PT85355B

PT85355B - Processo para a preparacao de novos peptidos

Info

Publication number: PT85355B
Application number: PT85355A
Authority: PT
Inventors: Jan Markussen; Liselotte Langkjaer; Kjeld Norris
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1986-07-21
Filing date: 1987-07-20
Publication date: 1990-04-30
Also published as: FI873185A7; NZ221130A; NO170978B; DD273839A5; ES2061504T3; NL300018I1; PT85355A; IL83243A0; CN87104988A; HU203371B; YU135387A; HUT45271A; ZA875295B; AU612324B2; KR880001701A; EP0254516A3; NO873018L; FI873185L; FI873185A0; IL83243A

Description

NOVO INDUSTRI A/S «PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS PÉPTIDOS»

Antecedentes da Invenção

A presente invenção refere-se a novos compostos insulínicos e a novas soluções injectáveis que possuem uma acção insulínica prolongada.

Muitas variedades de preparações insulínicas têm sido sugeridas e utilizadas no tratamento da diabetes mellitus. Algumas destas preparações possuem uma acção rápida e outras preparações possuem uma acção mais ou menos prolongada. Tal a_c ção prolongada pode obter-se por meio da administração de insu lina sob a forma duma suspensão de cristais de insulina. As preparações cristalinas podem obter-se por meio da cristaliza, TM ção de insulina na presença de zinco (tal como a Lente ver Schlichtkrullí Insulin Crystals, Cheinical and Biological Studies on Insulin Crystals and Insulin Zinc Suspensions, Munksgaard, 1958) ou por cristalização da insulina na presença de zinco e de protamina tal como a insulina NPH (ver «Rep. Steno Mem.Hosp.; 1946; p. 6θ).

Uma desvantagem da utilização das suspensões conhecidas de cristais de insulina e zinco ou de insulina-protamina-zinco é a necessidade de agitar a ampola para se assegu rar que se injecta uma quantidade correcta de insulina e para se assegurar que a concentração da insulina na ampola permanece constante durante a sua utilização. Nos cartuchos PenTM fill onde o ar tem que estar ausente, as suspensões de insu lina de acção prolongada requerem a incorporação de um corpo sólido na preparação, para proporcionar a agitação. A agitação das suspensões de insulina e das soluções de insulina com ar, são em si um processo indesejável, porque a insulina tem tendência para se desnaturar devido à formação de fibrilas nas interfaces água-ar. Consequentemente, são desejáveis solu ções de insulinas de acção prolongada.

Obtêm-se as soluções de derivados de insulina de acção prolongada a partir da insulina que foi modificada nos seus grupos amino mediante reacção com fenil-isocianato (designada por Isoinsulina, ver Hallas-Moeller; Chemical and Biological Insulin Studies based upon the Reaction between In sulin and Phenylisocyanatej Copenhagen; 19^5). De um modo Idêntico, a insulina substituída designada por Al, B29-di-Boc (Boc significa butiloxicarbonilo terciário) foi referida como exibindo uma acção insulínica prolongada após administração sub-cutânea (ver Geiger & Enzmann em: Proinsulin, Insulin, C-peptide; Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-Peptide; Tokushima 1978? Amsterdam-Oxford; 1979; p. 306-310). Verificou-se que a insulina substituída Al B29-di-Boc exibe uma acção prolongada demasiadamente insignificante para ter utilidade clínica.

As soluções de insulina não modificadas requerem grandes quantidades de iões de zinco (por exemplo, 0,4 a

mg por unidade de insulina), a fim de exibirem uma acção prolongada (ver ”J. Pharmacol”; 55 > 1935; P. 206) . A injecção destas doses elevadas de iões zinco causarão provavelmente dor e tais soluções nunca foram portanto utilizadas em te rapêutica.

ponto isoeléctrico da insulina é cerca de

5,5 e tem-se feito tentativas para diminuir a solubilidade dos derivados de insulina, a um pH neutro, por meio de um au mento do ponto isoeléctrico, por exemplo, através de adições, no terminal N da cadeia B de aminoácidos básicos como lisina ou arginina (ver por exemplo, German Offenlegungsschrift N9. 2.042.299) ou com o dipéptido básico arginil-arginina (ver Geiger & Enzmann referido antes). Contudo, p«rto do seu ponto isoelétrico, a solubilidade de insulina Arg ^^-Arg^® é muito mais elevada do que a insulina principal.

pedido de patente de invenção .japonesa N2 55-144032 refere-se a análogos de insulina humana em que o amino ácido B-30 foi substituído por um aminoácido com pelo menos cinco átomos de carbono e as suas respectivas amidas e ésteres. Estes análogos de insulina destinam-se a ser utilizados em doentes que desenvolveram anticorpos contra insulinas de mamíferos. No pedido de patente de invenção japonesa descrevem-se seis compostos específicos em que nenhum deles é referido como tendo uma acção prolongada. Também não foi descrita nenhuma preparação injectável nesse pedido de patente de invenção japonês.

pedido de patente de invenção europeia Ns. 84108442,9 refere-se a análogos de insulina onde um grupo

- 4 / ·* orgânico básico está ligado ao aminoácido B-30, introduzindo assim uma carga positiva a um pH neutro. Nestes análogos, o aminoácido B/30 é neutro e, de preferência, treonina como na insulina humana. 0 pedido de patente de invenção alemã

N9. 3.327.709,5 refere-se a uma suspensão de cristais de d£ rivados descritos no pedido de patente de invenção europeia referido antes, assim como a um composto hidroxi aromático. 0 pedido de patente de invenção alemã N?. 3.326.473,2 refere> -se a um medicamento que contém uma mistura de compostos de | insulina em que pelo menos um é descrito no pedido de patente de invenção europeia referido antes.

pedido de patente de invenção europeia publi cado N2, 194,864 de 12 de Março de 19θ5, reivindicando priord. dade, refere-se a derivados da insulina nos quais o resíduo B-30 do terminal-C está sempre bloqueado por um grupo amido ou éster e em que o aminoácido A21 é sempre asparagina, tal como na insulina humana.

Breve Descrição da Invenção

A presente invenção abrange novos analogos da insulina humana que diferem da insulina humana pors

a) a presença eventual de uma amida ou de um resíduo de éster no grupo carboxilo do terminal-C da cadeia B,

b) possuirem pelo menos mais uma carga do que a insulina humana a um pH de 7, de preferência não mais do que 4 cargas do que a insulina humana a um pH de 7,

c) o resíduo de asparagina do terminal-C da cadeia-A,

A O 1

Asn , poder ser substituído por outro aminoácido qualquer de

* w ocorrência natural, que pode ser codificado pelas sequências nucleotídicas,

d) no caso de se dar uma alteração na carga pelo blc>

queamento do grupo carboxilo no aminoácido

B30, o resíduo de aminoácido

A21 é diferente de um resíduo de asparagina.

Obtém-se a alteração na carga mediante a substi. tuição de. um ou mais resíduos de aminoácidos comparados com a insulina humana e, se se desejar, mediante o bloquearnento do grupo carboxílico do aminoácido B30.

Especificamente, os compostos de interesse para a prática da presente invenção caracterizam-se do seguinte modo: substitui-se um ou mais de quatro resíduos de ácido glutâmico em A4, A17, V13, B21 por outros resíduos de aminoácidos de ocor rência natural, de preferência um resíduo de glutamina; e/ou o resíduo de treonina em B27 é, em vez de um resíduo de aminoácido básico de ocorrência natural, de preferência um resíduo de L-arginina ou de L-lisina; e/ou o resíduo de treonina em B30 é substituído por um ou dois resíduos de aminoácidos básicos, de preferência um só; o grupo carboxílico do terminal-C da cadeia B pode ser protegido e o resíduo de asparagina em A21 pode ser substituído por um resíduo de um aminoácido L.

A presente invenção também abrange soluções dos compostos de fórmula geral I, posteriormente referidos que even tualmente contêm um nível controlado de iões zinco. Portanto, o grau de prolongamento da acção da insulina é reforçado e con trolado.

Método detalhado da presente invenção

Verificou-se, de um modo Surpreendente, que as soluçães injectáveis com uma acção de insulina combinada curta e prolongada podem ser realizadas utilizando-se, como ingre diente activo, um derivado simples de insulina de fórmula geral

(cadeia-A) (I) (cadeia-B) na qual

A e B, seguidos pelos números entre parêntesis, repre^ sentam, cada um, respectivamente, fragmentos das cadeias A e B indicados pelos números entre parêntesis, E^, Ep, E^ e E^, iguais ou diferentes, representam, cada um, um resíduo de ácido glutâmico ou um resíduo de um aminoácido neutro que pode ser codificado por sequências núcleotídicas,

X representa um resíduo de L-treonina, L-arginina ou L-lisina,

Y e Z, iguais ou diferentes, representam cada um, um resíduo de um aminoácido em que qualquer grupo amínico

I:

Λ.

da cadeia lateral pode ser acilado ou cada grupo hidrç>

xi de cadeia lateral pode ser alquilado, m e n, iguais ou diferentes, representam cada um zero ou um,

R representa um grupo resíduo de um grupo hidroxi, amido ou éster que bloqueia o grupo carboxílico do ter minai C da cadeia-B,

W representa um resíduo de aminoácido na condição de que quando W representa um resíduo de asparagina, R re presenta um grupo hidroxi; e quando W representa, um resíduo de asparagina , tanto como X e Y_m“^z _n“R representam cada um um resíduo de treonina e

E^ representa um resíduo de representam, simultaneamente glutamina, E^, Eg ácido resíduos de e E^ não glutâmico, e ainda na condição de pelo menos um dos seus resíduos de aminoácidos representados por E^, Eg, e E^, W e X serem diferentes dos resíduos de aminoácidos presentes nas posições correspondentes da insulina humana e, pelo menos um dos restos de aminoácidos representados por E^, Eg, E^, E^, W, X, Y e Z e o grupo representado por R serem escolhidos de tal modo que o composto de fórmula geral I possua pelo menos mais uma carga do que a insulina humana, a um valor do pH igual a 7·

Um subgrupo de compostos de fórmula geral I constitui um conjunto de compostos novos de fórmula geral na qual As letras A e B seguidas dos números representam os fragmentos peptídicos das cadeias A- e B- indicados, E^, Eg, e

E^, iguais ou diferentes, representam, cada um, um resíduo de ácido glutâmico. ou um resíduo de um aminoácido neutro que pode ser codificado por sequências nucleotídicas, X representa um resíduo de L-treonina, L-arginina ou L-lisina, Y e Z, iguais ou diferentes, representam cada um um resíduo de um aminoácido em que qualquer grupo amíno de cadeia lateral pode ser acilado ou em que qualquer grupo hidroxi de cadeia late ral pode ser alquilado, m e n, iguais ou diferentes, represen tam, cada um, zero ou um, R representa um resíduo de um grupo amido ou de um éster que bloqueia o grupo carboxílico do terminal C da cadéia-B e W é diferente de um resíduo de aspara gina.

Comparada com a insulina humana, obtem-se a alteração na carga mediante a substituição de um resíduo de treonina na posição B-27 por um resíduo de arginina ou de lisina e/ou a substituição de qualquer um dos quatro resíduos de ácido glutâmico nas posiçães Aà-, A17-, B13- © B21- por um resíduo de um aminoácido neutro, de preferência por um resíduo de glutamina. Além disso, o grupo carboxílico do terminal-C da cadeia-B pode ser bloqueado por um grupo éster ou por um grupo amido, que elimina portanto a carga negativa do grupo carboxílico. Também se pode introduzir uma carga positiva por meio de um resíduo de um aminoácido básico na posição B30e/ou na posição B31-.

Dado que os compostos de fórmula geral I podem ser aplicados na clínica sob a forma de soluções de acção prolongada, pode ocorrer uma diminuição na imunogenicidade quando comparada com a das soluções de insulina humana ou por-

cina utilizadas correntemente grau de prolongamento da acção pode ser re forçado e controlado mediante a adição de iões zinco.

Os parâmetros principais que controlam o grau de prolongamento do efeito da insulina são a concentração de zinco e a escolha do composto de fórmula geral I. Os limites para o teor de zinco preferidos estão compreendidos entre cerca de 0 a cerca de 2 mg/ml, de preferência entre 0 e 200/ig/ml de zinco com substituição na posição B13 e/ou B27 e de preferência de cerca de 20 a 200 /ig/ml com outros análogos numa pre paração que contém 2k0nmoles/ml de um composto de fórmula geral I. Utilizando-se outras concentrações do composto de fórmula geral I o teor de zinco tem de ser ajustado de uma forma correspondente.

A acção prolongada das soluções de compostos de fórmula geral I na presença de iões zinco é atribuída à reduzida solubilidade de tais compostos a um pH neutro.

pll da solução injectável desta invenção deve estar de preferência abaixo do pH fisiológico porque, a pH superior, ocorre a precipitação. A um valor de pH fisiológico, os compostos de fórmula geral I da presente invenção possuem uma solubilidade baixa. Tem-se obtido soluções estáveis contendo cerca de 24-0 nmoles/ml de compostos de fórmula geral I a um pH de cerca de 5,5. 0 limite superior depende dos constituintes da solução por exemplo de um agente isotónico de um conservante e da concentração de zinco e da escolha do composto de fórmula geral I. Não há limite inferior de pH para as soluções e / a estabilidade química dos compostos de fórmula geral I nos quais W é diferente da asparagina, é elevada ainda que a um pH3. Os limites de Ph preferidos para as soluções injectáveis da presente invenção situam-se entre cerca de 2,5 θ 8,5, dl·® preferência entre cerca de 4,5 e 8. Limites de pH especialmen te preferidos situam-se entre cerca de 2,5 e 5,5 ® os mais preferidos entre cerca de 3 e 4,5*

Um outro aspecto da presente invenção reside no facto de ela proporcionar uma melhor flexibilidade aos doentes. Com duas soluções aquosas, uma contendo um composto, de fórmula geral I e outra contendo um sal de zinco, o doente pode obter o grau desejado de uma acção prolongada e um per fil desejado mediante a mistura apropriada das duas soluções. Assim, o doente tem, utilizando as duas soluções em stock a possibilidade de escolher uma acção e um perfil para a inje£ ção da manhã e uma outra acção e um outro perfil para a inje_c ção da tarde. De preferência, a solução de zinco da presente invenção contém entre cerca de 2yug e 20 mg de zinco por ml. Alternativamente,ambas as soluções em stock podem conter zinco, quer na mesma concentração quer em concentrações diferentes e/ou ambas as soluções em stock podem conter um composto de fórmula geral I quer o mesmo quer um composto diferente.

De preferência, as soluções injectáveis da presente invenção possuem uma potência compreendida entre cerca de 6C e 6000 nmoles de composto de fórmula geral I por ml.

Quando o símbolo W não representa a L-asparagina, pode representar um L-aminoácido neutro, por exemplo valina, glutaraina, isoleucina, leucina, fenilalanina, tirosina,

metionina ou, de preferência, glicina,serinajtreonina,alanina ou homoserina. 0 símbolo W pode representar um aminoácido acídico, como ácido glutamico ou preferivelmente ácido aspártico ou um aminoácido básico, como, lisina, arginina ou, de preferência, histidina.

aminoácido neutro a Et) é, por exemplo, glicina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina, tirosina, metionina ou, de preferência, asparagina, glutamina, alanina, serina ou treonina.

São exemplos de radicais éster, representados pelo símbolo R, os grupos alcoxl inferior, de preferência metjo xi, etoxi e mais preferivelmente butoxi terciário.

Além disso, o símbolo R pode representar um grupo de fórmula geral -NR^R^ na qual os símbolos R^ e R iguais ou diferentes, representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior. Aqui o termo inferior” significa que o grupo em questão contém menos do que 7 átomos de carbono, de preferência menos do que 5 átomos de carbono. Nos casos preferidos, da presente invenção, o símbolo R representa um grupo -NH^. Além disso, o símbolo R pode representar um resíduo de lactama que contém, de preferência, menos que 8 átomos no anel lactâmico, por exemplo uma lactama de um ácido diaminocarboxílico.

Nos casos preferidos da presente invenção, o símbolo R não possui carga.

De acordo com o aspecto preferido da presente invenção, os resíduos de aminoácido designados por Y e Z são

resíduos de L-aminoácidos que são codificados por sequências nucleotídicas.

Qualquer grupo amino de cadeia lateral, nos resíduos de aminoácidos representados por Y e Z, podem ser aci^ lados por meio de um ácido que contenha entre 2 e 18 átomos de carbono, de preferência um ácido gordo contendo de 6 a 18 átomos de carbono, por exemplo, ácido láurico. Assim, -Y^-Z^-R pode representar -LisÍLauJ-NH^.

Exemplos de grupos hidroxi alquilados preferidos são os grupos metoxi, etoxi e butoxi terciário.

Num grupo preferido de compostos de fórmula geral I, os símbolos Y e/ou Z representam um resíduo de aminoácido básico, no qual o grupo amino da cadeia lateral eventualmente acilado (m = 1).

Num outro grupo de compostos preferidos de fórmula geral I, o símbolo n representa zero e o símbolo Y representa um resíduo de aminoácido básico (m = 1).

Ainda num outro grupo de compostos preferidos de fórmula geral I, os símbolos Y e Z representam ambos re_ síduos de aminoácidos alcalinos (m = 1, n = 1).

Um outro aspecto preferido da presente inven ção, consiste nas preparações que contêm um composto de fórmu tam um resíduo de glutamina e/ou o símbolo X representa Lys ou Arg, e o símbolo V representaGH,Ser,Tre, Ala, His, Asp, ou hSer e, dentro desta sub-classe de compostos de fórmula geral I, um outro aspecto preferido consiste nas preparações que *5Λ contêm um composto de fórmula geral I na qual o grupo de fórmula geral -Y -Z -R representa -T.ié -NH_O ou -Lis-NH_O.

ΙΏ XI

Os compostos específicos preferidos, de fór mula geral I, são os seguintes:

Gl_i ^A21,Ll=^B27,T_re^B3°

A21 _ . B27 ™ B30

Tre ,Lis ,Tre

Ser^A21,Lis^B2LTre^B3°

His^A21,Ll₅ ^B2\Tre^B30 . A21 —. B27 „ B30

Asp ,Lis ,Tre _A A21 . B27 _ B30

Asp ,Arg ,Tre

Ala^A21,Ar_e ^B27,Tre^B3°

Ser^A21 ₁Ar_g ^B27,Tre^B30 . Λ21 . B27 _ B30

Gli ,Arg ,Tre _m A21 _A B27 ™ B30

Tre ,Arg ,Tre _Α1 A21 _. B27 „ B30

Ala ,Lis ,Tre

H1S^A21,Ar_g ^B27,Tre^B3°

-NH₂	insulina	humana,
'-nh₂	insulina humana
’-HH₂	insulina	humana,
^LnH2	insulina	humana
-nh₂	insulina	humana,
’-nh₂	insulina	humana,
’-nh₂	insulina	humana,
-nh₂	insulina	humana,
-nh₂	insulina	humana,
-nh₂	insulina	humana,
-nh₂	insulina	humana,
	insulina humana

Gln^B’^L3,Gli^A21,Arg^B27,Tre^B3^-NH₂ insulina humana,

Gln^B13,Ser^A21,Arg^B27,Tre^B30-NH₂ insulina humana,

Gln^B13,Tre^A21,Arg^B27,Tre^B3°-NH₂ insulina humana,

Gln^B13,Ala^A21,Arg^B27,Tre^B30-NH₂ insulina humana,

Gln^B13,His^A21,Arg^B27,Tre^B3°-NH₂ insulina humana,

Gln^B13,Asp^A21,Arg^B27,Tre^B30-NH₂ insulina humana,

Gln^B13,Gli^A21,Lis^B27,Tre^B30-NH₂ insulina humana, «· ·*>

01η^Β^^,3βΓ^Α2^,Βΐ8^Β27,Τηβ^Β^θ-ΝΙΙ₂ insulina humana,

Gln^B13,Tre^A21,Lis^B27,Tre^B30-NH₂ insulina humana,

Gln^B1^,Ala^A21,Lis^B27,Tre^B^°-NH₂ insulina humana,

Gln^B13,His^A21,Lis^B27,Tre^E3°-NH2 insulina humana, Gln^B'*'^,Asp^A2^,Lis^B2í ,Tre^B^^B-NH2 insulina humana

Um outro aspecto preferido da presente invenção s3o as preparações que contêm um composto de fórmula geral I na qual o símbolo m representa um, α símbolo n repr£ senta zero e o símbolo Y representa Tre, Ala ou Ser, o símbolo R representa um grupo hidroxi e o símbolo w representa Gli, Ser, Tre, Ala, His ou Asp e, como exemplo de tais compostos, temos os seguintes:

. A21 _T . B27 Asn ,Lis _ A21 _T. B27 Ser ,Lis	insulina humana, insulina humana,
4.21 B27 Tre ,Lis ¹	insulina humana,
_A- A21 . B27 Ala ,Lis	insulina humana,
_ττ. A21 _ . B27 His ,Lis	insulina humana,
_A A21 _T. B27 Asp ,Lis	insulina humana,
.A21 _. B27 Gli ,Lis	insulina humana,
. A21 . B27 Asn ,Arg	insulina humana,
_ο A21 . B27 Ser ,Arg	insulina humana,
Tre^A!!W²⁷	insulina humana,
Ala^A21,Arg^B27	insulina humana,
A21 . B27 His ,Arg	insulina humana,

Asp^A2^,Arg^B27 insulina humana,

Gli^v2\ Arg^B2’⁷ insulina humana,

-- A17 * A21 . B27 Gin ,Asn ,Arg	insulina	humana,
Gln^A17,Ser^A21,Arg^B27	insulina	humana,
Gln^A17,Tre^A21,Arg^B27	insulina	humana,
__Ί AI 7 *i_A21 . B27 Gin ,Ala ,Arg	insulina	humana,
A17 A21 . B27 Gin ,His ,Arg	insulina	humana,
__ A17 . 421 . B27 Gin ’,Asp ,Arg	insulina	humana,
AI7 «ί -A21 λ ^B27 Gin ¹,Gli ,Arg	insulina	humana,
A17 _A A21 B13 Gin ,Asn ,Gln	insulina	humana,
A17 _β A21 B13 Gin ,Ser ,Gln	insulina	humana,
A17 „ A21 B13 Gin ,Tre ,Gln	insulina	humana,
A17 _A, A21 B13 Gin ,Ala ,Gln	insulina	humana,
A17 A21 B13 Gin ,His ,Gln	insulina	humana,
Gln^A17,A_Sp^A21,Gln^B13	insulina	humana,
Gln^A17,Gll^A21,Gln^B13	insulina	humana,
Arg^B27,A»n^A21,Gln^B13	insulina	humana,
Arg^B27,Ser^A21,Gln^B13	insulina	humana,
Arg^B27,Tre^A21,Gln^BA3	insulina	humana,
. B27 A21 „._B13 Arg ,Ala ,Gln	insulina	humana,
_A B27 A21 B13 Arg *,His ,Gln	insulina	humana,
. B27 . A21 __ B13 Arg ,Asp ,Gln	insulina	humana,
_A B27 «,.A21 B13 Arg ,Gli ,Gln	insulina	humana,

A17 . A21 _. B27 Gin ,Asn ,Lxs	insulina	humana,
A17 _c A21 _. B27 Gin ,Ser ,Lxs	insulina	humana,
A17 rn A21 _ . B27 Gin ,Tre ,Lxs	insulina	humana,
A17 A21 _T . B27 Gin ,Ala ,L±s	insulina	humana,
A17 A21 _ . B27 Gin ',Hxs ,Lis	insulina	humana,
A17 _Λ A21 _τ. B27 Gin ,Asp ,Lxs '	insulina	humana,
A17 . A21 _ . B27 Gin ,Glx ,Lxs	insulina	humana,
B13 . A21 _T. B27 Gin ,Asn ,Lxs	insulina	humana,
B13 _ A21 _T . B27 Gin ,Ser ,Lxs '	insulina	humana,
B13 _m A21 _T. B27 Gin ,Tre ,Lxs *	insulina	humana,
B13 _A, A21 _. B27 Gin ,Ala ,Lis	insulina	humana,
B13 r_T. A21 _ . B27 Gin ,His ,Lxs	insulina	humana,
B13 λ A21 _. B27 Gin ,Asp ,Lxs	insulina	humana,
B13 .A21 _T . B27 Gin ,Glx ,Lxs	insulina	humana.

Em um grupo preferido de compostos de fórmula geral I, os símbolos Eg e representam um resíduo de glutamina.

Num outro grupo preferido de compostos de fórmula geral I, o símbolo X representa um resíduo de arginina ou de lisina.

Ainda num outro grupo preferido de compostos de fórmula geral I, o símbolo W representa Gli, Ser, Tre, Ala, His, Asp ou hSer.

Como se sabe da técnica anterior, nem todos os

resíduos de aminoácidos da insulina humana são essenciais para a acção da insulina.

De facto, a insulina porcina e a insulina bovi na,que diferem da insulina humana nos resíduos de aminoácidos, têm sido utilizadas no tratamento de diabéticos. Existem variações consideráveis de espécie para espécie na molécula da insulina. Assim, podem-se trocar muitos resíduos de aminoácidos na molécula da insulina humana, sem diminuição prejudicial da actividade da insulina, incluindo alguns resíduos que influenciam o ponto isoeléctrico da molécula.

E óbvio que os grupos designados por E^, E^, E^, R, W, X, Y e Z são para seleccionar de tal modo o composto de fórmula geral I resultante seja aceitável ^E2’ que sob o ponto de vista farmacêutico.

Nas preparações conhecidas de insulina bifásica, é usual associar-se, na mesma injecção à insulina solúvel de acção rápida e prolongada com insulina cristalina. Utilizando-se os compostos de fórmula geral I da presente invenção, pode-se obter uma associação similar que combina a acção rápida com a acção prolongada por meio de uma solução de um único composto de fórmula geral I. A proporção entre o efeito de acção prolongada e da acção curta diminui à medida que a concentração em iões zinco na solução aumenta.

Os compostos de fórmula geral I podem preparar-se por meio de uma reacção de transpeptidação em que se faz reagir um composto precursor bio-sintético que possui as pontes de dissulforeto de insulina correctas, de fórmula geral

Χ-Β(26-22)-Ε^-Β(2Ο-14)-Ε₃-Β(12-1) (II)

B(28-29)-(Q_q-T)_r-A(l-3)-E₁-A(5-16)-E₂-A(18-20)-W na qual

A e B, seguidos dos números entre parêntesis representam os fragmentos peptídicos apropriados das cadeias

A- e B- indicados pelos números entre parêntesis, R representa uma cadeia peptídica composta por q aminoáciI dos em que q representa um número inteiro de 0 a 33,

T representa lisina ou arginina, r representa zero ou um e E^, E^, E^, E^, W e X têm os significados definidos antes, com um composto amínico de fórmula geral

H-Y -Z -R (lll) m n ^v ' na qual

Y, Z, R, m e n têm os significados descritos antes e em que os grupos hidroxi e amino da cadeia lateral, representados pelos símbolos Y e Z estão eventualmente bloqueados por grupos amínicos ou hidroxílicos protectores utilizando-se como catalisador um enzima que pode ser a tripsina ou um enzima equivalente, no seio de uma mistura de água e dissolventes orgânicos, analogamente ao que se descreve na patente de invenção norte-americana N? 4.3^-3.89&· Quando o símbolo representa hSer, introduzem-se nucleótidos que codificam para Met no sítio A21 do gene. A conversão expressa da proteína de Met em hSer é realizada por meio do brometo de cianogénio.

Os compostos de fórmula geral III preferidos para utilizar

derivados por meio de acilação com ácidos gordos. Os grupos hidroxi podem ser protegidos por meio de alquilação. Se os grupos representados pelos símbolos Y e Z contêm grupos que são bloqueados dum modo reversível por meio de grupos protectores amino, estes grupos podem ser eliminados posteriormente, após a separação do grupo intermédio amínico protegido da trig sina ou do enzima idêntico à tripsina. Entre os enzimas idênti_ cos à tripsina é utilizável a lisil endopeptidase proveniente da Achromobacter lyticus.

Os compostos de fórmula geral II podem ser expressos num organismo hospedeiro tal como uma levedura semelhante a descrita no pedido de patente de invenção europeia publicado N? 163.529 que utiliza um gene que possui codões correctos para os aminoácidos em causa. 0 gene que codifica o novo derivado da insolina é em seguida inserido em um vector de expressão apropriado que, quando transferido para a levedu ra, é capaz de expressar o composto desejado. 0 produto expresso é em seguida isolado das células ou do caldo de cultura conforme este é ou não segregado pelas células.

Um exemplo do grupo protector amínico reversível é o grupo butoxicarbonilo terciário e o exemplo de um grupo protector do grupo hidroxi reversível é o grupo butilo terciário. Tais grupos eliminam-se em condições que não causem ai terações indesejáveis no composto de fórmula geral I, por exem pio, por meio do ácido trifluoroacético.

Podem introduzir-se alterações nas posições A4, A17, A21, B13, B21 ou B27, por meio de engenharia genética que permitam que a semi-síntese catalisada da tripsina introduza o resíduo do terminal C desejado na cadeia B.

A vantagem da introdução de cargas positivas adicionais na cadeia dos 51 aminoácidos da molécula de insulina, para formar os novos compostos de fórmula geral I em vez do prolongamento da cadeia B, além dos 30 resíduos das insulinas de mamífero, relaciona-se com a sua fácil preparação. Na trans peptidação semi-sintética, utiliza-se um largo excesso molar de amida de aminoácido ou de éster de aminoácido. Se se utiliza na reacção de transpeptidação uma amida dipeptídica ou um éster, quer o preço quer a solubilidade ou ambos, são proibitd. vos para a utilização deste grande excesso e consequentemente o rendimento do produto torna-se menor. Mesmo quando se utiliza um excesso equimolar idêntico de por exemplo, Lis(Boc)-NH₉ou Lis(Boc)-Lis(Boc)-NH2, 11a reacção de transpeptidação, em condições idênticas, o rendimento com a amida de aminoácido torna-se substancialmente mais elevado do que com amida dipeptí. dica.

As preparações de insulina da presente invenção preparam-se mediante a dissolução de um composto de fórmula geral I em um meio aquoso em condições ligeiramente ácidas, por exemplo numa concentração de 240 ou ÓOO nmoles por ml. Tor na-se o meio aquoso isotónico, por exemplo com cloreto de sódio, acetato de sódio ou glicerol. Além disso, o meio aquoso pode conter iões de zinco numa concentração até cerca de 30 de Zn por nmole de composto de formula geral I, tampões tal τ

^τ I . -7 / ·³como acetato, citrato e histidina e agentes conservantes tais coruo m-cresol, nipagin ou fenol. 0 valor de pH da preparação de insulina final depende do número de cargas que foram altera das no composto de fórmula geral I,da concentração em iões zinco, da concentração do composto de fórmula geral I e do composto de fórmula geral I escolhido, A justa-se o valor do pll para um valor conveniente para administração, tal como entre cerca de 2,5 e 4,5, para evitar a precipitação. Torna-se a preparação de insulina esterilizada por meio de filtração.

As preparações de insulina da presente invenção utilizam-se de um modo semelhante ao das preparações de in sulina conhecidas.

Qualquer nova característica ou associação de características descritas antes são consideradas essenciais para a presente invenção.

As abreviaturas de aminoácidos aqui utilizadas são as estabelecidas em’’J, Biol. Chem.”; 243; Ρ,355θ, 1968, Os aminoácidos aqui citados têm a configuração L, Na fórmula geral I e em qualquer outra citação, A(l-3) representa Gli-Ile-Val, A(5“6) representa Gln-Cis etc,, comparar com a sequência de aminoácidos da insulina humana, A menos que indicado de um modo diferente, as espécies de insulina aqui referidas são humanas,

Síntese de compostos de insulina

A fonte de insulina foi um precursor insulínico expresso em levedura como se descreve no pedido de patente europeia publicado N^ 163.529.

- 22 Recolheram-se os precursores da insulina de caldos de fermentação por meio de adsorção em LiChroprep RP-18, como descrito no Exemplo 7 no mesmo pedido de patente de invenção euro meia. Fez-se a eluição dos precursores duma coluna com KG1 0,2M, HC1 0,001 M em etanol a 33% (v/v). Os precursores da insulina cristalizaram no tanque por adições sucessivas de água (1 volume do tanque), citrato trissódico sólido, para se obter uma mo laridade de 0,05 M ^e finalmente acetato de zinco para se obter uma molaridade de 0,006 M. 0 valor de pH foi ajustado para 6,8 e deixou-se a mistura repousar durante a noite à temperatura de 4°C. Isolaram-se os cristais por meio de centrifugação, lavaram -se com água e secaram-se no vácuo.

Prepararam-se os aminoácidos protegidos e os péptidos protegidos para as semi-sínteses enzimáticas por métodos convencionais (habitualmente sínteses)ou por aquisição quer na Nova Biochem ou na Bachem, ambas da Suiça.

As letras TM após o nome indicam que se trata de uma marca registada

Nos exemplos até 14, o material inicial (Q -T)_r da fórmula geral II construído como se descreveu foi para escolhido para Ala-Ala-Lis e o plasmídio de levedura pMTólO do exemplo 10 no pedido de patente de invenção europeia r B13 publicado N? 163.529* Os nucleótidos que codificam para Gin ,

B17 . B27 B27 . A21 .A21 A21 _β A21 _Q - A21

Gin ‘, Arg , Lis , Asp , Gli , His , Ser e Tre , foram substituídos por pMTólO por meio de mutagenése local específica, utilizando-se o processo descrito em Nucl. Acids. Res.;ll 1983; p. 5103-5112.

Exemplo 1

PP *7

Síntese de insulina humana Gin Arg '

Adicionou-se a uma suspensão de 5 g do precursor de insulina Gln^³, Arg^^, b(1-29)-Ala-Ala—Lis-A(l-21) , em 50 ml de Tre-OBu^jCH^COCH 2 molar (éster de L- treonina. terci-butílico, hidroacetato) em dimetilformamida, 25 ml de água em dirnetilforraarjida a 25,5% (^v/^v) (²5,5 ml de água e dime tilformamida até perfazer 100 ml). Arrefeceu-se a suspensão até 12°C com agitação. Adicionou-se uma solução de 0,5 g de tripri. na porcina em 12,5 ml de uma solução aquosa a 0,05 M de acetato de cálcio. Manteve-se a agitação até à dissolução. Após 48 horas à temperatura de 12°C as proteínas precipitaram quando se verteu a solução sobre 600 ml de acetona. Isolou-se o precipitado por centrifugação, lavou-se uma vez com 200 ml de acetona, isolou-se por centrifugação e secou-se sob uma corrente de azoto. Dissolveu-se o precipitado em 100 ml de ácido clorídrico 0,04 N, ajustou-se o valor de pH para 2,5 e introduziu-se a solução numa coluna de cromatografia líquida preparativa de alta pressão de 5 x 30 cm (aqui designada por CLAP) cheia com partículas de sílica substituídas por octadecildimetilsililo (isto é, partículas de 15 micra com o diâmetro dos poros de 100 Angstr/m). A coluna foi equilibrada com etanol/solução aquosa de cloreto de potássio 0,3M, ácido clorídrico 0,001 N, numa pro. porção de 35,5/6^-,5 (partes por volume). Eluiram-se as proteínas da coluna com o mesmo tampão a uma velocidade de 2 litros por hora.

Num pico que emergiu da coluna entre 55 θ 100 mi

Τ>Ί Q Ρ3Π nutos, encontrou-se a insulina humana Gin , Arg , Tre -OBu\ Isolou-se a insulina humana Gln^^, Arg®^^, Tre^^*t Λ Z '

-OBu , do tanque por adições sucessivas de agua ate a concentra ção em etanol de 15 % (^v/^v) ^e de citrato trissódico sólido, para se obter uma molaridade de 0,05 M relativamente ao citrato e cl<> reto de zinco sólido para se obter uma molaridade de 0,006 M relativamente ao zinco.

Agitou-se o valor de pH para 6,8 e, após 1 hora à temperatura ambiente, a cristalização continuou a temperatura de 4°C durante 24 horas com agitação. Os cristais foram retirados por meio de uma colher, foram lavados duas vezes com 20 ml de água arrefecida com gelo, retirados novamente e secos em váRI 3 B27 cuo. Rendimento; 2,51 g de insulina humana Gin , Arg , „ B30 t

Tre ^J -OBu .

Dissolveu-se a insulina humana Gln^^^, Arg^-*³^^,

Tre ^J -OBu em 100 ml de ácido trifluoracótico e deixou-se 2 ho ras á temperatura ambiente. Eliminou-se o ácido trifluoracótico por meio de liofilização. Dissolveu-se o liofilizado em 100 ml | de água, ajustou-se o valor do pH para 2,5 e adicionou-se 20g de cloreto de sódio. Isolou-se por centrifugação o sal sólido

B13 B27 que constituído por insulina humana Gin , Arg ', Dissolveu

B13 -se o sal sólido em 850 ml de água e a insulina humana Gin , Arg ‘ cristalizou por adições sucessivas de 150 ml de álcool etílico, 14,7 g de citrato trissódico dihidratado e 0,82 g de cloreto de zinco apresentando-se a seguir o valor de pl-l para 6,8. Após uma hora á temperatura ambiente, continuou a cristalização á temperatura de 4°C durante 24 horas com agitação cui. dadosa. Retiraram-se os cristais, lavaram-se duas vezes com

ml de água arrefecida em gelo e secaram-se no vácuo. Rendijáj o mento: 1,71 g de insulina humana Gin , Arg ' correspondendo a 36 %.

A composição de aminoácidos estava de acordo com a teoria havendo dois resíduos de arginina por molécula. 0 produto mostrou-se puro quando analisado por electroforese de Disco PAGE, a uma velocidade de migração de 55 % da insulina humana, correspondendo a uma diferença nas cargas de cerca de 2. Para os pormenores da análise por electroforese de Disco PAGE, ver *Horm. Metab.Res.; Suplementos da série N9 5? 197’'·; p. 134. 0 teor de zinco nos cristais era de 0,42 % (peso em peso).

Exemplo 2-6 .r i ry _pi o

Síntese de insulina humana Gin “ , GlrV' '', insu

B27 *17 B27 lina humana Arg ~ ‘ , Gin' ‘ , insulina humana Arg , insulina humana Lis^B ⁷, e insulina humana Arg^'⁷, His²'.

Sintetizaram-se os 5 compostos em título a partir dos prensares insulínicos de cadeia única correspondentes, viz. Gln^B13,Gln^A17,B(l-29)-.Ua-Ala-Lis-A(l-21), Gln^A17,Arg^B27,B(1-29)-Ala-Ala-Lis-A(1-21), Arg^B27,B(1-29)-Ala-Ala-Lis-A(1-21), Lis^B27,B(l-29)-Ala-^Ala-Lis-A(l-21) e His^A21,Arg^B27,B(l-29)-Ala-Ala-Lis-A(l-21), utilizando os métodos descritos no Exemplo 1. Rendimentos, cargas relativas à in sulina humana, velocidades de migração relativas à insulina em eletroforese DISC PAGE a um pK de 8,9 e desvios nas composi- 26 ções de aminoácidos da insulina humana, representam-se no Quedro I a seguir.

Exemplos 7-13

Síntese de insulina , . A21 . B27 B30 ,_TTT humana Asp , Arg , Tre -NH₂, insulina humana insulina humana insulina humana

-nh₂, insulina humana .Λ21 _A B27 B13 π, B30

Gli ,Arg ’,Gln ,Tre

A21 . B27 __ 313 B30 ._TTT

Ser ,Arg ,Gln ,Tre -NH₉, insulina humana

Tre^A21,Arg⁵²⁷,Gin³¹ ⁵,Tre^B3°-NH₂, e insulina humana _σ Λ21 . B27 _m B30 „_TT

Ser ,Arg ,Tre -NHp

Sintetizaram-se os sete compostos em título a partir dos precursores de insulina de cadeia simples correspon dente, viz.

Asp^A21,Arg^B27,B(1-29)-Ala-Ala-Lis-A(1-21), Gli^A21,Arg^B27,B(l-29)-Ala-^Ala-Lis-A.(l-21) , Ili s^A21, Ar g^{B2 7}, B (1 -2 9 ) - Al a-Ala-L 1 s - A (1 -21) , Gli^A21,Arg^B27,Gln^B13,B(l-29)-Ala-Aia-Lis-A(l-21),

Ser^A21, Arg^B27,Gin⁵¹-³,B( 1-29)-Ala-Ala-Lis-A(l-21) , Tre^A21,Arg^B27,Gln^B13,B(I-29)-Ala-Ala-Lis-A(1-21) e Ser^A21,Arg^B27,B(l-29)-Ala-Ala-Lis-A(l-21) por meio de transpeptidação tríptica no seio cie uma solução aquosa orgânica, na presença de Tre-NHg, como descrito no pedido de patente de invenção europeia N^T2 194.864, Exemplos 4 e 6. Rendimentos, cargas relativas à insulina humana, velocidades de migração relativa à

insulina humana em electroforese Disc PAGE a um pH 8,9 e de_s vios nas composições de aminoácidos da insulina humana repre sentam-se no Quadro I.

Exemplo 14

Síntese de insulina humana Asp^\ Arg^^, Lis^O -NH_n

Sintetizou-se o composto em título a partir do precursor insulínico de cadeia simples correspondente, Viz. AspA'~l_y Arg^^, B (1-29)-Ala-Ala-Lis-A( 1-21) por meio de transpeptidação tríptica no seio de uma solução aquosa or gânica na presença de Lis (Βοο)θ^θ-ΝΉ2, purificação do compos^ to intermédio insulina humana Lis (BocJ^^-NIL, , seguida de eliminação do grupo protector Boc por meio de TFA como descrito no pedido de patente de invenção europeia publicado NS 194 864, Exemplos 5 ® 7* θ rendimento e os dados analíticos mostram-se no Quadro I.

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Exemplo 15

Preparação de soluções injectáveis de compostos de fórmula geral I

Prepararam-se soluções injectáveis estéreis dos compostos de fórmula geral I para ensaio do grau de acção prolongada, utilizando-se como agente isotónico glicerol a 1,6$ ( peso em volume), m-cresol a 0,3$ (peso em volume) como agente conservante e como agente tampão acetato de sódio 0,01 molar, A concentração em iões zinco foi entre 8 e 80 pg/ml. Os valores de pH das soluções foram ajustados suficientemente afastados do ponto isoeléctrico dos compostos de fórmula geral I para manter as soluções límpidas após armazenagem à temperatura de 4° C. As soluções continham 240 nmoles/ml dos compostos de fórmula geral I. A concentração de 240 nmoles/ml foi es^ tabelecida por meio de avaliação da absorváncia a 276 nm de uma solução armazenada mais concentrada, isenta de metacresol, utilizando-se um coeficiente de extinção molar para a insulina porcina de 6100 para estes derivados (ver Handhuch der Inneren Medizin, Vol. 7/Part 2A, Editor: Oherdisse; 1975; 113 p.). Para a insulina porcina como monocomponente a potência estabelecida foi de 28,5 U/mg de substância seca (ver Diabetes Care; Vol. 6/Supplement 1; 1983; p. 4) viz. Uma unidade correspondente a 5,95 nmoles.

Prepararam-se as soluções injectáveis que continham 240 nmoles/ml de compostos de fórmula geral I, representadas no Quadro II e que tinham os valores de pH e

conteúdo de zinco aí indicados.

Ensaio do efeito de acção prolongado da insulina prolongamento do efeito hipoglicémico produzido pelas soluções injectáveis de insulina foi ensaiado de acordo com a Farmacopeia Britânica I98O, A 142, em coelhos em jejum. Cada solução do ensaio foi administrada por via sub-cutânea numa dose de 14,3 nmoles por coelho em doze animais com o peso compreendido entre 3 θ 4 kg. e o comportamento da hipoglicémia foi seguido durante 6 horas. Para comparação foram incluídas nos testes a preparação de acção imediata Actra

TM * pid de insulina porcina e a preparação de acção intermédia

TM

Monotard de insulina humana. Os resultados dos ensaios estão representados no Quadro II.

Compostos de Zn Glucose em percentagem da inicial fórmula geral I ^ug/ml pH 1 h 2h 4 h 6 h

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β H	β Η	fl H	fi k	β	β
•ri 0	•ri 0	•ri 0	•ri H	•ri	•ri

As potências dos compostos de insulina foram avaliadas por meio do teste de diminuição do açúcar no sangue de murganho (Farmacopeia Britânica I98O, p. A 141 - A 142). Com a finalidade de minimizar o problema da avaliação da potência das insulinas que possuem um tempo diferente do tempo normalizado, as soluções de insulina para as determinações de potência foram preparadas sem a adição de zinco. As soluções foram preparadas para conter 240 nmoles/ml fundamentadas na absorvância a 276 nm, 0 conteúdo de zinco das soluções situava-se entre 8 a 10 ^tig/ml partindo de derivados cristalinos.

As potências avaliadas de alguns compostos de insulina, indicam- se no Quadro III a seguir.

Quadro III

	Potência relativa à insulina, %	Limite de confiança
(P =	0,05)
A17 B27 insulina humana Gin ,Arg	69	79	- 62
B13 B27 insulina humana Gin ,Arg '	78	88	- 69
insulina humana Gln^B13,Gln^’¹^	50	63	- 4o
insulina humana Arg^BB^	87	95	- 80
insulina humana Lis '	88	97	- 80
, . , A21 _A B27 insulina humana Asp ,Arg ,
Tre^B30-NH₂	83	92	- 74
. A21 . B27 insulina humana Asp ,Arg ,
_T . B30 _ΆΤ„ Lis -NIL,	69	77	- 62
, . .A21 . B27 insulina humana Gli ,Arg ,
Tre^B30-NH„	75	83	- 68

Quadro III (Continuação)

	Potência relativa à insulina, $	Limite de confiança (P - 0,05), $
insulina humana His^'²^,Ai'’g^B2^	71	79 - 63
insulina humana His^A2\Arg^B2^, Tre^B30-NH₂	72	81 - 64
A21 B27 insulina humana Gli ,Arg , Gln^B13,Tre^B30-NH₂	49	54 - 44
A21 B27 insulina humana Ser ,Arg , _ηη B13 _ B30 _ΆΤΤΙ Gin ,Tre -NH₂	47	54 - 4o
insulina humana Gln^B13,Tre^B30-NH₂	28	32 - 24
A21 B27 insulina humana Ser ,Arg ', Tre^B3O-NH₂	76	83 - 68

Claims

Reivindicacões

1.- Processo para a preaparação de compostos de formula geral

A( 1-3)-E^AÍ 5-6 )-Cys-A( 8-16 )-E₂-A( 18-19 )-Cys-W

II ss

II s S(I)

I1'

B(1-6)-Cys-B(8-12)-E₃-B(14-18)-Cys

I

R-Z_n-Y_m-Lys-Pro-X-B(26-22)-E₄-Gly na qual

A e B seguidos pelos numeros entre parênteses representam, cada um, respectivamente, fragmentos das cadeias A- e B-, indicadas pelos numeros entre parênteses, , , Eg e , iguais ou diferentes, representam (cada um, um resto de ácido glutâmico ou de um aminoácido neutro, que pode ser codificado por sequências nucleotídicas,

X representa um resto de L-treonina, L-arginina ou L-lisina,

Y e Z, iguais ou diferentes, representam, cada um, um resto de um aminoãcido, em que qualquer grupo amínico da cadeia lateral pode ser acilado ou cada grupo hidroxi da cadeia lateral pode ser alquilado,

M e N, iguais ou diferentes, representam, cada um, zero ou 1,

R representa um grupo hidroxi ou um resto amidíco ou éster que bloqueia o grupo carboxílico C-terminal da cadeia-B,

W representa um resto de aminoãcido, com a condição de quando W representa asparagina R representa um grupo hidroxi ou quando W representa um resto asparagina X e -Y -Z -R representam, cada um, um resto treonina, E„ m n ^r ’ 3 representa um grupo glutamina, E^, e E^ não representam todos três, restos de ãcido glutâmico e, ainda, com a condição de pelo menos um dos seis restos de aminiácidos representados por E^, E? , Eg, , W e X serem diferentes dos restos de aminoácidos presentes nas posições correspondentes da insulina humana e, pelo menos, um dos restos de aminoácidos representados por E^

E₂, E₃, E_u, W, X, Y e Z e o grupo representado por

R serem escolhidos de tal modo que o composto de formula geral I possua pelo menos mais uma carga do que a insulina humana,a um valor do pH igual a 7, caracterizado pelo facto de se realizar a transpeptizaçao de um composto precursor da insulina de fórmula geral

X-B(26-22)-E_u-B(20-11)-E₃-B(12-1)

B(28-29)-(Q -T) -A(l-3)-E.-A(5-16)-E₉-A(18-20)-W (II) q r 1 z na qual

A e B representam os fragmentos das cadeias A- e β_ Indicadas pelos numeros entre parênteses,

Q representa uma cadeia peptídica composta por o aminoácidos em que q representa um numero inteiro de 0 a 33,

T representa lisina (Lys) ou arginina (Arg), e r representa zero ou 1 e

E^, E₂, E₃, Ε_μ, w e X. têm os significados definidos antes, com um composto de fórmula geral

Η-Y -Z -R (III) m n na qual

Y, Z, R, m e n tém os significados definidos antes e em que os grupos hidroxi e amino da. cadeia lateral representados pelos símbolos Y e Z são eventualmente bloqueados por grupos amínicos ou hidroxílicos protectores e de se utilizar como catalisador um enzima tripsina ou semelhante â tripsina.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual X representa um resto de lisina ou arginina, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.
3. - Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual E£ .e E^ representam, cada um, um resto de glutamina, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.
4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

1 a 3, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual Y e/ou Z representam, cada um, um resto de aminoácido básico em que a cadeia lateral contém um grupo amínico eventualmente acilado e m representa o numero 1, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.
5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

1 a 4, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual n representa zero e Y representa um resto de um aminoácido básico e m o numero 1, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

1 a 5, para a preparação de compostos de formula geral I na qual Y e Z representam, cada um, restos de aminoácidos básicos em que m e n representam, cada um, o numero 1, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.
7, - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

1 a 6, para a preparação de compostos de formula geral I na qual R representa um grupo de fórmula geral em que R e R?» iguais ou diferentes, representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior ou R representa, de preferência, um grupo -NH₂, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.
8, - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

1 a 6, para a preparação de compostos de fórmula geral I na quaZ R representa um grupo alcoxi inferior, de preferência butilóxi terciário, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.
9, - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

1 a 6, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R representa um resto de uma lactama contendo um anel de preferência constituído por menos de oito átomos, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos .
10.— Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações

1 a 9, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual

-40W, diferente de asparagina, representa um resto de um aminoãcido, de preferência, Gly, Ser, Thr, Ala, His, Asp ou hSer, caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.
11.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação dos compostos de formula geral I seguintes: insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina humana-Gly^A21,Lys®²⁷,Thr^B30-NH humana-Ser^A21,Lys®²⁷,Thr^B30-NH humana-Thr^A21,Lys^B27,Thr^B30-NH2 humana-Ala^A21,Lys^B27,Thr^B30-NH_ humana-His^A21,Lys^B27,Thr^B30-NH2 humana-Asp^A21,Lys®^{2 7},Thr^B3 °-NH2 humana-Gly^A21,Arg®²⁷,Thr^B30-NH humana-Ser^A21,Arg®^{2 7},Thr^B30-NH humana-Thr^A21,Arg^B27,Thr^B30-NH humana-Ala^A21,Arg^B27,Thr^B30-NH humana-His^A21,Arg^B27,Thr^B30-NH humana-Asp^A21,Arg^B27,Thr^B30-NH2 humana-Gln®¹³,Gly^A21,Arg®^{2 7},Thr^B30-NH humana-Gln^B13,Ser^A21,Arg®²⁷,Thr^B30-NH²humana-Gln^B13,Thr^A21,Arg^B27,Thr^B30-NH²humana-Gln®¹³,Ala^A21,Arg®²⁷,Thr^B30-NH humana-Glr®¹³,His^A21,Arg®²⁷,Thr^B30-NH2 humana-Gln^B13,Asp^A21,Arg^B27,Thr®³⁰-NH2 humana-Gln®¹³,Gly^A21,Lys®²⁷,Thr^B30-NH2 humana-Gln®¹³,Ser^A21,Lys®²⁷,Thr^B30-NH humana-Gln®¹³,Thr^A21,Lys®²⁷ ,Thr^B30-NH²humana-Gln®¹³,Ala^A21,Lys®²⁷,Thr^B30-NH²humana-Gln®¹³,His^A21,Lys®²⁷,Thr^B30-NH²humana-Gln®¹³,Asp^A21,Lys®²⁷,Thr^B30-NH2 humana-Asn^A21,Lys®²⁷humana-Ser^A21,Lys®²⁷

-41insulina insulina ínsuTíha insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina ins-ulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina humana- Thr^A2^ _f Lys^B27humana-Âla^A2l,Lys^B27humana-His^A2l,Lys^B27humana- Asp^A2i,Lys^B27humana-Gly^A21,Lys^B27. . A21 . B27 humana-Asn ,Arg humana-Ser^A23,Arg^B27humana-Thr^A23,Arg^B27humana-Ala^A21,Arg^B27humana-His^A21,Arg^B27humana- Asp^A21,Arg^B27#Lys^B30-NH₂humana-Asp^A23,Arg^B27humana-Gly^A23,Arg^B27humana-Gln^A17 hsn^k21, Arg^{B2 7}humana-Gln^A37,Ser^A21,Arg^{B2 7}humana-Gln^A17,Thr^A21,Arg^B27humana-Gln^M7, Ala^A21 ,Arg^B27humana-Gln^A17,His^A21,Arg^B27humana-Gln^A17 , Asp^A21, Arg^B27humana-Gln^A^⁷,Gly^A2^,Arg^B27humana-Gln^A17,Asn^A21,Gln^B13humana-Gln^A17,Ser^A23,Gln^B13humana-Gln^A17,Thr^A21,Gln^B13humana-Gln^A17,Ala^A21,Gln^B13humana-Gln^A17,His^A2I,Gln^B13humana-Gln^A17,Asp^A21,Gln^B13humana-Gln^A17,Gly^A21,Gln^B13huinana-Arg^B27 , Asn^A21, Gln^B13humana-Arg^B27,Ser^A21,Gln^B13humana-Arg^B27,Thr^A21,Gln^B13humana-Arg^B27,Ala^A2^,ΰ1η^Β^³humana-Arg^B27,His^A23,Gln^B13humana-Ârg^B27,Asp^A21,Gln^B13humana-Arg^B27,Gly^A21,Gln^B13

-42insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina insulina humana-Gln^A17,Asn^A21,Lys^B27humana-Gln^A17,Ser^A21,Lys^B27human -Gln^A17,Thr^A21,Lys^B27humana-Gln^A17,Ala^A21 _/Lys^B27humana-Gln^A17,His^A21,Lys^B27humana-Gln^A17,Asp^A21,Lys^B27humana-Gln^A37,Gly^A2^,Lys^B27humana-Gln^B13,Asn^A21,Lys^{B2 7}humana-Gln^B13,Ser^A21,Lys^B27humana-Gln^B13,Thr^A21,Lys^B27humana-Gln^B13,Ala^A21,Lys^B27humana-Gln^B13,His^A21,Lys^B27humana-Gln^B13,Asp^A21,Lys^B27humana-Gln^B13,Gly^A21,Lys^B27humana-hSer^A21, Arg^B27, Thr^B30-NH

2 j caracterizado pelo facto de se utilizar compostos iniciais correspondentemente substituídos.
12.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas injectáveis, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de um composto de fórmula geral I, preparado pelo processo, de acordo com a reivindicação 1, como ingrediente activo, com um veículo apropriado aceitável em farmácia.
13. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de a referida solução conter iões de zinco, de preferência em uma quantidade compreendida entre 2pg e 2mg por ml, mais preferivelmente entre 5/ag e 200^ug de zinco por ml.
14. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas de acção mais duradora, caracterizado pelo facto de se misturar uma solução de um composto de fórmula geral I de acordo com a rei vindicação 11, em uma quantidade eficaz, como ingrediente activo, com uma solução contendo uma quantidade de zinco compreendida, de preferência, entre 10pg e 20mg por ml.
15.- Processo de acordo com a reivindicação 12, para a preparação de composições farmacêuticas injectaveis, eventualmente contendo zinco, caracterizado pelo facto de se misturar as referidas soluções dos compostos de fórmula geral I com uma solução contendo zinco e, eventualmente, um composto de fórmula geral I, de tal modo que a mistura possua uma concentração superior a 2mg de zinco por ml e que o teor de zinco em cada uma das duas soluções seja de preferência inferior a Umg/ml,