DD283154A5 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen humanes interferon-alpha 1 - Google Patents
Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen humanes interferon-alpha 1 Download PDFInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung monoklonaler Antikoerper gegen humanes Interferon-alpha 1 (HuIFN-alpha1), die zur ausschlieszlichen Reaktion gegen dieses befaehigt sind. Ziel der Erfindung ist die Herstellung von monoklonalen Antikoerpern, die fuer eine immunaffinitaetschromatographische Anreicherung und die immunchemische Bestimmung von rekombinanten HuIFN-alpha1 (rHuIFN-alpha1) nutzbar sind. Das erfindungsgemaesze Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dasz man Milzzellen von Maeusen, die intraperitoneal und subkutan mit rHuIFN-alpha1 immunisiert, mit Myelomzellen der Linie FO in vitro fusioniert, die erhaltenen Hybridome mit spezifischer Antikoerperproduktion selektiert, anschlieszend Einzelzellklonierung durchfuehrt und die erhaltenen stabilen Klone in ueblicher Weise weiter vermehrt. Durch Kultivierung der Hybridzellklone der Linien H62/21B10 und H62/21B12 werden die neuen monoklonalen Antikoerper ZIMET 21B10 bzw. ZIMET 21B12 gewonnen. Die neuen Hybridomzellinien H62/21B10 und H62/21B12 wurden unter den Nummern ZIM-0441 bzw. ZIM-0442 in der Hinterlegungsstelle fuer Zellinien im Zentralinstitut fuer Molekularbiologie der AdW der DDR hinterlegt. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Humanmedizin, Biologie, Veterinaermedizin und die Biotechnologie.{Gewinnung von monoklonalen Antikoerpern, spezifische Reaktion mit Interferon-alpha 1, intraperitoneale und subkutane Immunisierung; Fusion mit Myelomzellen der Linie FO; Selektion; Einzelzellklonierung; Hybridzellklone H62/21B10 und H62/21B12}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humanes Interferon-alpha 1 (HuIFN-alphai).
Diese Antikörper können sowohl zur immunchemischen Bestimmung von rekombinanten HulFN-alphai als auch zur immunaff initätschromatographischen Anreicherung von rHulFN-alphai in der Biotechnologie eingesetzt werden.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind die biologische und medizinische Forschung, die klinische Diagnostik und die Biotechnologie.
Natürliche und rekombinante Human-Interferone sind Proteine, die durch eine Stimulation menschlicher Zellen bzw. gentechnisch gewonnen werden (Stewart II, W. E. et al., Nature 286,1980,110-113; Cantell, K. et al.. Methods in Enzymology 78, 1981,29-38).
Auf Grund ihrer heterogenen chemischen Zusammensetzung werden verschiedene Interferontypen und Subtypen unterschieden (Rubinstein, M., Arch. Biochern. Biophys. 210,1981,307-318).
Monoklonal Antikörper gegen natürliches oder durch rekombinante DNS-Technik erhaltenes HulFN-alphai sind seit 1980 bekannt (SECHER, D.S., und D.C. BURKE, Nature 285,446-450,1980; STAEHELIN, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78,1848-1852,1981; IMAI, M. et al., J. Immunol. 128,2824-2825,1982; BERG, K., J. Interferon Res. 4,481-491,1984; NOVAK, M.. et al., Acta Virol. 30,228-233,1986).
In der DDR sind die Schutzrechte WP 231007 und WP 254B93 bekannt, welche die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen HulFN-alphai betreffen. Die darin beschriebenen Antikörper haben den Nachteil, daß sie die biologische Aktivität des HuIFN-alphai nicht oder nicht wesentlich hemmen. Diese Antikörper binden Toilstrukturen des HulFN-alphai-Moleküls, die für seine biologische Wirkung und insbesondere seine Bindung an Interferonrezeptoren nicht essentiell sind. Daraus ergibt sich als weiterer Nachteil, daß die Bindung dieser Antikörper an das HulFN-alphai die native Struktur von Molekülbereichen nicht voraussetzt, die für die biologische Aktivität des HulFN-alphai und insbesondere seine Bindung an Interferonrezeptoren essentiell sind.
Die Erfindung verfolgt das Ziel, monoklonale Antikörper gegen HulFN-alpha zu gewinnen, die zur immunaffinitätschromatographischen Anreicherung von gentechnisch produziertem rHulFN-alphai sowie zur immunchemischon Bestimmung in der Biotechnologie eingesetzt werden können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein hinreichend einfaches und zuverlässig handhabbares Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen HulFN-alphai anzugeben
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe wie folgt gelöst:
BALR/c-Inzuchtmäuse werden mehrmals mit gereinigtem rekombinatem HulFN-alphai intraperitoneal (i. p.) und subkutan (s. c.) immunisiert, ihre Milzzellen in bekannter Weise mit murinen Plasmozytomzellen der Linie FO in vitro fusioniert, die daraus entstandenen Hybridzellklcne durch Kultivierung in einem Hypoxanthin-Azaserin-Medium selektioniert und ihre Kulturüberstände mit Hilfe eines indirekten Festphasenenzymimmunoassays (Peters, J. H. et al., Monoklonale Antikörper-Herstellung und Charakterisierung, 1980, Springer Verlag, 114-127) auf ihren Antikörpergehaft testet und anschließend in an sich bekannterWeise die Bindungsspezifität durch einen Festphasan-Bioassay (Berthold, W. et al., Arzneim.-Forsch. 35 [I], 1985, 364-369) bestimmt. Die Hybridomzellen der nach diesem Verfahren neu etablierten Linien H62/21 BIO und H62/21B12 werden in vit.' ider nach intraperitonealer Inokulation in Pararrinum perliquidum-stimulierte Mäuse in Aszitesform in vivo vermehrt. Die Herstellung der monoklonalen Antiköper erfolgt aus Kulturüberständen der H62/21B10- bzw. H62/21 B12-Zellen oder aus der
Aszitesflüssigkeit Hybridom-tragender BALB/c-Mäuse bzw. vorzugsweise (BALB/c NMRI)F,- oder NMRI BALB/c)F,-Hybridmäuse nach gebräuchlichen Isolierungsverfahren.
Die Lagerung von Konserven der Hybridomzellinien H62/21B10 bzw. H62/21B12 erfolgt in flüssigem Stickstoff. Die Hybridomzellinien H62/21B10 und H62/21B12 wurden unter den Nummern ZIM-0441 bzw. ZIM-0442 in der Hinterlegungsstelle für Zellinien im Zentralinstitut für Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der DDR, DDR -1115 Berlin, Robert-Rössle-Str. 10, hinterlegt.
Die verfahrensmäßig gewonnenen Antikörper ZIMET 21B10 und ZIMET 21B12 haben gegenüber anderen monoklonalen Antikörpern den Vorteil, daß sie eine spezifische Antigendeterminante für HulFN-alphai besitzen. Sie erlauben damit eine Unterscheidung der biologischen Wirkung von HulFN-alphai und HulFN-alpha2.
Als einen Vorteil des Verfahrens wird die Verwendung von gentechnisch hergestelltem HulFN-alphai zur Stimulierung der BALB/c-Mäuse und damit der Herstellung ganz spezifischer Antikörper angesehen.
Ausführungsbelspiel
Die Herstellung der monoklonalen Antikörper erfolgt in den folgenden Arbeitsschritten:
- Weibliche Mäuse des Stammes BALB/c werden in mehrwöchigen Abständen mit jeweils 10e I. U. rl \ 'FN-alphai (ZIMET L13E1) i.p. und s.c. immunisiert.
Drei Tage nach der letzten Immunisierung erfolgt die Fusion der Milzzellen mit murinen Plasmozytomzellet ι der Linie FO (Fazekas de St Groth, S. und Scheidegger, D. J., Immunol. Methods 35,1980,1-21) nach bekannten Verfahren (Köhler, G. und Mnstein, Nature 256,1975,459^497; Galfre G. et al.. Nature 266,1977,550-562).
- Die in einem Hypoxanthin-Azaserin-Selektionsmedium wachsenden Hybridomzellklone werden mitteis ELISA auf Freisetzung von HulFN-alphai-spezifischen Antikörpern untersucht. Die Wirkung der monoklonalen Antikörper wird im Virus-Wirts-System Vesicularstometitisvirus/Madin Darby bovine Nierenzellen (MDBK) geprüft. Es werden Antikörperverdünnungsreihen mit Faktor 2 hergestellt und mit verschiedenen Interferonkonzentrationen (500,250,125 usw. bis 0,5IE/ml) 2 Stunden bei 370C inkubiert. Anschließend wird die Reduktion der IFN-Wirkung durch Bestimmung der noch vorhandenen 50%igen Hemmung der viralen Zellzerstörung im Mikrotitertest ermittelt.
- Hybridomzellklone, die monoklonale Antikörper mit Spezifität für HulFN-alphai freisetzen, werden bis zur Etablierrng einer stabilen Hybridomzellinie mehrfach rekloniert.
- Zur Herstellung der monoklonalen Antikörper ZIMET 21B10 bzw. ZIMET 21B12 werden Hybridomzellen der neuen Linien H62/21B10 bzw. H62/21B12 entweder in vitro oder in Aszitesform in Labormäusen, vorzugsweise (NMRI · BALB/c)F,- oder (BALB/c NMRI)FpHybridmäusen, vermehrt. Die monoklcnalen Antikörper werden aus dem Kulturuberstand bzw. aus der Aszitesflüssigkeit nach üblichen Methoden angereichert und gereinigt.
- Eigenschaften der monoklonalen Antikörper ZIMET 21B10 und ZIMET 21B12:
| Eigenschaften | Monoklonale Antikörper | ZIMET21B12 |
| ZIMET21B10 | IgGi | |
| Ig-Subklasse | IgGi | |
| Interferon-Sub- | HulFN-alphai | |
| typspezifität | HulFN-alphai | |
| Eignung zurlmmun- | gut | |
| affinitätschromatographie | gut | |
Claims (1)
- Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes Interferon-aipha 1 (HuIFN-alphai) durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit HulFN-alphai, Fusion ihrer Milzzellen mit Myelomzellen, Selektion der erhaltenen Hybridome, Bestimmung ihrer Antigendeterminatenspezifität, Auswahl der spezifischen Hybridome, Elablierung von Hybridomlinien durch Klonierung und mehrfache Reklonierung und Kultivierung der Hybridomlinien bzw. Transplantation der Hybridome. auf Mäuse- und Passagierung in Aszitesform, gekennzeichnet dadurch, daß- die Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit rekombinanten HulFN-alphai erfolgt,- die Antigendeterminantenspezifität mittels ELISA und Festphasenbioassay bestimmt wird,- zur Kultivierung bzw. Transplantation die neuen Hybridomlinien H62/21B10 bzw. H62/21B12 eingesetzt und- die monoklonalen Antikörper ZIMET 21B10 bzw. ZIMET 21B12 aus Kulturüberständen von Hybridomzellen bzw. aus der Aszitesflüssigkeitvon Hybridom-tragenden Mäusen isoliert werden.
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
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| DD283154A5 true DD283154A5 (de) | 1990-10-03 |
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|---|---|---|---|---|
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| CN111087461A (zh) * | 2020-01-13 | 2020-05-01 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种重组蛋白、编码该重组蛋白的核酸及其应用 |
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1989
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