DD259208A1

DD259208A1 - Anordnung zur signalvorverarbeitung fuer laserentfernungsmesssysteme

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Publication number: DD259208A1
Authority: DD
Publication date: 1988-08-17

Abstract

Das "Verfahren zur Bestimmung und Charakterisierung von Molekuelfragmentwirkungen" dient der Effektivierung der Pflanzenschutzmittelforschung. Es verfolgt das Ziel, ueber eine minimierte Testhierarchie und minimierte Auswertungsverfahren der Analyseergebnisse die teils substanzinitiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften, der Ionenumsaetze und gegebenenfalls der Gaswechselumsaetze einzelliger Algensuspensionen in moeglichst einem Arbeitsgang zu analysieren und durch vergleichende Betrachtungen der Wirkquantitaeten entsprechender verwandter Molekuelstrukturen komplexe und/oder spezifische Wirkquantitaeten von Molekuelfragmenten, die nach einem Naeherungsmodell additiv sind, zu bestimmen. Durch vergleichende Betrachtungen relativer Wirkbilder von Wirkstoffen aehnlicher Struktur, in denen die Wachstums- und/oder Hemmparameter untereinander als Wirkeffekt-Wirkeffekt-Kurven in Abhaengigkeit von der Dosis betrachtet werden sowie gegebenenfalls weitere Parameter sind typische Aussagen zur Hauptwirkrichtung und zur Wirkspezifik der betrachteten Molekuelfragmente hinsichtlich der Beeinflussung der Photosynthese, der Atmung, des Wachstums oder des Stickstoffhaushaltes zugaenglich. Bei Kenntnis der relevanten additiven Wirkquantitaeten, der Hauptwirkrichtungen von Molekuelfragmenten und den entsprechenden quantitativen Struktur-Wirkungs-Beziehungs-Modellen, koennen hochwirksame und selektiv wirkende Strukturen fuer den Pflanzenschutz abgeleitet werden.

Description

Hierzu 8 Seiten Zeichnungen

Anwendung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung und Charakterisierung von SpezialWirkungen der Moiekülfragmente und von'intramolekular determinierten Kombinationswirkungen biologisch aktiver Stoffe mittels Wachstums-, gegebenenfalls Ionenumsatz- und/oder Gaswechselumsatzanalysen substanzbehandelter Algensuspensionen und einem speziellen Auswertungsverfahren der Analyseergebnisse, das beispielsweise in der Pflanzenschutzmittelforschung angewendet werden kann.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß der komplexe Einfluß chemischer Substanzen auf biologische Prozesse auf vielfältige Weise geprüft werden kann. Zunehmend werden hierfür als Indikatormodell Mikroalgensuspensionen genutzt, die sich unter standardisierten Bedingungen autotroph oder heterotroph, synchron oder asynchron kultivieren lassen. Nach den Verfahren DD PS 94234 und DD PS 227446 lassen sich mittels einzelliger Algensuspensionen diejenigen Chemikalien aus einer Stichprobe selektieren, die den fundamentalen Prozeß des autotrophen Zellwachstums unmittelbar oder mittelbar beeinträchtigen.

Durch parallele Analyse der substanzinitiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften bei zwei oder mehreren Wellenlängen und/oder der photosynthetischen bzw. respiratorischen Gaswechsel Umsätze und/oder der Ionen Umsätze solcher Algensuspensionen ist man über spezifische Auswertungsverfahren in der Lage, die Effektoren hinsichtlich ihrer Hauptwirkrichtung beispielsweise als Photosynthese- oder als Stickstoffhaushaltseffektor näher zu charakterisieren. (DD PS 200472/1, DD PS 211 1-26, DD PS 212985, DD PS 213949, DD PS 213950, DD PS 214146, DD PS 216253, DD PS 216254, DD PS 220047, DD PS 237001).

Geht man gemäß den Verfahren DD PS 226297 bzw. DD PS 226903 von nährstofffreien Suspensionskulturen aus, so ist eine wachstumsunabhängige Beurteilung derToxizität von Effektoren möglich. Gleichzeitig können die Wirkstoffe durch Vergleich der Wirkquantitäten für die substanzinitiierten Beeinträchtigungen bzw. der Wachstumsbeeinflussungen der entsprechenden Suspensionskulturen nach diesen Verfahren als reine oder partielle Wachstumseffektoren oder als rein toxisch wirksame Effektoren charakterisiert werden. Alle diese und andere Prüf- und Selektionsverfahren sind an das komplexe Wachstum der Algen- bzw. Zellsuspensionen gebunden, und die erhaltenen Hemmdaten resultieren aus der Gesamtwirkung der getesteten Substanzen. Für die Wirkstofforschung, insbesondere für die gezielte Synthese von Effektoren mit vorhersagbaren Eigenschaften sind Aussagen zur Wirkrichtung, zur Wirkquantität und zur Wirkspezifik einzelner Molekülteile bzw. von Kombinationswirkungen, die durch bestimmte Molekülfragmente ausgelöst werden, von Interesse. Daraus ergibt sich der Wunsch nach einem Screeningverfahren, das ebenfalls auf Mikroalgensuspensionen beruht aber durch Nutzung spezifischer Auswertungsmethoden der Analyseergebnisse eine Beurteilung der Wirkquantitäten von Molekülfragmenten und möglicher intramolekular determinierter Kombinationswirkungen sowie Aussagen zur spezifischen Wirkcharakteristik solcher Wirkungen ermöglicht.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, für Tests mit Mikroalgensuspensionen ein Analyseverfahren vorzuschlagen, das die substanzinitiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften, der lonenumsätze und gegebenenfalls der Gaswechselumsätze zu analysieren ermöglicht und über einen Auswertungsmodus der Analyseergebnisse eine differenzierte Einschätzung der Wirkquantitäten einzelner Molekülfragmente und möglicher intramolekular determinierter Kombinationswirkungen sowie qualitative Aussagen zur Wirkrichtung und Wirkspezifik hinsichtlich der am genutzten Testmodell manifestierten Hauptwirkungen solcher Kombinationswirkungen gestattet.

Darlegung des Wesens der Erfindung · .

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mittels der Analyse der Beeinflussungen der optischen Eigenschaften, der lonenumsätze und gegebenenfalls der Gaswechsel Umsätze einzelliger Algensuspensionen in möglichst einem Arbeitsgang und spezieller Auswertungsverfahren auf der Grundlage von Vergleichen dieser Analysenergebnisse gegebenenfalls unter Einbeziehung von Literaturdaten die Wirkquantitäten von Molekülfragmenten und mögliche intramolekular determinierte Kombinationswirkungen zwischen solchen Molekülfragmenten bei Effektoren quantitativ und vergleichbar zu bestimmen und die spezifischen sich am Testmodell manifestierenden Hauptwirkungen näher zu charakterisieren. Durch Vergleich meist . komplexer Wirkquantitäten von Molekülfragmenten verschiedener Wirkstoffe ist man in der Lage, die spezifischen Einflüsse einzelner Molekülfragmente auf spezifische Stoffwechselprozesse wie die Photosynthese, die Atmung, den Stickstoff haushalt usw. umfassend zu charakterisieren, so daß bei Kenntnis der durch Molekülfragmente determinierten Wirkanteile sowie der durch die Molekülfragmente ausgelösten spezifischen Beeinflussungen die Möglichkeit besteht, Wirkstoffe mit vorhersagbaren Wirkeigenschaften gezielt zu synthetisieren. .

Beim „Verfahren zur Sestimmungund Charakterisierung von Molekülfragmentwirkungen bei Phytoeffektoren" werden definierte Mengen chemischer Verbindungen parallel oder simultan mit einzelligen Algensuspensionen, die in einer geeigneten Nährlösung autotroph und/oderheterotroph kultiviert werden, in unmittelbaren Kontakt gebracht und diese Proben parallel mit unbehandelten Vergleichskulturen bei einheitlicher Temperatur zwischen 20°C und 38°C im Licht bzw. im Dunkeln belüftet, so daß sie auf der Grundlage der sich vollziehenden Photosynthese- bzw. Atmungsprozesse wachsen und sich entwickeln. Zu festgelegten Zeitpunkten werden dann von Proben und von Vergleichskulturen oder von Anteilen von beiden parallel oder in definierter Folge die optischen Eigenschaften mittels spektralanalytischer Verfahren bei einem oder mehreren Wellenlängenbereichen insbesondere des sichtbaren Spektrums, der Stickstoffionenumsatz mittels pH-Elektroden, nitratsensitiver Elektroden bzw. anderen stickstoffionensensitiven Elektroden oder anderen geeigneten Meßverfahren und gegebenenfalls der photosynthetische bzw. respiratorische Sauerstoffumsatz mittels Paramaghet-Gasanalysatoren, sauerstoffsensitiver Elektroden oder anderer geeigneter Methoden und/oder der photosynthetische bzw. respiratorische Kohlendioxidumsatz mittels Irifrarot-Gasanaiysatoren oder anderer geeigneter Methoden untersucht und die dabei gewonnenen Analysenergebnisse vergleichenden Betrachtungen unterzogen, wobei bei Bedarf Literaturdaten in die Auswertungen mit einbezogen werden können.

Ausführungsbeispiele

I.Beispiel

Zirka 80 z.T. in Tab. 1 zusammengefaßte, kommerziell verfügbare mono- und disubstituierte Benzene gemäß den Serien Nr. 1 bis 11 in Tab. 1 wurden in einem standardisierten Wachstumstest gemäß BÖHM u. Mit. (DD PS 94234), welcher über die Beeinflussung komplexer Wachstums- und Entwicklungsparameter der thermophilen chloroccalen Alge Chlorella vulgaris BEIJERNICK 1890 var. vulgaris FOTT et NOVAKOVA 1969 Stamm: BÖHM/BORNS 1972/1 eine effektive Charakterisierung biochemisch wirksamer Verbindungen ermöglicht, untersucht.

Anzucht und Entwicklungssynchronisation des Testorganismus wurden in einem odifizierten Nährmedium nach KUHL und LORENZEN (KUHL, A. und LORENZEN, H.: In Methods in Cell Physiology", Vol. 1 [PRESCOTT, D. Ed.], Academic Press. New York 1964, S. 159 bis 187) mit einer von BÖHM vorgeschlagenen, weitgehend automatisierten Apparatur durchgeführt (BÖHM, H.:

Wiss. Hefte d. Pad. Inst. Köthen 2 [1973] 217-220).

Das Prinzip des gewählten autotrophen Wachstumstests besteht in der 6stündigen parallelen Konfrontation synchroner Chlorella-Flüssigkeitskulturen konstanter Zelldichte (etwa 7,5 · 10⁶ Autosporen/ml) mit Konzentrationsreihen des jeweiligen in wäßriger Lösung applizierten Wirkstoffs.

Die Kultivierung der Testkulturen erfolgte in einem spezifisch entwickelten Licht-Karussell-Thermostaten, der für 30 Kultivierungsplätze (Reagenzgläser 30/200) eine gleichmäßige Belichtungsintensität von 28 Watt/m², Temperierung von 36,5"C und Begasung von 101 Luft mit 2Vol.-%CO₂/h garantiert (BORNS, E..-Diss. [A] Pad. Hochschule „K: Liebknecht" Potsdam

Die resultierende biologische.Wirkung W in Form prozentualer Wachstumshemmungen ist über direkte Extinktionsmessungen bei 680nm oder750nm bzw. über pH-Messungen entsprechend

w,ιοο·4^-loo- (D

E_K - E₀ pH pH

zu berechnen, wobei E₀ (pH₀) die standardisierte Anfangsextinktion (Anfangs-pH-Wert), E_w (pH_w) und E_K (pH_K) die Extinktionen bzw. pH-Werte wirkstoffbehandeiter bzw. parallel belichteter Kontrollsuspensionen nach 6h Testdauer darstellen. Aus der Dosisabhängigkeit der relativen prozentualen Wachstumshemmungen sind die als Aktivitätsparameter definierten negativen dekadischen Logarithmen der molaren Effektorkonzentrationen, welche eine 50%ige Hemmung des autotrophen Algenwachstums bewirken (pc₅₀), durch grafische Interpolation zugänglich.

Auftragungen der Logarithmen der isoaktiven Konzentrationen peso in Abhängigkeit hydrophober ng-Konstanten nach HANSCH u. Mit. (HANSCH, C, LEO, A., UNGER, S. H., KIM, K. H„ NIKAITANI, D. und LIEN, E. J.: J. Med. Chem. 16 [1973] 1207-1216) zeigen, wie es am Beispiel für die monosubstituierten Benzene in Fig. 1 illustriert wird, immer eine etwa lineare Zunahme der biologischen Aktivität in Abhängigkeit von n_B-Werten nur für die „unspezifischen" Substituenten (Br, CH₃, Cl, H, I, OCH₃). Substituenten mit negativen n_B-Parametern (z. B. NO₂, CN, CHO, NH₂, OH) verursachen in den meisten Fällen eine Wirkungssteigerung, Fig. 1. Der Betrag dieser Aktivitätserhöhung ist in den Serien, die auf „unspezifischen" Grundkörpern. (Leitverbindungen) gemäß den Serien laut Tab. 1 basieren, fast identisch, wie beispielsweise ein Vergleich der pc₅₀-Daten der Chlorbenzene und der Brombenzene gemäß Gl.(2) bzw. in Fig.2 dokumentiert.

PC₅₀(Br) = 0,8856 PC₆₀(CI) + 0,5814 (2)

η = 18 r = 0,905 s = 0,3223

Die prinzipiell adäquaten Resultate für die unterschiedlichen Serien deuten auf eine Verallgemeinerungsfähigkeit der Ergebnisse hin und erlauben gleichzeitig die Ableitung eines praktikablen Modells zur Bestimmung von Wirkanteilen von Molekülfragmenten bzw. von Wirkanteilen, die aus Kombinationswirkungen von Molekülteilen resultieren.

pc₅₀ = än_B + 5 (3)

Tabelle 1: Korrelationsdaten der linearen Bereiche pc₅₀ = f(n_B) für verschiedene Benzenserien RiC₆H₄R₂ gemäß Gl. (3) und Hydrophobizitätsparameter lgP° für die Verteilungder unsubstituierten Stammverbindungen im System Octanol/ Wasser pc₅₀ = än_B + b (3)

Nr. .	R,"	R₂ ²¹	a	b	n³¹	_r3)	s³»	lgP°
1.	Br	Br, Bu', CH₃, Cl, H, I, OCH₃	0,70	3,33	11	0,960	0,104	2,82
2.	CH₃	Br, Cl, H, OCH₃	1,06	2,72	6	0,995	0,105	2,52
3.	Cl	Br, CH₃, Cl, H, I	1,00	2,92	10	0,969	0,079	2,67
4.	H	Br, CH₃, Cl, H, I, OCH₃	• 1,31	2,04	6	0,998	0,064	1,96
5.	I	Br, Cl, H, OCH₃	0,70	3,56	4	0,926	0,259	3,08
6.	OCH₃	Br, CH₃, H	1,21	2,03	3	0,999	0,050	1,94
7.	OH	OCH₃, H, F, CH₃, Cl, Br, I	1,34	2,43	10	0,952	0,118	1,29
8.	CN	Br, Cl, CH₃, H	1,14	2,48	8	0,867	0,196	1,39
9.	NO₂	H, OC₂H₅, Cl, Br, OCH₃, CH₃,	0,57	3,56	11	0,751	0,260	1,68
		OC₃H₇, OC₄H₉
10.	CHO	OCH₃, Cl, Br, H	1,02	2,76	5	0,934	0,192	1,31
11.	NH₂	F, Cl, Br, I, CH₃, H, OCH₃	1,29	2,46	8	0,978	0,134	0,73
12.	NHCONH₂		1,04	2,252	10⁴⁾	0,992		0,66
13.	NHCSNH₂		0,770	2,60	11"»	0,945		0,56
14.	NHCSMe=NH		1,001	2,70	13⁴¹	0,974		1,12

1) R₁ = fixer Substituent

2) R₂ = variabler Substituent

3) η = Stichprobenumfang, r = Korrelationskoeffizient, s = Standardabweichung

4) nur meta- und para-Derivate

Trägt man die absoluten Gliederb, die durch einfache lineare Korreiationsanalyse gemäß Gl. (3) für die linearen Bereiche, .pc₅₀ = f(n_B), entsprechend dem illustrierten Beispiel in Fig. 1 erhalten wurden und hier den theoretischen pc°₅₀-Werten der unsubstituierten Derivate der einzelnen Serien nach Tab. 1 entsprechen, gegen die entsprechenden n_B-Daten der fixen Substituenten Ri bzw. den Verteilungsparametern IgP der entsprechenden Stammverbindung auf, so erhält man eine ausgezeichnete Gerade G. (4)-für die „Nonhydrogen Bondos" (siehe auch Fig. 3).

b(pc₅₀°) = 1,37π_Β + 2,03 . (4)

η = 6 r = 0,993 s = 0,084

Durch Zusammenfassen der GIn. (3) und (4) erhält man fir die betrachteten Benzenderivate, die aus den „unspezifischen" Molekülfragmenten I.Ordnung (Br, CH₃, Cl, H, I, OCH₃ und dem Phenylring als Grundgerüst) zusammengesetzt sind, eine einfache mit Sicherheit hydrophob-hydrophil determinierte quantitative Struktur-Wirkungs-Beziehung gemäß Gl. (5), wie durch Gl. (6) bestätigt wird.

PC₅₀ = 8Σπ_Β + pc₅₀,_Benzeri) ' . (5)

pc₅₀ = 0,95 Σπ_Β + 2,29 (6)

η = 21 r= 0,961 s = 0,190

Da der Anstieg von 0,95 in Gl. (6) sich nur geringfügig von 1 unterscheidet und die Absolutbeträge von 2,03 in Gl. (4) bzw. 2,29 in Gl.(6) etwa dem rt_B-Wert von 1,96 für Benzen entsprechen, kann als Näherungsmodell für die Beschreibung der quantitativen-Struktur-Wirkungs-Beziehung (QSWB) für die Wachstumshemmung von autotroph kultivierten Chlorella-Suspensionen durch „unspezifische" Benzenderivate Gl. (7), die wiederum ein Grenzfall der Gl. (8) darstellt, genutzt werden. Nach diesem QSWB-Modell gilt, daß zwischen Fragmenten I.Ordnung keine biologisch relevanten Wechselwirkungen auftreten und daß die beobachteten biologischen Aktivitäten, die sich als allgemeine unspezifische Phytotoxizitäten manifestieren, additiv sind und durch Hydrophobizitätskonstanten rt_B nach HANSCH beschreibbar sind.

pc₆₀(gesamt) = Ipc₆₀(Fragmente) = Σπ_Β (7)

Neben den „unspezifischen" Fragmenten I.Ordnung gibt es Fragmente höherer Ordnung wie beispielsweise NO2, CHO, CN, OH, NH₂, NHCONH₂, NHCSNH₂, NHCSMe=NH und andere, die in der Lage sind, die Wirkung meist über spezifische Wirkmechanismen wesentlich zu erhöhen. So bewirken beispielsweise Aniline Veränderungen im Nukleinsäurebau. Für Benzonitrile ist das Eingreifen in den photosynthetischen Eiektronentransport bekannt. Gleichzeitig ist für beide Benzenserien der biologische Wirkeinfluß über die Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung bei verschiedenen Testobjekten nachgewiesen worden.

Als den genannten Sachverhalten ist abzuleiten, daß sich die Gesamtwirkquantität pc₅₀ in Näherung gemäß G. (8) additiv aus mehreren Termen zusammensetzt, wobei die einzelnen Beiträge pcso(sp) zum komplexen Term für die SpezialWirkungen IpC₅O = (sp) positiv, negativ oder null sein können.

PC₅₀ = Zpc₅₀-Anteile = a Σπ_Β + a' Ipc₅₀(sp) + K (8)

Unter der Voraussetzung, daß die Anstiege a und a' in Gl. (8) den Wert 1 haben und der Term K beim genutzten Testsystem vernachlässigt werden kann, besteht die Möglichkeit, den komplexen Beitrag der SpezialWirkungen (ZpC₅₀ (sp)) über Gl. (8.1) abzuschätzen.

Ipc₅₀(sp) = pc₅₀ - Σπ_Β = PC₅₀ - IgP (8.1)

Die pc₅₀(sp)-Werte einzelner Fragmente bzw. Substituenten sind durch Vergleich der komplexen Σρο₅ο(3ρ)-θ3ΐβη entsprechender Derivate über bekannte Methoden wie beispielsweise über das Subtraktionsverfahren zugänglich. Sind die n_B-Werte (IgP) und die Wirkquantitäten pc₅o(sp) aller Strukturelemente bestimmt bzw. bekannt, so läßt sich die Gesamtwirkung pc₅₀ beliebiger Strukturen nach Gl. (8.2) in Näherung bestimmen.

pc_so = Σπ_Β + Zpc₅₀(sp) = IgP + Ipc₅₀(sp) . . (8.2)

Die Wirkquantitäten pc₅₀(sp) für Fragmente höherer Ordnung können nach Gl. (9) bestimmt werden, in der die n_B-Konstanten als theoretische n_B-Konstanten der Fragmente höherer Ordnung sinngemäß über Gl. (4) zugänglich sind

pc₅₀(sp) = π_Β - π_Β (9)

So wurden beispielsweise für die Substituenten 2. Ordnung NO₂, CHO, CN, OH und NH₂ die pc_5a(sp)-Werte 1,40,1,18,0,90,0,96, 1,54 bestimmt. Die Brauchbarkeit dieses QSWB-Modells wird durch Gl. (8.3) unterstrichen, die die Struktur-Wirkungs-Beziehung für die Hemmwirkung von Chlorella-Suspensionen durch 81 mono-und disubstituierte Benzene beschreibt. -

PC₅₀ = Σπ_Β + 1,37 Ipc₅₀(sp) + 0,07 ' (8.3)

η = 81 r = 0,966 s = 0,153"

Da der beobachtete Konfidenzbereich der Regressionskoeffizienten a bzw. a' in Gi. (8) bzw. (8.3) Anstiege von a = a' = 1 zuläßt, können Gesamtwirkungen pc₅₀ (theoretisch) beliebiger Strukturen nach einem vereinfachten Näherungsmodell einer allgemeinen QSWB gemäß Gl. (10) abgeschätzt werden. s

pc₅₀(theor.) = Σπ_Β + ηΚ₂ + ηΚ₃ + ... . (10)

K₂ = -=1,40 (10.1)

In Gl. (10) gibt η die Anzahl der Substituenten 2. Ordnung (NO₂, OH, CHO, CN, NH₂, NHCONH₂, OHCSNH₂ und andere), 3. Ordnung (z. B. SO₂NH₂, NHNH₂, CONHNH₂, NHCONHNH₂ und andere) und weitere Ordnungen an. Die additiven Wirkquantitäten K₂ und K₃ stehen für Substituenten 2. Ordnung (K₂ - 1,4) bzw. 3. Ordnung (K₃ = 2,8). Bisherige Untersuchungen an heterozyklischen Strukturen verdeutlichen, daß einige heterozyklische Fragmentesich wie Substituenten 1. oder 2. Ordnung verhalten. Für einen großen Teil anderer heterozyklischer Fragmente

K 3 K

werden die spezifischen Wirkquantitäten in Gl. (10) am besten durch bzw. in einigen Fällen auch durch beschrieben.

pc₅₀(exp.) = 0,85 pc₆₀(theor.) + 0,45 (11)

η = 63 r = 0,364 s = 0,303

Sowohl der Korrelationskoeffizient als auch die Standardabweichung in Gl. (11) für mono- und disubstituierte Benzenderivate weisen darauf hin, daß eine Abschätzung von additiven Wirkquantitäten nach diesem vereinfachten Modell praktischen Ansprüchen hinreichend genügen kann.

Tabelle 2: Experimentell bestimmte Wirkquantitäten pc₅₀(exp.) und nach Gl. (7) bzw. GI. (10) abgeschätzte Wirkquantitäten pc₅o(calc.) einiger Wirkstoffe

Fragment Fragment

Nr. . Substanz I.Ordnung 2. Ordnung pc₅₀(exp.) pc₅₀(calc.) Apc

1.	C₆H₅-Bu¹	C₆H₅, Bu¹	—	3,73	3,94	-0,21
2.	C₁₀H₇NHCONH₂	C-IoH₇	NHCONH₂	3,66	3,38	0,28
3.	(C₆Hg)₂NCONH₂	2 x C₆H₅	NCONH₂	4,30	4,02	0,28
4.	1-CN, 3,5-Br₂,4-OH-C₆H₂	C₆H₂,2 x Br	CN, OH	5,45	5,24	0,21
5.	1-CN, 3,5-I₂,4-OH-C₆H₂	C₆H₂,2xl	CN, OH	6,0	5,76	0,24
6.	1-NO₂,3,5-I₂,4-OH-C₆H₂	C₆H₂,2 x I	NO₂, OH	6,23	6,05	0,18
7.	1,3(NO₂J₂,4-0H, 5-Me-C₆H₂	C₆H₂, Me	2 χ NO₂, OH	5,11	5,49	-0,38
8.	1-NO₂,2-ME,3-I,4-OH,	C₆H₁, Me, Pr', I	NO₂, OH	6,7	6,81	-0,11
	5-PH-C₆H₁

Die Beispiele Nr. 1 bis 3 in Tab. 2 veranschaulichen, daß die normalen und verzweigten Aklylgruppen bis zu einer Kettenlänge, von etwa vier Kohlenstoffatomen, Phenylgruppen und Naphthylgruppen als Grundgerüst den Fragmenten I.Ordnung zuzurechnen sind.

Die in Tabelle 2 aufgeführten Beispiele vier- und fünffach substituierter Benzene, die z.T. kommerziell als Herbizide vertrieben werden, bestätigen die Allgemeingültigkeit des genutzten QSWB-Modells. Die bisher untersuchten Phytoeffektoren stellen insgesamt nur einen Bruchteil denkbarer biologisch aktiver Strukturen dar. Trotzdem illustrieren die vorgestellten Ergebnisse, daß die vorgeschlagenen Tests auf der Basis von Mikroalgensuspensionen und die vorgeschlagenen " Auswertungsmöglichkeiten der Analyseergebnisse solcherTests geeignet sind, in Näherung additive Wirkquantitäten von Molekülfragmenten und komplexe oder spezifische Kombinationswirkquantitäten, die für die Wirkstofforschung von relevanter Bedeutung sind, zu bestimmen. "

2. Beispiel

Frisch geschlüpfte Aplanosporen synchroner Kulturen einzelliger Grünalgen derSpeciesChlorella vulgaris var. vulgaris, Stamm BÖHM und BORNS 1972/1, werden in eine anorganische Nährlösung mit Fe-EDTΑ-Komplex und Spurenstoffen so überführt, daß jeder Kubikzentimeter der Suspension etwa sechs Millionen Algenzellen enthält. 1 Liter der Kultur-Nährlösung N setzt sich dabei aus den drei Teilnährlösungen N₁, N₂ und N₃ zusammen:

1 000cm³ N = 998cm³ N₁ + 1 cm³ N₂ + 1 cm³ N₃.

Die Nährlösungen N₁, N₂ und N₃ enthalten folgende Substanzen:

Nährlösung N₁

Für die Nährlösung N₁ werden zunächst die Stammlösungen 1 bis4durch Auffüllen der genannten Substanzmengen mit Aqua dest. hergestellt:

Stammlösung 1: 100g KNO3/I 000cm³

Stammlösung 2: 25g CaCI₂ · 6H₂O/1 000cm³

Stammlösung 3: 250g MgSO₄ · 7H₂O/1 OOOcm³

Stammlösung 4: 160g KH₂PO₄/1 000cm³.

Diese Stammlösungen sind zu sterilisieren (Feuchtsterilisation) und kühl zu lagern.

Aus je 5 cm³ der Stamm lösung 1, 0,5 cm³ der Stamm lösung 2,1 cm³ der Stamm lösung 3 und 5 cm³ der Stamm lösung 4 werden durch Auffüllen mit destilliertem Wasser entweder 1 000 cm³ bzw. bei Beachtung der Verhältnisse eine beliebige Menge der

Nährlösung N₁ hergestellt. .

Nährlösung N₂ """

Die Nährlösung N₂ enthält in 1 000cm³ Lösung 61 mg H₃BO₃,169 mg MnSO₄ · H₂O, 287 mg ZnSO₄ · 7 H₂O, 2,5mg CuSO₄ · 5H₂O und 12,4mg (NH₄J₂MoO₄.

Nährlösung N₃

Zur Herstellung der Nährlösung N₃ werden 6,9g FeSO₄ · 7 H₂O und 9,3 g Na-EDTA in destilliertem Wasser gelöst und auf 1 000cm³ mit Aqua dest. aufgefüllt.

Für die heterotrophe Testvariante werden zu derfrisch hergestellten Algensuspension 0,1 Ma.-% Glukose als organische Kohlenstoffquelle und 20mg/l Chloramphenicol zugegeben.

Je 80 cm³ der so hergestellten Suspension werden in je eine Kulturröhre eingebracht und mit je 1 cm³ verschieden konzentrierter wäßriger Lösung der zu prüfenden Substanzen gemäß Tab. 3 beimpft oder als unbehandelte Kontrollen in.der autotrophen Testvariante bei 37⁰C belichtet und mit gereinigter Luft, der 2 Vol.-% Kohlendioxid beigegeben wird, begast oder in der heterotrophen Testvariante nur bei 37°C im Dunkeln mit gereinigter Luft begast, so daß alle erforderlichen Voraussetzungen für die Photosynthese bzw. für das heterotrophe Wachstum gegeben sind.

Während die in Nährlösung suspendierten Zellen in den unbehandelten Vergleichskulturen normal wachsen und sich entwickeln, werden Wachstum und lonenumsatzin den mit Chemikalien versetzten Proben mehr oder weniger beeinflußt, wenn verschiedene Substanzkonzentrationen den Photosyntheseprozeß, die Atmung oder den Stickstoffhaushalt mehr oder weniger stören. In definierter Zeitfolge werden von den Vergleichskulturen und den mit den Substanzen behandelten Proben die optischen Eigenschaften bei 630 und 750 nm als Wachstumsparameter sowie der pH-Wert als Maß für den Stickstoffhaushalt gemessen.

Die Ergebnisse der Analysen sind der Tab. 3 und den Fign.4bis8zu entnehmen..

Die Tab. 3 enthält die Wirkquantitäten pc_50(A), pcsomi ^ur|d ApC₅₀, die aus Dosis-Wirkungs-Untersuchungen meistens bereits in einem Vorscreening, bei dem der Wirkbereich der Effektoren eingegrenzt wird, zugänglich und in der angegebenen Weise (siehe Tab. 3) definiert sind. Von allen Wirkstoffen wurden die über die GIn. (12) und (13) bestimmten Wachstumsparameter AIgE₆₈₀, A¹IgE₇₅₀ und Δ'ρΗ in Form von Wirkbildern verglichen.

IgEo.Kontrolle ~ IgEEnde.Kont PHo.Prabe ~ Pj"jtProbe

—

P"o,Kontrolle ~ P^Ende, Kontr

AIgC ₍₁₄₎

igEo.Kontrolle — IgEEnde.Kontrolle

.+ _u pHt,Kontrolle ~ pHt,Probe ,.,_,

A pn = — (15)

PH_O, Kontrolle ~ PriEnde, Kontrolle

Entsprechend der Größe der Apc₅₀-Werte, gemäß Tab.3, die aus einem Vergleich der pcg_O-Daten aus den autotrophen (A) und heterotrophen (H) Testvarianten resultieren, können die Effektoren in verschiedene quantitative Stufen hinsichtlich ihrer Beeinflussung der Photosynthese als eine durch die Fragmente und ihrer Kombination bewirkte komplexe Wirkqualität eingeordnet werden. Aufgrund ihrer Apc₅₀-Werte gemäß Tab. 3 sind beispielsweise die Herbizide Simazin und Atrazin als echte Photosynthesehemmer, Prometryn und Bromuron als gute Photosynthesehemmer und DNOC und Amidinothioharnstoff als ur\spezifische Photosynthesehemer einzustufen.

Ein Vergleich der Strukturen der Wirkstoffe in Tab. 3 verdeutlicht, daß nur dann größere Apc-Werte beobachtet werden, wenn die Wirkstoffstrukturen Alkylaminofragmente enthalten. Durch gezielte Untersuchungen weiterer Wirkstoffe bzw. Wirkstoffserien, können möglicherweise weitere Fragmente mit größeren Apc-Werten aufgefunden werden. Andererseits sind durch Vergleich anderer Wirkquantitäten weitere Wirkquaiitäten von Strukturfragmenten nachweisbar.

Tabelle 3: pc₅o-Daten¹¹ für die Hemmung des autotrophen (A) und des heterotrophen Wachstums (H) synchroner Chlorella-Suspensionen

PC50(A) PC50(H) ApC₅₀

Substanzen E(X = 680nm) E(x ₌ 75₀nm) E(,\ ₌ 680nml

Simazin 6,07 6,14 3,0²⁾ 3 Atrazin 6,22 6,19 3,13 3,09 Prometryn 6,66 6,65 3,72 2,94 Bromuron 5,92 6,30 3,44 2,48 DNOC 5,11 5,07 4,91 0,20 Amidinothioharnstoff 2,97 2,97 3,6²⁾ . ca. 0

Besonders aussagekräftig sind in diesem Sinne Vergleiche von Wirkbildern, wie sie als ausgewählte Beispiele für die Strukturverwandten Simazin und Atrazin bzw. 4-MethyIphenol und DNOC in den Wirkbildern A, B und C in den Figuren 4 bis 8 vorgestellt werden. In den Wirkbildern der Figuren 4 bis 8 wurden hierfür die Wachstumsparameter AMgE₆₈₀ als Maß der Chlorophyllbeeinträchtigung mit A¹IgE₇₅₀ als Maß des allgemeinen Zellwachstums (Wirkbilder A), die A'lgE₇₅₀-Daten'mit den Δ'ρΗ-Werten als Maß der Nitrationenaufnahmebeeinfiussungen (Wirkbilder B) und die entsprechenden Hemmparameter ^{+ mit Δ+}Ρ^Η (Wirkbilder C) verglichen.

1) pc₅₀ =-Ig (ED₅₀) ([C] = mol · Γ¹);

Die Bestimmungen der pcso-Werte erfolgten über Extinktionsmessungen der Suspensionen bei λ = 680 und λ = 750 nm.

2) Bei der maximalen getesteten Wirkkonzentration pe = 3,0 bzw. 3,6 wurde keine Wirkung festgestellt.

So zeigt das Wirkbild Fig. 4, A für Simazin, daß im Vergleich zur Kontrolle K mitzunehmender Dosis von 1 bis 9 das allgemeine Zellwachstum (AIgE₇₅₀) etwas stärker tangiert wird als das Chlorophyllwachstum (AIgE₆₈₀), wobei dieser relativ geringe Effekt ,« am Anfang der Kurven am deutlichsten zu erkennen ist. Daraus kann geschlußfolgert werden, daß Simazin neben der Beeinflussung der Photosynthese bzw. derChloroplasten primär zu einer Oberflächen beeinflussung bzw. Form veränderung der Zellen führt, die über Streueffekte durch die Extinktionsmessungen bei 750 nm erfaßt werden und in diesem Fall eine scheinbare stärkere Tangierung des Zellwachstums anzeigen.

Ein ganz anderes Bild zeigen die Wirkbilder, in denen die Wachstumsparameter AIgE₇₅₀ mit den entsprechenden Δ'ρΗ-Werten, Fig.5, B verglichen werden.

So zeigt die Fig. 5, B für die Beeinflussung des Zellwachstums und des Nitrathaushaltes durch Simazin mehrere Metabilismen, die durch die in mehreren Wellen verlaufenden A'lgE₇₅₀-A'pH-Kurven angezeigt werden. Dosisabhängig wird zunehmend in einem primären Schritt das Zellwachstum stärker tangiert als die Beeinflussung des Nitrathaushaltes. Die Dosis 7 führt zu einer Blockierung der Nitrationenaufnahme bei gleichzeitig weiterem Wachstum der Zellen. Die sehr starken Dosen 8 und 9 führen zu einer Protonenemission, denn es wird eine pH-Wert-Abnahme angezeigt. In einem sekundären Prozeß wird dann die Beeinflussung des Nitrathaushaltes im Vergleich zum Zellwachstum stärkertangiert. Ein Vergleich derentsprechenden AIgE₇₅₀-A'pH-Kurven verdeutlichtauch, daß bei kleiner werdenden Dosen mit weiterem Verlauf der Kurven das entsprechende Verhältnis A'lgE₇₅₀/A'pH der Kontrolle K angenähert wird. Das läßt Reparatureffekte vermuten.

Aufgrund der ähnlichen Struktur von Atrazin und Simazin sind auch vergleichbare Wirkparameter pc₅o und ApC₅₀ sowie vergleichbare Beeinflussungen der optischen Eigenschaften und des pH-Wertes der Algensuspensionen zu erwarten. Das wird durch die pc₅₀- und Apc₅₀-Daten in Tab. 3 und die Wirkbilder A und B in den Fign.4 und 5 bestätigt. Geringe Unterschiede zeigt ein Vergleich der Wirkbilder B und C in den Fign. 5 und 6 für Simazin und Atrazin. Da sich die Struktur des Atrazins von Simazin dadurch unterscheidet, daß eine NHEt-Gruppe durch eine NHPr'-Gruppe ausgetauscht wurde, dürften die sich in Fig. 5, B darstellenden quantitativen und qualitativen Unterschiede in den Wirkbildern B durch diese Molekülfragmente NHEt bzw. NHPr' determiniert sein, wobei Kombinationswirkungen nicht auszuschließen sind.

Vergleicht man die über die GIn. (14) und (15) zugänglichen Hemmparameter A⁺IgE₇₅₀ und A⁺pH gemäß den Wirkbildern beider Wirkstoffe in Fig. 6, C miteinander, so erhält man eine weitere Möglichkeit, die strukturfragmentdeterminierten Wirkeffekte näher zu charakterisieren. - .

Ein Vergleich der A'lgE_e8o^'lgE₇₅o-Auftragungen für die Wirkstoffe 4-Methylphenol und DNOC in Fig.7, A verdeutlicht als ein weiteres Beispiel, daß die strukturfragmentdeterminierten Wirkqualitäten gut mit Hilfe der vorgeschlagenen Methoden nachweisbar sind. Da, abgesehen von der Stellung der Substituenten, sich die Struktur des DNOC vom Methylphenol nur durch zwei Nitrogruppen unterscheidet, dürfen die deutlich sichtbaren dosisabhängigen stärkeren Beeinflussungen der optischen Eigenschaften bei 680 nm für DNOC in Fig. 7 durch die Nitrogruppen determiniert sein. Auch die im Gegensatz zum Wirkbild B für 4-Methylphenol in der A'lgE₇₅₀-A'pH-Auftragung für DNOC in Fig.8 erkennbaren wellenartig und dosisabhängig verlaufenden A'lgE_7S0-A'pH-Kurven, die auf mehrere Metabolismen schließen lassen, werden durch die Nitrogruppen bzw.'durch Kombinationswirkungen unter Beteiligung der Nitrogruppen hervorgerufen. Während durch 4-Methyiphenol primär der Nitrathaushalt stärker tangiert wird, zeigt das entsprechende Wirkbild für DNOC in Fig. 8, daß dieser Wirkstoff zunächst das Zellwachstum stärker tangiert, was wiederum auf die Nitrogruppen zurückzuführen ist.

Neben den bisher aufgeführten Selektionsprinzipien können zur weiteren Differenzierung der Wirkqualitäten von Strukturfragmenten der Wirkstoffe zusätzliche qualitative und quantitative Effekte, die entweder aus den gleichen Tests oder zusätzlichen Untersuchungen resultieren, herangezogen werden. So ist eine weitere Differenzierung der Wirkqualitäten der Fragmente durch Vergleiche der Qualität von Wirkbildern möglich, bei denen beispielsweise weitere geeignete Parameter, die eng mit dem Wachstum der Algensuspensionen zusammenhängen, untereinander verglichen werden. Beispielsweise können zusätzlich die Beeinflussungen der photosynthetischen und/oder respiratorischen Gaswechselumsetze (O₂, CO2) untereinander oder mit den Beeinflussungen der optischen Eigenschaften bei 680 und 750 nm oder weiteren Wellenlängen und mit lonenumsätzen bzw. pH-Werten in beiden Testvarianten verglichen werden.

Bereits die Wirkparameter (Tab. 3) und die Wirkbilder Fign. 4 bis 8 der untersuchten Wirkstoffe verdeutlichen, daß die vorgeschlagene minimierte Testhierarchie auf der Grundlage autotroph und heterotroph kultivierter Algensuspensionen und das vorgeschlagene minimierte Auswertungssystem der Meßdaten zu klaren Informationen über die komplexe oder spezifische Wirkqualität und Wirkquantität von Strukturfragmenten führen können, die sich auch als Screeningverfahren zur Charakterisierung und Selektion von Effektoren nutzen lassen.

Bei Bedarf können in weiterführenden Tests die teils unterschiedlich substanzinitiierten Beeinflussungen der lonenumsätze des durch wahlweise Nitrat- und durch Ammoniumionen determinierten Wachstums einzelliger Algensuspensionen untersucht und vergleichend betrachtet werden. Durch solche Spezialtests läßt sich die Wirkspezifik der Molekülfragmente weiter einengen, wobei man zunehmend konkretere Hinweise betreffs der möglichen kommerziellen Nutzung erhält.

Durch Vergleich solcher Wirkdaten wie pc_50(A), pc₅₀(_H), Apc_5Ound von Wirkbildern gemäß den Fig.4bis8von neu untersuchten Substanzen, die aus der vorgeschlagenen minimierten Testhierarchie resultieren, mit einer Wirkdaten- und Wirkbildkartei oder mit Hilfe der elektronischen Datenverarbeitung von Wirkstoffgrundtypen, die sich in der Praxis bewährt haben, erhält man durch' Nutzung der vorgeschlagenen minimierten Auswertung der Wirkdaten konkrete Hinweise über komplexe oder spezifische Wirkquantitäten und vergleichbare Wirkspezifiken und damit über die gezielte Wirkstoffsynthese kommerzielle Anwendungsmöglichkeiten neuer Effektoren.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung und Charakterisierung von Molekülfragmentwirkungen bei Phytoeffektoren, gekennzeichnet dadurch, daß mittels einer minimierten Testhierarchie die teils substanzinitiierten Beeinflussungen der optischen Eigenschaften, der lonenumsätze und gegebenenfalls der photosynthetischen und/oder respiratorischen Gaswechselumsätze einzelliger Algensuspensionen, analysiert und die Analysenergebnisse einem minimierten Auswertungsmodus unterzogen werden, um dann mittels Vergleich der absoluten Wirkquantitäten strukturverwandter Effektoren komplexe oder spezifische Wirkqualitäten von Molekülfragmenten, die in Näherung additiv sind, zu bestimmen und mittels Vergleich von Wirkbildern, in denen die für die Beeinflussungen der optischen Eigenschaften bei beispielsweise zwei Wellenlängen bzw. -bereichen, der lonenumsätze bzw. der pH-Werte und gegebenenfalls der Gaswechselumsätze beispielsweise als Wirkeffekt-Wirkeffekt-Kurven in Abhängigkeit von der Dosis betrachtet werden, typische Aussagen zur Hauptwirkrichtung und zur Wirkspezifik der betrachteten Molekülfragmente hinsichtlich der Beeinflussung der Photosynthese, der Atmung, des Wachstums und/oder des Stickstoffhaushaltes zu erhalten.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Testmodell alle suspendierbaren autotroph und heterotroph kultivierbaren einzelligen Grünalgen verwendet werden können.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die optischen Eigenschaften der Mikroalgensuspensionen mittels Spektralkolorimetrie, Spektralphotometrie oder Nephelometrie bei ein bzw. zwei bis η verschiedenen Wellenlängenbereichen oder ganzen Spektralbereichen, insbesondere im sichtbaren Spektralbereich analysiert werden.

4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß der ionenumsatz der Mikroalgensuspensionen mittels pH-Elektroden, nitratsensitiver Elektroden oder anderer ionensensitiver Elektroden oder anderen geeigneten Verfahren oder durch Kombination dieser Methoden analysiert wird.

5. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß der Sauerstoffumsatz mittels Paramagnet-Gasanalysatoren, sauerstoffsensitiver Elektroden oder geeigneten anderen Methoden oder durch Kombination mehrerer dieser Methoden analysiert wird.

6. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß der Kohlendioxidumsatz mittels Infrarot-Gasanalysatoren, 14_c-Methode, photometrischer Methoden oder durch Kombination mehrerer dieser Methoden analysiert wird.

7. Verfahren nach Punkt 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die optischen Eigenschaften, der Ionenumsatz und der Gaswechselumsatz der autotrophen oder heterotrophen Mikroalgensuspensionen in je einem Arbeitsgang kontinuierlich oder in definierter Zeitfolge parallel oder simultan analysiert werden.