DD287955A5 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen das lipopolysaccharid 018 und 083 aus escherichia coli - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen die Lipopolysaccharidtypen 018 und 083 aus E. coli. Durch Immunisierung von Maeusen und Immortalisierung ihrer Milzlymphocyten mit einer murinen Myelomzellinie werden die Hybridomzellinien H-CB-LPS 018-G1, H-CB-LPS 083-G1, H-CB-LPS 083-G2 und H-CB-LPS 083-G3 erhalten (ZIM-0492, -0493, -0494, -0495). Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik sowie die Impfstoffherstellung.{Antikoerper; monoklonale Antikoerper; Antigen; Escherichia coli; Lippolysaccharid 018; Lipopolysaccharid 083; Immunisierung; Maeuse; Hybridzellen; Medizin; Diagnostik; Impfstoff}

Description

709) werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelom- und Milzzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Klone selektlonlert, die Antikörper der gewünschten Spezlfität produzieren. Die Detektion dieser Klone erfolgt dadurch, daß Im zollfreien Überstand der angelegten Zellkulturen (Primärzellkulturen) durch ein geeignetes Verfahren (z.B. einem spezifischen Enzymimmunoassay [EIA]) sezemierte Antikörper gegen die Llpopolysaccharidtypen 018 und 083 aus E. coli nachgewiesen werden. Die Primärzellkulturen mit Antikörperproduktion gegen die Lipopolysaccharidtypen 018 und 083 aus E. coli K1018 und E. coli K1083 werden Moniert und mehrmals rekloniert, bis monoklonal Subklone erhalten werden, die stabil und in hohen Konzentrationen Antikörper der gewünschten Spezifität sezernieren.

Diese Hybridome werden als H-CB-LPS 018 und H-CB-LPS 083 bezeichnet. Besonders geeignet sind die Zellkulturen H-CB-LPS 018-G1, H-CB-LPS 083-G1, H-CB-LPS 083-G2 und H-CB-LPS 083-G3. Diese 4 Hybridome sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralihstituts für Molekularbiologie der AdW der DDR, Berlin-Buch unter folgenden Nummern registriert:

H-CB-LPS 018-G1 alsZIM-0492 H-CB-LPS 083-G1 alsZIM-0493 H-CB-LPS 083-G2 als ZIM-0494 H-CB-LPS 083-G3 als ZIM-0495

Die hinterlegten Hybridomzellkulturen eignen sich für eine Massenproduktion von monoklonalen Antikörpern in vitro und in

Im ersten Fall werden die Zellen in 6-well-Zellkulturplatten bis zu einer maximalen Zelldichte von 9 χ 10⁶ Zellen/ml Kulturflüssigkeit kultiviert, wobei Antikörperkonzentrationen Im Zellkulturüberstand bis zu49pg lg/ml Kulturflüssigkeit ermittelt werden konnten.

Im zweiten Fall werden die Zellen aus der Zellkultur In dere-well-Zellkulturplatte auf eine Konzentration von 1-5 x 10⁶Zellen/ml PBS eingestellt und in an sich bekanntem Verfahren mit Pristann vorbehandelten Mäusen intraperioneal appliziert. Nach ca.

14 Tagen lassen sich durch Punktion In hohem Maße antikörperhaltige Ascitesflüsslgkeiten gewinnen.

Auf diese Weise werden aus den genannten Hybridomen die monoklonalen Antikörper CB-LPS 018-G1, CB-LPS 083-G1, CB-LPS 083-G2 und CB-LPS 083-G3 gewonnen. Durch Anwendung verschiedener biochemischer und immunochemischer Verfahren lassen sich die genannten Antikörper bis zu einem hohen Reinheitsgrad e nreichern.

Fürdie Entwicklung bestimmterTestverfahren können die Antikörper mit Enzymen oder partikulären Trägern gekoppelt werden (Peroxidasemarkierung bzw. Latexkopplung). Für Reinigungsverfahren ist die kovalente bzw. nichtkovalente Bindung an verschiedene Trägermaterialien möglich.

Anwendungsbelsplele

Beispiel 1

Über einen Zeitraum von 8 Wochen werden drei weiblicho Balb/c-Mäuse 2x wöchentlich mit 0,1 ml einer Escherichia coli K1018 Vollkeimsuspension (formelininaktlviert, optische Dichte 1,0 In der 1-cm-Küvette bei 650nm In PBS) intravenös immunisiert.

4 Tage nach der letzten Antigenapplikation werden die Milzen der Versuchstiere entnommen und mittels Glashomogenisator Einzelzellsuspensionen hergestellt. Je Versuchstier lassen sich 1-2 χ 10^s Milzzellen isolieren. Die präparierten Milzzellen werden mit Myelomzellen der Linie P3 X63 Ag8/653 im Verhältnis 1:3 bis 1:8 (Myelomzellen:Mllzzellen) gemischt und unter serumfreien Bedingungen mittels Polyethylenglykol 1500 fusioniert.

Nach entsprechenden Waschschritten werden die Zellen in Zellkulturmedium RPM11640 mit 10%igem FKS-Anteil aufgenommen und in 86-well-Zellkulturplatten mit 10^s Zellen/well In 100μΙ ausplattiert. Am folgenden Tag werden 100μΙ eines doppelt konzentrierten HAT-Selektionsmediums zugesetzt. Eine weitere Zugabe von 50 μΙ des HAT-Mediums pro Kavität erfolgt nach einer Woche. Nach ca. 14tägiger Zellkultur werden die Primärzellkulturüberstände mit einem hochspezifischem EIA hinsichtlich ihres Gehaltes an spezifischen Antikörpern geprüft.

Die Ergebnisse der Primärzellkulturtestung werden in Tabelle 1 dargestellt.

Die positiven Primärzellkulturen werden au'Peritonealmakrophagen der Balb/c-Maus (10⁴ Zellen/well) nach dem Grenzverdünnungsverfahren kloniert und bis zum Erreichen der Monoklonalität rekloniert.

Auf diese Weise werden Zellinien mit spezifischer Antikörperproduktion gegen das Lipopolysaccharid 018 aus E. coli K1018 gewonnen.

Beispiel 2

Über einen Zeitraum von 8 Wochen werden 3 weibliche NZB-Mäuse 2x wöchentlich mit 0,1 ml einer Escherichia coli K1 088-Vollkeimsuspension (formalininaktiviert, optische Dichte 1,0 in der 1-cm-Küvette bei 650nm in PBS) intravenös immunisiert.

4 Tage nach der letzten Antigenapplikation werden die Milzen entnommen und mittels Glashomogenisator Einzelzellsuspensionen hergestellt. Es werden 3 unabhängige Fusionen nach dem unter Beispiel 1 beschriebenen Ablaufschema durchgeführt. Die Ergebnisse der Primärzellkulturtestung werden in Tabelle 2 dargestellt. Die positiven Primärzollkulturen werden auf Peritonealmakrophagen der Balb/c-Maus (10⁴ Zellen/well) nacch dei n Grenzverdünnungsverfahren kloniert und bis zum Erreichen der Monoklonalität rekloniert.

Auf diese Weise werden Zellinien mit spezifischer Antikörperproduktion gegen das Lipopolysaccharid 083 aus Escherichia coli K1083 gewonnen.

Beispiel 3 Nach dem beschriebenen Schema sind Hybridomzellen mit monokionaler Antikörperproduktion gegen die Lipopolysaccharldtypen 018 und 083 aus E. coil K1 018 bzw. E. coil K1 083 hergestellt worden, die mit H-CB-LPS 018-01, H-CB- LPS 083-Q1, H-CB-LPS 083-G2 und H-CB-LPS 083-G3 bezeichnet wurden. Diese ZeNinien wurden für die Optimierung des Verfahrens zur Herstellung der entsprechenden Antikörper charakterisiert (Tabelle 3). Die Spezifitätscharakterisierung der durch die genannten Zellinien produzierten Antikörper wurde ebenfalls durchgeführt

(Tabelle 4).

Tabelle 1: Prlmarzellkulturtestung von murlnen Hybridomen nach Immunisierung mit Escherlchla coil K1 018 (Balb/c-Maus)

Fusions nummer	wells total	wells mit Wachstum	wells mit IgG	IgM	Immunglobulinprodukt. Anti-LPS Anti-LPS 018-IgG 018IgM	18 23 35	wells total	wells mit Wachstum	wells mit IgG	IgM	Immunglobüllnproduktion Anti-LPS Anti-LPS 083-IgG 083-IgM	15 21 10
1 2 3	288 288 288	288 284 255	124 130 110	178 1G4 145	29 42 68	9,2	288 288 288	142 263 160	63 152 72	52 89 75	27 14 10	8,1
%(Durchschn.)		95,7	43,8	57,6	16,8	Tabelle 2: Prlmarzellkulturtestung von murlnen Hybridomen nach Immunisierung mit Escherlchla coil K1 083 (NZ		65,4	50,8	38,2	9,3
Fusions nummer
1 2 3
%(Durchschn.)

Tabelle 3: Charakterisierung der Hybrldomzellinlen mit monokionaler Antikörperproduktion gegen die Lipopolysaccharldtypen 018 und 083 aus E. coil

Klon	Ig-Klasse	max.lg-Produktionin
		Mg/ml Zellkulturflüssigkeit
H-CB-LPS 018-G1	G	8,1
H-CB-LPS 083-G1	G	14,6
H-CB-LPS 083-G2	G	17,3
H-CB-LPS 083-G3	G	11,5

Tabelle 4: Spezifitätscharakterisierung der monoklonalen CB-LPS 018 und CB-LPS 083 im EIA gegenüber verschiedenen bakteriellen Antigenen (Festphasenbeladung mit Vollkeimsuspensionen [VK] bzw. immunochemisch charakterisierten Teilantigenen [PA], Entwicklung mit Antlspecles-Antikörpern POD-marklert, Testung ZKU natlv)

Antigen Klon/Ext. 460 nm	CB-LPS	CB-LPS	CB-LPS	CB-LPS
	018-G1	083-G1	083-G2	083-G3
	0,107	0,109	0,116	0,109
Streptococcus
agalactiae(VK)	0,012	0,005	0,172	0,041
Candida albicans (VK)	0,011	0,008	0,136	0,259
B-Meningokokken (VK)	0,022	0,012	0,075	0,167
E. coli O76K100 (VK)	1,754	0,026	0,206	0,229
LPS aus E. CoIiO18	0,185	2,205	2,312	1,957
LPS aus E. coli O8J	1,654	0,011	0,005	0,081
E. coli O18K1 (VK)	0,021	2,073	2,014	2,220
E1CoIiO83K1(VK)	1,432	0,013	0,042	0,076
E. coli O18K1 (PA)	0,030	1,973	1,771	1,476
E1CoIiO83K1(PA)

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die die Lipopolysaccharidtypen 018 bzw. 083 aus E. coli 018 bzw. 083 erkennen, durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit Vollkeimsuspensionen von Escherichia coli K1018 bzw. durch Immunisierung von NZB-Mäusen mit Vollkeimsuspensionen von Escherichia coli K1 083 und Immortalisierung ihrer Milzlymphocyten mit einer murinen Myelomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß daraus die Hybridomzellinien H-CB-LPS 018-G1 (ZIM-0492), H-CB-LPS 083-G1 (ZIM-0493), H-CB-LPS 083-G2 (ZIM-0494) und H-CB-LPS 083-G3(ZIM-0495) selektiert zurZüchtung eingesetzt und aus dem Überstand die monoklonalen Antikörper CB-LPS 018-G1, CB-LPS 083-G1, CB-LPS 083-G2 und CB-LPS 083-G3 isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Milzlymphozyten erfolgt, nachdem das Antigen 8 bis 10 Wochen alten weiblichen Mäusen über einen Zeitraum von 8 Wochen zweimal wöchentlich intravenös appliziert wird und die letzten Gabe des Antigens 4 Tage vor der Mil?entnahme erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper biotiniliert oder an Enzyme, ζ. B. zur Peroxidase-Markierung, an partikuläre Träger, z. B. Latex bzw. an Trägermaterialien gekoppelt werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung nonoklonaler Antikörper gegen das Llpopolysaccharid der Typen 018 und 083 aus Escherichia coli. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik sowie die Impfstoffherstellung.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Herstellung monoklcnaler Antikörper ist ein durch Köhler und Milstein bereits im Jahre 1975 beschriebenes Verfahren (Nature 1975,256,495). Den genannten Autoren gelang es erstmalig, durch somalische Fusion von murinen antikörpersezernierenden Zellen und Zellen einer permanent wachsenden Plasmocytomzellinie Hybridome zu erzeugen, die nach verschiedenen Klonierungsschritten monoklonal Antikörper murinen Ursprungs gegen eine gewünschte Antigenspezifität produzieren. Die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen verschiedene Lipopolysaccharidtypen aus Escherichia coli nach der von Köhler und Milstein entwickelten Prinziplösung ist ebenfalls bereits beschrieben worden (Mutharia, L. M„ G.Crockford, W. C. Bogard und R. E.W. Hancock, Infect. Immun. 45,631,1984; Kirkland, T. N., E. J. Ziegler 1984, J. Immunol. 132,2590; L.S. Young 1984, Clin. Res. 32,518; Young, L.S.,S.AIam und R.Gascon 1982, Clin. Res.30,522; Pluschke, G. und G. Bordmann 1987, Eur. J. Immunol. 17,413). Es sind jedoch keine Hybridome bekannt, die in hoher Ausbeute monoklonale Anitkörper vom Typ CB-LPS 018-G1, CB-LPS 083-G 1, CB-LPS 083-G2 und CB-LPS 083-G3 sezernieren.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, für die medizinische Diagnostik monoklonale Antikörper zur Verfügung zu stellen, die für den Aufbau von Testsystemen zum Nachweis von Escherichia coli geeignet sind. Ein weiteres Einsatzziel ist die Verwendung dieser monoklonalen Antikörper im Rahmen der Impfstoffreinigung se vie der passiven Immunisierung.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein effektives Verfahren zur Erzeugung von Hybridomzellinien aus deren Zellkulturüberständen in weiterführenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper gegen Lipopolysaccharide der Typen 018 und 083 des Escherichia coli gewonnen weiden können, zu entwickeln. Die nach dem beschriebenen Verfahren erzeugten Hybridomzellinien sollen mit geringstem ökonomischen Aufwand in vitro und in vivo kultivierbar sein, sowie die für eine wirtschaftliche Reinigung erforderlichen Mengen an stabilen Antikörpern sezernieren. Die Aufgabenlösung erfolgte durch Immunisierung von Mäusen des Balb/c-Stammes mit einer Vollkeimvakzine aus E. coli K1018 sowie Immunisierung von Mäusen des NZB-Stammes mit einer Vollkeimvakzine aus E. coli K1083 nach einem bestimmten erfinderischen Schema. Als günstig erwies sich die Immunisierung von weiblichen Mäusen der genann'en Inzuchtstämme im Alter von 8 bis 10 Wochen. Die Immunisierung erfolgte durch mehrmalige Antigenapplikation. Als ökonomisch außerordentlich günstige Variante erwies sich die intravenöse Applikation von ΙΟΟμΙ einer Vollkeimsuspension (formalininaktiviert, optische Dichte 1,0 in einer 1-cm-Küvette bei 650nm) zweimal wöchentlich über einen Zeitraum von 8 Wochen. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse wurde

4 Tage nach der letzten Antigenapplikation in an sich bekannter Art und Weise eine Einzelzellsuspension mittels Glashomogenisator hergestellt.

Als Fusionspartner für die derart präparierten Zellen wurden Maus-Myelomzellen der Linie P3 X63 Ag8/653 (Kearney et al. 1979, J. Immunol. 123,1548) verwendet. Die Kultivierung der Mausmyelomzellen erfolgte im Zellzuchtmedium RPM11640 mit einem 10%igen Anteil an fetalem Kälberserum (FKS). Beide Fusionspartnei wurden nach vorhergehenden Waschschritten in FKS-freiem RPFI-Medium und anschließender Sedimentation mittels Polyethylenglykol verschmolzen. Nach abgeschlossenem Fusionsvorgang wurden die mehrmals gewaschenen Fusionsprodukte in eine Vielzahl von separaten 200-pl-Kulturen aufgeteilt. In einem Hypcxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltenden Zellkulturmedium (HAT) nach LITTLEFIELD (Science 1964,145,