DD274631A5 - Verfahren zur biologischen herstellung von amiden - Google Patents

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Hideaki Yamada
Toru Nagasawa
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids, in dem ein Nitril durch Einwirkung einer in einem Mikroorganismus entstehenden Nitrilhydratase zu einem entsprechenden Amid hydratisiert wird. Die Verfahrensverbesserung umfasst die Verwendung einer Nitrilhydratase, die durch Zuechtung eines Mikroorganismus der Gattung Rhodococcus rhodocrous in Gegenwart eines Kobaltions gewonnen wird. Aromatische Nitrils, wie z. B. Zyanopyridin, und aliphatische Nitrile, wie z. B. Akrylonitril, werden zu den entsprechenden Amiden hydratisiert.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur biologischen Herstellung von Amiden, wie das zum Vitamin-Bj-Komplex gehörige Nicotinamid sowie das als Tuberkulostatikum zu verwendende Pyrzinamid, durch Hydratisierung eines Nitrils.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik Durch Hydratisierung eines Nitrils, zum Beispiel Akrylonitril, wird ein niedrigaliphatisches Amid, zum Beispiel Akrylamid,
horgestellt. Es wurden viele Methoden der Hydratisierung durch das Wirken von Enzymen wie Nitrilase c ar Nitrilhydratase, dievon Mikroorganismen erzeugt wurden, vorgeschlagen (siehe zum Beispiel Japanische Patentveröffont! lung Nr. 21519/87,
US-Patent Nr.4001081,ungeprüfte japanische Patentveröffentlichungen Nr. 1621^3/86 und 91189/87,EPCNrOIeSaIe und
0204555, Japanische Patentveröffentlichungen Nr. 17918/81 und 37951/84 und US-Patente Nr.4248968 und 4631982). Solche
Methoden zur biologischen Herstellung eines Amids wurden ebenfalls kommerziell genutzt und haben die Aufmerksamkeit auf
sich gezogen; da es sich um vorteilhafte Verfahren zur Herstellung von Akrylamid handelt.
E s wurden bereits einige Mikroorganismen vorgeschlagen, die für das Verfahren zur Herstellung eines Amids verwendet werden
können. Soweit wir, die Erfinder, ermitteln konnten, sind diese Mikroorganismen, obwohl sie bei der Hydratisierungniedrigaliphatischer Nitrile effektiv sind, für die Hydratisierung aromatischer Nitrile nicht immer wirkungsvoll. Aus diesem
Grund ergibt die Methode zur Herstellung von Nikotinamid durch Hydratisierung von 3-Zyanopyridin eine zu geringe Ausbeute,
so daß sie für kommerzielle Zwecke nicht eingesetzt werden kann.
Die bisherige Technik der Züchtung von Mikroorganismen bei Vorhandensein eines Eisenions oder einos Manganions ist
bekannt. Diese Technik wird ebenfalls in dem Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids angewendet. Beispiele für die
Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Rhodococcus in Gegenwart eines Eisenions werden in der urigeprüften
japanischen Patentanmeldungen Nr. 162193/86 und 91189/87 beschrieben.
Die von ins durchgeführten Forschungen haben ergeben, daß ein Enzym zur Hydratisierung von Nitril, nämlich die in einem Bakteriun. der Gattung Pseudomonas entstehende Nitrilhydratase, in ihrem aktiven Zentrum Fe+++ enthält und somit das Vorhandensein eines Eisonions im Nährboden von entscheidender Bedeutung für die Züchtung des Mikroorganismus ist. Entsprechend wird für den in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Mikroorganismus der Gattung Rhodococcus ebenfalls
davon ausgegangen, daß ein Eisenion im Nährboden für die Züchtung des Mikroorganismus wichtig für die Herstellung eines
Enzyms zur Hydratisierung von Nitril ist. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß ein spezifischer Kulturstamm der Gattung Rhodococcus, d. h. ein Sta'mm J-1 der Art rhodocrous, in einem ein Eisenion enthaltenden Nährboden keine Nitrilhydratase produziert, sondern daß die Nitrilhydratase in einem Kulturstamm produziert wird, der ein Kobaltion enthält, und daß die auf diese Weise produzierte Nitriihydratase ein aromatisches Nitri! als Substrat nutzen kann, so daß sie in ein Amid umgewandelt wird. Somit ist das Verfahren zur Herstellung eines Amids gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids, in dem ein Nitril durch Einwirkung einer in einem Mikroorganismus erzeugten Nitrilhyo'ratase zu einem
entsprechenden Amid hydratisiert wird, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß die vorstehend erwähnte
Nitrilhydratase durch Züchtung eines Mikroorganismus oer Art Rhoddcoccus rhodocrous in Gegenwart eines Kobaltions
gewonnen wird.
Obwohl es in einem ein Eisenion enthaltenden Nährboden keinerlei Aktivitäten hi isichtlich der Nitrilhydratase gibt, entwickelt
sich entsprechend der vorliegenden Erfindung diese Aktivität in einem ein Kobaltion enthaltenden Nährboden. Wir hätten nichterwartet, daß die Entwicklung der Nitrilhydratase dieses spezifischen Mikroorganismus eine starke Abhängigkeit von der Art des
Metallions in einem Nährboden aufweist. Ziel der Erfindung
Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahrenzur Hydratisierung aromatischer und aliphatischer Nitrile bereitgestellt, das u. a. eine effektive Herstellung der <um Vitamin-Bj-Komplex gehörigen Nicotinamide, dem Hydratisierungsprodukt des 3-Zyjnopyridins, sowie dos Pyrizinamids, dem Hydratisierungsprodukt des Zyanopyrazins, erlaubt. Durch Verwendung einer Nitrilhydratase, die durch Züchtung eines Mikroorganismue der Gattung Rhoriococcus rhodocrous in Gegenwart eines Kobaltions gewonnen wird, wird eine Verfahrensverbesserung bewirkt.
Darlegung dos Wesens der Erfindung
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Hydratisierung aromatischer Nitrile bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Hydratisierung eines Nitrile, wobei dieses durch die Wirkung einer in einem Mikroorganismus entstehenden Nitrilhydratase in ein entsprechendes Amid umgewandelt wird. Das Verfahren umfaßt im wesentlichen die Züchtung eines Mikroorganismus, die Induzierurig einer Nitrilhydratase und die Veranlassung der Reaktion der auf diese Weise gewonnenen Nitrilhydratase mit einem Substratnitril.
Diese Schritte per se werden als Einheitsoperationen bezeichnet und werden in der vorliegenden Erfindung in ihrer geeigneten Form angewendet. Die Formulierung „Nitrilhydratase wird durch Züchtung eines Mikroorganismus in Gegenwart eines Kobaltions gewonnen" benötigt die Induzierung einer Nitrilhydratase als natürliche Voraussetzung.
Die Vrru'^setzung der vorliegenden Erfindung „ein Verfahren zur Hydratisierung eines Nitrils und dessen Umwandlung in ein entsprechendes Amid durch Einwirkung einer in einem Mikroorganismus entstehenden Nitrilhydratase" schließt alle geeigneten Ausführungsformen oder Variationen ein, die eine Reaktion der Nitrilhydratase mit dem Nitril veranlassen. Eine dieser Ausführungsformen ist eine Methode zum Auffangen eines Enzyms, das von einem Mikroorganismus erzeugt wurde, und die Verwendung dieses Enzyms als Enzympräparat. Diese Art der Verwendung der Nitrilhydratase, bei der das Enzym als Enzympräparat benutzt wird, fällt in der vorliegenden Erfindung unter die Kategorie „ein Verfahren zur biologischen Herstellung".
2. Details der Hydratisierungsreaktion
1) Mikroorganismus
Bei dem in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikroorganismus handelt es sich um einen Mikroorganismus der Gattung
Rhodococcus rhodocrous.
Ein repräsentativer Kulturstamm dieser Gattung ist der Stamm J-1.
Der Kulturstamm J-1 weist im einzelnen folgende Merkmale auf:
(1) Herkunft und Deponierung
Der Stamm J-1 wurde als Bodenprobe in Sakyo-ku, Kyoto, Japan, entnommen und als internationales Depositum (gemäß dem Budapester Vertrag über die Deponierung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren) unter der Zugriffsnummer BP-1478 im Fermentationsforschungsinstitut Jiapans, Abteilung Industrielle Wissenschaft undTechnik, hinterlegt.
(2) Bakteriologische Eigenschaften (a) Morphologie
(1) Form und Größe der Zellen: 0,9-1,0 μ χ 3-10 μ
(2) Vorhandensein von Zellpolymorphio:
Im Anfangsstadium der Züchtung weist die Zelle eine längliche Stabform auf, wächst dann in eine gekrümmte Form und wird anschließend in kurze Bazillen geteilt.
(3) Motilität: keine
(4) Vorhandensein von Sporen: keine
(5) GramscheFärbung: positiv
(6) Säurebeständigkeit: negativ
(7) HeterophilesGranulozyt: nachgewiesen
(b)· Wachstumsstadien in verschiedenen Nährböden (30"C)
(1) Nähragar-Platten- Kreis mit einem Durchmesser von 1 mm (48 Std.), unregelmäßig und glr.tt mit ziemlich trockener, ebener kultur: und opaker Oberfläche mit schwacher Orange-Rosa-Färbung.
(2) Nähragar-Schräg- Faden mit glatter, ziemlich trockener Oberfläche, Querschnitt leicht herausragend mit ziemlich trockener kultur: Oberfläche und schwacher Orange-Rosa-Färbung.
(3) Nähragar-Flüssig- Blühendes Wachstum, Bildung einer bakteriellen Zellmembran. Während des Wachstums tritt eine mäßi keitskultur: Trübung und Sedimentbildung auf. ,
(4) Nähragar-Gelutine- Feines Wachstum auf der Oberfläche kegelförmig entlang dem Stich, jedoch nicht in der unteren stichkultur: S c h i c h t. In der Gelatine wird keine Verflüssigung beobachtet.
(5) Lackmus-Milch: keineVeränderung (c) Physiologische Eigenschaften
(1) Reduktion von Nitraten: Positiv
(2) Denitrifikation: Negativ
(3) MR-Test: Negativ
(4) VP-Test: Negativ
(5) Bildung von Indol: Positiv
(6) Bildung von Hydrogensulfid: Positiv
(7) Stärkhydrolyse: Negativ
(8) Eini atz von Zitronensäure: Negativ (9) Einsatz einer anorganischen Nitrogen- Positiv
Kocurscher Nährboden: Positiv quelle: Positiv +
Christensen-Nährboden: Nitrat: Negativ +
Ammoniumsalz: Positiv
(10) Bildung von Farbstoff: Negativ +
(11) Urease: Positiv +
(12) Oxydase: Negativ +
(13) Katalase: pH: 5-10 +
(14) Hydrolyse der Zellulose: 10-410C +
(15) Wachstumsbereich: aerob +
Temperatur: Positiv +
(16) Verhalten gegenüber Sauerstoff: Positiv +
(17) Zerfall des Tyrosins: Positiv (+)
(18) Zerfall des Adenine: Positiv (+)
(19) Phosphatase: Negativ +
(20) HydrolysevonTween80: keine
(21) O-F-Test: + : Positiv; -: negativ; (+): Leicht positiv
(22) Wärmebeständigkeit (in 10%iger
Magermilch bei 720C über
15 Minuten): SSure
(23) Bildung von Säure und Gas aus -
einem Zucker: -
L-Arabinose +
D-Xylose -
D-Glukose +
D-Mannose +
D-Fruktose +
Maltose
Zucker -
Laktose +
Trehalose +
D-Sorbitol +
D-Manitol
Glyzerin (24) Wachstum in einer Einstoff-Kohlenstoffquelle:
+ !positiv; -!negativ Inositol
Maltose
D-Mannitol
Rhamnose
D-Sorbitol
m-Hydioxy benzoesäure
Natriumdipat
Natriumbenzoat
Natriumzitrat
Natriumlaktat
Testotetron
L-Tyrosin
Glyzerin (1 %) (Masse/Volumen)
Trehalose
p-Hydroxybenzoesäure
(1 %) (Masse/Volumen)
Gas
(25) Fettsäure und Analyse der Zellwand:
Enthält ungesättigte und gesättigte geradketiige Fettsäuren sowie Tuberkulo-Slearirisäuf e. Die Dünnschichtspektioskopie der Mykolsäure ergibt einen Einzelfleck.
Als Ergebnis der Klassifizierung der vorstehend beschriebenen bakteriologischen Eigenschaften gemäß dem Handbuch der systematischen Bakteriologie von Bergy handelt es sich bei dem Kulturstamm J-1 um einen aeroben, grampositiven, schwach säurebeständigen, katalasepositiven und nichtendosporen Bazillus, der kein Flagsllum einlagert. Der Kulturstamm besitzt ebenfalls die Form eines verlängerten Bazillus wie ein Myzel im Anfangsstadium des Wachstums, wächst mit Verzweigungen und teilt sich dann in kurze Bazillen. Aus diesem Grunde wird er einem Bakterium des Nocardia-Typs zugeordnet.
Die Analyse der Zusammensetzung der Fettsäure zeigt, daß das Bakterium ungesättigte und gesättigte geradkettige Fettsäuren enthält, dieTuberkulo-Stearinsäure enthalten. Die Dünnschichtchromatografie der Mykolsäure ergibt einen Einzelfleck mit dem aleinhen Rf-Wert wie beim Standardbakterlum Rhodococcus rhodocrous (IFO 3338) und unterscheidet sich somit von der Gattung Mykobakterlum. Aufgrund der Zusammensetzung (Anzahl der Kohlenstoffatome) der Mykolsäure unterscheidet sie sich ebenfalls von der Gattung Nocardla. Im Ergebnis der Untersuchung weiterer biochemischer Eigenschaften wurde das Bakterium als Rhodococcus rhodocrous erkannt.
Mikroorganismen neigen zu Mutationen. Aus diesem Grunde muß wohl nicht darauf hingewiesen werden, daß das Bakterium, selbst wenn es sich um einen Mutanten eines betreffenden KuJturstamms wie dem Stamm J-1 handelt, für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, w ,i sein Züchtungsprodukt in Gegenwart eines Kobaltions Nitrilhydratase produziert.
2) Substrat/Nitril
Bei den Nitrilen, die als Substrat für die durch den vorstehend beschriebenen Mikroorganismus gebildete Nitrilhydratase verwendet werden, handelt es sich um aromatische und aiiphatische Mononitrile oder Dinitrile, wobei die Mononitrile bevorzugt werden.
Bei den Nitrilen, die die Kennziffern der vorliegenden Erfindung am besten erfüllen, handelt es sich um aromatische Nitrile, vor allem um jene, bei denen der aromatische Ring aus 4-10 Kohlenstoffatomen gebildet wird. Einige typische Beispiele aromatischer Nitrile sind die in den nachstehenden allgemeinen Formeln (I) bis (Vl) dargestellten Verbindungen:
(I)
Typische Vertreter hiervon sind 4-, 3- und 2-Zyanopyridine
CN
(II)
Hierbei stellen R1 und R2 jeweils H, CH3, OH, OCH3, Cl, F, CN, NH2 oder NO2 dar.
Typische Vertreter hierfür sind Benzonitril, o-, m- und p-Chlorbenzonitrile, o-, m- und p-Fluorbenzonitrile, o- und m-Nitrobenzonitrile, p-Ami. ibonzonitril, o-, m- und p-Tolunitril, 4-Zyanophenol, Anisonitril, Phtalonitril, Isophtalnitril, Terephthalnitril, 2,6-Dichlorbonzonitril, 7.4-Dichlorbenzonitril und 2,6-Difluorbenzonitril.
(Ill)
Typische Vertreter hierfür sind α- und ß-Naphthonitrile
X
CN
(IV)
Hierbei stellt X S oder O dar.
Typische Vertreter hierfür sind 2-Thiophenkarbonitril und 2-Furonitril.
(V)
Ein typisches Beispiel hierfür ist 5-Zyanoindol
.N
(Vl)
Ein typisches Beispiel hierfür ist Zyanopyra?in. Eine weitere Gruppe von Nitrilen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, sind vorzugsweise aliphatische Nitrile, von
den·.η die Mono- oder Dinitrile mit 2-6 Kohlenstoffatomen zu bevorzugen sind, wobei hiervon wiederum die Mononitrile ambi. η geeignet sind. Vom Standpunkt der Nutzbarkeit der zu produzierenden Amide aus betrachtet, ist Akrylnltril typisch undleicht produzierbar.
Es muß wohl nicht darauf hingewiesen werden, daß es sich bei den Amiden, die diesen Nitrilen entsprechen, um jene handelt,
die durch Umwandlung der CN-Gruppe letztgenannter in eine CONH2-Gruppe gewonnen werden. Im Falle der Dinitrile sollte essich um die entsprechenden Nitrile handeln, die durch Umwandlung von mindestens einer der CN-Gruppen in eine CONH2-
Gruppe gewonnen werden.
3) Züchtung/Herstellung von Nitrilhydratase
Die Züchtung eines Mikroorganismus in der Gattung Rhodococcus rhodocrous kann unter beliebigen geeigneten Bedingungen
unter der Voraussetzung erfolgen, daß in einem Nährboden ein Kobaltion vorhanden ist. In vielen Fällen kann in einem
Nährboden ein Enzyminduzierstoff, der nachstehend detailliert beschrieben wird, verwendet werden, so daß sich die Nitrilhydratase in den bakteriellen Zellen sammelt.
(1) Grundnährböden
Im folgenden sind Beispiele geeigneter Nährböden aufgeführt. Diese lassen sich leicht von einer Fachkraft herstellen, die es
versteht, die nachstehend aufgeführte(n) Menge(n) der Bestandteile zu verändern, einen Bestandteil durch einen anderen zuersetzen und bestimmte Bestandteile zu eliminieren oder hinzuzufügen.
Nährboden A Menge (In 1 Liter des Nährbodens)
Bestandteil 0,1ml
Vitamingemisch· 13,4 g
K2HPO4 6,5 g
KH2PO4 - 1,0g
NaCI 0,2 g
MgSO4 7 H2O Gleichgewicht (pH 7,0)
Destilliertes Wasser
* Zusammensetzung: 2Mg
Biotin 0,4 mg
Kalziumpantothenat 2 mg
Inositol 0,4 mg
Nikotinsäure 0,4 mg
Thiaminhydrochlorid 0,4 mg
Pyridoxinhydrochlorid 0,2 ng
p-Aminobenzoesäure 0,2 mg
Riboflavin 0,01 ng
Folsäure bis 1 Liter
Wasser
Nährboden B 10g
Glycerin Bg
Pepton 3g
Malzextrakt 3g
Hefeextrakt Gleichgewicht (pH 7,2)
Destilliertes Wasser
Nährboden C 3g
Hefeextrakt 0,5 g »
KH2PO4 0,5 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO47H2O Gleichgewicht (pH 7,2)
Destilliertes Wasser
(2) Enzyminduzierstoff
Bei den Enzyminduzierstoffen zur Induzierung und Produktion von Nitrilhydratase in einem Mikroorganismus Rhodococcus
rhodocrous kann es sich um beliobige Stoffe handeln, die dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung entsprechen.
Typische Induzierstoffe für die vorliegende Erfindung sind Nitrile und Amide. Beispiele für Enzyminduzierstoffe, deren Wirkung für den Kulturstamm J-1 nachgewiesen wurde, sind folgende: Krotonamid, Azetonitril, Propionitril, Benzamid, Propionamid, Azetamid, Isovaleronitril, n-Butyronitril, Isobutyronitril, n- Kapronitril, 3-Pentenniti il, Pivalonitril, n-Butyramid, Isobutyramid, n-Valeramid, n-Kapronamid, Methakrylamid und Phenylazetamid.
(3) Kobaltion-Quelle
Selbst wenn Im Nährboden der vorstehend beschriebene Enzyminduzierstoff vorhanden ist, wird keine Nitrilhydratase gewonnen, so daß es entsprechend der vorliegenden Erfindung wesentlich ist, daß im Nährboden ein Kobaltion vorhanden ist. Da der Nährboden gewöhnlich wäßrig ist, wird das Kobaltion üblicherweise durch Zugabe einer wasserlöslichen Kobaltverbindung zum Nährboden erzeugt, Die wasserlöslichen Kobaltverbindungen werden in chemischen Fachbüchern beschrieben, so daß es für eine Fachkraft auf diesem Gebiet einfach ist, eine geeignete Verbindung au. zuwählen und zu verwenden (in manchen Fällen durch einen einfachen vorbereiteten Test). Typische Kobaltverbindungen sind jeno, die Co++ oder Co+++ erzeugon, vor allem jedoch die, bei denen Co++ entsteht.
Typische Beispiele hierfür sind Kobaltchlorid, Kobaltsulfat, Kobaltacetat, Kobaltbromid, Kobaltborat oder ähnliche. Weitere Beispiele für Kobaltverbindungen sind des Vitamin B12 und metallisches Kobalt, da diese durch Ionisierung oder oxydativen Angriff durch den Mikroorganismus während der Züchtung In situ ein Kobaltion im Nährboden bilden.
(4) Züchtung
C ie Züchtung zur Herstellung und Akkumulierung von Nitrilhydratasa in der bakteriellen Zelle kann durch Kultivierung des verwendeten Mikroorganismus, zum Beispiel des Kulturstamms J-1, in einem der vorstehend beschriebenen Nährböden unter geeigneten Bedingungen erfolgen.
Die Menge des zu verwendeten Enzyminduzierstoffes liegt in der Größenordnung zwischen 2 und 6g pro Liter Nährboden. Auf der Basis von CoCI2 liegt die Menge des Kobaltions im Bereich zwischen 5 und 15mg pro Liter des Nährbodens.
Typische Beispiele für die Zusammensetzung der Nährböden sind nachstehend spezifiziert:
(i) NährbodenA 1 Liter
Azetonitril (Induzierstoff) 2g
CoCI, 10mg
(ii) Nährboden B 1 Liter
Isoveleronitril 2g
CoCI2 10mg
iii) Nährboden C 1 Liter
Krotonamid 2g
CoCI2 10mg
Die Nitrilhydratase läßt sich auf vorteilhafte Weise durch Schüttelkultivierung der Stammkultur J-1 bei einerT jmperatur zwischen 15 und 50°C, vorzugsweise zwischen 20 und 450C und am besten bei etwa 3O0C, und einem pH-Wert zwischen 7 und 9 für etwa 30 Stünden oder mehr, vorzugsweise 40 Stunden oder mehr (bis zur oberen Grenze von etwa 120 Stunden) herstellen. Der Enzyminduzierstoff sollte vorzugsweise vom Beginn der Züchtung an vorhanden sein. Zur Präparierung bakterieller Zellen mit hoher Aktivität ist ebenfalls anzustreben, einen Induzierstoff hinzuzugeben. Wird die Schüttelkultivierung zum Beispiel bei einer Temperatur von 280C 76 Stunden lang durchgeführt, ist 26 und 56 Stunden nach Reaktionsbeginn eine zusätzliche Menge an Krotonamid beizumischen, so daß die Konzentration jederzeit 0,2% (Masse/Volumen) beträgt.
4) Hydratisierung des Nitrits
Die Prämisse der vorliegenden Erfindung „Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids, wobei ein Nitril durch Einwirkung einer in einem Mikroorganismus entstehenden Nitrilhydratase zu einem entsprechenden Amid hydratisiert wird" schließt, wie vorstehend beschrieben, verschiedene geeignete Ausführungsformen oder Variationen hinsichtlich der Art und Weise der Veranlassung der Reaktion der Nitrilhydratase mit dem Nitril ein.
Eine dieser Ausführungeformen besteht in der Herstellung eines Amids in einem Nährboden, wobei in einem Nährboden eines Mikroorganismus ein Substratnitril vorhanden ist.
Eine weitere Ausführungsform zur Veranlassung der Reaktion der Nitrilhydratase mit deren Substrat besteht in der Zugabe eines Substratnitrils zu einem Nährboden, in dem zur Durchführung der Hydratisierungsreaktion eino Nitrilhydratase akkumuliert wurde. Die Variation dor Ausführungsform bedient sich eines Nährbodens, in dem die Zellen des Mikroorganismus zerstört sind.
Hierbei handelt es sich um ,einen Nährboden, in dem eine Nitrilhydratase akkumuliert wurde".
Eine weitere Ausführungsform zur Veranlassung der Reaktion der Nitrilhydratase mit deren Substrat besteht in der Isolierung der Zellen, in denen Nitrilhydratase akkumuliert wurde, aus dem Nährboden. Diese Zellen sind vorzugsweise auf eine geeignete Trägersubstanz zu bringen oder ,bewegungsunfähig" zu machen und anschließend mit einem Substrat zu kontaktieren. Diese Methode, vor allem die bevorzugte Ausführungsform, bei der bewegungsunfähige Zellen benutzt werden, wird als ebenso oder sogar besser geeignet für die industrielle Anwendung angesehen wie die vorstehend beschriebenen anderen Ausführungsformen. Die Technik der Verwendung bewegungsunfähiger Zellen ist in der Fachwelt bekannt, was die Art der Trägersubstanz, die Methode zur Herstellung der Bewegungsunfähigkeit in einer Trägersubstanz und die Verwendung des bewegungsunfähigen Mikroorganismus in einem sogenannten Bioreaktor betrifft.
Eine weitere Ausführungsform zur Veranlassung der Reaktion der Nitrilhydratase mit deren Substrat besteht in einer Methode, bei der ein Enzympräparat einer Nitrilhydratase hergestellt und ein Nitril durch das Enzympräparat auf eine eher unbiologische Weise hydratisiert werden. Es muß wohl nicht darauf hingewiesen werden, daß die auf eine solche Weise durchgeführte Hydratisierungsreaktion unter pH-Wert- und Temperaturbedingungen erfolgen sollte, bei denen die Enzymaktivität nicht verloren geht. Diese Bedingungen sind die gleichen wie bsi der vorstehend beschrieb snen „biologischen Weise". Die vorstehend beschriebene Ausführungsform, bei der während der Einwirkung des Enzyms keine Mikroorganismen vorhanden sind, wird in der vorliegenden Erfindung ebenfalls als ein „biologisches Herstellungsverfahren" behandelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung liegt der geeignete pH-Wert-Bereich für die Nitrilhydratase zwischen 7 und 9, wobei ihr optimaler pH-Wert 8,0 beträgt. Weist die Reaktionslösung einen pH-Wert von weniger aus 7 auf, nimmt die Enzymaktivität abrupt ab. Aus diesem Grunde ist es erstrebenswert, der Reaktionslösung einen Puffer beizumischen. Selbst bei Verwendung eines beliebigen Puffers wie einem Kaliumphosphat-Puffer, ein6m Tris/HCI-Puffer, einem HEPES/KOH-Puffer und einem Natriumborat-Puffer verändert sich die Enzymaktivität der Nitrilhydratase nicht.
Die Konzentration eines Substrats in einem Nährboden oder in einer Reaktionslösung zur Hydratisierung liegt gewöhnlich im Boreich zwischen 4 und 7 mol/Llter. Die Reaktionstemperatur beträgt im allgemeinen zwischen 10 und 30°C.
AusfuhrungtbeUplele
Die Methode zur Messung der Aktivität einer Nitrtlhydratase und die Einheit der Aktivität in den nachstehenden Vnrsuchsbeispielen sind folgendermaßen definiert:
(1) Methode zur Messung der Aktivität einer Nitrilhydratase
Die Aktivität einer Nitrilhydratase wird durch die Reaktion von 2ml eines Reaktionsgemischtsgemessen, das 1OmM Benzonitril, 3OmM eines Kaliumphosphat-Puffers (pH-Wert 7,0) und eine bestimmte Anzahl von Zellen eines Mikroorganismus (die aus einem Nährboden isoliert wurden) enthält. Diese Reaktion erfolgt bei einer Temperatur von 100C über einen Zeitraum von 5 Minuten und wird durch Beimischung von 2 ml 1 N-HCi beendet.
(2) Definition der Einheit
Eine Einheit (E) der Aktivität der Nitrilhydratase ist definiert, als die Menge eines Enzyms, die zur Herstellung von Benzamid aus Benzonitril mit einer Ausbeute von 1 μηιοΙ/min unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen benötigt wird.
Bezugsbeispiel 1
Die J-1 -Kultur wurde in einem Nährboden, dessen Zusammensetzung nachstehend spezifiziert sind, kultiviert. Die aufgetretene Aktivität der Nitrilhydratase wurde untersucht, indem dem Nährboden während der Züchtung CoCI2 und/oder FeSO4 beigemischt wurden.
(i) Zusammensetzung des Nährbodens
Bestandteile Menge (In 1 Liter Nährboden)
Vi'.amingemisch 3,0 ml
K2MPO4 0,5 g
KH2HPO4 0,5 g
MgSO4 7 H2O 0,5 g
Propionitril 2,0 ml
Destilliertes Wasser Gleichgewicht (pH 7,2)
(ii) Züchtungsbedingungen
28 "C/70-80 Stunden
Die erzielton Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.
Es ist ersichtlich, daß die Nitrilhydratase selbst dann keine Aktivität entwickelt, wenn dem Grundnährboden FeSO4 beigemischt wird, daß die Nitrilhydratase bei Zugabe von CoCI2 aktiv wird und daß sich die Beimischung von FeSO4 zum System, das bereits CoCI2 enthält, negativ auf die Ergebnisse auswirkt.
BeigernischU r lelallionen 0 0 0 0 10 10 10 10 10
CoCI2 (mg) 0 5 10 20 40 0 5 10 20 40
FeSO4 (mg) 0 1.1·» 1,25 1,24 1,34 2,04 1,90 2,16 2,16 2,07
Menge der Zellen» mg/ml 1,06
Enzymaktivität 0 0 0 0 0,59 0,26 0,34 0,32 0,16
E/mg der Zellen·· 0 0 0 0 0 1,20 0,49 0,73 0,69 0,33
E/mg des Nähr bodens 0
* Menge der Zellen: basiertauf der Trockenmasse
** E: Einheit der Aktivität gemäß der vorstehenden Definition und Menge der Zellen basieren auf der Trockenmasse.
Bezugsboltplel 2
In der nachstehenden Tabelle sind die Wirkungen der verschiedenen Nitrile oder Amide als Enzyminduziertstoffe für den Kulturstamm J-1 aufgeführt.
Die in der nachstehenden Tabelle enthaltenen Ergebnisse wurden mittels vorbereitender Züchtung der Kultur J-1 in dem vorstehend genannten Nährboden B bei einer Temperatur von 280C gewonnen, wobei als Induzierstoff ein Nitril in einer Menge von 0,1 % (Volumen/Volumen) oder ein A id in einer Menge von 0,2% (Masse/Volumen) beigemischt wurden, nachdem sich der Stamm ausreichend verbreitet hatte. Anschließend wurde der Kulturstamm in den vorstehend genannten Nährboden C inokuliert, dem zuvor 0,001 % (Masse/Volumen) CoCI] beigemischt wurden. Die Kultivierung erfolgte dann über einen Zeitraum von 36 bis 48 Stunden.
Spezifische Aktivität Gesamtaktivität Menge der Zellen
(E/mg) (E/ml) (mg trockener
Zellen/ml)
Krotonamid 2,22 4,48 2,02
Azetonitril 1,41 3,47 2,46
Propionitril 1,36 4,44 3,26
Benzamid 0,84 2,75 3,26
Propionamid 0,79 2,29 2,90
Azetamid 0,71 1,55 2,18
n-Butyronitril 1,40 0,38 3,70
Isobutyronitril 0,41 1,24 3,06
Isovaleronitril 0,34 1,05 3,07
n-Kapronitril 0,28 1,04 3,71
3-Pentennitril 0,32 1,42 4,49
Pivalonitril 0,35 0,24 0,69
n-Butyroamid 0,43 1,55 3,62
Isobutyramid 0,09 0,33 3,48
Isovaleramid 0,44 1,08 1,81
n-Kapronamid 0,30 1,06 3,52
Methakrylamid 0,20 0,62 3,12
Phenylazetamid 0,29 0,28 0,95
Beispiel 1
Die Zellen des Kulturstamms J-1, die durch Züchtung des Stammes in einem Nährboden gewonnen wurden, der aus d6m vorstehend genannten Nährboden C mit 0,01 g pro Liter CoCI2 und 2g pro Liter Krotonamid bestand, reagierten mit verschiedenen Nitrilen, dio als Substrat verwendet wurden. Die Reaktion erfolgte unter Verwendung von 2ml einer Reaktionslösung, die die aus 2 ml der Kultur gewonnenen Zellen, 10mM eines Kaliumphosphat-Puffers (pH8,0) und 20OmM des Substrats enthielt. Die Reaktion erfolgte über einen Zeitraum von 76 Stunden bei einer Temperatur von 250C. Sie wurde durch Beimischung von 0,2 ml 1N-HCI gestoppt. Die Aktivität der Nitrilhydratase hinsichtlich der jeweiligen Substrate wird als Verhältnis des Reaktionsproduktes oder der verbrauchten Menge an Substrat, die mittels der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie gemessen wurde, zur Aktivität der Nitrilhydratai e, die mit 3-Zyanopyridin als Substrat gemessen wurde, angegeben und als spezifische Aktivität (%) bezeichnet. Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.
Substrat
Spezifische Aktivität (%)
3-Zyanopyridin
Akrylonitril
4-Zyanopyridin
2-Zyanopyridin
5-Zyanoindol
2-Thiophenonitril
2-Furonitril
Benzonitril
4-Zyanopheno!
p-Aminobenzonitril
m-Nitrobenzonitril
o-Nitrobenzonitril
m-Chlorbenzoniträl
p-Tolunitril
o-Tolunitril
m-Tolunitril
100
106
129
64
116 71 80 24 16 /
16
29
46 32
Anisonitril 20
o-Chlorbenzonitril 41
p-Chlorbenzonitril 7
2,4-Dichlorb9nzonitril 2
2,6-Dichlorbenzonitril 1
Zyanopyrazin 80
Beispiel 2 In einen 1-Liter-Sakaguchi-Kolben wurden 400ml eines Nährmittels gegeben, das aus dem vorstehend genannten Nährboden C
bestand, dem 0,01 g CoCI2 und 2g Krotonamid pro Liter beigemischt wurden. Das Gemisch wurde anschließend bei einer
Temperatur von 28°C in einer Schüttelvorrichtung kultiviert. Die Kultivierung wurde fortgesetzt, indem dem Nährboden 30 und
60 Stunden nach deren Beginn (0,2% (Masse/Volumen) Krotonamid (800mg/400ml) beigemischt wurde.
30 Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde diese abgebrochen.
Die bakteriellen Zellen wurden durch 15minütiges Zentrifugieren des Nährbodens mit 12000g in einem Zentrifugalabscheider
(Hitachi Modell SCR 20B) abgeschieden, mit 0,85%iger NaCI-Lösung gewaschon, nochmals zentrifugiert und in 40ml dervorstehend beschriebenen Lösung suspendiert. Der Suspension wurde eine kleine Menge als Probe entnommen, die zur
Messung der Trockenmasse der ba„.eriellen Zelle.ι in der Suspension verwendet wurde. Der Zellen (2,33 mg der Trockenzellen) enthaltenden Suspension wurden 4 ml einer Reaktionslösung beigemischt, die 1OmM Kaliumphosphat-Puffer (pH 8,0) und 4,57 M 3-Zyanopyridin enthielt. Die Reaktion erfolgte bei einer Temperatur von 250C über Nacht, wobei der Reaktionslösung 3 Stunden nach Reaktionsbeginn 0,55 M 3-Zyanopyridin und 6 Stunden nach Reaktionsbeginn
weitere 0,49M 3-Zyanopyridin heigemischt wurden. 18 Stunden nach Beginn der Reaktion betrug die Ausbeute an Nikotinamid5.58M. Somit erreichte die Umwc ndlung 99,5%, was der Akkumulierung von 681 g Nikotinamid entspricht. Bei dieser
Konzentration verfestigte sich das Reaktionsprodukt aufgrund der Ablagerung von Nikotinnmid. Das auf diese Weise produzierte Nikotinamid wurde als solches identifiziert, indem das Produkt in Form von Kristallen isoliert
und mittels der Elementaranalyse, der Infrarot-, NMR- und Massenspektrometrie analysiert. Es wurde keine Nikotinsäureentdeckt.
Beispiel 3 Die in Beispiel 2 gewonnene und Zellen (2,33mg der Trockenzellen) enthaltende Suspension wurde einer Reaktionslösung von
4ml beigemischt, die 1OmM Kaliumphosphat-Puffer (pH8,0) und Zyanopyrazin in verschiedenen Konzentrationen enthielt. Die
Reaktion erfolgte bei einer Temperatur von 250C. Bei einer Umwandlung von 100% wurden nach einer Reaktionszeit von
6 Stunden 4 Mol Zyanopyrazin in Pyrazinamid umgewandelt. Nach einer Reaktionszeit von 9 Stunden waren es sechs Mol. Alsjedoch einer ähnlichen Reaktionslösung (4ml) einer Suspension beigemischt wurde, die bakteriellen Zellen in einer Menge von4,66mg der Trockenmasse enthielt, wurden bei einer Umwandlung von 100% nach einer Reaktionszeit von 6 Stunden 7M des
Zyanopyrazins in Pyrazinamid umgewandelt. Nach einer Reaktionszeit von 9 Stunden waren es 8M. Die Bildung von Pyrazinkarboxylsäure konnte nicht nachgewiesen werden. Das Pyrazinamid kristallisierte sich während seiner Bildung aus der Lösung heraus. Die kristalline Ablagerung wurde aus dem Methanol direkt abgeschieden und rekristallisiert. Die Kristalle wurden als Pyrazinamid identifiziert, indem sie mittels der Elementaranalyse, der Infraror-, NMR- und Massenspektrometrie analysiert wurden. Die Analyse des Zyanopyrazins, des Pyrazinamids und der Pyrazinkarboxylsäure erfolgte mittels der Hochleistungsflüssigkeitschromatografie. Die gleiche Analyse wie im vorliegenden Beispiel wurde auch bei den folgenden Beispielen durchgeführt. Beispiel 4
Die in Beispiel 2 gewonnene und Zellen (4,66mg der Trockenzeiten) enthaltende Suspension wurde einer Reaktionslösung von 4ml beigemischt, die 1OmM eines Kaliumphosphat-Puffers (pH8,0) und 3M Methakrylnitril enthielt. Die Reaktion erfolgte bei einer Temperatur von 250C, wobei der Reaktionslösung 1 und 3 Stunden n&ch Reaktionsbeginn je 3 M Methakrylonitril beigemischt wurden. 12 Stunden nach Beginn der Reaktion wurden bei einer Umwandlung von 100% 9 M Methakrylamid produziert.
Wenn der vorstehend beschriebenen Reaktion 5 Stunden nach Reaktionsbeginn weitere 1M Methakrylonitril beigemischt wurden, betrug die Ausbeute 24 Stunden nach Beginn der Reaktion 1CM Methakrylamid bei einer Umwandlung von 100%. Eine Konzentration von 10M bedeutet, daß pro Liter Reaktionslösung 851 g Methakrylamid produziert und akkumuliert wurden. Die Reaktionslösung wurde mit Wasser verdünnt, und die bakteriellen Zellen wurden durch Zentrifugalbehandlung (15 Minuten bei 12000g) abgeschieden. Die zellfreie Lösung wurde auf einem Rotationsverdampfer konzentriert und kristallisiert. Anschließend wurden die Kristalle im Wasser gelöst und aus diesem rekristallisiert, um Methakrylamid-Kristalle zu gewinnen.
Beispiel5
Die in Beispiel 2 gewonnene und bakterielle Zellen (4,66mg der Trockenmasse) enthaltende Suspension wurde der Reaktionslösung von 4ml beigemischt, die 10mM eines Kaliumphosphatpuffers (pH 8,0) und 1M Krotonitril enthielt. Die Reaktion erfolgte bei einer Temperatur von 250C, wobei der Reaktionslösung nach Beginn der Reaktion im Abstand von jeweils einer Stunde insgesamt fünfmal je 1M Krotonitril beigemischt wurde. 6 Stunden nach Reaktionsbeginn wurden bei einer Umwandlung von 100% 6 Mol Krotonamid produziert. Als der Reaktionslösung 6 und 10 Stunden nach Reaktionsbeginn weitere 1M Krotonitril beigemischt wurden, entstanden 7 und 8 M Krotamid bei einer Umwandlung von 100% nach 10 bzw. 22 Stunden. Eine Konzentration von 8 M bedeutet, daß pro Liter Reaktionslösung 681 g Krotonamid produziert und akkumuliert wurden. Die Kristallisierung des Krotonamids erfolgte auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4.
Die in Beispiel 2 gewonnene und bakterielle Zellen (4,66mg Trockenmasse) enthaltende Suspension wurde einer Reaktionslösung von 4ml boigemischt, die 1OmM eines Kaliumphosphat-Puffers (pH8,0) und 3M Acetonitril enthielt. Die Reaktion erfolgte be! einer Temperatur von 25"C, wobei der Reaktionslösung 1 bis 3 Stunden nach Reaktionsbeginn je 3 M Azetonitril und 6 Stunden nach Beginn der Reaktion 5M Acetonitril beigemischt wurden. 12 Stunden nach Reaktionsbeginn wurden bei eine·' Umwandlung von 100% 14 M Acetamid produziert. Anders aur ^drückt, wurden pro Liter Reaktionslösung 827g Azetamid produziert und akkumuliert.
Die Reaktionslösung wurde mit Wasser verdünnt und zum Zwecke der Abscheidung der bakteriellen Zellen einer Zentrifugalbehandlung unterzogen. Die überstehende Flüssigkeit wurde in einem Rotationsverdampfer verdampft. Das Konzentrat wurde anschließend in Methanol gelöst und zur Gewinnung der Azetar iid-Kristalle aus dem Methanol kristallisiert.
Beispiel 7 Die in Beispiel 2 gewonnene und bakterielle Zollen (4,66mg Trockenmasse) enthaltende Suspension wurde einer Reaktionslösung von 4ml beigemischt, die 10mM eines Kaliumphosphat-Puffers (pH 8,0) und 3 M 3-Hydroxypropionitril enthielt. Die Reaktion erfolgte bei einer Temperatur von 250C, wobei der Reaktionslösung im Abstand von jeweils 1 Stunde nach Reaktionsbeginn insgesamt viermal je 3M 3-Hyd/oxypropionitril beigemischt wurden. 5 Stunden nach Beginn der Reaktion
wurden be! einer Umwandlung von 100% 1F M 3-Hydroxypropionamid produziert. Als der Reaktionslösung in diesem Stadiumweitere 3 M 3-Hydroxypropionitril beigemischt wurden, wurden 11 Stunden nach Reaktioncbeginn bei einer Umwandlung von100% 18M 3-Hydroxypropionamid produziert. Dies bedeutet, daß pro Liter Reaktionslösung 1600g 3-Hydroxypropionamidproduziert und akkumuliert wurden.
Die Reaktionslösung wurde mit Wasser verdünnt und zur Abscheidung der bakteriellen Zellen einer Zentrifugalbehandlung
unterzogen. Die zellfreie überstehende Flüssigkeit wurde anschließend auf einem Rotationsverdampfer verdampft und bei e'ner
Temperatur von -20°C kristallisiert. Zur Gewinnung der 3-Hydroxypropionamid-Kristalle wurden die Kristalle dann in Isopropanol gelöst und anschließend aus dom Lösungsmittel rekristallisiert. Beispiel 8 In einen 1 -Liter-Sakaguchi-Kolben wurde, 400ml eines Mährbodens gegeben, der aus dem vorsteheno genannten Nährboden C
mit 0,01 g pro Liter CoCI2 und 2g pro Liter Krotonamid bestand. Anschließend wurde das Gemisch bei einer Temperatur von 28°Cin einer Schüttelvorrichtung kultiviert. Die Kultivierung wurde fortgesetzt, indem dem Nährboden 26 und 56 Ständen nach deren
Beginn 0,2% (Masse/Volumen) Krotonamid (800mg/400ml) beigemischt wurde. 76 Stunden nach Beginn nor Kultivierung
wurde diese abgebrochen.
Die bakteriellen Zellen wurden durch 20minütiges Zentrifugieren des Nährbodens mit 10000g mit einem Zentrifugalabscheider
(Hitachi Modell SCR20B) abgeschieden, mit 0,85%iger NaCI-Lösung gewaschen, nochmals zentrifugiert und in 40ml dervorstehend beschriebenen Lösung suspendiert. Der Suspension wurde eine kleine Menge als Probe entnommen, die zur
Messung der Trockenmasse der bakteriellen Zellen in der Suspension verwendet wurde. Die Zellen (2,86mg der Trockenmasse) enthaltende Suspension wurde einer Reaktionslösung von 4 ml beigemischt, die 1OmM Kaliumphosphat-Puffer (pH 8,0) und 3-Zyanopyridin in vsrschi adene ι Konzentrationen enthielt. Die Reaktion erfolgte bei einer Temperatur von 250C. Bei einer Umwandlung von 100% wurden nach einer Riaktionszeit von 9 Stunden acht Mol 3-Zyanopvridin in Nikotinamid
umgewandelt. Als jedoch einer ähnlichen Reaktionslösung (4ml) eine Suspension beigemischt wurde, die bakterielle Zellen ineiner Menge von 5,92 mg Trockenmasse anstelle der vorstehend beschriebenen 2,96 mg der Tr jckenmasse enthielt, wurden beieiner Umwandlung von 100% nach einer Reaktionszeit von 5 Stunden 9M 3-Zyanopyridin in Nikotinamid umgewandelt. Nacheiner Reaktionszeit von 9 Stunden wurden 12 M 3-Zyanupyridin umgewandelt. Die Bildung von Nikotinsäure wurde nichtnachgewiesen. Eine Konzentration von 12M bedeutet, daß pro Liter Reaktionslösung 1965g Nikotinamid produziert undakkumuliert wurden.
Das Nikotinamid wurde während seiner Bildung aus der Lösung herauskristallisiert. Die kristallinen Stoffe wurden aus dem Methanol abgeschieden und rekristallisiert. Beispiel 9
Die in Beispiel 8 gewonnene und bakteriellen Zellen (5,92 mg der Trockenmasse) enthaltende Suspension wurde einer Reaktionslösung von 4ml beigemischt, die 1OmM eines Kaliumphosphat-Puffers (pH8,0) und 1M Benzonitril enthielt. Die Reaktion erfolgte bei einer Temperatur von 250C, wobei der Reaktionslösung 1,2,3,4,5 und 7 Stunden nach Reaktionsbeginn je 1M Benzonitril beigemischt wurden. 24 Stunden nach Beginn der Reaktion wurden bei einer Umwandlur.g von 100% 7 M Benzamid produziert. Dies entspricht einer Konzentration von 848 Benzamid pro Liter.
Beispiel 10
Die in Beispiel 3 gewonnene und bakterielle Zellen (5,92 mg der Trockenmasse) enthaltende Suspension wurde einer Reaktionslösung von 4ml beigemischt, die 1OmM eines Kaliumphosphat-Puffers (pH8,0) und 0,5M 2,6-Difluoibenzonitril enthielt. Die Reaktion erfolgte bei einer Temperatur von 25°C, wobei der ReaktionsNisung 2,4,6 und 8 Stunden nach Reaktionsbeginn je 0,5M 2,6-Difiuorbenzonitril beigemischt wurden. 22 Stunden nach Beginn der Reaktion wurden bei einer von 100% 2,5M 2,6-Difluorbenzamid produziert. Dies entspricht einer Komentration von 393g pro Liter.
BeUpIeMI
Die in Beispiel β gewonnene und bakterielle Zellen (5,92 mg der Trockenmasse) enthaltende Suspension wurde einer Reaktionslösung von 4ml beigemisciit, die 10mM eines Kaliumphosphat-Puffers (pH 8,0) und 1M 2-Thiophenkarbonltril enthielt. Die Reaktion erfolgte bei einer Temperatur von 250C, wobei der Reaktionslösung 1 Stunde nach Beginn der Reaktion 1M 2- Thiophenkarbonitril beigemischt wurden. 5 Stunden nach Reaktionsbeginn wurden bei einer Umwandlung von 100% 7 M
2-Thiophenkarboxvlamid produziert. Dies entspricht einer Konzentration von 254g 2-Thiophenylkarboxyler*.id pro Liter
Reaktionslösung. Beispiel 12 Die in Beispiel 8 gewonnene und bakterielle Zellen (5,92 mg der Trockenmasse) enthaltende Suspension wurde einer Reaktionslösung von 4ml beigemischt, die 1OmM eines Kaliumphosphat-Pujfers (pH8,0) und 1M 2-Furonitril enthielt. Die Reaktion erfolgte bei einer Temperatur von 25°C, wobei der Reaktionslösung 1,2,4,6,8,11 und 23 Stunden nach Reaktionsbeginn je 1M 2-Furonitril beigemischt wurden. 30 Stunden nach Reaktionsbeginn wurden bei einer Umwandlung von
100% 8M 2-Furankarboxylamid produziert. Dies entspricht einer Konzentration von 888g 2-Furankarboxylamld pro Liter
Reaktionslösung. Beispiel 13 Die in Beispiel 8 gewonnene und bakterielle Zellen (5,92 mg der Trockenmasse) enthaltende Suspension wurde einer Reaktionslösung von 4ml beigemischt, die 1OmM eines Kaliumphosphat-Puffers (pH8,0) und 4M 3-lndolazctonitril enthielt. Die Reaktion erfolgte bei einar Temperatur von 250C. 24 Stunden nach Beginn der Reaktion wurden bei einer Umwandlung von
100% 4 M 3-lndolazetamid produziert.
Dies entspricht einer Konzentration von 697g 3-lndolazetamid pro Liter Reaktionslösung.

Claims (9)

  1. Patentansprüche:
    1. Ein Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nitril durch Einwirkung einer in einem Mikroorganismus entstehenden Nitrilhydratase zu einem entsprechenden Amid hydratisiert wird, wobei das Verfahren dadurch charakterisiert worden ist, daß es die Verwendung einer Nitrilhydratase umfaßt, die durch Züchtung eines Rhodococcus rhodocrous in Gegenwart eines Kobaltions gewonnen wird.
  2. 2. Ein Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem genannten Mikroorganismus um einen Kulturstamm J-1 der Gattung Rhodococcus rhodocrous, FERM BP 1478, handelt.
  3. 3. Ein Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem genannten Nitril um ein aromatisches Nitril handelt, das in seinem Nukleus 4-10 Kohlenstoffatome aufweist.
  4. 4. Ein Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eins genannte aromatische Nitril aus der Gruppe mit folgenden Bestandteilen ausgewählt wird:
    CN
    (D
    (II)
    Hierbei stellen R1 und Rz jeweils H, CH3, OH, OCH3, Cl, F, CN, MH2 oder NO2 dar.
    (IH)
    (O
    CN
    (IV)
    X stellt hierbei S oder G dar. N
    (V)
    CN
    (Vl)
  5. 5. Ein Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei α>πι genannten aromatischen Nitril um 2-Zyanopyridin, 3-Zyanopyridin oder4-Zyanopyridin handelt.
  6. 6. Ein Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem genannten aromatischen Nitril um 3-Zyanopyridin handelt.
  7. 7. Ein Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem genannten aromatischen Nitril um Zyanopyridin handelt.
  8. 8. Ein Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem genannten Nitril um ein aliphatisches Nitril mit 2-6 Kohlenstoffatomen handelt.
  9. 9. Ein Verfahren zur biologischen Herstellung eines Amids gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem genannten aliphatischen N.iril mit 2-6 Kohlenstoffatomen um Akrylonitril handelt.
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