüllen mit destilliertem Wasser entweder 1 000cm³ bzw. bei Beachtung der Verhältnisse eine beliebige Menge der Nährlösung N₁ hergestellt.

,Nährlösung N₂ · -

Die Nährlösung N₂ enthält in 1000cm³ Lösung 61 mg H₃BO₃.169mg MnSO₄ · H₂O, 287mg ZnSO₄ · 7H₂O, 2,5mg CuSO₄ · 5H₂O und 12,4mg (NH₄I₂MoO₄.

Nährlösung N₃

Zur Herstellung der Nährlösung N₃ werden 6,9g FeSO₄ · 7H₂O und 9,3 g Na-EDTA in destilliertem Wasser gelöst und auf 1 000cm³ mit Aqua dest. aufgefüllt.

Zu derfrisch hergestellten Algensuspension werden dann 0,1 Ma.-% Glukose als organische Kohlenstoffquelle und 20mg/l Chloramphenicol zugegeben.

Je 80cm³ der so hergestellten Suspension werden in je eine Kulturhöhe eingebracht, mit je 1 cm³ verschieden konzentrierter Lösung der zu prüfenden Substanzen A, B und C beimpft oder als nur mit dem Lösungsmittel behandelte Kontrollen bei 37°C im Dunkeln mit gereinigter Luft begast, so daß alle erforderlichen Voraussetzungen für das heterotrophe Wachstum gegeben sind. ·

Während die in die Nährlösung suspendierten Zellen in den unbehandelten Vergleichskulturen normal wachsen und sich entwickeln, werden Wachstum und lonenumsätz in den mit Chemikalien versetzten Proben mehr oder weniger beeinflußt, wenn

verschiedene Substanzkonzentrationen den Atmungsprozeß bzw. den Stickstoffhaushalt mehr oder weniger stören. In definierter Zeitfolge werden von den Vergleichskulturen und den mit den Substanzen A, B und C behandelten Proben die optischen Eigenschaften bei 680 und 750 nm als Wachstumsparameter sowie der pH-Wert als Maß für den Stickstoffhaushalt gemessen. Die Ergebnisse der Analysen sind den Fig. 1 bis 6 zu entnehmen. Fig. 1, Α_Ί enthält die dekadischen Logrithmen der Extinktionsmessungen bei 680 nm für die unbehandelte Kontrolle Kund die mit abgestuft zunehmenden Konzentrationen der Substanz A versetzten Proben 1 bis 6, die von der nullten Stunde bis etwa zur fünfzehnten Stunde rund al Ie 45 Minuten gemessen wurden, die Fig. 1,A₅. die entsprechenden Ergebnisse solcher Extinktionsmessungen bei 750 nm. Ein Vergleich der auf diese Weise parallel, also in einem Arbeitsgang gewonnen Wirkbilder zeigt trotz unterschiedlicher Spektralbereiche weitgehende und prinzipielle Übereinstimmung der dosisabhängigen Wirkungsverläufe.

Ein Vergleich der substanz! η itiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften bei 680 und 750 η m in Form einer Auftrag u ng der Logarithmen dei^Extinktionen bei 680 und 750 nm zueinander, Fig. 2, A₄ macht aber deutlich, daß substanzspezifisch und dosierabhängig die optischen Eigenschaften bei 750nm stärker tangiert werden als bei 680nm. Daraus kann geschlußfolgert werden, daß dieser Effektor erst sekundär die Photosynthese beeinflußt.

Die Analysenergebnisse für die pH-Messungen sind der Fig. 1,A₃ zu entnehmen. Einen Vergleich der Beeinflussungen des lonenumsatzesund der optischen Eigenschaften durch Substanz A zeigen die entsprechenden Wirkbilder Fig.2, A₅ und A₆. Aus beiden Figuren wird deutlich; daß nur geringe Effekte auftreten.

Während die geringen Dosen 1 bis 3 zu einer etwas stärkeren Hemmung des lonenumsatzes im Vergleich zur Beeinflussung der optischen Eigenschaften führen, verursacht die Dosis 4 eine stärkere Beeinflussung der optischen Eigenschaften im Vergleich zum lonenumsatz. Die Dosen 5 und 6 determinieren eine Zerstörung der Zellen. Auf diesen Wirkbildern ist zu schlußfolgern, daß Substanz A ein relativ unspezifisch toxisch wirkender Atmungseffektor ist. Die in Fig. 2, A₄ gezeigte Wirkspezifik sollte aber Anlaß sein, Substanz A auch in einem Autotrophtest zu untersuchen, um weitere Informationen zur Wirkspezifik von Substanz A zu erhalten.

Von der Substanz B, über deren Analysenergebnisse und Auswertungen Fig.3 und 4 informieren, wurde der Einfluß von 7 abgestuft zunehmenden Konzentrationen 1 bis 7 auf Wachstum und Stickstoffhaushalt von Chlorella-Suspensionen untersucht. ' .

Fig. 3, B₁ enthält eine Auftragung der Logarithmen der Extinktionen bei 630 run in Abhängigkeit von der Wachstums- bzw. Einwirkzeit und Flg. 3, B2 eine entsprechende Korrelation der Extinktionen bei 750 nm. Ein Vergleich beider Wirkbilder zeigt weitgehende Übereinstim.mung. Dies wird besonders deutlich bei einer Zusammenfassung beider Wirkbilder in Form einer Auftragung der Logarithmen der Extinktionen bei 680 rim und 750 nm gegeneinander in Fig. 4, B₅. Aus diesem Vergleich läßt sich zunächst nur der Schluß ziehen, daß Substanz B auf jeden Fall biochemisch aktiv ist, wobei sich ihre Aktivität als eine unspezifische, die Atmungsprozesse tangierende toxische Wirkung darstellt.

Die Analysenergebnisse für die pH-Messungen zeigen die Fig. 3, B₃ und B₄. Während die unbehandelte Kontrolle Keinen Anfangs-pH-Wert von 5,67 hat, der nach siebeneinhalb Stunden den Wert 6,13 erreicht, variieren die Anfangs-pH-Werte der mit der Substanz B behandelten Suspensionen konzentrationsabhängig von 5,2 für Probe 1 bis 5,63 für Probe 7. Zur Vereinfachung der Auswertung wurde deshalb dieses Wirkbild in Form von Fig.3, B₄ normiert, indem die pH-Zeit-Kurven für die Dosen 1 bis 7 parallel zur Zeitachse so verschoben wurden, daß die Anfangs-pH-Werte für alle Dosen mit dem Kontrollwert 5,67 übereinstimmten. Das so erhaltene, normierte Wirkbild Fig. 3, B₄ ist qualitativ von den Wirkbildern Fig. 3, B₁ und Fig. 3, B₂ verschieden.

Eine Auftragung der Logarithmen der Extinktionen bei 750nm zu den entsprechenden normierten pH-Werten zeigt das Wirkbild Fig.4, B₆. Auffällig in diesem Wirkbild im Vergleich zu Fig.2, A₅ bzw. A₆ ist, daß Substanz B dosisabhängig den lonenumsatz zunehmend in einem primären Wirkmechanismus hemmt. Die starken Dosen 5, 6 und 7 führen zu einer Protonenemission, deshalb verkleinert sich der pH-Wert dieser Suspensionen. In einem sekundären Metabolismus kommt es danach teilweise zu Reparatureffekten. Die IgE/pH-Graphen der Dosen 1 bis 4 erreichen ähnliche Anstiege wie der entsprechende Graph der Kontrolle. Allerdings ist eine dosisabhängige parallele Verschiebung zu höheren lgE₇₅₀-Werten zu beobachten. Aus dem Wirkbild Fig. 4, B₆ ist im Zusammenhang mit dem Wirkbild Fig.4, B₅ zu schlußfolgern, daß Substanz B primär den Stickstoff haushalt und damitdie Proteinsynthese beeinflußt. Die in Fig. 4, B₅ angezeigten unspezifischen toxischen Wirkungen sind sekundäre Effekte. Über die Analysenergebnisse der Beeinflussung des Wachstums und des Stickstoffhaushaltes der Chlorella-Suspensionen durch Substanz C informieren die Fig. 5, C, bis C₄ und Fig. 6, C₅ und C₆. Auch hier zeigen die Fig. 5, C₁, C₂ und C₃ die zeitabhängigen Beeinflussungen der optischen Eigenschaften bei 680 nm, Fig. 5, Ci, und bei 750 nm, Fig. 5, C₂, sowie des pH-Wertes, Fig. 5, C₃, von der nullten bis zur fünfzehnten Stunde. Eine Auftragung der Lagarithmen der Extinktionen bei 680 nm und 750 nm gegeneinander, Fig. 6, C₅, zeigt ähnlicher Weise wie Fig. 4, B₅ für die Substanz B, daß Substanz C die optischen Eigenschaften heterotropher Algensuspensionen unspezifisch beeinflußt. Die spezifische Beeinflussung des Stickstoffhaushaltes der Algen durch Substanz C zeigen die Fig. 5, C₃ bzw. in normierter Form C₄.

Obwohl Substanz C dosisabhängig aufgrund ihrer Basizität die Anfangs-pH-Werte der Suspensionen erhöht, zeigt sie eine vergleichbare Wirkspezifik wie Substanz B, die saure Eigenschaften aufwies. Ein Vergleich der Fig. 6, C₆ mit Fig. 4, B₆ bestätigt, daß Substanz C auch als ein primärer Hemmer des Stickstoffhaushaltes einzustufen ist.

Vergleicht man die Aussagen der Figuren 1 bis 6für die Substanzen A, B und C miteinander, so wird deutlich, daß die Auswertung solcher Tests bei verschiedenen Wellenlängen, für die die Extinktionsmessungen bei 680 bis 750 nm lediglich eine mögliche Kombination von vielen darstellen, und gleichzeitiger pH-Messungen, wiederum nur eine von mehreren lonenumsatzmessungen darstellen, in einem Arbeitsgang auch für heterotrophe Kulturen zu sehr differenzierten Aussagen hinsichtlich der Wirkung der drei Substanzen führen kann. Besonders deutlich zeigen sich diesbezüglich Unterschiede bei Korrelationen der dekadischen Logarithmen der Extinktionen verschiedener Wellenlängen wie 680 und 750 nm zueinander sowie Auftragungen der dekadischen Logarithmen der Extinktionen in Abhängigkeit von den entsprechenden pH-Werten. Durch Vergleich entsprechender Wirkbilder von neu untersuchten Substanzen, über deren herbizide Wirksamkeit bisher nicht oder wenig bekannt ist, mit einer Wirkbildkartei oder mit Hilfe der elektronischen Datenverarbeitung der Wirkdaten von gut untersuchten, auch kommerziell vertrie'benen Herbiziden oder Standardherbiziden erhält man konkrete Hinweise über ähnliche Wirkspezifika, Wirkmechanismus, Selektivität und Anwendungsmöglichkeiten solcher Effektoren.

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Selektion von Effektoren mittels Wachstums- und lonenumsatzanalysen heterotropher Zellsuspensionen, gekennzeichnet dadurch, daß die optischen Eigenschaften und der lonenumsatz des Stickstoffhaushaltes substanzbehandelter heterotroph angezogener Mikroalgensuspensionen genutzt werden, um mittels substanzinitiierter Variation der optischen Eigenschaften und der lonenumsätze solcher Suspensionen die Effektoren in einem Arbeitsgang nach ihrer Wirkspezifik in primäre und sekundäre, die Atmung tangierende Effektoren bzw. Proteinsyntheseeffektoren sowie in atmungs- bzw. proteinsyntheseneutrale Effektoren differenzieren zu können.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als heterotrophe Zellsuspensionen alle suspendierbaren ' heterotroph anziehbaren einzelligen Algen verwendet werden können.
3. Verfahren gemäß Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die optischen Eigenschaften der Algensuspensionen mittels Spektralkolorimetrie, Spektralphotometrie oder Nephelometrie bei ein bzw. zwei bis zu η verschiedenen Wellenlängenbereichen oder ganzen Spektralbereichen im infraroten oder ultravioletten Spektralbereich analysiert werden.
4. Verfahren gemäß Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß der lonenumsatz der Al'gensuspensionen mittels pH-Elektroden, nitratsensitiver Elektroden oder anderer ionensensitiver Elektroden, polarographischer Methoden oder anderer elektrochemischer Verfahren, spektralanalytischer Methoden oder durch Kombination mehrerer dieser Methoden analysiert wird.
5. Verfahren gemäß Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß die optischen Eigenschaften und die lonenumsätze der heterotrophen Algensuspensionen in einem Arbeitsgang kontinuierlich oder in definierter Zeitfolge parallel oder simultan analysiert werden.